Grundlagen der Chromatographie

Grundlagen der
Chromatographie
(Additional Reading)
Astrid Zuern, Reiner Salzer
Steffen Thiele
prof. aza
1
Inhaltsverzeichnis
•
•
–
–
–
•
•
•
3.1) Vorgang der
Stofftrennung
4) Van-Deemter-Gleichung
–
4.1) Peakverbreiterung Animation
5) Der Chromatograph
6) Das Chromatogramm
7) ChromatographieKenngrößen
– 7.1) Charakterisierung Stoffe
– 7.2) Charakterisierung Trennung
– 7.3) Charakterisierung -Säule
– 7.4) Optimierung einer
Trennung
– 7.5) Beispielrechnung
– 7.6) Übungsaufgabe
2.1) M. S. Tswett
2.2) Erste Techniken
2.3) Entwicklungsrichtungen
3) Säulenchromatographie
–
•
•
1) Trennvorgang
2) Geschichte
•
•
•
prof. aza
8) Die Totzeit
9)
Säulenchromatographiearten
10) Silbenrätsel
Chromatographie
2
Chromatographische Methoden im
Überblick
• Mit Chromatographie werden alle die
physikalisch-chemischen Trennverfahren
bezeichnet, bei denen der Trennvorgang auf der
Verteilung eines Stoffes zwischen einer mobilen
und einer stationären Phase beruht.
Verschiedene Stoffe einer Probe werden
unterschiedlich stark von der stationären Phase
zurückgehalten, während die mobile Phase den
Transport übernimmt. Chromatographie wird
präparativ und analytisch genutzt.
prof. aza
3
Lernziele
• Grundlegende Begriffe zur
Chromatographie
• Historischer Überblick zur Entwicklung der
Chromatographie
• Vorgänge und Begriffe in der
Säulenchromatographie
prof. aza
4
Einstufung
• Fachgebiet: Chemie / Analytische Chemie
/ Chromatographie
• Bearbeitungszeit: 30 min
• Schwierigkeitsgrad: leicht
• Vorkenntnisse, keine
prof. aza
5
ein historischer Überblick
• In diesem Abschnitt wird ein historischer
Überblick über die Entwicklung der
Chromatographie zur leistungsfähigen
Analysenmethode gegeben. Außerdem werden
die grundlegenden Begriffe, Kenngrößen und
Vorgänge in der Säulenchromatographie
beschrieben. Ergänzt wird der Abschnitt durch
eine Übungsaufgabe zu den
Chromatographiegrößen, durch Animationen zur
Van-Deemter-Gleichung und durch ein
Silbenrätsel zur Chromatographie, mit dem man
seinen Begriffswissenstand testen kann.
prof. aza
6
PC: Papierchromatographie DC: Dünnschichtchromatographie GC:
Gaschromatographie HPLC: Hochdruckflüssigchromatographie (high pressure
liquid chromatography) NP-LC: Normalphasen-Flüssigchromatographie (normal
phase liquid chromatography) RP-LC: Umkehrphasen-Flüssigchromatographie
(reversed phase liquid chromatography
prof. aza
7
HPLC
• HPLC wird nicht nur
als Hochdruckflüssigchromatographie (high
pressure liquid chromatography) bezeichnet,
sondern auch als
Hochleistungsflüssigchromatographie (high
performance liquid chromatography), was aber
eine sehr positivistische Interpretation oder
Namensgebung der Chromatographie-Firmen ist
- im Vergleich zur vorher üblichen
Säulenchromatographie.
prof. aza
8
• Die Leistungsfähigkeit ist eigentlich eher eine
Minimierung der HPLC-Gerätebestandteile mit den damit
verbundenen neuen technischen Erfordernissen (hoher
Druck) und der Möglichkeit sehr geringer Probemengen,
gleichbleibend guter Trennleistung und einer
Beschleunigung der Analyse. Die absolute Zahl
möglicher trennbarer Verbindungen ist normalerweise
weiter auf ca. 25 beschränkt.
