Dokument_1. - OPUS Würzburg

Identifizierung und Charakterisierung von
Genen für sensorineurale Hörstörungen
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Eberhard Schneider
geboren in
St. Gallen/Schweiz
Würzburg Mai 2010
Eingereicht am:
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender:
Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. Thomas Haaf
Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. Thomas Dandekar
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am:
2
Die vorliegende Arbeit wurde von März 2007 bis Mai 2010 an den Instituten für
Humangenetik der Universitäten Mainz und Würzburg unter Betreuung von Herrn
Univ.-Prof. Dr. med. Thomas Haaf angefertigt.
Hiermit erkläre ich, daß ich diese Doktorarbeit selbständig und ausschließlich unter
Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel verfasst habe.
Die Dissertation hat bisher weder in gleicher noch in ähnlicher Form in einem
anderen Prüfungsverfahren vorgelegen.
Es wurde zuvor kein anderer akademischer Grad erworben.
Würzburg, Mai 2010
_______________________________
Eberhard Schneider
3
Danksagung
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt meinem akademischen Lehrer, Herrn Univ.-Prof. Dr. med.
Thomas Haaf.
Danken möchte ich auch Frau Priv.-Doz. Dr. med. habil. Angelika Daser und Herrn
Priv.-Doz. Dr. biol. hum. et med. habil. Ulrich Zechner und den Teams der Institute
für Humangenetik der Universitäten Mainz und Würzburg.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Frau Pia und meiner Tochter Emma.
4
Zusammenfassung
Inhalt
Seite
1. Zusammenfassung............................................................................................ 9
2. Summary............................................................................................................10
3. Einleitung...........................................................................................................11
3.1 Epidemiologie sensorineuraler Hörstörungen.................................. 13
3.2 Evolution des Hörens........................................................................14
3.3 Hören und Hörstörungen.................................................................. 15
3.3.1 Anatomie und Physiologie des Hörens..................................15
3.3.2 Genetik des (Innenohr-) Hörens........................................... 20
3.4 Molekularbiologische Diagnostik...................................................... 26
3.5 Therapeutische Ansätze................................................................... 32
3.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................35
4. Material und Methoden.....................................................................................37
4.1 Polymerase- Kettenreaktion (PCR).................................................. 37
4.2 Long Range PCR..............................................................................37
4.3 Vektor Ligation..................................................................................38
4.4 DNA Sequenzierung......................................................................... 38
4.5 RNA- Extraktion................................................................................ 39
4.6 cDNA- Umschreibung....................................................................... 39
4.7 Messung gewebespezifischer Expression........................................40
4.8 Gel- Extraktion.................................................................................. 40
4.9 Bisulfitkonvertierung der DNA...........................................................41
4.10 Pyrosequencing.............................................................................. 41
4.11 Patienten/Kontrollen....................................................................... 42
4.12 Stammbaum- und Karyotypanalyse................................................43
4.13 GST-Pulldowns und Western-Blotanalysen....................................43
4.14 Datenauswertung............................................................................44
4.15 Primerlisten.................................................................................... 46
4.15.1 Bruchpunkteinegnung PDZD7.............................................46
5
Zusammenfassung
Seite
4.15.2 Expressionsanalyse PDZD7................................................ 47
4.15.3 Sequenzierungsassay PDZD7............................................ 47
4.15.4 Sequenzierungsassays Connexine..................................... 49
4.15.5 Pyrosequencing Assay OTOF............................................. 49
4.15.6 Pyrosequencing Assay KCNE1........................................... 49
4.15.7 PCR-Assay "Wilch-Deletion"............................................... 50
4.15.8 Pyrosequencing Assay GJB2-Promoter.............................. 50
5. Ergebnisse.........................................................................................................51
5.1 Identifizierung und Charakterisierung von neuen Hörstörungsgenen......... 53
5.1.1 Klonierung eines Kandidatengens....................................................53
5.2 Identifizierung und Charakterisierung genetischer und
epigenetischer Hörstörungsmechanismen.................................................. 63
5.2.1 Screening des Kandidatengens PDZD7.......................................... 63
5.2.2 Screening der Connexine CX30, CX30.3 und CX43........................66
5.2.3 Sreening der Q829X Mutation in OTOF........................................... 67
5.2.4 Screening des Gly38Ser Polymorphismus (KCNE1) .......................69
5.2.5 Screening der Deletion
[del(chr13:19,837,344-19,968,698)]................................................. 71
5.2.6 Screening nach Epimutationen des GJB2-Promoters......................72
5.2.7 Zusammenfassung der Daten.......................................................... 74
6. Diskussion.........................................................................................................78
6.1 Auswertung der Patientendaten aus der Routinediagnostik....................... 78
6.2 Identifizierung und Charakterisierung von neuen Hörstörungsgenen..........79
6.3 Patienten Screenings...................................................................................84
6.3.1 PDZD7..............................................................................................84
6.3.2 Connexine........................................................................................ 86
6.3.3 OTOF............................................................................................... 91
6.3.4 KCNE1..............................................................................................92
6.3.5 Regulatorische Effekte..................................................................... 93
6
Zusammenfassung
Seite
7. Referenzen.......................................................................................................102
7.1 Literatur......................................................................................................102
7.2 Elektronische Quellen................................................................................119
8. Abkürzungen................................................................................................... 121
8.1 Allgemein...................................................................................................121
8.2 Gene..........................................................................................................122
9. Curriculum vitae............................................................................................ 125
10. Publikationen und Kongressbeiträge........................................................ 126
10.1 Publikationen........................................................................................... 126
10.2 Kongressbeiträge (nur Vorträge ohne Posterpräsentationen).................128
Abbildungen und Tabellen
Abbildungen
3.1 Verteilung angeborener Hörstörungen........................................................ 12
3.2 Tonotopische Reizverteilung....................................................................... 20
3.3 Expression von Hörstörungsgenen im Innenohr......................................... 22
3.4 Verteilung genetisch bedingter Hörstörungen............................................. 29
5.1 Stammbaum der Familie........................................................................... 54
5.2 Darstellung der Translokation................................................................... 55
5.3 Kartierung der Bruchpunktregion.............................................................. 56
5.4 Vektor-Ligationstechnik............................................................................. 57
5.5 Fusionssequenz........................................................................................ 58
5.6 PDZD7- Isoformen.................................................................................... 60
5.7 Expression von PDZD7 im Innenohr......................................................... 61
5.8 Aminosäurehomologien............................................................................ 62
5.9 Sequenzpolymorphismus.......................................................................... 65
7
Zusammenfassung
Seite
5.10 Pyrosequencing der OTOF-Mutation Q829X............................................ 68
5.11 Verteilung des Gly38Ser-Polymorphismus................................................70
5.12 Deletions-Multiplex Assay......................................................................... 71
5.13 Pyrosequencing-Assay GJB2 Promoter- Methylierung............................. 72
5.14 Ergebnisse GJB2 Promoter-Methylierung................................................. 74
6.1 PDZ-Domänenproteine Harmonin, Whirlin und PDZD7............................ 82
6.2 Polymorphismen in PDZD7....................................................................... 85
6.3 Ausschluß des pCX43-Assays von Yang et al.......................................... 87
6.4 SNP-Vergleich CX43 mit pCX43............................................................... 89
6.5 Vorhersage der pathogenen Relevanz eines Aminosäureaustausches....91
6.6 Deletionen in einer Gründerfamilie............................................................ 94
6.7 CpG-Inseln auf Chr. 13............................................................................. 95
Tabellen
3.1 Überblick Hörstörungsgene....................................................................... 26
5.1 Diagnostische Untersuchungen 2002 – 2009............................................ 48
5.2 Polymorphismen in Transkript PDZD7_human.......................................... 60
5.3 Ergebnisse Mutationsscreening C2485T (Q829X).................................... 65
5.4 Übersicht Hörstörungspatienten................................................................ 72
5.5 Auswertung NHSL-Patienten..................................................................... 73
6.1 Anteil von 46 bekannten Hörstörungsgenen an NHSL...............................95
8
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Ungefähr 1 -3 Lebendgeborene von 1000 sind von einer Hörstörung betroffen, wovon
etwa 60% der Fälle genetisch bedingt sind und in der Mehrzahl einem autosomal
rezessiven Erbgang unterliegen. Die Ursachen dieser, zumeist das Innenohr
betreffenden, Schallempfindungsstörungen sind äußerst heterogen. Rund 50 Gene
konnten
bisher
mit
angeborener,
nicht-syndromaler
Schallempfindungs-
schwerhörigkeit in kausalen Zusammenhang gebracht werden, mit GJB2 als dem
bislang bedeutendsten, das für bis zu 50% aller Fälle verantwortlich ist. Die
Identifizierung
weiterer
Hörstörungsgene
und
deren
Charakterisierung
war
Gegenstand dieser Arbeit. Dafür wurden Positionsklonierungsverfahren einerseits
und Patienten-screenings andererseits, angewandt.
Wir fanden eine homozygote, reziproke Translokation 46,XY,t(10;11),t(10;11) bei
einem Patienten mit kongenitaler Schallempfindungsschwerhörigkeit. Beide Eltern
und vier weitere Geschwister waren heterozygote Träger der Translokation. Nach der
Einengung der Bruchpunktregionen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
von spezifischen BAC-Klonen, konnte der exakte Bruchpunkt mittels Vektor-Ligation
der Fusionsfragmente und anschließender Sequenzierung bestimmt werden. PDZD7
ist ein PDZ-Domänen-kodierendes Gen auf Chromosom 10, das durch die
Translokation beim Patienten zerrissen ist. PDZD7 ist ein Paralog zu den PDZDomänen enthaltenden Genen Harmonin und Whirlin. Mutationen in beiden Genen
können
kongenitale
nicht-syndromale
Taubheit
und
das
Usher-Syndrom
verursachen, eine Erkrankung mit Taub- und Blindheit. Funktionelle Protein-Protein
Interaktionsstudien und Genexpressionsmessungen konnten zeigen, dass PDZD7
mit den beiden Usher-Proteinen interagiert und im menschlichen Innenohr exprimiert
wird. Diese Daten unterstützen eine starke Evidenz für PDZD7 als syndromales und
nicht-syndromales Hörstörungsgen.
Weiterhin wurden durch Screenings eines Hörstörungspatientenkollektives (n=534)
genetische
und
epigentische,
möglicherweise
pathogene
Mechanismen
charakterisiert. Diese Screenings wurden für PDZD7, CX30, CX30.3, CX43
(Exomsequenzierung); OTOF, KCNE1 (SNP-Typisierung); del(chr13:19,837,34419,968,698) (Deletionsscreening) und GJB2 (Promotermethylierung) durchgeführt.
9
Summary
2. Summary
Congenital deafness occurs with a frequency of 1 -3 in 1000 live births. Genetic
defects cause nearly 60% of all cases with 70% of them being autosomal recessive
disorders. There are heterogenous reasons for genetic hearing loss which affect
mostly structures of the inner ear. To date some 50 genes could have been linked to
sensorineural non-syndromic deafness. Among them GJB2 is the most prominent
and important gene and it accounts for up to 50% of all cases. Positional cloning and
screening of patients had been applied for the identification and characterization of
additional deafness genes which was an issue of this work.
A homozygous reciprocal translocation 46,XY,t(10;11),t(10;11) was detected in a
patient with congenital non-syndromic sensorineural deafness. Both parents and their
four other children were heterozygous translocation carriers. Fluorescence in situ
Hybridisation (FISH) of region-specific clones to patient chromosomes was used to
narrow down the breakpoint regions. Vector ligation of junction fragments were
cloned and subsequently sequenced to localize the exact breakpoint. PDZD7, a PDZ
domain coding gene on chromosome 10, was disrupted by the chromosomal break.
PDZD7 is a paralog of PDZ domain containing genes harmonin and whirlin.
Mutations in both genes can cause congenital non-syndromic deafness and/or Usher
syndrome. Functional protein-protein interaction assays and gene expression
experiments revealed that PDZD7 is integrated in the Usher network and is
expressed in the human inner ear, respectively. These data support strongly that
PDZD7 is a further autosomal recessive deafness- and Usher syndrome-gene.
Further on we screened a panel of genes in deafness patients (n=534) to
characterize potentially pathogenic genetic and epigenetic mechanisms. The
analysed genes had been PDZD7, CX30, CX30.3, CX43 (exome-sequencing);
OTOF, KCNE1 (SNP-genotyping); del(chr13:19,837,344-19,968,698)
(deletion-
screening) and GJB2 (promotermethylation).
10
Einleitung
3. Einleitung
Hörstörungen gehören zu den ätiologisch heterogenen Erkrankungen und haben
vielfältige genetische und umweltbedingte Ursachen. Prälinguale Formen sind
besonders
schwerwiegend,
da
diese
durch
die
Einschränkung
der
Kommunikationsfähigkeit häufig kognitive und soziale Entwicklungsstörungen nach
sich ziehen (Kubisch, 2005). Genaue Erhebungen über die Inzidenz in der
Bevölkerung gibt es erst seit den 1960er Jahren mit der Einführung von noninvasiven, nicht-apparativen und apparativen Tests. Routinemäßiges NeugeborenenScreening gibt es seit den späten 1980er Jahren, beginnend mit Verhaltenstests in
den Vereinigten Staaten (Morton und Nance, 2006) bis hin zu der heute üblichen
Anwendung nicht-invasiver, elektrophysiologischer Untersuchungsmethoden wie
zum Beispiel dem BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry)-phone
(Shehata-Dieler et al., 2000). Beeinflusst durch zahlreiche Faktoren wie Geographie
und Population kann man grob verallgemeinert sagen, dass etwa 1/1000
Neugeborenen durch eine hochgradige bis schwere Hörstörung betroffen ist
(Marazita et al., 1993; Elden et al., 2002), was bedeutet, dass für die Betroffenen
Hören erst ab ca. 70 dB, oder überhaupt nicht mehr möglich ist (Denoyelle et al.,
1999). Das Hören wird in Dezibel (dB) gemessen. Dabei ist die 0 dB-Schwelle für
eine gegebene Frequenz der Wert, bei dem ein gesunder junger Erwachsener diese
gerade noch wahrnimmt. Liegt die Hörschwelle bis 15dB gilt dies noch als normales
Hören. Hörstörungen werden unterteilt in leicht (engl.: mild, 26-40dB), mittel (engl.:
moderate, 41-55dB), mäßig schwer (engl.: moderately severe, 56-70dB), schwer
(engl.: severe, 71-90dB) und resthörig bis taub (engl.: profound, >90dB). Diese
Einteilung wird zum Teil bei Kleinkindern etwas nach unten korrigiert, da selbst
schwächere Hörstörungen die Sprachentwicklung nachhaltig verzögern können
(Kochhar et al., 2007). In den Industrieländern haben bis zu 60% der Fälle eine
genetische Ursache (Smith et al., 2005) (Abb. 3.1). Dass dieser Wert etwas höher
liegt als in eher unterentwickelten Regionen, ist dem geringeren Anteil perinataler
Komplikationen und maternofetaler Infektionen zuzuschreiben (Kubisch, 2005). Der
Zusammenhang von Vererbung und Hörstörungen wurde schon im 16. Jahrhundert,
unter
anderem
bei
konsanguinen
Familien,
beobachtet
und
mit
sozialen
Repressalien wie Heiratsverboten belegt. Gründereffekte wurden ebenfalls bereits im
17. Jahrhundert in Martha’s Vineyard, eine der Küste des US-Staates Massachusetts
11
Einleitung
vorgelagerte Insel, beschrieben, wobei die erste Aufzeichnung einer tauben Person
von 1694 stammt. Möglicherweise auf Grund der durch den Gründereffekt bedingten
hohen Inzidenz angeborener Hörstörungen wurde hier auch eine Zeichensprache
entwickelt, die jeder Inselbewohner „sprach“ (Dror et al., 2009). Nicht immer wurden
Hörgestörte ohne weiteres in ihrem sozialen Umfeld aufgenommen. Alexander Bell,
der Erfinder des Telefons, galt als ausgemachter Gegner von
Abb. 3.1 Verteilung angeborener Hörstörungen. Repräsentiert ist der Stand 2005 (nach Smith et
al., 2005).
Hochzeiten hörgestörter Paare (seine Frau und seine Mutter waren taub). Einen
traurigen Höhepunkt der Benachteiligung hörgestörter Menschen erlebte das NaziDeutschland der 1930er und 1940er Jahre, wo 1600 Taube ermordet und 17000
sterilisiert wurden (Branson et al., 2002; Dror et al., 2009). Heutzutage gibt es
regelrechte Kulturen tauber Menschen unter denen es sogar Theatergruppen von
Taubblinden gibt. Letztere sind überwiegend vom Usher-Syndrom betroffen, einer
erblichen Erkrankung, die nicht nur Hörstörungen verschiedenen Ausmaßes
verursacht, sondern auch zur Erblindung führt (Dror et al., 2009). Schwerhörigkeit
oder Taubheit betreffen heute allein in Europa 22,5 Millionen Menschen (Eurohear,
Stand 2003). Vor allem bei angeborenen Hörstörungen ist eine frühe Diagnose im
Hinblick auf optimale Behandlung und Betreuung oberstes Ziel (Kubisch, 2005) und
12
Einleitung
genau dafür kann die Aufklärung genetischer Ursachen wichtige Informationen
liefern. In dieser Hinsicht sind in den letzten 20 Jahren enorme Fortschritte gemacht
worden: etwa 60 autosomal dominante, 80 autosomal rezessive und 8 Xchromosomale Gen-Orte für nicht-syndromale Hörstörungen, sowie 46 ursächliche
Gene wurden identifiziert (Hilgert et al., 2009; Hereditary Hearing Loss Homepage).
3.1 Epidemiologie sensorineuraler Hörstörungen
Sensorineurale Hörstörungen zählen zu den am häufigsten vorkommenden
angeborenen Erkrankungen des Menschen (Congenital Sensorineural Hearing Loss:
CSHL) in entwickelten Ländern. Damit treten Hörstörungen, am Beispiel der USA,
etwa dreimal häufiger auf als das Down Syndrom, sechsmal häufiger als Spina bifida
und fünfzigmal häufiger als Phenylketonurie (Smith et al., 2005). Grundsätzlich
lassen sich zwei Altersgipfel beobachten und zwar in der frühen Kindheit und im
fortgeschrittenen Erwachsenenalter (Davis et al., 1989). Die Prävalenz angeborener
Hörstörungen ist bei Geburt etwa 1-2/1000, bis zum 5. Lebensjahr steigt dieser Wert
auf 2-3/1000 und weiter auf 3-4/1000 während der Adoleszenz, also zwischen dem
10-20 Lebensjahr (Morton und Nance, 2006). Prälinguale, also vor dem Erwerb des
Sprechvermögens auftretende monogene Hörstörungen sind häufig autosomal
rezessiv, während postlinguale Hörstörungen eher autosomal dominant sind.
Autosomal rezessive Hörstörungen haben einen Anteil von etwa 80% und meist
schwere Verläufe, während autosomal dominante etwa 15% ausmachen und meist
spät einsetzten (engl.: „late onset“) und progradient zu verlaufen (Hereditary Hearing
Loss Homepage). Von 100 Fällen angeborener Hörstörungen sind statistisch ca. 40
umwelt- und 60 genetisch bedingt (s.o.); die genetisch bedingten Hörstörungen
unterteilen sich in 40 nicht- syndromische und 20 syndromische, wobei bei letzteren
die Hörstörung nicht notwendigerweise die herausragende klinische Indikation sein
muss. Insgesamt sind über 400 Syndrome bekannt bei denen Hörstörungen ein
Symptom darstellen. Zu den häufigsten Syndromen mit Hörstörungen gehören
Usher-, Pendred- und Waardenburg Syndrom. Für die nicht-syndromischen
monogenen Hörstörungen sind über 100 genetische Loci und knapp 50 ursächlich
involvierte Gene bekannt, wovon etwa ¾ autosomal rezessive und 1/4 dominante
Erbgänge haben (Hilgert et al., 2009). Bemerkenswert ist, das trotz der sehr
13
Einleitung
heterogenen Ursachen nicht-syndromaler Hörstörungen etwa die Hälfte der Fälle
durch Mutationen eines Gens, GJB2, verursacht werden (Kelsell et al., 1997; Apps v,
2007). Ein sehr kleiner Teil (unter 1%) ist X-gebunden oder mitochondrial (Abb. 3.1)
3.2 Evolution des Hörens
Bereits paläozoische Amnionten (Landwirbeltiere) verfügten über ein „modernes“
Gehör, in seiner Leistung etwa dem einer heutigen Eidechse vergleichbar. Damit war
tympanisches Hören seit mindestens 260 Millionen Jahren möglich (Müller und Tsuji,
2007; Schnupp und Carr, 2009). Allerdings sind Paukenhöhlen mit einem oder
mehreren Knöchelchen unabhängig voneinander (synapomorph) in vielen und zum
größten Teil ausgestorbenen (Land-) Wirbeltierlinien entstanden (Manley, 2009). Das
Säugerohr oder besser, das Hörvermögen der Säuger, hat eine Ausnahmestellung
im Tierreich. In den letzten 140 Millionen Jahren kamen eine Reihe an Apomorphien
hinzu, die das Säuger-Hören spezifisch gemacht haben: (1) die Verlängerung des
Corti-Organs, (2) eine (beim Menschen 2,5-fach) gewundene Cochlea, (3) fast
geschlossene Mittelohrhöhlen, (4) verbessertes Hochfrequenzhören weit über
10kHz, (5) bewegliche Ohrmuscheln (nicht beim Menschen) und (6) hochentwickelte
Hirnstrukturen welche die Schall-Lokalisierung durch binaurale, neuronale Reize
ermöglichen (Manley, 2009). Die Hörleistungen der Primaten bewegen sich an der
unteren Grenze (Low Frequency Limit, LFL) bei 0,028kHz [Macaca fuscata
(Schneeaffe)] und an der oberen Grenze (High Frequency Limit, HFL) bei 65kHz
[Galago senegalensis (Bushbaby)]. Der Mensch liegt mit einer HFL von 17,6kHz
knapp 2 Oktaven unter der HFL des Bushbabys. Im Vergleich zum Schimpansen hört
der Mensch am besten bei 4kHz (Schimpanse: 8kHz) und hat von allen Primaten mit
einem Wert von -10dB die höchste Hör-Sensitivität (Heffner et al., 2004). Offenbar ist
die humanspezifische Konstruktion des Hörapparates darauf abgestimmt, im
Frequenzbereich zwischen 2 und 4 kHz mit einer relativ hohen Sensitivität zu
arbeiten. Genau dieser Bereich enthält auch die akustisch relevante Information der
gesprochenen Sprache. Der nächste lebende Verwandte des Menschen, der
Schimpanse, zeigt in Audiogrammen eine W-artige Verteilung der höchsten
Sensitivität in den Frequenzbereichen um 1 kHz und 8 kHz während für die
humantypischen Bereiche (2 und 4 kHz) die Sensitivität reduziert ist (Martinez et al.,
14
Einleitung
2004).
Der
Schimpanse
zeigt
ebenfalls
eine
Adaption
der
hör-sensitiven
Frequenzbereiche an die Vokalisierung: die für diese Art typischen Rufe („pant
hoots“)
werden
bei
etwa
1
kHz
abgegeben
(Riede
et
al.,
2004).
Die
humanspezifische Adaption scheint evolutionär früh in der Hominidenfamilie
aufgetreten zu sein. Untersuchungen an ca. 350.000 Jahre altem, fossilem
Fundmaterial des Homo heidelbergensis zeigen, dass dieser eine dem heutigen
Menschen vergleichbare Hör-Sensitivität besessen haben muss (Martinez et al.,
2004). Homo heidelbergensis ist allerdings nach heutigem Kenntnisstand kein
direkter
Vorfahre
des
rezenten
Menschen
sondern
des
Homo
sapiens
neanderthalensis. Damit kann die Adaption des Gehörs in der Linie zum Homo
sapiens sapiens auf ca. 500.000 Jahre bis zu Homo antecessor, als letztem
gemeinsamen Vorfahr der beiden Linien, zurückdatiert werden (Wood und
Richmond, 2000). Das frühe Auftauchen der humanspezifischen Adaptionen des
Gehörs ist auch auf genomischer Ebene zu beobachten. Sequenzanalysen von
homologen Gen-Trios von Mensch, Schimpanse und Maus zeigen eine positive
Selektion beim Menschen für bestimmte „Hör“-Gene: TECTA, DIAPH1, FOXI1,
EYA4, EYA1 und OTOR (Clark et al., 2003), allerdings müssen diese Arbeiten
aufgrund der seitdem gewonnenen Erkenntnisse kritisch gesehen und überabeitet
werden (Ellegren et al., 2008).
3.3 Hören und Hörstörungen
Das Hörorgan und das Gleichgewichtsorgan bilden das innere Ohr. Beide liegen in
enger Nachbarschaft im Felsenbein und haben die gleiche evolutionsiologische
herkunft (Schmidt und Thews, 1993). Im vorliegenden Text soll ausschließlich auf die
Hörfunktion eingegangen werden, da Gleichgewicht und Gleichgewichtsstörungen
nicht Gegenstand dieser Arbeit waren.
3.3.1 Anatomie und Physiologie des Hörens
Körpergewebe sind ungefähr 1000-mal dichter als Luft. Damit würden 99,99% aller
durch die Luft übertragenen Geräusche reflektiert werden und so einer akustischen
15
Einleitung
Sinneswahrnehmung entzogen sein. Das menschliche Ohr ist ein Sinnesorgan,
welches akustischen Druck durch Vibrationen einer kleinmassigen Membran
aufzeichnet und über ein komplexes System an entsprechende Rezeptoren
weiterleitet. Diese Information wird anschließend im Gehirn dekodiert und so
erfahrbar gemacht (Mallo, 2001). Schallwellen werden über Außen- und Mittelohr zur
Hörschnecke des Innenohres transportiert. Dort erreicht die Amplitude, je nach
Frequenz, an einem bestimmten Abschnitt der Hörschnecke ihr Maximum. Die
dadurch verursachten mechanischen Bewegungen an der Basilarmembran werden
durch die äußeren Haarzellen verstärkt (Hudspeth et al., 2008) und durch die inneren
Haarzellen als Impuls an den Hörnerven weitergegeben. Schädigungen oder
Pathologien am auditiven System können, wenn sie das Außen- oder Mittelohr
betreffen,
zur
Schalleitungsschwerhörigkeit
führen,
im
Innenohr
zur
Schallempfindungsschwerhörigkeit (auch: sensorineurale Schwerhörigkeit). Der
Hörnerv leitet die Erregung über den Metathalamus in das Großhirn. Im Großhirn
werden die Signale in Hörerfahrungen, wie zum Beispiel Frequenzhören und
Richtungshören, umgewandelt (Thews et al., 2007).
Das Außenohr
Funktionell wie anatomisch wird das menschliche Ohr in drei Kompartimente
unterteilt: das Außenohr, das Mittel- und das Innenohr. Das Außenohr, bestehend
aus Ohrmuschel (Auricula auris), Ohrläppchen (Lobulus auriculae) und den äußeren
Gehörgang (Meatus acusticus externus) leitet Schall aus der Umwelt zum
Trommelfell (Membrana tympani), welches die Grenze zwischen Außen- und
Mittelohr darstellt. Dieser Prozess ist stark richtungsabhängig, beeinflusst durch die
Form der Ohrmuschel und des äußeren Gehörganges. Die spezifische Form des
Außenohres bildet ein Resonanzsystem durch welches, nach entsprechender
Prozessierung
entstehender
Minima
und
Maxima
im
Frequenzspektrum,
richtungsabhängiges Hören möglich wird. Entwicklungsbiologisch entsteht das
Außenohr aus sechs mit Ektoderm überzogenen, mesenchymalen Höckern. Die
Hälfte der Höcker entstammen dem zweiten Kiemenbogen. Die Verschmelzungen
um die erste Kiemenfurche bilden die Ohrmuscheln. Die Einsenkung der
Kiemenfurche bildet äußeren Gehörgang und äußeren Anteil des Gehörganges
(Schmidt undThews, 1993; Schmidt et al., 2005; Thews et al., 2007; Gillet et al.
2008). Normalerweise wird der Schall über das Außenohr zum Mittelohr geleitet, ein
16
Einleitung
Vorgang der als Luftleitung bezeichnet wird. Die Luftleitung kann aber auch
umgangen bzw. ergänzt werden, wenn der Schall direkt über die Knochen zum
Innenohr übertragen wird. Diese so genannte Knochenleitung verläuft vom
Unterkiefer zum
äußeren Gehörgang und ist einerseits nur mit einer höheren
Reizstärke aktivierbar, kann aber andererseits bestimmte Frequenzen selektiv
verstärken ( Thews et al., 2007). Wir nehmen daher eine Tonbandaufzeichnung
unserer eigenen Sprache als fremdartig und ungewohnt wahr, denn diese setzt sich
auf dem Tonträger nur aus luftübertragenen Frequenzen, im eigenen Gehör aber aus
luft- und knochenübertragenen Frequenzen zusammen (Pritzel et al., 2009).
Das Mittelohr
Das Mittelohr (Auris media) besteht aus Trommelfell, (luftgefüllter) Paukenhöhle
(Cavum tympani), den Gehörknöchelchen (Ossicula auditus) Hammer (Malleus),
Amboss
(Incus)
und
(Trommelfellspanner,
Steigbügel
Musculus
(Stapes)
tensor
sowie
tympani;
der
Mittelohrmuskulatur
Steigbügelmuskel,
Musculus
stapedius). Im Mittelohr werden die vom Trommelfell auf die Gehörknöchelchen
übertragenen Schwingungen auf das Innenohr übertragen ( Thews et al., 2007). Die
Mittelohrmuskulatur kann durch Kontraktion die Lage der Gehörknöchelchen und des
Trommelfells beeinflussen und so die Schallübertragung steuern. Dies dient unter
anderem auch dem Schutz des Innenohrs vor schädigender Lautstärke. Allerdings
sind dieser Schutzfunktion Grenzen gesetzt, da die Muskulatur mit einer zeitlichen
Verzögerung arbeitet. Im Falle eines plötzlich auftretenden Schallereignisses kann
daher das Gehör irreparabel geschädigt werden, man spricht von einem
„Knalltrauma“ ( Thews et al., 2007). Auswirkungen bestimmter Noxen auf das Gehör
können übrigens auch im Computermodell recht erfolgreich simuliert und deren
Folgen abgeschätzt werden (Gan et al., 2004). Die Hörschwelle, also die Grenze
dessen was noch als Ton oder Geräusch wahrgenommen werden kann, liegt dabei
bei einer Frequenz von ~1000Hz (Schmidt und Thews, 2007). Die Amplitude der
dadurch entstehenden Trommelfell-Schwingungen liegt unterhalb des Durchmessers
eines Wasserstoffatoms und unterhalb der Wellenlänge des sichtbaren Lichts.
Außerdem
findet
im
Innenohr
eine
Impedanzanpassung
statt,
um
den
Reflexionsverlust der durch den Medienübergang (gasförmig/flüssig) an der Grenze
vom Mittelohr zum Innenohr bedingt ist, abzufedern. Durch die Erhöhung des Drucks
am ovalen Fenster des Innenohres um das 22-fache, im Vergleich zum Druck am
17
Einleitung
Trommelfell, werden nur ca. 40% anstatt 98% der Schallwellen reflektiert (ZervosKopp, 2007). Ein großer Teil der physiologischen und vor allem der molekularen
Erkenntnisse über die Funktionen des menschlichen Hörens konnte durch
systematische Untersuchungen von Pathologien, im wesentlichen von Hörstörungen,
generiert
werden.
klassifizieren:
Hörstörungen
(1)
die
lassen
sich
in
drei
verschiedene
Schallleitungsschwerhörigkeit,
Typen
(2)
die
Schallempfindungsschwerhörigkeit und (3) die Schallwahrnehmungsschwerhörigkeit.
Während erstere ein Problem des Außen- und Mittelohres und letztere ein Problem
der
Reizverarbeitung
im
Gehirn
darstellt,
betrifft
die
Schallempfindungsschwerhörigkeit, auch sensorineurale Schwerhörigkeit genannt,
vor allem das Innenohr (Auris interna). Da die meisten angeborenen, nichtsyndromalen Hörstörungen mit genetischer Ursache Funktionen vor allem des
Innenohrs, betreffen, soll an dieser Stelle dessen Anatomie und Arbeitsweise
ausführlicher dargestellt werden.
Das Innenohr
Das Innenohr befindet sich in einem Hohlraum des Felsenbeins (ossis temporalis
pars petrosa) welches zu den härtesten Knochen des menschlichen Körpers gehört.
