Kontrolle der zeitlichen und räumlichen Expression von uncx4.1 im

Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie (Lehrstuhl II)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
(Prof. Dr. med. Dr. h. c. Bodo Christ)
Kontrolle der zeitlichen und räumlichen Expression von uncx4.1
im paraxialen Mesoderm des Hühnerembryos
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2007
von Julia Schrägle
geboren in Freiburg im Breisgau
Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter: Frau Prof. Dr. Felicitas Pröls
2. Gutachter: Prof. Dr. Norbert P. Südkamp
Jahr der Promotion: 2008
Meinen Eltern
in Dankbarkeit gewidmet
Inhalt
1. Einleitung
1
2. Fragestellung dieser Arbeit
13
3. Material und Methoden
14
3.1 Tiere
14
3.2 Operations-Instrumentarium
14
3.3 Herstellung der für die Operationen verwendeten Materialien
15
3.3.1 Operationsnadeln
15
3.3.2 Färbestifte
15
3.3.3 Protein-Träger-Kügelchen
16
3.3.4 Agaroseschalen
17
3.4 Mikromanipulationen
17
3.4.1 Implantation von Barrieren
19
3.4.2 Implantation von Protein-Kügelchen
20
3.4.3 Exstirpations- und Ablationsexperimente
21
3.5 In situ-Hybridisierung (ISH) am ganzen Embryo (whole mount)
25
3.5.1 Präparation der Gensonde uncx4.1
25
3.6.2 Fixierung der Embryonen
28
3.6.3 Durchführung der Hybridisierung
28
3.7 Knorpel- und Knochenfärbung
30
3.7.1 Fixierung der Embryonen
31
3.7.2 Durchführung der Färbung
31
3.8 Anfertigung von Gewebeschnitten am Vibratom
31
3.9 Fotografieren von Embryonen
32
3.10 Chemikalien und Reagenzien
34
4. Ergebnisse
4.1 Expressionsmuster von uncx4.1 im paraxialen Mesoderm
41
41
4.2 Expression von uncx4.1 während der Entstehung und Reifung des Sklerotoms 45
4.3 Expression von uncx4.1 außerhalb der Somiten
48
4.4 Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten
49
4.4.1 Regulation durch Signale der axialen Strukturen
49
4.4.2 Regulation durch Signale der lateralen Strukturen
55
4.4.3 Regulation durch Signale des Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres
57
4.4.4 Regulation durch Signalproteine
59
5. Diskussion
64
5.1 Regulation der Expression von uncx4.1 im präsomitischen Mesoderm durch
intrinsische Mechanismen
5.2 Rolle der uncx4.1-Expression für die Entwicklung des Achsenskeletts
64
69
5.3 Aufrechterhaltung der uncx4.1-Expression durch Signale umgebender
Strukturen
5.4 Einfluss des Neuralrohres auf die uncx4.1-Expression
71
74
5.5 Aufrechterhaltung der Segmentpolarität vom präsomitischen Mesoderm
bis zur Skelettentwicklung durch uncx4.1
76
6. Zusammenfassung
79
7. Literaturverzeichnis
80
Anhang:
Lebenslauf
97
Danksagung
100
Verzeichnis eigener Publikationen
101
Erklärung
102
1
1. Einleitung
———————————————————————————————————
1. Einleitung
In der Entwicklung der Wirbeltiere ist der Aufbau der Körpermetamerie ein
entscheidender Meilenstein. Der Aufbau einer geordneten Folge von knöchernen und
muskulären Körpersegmenten ist Voraussetzung für eine geordnete Bewegung zu
Wasser, an Land und in der Luft.
Der Aufbau der Körpermetamerie beginnt bereits während der frühen Entwicklung des
Embryos. Daher ist die Betrachtung derselben für das Verständnis der weiteren
Entwicklung unerlässlich. Zur Analyse des Aufbaus der Körpermetamerie eignen sich
die Maus und das Huhn als experimentelles Modell. Bei diesen Wirbeltieren ist der
zeitliche Ablauf der Entwicklung der des Menschen sehr ähnlich, und sie stehen für die
Wissenschaft ohne besonderen Aufwand in ausreichender Menge zur Verfügung. In
dieser Studie wird das Huhn als Modell zur Erforschung des Aufbaus der
Körpermetamerie verwendet. Seine Entwicklung wurde im Jahre 1951 von Hamburger
und Hamilton in Stadien eingeteilt (Hamburger und Hamilton, 1951).
Zu Beginn seiner Entwicklung besteht der Embryo aus zwei Keimblättern, dem
Hypoblast und dem Epiblast. Die Zellen beider Keimblätter weisen eine epitheliale
Struktur auf. Durch Organisation entlang einer Achse und Differenzierung einzelner
Zellen entsteht an einem Ende des Epiblasten der Primitivknoten, von dem ausgehend
der longitudinal verlaufende Primitivstreifen entsteht. Dieser markiert durch seinen
Verlauf die Längsachse, das kraniale und das kaudale Ende des Embryos. Zellen des
Primitivstreifens wandern während der Gastrulation zwischen den Epiblasten und den
Hypoblasten ein und bilden das dritte Keimblatt des Embryos, das Mesoderm (Lawson
et al., 1991; Lawson und Pedersen, 1992; Tam et al., 1993). Zuerst wandern die Zellen
aus der Mitte des Primitivstreifens nach lateral und bilden das Seitenplattenmesoderm,
anschließend wandern Zellen des oberen Drittels des Primitivstreifens und des
Primitivknotens ein und bilden das paraxiale Mesoderm, und zuletzt bilden aus dem
kaudalen Anteil des Primitivstreifens eingewanderte Zellen das axiale Mesoderm
(Lawson und Pedersen, 1992; Tam und Beddington, 1987; Tam et al., 1993). Die
einwandernden
epithelialen
Zellen
durchlaufen
eine
epithelio-mesenchymale
Transformation und liegen im Mesoderm als mesenchymale, bindegewebige Zellen vor.
2
1. Einleitung
———————————————————————————————————
Das axiale Mesoderm wird zu einem longitudinal verlaufenden Strang, der Chorda
dorsalis, organisiert (Tam und Beddington, 1987). Während der Gastrulation bildet sich
der Primitivstreifen von kranial nach kaudal zurück. Aus seinem verbleibenden
kaudalen Ende, dem Primitivknoten und Zellen des kaudalen paraxialen Mesoderms
entsteht die Schwanzspitze des Embryos (zusammengefasst im Tam und Trainor, 1993).
Während der Gastrulation als Stammzellen im Primitivstreifen verbliebene Zellklone
fungieren in der Schwanzspitze als Zelllager für das paraxiale Mesoderm und sichern
durch Zellteilung und –differenzierung das Längenwachstum des paraxialen Mesoderms
– ein Vorgang der als sekundäre Gastrulation bezeichnet wird (Holmdahl 1925; Ooi et
al., 1986; Tam und Beddington, 1987; Selleck und Stern, 1991).
Nach Abschluss der Gastrulation besteht der Embryo aus drei Keimblättern, dem
Ektoderm, dem Mesoderm und dem Entoderm. Die über der Chorda dorsalis liegenden
Zellen des Ektoderms differenzieren sich zu neuroektodermalen Zellen und bilden die
Neuralrinne, aus der das Neuralrohr als Anlage des zentralen Nervensystems entsteht
(zusammengefasst in Tam und Trainor, 1993).
Das Ursprungsgewebe der Körpersegmente ist das paraxiale Mesoderm, welches in
zwei longitudinalen Strängen parallel zu Neuralrohr und Chorda dorsalis verläuft. Es
wird im Kopfbereich durch die Ohrplakode in das kranial gelegene paraxiale
Kopfmesoderm und das kaudal davon gelegene präsomitische Mesoderm unterteilt.
Durch vom kranialen Ende des präsomitischen Mesoderms zu dessen kaudalen Ende
fortschreitende Segmentierung entstehen paarweise zu beiden Seiten des Neuralrohres
die Ursegmente des Körpers, die Somiten (Christ et al., 1974; zusammengefasst in Tam
und Trainor, 1993, und in Christ et al., 2000). Wird im folgenden Text von Somiten
gesprochen, so sind stets Somitenpaare gemeint. Die Somiten werden nach ihrem
Reifungszustand in Stadien eingeteilt. Dabei entspricht Somit I dem zuletzt gebildeten
Somiten und Somit –I dem als nächstes zu bildenden Somiten im präsomitischen
Mesoderm (Christ und Ordahl, 1995).
Es stellt sich nun die Frage nach dem Mechanismus, nach welchem das präsomitische
Mesoderm, ein homogener Strang mesenchymaler Zellen, segmentiert wird und dabei
geordnete, epitheliale Somiten entstehen. Fest steht, dass die von kranial nach kaudal
ablaufende Segmentierung des präsomitischen Mesoderms und die dabei gebildete
Anzahl an Somiten autonom und unabhängig von Signalen umgebender Strukturen
3
1. Einleitung
———————————————————————————————————
ablaufen (Christ et al., 1974; Packard et al., 1993). Bisher sind fünf Theorien
beschrieben worden, welche von der Morphologie über die Beobachtung zellulärer
Prozesse zur Entdeckung des molekularen Mechanismus der Segmentierung geführt
haben.
Im Zeitalter der Elektronenmikroskopie ging man davon aus, dass das präsomitische
Mesoderm schon bei seiner Entstehung in segmentale Einheiten, die Somitomere,
unterteilt ist. Diese sollten Kugeln aus mesenchymalen Zellen entsprechen, welche
durch Adhäsionsmoleküle, Filopodien und Lamellopodien zusammengehalten werden.
Aus jedem Somitomer sollte durch mesenchymal-epitheliale Transformation der Zellen
ein Somit entstehen (Meier, 1979, 1984; Jacobson, 1988). Die Somitomere waren
jedoch lediglich durch Scanning-Elektronenmikroskopie beobachtet worden, und ihre
Existenz wurde in späteren Studien zunehmend in Frage gestellt. Weder in
lichtmikroskopischen Betrachtungen noch in Messungen der Zelldichte wurden
Somitomere beobachtet (Jacob et al., 1986). 1988 wurde durch Einzelzellmarkierung
festgestellt, dass die Zellen eines mutmaßlichen Somitomers das Zellmaterial nicht nur
für einen, sondern für zwei Somiten liefern. Damit war der Beweis erbracht, dass das
vermutete, durch Somitomere definierte Vormuster des präsomitischen Mesoderms
nicht dem definitiven Muster der Somiten entsprach (Stern et al., 1988).
1976
stellten
Cooke
und
Zeeman
das
"Clock-and-wavefront-Modell"
der
Segmentierung des präsomitischen Mesoderms vor. Nach diesem Modell oszillieren alle
Zellen des präsomitischen Mesoderms, gesteuert durch eine intrinsische "Uhr",
kontinuierlich zwischen einem reifen und einem unreifen Zustand. Gleichzeitig wandert
eine "Welle" der Zelldifferenzierung vom kranialen zum kaudalen Ende des
präsomitischen Mesoderms. Trifft diese "Welle" auf Zellen, welche sich im reifen
Zustand befinden, wird die Oszillation in diesen Zellen gestoppt. Durch Verlust der
Adhäsionskräfte zwischen diesen und den sich kaudal anschließenden Zellen wird etwa
jede Stunde ein neuer Somit vom präsomitischen Mesoderm abgegrenzt. Die
Periodizität der "Uhr" und die kontinuierlich wandernde "Welle" sind Voraussetzung
für die Entstehung der korrekten, speziesspezifischen Anzahl an Somiten und einer
einheitlichen Somitengröße. Sie sind unabhängig von Signalen umgebender Strukturen
und anderen äußeren Einflüssen, wie chemische Umgebung und Temperatur (Cooke
und Zeeman, 1976).
4
1. Einleitung
———————————————————————————————————
Meinhardt stellte 1986 ein weiteres Modell der Segmentierung des paraxialen
Mesoderms vor, welches beide zuvor bekannten Modelle integrierte. Demnach sollten
im präsomitischen Mesoderm nicht einzelne Zellen, sondern Zellcluster zwischen einem
reifen und einem unreifen Zustand oszillieren. Diese Cluster müssen eine dem
präsomitischen Mesoderm intrinsische, festgelegte Anzahl von Oszillations-Zyklen
(beim Huhn 12 Zyklen) durchlaufen, bevor sie zur Differenzierung und Abgrenzung zu
den benachbarten Clustern fähig sind. Durch Aufeinandertreffen von zwei Clustern
verschiedener Zustände entsteht zwischen ausreichend differenzierten Zellen am
kranialen Ende des präsomitischen Mesoderms eine Grenze und damit ein neuer Somit
(Meinhardt, 1986).
1988/1989 stellten Primmet und Kollegen mit ihrem Modell der Segmentierung des
präsomitischen Mesoderms die Beziehung der Periodizität der Segmentierung zum
Zellzyklus her. Sie stellten fest, dass Hitzeschock-Applikationen in den verschiedenen
Phasen des Zellzyklus zu regelmäßigen, alle 6 bis 7 Somiten auftretenden
Somitenanomalien führten. Die Frage nach dem genauen Zusammenhang zwischen dem
9,5 Stunden dauernden Zellzyklus und dem 90 Minuten dauernden Zyklus der
Somitenbildung blieb jedoch weiterhin ungeklärt (Primmet et al., 1988, 1989;
zusammengefasst in Gossler und Hrabe de Angelis, 1998).
Der erste molekulare Ansatz der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms wurde
1997 von Palmeirim und Kollegen vorgestellt. Er beschreibt die zyklische Expression
des Gens
c-hairy1, einem Homologen des Gens hairy der Fruchtfliege Drosophila
melanogaster, im präsomitischen Mesoderm des Hühnerembryos während dessen
Segmentierung. C-hairy1 ist im präsomitischen Mesoderm in einer zyklischen Abfolge
in drei Phasen exprimiert, deren Gesamtdauer 90 Minuten beträgt: In Phase I ist chairy1 in einem breiten, die kaudalen zwei Drittel des präsomitischen Mesoderms
ausfüllenden Streifen und einem schmalen Streifen in der kaudalen Hälfte des Somiten I
exprimiert. In Phase II verschmälert sich der Streifen im präsomitischen Mesoderm auf
den Bereich der Somiten –I bis –III, und in Phase III auf die kaudale Hälfte des Somiten
–I. Nach Abschluss der drei Phasen entsteht zwischen der kaudalen Hälfte des Somiten
–I, welche c-hairy1 exprimiert, und dem unsegmentierten präsomitischen Mesoderm
eine Grenze und damit ein neuer Somit. Die zyklische Expression von c-hairy1 im
präsomitischen Mesoderm wird durch intrinsische Mechanismen des präsomitischen
5
1. Einleitung
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Mesoderms gesteuert und ist unabhängig von Signalen umgebender Strukturen. Eine
Bewegung der Zellen des präsomitischen Mesoderms vom kaudalen zum kranialen
Ende – als mögliche Erklärung für die nach kranial wandernde Expressionsdomäne –
konnte ebenfalls ausgeschlossen werden (Palmeirim et al., 1997).
Ein weiteres, im präsomitischen Mesoderm in drei Phasen exprimiertes Gen ist lunatic
fringe, welches für die Glycosyltransferase Lunatic Fringe kodiert (Forsberg et al.,
1998; Aulehla und Johnson, 1999). Bei Drosophila melanogaster ist Lunatic Fringe ein
Homolog der Glycosyltransferase Fringe, welche durch Inhibition des weiteren
Wachstums die distale Begrenzung des Flügels determiniert (Irvine und Wieschaus,
1994; Fleming et al., 1997; Panin et al., 1997). Im präsomitischen Mesoderm der Maus
und des Huhns ist lunatic fringe in der ersten Phase im mittleren Teil exprimiert. Diese
Expressionsdomäne dehnt sich in der zweiten Phase nach kranial und kaudal aus. In der
dritten Phase schließlich ist lunatic fringe als ein schmaler Streifen in der kranialen
Hälfte des Somiten –I exprimiert. Die Gesamtdauer der drei Phasen beträgt 90 Minuten
und entspricht damit der Dauer der Bildung eines neuen Somitenpaares. Gegenüber der
Expression von c-hairy1 im präsomitischen Mesoderm ist die Expression von lunatic
fringe stets um eine Phase verzögert (Aulehla und Johnson, 1999).
Der Transkriptionsfaktor c-Hairy1 und die Glykosyltransferase Lunatic Fringe sind
Modulatoren des Notch-Delta-Signalweges (Palmeirim et al., 1997, 1998; Johnston et
al., 1997; Evrard et al., 1998; Zhang und Gridley, 1998; Aulehla und Johnson, 1999;
Dale et al., 2003). Dieser in der Evolution hochkonservierte Signalweg bewirkt bei
Insekten und Vertebraten die Grenzentstehung zwischen ursprünglich identischen
Zellen oder Zellverbänden. Neben seiner Rolle bei der Begrenzung des distalen Flügels
bei Drosophila melanogaster und bei der Gonadenentwicklung des Wurms
Caenorrhabditis elegans ist er bei der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms
der Vertebraten von entscheidender Bedeutung. Hierbei führt die Interaktion des
transmembranären Rezeptors Notch einer Zelle mit dem transmembranären Liganden
Delta einer benachbarten Zelle zu einer Konformationsänderung des Notch-Rezeptors,
zu einer Verlagerung der an seiner intrazellulären Domäne bindenden Supressor-ofHairless [Su(H)]-Proteine in den Zellkern, Bindung dieser an den Enhancer-of-splitKomplex der DNA und zur Expression der Gene der CBF1/RBPJĸ– Genfamilie. Diese
induzieren die Expression der Effektorgene des Notch-Delta-Signalweges, bei den
6
1. Einleitung
———————————————————————————————————
Vertebraten
die
für
basic-Helix-Loop-Helix
(bHLH)-Transkriptionsfaktoren
kodierenden Gene des hes-Komplexes (hes1, hes3, hes5 und hes7), mesp1, mesp2, cmeso2 sowie die Glykosyltransferase lunatic fringe (Saga et al., 1996, 1997; Cohen et
al., 1997; Johnston et al., 1997; Forsberg et al., 1998; Holley et al., 2000; Jouve et al.,
2000; Sawada et al., 2000; Bessho et al., 2001; Buchberger et al., 2002). Die Interaktion
von Rezeptor (Notch) und Ligand (Delta) führt zu einer Vermehrung bestimmter
Signale in einigen Zellen und gleichzeitiger Herunterregulation dieser Signale in
angrenzenden Zellen. Durch diesen, "laterale Spezifizierung", genannten Mechanismus
werden Zellverbände des präsomitischen Mesoderms gegenüber den ihnen benachbarten
Zellverbänden in ihren Eigenschaften verändert. Zwischen den Zellverbänden entsteht
durch Verlust der Adhäsionsmoleküle eine Grenze (Artavanis-Tsakonas et al., 1995;
Artavanis-Tsakonas et al., 1999, zusammengefasst in Rida et al., 2004). Die Aktivität
des Notch-Delta-Signalweges im Rahmen der Segmentierung des präsomitischen
Mesoderms wird durch seine Effektorgene reguliert und ist unabhängig von Signalen
umgebender Strukturen. C-Hairy1 aktiviert den Notch-Delta-Signalweg, indem es die
Expression von delta induziert (Palmeirim et al., 1997, 1998). Lunatic Fringe dagegen
hemmt den Notch-Delta-Signalweg, indem es im kranialen Anteil des präsomitischen
Mesoderms die Interaktion zwischen dem Rezeptor Notch und seinem Liganden Delta
verhindert. Durch Herunterregulation des Notch-Delta-Signalweges reguliert Lunatic
Fringe auch indirekt die Aktivität von c-Hairy1, da c-hairy1 (bei Fliegen und
Invertebraten) als Mitglied der Hairy/Enhancer of Split-Genfamilie ein Effektorgen des
Notch-Delta-Signalweges ist. Die Herunterregulation der Notch-Signaltransduktion
führt zum Anhalten der Oszillationen (Evrard et al., 1998; Aulehla et al., 1999; Dale et
al., 2003). Das Zusammenwirken seiner Regulatoren bewirkt eine geordnete
Aktivierung und Hemmung des Notch-Delta-Signalweges und damit eine geordnete
Segmentierung (Gridley et al., 1997; Greenwald et al., 1998; Evrard et al., 1998;
Aulehla et al., 1999).
Weitere Regulatoren des Notch-Delta-Signalweges während der Segmentierung des
präsomitischen Mesoderms sind die Proteine des Wnt-ß-Catenin-Signalweges. Bei
Drosophila sind die Wingless-Proteine Homologe von Wnt und finden sich im
präsomitischen Mesoderm in einem von kranial nach kaudal ansteigenden Gradienten
(Behrens et a., 1998; Aulehla et al., 2003). Sie induzieren die Transkription der
7
1. Einleitung
———————————————————————————————————
Fibroblast-Growth-Factors (FGF) – Proteine, welche durch periodische Inhibition des
Notch-Delta-Signalweges im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms die
Position der Somitengrenzen determinieren (Mohammadi et al., 1997; Dubrulle et al.,
2001). Hierbei spielt der Faktor Wnt-3a, welcher die Expression des für den
Transkriptionsfaktor FGF-8 kodierenden Gens fgf-8 induziert, eine entscheidende Rolle.
FGF-8 ist in hoher Konzentration im kaudalen Anteil des präsomitischen Mesoderms,
sein Rezeptor FGFR-1 im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms lokalisiert
(Yamaguchi et al., 1994; Dubrulle et al., 2001; Sawada et al., 2001; Stolte et al., 2002;
Dubrulle und Pourquié, 2004). Durch Interaktion zwischen Rezeptor und Ligand wird
die Aktivität des Notch-Delta-Signalweges gehemmt und damit die kaudale Begrenzung
des nächsten zu bildenden Somiten determiniert (Dubrulle et al., 2001). Die Aktivität
von Wnt-3a und FGF-8 wird in periodischen Abständen durch den Wnt-3a-Inhibitor
Axin2 gehemmt. Das für Axin2 kodierende Gen ist im präsomitischen Mesoderm in
periodischer Abfolge in drei Phasen exprimiert. Da diese drei Phasen denen der
Expression von lunatic fringe im präsomitischen Mesoderm jeweils um eine Phase
vorausgehen, werden die Proteine des Wnt-Signalweges als direkte Regulatoren des
Notch-Signalweges im präsomitischen Mesoderm angesehen (Aulehla et al., 2003).
