Elektrophorese

Elektrophorese
1. Gelelektrophorese
nativ
denaturierend
2. Elektroelution
3. Western-Blot
4. Kapillarelektrophorese
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Elektrophorese - Historie I
Arne Tiselius: 30er Jahre des 20. Jahrhunderts
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Trennung von menschlichem Serum in 4 Komponenten
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Albumin, Globuline ", $ und (
•
Nobelpreis: 1948
Weiterentwicklung zur Zonenelektrophorese
antikonvektive Träger: Papier, Agargele und Kieselgele
sehr diffuse Banden wegen Eigenladung
Inerte Matrices:
•
Stärkegele (1955, Smithies)
Trennung von DNA-Fragmenten
•
Celluloseacetatfolien (1957, Kohn)
Klinische Routineuntersuchungen
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Polyacrylamidgele (1959, Raymond und Weintraub)
Inert, vollständig transparent, höchstes Auflösungsvermögen für DNA-Fragmente, Proteine und Peptide
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Agarosegele (1961, Hjertén)
Trennung von DNA-Fragmenten, Immunelektrophorese
Isoelektrische Fokussierung (IEF), 1966
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pH-Gradient mit Trägerampholyten
•
sehr hoch auflösende Elektrophoresemethode
•
Proteine wandern in einem pH-Gradienten bis zu dem pHWert, der ihrem isoelektrischen Punkt (pI) entspricht
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seit 1982 immobilisierte pH-Gradienten
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Elektrophorese - Historie II
SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat), 1967
•
Denaturierung von Proteinen
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Molekulargewichtsbestimmung (SDS-PAGE)
Gradientengele, 1967, Margolis und Kenrick
Zweidimensionale Elektrophorese (2-DE), 1975
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Erste Dimension: IEF
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Zweite Dimension: SDS-PAGE
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seit 1988 2-DE mit immobilisierten pH-Gradienten
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Auflösung: mehrere Tausend Proteine auf 20 cm x 20 cm
Blotting-Techniken, 1975
•
Southern-Blot (DNA-Fragmente aus Agarose-Gelen)
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Northern-Blot (RNA-Fragmente)
•
Western-Blot (Proteine)
Kapillarelektrophorese, 1983
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Theoretische Grundlagen I
Definition
Die elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) ist eine
substanzspezifische Größe, die die Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld bestimmt und damit für die Trennung
entscheidend ist.
Kraft im elektrischen Feld
Fe = qCE mit q = zCe
q: Ladung
z: Ladungszahl
e: Elementarladung in Coulomb
E: elektrische Feldstärke
Reibungskraft
Fr = fcCv
v: Wanderungsgeschwindigkeit
fc: Reibungskoeffizient
Gleichgewicht beider Kräfte:
K konstante Wanderungsgeschwindigkeit
Fe = Fr
qE = fcCv
u: Mobilität
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Theoretische Grundlagen I
Mobilität u
für kugelförmige Moleküle (Stokessche Gesetz)
0: Viskosität der Lösung
r: Radius des hydratisierten Ions
für nicht-kugelförmige Moleküle
empirischer
M: Molekulargewicht
Zusammenhang:
d: 1/3 bis 2/3
Joulesche Wärme
c: molare Konzentration des Analyten
E: elektrische Feldstärke
8: Äquivalenzleitfähigkeit
K Puffer erwärmt sich ungleichmäßig
K Konvektion wirkt Trennung entgegen
K Inerte Matrix einsetzen
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Agarose-Gele
Relativ großporig: 150 - 500 nm (1 - 0,16 Gew.%)
Polysaccharid (aus Rotalge)
Charakterisierung über Schmelzpunkt
Herstellung: Erhitzen, auf Platte gießen, geliert beim Abkühlen
Struktur
Polyacrylamid-Gele
chemisch inert
stabil
klares Gel
Porengröße über Totalacrylamid- (T) und Vernetzungsgrad (C)
definiert
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Apparaturen
Vertikale Elektrophoreseapparatur
Horizontale Gelelektrophorese
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Färbetechniken
1. Organische Farbstoffe
z.B. Coomassie Brillant Blau (Triphenylmethanfarbstoff)
•
Gel mit Farbstoff färben
•
Farbstoff bindet an Proteine (ionisch und/oder hydrophob)
•
Farbstoff aus Gel herauslösen
•
Proteinbanden sichtbar
Nachweisgrenze: bis 100 ng Protein/Bande
2. Silberfärbung
•
Silberionen (AgNO3) binden an Proteine
•
Bildung von “Silberkeimen” nach der Reduktion
•
Reduktion aller Silberionen im Gel zu metallischem Silber
(ähnlich Fotoentwicklung)
•
Reduktion verläuft an “Silberkeimen” am schnellsten
K Proteinbanden sichtbar (schwarz/braune Bande)
•
sensitiver als Coomassie (<10 ng Protein/Bande)
3. Fluoreszenzfarbstoffe
Fluorophore, Metallchelate (z.B. SyproRuby)
binden an Proteine (s. Organische Farbstoffe)
sehr empfindlich (10 ng), großer dynamischer Bereich
Varianten
Proteine vor der Elektrophorese kovalent modifizieren
3.1 Saturation Labeling
• Fluorophor an Cys koppeln (quantitativ)
• z.B. Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5)
3.2 Minimal Labeling
• Fluorophor an Lys koppen (ca. 1% der Aminogruppen)
• z.B. Cyaninfarbstoffe (Cy3, Cy5)
Proteingemische können parallel separat und unabhängig
detektiert werden
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Native Gelelektrophorese
•
•
•
•
•
Ohne Zusatz von Detergenzien
Neutrale bzw. schwach saure/basische Bedingungen
Proteine wandern auf Grund der Eigenladung
pH-Wert!