• Das P in der Abkürzung HPLC wurde aber auch noch mit
anderen (humoristischen) Interpretationen belegt, z.B mit
"price" wegen der anfangs hohen Anschaffungskosten.
prof. aza
9
• Antike: schon Nutzung des Prinzips
(Aristoteles verwendete einige Tonerden
zum Reinigen von Meerwasser)
• 1859 Runge: Kapillarbilder - Urform der
Papier-Chromatographie
• Aber bis dahin alles ohne das Verständnis
für die Vorgänge
prof. aza
10
• 1903 Tswett: Arbeiten zur Trennung von
Chlorophyll mittels Adsorptionschromatographie
- Namensgebung für die Methode
• Anfang der 30er Jahre Gruppe um Kuhn: neue
Versuche zu Pflanzenfarbstoffen und
Chromatographie
• 1938 Kuhn: Nobel-Preis für seine Anwendung
der Tswett'schen Adsorptionschromatographie
an Carotinoiden und Vitaminen
• 1938 Iszmailov und Schraiber: Grundlagen der
Dünnschichtchromatographie
prof. aza
11
• 1940 Martin und Synge: Arbeiten zur
Verteilungschromatographie, theoretische Grundlagen
durch Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung
der HETP als chromatographische Kenngröße - NobelPreis 1952
• 1951 erster Gaschromatograph von Martin und James
• 1956 Van-Deemter-Gleichung von der Gruppe um
Klingenberg (Shell)
• 1965 Stahl: Einzug der Dünnschichtchromatographie in
die chemische Analytik
• zwischen 1937 und 1972 12 Nobel-Preise für Arbeiten, in
denen die Chromatographie eine entscheidende Rolle
spielte
prof. aza
12
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
russischer Botaniker
19. 5. 1872 - 26. 6. 1919
Vater Russe, Mutter Italienerin
Studium in Genf
(Naturwissenschaften)
1896 Promotion (Zellphysiologie)
ab 1897 Dozent für
Pflanzenanatomie und -physiologie
in St. Petersburg
ab 1907 Professuren in Warschau
ab 1915 Flucht vor deutschen
Truppen nach Moskau, Nisnij
Novgorod, Jurev und Voronesch
große Anerkennung für seine
Forschung über Blattpigmente
Buch: (1910) Die Farbstoffe im
Tier- und Pflanzenreich
prof. aza
Michail
Semjonowitsch
Tswett
13
Verdienst für Chromatographie
• 21. 3.1903 Vortrag auf einer Tagung der
Biologischen Sektion der Warschauer
Gesellschaft der Naturwissenschaften
• Titel: "...über eine neue Kategorie von
Adsorptionsphänomenen und ihre
Anwendung auf die biochemische
Analyse"
prof. aza
14
• Tswett hatte ein Glasrohr mit
Inulin gefüllt und ein
Chlorophyll-Extrakt in Ligroin
darauf gegeben. Er goss
weiter Ligroin darüber.
• Zuerst kam eine farblose
Flüssigkeit, dann wurde ein
gelber Ring (Carotin) vor
einem grünen Ring am
oberen Ende der Säule
sichtbar, der sich während des
Laufes in einen grünen und
einen gelben teilte. grün:
Chlorophyll a , gelb:
Chlorophyll b
prof. aza
Sein Experiment:
15
prof. aza
16
Tswett nannte seine Methode Chromatographie
(Farbschreibung)
Seine Arbeiten zur Chromatographie wurden ca.
30 Jahre lang nicht beachtet.
.
prof. aza
17
Die Entwicklung der Technik für die
Chromatographie
• Die meisten in der Natur und Produktion
vorkommenden Stoffe liegen in Gemischen vor.
Der Bedarf an gezielten Informationen zu Art
und Menge eines bestimmten Stoffes ist sehr
hoch und weiter steigend.
• Daher ist es verständlich, dass mit der
Entdeckung der Möglichkeiten des
chromatographischen Prinzips eine rasante
Entwicklung einsetzte. Heute ist es undenkbar,
ein chemisches Labor ohne Chromatographie zu
betreiben.
prof. aza
18
• Die Reinheitskontrolle im Pharmabereich, die
Schadstoffanalytik im Umweltbereich und die
Produktkontrolle in der chemischen Industrie
sind durch die Chromatographie zu heute
selbstverständlichen Möglichkeiten geworden.