Die Robustizität des Felsenbeins und gleichsam die geschützte Lage im inneren des
Schädels zeigt sich eindrucksvoll in der Tatsache, dass bei anthropologischen
Untersuchungen an Leichenbränden das Felsenbein oftmals bei ca. 60-90% aller
Brandgräber als einzig diagnostisch verwertbares Material übrigbleibt (WiltschkeSchrotta, 2003; Wahl, 1981). Die Diagnostik beschränkt sich dabei zumeist auf die,
recht
zuverlässige,
Geschlechtsbestimmung;
unter
Zuhilfenahme
von
5
Diskriminanzpunkten werden über 90% Trennung (männlich/weiblich) erreicht (Wahl,
1981). Das Innenohr besteht aus zwei Teilen dem (1) Gleichgewichtsorgan (Organon
vestibulare), welches nicht in den Hörprozess involviert ist und (2) der Schnecke
(Cochlea). Beide befinden sich im knöchernen Labyrinth (Labyrinthus osseus) des
Felsenbeins.
In
der
Cochlea
werden
mechanische
Schwingungen
zu
Nervenimpulsen umgewandelt. Die Cochlea ist (Name) schneckenförmig, hat 2,5
Windungen und würde aufgewickelt etwa 30mm lang sein. Der Durchmesser der
Cochlea verjüngt sich von anfangs 0,9 auf 0,3mm am Ende; sie enthält drei Röhren,
umgeben von einer Knochenhülle: Scala vestibuli, Scala media und Scala tympani.
Im Gegensatz zum luftgefüllten Außen- und Mittelohr ist die Cochlea mit Flüssigkeit
18
Einleitung
gefüllt. Dabei können drei verschiedene extrazelluläre Flüssigkeiten unterschieden
werden: (1) Endolymphe, die einen hohen K+ und HCO3--Gehalt und einen niedrigen
Na+-und Ca+-Gehalt aufweist, (2) Perilymphe die in ihrer Zusammensetzung, bis auf
einen niedrigen Proteingehalt, dem Plasma ähnelt und (3) intrastriale Flüssigkeit. Die
Scala media ist gefüllt mit Endolymphe und durch die Reissnersche Membran von
der Scala vestibuli getrennt. Scala vestibuli und Scala tympani sind mit Perilymphe
gefüllt; letztere ist von der Scala media durch die Basilarmembran getrennt (Schmidt
et al., 2005; Thews et al., 2007). Die kleinen extrazellulären Räume innerhalb der
Stria vascularis, einem mit Kapillaren durchsetzten, streifenförmigen Organ an der
Außenwand der Cochlea, sind mit intrastrialer Flüssigkeit gefüllt (Wangemann et al.,
2006). Die Stria vascularis besteht aus drei Schichten, den Marginal-, den
Intermediär- und den Basalzellen. An der Basilarmembran, Scala media-seitig,
befindet sich das Corti-Organ (Organon spirale ) welches die eigentliche
Transformation mechanischer in neuronale Impulse leistet. Vom basalen zum
apicalen Ende hin werden die mechanischen Eigenschaften der Basilarmembran
durch Änderung der Steifigkeit und der Breite modifiziert. Das ermöglicht eine
tonotopische Reizverteilung entsprechend des jeweiligen Impulses, das heißt jede
Frequenz hat ein ortsspezifisches Amplitudenmaximum (Abb. 3.2). Daraus folgend
werden die hohen Frequenzbereiche an der Basis und die tiefen Frequenzen am
apikalen Ende der Cochlea transduziert (Raphael und Altshuler, 2003). Die
Basilarmembran besteht aus Matrix- und Fasermaterial (Kollagen Typen II, IV und
VI). Aus diesem Grund können sich Erkrankungen mit Kollagenmutationen, wie dem
Alport Syndrom, ebenfalls in Hörstörungen niederschlagen (Alves et al., 2005). Die
Transformation von Schallwellen zu neuronalen Impulsen in der Cochlea ist ein
hochkomplexer und noch nicht bis ins letzte Detail verstandener Prozess. Von allen
Organen
des
Körpers
generiert
die
Cochlea
das
größte
transepitheliale
Spannungspotential, endocochläres Potential genannt, welches dazu dient die
mechanotransduktive Funktion der Haarzellen zu ermöglichen und zu erhalten
(Thews et al., 2007). Nach der Schallreizverarbeitung durch Außen-, Mittel- und
Innenohr muss das nunmehr neuronale Signal über die Hörbahn zum Gehirn
weitergeleitet werden. Dabei bildet das Muster der neuronalen Erregung die
physikalischen Eigenschaften des Schallsignales ab. Im Gehirn werden diese
anschließend zu einer akustischen Wahrnehmung verarbeitet. Die Weiterleitung der
neuronalen Information geschieht über den Hörnerven (Nervus acusticus),
19
Einleitung
Abb. 3.2 Tonotopische Reizverteilung. Frequenzspezifische Amplitudenmaxima entlang der
aufgerollten Cochlea. Tiefe Töne (25Hz) werden am apikalen Ende, hohe Töne (1600Hz) am
basilaren Ende abgebildet. Aus: NCBI Bookshelf » Neuroscience » Sensation and Sensory
Processing » The Auditory System » The Inner Ear.
der zusammen mit dem Gleichgewichtsnerven (Nervus vestibularis) den achten
Hirnnerven (Nervus vestibulocochlearis) bildet. Die Fortsätze des N. acusticus
beginnen an den Haarzellen des Corti-Organs, die Zellkörper befinden sich im
Ganglion spirale innerhalb der Cochlea. Die Axone verbinden sich dann im
Hörnerven und enden im verlängerten Mark (Medulla oblongata) in den beiden
Hörkernen (Nucleus Cochlearis ventralis, Nucleus Cochlearis dorsalis) des
Nachhirns (Myelencephalon). Nach dem Durchlaufen der Hirnareale gelangt der
neuronale Reiz zur Weiterprozessierung in den auditiven Cortex im Temporallappen
des Großhirns (Schmidt und Thews, 2004). Auf diese Prozesse soll an dieser Stelle
nicht näher eingegangen werden, da Patienten mit entsprechenden Störungen nicht
Gegenstand unserer Untersuchungen waren.
3.3.2 Genetik des (Innenohr-) Hörens
Die Basis für eine funktionierende Signaltransduktion in der Cochlea ist eine
entsprechende Flüssigkeitshomöostase und das endocochleäre Potential. Letzteres,
überwiegend ein K+-Gleichgewichtspotential, wird als die treibende Kraft der
20
Einleitung
Signaltransduktion bezeichnet und durch die Stria vascularis generiert. Diese stellt
die metabolische (energetische) Versorgung mit Sauerstoff, Glukose und dem
Abtransport von CO2 sicher, unter Zuhilfenahme einer hohen Kapillarisierung
(Wangemann
et
al.,
2006).
Konsequenterweise
führt
eine
Reduktion
der
Blutversorgung, wie sie zum Beispiel bei Alternsprozessen oder chronischer LärmExposition beobachtet werden kann, zur Einschränkung der Sensitivität der
Hörleistung (Raphael und Altschuler, 2003). An der Generierung des endocochleären
Potentials in der Stria vascularis ist eine komplexe Architektur von Gewebeschichten
und Ionenkanälen maßgeblich beteiligt. Die für den Humangenetiker bedeutendsten
Untereinheiten sind die Ionenkanal-Proteine „Gap Junction Protein, beta 2“ und „Gap
Junction Protein, beta 6“, auch Connexin 26 und 30 genannt, welche durch die Gene
GJB2 und GJB6 kodiert werden (Del Castillo et al., 2002; Schrijver, 2004; Petersen
und Willems, 2006). GJB2 als Hörstörungsgen oder zumindest der chromosomale
Locus auf 13q war bereits vergleichsweise früh identifiziert (Guildford et al., 1994;
Kelsell et al., 1997). Mutationen in GJB2 werden für etwa die Hälfte der nichtsyndromalen genetisch bedingten Hörstörungen verantwortlich gemacht (Zelante et
al., 1997; Denoyelle,1998). Der Begriff „Mutation“ wird in der biologischen Genetik
und der medizinischen Genetik nicht immer synonym verwendet. Während erstere
eine Mutation hypothesen- und wertfrei nur als eine Veränderung der DNA- Sequenz
sieht, wird mit einer Mutation in der medizinischen Genetik häufig ein pathologischer
Phänotyp assoziiert. In dieser Arbeit wird der Begriff „Mutation“ im medizinischen
Sinn verwendet, d.h. als pathologische Indikation verstanden. Die meisten
syndromalen, genetisch bedingten Hörstörungen werden durch Mutationen des
SLC26A4-Gens verursacht (Kopp et al., 2008). Dieses Gen kodiert Pendrin, ein
Protein das negativ geladene Ionen transportiert (z.B. Cl-, HCO3-) und dessen
uneingeschränkte Funktion für den Erhalt der Homöostase (pH-Wert) in der Cochlea
unerlässlich ist (Wangemann et al., 2006; Genetic Home Reference, NIH,
http://ghr.nlm.nih.gov/gene=slc26a4). Weitere Gene die in der Stria vascularis
exprimiert werden und die durch Mutationen Hörstörungen verursachen können sind:
ATP6B, BSND, CLCNKA, CLCNKB, EDN3, EDNRB, KCNE1, KCNQ1, MITF,
MYH14, TFCP2L3 und TMPRSS (Abb. 3.3). Das Corti-Organ ist das sensorineurale
Endorgan des Hörvorganges, ab hier findet die Weiterleitung neuronaler Impulse
durch den akustischen (achten) Nerv und deren Verarbeitung in bestimmten Nuclei
des zentralen auditorischen Systems und anschließend in der Hörrinde des
21
Einleitung
Großhirns (auditiver Cortex) statt (Willems, 2000). Wie oben erwähnt, ist das CortiOrgan für die eigentliche Transduktion mechanischer in neuronale Reize zuständig.
Abb.3.3 Expression von Hörstörungsgenen im Innenohr. Gezeigt sind Hörstörungsgene und die
Lokalisation deren Genprodukte in Außen-, Mittel- und Innenohr mit Cochlea-Querschnitt und
Haarzellen (Abbildung aus: Morton und Nance, 2006).
Es befindet sich zwischen Tektorial- und Basilarmembran, wird gestützt durch
Deiters-, Hensen- und Claudiuszellen (Unterstützerzellen) und beherbergt die
22
Einleitung
eigentlichen Hörzellen, die Haarzellen (Pschyrembel, 1986; Raphael und Altshuler,
2003; Thews et al., 2007). Eine Besonderheit des Corti-Organs ist die für
Epithelzellen unübliche Abwesenheit undifferenzierter Zellen, ein Umstand der erklärt
warum zerstörte Haarzellen nicht ersetzt werden können (Raphael und Altshuler,
2003). Die Haarzellen, so genannt wegen der apikalständigen Stereozilien, sind
unterteilt in äußere Haarzellen (~12.000 Zellen in 3 Reihen) und innere Haarzellen
(~3500 in 1 Reihe) (Speckmann et al., 2008).
Der apikale Teil der Zelle mit den ca. 80-100 Stereozilien befindet sich in der
Endolymphe der Scala media, die eine hohe Kalium- und eine geringe
Natriumionenkonzentration aufweist. Der basale Teil der Haarzelle befindet sich in
der Perilymphe bei der dieses Ionenverhältnis umgekehrt ist. Die linear
angeordneten inneren Haarzellen gelten als die eigentlichen sensorischen Zellen,
während die U-förmig angeordneten äußeren Haarzellendie qualitative und
quantitative Leistung der Cochlea durch Erhöhung der Selektivität respektive der
Sensitivität, verstärken. Das Zilienbündel besteht aus einer Kinozilie die sich nach
der Geburt wieder zurückbildet und aus etwa 60-80, durch „Tip links“ an den Spitzen
verbundene (engl.: tips=Spitzen, to link=verbinden) und aus Aktinfilamenten
bestehende Stereozilien (Schmidt und Thews, 1993). Tip links sind assymmetrische
Filamente, die überwiegend aus 2 Proteinen der Cadherin-Familie gebildet werden,
CDH23 und PCDH15. Mutationen der entsprechenden kodierenden Gene (CDH23,
PCDH15) werden mit erblichen Hörstörungen und speziell mit dem Usher-Syndrom
assoziiert (Sakaguchi et al., 2009). Die Anordnung der Stereozilien ist treppenförmig.
Erreicht eine Amplitude auf der Basilarmembran ihr Maximum, entsteht eine
Relativbewegung zwischen Basilar- und Tektorialmembran. Die so entstehende
Abscherbewegung stimuliert die äußeren Haarzellen und diese verstärken durch
„Vibrationen“ die Signalintensität um den Faktor 1000. Diese Verstärkung wiederum
führt zur Stimulierung der inneren Haarzellen, leise Töne werden dadurch erst hörbar
(Raphael und Altshuler, 2003; Thews et al., 2007). Durch die Bewegung der
Stereozilien und damit der Tip links, kommt es zur Öffnung von Ka+-Ionenkanälen
und zur Depolarisation der Haarzelle welche zur Aktivierung spannungsgesteuerter
Calcium-Kanäle und zur Freisetzung von Neurotransmittern an der Zellbasis führt
(Gillespie et al., 2009).
Die Signaltransduktion durch die Haarzellen des Corti Organs wird an dieser Stelle
noch etwas eingehender dargestellt, da eine große Anzahl bekannter syndromaler
23
Einleitung
und nichtsyndromaler Hörstörungsgene in diesen hochkomplexen Vorgang involviert
sind. Um die Signalamplifikation durch die äußeren Haarzellen zu gewährleisten,
wird deren Länge aktiv verändert und so die Schwingung der Basilarmembran
verstärkt. Diese Längenänderung wird durch das Motor-Protein Prestin, welches
durch
das
Gen
PRES
kodiert
wird,
bewirkt.
Prestin
ist
das
einzige
spannungsabhängige Protein dass zur Solute Like Carrier Familie 26 (SLC26)
gehört. Durch einwertige Anionen (z.B. Cl-) die bei einer Depolarisierung transloziert
werden, wird die Proteinkonformation in lang oder kurz verändert. Dieser Vorgang
geschieht ohne ATP-Verbrauch (Dallos et al., 2002, 2006, 2008). Mutationen des
PRES-Gens, vor allem der Isoform SLC26A5a können zu nicht- syndromalen
Hörstörungen führen (Liu et al., 2003). Klinisch bedeutender sind Beeinträchtigungen
der Formation und Länge der Haarzellen. Die U-förmige und treppenartige
Ausrichtung der Haarzellen wird durch Mutationen zweier Myosin-Gene (MYO6 und
MYO7a) und eines Cadherin-verwandten Gens (CDH23) verändert, so dass
Hörstörungen die Folge sind. Für die Matrix der Haarspitzen scheint ebenfalls ein
Myosin von hoher Bedeutung zu sein, MYO15. Bei (tauben) Myo15 KnockoutMäusen sind die Haarzellen sehr gedrungen, ohne intakte Spitze und ohne
erkennbare U-Form des Bündels. Ein weiteres „Spitzenprotein“ ist Whirlin das bei
Knockout-Mäusen einen ähnlichen Phänotyp zeigt, allerdings, im Gegensatz zu
Myo15, die U-Form des Haarbündels beibehält. Die Mausmodelle bei diesen
Versuchen zeigen oft auffällige Bewegungsmuster da auch die Haarzellen des
Vestibularorgans betroffen sind (Steel und Bock, 1980). Die Namensgebung der
Tiermodelle versucht diesem Umstand Rechnung zu tragen, so heißen zum Beispiel
die Myo15- und Whrn-Kockout-Mäuse Shaker2 (engl.: to shake – schüttlen)
respektive Whirler-Mäuse (engl.: to whirl – wirbeln, sich drehen) (Frolenkov et al.,
2004). Die Aufrechterhaltung der Haarzellen in spezifisch geformten Bündeln wird
unter anderem auch durch Verbindungen der einzelnen Stereozilien untereinander,
durch „Links“ bewerkstelligt. Dabei sind die oben erwähnten Tip Links, welche die
Spitzen verbinden, nicht die einzigen Verbindungen dieser Art sondern es sind
insgesamt
5
verschiedene
Verbindungstypen
bekannt:
horizontale
Kopfendenverbindungen (horizontal top connectors), Spitzenverbindungen (Tip
links), Kinoziliäre Verbindungen (Kinocilial links), Schaftverbindungen (Shaft
Connectors) und Verbindungen an der Stereozilien-Basis (Ankle Links). Mit diesen 5
verschiedenen Verbindungstypen wurden bislang 5 Oberflächenproteine assoziiert:
24
Einleitung
Cadherin 23 (Gen: CDH23) mit Tip Links, Kinocilial Links und Lateral Links,
Protocadherin 15 (Gen: PCDH15) mit Tip und Kinocilial Links, Protein Tyrosin
Phosphatase Rezeptor Q (Gen: PTPRQ) mit Schaftverbindungen, Very Large GProtein Coupled Receptor 1 (Gen: VLGR1) und Usherin (Gen: USH2A) mit Basis
Verbindungen (Eudy et al., 1998; Nayak et al., 2007). Einige der genannten Proteine
gehören zum Usher-Netzwerk, von welchem bisher 10 Proteine bekannt sind und
diese wiederum wahrscheinlichste Kandidaten-Komponenten der Haarspitzen/Mechanotransduktions-Maschinerie sind (Bolz, 2009; Sakagutchi et al., 2009). Das
Usher-Syndrom geht einher mit visueller und auditiver Beeinträchtigung, genauer, mit
angeborener Taubheit und Retinitis Pigmentosa, letztere eine entzündliche
Netzhautdegeneration bei der die Photorezeptoren zerstört werden (Kremer et al.,
2006). Unter etwa 50 bekannten Syndromen die zur Beeinträchtigung von Hör- und
Sehvermögen führen, ist das Usher Syndrom mit etwa 50% aller Patienten das
Häufigste. Es hat eine Prävalenz von ungefähr 3-6 Fällen auf 100.000 Geburten und
wird in drei Subtypen USH1, USH2 und USH3, je nach Schweregrad und
Progression, unterteilt (Saihan et al., 2009). Mutationen an 11 Loci und 10 Genen
können das Usher-Syndrom auslösen, 5 der 10 Usher-Gene können durch
Mutationen auch nicht-syndromale Hörstörungen verursachen. Dabei scheint vor
allem entscheidend zu sein welcher Art die Mutation ist. Für einige der 5 Usher/nicht-syndromale Hörstörungs-Gene wurde beobachtet, das eine Trunkation
(Abbruch) des Proteins, durch Verlust der genetischen Information, syndromale,
Nukleotidaustausche hingegen nicht-syndromale Hörstörungen verursachen. Die
vollständige bis dato bekannte Liste der Gene des Usher-Netzwerkes umfasst:
MYO7A, USH1C (Harmonin), CDH23, USH1E, PCDH15, USH1G (SANS), USH2A,
VLGR1, WHRN (Whirlin) und USH3A. 5 Gene dieses Netzwerkes sind für
funktionelle Aufgaben bei der Stereozilien-Morphogenese bekannt: CDH23, WHRN,
PCDH15, USH1C und MYO7A (Saihan et al., 2009; Williams, 2008).
Nach der Cochlea erreicht der Hörnerv das Stammhirn wo er sich in drei
Abzweigungen teilt und die drei Abteilungen des cochleären Nukleus innerviert.
Innerhalb des cochleären Nukleus unterteilt sich jede der drei Abzweigungen des
Hörnerven in einen aufsteigenden Ast zum anteroventralen cochleären Nukleus und
einen absteigenden Ast zum posteroventralen und dorsalen cochleären Nukleus. Bis
auf
einige
wenige
Nervenfasern
zieht
dann
die
Masse
der
ipsilateralen
25
Einleitung
(gleichseitigen) Axone des cochleären Nukleus zur kontralateralen (gegenseitigen)
Hälfte des Gehirns. Das bedeutet, dass der Großteil der Information von der jeweils
anderen Seite verarbeitet wird, was im Kontrast zum visuellen System steht, wo die
Ganglien auf der gleichen Hirnseite bleiben. Außerdem ermögliche die regelmäßigen
Umschaltungen innerhalb der Hörbahn das Richtungshören. Die Fasern von den
cochleären Nuclei werden im Bereich des Hirnstammes als oberer Olivenkomplex
bezeichnet. Der obere Olivenkomplex empfängt damit als erstes Hirnareal
Informationen von beiden Ohren. Die aufsteigenden Signale werden dann weiter vom
oberen Olivenkomplex über die seitliche Schleifenbahn (Lemniscus lateralis) zum
unteren Hügel (Colliculus inferior) geleitet. Im Nukleus der lateralen Schleifenbahn
werden
wiederum
einige
Signale
umgeschaltet.
Anschließend
werden
die
aufsteigenden Signale nach einer letzten Verschaltung im mittleren, zum
Metathalamus gehörigen Kniehöcker (Corpus geniculatum mediale) in den auditiven
Cortex im Temporallappen des Großhirns geleitet. Der auditive Cortex ist in drei
auditive Gebiete unterteilt (primär, sekundär, tertiär), deren erste dem BrodmannAreal 41 und zweite den Arealen 22 und 42 entsprechen. Das primäre auditive
Gebiet ist analog zur Cochlea tonotopisch aufgebaut und gewährleistet das
Frequenzhören. Die sekundären und tertiären Gebiete zeigen eine wesentlich
weniger stringente Tonotopie und prozessieren eher komplexe Klangmuster, wie
zum Beispiel die menschliche Sprache. Das sensorische Sprachzentrum (WernickeZentrum) im menschlichen Gehirn grenzt direkt an die sekundäre Hörrinde an und
zählt ebenfalls zum Brodmann Areal 22. Eine weitere wichtige Hörfunktion, das
Richtungshören, funktioniert über die Zeitunterschiede die ein Hörreiz braucht um
das distal bzw. proximal zur Reizquelle gelegene Ohr zu erreichen. Dieser
Unterschied beträgt, je nach Position, etwa 6 x 10-3 Sek. (Schmidt und Thews, 2005;
Bear et al., 2008).
3.4 Molekularbiologische Diagnostik
Hören basiert im Grunde auf zwei funktionalen Entitäten, einer mechanischen und
einer elektrochemischen. Die Verschiedenheit von Hörstörungen, die mit dem einen
oder dem anderen Prozess verknüpft sind, werden klinisch üblicherweise ebenfalls in
zwei Kategorien unterschieden, die Schallleitungsschwerhörigkeit (mechanisch) und
26
Einleitung
die
Schallempfindungs-
oder
auch
sensorineurale
Schwerhörigkeit
(elektro-
chemisch). Schalleitungsschwerhörigkeit ist meist auf das Mittelohr fokussiert und
wird in der Regel mit technischen und pharmazeutischen Standardapplikationen
diagnostiziert und klinisch versorgt. Angeborene, überwiegend das Innenohr
betreffende sensorineurale Hörstörungen resultieren in fast der Hälfte aller Fälle aus
genetischen Ursachen und werden üblicherweise in syndromale und nichtsyndromale Hörstörungen unterteilt (Kochhar et al., 2007).
Tab. 3.1 Überblick Hörstörungsgene. Aufgelistet sind alle bis 2009 bekannten insgesamt 46 nichtsyndromalen
Hörstörungsgene
(Hilgert
et
al.,
2009;
Hereditary
hearing
loss
homepage,
http://webhost.ua.ac.be/hhh/, 2008).
Genetische Loci und Gene erblicher nicht-syndromaler Hörstörungen werden
unterteilt in autosomal dominant (DFNA), autosomal rezessiv (DFNB), X-gebunden
(DFN), Y-gebunden (DFNY, bisher noch keine Gene/Loci identifiziert), Modifier Loci
27
Einleitung
(DFNM; nicht kausal, sondern wirken als Verstärker) und Loci für Auditorische
Neuropathie (AUNA). Auf molekularer Ebene existiert mittlerweile ein umfassendes
Grundverständnis der Funktionen des Innenohrs. In diesem Zusammenhang wurden
bereits mehr als 100 Gene und genetische Loci ursächlich mit sensorineuralen
Hörstörungen assoziiert, davon 46 (Tab. 3.1) Gene mit nicht-syndromalen
Hörstörungen, von denen einige Eingang in die klinische Diagnostik gefunden haben
(Eisen et al., 2007). Die überaus große Bedeutung rechtzeitiger erzieherischer und
therapeutischer Intervention in die Entwicklung, vor allem der Sprachfähigkeit
hörgestörter Kinder, zeigt klar den Stellenwert genetischer Diagnostik (Matsunaga,
2009). Obwohl hier, der Fragestellung dieser Arbeit entsprechend, nur die Diagnostik
nicht-syndromaler Hörstörungen beleuchtet wird, sollen der Vollständigkeit halber die
wesentlichen
syndromalen
Ursachen
von
Hörstörungen
genannt
werden.
Syndromische Erkrankungen verursachen bis zu 30% prälingualer Hörstörungen. Die
häufigsten Syndrome sind, entsprechend ihrerPrävalenz, das autosomal dominante
Waardenburg-, Branchio-Oto-Renal- (BOR) und Stickler-Syndrom, sowie die
Neurofibromatose Typ 2; die häufigsten autosomal rezessiven Syndrome sind
Pendred-, Usher-, Jervell und Lange-Nielsen- und Refsum- Syndrom und die
Biotinidase-Defizienz; von den X-gebundenen Syndromen haben nur das Alport- und
das Mohr-Tranebjaerg-Syndrom diagnostische Bedeutung (Kochhar et al., 2007). In
der Diagnostik nicht-syndromaler Hörstörungen, kommt das seit der ersten
bekannten
nicht-syndromalen
genetischen
Ursache
einer
Hörstörung,
der
mitochondrialen A1555G-Mutation (Prezant et al., 1993) gestiegene Wissen zum
Einsatz. Im Laufe hat sich herausgestellt, dass Hörstörungen genetisch extrem
heterogen sind (Abb.3.4). Die meisten Hörstörungs-Gene tragen daher nur einen
kleinen Teil zur Masse der Hörstörungspatienten bei, während Mutationen in GJB2,
POU3F4, SLC26A4 und OTOF über die Hälfte aller Fälle weltweit ausmachen. Für
die Eingrenzung der Suche nach genetischen Ursachen muss also im Vorfeld eine
möglichst umfassende und genaue klinische Untersuchung stehen (Kochhar et al.,
2007; Matsunaga, 2009). Dabei steht zuerst der Ausschluss nicht-genetischer
Ursachen, wie zum Beispiel geburtliche Komplikationen oder Infektionen und
anschließend der Ausschluss
syndromischer Erkrankungen im
Vordergrund
(Kubisch, 2005).
28
Einleitung
Abb.3.4 Verteilung genetisch bedingter Hörstörungen. Dargestellt sind die Jahresstatistiken der
Hereditary hearing loss homepage (http://webhost.ua.ac.be/hhh/)
Geeignete Richtlinien für die klinische Diagnostik und Interventionsstrategien finden
sich im „Position statement: principles and guidelines for early hearing detection and
intervention programs“-Papier des US-amerikanischen Joint Committee on Infant
Hearing (2007). Wenn auf Grund der Klinik eine genetische Ursache der Hörstörung
vermutet wird, so ist eine anschließende genetische Diagnostik indiziert. An dieser
Stelle muss einiges zu den Techniken der molekularen Diagnostik gesagt werden.
Die drei zurzeit vermutlich etabliertesten Techniken der Diagnostik sind die SangerSequenzierung, die Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) und
die
Array
Comparative
Genomic
Hybridization
(CGH).
Erstere
wird
zur
Sequenzanalyse der DNA eingesetzt und erkennt Veränderungen der Basenabfolge
und deren Homo-/Heterozygotie. Die beiden anderen Techniken werden der
molekularen Zytogenetik zugeschrieben und identifizieren im Falle der MLPA
hypothesenbasiert, also an bekannten Stellen, Insertionen und Deletionen. Die Array
CGH detektiert ebenfalls Insertionen, Deletionen und Copy number variations
(CNV’s), allerdings genomweit mit hoher Auflösung und hypothesenfrei. Diese
Techniken haben ältere Verfahren, wie zum Beispiel Restriktionsverdau-basierte
Analysen, weitgehend verdrängt. In naher Zukunft darf durch die Next GenerationSequenziertechnik
und
dem
damit
verbundenen
„1000-Dollar-Genom“
mit
einschneidenden Veränderungen in der molekularen Diagnostik, nicht nur von
29
Einleitung
Hörstörungen, gerechnet werden (Wolinsky, 2007; Hilgert et al. 2009). Bei einem
vermuteten
genetischen
Hintergrund
einer
Hörstörung
wird
in
der
Regel
opportunistisch nach drei Kriterien selektiert: (1) die Häufigkeit eines mutierten
Hörstörungsgens, z.B. im Falle von GJB2, (2) die Assoziation mit einer zuordenbaren
klinischen Eigenschaft, wie z.B. SLC26A4 und ein dilatierter Aquaeductus vestibuli
und (3) ein typisches Audioprofil, wie es bei WFS1 der Fall ist (Hilgert, 2009). Zuerst
wird in aller Regel das Connexin 26-kodierende Gen GJB2 getestet. Da allein für
GJB2 an die hundert verschiedener Mutationen bekannt sind (connexin and
deafness homepage), die meisten außer der Mutation del35G allerdings nur mit
geringer Häufigkeit, wird in der Regel der kodierende Bereich des kompletten Gens,
welches nur zwei 2 Exons aufweist, sequenziert. Wird beim Patienten der Wildtyp
gefunden oder liegt eine Mutation nur infach heterozygot vor, schließen sich
üblicherweise eine Untersuchung der Connexine GJB6 und GJB3 an (Matsunaga,
2009). Wegen ihres geringen Anteils an pathogenen Veränderungen (Hilgert et al.,
2009) sind die Untersuchung der Connexine GJB6 und GJB3 umstritten und
abhängig vom ethnischen Hintergrund der Betroffenen (Kunstmann et al., 2005).
Allerdings
waren
die
meisten
Untersuchungen
zur
Frequenz
pathogener
Veränderungen in GJB6 in der Regel nur auf Basenaustausche fokussiert und
weniger auf andere, putativ pathogene Mutationen wie Deletionen, Mutationen im
Promoterbereich oder anderem (Kunstmann et al., 2005; Gabriel et al., 2001). Bei
entsprechender klinischer Examination kann die Suchrichtung der Diagnostik weiter
eingegrenzt werden. Bei Veränderungen des Aquaeductus vestibuli (z.B. Dilatation)
oder einer Mondini- Dysplasie (angeborene Fehlbildung des Innenohres, bei der die
Cochlea nur 1,5 statt 2,5 Windungen aufweist) ist es zum Beispiel sinnvoll zuerst die
beiden, mit diesen Pathologien assoziierten Gene SLC26A4 und POU3F4 zu testen
(Kochhar et al., 2007). Das Fehlen von ABR-Antworten (ABR=Auditory Brainstem
Response: Reaktion des autitorischen Hirnstamms) bei Vorliegen von OAE
Antworten
(OAE=Otoacoustic
Emission:
otoakustische
Emissionen)
legt
ein
Screening des OTOF-Gens nah. Bei progressiven, spät einsetzenden Hörstörungen
zusammen mit Gleichgewichtsstörungen könnte eine Untersuchung des COCH-Gens
indiziert sein. Mutationen des Gens TECTA wiederum sind, ähnlich wie bei
Mutationen des WFS1-Gens, eng assoziiert mit bestimmten Audioprofilen der
Patienten (Cryns et al., 2003; Pfister et al., 2004; Hilgert et al., 2009). Von den
Mutationen der mütterlich vererbten mtDNA wird am häufigsten auf die Mutation
30
Einleitung
1555 A>G des 12S ribosomalen RNA-Gens getestet, dessen Häufigkeit bei
Hörstörungspatienten in etwa der von TECTA entspricht (Hilgert et al., 2009). Für
viele Patienten kann das Wissen um diese Mutation sehr wichtig sein, da
Aminoglykoside (Antibiotika) wie zum Beispiel Streptomycin bei 1555 A>G-Trägern
zu Hörstörungen führen kann (Kokotas et al., 2007). Zusammenfassend kann man
festhalten, dass nach einer aktuellen Untersuchung von Hilgert et al. (2009) die
weltweit am häufigsten diagnostizierten autosomal rezessiven Hörstörungsgene, in
der Reihenfolge ihrer Bedeutung, GJB2, SLC26A4, OTOF, CDH23 POU3F4 und
WFS1 sind. Untersuchungen anderer genetischer und epigenetischer Ursachen von
Hörstörungen, auch an Genen die bereits in der Routinediagnostik etabliert sind,
werden zurzeit noch auf Forschungsbasis betrieben.
