2. rflp sonde
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1. Einordnung der Biotechnologie als eine Einführung 2. Der jetzige Stand 3. Einige molekularbiologische Grundlagen 4. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil I 5. Was sind Mutanten und wie werden sie erzeugt? 6. Wie macht man gentechnisch veränderte Pflanzen? 7. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil II 8. Umweltaspekte und ethische Erwägungen 9. Biotechnologische Diagnostik 10. Anwendungsbeispiele MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Lokalisierbarer Unterschied im Genom zweier Individuen oder Gruppen 1. 2. 3. 4. Insertion Deletion Inversion Mutation MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird vom verdauten Genom ausgegangen, so werden nachfolgend auch Unterschiede im Genom erfasst. Damit sind je nach Verwandtschaften Methode nahe Unterscheidungen oder weit und entfernter taxonomischer Gruppen (Art, Klon, Varietät, Linie) im Sinne der Systematik und die Identifizierung und Einordnung von Individuen in Gruppen möglich. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird von der isolierten RNA (Transkriptom) ausgegangen, so werden nachfolgend Unterschiede in den unter den gegebenen Bedingungen endogene transkriptierte oder exogene Gene Einflüsse erfasst. auf das Damit sind abgelesene Genprogram qualitativ und quantitativ erfassbar. Anwendung z. B. in der Stressphysiologie (biotisch, abiotisch) und der Entwicklungsphysiologie. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Experiment: Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp) und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen G/AATTC). Führt zu etwa 30.000 Restriktionsfragmenten. Die sind auf keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet. MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik: 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Entweder „färbt“ man nur einige Banden spezifisch an, dann sind die anderen Fragmente nicht sichtbar. Mittels „sichtbarer“ Sonden erfolgt eine Hybridisierung mit den gewünschten Fragmenten. Oder man amplifiziert einige Banden mit PCR, so dass die anderen einfach als Hintergrund verbleiben. Mittels geeigneter primer werden nur gewünschte Fragmente sichtbar gemacht. MARKER-Typen 1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied 2. RFLP: restriction fragment length polymorphism 3. AFLP: amplified fragment length polymorphism 4. SSLP: simple sequence length polymorphism 5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit) 6. SNP: single nucleotide polymorphism 7. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 8. RAPD: random amplified polymorphic DNA 1. PHÄNOTYP Meist unbekannte Art von Unterschied zwischen Genomen, dessen Konsequenz die veränderte Aktivität eines Gens ist, die sich in der sicht- oder messbaren Veränderung bestimmter Eigenschaften dieser Individuen ausdrückt und nach Mendelschen Regeln vererbt wird ERKENNBAR Blütenfarbe bei Erbsen (Mendel) Normal und zwergwüchsige Erbsen MESSBAR Hypokotyllänge (Phytochrom A Mutante und Wildtyp im Dauerdunkelrot) Antibiotikaresistente Linie gegenüber Wildform unter Selektionsbedingungen 2. RFLP Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen Zusätzliche Restriktionsschnittstelle Gelanalyse Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden. 2. RFLP Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus 2. RFLP DURCHFÜHRUNG RFLP ist eine Sonden-Technik, auf DNA angewendet 1. Übertragung der verdauten, genomischen DNA auf dem Gel auf eine Membran = Blotten 2. Markieren einer „Sonde“, z.B. durch Einbau von radioaktivem 32Phosphor in das Phosphatrückgrat der DNA 3. Hybridisieren der Membran mit dieser Sonde unter Bedingungen, bei denen sich die Sonde nur an basenkomplementäre Fragmente anlagert 4. Autoradiographie der Membran. Der Film (die Platte des Phosphoimagers) wird nur dort geschwärzt, wo sich die Radioaktivi-tät befindet. Man erhält das vorher dargestellte Gelbild 2. RFLP SONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm 2. RFLP SONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm 2. RFLP Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen 2. RFLP ERSTELLUNG 1. 2. 3. 4. 5. Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt 2. RFLP PROBLEME 1. Große pflanzliche Genome besitzen einen hohen Anteil repetitiver DNA, d.h. es ist schwierig DNA Fragmente zu klonieren, die nur mit einem Locus des Genoms hybridisieren 2. Züchterisch eingesetzte Varietäten von Kulturpflanzen sind häufig sehr nahe miteinander verwandt, d.h. die Zahl der polymorphen Loci ist gering, so dass eine große Zahl von Enzymen und/oder Sonden getestet werden muss 3. Die Analysentechnik ist zwar robust und gut reproduzierbar, aber teuer und aufwendig. 