B2-08Fo3 - Bionik TU

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Ingo Rechenberg
PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung „Bionik II / Biosensorik“
Zwischen Bionik und Biotechnologie
Wie baut man einen Biosensor ?
Weiterverwendung nur unter
Angabe der Quelle gestattet
Biotechnologie versus Bionik
Lotus Effekt
Biotechnologie
Lotusblatt-Zellkultur
versus
Bionik
Synthetisches Produkt
Erkundung des Effekts
Photobiologische
Wasserstoffproduktion
H2
Biotechnologie
Blaualge
Nostoc muscorum
versus
H2O
Vegetative
Zelle
O2
O2
H2
Bionik
N2
CO2
<CH2O
<
H2
Heterocyste
Algen-Analoga
Bakterien-Analoga
Konstruktion eines
Schallschnelle-Vektormessgeräts
Partikel Geschwindigkeit
Technische
Schaltung
Biotechnologie
versus

Bionik
Der bionische Ansatz zur
Realisation einer künstlichen Nase
Vorbild Biologie: Verstärkung durch
eine Enzymkaskade
Duftstoff
Rezeptor

AC
cAMP
cAMP
cAMP
cAMP
ATP


G-Protein
ATP
ATP
cAMP
AC = Adenylcyclase
cAMP
cAMP
cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat
Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft
1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor
2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein
3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)
4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP
5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an
6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen
7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal
Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft
1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt
2. Es entsteht Metarhodopsin
3. Metarhodopsin zerfällt in Opsin und all-trans Retinal
4. Metarhodopsin aktiviert Transducin
5. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE)
6. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP
7. Dadurch schliessen sich Na-Kanäle
8. Es kommt zu einer Hyperpolarisation
9. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV
3 000
2 000
Molekulare Verstärkung: 6000 000
Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste
auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !
Entwurf eines mechanischen Modells
für eine Katalysatorkaskade
Wilhelm Ostwald (1853-1932)
"Katalyse ist die Beschleunigung eines
langsam verlaufenden chemischen
Vorgangs durch die Gegenwart eines
fremden Stoffes" (1894).
"Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im
Endprodukt einer chemischen Reaktion zu
erscheinen, ihre Geschwindigkeit
verändert. (1901)"
Wilhelm Ostwald
Dr. Jörg Libuda, Prof. Hans-Joachim Freund
Fritz-Haber-Institut Berlin
Durch einen Molekularstrahl, in dem Moleküle gebündelt in eine Richtung
geschickt werden, konnte nachgewiesen werden, dass die Aufspaltung der
C-O-Bindung des Methanols gerade an den Kantenatomen ( ) der
Palladium-Katalysatorteilchen besonders beschleunigt wurde.
Entwurf eines mechanischen Modells
für eine Katalysatorkaskade
S
N
S
N
oder
S
N
Mechanisches Modell eines Moleküls,
das in eine andere Form umgewandelt
wird (z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin)
S
N
S
N
Mechanisches Enzym
S
N
S
N
N
S
S
N
S
N
S
N
S
N
1000
· · ·
1000
1000
1000
· · 000
·
1
S
N
1000000
An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten
Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine
solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden
Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten
Das sieht dann so aus:
Was zeichnet den Biosensor aus ?
Extreme
Empfindlichkeit
Selektivität auf
biologische Stoffe
Der geschichtlich erste Biosensor, der die
Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte
Der Glukose-Biosensor
Elektrode
Messlösung
Membran
Immobilisiertes Enzym
Elektronik
Membran
?
Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode
Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor
Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt
Text
Schaltkreis
Signalmoleküle
Signalumformer
Anzeigegerät
Sensor
Molekulare Formerkennung
Schema eines Biosensors
Effekt
Chemische
Substanz
Temperatur
Transducer
Elektrode
Thermistor
Licht
Masse
Elektrisches
Potenzial
Piezokristall
Verstärker
Funktionsprinzip eines Biosensors
Elektrisches Signal
Analytlösung
Selektor
(Rezeptor)
Van-der-Waals-Bindung
(Adsorption) des Enzyms
Einbau des Enzyms
in eine Polymer-Matrix
Kovalent gebundene Atome teilen sich
die Orbitale der Valenzelektronen
Kovalente atomare
Bindung des Enzyms
Enzym
Technisches
Substrat
In Biosensoren benutzte
Immobilisierungsmethoden
Enzym in
semipermeabler
Membran-Hülle
EnzymVernetzung
Magensäure
Eiweiß
spalten !
Kann kein
Eiweiß
spalten.
Pepsin: Kann noch
Pepsinogen:
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines
Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym
Immobilisiertes
Pepsinogen
Pepsin
Eiweißspaltung
Messung des
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines
Eiweiß-Spaltprodukts
Magensäure-Biosensors
mit immobilisiertem Enzym
Effekt
Chemische
Substanz
Temperatur
Transducer
Elektrode
Thermistor
Licht
Masse
Elektrisches
Potenzial
Piezokristall
Verstärker
Funktionsprinzip eines Biosensors
Elektrisches Signal
Analytlösung
Selektor
(Rezeptor)
Amperometrie
Lumineszenz
Glucose +
1
2
O2 + H2O
Sauerstoffelektrode
Lumineszenz
Glucoseoxidase
Kalorimetrie
Gluconolacton + H2O2 + 7 kcal
Gluconolactonase
Gluconsäure + H+
pH-Elektrode
MOSFET
Mögliche technische Messaufnehmer
für einen Glukose-Biosensor
Zum Glukosesensor
Transducer
Thermodynamik
Mechanik
Optik
Kalorimetrie
Mikrogravimetrie
Photometrie
Temperaturmessung
Elektrochemie
Potenziometrie
Amperometrie
Voltammetrie
Konduktometrie
Wägung
Lumineszenz-, Farb-Messung
Potenzialdifferenz bei Strom Null
Strom bei konstanter Spannung
Strom mit Spannungsänderung
Widerstands/Leitfähigkeitsmessung
Glukose-Sensor heute
Metallstab
Elektrochemische Zelle
Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so
werden an der Phasengrenze Ladungsträger verschoben.
Die Potenzialdifferenz ist aber separat nicht messbar.
Elektrolyt
V
Elektrode 1
Leitende Brücke
Um das Potenzial zu messen ist eine
zweite (Ableit)elektrode notwendig !
Elektrolyt
Elektrode 2
Bei der Amperometrie wird an die Elektroden ein
konstantes Potenzial gelegt und der dadurch
resultierende Stromfluss gemessen.
Angelegtes Potenzial
A
Arbeitselektrode
z.B. 600mV
Elektrolyt
Referenzelektrode
U
Konzentrationselement
eAg
e-
Semipermeable
Membran
eAg
NERNSTsche Gleichung
NO3
cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels
cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels
Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie
cox
R