Zur Epigenetik von nicht-syndromalen sensorineuralen Hörstörungen gibt es
bisher nur wenig bis gar keine publizierten Forschungsdaten. Die Epigenetik
(außerhalb der Genetik) beschreibt von Zelle zu Tochterzelle oder sogar von einer
Generation auf die nächste vererbbare Veränderungen der Genregulation, die nicht
auf Veränderungen der DNA-Sequenz basieren. Durch Umwelteinflüsse und
genetische Faktoren bedingte epigenetische Mutationen tauchen etwa 100-mal
häufiger auf als somatische DNA-Mutationen (Bennet-Baker et al., 2003; Goyal et al.,
2006) und sind dadurch per se interessant für die Hörstörungsdiagnostik. Die beiden
bislang als Hauptkomponenten erkannten Mechanismen der Epigenetik sind die
DNA-Methylierung und die Histon-Modifikation (Jaenisch et al., 2003; Horsthemke,
2006; Whitelaw und Whitelaw, 2008). Epigenetische Information wird nicht durch die
DNA selbst kodiert, sondern durch reversible Veränderungen der DNA und/oder der
Histone. Ein wichtiger Mechanismus ist dabei die DNA-Methylierung von CpGDinukleotiden, speziell sogenannter „CpG-Islands“. Dies sind Anhäufungen von CpGDinukleotiden in 500-2000 bp großen DNA-Sequenzabschnitten, mit einer CpGFrequenz von 50-60%, welche sich in den meisten Promotern der bekannten Gene
finden lassen und denen eine cis-regulatorische Funktion zugeschrieben wird
(Rollins et al., 2005; Feinberg et al., 2007; Weber et al., 2007). Die Regulierung kann
dabei sehr spezifisch sein und nur einzelne Gewebe betreffen (Barros et al., 2009;
Schneider et al., 2010), ein Umstand der die Epigenetik zusätzlich interessant für
Untersuchungen an Hörstörungspatienten macht (Provenzano et al., 2007;
Friedmann et al., 2009).
31
Einleitung
3.5 Therapeutische Ansätze
In den letzten 30 Jahren hat neben einer umfangreichen audiologischen und etwas
jüngeren molekularbiologischen Diagnostik auch die Therapie sensorineuraler
Hörstörungen, z.B. mit einem Cochlea Implant, bedeutende Fortschritte für die
Patienten gebracht (Papsin und Gordon, 2007). Solche therapeutischen Neuerungen
setzen sich oft langsam durch, zum Beispiel wurde das erste Verpflanzen einer
Sonde im Innenohr vor über 40 Jahren durchgeführt (Doyle et al., 1964).
Berücksichtigt man also die Geschwindigkeit die eine Entwicklung von der
(Grundlagen-) Forschung bis zur Applikation am Patienten hat, so ist es sicher
verfrüht,
zum
gegenwärtigen
Zeitpunkt
Behandlungsmöglichkeiten
auf
molekularbiologischer Ebene zu erwarten. Zudem gab es bis heute etwa 1400
klinische Studien zur Gentherapie, aber noch keine einzige hat bislang eine
Bedeutung in der klinischen Praxis gefunden (Müller-Röber et al., 2009). Dennoch
wäre eine Arbeit über sensorineurale Hörstörungen sicher unvollständig, ohne die
aktuellen Therapieansätze zu erörtern, auch wenn diese sich weitgehend noch im
(tier-) experimentellen Stadium befinden. Mit dem stetig wachsenden Wissen um die
Genetik von Hörstörungen steigt auch das Potential gentherapeutischer Ansätze. Ein
Grundproblem ist hierbei Raum und Zeit, d.h. eine Therapie (1) auf die
entsprechenden Zielzellen zu den (2) ontogenetisch relevanten Zeitpunkten
zuzuschneiden.
Von allen Strukturen der Cochlea könnte man die rund 15.000 (inneren und äußeren)
Haarzellen als „Achillesferse“ des auditorischen Systems bezeichnen. Grundsätzlich
sind die äußeren Haarzellen empfindlicher gegen Schädigungen, während eine
Schädigung der inneren Haarzellen schwerwiegender ist (Brigande et al., 2009). Eine
Regeneration der Haarzellen sollte also das erklärte Ziel einer Therapie sein.
Unterstützerzellen der Haarzellen und Neuronen der Cochlea sind ebenfalls putative
Therapieziele. Von den Säuger-typischen, evolutionären Anpassungen, wie zum
Beispiel der Elektromotilität der äußeren Haarzellen, welche durch positive Selektion
des Prestin-Gens SLC26A5 entstanden sind (Franchini et al., 2006), stellt die SelbstRegeneration der Haarzellen eine Eigenschaft dar, die in den Säugetieren verloren
gegangen ist (Cotanche et al., 2008). Andere Vertebraten, wie zum Beispiel die
Vögel, scheinen diese Eigenschaft konserviert zu haben, ein Umstand, der sie zum
bevorzugten Gegenstand gentherapeutischer Forschung macht (Corwin et al., 1988;
32
Einleitung
Ryals und Rubel, 1988). Die Cochlea ist auch geeignet, um ein entsprechende
Gentherapie zu applizieren: (1) Die Cochlea ist vergleichsweise isoliert, ein Umstand.
der die Kontaminierung anderer Gewebe minimiert. Außerdem gewährleistet das mit
Flüssigkeit gefüllte Innenohr die gute Erreichbarkeit der Zielzellen. (2) Darüber
hinaus eignet sich die Cochlea auch gut zur zielgerichteten Applikation von
Therapeutika, da man durch die Scala media und den Modiolus einfache
Injektionsmöglichkeiten hat (Vlastarakos et al., 2008). (3) Die Entwicklung und der
Verlauf einer Therapie kann mit einer Vielzahl effektiver Meßinstrumente (z.B.
Cochlea Mikrophone und Otoakustische Emissions-Messung) aufgezeichnet werden.
(4) Bei kaum einem sensorischen System des Körpers wurden so viele funktionell
relevante Gene und Loci (n>100) kartiert und zum Teil auch schon erfolgreich in
Vorstufen der Gen-Therapie verwendet, z.B. in Shaker-2 Mäusen (Probst et al.,
1998) und aktuell in Meerschweinchen (Shibata et al., 2009). (5) Es gibt gute,
konkrete Anwendungsmöglichkeiten wie zum Beispiel die Neurotrophintherapie;
Neurotrophine sind bei der Entwicklung des Innenohres von Bedeutung, sowie beim
Schutz gegen ototoxische und physikalische (Lärm) Noxen (Duan et al., 2004). Auch
die nachgewiesen protektive Wirkung von BDNF, einem Neurotrophin-kodierenden
Gen,
auf
Neuronen
des
Ganglion
spirale
war
bereits
Gegenstand
gen-
therapeutischer Versuche. In einem ex vivo-Modell wurde eine Cochlea-ImplantatElektrode mit Fibroblasten ummantelt, die mit Hilfe eines viralen Vektors mit einem
BDNF Gen-Insert versehen waren. Es konnte gezeigt werden, das nach Implantation
der präparierten Elektrode in Meerschweinchen-Cochlea die BDNF-Expression eine
Neuronen-protektive Wirkung entfalten konnte (Rejali et al., 2009). Eine protektive
Funktion wird auch dem Gen OTOS zugeschrieben. Dieses Gen wurde bereits
erfolgreich in Fibrozyten des Spiralligaments exprimiert und so eine Cisplatininduzierte Apotose signifikant gebessert (Zhuo et al., 2008). Das nahe liegendste
Therapieziel ist vielleicht das Kanal-Protein GJB2, das zusammen mit GJB6 Hybrid
Zell-Zell-Kanäle bildet und das für bis zu 50% aller nicht-syndromalen erblichen
Hörstörungen verantwortlich ist. Allerdings scheinen, zumindest bei Mäusen, diese
Hybridkanäle nicht essentiell für das Hören zu sein, da transgene Tiere ohne GJB6Gen (-/-) aber mit Zusatzkopien des GJB2-Gens in der Lage waren, ihr Gehör zu
erhalten (Ahmad et al., 2007). Sollte dies beim Menschen auch der Fall sein, wäre
ein gentherapeutischer Ansatz mit GJB2-Applikation äußerst vielversprechend.
Ebenso wurden Experimente an Mäusen mit dem Transkriptionsfaktor Atoh1
33
Einleitung
gemacht, der eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Haarzellen spielt
(Bermingham et al., 1999; Izumikawa et al., 2005). Durch die Beeinflussung des
Notch-Rezeptor- Signalwegs, der durch Regulierung der TranskriptionsfaktorenGene Hes und Hey über Atoh1 die Haarzellentwicklung reguliert, konnte in VogelEpithelzellen und Cochleae von Mäusen und sogar Meerschweinchen eine Zunahme
an Haarzellen erzeugt werden (Kawamoto et al., 2003; Izumikawa et al., 2005;
Brooker et al., 2006; Kelly et al., 2009; Daudet et al., 2009, Gubbels et al., 2009). In
Versuchen mit der Deletierung von P27kip1, einem Gen das als „Bremse des
Zellzyklus“ bezeichnet wird, konnten ebenfalls überzählige Haarzellen generiert
werden (Loewenheim et al., 1999). Für eine entsprechende Therapie mit der
Zielsetzung Regeneration der Haarzellen, müssen entweder ganze Zellen oder
Fremd-DNA in das Corti-Organ, bzw. in dessen Zellen eingebracht werden, oder die
Expression von Ziel-Genen durch Wirkstoffe beeinflusst werden. Daraus leiten sich
drei
therapeutische
Ansätze
ab:
Stammzell-Therapie,
Gen-Transfer
und
Pharmakotherapie (Brigande et al., 2009). Abgesehen davon, dass in allen Ansätzen
in den letzten Jahren zumindest ein „proof of principle“-Status erreicht werden konnte
(Brigande et al., 2009), müssen in allen Bereichen noch wesentliche Einflussfaktoren
in den Griff bekommen werden. Die Problematiken der Stammzellentherapie sind
mögliche Abstoßungsreaktionen, nicht zielgenaue Applikation, Interferenz durch
intraskaläre Ionenkonzentrationen, die Überwindung von Zellverbindungen und das
mögliche Fehlen anderer unterstützender Strukturen ohne die neue bzw.
regenerierte Haarzellen wohl kaum erfolgreich ihre Funktion erfüllen werden
(Brigande et al., 2009). Eine Therapie, die auf Gen-Transfer setzt, also zum Ziel hat
Fremd-DNA in bestimmte Zellen einzuführen, muss sich bestimmter Vektoren
bedienen, die diese Arbeit zuverlässig verrichten. Grundsätzlich gibt es zwei
Möglichkeiten, nämlich nicht-virale oder virale Vektoren zu verwenden. Liposome, als
nicht-virale Vektoren, wurden schon erfolgreich bei in vivo-Experimenten in die Zellen
von Säugetier-Cochleae eingeführt (Duan et al., 2004). So konnte in der MausCochlea mit Hilfe der RNAi-Technik zur allel-spezifischen Gen-Unterdrückung, die
Expression einer pathologischen Mutante (R75W) des Hörstörungsgens GJB2
unterbunden werden (Maeda et al., 2005). Generell werden an die RNAi-Technik
große Erwartungen geknüpft bezüglich der Knock-down-, also „Ausschalt“-Effekte
dominanter, einzelne Allele betreffender Mutationen (Hildebrand et al., 2008). Die
RNAi-Technik wurde 1998 eingeführt (Fire et al., 1998) und basiert auf einem in zwei
34
Einleitung
Schritten
ablaufenden
intrazellulären
Prozess,
bei
dem
am
Ende
kleine
einzelsträngige RNA’s sequenzspezifische Knock Downs generieren (Hildebrand et
al., 2008). Andere, nicht-virale Vektoren befinden sich noch im Erprobungs-Status
(Duan et al., 2004). Als virale Vektoren wurden am Innenohr vor allem Herpes
simplex Typ I Viren, Vaccinia Viren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte
Viren (AAV) angewandt (Human genome project information). Zur Zeit ist aber noch
kein idealer Vektor gefunden, der einen therapeutischen Gen-Transfer zeit- und
ortsgenau verrichtet. Virale Vektoren bergen auch immer die Gefahr eine ungewollte
Immunantwort hervorzurufen (Brigande et al., 2009). Die besten Möglichkeiten
scheinen momentan Adenoviren und AAV’s zu bieten, die bereits mit guten
Teilerfolgen an Mäusen und Meerschweinchen eingesetzt wurden (Praetorius et al.,
2009; Konishi et al., 2008; Liu et al., 2007; Ballana et al., 2008). Die Übertragbarkeit
der Ergebnisse auf den Menschen ist allerdings nur eingeschränkt möglich und trotz
der insgesamt vielversprechenden Therapieansätze wird kurz- und mittelfristig eher
nicht mit klinischen Routineanwendungen zu rechnen sein. Auch erste erfolgreiche
Anwendungen von Therapien an Sinnesorganen, wie im Fall einer erblichen
Retinalen Dystrophie (Bainbridge et al., 2008) sind immer noch im ExperimentStadium: „These results give us great confidence that this technique is safe and can
bring real benefit to patients..., it’s important to emphasise that gene therapy is still
an experimental treatment not yet generally available to patients.” (Robin Ali,
University College London, Pressemitteilung 28.04.2008).
3.6 Zielsetzung der Arbeit
Das
Spektrum
der
zyto-
und
molekulargenetischen
routinediagnostischen
Versorgung von Hörstörungspatienten der Mainzer Universitätsmedizin hat in den
letzten Jahren neue Erkenntnisse aus der Forschung implementiert. Die Zielsetzung
dieser Arbeit war es, durch Auswertung der routinediagnostisch erhobenen Daten
des Patientenpools Kandidatengene für Hörstörungen zu identifizieren und zu
charakterisieren. Hintergrund einer solchen Forschungsarbeit ist letztendlich auch die
Hoffnung, zumindest einen Teil der generierten Resultate anwendungsbezogen in
der klinischen Routine nutzen zu können. In der Humangenetik ist dies in aller Regel
kurz- und mittelfristig nur im Bereich der Diagnostik möglich. (Gen-) Therapeutische
35
Einleitung
Ansätze sind erst nach jahrelangen Forschungs- und Validierungsarbeiten, wenn
überhaupt, umsetzbar. Aus diesem Grund wurde versucht, auf den Auswertungen
der
Routinediagnostik
basierend,
den
experimentellen
Teil
und
die
Forschungsrichtung dieser Arbeit möglichst auf Ergebnisse mit Anwendungscharakter zu fokussieren.
36
Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1 Polymerase- Kettenreaktion (PCR)
Alle
PCR-Reaktionen
wurden
nach
Standard
Protokollen
ausgeführt.
Das
Reaktionsgemisch bestand aus 2,5 µl 10xPCR-Buffer, 2.5 µl 50 mM MgCl2, 2.5 µl 10
mM dNTP mix, 1.0 µl (100 ng) je Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 0.5 µl (2.5 U) Taq
Polymerase (FastStart Taq Polymerase, Roche Diagnostics, Mannhein, Germany),
14 µl Reinstwasser und 100 ng DNA-Matrize. Die Amplifikationen wurden in einem
Tetrad2 thermal cycler (BioRad, USA) durchgeführt. Nach einem AnfangsDenaturierungsschritt bei 94°C von 3 min Länge wurd en 35 Zyklen mit 94°C für 30
sek., Primer-spezifischer Annealing –Temperatur (zw. 55°C – 65°C) für 30 sek. und
72,8°C für 60°. Abschließend wurde ein Extensionssc hritt bei 72,8°C für 10 min.
gemacht. Bei den PCR Amplifikationen für die Pyrosequenzing Assays wurde die
Zyklenzahl auf 40 erhöht. Alle verwendeten Primer sind in der Primertabelle
verzeichnet.
4.2 Long Range PCR
Mit der Long range PCR können Sequenzabschnitte amplifiziert werden, die für eine
herkömmliche PCR zu groß sind (>1500 nt). Fragmente dieser Größe wurden mit
dem Expand Long Template PCR- System (Roche Diagnostics, Mannheim,
Germany) nach dem Herstellerprotokoll amplifiziert. Das Reaktionsgemisch bestand
aus 10 µl 5x Expand Long Range Buffer (mit 12,5 mM MgCl2), 2,4 µl NukleotidGemisch, 1,5 µl (150 ng) je Vor- und Rückwärts-Primer, 0,7 µl (3,5 U) Expand Long
Range
Enzyme
Mix,
Annealingtemperaturen
100
und
ng
DNA
Matritze
Elongationszeiten
und
33
µl
Reinstwasser.
wurden
für
jedes
Primerpaar
angepasst.
37
Material und Methoden
4.3 Vektor Ligation
Für die Klonierung des Bruchpunktfragmentes in der PDZD7-Untersuchung fand eine
neue Vektor-Ligationstechnik Anwendung. Dazu wurde genomische DNA des
Indexpatienten
(homozygote
Translokation),
seines
Bruders
(heterozygote
Translokation) und einer gesunden Kontrollperson mit unauffälligem Karyotyp mit
dem Restriktionsenzym PstI (New England Biolabs Frankfurt, Germany) verdaut.
Dieses Enzym schneidet etwa alle 1000 bp in der menschlichen Sequenz. Bezogen
auf das Bruchpunktfragment schneidet das Enzym nahe an den äußeren Grenzen
aber nicht innerhalb dieser Sequenz. Zum Verdau wurden 2 µg genomischer DNA
(Kontrollpersonen, Indexpatient) und 2,0 µl pBluescriptII Phagemid Vektor (New
England Biolabs Frankfurt, Germany) in einer 40 µl Reaktion eingesetzt, die 1,5 µl
PstI, 4 µl 10xNEB-Buffer 3, und Reinstwasser enthielt. Nach einem Inkubationsschritt
übernacht bei 37°C wurde das Enzym bei 80°C für 20
min inaktiviert. Um 5’-
Phosphat-Reste zu entfernen wurde der Plasmid Vektor mit CIP (Calf Intestine
Phosphatase; New England Biolabs, Frankfurt, Germany) behandelt. Um die
verdaute genomische mit der Vektor DNA zu ligieren wurde ein Übernacht-Schritt bei
16°C mit 1 µl Plasmid Vektor, 10 µl (500 ng) DNA, 1 2.5 µl T4 DNA Ligase.2x rapid
ligation buffer und 1.5 µl T4 DNA Ligase (Promega, Mannheim, Germany)
durchgeführt. Die Reaktion wurde dann durch einen Inkubationsschritt bei 75°C für
20 min gestoppt. Anschließend wurden die Ligationsprodukte mit DNA Clean &
Concentrator
5
(Zymo
Research,
Orange,
CA,
USA)
gereinigt.
Um
die
bruchpunktspannende Sequenz zu amplifizieren (Standard-PCR) wurden jeweils ein
T7- und m13 Primer mit je einem spezifischen Primer (Primertabelle) verwendet (auf
dem Vektor befinden sich T7 und m13-Primerbindungsstellen).
4.4 DNA-Sequenzierung (Sanger-Methode)
In dieser Arbeit wurden Sequenzierungsassays für verschiedene Gene etabliert:
PDZD7, GJB4, GJB6 und GJB43. Im Falle von PDZD7 wurden alle vorbereitenden
Arbeiten bis zur Sequenzierreaktion am Institut durchgeführt. Die Sequenzierungen
wurden anschließend von der Fa. Genterprise (Mainz, Germany) durchgeführt. Die
Pilotsequenzierungen zu PDZD7 und alle anderen Sequenzierungen wurden selbst
38
Material und Methoden
mit dem Beckman Protokoll durchgeführt. Die zu sequenzierenden PCR-Produkte
wurden zuerst mit Exo/SAP-Enzymen verdaut (Reinigungsschritt). Danach wurde die
gereinigte DNA nach dem Standardprotokoll des Herstellers mit dem CEQ DTCS
Quick Start Kit (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) markiert. Die Produkte wurden
anschließend durch Ethanolprezipitation gefällt, in SLS-Puffer (Beckman Coulter,
Krefeld, Germany) gelöst und mit einem Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic
Analysis System sequenziert.
4.5 RNA- Extraktion
Für die RNA Extraktion wurde die Trizol-Methode verwendet. Die Extraktionen
wurden unter Einhaltung der üblichen Sicherheitsstandards unter einem Abzug
gemacht. Die Gewebeproben wurden auf Eis aufgetaut und zusammen mit 500 µl
Trizol
(Invitrogen,
Karsruhe,
Germany)
mit
einem
Ultraturrax
mechanisch
aufgeschlossen. Danach wurden sie mit weiteren 500 µl Trizol aufgefüllt und 5min
bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann wurden 200 µl Chloroform zugesetzt und
kräftig geschüttelt bis die Lösung milchig war. Danach wurde wieder für 2min bei
Raumtemperatur inkubiert. Durch anschließende Zentrifugation mit 13.000 U/min bei
4°C für 15 min wurde eine Phasentrennung erreicht. Die obere Phase wurde in
eiskaltes Isopropanol überführt und nach leichtem Schwenken für 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Es folgte ein zweiter Zentrifugationsschritt für 15 min.
Danach wurde der Überstand verworfen und mit EtOH (70%) gewaschen. Nach
einem letzten Zentrifugationsschritt für 5min wurde noch einmal gewaschen und
anschließend das entstandene Pellet luftgetrocknet. Zur weiteren Verwendung wurde
das Pellet in DEPC-Wasser gelöst und unmittelbar bei -80°C weggefroren. Zur
Überprüfung der RNA-Menge und Qualität wurden 2 µl RNA isoliert und mit einem
NanoDrop Spektrofotometer (Peqlab, Erlangen, Germany) gemessen.
4.6 cDNA- Umschreibung
Die Umschreibung der RNA zu cDNA [reverse Transkription (RT)-PCR] wurde mit
dem SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Darmstadt, Germany)
39
Material und Methoden
durchgeführt. Dazu wurden 1µl oligo(dT) (50 µM), 1µl random primers, 1 µl dNTP-Mix
(10 mM) und RNA (Menge konzentrationsabhängig) mit sterilem Wasser auf 13 µl
aufgefüllt. Einem Inkubationsschritt für 5min bei 65°C folgte die Kühlung auf Eis (2
min). Nach kurzem Herunterzentrifugieren wurden 4 µl 5xFirst-Strand buffer, 1 µl 0,1
M DTT, 1 µl RNaseOUT und 1 µl SuperScript III RT zugefügt und durch vorsichtiges
Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach 5-minütiger Inkubationszeit bei RT wurde bei
50°C für eine Stunde inkubiert. Durch 15-minütiges Lagern auf Eis wurde die
Reaktion abgestoppt.
4.7 Messung gewebespezifischer Expression
Da es zum Zeitpunkt unserer Untersuchungen im Gegensatz zur Maus (Expression
im Innenohr; NCBI/UniGene/ESTProfileViewer) keine Datenbankangaben zur
Expression von PDZD7 im menschlichen Innenohr gab, wurden Exon-spannede
Primer entwickelt (Primertabelle), die alle vier bis dato bekannten Transkripte
detektieren konnten. Als Template wurde cDNA aus humanem Innenohrgewebe
verwendet. Als Positivkontrolle wurde Cortexgewebe verwendet, von dem laut
Datenbank eine Expression von PDZD7 bekannt war. Als Funktionskontrollen
wurden die Gene ACTB und GAPDH verwendet. Obwohl sich durch die Wahl
exonspannender Primer eine DNA-Kontamination mit großer Sicherheit ausschließen
lies (Größe des DNA Fragments 822 bp), wurde zur Überprüfung zusätzlich die 298
bp-Bande aus dem Agarosegel ausgeschnitten (2.8), reamplifiziert (2.1) und durch
einen Sequenzierungsschritt (2.4) sicher als Expressionsprodukt verifiziert.
4.8 Gel- Extraktion
Die Gel Extraktion wurde mit einem NucleoSpin® Extract II –Kit von Macherey und
Nagel durchgeführt. Zuerst wurde die Bande der Wahl vorsichtig unter Einhaltung der
Sicherheitsbestimmungen
(Sichtschutz,
Kittel,
Nitrilhandschuhe)
aus
dem
Agarosegel herausgeschnitten und in ein 1,5ml Eppendorf Reaktionsgefäß gegeben.
Dazu wurden 200 µl Puffer NT gegeben und bei 50°C 1 0 min inkubiert. Das gelöste
Gel wurde dann durch eine NucleoSpin Säule bei 13.000 U/min zentrifugiert und
40
Material und Methoden
anschließend mit 600 µl Waschpuffer NT3 gewaschen. Das gereinigte Produkt wurde
mit 30 µl Reinstasser gelöst und zur weiteren Verwendung weggefroren.
4.9 Bisulfitkonvertierung der DNA
Bei der Bisulfitkonvertierung der DNA wird das Cytosin nicht-methylierter CpG
Dinukleotide in Uracil umgewandelt und anschließend als Thymidin amplifiziert,
wohingegen methylierte Cytosine geschützt sind und Cytosine bleiben. Die
Konvertierung der DNA wurde mit einem EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben durchgeführt. In die Konvertierung wurden 2 µg
DNA eingesetzt.
4.10 Pyrosequencing
Die Pyrosequenzieruzng wurde mit einem PSQ96MA Pyrosequencing System
(Biotage) mit dem PyroGold SQA reagent kit (Biotage) (Tost, 2003) nach
Herstellerangaben durchgeführt. Die bei der Synthese in Echtzeit laufende
Sequenzierung (im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung) wurde in unserem Falle
für zwei verschiedene Applikationen benutzt: (1) die Genotypanalyse und (2) die
Methylierungsanalyse. Erstere detektiert Sequenzpolymorphismen (SNP’s) und gibt
einen bestimmten Ratio-Wert dafür an, letztere misst die Methylierung von CpGDinukleotiden. In dieser Arbeit wurden Sequenzpolymorphismen des OTOF- und des
KCNE1-Gens
und
die
Promoter-Methylierung
des
GJB2-Gens
bestimmt
(Primertabelle). Bei der Pyrosequenzierung wird das PCR Produkt zusammen mit
vier Nukleotiden und einem Enzym- und Substratmix in den Sequencer gegeben. Der
erfolgreiche Einbau eines Nukleotids wird durch einen Lichtblitz signalisiert der vom
Gerät detektiert und aufgezeichnet wird. Vor der Pyrosequenzieung muss die (PCRamplifizierte) DNA entsprechend vorbereitet werden. Diese wird in einer speziellen
96-Well Platte zusammen mit Wasser, Puffer und Sepharose-beads vorgelegt. In
eine zweite 96-Well Platte werden Annealingpuffer und Primer vorgelegt. Mit der
sogenannten PyroMark Vacuum Prep Worktable wird nun die an die Sepharosebeads gebundene DNA mit den Primern zusammengebracht. Diese Platte wird
41
Material und Methoden
zusammen mit der Kartusche, welche die Enzyme und Nukleotide enthält, in den
Pyrosequenzierer gestellt. Als Endergebnis erhält man ein Pyrogramm genanntes
Protokoll, das mit Hilfe der von Biotage mitgelieferten Software erstellt wird. Dabei
wird in die Qualitätsstufen rot, gelb und blau unterschieden, wobei blau die höchste
Qualität der Sequenzierung bedeutet.
4.11 Patienten/Kontrollen
Die Hörstörungspatienten stammen aus einer Zusammenarbeit des Institutes für
Humangenetik
der
Universitätsmedizin
Mainz
und
der
Abteilung
für
Kommunikationsstörungen (Leitung: Prof. Dr. A. Keilmann). Aufgrund klinisch
diagnostizierter fehlender exogener Faktoren ist eine genetische/epigenetische
Ursache für die Hörstörung dieser Patienten wahrscheinlich. Bei allen Patienten
wurden standardisierte Hör-, Sprach und kognitive Tests durchgeführt. Im Rahmen
der humangenetischen Diagnostik werden routinemäßig eine Stammbaumanalyse,
eine Chromosomenbänderungsanalyse, eine Sequenzanalyse des GJB2- Gens und
eine Deletionsanalyse des GJB6-Gens (d13s1839) durchgeführt. In begründeten
Fällen werden zusätzliche Hörstörungsgene untersucht wie z.B. SLC26A4 (PendrinGen) oder die mitochondrielle 12 S rRNA. Von allen Hörstörungspatienten wurde im
Rahmen der Routinediagnostik Blut-DNA [DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen,
Hilden, Germany)] isoliert und zum Teil EBV-transformierte Lymphoblastenkulturen
angelegt. Innenohr- und Cortexgewebe wurde von männlichen Verstorbenen
zwischen 20-45 Jahren innerhalb von 48h post mortem entnommen (Rechtsmedizin,
Universitätsmedizin Mainz). Die Entnahme der Cortexprobe erfolgte am lateralen
frontalen Lappen, linksseitig. Zur Innenohrentnahme wurde bei aufgesägten Schädel
vom Pars petrosa ossis temporalis her vorsichtig zur Cochlea hin aufgemeißelt und
diese dann entnommen. In den meisten Fällen wurde beidseitig aufgemeißelt, aber
die Cochlea nur entnommen, wenn diese eindeutig identifiziert werden konnte (d.h.
nicht zerstört war). Unmittelbar nach Entnahme wurden die Proben zur weiteren
Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.
42
Material und Methoden
4.12 Stammbaum- und Karyotypanalyse [GTG-Banding und Fluoreszenz in situ
Hybridisierung (FISH)]
Diese Untersuchungsmethoden wurden als Standardanalysen in der laufenden
Routinediagnostik des Institutes für Humangenetik der Universitätsmedizin Mainz
durchgeführt. Im speziellen Fall von PDZD7 soll hier noch einmal kurz die
Vorgehensweise der Routinediagnostik umrissen werden. Aus Phytohämagglutininstimulierten
Lymphozytenkulturen
wurden
Metaphasen
präpariert
und
mit
klassischem GTG-Banding auf dem 500 Band Niveau analysiert. Für die FISH
wurden spezifische BAC-Klone ausgewählt (Tabelle BAC Klone, 2.16). Die
genomischen BAC Klone wurden durch Nick-Translation mit Fluoreszenz-Farbstoffen
gelabelt
(Fluorescin-12-dUTP
oder
Tetramethyl-Rhodamin-5-dUTP;
Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany). Die FISH wurde an den Patienten-Metaphasen
durchgeführt. Die Bruchpunkteinengung mit FISH wurde durch eine Kollegin (R.
Farcas) als Vorarbeit durchgeführt.
4.13 GST-Pulldowns und Western-Blotanalysen
Die GST Pulldown- und Western Blot- Untersuchungen an Mausgeweben wurden
von der AG Wolfrum der Abteilung für Zell- und Matrixbiologie der Universität Mainz
im Rahmen einer Kollaboration durchgeführt. Zur Durchführung der GST-Pulldown
Assays wurden Full-Length-Konstrukte muriner Pdzd7 cDNA (FANTOM 3 clone
9130207N01, imaGenes GmbH, Berlin, Germany) in einen pDEST15 Vektor
(Gateway Cloning System, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) kloniert. Die GST
Fusionsproteine wurden durch Transformation von E. coli BL21AI- Zellen mit
pDEST15-Pdzd7 hergestellt. Die Zellen wurden bei 30°C mit 0,5mM Isopropyl-b-DThiogalaktopyranosid über Nacht inkubiert und anschließend mit STE-Puffer mit
Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) lysiert. Die
Lysate wurden mit Gluthathion-Sepharose 4B Beads (Amersham Biosciences,
Freiburg, Germany) inkubiert. Die Menge der an die Beads gebundenen GSTFusionsproteine wurde auf einer NUPAGE Novex 4-12% SDS PAGE verifiziert und
mit Simply Blue Safe Stain (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) gefärbt. Das FLAGmarkierte humane SANS Protein wurde durch Transfektion von HEK293T- Zellen
43
Material und Methoden
hergestellt. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und auf Eis lysiert. Diese
und die Extrakte aus Retina adulter C57BL/6J Mäuse wurden über Nacht bei 48°C
mit gleichen Mengen GST- oder GST Fusionprotein- vorbehandelter Beads inkubiert.
Die Beads wurden anschließend gewaschen und mit SDS Sample Buffer für eine
folgende SDS-PAGE und Western Blot Analyse eluiert. Für die Western Blot Analyse
wurden die GST Pulldowns auf einem 12%-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Daraufhin
wurden die getrennten Proteine auf Polyvinyidän Difluorid Membranen (Millipore,
Schwalbach, germany) auf einem Semidry Blotter (BioRad Laboratories, Munich,
Germany) aufgebracht. Nach dem Abblocken der Membran (Applichem, Darmstadt,
Germany) wurde die Immunreaktivität mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper
(Harmonin H3) oder monoklonalen Maus-Antikörpern (anti FLAG; Sigma-Aldrich,
Hannover, Germany) und geeigneten sekundären Antikörpern (IRDye 680 or 800,
Rockland) (Biotrend Chemikalien, Köln, Germany) mit einem Odyssey Infra Red
Imaging System (LI-COR Biosciences, Bad Homburg, Germany) detektiert. Als
Marker wurde eine vorgefärbte Leiter (11 – 170kDa) verwendet (Sigma-Aldrich).
4.14 Datenauswertung
Alle
Genomdaten
wurden
über
die
Ensembl-Datenbank
[http://www.ensembl.org/index.html; Versionen 43 (Februar 2007) bis Version 56
(September 2009)], die NCBI- Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und die
UCSC-Datenbank
wurden
über
(http://genome.ucsc.edu/)
SwissProt
generiert.
Proteom-Informationen
(http://www.expasy.org/sprot/)
bezogen.
