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3´
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P
5´
5´
In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix
mit zwei antiparallelen Ketten
Das Rückgrat jeder Kette ist der
Phosphate (P)-----Desoxyribose (D-R) -Strang
Die Basen sind wie Rippen an diesem
Rückgrat angeordnet, und jeweils an die
Desoxyribosen gebunden
Die beiden Stränge sind antiparallel angeordnet
5´
3´
3´
5´
Die beiden Stränge treten entlangen der Basen
zusammen und werden zusammengehalten
durch
(i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
(ii) hydrophobe Wechselwirkungen
A und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-Brücken
G und C bilden ein Basenpaar mit 3 H-Brücken
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung
(i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
(ii) hydrophobe Wechselwirkungen
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung
(i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung
(i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
0.27-0.31 nm
biologisch releveant
12 - 29 kJ/mol
5´
3´
Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung
die beiden DNA-Stränge treten entlang
der Basen zusammen und werden zusammengehalten durch
(i) Wasserstoffbrücken-Bindungen
(ii) hydrophobe Wechselwirkungen
die Basen auf den gegenüberliegenden Strängen
stehen sich exakt gegenüber
A und T ein Basenpaar mit 2 H-Brücken
G und C ein Basenpaar mit 3 H-Brücken
die Basen sind planar gebaut > Stapelung
der Basenpaare in der Doppelhelix
(´base stacking´)
H-Brücken
3´
5´
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
G=C
A=T
A+G = T+C
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Bei de r doppe lst rängig en DNA einer Zell e ist der An teil an dGMP etwas 20 %.
Etwa wie hoch ist der An teil an dAMP (nach der Chargaff-Regel)?
(A)
20 %
(B)
30 %
(C)
40 %
(D)
60 %
(E)
80 %
Strukturprinzip der
Doppelhelix
3'
5'
T
A
G
C
G
T
3'
das Desoxyribose-PhosphatRückgrat bildet eine
Helix-Struktur aus
die Basen sind zum Innern
der Helix gekehrt und die
Desoxyribose/PhosphatReste liegen an der Außenseite
A
T
C
G
C
A
die Ringebenen der Basen
stehen senkrecht zur Helixachse
die Zucker stehen fast im
rechten Winkel zur Base
die genetische Information
liegt in der Abfolge der
Basenpaare TAGCGT
5'
Leiter-Modell
Ribbon-Modell
Raumfüllendes Kalottenmodell
1. Strang (5´)
2. Strang (3´)
große Furche
kleine Furche
DNA-bindende Proteine können spezifisch
an die DNA binden. Dabei lagern sich die Proteine
rote Linien verbinden die Phosphat-Reste
in die große bzw. kleine Furche ein und bekommen
dadurch Zugang zu den Basen. Dadurch ist die
Erkennung einer spezifischen Basenabfolge möglich
(z. B. Transkriptionsfaktoren, Restriktionsenzyme)
Rechtsläufige Doppelhelix
Entspricht 99% der zellulären DNA
GCGCGCGC Abfolge
Zick-Zack Verlauf des
Phosphodiester-Bandes
Entsteht bei drastischer Abnahme
des Wassergehalts
Rechtsläufige Doppelhelix
Basenpaare nicht senkrecht wie bei
B-Form, sondern um 70° gekippt
Offener Raum im Molekülinneren
Linksläufige Doppelhelix
Zusammenfassung der DNA Struktur
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1953 haben Watson & Crick die
drei-dimensionale Struktur der
DNA -Doppelhelix aufgeklärt und
sofort den Mechanismus der
DNA-Replikation vorhergesagt
wichtig ist, daß die genetische Information
(= Abfolge der Basensequenz in der DNA-Kette)
während der Zellteilung exakt von der Mutterzelle
auf die Tochterzelle übertragen wird
Fehler können sich kastastrophal auf die Lebensfähigkeit
der Zelle auswirken, oder Krebs entstehen lassen
bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der
doppelsträngigen DNA als Matritze
bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze
5'
Met
Gln Asp Ser Sto p
A T G C A AG A T A G C T A A
T A C G T T C T A T C GA T T
3'
3'
Sinnstran g
5'
1. Replikation der DN
5'
3'
A
op
t
S
Se r
p
As
AA
n
T
l
G
C
G AT T
A
T
Met
A T CG
G
A
CA TC T A
G
T
A C GT
TA
3'
Mutterzell e
5'
Fehler bei der Verdopplun g
ATG
T statt C
T AC T AAG
GT T A T A
C T A G CT
T CG A A
3'
AT
T
Tochterzell e
5'
5'
3'
5'
3'
t op
er S
S
sp
T A AT
ln A
G
C
G
t
A
T
Me
G A TA T C GA
A
A
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C
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3'
Mutterzell e
5'
Fehler bei der Verdopplun g
AT
T statt C
T A CG T A AG
GT T A T A
C T A G CT
T CG A A
3'
ATT
Tochterzell e
5'
5'
Replikation der DNA de
Tochterzell e
5'
3'
r
3'
Sinnstran g
op
T A AT
t
C
S
G
5'
Met
A T AT C GA T
G
A
T A TCT A
G
T
A C AT
Manifestation der Mutation (T::A) i
TA
einem der beiden Stränge der 2
Met
Generatio n
Gln
Asp
ATG
C
Ser
T AC AAG
St op
GT T A T A
C T A G CT
T CG A A
3'
AT T
5'
n
.