• Dementsprechend groß ist die Umsatzmenge an
chromatographischen Produkten auf dem
Weltmarkt (viele Millionen Dollar).
prof. aza
19
Eddy-Diffusion A
• Dieser Term beschreibt den Einfluss der Packung in der
Säule auf die Verbreiterung der Probenzone, allein durch
die mechanischen Widerstände, die die Teilchen der
Packung der mobilen Phase und damit den einzelnen
Probenbestandteilen entgegensetzen.
• Die Analytmoleküle legen zwischen den Teilchen
unterschiedlich lange Wege zurück, so dass sie auch
schon ohne Wechselwirkungen mit der
Teilchenoberfläche zu unterschiedlichen Zeiten aus der
Säule austreten.
• Das bewirkt eine Peakverbreiterung. Die Eddy-Diffusion
ist praktisch unabhängig von der Fließgeschwindigkeit.
prof. aza
20
Eddy-Diffusion
Abb.13. Peakform kurz nach der
Injektion
Abb.14. Peakform nach Passieren
des Säulenbettes
prof. aza
21
Diffusion B
• Mit Diffusion werden die Teilchenbewegungen
beschrieben, die infolge eines
Konzentrationsgefälles auftreten. Dieser
Vorgang findet sowohl in gepackten als auch
ungepackten Säulen statt.
• Durch einen schnellen Fluss der mobilen Phase
kann dieser Einfluss gering gehalten werden, da
es sich um einen zeitabhängigen Prozess
handelt
prof. aza
22
Diffusion
Abb.15. Peakform kurz nach der
Injektion
Abb.16. Peakform nach Passieren
der Säule
prof. aza
23
Stoffaustausch C
• Dieser Term der Van-Deemter-Gleichung beschreibt den
eigentlichen chromatographischen Effekt. Durch die Zahl
und Intensität der Wechselwirkungen der verschiedenen
Probenbestandteile mit der stationären Phase kommt es
zu einer Verzögerung der Bewegung der Stoffteilchen.
Bei geeigneteten Verhältnissen kann so eine
vollständige Peaktrennung erreicht werden. Gegen
diesen Trenneffekt wirken die beiden zuerst
beschriebenen Terme, die zu einer teilweisen
Rückvermischung führen.
• Der Stoffaustausch benötigt eine gewisse Zeit, so dass
geringe Flussraten den Stoffaustausch begünstigen,
aber den gegenläufigen Prozess der Diffusion verstärken
prof. aza
24
Abb.17 Veränderung der Peakform durch
den Stoffaustausch-Prozess
prof. aza
25
Abb.7Technische
Entwicklung der Chromatographie
prof. aza
26
Säulenchromatographie
• Eine Form der technischen Ausführung der
Chromatographie ist die Säulenchromatographie. Den
dazu zählenden Methoden ist gemeinsam, dass die
stationäre Phase in eine Röhre gefüllt ist, durch die die
mobile Phase geführt wird. Die Inhaltsstoffe der Probe
werden bei ihrem Weg durch die Säule aufgetrennt und
verlassen sie nacheinander.
• Die Substanzen werden in der Regel nach dem
Verlassen der Säule detektiert. Dies wird äußeres
Chromatogramm genannt (im Gegensatz z.B.
