Grün-fluoreszierende Protein
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Biochemisches Praktikum für Biologen Institut für Biochemie Peter Friedhoff Organisationsstufen in der Zelle Bestandteile einer E. coli Zelle Bestandteile einer E. coli Zelle Proteinaufreinigung Funktion bekannt – Protein unbekannt Welches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich? Protein bekannt – Funktion unbekannt Welche Funktion hat ein bestimmtes Protein? Aufreinigung von Proteinen Proteineigenschaften Verfahren Stabilität Zellaufschluß Löslichkeit Pufferbedingungen Ladung Zentrifugation Hydrophobizität Fällung Größe/Form/Masse Dialyse spezifische Interaktionen Säulenchromatographie (Affinität) Charakterisierung von Proteinen Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur) Aufreinigungsprotokoll von Proteinen Voet Biochemistry 3e Page 142 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase Zentrifugation Dialyse Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch (z.B. Mr < 5000) Makromoleküle werden zurückgehalten Anwendung: Pufferwechsel Säulenchromatographie Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase. Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsgeschwindigkeit der gelösten Teilchen. Ionenaustauschchromatographie Kationenaustausch stationäre Phase Anion z.B. MonoS (-CH2SO3-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation Anionenaustausch stationäre Phase Kation z.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie Affinitätschromatographie Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase) Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition) Affinitätschromatographie Affinitäts-tag Matrix Antigen Antikörper (immobiliert) 6His (His6-tag) Ni-NTA Strep-tag II (Peptid) Streptactin (StreptavidinDerivat) Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix Glucose-Bindungsprotein GlucoseBindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose Elution durch (freie) Glucose, die GlucoseBindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution) Ni-NTA-Affinitätschromatographie Komplex aus His und Ni2+-NTA Protein mit HistinAffinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+Ionen Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert. Charakterisierung von Proteinen Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur) SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) Schematische Darstellung einer ProteinAufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese 2-D Gelelektrophorese Western-Blotting Voet Biochemistry 3e Page 148 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Western-Blotting Voet Biochemistry 3e Page 172 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie Massenspektrometrie exakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie SDS-Gel oder 2D-Gel Bande/Spot ausschneiden Tryptischer Verdau der Proteine Bestimmung der Peptidmassen Peptid-Fingerabdruck Datenbanksuche nach Proteinen mit identischem Peptid-Fingerabdruck Protein-Sequenzierung Edman-Abbau Affinitätschromatographie/ Elektrophorese Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz Analyse der Aufreinigung mittels SDSGelelektrophorese Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand Grün-fluoreszierendes Protein (GFP) Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn Energie des Ca2+aktivierten Photoproteins Aequorin auf das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) übertragen wird GFP-Chromophor Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt Voet Biochemistry 3e Page 119 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. In vivo Fluoreszenz mittels GFP