Die Expression von Genen des Notch-Delta-Signalweges und seiner Modulatoren findet
sich nach Abschluss der Segmentierung in den neugebildeten Somiten wieder. So ist
notch in der kranialen Hälfte des Somiten I, lunatic fringe in den kranialen Hälften der
Somiten I bis III, mesp2 und ripply2 in der kranialen Hälfte des Somiten I, delta, chairy1 und semaphorinD in den kaudalen Hälften der Somiten I bis III und c-meso2 in
den kaudalen Hälften der Somiten I bis III exprimiert (Püschel et al., 1995; Wright et
al., 1995; Messersmith et al., 1995; Hrabe de Angelis et al., 1997; Palmeirim et al.,
1997, 1998; Saga et al., 1997; Aulehla et al., 1999; Mansouri et al., 2000; Buchberger
et al., 2002; Nomura-Kitabayashi et al., 2002; Kawamura et al., 2005; Chan et al.,
2007). Die Expressionsmuster der genannten Gene lassen in jedem Somiten eine
kraniokaudale Polarität erkennen. Diese ist bereits im präsomitischen Mesoderm in
Höhe des Somiten -V endgültig determiniert, und die Determinierung geschieht wie die
Segmentierung selbst unabhängig von Signalen umgebender Strukturen. Durch die
Expression von Genen des Notch-Delta-Signalweges und deren Persistenz in entweder
der kranialen oder der kaudalen Hälfte eines prospektiven Somiten erhalten die
8
1. Einleitung
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Somitenhälften unterschiedliche Eigenschaften (Keynes und Stern, 1988; Palmeirim
et al., 1997, 1998; Gossler und Hrabe de Angelis, 1998; Dubrulle et al., 2001).
Nach autonom erfolgter Segmentierung des präsomitischen Mesoderms und
kraniokaudaler Polarisierung der (prospektiven) Somiten ist die Epithelialisierung der
neugebildeten Somiten der erste Schritt in der Somitogenese, welcher Signale
umgebender Strukturen erfordert. Die Umwandlung der mesenchymalen Zellen in
epitheliale Zellen durch epithelio-mesenchymale Transformation erfordert die Präsenz
des Transkriptionsfaktors Paraxis, und für die Expression des für ihn kodierenden Gens
paraxis in den neugebildeten Somiten sind Signale des Ektoderms notwendig. Bei
fehlendem Ektoderm bleibt die epithelio-mesenchymale Transformation der Somiten
aus (Burgess et al., 1996; Šoš
ičet al., 1997).
Jeder Somit durchläuft eine Reifung, während welcher er die Eigenschaften für die
Bildung seiner Derivate – der Wirbel, der Muskulatur des Rückens und der
Extremitäten sowie der Dermis des Rückens – entwickelt. Während der Reifung des
Somiten kommt es zu deutlichen Veränderungen seiner Morphologie (Christ und
Ordahl, 1995; zusammengefasst in Christ et al., 2000). In den Somitenstadien I bis III
besteht jeder Somit aus einem äußeren epithelialen Randwall und dem inneren
mesenchymalen Somitocoel. Im Somiten IV beginnt die Kompartimentierung des
Somiten in das dorsal gelegene, epitheliale Dermomyotom und das ventral gelegene,
mesenchymale Sklerotom. In das Sklerotom werden das Somitocoel und die Zellen des
ventralen epithelialen Randwalls, welche eine epithelio-mesenchymale Transformation
durchlaufen, einbezogen. Für die Kompartimentierung des Somiten und die
nachfolgende Differenzierung der Zellen von Dermomyotom und Sklerotom sind
Signale umgebender Strukturen notwendig. Bone Morphogenetic Protein (BMP)-4,
Wnt-1 und Wnt-3a als Signalmoleküle des Ektoderms, des dorsalen Anteils des
Neuralrohres und des Seitenplattenmesoderms fördern durch Induktion der Gene pax3
und myoD die Entwicklung des Dermomyotoms. Noggin und Sonic hedgehog (Shh) als
Signalmoleküle
des
Chorda-Bodenplatten-Komplexes
dagegen
induzieren
die
Expression von pax1 und fördern die Entwicklung des Sklerotoms. Durch die
antagonistische Wirkung der Signalmoleküle wird gleichzeitig das jeweils andere
Kompartiment in seiner Entwicklung und Ausdehnung gehemmt (Brand-Saberi et al.,
1993; Dietrich et al., 1993; Goulding et al., 1993, 1994; Pourquié et al., 1993, 1995,
9
1. Einleitung
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1996; Fan und Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994; Monsoro-Burq et al., 1994,
1996; Williams und Ordahl, 1994; Ebensperger et al., 1995; Hirano et al., 1995; Müller
et al., 1996; Hirsinger et al., 1997; Borycki et al., 1998; McMahon et al., 1998;
Watanabe et al., 1998; Wagner et al., 2000; Sanders et al., 2001; Schmidt et al., 2001).
Das Dermomyotom liefert das Material für die Dermis und die autochtone Muskulatur
des Rückens, die Muskulatur der Extremitäten, die Skapula, die distalen Anteile der
Rippen, Gefäßendothelzellen und die glatte Muskulatur der Organe (Kato und Aoyama,
1998; zusammengefasst in Christ et al., 2000). Aus dem Sklerotom entstehen die
Wirbel, die Bandscheiben und die proximalen Anteile der Rippen (Christ und Wilting,
1992; Huang et al., 1996, 2000b; zusammengefasst in Christ et al., 2000). Als
Vorbereitung der Entwicklung der Derivate seiner verschiedenen Anteile erfährt das
Sklerotom während seiner Reifung deutliche Veränderungen in Form und Größe.
Unmittelbar nach seiner Bildung im Somiten IV hat das Sklerotom die Form eines
gleichseitigen Dreiecks mit einer ventralen, einer dorsalen und einer lateralen Ecke. Die
dorsale und die laterale Ecke wachsen nach dorsal bzw. ventrolateral aus, während die
ventrale Ecke in ihrem Wachstum zurückbleibt. Aus dem ventromedialen Anteil des
Sklerotoms entstehen die Wirbelkörper und die Bandscheiben, aus dem dorsalen Anteil
die Bogenwurzeln und die Wirbelbögen und aus dem lateralen Anteil die Querfortsätze
und die proximalen Rippen (zusammengefasst in Christ et al., 2000). Die verschiedenen
Anteile des Sklerotoms zeigen unterschiedliche Genexpression: Pax1 ist dabei im
medialen Anteil, scleraxis im ventrolateralen Anteil, msx1 und msx2 im dorsalen Anteil
des Sklerotoms exprimiert (Takahashi et al., 1992; Monsoro-Burq et al., 1994; Cserjesi
et al., 1995; Ebensperger et al., 1995; Brand-Saberi et al., 1996; Monsoro-Burq und Le
Douarin, 2000).
Während das Dermomyotom zu keinem Zeitpunkt eine kraniokaudale Polarität
aufweist,
wird
die
während
der
Segmentierung determinierte kraniokaudale
Somitenpolarität im Sklerotom bis zur Entwicklung der Wirbel beibehalten. Sie
zeichnet sich durch die Expression verschiedener Gene in der kranialen – m-cer, mesp2,
ephA4 und tbx18 – und in der kaudalen Sklerotomhälfte – m-twist und pax9 – aus
(Füchtbauer et al., 1995; Müller et al., 1996; Saga et al., 1997; Biben et al., 1998;
Schmidt et al., 2001; Barrios et al., 2003; Bussen et al., 2004). Zudem weist die
kraniale Sklerotomhälfte eine lockere Zelldichte auf, während die kaudale Hälfte dicht
10
1. Einleitung
———————————————————————————————————
gepackte Zellen enthält. Dieses ist für die Segmentierung des zentralen Nervensystems
von großer Bedeutung, da die aus dem Neuralrohr in die Peripherie aussprossenden
Axone nur in die kraniale Sklerotomhälfte einwachsen können (Keynes und Stern,
1984; Kalcheim und Teillet, 1989; Lim et al., 1991; Stern et al., 1991). Das
morphologische Korrelat der kraniokaudalen Somitenpolarität ist die von Ebner`sche
Fissur, welche als intersomitische Grenze die kraniale und die kaudale Somitenhälfte
mit ihren jeweils spezifischen Eigenschaften voneinander separiert (von Ebner, 1888,
1892; Christ, 1975). Zur Bildung eines Wirbels muss eine kaudale Sklerotomhälfte mit
der
kranialen
Sklerotomhälfte
des
sich
kaudal
anschließenden
Somiten
aufeinandertreffen. Diese "Resegmentierung" des paraxialen Mesoderms wurde
erstmals 1850 von Remak beschrieben, und seither durch zahlreiche Studien bestätigt
(Remak, 1850; Bagnall et al., 1988, 1989; Huang et al., 1994, 2000a; zusammengefasst
in Christ et al., 1998). Die Elemente des Achsenskeletts werden somit aus Zellmaterial
der kaudalen (Bogenwurzeln, Wirbelbögen, Querfortsätze und proximale Rippen) oder
der kranialen Sklerotomhälfte (kaudaler Anteil des Wirbelkörpers, Dornfortsatz)
gebildet (Huang et al., 1994, 2000b; zusammengefasst in Christ et al., 2000). Da das
Dermomyotom keine kraniokaudale Polarität aufweist und somit nicht in die
Resegmentierung miteinbezogen wird, verbinden die sich aus dem Dermomyotom eines
Somiten entwickelnden segmentalen Muskeln jeweils zwei Wirbel miteinander. Ein
Bewegungssegment besteht aus den Derivaten eines Somiten: zwei Wirbelhälften und
dem sie verbindenden segmentalen Muskel (von Ebner, 1888, 1892; Schultze, 1896;
Köntges und Lumsden, 1996).
Ein wichtiger Marker der kraniokaudale Somitenpolarität ist das Gen uncx4.1, welches
für den Transkriptionsfaktor Uncx4.1 kodiert (Rovescalli et al., 1996; Del Barco
Barrantes et al., 1999). Uncx4.1 wurde für die Maus erstmals 1996 von Rovescalli und
Kollegen kloniert (Rovescalli et al., 1996). Es besteht aus zwei Exons (138 und 151
Nukleotide), welche durch ein Intron getrennt sind. Die Exons codieren für die
Homöodomäne des Transkriptionsfaktors Uncx4.1, welche zwischen den Positionen 1
und 60 innerhalb eines offenen Leserahmens von mindestens 386 Aminosäuren liegt
(Rovescalli et al., 1996; Mansouri et al., 1997). Die Aminosäuresequenz von Uncx4.1
zeigt eine Identität von 88 % zu der des Proteins Unc-4 des Fadenwurms
Caenorrhabditis elegans (Miller et al., 1992; Rovescalli et al., 1996; Mansouri et al.,
11
1. Einleitung
———————————————————————————————————
1997; Neidhardt et al., 1997). Northern-Blot-Analysen von verschiedenen Geweben der
embryonalen Maus (Tag 7 bis Tag17) ergaben eine Expression von uncx4.1 im Herz-,
Gehirn-, Milz-, Lungen-, Leber- und Nierengewebe. In Geweben der adulten Maus
dagegen fand sich uncx4.1 nicht mehr im Herzen, jedoch zusätzlich im Hodengewebe
(Rovescalli et al., 1996).
Whole-mount in situ-Hybridisierungen an Mausembryonen ergaben ein dazu passendes
Bild. Uncx4.1 ist ab dem 8. Tag im ersten Branchialbogen und in den kaudalen Hälften
eines jeden Somiten exprimiert. Ab dem 9. Tag findet sich eine Expression von uncx4.1
zusätzlich im Mesonephros, im nephrogenen Band und im zentralen Nervensystem
(Mansouri et al., 1997; Neidhardt et al., 1997). Im peritubulären Mesenchym der
Nierenanlage folgt die Expression der Entwicklung, als ein longitudinal verlaufendes
Band im intermediären Mesoderm ist sie vom 8. Tag an erst im Pronephros, nach
dessen Degeneration im Mesonephros und schließlich in hoher Intensität im
Metanephros zu erkennen. Im zentralen Nervensystem beginnt die Expression im
Mittelhirn, schreitet dann über die Riechgrube fort und ist schließlich in der Wand der
Hirnventrikel zu finden (Mansouri et al., 1997; Neidhardt et al., 1997; Asbreuk et al.,
2006).
Uncx4.1 ist als Zielgen des Notch-Delta-Signalweges in den kaudalen Hälften
neugebildeter Somiten exprimiert (Del Barco Barrantes et al., 1999). Nach erfolgter
Kompartimentierung des Somiten in das ventral gelegene Sklerotom und das dorsal
gelegene Dermomyotom im Somiten IV ist die Expression von uncx4.1 nur noch in der
kaudalen Sklerotomhälfte zu erkennen (Neidhardt et al., 1997). Im lateralen Anteil der
kaudalen Sklerotomhälfte bleibt die Expression bis zur Entwicklung der daraus
hervorgehenden Elemente des Achsenskeletts – Wirbelbögen, Bogenwurzeln und
proximale Rippen – erhalten (Neidhardt et al., 1997). Uncx4.1 ist dann in den
knorpeligen Anlagen der proximalen Rippen, der Wirbelbögen, der kranialen Hälften
der distalen Rippen und der lateralen Anteile der Wirbel und Bandscheiben exprimiert.
Eine Expressionsdomäne im ersten Finger der oberen Extremität konnte nur vom 13. bis
zum 16. Tag, eine weitere im ersten Branchialbogen nur vom 9. bis zum 10. Tag
nachgewiesen werden (Neidhardt et al., 1997).
Mithilfe von uncx4.1-Knockout-Mäusen wurden die Funktionen von Uncx4.1 in der
Embryonalentwicklung von Mausembryonen untersucht. Eine bedeutende Rolle wird
12
1. Einleitung
———————————————————————————————————
Uncx4.1 während der Entwicklung des Achsenskeletts zuteil. Hier erhält er – als
Produkt eines direkten Zielgens des Notch-Delta-Signalweges – die kraniokaudale
Polarität der Somiten bis zur Entstehung der Wirbel (Mansouri et al., 2000; Leitges et
al., 2000). Mutationsanalysen an Mäusen ergaben, dass bei homozygoten uncx4.1-/-Mäusen die kraniokaudale Polarität der Somiten aufgehoben ist und es zu einer
kompletten Fusion der Wirbel und der Spinalganglien kommt (Mansouri et al., 2000;
Leitges et al., 2000). Die Mäuse zeichnen sich durch einen stark verkürzten Rumpf mit
einer Lordose der thorakalen Wirbelsäule aus und sterben wenige Tage nach der Geburt
an respiratorischer Insuffizienz. Des weiteren ist Uncx4.1 für die korrekte Entwicklung
der Derivate des lateralen Anteils der kaudalen Sklerotomhälfte essenziell. Uncx4.1-/-Mäusen fehlen die Wirbelbögen, die Bogenwurzeln und die proximalen Rippen
vollständig, bei uncx4.1+/--Mäusen sind diese Skelettelemente rudimentär angelegt
(Mansouri et al., 2000; Leitges et al., 2000). Die Rollen von Uncx4.1 während der
Entwicklung des zentralen Nervensystems und der Niere sind bislang unklar.
13
2. Fragestellung dieser Arbeit
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2. Fragestellung dieser Arbeit
Uncx4.1 stellt als Zielgen des Notch-Delta-Signalweges, Marker der kaudalen
Sklerotom-hälfte
und
essenzieller
Faktor
für
die
Entwicklung
einiger
Achsenskelettelemente die einzige bislang bekannte Verbindung zwischen der
Determinierung der kraniokaudalen Somitenpolarität und der Entwicklung des
Achsenskeletts dar. Dies ist ein neuer Baustein des komplexen Mechanismus der
Entwicklung des Achsenskeletts, und gibt Anlass zu folgenden Fragen:
-
Ist das Gen uncx4.1 auch in Hühnerembryonen exprimiert? Wie ist ggf. der
räumliche und zeitliche Ablauf seiner Expression?
-
Kann eine eventuelle Expression von uncx4.1 in den Somiten durch Signale
umgebender Strukturen beeinflusst werden, wie es für andere Markergene des
Sklerotoms der Fall ist?
-
Spielt Uncx4.1 in der Entwicklung der Achsenskelettelemente beim Huhn
dieselbe Rolle wie bei der Maus?
Zur Klärung dieser Fragen wird in dieser Studie zunächst ein Fragment der
vogelspezifischen
uncx4.1-cDNA
Hühnerembryonen
verschiedener
isoliert.
Durch
in
Entwicklungsstadien
situ-Hybridisierung
mit
der
mRNA
von
dieses
Fragmentes wird der zeitliche und räumliche Verlauf der Expression von uncx4.1 beim
Huhn im allgemeinen sowie während der Entwicklung und Reifung des Sklerotoms im
besonderen dargestellt. Die Regulation seiner Expression in den Somiten durch Signale
umgebender Strukturen wird durch in situ-Hybridisierung an mikrochirurgisch
manipulierten Embryonen untersucht. Aus dem räumlichen und zeitlichen Verlauf der
Expression von uncx4.1 in den Somiten kann die mögliche Funktion des
Transkriptionsfaktors Uncx4.1 beim Huhn während der Entwicklung des Achsenskeletts
beschrieben werden.
14
3. Material und Methoden
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3. Material und Methoden
3.1 Tiere
Reinerbige Hühnerembryonen der Gattung Weißes Leghorn wurden von der
Hühnerfarm Bronner in Freiburg-Tiengen bezogen und bis zu ihrer Inkubation bei 8°C
maximal 2 Tage im Kühlschrank gelagert. Anschließend wurden die Eier in einem
Brutschrank bei 37°C und 80% Luftfeuchte bis zum Erreichen des gewünschten
Entwicklungsstadiums der Embryonen nach Hamburger und Hamilton (HH)
(Hamburger und Hamilton, 1951) bebrütet. Dazu wurden die Eier auf Paletten gelagert,
um einer Fehllage der Embryonen vorzubeugen.
Für die durchgeführten Manipulationen wurden Embryonen der Stadien HH-11 bis HH14 verwendet.
3.2 Operations-Instrumentarium
Einstrichsägen aus Metall: zum Öffnen der Eischale
Dumont-Pinzetten: zum Öffnen der Eimembran
Iridektomieschere
Federschere
Schere spitz/spitz: zum Eröffnen der Eischale vor der Fixierung des Embryos
Keratoplastikspatel
Wolframdraht-Nadeln, elektrolytisch geschärft
Färbestifte
Pasteurpipetten aus Glas: zur Applikation von Locke-Lösung
Sterile 2 ml-Spritzen und Kanülen (21 G): zum Absaugen von Eiweiß, um den Embryo
nach Beendigung der Operation im Ei wieder abzusenken
15
3. Material und Methoden
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Locke-Lösung mit Penicillin (100 000 I.U./ml): zu Befeuchtung des Embryos während
der Operation
Goldfolie und Aluminiumfolie: als Material für Barrieren
Kügelchen, mit Protein beladen: Affigel®-Kügelchen (Shh, Noggin) mit Heparin,
Acrylamid-Kügelchen (FGF-8) und AG 1-X2 Kügelchen (SU 5402)
3.3 Herstellung der für die Operationen verwendeten Materialien
3.3.1 Operationsnadeln
Für die Herstellung von Operationsnadeln wurde ein Wolframdrahtstück von 2 cm
Länge und 5 mm Durchmesser in die vordere Öffnung einer Glaspasteurpipette mit
Hilfe der Flamme eines Bunsenbrenners eingeschmolzen. Dieser Wolframdraht wurde
anschließend an der Kathode in einer gesättigten Natriumnitrit-Lösung bei einer
Spannung von 4 Volt elektrolysiert, um ihn zu schärfen und anzuspitzen. Dazu wurde
der Wolframdraht mehrmals in die Natriumnitrit-Lösung, welche die Anode enthielt,
eingetaucht.
3.3.2 Färbestifte
Zur Herstellung von Färbestiften, die der Markierung des Embryos in ovo dienten, wurden
20 cm lange Glasstäbe von ca. 6 mm Durchmesser bis zum Erreichen der gewünschten
Dicke des Färbestiftes über der Flamme eines Bunsenbrenners auseinandergezogen. Durch
anschließend kurzen Kontakt der Stiftspitze mit der Flamme eines Alkoholbrenners
entstand dort eine kleine Kugel, auf die die Farbe aufgetragen wurde. Die Farblösung wurde
aus 0,25 g Agarose und 0,1 g Nilblausulfat (Nile Blue Sulfate, Serva/Heidelberg) in 10 ml
Aqua dest. unter Erhitzen der Lösung auf 70°C und ständigem Rühren auf einem Heiz-
16
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Magnetrührer hergestellt. Danach wurden die Spitzen der Stifte nacheinander mehrmals
kurz in die Farblösung eingetaucht und anschließend bei Raumtemperatur gelagert.
3.3.3 Protein-Träger-Kügelchen
Zur Herstellung von mit Protein beladenen Kügelchen wurden Affigel®-Kügelchen mit
Heparin für die Proteine Sonic hedgehog (Shh) und Noggin, Acrylamid-Kügelchen für
FGF-8 und AG 1-X2-Kügelchen für SU 5402 verwendet. Um ein Auslaufen des
Proteins zu vermeiden und die optimale Beladung der Kügelchen zu gewährleisten,
wurden für ihre Herstellung ausschließlich mit chloriertem Organopolysiloxan
beschichtete Materialien benutzt. 10 μl dieser Kügelchen wurden mittels eine
Mikropipette auf die Oberseite des Deckels eines 2 ml-Reaktionsgefäßes gebracht.
Durch zweimaliges kurzes Waschen der Kügelchen mit sterilem Phosphatpuffer mit
1 % Bovinem Serum-Albumin wurde die Lagerungslösung der Kügelchen von diesen
entfernt und die Kügelchen für das Protein aufnahmefähig gemacht. Die mit SU 5402
beladenen Kügelchen wurden mehrmals in Minimum Essential Medium Alpha
gewaschen, um das Dimethylsulfoxid, in dem das Protein gelöst war, zu entfernen.
Unter dem Mikroskop wurden die Kügelchen, die für die vorgesehene Operation zu
groß waren, mit einer Mikropipette entfernt. Dadurch verringerte sich das
Gesamtvolumen der Kügelchen. Anschließend wurde 1 μl des gewünschten Proteins auf
die Kügelchen aufgetragen, und die Kügelchen wurden 2 Tage in einer sterilen
Kulturschale von 35 mm Durchmesser, die in eine sterile Kulturschale von 50 mm
Durchmesser mit sterilem Phosphatpuffer gestellt wurde, bei 4°C inkubiert. Dicht
verschlossen, ausreichend befeuchtet und steril gehalten hielten sich die Kügelchen im
Kühlschrank 2 Wochen. Die Kügelchen wurden mit folgenden Protein-Konzentrationen
beladen:
FGF-8: 2 µg / µl
SU 5402: 10 mM
Noggin: 5 µg / µl
Shh: 8 µg / µl
17
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
3.3.4 Agaroseschalen
Für die für einige Manipulationen außerhalb des Eies benötigten Agaroseschalen
wurde 2 % Agarose in Aqua dest. unter ständigem Rühren aufgekocht und die heiße
Lösung in Zellkulturschalen von 5 cm Durchmesser gegossen, sodass eine Schicht von
5 mm Dicke entstand. Die Agaroseschalen wurden über Nacht bei Raumtemperatur
getrocknet und anschließend im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt.
