Fetale_cells_DNA_in_mat_Blood_2009

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Fetale Zellen im maternalen Blut
Bernd Eiben
Institut für Labormedizin und Klinische Genetik Rhein Ruhr
im Laborverbund wagnerstibbe
45127 Essen
© eibenglaubitz 2008
Eine exakte pränatale Diagnostik setzt gegenwärtig einen
invasive Eingriff voraus.
CVS oder Amniocentese
Abortrisiko hierdurch ca. 1%
==> alternativ: fetale Anteile in der mütterlichen Zirkulation
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Suche nach fetalen Zelle in der maternalen Zirkulation
Trophoblastzellen
4 Ansätze
fetale Leukozyten
fetale Erythroblasten
fetale DNA
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erste Hinweise auf fetale Zellen
1893 durch Georg Schmorl:
fand Trophoblastzellen in der Lunge von Patientinnen,
die an Präeklampsie verstorben waren
Untersuchung mittels histologischer Methoden
100.000 Zellen/d
Schmorl, G. (1893) Pathogisch-anatomische Untersuchungen über
Publeraleklampsie. Vogel, Leipzig.
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Trophoblastzellen in der mat. Zirkulation
Trophoblastzellen wurden 1994 erstmals zur
Diagnostik einer Häminoglobinopathie verwendet.
Hawes et al. (1994): An N Y Acad Sci 173: 181-185
Zellen werden aber in der Lunge absorbiert
Plazenta weist viele Mosaike auf
sind mehrkernig
==> kein Aneuploidieuntersuchung
Trophoblastzellen ungeeignet
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fetale Lymphozyten im maternalen Blut
seit Ende 1960er Jahre Untersuchung der fet. Lymphozyten
Untersuchung mittels zytogenetischer Methoden
Lymphos sind leichter anzureichern und zu kultivieren
aber: die fetale Lymphocytenproduktion startet erst ab der ca. 20. SSW.
 schlechte Ausgangssituation für eine frühe Diagnostik.
aber: absolutes Überwiegen mütterlicher Leukocyten
extreme Selektionsschwierigkeiten zwischen fetalen und
maternalen Zellen
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fetale Lymphozyten im maternalen Blut
Untersuchungen von Bianchi et al. (1996) zeigten, dass männliche
fetale T-Lymphocyten (CD 3+; CD 4+) nach 27 Jahren im Blut einer
Frau gefunden wurden, die einen Jungen geboren hatte.
==> Lymphozyten sind nicht geeignet
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
Vorteile:
Im 1. Trimenon stellen kernhaltige rote Blutzellen den größten Teil der
kernhaltigen Zellen des Feten dar
==> können in die maternale Zirkulation übertragen werden
kernhaltige rote Blutzellen fehlen im Blut von Erwachsenen bzw.
sind äußerst selten
==> bessere Detektionschance
haben eine Lebensdauer von nur ca. 90 d
==> können damit nicht aus einer vorherigen Schwangerschaft
stammen.
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
fetale Erythroblasten : mononukleär
geeignete Oberflächenantigene
Vorteile:
gesamtes fetale Genom ohne maternale Kontaminationen
==> Mögliche Diagnostik von Punktmutationen
Vorliegen einer einzelnen fetalen Zelle
==> mögliche FiSH Untersuchung
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
Untersuchung der fetalen Erythroblasten
über FiSH
Bianchi et al. (1992): Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal
peripheral blood. Hum Genet 90: 368- 370
Valerio, D., Altieri, V., Cavallo, D., Aiello, R. and Antonucci, F.A. (2000) Detection of fetal
trisomy 18 by short-term culture of maternal peripheral blood. Am. J. Obstet. Gynecol.,
183, 222±225.
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
Analytische Betrachtung
sehr hoher methodischer Aufwand
große Kontaminationsgefahr mit maternalen Zellen
Allel drop out (Fehlanalyse durch „nicht Amplifikation“
einzelner Loci bei Einzelzellanalysen)
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
große NIFTY Studie (National Institute of Child Health and
Developement Fetal Cell Isolation Study)
3000 klinische Fälle wurden in 5 Zentren mittels MACS oder
FACS untersucht
==> fetale Zellen konnten nur mit eine Sensitivität von 50%
entdeckt werden
Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615
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fetale Erythroblasten im maternalen Blut
NIFTY Studie der NIH zeigte deutlich, dass die
Anreicherung und Diagnostik aus
zirkulierenden fetalen Zellen mit den
gegenwärtigen Techniken nicht praktikabel ist!
Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615
==> fetale DNA im maternalen Blut
Lo et al. (1997): Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.