Alle
selbstentworfenen Primer wurden mit Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/;
Version 0.4.0; ) entworfen. Die Daten wurden mit MS-Excel (Versionen 2003 und
2007) erfasst. Statistische Auswertungen wurden mit SPSS (2010 SPSS Inc., an IBM
Company, Chicago, USA; Version 17.0) und MS Excel (Versionen 2003 und 2007)
gemacht. Sequenz-Alignierungen und Auswertungen wurden mit BioEdit (Version
7.0.9.0), Mutation Surveyor (v2.51; SoftGenetics LLC, USA) und Gensearch
(PhenoSystems®S.A., Belgien; Version 3.6.3b) durchgeführt. Vorhersagen zu
Aminosäureaustauschen
wurden
mit
http://www.russell.embl-
heidelberg.de/aas/Gly.html.und http://genetics.bwh.harvard. edu/pph/
gemacht.
44
Material und Methoden
CpG-Inseln
wurden
mit
CpGPlot
bestimmt
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html).
45
Material und Methoden
4.15 Primerlisten
4.15.1 Bruchpunkteinengung PDZD7
Fragment 1
Fragment 2
Fragment 2a
Fragment 2b
Fragment 2c
Fragment 2d
Fragment 2d1
Fragment 2d2
Fragment 3
Fragment 4
junction Fragment 1
junction Fragment 2
Amplikonlänge (bp)
Primer
5436
for
AGTTGCTGGATAAAGAGTACAGG
rev
TCCAAGTCCATGGACTTAAAGC
for
CAGAACCAGCCTCATATGTGC
rev
CTCAAGGGAGATTCCTTACATAGC
for
CTCAAGGGAGATTCCTTACATAGC
rev
GCTCAGATGTTTAGACCCAGC
for
GCTGGGTCTAAACATCTGAGC
rev
CACGTCTCAGTCTCCAGGTGAC
for
GTCACCTGGAGACTGAGACGTG
rev
ACCTCGTCATCAGTCAGCAGC
for
GCTGCTGACTGATGACGAGGT
rev
CAGAACCAGCCTCATATGTGC
for
GCTGCTGACTGATGACGAGGT
rev
AACAGGGGAGAGGACCTGGC
for
GCCTGGCTTCATGCCAGGTCC
rev
ACCGGGCCTTGATAACAGG
for
AGACAGGATCTGCAGCTACGC
rev
CCTGTAGTCCTAGCTACTTGG
for
AGGGTCTTGCTCTGTCATCC
rev
GTTCATGCAGCCTCTTTAGACC
5273
1176
954
787
2452
543
563
5987
6642
1326
1673
for (T7)
Primer Sequenz (5' - 3')
TAATACGACTCACTATAGGG
rev
GTCTCCAGGTGACAATGCATGG
for
rev
GCCTGGCTTCATGCCAGGTCC
AGTCATGCTGACTGAACGCTTTG
46
Material und Methoden
4.15.2 Expressionsanalyse PDZD7
Transkript:
298bps
Genomisch:
822bps
for
GACTCTGCGCTCTCTGAGTCTCC
rev
CTTTCTCTATGTCCAGGCGAGG
4.15.3 Sequenzierungsassay PDZD7
PCR-Primer
1
360
for
rev
CTAAATTTGCGGAATGAGCTAGGG
AAGCTCTGGGACCTAGAATGAAGC
2
699
for
rev
TAAAGTCAGCGAGAGTCCAAGATG
TCTTGAATTCCCCCAATCATACTG
3
780
for
rev
CTACGTGCCTGTGTGACTGTGC
CAGGGCTAGGATGAGGGAGTTG
4
936
for
rev
CTAATGAACCTATGCCCCACTGC
GTAAGTGACCTGTTCGTGAGTTGC
5
548
for
rev
TGAAGTTGAAAGTTTACTCCCATCC
CCCGAGTAGCTGGGATTACAG
6.1
560
for
rev
TCTGAGAATCTGCGGATAAAATGC
AGACTCAGAGAGCGCAGAGTCAAG
6.2
490
for
rev
TTGACTCTGCGCTCTCTGAGTCTC
GGTTCCTCTTCCGACTTTCTGAC
7
468
8
965
for
rev
for
rev
GTCAGAAAGTCGGAAGAGGAACC
AGTAGGGACTCAGCTGGTAAGACG
CGTCTTACCAGCTGAGTCCCTACT
CTCTGTTCTTAGCCCGTGTACTCC
9
560
for
rev
TCCCCTGAAGGTAGGTACTTCTCC
GCCACCCTATCTTTCCTAGTCAGC
10
522
for
rev
ACTGGTATAGGGGTCCATGTTGG
AGGAGTGACTTCTGATTTTACTGACC
11/12
703
for
rev
GGGGTGGAGTGAACCTTTCC
GGGTGATAAGGTGACGCTTGG
13
998
for
rev
ACAGCATGGTGATGCTTGTGG
GAGTTTGTTCAGGCACCACTGC
14
775
15
277
for
rev
for
rev
GCAGTGGTGCCTGAACAAACTC
CAGGCTTCCTAGTGTCCTCTGC
GGGATGGGATTCTAGGTTTCTCC
GCTAAACATGTCTGGCTGGAAGC
47
Material und Methoden
16.1
863
for
rev
ATGAGGAGGGAGGGATGTGACT
GGAAACGGATGAAAGGCTTTTCTA
16.2
792
for
rev
TCACATGCTGTCCCTTATGAGTCG
GGGTAACAGTGAACACGGGGAC
Sequenzierungsprimer
1
CTAAATTTGCGGAATGAGCTAGGG
2
TAAAGTCAGCGAGAGTCCAAGATG
3
CTACGTGCCTGTGTGACTGTGC
4
CTAATGAACCTATGCCCCACTGC
5
TGAAGTTGAAAGTTTACTCCCATCC
6.1
TCTGAGAATCTGCGGATAAAATGC
6.2
TTGACTCTGCGCTCTCTGAGTCTC
7
GTCAGAAAGTCGGAAGAGGAACC
8
CGTCTTACCAGCTGAGTCCCTACT
9
TCCCCTGAAGGTAGGTACTTCTCC
10
ACTGGTATAGGGGTCCATGTTGG
11/12
GGGGTGGAGTGAACCTTTCC
13
14
ACAGCATGGTGATGCTTGTGG
GCAGTGGTGCCTGAACAAACTC
15
GGGATGGGATTCTAGGTTTCTCC
16.1
ATGAGGAGGGAGGGATGTGACT
16.2
TCCAGACTCCTGATTCTAAGCCC
16.3
TCACATGCTGTCCCTTATGAGTCG
48
Material und Methoden
4.15.4 Sequenzierungsassays Connexine
PCR-Primer
Cx30.3_1_m13for
571bps
Cx30.3Intern_m13rev
Cx30.3Intern_m13for
511bps
Cx30.3_3_m13rev
CX30_1_m13for
534 bps
CX30_Intern1_m13rev
CX30_intern1_m13for
577 bps
CX30_neu_m13rev
for
tgtaaaacgacggccagtGCATTAAGGGTGCCCATCTC
rev
caggaaacagctatgaccAGGCGGTGGAAGATATAGA
for
tgtaaaacgacggccagtCCGTCCCTGTACGACAACC
rev
caggaaacagctatgaccTTTTCCTGGGTGGCCTCAT
for
tgtaaaacgacggccagtGGCAGGGAGTTGAAGTTGTA
rev
caggaaacagctatgaccCCTCTATCCGAACCTTCTGC
for
tgtaaaacgacggccagtTGCATGTGGCCTACTACAGG
rev
caggaaacagctatgaccAGGTTGGTATTGCCTTCTGG
CX43_1_m13for
CX43_Intern1_m13rev
638 bps
for
rev
tgtaaaacgacggccagtGAAGGCGTGAGGAAAGTACC
caggaaacagctatgaccACATGAGCCAGGTACAAGAGTG
CX43_Intern1_m13for
431 bps
for
tgtaaaacgacggccagtCCGAATCCTGCTGCTGGG
rev
caggaaacagctatgaccATGTACCACTGGATCAGCAAG
for
tgtaaaacgacggccagtATGGTAAGGTGAAAATGCG
rev
caggaaacagctatgaccAAATCAAAAGGCTGTGCA
for
tgtaaaacgacggccagtACCATGCGACCAGTGGTG
CX43_4_m13rev
rev
caggaaacagctatgaccCCTCCACCGGATCAAAATTA
Sequenzierungsprimer
m13 for
m13rev
for
rev
tgtaaaacgacggccagt
CX43_Intern2_m13rev
CX43_Intern2_m13for
586 bps
pCX43_Intern3_m13rev
CX43_Intern3_m13for
506 bps
caggaaacagctatgacc
4.15.5 Pyrosequencing Assay OTOF
OTOF 829 for
OTOF 829 bio rev
OTOF 829 seq
GGTGCGGGACAAGCTGAG
AAGCGCAGCTTCTGCAGG
ACAAGCTGAGGCTGT
4.15.6 Pyrosequencing Assay KCNE1
KCNE1for
KCNE1bio rev
KCNE1seq
AGAGGGCCTCCAGCTTGC
GCAGGGTGGCAACATGTC
CCAGCTTGCCGTCAC
49
Material und Methoden
4.15.7 PCR-Assay "Wilch-Deletion"
delF
delR
628bps
TGGGACCAGGTCTGTTGTT
ATTGCGACTTGCTTTTCGTT
internalF
InternalR
836bps
GCAGCCATCTCATGGTCTCT
CCAACACAATTGGGTCACTCT
4.15.8 Pyrosequencing Assay GJB2-Promoter
GJB2for (biotyniliert)
GJB2rev
GJB2seq
ATTCGGGAAGTTTTGAGGA
CCRCCTCTTCCCTCAAAAC
TCRAAAACTAAAAAA
50
Ergebnisse
5. Ergebnisse
Der Zielsetzung dieser Arbeit, aus dem Hörstörungspatientenpool des Institutes für
Humangenetik der Universitätsmedizin Mainz, Kandidatengene sowie genetische
und epigenetische Mechanismen für Hörstörungen zu identifizieren und durch deren
Charakterisierung möglichst auch konkrete Anwendungsmöglichkeiten in der
molekularen Diagnostik zu generieren, konnte weitgehend Rechnung getragen
werden. Um einen Überblick über den erwähnten Patientenpool zu bekommen und
weil die in der Routinediagnostik erhobenen Daten die Grundlage für die
Forschungsrichtung dieser Arbeit darstellten, sollen diese zunächst einmal vorgestellt
werden (Tab 5.1). Die Karyotypisierung von 397 Patienten ergab insgesamt bei 13
Patienten
chromosomale
Auffälligkeiten,
davon
4
Translokationen.
Die
Sequenzierung des GJB2-Gens wurde bei den meisten Patienten durchgeführt
(n=505). Homozygote oder digenische Mutationen dieses Gens (mit GJB6) konnten
bei
87
Patienten
detektiert
werden.
Betrachtete
man
nur
Patienten
mit
nichtsyndromalen, sensorineuralen Hörstörungen ohne chromosomale Auffälligkeiten
(n=487) so zeigten 84 eine homozygote bzw. digenische GJB2-(GJB6-) Mutation.
Homozygote Mutationen der anderen komplett sequenzierten Gene SLC26A4
(n=112) und FOXI1 (n=10) konnten nur bei einem Patient für SLC26A4
nachgewiesen
werden.
Die
Teilsequenzierung
des,
die
Mutation
A1555G
enthaltenden, mtDNA- Abschnittes führte in keinem der 58 untersuchten Patienten zu
einem positiven Resultat. Die PCR-Detektion einer bekannten GJB6- Deletion bei
376 Patienten ergab 3 heterozygote Positivbefunde. Schloss man die 47 Patienten
aus, deren Diagnosen syndromale Hörstörungen oder den Verdacht darauf
implizierten und/oder die chromosomale Auffälligkeiten aufwiesen, blieben n=487
Patienten übrig, für die zusammenfassend in 84 Fällen eine genetische Ursache für
ihre Hörstörung gefunden werden konnte, die in allen 84 Fällen ausschließlich auf
GJB2 und GJB6- Mutationen zurückzuführen waren. Aus diesen Daten leiteten sich
die Forschungsansätze der Arbeiten mit Hörstörungspatienten ab, die im Institut für
Humangenetik in Mainz durchgeführt wurden.
51
Ergebnisse
Tab. 3.1 Diagnostische Untersuchungen 2002 – 2009 (des Institutes für Humangenetik der
Universitätsmedizin Mainz an 534 Hörstörungspatienten). Die zytogenetisch, durch Komplett- und
Teilsequenzierung und PCR-basierten Methoden
erhobenen Daten
waren Bestandteil der
Routinediagnostik. (A) Auflistung der diagnostischen Ergebungen („Analysiert“) und der angewandten
Techniken („Methode“). Nicht untersuchte Patienten sind unter „Nicht analysiert“ gelistet. (B)
Erfassung der absoluten Zahlen und prozentualen Anteile der Befunde aller untersuchten Patienten
(n=534) aus A. In der Spalte „Untersucht“ sind alle für jedes Gen untersuchten Personen gelistet,
unter „Gefunden“ diejenigen mit einer Mutation bzw. einem Polymorphismus. (C) Erfassung der
absoluten Zahlen und prozentualen Anteile der Befunde aller Patienten aus A mit nichtsyndromalen
sensorineuralen Hörstörungen ohne chromosomalen Auffälligkeiten (n=487). (D) Die Verteilung
chromosomaler Aberrationen bei 13 betroffenen Patienten. Diese Patienten sind in A und B
mitgelistet, nicht aber in C.
52
Ergebnisse
In dieser Arbeit wurden folgende Forschungsziele verfolgt:
-
die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Hörstörungsgenen
- Klonierung eines Kandidatengens bei einem Patienten mit
chromosomaler Translokation 46,XY,t(10;11),t(10;11)
-
die Identifizierung und Charakterisierung von genetischen und epigenetischen
Hörstörungsmechanismen
- Screening des Kandidatengens PDZD7
- Screening der Connexine CX30, CX30.3 und CX43
- Screening der Q829X- Mutation des OTOF-Gens
- Screening des Gly38Ser-Polymorphismus des KCNE1-Gens
- Screening der Deletion [del(chr13:19,837,344-19,968,698)]
- Screening nach Epimutationen des GJB2-Promoters
5.1 Identifizierung und Charakterisierung von neuen Hörstörungsgenen
5.1.1 Klonierung eines Kandidatengens
Der Patient war zum Zeitpunkt der ersten medizinischen Examination 4 Jahre alt und
wurde vorstellig auf Grund einer bilateralen mittleren sensorineuralen Hörstörung.
Außer der Hörstörung zeigten alle routinemäßig durchgeführten Tests (physische
Untersuchung,
EKG,
Blut-
und
Urinuntersuchungen,
ophtalmologische
Untersuchungen) eine altersgemäße unauffällige Entwicklung. Eine Funduskopie des
Patienten im Alter von 8 Jahren zeigte keine retinale Auffälligkeit. Die Sequenzierung
des GJB2-Gens war ebenfalls negativ. Eine Stammbaumanalyse aus der
genetischen Beratung der Universitätsmedizin Mainz bestätigte der Familie
Konsanguinität (Abb. 5.1). Eine balanzierte Translokation der langen Arme des
Chromosomen
10
und
11
46,XY,t(10;11)(q24.3;q23.3)
konnte
durch
Chromosomenbänderung in heterozygoter Form bei beiden, leicht hörgestörten
Eltern (Konsanguinität!), in allen vier, normal hörenden Geschwistern des Patienten
und in homozygoter Form beim Patienten selbst nachgewiesen werden
[ 46,XY,t(10;11)(q24.3;q23.3),t(10;11)(q24.3;q23.3)] (Abb. 5.2).
53
Ergebnisse
Abb. 5.1 Stammbaum der Familie. Der Patient (roter Pfeil) ist homozygoter
Träger der reziproken Translokation t(10;11)(q24.3;q23.3) und leidet unter einer
angeborenen Schwerhörigkeit (aus: genetische Beratung, Universitätsmedizin
Mainz)
Weitere Vorarbeiten (R. Farcas) konnten den Bruchpunkt auf 10q24.3 einengen auf
~96kb (chromosomale Lage, Ensembl release 49: 10:102,752,043 - 102,848,009bp)
(Überlapp der BACs: RP11-108L7 und RP11-11122F15). Der Bruchpunkt auf
11q23.3 konnte auf ~30 kb eingeengt werden (chromosomale Lage, Ensembl release
49: 11:115,317,529 - 115,347,799 bp) (Überlapp der distalen 20 kb von BAC RP11188O8 und der proximalen 20 kb von BAC RP11-13C8). Eine Datenbankanalyse
ergab eine sogenannte „Gen-Wüste“ des Bruchpunktes auf Chromosom 11 während
in der Bruchpunktregion auf Chromosom 10 sieben Gene (PEO1, LZTS2, PDZD7,
SEMA4G, MRPL43, SFXN3 und KAZALD) lokalisiert werden konnten. Daher wurde
zuerst auf Chromosom 10 versucht, den Bruchpunkt weiter einzuengen. Es wurden
mit geeigneten Primer-Kombinationen überlappende ~5kb-Fragmente der im
Bruchpunkt liegenden Gene mit Long Range PCR’s amplifiziert.
54
Ergebnisse
Abb. 5.2 Darstellung der Translokation t(10;11)(q24.3;q23.3). (A) GTG-Bänderung des
Karyotyps des Patienten mit der homozygoten Translokation. Ausschnitte aus den Karyotypen der
Eltern, (B) Vater und (C) Mutter. (D) FISH mapping der bruchpunktspannenden BAC-Klone RP11108L7 von Chromosom 10q24.3 und (E) CTD-2527F12 von Chromosom 11q23.3 auf Metaphasen
des Patienten. (Karyogramme und FISH-Analysen: Abteilung für Zytogenetik, Universitätsmedizin
Mainz).
55
Ergebnisse
Bei Gen PDZD7 konnten von vieren die Fragmente A, C und D im Patienten, seinen
heterozygoten
Abb. 5.3 Kartierung der Bruchpunktregion. (A) Das bruchpunktspannende Fragment (5273bp) auf
Chr. 10q24.3 konnte nur beim Patienten nicht amplifiziert werden (fehlende Bande). (B) Weitere
Einengung des Bruchpunktfragmentes auf 564bp. Die Amplifikation gelang wiederum nur bei einem
heterozygoten Geschwister.
Geschwistern und Normalkontrollen amplifiziert werden. Fragment B konnte nicht
beim Patienten, hingegen bei seinen Geschwistern und den Normalkontrollen
amplifiziert werden. Damit war der Bruchpunkt auf dieses Fragment eingeengt. Um
weiter einzuengen wurde das Fragment weiter unterteilt und in derselben Weise
verfahren (nur mit PCR anstelle der Long range PCR). Die kleinste erreichte
Einengung war ein 564bp großes Fragment (Abb. 5.3). Die vermutete Bruchstelle
konnte so in Intron 10 der genomischen PDZD7 Sequenz lokalisiert werden. Um die
Fusionssequenzen und damit die exakten Bruchpunkte zu erhalten, wurde eine
Vektor Ligationstechnik angewendet (Abb. 5.4). Zuerst wurde die Fusionssequenz
kloniert und dann PCR-amplifiziert (je ein unspezifischer T7 bzw. m13-Primer und ein
spezifischer PDZD7- Primer). Das Amplifikat war bei einer Normalkontrolle ~650bp
groß (564bp Fragment plus 90bp Vektor Sequenz). Beim Patienten war das Produkt
1400bp groß, da hier die bis dahin unbekannte Fusionssequenz amplifiziert wurde
(Abb. 5.5).
56
Ergebnisse
Abb. 5.4 Vektor Ligationstechnik. (A) und (B) Translokationschromosomen der (11) und der (10).
Der Bruchpunkt (roter Pfeil) wurde durch FISH und PCR in einem 564bp großen Segment in Intron 10
lokalisiert. Die eingezeichneten PstI-Schnittstellen sind dem Bruchpunkt am Nähesten gelegen
(Datenbankinformation). (C) Das Translokationschromosom der (11) wird geschnitten (PstI) und (D)
in den Vektor (pBluescript) ligiert. (E) Die Ligation wird mit einem unspezifischen Primer (T7) aus dem
Vektor und einem spezifischen Primer (PDZD7_16525R) der bekannten Bruchpunktregion in PDZD7
auf Chromosom 10 amplifiziert. (F) Dargestellt ist das PCR und semi-nested PCR-Amplifikat des
Patienten, darunter (in Klammern) das Fragment einer Normalkontrolle (654bp). Aus beiden wird
anschließend durch Sequenzierung und Alignierung Fusionssequenz 1 extrahiert (nicht gezeigt).
57
Ergebnisse
Ein ebenfalls mitamplifziertes Produkt des Bruders zeigte erwartungsgemäß
(Heterozygotie) beide Produktgrößen. Die Sequenzierung des 650bp großen
Produktes lieferte die komplette Sequenz des Bruchpunktes auf Chr. 10 und der(11).
Abb. 5.5. Fusionssequenzen [t(10;11)(q24.3;q23.3)]. (A) PCR-Amplifikat aus dem Produkt der
Vektorligation mit PDZD7-spezifischen und unspezifischen (T7/m13) Primern. Die Normalkontrolle
(Kontr.) zeigt die errechnete Fragmentgröße von ~650bp. Beim Patienten beträgt die Produktgröße
etwa 1400bp. (B) Chromatogramm der Fusionssequenz 1. Der rote Pfeil zeigt den Bruchpunkt. (C).
Das Alignment der Fusionssequenz 1 (der11) mit den humanen Referenzsequenzen der
Chromosomen 11 und 10 (homologe Sequenzen grau unterlegt) lokalisiert den Bruchpunkt bei
115.319.661+ auf Chr. 11 und 102.764.759+ auf Chr. 10. Fusionssequenz 2 (der10) wurde aus der
PCR-Amplifizierung mit einem spezifischen Primerpaar generiert und bestätigt den Bruckpunkt ohne
einen erkennbaren DNA-Verlust.
Um nun auch die Sequenz von 11 und der(10) zu erhalten, wurde mit Hilfe der ersten
Sequenz ein Primerpaar mit einem Vorwärtsprimer auf Chromosom 10q24.3 und
einem Rückwärtsprimer auf Chromosom 11q23.3 entwickelt. Die PCR-Amplifizierung
und anschließende Sequenzierung ergab identische Bruchpunktregionen auf den
Chromsomen 10 und 11, ohne DNA-Verlust (Abb 5.5 C). Die bioinformatische
58
Ergebnisse
Analyse der Fusionsequenzen (BioEdit) ergab keinen Hinweis auf ein funktionelles
Fusionsprotein.
Um die Auswirkungen des Bruches im Intron 10 von PDZD7 auf die Aktivität des
Gens einschätzen zu können, wurden zunächst die (translatierten) Isoformen
untersucht. Von diesen gibt es 4 Stück mit 2114 (264), 1758 (512), 2032 (517) und
624 (208) Basenpaaren Länge (Aminosäurenanzahl der Peptide in Klammern
angegeben). Das Gen ist 23,3kb lang und hat 16 Exons. Da die vier verschiedenen
Isoformen unterschiedliche Exons benutzen, intronische Sequenz exonisieren und
auch umgekehrt, wurde die Namensgebung der Introns und Exons aus Gründen der
Übersichtlichkeit nach der genomischen Sequenz (ergo Exons 1-16) und nicht
transkriptbezogen, bestimmt. Eine Übersicht liefert Abb. 5.6. Zuzüglich zu den zum
damaligen Zeitpunkt analysierten Transkripten sind laut aktueller Ensembl-Version
(release 57, march 2010) noch drei weitere sogenannte „prozessierte Transkripte“
gekommen. Diese werden allerdings nicht translatiert, so dass man weiterhin von
vier aus PDZD7 abgeleiteten Proteinen ausgehen darf.
Durch den Bruch in Intron 10 sind zwei der vier Transkripte betroffen, PDZD7-202
und PDZD7-203. In PDZD7-202 geht der Bruch direkt durch den ORF, allerdings
besitzt dieses Transkript keine PDZ Domänen welche für Interaktionen mit
bestimmten Gruppen anderer Hörstörungsgene von großer Bedeutung sind. Diese
wiederum ist in PDZD7-203 zu finden, allerdings hier nicht direkt durch den Bruch
betroffen, denn dieser verläuft durch den untranslatierten Teil des Transkriptes.
Dennoch kann sich ein Zerreißen des UTR negativ auf die Translation auswirken.
Paraloge des Gens PDZD7, also Gene mit sehr ähnlichen Struktureigenschaften,
sind DFNB31 und USH1C auch Whirlin und Harmonin genannt (Ensembl database).
Mutationen dieser Gene verursachen das Usher-Syndrom, eine Erkrankung die zu
Hörstörungen und Erblindung führt. Sequenzvergeiche zwischen den PDZ-Domänen
1 und 2 der Usher-Proteine Whirlin und Harmonin und der Peptide von PDZD7-203
(Abb. 5.8 A) sowie ENSP00000238965 (Abb. 5.8 B) zeigen eine große Homologie.
Datenbankanalysen
zeigten,
dass
PDZD7
im
murinen
Innenohr
(NCBI/UniGene/ESTProfileViewer) und auch in vielen anderen Geweben, unter
anderem in Gehirn von Mensch und Maus, exprimiert wird. Um dies an
menschlichem Innenohrgewebe und als Positivkontrolle Gehirn zu überprüfen, wurde
ein alle vier Transkripte detektierendes, exonspannendes Primerpaar konstruiert.
59
Ergebnisse
Abb. 5.6 PDZD7 Isoformen. (A) Exon/Intron-Struktur des Gens PDZD7. Exons erscheinen als
Röhren und sind teilweise nummeriert. Introns sind als Verbindungslinien zwischen den Exons
dargestellt. (B) Exons der Transkripte als Röhren dargestellt; die grüne Schattierung verweist auf den
Open Reading Frame (ORF), also den translatierten Teil des Transkriptes, graue Schattierung auf den
untranslatierten Teil (UTR). Die Peptidstruktur ist als dünne Röhre unter dem Transkript dargestellt.
Bei Transkript PDZD7-202 ist durch den Bruch der ORF zerrissen, bei Transkript PDZD7-203 der
UTR. Die Transkripte RP11-108L7.9-003 und PDZD7-201 sind durch den Bruch nicht betroffen.
Bedeutsam für die spezifische Funktion von PDZD7 sind vor allem die PDZ-Domänen (blau
schattiert).
Das Amplifikat war 298bp groß, GAPDH und ACTB dienten als Kontrollgene.
Während PDZD7-Transkripte in Gehirn eindeutig identifiziert werden konnten, zeigte
sich im Innenohr nur eine schwache Expression (Abb. 5.7) Da allerdings GesamtInnenohrgewebe verwendet wurde ist eine hohe Expression in einigen wenigen
spezialisierten
Geweben
des
Innenohres,
am
ehesten
der
Haarzellen,
wahrscheinlicher. Ein Vergleich mit der Maus zeigt, das dass murine Pdzd7Transkript NM 177605.3, welches die größte Homologie zum humanen PDZD7-203
aufweist (im Indexpatienten zerstört) in Retina und Innenohr exprimiert wird. Diese
Tatsache und die Paralogien zu den Usher-Proteinen führte zu einer Überprüfung
60
Ergebnisse
Abb. 5.7 Expression von PDZD7 im humanen Innenohr. (A) Gezeigt sind die vier bekannten
translatierten Transkripte des Gens PDZD7. Es wurde ein exonspannendes Primerpaar gewählt das
alle vier Transkripte detektieren konnte und ein Amplifikat von 298bp generierte. (B) Im linken Panel
(Innenohr) ist das relativ schwache Amplifikat eingekreist (schwarzer Pfeil). Weiter oben ist als starke
Bande das 822bp große genomische Produkt zu sehen. Im rechten Panel (Gehirn) ist hingegen nur
eine schwache genomische Kontamination zu sehen dafür eine starke Expression bei 298bp. (C) Um
die 298bp Bande zur Kontrolle sequenzieren zu können, wurde die Bande ausgeschnitten und
reamplifiziert (linkes Panel; zum Vergleich im rechten Panel Gehirn). (D) Die anschließende
Sequenzierung zeigte eindeutig die Transkriptsequenz (Seq3 und 4 und Chromatogramm). Als
Kontrolle in Reihe 1 die Referenzsequenz aus Ensembl. Die beiden verschiedenen Exons (6 und 7)
sind in Reihe 4 und 5 gezeigt.
der möglichen Interaktion von PDZD7 mit dem Usher-Proteinen SANS, einem Usher
Syndrom Typ 1-verursachenden Gerüstprotein. Diese Versuche wurde von einer
Kollaborationsgruppe der Uni Mainz durchgeführt (AG Wolfrum). Es wurden
rekombinant exprimierte Proteindomänen von SANS und PDZD7 in Gluthation STransferase (GST) Pulldown-Assays verwendet.
61
Ergebnisse
Abb. 5.8 Aminosäurenhomologien. (A) Vergleich der beiden PDZ-Domänen enthaltenden Peptide
P1 (aus Transkript RP11-108L7.9-003) und (B) P4 (aus Transkript PDZD7-203) mit den „UsherSyndrom-Proteinen“ Whirlin und Harmonin. Die Pfeile geben die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz
in Prozentpunkten an.
Immobilisiertes GST-markiertes, also gekennzeichnetes, PDZD7 („Köder“-) Protein
konnte mit FLAG markiertes („Beute“-) SANS „einfangen“, welches aus HEK293T
Zell-Lysat gewonnen wurde. Auf einem Western-Blot mit anti-FLAG konnte dann eine
~57kDa große Bande identifiziert werden, die auf eine direkte Interaktion von PDZD7
62
Ergebnisse
und SANS hinwies. Um eine Einbindung von PDZD7 in das Usher Protein- Netzwerk
der Retina nachzuweisen wurde ein ähnlicher Ansatz mit Zelllysaten der Mausretina
und anti-Harmonin geprobten Western-Blots gefahren. Die Quantifizierung der
entsprechenden Banden ergab die vierfache Menge an gebundenem Harmonin im
Vergleich zur Leerprobe (nur GST). Diese Ergebnisse legen PDZD7 als weiteren
Interaktionspartner des Usher Syndrom Protein-Netzwerkes nahe.
5.2 Identifizierung und Charakterisierung von genetischen und epigenetischen
Hörstörungsmechanismen
5.2.1 Screening des Kandidatengens PDZD7
Als weitere Evidenz für PDZD7 als Hörstörungsgen würde ein zusätzlicher Patient
mit einer Mutation in diesem Gen dienen. Daher wurde ein Sequenzierungsassay
entwickelt und 135 Patienten mit sensorineuralen Hörstörungen unbekannter
Ursache gescreent. Die Patienten, oder richtiger die DNA der Patienten, stammte
aus dem institutsinternen Pool. Die Primer für die PCR-Amplifikationen wurden so
entworfen, dass alle Exons und Spliceseiten sequenziert werden konnten
(Primertabelle). Da manche Exons zu groß für eine Sequenzierreaktion waren,
wurden diese in mehrere überlappende Einheiten unterteilt. Daher liegt die Anzahl
der Sequenzen pro Patient über jener der genomischen Exons. Alle Vorarbeiten wie
PCR-Amplifikation, Gelkontrolle, Verdau und Fertigstellung der Sequenzierproben
(Amplifikat + Primer) wurden selbst erledigt, die Sequenzierreaktion hingegen von
der Firma Genterprise (Mainz, Deutschland) durchgeführt. Aus finanziellen Gründen
wurde nur in eine Richtung sequenziert. Die meisten gefundenen Polymorphismen
wurden zur Validierung noch einmal nachgearbeitet. Die erhaltenen Daten wurden
mit Hilfe von Datenbanken (Ensembl, NCBI, UCSC) und Softwaretools (BioEdit,
Mutation Surveyor, GenSearch, PolyPhen) ausgewertet. Insgesamt wurden (1) bei
15 Patienten 14 verschiedene Einzelnukleotid- Polymorphismen (SNPs) detektiert
(Tab. 5.2), allerdings (2) kein weiterer Patient mit einer
63
Ergebnisse
Tab. 5.2 Polymorphismen in Transkript PDZD7_human. Insgesamt wurden unter 135 Patienten
105 Polymorphismen gefunden davon in Transkript PDZD7_human die hier gezeigten 14
verschiedenen Polymorphismen bei 15 Patienten. Die niedrige Zahl ist nicht unerwartet, da in diesem
Transkript nur 2 SNP’s bekannt sind und diese eine sehr niedriger Frequenz haben (unter 15%).
homozygoten Mutation gefunden und (3) ein bis dato (2008) nicht beschriebener
Polymorphismus in Exon 14 bei einem Großteil (n=90) der Patienten entdeckt (Abb.
5.9). Es wurden 3 Transkripte (PDZD7_human, Q5JW17 und Q9H7Q6) untersucht,
die alle einen ORF besaßen, validiert waren (in der Ensembl Datenbank) und alle 16
Exons
von
PDZD7
abdeckten.