3.4 Mikromanipulationen
Alle Operationen an den Hühnerembryonen wurden in einem eigenen Operationsraum
durchgeführt, der durch UV-Strahlung keimarm gehalten wurde. Die Arbeitsfläche
wurde vor Beginn der Operation mit 70% Ethanol desinfiziert. Die Operationen fanden
unter Stereomikroskopen des Typs Wild M3Z der Firma Leica statt, an denen 6,5-fache
bis 40-fache Vergrößerungen erreicht werden konnten.
Die Eier wurden direkt nach ihrer Entnahme aus dem Brutschrank auf einem Holzkasten
über einem Loch mit einer 100 W-Glühbirne von unten beleuchtet, und die Lage des
Embryos sowie die der Luftkammer wurden mit einem Bleistift auf der Schale markiert.
Für die Operation wurden die Eier mit der markierten Stelle nach oben auf eigens zu
diesem Zweck angefertigte Nester gelegt, jedes bestehend aus einer mit Aluminiumfolie
und einem Zellstofftupfer ausgepolsterten Kulturschale von 50 mm Durchmesser.
Anschließend wurde mit einer Einstrichsäge ein etwa 5 mm hohes und 5 mm breites
Fenster über dem Embryo in die Eischale gesägt. Ebenso wurde diese über der
Luftkammer mit der Einstrichsäge perforiert. Mit einer Dumont-Pinzette wurde das
herausgesägte Stück der Eischale vorsichtig angehoben und entfernt, und sogleich
wurden zur Vermeidung der Austrocknung des Embryos mit einer Glaspasteurpipette
einige Tropfen Locke-Lösung auf die Eimembran getropft. Dann wurde die Eimembran
mit einer Dumont-Pinzette im Bereich des Fensters vorsichtig entfernt, und wieder
18
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Locke-Lösung auf den nun sichtbaren Embryo gegeben. Um den Embryo während der
Operation in einer stabilen Position zu halten, wurde die Luft aus dem Ei durch
Perforieren der Eimembran im Bereich der zuvor gesägten Öffnung der Luftkammer
abgelassen. Die Luft wurde anschließend durch vorsichtiges Einträufeln von LockeLösung ersetzt. An dem nun an der Oberfläche des Eies liegenden Embryo konnte
dessen Entwicklungsstadium bestimmt werden. Im Operationsbereich wurde die
Vitellinmembran mit einem Färbestift kurz angefärbt und dann mit einer Wolframnadel
eröffnet. Um eine Austrocknung des freigelegten Embryos während der Operation zu
verhindern, wurde seine Oberfläche mehrmals mit Locke-Lösung befeuchtet. Nach
Beendigung der Operation wurde mit einer Spritze und einer Kanüle 1 ml Eiweiß und
Locke-Lösung durch die Öffnung der Luftkammer abgesaugt und der Embryo dadurch
wieder in das Ei abgesenkt. Die Öffnungen der Eischale wurden mit Leukosilk®
verschlossen und der Embryo mit dem Nest auf einem Gitter im Inkubator 12 Stunden
bis 6 Tage reinkubiert. Im Anschluss an die Reinkubation wurde das Ei im Bereich des
mit Leukosilk® verschlossenen Fensters mit einer spitz/spitzen Schere aufgeschnitten,
der Embryo mit einem Keratoplastikspatel aus dem Ei gehoben und in eine sterile
Kulturschale mit der für die jeweilige Fixierung erforderlichen Lösung gelegt.
Anschließend wurde unter dem Stereomikroskop das Stadium des Embryos bestimmt
und dieses sowie eventuell bereits sichtbare Veränderungen dokumentiert.
Über jede einzelne Operation wurde ein Protokoll geführt, aus dem Zeitpunkt und Art
der Operation, das Stadium des Embryos bei der Operation und bei der Fixierung, die
Art der Fixierung, die Weiterverarbeitung des Embryos sowie das Resultat
hervorgingen.
Je nach Art und Umfang der Operationen wurden Überlebensraten von 50 % bis 90 %
erzielt.
19
3. Material und Methoden
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3.4.1 Implantation von Barrieren
Zwischen die axialen Organe und den kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms
bzw. die Somiten I bis V
Mit einer Wolframdrahtnadel wurden an der Grenze zwischen den axialen Organen und
dem kranialen präsomitischen Mesoderm bzw. den Somiten I bis V nacheinander das
Ektoderm, das Mesoderm und das Entoderm auf einer Länge von 5 prospektiven
Somiten durchgetrennt. Aus einer sterilisierten Aluminiumfolie wurde mit Hilfe einer
Federschere unter dem Mikroskop ein Streifen gleicher Länge geschnitten, der dann
mittels einer spitzen Pinzette in das Loch zwischen den axialen Organen und dem
kranialen präsomitischen Mesoderm eingebracht wurde. Durch vorsichtiges Absaugen
von Locke-Lösung von der Oberseite des Embryos mit einem Zellstofftupfer schloss
sich das Loch und der Aluminiumstreifen wurde darin festgehalten (Schema 1 und 2).
Schema 1
Schema 2
Zwischen die lateralen Organe und den kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms
bzw. die Somiten I bis V
Mit
einer
Wolframdrahtnadel
wurden
an
der
Grenze
zwischen
dem
Seitenplattenmesoderm und dem kranialen präsomitischen Mesoderm bzw. zwischen
dem intermediären Mesoderm und den Somiten I bis V nacheinander das Ektoderm, das
Mesoderm und das Entoderm auf einer Länge von 5 (prospektiven) Somiten
durchgetrennt. Aus einer sterilisierten Aluminiumfolie wurde mithilfe einer Federschere
unter dem Mikroskop ein Streifen gleicher Länge geschnitten, der dann mittels einer
spitzen Pinzette in das Loch eingebracht wurde. Durch vorsichtiges Absaugen von
Locke-Lösung von der Oberseite des Embryos mit einem Zellstofftupfer schloss sich
das Loch und der Aluminiumstreifen wurde darin festgehalten (Schema 3 und 4).
20
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Schema 3
Schema 4
3.4.2 Implantation von Protein-Kügelchen
Implantation von Protein-Kügelchen in das präsomitische Mesoderm
Bei dieser Manipulation wurden mit Silikon beschichtete Instrumente verwendet, um zu
verhindern, dass das mit Protein beladene Kügelchen an den Instrumenten haften bleibt.
Zuerst wurde das über dem präsomitischen Mesoderm liegende Ektoderm kaudal des
gewünschten Implantationsortes mit einer Wolframdrahtnadel eingeschnitten. Durch
diesen Schnitt wurde eine Mikropipette mit gleichem Durchmesser wie das Kügelchen
hatte unter das Ektoderm in kranialer Richtung geschoben und so ein Tunnel gebohrt.
Das Kügelchen wurde mit einer an beiden Spitzen nach innen gebogenen Pinzette aus
der Proteinlösung entnommen und auf den Embryo gelegt. Mit einem Glasstift, dessen
Spitze den gleichen Durchmesser wie das Kügelchen hatte, wurde es in den Tunnel an
den gewünschten Implantationsort geschoben. Auf der rechten Seite wurde das mit
Protein beladene Kügelchen (rot), auf der linken Seite ein unbeladenes KontrollKügelchen (gelb) implantiert (Schema 5).
Schema 5
21
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Implantation von Protein-Kügelchen in das präsomitische Mesoderm und gleichzeitige
Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes
Es wurde zuerst das Kügelchen wie zuvor beschrieben implantiert, um die Stabilität des
Embryos während der Implantation zu erhalten. Anschließend wurde wie unten genau
beschrieben der Chorda-Bodenplatten-Komplex entfernt (Schema 6).
Schema 6
3.4.3 Exstirpations- und Ablationsexperimente
Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes
Um den Chorda-Bodenplatten-Komplex sichtbar zu machen, wurde mit einer
Wolframdrahtnadel das Ektoderm in der Mittellinie in Höhe des kranialen
präsomitischen Mesoderms auf einer Länge von 5 prospektiven Somiten bzw. in Höhe
der Somiten I bis V durchgetrennt. Anschließend wurden die Neuralfalten mit einer
Wolframdrahtnadel vorsichtig teils scharf, teils stumpf auseinandergedrängt, bis an
ihrem Grund der Chorda-Bodenplatten-Komplex erkennbar war. Dieser wurde zu
beiden Seiten mit einer Wolframdrahtnadel scharf vom restlichen Neuralrohr abgetrennt
(Schema 7 und 8).
Schema 7
Schema 8
22
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Exstirpation des Neuralrohres
Das gesamte Neuralrohr wurde in Höhe des kranialen präsomitischen Mesoderms auf
einer Länge von 5 prospektiven Somiten entfernt. Dazu wurde mit einer
Wolframdrahtnadel zuerst das Ektoderm auf beiden Seiten des zu entfernenden Stückes
durchgetrennt, um das Neuralrohr exakt gegen das umgebende präsomitische Mesoderm
abgrenzen zu können. Anschließend wurde das axiale Mesoderm ebenfalls mit einer
Wolframdrahtnadel bis auf die Chorda dorsalis durchgetrennt. Das zu entfernende Stück
wurde an seinem kranialen und kaudalen Ende vom Rest des Neuralrohres abgetrennt
und mit einer feinen Wolframdrahtnadel vorsichtig von kranial nach kaudal von der
Chorda dorsalis abgelöst. Anschließend wurde die Chorda dorsalis nochmals mit einem
Färbestift angefärbt, um eventuell verbliebene Reste des Neuralrohres zu entdecken.
Diese wurden dann mit einer Mikropipette abgesaugt (Schema 9).
Schema 9
Transplantation eines Chorda-Bodenplatten-Komplexes auf das präsomitische
Mesoderm bzw. die Somiten I bis V
Für diese Manipulation wurden zwei Embryonen gleichen Entwicklungsstadiums
benötigt. Zuerst wurde das Ei des Spenderembryos vorsichtig aufgeschlagen und der
Inhalt in eine sterile Glasschale gegeben. Der auf dem Dotter liegende Embryo wurde
mit einer Iridektomieschere ausgeschnitten und mit Hilfe eines großen Sieblöffels in
eine mit Locke-Lösung gefüllte Agaroseschale gelegt. Hier wurde die Vitellinmembran
entfernt und der Embryo auf der Oberfläche der Agarose fixiert, indem mithilfe zweier
Wolframdrahtnadeln mehrere Schlitze in die Agarose geschnitten wurden, in die die
Dottermembran des Embryos gedrückt wurde. Zur besseren Fixierung wurde die LockeLösung mit einer Mikropipette abgesaugt und der Embryo zum Schutz vor
Austrocknung mit einigen Tropfen frischer Locke-Lösung bedeckt. Diesem Embryo
23
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
wurde, wie zuvor beschrieben, der Chorda-Bodenplatten-Komplex entfernt. Der
Chorda-Bodenplatten-Komplex wurde nach seiner Exstirpation nochmals mit einem
Färbestift angefärbt, vorsichtig in eine mit Locke-Lösung gefüllte Mikropipette gesaugt
und in das Ei des Empfängerembryos gebracht. Hier wurde beim Empfängerembryo das
Ektoderm am kaudalen Ende des Implantationsortes mit einer Wolframdrahtnadel
eingeschnitten. Mit einer sehr feinen Mikropipette wurde von diesem Schnitt aus ein
Tunnel von der Länge des Transplantates unter das Ektoderm gebohrt. In diesen Tunnel
wurde der Chorda-Bodenplatten-Komplex des Spenderembryos mithilfe einer feinen
Wolframdrahtnadel geschoben (Schema 10).
Schema 10
Ablation des Ektoderms
Zu beiden Seiten des kranialen präsomitischen Mesoderms wurde das Ektoderm auf
einer Länge von 5 prospektiven Somiten mit einer Wolframdrahtnadel eingeschnitten.
Zudem wurde das zu entfernende Stück an seinem kranialen und kaudalen Ende vom
Rest des Ektoderms abgetrennt. Anschließend wurde das Stück von medial nach lateral
vom
präsomitischen
Mesoderm
abgezogen.
Zur
Sichtbarmachung
eventuell
verbliebener Reste wurde das Operationsgebiet mit einem Färbestift nochmals
angefärbt, die Reste dann mit einer Wolframdrahtnadel entfernt. Ein Stück Goldfolie
gleicher Größe wie das entfernte Stück Ektoderm wurde mit einer Federschere unter
24
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
dem Mikroskop zugeschnitten und mit einer feinen Pinzette auf das freiliegende
kraniale präsomitische Mesoderm gedrückt (Schema 11).
Schema 11
Ablation des Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres
Das Ektoderm wurde in der Mittellinie des Neuralrohres, über der lateralen Begrenzung
des kranialen präsomitischen Mesoderms und am kranialen und kaudalen Ende des zu
entfernenden Stückes mit einer Wolframdrahtnadel durchgetrennt und anschließend wie
zuvor
beschrieben
entfernt.
Das
Neuralrohr
wurde
in
der
Mittellinie
auseinandergedrängt und an seiner rechten lateralen Begrenzung mit einer
Wolframdrahtnadel vom präsomitischen Mesoderm getrennt. Das zu entfernende Stück
wurde an seinem kranialen und kaudalen Ende vom Rest der rechten Neuralfalte
abgetrennt und mit einer Wolframdrahtnadel entfernt. Ein Stück Goldfolie gleicher
Größe wie das entfernte Stück Ektoderm und dorsales Neuralrohr wurde mit einer
Federschere unter dem Mikroskop zugeschnitten und mit einer feinen Pinzette auf das
freiliegende restliche Neuralrohr und kraniale präsomitische Mesoderm gedrückt
(Schema 12).
Schema 12
25
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
3.5 In situ-Hybridisierung (ISH) am ganzen Embryo (whole mount)
Durch die whole mount in situ-Hybridisierung werden die Expressionsorte eines Gens
am ganzen Embryo nachgewiesen. Es werden dabei mit einem Antigen (Digoxigenin)
markierte mRNA-Gensonden verwendet, die zu dem nachzuweisenden Genstück
komplementär sind. Sie binden an die entsprechende mRNA und lassen sich dort durch
gegen Digoxigenin gerichtete Antikörper, die an einen Farbstoff oder ein Enzym
gekoppelt sind, sichtbar machen.
Die in dieser Studie verwendete Methode für die whole mount in situ-Hybridisierung
wurde von Nieto et al. (1996) beschrieben.
Während aller Arbeitsschritte wurde mit RNase-freien Materialien und Reagenzien
gearbeitet und es wurden Einmalhandschuhe getragen, um die Zerstörung der mRNA
durch RNasen zu verhindern. Die Materialien wurden entweder direkt vom Hersteller
RNase-frei geliefert oder durch eine Heißluftsterilisation bei 180°C über 3 Stunden von
RNasen befreit. Die Lösungen wurden bis zur Antikörperreaktion mit Aqua bidest., das
mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat inkubiert war (DEPC-H2O), danach mit Aqua bidest.
angesetzt und in beiden Fällen autoklaviert.
3.6.1 Präparation der Gensonde uncx4.1
Die publizierte murine uncx4.1-cDNA ist 2049 bp groß und hat zwei charakteristische
Domänen: die Homöobox-Domäne und – benachbart zu ihr – ein nukleäres
Lokalisationssignal (Neidhardt et al., 1997). Als Template für die initiale ReverseTranskriptase-Reaktion diente Huhn- und Wachtel-RNA verschiedener embryonaler
Stadien (Tag 3 und Tag 6). Die Reverse-Transkriptase-Reaktion wurde mit RandomHexamer-Primern (Invitrogen) durchgeführt. Das Template (1 µg RNA) wurde mit dem
Primer (1 µl) für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur
wurden 10 µM DDT, 1 µM dNTPs und 1 µl Reverse Transkriptase M-MLV-H
(Promega) hinzugefügt, diese Mischung wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
26
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Anschließend
wurde
eine
PCR
mit
5’-AGACGCACCCGCACCAACTTTAC-3’
dem
und
Primerpaar
Uncx4.1-rev:
Uncx4.1-fwd:
5’-ATTTGGCCC
GGCGATTTTGGAACC-3’ (je 2 pmol), 1 x PCR-Puffer, 5 mM MgCl2, 200 µM
dNTPs, DMSO und 5 U Euro-Taq-Polymerase (Promega) mit einer AnnealingTemperatur von 60 °C durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde in pCR3.1
kloniert. Die Identität und die Orientierung des amplifizierten PCR-Fragmentes wurde
durch Sequenzanalyse bestätigt bzw. bestimmt. Auf diese Weise konnte ein 163 bp
großes Fragment der vogelspezifischen uncx4.1-cDNA gewonnen werden. Eine
Sequenzanalyse zeigte eine Sequenzidentität des PCR-Fragmentes von 90 % mit der
murinen uncx4.1-Homöobox und der Homöobox von unc4 des Fadenwurms
Caenorrhabditis elegans. Zur Herstellung von Sense-Sonden wurde das Plasmid
BamHI linearisiert und mit Sp6 Polymerase transkribiert, zur Herstellung der AntisenseSonde wurde das Plasmit mit PstI geschnitten und mit T7 Polymerase transkribiert. Die
Transkription erfolgte in Gegenwart von Digoxigenin-markierten dUTPs (Digoxigenin
Labeling Kit von Roche, nach Herstellerangaben).
27
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
a)
uncx-hox 5’
Homeobox NLS
murine uncx4.1 mRNA
- polyA
uncx- hox 3’
b)
#2184: chick-uncx-PCR fragment(163 bp)
raised with the primers: uncx-hox 5’ & uncx-hox3’; cloned into pCR3.1
AGACGCACCCGCACCAACTTTACTGGCTGGCAGCTCGAGGAGCTGGAAAAGGCGTTTAATGAGAGCCATTACCCGGAC
GTGTTTATGCGAGAGGCTCTGGCTCTCAGGCTGGATTTGGTGGAGTCCAGAGTGCAGGTCTGGTTCCAAAATCGCCGG
GCCAAAT
c)
>gi|7305612|ref|NM_013702.1| Mus musculus Unc4.1 homeobox (C. elegans)
Query: 1
agacgcacccgcaccaactttactggctggcagctcgaggagctggaaaaggcgtttaat 60
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Sbjct: 384 agacgcacccgcaccaactttaccggctggcagctggaggagctggagaaggcgttcaat 443
Query: 61
gagagccattacccggacgtgtttatgcgagaggctctggctctcaggctggatttggtg 120
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| |||||
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Sbjct: 444 gagagccactacccggacgtgtttatgcgcgaggcgctggcgctgcgcctggacctggtc 503
Query: 121 gagtccagagtgcaggtctggttccaaaatcgccgggccaaat 163
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Sbjct: 504 gagtcccgagttcaggtctggttccaaaatcgccgggccaaat 546
Schema 13: a) Aufbau des Gens uncx4.1. b) Sequenz des amplifizierten Huhn-spezifischen
uncx4.1-Fragmentes. c) Vergleich der Nukleotidsequenzen der murinen (Subject) und der
vogelspezifischen (Query) uncx4.1-cDNA.
28
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
3.6.2 Fixierung der Embryonen
Für eine whole mount in situ-Hybridisierung wurden Embryonen der Stadien HH 4 bis
HH 28 verwendet. Diese wurden nach der Entfernung aus dem Ei in eine sterile
Kulturschale mit Phosphatpuffer gebracht. Dieser Phosphatpuffer war mit 0,1 % Triton
als Detergens und Diethylpyrocarbonat zur Vermeidung von RNase-Aktivität versetzt
(DEPC-PBT).
Bei Embryonen, die jünger als Stadium HH 19 waren, musste vermieden werden, dass
die Embryonen sich im Rumpfbereich aufrollten und so die Somiten schlecht
beurteilbar gewesen wären. Daher wurde nur die Vitellinmembran sofort entfernt und
unmittelbar anschließend der Phosphatpuffer mit einer sterilen Plastikpasteurpipette
abgesaugt. Mit einer weiteren sterilen Plastikpasteurpipette wurde eine Lösung aus 4 %
Paraformaldehyd (PFA) in DEPC-PBT vorsichtig auf die Embryonen getropft. Die
Embryonen wurden in 4 % PFA in DEPC-PBT bei 4°C mindestens 1 Stunde gelagert,
bevor mit einer sterilen Iridektomieschere und einer sterilen Pinzette das Amnion
entfernt und ein Loch in das Gehirn geschnitten wurde, um später eine Ansammlung der
Farblösung in Neuralrohr und Gehirn zu vermeiden. Danach wurden die Embryonen in
sterilen Plastikgefäßen in 4 % PFA in DEPC-PBT bei 4°C 1 Tag fixiert.
Embryonen, die Stadium HH 19 und älter waren, wurde dagegen sofort nach Entnahme
aus dem Ei die Vitellinmembran und das Amnion entfernt sowie ein Loch ins Gehirn
geschnitten. Sie wurden ebenfalls in sterilen Plastikgefäßen in 4 % PFA in DEPC-PBT
bei 4°C 1 Tag fixiert.
3.6.3 Durchführung der Hybridisierung
Die whole mount in situ-Hybridisierung wurde auf sterilen 24-Loch-Zellkulturplatten
durchgeführt, die die gleichzeitige in situ-Hybridisierung mehrerer Embryonen
ermöglichten. In jeder Vertiefung der Zellkulturplatte befanden sich, abhängig von ihrer
Größe und von der durchgeführten Manipulation, bis zu 4 Embryonen. Bei allen
Reaktionen wurden die Embryonen auf einem Schüttler leicht bewegt.
29
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Nach der Fixierung in 4 % PFA in DEPC-PBT wurden die Embryonen 10 bis 20
Minuten lang bei 4°C in DEPC-PBT gewaschen, um das Paraformaldehyd zu entfernen.
In einer aufsteigenden Methanolreihe (50 % Methanol in DEPC-PBT, 100 % Methanol,
jeweils 20 Minuten bei 4°C) wurden die Embryonen dehydriert. Anschließend wurden
sie in 100 % Methanol über Nacht bei -20°C gelagert.