Dünnschichtchromatographie - inneres
Chromatogramm).
prof. aza
27
prof. aza
Die entscheidenden
Vorgänge, die die Form
und Lage der
Substanzpeaks
bestimmen, sind die durch
den
Strömungswiderstand
entstehenden
Vermischungen, die
Diffusion auf Grund von
Konzentrationsunterschied
en innerhalb einer Phase
und die
Wechselwirkungen
zwischen den beiden
Phasen
28
• Dabei sind die ersten beiden Vorgänge
größtenteils unspezifisch für die eigentliche
Chromatographie. Sie treten in jedem (mit
inertem Material) gefüllten Rohr auf. Die
Wanderungsgeschwindigkeit der
Einzelsubstanzen einer Probe hängt praktisch
ausschließlich von den Wechselwirkungen
zwischen den beiden Phasen ab, die auf den
Vorgängen Adsorption, Verteilung,
Ionenaustausch, Ausschluss oder Affinität
beruhen.
prof. aza
29
Prozesse der Bandenverbreiterung - Die VanDeemter-Gleichung
• Durch die Prozesse der Chromatographie werden
unterschiedliche Stoffe voneinander getrennt. Die
Effizienz der Trennung gehorcht in erster Linie den
Gesetzen der Verteilung (siehe ChromatographieKenngrößen).
• Die Trennung wird aber außerdem von anderen
Prozessen überlagert, die die Peakform und die Effizienz
der Trennung beeinflussen. Diese Prozesse hängen alle
von der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase ab.
Dieser Zusammenhang wird in der so genannten VanDeemter-Gleichung ausgedrückt.
prof. aza
30
Prozesse der Bandenverbreiterung - Die
Van-Deemter-Gleichung
• Durch die Prozesse der Chromatographie werden
unterschiedliche Stoffe voneinander getrennt. Die
Effizienz der Trennung gehorcht in erster Linie den
Gesetzen der Verteilung (siehe ChromatographieKenngrößen).
prof. aza
31
Abb.12Terme der Van-Deemter-Gleichung
prof. aza
32
• Die resultierende H-u-Funktion zeigt ein
Minimum bei einer bestimmten
Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase.
In diesem Minimum ist die Höhe der
theoretischen Böden am kleinsten, die
Anzahl der Böden in einer stets
gleichlangen Säule am größten. In diesem
Minimum sind also die größte Trennstärke
der Säule und die schmalsten Peaks zu
erreichen
prof. aza
33
Eddy-Diffusion A
• Dieser Term beschreibt den Einfluss der Packung in der
Säule auf die Verbreiterung der Probenzone, allein durch
die mechanischen Widerstände, die die Teilchen der
Packung der mobilen Phase und damit den einzelnen
Probenbestandteilen entgegensetzen.
• Die Analytmoleküle legen zwischen den Teilchen
unterschiedlich lange Wege zurück, so dass sie auch
schon ohne Wechselwirkungen mit der
Teilchenoberfläche zu unterschiedlichen Zeiten aus der
Säule austreten. Das bewirkt eine Peakverbreiterung.
Die Eddy-Diffusion ist praktisch unabhängig von der
Fließgeschwindigkeit.
prof. aza
34
Der Chromatograph
• Um die Vorgänge in der chromatographischen
Säule analytisch nutzen zu können, wird ein
Chromatograph benötigt. Er ermöglicht den
Transport der mobilen Phase, das Aufbringen
der Probe und die Detektion der eluierten
Substanzen.
• Mit einem guten Chromatographen soll es
möglich sein, die experimentellen Bedingungen
konstant und reproduzierbar zu halten. Dies ist
Voraussetzung für die Identifikation der
Substanzen und ihre quantitative Erfassung.
prof. aza
35
Abb.21 Prinzip des Chromatographen
• Vorrat an mobiler Phase kontinuierliche Nachlieferung
für konstanten Fluss z.B. Eluentenflasche, Gasflasche
• Fördersystem reproduzierbarer Transport der mobilen
Phase, variabel einstellbar z.B. Kolbenpumpe,
Druckgasflasche
• Probenaufgabe Einbringen der Probe in den
strömenden Fluss der mobilen Phase,
Reproduzierbarkeit ist entscheidend für Quantifizierung
z.B. Eindrehschleife, Injektor, Ventil
• Säule chromatographische Säule und ihre Halterung,
u.U. Thermostatierung, totvolumenarme Anschlüsse
der Fließwege z.B. Kapillarsäule im Säulenofen
• Detektor Umwandlung konzentrationsproportionaler
chemischer oder physikalischer Substanzeigenschaften
in elektrische Signale z.B. UV/VIS-Detektor,
Wärmeleitfähigkeitsdetektor
• Auswerteeinheit Visualisierung der elektrischen Signale
des Detektors, Analogsignal-Ausgabe z.B. Schreiber
Analog/Digitalwandlung und Digitalsignal-Ausgabe z.B.
