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Grundlagen der Immunologie Geschichtliche Entwicklung • • Antike: Überstandene Pesterkrankung schützt vor Pest Mittelalter: … für Pocken gilt das gleiche – Erste Immunisierungsversuche mit Eiter aus Pocken brachten nicht den gewünschten Erfolg. – 1798: Edward Jenner erkennt, dass überstandene Kuhpocken vor „echten“ Pocken schützen. => erste erfolgreiche „Impfung“ • 1889: Louis Pasteur entdeckt die Entstehung avirulenter Bakterienstämme. – Impfungen mit abgeschwächten Erregern gegen Tollwut, Milzbrand (Vakzination) • Ende 19. Jahrhundert: – Entdeckung der Antikörper (humorale Immunität) – Entdeckung beweglicher Zellen, die Fremdkörper beseitigen (zelluläre Immunität) • 20. Jahrhundert: – Struktur und Wirkungsweise der Antikörper – Komplementsystem ……….... Inge Vonnieda 2 Angeborene Immunität • Unspezifische Immunität – Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, NK-Zellen (Leukozyten) erkennen Mikroorganismen, phagozytieren und zerstören sie. – Komplement (ca. 20 Proteine) kann auf verschiedenen Wegen aktiviert werden. Dies führt zur Markierung oder Lyse der Zelle. Inge Vonnieda 3 Granulozyten • Neutrophile: Phagozytose in intrazelluläre Vesikel, Abtötung der Erreger durch Sekretion von Sauerstoffradikalen u.a. toxische Substanzen • Eosinophile: Abwehr von Parasiten durch toxische Substanzen, Beteiligung bei Allergien • Basophile: Sekretion von Histamin, Heparin und Serotonin und Zytokinen nach Aktivierung - Anlocken weiterer Leukozyten, Entzündngsreaktion Inge Vonnieda 4 Makrophagen, NK-Zellen • Makrophagen, Dendritische Zellen – Phagozytose und Zerlegung der aufgenommene Substanzen in kleine Proteine (Antigene) – Einwanderung in das Lymphsystem und die Lymphknoten – Präsentation der Antigene über MHC-Moleküle – Induktion der spezifischen Immunantwort • NK-Zellen – Spezielle Lymphozyten, die durch direkte Zellzu-Zell-Interaktion Tumorzellen und virusinfizierte Zellen abtöten Inge Vonnieda 5 Komplementsystem • Aktivierung – Klassischer Weg: Antigen-AntikörperKomplexe – MB-Lektin-Weg: mannanbindendes Lektin (normaler Bestandteil im Serum) bindet an eingekapselte Bakterien – Alternativer Weg: direkte Aktivierung an Oberflächen von Mikroorganismen Inge Vonnieda 6 Komplementsystem Inge Vonnieda 7 Komplement - Aktivierung Inge Vonnieda 8 Komplement – terminale Lyse Inge Vonnieda 9 Komplement – Spaltprodukte • Spaltprodukte wirken als Anaphylatoxine Inge Vonnieda 10 Erworbene Immunität • Spezifische Immunität – Lymphozyten • B-Lymphozyten (Antikörperproduktion) • T-Lymphozyten (Zytokinproduktion) – – – – Kontrolle der Antikörperproduktion Immunität gegen virusbefallene Zellen Regulierung der Immunantwort Interaktion mit Phagozyten – Phagozyten (Monozyten, Makrophagen) • Phagozytose von „Eindringlingen“ und Präsentation der Antigene – Antikörper Inge Vonnieda 11 Lymphatische Organe • Primäre lymphatische Organe – Knochenmark – Thymus • Sekundäre lymphatische Organe – Lymphknoten – Milz – Knochenmark Inge Vonnieda 12 Primäre lymphatische Organe • Knochenmark – Aus Stammzellen entwickeln sich Vorläuferzellen der Lymphozyten – Reifung und Prägung der B-Lymphozyten (lebenslang) • Thymus – Aus dem Knochenmark eingewanderte Vorläuferzellen entwickeln sich zu unreifen TLymphozyten – Reifung und Prägung der T-Lymphozyten, Absterben autoaggressiver Lymphozyten (vor allem bis zur Pubertät, danach abnehmend) Inge Vonnieda 13 Sekundäre lymphatische Organe • B-Lymphozyten – Kontakt mit Antigen – Produktion von Antikörpern – Gedächtniszellen • T-Lymphozyten – Nach Antigenkontakt Produktion von Zytokinen zur Unterstützung der B-ZellProliferation Inge Vonnieda 14 Sekundäre lymphatische Organe Inge Vonnieda 15 Antikörper • Proteine der γ-Globulinfraktion => Immunglobuline (Ig) • Mindestens zwei spezifische Bindungsstellen für Antigene • 5 Antikörperklassen (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD) • Bildung durch B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen Inge Vonnieda 16 Grundstruktur der Antikörper • Zwei identische schwere Ketten (H) • Zwei identische leichte Ketten (L) • Disulfidbrücken, die für die Entstehung von Peptidschleifen (Domänen) verantwortlich sind • Konstante Domänen • Variable Domänen (= Antigenbindungsstelle) • Hinge-Region (nicht bei jeder Immunglobulinklasse) • Komplementbindungsstellen (nicht überall) Inge Vonnieda Variabel Fab-Teil Konstant HingeRegion Fc-Teil 17 Struktur der Antikörper • Schwere Ketten (Anzahl konstanter Domänen) – – – – – IgG: IgM: IgA: IgE: IgD: γ-Kette μ-Kette α-Kette ε-Kette δ-Kette (3) (4) (3) (4) (3) • Leichte Ketten – κ-Kette – λ -Kette Inge Vonnieda 18 Immunglobulinklassen – IgG • 80 % aller Immunglobuline • 8 – 18 g/l im Serum, die gleiche Menge im extravasalen Raum • 4 Subklassen (IgG1 – 4) • Komplementbindungsstelle am CH2 bei IgG1, 2, 3 • Bindung an die Fc-Rezeptoren der Makrophagen (IgG1, 3) • Erscheint bei einer primären Immunreaktion nach einigen Tagen IgG1: 65 – 70% IgG2: 20 – 28% IgG3: 4 – 8% Inge Vonnieda IgG4: 2 – 4% 19 Immunglobulinklassen – IgM • Pentamer aus 5 Untereinheiten (manchmal auch Hexamer) • 4 konstante Domänen • J-Kette (joining), die für die Bildung des Pentamers zuständig ist. (ohne J-Kette entstehen Hexamere) • Komplementbindungsstelle • Zuerst produziertes Immunglobulin nach Antigenkontakt Inge Vonnieda 20 Immunglobulinklassen – IgA • Dimer oder Monomer • J-Kette bei Dimeren • Sekretorische Komponente, die erst sekundär an das dimere Molekül bindet und in Sekreten den Transport begünstigt und vor Proteolyse schützt. • Zwei Subklassen: IgA1(Serum) und IgA2 (Sekret) Sekretorische Komponente Inge Vonnieda 21 Immunglobulinklassen – IgD • Im Serum nur in Spuren vorhanden (< 1%) • Rezeptormolekül auf nicht aktivierten BLymphozyten • Funktion unbekannt Inge Vonnieda 22 Immunglobulinklassen – IgE • Monomer mit 4 konstanten Domänen • Im Plasma nur in geringer Konzentration • Bindung mit dem Fc-Teil an Rezeptoren von basophilen Granulozyten und Mastzellen • Bei Allergikern erhöhte IgESpiegel Inge Vonnieda 23 Entstehung der Diversität • Ein Gen – ein Antikörper? – Sehr viele Gene notwendig (mehr als im Genom vorhanden sind) (108 – 109 verschiedene AK) • Große Teile der AK-Moleküle sind in einer Klasse konstant – Zusammensetzen des Moleküls aus verschiedenen Genabschnitten ??? – Zusammenfügen des Gens im Laufe der Reifung der antikörperproduzierenden B-Lymphozyten !!! Inge Vonnieda 24 Entstehung der Diversität • Beispiel: Leichte Kette (Maus) – Während der Reifung werden aus der Keimbahn-DNA Vund J-Segment gekoppelt. C- und L-Segment bleiben noch abgetrennt. – Bildung langer m-RNA und Ausspleißen der nicht benötigten Teile – Abtrennung von L und Translation (Proteinbildung) Inge Vonnieda 25 Entstehung der Diversität • Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (H-Kette, Chromosom 14) – – – – Ca. 50 V-Gene (AA 1 – 95) Ca. 10 – 30 D-Gene (AA 96 – 101) 6 J-Gene (AA 102 – 110) 9 C-Gene für den konstanten Teil (μ, γ1, γ2, γ3, γ4, ε, δ, α1, α2) – L-Gene (leader) vor jedem V-Segment – Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation vor allem der V-Gene Inge Vonnieda 26 Entstehung der Diversität • Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (κ-Kette, Chromosom 2) – – – – Ca. 35 - 40 V-Gene (AA 1 – 95) 5 J-Gene (AA 96 – 110) Cκ-Gen für den konstanten Teil Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation • Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (λ-Kette, Chromosom 22) – – – – Verschiedene V-Gene J-Gene liegen direkt vor den C-Genen Mehrere Gene für den konstanten Teil Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation Inge Vonnieda 27 Klassen-Switch • Reifende B-Lymphozyten produzieren zuerst IgM, später IgG – S-(switch)-Sequenzen steuern die Umlagerung der CGene der mRNA – Antigenbindungsstelle (variable Region) bleibt beim Klassen-Switch erhalten Inge Vonnieda 28 Antigenbindungsstelle • Bestimmt die Spezifität • Zusammengesetzt aus den variablen Regionen der H- und L-Ketten • Hypervariable Regionen bei: (CDR = komplementaritäts determinierende Regionen) – Leichtkette: • AA 26 – 32 • AA 49 – 55 • AA 90 – 95 – Schwere Kette • AA 30 – 35 • AA 49 – 64 • AA 95 - 101 Inge Vonnieda 29 Antigen (aus http://de.wikipedia.org/wiki/Antigen) • Antigene (kurz für Antisomatogene) sind Moleküle, die vom Immunsystem bekämpft werden, weil sie vom Körper als körperfremd erkannt werden. Sie lösen eine Immunreaktion oder Immunantwort aus. Sie heißen Antigene, weil sie die Bildung von spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern hervorrufen können. (Sie haben nichts mit Genen zu tun). • Antigene können aus ganz verschiedenen Molekülen bestehen: Die meisten sind Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und Komplexe aus diesen Molekülklassen. • Auch körpereigene Strukturen können als Antigene wirken, wenn sie fälschlicherweise als fremd angesehen werden. Dadurch wird eine Autoimmunreaktion ausgelöst. • Kleine Moleküle wie einzelne Kohlenhydrate, Amino- oder Fettsäuren können keine Immunreaktion bewirken. • Verschiedene niedermolekulare Stoffe, die alleine keine Antikörperreaktion hervorrufen können, sondern nur, wenn sie an ein Trägerprotein gebunden sind, heißen Haptene. Inge Vonnieda 30 Antigen – Antikörper – Bindung • Ausbildung nicht kovalenter Bindungen zwischen Antigen und Aminosäuren der hypervariablen Regionen des Antikörpers – – – – Wasserstoffbrücken Elektrostatische Anziehung Van-der-Waals-Bindung Hydrophobe Bindung • In der Summe beachtliche Bindungsenergie – Abhängig vom Abstand zwischen den reagierenden Gruppen Inge Vonnieda 31 Antigen – Antikörper – Bindung • Überlappende Elektronenwolken nicht genau passender Antigene erhöhen sehr stark die Abstoßung zwischen Antigen und Antikörper • Schlechte Passform des Antigens vermindert die Anziehungskräfte Inge Vonnieda 32 Antikörperaffinität • Affinität = Kraft einer einzelnen (monovalenten) Antigen-Antikörper-Bindung (Summe aller anziehenden und abstoßenden Kräfte) – Hohe Affinität = hohe Passform – Niedrige Affinität = schlechte Passform Inge Vonnieda 33 Avidität (=funktionelle Affinität) • Multivalente Bindung (mind. 2 Bindungsstellen) erhöht die Stabilität der Bindung – Antigene besitzen i.d.R. viele Bindungsstellen => multivalente Bindung auch mit IgG – Haptene besitzen nur eine antigene Determinante => monovalente Bindung Inge Vonnieda 34 Kreuzreaktivität • Ein Antigen kann verschiedene Determinanten haben. • Verschiedene Antigene können gleiche Determinanten haben. • Ein Antiserum enthält eine Antikörpergemisch aus Antikörpern gegen alle Determinanten eines Antigens. • Ein Antiserum, das durch Immunisierung mit Antigen A gebildet wurde, kann mit Antigen B kreuzreagieren. Inge Vonnieda 35 Antikörperbildung • Bakterium oder Virus o.