Dann wurden die Embryonen zuerst 10 Minuten bei 4°C in 50 % Methanol in DEPCPBT rehydriert und weitere 10 Minuten bei 4°C in DEPC-PBT gewaschen. Um eine
bessere Gewebepenetration der RNA-Sonden zu erreichen, wurden die Embryonen
anschließend in einer Lösung aus 2 % Proteinase K (20 μg/ml) in DEPC-PBT bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Dauer der Inkubation richtete sich nach dem Stadium
der Embryonen: 10 Minuten bei Stadium HH 4 bis HH 9, 15 Minuten bei Stadium HH
10 bis HH 13, 20 Minuten bei Stadium HH 14 bis HH 20. Embryonen älter als Stadium
HH 20 wurden inkubiert, bis sie transparent wurden, maximal jedoch 30 Minuten. Diese
Reaktion wurde durch 10 Minuten Waschen der Embryonen in DEPC-PBT beendet. Es
folgte die Nachfixierung der Embryonen in 1 % Glutaraldehyd in 4 % PFA in DEPCPBT für 30 Minuten bei 4°C. Nach erneutem Waschen in DEPC-PBT für 10 Minuten
bei 4°C wurden die Embryonen 1 bis 2 Stunden lang in Hybridisierungslösung bei 65°C
äquilibriert. Über Nacht wurden sie mit frischer Hybridisierungslösung bei 65°C
inkubiert.
Die bei -20°C gelagerte RNA-Sonde wurde aufgetaut. Jeweils 1 μl der RNA-Sonde
wurde mit einer Mikropipette zu 1 ml Hybridisierungslösung in ein Reaktionsgefäß
gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden sogleich in einen Thermomixer gestellt, wobei
die RNA-Sonde 5 Minuten bei 80°C denaturiert wurde. Sie wurde danach 5 Minuten
auf Eis wieder abgekühlt. Anschließend wurden die Embryonen mit der RNA-Sonde 2
Tage lang bei 65°C inkubiert. Um einer Austrocknung der Embryonen durch
Verdunstung der Lösung vorzubeugen, wurde die Zellkulturplatte mit sterilisierter
Aluminiumfolie zuvor dicht verschlossen. Während der gesamten Inkubationszeit mit
der Hybridisierungslösung und der RNA-Sonde wurden die Embryonen auf einer
Schüttelplatte in einem Hybridisierungsofen gehalten.
Nach Abschluss der Hybridisierung wurden die Embryonen zuerst in 2-fach
konzentrierter Natriumchlorid-Natriumcitrat-Lösung (SSC) bei 65°C für 20 Minuten
gewaschen. Anschließend wurden sie bei 65°C für jeweils 2 mal 20 Minuten in SSC
30
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
von absteigender Konzentration (2-fach- und 0,2-fach-konzentriert), die mit
3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS, Sigma, 5 g in
50 ml DEPC-H2O unter Schütteln bei Raumtemperatur lösen, Lagerung der Lösung bei
4°C) als Detergens versetzt war, gewaschen. Sie wurden für 5 Minuten bei
Raumtemperatur in Natrium-Kalium-Puffer (KTBT) äquilibriert und danach für 4
Stunden bei Raumtemperatur in 10 % Lammserum in KTBT inkubiert. Anschließend
erfolgte die Inkubation mit dem Anti-Digoxigenin-Antikörper in 1:2000-facher
Verdünnung in 10 % Lammserum in KTBT über Nacht bei 4°C. Überschüssiger
Antikörper wurde in mehreren Schritten mit KTBT für je 1 Stunde bei Raumtemperatur
und anschließend über Nacht bei 4°C ausgewaschen.
Um die Detektion der Antikörperbindungsstellen zu optimieren, wurden die Embryonen
für 2 mal 15 Minuten bei Raumtemperatur in Alkalische-Phosphatase-Puffer (APPuffer) gewaschen. Dann wurde die Farblösung aus 4-Nitrobluetetrazolium (NBT,
Roche) und 5-Bromo-4-chloro-3-Indolylphosphat (BCIP, X-Phosphat, Roche) in APPuffer aufgetragen und die Embryonen darin bei Raumtemperatur inkubiert, bis das
Signal von blauvioletter Farbe gut sichtbar war. Anschließend wurde überschüssige
Farblösung mit AP-Puffer bei Raumtemperatur ausgewaschen, und die fertigen
Embryonen wurden in 4 % PFA in Phosphatpuffer (PBS) bei 4°C gelagert.
3.7 Knorpel- und Knochenfärbung
Um Veränderungen am Skelettapparat zu untersuchen, wurden manipulierte Embryonen
der Stadien HH 30 bis HH 35 in einer Lösung aus Alzian Blau (Färbung knorpeliger
Skelettelemente) und Alizarin Rot (Färbung knöcherner Skelettelemente) gefärbt. Die
hier verwandte Methode der Knorpel- und Knochenfärbung wurde von Kessel und
Gruss (1991) beschrieben.
31
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
3.7.1 Fixierung der Embryonen
Die Embryonen wurden nach Entnahme aus dem Ei in steriler Locke-Lösung
gewaschen. Mithilfe einer Iridektomieschere wurde das Amnion vollständig entfernt.
Anschließend wurden die Embryonen in 100 % Ethanol für 3 Tage bei 4 °C fixiert.
Nach Beendigung der Fixierung wurden sie zum Zwecke der besseren Penetration der
Färbelösung durch das Gewebe in 100 % Aceton für einen Tag bei 4°C inkubiert.
3.7.2 Durchführung der Färbung
Vor der Färbung wurden die Embryonen in Aqua bidest zweimal für jeweils zehn
Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend wurden sie in der Färbelösung,
bestehend aus 1 ml 0,1 % Alizarin Rot (Sigma, Steinheim) in 95 % Ethanol, 1 ml
0,3 % Alcian Blau (Sigma) in 70 % Ethanol, 1 ml Eisessig und 17 ml 70 % Ethanol für
3 bis maximal 5 Tage bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Färbung
wurde dabei täglich kontrolliert und nach Sichtbarwerden der Tibia der Embryonen
durch Waschen der Embryonen in Aqua bidest. für einige Minuten bei Raumtemperatur
beendet. Durch Inkubation in einer Lösung aus 20 % Glycerin und 1 % Kaliumhydroxid
in Aqua bidest. wurden die Embryonen für 1 bis maximal 3 Tage bei Raumtemperatur
aufgehellt, bis das gesamte Skelett gut sichtbar war. Dann wurden sie in 50 % und 80 %
Glycerin in Aqua bidest. jeweils über einen Tag gehärtet, und schließlich in 100 %
Glycerin bei Raumtemperatur aufbewahrt.
3.8 Anfertigung von Gewebeschnitten am Vibratom
Von Embryonen, an denen zuvor eine whole mount in situ-Hybridisierung durchgeführt
worden war, wurden an einem Vibratom der Marke Reichert-Jung (Modell 1140
32
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Autocut) Transversal-, Frontal- und Sagittalschnitte von 30 bis 40 µm Dicke im Bereich
der Somiten und des kranialen präsomitischen Mesoderms angefertigt. Zuerst wurde
eine Lösung aus 4 % Agar in Aqua bidest. in eine sterile Zellkulturschale gegossen,
sodass der Boden der Schale gerade bedeckt war. Nachdem der Agar fest war, wurde
der Embryo mit Hilfe eines Keratoplastikspatels auf den Agar gelegt und mit einer
Nadel positioniert. Anschließend wurde er mit flüssigem Agar bedeckt und bis zum
Aushärten des Agars bei Raumtemperatur, danach über Nacht bei 4 °C fixiert.
Unmittelbar vor dem Schneiden wurde mit einem Einmalskalpell ein quadratischer
Block, in dessen Mitte sich der Embryo befand, aus dem Agar herausgeschnitten. Dieser
Block wurde entsprechend der gewünschten Schnittrichtung mit Sekundenklebstoff auf
eine Metallplatte aufgeklebt, die dann in die mit Phosphatpuffer (PBS) gefüllte Schale
des Vibratoms eingespannt wurde. Die Schnittdicke wurde bei Embryonen der Stadien
HH 12 bis HH 18 auf 30 µm, bei älteren Embryonen auf 40 µm eingestellt. Jeder
Schnitt wurde mithilfe eines dicken Pinsels aus der Schale mit PBS in eine Glasschale
mit Aqua bidest. transferiert, um das PBS aus dem Schnitt auszuwaschen und die
Bildung von Salzrändern auf dem Objektträger zu verhindern. Aus dem Wasser wurde
der Schnitt anschließend mit einem dünnen Pinsel auf einen Objektträger gezogen und
positioniert. Nach dem Trocknen des Schnittes erfolgte die Begutachtung unter einem
Mikroskop der Marke Leica DMR.
3.9 Fotografieren von Embryonen
Ganze Embryonen wurden unter dem Durchlichtmikroskop Wild M3Z (Heerbrugg/
Schweiz) mit der Digitalkamera Leica DC 300F fotografiert.
Zum Fotografieren der Schnitte wurde das im verhergehenden Abschnitt genannte
Mikroskop zusammen mit der darauf aufgesetzten Kamera Leica MPS 30 benutzt. Für
diese Fotos wurden Filme der Marke Ektachrome 64 verwendet, die anschließend bei
der Firma Vario Foto & Hobby in Freiburg entwickelt wurden. Die fertigen Diapositive
33
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
wurden zur weiteren Bearbeitung mit einem Scanner für Diapositive in den Computer
eingescannt.
Alle Bilder wurden mit dem Programm Adobe Photoshop 7.0 bearbeitet.
34
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
3.10 Chemikalien und Reagenzien
Acrylamid-Kügelchen mit Heparin (Merck)
Affi-Gel Blue Gel Beads (Biorad / Hercules (USA))
AG 1-X2 Kügelchen (Biorad)
Alkalische-Phosphatase-Puffer (AP-Puffer)
Stammlösungen:
1 M Magnesiumchlorid-Lösung: 203,30 g MgCl2 (Magnesiumchlorid-Hexahydrat,
Merck) in 1000 ml Aqua bidest. lösen
5 M Natriumchlorid-Lösung: 58,44 g NaCl (Natriumchlorid, Sigma) in 1000 ml Aqua
bidest. lösen
Tris-Puffer, pH 9,5 (siehe unten)
25 % Triton X-100 (siehe unten)
Gebrauchslösung: 10 ml Tris-Puffer, pH 9,5
5 ml 1 M MgCl2
2 ml 5 M NaCl
4 ml 25 % Triton X-100
79 ml Aqua bidest.
unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur lösen
Lagerung bei Raumtemperatur
Antikörper
Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragments (Roche / Mannheim)
Chloriertes Organopolysiloxan
Chloriertes Organopolysiloxan in Heptan: Sigmacote® (Sigma)
35
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
DEPC-Wasser / DEPC-H2O
1 l Aqua bidest.
1 g Diethylpyrocarbonat (Sigma)
über Nacht inkubieren, anschließend autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
DEPC-PBS, pH 7,4 (Phosphatpuffer)
Stammlösung (20-fach konzentriert): 160
4
g NaCl (Natriumchlorid; Sigma)
g KCl (Kaliumchlorid, Sigma)
28,8 g Na2HPO4 (Dinatriumhydrogenphosphat,
Merck)
4,8 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat,
Sigma)
in 800 ml DEPC-H2O lösen und auf 1000 ml
auffüllen
Gebrauchslösung (einfach konzentriert): 50 ml Stammlösung
950 ml DEPC-H2O
DEPC-PBT (Phosphatpuffer mit 0,1 % Triton)
1 ml Triton X-100 (Sigma)
1000 ml DEPC-PBS Gebrauchslösung
36
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Hybridisierungspuffer
500 ml Formamid (Merck)
250 ml 20-faches SSC (siehe unten)
2,5 g CHAPS
1
ml Triton X-100
10 ml EDTA (Sigma)
50 mg Heparin (Heparin Natriumsalz, Sigma)
20 ml tRNA aus Hefe (Boehringer / Mannheim)
20
g Blocking Reagent (Roche)
mit 1000 ml DEPC-H2O auffüllen und autoklavieren
Lagerung bei -20 °C
Inkubator mit beweglicher Platte
Shake `n` Shack (Hybaid Instruments)
KTBT (Natrium-Kalium-Puffer)
965 ml Aqua bidest.
8,8 g NaCl (Natriumchlorid, Sigma)
1,5 g KCl (Kaliumchlorid, Merck)
10 ml Triton X-100
unter ständigem Rühren lösen und autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
Kulturschalen
Sterile Zellkulturschalen (Falcon)
Lammserum (Gibco / Karlsruhe)
37
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
Locke-Lösung
Stammlösungen: 94,270 g NaCl (Natriumchlorid, Sigma) auf 1000 ml Aqua bidest.
12,0255 g KCl (Kaliumchlorid, Merck) auf 1000 ml Aqua bidest.
15,8092 g CaCl2 (Calciumchlorid) auf 1000 ml Aqua bidest.
Gebrauchslösung: 100 ml NaCl-Stammlösung
37 ml KCl-Stammlösung
21 ml CaCl2-Stammlösung
mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und autoklavieren
1 000 000 I.E. Penicillin G Natrium-Salz (Sigma) dazugeben
Lagerung bei 4 °C
Magnet-Heizplatte (Heidolph)
Mikropipetten (Eppendorff)
Minimum Essential Medium Alpha (Sigma)
Natriumnitrit, gesättigte Lösung
Natriumnitrit (Merck)
Objektträger (Langenbrinck / Emmendingen)
Paraformaldehyd-Lösung (4%) in PBT
40,0 g Paraformaldehyd-Pulver (Merck)
1000 ml DEPC-PBT
bei 65 °C im Wasserbad unter ständigem Rühren lösen
Lagerung bei -20 °C
38
3. Material und Methoden
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PBS (Phosphatpuffer), pH 7,2
Stammlösung (10-fach konzentriert): 14,8 g NaHPO4 (Natriumhydrogenphosphat,
Sigma)
4,3 g KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat,
Sigma)
72,0 g NaCl (Natriumchlorid, Sigma)
in 1000 ml Aqua bidest. lösen und autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
Gebrauchslösung: 100 ml Stammlösung
900 ml Aqua bidest.
Proteinase K-Lösung, 20 mg/ml
100 mg Proteinase K (Boehringer / Mannheim) als Puder
5 ml DEPC-H2O
Aliquots von je 50 µl
Lagerung der Lösung bei -20 °C
Proteine
FGF-8 (R&B Systems / Wiesbaden): gelöst in PBS
Noggin (R&B Systems): gelöst in PBS
Sonic hedgehog (Shh) (von G.M.Cann, Stanford / USA, siehe Cann et al., 1999):
gelöst in PBS
SU 5402 (Calbiochem): gelöst in Dimethylsulfoxid
Lagerung aller Proteine bei - 20 °C
39
3. Material und Methoden
———————————————————————————————————
SSC 20-fach, pH 7,0 (Natriumchlorid-Natriumcitrat-Lösung)
Stammlösung: 175,3 g NaCl (Natriumchlorid, Sigma)
88,2 g Natriumcitrat (Sigma)
in 800 ml DEPC-H2O lösen
pH-Wert mit 10 N NaOH- oder HCl-Lösung auf 7,0 einstellen
mit DEPC-H2O auf 1000 ml auffüllen und autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
Gebrauchslösung 2-fach: 10 ml 20-faches SSC mit DEPC-H2O auf 100 ml auffüllen
Gebrauchslösung 0,2-fach: 1 ml 20-faches SSC mit DEPC-H2O auf 100 ml auffüllen
Schüttler
Duomax 1030 (Heidolph)
Rotamax 120 (Heidolph)
1 M Tris-Puffer, pH 7,3
88,95 ml 1 M Tris-HCl (Sigma)
11,05 ml 1 M Tris-Base (Sigma)
unter ständigem Rühren lösen, den pH-Wert einstellen und autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
1 M Tris-Puffer, pH 9,5
475 ml 2 M Tris-Base (Sigma)
25 ml 2 M Tris-HCl (Sigma)
500 ml Aqua bidest.
unter ständigem Rühren lösen, den pH-Wert einstellen und autoklavieren
Lagerung bei Raumtemperatur
40
3. Material und Methoden
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25 % Triton X-100
12,5 ml Triton X-100 (Sigma)
50
ml DEPC-H2O (für in situ-Hybridisierung) oder Aqua bidest.
unter Schütteln bei Raumtemperatur lösen
Lagerung bei Raumtemperatur
Tubes, sterile
Polypropylenröhrchen, 15 ml / 50 ml (Falcon)
Wolframdraht, Durchmesser 0,5 mm (Thyssen Edelstahlwerk)
Zellkulturplatten, steril (Falcon)
Zellstofftupfer (Lohmann)
41
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
4. Ergebnisse
Im folgenden werden die Ergebnisse der whole mount in situ-Hybridisierungen an
unmanipulierten und manipulierten Embryonen, sowie die Resultate der Knorpel- und
Knochenfärbung dargestellt. Die Gliederung erfolgt nach folgenden Gesichtspunkten:
-
Expressionsmuster von uncx4.1 im paraxialen Mesoderm
-
Expression von uncx4.1 während Entstehung und Reifung des Sklerotoms
-
Expression von uncx4.1 außerhalb der Somiten
-
Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten: durch Signale der
axialen Strukturen, der lateralen Strukturen, des Ektoderms sowie durch
Signalproteine des Chorda-Bodenplatten-Komplexes und des Fibroblast Growth
Factor (FGF) – Signalweges
4.1 Expressionsmuster von uncx4.1 im paraxialen Mesoderm
Um den normalen zeitlichen und räumlichen Verlauf der Expression von uncx4.1 im
paraxialen Mesoderm zu untersuchen, wurden in situ-Hybridisierungen mit uncx4.1mRNA an ganzen Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien durchgeführt.
Die Expression von uncx4.1 im paraxialen Mesoderm des Hühnerembryos konnte
erstmals im Stadium HH-6 (nach 22 Stunden Bebrütungszeit) beobachtet werden.
Uncx4.1 war im Kopffortsatz, im Hensen-Knoten und in der kranialen Hälfte des
präsomitischen Mesoderms exprimiert, an all diesen Orten war die Expression jedoch
nur schwach ausgeprägt. Im präsomitischen Mesoderm stellte sich die Expression als
ein breiter waagerechter Streifen dar, der zu beiden Seiten des Neuralrohres über eine
Somitenlänge die gesamte Breite des präsomitischen Mesoderms ausfüllte (n = 12)
(Abb. 1 A, B).
42
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
Im Stadium HH-7 (nach 24 Stunden Bebrütungszeit) war uncx4.1 in den kaudalen
Hälften der ersten beiden Somiten exprimiert. Diese Somiten befanden sich paarig
angelegt zu beiden Seiten des Neuralrohres in der Mitte des Embryos. Des weiteren war
im kranialen präsomitischen Mesoderm ein breiter uncx4.1-positiver Streifen im
Bereich der kaudalen Hälfte des Somiten -I zu erkennen. Aufgrund seiner unscharfen
Begrenzung konnte dieser Streifen deutlich von den Expressionsorten von uncx4.1 in
den Somiten unterschieden werden (Abb. 1 C). Die Expression von uncx4.1 im
kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms bestand bis zum Stadium HH-14 in
Form von einem oder zwei waagerechten Streifen fort (Abb. 1 D – K). Im Stadium HH16 trat eine uncx4.1-positive Domäne in der Schwanzspitze auf, welche im Stadium
HH-18 nicht mehr vorhanden war (Abb. 1 L – O).
Im Stadium HH-22 war das präsomitische Mesoderm bis in die Schwanzspitze
segmentiert. Uncx4.1 war in der kaudalen Hälfte eines jeden Somiten exprimiert (Abb.
1 P). In den okzipitalen Somiten jedoch wurde die Intensität und die kraniokaudale
Ausdehnung der Expression von kranial nach kaudal fortschreitend reduziert, bis sie im
Stadium HH-24 in den ersten 2 Somiten vollständig verschwunden und im dritten und
vierten Somiten auf einen schmalen Streifen am kaudalen Ende begrenzt war
(Abb. 1 Q).
Mit fortschreitender Somitenreifung wurde die Expression von uncx4.1 in allen
Somiten, beginnend in den zervikalen Somiten, auf das kaudale Drittel eines jeden
Somiten reduziert. Im Stadium HH-24 hatte diese Reduktion die zervikalen Somiten
erfasst, während uncx4.1 in den thorakalen und lumbalen Somiten noch in der kaudalen
Hälfte exprimiert war (Abb. 1 R). Im Stadium HH-28 hatte sich die Reduktion der
Expression von uncx4.1 auf das kaudale Somitendrittel bis in die thorakalen Somiten
ausgedehnt (Abb. 1 S, T).
43
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
Abbildung 1 (folgende Seite): Expression von uncx4.1 vom 1. bis zum 6. Tag der Entwicklung.
In situ-Hybridisierungen von ganzen Hühnerembryonen verschiedener Entwicklungsstadien.
Die Länge des Balkens entspricht 250 µm in A – D, F, H, I, Q, R; und 500 µm in E, G, J – P, S.
A Stadium HH-5. In diesem Stadium ist keine Expression von uncx4.1 nachweisbar.
B Stadium HH-6. Uncx4.1 ist im Kopffortsatz (Pfeilspitze), in der rechten Seite des Hensen- Knotens
(*) und im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms (Pfeil) exprimiert.
C Stadium HH-7. Das erste Somitenpaar ist entwickelt. Uncx4.1 ist in der kaudalen Somitenhälfte
(Pfeil), als ein schwacher Streifen im kranialen präsomitischen Mesoderm, in den Neuralfalten (NF)
und im Kopffortsatz (Pfeilspitze) exprimiert.
D Stadium HH-8. Uncx4.1 ist in der kaudalen Hälfte aller vier Somiten (Pfeile) und weiterhin in den
Neuralfalten (NF) exprimiert. Im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms ist unmittelbar
kaudal des letzten gebildeten Somiten ein schwacher, unscharf begrenzter uncx4.1-positiver
Streifen sichtbar (*).
E Stadium HH-10. Die Expression von uncx4.1 ist in allen 9 Somiten in der kaudalen Somitenhälfte
zu erkennen. Im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms ist uncx4.1 in zwei schwachen
Streifen exprimiert (Pfeile). Die Expression in den drei Hirnventrikeln, und dem durch den Schluss
der Neuralfalten entstandenen Neuralrohr besteht auch in diesem Stadium.
F Ausschnittsvergrößerung von E.
G Stadium HH-13. In allen 19 Somiten ist uncx4.1 in der kaudalen Somitenhälfte exprimiert. Die zwei
uncx4.1-positiven Streifen im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms sind stärker
ausgeprägt und schärfer begrenzt als in den vorhergehenden Stadien. Im Neuralrohr ist uncx4.1
als ein schwacher, longitudinal verlaufender Streifen exprimiert.
H Ausschnittsvergrößerung von G. Die römischen Ziffern bezeichnen die Somitenstadien.
I Sagittalschnitt durch den kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms, wie in H angezeigt. Eine
Somitenlänge kaudal des Somiten I ist ein unscharf begrenzter Streifen der Expression von
uncx4.1 zu erkennen, welcher dem Somiten –I entspricht (Pfeil). Die römischen Ziffern bezeichnen
die Somitenstadien. Die Somitengrenzen sind durch Striche am Bildrand markiert.