Integrator, Computer
prof. aza
36
Das Chromatogramm
• Die Substanzen, die von der
chromatographischen Säule eluiert werden,
erzeugen im Detektor elektrische Signale. Bei
entsprechender Visualisierung über Schreiber,
Integrator oder PC beschreiben sie die Form
eines Peaks.
• Der Peak verkörpert die Konzentration der
Komponente in Abhängigkeit von der Zeit.
Zwischen zwei Peaks erzeugt die mobile Phase
das Basisliniensignal.
prof. aza
37
Abb.22. Peaks als Aufzeichnungen des
Messsignalverlaufs in der Chromatographie
prof. aza
38
Abb.23. Ein Chromatogramm
prof. aza
39
Parameter, die aus einem
Chromatogramm erhalten werden:
•
•
•
•
•
Die Brutto-Retentionszeit tR
Die Totzeit t0
Die Netto-Retentionszeit tR '
Verteilungskoeffizient K
Phasenverhältnis β
prof. aza
40
Die Brutto-Retentionszeit tR
• Die Brutto-Retentionszeit tR ist die Zeit, die von
der Probenaufgabe bis zum Erreichen des
Peakmaximums einer Komponente vergeht. Sie
kann eine qualitative Aussage über die
enthaltenen Komponenten liefern. Die
Retentionszeit einer Verbindung ist nämlich
charakteristisch, wenn die chromatographischen
Bedingungen streng konstant gehalten werden.
Dazu werden die vermutete Substanz als
Standard ebenfalls injiziert und die
Retentionszeiten verglichen.
prof. aza
41
Die Totzeit t0
• Die Totzeit t0 ist die Zeit, die eine nichtretardierte
Komponente von der Probenaufgabe bis zum
Erscheinen im Detektor benötigt.
• Sie zeigt, wie lange eine Substanz mindestens in einer
chromatographischen Anlage verweilt, auch wenn sie
keine Wechselwirkungen mit der stationären Phase hat.
• In der Praxis wird angestrebt, diese Zeit so klein wie
möglich zu halten, da der lange Aufenthalt zur
Rückvermischung (Diffusion) der Komponenten führt und
damit zu flacheren Peaks.
prof. aza
42
Die Netto-Retentionszeit tR '
• Die Netto-Retentionszeit tR ' ist die Differenz aus
Bruttoretentions- und Totzeit. Sie zeigt die
Aufenthaltszeit der Komponenten ausschließlich
innerhalb der stationären Phase an.
• tR ' = tR − t0
• Während die Peakbreiten (Peak-Halbwertsbreite w ½ ,
Basispeakbreite w ) der Berechnung von
Chromatographiekenngrößen wie Auflösung und
Bodenzahl dienen, werden Höhe h und Fläche A zum
Quantifizieren der Komponenten benötigt.
prof. aza
43
Kenngrößen zur modellhaften
Beschreibung eines
säulenchromatographischen Systems
• Mathematische Modellgrößen dienen in der
Chromatographie dazu, ein chromatographisches
System zu beschreiben und seine Veränderung zu
erfassen. Außerdem lassen sich verschiedene Anlagen
oder einzelne Säulen über rechnerische Parameter
vergleichen und optimieren. Dabei muss man sich
bewusst sein, dass die meisten Parameter auf Modellen
basieren. Das hat wie bei allen Modellen den Nachteil,
dass sie nur in gewissen Grenzen gelten und nur Teile
der Wirklichkeit beschreiben.
