Die Rolle des Faktors IkB£ als Effektor des atypischen, NFicB

Aus dem Hertie-lnstitut
für klinische Hirnforschung Tübingen
Abteilung Neuroonkologie
Arbeitsgruppe Naumann
Die Rolle des Faktors IkB£ als Effektor des atypischen,
NFicB-abhängigen Zelltods im Glioblastom
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Eberhard Karls Universität
zu Tübingen
vorgelegt von
Heiko Brennenstuhl
aus Leonberg / Baden-Württemberg
Promotionsjahr 2016
1. Einleitung................................................................................................................................1
1.1 Gliome.......................................................................................................................1
1.2 Klassifizierung und genetisches Profil des Glioblastoms............ ............... 2
1.3 Epidemiologie.........................................................................................................4
1.4 Diagnose, Prognose und Klinik..........................................................................4
1.5 Perspektiven der GBM Therapie...................................................................... 6
1.6 Der Nuclear factor-kappa B - NFkB .....................................................................8
1.6.1 N F kB und k B -P ro te in e ......................................................................................... 8
1.6.1.1 Die NFkB - Proteine.............................................................................................8
1.6.1.2 Zytoplasmatische IkB - Proteine......................................................................10
1.6.1.3 Nukleäre kB - Proteine.................................................................................... 11
1.6.1.4 IkB<.....................................................................................................................12
1.6.1.5 Der kB-Kinase Komplex - die IKK-Proteine..................................................... 15
1.6.2 Drei Mechanismen der NF kB - A ktivierung....................................................16
1.6.2.1 Der kanonische Weg der NFxB-Aktivierung..................................................... 16
1.6.2.2 Der alternative Weg der NFKB-Aktivierung....................................................... 17
1.6.2.3 Atypische NFkB -Aktiverungswege.................................................................. 17
1.6.3 Regulation des NFKB-Signalw egs.....................................................................19
1.6.3.1 Posttranslationale Modifikation..........................................................................19
1.6.4 NF-kB Z ie lg ene.................................................................................................... 21
1.6.5 Die Rolle von NF k B bei der T u m orentstehung...............................................22
1.6.6 Die Rolle des NFKB-Signalwegs im G liobla stom ............................................22
1.7
p53 Signalweg.......................................................................................................24
1.7.1
1.7.2
1.7.3
1.7.4
1.8
1.9
Schnittstellen von NFkB- undp53-vermitteltemSignaling.............................30
Die Rolle ausgewählter Zytokine imGlioblastom........................................... 32
1.9.1
1.10
1.11
p53 - A llg em e ines.................................................................................................24
Regulation der p53 A ktivitä t................................................................................26
Die Rolle von p53 im G lioblastom ......................................................................27
C TS-1..................................................................................................................... 26
Interleukine.......................................................................................................... 32
Tetrazyklin-induzierbare Genexpressionssysteme................................... 34
Fragestellung......................................................................................................36
2. M aterial und M eth od en ..................................................................................................... 38
2.1 Material...................................................................................................................38
2.1.1 G eräte.................................................................................................................... 36
2.1.2 C hem ikalien.......................................................................................................... 39
2.1.3 Verbrauchsm aterialien........................................................................................ 40
2.1.4 Größen- und M olekulargew ichtsm arker...........................................................41
2.1.5 Medien, Lösungen und P uffer........................................................................... 41
2.1.5.1 Medien und Lösungen für die Zellkultur............................................................41
2.1.5.2 Medien, Lösungen und Bakterien für die Klonierungsarbeit............................. 42
2.1.6 K its .......................................................................................................................... 42
2.1.7 O ligonukleotide.................................................................................................... 43
2.1.8 Antikörper...............................................................................................................44
2.1.9 V iren........................................................................................................................45
2.1.10 E nzym e................................................................................................................45
2.1.11 Zelllinien...............................................................................................................46
2.1.12 P lasm ide..............................................................................................................47
2.1.13 shR N A..................................................................................................................47
2.2
Methoden.................................................................................................
48
2.2.1 Allgemeine Methodik.................................................................................
48
2.2.1.1 Kultivierung von Zellen.......................................................................................48
2.2.1.2 Passage und Konservierung von Zellen.......................................................... 48
2.2.1.3 Transfektionen.................................................................................................49
2.2.1.4 Transformation von E.coli............................................................................... 49
2.2.1.5 Elektroporation.................................................................................................. 50
2.2.1.6 Plasmidpräparationen........................................................................................51
2.2.1.7 Restriktionsverdau.............................................................................................51
2.2.1.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)..................................................................... 52
2.2.1.9 Agarosegelelektrophorese................................................................................ 53
2.2.1.10 Quantitative-Polymerasekettenreaktion (qPCR)............................................ 53
2.2.1.11 RNA-Isolation................................................................................................. 55
2.2.1.12 Synthese von cD N A ....................................................................................... 55
2.2.1.13 Herstellung von Proteinlysaten.......................................................................55
2.2.1.14 Herstellung von nukleären Extrakten............................................................. 56
2.2.1.15 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford.........................................56
2.2.1.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese......................................................... 57
2.2.1.17 Western-Blotting............................................................................................. 58
2.2.1.18 Inkubation in Erst- und Zweitantikörper......................................................... 59
2.2.2
Spezielle M ethodik.............................................................................................61
2.2.2.1 Generierung Adenoviraler Expressionsplasmide............................................. 61
2.2.2 2 Sequenzierung des rekombinanten Genoms Ad-Tet-kB^ # 9 /6 ...................... 63
2.2.2.3 Virale Infektion und Titerbestimmung............................................................... 64
2.2.2 4 Wachstums (Proliferations)-Assay....................................................................66
2.2.2 5 Wound-Healing-Assay/Migrations-Scratch Assay............................................ 66
2.2.26 Reportergenassay..............................................................................................67
2.2.2 7 Bestrahlung von Zellen...................................................................................... 69
2.2.2.8 Semiquantitative Zytokindetektion.....................................................................69
2.2.2.9 IL-6 ELISA.......................................................................................................... 69
2.2.2.10 Datenbanken.................................................................................................. 70
2.2.2.11 Statistische Auswertung.................................................................................. 70
3.