J Stadium HH-14. Uncx4.1 ist in den kaudalen Hälften aller bereits gebildeten Somiten und des
Somiten –I sowie im Neuralrohr exprimiert.
K Ausschnittsvergrößerung von J.
L Stadium HH-16. Uncx4.1 ist in den kaudalen Hälften aller Somiten, in der Schwanzspitze und im
Neuralrohr exprimiert.
M Ausschnittsvergrößerung von L.
N Stadium HH-18. Zusätzlich zu den Expressionsorten in den Somiten und im Neuralrohr ist uncx.4.1
in diesem Stadium im intermediären Mesoderm in Höhe der Somiten 21 bis 25 exprimiert (Pfeile).
In diesem Bereich befindet sich die Nierenanlage. Die Expression in den Somiten ist stark
ausgeprägt, im ersten Somiten ist sie in ihrer dorsoventralen Ausdehnung gegenüber den anderen
Somiten reduziert. In der Schwanzspitze und im präsomitischen Mesoderm ist keine Expression
von uncx4.1 mehr zu erkennen.
O Sagittalschnitt durch die kaudalen Somiten wie in K angezeigt. Uncx4.1 ist in der kaudalen Hälfte
eines jeden Somiten exprimiert.
P Stadium HH-24. Alle Somitenpaare sind ausgebildet. In den ersten zwei Somiten ist die Expression
von uncx4.1 vollständig verschwunden. Im dritten und vierten Somiten ist sie auf einen schwachen,
schmalen Streifen am kaudalen Somitenende reduziert. Uncx4.1 ist in den zervikalen Somiten im
kaudalen Somitendrittel, in den thorakalen und lumbalen Somiten weiterhin in der kaudalen
Somitenhälfte exprimiert.
Q Sagittalschnitt durch die okzipitalen Somiten wie in M angezeigt. In den ersten beiden Somiten
fehlt die Expression von uncx4.1, während sie im dritten und vierten Somiten lediglich in Intensität
und Ausdehnung reduziert ist. Die arabischen Ziffern bezeichnen die Somitenzahlen.
R Frontalschnitt durch die kaudalen Somiten wie in M angezeigt. Die Expression von uncx4.1 ist in
den gezeigten Somiten stark ausgeprägt und streng auf die kaudale Somitenhälfte begrenzt. Im
Neuralrohr ist uncx4.1 in zwei longitudinal verlaufenden Streifen auf beiden Seiten exprimiert. Die
Somitengrenzen sind durch Striche am Bildrand markiert.
S Stadium HH-28, Lateralansicht. In den zervikalen und den thorakalen Somiten ist die Expression
von uncx4.1 auf das kaudalen Somitendrittel reduziert. Die Expression im Neuralrohr ist stark
ausgeprägt.
T Dorsalansicht des Embryos in S.
44
4. Ergebnisse
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45
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
4.2 Expression von uncx4.1 während Entstehung und Reifung des
Sklerotoms
Frühere Untersuchungen zum Expressionsmuster von uncx4.1 an Mausembryonen
haben gezeigt, dass uncx4.1 nach erfolgter Kompartimentierung der Somiten
ausschließlich im Sklerotom exprimiert ist. Um den zeitlichen und räumlichen Verlauf
der Expression von uncx4.1 während der Entwicklung und Reifung des Sklerotoms zu
untersuchen, wurden Vibratomschnitte zwischen 30 und 60 µm Dicke von mit uncx4.1mRNA hybridisierten Embryonen angefertigt. Die Stadieneinteilung der Somiten
erfolgte nach Christ und Ordahl (1995).
Der Somit -I, welcher im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms unmittelbar
kaudal des letzten epithelialen Somiten gelegen war, bestand aus dicht gepackten,
ungeordneten mesenchymalen Zellen. Uncx4.1 war in der kaudalen Hälfte dieses
Somiten mit homogener Intensität über dessen gesamte dorsoventrale Ausdehnung
exprimiert (Abb. 2 A).
Die Somiten I bis III bestanden aus einem epithelialen Randwall, der das zentral
gelegene mesenchymale Somitocoel umschloss. In den kaudalen Hälften dieser Somiten
war die Expression von uncx4.1 in ihrer Ausdehnung gegenüber dem Somiten -I
deutlich reduziert. Sie war ausschließlich im ventralen Anteil des Somitocoels und im
unmittelbar an das Somitocoel angrenzenden inneren Teil des ventralen epithelialen
Randwalls zu erkennen. Die Intensität der Expression war im medialen Anteil des
Somiten höher als im lateralen (Abb. 2 B).
Im Somiten IV erfolgte die Kompartimentierung des Somiten, und es entstanden das
ventral gelegene mesenchymale Sklerotom und das dorsal gelegene epitheliale
Dermomyotom. Das Somitocoel wurde dabei in das Sklerotom einbezogen, von dem
das Dermomyotom durch einen zellfreien Raum abgegrenzt war. Die Expression von
uncx4.1 war in diesem Somiten ausschließlich in der kaudalen Hälfte des Sklerotoms in
mäßiger Intensität zu erkennen (Abb. 2 C).
Im Somiten VII waren die Zellen des Sklerotoms stärker kondensiert als in jüngeren
Somiten. Die Expression von uncx4.1 war im ventromedialen Anteil des Sklerotoms
stark ausgeprägt, während sie im lateralen Anteil des Sklerotoms fehlte. Um die Chorda
46
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
dorsalis herum, wo in diesen zuvor zellfreien Raum eingewanderte Sklerotomzellen die
Perichordalröhre als Anlagematerial für die Wirbelkörper und die Bandscheiben
bildeten, war uncx4.1 in mäßiger Intensität exprimiert (Abb. 2 D).
Im Sklerotom des Somiten X waren die Zellen sehr dicht gepackt. Dieses Sklerotom
wies die Form eines gleichseitigen Dreiecks auf, mit jeweils einer nach ventral, dorsal
und lateral gerichteten Ecke. Uncx4.1 war in der gesamten kaudalen Sklerotomhälfte
mit hoher, homogener Intensität exprimiert (Abb. 2 E).
Während seiner weiteren Reifung nahm das Sklerotom mehr und mehr die Form eines
langgestreckten Dreiecks an, indem das Wachstum der dorsalen und der lateralen Ecke
das der ventralen Ecke überstieg. Im Sklerotom des Somiten XVIII war diese Form
bereits deutlich augeprägt. Uncx4.1 war hier ausschließlich im lateralen Anteil der
kaudalen Sklerotomhälfte exprimiert. Die Intensität der Expression. war im
ventrolateralen Anteil der kaudalen Sklerotomhälfte höher als im dorsolateralen
(Abb. 2 F).
Im Somiten XXIV waren bereits die knorpeligen Anlagen der Achsenskelettelemente zu
erkennen: Dorsal die Wirbelbögen, ventral die proximalen Rippen, lateral die
Bogenwurzeln und medial die Wirbelkörper. Die zuvor dicht gepackten, ungeordneten
Sklerotomzellen hatten sich zu größeren, linear angeordneten Knorpelzellen
umorganisiert. Uncx4.1 war in den Bogenwurzeln und in den proximalen Rippen in
hoher Intensität exprimiert, die Expressionsorte waren jeweils scharf begrenzt
(Abb. 2 G).
47
4. Ergebnisse
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Abbildung 2: Expression von uncx4.1 während der Entwicklung und Reifung des Sklerotoms.
Transversalschnitte von Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien im Bereich der
Expressionsorte von uncx4.1 (kaudale Somitenhälfte).
Sklerotom (scl), Neuralrohr (NR), Chorda dorsalis (Cd), Dermomyotom (dm), Myotom (m),
Somitocoel (sc). Schnittdicke: A –C 30 µm, D – E 40 µm, F – G 60 µm.
Die Länge des Balkens entspricht 500 µm.
A Somit –I, Stadium HH-13. Uncx4.1 ist in dessen kaudaler Hälfte über die gesamte dorsoventrale
Ausdehnung exprimiert.
B Somit III, Stadium HH-13. Dieser Somit besteht aus einem epithelialen Randwall und dem zentral
gelegenen mesenchymalen Somitocoel. Die Expression von uncx4.1 ist auf den ventralen Anteil
des Somitotcoels und den unmittelbar angrenzenden epithelialen Randwall reduziert.
C Somit IV, Stadium HH-13. Dieser Somit zeigt die beginnende Kompartimentierung in das dorsale
epitheliale Dermomyotom und das ventrale mesenchymale Sklerotom. Uncx4.1 ist nur im
Sklerotom exprimiert.
D Somit VII, Stadium HH-18. Die Somitenkompartimente sind vollständig ausgebildet. Die
Expression von uncx4.1 ist auf den medialen Anteil des Sklerotoms reduziert. Im zuvor zellfreien
Raum um die Chorda dorsalis finden sich nun Sklerotomzellen, in denen uncx4.1 ebenfalls
exprimiert ist.
E Somit X, Stadium HH-18. Das Sklerotom ist vergrößert und seine Zellen sind dichter gepackt als in
den Sklerotomen jüngerer Somitenstadien. Zwischen Dermomyotom und Sklerotom hat sich das
Myotom ausgebildet. Uncx4.1 ist hier im gesamten Sklerotom exprimiert. Um die Chorda dorsalis
ist keine Expression von uncx4.1 mehr zu erkennen.
F Somit XVIII, Stadium HH-24. Der dorsale und der laterale Anteil des Sklerotoms haben sich stärker
vergrößert als der ventrale Anteil, sodass das Sklerotom nun die Form eines langgestreckten
Dreiecks aufweist. Die Expression von uncx4.1 ist auf den ventrolateralen Anteil des Sklerotoms
reduziert. Starke Expression von uncx4.1 im dorsalen Neuralrohr (Pfeil).
G Achsenskelettentwicklung in der oberen Thoraxregion, Stadium HH-28. Hier ist uncx4.1 in den
knorpeligen Anlagen der Bogenwurzeln (*) und der proximalen Rippen exprimiert (**).
48
4. Ergebnisse
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4.3 Expression von uncx4.1 außerhalb der Somiten
Neben seiner Expression im paraxialen Mesoderm war uncx4.1 während der
Entwicklung des Hühnerembryos auch im zentralen Nervensystem und im
intermediären Mesoderm exprimiert.
Im Stadium HH-7 war erstmals eine schwache Expression von uncx4.1 in den
Neuralfalten zu erkennen, am deutlichsten im kranial des ersten Somitenpaares
gelegenen Anteil der Neuralfalten, aus welchem die Hirnventrikel entstehen (Abb. 1 C).
In den folgenden Entwicklungsstadien blieb die Expression von uncx4.1 in der
dorsolateralen Wand der Hirnventrikel bestehen (Abb. 1 D, E, G, P, S). Kaudal davon
schlossen sich die Neuralfalten, zeitgleich mit der Bildung neuer Somiten von kranial
nach kaudal fortschreitend, zum Neuralrohr, der Anlage des Rückenmarks. Im
Neuralrohr war uncx4.1 in zwei longitudinal verlaufenden Streifen zu beiden Seiten der
Deckplatte und in zwei ebenfalls longitudinal verlaufenden Streifen zu beiden Seiten
der Bodenplatte exprimiert (Abb. 1 E – H, J, K, P, R, T; Abb. 2 F, G).
Im Stadium HH-13 war erstmals eine Expression von uncx4.1 im intermediären
Mesoderm zu erkennen. Zuerst trat lateral der Somiten I bis IV ein schwach uncx4.1positiver Streifen auf (Abb.1 G, H). Dieser Streifen verlängerte sich in den folgenden
Entwicklungsstadien zeitgleich mit der Bildung weiterer Somiten nach kaudal, während
er sich an seinem kranialen Ende zurückbildete (Abb. 1 K, L). Im Stadium HH-18
schließlich war uncx4.1 im intermediären Mesoderm in Höhe der Somiten 20 bis 30 als
ein
unscharf
begrenzter,
gesprenkelter
Streifen
exprimiert
(Abb.
1
N).
Transversalschnitte durch diesen Bereich zeigten, dass uncx4.1 in den Tubuli der
Nierenanlage exprimiert war (Abb. 2 D, E).
49
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
4.4 Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten
4.4.1 Regulation durch Signale der axialen Strukturen
Die axialen Strukturen, zu welchen die ventral gelegene Chorda dorsalis und das dorsal
gelegene
Neuralrohr
zählen,
spielen
eine
entscheidende
Rolle
in
der
Kompartimentierung des Somiten und in der Entwicklung und Reifung des Sklerotoms.
Um einen möglichen Einfluss der axialen Organe auf die Expression von uncx4.1 in den
Somiten zu untersuchen, wurden sie einzeln oder gemeinsam vom präsomitischen
Mesoderm bzw. den neugebildeten Somiten abgeschirmt.
Wurde eine Barriere aus Aluminiumfolie zwischen die axialen Organe und den
kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms implantiert (n = 55), so waren nach
einer Reinkubationszeit von 24 Stunden lateral dieser Barriere keine Somiten zu
erkennen. Das paraxiale Mesoderm bestand in diesem Bereich aus einem homogenen
Band. Uncx4.1 war auf der manipulierten Seite in keinem der untersuchten Embryonen
exprimiert (Abb. 3 A, B). Nach Implantation einer Barriere zwischen die axialen
Organe und die Somiten I bis V (n = 25) waren die Somiten alle in ihrer ursprünglichen
Form und Größe erhalten. Die kraniokaudale Ausdehnung der Expression von uncx4.1
war in jedem dieser Somiten deutlich reduziert, sodass uncx4.1 lediglich schwach als
ein schmaler Streifen am kaudalen Ende eines jeden Somiten exprimiert war
(Abb. 3 C, D).
Regulation durch Signale des Chorda-Bodenplatten-Komplexes
Nach Entfernung des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe des kranialen
präsomitischen Mesoderms auf einer Länge von 5 prospektiven Somiten bildeten sich
nach einer Reinkubationszeit von 8 Stunden im manipulierten Bereich verkleinerte,
scharf begrenzte Somiten aus (n = 13) (Abb. 3 E, F). In keinem dieser Somiten war eine
Expression von uncx4.1 zu erkennen. 24 Stunden nach derselben Operation waren im
Operationsgebiet ebenfalls scharf begrenzte, verkleinerte Somiten zu erkennen (n = 65).
Auch in diesen Somiten war uncx4.1 nicht exprimiert (Abb. 3 G).
50
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
Wurde der Chorda-Bodenplatten-Komplex in Höhe der Somiten I bis V entfernt, waren
die Somiten im manipulierten Bereich in ihrer Größe und Struktur erhalten (n = 19). In
diesen Somiten war die kraniokaudale Ausdehnung der Expression von uncx4.1 deutlich
reduziert, und uncx4.1 war lediglich als ein schmaler Streifen am kaudalen Ende eines
jeden Somiten exprimiert (Abb. 3 H, I).
Nach der Transplantation eines zusätzlichen Chorda-Bodenplatten-Komplexes aus der
Höhe des präsomitischen Mesoderms über das kraniale präsomitische Mesoderm
zeigten sich nach 24 Stunden Reinkubation im manipulierten Bereich Somiten normaler
Größe (n = 12). Das Sklerotom dieser Somiten war auf Kosten des Dermomyotoms
nach dorsal vergrößert. Uncx4.1 war in der kaudalen Sklerotomhälfte in deren gesamter
dorsoventraler Ausdehnung exprimiert (Abb. 3 J – L). Wurde ein zusätzlicher ChordaBodenplatten-Komplex aus der Höhe der Somiten über die Somiten I bis V
transplantiert, so fand sich nach 12 Stunden Reinkubation in keinem der untersuchten
Embryonen eine Veränderung des Sklerotoms im manipulierten Bereich (n = 4). Das
Expressionsmuster von uncx4.1 entsprach dem eines unmanipulierten Somiten
(Abb. 3 M – O).
51
4. Ergebnisse
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Abbildung 3 (folgende Seite):Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten
durch Signale der axialen Organe.
Um den Einfluss der axialen Organe auf das Expressionsmuster von uncx4.1 im paraxialen
Mesoderm zu untersuchen, wurden nach Mikromanipulationen in situ-Hybridisierungen mit
uncx4.1-mRNA an ganzen Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien angefertigt. Alle
Mikromanipulationen im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms wurden über eine
Länge von fünf prospektiven Somiten ausgeführt. Bei einseitigen Manipulationen (A - D, J - O)
ist jeweils die rechte Seite des Embryos die manipulierte Seite.
Die Länge des Balkens entspricht 250 µm in B, G, I; und 500 µm in A, C – F, H, J – O.
A Stadium HH-24, 36 Stunden nach Trennung der axialen Organe vom kranialen Anteil des
präsomitischen Mesoderms durch eine Barriere aus Aluminiumfolie. Auf der manipulierten
Seite ist die Segmentierung gestört, und es fehlen reguläre Somiten. Uncx4.1 ist auf dieser
Seite nicht exprimiert.
B Ausschnittsvergrößerung von A.
C Stadium HH-19, 12 Stunden nach Trennung der axialen Organe von den Somiten I bis V
durch eine Barriere aus Aluminiumfolie.
D Ausschnittsvergrößerung von C. Die Somiten der manipulierten Seite behalten ihre Struktur
bei, während die Expression von uncx4.1 in diesen Somiten auf einen schwachen,
schmalen Streifen am kaudalen Somitenende reduziert ist (Pfeile).
E Stadium HH-12, 9 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
des kranialen präsomitischen Mesoderms. Die im manipulierten Bereich gebildeten Somiten
sind verkleinert, und uncx4.1 ist in diesen Somiten nicht exprimiert.
F Ausschnittsvergrößerung von E. Die Somitengrenzen sind durch Striche am Bildrand markiert.
G Stadium HH-19, 12 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
des kranialen präsomitischen Mesoderms. Auch in den hier gezeigten reiferen Somiten im
manipulierten Bereich fehlt die Expression von uncx4.1.
H Stadium HH-18, 10 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
der Somiten I bis V. Die Struktur der Somiten im manipulierten Bereich ist erhalten.
I Ausschnittsvergrößerung von H. Uncx4.1 ist in den Somiten der manipulierten Seite im
medialen Anteil des kaudalen Somitendrittels exprimiert (Pfeile). Die Somitengrenzen sind
durch Striche am Bildrand markiert.
J Stadium HH-16, 16 Stunden nach Transplantation eines zusätzlichen Chorda-BodenplattenKomplexes über das kraniale präsomitische Mesoderm (rote Pfeile). Die Expression von
uncx4.1 in den auf der manipulierten Seite gebildeten Somiten wird durch die Anwesenheit
eines zusätzlichen Chorda-Bodenplatten-Komplexes nicht beeinflusst.
K Ausschnittsvergrößerung von J.
L Transversalschnitt durch den manipulierten Bereich des in J und K gezeigten Embryos. Auf
der manipulierten Seite ist das Sklerotom vergrößert, während das Dermomyotom
verkleinert ist. Uncx4.1 ist über die gesamte dorsoventrale Ausdehnung des Sklerotoms
exprimiert. Der rote Pfeil markiert die Position des transplantierten Chorda-BodenplattenKomplexes.
M Stadium HH-17, 12 Stunden nach Transplantation eines zusätzlichen Chorda-BodenplattenKomplexes über die Somiten I bis V (rote Pfeile). Die Struktur der Somiten und die
Expression von uncx4.1 auf der manipulierten Seite sind gegenüber der unmanipulierten
Seite nicht verändert.
N Ausschnittsvergrößerung von M.
O Transversalschnitt durch den manipulierten Bereich des in M und N gezeigten Embryos. Das
Sklerotom und das Dermomyotom sind in ihrer Ausdehnung unverändert. Uncx4.1 ist in der
gesamten dorsoventralen Ausdehnung des Sklerotoms exprimiert. Der rote Pfeil markiert
die Position des transplantierten Chorda-Bodenplatten-Komplexes.
52
4. Ergebnisse
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53
4. Ergebnisse
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Regulation durch Signale des Neuralrohres
Das Neuralrohr spielt neben seiner Eigenschaft als Vorläufer des zentralen
Nervensystems eine wichtige Rolle in der Achsenskelettentwicklung, indem die von
seinen verschiedenen Anteilen sezernierten Proteine durch ihre Interaktion mit anderen
Proteinen aus den die Somiten umgebenden Strukturen die Entwicklung verschiedener
Achsenskelettelemente steuern (Monsoro-Burq et al., 1994; Monsoro-Burq und
Le Douarin, 2000; Wagner et al., 2000).
Wurde das Neuralrohr vor der Segmentierung in Höhe des kranialen präsomitischen
Mesoderms entfernt, so bildeten sich im manipulierten Bereich in der Mittellinie
fusionierte Somiten (n = 52) (Abb. 4 A). Im Somiten II waren sowohl die beiden
Somitocoele als auch die epithelialen Randwälle miteinander fusioniert, sodass die
paarigen Somiten als ein einziger Somit imponierten. Uncx4.1 war in diesen Somiten im
medialen Anteil der Somitocoele in hoher Intensität exprimiert (Abb. 4 B). Im Somiten
X waren die beiden Dermomyotome und die beiden Sklerotome in der Mittellinie
fusioniert. Die Sklerotome wiesen die für dieses Somitenstadium typische Form eines
gleichseitigen Dreiecks auf, waren jedoch gegenüber den Sklerotomen unmanipulierter
Somiten verkleinert. Die Expression von uncx4.1 umfasste die gesamte kaudale
Sklerotomhälfte (Abb. 4 C). Im Somiten XVIII blieben die Sklerotome fusioniert,
während die Dermomyotome voneinander getrennt lateral der Sklerotome lagen. Die
Sklerotome waren gegenüber denen in unmanipulierten Somiten deutlich verkleinert,
und es fehlte ihnen der ventrolaterale Anteil. Uncx4.1 war in den dorsolateralen
Anteilen der kaudalen Sklerotomhälften exprimiert, die Intensität der Expression war
schwächer als in den weiter kaudal gelegenen Somiten (Abb. 4 D).
Um die Auswirkungen der Entwicklungsverzögerung des Sklerotoms auf die
Entwicklung des Achsenskeletts zu untersuchen, wurde das Neuralrohr in Höhe des
präsomitischen Mesoderms im Bereich der prospektiven Somiten 19 – 26, welche die
Vorläufer des thorakalen Achsenskeletts sind, entfernt (n = 18). Das Skelett der
manipulierten Embryonen wurde nach einer Reinkubationszeit von 6 Tagen mit
Alizarin Rot und Alcian Blau gefärbt. Bei allen untersuchten Embryonen fehlten die
Wirbelbögen und die Bogenwurzeln vollständig. Die Wirbelkörper waren verkleinert
und wiesen anstelle der querovalen Form der Wirbelkörper unmanipulierter Embryonen
eine runde Form auf. Die Rippenköpfe und die proximalen Anteile der Rippenhälse
54
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
waren nur rudimentär ausgebildet. Dadurch fehlten den Embryonen sowohl die RippenWirbelbogen-Gelenke als auch die Rippen-Wirbelkörper-Gelenke. Die fehlende
Verbindung zwischen Rippen und Wirbeln führte bei allen untersuchten Embryonen zu
einer starken Lordose mit nach ventral verlagerten Wirbelkörpern (Abb. 4 E – G).