• Andererseits sind sie natürlich wichtige Hilfsmittel, um
diese komplexen Systeme zu erfassen und Einflüsse
und Wirkungen vorhersagen zu können.
prof. aza
44
Die chromatographischen Größen lassen
sich einordnen nach ihrer Funktion:
• zur Charakterisierung eines Stoffes (Analyten) in
einem chromatographischen System
• zur Charakterisierung von zwei getrennten
Analyten in einem chromatographischen System
• zur Charakterisierung einer
chromatographischen Säule
• zur Optimierung einer Trennung
prof. aza
45
Chromatographie-Kenngrößen zur
Charakterisierung eines Stoffes (Analyt)
• Verteilungskoeffizient K
• Phasenverhältnis β
• Kapazitätsfaktor (Retentionsfaktor) k '
prof. aza
46
Verteilungskoeffizient K
• K = cs cm cs - Konzentration des Analyten
in der stationären Phase cm Konzentration des Analyten in der mobilen
Phase Konzentration des Analyten in der
stationären und in der mobilen Phase
• beschreibt den theoretischen
Gleichgewichtszustand
• gleiche Volumina der Phasen
vorausgesetzt
prof. aza
47
Chromatographie-Kenngrößen zur
Charakterisierung eines Stoffes (Analyt)
• Verteilungskoeffizient K
• K = cs cm cs - Konzentration des Analyten in der
stationären Phase cm - Konzentration des
Analyten in der mobilen Phase Konzentration
des Analyten in der stationären und in der
mobilen Phase
• beschreibt den theoretischen
Gleichgewichtszustand
• gleiche Volumina der Phasen vorausgesetzt
prof. aza
48
Phasenverhältnis β
• β = Vm Vs Vm - Volumen der mobilen Phase Vs
- Volumen der stationären Phase
Volumenverhältnis der Phasen
• dient der Korrektur des Verteilungskoeffizienten
• wenn groß, dann ist die Säule relativ
durchgängig und eine große Menge an mobiler
Phase liegt vor
• übliche Werte: 5 bis 35 für die HPLC, 50 -1000
für die GC
prof. aza
49
Kapazitätsfaktor (Retentionsfaktor) k '
• k ' = K β = cs ⋅ Vs cm ⋅ Vm K Verteilungskoeffizient β - Phasenverhältnis cs Konzentration des Analyten in der stationären
Phase cm - Konzentration des Analyten in der
mobilen Phase Vm - Volumen der mobilen
Phase Vs - Volumen der stationären Phase
Wenn die Konzentration c in gL-1 angegeben
wird, ist der Kapazitätsfaktor auch
• (5)
• k ' = mS mm mm - Masse des Analyten in der
mobilen Phase ms - Masse des Analyten in der
stationären Phase
prof. aza
50
Wenn die Konzentration c in molL-1 angegeben wird, ist
der Kapazitätsfaktor auch
• k ' = ns nm nm - Molzahl des Analyten in der
mobilen Phase ns - Molzahl des Analyten in der
stationären Phase Soll der Kapazitätsfaktor
eines Analyten experimentell bestimmt werden,
nutzt man folgenden Zusammenhang:
• k ' = tR ' − t0 t0 tR ' - Nettoretentionszeit t0 Totzeit Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit
in einem chromatographischen System
• ist als Parameter günstiger zu verwenden als die
Nettoretentionszeit, weil unabhängig von
Säulenlänge und Fließgeschwindigkeit
prof. aza
51
Hinweis:
• Die Bestimmung der wahren Nettoretentionszeit
ist in der Realität nicht so einfach möglich, da sie
auf der exakten Bestimmung der Totzeit basiert.
Diese ist aber nur sehr aufwendig bestimmbar
(Chromatographieren einer homologen Reihe,
lineare Regression). In der Praxis verwendet
man Hilfsverbindungen zur Bestimmung der
"experimentellen" Totzeit. Die wahre Totzeit des
Systems ist so nicht zugänglich und ist kleiner
als die experimentelle. Dadurch ist der
Kapazitätsfaktor nur wenig aussagekräftig.
prof. aza
52
Chromatographie-Kenngrößen zur
Charakterisierung von zwei getrennten
Analyten
• Auflösung R
• Selektivitätsfaktor (Trennfaktor) α
prof. aza
53
Auflösung R
• R = 2 (t r 2 − t r 1)/ (w 1 + w 2) = 1,18 (t r 2 − t r
1 )/ (w 0,5 1 + w 0,5 2).