Bei
den
entdeckten
14
verschiedenen
Polymorphismen in 15 Patienten handelt es sich ausschließlich um bislang nicht
gelistete SNPs, die ohne Ausnahme nur auf einem Allel, also heterozygot vorkamen.
Von
allen
14
SNPs
waren
8
nicht-synonym,
also
führten
zu
einer
Aminosäurenveränderung, 6 SNPs waren synonym, d.h. ohne Aminosäureänderung.
64
Ergebnisse
Abb. 5.9 Sequenzpolymorphismus. Die grau unterlegten und mit Pfeil gekennzeichneten Stellen
markieren den Polymorphismus in Exon 14 (Transkript Q9H7Q6; aa 138/139) von PDZD7. (A) DNAAlignment. In der ersten Reihe (Mensch) ist der Wildtyp zu sehen, darunter ein Individuum mit der
Insertion. Es folgen Craig Venter, der heterozygot für den Polymorphismus ist. Die folgenden Primaten
und Maus sind in phylogenetischer Folge absteigend angeordnet. Diese zeigen kein erkennbares
phylogenetisches Muster bezüglich der Repeatlänge des Polymorphismus. (B) AminosäurenAlignment, gleich angeordnet wie unter A. (C) Im oberen Panel ist die Allelverteilung der untersuchten
Patienten zu sehen im unteren die Allelfrequenz. Eine Allelverteilung/-frequenz im Hardy/WeinbergGleichgewicht würde 0,25/0,5/0,25 bzw. 0,5/0,5 aufweisen.
Der neu entdeckte Polymorphismus in Exon 14 ist eine Insertion von 6 Nukleotiden
(CGCAGC) die für die Aminosäuren Arginin und Alanin kodierten (Transkript
Q9H7Q6, Aminosäuren- Position: 138/139) und sich in einem Arginin/Alanin-Repeat
befanden. Insgesamt wurde dieser Polymorphismus in 90 Patienten, homozygot oder
heterozygot, gefunden. Interessant ist die Tatsache dass die Insertion dem Wildtyp
einiger Primaten entspricht (Schimpanse, Orang Utan). Andere Primaten wiederum
65
Ergebnisse
zeigen
weniger
Repeats
als
der
humane
Wildtyp
(Gorilla,
Rhesusaffe,
Weißbüschelaffe).
5.2.2 Screening der Connexine CX30 (GJB6), CX30.3 (GJB4) und CX43 (GJA1)
Um
die
Diagnostik
für
Hörstörungen
am
Institut
für
Humangenetik
der
Universitätsmedizin Mainz zu erweitern wurden im Rahmen dieser Arbeit
Sequenzierungsassays
für
3
Connexin-Gene
und
ein
Connexin-Pseudogen
entwickelt. Die meisten Primerpaare für die Sequenzierungsassays wurden aus der
Literatur (Yang et al., 2007; López-Bigas et al., 2002) übernommen. Da allerdings
die Amplikons relativ groß und daher ungeeignet für eine Sequenzierung waren,
wurden diese weiter unterteilt und dafür entsprechende Primerpaare konstruiert
(Primer3, BioEdit). Alle Primer wurden zusätzlich mit m13-Tags (vor- und rückwärts)
versehen
und
HPLC-gereinigt.
Es
ist
aus
zwei
Gründen
von
Vorteil,
Sequenzierprimer mit m13-Tags zu versehen: (1) können so beliebig viele
verschiedene Sequenzierungen nur mit einem Primerpaar durchgeführt werden und
(2) wird die Sequenzqualität erhöht und der Hintergrund minimiert, da die Firma
Beckman, deren Produkte Verwendung fanden, den Sequenzierungsmastermix auf
m13-Primer optimiert hat. So konnte eine robuste, dem diagnostischen Standard
entsprechende, Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierung von Fragmenten, nicht
größer als maximal 650bp, gewährleistet werden. Bei der Etablierung der Assays für
CX43 und pCX43 wurde festgestellt, dass die PCR-Assays dieser beiden Gene und
die Interpretation der daraus im Folgenden generierten Daten der Publikation von
Yang
et
al.
(2007) mit
größter Wahrscheinlichkeit
fehlerhaft
waren.
Die
Sequenzierung des Pseudogens pCX43 wurde daher verworfen, während für das
CX43-Gen aus den o.g. Gründen ein neuer Sequenzierungs-Assay designt wurde.
Dabei wurde unter Ausnutzung der Sequenzunterschiede zum Pseudogen darauf
geachtet, dass diese immer am 3’-Ende der Primer zu liegen kamen, um die Bindung
an die CX43-Sequenz möglichst spezifisch zu halten. Bei der Analyse der erhaltenen
Sequenzen wurde dennoch immer die Pseudogensequenz mit-aligniert, um jede
Falschamplifikation auszuschließen. Die Assays, die letztendlich zur Anwendung
kamen, waren für die Connexine CX30 (GJB6), CX30.3 (GJB4) und CX43 (GJA1).
Bislang wurden im Rahmen der Routinediagnostik 26 Patienten, die heterozygot für
66
Ergebnisse
GJB2-Mutationen waren, mit diesen Connexin-Assays untersucht, davon 21
Patienten ohne Befund. Bei 5 Patienten wurden Sequenzveränderungen in CX30.3
(n=4) und CX43 (n=1) detektiert, CX30 war in keinem Patienten verändert. In CX30.3
wurden je zweimal die Veränderungen CX30.3 c154 del4/wt und die Veränderung
Cx30.3 c.507 C>G(C169W)/wt gefunden. Die Untersuchung des Gens CX43 zeigte
bei einem Patienten eine, bis dahin unbekannte Veränderung, CX43 c.962 G>T
(G321V)/wt.
5.2.3 Screening der Q829X- Mutation in OTOF
OTOF wird als eine der häufigsten genetischen Ursachen für prälinguale
Hörstörungen angesehen (Hilgert, 2009), allein die Mutation Q829X macht im
spanischen Kulturraum bis zu 4% aller genetisch bedingten Hörstörungen aus
(Migliosi, 2008). Das OTOF-Gen ist mit 48 Exons relativ groß, daher wurde
beschlossen, auf eine Sequenzierung des gesamten Gens zu verzichten und nur
nach der Mutation Q829X zu suchen. Aus Kosten- und Zeitgründen wurde davon
abgesehen für eine einzige Position eine klassische Sanger-Sequenzierung
durchzuführen. Um unsere Patienten auf das Vorhandensein von C2485T (Q828X)
zu screenen, wurde ein Pyrosequencing SNP-Assay generiert. Die PyrosequencingMethode ist hypothesenbasiert im Gegensatz zur hypothesenfreien Sanger-Methode.
Die zu untersuchende Sequenz wird dem Gerät vorgegeben. Dann versucht das
Gerät die Nukleotide nach der vorgegebenen Sequenz einzubauen. Der erfolgreiche
Einbau eines Nukleotids kann dann in Echtzeit am Gerät verfolgt werden. Mit der
Pyrosequencing-Methode ist es möglich, viele Proben in kurzer Zeit und relativ
kostengünstig zu analysieren. Allerdings besteht eine weitere Limitation darin, das
die Sequenzabschnitte, die zuverlässig sequenziert werden können, nur sehr kurz
sind, d.h. nicht über 50-60 nt Länge. Für die Untersuchung eines SNPs hingegen ist
die Pyrosequenzierung sehr gut geeignet. Das Design des Assays wurde auf Basis
der humanen Referenzsequenz (NCBI 36) mit der geräteeigenen Software des
Pyrosequenzierers ausgearbeitet. Dazu musste ein PCR- Primerpaar mit einem
biotynilierten Primer und ein Sequenzierprimer
67
Ergebnisse
Abb. 5.10. Pyrosequencing der OTOF-Mutation Q829X. (A) Die Agarosegel-Kontrolle der PCR
Produkte zeigt starke Banden ohne Nebenprodukte, eine Grundbedingung des Pyrosequencing
Protokolls. (B) Screenshot der Ergebnisausgabe des Pyrosequenzierers. Der blaue Pfeil weist auf die
Ergebnisse der Sequenzierung hin (blauer Kasten). Wenn diese technisch einwandfrei sind, werden
sie blau unterlegt, sonst gelb oder rot. In diesem Fall sind die Ergebnisse gut (blau), die Nullkontrolle
erwartungsgemäß rot. Das untere Panel zeigt das Pyrogramm der Sequenzierung eines Patienten.
Der gestrichelte Pfeil weist auf die gelbe Schattierung hin die den Zielbereich mit den Nukleotiden C
und T markiert. Da kein T sondern zwei C’s detektiert wurden, ist der C-Peak doppelt so hoch wie bei
nur einem C. An der Stelle des T’s ist kein Peak zu sehen (schwarzer Pfeil).
entworfen werden (Primertabelle). Nach der Etablierung des Assays wurden 15
Patienten ausgewählt die (1) bislang in allen humangenetischen Untersuchungen
keinerlei ursächliche Mutationen zeigten und die (2) südeuropäisch klingende Namen
hatten, letzteres um die Wahrscheinlichkeit eines Positivtreffers zu erhöhen (Studie
68
Ergebnisse
Migliosi, 2008). Eine zusätzliche Verbesserung der Effektivität wäre es gewesen,
Patienten mit auditorischer Neuropathie zu berücksichtigen (Rodriguez-Ballesteros et
al., 2003). Die Durchführung der Sequenzierung (Abb. 5.10) ergab, das keiner der 15
Patienten eine Mutation C2485T (Q828X) zeigte (Tab. 5.3).
Tab. 5.3 Ergebnisse Mutationsscreening C2485T (Q828X) Keiner der 15 Patienten zeigte eine
Mutation (Spalte „found haplotype“) der Position C2485T in OTOF; der detektierte Haplotyp war in
allen Fällen C/C.
5.2.4 Screening des Gly38Ser-Polymorphismus des KCNE1-Gens
Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Institut für Anthropologie der Universität
Mainz wurde eine Publikation über den Gly38Ser- Polymorphismus des KCNE1Gens veröffentlicht (Herlyn, 2009). KCNE1 kodiert für die regulatorische BetaUntereinheit eines Kaliumkanals. Bestimmte Haplotypen von KCNE1 wurden mit
verschiedenen Krankheiten, darunter auch Hörstörungen assoziiert. Um zu
69
Ergebnisse
überprüfen, ob unsere Hörstörungspatienten für den Gly38Ser- Polymorphismus eine
vom Durchschnitt der europiden Bevölkerung abweichende Haplotypenverteilung
haben, wurden mit dem in der Publikation verwendeten Pyroassay (Primertabelle)
109 Patienten für den Gly38Ser- Polymorphismus überprüft. Eine vom Durchschnitt
abweichende Frequenz würde darauf hinweisen, dass der Polymorphismus die
Hörfähigkeit beeinflusst.
Abb. 5.11 Verteilung des Gly38Ser Polymorphismus. (A) Allelverteilung. Im oberen Panel ist der
Durchschnitt der europiden Bevölkerung dargestellt (CEU/HapMap-Projekt). Darunter die Verteilung
von 103 Hörstörungspatienten. Zwischen den beiden Verteilungen bestehen nur marginale
Unterschiede die keinen Schluss auf eine möglicherweise nachteilige Verschiebung zu Ungunsten der
Hörstörungspatienten hinweisen. (B) Allelfrequenz. Auch hier ist eine ähnliche Verteilung beider Pools
zu beobachten. Ein unterschiedlicher selektiver Druck ist nicht zu beobachten.
In beiden Populationen, also in der europiden Durschnittsbevölkerung und den
Hörstörungspatienten ist eine sehr ähnliche Allelverteilung und -frequenz zu
beobachten (Abb. 5.11). Daraus kann kein Erklärungsmodell für das Überwiegen
eines ungünstigeren Genotyps im Patientenpool abgeleitet werden.
70
Ergebnisse
5.2.5 Screening der Deletion [del(chr13:19,837,344-19,968,698)]
Eine U.S.-amerikanische Arbeitsgruppe um Ellen Wilch von der Michigan State
University (USA) identifizierte eine 131,4kb große Deletion stromabwärts der
Transkriptionsstartseiten von GJB2 und GJB6, die in einer im 19. Jhd. emigrierten,
katholischen deutschstämmigen Familie mit Hörstörungen segregiert (Wilch et al.,
2010). Die Gründerväter der untersuchten Familie stammen ursprünglich aus der
Eifel (persönliche Kommunikation, E. Wilch). Daher wurden im Rahmen einer
Kooperation mit der Wilch-Gruppe 31 Patienten mit monolallelischen GJB2/GJB6Mutationen mit dem von Wilch et al. verwendeten PCR-Assay (Primertabelle) und
einer mitgelieferten Positivkontrolle untersucht (Abb. 5.12).
Abb. 5.12 Deletions-Multiplex assay. (A) Zur Veranschaulichung ist hier der Multiplex als Singleplex
gezeigt. Patienten-DNA aus unserem Pool (39/03) und die Positivkontrolle (rote Schrift) wurden mit je
den internen (836bp) und den externen Primern (628bp) amplifiziert. Die Positivkontrolle zeigt wie zu
erwarten beide Banden, wohingegen unser Patient nur die interne Bande zeigt. (B) Vergleich der
Multiplex PCR mit 6 Patienten und der Positivkontrolle. Keiner der Patienten weist die 628bp Bande
auf (roter Pfeil) welche die „Wilch-Deletion“ zeigen würde.
Dazu wurde ein 2-Produkt Multiplex-Ansatz verwendet. Zwei Primer flankierten den
Deletions- Bruchpunkt und amplifizierten ein 628bp großes Stück der genomischen
DNA, zwei weitere Primer amplifizierten ein 836bp großes Stück innerhalb der
Deletion. In dem Patientenpool waren 23 Deutsche, davon nur einer aus der Eifel
stammend und 8 Nicht-Deutschstämmige (5 Türken, 2 Marrokaner, 1 Spanier). Da
jedoch die Suche nach weiteren Betroffenen von Wilch et al. international
71
Ergebnisse
ausgedehnt wurde, wurden auch die Nicht- Deutschstämmigen mit untersucht.
Insgesamt wurden weltweit 528 Personen mit monolallelischen GJB2/GJB6Mutationen gescreent, allerdings ohne eine weitere Deletion in der Zielregion zu
entdecken (Wilch et al., 2010).
5.2.6 Screening nach Epimutationen des GJB2-Promoters
GJB2-Mutationen auf nur einem Allel sind nach gängiger Ansicht nur dann
mitverantwortlich für eine genetisch bedingte Hörstörung, wenn eine zweite Mutation,
zum Beispiel eine Deletion des benachbarten GJB6-Gens, sich mit der ersten
Mutation addiert.
Abb. 5.13 Pyrosequencing-Assay GJB2 Promoter-Methylierung. (A) Die oval eingekreisten GCBoxen wurden von Tu und Kiang (1998) als essentielle Transkriptionsfaktoren- Bindungsstellen
postuliert. (B) 5 CpG-Positionen der unter A) gezeigten GC-Boxen (gelb unterlegt) wurden in das
Pyroassay integriert. Das Alignment zeigt oben die humane Originalsequenz, in der Mitte die
konvertierte und PCR-amplifizierte Sequenz. Unten ist die sequenzierte, im Pyrosequencer als
„sequence to analyze“ bezeichnete Sequenz zu sehen.
Als weitere, bis dato nicht untersuchte pathogene Mechanismen, könnten
epigenetische Effekte verantwortlich sein. Denkbar sind Mutationen in der
72
Ergebnisse
Methylierung der Promoterbindungsstellen von GJB2, welche die Expression dieses
Gens auf einem oder gar beiden Allelen beeinflussen könnten. Die 21
Hörstörungspatienten welche für die Untersuchung ausgewählt wurden, waren alle
GJB2-Heterozygot (für verschiedene Mutationen) und ohne jeden weiteren
molekularbiologischen Befund.
Um die Methylierung der Promoterregion an Blut-DNA von GJB2-Heterozygoten
Patienten zu überprüfen, wurde ein Pyrosequencing-Assay über zwei von Tu und
Kiang (1998) als essentiell deklarierte GC-Boxen etabliert (Abb. 5.13). Unser Assay
konnte beide GC-Boxen berücksichtigen und analysierte die Methylierung an 5
benachbarten CpG-Positionen. Insgesamt wurden alle 21 Patienten und eine
gesunde Kontrolle gemessen. Die Ergebnisse (Abb. 5.14 C) zeigten bei allen
Patienten eine durchschnittliche Methylierung von 6,2% (Median) mit einer
Standardabweichung von 1,4%. Die Normalkontrolle zeigte 5,4 % Methylierung und
war damit ebenfalls im Bereich des Patientendurchschnitts (nicht gezeigt). Es ist
bekannt, dass CpG-sites nicht immer gleichstark methyliert sind und dass offenbar
Positionseffekte benachbarte Sites beeinflussen, ja das es sogar möglich ist, anhand
der Methylierungsmuster verschiedene Gewebetypen vorherzusagen (Schneider et
al., 2010). Dieses Phänomen war auch hier zu sehen, da die Methylierung der
unterschiedlichen CpG-sites einem bestimmten Muster folgte. Die zweite CpG-site
zeigte dabei die höchste (∅ 11,44%), die dritte CpG-site die niedrigste Methylierung
(∅ 1,44%) (Abb. 5.14 A). Das gleiche Muster war auch bei der mitgeführten
Normalkontrolle zu beobachten (Abb. 5.14 B).
73
Ergebnisse
Abb. 5.14 Ergebnisse GJB2 Promoter- Methylierung. (A) Dargestellt sind die Durchschnittswerte
für alle 21 Patienten für jede einzelne untersuchte CpG-site. Die vertikalen Linien auf den Balken
stellen die Standardabweichungen dar. (B) Die Methylierungswerte für die einzelnen CpG-Sites der
Kontrolle (durchschnittliche Methylierung: 5,4%). (C) Tabellarischer Überblick. Alle untersuchten
Patienten (n=21) sind GJB2-heterozygot und haben keine weiteren bekannten genetischen
Mutationen
die
zu
Hörstörungen
führen.
In
der
rechten
Spalte
sind
die
Durchschnittsmethylierungwerte, über alle 5 CpG’s gerechnet, angegeben. Der Medianwert liegt bei
6,2% durchschnittlicher Merthylierung mit einer Standardabweichung von 1,4%. Damit entspricht die
Patientengruppe der Erwartung (Hypomethylierung) wie auch die mitgeführte Kontrolle (5,4 %
Promotermethylierung).
5.2.7 Zusammenfassung der Daten
Um einen abschließenden Überblick aller durchgeführten Untersuchungen zu
gewinnen, wurden alle Daten in die Patientenliste eingepflegt (Tab. 5.4). Zusätzlich
zu den Daten der beschriebenen Screenings wurden noch zwei weitere
Untersuchungen mit berücksichtigt: (1) ein Deletionsscreening des Gens CECR6
74
Ergebnisse
(Damatova et al., 2009) und (2) ein Copy number variation (CNV)-Screening der
Region 13q12 (Schmitt, B; nicht publizierte Daten).
CECR6 wurde als Kandidatengen für Schallleitungsschwerhörigkeit mit der Multiplex
Ligation-dependent
Probe
Amplification
(MLPA)-Methode
bei
126
Patienten
untersucht. Dabei sollte festgestellt werden ob bei den Patienten, im Vergleich zu 26
normalhörenden Kontrollpersonen, Abweichungen in der Gendosis des CNCR6Gens, sogenannte „Copy number variations“ (CNV), zu beobachten waren. Diese
Hypothese gründete auf der Haploinsuffizienz der entsprechenden Region auf
22pter-q11.21 einer Patientin mit Schallleitungsschwerhörigkeit.
Nach CNVs, die eventuell bedeutende Positionen in cis für die Regulierung des
GJB2-Gens betreffen, wurde in der Untersuchung von Schmitt gesucht. Dazu wurde
ein qPCR-basiertes Verfahren gewählt um CNVs in 5 verschiedenen Zielbereichen,
in einer 300 Kb großen Region auf 13q12 zwischen den Genen GJB6 und CRYL1, in
einem Kollektiv von GJB2-heterozygoten Patienten zu detektieren. Dosisvariationen,
die ausschließlich bei den GJB2-Heterozygoten und nicht bei einer Kontrollgruppe
auftauchten, konnten als Kandidatenregionen von cis-regulatorischer Bedeutung für
das GJB2- Gen gelten.
Nach Abzug von 47 Patienten mit syndromalen oder vermuteten syndromalen
Hörstörungen und/oder chromosomalen Auffälligkeiten konnten abschließend 487
Patienten ausgewertet werden. Zu den 84 bereits sicher bestimmten pathogenen
Befunden aus der Routinediagnostik konnten 11 weitere Patienten mit mindestens 2
Mutationen in verschiedenen Genen identifiziert werden, die nur für sich genommen
den Phänotyp nicht erklären konnten. In diesen 11 Fällen hatten 9 Patienten zwei
Mutationen und 2 Patienten drei Mutationen (Tab. 5.5). Bis auf einen Fall war bei
allen Patienten eine heterozygote GJB2-Mutation vorhanden, eine Verzerrung, die in
der Auswahlstrategie begründet war, da in der Regel GJB2-Heterozygote für
weiterführende Studien ausgewählt wurden. Die drei eingangs erwähnten Patienten
mit digenischen GJB2/GJB6-Mutation sind der Vollständigkeit halber mitgelistet. Bei
drei weiteren Patienten wurde zusätzlich zur GJB2 Mutation eine heterozygote
Mutation in CX30.3 gefunden, ein Patient davon noch mit einer heterozygoten
synonymen PDZD7-Mutation 797C>T (PDZD7_human). Ein Patient hatte außer der
GJB2-Mutation eine heterozygote CX43-Mutation.
75
Ergebnisse
Tab. 5.4 Übersicht Hörstörungspatienten. Gelistet sind alle diagnostische Untersuchungen und
Screenings
des
Institutes
für
Humangenetik
der
Universitätsmedizin
Mainz
an
487
Hörstörungspatienten im Zeitraum 2002 – 2009. Die Angaben der Routinediagnostik wurden durch die
eigenen Untersuchungen ergänzt. Zuzüglich wurden der Vollständigkeit halber die Untersuchungen
von Damatova et al. (CECR6) und Schmitt (CNV 13q12) implementiert. In der Spalte „Untersucht“ sind
alle für jedes Gen untersuchten Personen gelistet, unter „Gefunden“ diejenigen mit einer Mutation
bzw. einem Polymorphismus. „Anteil“ gibt den Prozentanteil der Gefundenen an den Untersuchten an.
Tab. 5.5 Auswertung NSHL-Patienten (n=487. Aus 487 Patienten wurden 14 Fälle gerastert, die
mindestens 2 Mutationen aufwiesen die jede für sich genommen den Phänotyp nicht erklären konnte.
Der Vollständigkeit halber sind die 3 bereits genannten GJB2/GJB6-compound Heterozygoten (Fälle
1, 2 und 3) mit aufgeführt. Alle anderen Patienten, die entweder (1) keine Auffälligkeiten hatten oder
die (2) eine homozygote GJB2-Mutation aufwiesen, wurden herausgerastert. GJB2- und GJB6Untersuchungen gehörten zur Routinediagnostik deren Ergebnisse die Basis für alle weiteren
Entscheidungen
in
Richtung
Neu-Implementation
von
Diagnoseverfahren
bildeten.
Die
Untersuchungen von CECR6 und CNV 13q12 wurden von Damatova et al. (2009) und Schmitt (nicht
publiziert) durchgeführt.
76
Ergebnisse
6 Patienten hatten außer einer GJB2-Mutation CNV’s (5 gains, 1 loss) in einer
proximal der Gene GJB2 und GJB6 gelegenen Region auf 13q12. Ein Patient hatte
eine heterozygote SLC26A4-Mutation und eine Deletion des CECR6-Gens auf Chr.
22.
77
Diskussion
6. Diskussion
Der Wissenszuwachs den die Molekularbiologie und speziell die Genetik/Epigenetik
in den letzten zwei Dekaden der Medizin beschert hat, kann ohne Zweifel als
revolutionär gelten. Das erweiterte Verständnis komplexer biologischer Vorgänge hat
aber nicht nur wissenschaftliche Neugier befriedigt, sondern auch konkret Nutzen für
den
Patienten
gebracht.
Vor
allem
im
diagnostischen
Bereich
ist
die
Molekulargenetik nicht mehr aus der klinischen Routine wegzudenken. In der
Therapie ist bislang noch vergleichsweise wenig angekommen, was aber nicht
unerwartet ist, wenn man die Entwicklungszeiten „klassischer“ therapeutischer und
pharmakologischer Ansätze bedenkt (Doyle et al., 1964). In der Erforschung
genetisch bedingter nichtsyndromaler sensorineuraler Hörstörungen wurden sehr
große Fortschritte gemacht, so sind 46 Gene auf den bisher 128 bekannten
Hörstörungs-Genloci gefunden worden (Hilgert et al., 2009). Aus den genannten
Zahlen geht allerdings auch hervor, dass damit erst schätzungsweise ein gutes
Drittel möglicher Hörstörungsgene bekannt ist. Da Hörstörungsgene außerdem sehr
heterogen sind, ist die weitere intensive Erforschung neuer Gene und vor allem auch
der biologischen Funktionen und „Pathways“, von großer Bedeutung für Diagnostik
und Therapie. In der Zukunft kann dadurch die Behandlungsqualität und der
Behandlungserfolg bei Patienten mit genetisch bedingten Hörstörungen stark
verbessert werden.
6.1 Auswertung der Patientendaten aus der Routinediagnostik
Alle Arbeiten bauten auf den Daten des Hörstörungspatientenpools des Institutes für
Humangenetik der Universitätsmedizin Mainz auf. Die in der Literatur genannten
Zahlen konnten mit der Auswertung der vorhandenen Daten weitgehend bestätigt
werden. Von den insgesamt 534 Patienten die zur Auswertung kamen wurde bei den
nichtsyndromalen sensorineuralen Hörstörungen (n=487) eine homozygote oder
compound heterozygote GJB2- Mutation in 16,63% (n=81) der Fälle als ursächlich
erkannt. Dieser Wert entspricht den Erwartungen insofern, dass GJB2- Mutationen
die häufigste genetische Ursache für Hörstörungen sind (Tab. 6.1) (Hilgert et al.,
2009). Der Anteil der GJB2/GJB6- digenisch Heterozygoten lag mit 3 Fällen bei unter
einem Prozent. Für einen geringen Anteil aller 534 Patienten (0-3%) stehen
78
Diskussion
chromosomale Aberrationen in Verdacht pathogener Auswirkungen. Vor allem 2
Fälle mit chromosomalen Translokationen wurden für einen Kandidatengen-Ansatz
als geeignet angesehen. Davon wurde einer von beiden Fällen analysiert
(Kandidatengen: PDZD7). Von den Mutationen der mütterlich vererbten mtDNA wird
am häufigsten auf die Mutation 1555 A>G des 12S ribosomalen RNA-Gens getestet,
dessen Frequenz bei Hörstörungspatienten in etwa der von MYO7A entspricht,
einem Gen das zu autosomal dominanten und rezessiven, syndromalen und nicht
syndromalen Hörstörungen führen kann (Hilgert, 2009). Für viele Patienten kann das
Wissen um diese Mutation sehr wichtig sein, da Aminoglykoside (Antibiotika) wie
zum Beispiel Streptomycin bei 1555 A>G-Trägern zu Hörstörungen führen können
(Kokotas et al., 2007). Obwohl unter 58 Patienten kein einziger Fall positiv
diagnostiziert werden konnte, ist es sicher sinnvoll, auch in Zukunft weiter zu testen,
da man erstens bei etwa 1,2% kaukasoider Patienten mit einer 1555 A>G Mutation
rechnen
kann
(Hilgert
et
al.,
2009) und
daher bei 58 Patienten
nicht
notwendigerweise einen Fall erwarten konnte. Zweitens sind die Auswirkungen für
einen
Mutationsträger
Verhaltensmaßnahmen
schwerwiegend
minimiert
oder
und
gar
können
verhindert
durch
werden.
einfache
Lässt
man
chromosomale Aberrationen außer acht, kann man festhalten dass insgesamt für
16,5%
(n=88)
aller
534
mit
molekulargenetischer
Diagnostik
untersuchter
Hörstörungs-Patienten eine genetische Ursache gefunden werden konnte: 84 Fälle
mit einer homozygoten oder compound-heterozygoten GJB2-Mutation, 3 Fälle mit
einer GJB2/GJB6 digenischen Heterozygotie. Um diesen Quotient weiter nach oben
zu verschieben, d.h. die molekulargenetische Diagnostik leistungsfähiger zu machen,
wurden verschiedene Strategien verfolgt. Einerseits wurden neue Kandidatengene
im klassischen Sinne kloniert und andererseits sogenannte „Screening“-Methoden
angewandt, also Verfahren, mit denen an ausgesuchten Patientengruppen
systematisch Kandidatengene untersucht wurden.
6.2 Identifizierung und Charakterisierung von neuen Hörstörungsgenen
In der Vergangenheit wurden die meisten Gene, die eine Rolle bei Hörstörungen
spielten durch eine Kopplungsanalyse mit anschließender Klonierung entdeckt
(Kremer und Cremers, 2009). Eine Bestätigung als Hörstörungsgen ist damit
79
Diskussion
allerdings
nicht
unbedingt
gegeben.
Diese
erfordert
weitere
funktionelle
Untersuchungen in vitro und in vivo bis hin zu Knock-out Tiermodellen und/oder aber
die Identifizierung weiterer Patienten mit vergleichbarem Phäno- und Genotyp.
Kopplungsanalysen werden in westlichen Gesellschaften immer schwerer, da immer
kleiner werdende Familien, die zudem meist auch noch verstreut leben, eine solche
Analyse oft unmöglich machen. Unter den in Frage kommenden Patienten in
unserem Pool befand sich jedoch eine Familie die für eine Positionsklonierung in
Frage kam. Aus dem Stammbaum dieser Familie konnte man auf einen autosomal
rezessiven Erbgang schießen. Die Familie war konsanguin und der hörgestörte
Indexpatient hatte eine homozygote balancierte Translokation, was so gut wie nur bei
konsanguinen Familien vorkommt. Eine der neuesten Arbeiten berichtet von
Zwillingen eines konsanguinen Paares die eine homozygote Translokation tragen
(Beyazyurek et al., 2010). Die Autoren versuchten zu einem Überblick über die
Anzahl der bisher bekannten Fälle zu gelangen, kamen jedoch, unseren Patienten
mit eingeschlossen, auf weniger als 5 Fälle. Den uns vorliegenden Informationen
nach dürfte es bisher nur 7 weltweit beschriebene Fälle einer homozygoten
balancierten Translokation geben, inklusive unserem Patienten und den beiden
Patienten von Beyazyurek et al. (Leschot et al., 1986; Wilmot et al., 1990; Martinet et
al., 2006; Zaki et al., 2007; Schneider et al., 2009; Beyazyurek et al., 2010).
Homozygote balancierte Translokationen eignen sich gut um Bruchpunkte mit hoher
Auflösung zu kartieren, da Amplifikationen nicht durch ein gesundes Allel beeinflusst
werden. Und in der Tat konnten in unserem Indexpatienten die Bruchpunkte auf
Chromosom 10 und 11 exakt bestimmt werden. Der Bruchpunkt auf Chromosom 11
lag zwischen den Genen CADM1 und QSK in einer sogenannte „Genwüste“, also in
einer intergenischen und gen-armen Region. Der Bruchpunkt auf Chromosom 10 lag
im Intron 10 des Gens PDZD7. Für dieses Gen waren bis 03/2010 (PubMed –
Suche)keine weiteren Funktionen bekannt. Grundsätzlich war es nicht beweisend,
dass die chromosomale Aberration des Patienten den Phänotyp verursachte, aber es
war die wahrscheinlichste Ursache. Zumal die heterozygoten Eltern leichte
Hörstörungen hatten und man auf einen Dosiseffekt spekulieren konnte. Allerdings
waren die ebenfalls heterozygoten Geschwister normalhörig was insgesamt
betrachtet auf einen spät einsetzenden („late onset“) Krankheitsverlauf bei
Heterozygotie schließen lassen würde. Die Krankheitsursache lag also aller
Wahrscheinlichkeit entweder in dem Bruch in PDZD7 begründet und würde damit
80
Diskussion
dieses Gen als Hörstörungsgen postulieren. Der Chromosom 11-Bruchpunkt ging,
wie bereits beschrieben, nicht durch ein Gen. Auch wenn man zu Grunde legt dass
potentiell funktionelle, regulatorische Abschnitte durch den Bruch betroffen sein
könnten, oder dass Positionseffekte Auswirkungen auf andere Hörstörungsgene „in
der Nähe“ des Bruchs haben könnten, waren diese Möglichkeiten weniger
wahrscheinlich. Zumal die proximal gelegenen Hörstörungsgene auf Chromosom 11,
RDX und TECTA, mehr als 5 Mb entfernt waren und Positionseffekte über 1 Mb eher
unwahrscheinlich sind. Zusammengenommen legen unsere Untersuchungen an
PDZD7 nahe, das der biallelisch vorliegende Bruch und damit der zumindest partielle
Funktionsverlust des Gens, die wahrscheinlichste Ursache für die Hörstörung des
Patienten ist. Zu diesen Untersuchungen gehörten in silico-Analysen, funktionelle
Analysen und ein Patienten-Screening. Die Ergebnisse der in silico-Untersuchungen
wiesen PDZD7 als Paraloges zu Harmonin und Whirlin, zwei PDZ-Domänen
tragende, bekannte Hörstörungsgene, die sowohl autosomal-rezessive, syndromale
als auch nicht syndromale Hörstörungen verursachen können. PDZ-Domänen sind
Interaktionsstrukturen bestimmter Proteine, meist Gerüstproteine (Abb. 6.1). Eine
PDZ- Domäne besteht aus ca. 90 Aminosäuren und hat eine globuläre Form. An die
PDZ-Domäne kann ein anderes Protein mit einem PDZ Bindungsmotiv gebunden
werden. Diese Bindungsmotive liegen oft am C-Terminalen Ende des Proteins. Je
nach Spezifität bestimmter bindungsrelevanter Aminosäuren werden PDZ-Domänen
in drei verschiedene Klassen 1, 2 und 3 unterteilt. In den Proteinen Whirlin und
Harmonin sind alle drei PDZ-Domänen vorhanden. Aus der Sequenz von PDZD7
sind insgesamt 3 PDZ-Domänen translatierbar, allerdings sind nur die PDZDomänen Klasse 1 und 2 repräsentiert. Im Indexpatienten ist die genomische
Sequenz in Intron 10 zerrissen, dass heißt, wenn man Positionseffekte ausschließt,
dürfte nur das Transkript ENST00000238965 durch die Translokation betroffen sein.