Abbildung 4: Expression von uncx4.1 und Entwicklung des Achsenskeletts nach
Exstirpation des Neuralrohres in Höhe des kranialen Anteils des präsomitischen
Mesoderms.
Die Manipulationen wurden über eine Länge von fünf prospektiven Somiten ausgeführt.
In den Abbildungen ist folgende Struktur markiert: Nierenanlage (N).
Die Länge des Balkens entspricht 500 µm in A – D und 1 mm in E – G.
A Stadium HH-15, 6 Stunden nach Exstirpation des Neuralrohres in Höhe des kranialen
präsomitischen Mesoderms. Im manipulierten Bereich sind die Somiten in der Mittelllinie
fusioniert. Uncx4.1 ist in jedem dieser Somiten in der kaudalen Somitenhälfte exprimiert. Die
römischen Ziffern bezeichnen die Somitenstadien.
B Transversalschnitt durch den Somiten II des in A gezeigten Embryos. Sowohl die epithelialen
Randwälle als auch die Somitocoele der beiden Somiten sind in der Mittelllinie miteinander
fusioniert. Die Expressionsorte von uncx4.1 im medialen Anteil eines jeden Somitocoels sind
ebenfalls miteinander fusioniert. Daneben ist uncx4.1 in der Nierenanlage exprimiert.
C Transversalschnitt durch den Somiten X eines Embryos im Stadium HH-18. Hier sind die
Sklerotome und die Dermomyotome der beiden Somiten in der Mittelllinie miteinander
fusioniert. Uncx4.1 ist stark in der gesamten kaudalen Sklerotomhälfte exprimiert. Eine
deutliche Expression von Uncx4.1 ist auch in der Nierenanlage zu erkennen.
D Transversalschnitt durch den Somiten XVIII eines Embryos im Stadium HH-24. Die
Sklerotome der beiden Somiten sind in der Mittelllinie fusioniert, während sich die
Dermomyotome getrennt entwickeln. Uncx4.1 ist in den lateralen Anteilen der Sklerotome und
in der Nierenanlage exprimiert.
E Skelettfärbung an einem 8 Tage alten Embryo, 6 Tage nach Exstirpation des Neuralrohres in
Höhe des kranialen präsomitischen Mesoderms.
F Ausschnittsvergrößerung von E. Im manipulierten Bereich sind die Wirbelkörper verkleinert
(roter Pfeil). Die Rippenköpfe sind ebenfalls verkleinert und die Wirbelbögen fehlen
vollständig.
G Einzelner Wirbel mit dazugehörigen Rippen des in E und F gezeigten Embryos.
55
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
4.4.2 Regulation durch Signale der lateralen Strukturen
Die lateralen Strukturen, zu welchen das Seitenplattenmesoderm und das intermediäre
Mesoderm zählen, spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der dorsalen Anteile
des Achsenskeletts und der epaxialen und hypaxialen Muskulatur. Durch die von ihnen
sezernierten Signalmoleküle wird der Einfluss der Signale des Chorda-BodenplattenKomplexes im dorsolateralen Anteil des Somiten gehemmt und die Entwicklung des
Dermomyotoms induziert (Monsoro-Burq et al., 1994, 1996; Müller et al., 1996;
Pourquié et al., 1995, 1996; McMahon et al., 1998; Monsoro-Burq und Le Douarin,
2000). Durch die Abschirmung der lateralen Organe vom paraxialen Mesoderm wurde
ihr möglicher Einfluss auf die Expression von uncx4.1 in den Somiten untersucht.
Nach Trennung des Seitenplattenmesoderms vom kranialen Anteil des präsomitischen
Mesoderms auf einer Länge von fünf prospektiven Somiten durch eine Barriere aus
Aluminiumfolie bildeten sich bei allen Embryonen im manipulierten Bereich
verkleinerte Somiten aus (n = 18). Uncx4.1 war in der kaudalen Hälfte eines jeden
Somiten in normaler Intensität und Ausdehnung exprimiert (Abb. 5 A). Wurde eine
Barriere zwischen das intermediäre Mesoderm und die Somiten I bis V implantiert,
konnte im Operationsgebiet keine Veränderung der Form und Größe der Somiten
beobachtet werden (n = 13). Die Expression von uncx4.1 war in diesen Somiten
gegenüber der Expression in normalen Somiten nicht verändert (Abb. 5 B).
56
4. Ergebnisse
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Abbildung 5: Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten durch Signale der
lateralen Strukturen.
Um den Einfluss der Sklerotom-supprimierenden Strukturen auf die Expression von uncx4.1 in
den Somiten zu untersuchen, wurden nach Mikromanipulationen in situ-Hybridisierungen mit
uncx4.1-mRNA an ganzen Embryonen durchgeführt. Alle Mikromanipulationen im kranialen
Anteil des präsomitischen Mesoderms wurden über eine Länge von fünf prospektiven Somiten
ausgeführt. Bei einseitigen Manipulationen ist jeweils die rechte Seite des Embryos die
manipulierte Seite.
Die Länge des Balkens entspricht 500 µm.
A Stadium HH-16, 8 Stunden nach Trennung des Seitenplattenmesoderms vom kranialen
präsomitischen Mesoderm durch eine Barriere aus Aluminiumfolie. In den Somiten der
manipulierten Seite ist uncx4.1 in den kaudalen Somitenhälften exprimiert. Das intermediäre
Mesoderm und die Expression von uncx4.1 in der Nierenanlage fehlen im manipulierten
Bereich.
B Stadium HH-19, 20 Stunden nach Trennung des intermediären Mesoderms von den Somiten
I bis V durch eine Barriere aus Aluminiumfolie. Die Somiten der manipulierten Seite haben
ihre Struktur beibehalten, und uncx4.1 ist in den kaudalen Somitenhälften exprimiert.
57
4. Ergebnisse
———————————————————————————————————
4.4.3 Regulation durch Signale des Ektoderms und des dorsalen
Neuralrohres
Signale des Ektoderms induzieren im präsomitischen Mesoderm die Expression von
paraxis. Dieses Gen kodiert für das bHLH-Protein Paraxis, welches für die
Epithelialisierung der Somiten notwendig ist (Burgess et al., 1996; Šoš
ičet al., 1997).
Das Ektoderm und der dorsale Anteil des Neuralrohres sezernieren den NogginAntagonisten BMP4 und fördern so die Entwicklung des Dermomyotoms, während die
des Sklerotoms unterdrückt wird
(Brand-Saberi et al., 1993; Pourquié et al., 1993,
1996; Goulding et al., 1994; Monsoro-Burq et al., 1994, 1996; McMahon et al., 1998;
Monsoro-Burq und Le Douarin, 2000; Wagner et al., 2000). Um einen möglichen
Einfluss des Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres auf die Expression von uncx4.1
in den Somiten zu untersuchen, wurden beide Gewebe vom kranialen Anteil des
präsomitischen Mesoderms entfernt. Um ein Nachwachsen des Ektoderms bzw. des
Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres zu verhindern, wurde nach der Entfernung ein
Streifen Goldfolie gleicher Größe in den operierten Bereich eingebracht.
Nach Entfernung des Ektoderms über dem kranialen Anteil des präsomitischen
Mesoderms auf einer Länge von fünf prospektiven Somiten waren die Somiten auf der
manipulierten Seite in ihrer mediolateralen Ausdehnung gegenüber den Somiten der
Gegenseite verkleinert (n = 15). Uncx4.1 war in der kaudalen Hälfte eines jeden
Somiten in normaler Intensität und Ausdehnung exprimiert (Abb. 6 A).
Wurde das Ektoderm über dem präsomitischen Mesoderm zusammen mit dem dorsalen
Anteil des Neuralrohres in gleicher Höhe entfernt, so waren die Somiten auf der
manipulierten Seite stark verkleinert (n = 22). Die Expression von uncx4.1 umfasste
nach wie vor die kaudale Hälfte eines jeden Somiten, wobei die kraniokaudale
Ausdehnung der Expression der reduzierten Somitenlänge angepasst war. Auch die
Intensität der Expression von uncx4.1 war gegenüber der in normalen Somiten
unverändert (Abb. 6 B).
58
4. Ergebnisse
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Abbildung 6: Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten durch Signale des
Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres.
Die Länge des Balkens entspricht 500 µm.
A Stadium HH-15, 8 Stunden nach Entfernung des Ektoderms über dem kranialen
präsomitischen Mesoderm und Ersatz des Ektoderms durch Goldfolie. Die Somiten der
manipulierten Seite sind gegenüber normalen Somiten in Größe und Struktur unverändert.
Uncx4.1 ist in den kaudalen Somitenhälften exprimiert. Der Bereich, in welchem das
Ektoderm entfernt wurde, ist durch Striche markiert.
B Stadium HH-19, 20 Stunden nach Entfernung des Ektoderms und des dorsalen Neuralrohres
über dem kranialen präsomitischen Mesoderm und Ersatz der entfernten Strukturen durch
Goldfolie. Die Somiten im manipulierten Bereich sind verkleinert. Uncx4.1 ist in allen Somiten
in der kaudalen Somitenhälfte exprimiert, die kraniokaudale Ausdehnung der Expression ist
der jeweiligen Somitengröße angepasst.
59
4. Ergebnisse
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4.4.4 Regulation durch Signalproteine
Regulation durch Signalproteine des Chorda-Bodenplatten-Komplexes
Um das Signal des Chorda-Bodenplatten-Komplexes, welches die Expression von
uncx4.1 in den Somiten möglicherweise reguliert, zu identifizieren, wurden mit den
bekannten vom Chorda-Bodenplatten-Komplex sezernierten Proteinen Noggin und
Sonic hedgehog (Shh) beladene Kügelchen in das kraniale präsomitische Mesoderm
implantiert. Anschließend wurde im Bereich der Implantation der Chorda-BodenplattenKomplex entfernt.
Nach der Implantation eines mit Shh in einer Konzentration von 8 µg/µl beladenen
Kügelchens und anschließender Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes war
uncx4.1 in den Somiten des manipulierten Bereiches nicht exprimiert (n = 21)
(Abb. 7 A, B). Auch die Implantation eines mit Noggin in einer Konzentration von 5
µg/µl beladenen Kügelchens konnte in Abwesenheit des Chorda-BodenplattenKomplexes in den Somiten des manipulierten Bereiches keine Expression von uncx4.1
induzieren (n = 10) (Abb. 7 C, D). Wurde ein mit 5µg/µl Noggin und 8 µg/µl Shh
zugleich beladenes Kügelchen implantiert und der Chorda-Bodenplatten-Komplex
entfernt, konnte in den im manipulierten Bereich gebildeten Somiten ebenfalls keine
Expression von uncx4.1 beobachtet werden (n = 17) (Abb. 7 E, F).
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Abbildung 7 (folgende Seite): Expression von uncx4.1 in den Somiten nach Exstirpation
des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe des kranialen präsomitischen Mesoderms
und anschließender Implantation von mit Sonic Hedgehog (Shh), Noggin oder Shh und
Noggin beladenen Kügelchen auf der rechten Seite des Embryos.
Die Länge des Balkens entspricht 250 µm in B, D, F; und 500 µm in A, C, E.
A Stadium HH-18, 24 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
des kranialen präsomitischen Mesoderms und Implantation eines mit Shh beladenen
Kügelchens in gleicher Höhe. Im manipulierten Bereich sind verkleinerte Somiten ausgebildet.
Uncx4.1 ist in diesen Somiten nicht exprimiert.
B Ausschnittsvergrößerung von A.
C Stadium HH-18, 24 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
des kranialen präsomitischen Mesoderms und Implantation eines mit Noggin beladenen
Kügelchens in gleicher Höhe. In den verkleinerten Somiten im manipulierten Bereich ist keine
Expression von uncx4.1 zu erkennen.
D Ausschnittsvergrößerung von C.
E Stadium HH-17, 20 Stunden nach Exstirpation des Chorda-Bodenplatten-Komplexes in Höhe
des kranialen präsomitischen Mesoderms und Implantation eines mit Shh und Noggin
beladenen Kügelchens in gleicher Höhe. Auch hier sind die Somiten im manipulierten Bereich
verkleinert, und uncx4.1 ist nicht exprimiert.
F Ausschnittsvergrößerung von E.
60
4. Ergebnisse
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61
4. Ergebnisse
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Regulation durch Signalproteine des Fibroblast Growth Factor (FGF) - Signalweges
Der geordnete Ablauf der Segmentierung des paraxialen Mesoderms durch intrinsische
zelluläre und molekulare Oszillatoren ist für die korrekte Somitenentwicklung
unentbehrlich. Im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms führt die Bindung
des zu den Proteinen des Fibroblast Growth Factor (FGF)-Signalweges gehörenden
Faktors FGF-8 an seinen Rezeptor FGF-Rezeptor-1 (FGFR-1) zum Anhalten der
Oszillationen, wodurch die kaudale Begrenzung und die kraniokaudale Ausdehnung des
nächsten Somiten festgelegt werden. Der Faktor SU 5402 besetzt die Bindungsstellen
für FGF-8 an FGFR-1 und kann die FGF-8-induzierte Signalkaskade verhindern (Green
et al., 1996; Mohammadi et al., 1997; Dubrulle et al., 2001; Sawada et al., 2001; Stolte
et al., 2002). Ein möglicher Einfluss des FGF-Signalweges auf die Expression von
uncx4.1 in den Somiten wurde durch Implantation von mit FGF-8 oder SU 5402
beladenen Kügelchen in verschiedenen Höhen des präsomitischen Mesoderms
untersucht.
Nach Implantation eines mit FGF-8 in einer Konzentration von 2 µg/µl beladenen
Kügelchens in die kraniale Hälfte des präsomitischen Mesoderms zeigte sich auf der
Seite des Kügelchens keine Veränderung in Somitengröße und Expression von uncx4.1
gegenüber der Gegenseite (n = 5) (Abb. 8 A). Wurde ein solches Kügelchen jedoch in
die kaudale Hälfte des präsomitischen Mesoderms implantiert, war der unmittelbar
kranial des Kügelchens gelegene Somit gegenüber dem in gleicher Höhe gelegenen
Somiten der Gegenseite in seiner kraniokaudalen Ausdehnung reduziert (n = 6). Die
Grenzen der sich kaudal anschließenden Somiten waren verschoben, die Anzahl der
Somiten zu jeder Seite des Neuralrohres blieb jedoch konstant. Uncx4.1 war auf der
Seite des mit FGF-8 beladenen Kügelchens in der kaudalen Hälfte eines jeden Somiten
exprimiert, die Intensität der Expression entsprach der in einem normalen Somiten
(Abb. 8 B).
Die Implantation eines mit SU 5402 in einer Konzentration von 10mM beladenen
Kügelchens in die kraniale Hälfte des präsomitischen Mesoderms führte auf der
manipulierten Seite zur Bildung von Somiten normaler Größe (n = 4). Die Expression
von uncx4.1 umfasste die kaudale Hälfte eines jeden Somiten (Abb. 8 C). Dagegen hatte
die Implantation eines solchen Kügelchens in die kaudale Hälfte des präsomitischen
Mesoderms im Bereich des Kügelchens einen vergrößerten Somiten zur Folge (n = 8).
62
4. Ergebnisse
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Dieser Somit war gegenüber dem in gleicher Höhe gelegenen Somiten der Gegenseite
nach kaudal verlängert, seine Gesamtlänge entsprach dabei der Länge von 1½ Somiten.
Die sich unmittelbar kaudal anschließenden Somiten auf der Seite des Kügelchens
waren ebenfalls verlängert, ihre Länge nahm nach kaudal hin mit zunehmender
Entfernung zum Kügelchen ab. Die Expression von uncx4.1 in diesen Somiten war in
dem im Bereich des Kügelchens gelegenen Somiten auf einen schwachen, schmalen
Streifen am kaudalen Ende des Somiten reduziert. Die Ausdehnung und die Intensität
der Expression nahmen in den sich kaudal anschließenden Somiten gemeinsam mit der
Abnahme ihrer Länge zu (Abb. 8 D).
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Abbildung 8 (folgende Seite): Regulation der Expression von uncx4.1 in den Somiten
durch auf das präsomitische Mesoderm wirkende Proteine des Fibroblast-Growth-Factor
(FGF)-Signalweges.
Mit den Proteinen FGF-8 und SU 5402 beladene Kügelchen wurden auf der rechten Seite des
Embryos in unterschiedlicher Höhe in das präsomitische Mesoderm implantiert, auf der linken
Seite wurde jeweils in gleicher Höhe ein mit dem Lösungsmittel der Proteine beladenes
Kontrollkügelchen implantiert.
Die Länge des Balkens entspricht 300 µm.
A Stadium HH-18, 18 Stunden nach Implantation eines mit FGF-8 beladenen Kügelchens in die
kraniale Hälfte des präsomitischen Mesoderms. Die Somiten in der Umgebung des
Kügelchens sind gegenüber denen der Kontrollseite in Größe und Struktur nicht verändert.
Uncx4.1 ist in der kaudalen Hälfte eines jeden Somiten exprimiert, die Intensität der
Expression entspricht der in den Somiten der Kontrollseite.
B Stadium HH-17, 12 Stunden nach Implantation eines mit FGF-8 beladenen Kügelchens in die
kaudale Hälfte des präsomitischen Mesoderms. Der unmittelbar kranial des Kügelchens
gelegene Somit ist in seiner kraniokaudalen Ausdehnung verkleinert, der sich kaudal
anschließende Somit kompensatorisch vergrößert. In beiden Somiten ist uncx4.1 in der
kaudalen Hälfte in normaler Intensität exprimiert.
C Stadium HH-19, 26 Stunden nach Implantation eines mit SU 5402 beladenen Kügelchens in
die kraniale Hälfte des präsomitischen Mesoderms. Auch hier sind die Somiten in der
Umgebung des Kügelchens von normaler Größe und Struktur. Uncx4.1 ist in den kaudalen
Somitenhälften in normaler Intensität exprimiert.
D Stadium HH-19, 26 Stunden nach Implantation eines mit SU 5402 beladenen Kügelchens in
die kaudale Hälfte des präsomitischen Mesoderms. Der Somit im Bereich des Kügelchens ist
vergrößert, die sich kaudal anschließenden Somiten sind ebenfalls vergrößert und werden
nach kaudal hin sukzessive wieder kleiner. In den Somiten in der unmittelbaren Umgebung
sowie kaudal des Kügelchens ist die Expression von uncx4.1 auf einen schwachen, schmalen
Streifen am kaudalen Somitenende reduziert. Dieser Streifen nimmt nach kaudal hin parallel
zur Größenabnahme der Somiten in Ausdehnung und Länge zu, bis 5 Somiten kaudal des
Kügelchens Somitengröße und Expression von uncx4.1 wieder denen eines unmanipulierten
Somiten entsprechen.
63
4. Ergebnisse
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64
5. Diskussion
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5. Diskussion
Die vorliegende Studie beschreibt das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des
Gens uncx4.1 im paraxialen Mesoderm und im Achsenskelett des Hühnerembryos, die
Regulation dieser Expression durch Signale umgebender Strukturen und den
Zusammenhang der somitischen uncx4.1-Expression mit der Achsenskelettentwicklung.
Die Ergebnisse geben einen Hinweis auf die Funktionen des Transkriptionsfaktors
Uncx4.1 während der Achsenskelettentwicklung. Einerseits erhält Uncx4.1 die während
der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms determinierte kraniokaudale
Polarität der Somiten bis zur Wirbelentwicklung, andererseits spielt es auch eine
entscheidende Rolle bei der Spezifizierung des Sklerotoms
5.1 Regulation der Expression von uncx4.1 im präsomitischen
Mesoderm durch intrinsische Mechanismen
Während der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms weist die Expression von
uncx4.1 eine zeitliche und räumliche Dynamik auf. Von der Entstehung des ersten bis
zur Entstehung des 22. Somiten ist uncx4.1 in den Somiten -I und -II, anschließend bis
zur Entstehung des 28. Somiten im Bereich der Schwanzspitze exprimiert. Dieses im
präsomitischen Mesoderm von Hühnerembryonen beobachtete Expressionsmuster von
uncx4.1 konnte in Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden. Bei Mausembryonen
wurde keine uncx4.1-Expression im präsomitischen Mesoderm beschrieben. Der
früheste Zeitpunkt des Auftretens einer Expression von uncx4.1 lag in den kaudalen
Hälften der Somiten I und II (Mansouri et al., 1997; Neidhardt et al., 1997; Mansouri
et al., 2000; Leitges et al., 2000).
Im präsomitischen Mesoderm von Hühnerembryonen konnte bei einigen Embryonen
die Expression von uncx4.1 nur im Somiten -I, bei anderen in den Somiten -I und -II
65
5. Diskussion
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gezeigt werden. Diese Beobachtung lässt an eine Regulation der Expression von
uncx4.1 durch den Segmentierungszyklus denken. Analog zu bekannten zyklisch
exprimierten Genen des präsomitischen Mesoderms – lunatic fringe (Aulehla et al.,
1999) und c-hairy1 (Palmeirim et al., 1997, 1998) – könnte die Expression von uncx4.1
im präsomitischen Mesoderm in Phasen ablaufen, welche in 90-minütigem Takt das
präsomitische Mesoderm in kaudokranialer Richtung durchlaufen. Ein neuer Somit wird
nach Beendigung jedes Segmentierungszyklus am kranialen Ende des präsomitischen
Mesoderms gebildet. Für uncx4.1 konnten in der vorliegenden Studie jedoch keine
zyklischen Expressionsphasen beobachtet werden. Uncx4.1 war bei allen untersuchten
Embryonen erst am Ende des Segmentierungszyklus (kurz vor Bildung des neuen
Somiten) exprimiert. Dort überlappen die Expressionsorte von uncx4.1 teilweise mit
denen der Gene des Notch-Delta-Signalweges, notch und dll1 (Hrabe de Angelis et al.,
1997; Palmeirim et al., 1998; Del Barco Barrantes et al., 1999). Uncx4.1 wurde als
Zielgen des Notch-Delta-Signalweges, welches im Genom stromabwärts von notch,
delta-like1 (dll1) und rbpjκ liegt, identifiziert (Del Barco Barrantes et al., 1999).
Mutationen der Gene des Notch-Delta-Signalweges führen zu fehlender Expression der
Zielgene (Del Barco Barrantes et al., 1999, zusammengefasst in Rida et al., 2004). So
führen Mutationen von notch zu fehlender Expression von jag1 und hes5 im
präsomitischen Mesoderm und zu fehlender Expression von dll1 und jag1 im Somiten I.