• tR - (Brutto-)Retentionszeit ; w –
Basispeakbreite; w 0,5 - Peakbreite in halber
Höhe Maß für die Fähigkeit des Systems, mit
den gewählten chromatographischen
Bedingungen zwei Analyten zu trennen
• ausreichend ist eine Auflösung größer 1,5 (bei
1,5 überlappen nur noch 0,3 % der Peakflächen)
prof. aza
54
Selektivitätsfaktor (Trennfaktor) α
• α = K 2 K 1 = k 2 ' k 1 ' K - Verteilungskoeffizient
k ' - Kapazitätskoeffizient Maß für die
Trennbarkeit von zwei Analyten
• Je größer die Differenz der
Verteilungskoeffizienten, desto einfacher gelingt
die Trennung.
• Da später eluierter Stoff immer im Quotient oben
steht, ist Selektivitätsfaktor stets größer als eins.
• optimal sind Werte von 1-10
prof. aza
55
Chromatographie-Kenngrößen zur
Charakterisierung einer chromatographischen
Säule
• Bodenzahl N
• Bodenhöhe H
prof. aza
56
Bodenzahl N
• N = 16 tR w 2 = 5,54 tR w 0,5 2 tR - (Brutto)Retentionszeit w - Basispeakbreite w 0,5 - Peakbreite in
halber Höhe abhängig von der Retentionszeit einer
Substanz, also abhängig von der Testsubstanz und dem
Gerät (von Injektion bis Detektion)
• zum Vergleich zweier Säulen nur mit der gleichen
Testsubstanz im selben Gerät geeignet
• übliche Werte: HPLC 1000 - 8000, GC 10 000
• Hinweis: Eine säulenspezifische, nicht
substanzabhängige Trennstufen-(Boden-)zahl erhält
man durch ein aufwendigeres Verfahren
(Chromatographieren einer homologen Reihe, lineare
Regression der Wertepaare Halbwertsbreite und
Retentionszeit).
prof. aza
57
Bodenhöhe H
• H = L N L - Säulenlänge N - Bodenzahl je
kleiner der Wert, umso mehr Böden (mit
resultierender besserer Auflösung)
befinden sich in einer Säule gleicher
Länge
• übliche Werte: HPLC [INVALID] The
content of "number" must match "unit?"
0.1, GC [INVALID] The content of
"number" must match "unit?" 1
prof. aza
58
Chromatographie-Kenngrößen zur Optimierung einer
Trennung
Ziel: kleine Analysenzeit bei ausreichender Trennung !!
gewünschte Änderung
Mittel / Weg
Erhöhung der Bodenzahl N
längere Säule
Verkleinerung der Bodenhöhe H
kleinere Teilchen, Viskosität der
mobilen Phase verringern
Änderung des
Kapazitätskoeffizienten k´ der
Analyten
effektivste Methode,
Temperaturerhöhung in der GC,
Eluentenzusammensetzung in der
HPLC
Einstellen des Selektivitätsfaktors
von zwei Analyten auf Werte
zwischen 1-10 (darf nicht 1 sein,
sonst keine Trennung)
Zusammensetzung der mobilen Phase,
Temperatur (besonders bei Ionen),
stationäre Phase ändern,
chemische Effekte nutzen
prof. aza
59
Zur Abschätzung der Optimierungserfolge geeignete
Beziehungen (für annähernd ähnliche Kapazitätsfaktoren
von zwei Analyten) :
• R neu R vorher = N neu N vorher = tR neu
tR vorher R - Auflösung N - Bodenzahl tR (Brutto-)Retentionszeit Die besten
Trennerfolge sind dann möglich, wenn
man den Selektivitätsfaktor für jedes
Analytenpaar anpassen kann. In der
HPLC nutzt man dazu die
Gradientenelution (Lösungsmittelgradient),
in der GC die Temperaturprogrammierung
(Temperaturgradient).
prof. aza
60