Auch hier ist aber nur die untranslatierte Region (UTR) in 5’ betroffen, mit anderen
Worten die Proteinstruktur ist intakt. Da die UTR in 5’ (wie auch in 3’) für die korrekte
„Transkriptionsmechanik“ von Bedeutung ist, könnte die Synthese des PDZD7Proteins ENSP00000238965 im Indexpatient erheblich beeinträchtigt sein.
81
Diskussion
Abb. 6.1 PDZ-Domänenproteine Harmonin, Whirlin und PDZD7. (A) Abgebildet sind die
Proteinstrukturmodelle (http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/) von Harmonin, PDZD7 und Whirlin.
Jeweils
unter
den
Strukturen
sind
schematisch
die
PDZ-Domänen
dargestellt
(Prosite,
http://expasy.org/prosite/). Während PDZD7 nur die Domänen 1 und 2 besitzt, haben Harmonin und
Whirlin noch die Domäne PDZ3. Den verschiedenen PDZ-Domänen wird, trotz der großen Ähnlichkeit,
eine unterschiedliche Bindungsaffinität unterstellt. Piserchio et al. zeigten bei PSD95, dass PDZ1und
2 eher affin zu Kaliumkanalproteinen sind, wohingegen PDZ3 affin zu Strukturproteinen ist. (B) Die
molekulare Oberfäche einer Peptidbindungstasche einer PDZ1 Domäne (Im, 2003). Das gebundene
Protein
ist
als
Kugel-
und
Stabmodell
dargestellt.
Die
gestrichelten
Linien
stellen
Wassertstoffbindungen zwischen Ligand und PDZ Domäne dar. Die hydrophobischen Reste sind in
dunkelgrau, saure und basische respektive in rot und blau.
Ein Vergleich der Aminosäurenhomologie zwischen den PDZ-Domänen der PDZD7Proteine PDZD7-003 und ENSP00000238965 mit Whirlin, bzw. Harmonin konnte
eine große Ähnlichkeit der PDZ Domänen bestätigen (Abb. 5.8).
Whirlin und
Harmonin interagieren unter anderem im sogenannten Usher-Netzwerk, von dem
aktuell 10 Proteine bekannt sind (Bolz, 2009). Die meisten dieser Proteine befinden
sich in den Stereozilien und den synaptischen Regionen der Haarzellen, wo sie eine
Rolle für die Stereozilienentwicklung und Signalübertragung spielen (Reiners et al.,
82
Diskussion
2006; Kremer et al., 2006). Mutationen in einem oder mehreren dieser Proteine
können zum Usher- Syndrom führen, einer Erkrankung die Taub- und Blindheit mit
sich bringt. Dabei ist es für den Verlauf bzw. den Typ dieser Krankheit entscheidend,
welches Protein betroffen ist. Allerdings ist bei 20% der an Usher Erkrankten die
Pathologie nicht durch eine Mutation der Gene des Usher Netzwerks zu erklären
(Bolz, 2009). Diese Tatsache und die große Ähnlichkeit des in unserem Patient
zerrissenen Gens mit den Usher- Genen legte es nahe, das PDZD7 nicht nur ein
Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen, sondern auch für Usher-Syndrom
darstellt. Diese Auffassung erfuhr auch weitere Unterstützung durch die Tatsache,
dass die Expression von Pdzd7 in Mausinnenohr und Auge in der UniGeneDatenbank von NCBI gelistet war (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene/). Da für den
Menschen keine Datenbankeintragungen über die Expression von PDZD7 im
Innenohr zu finden waren, wurden eigene Untersuchungen durchgeführt. Das
präparierte Material war nicht weiter differenziertes Innenohrgewebe. Die Ergebnisse
zeigten eine schwache Expression von PDZD7 im menschlichen Innenohr. Da nicht
die einzelnen Strukturen, sondern das gesamte Innenohr untersucht wurde, kann es
sein, dass ein Maskierungseffekt vorliegt. Wenn zum Beispiel PDZD7 in einer
Mikrostruktur wie den Spitzen der Haarzellen stark exprimiert ist, dann würde das in
der Präparation mit den restlichen Innenohrstrukturen nur ein schwaches Signal
ergeben.
Es
lässt
sich
also
aus
den
Datenbankrecherchen
und
den
Expressionsanalysen nur festhalten, dass PDZD7 im Innenohr von Mäusen und
Menschen exprimiert wird. Die Kenntnisse über Strukturähnlichkeiten von PDZD7
mit Harmonin und Whirlin und die Expression aller drei Proteine im Innenohr wurden
gefolgt von funktionellen Analysen, die durch eine kollaborierende Arbeitsgruppe an
der Universität Mainz (AG Wolfrum) durchgeführt wurden. Damit wurde gezeigt, dass
PDZD7 mit Proteinen des Usher Netzwerkes interagiert. Durch den Einsatz von Pulldown Assays konnte eine direkte Interaktion mit Harmonin und SANS nachgewiesen
werden und damit wurde PDZD7 als Kandidat für ein weiteres Usher- Protein
erhärtet. Wir baten die Eltern des Patienten, der zu diesem Zeitpunkt 8 Jahre alt war,
eine ophtalmologische Untersuchung auf die für das Usher Syndrom typische
Retinitis
pigmentosa
an
ihrem
Sohn
durchführen
zu
lassen.
Diese
war
glücklicherweise unauffällig, wenn man natürlich auch nicht ausschließen kann, dass
eine solche Augenerkrankung später noch auftreten kann.
83
Diskussion
6.3 Patienten Screenings
6.3.1 PDZD7
Um weitere Evidenzen für PDZD7 als Hörstörungsgen zu finden wurde ein Screening
an 135 ausgewählten Hörstörungspatienten durchgeführt. Dazu wurden alle Exons
(n=16) inklusive der Splicingsites sequenziert. Aus Kostengründen wurde nur
unidirektional sequenziert. Fragwürdige aber potentiell interessante Positionen
wurden mit einem Beckman-Sequenzierer wiederholt. Insgesamt wurden 102
Polymorphismen gefunden, ein Wert der unter dem häufig kolportierten Durchschnitt
von 1/1000 lag aber nicht überraschte, da in der SNP-Referenzdatenbank nur 2
SNPs für das Transkript PDZD7_human und kein einziger SNP in Transkript
Q5JW17 gelistet waren. Die beiden SNPs in PDZD7_human hatten nur eine
Heterozygotenfrequenz
von
unter
0,5%.
In
Transkript
Q9H7Q6
waren
6
Polymorphismen gelistet, allerdings nur zwei mit einer Populationsfrequenzangabe,
davon nur einer mit einer Angabe für Europäer, die eine Heterozygotenfrequenz von
unter 15% zeigten. Die in Transkript PDZD7_human entdeckten 14 verschiedenen
Einzelnukleotid-Polymorphismen und die in Transkript Q9H7Q6 detektierten 90
InDel-Polymorphismen sind also vor diesem Hintergrund nicht unerwartet. Die 14
Polymorphismen in Transkript PDZD7_human waren zum Teil synonym, zum Teil
nicht-synonym, lagen aber alle heterozygot vor. Eine pathogene Funktion konnte
daher keinem SNP eindeutig zugeordnet werden. Eine aktuelle Publikation schreibt
PDZD7 eine verstärkende Wirkung bei Vorliegen bestimmter Usher-SyndromVarianten zu (Ebermann et al., 2010). Diese verstärkende Wirkung wurde
ausschließlich durch heterozygote Mutationen in PDZD7 ausgelöst. Aus diesem
Grunde wurden die aus unseren Experimenten hervorgegangenen Polymorphismen
(1) mit denen von Ebermann et al. abgelichen und (2) zusätzlich unter Zuhilfenahme
eines In silico-Vorhersage-tools (PolyPhen), nach der Wahrscheinlichkeit einer
pathogenen Auswirkung überprüft (Abb. 6.2).
PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) sagt, basierend auf Sequenz,
Phylogenie
und Struktur der Substitution,
die
mögliche
Auswirkung einer
Aminosäuresubstitution auf Struktur und Funktion eines Proteins voraus. Die
übereinstimmenden SNPs (n=2) wurden als benigne (462Q>E) bzw. eventuell
schädigend eingestuft (191V>E). Da von Ebermann et al. dem SNP 191V>E keine
84
Diskussion
verstärkende Bedeutung zugeordnet wurde, gehen wir auch von einer wahrscheinlich
nicht pathogenen Wirkung aus. Der nur in unserem Patienten 250/04 detektierte SNP
476R>G wurde als einziger als mutmaßlich schädigend eingestuft. Bei diesem
Patienten liegen allerdings keine weiteren bekannten Mutationen in anderen
Hörstörungsgenen vor. Sollte also der SNP 476R>G eine verstärkende Wirkung in
Zusammenhang mit einer Mutation eines anderen Hörstörungsgens haben, so
müsste das ein Gen sein, dass nicht von uns im Rahmen der Routinediagnostik und
der einzelnen Forschungsprojekte überprüft wurde.
Abb. 6.2 Polymorphismen in PDZD7. Die Vorhersagen der möglichen Pathogenität einer Mutation
wurden mit PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) gemacht. Die Farbgebung bei den
Vorhersagen entspricht dem Ampelprinzip, d.h. die rot unterlegte Vorhersage hat die höchste
Wahrscheinlichkeit pathogener Natur zu sein. Der PSIC (Position-Specific Independent Counts) score
difference gibt die Rarität einer Substitution wieder: je höher der Wert, desto seltener die Substitution,
desto wahrscheinlicher ihre Relevanz.
Der Insertions-/Deletions-(In/Del) Polymorphismus des Exons 14 (genomisch
gezählt)
in Transkript Q9H7Q6 zeigte eine enorm hohe Frequenz. Allerdings ist
85
Diskussion
dieses In/Del mittlerweile in der SNP Referenzdatenbank als nicht-pathogener
Polymorphismus gelistet. Der In/Del-Polymorphismus wurde übrigens auch bei Craig
Venter gefunden (rs71013480, seit Ensembl release 56, September 2009) einem der
beiden
zuerst
diploid
sequenzierten
Menschen.
Eine
Betrachtung
der
Sequenzevolution des In/Dels in der Primatenreihe lieferte widersprüchliche
Ergebnisse. Der humane Polymorphismus entsprach dem Wildtyp von Schimpanse
und
Orang-Utan
wohingegen
Mensch
(Wildtyp),
Gorilla,
Rhesusaffe
und
Weißbüschelaffe kürzere RS-repeats aufwiesen. Dabei war kein dem Stammbaum
entsprechendes Muster zu beobachten. Interessant wäre es, die Häufigkeit des
Polymorphismus in den verschiedenen Primatenpopulationen zu messen, ein
Unterfangen das vermutlich an den notwendigen Individuenzahlen scheitern würde.
Der Umstand, dass beim Menschen ein Polymorphismus mit hoher Frequenz zu
beobachten ist, lässt auf eine Reduzierung des Selektionsdrucks an dieser Position
schließen. Daraus kann man schlussfolgern, dass die Position für essentielle
Funktionen nicht relevant ist. Das wird auch durch die Analyse der Allelfrequenz
unterstrichen (wt 44,4%/ mut 55,6%), die sich zwar nicht vollständig im HardyWeinberg-Gleichgewicht befindet (50%/50%), aber keinen besonderen selektiven
Druck
auf
einem
der
beiden
Allele
erkennen
lässt
(p=0,4;
Chi2-Test).
Zusammenfassend wurden 102 Polymorphismen bei 135 Patienten entdeckt,
allerdings konnte keiner dieser Polymorphismen in einen kausalen Zusammenhang
mit dem Phänotyp im Sinne einer pathogenen Mutation gebracht werden. Zu diesem
Schluß kamen auch Ebermann et al., die mit 52,5% Allelfrequenz (mut) bei ihrem
Patientenpool einen sehr ähnlichen Wert fanden (n=237) und ebenfalls keine
pathogene Wirkung dieses InDels fanden.
Das oben diskutierte PDZD7-Screening war mit 135 Patienten das bislang
umfangreichste der am Institut für Humangenetik bei Hörstörungspatienten
durchgeführten Patienten-Screenings außerhalb der Routinediagnostik (GJB2/GJB6
etc.).
6.3.2 Connexine
Ebenfalls mit der Methode der Sanger Sequenzierung kodierender DNA-Abschnitte
wurden weitere potentielle (GJA1, GJB4) bzw. bereits publizierte Hörstörungsgene
86
Diskussion
(GJB6) bei Hörstörungspatienten untersucht. Die Auswahl dieser Gene begründete
sich erstens auf der Bedeutung von Connexinen für das Hören und zweitens auf eine
Publikation welche Connexin-Mutationen von 260 Patienten mit nicht syndromalen
Hörstörungen mit einer 120 Personen starken Kontrollgruppe verglich (Yang et al.,
2007). Die ausgewählten Gene/Pseudogene zeigten bei der Untersuchung von Yang
et al. (2007) und einer in der Publikation zitierten Referenz (López-Bigas et al., 2002)
pathogene Mutationen. Schon vorhergehende Publikationen hatten Mutationen in
Abb. 6.3 Ausschluß des pCX43-Assays von Yang et al. (2007). (A) In der oberen Tabelle sind die
Originalprimer der Publikation von Yang et al. (2007) entnommen. Das Alignment zeigt das
zusätzliche falsche „T“ (schwarzer Pfeil) im Vorwärtsprimer. (B) Die chromosomale Lage von pCX43
und CX43 auf den Chromosomen 5 und 6 (rote Klammern). (C) Mögliche Fehlerquelle der Mutation an
Position 932: (1) Die Wildtypsequenz von CX43 ist um 3 Basen länger als die des Pseudogens (Pfeil).
(2) Dadurch entsteht an Position 932 ein „A“ (Pfeil) anstelle eines „C“ oder eine Deletion, je nach
Bearbeiter. (3) Aligniert man die Sequenzen von Gen und Pseudogen sieht man an dieser Stelle
(Pfeil) 100%-ige Sequenzidentität.
CX43 als Ursache von Hörstörungen erkannt (Liu et al., 2001) und die funktionelle
Relevanz des Pseudogens pCX43, das einen intakten Leserahmen besitzt, bestätigt
(Kandouz et al., 2004). Yang et al. (2007) fanden bei ihren Untersuchungen
insgesamt 17 (!) Mutationen des Pseudogens pCX43 in 260 ertaubten Patienten,
nach dem zu erwartend hohen Anteil von GJB2- Mutationen die zweithöchste
87
Diskussion
Mutationsrate; ein Erfolg der die Autoren überraschte: „Surprisingly, pCx43 mutations
(6.54%, 17/260) were the second highest mutation found in our study, suggesting
that pGJA1 plays an important role in hearing“. Von den genannten 17 Mutationen
waren 16 einer Mutation an Position 932 zuzuschreiben. Ein erster Versuch mit den
in der Publikation verwandten Primern führte zu keinem Amplifikat, da die Sequenz
des Vorwärtsprimers am 3’-Ende fehlerhaft war (Abb. 6.3). Davon ausgehend, dass
es sich hier um einen Übertragungsfehler handelte, wurde ein neuer Primer mit dem
korrekten 3’-Ende getestet. Das Ergebnis war ein Amplifikat, dessen Sequenzierung
und anschließende Alignierung mit den Referenzsequenzen von pCX43 und CX43
klar zeigte, das hier nicht das Pseudogen pCX43, welches auf Chromosom 5 liegt
sondern das Gen CX43 welches auf Chromosom 6 liegt, amplifiziert wurde. Beide
Sequenzen unterscheiden sich durch etwa 28 SNP’s und zusätzlich durch eine
Insertion von 3 Nukleotiden im intakten Gen. Da die von den Autoren genannte
Mutation an Position 932 der Wildtypsequenz des intakten Gens CX43 entsprach,
musste gefolgert werden, dass deren Interpretation falsch waren (Abb. 6.3 C).
Weiterhin verwunderte ein Blick auf die bekannten Polymorphismen im ORF von
CX43 (GJA1-001). Während man durchschnittlich etwa 1 SNP auf 1000bp erwarten
kann (0,1%), das heißt etwa 1-2 SNP’s für den ORF von CX43, lieferten die
Datenbanken (Ensembl, NCBI SNP) 44 SNP’s in 1150bp (3,8%), ein Wert der
dramatisch über dem Erwarteten lag (Abb. 6.4). Ein Alignment der ORF-Sequenzen
von CX43 und pCX43 zeigte, dass 31 SNP’s mit der jeweiligen Wildtysequenz des
Antagonisten zu erklären waren. Nur 9 SNP’s in CX43 und 4 SNP’s in pCX43 waren
so nicht zu erklären und stellen daher mit größter Wahrscheinlichkeit „echte“ SNP’s
dar. Die SNP-Frequenzen sind damit immer noch relativ hoch, verglichen mit dem
Erwartungswert, allerdings nur im Falle von CX43 signifikant (pCX43=0,0245; Chi2 und
Fisher’s exakter Test). Falsch-positive SNPs in den Datenbanken zu finden ist nicht
ungewöhnlich. Mitchell et al. (2004) schätzen etwa 15-17% der Einträge als
fehlerhaft ein. Vor diesem Hintergrund waren die Ergebnisse von Yang et al. (2007)
für pCX43 mit großer Skepsis zu sehen. Es wurde daher von einer Sequenzierung
des Pseudogens pCX43 abgesehen. Bislang wurden mit den verbliebenen
Sequezierungsassays für die Connexine CX30, CX30.3 und CX43 bei 5 Patienten
Sequenzveränderungen entdeckt: in CX30.3 waren 4 (je zweimal c154 del4/wt und
c.507 C>G(C169W)/wt), in CX43 1 und in CX30 keine Veränderung detektierbar.
88
Diskussion
Abb. 6.4 SNP-Vergleich CX43 mit pCX43. Die türkis schraffierten Positionen sind SNP’s (n=31) die
mit großer Wahrscheinlichkeit auf Verwechslungen der originären Wildtypsequenzen des Gens und
des Pseudogens basieren. Die gelb schraffierten Positionen sind vermutlich echte SNP’s in CX43
(n=9) oder pCX43 (n=4).
Die Frameshift-Deletion CX30.3 c154 del4/wt hat zumindest in einer spanischen
Population 4% Frequenz und wird als nicht ursächlich für Hörstörungen gesehen
(Lopez-Bigas et al., 2002). In den bislang untersuchten Patienten fanden wir eine
Allelfrequenz von 7,7%, die nicht signifikant höher ist als in der spanischen Studie
(p= 0,3232; Chi2 und Fisher’s exakter Test), allerdings sollte zur Validierung dieser
Auswertung die Anzahl der Individuen mindestens um den Faktor 4 erhöht werden.
Immerhin ist es interessant festzustellen, dass in der südeuropäischen wie in unserer
Patientengruppe beide Werte über der Frequenz der 35delG- Mutation des GJB2
Gens liegen (2,5%), welche die häufigste Mutation aller Hörstörungsgene darstellt
(Rabionet et al., 2000). Die zweite Mutation die wir in GJB4 finden konnten, Cx30.3
c.507 C>G(C169W)/wt, ist möglicherweise mit-ursächlich für den Phänotyp der
Patienten, da in der Studie von Lopez-Bigas et al. (2002) ebenfalls ein Patient mit
dieser Mutation gefunden wurde, hingegen nicht in der Kontrollgruppe (n=69). Leider
haben die Autoren in ihrer Studie Homozygote und Heterozygote nicht eindeutig
unterscheidbar zusammengefasst, daher lässt sich nicht sagen, ob in deren Patient
nur ein (wie bei unseren Patienten) oder beide Allele betroffen waren. Unsere beiden
89
Diskussion
Patienten haben zusätzlich eine Mutation in GJB2, es kann daher ein digenischer
Effekt angenommen werden, auch wenn sich die beiden Connexine auf
verschiedenen Chromosomen befinden (CX26/Chr. 13 und CX30.3/Chr. 1).
Die in CX43 entdeckte Variation c.962 G>T (G321V)/wt stellte eine bislang
unbekannte Veränderung dar. Die Interpretation einer Variante die zu einer
Aminosäureänderung führt, die nirgendwo gelistet ist, gehört zu den schwierigsten
Aufgaben in der Befundung. Im Folgenden soll die Veränderung CX43 c.962 G>T
(G321V)/wt deshalb möglichst eng nach den Empfehlungen von Kremer und
Cremers (2009) geprüft werden. Beim Patienten war ein Glycin zu Valin Austausch
detektiert worden. Beide Aminosäuren sind (1) aliphatisch, hydrophob, unpolar
(neutral), weshalb hier von einem konservativen Austausch ausgegangen werden
kann, welcher einen schwächeren Effekt zur Folge hat als ein nicht-konservativer
Austausch. Bemerkenswert ist, das ein Glycin zu Valin Austausch normalerweise
nicht
zu
erwarten
gewesen
wäre
(http://www.russell.embl-
heidelberg.de/aas/Gly.html). Als nächstes Kriterium wurde (2) die evolutionäre
Konservierung
getestet.
Die
mögliche
Pathogenität
einer
evolutionär
hoch
konservierten Base oder Aminosäure ist höher als die einer geringer konservierten.
Um eine Vorhersage machen zu können, wird die entsprechende Position (AA321)
entweder
von
Hand
evolutionär
absteigend
aligniert
(BioEdit)
oder
die
entsprechenden Daten (Accession number, Position, Austausch) in das Online tool
„PolyPhen“
eingegeben
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/).
PolyPhen
sagt
automatisch den möglichen Einfluss einer Aminosäuresubstitution auf Struktur und
Funktion eines menschlichen Proteins vorher. Diese Vorhersage basiert auf der
Auswertung
von
Sequenz
und
phylogenetischen
sowie
strukturellen
Charaktereigenschaften der Substitution (Abb. 6.5). Letztendlich kamen beide Wege
zur gleichen Aussage, nämlich das die Variation G321V möglicherweise nachteilig
ist. Zusammengenommen konnte also aus der Betrachtung der Strukturelemente
und Konservierung geschlossen werden, dass trotz konservativem Charakter des
Austausches, basierend auf dessen starker evolutionärer Konservierung, eine eher
pathogene Eigenschaft wahrscheinlich ist. Die Mutation war nur auf einem Allel zu
finden. Es könnte ein digenischer Effekt vorliegen, da analog zu den o.g. beiden
Fällen, zusätzlich eine heterozygote GJB2-Mutation vorhanden war.
90
Diskussion
Abb. 6.5 Vorhersage der pathogenen
Relevanz eines
Aminosäureaustausches. Hier:
Aminosäureaustausch CX43 G321V. (A) Screenshot der Ergebnisausgabe von PolyPhen. Die
Vorhersage des Sequenz- und Phylogenetik-basierten Onlinetools „PolyPhen“ ist im roten Feld zu
sehen: der Aminosäreaustausch wird als möglicherweise nachteilig beschrieben. (B) Alignierung von
Hand (BioEdit). Es wurden 12 Arten mit Mensch aligniert (PolyPhen: 22 Arten). Das Ergebnis zeigt
ebenfalls eine hohe Konservierung der Position 962 (Pfeil).
6.3.3 OTOF
Mit einem Anteil von knapp 5% (Tab. 6.1) an allen genetische bedingten
Hörstörungen in kaukasoiden Populationen (Hilgert et al., 2009) gehört OTOF
(DFNB9 auf Chromosom 2p22-p23) zu den häufigsten genetischen Ursachen für
prälinguale Hörstörungen. OTOF hat 48 Exons, wird in den inneren und äußeren
Haarzellen der Cochlea exprimiert und kodiert für lange und kurze Isoformen des
Proteins Otoferlin. Die ersten 19 Exons kodieren exklusiv für die langen Isoformen
91
Diskussion
(Yasunaga et al., 2000). Je nach Population und Datenlage steht OTOF, nach GJB2,
an vierter oder fünfter Stelle in den Häufigkeitslisten (Hilgert et al., 2009). In Spanien
gilt OTOF, sogar als dritthäufigste Ursache für prälinguale Hörstörungen, davon hat
allein die Mutation Q829X einen Anteil von 4% (Migliosi et al., 2008). Diese Mutation
betrifft beide Isoformen. Wenn man in Mitteleuropa eine ähnlich hohe Frequenz
dieser Mutation voraussetzt wie in Spanien, ist mit der Untersuchung von etwa 25-30
Patienten mit genetisch bedingten Hörstörungen unbekannter Ätiologie ein
Positivbefund wahrscheinlich. Insgesamt wurden 15 Patienten mit einem auf die
Mutation Q829X (C2485T) zugeschnittenen Pyrosequencingassay untersucht. Dabei
wurde kein einziger Patient mit einer Mutation Q829X (C2485T) identifiziert, alle
Patienten zeigten die Wildtyp-Allele C/C (Tab. 5.3). Aus den o.g Angaben ist das
auch nicht weiter verwunderlich, da selbst bei einer Häufigkeit wie im hispanischen
Kulturkreis die doppelte Anzahl an Individuen notwendig gewesen wäre um einen
Positivbefund wahrscheinlich zu machen.
6.3.4 KCNE1
Krankheit verursachende genetische Mutationen entstehen nicht nur de novo oder
durch ungünstige Allelkombinationen in einem mehr oder weniger singulären
Erbgang. Sie entstehen auch durch bestimmte Allelfrequenzen mit denen in einer
Population Vorteile „erkauft“ werden, die für einige Wenige aber nachteilig sein
können, man spricht auch vom Heterozygotenvorteil (=Homozygotennachteil) oder
einem
balancierten
Sichelzellenanämie
Polymorphismus.
in
Malariagegenden
Bekannte
und
die
Beispiele
sind
die
Cystische
Fibrose
in
Zusammenhang mit Unempfindlichkeit gegen Typhus. Wenn in einer Population mit
dem Allel A eine seltene Mutation a auftritt, ist es wenig wahrscheinlich dass die
Allelkombinationen Aa und Aa aufeinandertreffen. Entsteht nun ein umweltbedingter
Selektionsvorteil (z.B. Malariaresistenz) für die Heterozygoten (Aa), nimmt durch den
reproduktiven Vorteil die Häufigkeit des veränderten Allels (a) zu. In einem HardyWeinberg-Gleichgewicht (HWÄ) d.h. in einer, nicht in der Realität existierenden,
idealen Population, herrscht ein Allelgleichgewicht. Das bedeutet, wenn es keinen
selektiven Druck auf eines von zwei Allelen gibt, dann sind beide Allele gleich verteilt
(Allelfrequenz: 0,5 Allelverteilung: 0,25/ 0,5/ 0,25). Als Formel ausgedrückt verteilen
92
Diskussion
sich die beiden Allele p und q wie folgt: p2 + 2pq + q2 = 1. Im idealen HWÄ betragen
die Allelfrequenzen (AF) 0,5 d.h
AFp
+
AFq
=1. Die Allelfrequenzen des Gly38Ser-
Polymorphismus im KCNE1-Gen weichen in der europäischen Bevölkerung davon
ab: G= ~0,617 und A= ~0,383. Das bedeutet, dass offensichtlich ein selektiver Druck
auf dem G-Allel lastet und auch der Vergleich beobachteter mit erwarteten
Genotypen unterscheidet sich tendenziell (p=0,11) (Herlyn et al., 2009). Wenn der
Gly38Ser-Polymorphismus in KCNE1, das für die regulatorische Beta-Untereinheit
eines Kaliumkanals kodiert und mit verschiedenen Krankheiten, darunter auch
Hörstörungen assoziiert ist, in der gesunden Normalbevölkerung einem selektiven
Druck ausgesetzt ist, könnte einer davon abweichenden Allelfrequenz in einer
Subpopulation (hier: Patienten mit genetisch bedingten Hörstörungen) eine
pathogene
Relevanz
zugeschrieben
werden.
Dies
wurde
an
109
Hörstörungspatienten aus unserem Pool mit Hilfe eines Pyrosequencing SNPAssays untersucht. Es konnte allerdings kein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den Allelfrequenzen der Normalbevölkerung und der hörgestörten
Subpopulation entdeckt werden (p=0,2665; Chi2 und Fisher exakter Test). Das gilt im
gleichen
Maß
für
die
Allelverteilung,
Normalbevölkerung aufwies.
Ein
von
die
der
nur
geringe
Unterschiede
Normalbevölkerung
zur
abweichender
selektiver Druck in der Subpopulation der Hörstörungspatienten ist somit nicht
feststellbar und muss als möglicherweise pathogener, hörstörungsrelevanter
Mechanismus abgelehnt werden.
6.3.5 Regulatorische Effekte
Mutationen im GJB2-Gen gehören zu den häufigsten genetischen Ursachen für
autosomal rezessive senorineurale nichtsyndromale Hörstörungen. Obwohl mehr als
200 GJB2-Mutationen und drei Deletionen Hörstörungen am DFNB1-Lokus
verursachen können (einmal GJB2 und GJB6 und zweimal GJB6 betreffend), sind
viele Patienten heterozygot für eine DFNB1- Mutation/Deletion und damit kann ihr
Phänotyp nicht erklärt werden. Daher liegt die Vermutung nahe, dass noch zusätzlich
unentdeckte Mutationen außerhalb der proximalen Promoter und transkribierten
Regionen von GJB2 existieren (Wilch et al., 2010). Die von der U.S.-amerikanischen
Arbeitsgruppe um Ellen Wilch von der Michigan State University entdeckte 131,4kb
93
Diskussion
große Deletion del(chr13:19,837,344-19,968,698) stromabwärts der Transkriptionsstartseiten von GJB2 und GJB6 (Abb. 6.6), die in einer im 19. Jhd. emigrierten,
katholischen deutschstämmigen Familie mit Hörstörungen segregiert, entspricht
genau diesem Typ. Die del(chr13:19,837,344-19,968,698) ist das dritte DFNB1-Allel
in dem GJB2 intakt ist. Aktuell sind 15 Mitglieder der Familie durch
aus: Wilch et al., 2010
Abb. 6.6 Deletion in einer Gründer-Familie. Dargestellt sind bekannte Deletionen außerhalb und
innerhalb der Promoter und transkribierten Regionen von GJB2 (schwarze Pfeile). Die von Wilch et al.
entdeckte Deletion in der Gründerfamilie (mit roten Pfeilen markiert) liegt 3’ von GJB6.
eine Hörstörung betroffen, die in 11 Fällen auf die sehr häufige 35delG-Mutation des
GJB2-Gens zurückzuführen ist. In 4 Fällen konnte die 35delG-Mutation nur
heterozygot
bestätigt
werden.
In
diesen
Fällen
wurde
die
o.g.
Deletion
del(chr13:19,837,344-19,968,698) in trans, also auf dem nicht betroffenen Allel
entdeckt. Offenbar werden durch die Deletion wichtige regulatorische Elemente für
GJB2 und GJB6 ausgeschaltet, so dass man als Erklärungsmodell für die Taubheit
der Betroffenen einen Compound-Effekt, bestehend aus der (heterozygoten) Deletion
und der (heterozygoten) GJB2–Mutation, vermuten darf (Wilch et al., 2010). Was
verwundert ist die Tatsache, dass CRYL1, obwohl mindestens 3 Deletionen die
dieses Gen betreffen im Zusammenhang mit Hörstörungen beschrieben wurden,
bisher von keinem Autor in ursächlichen Zusammenhang mit der Pathologie gebracht
wird.