3. AFLP amplified fragment length polymorphism Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen werden ausgenutzt IM GEGENSATZ ZUM RFLP 1. werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca. 4000 auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt. 2. wird statt der „Sonden-Technik“ das „Display“Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt. 3. AFLP 3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ PCR Primer 1 <——— AC GACGT GATT.. ....TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA.. ..ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT.. TGTC TAA TC ———> [MseI] PCR Primer 2 [PstI] 3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ Über- Anteil Genom hang ampl. 106 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024 1/4096 1/16384 1/65536 2 8 32 128 512 2048 8192 32768 Pflanze Bakterien Bakterien Hefe Arabidopsis Reis Zuckerrübe Gerste Weizen 3. AFLP VORTEIL Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten Bereich von Genomgrößen angepasst werden. NACHTEIL 1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen 2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur 4. SSLP simple sequence length polymorphism - PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen. 4. SSLP Primer I Primer II Primer I Primer II Insertion (Analog Deletion) Autoradiogramm 4. SSLP Einschätzung - Bei entsprechenden Vorkenntnissen (Gensequenz bekannt, ein locus für die Insertion kann vermutet werden) sehr effektiv. - Beschränkt auf Mutationen, die die Sequenzlänge zwischen den primern verändert. - CAPS wird oft bevorzugt. 5. SSR simple sequence length polymorphism Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen (TG)10 (TG)12 ENTSTEHUNG „Stottern“ der Polymerase bei der Replikation VORTEIL Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie 5. SSR IDENTIFIZIERUNG Amplifikation kurzer genomischer Fragmente, die den SSR enthalten und anschließender Vergleich der Fragmentlängen auf hochauflösenden Polyacrylamidgelen analog zur DNA- Sequenzierung. Folglich: Display-Technik, üblicherweise mit DNA 5. SSR IDENTIFIZIERUNG 1. Anlegen einer Bibliothek kurzer genomischer Fragmente in E. coli Plasmiden 2. Übertragen der Kolonien auf Nylonmembranen 3. Hybridisieren mit SSR-Oligonukleotiden, wobei selbstkomplementäre Sequenzen ([CG]n und [AT]n) ausgeschlossen sind 4. Sequenzieren positiver Klone 5. Design und Synthese von PCR-Primern 6. Überprüfen, ob Polymorphie des amplifizierten Fragmentes für die interssierenden Varietäten vorliegt 5. SSR IDENTIFIZIERUNG Alternativ A. Sequenzierung willkürlicher Genomabschnitte oder cDNA-Klone; dann weiter mit 5. und 6. B. Vergleichende Sequenzierung „identischer“ Genomabschnitte oder cDNA-Klone aus unterschiedlichen Varietäten 6. SNP single nucleotide polymorphism Unterschied in einem einzigen Basenpaar A C VORTEIL SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare) 6. SNP IDENTIFIZIERUNG Vergleichende Sequenzierung „identischer“ Genomabschnitte oder cDNA-Klone ANALYSE Sequenzierung von amplifizierten Fragmenten Hybridisierung von Oligonukleotiden, die den SNP berdecken, mit präamplifizierten genomischen Fragmenten 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit A C B 7. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences - Ähnlichkeit mit SSLP, ebenfalls PCR-gestützt (= Display-Technik) - Keine Sonde, sondern Ethidiumbromid-Färbung nach PCR - Das PCR-Propdukt wird zusätzlich mit Restriktionsenzymen verdaut and nach Längenpolymorphismen mit Agarose-Gelelektrophores untersucht. 7. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences primer A C Genom 1 Genom 2 neue Schnittstelle 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Genom 2 Genom 1 Gelektrophorese 8. RAPD random amplified polymorphic DNA Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse 8. RAPD 8. RAPD VORTEIL Nur geringe Vorarbeiten bzw. Vorinformationen erforderlich (Präparation genomischer DNA und Test der PCR-Primer) 8. RAPD NACHTEIL Geringe Reproduzierbarkeit, da die Amplifikation von Fragmenten unter Bedingungen stattfinden muss, bei denen die primer an Sequenzen der genomischen DNA binden, die nicht vollständig basenkomplementär sind. Das führt zu starken Abhängigkeiten von den Anfangsbedingungen (Konzentration und Reinheit der Komponenten) und den Versuchsablauf (Genauigkeit und Geschwindigkeit der Temperatureinstellung). Das war schon alles zu den Markern! 