Power-Point-Präsentation
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Gelelektrophorese am Isas SDS-Page 2D SDS-PAGE • Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese • Kontinuierliche PAGE • Diskontinuierliche PAGE • Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße 2D -PAGE • Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern • Auch orthogonale Seperation • 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen Punkt • 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen Trennverfahren Nachweißgrenze Molekülmasse Cells Proteine Peptide Aminosäuren Trennungskapazität Arbeitsschema für 2D-PAGE 1. Dimension ‚Probenbehälter‘ pH 3.0 IPG-strip pH 10.0 Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt + - 1. Dimension IPG-Strips: • Im Handel erhältliche Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pHgradient (pH 3-10 ) • Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung) • Rehydratisierung ist nötig • Für 24 cm Streifen sind 450 µL nötig • Mischung aus – – – – – 8M Harnstoff 2M Thioharnstoff 2% CHAPS 0.002% Bromphenol blau 2% IPG-Puffer Isoelektrische Fokusierung • Assembly of IEF-System – Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter) – Elektroden an das Gel anschließen – Proben aufs Gel/Streifen geben – Streifen mit Öl abdecken – Ungefähre Laufzeit 20h !!!! Vorbereitung für 2 Dimension • • • • Re-puffering von IPG-Streifen Reduktion and Alkylierung Schritt Streifen auf 2 Gel packen und laden Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass Streifen gut aufliegt 2. Dimension • Ungefähre Laufzeit 4h Färbung • Colloidal Coomassie (G-250) – 34% Methanol – 2% Phosphorsäure – 17% Ammoniumsulfat – 0,066% Coomassie • Silber Färbung