Überwiegend
wird
davon
ausgegangen,
dass
durch
die
Deletionen
regulatorische Elemente von GJB2 und /oder GJB6 betroffen sind, so auch von der
Wilch-Gruppe. Dabei wäre es aus mehreren Gründen interessant, CRYL1 in die Liste
der Hörstörungskandidaten aufzunehmen: (1) ist dieses Gen in den GlukoseMetabolismus involviert, also in die Energieversorgung. Für die Aufrechterhaltung der
Flüssigkeitshomöostase und des endocochleären Potentials im Innenohr durch die
Stria
vascularis
ist
eine
funktionierende
metabolische
Versorgung
Grund94
Diskussion
voraussetzung. Eine Beeinträchtigung dieser Versorgung resultiert in Hörverlusten
(Wangemann et al., 2006). Es ist also durchaus vorstellbar, dass eine Mutation in
CRYL1 die Versorgungsleistung der Stria vascularis einschränkt und so eine
Hörstörung verursachen kann. (2) Vergleicht man 13 Gene der engeren Region um
CRYL1 mit einer für die Vorhersage von putativen Krankheitsgenen spezialisierten
Software (http://www.genetics.med.ed.ac.uk/suspects/index.shtml), so wird CRYL1
mit einem Index von 11,04 als 5-bester Treffer herausgegeben, nach GJB2, GJB6,
GJA3 und ZNF273. Dieses Ergebnis kann durchaus als weitere Unterstützung der
Hypothese gelten. (3) Von 20 CpG-Inseln, Regionen mit überdurchschnittlicher CGDinukleotiddichte, denen grundsätzlich ein putativ regulativer Charakter unterstellt
werden darf, sind 9(!) in CRYL1 (Abb. 6.7). Vier weitere CpG-Inseln sind zwischen 20
und 25kb stromabwärts des Gens. Auf Grund ihrer Nähe zu CRYL1 und der relativ
Abb. 6.7 CpG-Inseln auf Chr.13 (Loc.: 19695605-19998012). Die Abbildung zeigt die Lage von
putativen
CpG-Inseln
in
der
DNA
Sequenz
zwischen
GJB2
und
CRYL1
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html). Die CpG-Inseln sind als senkrechte Linien in
den Kästen dargestellt. Der grüne Pfeil indiziert die Strangorientierung. Gene sind als schwarze,
Deletionen als farbige Querbalken gekennzeichnet. Die Wilch-Deletion chr13:19,837,344-19,968,698
(roter Querbalken) betrifft 13 CpG-Inseln, davon 9 in CRYL1 und 4 etwa 20-25kb stromaufwärts. Der
blaue Querbalken identifiziert einen Bereich der institutsintern nach Deletionen/Duplikationen
gescreent wurde (Schmitt, B).
95
Diskussion
großen
Entfernung
zu
GJB6/GJB2
(~160kb)
ist
es
zumindest
nicht
unwahrscheinlich, dass sich cis-regulatorische Effekte dieser 4 CpG-Inseln eher auf
CRYL1 auswirken als auf ein anderes Gen. Die 4 CpG-Inseln sind im Übrigen auch
von der del(chr13:19,837,344-19,968,698) betroffen. Auch wenn Wilch et al. eine
Beeinträchtigung der GJB2/GJB6-Expression durch die Deletion feststellen konnten,
müsste der Vollständigkeit halber zusätzlich geprüft werden, in wie weit das auch auf
CRYL1 zutrifft. Sollte dort ebenfalls ein Effekt festgestellt werden, so müssten
Folgeuntersuchungen klären welcher der ausschlaggebende Effekt ist bzw. ob sich
beide Effekte ergänzen. Im Rahmen einer internationalen Kollaboration mit der Wilch
–Gruppe wurden 31 unserer Patienten mit monolallelischen GJB2/GJB6-Mutationen
auf die Deletion del(chr13:19,837,344-19,968,698) mit dem von den Initiatoren der
Studie vorgegebenen PCR-Assay untersucht. In diesen 31 sowie in allen weiteren
international untersuchten Patienten (ntotal=528) konnte keine weitere Deletion
del(chr13:19,837,344-19,968,698) gefunden werden. Auf Grund dieses Ergebnisses
muss die Deletion del(chr13:19,837,344-19,968,698) als private Mutation eingestuft
werden.
Damit
macht
die
Implementierung
eines
solchen
Tests
in
die
Routinediagnostik wenig Sinn. Allenfalls sollte man diese Möglichkeit bei Patienten
aus dem Raum Eifel im Zweifel in Betracht ziehen.
Nicht nur Mutationen der DNA haben pathogene Auswirkungen sondern auch
Veränderungen epigenetischer Information. In jeder (Soma-) Zelle in jedem Gewebe
und jedem Lebensabschnitt ist die gleiche DNA vorhanden, dennoch werden
verschiedenste
Entwicklungsstufen
durchlaufen
und
es
finden
Differenzierungsprozesse in die unterschiedlichsten Zelltypen statt. Die Vielfalt dieser
Prozesse ist möglich durch die unterschiedliche Regulierung der vorhandenen DNAInformation, vor allem durch epigenetische Regulation. Konkrete Beispiele für
epigenetische Regulation sind die X-Inaktivierung (weitgehende Stilllegung von
überzähligen X-Chromosomen), das Imprinting (Aktivität, abhängig von der
elterlichen Herkunft), Gene-Silencing (Gen-inaktivierende Chromatinveränderung)
und die Genomreprogrammierung (Wiederherstellung der Omni-, bzw. Totipotenz
einer Zelle). Nicht ganz zu Unrecht werden Genetik und Epigenetik daher auch
salopp als „Hardware“ respektive „Software“ der Vererbung bezeichnet. Bedenkt man
den massiven Einfluss epigenetischer Regulation auf die Entwicklung und
Funktionalität eines Organismus liegt im Umkehrschluss die Frage auf der Hand, was
passiert im Falle von Epimutationen, also fehlerhafter epigenetischer Information? In
96
Diskussion
der Tat gibt es zahllose Beispiele von pathogenen Auswirkungen einer fehlerhafter
Epigenetik: Imprintingdefekte können, je nach elterlicher Herkunft, schwere
Erkrankungen verursachen wie zum Beispiel Prader-Willi-, Angelman- und BeckwithWiedeman Syndom. Epimutationen können die Funktion von Promoterbereichen von
Tumorsuppressorgenen blockieren und so Tumorwachstum hervorrufen. Einer der
basalen epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung. Dieser DNAModifikation kommt, vor allem in CpG-Inseln, besondere regulatorische Bedeutung
zu, die unter anderem auch stark gewebeabhängig ist (Barros et al., 2009; Schneider
et al., 2010). Es ist daher erlaubt zu spekulieren, dass falsche Methylierungsmuster
der Promotoren von Hörstörungsgenen zu Pathologien führen können, ohne das eine
Mutation des Gens detektiert werden kann. In einer Arbeit von Tu und Kiang (1998)
wurden
in
einem
anderen
Zusammenhang
(Tumorsuppression)
funktionelle
Transkriptionsfaktoren-Bindungsstellen im GJB2-Gen nachgewiesen. Die Autoren
berichteten über mehr als 90% Expressionssuppression wenn beide GC-Boxen
mutiert waren. Ein solcher Effekt wäre auch denkbar wenn die entsprechenden GCBoxen, die insgesamt 5CpG-Positionen enthalten, methyliert wären. GJB2 wird im
Blut exprimiert und der GJB2-Promoter ist im Normalfall hypomethyliert. Eine
Abweichung in Richtung Hypermethylierung konnte als Indikator für die „Blockierung“
mindestens eines Allels (90-100% Methylierung = beide Allele blockiert) gelten.
Allerdings kann die DNA-Methylierung, wie erwähnt, auch gewebsspezifisch sein
sodass die Daten für Blut nicht ohne weiteres auf Innenohrgewebe übertragbar sind.
Dennoch
führten
die
Überlegungen
dazu,
ein
Patienten-Screening
der
Promotormethylierung des Hörstörungsgens GJB2 durchzuführen. Dazu wurden
zunächst 21 Patienten, die heterozygot für GJB2-Mutationen waren, herausgesucht.
Die Heterozygotie der Mutation konnte den Phänotyp nicht erklären, da zwei GJB2Mutationen vorliegen müssen, um eine Pathologie hervorzurufen. Außerdem wurde
bei diesen Patienten keine weiteren Mutationen anderer Hörstörungsgene gefunden,
noch lagen chromosomale Anomalien vor. Das anschließende Screening wurde mit
einem Pyrosequenzierer durchgeführt, der in der Lage ist die Methylierung von CpGPositionen quantitativ zu messen. Aus den Werten der CpG-Methylierung läßt sich
dann ein Durchschnittswert errechnen, der die Methylierung der untersuchten
Sequenz quantitativ wiedergibt. Der Median der untersuchten 21 Patienten lag bei
6,2% (Standardabweichung 1,4%), die mitgeführte Normalkontrolle zeigte 5%
97
Diskussion
Methylierung. Die Ergebnisse zeigten also (1) eine Hypomethylierung, welche mit
Genexpression assoziiert ist und (2) keine Abweichung von der Normalkontrolle.
Zum gleichen Ergebnis kam auch die Analyse der Methylierung der einzelnen CpGsites. Nicht immer sind die CpG-sites eines genomischen Bereiches mit einer
bestimmten durchschnittlichen Methylierung in gleicher Höhe methyliert. Offenbar
beeinflussen sich CpG-site-Methylierungen gegenseitig und können dabei auch
gewebsspezifische oder gar speziesspezifische Muster zeigen (Schneider et al.,
2010; Farcas et al. 2009). Der Vergleich der CpG-site-Methylierungsmuster der
Patientengruppe mit der Normalkontrolle zeigte eine Übereinstimmung im Rahmen
der Standardabweichungen. Damit kann gefolgert werden, dass eine fehlerhafte
GJB2 Promoter-Methylierung, weder als Durchschnittswert der CpG-sites noch
bezogen
auf
das
Muster
der
einzelnen
CpG-site-Methylierungen
nicht
mitverantwortlich für die Hörstörungen der 21 untersuchten Patienten ist. Offen bleibt
an dieser Stelle natürlich, inwieweit die DNA-Methylierungsdaten aus Blut auf die
Situation im Innenohr übertragen werden kann.
Auf Basis der Daten der Hörstörungspatienten des Instituts für Humangenetik der
Universitätsmedizin
Mainz
sollten
Kandidatengene,
bzw.
genetische
und
epigenetische Mechanismen für Hörstörungen identifiziert und charakterisiert werden
und deren Relevanz im Rahmen einer Implementierung in die Routinediagnostik
beleuchtet werden. Dies ist im Falle der Klonierung von PDZD7 weitgehend
umgesetzt worden. In letzter Konsequenz müsste aber mindestens ein weiterer
Patient mit PDZD7- Mutation gefunden werden und/oder der Funktionsverlust durch
ein Tiermodell, zum Beispiel eine „Knockout“-Maus, bestätigt werden, um PDZD7 als
Hörstörungsgen zu validieren, von einem Tiermodell wurde aber aus Kosten- und
Zeitgründen abgesehen. Ersteres wurde durch ein Screening an 135 Patienten
versucht, es konnte jedoch kein weiterer Patient mit einer homozygoten Mutation
identifiziert werden. Bei einem Patienten mit einer heterozygoten Mutation konnte
eine starke Inzidenz für eine pathogene Auswirkung gezeigt werden. Möglicherweise
liegt hier ein Verstärkungseffekt für die Hörstörungssymptomatik vor, ähnlich wie von
Ebermann et al. (2010) beschrieben. Leider ist aber bisher keine weitere ursächliche
Mutation in einem anderen Hörstörungsgen bei diesem Patienten detektiert worden.
Weiterhin sollten in dem Patientenkollektiv Screenings durchgeführt werden, um
neue genetische und epigenetische, wissenschaftlich relevante und diagnostisch
verwertbare pathogene Mechanismen zu identifizieren. Um nun dieser Aufgabe
98
Diskussion
gerecht zu werden, mussten alle generierten Daten zusammenhängend ausgewertet
und in einer globalen Betrachtung abgeschätzt werden. Betrachtet man zunächst nur
die
Resultate,
zufriedenstellen.
so
Aus
können
487
die
Ergebnisse
Patienten
mit
der
investierten
nichtsyndromalen
Arbeit
nicht
sensorineuralen
Hörstörungen (NSHL) konnten durch die in dieser Arbeit etablierten Screenings nur
für 4 weitere Patienten Erklärungsmodelle für den Phänotyp abgeleitet werden.
Allerdings werden Pilotprojekte eben gerade als Versuchsballons vor die Etablierung
risikobehafteter
Unternehmungen
gesetzt
„um
Fragen
der
Akzeptanz,
der
Wirtschaftlichkeit, [...] und der technischen Optimierung im Feldversuch [...] zu
erproben"
(Fellbaum, 1981/82). Ein solches Projekt hat also eher einen
abschätzenden als endgültigen Charakter. Berücksichtigt man weiterhin die
statistisch evaluierbaren Häufigkeiten von pathogenen Mutationen, fällt auf, dass mit
Ausnahme von PDZD7 alle durchgeführten Screenings zu kleine Fallzahlen hatten.
Eine Auswertung der Angaben von Hilgert et al. (2009) macht das deutlich (Tab. 6.1):
nimmt man alle bis 2009 publizierten Daten zu NSHL kaukasoider Populationen
zusammen kommt man auf 341 nichtsyndromale Hörstörungspatienten mit kausalen
Mutationen
in
38
Hörstörungsgenen
(weltweit:
622
Mutationen
in
46
Hörstörungsgenen). Der erwartungsgemäß größte Anteil, knapp 44%, wird durch
Mutationen in GJB2 verursacht. Doch schon die Ränge 2, 3 und 4 haben nur noch je
5-6% Anteil, Rang 5-20 zwischen 1-4%, während alle weiteren Gene nur unter einem
Prozent vertreten sind. Um das am Beispiel des Gens OTOF noch einmal
aufzugreifen (Frequenz: 4,99%), hätte man bei einer Vollsequenzierung von 48
Exons (!) mindestens 25 Patienten untersuchen müssen um eine realistische Chance
zu haben, eine Mutation zu entdecken. Selbst die Ergebnisse von PDZD7 erscheinen
in einer Beispielrechnung in einem anderen Licht. Unsere Untersuchungen haben
gezeigt, dass PDZD7 mit großer Wahrscheinlichkeit ein weiterer Interaktionspartner
innerhalb des Usher-Netzwerkes ist und außerdem ein Paralog zu den beiden UsherGenen WHRN und USH1C. Mutationen dieser beiden Gene sind in der Liste von
Hilgert et al. (2009) bei kaukasoiden Populationen überhaupt nicht gelistet, man
findet sie nur in der weltweiten Gruppe. Dort haben sie einen Anteil von je (!) 0,32%.
Unterstellt man einem Gen mit ähnlichen Eigenschaften ein ähnliches pathogenes
Potential hätten wir, auf unser Screening übertragen, mindestens 312 Personen
untersuchen müssen um einen Positivbefund wahrscheinlich zu machen.
99
Diskussion
Tab. 6.1 Anteil von 46 bekannten Hörstörungsgenen an NSHL (autosomal rezessiv, autosomal
dominant und mitochondrial) nach Hilgert et al. (2009). Insgesamt kamen 622 Fälle zur
Auswertung, unterteilt in weltweite (n=622) und nur kaukasoide Populationen betreffende Fälle
(n=341). Die mit Abstand häufigste Ursache für genetisch bedingte nichtsyndromale Hörstörungen
sind Mutationen in GJB2.
100
Diskussion
Im Übrigen sind 4 der 5 NSHL-verursachenden Usher-Gene mit niedrigen
Frequenzen von höchstens bis zu einem Prozent vertreten. Nur CDH23 erreicht in
kaukasoiden Populationen 3,5%. Aus den genannten Ergebnissen und deren
Interpretation lassen sich mehrere Schlussfolgerungen ziehen. Erstens sollte für alle
durchgeführten Untersuchungen abgeschätzt werden, welche Fallzahlen notwendig
sind, um beim Mutationsscreening das Erreichen von 1-2 Positivbefunden
wahrscheinlich zu machen. Das sind, zusätzlich zu den bereits untersuchten
Patienten, im Einzelnen (erster Wert 1%, zweiter Wert 2% Wahrscheinlichkeit): für
PDZD7 177 – 289, für CX30.3 und CX43 je 140 – 306 (Berechnung basierend auf
GJB6 und GJB3) und für OTOF 10-35 Fälle. Für die Deletion del(chr13:19,837,34419,968,698) der Wilch-Gruppe wurden bereits weltweit 528 GJB2-heterozygote
Patienten untersucht. Dies zeigt beispielhaft, welche Fallzahlen benötigt werden, um
verlässliche Schlussfolgerungen zu ziehen.
Zusammengenommen sind die generierten Daten also nicht entmutigend, da im
Prinzip nur (1) die Fallzahlen erhöht werden müssten und (2) die Vorauswahl der
Patienten noch stringenter gehandhabt werden sollte als in der Vergangenheit, um
zu validen Ergebnissen zu kommen. Mit einem solchen Vorgehen würden die
Chancen auf Positivbefunde enorm verbessert werden und könnten als gute
Grundlage für eine Argumentationslinie zur Erweiterung der molekularen Diagnostik
dienen. Darüber hinaus sollte über die Verwendung der Ergebnisse als Basis für eine
Datenbank nachgedacht werden. Da in Zukunft genomische und epigenomische
Daten immer schneller und kostengünstiger zu generieren sind, wird die Problematik
für Diagnostik und Forschung mit großer Wahrscheinlichkeit eher im Bereich der
Dateninterpretation zu suchen sein als in der Datenproduktion. Ein wichtiges
Instrument zur Befundung von Patienten, von Grundlagenforschung und klinischen
Studien wird daher unter anderem auch eine gut geführte Datenbank sein. In diesem
Sinne konnte die vorliegende Arbeit ihrer ursprünglichen Zielsetzung gerecht werden
und mit wissenschaftlichen und anwendungsrelevanten Ergebnissen dazu beitragen,
künftig die Rahmenbedingungen für weiterführende Forschungsarbeiten und
diagnostische Anwendungen zu verbessern.
101
Referenzen
7. Referenzen
7.1 Literatur
Adie EA, Adams RR, Evans KL, Porteous DJ, Pickard BS. Speeding disease gene
discovery by sequence based candidate prioritization. BMC Bioinformatics. 2005 Mar
14;6:55.
Ahmad S, Tang W, Chang Q, Qu Y, Hibshman J, Li Y, Söhl G, Willecke K, Chen P,
Lin X. Restoration of connexin26 protein level in the cochlea completely rescues
hearing in a mouse model of human connexin30-linked deafness. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2007 Jan 23;104(4):1337-41. Epub 2007 Jan 16.
Alves FR, de A Quintanilha Ribeiro F. Revision about hearing loss in the Alport's
syndrome, analyzing the clinical, genetic and bio-molecular aspects. Braz J
Otorhinolaryngol. 2005 Nov-Dec;71(6):813-9. Review.
Anderson DW, Probst FJ, Belyantseva IA, Fridell RA, Beyer L, Martin DM, Wu D,
Kachar B, Friedman TB, Raphael Y, Camper SA. The motor and tail regions of
myosin XV are critical for normal structure and function of auditory and vestibular hair
cells. Hum Mol Genet. 2000 Jul 22;9(12):1729-38.
Apps SA, Rankin WA, Kurmis AP. Connexin 26 mutations in autosomal recessive
deafness disorders: a review. Int J Audiol. 2007 Feb;46(2):75-81. Review.
Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K,
Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya
SS, Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR. Effect of gene
therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 2008 May
22;358(21):2231-9. Epub 2008 Apr 27.
Ballana E, Wang J, Venail F, Estivill X, Puel JL, Arbonès ML, Bosch A. Efficient and
specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype
5. Neurosci Lett. 2008 Sep 12;442(2):134-9. Epub 2008 Jun 26.
102
Referenzen
Barros SP, Offenbacher S. Epigenetics: connecting environment and genotype to
phenotype and disease. J Dent Res. 2009 May;88(5):400-8. Review.
Bear MF, Connors BW, Paradiso MA, Engel A. Neurowissenschaften - Ein
grundlegendes Lehrbuch für Biologie, Medizin und Psychologie. Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg. 3. Auflage, 11/2008.
Beisel KW, Tamayo M, Morton CC, Swaroop A, Kimberling WJ, Sumegi J. Mutation
of a gene encoding a protein with extracellular matrix motifs in Usher syndrome type
IIa. Science. 1998 Jun 12;280(5370):1753-7.
Bennett-Baker
PE,
Wilkowski
J,
Burke
DT.
Age-associated
activation
of
epigenetically repressed genes in the mouse. Genetics. 2003 Dec;165(4):2055-62.
Bermingham NA, Hassan BA, Price SD, Vollrath MA, Ben-Arie N, Eatock RA, Bellen
HJ, Lysakowski A, Zoghbi HY. Math1: an essential gene for the generation of inner
ear hair cells. Science. 1999 Jun 11;284(5421):1837-41.
Beyazyurek C, Ekmekci CG, Sağlam Y, Cinar C, Kahraman S. Preimplantation
genetic
diagnosis
(PGD)
for
extremes-successful
birth
after
PGD
for
a
consanguineous couple carrying an identical balanced reciprocal translocation: a
case report and review of the literature. Fertil Steril. 2010 Jan 29.
Bolz H J. Genetik des Usher-Syndroms. Ophthalmologe 2009 · 106:496–504,
Springer Medizin Verlag, 2009.
Brigande JV, Heller S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 2009
Jun;12(6):679-85. Epub 2009 May 26. Review.
Brooker R, Hozumi K, Lewis J. Notch ligands with contrasting functions: Jagged1 and
Delta1 in the mouse inner ear. Development. 2006 Apr;133(7):1277-86. Epub 2006
Feb 22.
103
Referenzen
Chen Y, Hühn D, Knösel T, Pacyna-Gengelbach M, Deutschmann N, Petersen I.
Downregulation of connexin 26 in human lung cancer is related to promoter
methylation. Int J Cancer. 2005 Jan 1;113(1):14-21.
Clark AG, Glanowski S, Nielsen R, Thomas PD, Kejariwal A, Todd MA, Tanenbaum
DM, Civello D, Lu F, Murphy B, Ferriera S, Wang G, Zheng X, White TJ, Sninsky JJ,
Adams MD, Cargill M. Inferring nonneutral evolution from human-chimp-mouse
orthologous gene trios. Science. 2003 Dec 12; 302(5652) :1960-3.
Corwin JT, Cotanche DA. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.
Science. 1988 Jun 24;240(4860):1772-4.
Cotanche DA. Genetic and pharmacological intervention for treatment/prevention of
hearing loss. J Commun Disord. 2008 Sep-Oct;41(5):421-43. Epub 2008 Mar 25.
Review.
Cryns K, Sivakumaran TA, Van den Ouweland JM, Pennings RJ, Cremers CW,
Flothmann K, Young TL, Smith RJ, Lesperance MM, Van Camp G. Mutational
spectrum of the WFS1 gene in Wolfram syndrome, nonsyndromic hearing
impairment, diabetes mellitus, and psychiatric disease. Hum Mutat. 2003
Oct;22(4):275-87. Review.
Dallos P, Fakler B. Prestin, a new type of motor protein. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002
Feb;3(2):104-11. Review.
Dallos P, Zheng J, Cheatham MA. Prestin and the cochlear amplifier. J Physiol.2006
Oct 1;576(Pt 1):37-42. Epub 2006 Jul 27. Review.
Dallos P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol.
2008 Aug;18(4):370-6. Epub 2008 Oct 4. Review.
104
Referenzen
Damatova N, Beyer V, Galetzka D, Schneider E, Napiontek U, Keilmann A, Zechner
U, Bartsch O, Haaf T. Haploinsufficiency of 16.4 Mb from chromosome 22pter-q11.21
in a girl with unilateral conductive hearing loss. Cytogenet Genome Res.
2009;125(3):241-7. Epub 2009 Sep 4.
Daudet N, Gibson R, Shang J, Bernard A, Lewis J, Stone J. Notch regulation of
progenitor cell behavior in quiescent and regenerating auditory epithelium of mature
birds. Dev Biol. 2009 Feb 1;326(1):86-100. Epub 2008 Nov 5.
Davis AC. The prevalence of hearing impairment and reported hearing disability
among adults in Great Britain. Int J Epidemiol. 1989 Dec;18(4):911-7.
Del Castillo I, Villamar M, Moreno-Pelayo MA, del Castillo FJ, Alvarez A, Tellería D,
Menéndez I, Moreno F. A deletion involving the connexin 30 gene in nonsyndromic
hearing impairment. N Engl J Med. 2002 Jan 24;346(4):243-9.
Denoyelle F, Marlin S, Weil D, Moatti L, Chauvin P, Garabédian EN, Petit C. Clinical
features of the prevalent form of childhood deafness, DFNB1, due to a connexin-26
gene
defect:
implications
for
genetic
counselling.
Lancet.
1999
Apr
17;353(9161):1298-303.
Doyle JH, Doyle JB Jr, Turnbull FM Jr. Electrical stimulation of eight cranial nerve.
Arch Otolaryngol. 1964 Oct;80:388-91.
Dror AA, Avraham KB. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell
biology. Annu Rev Genet. 2009;43:411-37.
Duan M, Venail F, Spencer N, Mezzina M. Treatment of peripheral sensorineural
hearing loss: gene therapy. Gene Ther. 2004 Oct;11 Suppl 1:S51-6. Review.
105
Referenzen
Ebermann I, Phillips JB, Liebau MC, Koenekoop RK, Schermer B, Lopez I, Schäfer
E, Roux AF, Dafinger C, Bernd A, Zrenner E, Claustres M, Blanco B, Nürnberg G,
Nürnberg P, Ruland R, Westerfield M, Benzing T, Bolz HJ. PDZD7 is a modifier of
retinal disease and a contributor to digenic Usher syndrome. J Clin Invest. 2010 May
3. pii: 39715. doi: 10.1172/JCI39715. [Epub ahead of print]
Eisen MD, Ryugo DK. Hearing molecules: contributions from genetic deafness. Cell
Mol Life Sci. 2007 Mar;64(5):566-80. Review.
Elden LM, Potsic WP. Screening and prevention of hearing loss in children. Curr
Opin Pediatr. 2002 Dec;14(6):723-30. Review.
Ellegren H. Comparative genomics and the study of evolution by natural selection.
Mol Ecol. 2008 Nov;17(21):4586-96. Review.
Eudy JD, Weston MD, Yao S, Hoover DM, Rehm HL, Ma-Edmonds M, Yan D,
Ahmad I, Cheng JJ, Ayuso C, Cremers C, Davenport S, Moller C, Talmadge CB,
Beisel KW, Tamayo M, Morton CC, Swaroop A, Kimberling WJ, Sumegi J. Mutation
of a gene encoding a protein with extracellular matrix motifs in Usher syndrome type
IIa. Science. 1998 Jun 12;280(5370):1753-7.
Feinberg AP. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature.
2007 May 24;447(7143):433-40. Review.
Fellbaum K-R. Telekommunikation von A-Z. Gesellschaft zur Förderung der
Unterhaltungselektronik (GFU) in Verbindung mit der AMK Berlin (Hrsg.): Berlin:
VDE-Verlag, 1981/82
Ferdinand F, Müller-Röber B, Domasch S, Boysen M. Gentherapie in Deutschland Eine interdisziplinäre Bestandsaufnahme. Dornburg: Forum W - Wissenschaftlicher
Verlag, 2008.
106
Referenzen
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific
genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature.
1998 Feb 19;391(6669):806-11.
Franchini LF, Elgoyhen AB. Adaptive evolution in mammalian proteins involved in
cochlear outer hair cell electromotility. Mol Phylogenet Evol. 2006 Dec;41(3):622-35.
Epub 2006 Jun 6.
Friedman LM, Avraham KB. MicroRNAs and epigenetic regulation in the mammalian
inner ear: implications for deafness. Mamm Genome. 2009 Sep-Oct;20(9-10):581603. Epub 2009 Oct 30. Review.
Frolenkov GI, Belyantseva IA, Friedman TB, Griffith AJ. Genetic insights into the
morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 2004 Jul;5(7):489-98. Review.
Gabriel H, Kupsch P, Sudendey J, Winterhager E, Jahnke K, Lautermann J (2001)
Mutations in the Connexin 26/GJB2 Gene are the most common event in nonsyndromic hearing loss among the German population. Hum Mutat 17: 521–522
Gan RZ, Feng B, Sun Q. Three-dimensional finite element modeling of human ear for
sound transmission. Ann Biomed Eng. 2004 Jun;32(6):847-59.
Gillespie PG, Müller U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules and
mechanisms. Cell. 2009 Oct 2;139(1):33-44. Review.
Goodyear, R. and Richardson, G. (1992). Distribution of the 275 kD hair cell antigen
and cell surface specialisations on auditory and vestibular hair bundles in the chicken
inner ear. J Comp Neurol 325: 243-56.
Goodyear, R. and Richardson, G. (2003). A novel antigen sensitive to calcium
chelation that is associated with the tip links and kinocilial links of sensory hair
bundles. J Neurosci 23: 4878-87.
107
Referenzen
Goodyear, R.J., Legan, P.K., Wright, M.B., Marcotti, W., Oganesian, A., Coats, S.A.,
Booth, C.J., Kros, C.J., Seifert, R.A., Bowen-Pope, D.F. et al. (2003). A receptor-like
inositol lipid phosphatase is required for the maturation of developing cochlear hair
bundles. J Neurosci 23: 9208-19.
Goyal R, Reinhardt R, Jeltsch A. Accuracy of DNA methylation pattern preservation
by the Dnmt1 methyltransferase. Nucleic Acids Res. 2006 Feb 25;34(4):1182-8. Print
2006.
Grillet N, Kazmierczak P, Xiong W, Schwander M, Reynolds A, Sakaguchi H, Tokita
J, Kachar B, Müller U. The mechanotransduction machinery of hair cells. Sci Signal.
2009 Aug 25;2(85):pt5.
Gubbels SP, Woessner DW, Mitchell JC, Ricci AJ, Brigande JV. Functional auditory
hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 2008
Sep 25;455(7212):537-41. Epub 2008 Aug 27.
Guilford P, Ben Arab S, Blanchard S, Levilliers J, Weissenbach J, Belkahia A, Petit
C. A non-syndrome form of neurosensory, recessive deafness maps to the
pericentromeric region of chromosome 13q. Nat Genet. 1994 Jan;6(1):24-8.
Heffner RS. Primate hearing from a mammalian perspective. Anat Rec A Discov Mol
Cell Evol Biol. 2004 Nov;281(1):1111-22. Review.
Herlyn H, Zechner U, Oswald F, Pfeufer A, Zischler H, Haaf T. Positive selection at
codon 38 of the human KCNE1 (= minK) gene and sporadic absence of 38Sercoding mRNAs in Gly38Ser heterozygotes. BMC Evol Biol. 2009 Aug 6;9:188.
Hildebrand MS, Newton SS, Gubbels SP, Sheffield AM, Kochhar A, de Silva MG,
Dahl HH, Rose SD, Behlke MA, Smith RJ. Advances in molecular and cellular
therapies for hearing loss. Mol Ther. 2008 Feb;16(2):224-36. Epub 2007 Nov
27.Review.
108
Referenzen
Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing
impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics? Mutat Res. 2009
Mar-Jun;681(2-3):189-96. Epub 2008 Aug 29. Review.
Horsthemke B. Epimutations in human disease. Curr Top Microbiol Immunol.
2006;310:45-59. Review.
Hudspeth AJ. Making an effort to listen: mechanical amplification in the ear. Neuron.
2008 Aug 28;59(4):530-45.
Im YJ, Lee JH, Park SH, Park SJ, Rho SH, Kang GB, Kim E, Eom SH. Crystal
structure of the Shank PDZ-ligand complex reveals a class I PDZ interaction and a
novel PDZ-PDZ dimerization. J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):48099-104. Epub
2003 Sep 3.
Izumikawa M, Minoda R, Kawamoto K, Abrashkin KA, Swiderski DL, Dolan DF,
Brough DE, Raphael Y. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by
Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 2005 Mar;11(3):271-6. Epub 2005
Feb 13.
Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome
integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 2003 Mar;33 Suppl:245-54.
Review.
Jobling M-A, Tylor-Smith C, Hurles M. Human Evolutionary Genetics: Origins,
Peoples and Disease. Taylor & Francis Ltd.; Auflage: illustrated edition (4. Dezember
2003)
Kandouz M, Bier A, Carystinos GD, Alaoui-Jamali MA, Batist G: Connexin43
pseudogene is expressed in tumor cells and inhibits growth. Oncogene 2004; 23:
4763–4770.