Ergebnisse......................................................................................................... 72
3.1 Untersuchung zur lxB£-Expression in humanem Gehirn und im
Glioblastom...................................................................................................................72
3.1.1 IkB£ Expression in humanen Glioblastomproben der TCGA Datenbank.. 72
3.1.2 Ik B£ Expression in humanen etablierten Gliomzellininen, primären
Gliomzelllinien und in nicht-neoplastischem H irngew ebe....................................... 73
3.2 Charakterisierung des adenoviralen, tetrazyklin-induzierbaren
Expressionssystems zur Untersuchung von IkBC............................................... 75
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.3
K lonierung.............................................................................................................. 75
S equenzierung......................................................................................................76
Zeitlicher A blauf der kB ^-lnduktion nach Infektion mit A d -T e t-k B ^ ......... 77
Die Rolle von IkB£ im Glioblastom.................................................................... 78
3.3.1 Untersuchung des Einflusses der Ad-CTS1 Infektion auf die Expression
von k B C ...................................................................................................
78
3.3.2 Untersuchung des Einflusses von kB £ auf Ad-CTS1 vermittelten Zelltod 79
3.3.3 Untersuchung des Einflusses von kB £ auf die Zellteilungsrate in
G liom zellen...................................................................................................................... 81
3.3.4 Untersuchung des Einflusses von k B £ auf die Migration von Gliomzellen
................................................................................................................................82
3.3.5 Untersuchung des Einflusses von kB<; auf die Sensitivität von LNT-229
Gliomzellen gegenüber C hem otherapeutika............................................................ 83
3.4
Der Einfluss von IkB£ auf die Expression inflammatorischer Zytokine... 85
3.4.1
Untersuchung des Einflusses von kB < auf die Sezernierung
proinflam m atorischer Zytokine im G lioblastom ......................................................... 85
3.4.2 Untersuchung des Einflusses von kB £ auf die Expression von IL-6,
CXCL1 sowie IL -6 ........................................................................................................... 66
3.5 Der Einfluss von ionisierender Strahlung auf die IkB£ Expression in
Glioblastomzellen.......................................................................................................... 88
3.5.1 Untersuchung des Einflusses von y-Strahlung auf die Expression von Ik B£,
IL-6, IL-8, sowie CXCL1 in LNT-229 Z e lle n ..................................................................88
3.5.2 Untersuchung des shRNA vermittelten knockdowns von IkBC auf die
strahlungsbedingte Expression von IL-6, IL-8 und C X C L1........................................90
3.6 Einfluss der Expression von IkB£, IL-6, IL-8 und CXCL1 auf das
Gesamtüberleben von Gliompatienten......................................................................93
4. Diskussion............................................................................................................ 95
4.1
4.2
Methodik................................................................................................................ 96
Die Relevanz von IkB£ im Glioblastom........................................................... 98
4.2.1
Die gesteigerte Expression von Ik B£ in etablierten und primären
GlioblastomzeHlinien......................................................................................................... 96
4.2.2 Einfluss von IkB< auf Ad-CTS-1 vermittelten Zelltod im Glioblastom ........99
4.2.3 Einfluss der Ik B£ Expression auf die Sensitivität von Glioblastomzellen
gegenüber D oxorubicin...................................................................................................100
4.2.4 Einfluss von I kB£ auf die Migration & Proliferation von Glioblastomzellen
............................................................................................................................. 101
4.3 Die Rolle von IkB£ beider strahlungsbedingten Expression von
Zytokinen im Glioblastom.......................................................................................... 102
4.3.1 Analysen der Zytokinsekretion nach adenoviral verm ittelter Steigerung der
kB ^-E xp re ssio n ............................................................................................................... 102
4.3.2 Ik B£ moduliert die strahlungsbedingte Expression inflam matorischer
Zytokine im G lio b la sto m ................................................................................................ 105
4.3.3 Hohe IkB< Expression korreliert mit einer schlechten P ro g n o se ............ 106
4.4
Klinische Relevanz............................................................................................ 108
4.4.1
4.4.2
IkB£ als Tum orm arker im G liobla stom .......................
108
Therapeutische Im plikation.............................................................................. 108
5. Zusammenfassung.............................................................................................110
6. Summary..............................................................................................................112
7. Literatur.............................................................
113
8. Anhang.................................................................................................................131
8.1
8.2
8.3
Abbildungsverzeichnis.....................................................................................131
Tabellenverzeichnis........................................................................................... 133
Plasmidkarten.....................................................................................................134
8.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
8.3.5
pTreTight-kB<.....................................................................................................134
pTrack-Tet-kB<#9.............................................................................................. 135
pAd E asy-1 .......................................................................................................... 135
Pacl-Iinearisierter Plasmid nach Rekombination im A dE asy-G enom ...... 136
EGFP Expression in Glioblastomzellen nach adenoviraler Infektion....... 136
9. Veröffentlichung.................................................................................................137
10. Danksagung......................................................................................................138
11. Lebenslauf.........................................................................................................139