Mutationen von dll1 und rbpjĸführen zu fehlender Expression von jag1, hes5, eph-a4,
lunatic fringe und mesp im präsomitischen Mesoderm, und zu fehlender Expression von
jag1 und uncx4.1 im Somiten I. Mutationen von rbpjĸführen zu fehlender Expression
von jag1, hes5, eph-a4, lunatic fringe und mesp im präsomitischen Mesoderm, und zu
fehlender Expression von dll1, jag1 und uncx4.1 im Somiten I. Mutationen der den
Notch-Delta-Signalweg negativ regulierenden Gene ripply 1 und ripply2 führen zu
Expression von notch im gesamten Somiten, und zu fehlender Expression von uncx4.1
(de la Pompa et al., 1997; Del Barco Barrantes et al., 1999, zusammengefasst in Rida
et al., 2004; Kawamura et al., 2005; Chan et al., 2007) (siehe Schema 14). Auch die
Phänotypen dieser Mutationen lassen einen ursächlichen Zusammenhang zwischen dem
Notch-Delta-Signalweg und der Expression von uncx4.1 erkennen. Die Skelettdefekte
der dll1-/--Mäuse (fehlende Wirbelbögen, Bogenwurzeln und proximale Rippen;
unregelmäßig geformte Wirbelkörper und zu einem Strang fusionierte Spinalganglien)
66
5. Diskussion
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entsprechen denen der uncx4.1 -/--Mäuse, welche jedoch eine normale Expression von
dll1 aufweisen (Del Barco Barrantes et al., 1999). Die korrekte Expression von uncx4.1
in den Somiten erfordert daher eine koordinierte Aktivierung und Deaktivierung des
Notch-Delta-Signalweges. Uncx4.1 ist im Rahmen der Grenzentstehung zwischen zwei
Somiten als Effektorgen von dll1 das letzte bisher bekannte Glied des Notch-DeltaSignalweges, und damit ein die Identität der kaudalen Somitenhälfte kontrollierender
Faktor.
Uncx4.1 ist im paraxialen Mesoderm des Hühnerembryos bereits im Stadium der
Generierung von neuem Somitenmaterial exprimiert. Im Rahmen der sekundären
Gastrulation wird durch kontinuierliche Zellteilung in der Schwanzspitze das
Zellmaterial für die Somiten kaudal des 28. Somiten bereitgestellt (Holmdahl 1925;
zusammengefasst in Christ et al., 2000). Diese neuen Zellen des präsomitischen
Mesoderms zeigen bereits eine zyklische Expression der Gene c-hairy1, c-hairy2 und
lunatic
fringe,
was
ein
Beweis
dafür
ist,
dass
auch
diese
Zellen
den
Segmentierungszyklus und damit den Notch-Delta-Signalweg durchlaufen (Jouve et al.,
2002). Daher kann die Expression von uncx4.1 in diesem frühen präsomitischen
Mesoderm ebenfalls ein Resultat der Aktivität des Notch-Delta-Signalweges sein.
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Schema 14 (folgende Seite): Darstellung der Regulation des Notch-Delta-Signalweges
und der Expression seiner Zielgene im präsomitischen Mesoderm (a) und im Somiten I
(b).
a) Im präsomitischen Mesoderm wird der Notch-Delta-Signalweg durch Interaktion des
transmembranären Rezeptors Notch mit seinen Liganden (Dll1 und Dll3) aktiviert. Nach
Konformitätsänderung von Notch wird dessen intrazellulärer Anteil in den Nukleus transferriert
und dort mithilfe von Rbpjĸan die Promotorregionen der Zielgene auf der DNA gebunden. Es
kommt zur Induktion der Expression der Zielgene mesp, hes5, jag 1 (bHLHTranskriptionsfaktoren), m-cer (TGFß-Protein), eph-a4 (Rezeptor-Tyrosin-Kinase) und lunatic
fringe (Glykosyltransferase). Die von den Zielgenen kodierten Proteine regulieren die Aktivität
des Notch-Delta-Signalweges positiv (Mesp, über einen noch unbekannten Mechanismus)
oder negativ (Lunatic fringe, durch Glykosylierung von Notch). Ripply1 und Ripply2 hemmen
die Aktivität des Notch-Delta-Signalweges durch Herunterregulation von Mesp (de la Pompa
et al., 1997; Del Barco Barrantes et al., 1999, Rida et al., 2004; Kawamura et al., 2005; Chan
et al., 2007).
b)
Im Somiten I werden –wie im präsomitischen Mesoderm– jag1 und mesp als direkte
Zielgene von Rbpjĸexprimiert. Ein Ziel des Notch-Delta-Signalweges ist die Induktion der
Expression von uncx4.1 in der kaudalen Somitenhälfte. Da Rbpjĸdie Aktivität von Dll1 und
Dll3 heraufreguliert und seine Aktivität selbst von Dll1 und Dll3 heraufreguliert wird, erfolgt
hier eine Autoregulation der Aktivität des Notch-Delta-Signalweges. Zudem aktiviert Mesp den
Notch-Delta-Signalweg über einen unbekannten Mechanismus (Del Barco Barrantes et al.,
1999, Rida et al., 2004).
67
5. Diskussion
———————————————————————————————————
Schema 14
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Während der Segmentierung wird die Position der Somitengrenzen – und damit die
Länge eines jeden Somiten –durch im präsomitischen Mesoderm agierende Proteine des
Fibroblast Growth Factor (FGF) – Signalweges beeinflusst. Hierbei spielt vor allem die
Interaktion des Faktors FGF-8 mit dem FGF-Rezeptor 1 (FGFR-1) im kranialen Anteil
des präsomitischen Mesoderms eine entscheidende Rolle. Das für FGF-8 kodierende
Gen fgf-8 ist in der kaudalen Hälfte des präsomitischen Mesoderms und in den kaudalen
Hälften der Somiten I bis III, das für FGFR-1 kodierende Gen in der kranialen Hälfte
des präsomitischen Mesoderms exprimiert (Crossley und Martin, 1995; Green et al.,
1996; Mohammadi et al., 1997; Dubrulle et al., 2001; Sawada et al., 2001; Stolte et al.,
68
5. Diskussion
———————————————————————————————————
2002, Dubrulle et al., 2004). Die Interaktion von FGF-8 mit FGFR-1 führt im
präsomitischen Mesoderm zu Inaktivierung des Notch-Delta-Signalweges, damit zum
Anhalten des Segmentierungszyklus und zur Entstehung einer Somitengrenze (Dubrulle
et al., 2001, 2004; Sawada et al., 2001; Stolte et al., 2002). Vermehrte Interaktion von
FGF-8 mit FGFR-1 führen zu Bildung verkleinerter, verminderte Interaktion zu Bildung
vergrößerter Somiten. Die Anzahl der Segmentierungszyklen und damit der Somiten
bleibt
jedoch
gegenüber
unmanipulierten
Embryonen
unverändert,
die
Segmentierungszyklen laufen lediglich bei vermehrter Interaktion schneller und bei
verminderter Interaktion langsamer ab (Dubrulle et al., 2001). Die Trennung des
präsomitischen Mesoderms in eine kaudale, für Veränderungen in Somitengröße und
–polarität noch labile, und eine kraniale, hinsichtlich Somitengröße und kraniokaudaler
Polarität bereits determinierte Hälfte wird durch das Aufeinandertreffen der
Expressionsorte von fgf-8 und fgfr-1 in Höhe des Somiten –V determiniert (Dubrulle et
al., 2001). Analog zu diesen Ergebnissen konnte in dieser Studie nach experimenteller
Veränderung der Aktivität des FGF-Signalweges in der kranialen Hälfte des
präsomitischen
Mesoderms
keine
Veränderung
der
Somitengröße
oder
der
kraniokaudalen Somitenpolarität beobachtet werden. Wurde die Aktivität des FGFSignalweges jedoch in der kaudalen Hälfte des präsomitischen Mesoderms verändert, so
zeigten sich bei Vermehrung der Aktivität durch Hinzugabe von FGF-8 kranial des
implantierten Kügelchens verkleinerte Somiten mit normaler kraniokaudaler Polarität
und Expression von uncx4.1. Bei Verminderung der Aktivität des FGF-Singalweges
durch Implantation eines mit SU 5402 beladenen Kügelchens zeigten sich um das
implantierte Kügelchen vergrößerte Somiten, in welchen die Expression von uncx4.1
auf einen schmalen Streifen am kaudalen Ende reduziert war. In Anbetracht der
Tatsache,
dass
eine
Verminderung
der
Aktivität
des
FGF-Signalweges
zu
längerdauernden Segmentierungszyklen und vermehrter Aktivität des Notch-DeltaSignalweges führt, kann die Vergrößerung der Somiten hinreichend geklärt werden.
Unklar bleibt jedoch, warum die kaudale Somitenhälfte und die Expression von uncx4.1
in ihrer Ausdehnung so stark reduziert sind. Möglicherweise werden durch Interaktion
von FGF-8 mit FGFR-1 vor allem die Proteine des Notch-Delta-Signalweges, welche
für die Ausbildung der kranialen Somitenhälfte essenziell sind, gehemmt (Notch,
Mesp2, Ripply2). Die Reduzierung der Expression von uncx4.1 im Somiten kann als
69
5. Diskussion
———————————————————————————————————
das Resultat einer Vergrößerung der kranialen Somitenhälfte auf Kosten der kaudalen
angesehen werden. Die Regulation der Expression von uncx4.1 durch die Aktivität des
Notch-Delta-Signalweges und seiner Modulatoren reguliert kann damit abermals
bestätigt werden. Jedoch bleibt weiterhin unklar, warum eine verminderte Aktivität des
Notch-Delta-Signalweges – in der Annahme, dass bei vermehrter Aktivität des FGFSignalweges die Proteine des Notch-Delta-Signalweges in der kranialen Somitenhälfte
gehemmt werden – nicht zu einer Reduzierung der Ausdehnung der kranialen
Somitenhälfte zugunsten der kaudalen kommt.
5.2
Rolle
der
uncx4.1-Expression
für
die
Entwicklung
des
Achsenskeletts
Über den gesamten Zeitraum der Somitenentwicklung zeigt die Expression von uncx4.1
in den Somiten ein dynamisches Verhalten. Während uncx4.1 in den Somiten -II und -I
in der gesamten kaudalen Hälfte exprimiert ist, wird mit der Epithelialisierung der
Somiten die Expression von uncx4.1 auf den ventralen Anteil der kaudalen
Somitenhälfte reduziert. Nach der Kompartimentierung der Somiten ist uncx4.1 in der
kaudalen Sklerotomhälfte exprimiert, zuerst im medialen Anteil, dann im gesamten
Sklerotom und zuletzt im ventrolateralen Anteil. Hier besteht die Expression bis zur
Entwicklung der aus diesem Anteil des Sklerotoms entstehenden Elemente des
Achsenskeletts fort. Zum Ende der Entwicklung des Achsenskeletts ist uncx4.1 in den
knorpeligen
Derivaten
des
lateralen
Anteils
der
kaudalen
Sklerotomhälfte
(Wirbelbögen, Bogenwurzeln und proximale Rippen) exprimiert.
Bei Mausembryonen findet man ein weitgehend identisches Expressionsmuster.
Uncx4.1 ist erstmals am 9. Tag in den kaudalen Somitenhälften exprimiert. Nach
Kompartimentierung der Somiten findet sich die Expression von uncx4.1 nur noch in
der kaudalen Sklerotomhälfte, wo sie bis zur Entwicklung der daraus hervorgehenden
Skelettelemente persistiert (Mansouri et al., 1997; Neidhardt et al., 1997). Ab dem 12.
Tag ist uncx4.1 in den proximalen Rippen und den kranialen Anteilen der distalen
70
5. Diskussion
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Rippen, ab dem 15. Tag in den Wirbelbögen, Teilen der Wirbelkörper und in den
Bandscheiben exprimiert (Mansouri et al., 1997; Neidhardt et al., 1997).
Bei heterozygoten uncx4.1+/--Mäuse ist die Expression von uncx4.1 schwächer
ausgeprägt als in Wildtyp-Mäusen (Mansouri et al., 2000). Bei homozygoten uncx4.1-/-Mäusen dagegen ist keine uncx4.1-Expression vorhanden. Diese Mäuse weisen eine
fehlende Kondensierung der kaudalen Sklerotomhälfte auf, und ihnen fehlen die aus der
kaudalen Sklerotomhälfte entstehenden Skelettelemente (Wirbelbögen, Bogenwurzeln,
Querfortsätze und proximale Rippen). Die Expression des für die Determination dieser
Skelettanteile essenziellen Sklerotommarkers pax9 ist bei uncx4.1-/--Mäusen stark
reduziert (Neubüser et al., 1995; Mansouri et al., 2000). Die Expression des für die
Erhaltung der kraniokaudalen Somitenpolarität wichtigen Gens semaphorinD findet
sich bei diesen Mäusen in stark reduzierter Intensität uniform im gesamten Sklerotom,
während es in Wildtyp-Embryonen nur in der kaudalen Sklerotomhälfte exprimiert wird
(Mansouri et al., 2000). Fehlende kraniokaudale Polarität des Sklerotoms führt zu
Fusionen von Teilen der Wirbelkörper. Auch die Spinalganglien sind fusioniert, da die
Axone nicht mehr geordnet, sondern in ungeordneten Bündeln aus dem Neuralrohr
heraus in das gesamte Sklerotom einwachsen (Mansouri et al., 2000; Leitges et al.,
2000).
Das bei Hühnerembryonen dargestellte Expressionsmuster von uncx4.1 zeigt, dass
uncx4.1 hinsichtlich der Determination der kraniokaudalen Somitenpolarität in einem
späten, hinsichtlich der Sklerotomentwicklung jedoch in einem frühen Stadium
exprimiert ist. Bereits im Somiten I ist uncx4.1 in den sklerotombildenden Zellen des
ventralen Somitocoels und des angrenzenden epithelialen Randwalls exprimiert, es ist
damit der erste Marker des Sklerotoms. Weitere bekannte Sklerotommarker wie die
paired-box-enthaltenden
Gene pax1
und
pax9 werden
erst
kurz
vor
der
Somitenkompartimentierung im Somiten III (pax1) und im Somiten IV (pax9)
exprimiert (Wallin et al., 1994; Ebensperger et al., 1995; Neubüser et al., 1995; Müller
et al., 1996; Peters et al., 1999). Zudem persistiert die Expression von uncx4.1 von allen
präsomitischen und somitischen Markergenen einer Somitenhälfte über den längsten
Zeitraum während der Segmentierung, Somitenkompartimentierung, Sklerotomreifung
und Achsenskelettentwicklung. Damit spielt der Transkriptionsfaktor Uncx4.1 eine
entscheidende Rolle während der Achsenskelettentwicklung, als ein wichtiger, die
71
5. Diskussion
———————————————————————————————————
kaudale
Sklerotomhälfte
und
die
aus
ihr
hervorgehenden
Skelettelemente
determinierender Faktor.
5.3
Aufrechterhaltung
der
uncx4.1-Expression
durch
Signale
umgebender Strukturen
Während die Expression von uncx4.1 im präsomitischen Mesoderm unabhängig von
Signalen umgebender Strukturen ist, ist sie in den Somiten nicht länger nur das Resultat
des intrinsischen Notch-Delta-Signalweges und seiner Modulatoren, sondern erfordert
für ihr Fortbestehen Signale der axialen Organe.
Nach der autonom erfolgten Segmentierung des präsomitischen Mesoderms erfolgt die
Transformation der rein mesenchymalen Segmente zu epithelialen Somiten. Dieser
Vorgang erfordert Signale des Ektoderms, wie der die Expression des Gens paraxis
induzierenden Wnt-Proteine der wingless-Familie (Šoš
ič et al., 1997). Der
Transkriptionsfaktor Paraxis bewirkt die Epithelialisierung der Somiten. Fehlt Paraxis,
so bleibt das somitische Mesoderm mesenchymal strukturiert (Šoš
ičet al., 1997). Die
anschließende Kompartimentierung der Somiten in das ventromedial gelegene
Sklerotom und das dorsolateral gelegene Dermomyotom ist ebenfalls abhängig von
Signalen der umgebenden Strukturen. Die von dem Chorda-Bodenplatten-Komplex
sezernierten Proteine Noggin und Sonic hedgehog (Shh) ermöglichen die Ausbildung
des Sklerotoms, indem sie die epithelio-mesenchymale Transformation des ventralen
Anteils des Somiten bewirken (Fan und Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994;
McMahon et al., 1998). Sie sind Antagonisten der das Dermomyotom induzierenden
Signale des Seitenplattenmesoderms, des Ektoderms und des dorsalen Neuralrohrs,
welche die epitheliale Struktur des dorsalen Somitenanteils erhalten (Brand-Saberi
et al., 1993; Pourquié et al., 1993, 1995). Ein Ungleichgewicht der auf die Somiten
einwirkenden Signale führt zur Vergrößerung des Sklerotoms oder des Dermomyotoms
(Brand-Saberi et al., 1993; Hirsinger et al., 1997; McMahon et al., 1998; Watanabe
et al., 1998; Wagner et al., 2000).
72
5. Diskussion
———————————————————————————————————
Die Entfernung beider axialer Organe – Neuralrohr und Chorda dorsalis – vor der
Segmentierung führt zum vollständigen Fehlen von Somiten. Das somitische Mesoderm
weist lediglich unregelmäßig begrenzte, mesenchymale segmentartige Strukturen auf,
die nicht kompartimentiert werden (Christ, 1970). Die Zelldichte in diesen Strukturen
ist wesentlich geringer als in regulären Somiten (Christ, 1970; eigene Beobachtungen).
Zu keinem Zeitpunkt, auch nicht in den Somiten I bis III vor der Differenzierung des
Sklerotoms, kann in diesen Strukturen eine Expression von uncx4.1 beobachtet werden.
Dieses kann auf das Fehlen des im normalen Somiten uncx4.1-exprimierenden Gewebes
– des Sklerotoms bzw. dessen Vorläufer –zurückgeführt werden (Mansouri et al., 1997;
Neidhardt et al., 1997; diese Studie).
Wird vor der Segmentierung lediglich der Chorda-Bodenplatten-Komplex als Quelle
der sklerotominduzierenden Faktoren Noggin und Sonic hedgehog entfernt, so
unterbleibt die epithelio-mesenchymale Transformation des ventralen Somitenanteils,
und es entstehen Somiten ohne Sklerotom mit vergrößertem Dermomyotom (Christ
et al., 1979; Dietrich et al., 1993). Auch hier kann das Fehlen des Sklerotoms für die
Abwesenheit der Expression von uncx4.1 verantwortlich gemacht werden. Als ein
Resultat des intrinsischen Notch-Delta-Signalweges muss die Expression von uncx4.1
im präsomitischen Mesoderm dieser Embryonen normal induziert worden sein, was bei
den in dieser Studie untersuchten Hühnerembryonen jedoch nicht beobachtet werden
konnte.
Werden die axialen Organe nach erfolgter Segmentierung im Bereich der Somiten I bis
V entfernt, ist im Sklerotom eine erhöhte Zelltod-Rate zu beobachten, und das
Sklerotom wird auf seinen ventromedialen Anteil reduziert (Hirano et al., 1995; Sanders
et al., 2001). Gleiches geschieht nach Entfernung des Chorda-Bodenplatten-Komplexes
im Bereich der Somiten I bis V (zusammengefasst in Christ et al., 2000). Die
Expression von uncx4.1 in diesen Somiten ist in ihrer mediolateralen Ausdehnung
vermindert. Dieses zeigt, dass das Vorhandensein uncx4.1-positiver Zellen eng an die
Präsenz und die Größe des Sklerotoms gekoppelt ist, und es entsteht der Eindruck, die
Erhaltung der Expression von uncx4.1 in den Somiten durch Signale der axialen Organe
geschehe allein durch die Erhaltung des Sklerotoms. Jedoch führt die nach der
Segmentierung durchgeführte Entfernung des Chorda-Bodenplatten-Komplexes auch zu
einer deutlichen Reduktion der kraniokaudalen Ausdehnung der Expression von
73
5. Diskussion
———————————————————————————————————
uncx4.1 auf einen schmalen Streifen am kaudalen Ende eines jeden Somiten. Dieses
kann durch einen Verlust von Zellen der kaudalen Somitenhälfte entweder durch
erhöhte Apoptoserate oder durch eine verminderte Zellproliferation bedingt sein. Eine
erhöhte Apoptoserate nach Entfernung des Chorda-Bodenplatten-Komplexes vor allem
im medialen Anteil des Sklerotoms zeigten Hirano et al. (1995) und Sanders et al.
(2001). Bei uncx4.1-/--Mäusen wurde zudem eine stark herunterregulierte Expression
von pax9, dem Markergen der kaudalen Sklerotomhälfte, beobachtet, was ebenfalls ein
Hinweis auf eine Reduktion der Zellzahl in der kaudalen Sklerotomhälfte ist (Mansouri
et al., 2000). In den kaudalen Somitenhälften dieser Mäuse wurden jedoch keine
signifikant
erhöhten
Apoptoseraten
beobachtet,
vielmehr
waren
in
beiden
Somitenhälften sowohl die Apoptose- als auch die Proliferationsrate gleichermaßen
leicht reduziert. Für die fehlende Ausprägung der kaudalen Sklerotomhälfte und der aus
dieser hervorgehenden Skelettelemente wurden veränderte Zelladhäsionseigenschaften
innerhalb des kondensierenden Mesenchyms verantwortlich gemacht (Mansouri et al.,
2000).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Signale des Chorda-BodenplattenKomplexes durch die Erhaltung der Expression von uncx4.1 während Somitenreifung
und Achsenskelettentwicklung die Identität der kaudalen Somiten- und Sklerotomhälfte
kontrollieren. Sie kontrollieren somit nicht nur die dorsoventrale, sondern auch die
kraniokaudale Segmentpolarität. Die für die Wirkung dieser Signale auf das paraxiale
Mesoderm vulnerable Phase bezüglich der Determinierung und der Erhaltung der
kraniokaudalen Segmentpolarität liegt in den neugebildeten epithelialen Somiten. In
diesem Stadium der Somitenentwicklung ist die kraniokaudale Polarität der Somiten
zwar bereits determiniert, jedoch ist das Sklerotom als polaritätserhaltendes Gewebe
noch nicht ausgebildet. Die kraniokaudale Polarität ist daher in den epithelialen Somiten
noch durch äußere Faktoren modulierbar.