T
U
ln c
zF
red
( )
U= Spannung
R = Gaskonstante
T = Absolute Temperatur
F = Faraday-Konstante
z = Anzahl der pro Ion
übertragenen Elektronen
c = Elektrolytkonzentration
Weitere Beispiele für Biosensoren
Foto: Forschungszentrum Jülich
Der Knoblauch-Biosensor kann
die wertvollen Inhaltsstoffe des
Knoblauchs in den verschiedenen Pflanzen aufspüren.
Biosensor für Knoblauch
Foto: Forschungszentrum Jülich
Für einen erwachsenen Menschen ist
die Aufnahme von etwa 50 Milligramm
Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht
bereits auf den Millionstel Teil dieser
Menge an.
Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der
pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von
einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsänderung registriert.
Biosensor für Zyanid
Der Penicillinsensor besteht aus
einem Schichtpaket aus Aluminium,
p-dotiertem Silizium, Siliziumdioxid,
pH-empfindlichem Siliziumnitrid
und dem Penicillin abbauenden
Enzym Penicillinase. Das Enzym
ist mit “Cross-Linker-Molekülen” an
die Oberfläche gekoppelt.
Taucht der Sensor in eine penicillinhaltige. Lösung, werden bei der
enzymatischen Reaktion Wasserstoffionen frei. Diese lagern sich an
die Siliziumnitridoberfläche an und
ändern die elektrische Kapazität
des Schichtpaketes.
Penicillin-Biosensor
Enzym immobilisiert
in einer Matrix
Verkapselung
Platinelektrode
Elektr. Anschluss
Siliziumchip
300 µm
SiO2
Aktive Sensoroberfläche
130 µm
Querschnitt durch
einen Glukosesensor
mit Containment
Glukosesensor in Mikrosystemtechnik
Referenzelektrode
Gate (Tor)
Membran
Enzymgemisch
Drain (Senke)
Isolator
Source (Quelle)
Gehäuse
n
n
p
A
Spannungsquelle
Strommessgerät
Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)
Isolatoren
Halbleiter
Selen
Kunststoffe
Germanium
Diamant
Quarz
10
10
Silber
Eisen
Glas
Glimmer
-16
Metalle
Kupfer
Silizium
-12
-8
10
-4
10
Leitfähigkeit
0
10
1
Wm
4
10
8
10
Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in
einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration
und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.
n-dotiert
Silizium
Bor
Phosphor
p-dotiert
Fähigkeit der Elektronenleitung
und Löcherleitung
im dotierten Halbleiter
Zur Menge des
Dotierungsstoffs
im Halbleiter
Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken
p-dotiert
n-dotiert
+
+
Mit Elektronen
und
Mit Elektronen
und „Löchern“
Durchlass
Sperrschicht
„Löchern“
verarmte
Schicht
angereicherte
Schicht
Bewegung der Elektronen
Bewegung der Löcher
n-dotiert
Gate
Drain
Source
n
n
p-dotiert
p
MOSFET
Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor
Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Spannung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.
n-dotiert
G
S
n
D
n
p-dotiert
p
MOSFET
Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die
Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird
mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke.
Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.
n-dotiert
S
G
n
D
n
p-dotiert
p
CEMFET BIOFET
Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und
zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der
Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.
Ionen
Membran
Vergleich
Signalmolekül
Na+-Tore / BIOFET
Rezeptor
Immobilisierte Enzyme
V
Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran
und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran
zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter
durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom
Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen
arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!
S
G
n
D
n
p
A
Bei der klassischen
Elektronenröhre verhält
sich das Steuergitter
A
wie die Membran einer Sinneszelle, deren Durchlässigkeit
enzymatisch kontrolliert wird.
Was zeichnet den
heutigen Biosensor aus ?
Extreme
Empfindlichkeit
Es fehlt das Kaskadenprinzip !
Selektivität auf
biologische Stoffe
Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik
Glukose:
Harnstoff:
Potentiometrischer Biosensor
Lactat:
Hepatitis B:
Amperometrischer Biosensor
Chemolumineszenz Immunoassay
Candida albicans:
Piezoelektrizität Immunoassay
Amperometrischer Biosensor
Amperometrischer Biosensor
Cholesterin:
Penicillin:
Potentiometrischer Biosensor
Natrium:
Ionenselektive Glas-Elektrode
Kalium:
Ionenselektive Austausch-Elektrode
Kalzium:
Ionophore ionenselektive Elektrode
Fluoreszenz Quench-Sensor
Sauerstoff:
pH-Wert:
Ionenselektive Glas-Elektrode
Enzyme für Biosensoren
Harnstoff-Biosensor
Enzym Urease
Zyanid-Biosensor
Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak
Formaldehyd-Biosensor
Enzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3
Anthrax-Biosensor
Enzym ???
Ende
www.bionik.tu-berlin.de
Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann,
wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein
Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im
Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor
bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder
einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei
Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die
Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als
Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der
Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase
bestimmt werden.
Elektrode
Messlösung
Membran
Immobilisiertes Enzym
Membran
Elektronik
Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor
Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt
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