Marker

MARKER
DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
Einteilung nach Ausgangsmaterial
1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau
2. RNA – nach Umschreiben in cDNA
Einteilung nach der verwendeten Technik
1. Einsatz von Sonden
2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)
MARKER
DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
Einteilung nach der verwendeten Technik
1. Einsatz von Sonden
2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)
Experiment:
Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp)
und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen
G/AATTC).
Führt zu etwa 30.000 Restriktionsfragmenten. Die sind auf
keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet.
Was tun ? ( classical quotation)
MARKER-Typen
1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied
2. RFLP:
restriction fragment length polymorphism
3. AFLP:
amplified fragment length polymorphism
4. SSLP:
simple sequence length polymorphism
5. SSR:
simple sequence repeat (Mikrosatellit)
6. SNP:
single nucleotide polymorphism
7. CAPS:
cleaved amplified polymorphic sequences
8. RAPD:
random amplified polymorphic DNA
2. RFLP
2. RFLP
Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier
Individuen
Zusätzliche Restriktionsschnittstelle
Gelanalyse
Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl
der Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden.
2. RFLP
Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
2. RFLP
Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen
3. AFLP
3. AFLP
„SPEZIFISCHE PCR“
Über- Anteil Genom
hang ampl. 106 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
1/4
1/16
1/64
1/256
1/1024
1/4096
1/16384
1/65536
2
8
32
128
512
2048
8192
32768
Pflanze
Bakterien
Bakterien
Hefe
Arabidopsis
Reis
Zuckerrübe
Gerste
Weizen
3. AFLP
VORTEIL
Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen
Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe
Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten
Bereich von Genomgrößen angepasst werden.
NACHTEIL
1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen
2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur
4. SSLP
simple sequence length polymorphism
- PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik)
- Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern
überdeckt und mittels PCR amplifiziert
- Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese
in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und
verglichen.
4. SSLP
Primer I
Primer II
Primer I
Primer II
Insertion
(Analog Deletion)
Autoradiogramm
5. SSR
simple sequence length polymorphism
Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Diund Trinukeotidsequenzen
(TG)10
(TG)12
ENTSTEHUNG
„Stottern“ der Polymerase bei der Replikation
VORTEIL
Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen
solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h.
auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie
6. SNP
single nucleotide polymorphism
Unterschied in einem einzigen Basenpaar
A
C
VORTEIL
SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten
Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare)
6. SNP
Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)
Temperaturabhängigkeit
6. SNP
Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)
Temperaturabhängigkeit
7. CAPS
Cleaved amplified polymorphic sequences
primer
A
C
Genom 1
Genom 2
neue Schnittstelle
1. PCR-Amplifizierung
2. Restriktionsverdau
3. Gelelektrophorese
Genom 2
Genom 1
Gelektrophorese
8. RAPD
random amplified polymorphic DNA
Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden
willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden
unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer
Fragmente
Genom
Individuum 1
Genom
Individuum 2
Gelanalyse
Einsatz von molekularen Markern
zur Lokalisierung von
Mutationen
und
TILLING
Auf jeden Fall aber
Diagnostik
Einsatz von molekularen Markern
zur Lokalisierung von
Mutationen
und
TILLING
Auf jeden Fall aber
Diagnostik
1. Anwendung molekularer Marker
2. Diagnostik und Pflanzenschutz
Einsatz von molekularen Markern
zur Lokalisierung von
Mutationen
und
TILLING
Auf jeden Fall aber
Diagnostik
1. Anwendung molekularer Marker
2. Diagnostik und Pflanzenschutz
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Viroide
Viren
Bakterien
Pilze
1. Viroide
Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese
Largely internally base-paired viroid RNA
nativ
denat.
2. Viren
Polyklonale Antikörper
Trübungsmessung,
automatisierbar
3. Bakterien
Bindung der Bakterien
mittels Antikörper an
Magnetpartikel.
3. Bakterien
Entfernung der
Targets mit einem
Magneten.
Kultivierung der
isolierten Bakterien.
Klassischer Nachweis.
3. Bakterien
4. Pilze
RAPD