109
Referenzen
Kawamoto K, Ishimoto S, Minoda R, Brough DE, Raphael Y. Math1 gene transfer
generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo. J Neurosci. 2003 Jun
1;23(11):4395-400.
Kelly MC, Chen P. Development of form and function in the mammalian cochlea.
Curr Opin Neurobiol. 2009 Aug;19(4):395-401. Epub 2009 Aug 15.
Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, Lench NJ, Liang JN, Parry G, Mueller RF, Leigh
IM. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness.
Nature. 1997 May 1;387(6628):80-3.
Kochhar A, Hildebrand MS, Smith RJ. Clinical aspects of hereditary hearing loss.
Genet Med. 2007 Jul;9(7):393-408. Review.
Kokotas H, Petersen MB, Willems PJ. Mitochondrial deafness. Clin Genet. 2007
May;71(5):379-91. Review.
Konishi M, Kawamoto K, Izumikawa M, Kuriyama H, Yamashita T. Gene transfer into
guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J Gene Med. 2008
Jun;10(6):610-8.
Kopp P, Pesce L, Solis-S JC. Pendred syndrome and iodide transport in the thyroid.
Trends Endocrinol Metab. 2008 Sep;19(7):260-8. Epub 2008 Aug 7. Review.
Kremer H, van Wijk E, Märker T, Wolfrum U, Roepman R. Usher syndrome:
molecular links of pathogenesis, proteins and pathways. Hum Mol Genet. 2006 Oct
15;15 Spec No 2:R262-70. Review.
Kremer H, Cremers FP. Positional cloning of deafness genes. Methods Mol Biol.
2009;493:215-38.
Kubisch, Christian. Genetische Grundlagen nichtsyndromaler Hörstörungen. Dtsch
Arztebl 2005; 102(43): A-2946-2953
110
Referenzen
Kunstmann E, Hildmann A, Lautermann J, Aletsee C, Epplen J T, Sudhoff H.
Kongenitale Schwerhörigkeit, Molekular genetische Diagnostik der Connexin-Gene
und genetische Bera tung. HNO 2005 53:773–778.20. Oktober 2004
Leschot, N.J., Velden, J., Marinkovic-Ilsen, A., Darling, S.M. and Nijenhuis, L.E.
(1986) Homozygosity for a Y/22 chromosome translocation: t(Y;22)(q12;p12/13).
Clin. Genet., 29, 251–257.
Liu XZ, Xia XJ, Adams J, Chen ZY, Welch KO, Tekin M, Ouyang XM, Kristiansen A,
Pandya A, Balkany T, Arnos KS, Nance WE: Mutations in GJA1 ( connexin 43) are
associated with non-syndromic autosomal recessive deafness. Hum Mol Genet 2001;
10: 2945–2951.
Liu XZ, Ouyang XM, Xia XJ, Zheng J, Pandya A, Li F, Du LL, Welch KO, Petit C,
Smith RJ, Webb BT, Yan D, Arnos KS, Corey D, Dallos P, Nance WE, Chen ZY.
Prestin, a cochlear motor protein, is defective in non-syndromic hearing loss.Hum
Mol Genet. 2003 May 15;12(10):1155-62.
Liu Y, Okada T, Nomoto T, Ke X, Kume A, Ozawa K, Xiao S. Promoter effects of
adeno-associated viral vector for transgene expression in the cochlea in vivo.Exp Mol
Med. 2007 Apr 30;39(2):170-5.
López-Bigas N, Melchionda S, Gasparini P, Borragán A, Arbonés ML, Estivill X: A
common frameshift mutation and other variants in GJB4 (connexin 30.3): analysis of
hearing impairment families. Hum Mutat 2002; 19:458.
Löwenheim H, Furness DN, Kil J, Zinn C, Gültig K, Fero ML, Frost D, Gummer AW,
Roberts JM, Rubel EW, Hackney CM, Zenner HP. Gene disruption of p27(Kip1)
allows cell proliferation in the postnatal and adult organ of corti. Proc Natl Acad Sci U
S A. 1999 Mar 30;96(7):4084-8.
Maeda Y, Fukushima K, Nishizaki K, Smith RJ. In vitro and in vivo suppression of
GJB2 expression by RNA interference. Hum Mol Genet. 2005 Jun 15;14(12):164150. Epub 2005 Apr 27.
111
Referenzen
Mallo M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and
molecular mechanisms. Dev Biol. 2001 Mar 15;231(2):410-9. Review.
Manley GA. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 2009 Sep 26.
Marazita ML, Ploughman LM, Rawlings B, Remington E, Arnos KS, Nance WE.
Genetic epidemiological studies of early-onset deafness in the U.S. school-age
population. Am J Med Genet. 1993 Jun 15;46(5):486-91.
Martínez I, Rosa M, Arsuaga JL, Jarabo P, Quam R, Lorenzo C, Gracia A, Carretero
JM, Bermúdez de Castro JM, Carbonell E. Auditory capacities in Middle Pleistocene
humans from the Sierra de Atapuerca in Spain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul
6;101(27):9976-81. Epub 2004 Jun 22.
Martinet, D., Vial, Y., Thonney, F., Beckman, J.S., Meagher-Villemure, K. and Unger,
S. (2006) Fetus with two identical reciprocal translocations: description of a rare
complication of consanguinity. Am. J. Med. Genet., 140A, 769–774.
Matsunaga T. Value of genetic testing in the otological approach for sensorineural
hearing loss. Keio J Med. 2009 Dec;58(4):216-22. Review.
Migliosi V, Modamio-Høybjør S, Moreno-Pelayo MA, Rodríguez-Ballesteros M,
Villamar M, Tellería D, Menéndez I, Moreno F, Del Castillo I. Q829X, a novel
mutation in the gene encoding otoferlin (OTOF), is frequently found in Spanish
patients with prelingual non-syndromic hearing loss. J Med Genet. 2002
Jul;39(7):502-6.
Mitchell AA, Zwick ME, Chakravarti A, Cutler DJ. Discrepancies in dbSNP
confirmation rates and allele frequency distributions from varying genotyping error
rates and patterns. Bioinformatics. 2004 May 1;20(7):1022-32. Epub 2004 Feb
Morton CC, Nance WE. Newborn hearing screening--a silent revolution. N Engl J
Med. 2006 May 18;354(20):2151-64. Review.
112
Referenzen
Morton NE. Genetic epidemiology of hearing impairment. Ann N Y Acad Sci.
1991;630:16-31. Review.
Müller J, Tsuji LA. Impedance-matching hearing in Paleozoic reptiles: evidence of
advanced sensory perception at an early stage of amniote evolution. PLoS One.
2007 Sep 12;2(9):e889.
Müller-Röber,
B
et
al.
Zweiter
Gentechnologiebericht.
Analyse
einer
Hochtechnologie in Deutschland. Dornburg: Forum W - Wissenschaftlicher Verlag,
2009.
Nayak GD, Ratnayaka HS, Goodyear RJ, Richardson GP. Development of the hair
bundle and mechanotransduction. Int J Dev Biol. 2007;51(6-7):597-608. Review.
Papsin BC, Gordon KA. Cochlear implants for children with severe-to-profound
hearing loss. N Engl J Med. 2007 Dec 6;357(23):2380-7. Review.
Petersen MB, Willems PJ. Non-syndromic, autosomal-recessive deafness. Clin
Genet. 2006 May;69(5):371-92. Review.
Pfister M, Thiele H, Van Camp G, Fransen E, Apaydin F, Aydin O, Leistenschneider
P, Devoto M, Zenner HP, Blin N, Nürnberg P, Ozkarakas H, Kupka S. A genotypephenotype correlation with gender-effect for hearing impairment caused by TECTA
mutations. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4-6):369-76.
Piserchio A, Spaller M, Mierke DF. Targeting the PDZ domains of molecular scaffolds
of transmembrane ion channels. AAPS J. 2006 Jun 2;8(2):E396-401.
Praetorius M, Brough DE, Hsu C, Plinkert PK, Pfannenstiel SC, Staecker H.
Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear Res. 2009
Feb;248(1-2):31-8. Epub 2008 Dec 7.
113
Referenzen
Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, Bu X, Oztas S, Qiu WQ, Arnos KS,
Cortopassi GA, Jaber L, Rotter JI, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation
associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. Nat Genet.
1993 Jul;4(3):289-94.
Probst FJ, Fridell RA, Raphael Y, Saunders TL, Wang A, Liang Y, Morell RJ,
Touchman JW, Lyons RH, Noben-Trauth K, Friedman TB, Camper SA. Correction of
deafness in shaker-2 mice by an unconventional myosin in a BAC transgene.
Science. 1998 May 29;280(5368):1444-7.
Provenzano MJ, Domann FE. A role for epigenetics in hearing: Establishment and
maintenance of auditory specific gene expression patterns. Hear Res. 2007
Nov;233(1-2):1-13. Epub 2007 Jul 19. Review.
Pritzel M, Brand M, Markowitsch H. Gehirn und Verhalten: Ein Grundkurs der
physiologischen Psychologie. Springer, 2009.
Raphael Y, Altschuler RA. Structure and innervation of the cochlea PMID: 12787864.
Rabionet R, Gasparini P, Estivill X. 2000. Molecular genetics of hearing impairment
due to mutations in gap junction genes encoding beta connexins. Hum Mutat 16:190202.
Reiners, J., Nagel-Wolfrum, K., Jürgens, K., Märker, T. and Wolfrum, U. (2006)
Molecular basis of human Usher syndrome: deciphering the meshes of the Usher
protein network provides insights into the pathomechanisms of the Usher disease.
Exp. Eye Res., 83, 97–119.
Rejali D, Lee VA, Abrashkin KA, Humayun N, Swiderski DL, Raphael Y. Cochlear
implants and ex vivo BDNF gene therapy protect spiral ganglion neurons. Hear Res.
2007 Jun;228(1-2):180-7. Epub 2007 Mar 7.
114
Referenzen
Riede T, Owren MJ, Arcadi AC. Nonlinear acoustics in pant hoots of common
chimpanzees (Pan troglodytes): frequency jumps, subharmonics, biphonation, and
deterministic chaos. Am J Primatol. 2004 Nov;64(3):277-91.
Rodríguez-Ballesteros M, del Castillo FJ, Martín Y, Moreno-Pelayo MA, Morera C,
Prieto F, Marco J, Morant A, Gallo-Terán J, Morales-Angulo C, Navas C, Trinidad G,
Tapia MC, Moreno F, del Castillo I. Auditory neuropathy in patients carrying
mutations in the otoferlin gene (OTOF). Hum Mutat. 2003 Dec;22(6):451-6.
Rollins RA, Haghighi F, Edwards JR, Das R, Zhang MQ, Ju J, Bestor TH. Largescale structure of genomic methylation patterns. Genome Res. 2006 Feb;16(2):15763. Epub 2005 Dec 19.
Ryals BM, Rubel EW. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix
quail. Science. 1988 Jun 24;240(4860):1774-6.
Saihan Z, Webster AR, Luxon L, Bitner-Glindzicz M. Update on Usher syndrome.Curr
Opin Neurol. 2009 Feb;22(1):19-27. Review.
Sakaguchi H, Tokita J, Müller U, Kachar B. Tip links in hair cells: molecular
composition and role in hearing loss. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2009
Oct;17(5):388-93. Review.
Schmidt R F, Thews G. Physiologie des Menschen. Springer Verlag, Heidelberg. 25
Auflage, 1993.
Schmidt R F, Lang F, Thews G. Physiologie des Menschen mit Pathophysiologie.
Springer Medizin Verlag, Heidelberg. 29 Auflage, 2005.
Schneider E, Märker T, Daser A, Frey-Mahn G, Beyer V, Farcas R, SchneiderRätzke B, Kohlschmidt N, Grossmann B, Bauss K, Napiontek U, Keilmann A, Bartsch
O, Zechner U, Wolfrum U, Haaf T. Homozygous disruption of PDZD7 by reciprocal
translocation in a consanguineous family: a new member of the Usher syndrome
115
Referenzen
protein interactome causing congenital hearing impairment. Hum Mol Genet. 2009
Feb 15;18(4):655-66. Epub 2008 Nov 20.
Schneider E, Pliushch G, El Hajj N, Galetzka D, Puhl A, Schorsch M, Frauenknecht
K, Riepert T, Tresch A, Müller AM, Coerdt W, Zechner U, Haaf T. Spatial, temporal
and interindividual epigenetic variation of functionally important DNA methylation
patterns. Nucleic Acids Res. 2010 Mar 1.
Schnupp JW, Carr CE. On hearing with more than one ear: lessons from evolution.
Nat Neurosci. 2009 Jun;12(6):692-7. Epub 2009 May 26. Review.
Schrijver I. Hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss: transforming
silence to sound. J Mol Diagn. 2004 Nov;6(4):275-84. Review.
Shehata-Dieler W E, Dieler R, Keim R, Finkenzeller P, Dietl J, Helms J. Universelle
Hörscreening-Untersuchungen bei Neugeborenen mit dem BERAphon. LaryngoRhino-Otol 2000; 79: 69-76.
Shibata SB, Di Pasquale G, Cortez SR, Chiorini JA, Raphael Y. Gene transfer using
bovine adeno-associated virus in the guinea pig cochlea. Gene Ther. 2009
Aug;16(8):990-7. Epub 2009 May 21.
Smith RJ, Bale JF Jr, White KR. Sensorineural hearing loss in children. Lancet. 2005
Mar 5-11;365(9462):879-90. Review.
Speckmann EJ, Hescheler J, Köhling R. Physiologie. Elsevier, Urban & Fischer
Verlag, München. 5. Auflage, 2008.
Steel KP, Bock GR. The nature of inherited deafness in deafness mice. Nature. 1980
Nov 13;288(5787):159-61.
Thews G, Mutschler E, Vaupel P. Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie des
Menschen. Wissenschaftliche Verlagsges.; Auflage: 6., völlig überarb. u. erw. A. (Mai
2007)
116
Referenzen
Tost J, Dunker J, Gut IG. Analysis and quantification of multiple methylation variable
positions in CpG islands by Pyrosequencing. Biotechniques. 2003 Jul;35(1):152-6.
Tu ZJ, Kiang DT. Mapping and characterization of the basal promoter of the human
connexin26 gene. Biochim Biophys Acta. 1998 Nov 26;1443(1-2):169-81.
Vlastarakos PV, Nikolopoulos TP, Tavoulari E, Papacharalambous G, Tzagaroulakis
A, Dazert S. Sensory cell regeneration and stem cells: what we have already
achieved in the management of deafness. Otol Neurotol. 2008 Sep;29(6):758-68.
Review.
Wahl, J. Ein Beitrag zur metrischen Geschlechtsdiagnose verbrannter und
unverbrannter menschlicher Knochenreste -- ausgearbeitet an der Pars petrosa ossis
temporalis. Z Rechtsmed 86, 79-101 (1981).
Wangemann P. Supporting sensory transduction: cochlear fluid homeostasis and the
endocochlear potential. J Physiol. 2006 Oct 1;576(Pt 1):11-21. Epub 2006 Jul 20.
Review.
Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, Pääbo S, Rebhan M, Schübeler D.
Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation
in the human genome. Nat Genet. 2007 Apr;39(4):457-66. Epub 2007 Mar 4.
Whitelaw NC, Whitelaw E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and
disease. Curr Opin Genet Dev. 2008 Jun;18(3):273-9. Epub 2008 Aug 12. Review.
Wilch E, Azaiez H, Fisher RA, Elfenbein J, Murgia A, Birkenhäger R, Bolz H, da
Silva-Costa SM, Del Castillo I, Haaf T, Hoefsloot L, Kremer H, Kubisch C, Le
Marechal C, Pandya A, Sartorato EL, Schneider E, Van Camp G, Wuyts W, Smith
RJ, Friderici KH. A novel DFNB1 deletion allele supports the existence of a distant
cis-regulatory region that controls GJB2 and GJB6 expression. Clin Genet. 2010 Mar
1.
117
Referenzen
Willems PJ. Genetic causes of hearing loss. N Engl J Med. 2000 Apr
13;342(15):1101-9. Review.
Williams DS. Usher syndrome: animal models, retinal function of Usher proteins, and
prospects for gene therapy. Vision Res. 2008 Feb;48(3):433-41. Epub 2007 Oct 23.
Review.
Wilmot, P.L., Shapiro, L.R. and Casamassima, A.C. (1990) Disomic balanced
reciprocal translocation. Clin. Genet., 28, 126–127.
Wiltschke-Schrotta,
Karin.
Anthropologische
Bestimmung
der
menschlichen
Leichenbrände aus dem römerzeitlichen Hügel 41 Saaz, Gemeinde Paldau,
Steiermark. Archaeologica Austriaca, Band 87 / 2003, 165–167.
Wolinsky H. The thousand-dollar genome. Genetic brinkmanship or personalized
medicine? EMBO Rep. 2007 Oct;8(10):900-3.
Wood B, Richmond BG. Human evolution: taxonomy and paleobiology. J Anat. 2000
Jul;197 ( Pt 1):19-60. Review.
Yang JJ, Huang SH, Chou KH, Liao PJ, Su CC, Li SY. Identification of mutations in
members of the connexin gene family as a cause of nonsyndromic deafness in
Taiwan. Audiol Neurootol. 2007;12(3):198-208. Epub 2007 Jan 25. Erratum in:Audiol
Neurootol. 2007;12(5):344.
Yasunaga S, Grati M, Chardenoux S, Smith TN, Friedman TB, Lalwani AK, Wilcox
ER, Petit C. OTOF encodes multiple long and short isoforms: genetic evidence that
the long ones underlie recessive deafness DFNB9. Am J Hum Genet 2000;67:591600.
Zaki, M., Shehab, M., El-Aleem, A.A., Abdel-Salam, G., Koeller, H.B., Ilkin, Y., Ross,
M.E., Dobyns, W.B. and Gleeson, J.G. (2007) Identification of a novel recessive
RELN mutation using a homozygous balanced reciprocal translocation. Am. J. Med.
Genet., 143A, 939–944
118
Referenzen
Zelante L, Gasparini P, Estivill X, Melchionda S, D'Agruma L, Govea N, Milá M,
Monica MD, Lutfi J, Shohat M, Mansfield E, Delgrosso K, Rappaport E, Surrey S,
Fortina P. Connexin26 mutations associated with the most common form of nonsyndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans.
Hum Mol Genet. 1997 Sep;6(9):1605-9.
Zhuo XL, Wang Y, Zhuo WL, Zhang YS, Wei YJ, Zhang XY. Adenoviral-mediated upregulation of Otos, a novel specific cochlear gene, decreases cisplatin-induced
apoptosis of cultured spiral ligament fibrocytes via MAPK/mitochondrial pathway.
Toxicology. 2008 Jun 3;248(1):33-8. Epub 2008 Mar 20.
Zervos-Kopp J. Anatomie, Biologie und Physiologie. Georg Thieme Verlag KG,
Stuttgart, 2007.
7.2 Elektronische Quellen
Amino acid properties. http://www.russell.embl-heidelberg.de/aas/Gly.html Betts M J,
Russell R B. Amino acid properties and consequences of subsitutions. Bioinformatics
for Geneticists, M.R. Barnes, I.C. Gray eds, Wiley, 2003.
Connexins and deafness Homepage. http://davinci.crg.es/deafness/ Ballana E,
Ventayol M, Rabionet R, Gasparini P, Estivill X.
CpGPlot. http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html
The Ensembl Project.http://www.ensembl.org/index.html.
EuroHear http://www.eurohear.org/ EooHear (contract LSHG-CT-2004-512063) is
supported by funding under the Sixth Research Framework Programme of the
European Commission.
Expasy Proteomics Server.http://www.expasy.org/sprot/.
119
Referenzen
Hereditary hearing loss home page. http://webhost.ua.ac.be/hhh/
Van Camp G,
Smith R.
Human genome project information.
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genetherapy.shtml
Joint Committee on Infant Hearing. http://www.jcih.org/posstatemts.htm Year 2007
Position Statement: Principles and Guidelines for Early Hearing Detection and
Intervention Programs.
National Center for Biotechnology Information NCNI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
NCBI, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894
USA
Primer3. http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000)
Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S,
Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular
Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386
PolyPhen. http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/
Protein Data Bank Europe. http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/
Suspects. http://www.genetics.med.ed.ac.uk/suspects/index.shtml Speeding Disease
Gene Discovery by Sequence Based Candidate Prioritization Euan J Adie, Richard R
Adams, Kathryn L Evans, David J Porteous and Ben S Pickard BMC Bioinformatics.
2005 Mar 14;6(1):55
UCSC Genome Bioinformatics. http://genome.ucsc.edu/
120
Abkürzungen
8. Abkürzungen
8.1 Allgemein
Abkürzung
°C
µl
A
AAV
ABR
AG
array CGH
ATP
BAC
bp/bps
C
Ca+
cDNA
CIP
ClC-Terminal
dB
DEPC
der
DNA
dNTP
DTT
et al.
EtOH
EXO/SAP
FISH
G
Gly
GST
GTG Banding
HCO3HFL
HPLC
hz, kHz
In/Del
K+
kbp
LFL
MgCl2
MgCl2
min
MLPA
mM
Bezeichnung
Grad Celsius
Microliter
Adenin
Adeno-assoziierte Viren
Auditory Brainstem Response
Arbeitsgruppe
Array Comparative Genomic Hybridization
Adenosintriphosphat
Bacterial artificial chromosome
basepair/basepairs
Cytosin
Kalziumionen
complementary DNA
Calf Intestine Phosphatase
Chloridionen
Carboxy-Terminal
Dezibel
Diethylpyrocarbonate
derivative chromosome
Desoxyribonucleicacid
Desoxyribonukleosidtriphosphate
dithiothreitol
et alia
Ethanol
Exonuclease 1/Shrimp Alkaline
Phosphatase
Fluoreszenz in situ Hybridisation
Guanin
Glycin
Gluthation S-Transferase
Giemsa Banding
Hydrogenkarbonationen
High Frequency Limit
High Pressure Liquid Chromatography
Herz, kiloHerz
Insertion/Deletion
Kaliumionen
kilo base pair
Low Frequency Limit
Magnesiumchlorid
Milligramm
Minuten
Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification
Millimolar
121
Abkürzungen
mtDNA
Na+
NCBI
Sek.
Ser
SNP
STE Puffer
T
Taq
U
U/min
UTR
mitochondriale DNA
Natriumionen
National Center for Biotechnology
Information
Nanogramm
Non syndromal hearing loss
Nucleotide
otoakustische Emissionen
oligodeoxythymidylic acid
Open Reading Frame
Polymerase Chain Reaction
Ribonukleinsäure
RNA-Interferenz
ribosomale RNA
Reverse Transcriptase
Raumtemperatur
reverse transcriptase PCR
sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis
Sekunde
Serin
Single Nucleotide Polymorphism
Sodium Chloride–Tris–EDTA (STE) Puffer
Thymin
Thermus aquaticus
Unit
Umdrehungen pro Minute
Untranslated Region
wt
wildtype
ng
NSHL
nt
OAE
oligo(dt)
ORF
PCR
RNA
RNAi
rRNA
RT
RT (2)
RT-PCR
SDS PAGE
8.2 Gene
Gen
ACTB
APOH1
ATP6B
BDNF
BSND
CDH23
CECR6
CLCNKA
CLCNKB
COCH
CRYL1
Bezeichnung
actin, beta;ACTB
Apolipoprotein A1
ATPase, H+/K+ exchanging, beta
polypeptide;ATP4B
brain-derived neurotrophic factor;BDNF
Bartter syndrome, infantile, with sensorineural
deafness (Barttin);BSND
cadherin-like 23;CDH23
cat eye syndrome chromosome region, candidate
6;CECR6
chloride channel Ka;CLCNKA
chloride channel Kb;CLCNKB
coagulation factor C homolog, cochlin (Limulus
polyphemus);COCH
crystallin, lambda 1;CRYL1
122
Abkürzungen
DIAPH1
EDN3
EDNRB
EYA4
FOXI1
GAPDH
GJB2
GJB3
GJB6
HES
HEY
KAZALD
KCNE1
KCNQ1
LZTS2
MITF
MRPL43
MYH14
MYO15
MYO6
MYO7A
OTOF
OTOR
OTOS
P27KIP1
PCDH15
PDZD7
PEO1
POU3F4
PRES,SLC26A5
PTPRQ
SANS
SEMA4G
SFXN3
SLC26A4
SLC26A5
diaphanous homolog 1 (Drosophila);DIAPH1
endothelin 3;EDN3
endothelin receptor type B;EDNRB
eyes absent homolog 4 (Drosophila);EYA4
forkhead box I1;FOXI1
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase;GAPDH
gap junction protein, beta 2, 26kDa (connexin
26);GJB2
gap junction protein, beta 3, 31kDa (connexin
31);GJB3
gap junction protein, beta 6 (connexin 30);GJB6
ribosome binding protein 1 homolog 180kDa
(dog);RRBP1
Hairy/E(spl)-related with YRPW motif;Hey
Kazal-type serine peptidase inhibitor domain 1
potassium voltage-gated channel, Isk-related
family, member 1;KCNE1
potassium voltage-gated channel, KQT-like
subfamily, member 1;KCNQ1
leucine zipper, putative tumor suppressor 2;LZTS2
microphthalmia-associated transcription
factor;MITF
mitochondrial ribosomal protein L43;MRPL43
myosin, heavy chain 7B, cardiac muscle,
beta;MYH7B
myosin XVA;MYO15A
myosin VI;MYO6
myosin VIIA;MYO7A
otoferlin;OTOF
otoraplin;OTOR
otospiralin;OTOS
cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27,
Kip1);CDKN1B
protocadherin 15;PCDH15
PDZ domain containing 7;PDZD7
progressive external ophthalmoplegia 1;PEO1
POU domain, class 3, transcription factor
4;POU3F4
solute carrier family 26, member 5
(prestin);SLC26A5
protein tyrosine phosphatase, receptor type,
Q;PTPRQ
Usher syndrome 1G (autosomal
recessive);USH1G
sema domain, immunoglobulin domain (Ig),
transmembrane domain (TM) and short
cytoplasmic domain, (semaphorin) 4G;SEMA4G
sideroflexin 3;SFXN3
solute carrier family 26, member 4;SLC26A4
solute carrier family 26, member 5
123
Abkürzungen
TECTA
TFCP2L3
TMC1
TMPRSS
USH1E
USH1C
USH2A
USH3A
VLGR1
WFS1
WHRN
(prestin);SLC26A5
tectorin alpha;TECTA
grainyhead-like 2 (Drosophila);GRHL2
transmembrane channel-like 1;TMC1
Transmembrane Protease, Serine
Usher syndrome 1E (autosomal recessive, severe)
Usher syndrome 1C (autosomal recessive,
severe);USH1C
Usher syndrome 2A (autosomal recessive,
mild);USH2A
clarin 1;CLRN1
G protein-coupled receptor 98;GPR98
Wolfram syndrome 1 (wolframin);WFS1
deafness, autosomal recessive 31;DFNB31
124
Curriculum vitae
9. Curriculum vitae
Eberhard Schneider
Anthropologe (M.A.)
geboren am 14.07.1965 in St. Gallen / Schweiz
Schulsausbildung
1971 – 1975
Grundschule
Karl Treutel-Schule
Friedensstr. 2, 65451 Kelsterbach
1975 – 1986
Abitur
Rabanus-Maurus-Gymnasium
117er Ehrenhof 2, 55118 Mainz
Studium und Promotion
01 April 2001 - 28 Februar 2007
Magister Artium (M.A.)
Anthropologie (Humanbiologie)- Hauptfach
Psychologie- Nebenfach
Ethnologie- Nebenfach
Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Saarstr. 21, 55099 Mainz (Deutschland)
März 2007 – 2010
Promotion am Institut für Humangenetik der Johannes Gutenberg-Universität
Mainz (2007 – 2009) und am Institut für Humangenetik der Julius-MaximiliansUniversität Würzburg (2009 – 2010)
125
Publikationen und Kongressbeiträge
10. Publikationen und Kongressbeiträge
10.1 Publikationen
22q13.3 Deletion Syndrome and Fulminant Autoimmune Hepatitis Requiring
Emergency Liver Transplantation: Report of a Second Patient. Oliver Bartsch,
Eberhard Schneider, Natalja Damatova, Roger Weis, Maria Tufano, Alisho Ahmed,
Vera Beyer, Ulrich Zechner, Thomas Haaf. American Journal of Medical Genetics,
accepted for publishing April, 2010.
Spatial, temporal and interindividual epigenetic variation of functionally
important DNA methylation patterns. Schneider E, Pliushch G, El Hajj N, Galetzka
D, Puhl A, Schorsch M, Frauenknecht K, Riepert T, Tresch A, Müller AM, Coerdt W,
Zechner U, Haaf T. Nucleic Acids Res. 2010 Mar 1. [Epub ahead of print] PubMed
PMID: 20194112.
A novel DFNB1 deletion allele
supports the existence of a distant cis-
regulatory region that controls GJB2 and GJB6 expression. Wilch E, Azaiez H,
Fisher RA, Elfenbein J, Murgia A, Birkenhäger R, Bolz H, da Silva-Costa SM, Del
Castillo I, Haaf T, Hoefsloot L, Kremer H, Kubisch C, Le Marechal C, Pandya A,
Sartorato EL, Schneider E, Van Camp G, Wuyts W, Smith RJ, Friderici KH. Clin
Genet. 2010 Mar 1. [Epub ahead of print]
Extreme Methylation Values of Imprinted Genes in Human Abortions and
Stillbirths. Pliushch
G, Schneider E, Weise D, El Hajj N, Tresch A, Seidmann L,
Coerdt W, Müller AM, Zechner U, Haaf T. Am J Pathol. 2010 Jan 21. [Epub ahead
of print] PubMed PMID: 20093482.
Quantitative methylation analysis of developmentally important genes in
human pregnancy losses after ART and spontaneous conception. 7: Zechner U,
Pliushch G, Schneider E, El Hajj N,
Tresch A, Shufaro Y, Seidmann L, Coerdt W,
Müller AM, Haaf T. Mol Hum Reprod. . [Epub ahead of
print] PubMed PMID:
20007506.
126
Publikationen und Kongressbeiträge
Haploinsufficiency of 16.4 Mb from chromosome 22pter-q11.21 in a girl with
unilateral conductive hearing loss. Natalja Damatova, Vera Beyer, Danuta
Galetzka, Eberhard Schneider,
Ulrike Napiontek, Annerose Keilmann, Ulrich
Zechner, Oliver Bartsch, Thomas Haaf. Cytogenet Genome Res. 2009;125(3):241-7.
Epub 2009 Sep 4.
Homozygous
disruption
consanguineous family: a
of
PDZD7
by
reciprocal
translocation
in
a
new member of the Usher syndrome protein
interactome causing congenital hearing impairment. Eberhard Schneider, Tina
Märker, Angelika Daser, Gabriele Frey-Mahn, Vera Beyer, Ruxandra Farcas, Brigitte
Schneider-Rätzke, Nicolai Kohlschmidt, Bärbel Grossmann, Katharina Bauss, Ulrike
Napiontek, Annerose Keilmann, Oliver Bartsch, Ulrich Zechner, Uwe Wolfrum and
Thomas Haaf. Human Molecular Genetics 2009 18(4):655-666.
Differences in DNA Methylation Patterns and Expression of the CCRK Gene in
Human and Nonhuman Primate Cortices. Ruxandra Farcas, Eberhard Schneider,
Katrin Frauenknecht, Ivanela Kondova, Ronald Bontrop, Jürgen Bohl, Bianca
Navarro, Markus Metzler|, Hans Zischler, Ulrich Zechner, Angelika Daser and
Thomas Haaf. Molecular Biology and Evolution 2009 26(6):1379-1389.
Humans and chimpanzees differ in their cellular response to DNA damage and
non-coding sequence elements of DNA repair-associated genes. E. Weis, D.
Galetzka, H. Herlyn, E. Schneider, T. Haaf. Cytogenet Genome Res 2008;122:92102.
127
Publikationen und Kongressbeiträge
10.2 Kongressbeiträge (nur Vorträge ohne Posterpräsentationen)
Verbrühung eines Kleinkindes - Misshandlung oder akzidentelles Geschehen
bei genetisch bedingter Schmerzunempfindlickeit? Schneider E, Navarro B,
Urban R. 38. Treffen der Oberrheinischen Rechtsmediziner, Mainz (2008).
Considerable natural variation of functionally important DNA methylation
patterns. E. Schneider, G. Pliushch, N. El Hajj, A. Puhl, D. Galetzka, U. Zechner, T.
Haaf. 20th Conference of the German Society of Human Genetics, Aachen, Germany
(2009).
Promoter methylation at a candidate locus for language abilities has been
conserved in adult cortices of human and non-human primates. Schneider E,
Mayer S, El Hajj N, Farcas R, Jensen LR, Kuss A, Zechner U, Haaf T. 21st
Conference of the German Society of Human Genetics, Hamburg, Germany (2010).
128