Struktur bleibt erhalten
Reibungskraft von Struktur abhängig!
Unterschiedliche Puffersysteme einsetzbar
Blaue Nativ-PAGE
•
Anionischer Farbstoff (Coomassie Brillant Blau) in
Gelmatrix vorlegen
•
Proteine auftragen (z.B. Membranproteine)
•
Coomassie bindet an hydrophobe Bereiche der Proteine
•
Negativ geladener Protein/Coomassie-Komplex wandert
durch Gel
•
Protein wird als blaue Bande sichtbar
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Denaturierende Gelelektrophorese
SDS-PAGE
•
Proteine in SDS-haltigem Puffer lösen
•
Negativ geladener Protein/SDS-Komplex
•
Alle Proteine negativ geladen, wandern zur Anode
•
Konstantes Protein/SDS-Verhältnis
•
Wanderungsgeschwindigkeit von Größe abhängig
häufigste Technik im Bereich der Proteinanalytik
sehr einfach, gute Auflösung, hohe Reproduzierbarkeit
Isoelektrische Fokussierung
•
Proteine in einem pH-Gradienten trennen (z.B. 3-10)
•
Zusatz von Harnstoff (6 M)
•
Wandern gemäß Eigenladung zum isoelektrischen Punkt
und werden dort als scharfe Bande fokussiert
(Proteine sind am pI ungeladen)
•
Meist immobilisierte pH-Gradienten, kommerziell
verfügbar, gut reproduzierbar
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Zweidimensionale Techniken
•
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•
verschiedene Kombinationen möglich (orthogonal)
meist: IEF/SDS-PAGE
Auflösung: 1.000 - 10.000 Proteine
Problem: Reproduzierbarkeit, Gel-Gel-Variabilität
Standardmethode der Proteomanalytik (Proteomics)
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Elektroelution
•
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•
•
•
Proteinbanden (-spots) aus Gel ausschneiden
Gelstücke auf eine Membran legen
Spannung anlegen
Proteine wandern im elektrischen Feld aus dem Gel
Proteine werden oberhalb der Membran angereichert
Puffer mit Proteinen abziehen
Weitere Aufarbeitung in Lösung
Nur für größere Proteinmengen einsetzbar
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Elektroblotting
Proteine: Western-Blot
Alle Proteine eines Gels auf eine Membran übertragen
Spannung senkrecht zum Gel anlegen
Tank- oder Semidry-Blotting
Nahezu quantitativer Transfer in einer Richtung (SDS!)
Blotzeiten von Proteingröße abhängig
Hydrophobe Bindung an Membran (PVDF, Nitrocellulose)
SDS wandert weiter, Proteine bleiben an Membran haften
Verschiedene Techniken möglich:
Edman-Sequenzierung der Proteine
Immun-Blot (Proteine mit Antikörper identifizieren)
Lektin-Blot (Nachweis von Glykosylierungen)
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Beispiele: 2-DE und Immunoblot
IEF/SDS-PAGE eines E. coli Aufschlusses
Immunoblot: Anti-Tau mAk, Hirnhomogenat
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Prinzip
in Kapillare fast keine Konvektion (K keine Matrix)
homogener Puffer
•
konstanter pH-Wert
•
konstanter Stromfluss
•
einheitliche Feldstärke
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Kapillarinnenwand ist negativ geladen (Silanolgruppen)
Gegenionen in der Lösung wandern im elektrischen Feld
KTransport des Puffers zur Kathode
•
•
EOF ist vom pH-Wert abhängig
effektive Kühlung notwendig
Resultierendes Flussprofil
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Beispiel einer CZE
Elektropherogramm
CZE eines tryptischen Verdaus von Fetuin
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Trennung von Phosphopeptiden mittels CZE
A1:
A2-A4:
unphosphorylierte Sequenz
homologe einfach phosphorylierte Sequenzen
(Stellungsisomere!)
50
A2 A4
A3
A1
15% HCOOH
40
Absorption [mAu]
A1
12,5% HCOOH
30
A1
10% HCOOH
20
A1
7,5% HCOOH
10
A2, A3, A4
A1
0
5% HCOOH
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Zeit [min]
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