Das Signal oder die Signalkaskade, durch die der Chorda-Bodenplatten-Komplex die
uncx4.1-abhängige Identität der kaudalen Sklerotomhälfte aufrechterhält, ist bisher nicht
identifiziert. Noggin und Sonic hedgehog induzieren zwar zusammen – in Abwesenheit
des Chorda-Bodenplatten-Komplexes – ein Sklerotom, diesem fehlt aber die Expression
von uncx4.1 und somit die kraniokaudale Polarität. Diesen beiden Faktoren kann somit
die Kontrolle des kraniokaudalen Somitenpolarität nicht zugesprochen werden. Es
74
5. Diskussion
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bleibt derzeit noch offen, auf welche Weise die umgebenden Organe letztendlich die
zunächst autonom etablierte kraniokaudale Polarität der Somiten aufrechterhalten.
5.4 Einfluss des Neuralrohres auf die uncx4.1-Expression
Wird vor der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms das Neuralrohr entfernt,
wird die im normalen Sklerotom vorhandene Dynamik der zeitlichen und räumlichen
Expression von uncx4.1 während der späteren Sklerotomentwicklung gestört. Der
laterale Sklerotomanteil entwickelt sich nur unvollständig und uncx4.1 wird in dessen
kaudaler Hälfte nicht exprimiert. Es resultiert außerdem eine deutlich verzögerte
Gesamtentwicklung des Sklerotoms, das Sklerotom eines manipulierten Somiten im
Somitenstadium XVIII nach Christ und Ordahl entspricht dabei dem Sklerotom eines
normalen Somiten im Somitenstadium X. Die Derivate des ventrolateralen Anteils der
kaudalen Sklerotomhälfte – die Bogenwurzeln, die Wirbelbögen und die proximalen
Rippen – werden nach Entfernung des Neuralrohres vor der Segmentierung nicht
ausgebildet (Huang et al., 1994, 2000b; Monsoro-Burq et al., 1994, 1996;
zusammengefasst in Christ et al., 2000). Nach bisherigen Erkenntnissen führt die
Entfernung des Neuralrohres jedoch nicht zu einer erhöhten Apoptoserate im Sklerotom
(Hirano et al., 1995). Das Fehlen der Derivate des ventrolateralen kaudalen Sklerotoms
ist daher vermutlich auf eine verminderte Zellproliferation in diesem Sklerotomanteil
zurückzuführen.
Es ist anzumerken, dass uncx4.1 im reifen Sklerotom im dorsomedialen und im
ventrolateralen Anteil stark exprimiert ist. Diese Regionen wurden in den in früheren
Studien als pax1-freie Sklerotomanteile bezeichnet und durchlaufen ihre Entwicklung
und Reifung unabhängig von Signalen des Chorda-Bodenplatten-Komplexes (Koseki
et al., 1993; Ebensperger et al., 1995; Monsoro-Burq et al., 1994, 1996; Borycki et al.,
1998; Monsoro-Burq und Le Douarin, 2000). Während der Sklerotomentwicklung
bewirkt Sonic hedgehog (Shh) die Induktion und Erhaltung der Expression von pax1.
Überexpression von shh führt zu einer Ausdehnung des Sklerotoms und der pax1Expression nach dorsal (Wallin et al., 1994; Chiang et al., 1996). Homozygote shh-
75
5. Diskussion
———————————————————————————————————
Knockout-Mäuse weisen lediglich einige knorpelige Anteile der distalen Rippen auf, die
übrigen Achsenskelettelemente fehlen vollständig (Chiang et al., 1996). Homozygoten
pax1-Knockout-Mäusen fehlen dagegen lediglich die Wirbelkörper, die Bandscheiben
und die proximalen Rippen (Wallin et al., 1994). Homozygoten uncx4.1-KnockoutMäusen fehlen die Wirbelbögen, die Bogenwurzeln, die Querfortsätze und die
proximalen Rippen (Mansouri et al., 2000; Leitges et al., 2000). Damit integrieren
homozygote uncx4.1-Knockout-Mäuse sowohl Achsenskelettdefekte der homozygoten
shh-Knockout-Mäuse
als
auch
der
homozygoten
pax1-Knockout-Mäuse.
Die
Expressionsorte von pax1 und uncx4.1 überlappen im ventralen Anteil des Sklerotoms
teilweise, eine Überlappung der Expressionsorte von shh und uncx4.1 besteht jedoch
nicht. Auch zeigte Shh in dieser Studie keinen Einfluss auf die uncx4.1-Expression im
Sklerotom, wohingegen Signale des Neuralrohres für die Reifung der uncx4.1-positiven
Sklerotomanteile erforderlich waren. Erstaunlich ist, dass die distalen Rippen Derivate
des ventrolateralen, pax1-freien Sklerotomanteils sind (Huang et al., 2000b), in
welchem uncx4.1 exprimiert ist, welches jedoch bei deren Entwicklung bisher keine
Rolle zu spielen schien. Anhand dieser Beobachtungen könnte die von Mansouri und
Kollegen für Mausembryonen aufgestellte These, die Regulation der Expression von
uncx4.1 und pax1 werde durch zwei voneinander unabhängige Signalwege kontrolliert,
teilweise auch für das Huhn bestätigt werden (Mansouri et al., 2000). Denkbar wäre,
dass Signale des Chorda-Bodenplatten-Komplexes und des Neuralrohres nur die jeweils
für sie kompetenten Sklerotomzellen beeinflussen. Damit käme dem Neuralrohr nicht
nur eine entscheidende Rolle in der Entwicklung der Derivate des lateralen
Sklerotomanteils, sondern auch in der Kontrolle der korrekten räumlichen und
zeitlichen Expression von uncx4.1 zu (siehe Schema 16). Jedoch könnten Signale des
Neuralrohres auch die Expression von uncx4.1 und die Entwicklung der lateralen
Sklerotomanteile induzieren, gleichzeitig aber die Expression von pax1 und die
Entwicklung der übrigen Sklerotomanteile hemmen, sodass die Expression von uncx4.1
und pax1 doch durch einem einzigen Signalweg reguliert würden (siehe Schema 15).
76
5. Diskussion
———————————————————————————————————
Schema 15: Noggin und Shh als Signale des Chorda-Bodenplatten-Komplexes induzieren die
Expression von pax1 in den medialen Sklerotomanteilen, ein bislang unbekanntes Signal des
Neuralrohres induziert die Expression von uncx4.1 in den lateralen und ventralen
Sklerotomanteilen.
5.5 Aufrechterhaltung der Segmentpolarität vom präsomitischen
Mesoderm bis zur Skelettentwicklung durch uncx4.1
Die Expression von uncx4.1 persistiert in der kaudalen Hälfte eines jeden Somiten bis
zur Entwicklung der daraus hervorgehenden Achsenskelettelemente. Damit ist uncx4.1
das einzige bislang bekannte Zielgen des Notch-Delta-Signalweges, dessen Expression
eine derart lange Entwicklungsperiode überdauert. Andere Modulatoren und Zielgene
des Notch-Delta-Signalweges finden sich lediglich im präsomitischen Mesoderm und in
den neugebildeten Somiten: notch1 und notch2 in den Somiten –II und –I, dll1 in den
Somiten I bis IV, lunatic fringe in den Somiten I und II, ephA4 im Somiten I und
c-hairy1 in den Somiten I bis X (Hrabe de Angelis et al., 1997; Palmeirim et al., 1997,
1998; Aulehla et al., 1999; Del Barco Barrantes et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Die
Expression von uncx4.1 verschwindet nur in den okzipitalen Somiten vollständig und
wird in den zervikalen und thorakalen Somiten in ihrer kraniokaudalen Ausdehnung
innerhalb des einzelnen Somiten reduziert. Dieses dynamische Verhalten der Expression
von uncx4.1 über den gesamten Zeitraum der Somitenentwicklung lässt die Funktion
des Transkriptionsfaktors Uncx4.1 in der Kontrolle der Identität der kaudalen
Somitenhälfte erkennen. Uncx4.1 ist essenziell für die Etablierung der kraniokaudalen
Polarität der Somiten und des sich daraus entwickelnden Achsenskeletts. Es ist der
77
5. Diskussion
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bisher einzig bekannte Faktor, der die für die Resegmentierung der Somiten zu Wirbeln
unabdingbare kraniokaudale Somitenpolarität über alle Entwicklungsstadien der
Somiten erhält.
Fehlt die Expression von uncx4.1 in den Somiten, wird in neugebildeten Somiten die
kaudale Somitenhälfte initial gebildet, was an der Kondensierung ihrer Zellen erkennbar
ist (Mansouri et al., 2000; Leitges et al., 2000). In reiferen Somiten jedoch können in
Abwesenheit von uncx4.1 die Eigenschaften der kaudalen Somitenhälfte nicht erhalten
werden. Die Reduktion der Zellzahl in der kaudalen Somitenhälfte kann hierbei, wie
zuvor diskutiert, durch eine erhöhte Apoptoserate, aber auch durch eine Invasion von
Zellen der kaudalen in die kraniale Somitenhälfte bedingt sein. Umgekehrt wurde dieses
Phänomen (die Invasion von Zellen der kranialen in die kaudale Somitenhälfte) und die
Aufhebung der durch die von-Ebnersche Fissur markierten intersomitischen Grenze von
Bussen et al. (2004) anhand der Expression des Gens tbx18 beobachtet (Bussen et al.,
2004). Dieses für den bHLH-Transkriptionsfaktor Tbx18 kodierende Gen ist in den
kranialen Hälften der Somiten -I bis III und nach der Kompartimentierung in den
kranialen Sklerotomhälften exprimiert. Die Expression wird in der medialen
Sklerotomhälfte herunterreguliert und bleibt bis zur Resegmentierung in der lateralen
Sklerotomhälfte erhalten (Kraus et al., 2001; Bussen et al., 2004). Bei uncx4.1-/-Mäusen ist tbx18 im gesamten Somiten bzw. Sklerotom exprimiert, ebenso findet sich
bei tbx18 -/--Mäusen die Expression von uncx4.1 im gesamten Somiten bzw. Sklerotom
(Bussen et al., 2004). Das Fehlen von tbx18 führt in neugebildeten Somiten zu einer
erhöhten Apoptoserate in der kranialen Somitenhälfte. In bereits kompartimentierten
Somiten kommt es zu einer Aufhebung der von-Ebnerschen Fissur und nachfolgend zu
einer Invasion von Zellen der kaudalen in die kraniale Sklerotomhälfte (Bussen et al.,
2004). Analog dazu führt Überexpression von tbx18 zu einer Reduktion der Expression
von uncx4.1 auf einen schwachen, schmalen Streifen am kaudalen Ende eines jeden
Somiten bzw. Sklerotoms, die intersomitische Grenze ist dabei nach kaudal verlagert
und unklar definiert. In Abwesenheit von uncx4.1 kommt es zu einer erhöhten Aktivität
von tbx18 und sowohl zu erhöhter Apoptoserate in der kaudalen als auch zu Invasion
von Zellen der kranialen Somiten- bzw. Sklerotomhälfte in die kaudale. Dies erklärt
auch die Tatsache, dass bei den von Mansouri et al. (2000) untersuchten uncx4.1-/-Mäusen kein Unterschied zwischen den Zelldichten der beiden Somitenhälften auffiel.
78
5. Diskussion
———————————————————————————————————
Uncx4.1-/--Mäuse weisen eine im gesamten Somiten uniforme Expression des Markers
für erhöhte Zelldichte, semaphorinD auf, welches in Wildtyp-Mäusen nur in der
kaudalen
Somitenhälfte
exprimiert
ist. Die
uniforme
Zelldichte
in
beiden
Sklerotomhälften bedingt die teilweise Fusionierung der Wirbelkörper und – durch
Einwachsen der Axone aus dem Neuralrohr in das gesamte Sklerotom – die weitgehend
fehlende Segmentierung des Nervensystems (Püschel et al., 1995; Wright et al., 1995;
Messersmith et al., 1995; Mansouri et al., 2000).
Eine geordnete Resegmentierung erfordert das Aufeinandertreffen jeweils eines
kaudalen Somitendrittels mit den kranialen zwei Somitendritteln des darauffolgenden
Somiten (Remak 1850, Christ et al., 2000; Huang et al., 2000a). Fehlt uncx4.1 in den
Somiten, so kann eine geordnete Resegmentierung nicht stattfinden. Die Erhaltung der
kraniokaudalen Segmentpolarität erfordert sogar beide intakte Allele von uncx4.1. Bei
uncx4.1+/-- Mäusen ist die Expression von uncx4.1 bereits am Tag 10 der
Embryonalentwicklung nur noch in den lumbalen und sakralen Somiten zu erkennen,
im Gegensatz dazu besteht die Expression bei uncx4.1 +/+-Mäusen desselben
Entwicklungsstadiums auch in den thorakalen Somiten fort (Neidhardt et al., 1997;
Leitges et al., 2000; Mansouri et al., 2000). Die Reduktion der Expression von uncx4.1
in den Somiten der uncx4.1 +/--Mäuse führt zu Verlust der kraniokaudalen
Somitenpolarität und erfolgt in einem Somitenstadium, das zur Resegmentierung noch
nicht fähig ist. Dieses geschieht bei Wildtyp-Embryonen in den okzipitalen Somiten,
welche das Os occipitale bilden, regelhaft und ist hier erwünscht (zusammengefasst in
Christ et al., 2000). Bei den uncx4.1+/--Mäusen dagegen resultieren Wirbelkörper
unregelmäßiger Größe und Form als Ausdruck einer gestörten Resegmentierung
(Neidhardt et al., 1997; Leitges et al., 2000; Mansouri et al., 2000).
Nach diesen Ergebnissen kann Uncx4.1 als ein "Überlebensfaktor" für die kaudale
Sklerotomhälfte angesehen werden. Es erhält die Identität der kaudalen Sklerotomhälfte
und erhält die im präsomitischen Mesoderm erworbene kraniokaudale Polarität über das
Somitenstadium bis zu den definitiven Wirbeln aufrecht.
79
6. Zusammenfassung
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6. Zusammenfassung
Die Segmentierung des paraxialen Mesoderms ist ein entscheidender Meilenstein in der
Entwicklung der Vertebraten. Sie führt zur Bildung der Somiten, der Ursegmente des
Embryos, aus welchen Wirbel, Rippen, die Muskulatur des Rückens und der
Extremitäten, die Dermis des Rückens, Gefäßendothelien und die glatte Muskulatur der
viszeralen Organe entstehen. Bei der Segmentierung des präsomitischen Mesoderms
spielen die Gene des Notch-Delta-Signalweges eine große Rolle. Dieser in der Evolution
hochkonservierte Signalweg bewirkt durch "laterale Spezifizierung" die Grenzbildung
zwischen ursprünglich identischen Zellen. Ein Zielgen des Notch-Delta-Signalweges ist
uncx4.1, welches für den Homöobox-enthaltenden Transkriptionsfaktor Uncx4.1 kodiert.
In Mausembryonen ist uncx4.1 in den kaudalen Somitenhälften – später in den kaudalen
Sklerotomhälften –, im Zentralen Nervensystem und in der Nierenanlage exprimiert.
Whole
mount
in
situ-
Hybridisierungen
mit
einem
163
bp-Fragment
des
vogelspezifischen uncx4.1-mRNA ergeben ein dazu passendes Bild. Zusätzlich kann eine
Expression im kranialen Anteil des präsomitischen Mesoderms nachgewiesen werden.
Dabei ist die Induktion der Expression von uncx4.1 im präsomitischen Mesoderm
unabhängig von Signalen umgebender Strukturen, während für ihre Erhaltung im Somiten
Signale des Chorda-Bodenplatten-Komplexes und des Neuralrohres erforderlich sind.
Insbesondere Signale des Neuralrohres sind im reifen Sklerotom – durch Steuerung der
Entwicklung seines uncx4.1-exprimierenden lateralen und ventralen Anteils – essenziell.
Uncx4.1 ist als Zielgen des Notch-Delta-Signalweges im Rahmen der Segmentierung des
präsomitischen Mesoderms zu einem späten, im Rahmen der Spezifizierung des
Sklerotoms zu einem frühen Zeitpunkt exprimiert. Dieses räumliche und zeitliche
Expressionsmuster während der Sklerotomentwicklung weist auf die Rolle in Uncx4.1 im
Entwicklungs- und Reifungsprozess der Somiten hin. In neugebildeten Somiten
spezifiziert Uncx4.1 die Identität der kaudalen Somitenhälfte, in reifen Somiten die der
Zellen des ventralen und des lateralen Anteils der kaudalen Sklerotomhälfte. Dadurch
wird zum einen die im präsomitischen Mesoderm determinierte kraniokaudale Polarität
der Somiten bis zur Resegmentierung und Bildung der Wirbel erhalten, zum anderen
werden die Elemente des Achsenskeletts, welche Derivate des ventralen und des lateralen
Anteils der kaudalen Sklerotomhälfte sind, durch Uncx4.1 spezifiziert.
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97
Anhang: Lebenslauf
———————————————————————————————————
Anhang
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Schrägle
Vorname:
Julia
Geburtsdatum:
12.04.1978
Geburtsort:
Freiburg im Breisgau
Familienstand:
ledig
Anschrift:
Waterdelle 15
26757 Borkum
Telefonnummer:
04922 / 302645
Mobil:
0152 / 06668867
E-Mail:
[email protected]
Berufliche Tätigkeit:
07/2005 – 06/2006
Assistenzärztin in der Abteilung für Unfall- und
Handchirurgie der Chirurgischen Klinik der
St. Vincentius- Kliniken Karlsruhe
Seit 01.07.2006
Assistenzärztin in der Abteilung für Dermatologie der
Reha-Klinik Borkum Riff der Deutschen
Rentenversicherung Bund
Schulbildung:
1984 - 1988
Emil-Thoma-Grundschule, Freiburg
1988 - 1997
Deutsch-Französisches Gymnasium, Freiburg
Abschluss: Abitur am 18.06.1997
Hochschulbildung:
1997 - 2005
Studium der Humanmedizin an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg
98
Anhang: Lebenslauf
———————————————————————————————————
Ärztliche Vorprüfung: 22.03.2000 (Note: gut)
Erstes Staatsexamen: 22.03.2001 (Note: gut)
Zweites Staatsexamen: 08.09.2003 (Note: gut)
Drittes Staatsexamen: 25.04.2005 (Note: gut)
Approbation als Ärztin am 02.05.2005
Praktisches Jahr:
2004 - 2005
Innere Medizin: Städtisches Klinikum Karlsruhe
Chirurgie: Centre Hospitalier Universitaire, Grenoble/
Frankreich
Dermatologie: Städtisches Klinikum Karlsruhe
Famulaturen:
08 / 2000
Anästhesie und Intensivmedizin, Helios-Klinik, TitiseeNeustadt
09 / 2000
Allgemein- und Viszeralchirurgie, St.-JosefsKrankenhaus, Freiburg
08 / 2002
Unfallchirurgie, Centre Hospitalier Général, Evreux/
Frankreich
03 / 2003
Orthopädie und Rheumatologie, Praxis Prof. Hehne/
Dr. Morgenthaler, Freiburg
Nebentätigkeiten:
1997 - 2005
Tätigkeit als Aushilfe im Pflegedienst in der
Medizinischen Klinik des Universitätsklinikums
Freiburg
1998 - 2003
Mitarbeit bei der European Medical Students`
Association
1999 - 2002
Tätigkeit als Vorpräparantin am Institut für Anatomie
und Zellbiologie II der Universität Freiburg
99
Anhang: Lebenslauf
———————————————————————————————————
Dissertation:
2008
Kontrolle der zeitlichen und räumlichen Expression von
uncx4.1 im paraxialen Meosderm des Hühnerembryos.
Experimentelle Arbeit am Institut für Anatomie und
Zellbiologie II der Universität Freiburg unter der
Leitung von Frau Prof. Dr. rer. nat. F. Pröls
Veröffentlichung:
Schrägle J, Huang R, Christ B, Pröls F (2004). Control
of the temporal and spatial Uncx4.1 expression in the
paraxial mesoderm of avian embryos. Anat Embryol
208: 323 - 332.
Fremdsprachen:
Französisch (fließend), Englisch (gute Kenntnisse)
100
Anhang: Danksagung
———————————————————————————————————
Danksagung
-
Frau Prof. Dr. rer. nat. Felicitas Pröls danke ich für die Anregung und
Vorbereitung der Arbeit durch Klonierung der Gensonde uncx4.1, für die Hilfe
bei der Realisierung der Publikation, für die Durchsicht der Arbeit, die
hilfreichen Kommentare zum Manuskript und die Erstellung des Erstgutachtens.
Während der gesamten Arbeit hatte sie unendliche Geduld und nahm sich viel
Zeit für Diskussionen.
-
Herrn Prof. Dr. med. Dr. h. c. Bodo Christ danke ich für die Überlassung des
Themas, die ausführliche Anleitung zur Laborarbeit und die konstruktiven
Diskussionen.
-
Herrn Prof. Dr. med. Norbert P. Südkamp danke ich für die Erstellung des
Zweitgutachtens.
-
Herrn Prof. Dr. med. Ruijin Huang danke ich für die Einarbeitung in die
verschiedenen Operationstechniken und die Hilfe bei der Vorbereitung von
Vorträgen.
-
Frau Ulrike Pein, Frau Meike Ast-Dumbach, Frau Ellen Gimbel, Frau Lidia
Koschny und Herrn Günter Frank danke ich für ausgezeichnete technische
Assistenz im Labor.
-
Frau Dr. med. Marlyse Dieuguié-Fomenou, Herrn Dr. med. Florian Ehehalt und
Herrn Dr. med. Marc Rodriguez-Niedenführ danke ich für die Einarbeitung in
die verschiedenen Labormethoden.
-
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir Studium und Doktorarbeit finanziell
ermöglicht haben, und für ihre Geduld und Unterstützung während der gesamten
Arbeit.
-
Meinem Freund, Herrn Jörg Gropengießer, danke ich für seine unendliche
Geduld und die wertvolle Unterstützung in den letzten Phasen der Dissertation.
101
Anhang: Verzeichnis eigener Publikationen
———————————————————————————————————
Verzeichnis eigener Publikationen
Veröffentlichungen in Zeitschriften:
Schrägle, J., Huang, R., Christ, B., Pröls, F. (2004). Control of the temporal and
spatial Uncx4.1 expression in the paraxial mesoderm of avian embryos. Anat
Embryol 208: 323 - 332.
Kongressbeiträge:
J. Schrägle, F. Pröls, R. Huang, B. Christ. Regulation der Expression von Uncx4.1 in
den Somiten des Hühnerembryos. Vortrag im Rahmen der Arbeitstagung der
Anatomischen Gesellschaft vom 02.10.2002 bis 04.10.2002 in Würzburg
102
Anhang: Erklärung
———————————————————————————————————
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig angefertigt und in
dieser oder ähnlicher Form noch nicht anderweitig vorgelegt habe.
Borkum, den 20.09.2008
Julia Schrägle