5'
3'
A T G C A AG A T A G C T A A
T A C G T T C T A T C GA T T
3'
5'
Reißverschlußartige
Identische Trennung
der beiden Elternstränge
Verdopplung
entlang der Basenpaare
=
5'
3'
Elternstrang 1
Elternstrang 2
AA
T
C
G AT T
A
T
Brechen der H-Brücken
A T CG
G
A
CA T C T A
G
T
A C GT
TA
AT G
T A C T A AG
GT T A T A
CT A GCT
T CG A A
AT T
ang 1
r
t
s
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Elt er
a
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t
t e rs
Toch
5'
3
Toch '
t ers
t ra
Elt er
nst ra ng 2
ng 2
5'
A1 A2
A1 A2
Semi-konservative
DNA-Verdopplung
Parentale DNAwurde durch Watson & Crick (1953) vorhergesagt,
Doppelhelix
aber erst durch ein klassisches Experiment (1959) bewiesen von
Meselson & Stahl
A1 A2 N1 N2
N1 A1 A2 N2
Konservative
Replikation
Semi-Konservative
Replikation
DNA-Moleküle
nach einer
Runde der
Replikation
Der semi-konservative Replikationsmechanismus
wurde zunächst für E. coli gezeigt, und später für alle
Organismen einschließlich Homo sapiens bewiesen
Verfüttern von
15N-Stickstoff
Nährmedium
an E. coli
„Leichte DNA“
E. coli
DNA enthält normalen = leichten
14N-Stickstoff
14
DNA enthält jetzt ausschließlich
schweren 15N-Stickstoff
14
14
14
„Schwere DNA“
14
14
Rückführung der Bakterien in
14N-Stickstoff-Nährmedium
für eine Verdopplungszeit von 20 min
Anschließende Analyse der DNA
ob schwer, leicht oder Hybrid
durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation
Mögliche Ergebnisse
konservativ
Experimentelle Befunde
(Meselson & Stahl, 1958)
Semi-konservativ
Wachstum in 15N-Medium
Schwere DNA
(schwer = S)
S-S
S-S
S-S
1. Verdopplung
mit 14N-Stickstoff
(leicht = L)
S-S L-L
S-L
S- L S- L
L-L
2. Verdopplung
mit 14N-Stickstoff
(leicht = L)
S-S L-L L-L L-L
S- L L-L S- L L-L
S-L
Analyse der DNA
ob schwer, leicht oder Hybrid
durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation
Das Beweis-Experiment, daß auch eukaryontische DNA semi-konservativ
repliziert wird
Dazu wurden Wurzelzellen mit [3H]-Thymidin (radioaktiver Wasserstoff!)
durchmarkiert, isoliert und anschließend autoradiographisch untersucht
Röntgen-Film mit AgBr-Emulsion
eObjektträger
Radioaktiv-markiert Probe
(z. B. [3H]-Thymidin-markiertes Chromosom)
beim b-Zerfall des Tritiums werden
Elektronen frei, die den Röntgenfilm an
den Stellen schwärzen (Ag-Körner), an denen
die Chromosomen auf dem Film aufliegen.