ä. gelangt in den Körper • Makrophagen nehmen es auf, lysieren es und präsentieren Antigene. • Passende T-Lymphozyten werden aktiviert. • Proliferation passender B-Lymphoyzten zu Plasmazellklonen • Antikörperbildung in Plasmazellen • Gleichzeitig Bildung von Gedächtniszellen Inge Vonnieda 36 Polyklonale Antikörper • Antiserum stammt aus Mensch oder Tier • Werden nach Immunisierung aus verschiedenen Plasmazellklonen gebildet • Verschiedene Antikörper (Mischung) – gegen verschiedene Determinanten des Antigens – mit unterschiedlicher Affinität zum Antigen – Kreuzreaktionen möglich Inge Vonnieda 37 Monoklonale Antikörper • Nach Immunisierung werden Plasmazellen eines Versuchstiers (Maus) mit Myelomzellen fusioniert. • Anlegen von Zellkulturen (Zellklone) einzelner Hybridzellen, die die gewünschten Antikörper produzieren. • Trennung und weitere Zellkultur der gewünschten Hybridzellen => Zellklone, die monoklonale Antikörper produzieren • Groß angelegte Produktion monoklonaler Antikörper möglich Inge Vonnieda 38 Monoklonale Antikörper • Alle Antikörper haben – gleiche Spezifität. – gleiche Affinität – gleiche Avidität • Chimärenbildung möglich • Einsatzgebiete in Diagnostik und Therapie Inge Vonnieda 39 Designer-Antikörper • Chimäre Maus-Mensch-Antikörper – Murine V-Domänen und human C-Domänen => geringere Antigenität beim Mensch, Anwendung in vivo möglich • Übertragung der hypervariablen Domänen von einer Spezies in die Grundgerüst-Regionen der VDomänen einer anderen Spezies • Änderunge einzelner Aminosäuren der Bindungsstelle zur Erhöhung der Affinität Aus: http://www.i-s-b.org/wissen/broschuere/produkt/monoklon.htm Inge Vonnieda 40 Grundlagen der Immunologie Methoden Heidelberger Kurve • AG-Überschuss – lösliche Immunkomplexe – proportional zur AKKonzentration • Äquivalenzbereich – unlösliche Immunkomplexe – Immunkomplexe können sichtbar gemacht werden • AK-Überschuss – lösliche Immunkomplexe – proportional zur AGKonzentration Inge Vonnieda 42 Präzipitation, Agglutination • Präzipitation – Ein molekulares AG wird bei bekannter AK-Konzentration durch Diffusion (meist Gel) so verdünnt, dass sich Präzipitate bilden (Äquivalenzbereich). • Agglutination – Großes Antigen (Erythrozyten, Bakterien, Latexpartikel) – Sichtbare Agglutination – Mit Antigen oder Antikörper beschichtete Latexpartikel möglich. (z.B. Tinaquant®) Inge Vonnieda 43 Turbidimetrie, Nephelometrie • Turbidimetrie – Die Trübungsänderung einer Lösung, die durch Immunkomplexbildung entsteht, wird photometrisch gemessen. • Nephelometrie – Das Streulicht, das durch Immunkomplexbildung entsteht, wird gemessen. Inge Vonnieda 44 Immunelektrophorese • Eiweiß-Elektrophorese • Antiserum mit AK gegen alle Eiweißfraktionen diffundiert senkrecht zur Trennrichtung • Bildung scharfer Präzipitationslinien im Äquivalenzbereich Inge Vonnieda 45 Durchflusszytometrie (FACS) • Fluoreszenzmarkierte Antikörper werden an Zellen (z.B. Lymphozyten) gebunden. • Die Zellen werden in einer Durchflusszelle (Kapillare) von einem Laser erfasst. • Fotodetektoren erfassen Vorwärtsund Seitwärtsstreulicht und Fluoreszenz. Inge Vonnieda 46 Durchflusszytometrie (FACS) • Durch verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe sind parallel mehrere Antigene (Zellpopulationen) nachweisbar. Inge Vonnieda 47 Anti-Immunglobulin-Antikörper • Immunglobuline sind für andere Spezies immunogen • Die gebildeten Antikörper erkennen konservierte Merkmale der Immunglobuline (z.B. Fc-Teil des IgG) • Verschiedene Einsatzmöglichkeiten – Coombstest in der Blutgruppenserologie (direkt, indirekt) – Westernblot – Immunoassay (z.B. ELISA) Inge Vonnieda 48 Coombstest • Direkt – Antikörper der Mutter gehen durch die Plazenta und binden an kindliche Erythrozyten. (direkte Agglutination nicht möglich) – Durch Zugabe eines Anti-HumanGlobulins werden die Erythrozyten agglutiniert. • Indirekt – Im Serum der Mutter sind Antikörper, die mit Rhesuspositiven Erythrozyten inkubiert werden – Beladung der Erys mit AK – Zugabe von AHG – Agglutination Inge Vonnieda 49 Western Blot • Zerlegung der Proteine, z.B. Viren durch SDS-PAGE SDS = Natriumdodecylsulfat PAGE = Polyacrylamidelektrophorese • Übertragen der Proteine auf Nitrocellulose und Markierung der gewünschten Proteine durch Antikörper • Nachweis der AK-Bindung durch enzymgekoppelte Antikörper Inge Vonnieda 50 Immunoassay • Nachweis von AG oder AK mit Hilfe des markierten Reaktionspartners. – Enzyme (die meisten klinischchemischen immunologischen Untersuchungen) (ELISA) – Fluoreszenz (z.B. an Gewebeschnitten, Durchflusszytometrie) ( – Radioaktivität (nur noch selten angewandt) – Licht (bei Elecsys) Inge Vonnieda 51 Immunoassay • Homogen – AG-AK-Reaktion und Messung läuft in flüssiger Phase ab. – Keine Waschschritte notwendig – Marker meist Einzym – Antikörperbindung inhibiert oder stimuliert die Enzymaktivität Inge Vonnieda 52 Immunoassay • Heterogen – Ein Reaktionspartner ist an eine Festphase gebunden (Röhrchen, Mikrotiterplatten, Mikropartikel) – Unterschiedliche Marker möglich: • • • • Radioaktive Isotope: Radio-Immunoassay RIA Enzyme: Enzym linked immunosorbent assay ELISA Fluorogene: Fluoreszenz Immunoassay FIA Luminogene: Lumineszenz Immunoassay LIA Inge Vonnieda 53 Immunoassay • Heterogen – Sandwichtest • Bindung eines hochmolekularen Moleküls an die Festphase und den markierten Reaktionspartner • Auswaschen der nicht gebundenen, markierten Moleküle • Nachweis des gebundenen Labels • Sehr hohe Sensitivität Inge Vonnieda 54 Immunoassay • Heterogen – Kompetitiv • Geeignet für kleine Moleküle (AG), die nur einen AK binden können. • Die AG aus der Probe konkurrieren mit zugegebenen AG (evtl. markiert) um den AK (evtl. markiert) • Nach Waschen Nachweis des gebundenen Labels • Hohe Sensitivität Inge Vonnieda 55 ECL-Technologie • Elektro-Chemi-Lumineszenz – Universelle Festphase: paramagnetischer, mit Streptavidin beschichteter Mikropartikel – Je nach Test können Biotin-beschichtete Antigene oder Antikörper verwendet werden, die über Biotin an Streptavidin binden. – Zum Nachweis dienen Ruthenium-Komplex-markierte Antigene oder Antikörper. Inge Vonnieda 56 ECL-Technologie • Nachweis eines Antigens – Bindung von Biotin-markiertem AK und Ruthenium-markiertem AK an das AG – Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln – Messung Inge Vonnieda 57 ECL-Technologie • Nachweis eines Antikörpers – Bindung von Biotin-markiertem AG und Ruthenium-markiertem AG an den AK – Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln – Messung Inge Vonnieda 58 ECL-Technologie • Nachweis von IgM-AK – IgG_AK aus der probe werden durch Fab-Fragment (AGBindungsstellen) gegen γ–Ketten blockiert. – Ruthenium-markiertes Antigen regiert mit dem IgM-AK. – Biotin-markiertes Anti-IgM bindet an Streptavidin – Anti-IgM ´bindet an IgM, das das markierte AG gebunden hat. – Messung Inge Vonnieda 59