Lancet 12: 1904- 1904
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fetale DNA im maternalen Blut
Herkunft der cell free fetal DNA: Adoptosis von Trophoblastzellen
Bischoff et al. (2005). Hum Repro Update 11: 59- 67
Kann schon 7 Wochen post conceptionem analysiert werden
3- 5% der freien DNA im maternalen Blut ist fetaler Herkunft
1. Präparation über Qiagen Säulen
Cell free fetal DNA (cff DNA) ist kürzer als
free maternal DNA (cfm DNA):
99% cff DNA < 313 bp: Hauptanteil bei </= 145 bp
2. Präparation über Gel Elektrophorese (MG)
3. (Unterscheidung über unterschiedliche Methylierung)
cff DNA wird sehr schnell pp vollständig abgebaut
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fetale DNA im maternalen Blut
Aneuploidiediagnostik
1) Der relative DNA Anteil eines jeden Chromosoms in der freien DNA müsste
grundsätzlich gleich sein.
Messung einzelner Chrom. 21 Marker und Vergleich zu Referenzmarkern anderer
Chromosomen: Relative Chromosomen Dosis ROD
ROD Verhältnis 2:2 = Euploid/ Verhältnis 3:2 = Aneuploid
2) Untersuchung chromosomenspezifischer Polymorphismen bei Vater & Mutter
Allel Verhältnis (Allel Ratio AR)
Bei
euploidem Fetus Heterozygot
==> AR 1:1
bei
aneuploidem Fetus
==> AR 2:1
Analysen mit hoher Sicherheit können mit nur mit
multi copy Sequenzen vom Y Chromosom
erfolgen!!!!!
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fetale DNA im maternalen Blut
bei Präeklampsie
■ Schwangere, die eine Präeklampsie entwickeln, haben bereits
Wochen vor Erkrankungsbeginn eine erhöhte Konzentration von
fetalen Zellen und fetaler freier DNA im Blut.
Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S.: Circulatory fetal and maternal DNA in pregnancies at risk and those
affected by preeclampsia. Ann N Y Acad Sci 2001; 945: 138–140.
■ 5 fach höhere cffDNA bei Schwangeren mit Präeklampsie
Lo et al.: Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in PET. Clin chem 1999; 45; 184- 188
■ je höher die cffDNA Konzentration ist, desto schwerer der
Krankheitsverlauf
Schwinkel et al.: Hemolysis, elevated live enzymes and low platele count (HELLP) syndrome as a
complication of PET...Clin Chem 2002; 48; 650-653
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fetale DNA im maternalen Blut
Mögliche sichere diagnostische Möglichkeiten:
==> fetales Geschlecht
sinnvoll? Ethisch problematisch
==> fetaler Rhesusfaktor bei rh neg. Schwangeren
17% der Deutschen sind Rhesus D negativ
0,4% unvollständige D Ausprägung
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fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren
Deletion des Rh-D-Gens ist die häufigste Form bei Rhesus-D-negativen
Europäerinnen.
Aber: Mehrheit der Rh-D-negativen afrikanischen Patientinnen tragen ein
Pseudogen (RHDy) oder ein (C)cdes-Allel.
In beiden Allelen sind Rh-D-spezifische Sequenzen vorhanden. Aufgrund der
Anwesenheit eines Stop-Codons (RHDy) oder des Ersatzes der Rh- Dspezifischen Sequenzen bei Rh-CE-spezifischen Sequenzen ([C]cdes) keine
D-Epitope auf den Erythrozyten feststellbar.
==> Sonderformen müssen mitberücksichtigt werden
Molekülgrösse fetaler DNS von <300 bp zu beachten
Sensitivität von >99% erforderlich
Wegen unterschiedlichen Varianten des Rh-D-Genes ist eine
«Multiplex»-PCR notwendig, in welcher verschiedene
Regionen des Rhesus-D-Genes amplifiziert werden.
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fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren
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fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren
Annahme: Rhesus Typisierung direkt nach Geburt
96,7%: anti-RhD Prophylaxe nur bei pränatalem Nachweis Rh D pos.
99,7%: anti-RhD Prophylaxe bei pränat. Nachweis Rh pos., unbestimmt &
Rh. Varianten
Risiko einer Alloimmunisierung
bei anti-RhD Prophylaxe post Partum: ca. 1%
bei anti-RhD Prophylaxe pP & pränatal: 0,3%
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fetale DNA im maternalen Blut
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Fetale Zellen/ DNA in der maternalen Zirkulation
Fazit
Die meisten Anwendungshoffnungen haben sich nicht erfüllt!
Realisierbar sind gegenwärtig die Bestimmung Marker wie Rhesus
oder y Chromosom Anteile, die bei der ggf. Mutter nicht vorhanden
sind!
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