2. Diagnostik und Pflanzenschutz - Viroide - Viren - Bakterien - Pilze Molekulare Diagnostik und Pflanzenschutz 1. Nachweis der Pathogenfreiheit für kommerzielle Zwecke 2. Absicherung der Pathogenfreiheit im Ausgangsmaterial für Züchtungszwecke 3. Allgemeine phytosanitäre Überwachung Ökonomische Aspekte der Methodenwahl 1. Zeitaufwand, besonders Lohnkosten 2. Automatisierbarkeit 3. Materialkosten 1. Viroide Ein Viroid ist ein infektiöses Molekül, das aus einer einzelsträngigen, zirkulären (nur 150–400 Nukleotide) RNA besteht. Dem Viroid fehlt vor allem die Proteinhülle eines normalen Virus. Viroide kommen in der Natur als Krankheitserreger von Pflanzen vor (Pflanzenpathogen). Im Gegensatz zu Viren tragen Viroide keine Gene. Sie codieren also keine Proteine, weshalb Viroide bei ihrer Replikation und ihrem Transport ausschließlich auf Enzyme der Wirtspflanzen angewiesen sind. Der Infektionsmechanismus der Viroide ist bisher unklar. Allerdings wurden Nukleotidsequenzen in der Wirtspflanzen-DNA gefunden, die komplementär zu den Sequenzen der Viroide sind. Hierbei wäre also denkbar, dass das Viroid selbst als primärer Pathogenitäts-Effektor wirkt. Alternativ wird diskutiert, dass Viroide ihre Pathogenität durch "RNA silencing" erlangen. 1. Viroide Die meisten Viroide tauchen in Kulturpflanzungen auf bzw. sind dort am meisten verbreitet. Ein gutes Beispiel ist das Kartoffelspindelknollen-Viroid (Abk. PSTVd), welches Kartoffeln, Tomaten und viele andere Pflanzenarten befällt und großen wirtschaftlichen Schaden anrichtet. 1. Viroide Molekulare Nachweismöglichkeit: - Bereits 1981 wurde Viroid-RNA (als cDNA) in einem Vektor kloniert und nach radioaktiver Markierung als Hybridisierungssonde verwendet. - Ursprünglich hat die Notwendigkeit der radioaktiven Markierung die Anwendung in breitem Massstab verhindert. - Heute ist nicht-radiokative Markierung kein Problem mehr, der finanzielle Aufwand hat solche und ähnliche Methoden bisher jedoch nicht zum Einsatz kommen lassen. 1. Viroide Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese Largely internally base-paired viroid RNA nativ denat. 1. Viroide Bidirektionale Gelektrophorese mit nachfolgender Silberfärbung hat dieselbe Empfindlichkeit wie Hybridisierungstechniken (5 ng/ g Frischgewicht), ist jedoch wesentlich billiger. Außerdem braucht man nicht jedesmal eine neue Sonde, wenn Ein anderes Viroid zu bestimmen ist. 2. Viren Hybridisierungstechniken sind möglich, auch PCR-gestützte Methoden sind beschrieben und werden in der Forschung verwendet. In den Großtests jedoch sind diese Methoden zu teuer. Ein Testverfahren, dass von den Hüllproteinen der Viren Gebrauch macht, wird hingegen wegen der geringen Kosten im Routinetest eingesetzt. 2. Viren Enthalten Hüllproteine, gegen die Antikörper erzeugt werden können. 2. Viren Polyklonale Antikörper Trübungsmessung, automatisierbar 3. Bakterien Saprophytische Bakterien überdecken meist pathogene Bakterien. Im Routinetest kann man nicht axenisch arbeiten. 3. Bakterien Bindung der Bakterien mittels Antikörper an Magnetpartikel. 3. Bakterien Entfernung der Targets mit einem Magneten. Kultivierung der isolierten Bakterien. Klassischer Nachweis. 3. Bakterien 4. Pilze Anwendungsbeispiel: Schwarzfusskrankheit bei Cruciferen (Kreuzblütengewächse) z. B. Raps und Kohl Infektion durch den Pilz Leptospaeria Maculans Unterscheidung aggressiv/ nichtaggressiv Resitent Empfänglich 4. Pilze Besonders erfolgreich in letzter Zeit hat sich der Einsatz von Antikörpern gegen Komponenten der Zellwand aus Mycel und Sporen entwickelt. Je nach Spezifität kann man auf diese Weise gattungs- oder artspezifische Nachweise führen. Zunehmend gewinnen aber PCR-gestützte Methoden zum Pilznachweis an Bedeutung. 4. Pilze RAPD 1. Einordnung der Biotechnologie als eine Einführung 2. Der jetzige Stand 3. Einige molekularbiologische Grundlagen 4. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil I 5. Was sind Mutanten und wie werden sie erzeugt? 6. Wie macht man gentechnisch veränderte Pflanzen? 7. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil II 8. Umweltaspekte und ethische Erwägungen 9. Biotechnologische Diagnostik 10. Anwendungsbeispiele 1. Einordnung der Biotechnologie als eine Einführung 2. Der jetzige Stand 3. Einige molekularbiologische Grundlagen 4. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil I 5. Was sind Mutanten und wie werden sie erzeugt? 6. Wie macht man gentechnisch veränderte Pflanzen? 7. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil II 8. Umweltaspekte und ethische Erwägungen 9. Biotechnologische Diagnostik 10. In vitro-Kultivierung : Selektion von Variationen und Mutationen