Genauigkeit der Lokalisierung: ca. 0.5 - 1.0 mm
…….semi-konservative Replikation von eukaryontischer DNA in Wurzelzellen
A1 A2
A1 N1 A2 N2
DNA-Replikation
in nicht-radioaktivem
Medium
Teilung
DNA-Synthese in
radioaktivem Medium
[3H]-Thymidin
2n
Autoradiographie-Bild
beide SchwesterChromatide
sind markiert
1n
2n
Autoradiographie-Bild
nur ein SchwesterChromatid
ist markiert
Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional
Replikationsgabel
• Die Replikation der DNA erfolgt nicht spontan,
sondern wird durch Enzyme (DNA-Polymerasen)
katalysiert
• Grundsätzlich gilt, daß die DNA-Polymerasen die
Replikation nicht an jeder beliebigen Stelle der
DNA initiieren, sondern nur am ReplikationsStartpunkt = “Origin“
• am häufigsten findet man, daß die Replikation am Origin beginnt und
sich von dort bi-direktional forstsetzt
• dadurch entstehen 2 Replikationsgabeln
linke Wachstumsgabel
•
Wachstum in
beide Richtungen
rechte Wachstumsgabel
bei ringförmiger DNA (z. B. E. coli) genügt meist ein Origin. Die beiden dort
entstehenden Replikationsgabeln verschmelzen schließlich auf der
gegenüberliegendenen Seite des Origins nach erfolgter Replikation
Ende der Replikation
•
die langen, linearen eukaryontischen Chromosomen (= lineare DNA)
haben viele DNA-Replikations-Startpunkte (vermutlich einige tausende bis
zehntausende Origins beim Menschen)
•
die bi-direktionalen Replikationsgabeln bewegen sich aufeinander zu,
solange bis sich benachbarte Startpunkte begegnen
•
durch das Vorhandensein von vielen Replikons (ReplikationsStartstellen) schafft es die eukaryontische Zelle die ca. 1000-fach größere
DNA (vgl. E. coli > Mensch) in der erforderlichen Zeit zu replizieren
•
•
Der Nachweis der bi-direktionalen DNA-Replikation wurde durch
Autoradiographie von radioaktiv markierter DNA, die aus Säugerzellen isoliert
wurde, erbracht.
Markierung der DNA erfolgte mit [3H]-Thymidin, zunächst von niedriger
Radioaktivität.Nach Beginn der Replikation wurde die Menge an
radioaktivem [3H]-Thymidin erhöht. Anschließend wurden die
Chromsomen autoradiographiert.
Autoradiogramm
e-
Ori 1
hohe niedrige hohe
Radioaktivität
[3H]-markierte DNA
Ori 2
hohe niedrige hohe
Radioaktivität
Sichtbarmachen von Replikationsblasen
1n DNA
Replikationsblase
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•
2n DNA
Replikationsgabel
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von sich replizierender DNA aus
Drosophila-Zellen, die sich rasch teilen (= aktive DNA-Replikation). Die
Pfeile zeigen Replikationsblasen, in denen bi-direktionale Replikation
stattfindet.
Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln
•
Zellen werden unterschiedlich lang mit [3H]-Thymidin markiert,
bevor die DNA isoliert und autoradiographisch analysiert wird
•
durch die Länge der Schwärzung auf dem Röntgenfilm kann
die Geschwindigkeit, mit der sich die Replikationsgabel entlang der
DNA bewegt, bestimmt werden
hohe
niedrige hohe
Radioaktivität
OriC
t1
t2
t3
Länge der radioaktiv markierten DNA (mm)
in Abhängigkeit der Replikationsdauer
Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln
Länge der DNA auf dem Autoradiogramm
proportional zur Anzahl der replizierten Basenpaare
> Bestimmung der Replikationsgeschwindigkeit
= 1000 BP/sec/Gabel bei E.coli
Kleine Rechnung
bei E. coli dauert die Replikation 20 min
(Genomgröße = 3 x 106 BP)
bei 2 Replikationsgabeln mit einer V = 1000 BP/sec
stimmen theoretischer und errechneter Wert überein
1200 sec x 1000 BP = 1.2 x 106 BP
bei 2 Gabeln: 2.4 x 106 BP
Homo sapiens ~ 100 BP/sec/Gabel
(Autoradiographie)
 bei 3 x 109 BP/Genom benötigt man ca.
1000 Replikationsgabeln für die
Replikation des gesamten Genoms (in ca.10 hr)
Wie funktioniert der einzige “Origin of
Replication“ in E. coli?
OriC
DnaA
( ATPase)
Erkennung
leichtes „Schmelzen“
der DNA
30°C
DnaB = Helikase
DnaC
ATP
Startkomplex
Offener
Komplex
„Prä-Priming“
Komplex
Replikation
- Primase
- DNA-Polymerase