1. rflp sonde
Werbung
MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Lokalisierbarer Unterschied im Genom zweier Individuen oder Gruppen 1. 2. 3. 4. Insertion Deletion Inversion Mutation MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird vom verdauten Genom ausgegangen, so werden nachfolgend auch Unterschiede im Genom erfasst. Damit sind je nach Verwandtschaften Methode nahe Unterscheidungen oder weit und entfernter taxonomischer Gruppen (Art, Klon, Varietät, Linie) im Sinne der Systematik und die Identifizierung und Einordnung von Individuen in Gruppen möglich. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird von der isolierten RNA (Transkriptom) ausgegangen, so werden nachfolgend Unterschiede in den unter den gegebenen Bedingungen endogene transkriptierte oder exogene Gene Einflüsse erfasst. auf das Damit sind abgelesene Genprogram qualitativ und quantitativ erfassbar. Anwendung z. B. in der Stressphysiologie (biotisch, abiotisch) und der Entwicklungsphysiologie. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Experiment: Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp) und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen G/AATTC). Führt zu etwa 30.000 Restriktionsfragmenten. Die sind auf keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik: 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Entweder „färbt“ man nur einige Banden spezifisch an, dann sind die anderen Fragmente nicht sichtbar. Mittels „sichtbarer“ Sonden erfolgt eine Hybridisierung mit den gewünschten Fragmenten. Oder man amplifiziert einige Banden mit PCR, so dass die anderen einfach als Hintergrund verbleiben. Mittels geeigneter primer werden nur gewünschte Fragmente sichtbar gemacht. MARKER-Typen 1. RFLP: restriction fragment length polymorphism 2. AFLP: amplified fragment length polymorphism 3. SSLP: simple sequence length polymorphism 4. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 5. RAPD: random amplified polymorphic DNA 1. RFLP Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen Zusätzliche Restriktionsschnittstelle Gelanalyse Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden. 1. RFLP Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus 1. RFLP DURCHFÜHRUNG RFLP ist eine Sonden-Technik, auf DNA angewendet 1. Übertragung der verdauten, genomischen DNA auf dem Gel auf eine Membran = Blotten 2. Markieren einer „Sonde“, z.B. durch Einbau von radioaktivem 32Phosphor in das Phosphatrückgrat der DNA 3. Hybridisieren der Membran mit dieser Sonde unter Bedingungen, bei denen sich die Sonde nur an basenkomplementäre Fragmente anlagert 4. Autoradiographie der Membran. Der Film (die Platte des Phosphoimagers) wird nur dort geschwärzt, wo sich die Radioaktivi-tät befindet. Man erhält das vorher dargestellte Gelbild 1. RFLP SONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm 1. RFLP SONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm 1. RFLP Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen 1. RFLP ERSTELLUNG 1. 2. 3. 4. 5. Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt 1. RFLP PROBLEME 1. Große pflanzliche Genome besitzen einen hohen Anteil repetitiver DNA, d.h. es ist schwierig DNA Fragmente zu klonieren, die nur mit einem Locus des Genoms hybridisieren 2. Züchterisch eingesetzte Varietäten von Kulturpflanzen sind häufig sehr nahe miteinander verwandt, d.h. die Zahl der polymorphen Loci ist gering, so dass eine große Zahl von Enzymen und/oder Sonden getestet werden muss 3. Die Analysentechnik ist zwar robust und gut reproduzierbar, aber teuer und aufwendig. 2. AFLP amplified fragment length polymorphism Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen werden ausgenutzt IM GEGENSATZ ZUM RFLP 1. werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca. 4000 auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt. 2. wird statt der „Sonden-Technik“ das „Display“Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt. 2. AFLP 2. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ PCR Primer 1 <——— AC GACGT GATT.. ....TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA.. ..ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT.. TGTC TAA TC ———> [MseI] PCR Primer 2 [PstI] 2. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ Über- Anteil Genom hang ampl. 106 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024 1/4096 1/16384 1/65536 2 8 32 128 512 2048 8192 32768 Pflanze Bakterien Bakterien Hefe Arabidopsis Reis Zuckerrübe Gerste Weizen 2. AFLP VORTEIL Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten Bereich von Genomgrößen angepasst werden. NACHTEIL 1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen 2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur 3. SSLP simple sequence length polymorphism - PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen. 3. SSLP Primer I Primer II Primer I Primer II Insertion (Analog Deletion) Autoradiogramm 3. SSLP Einschätzung - Bei entsprechenden Vorkenntnissen (Gensequenz bekannt, ein locus für die Insertion kann vermutet werden) sehr effektiv. - Beschränkt auf Mutationen, die die Sequenzlänge zwischen den primern verändert. - CAPS wird oft bevorzugt. 4. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences - Ähnlichkeit mit SSLP, ebenfalls PCR-gestützt (= Display-Technik) - Keine Sonde, sondern Ethidiumbromid-Färbung nach PCR - Das PCR-Propdukt wird zusätzlich mit Restriktionsenzymen verdaut and nach Längenpolymorphismen mit Agarose-Gelelektrophores untersucht. 4. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences primer A C Genom 1 Genom 2 neue Schnittstelle 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Genom 2 Genom 1 Gelektrophorese 5. RAPD random amplified polymorphic DNA Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse 5. RAPD 5. RAPD VORTEIL Nur geringe Vorarbeiten bzw. Vorinformationen erforderlich (Präparation genomischer DNA und Test der PCR-Primer) 5. RAPD NACHTEIL Geringe Reproduzierbarkeit, da die Amplifikation von Fragmenten unter Bedingungen stattfinden muss, bei denen die primer an Sequenzen der genomischen DNA binden, die nicht vollständig basenkomplementär sind. Das führt zu starken Abhängigkeiten von den Anfangsbedingungen (Konzentration und Reinheit der Komponenten) und den Versuchsablauf (Genauigkeit und Geschwindigkeit der Temperatureinstellung).
