Biofilm – Problem oder Perspektive?
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ÜBERSICHT ❚ M. Folwaczny, R. Hickel1 Biofilm – Problem oder Perspektive? Die spezifischen Bedingungen in der Mundhöhle ermöglichen den ortsständigen Bakterien die Ausbildung von mikrobiellen Biofilmen auf den anorganischen Zahnoberflächen. Bakterien in Biofilmen besitzen gegenüber Mikroorganismen in planktonischer Lebensform einige Vorteile, wie zum Beispiel eine hohe Resistenz gegen antimikrobielle Noxen. Dentale Biofilme sind außerdem, auf Grund einer speziellen Verankerung mit Hilfe von unlöslichen extrazellulären Polysacchariden, nur sehr schwer von der Zahnoberfläche abzulösen. Die wirksame therapeutische Beseitigung von dentalen Biofilmen, beispielsweise im Rahmen der Parodontaltherapie, ist deshalb häufig außerordentlich schwierig. Die teilweise sehr komplexen Entwicklungsund Erhaltungsprozesse innerhalb des ökologischen Systems der Biofilme eröffnen jedoch möglicherweise neue therapeutische Optionen. Die vorliegende Übersicht soll den aktuellen Stand der Forschung zu Entwicklung und Aufbau von bakteriellen Biofilmen zusammenfassen und mögliche Ansätze für neue Behandlungsstrategien diskutieren. Schlüsselwörter: Biofilm, Plaque, Entfernung, antibakterielle Behandlung Biofilms – problem or chance? Oral bacteria establish biofilms on the mineralised tooth surfaces due to the specific growth conditions within the oral cavity. Bacteria organized as a biofilm have several particular advantages as compared to bacteria in planctonic growth, i.e. resistance against antimicrobial noxae. Moreover, dental biofilms can be removed only insufficiently from the tooth surface since specifically these biofilms establish a very strong adhesion to the tooth surface by the production of chemically very stable extracellular polysaccharides. The thorough removal of dental biofilms, e.g. during periodontal root surface management, is very difficult to achieve in most cases. However, the complex program of biochemical processes leading to the manifestation and strongly needed for the maintenance of biofilms might offer completely new therapeutic strategies. The present review presents the recent knowledge regarding the development and architecture of bacterial biofilms. In addition, future therapeutic strategies are discussed. Keywords: biofilm, plaque, removal treatment, antibacterial 1. Einleitung Mikrobielle Biofilme stellen eine spezielle, symbiotische Lebensform von Bakterien und Pilzen dar. Obwohl schon frühe Pioniere auf dem Gebiet der Mikrobiologie wie Anton van Leeuwenhoek im 17. Jahrhundert die ersten mikroskopischen Untersuchungen an Bakterien in Biofilmen vornahmen, dauerte es immerhin bis ca. 1940, bis man die Existenz von mikrobiellen Biofilmen grundsätzlich erkannte [77]. Bis zu 1 Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie, Ludwig-Maximilians-Universität München (Direktor: Prof. Dr. R. Hickel) 648 diesem Zeitpunkt besaß das Modell allgemeine Gültigkeit, wonach die Besiedelung von natürlichen und künstlichen Oberflächen durch Bakterien und Pilze im wesentlichen einem zufälligen Aufbau folgt und durch die einfache Vermehrung von anhaftenden Mikroorganismen erreicht wird. Gestützt wurde diese, aus heutiger Sicht sehr vereinfachende Annahme nicht zuletzt durch die klassischen Kulturverfahren in der mikrobiologischen Analyse [70]. Durch die Inokulation von Bakterien in flüssige oder feste Nährmedien wird nach einer ausreichend langen Inkubationsphase ein disseminierter Bakterienrasen oder eine trübe Zellsuspension gewonnen, die tatsächlich einer zufälligen Verteilung der einzelnen Zellen folgen. Neben dieser planktonischen Wuchsform ist es inzwischen allgemein anerkannt, dass Bakterien auf den unterschiedlichsten natürlichen und künstlichen Oberflächen eine Art sesshafte Wuchsform als Biofilm etablieren können [14]. Wahrscheinlich sind sogar fast alle Bakterienarten in der Lage, neben der planktonischen, frei flottierenden Wuchsform, auch ein auf der Unterlage festhaftendes Wachstum als Biofilm zu zeigen [15]. Besonderes Charakteristikum aller Biofilme ist neben der festen Anheftung an einem Ort, ihr weitgehend strukturierter Aufbau [29]. Wie bei allen natürlichen evolutionären Entwicklungen besitzt die Organisation von einzelnen oder mehreren Bakterienarten als Biofilm einige Selektionsvorteile. Aus medizinischer Sicht ist vor allem der große Schutz vor den Wirkungen von antibakteriellen Substanzen oder körpereigenen Abwehrmechanismen von Bedeutung [7, 87, 115]. Demgegenüber sind Bakterien in planktonischer Wuchsform den Angriffen von antibakteriellen Noxen stets unmittelbar ausgesetzt [17]. Im direkten Vergleich der beiden Organisationsformen zeigen sich Bakterien einer identischen Spezies in Biofilmen gegenüber Konzentrationen eines Antibiotikums, entsprechend der 1000fachen minimalen Inhibitionskonzentration für planktonische Supsensionen, noch als resistent [9]. Auf Grund der großen Tendenz zur Manifestation auf anorganischen Oberflächen galten Biofilme zunächst vor allem in der Umweltbiologie und der Wassertechnik als wichtiges Problem [6, 29]. Die Besiedelung der wasserführenden Systeme von zahnärztlichen Behandlungseinheiten durch Biofilme bildet ein besonderes wassertechnisches Problem, mit dem jeder Zahnarzt nahezu täglich konfrontiert wird [64, 112]. Nach wenigen Wochen des Gebrauchs findet sich in den wasserführenden Kompartimenten dentaler Einheiten regelmäßig eine persistierende Besiedelung mit unterschiedlichen bakteriellen Spezies, unter anderem der Gattung Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium sowie durch Legionella pneumophila [2, 63, 102]. Die charakteristische, hohe Resistenz von Bakterien in Biofilmen gegen antibakterielle Substanzen unterstreicht die Feststellung, wonach bislang kein Desinfektionsverfahren zur wirkungsvollen und dauerhaften Beseitigung des bakteriellen Biofilms in dentalen Behandlungseinheiten zur Verfügung steht [29, 62, 108]. Erst später erkannte man die herausragende Bedeutung von Biofilmen für die Medizin. Gerade die bereits erwähnte © Deutscher Ärzte-Verlag, Köln Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm außerordentlich hohe Resistenz von Bakterien in Biofilmen gegen nahezu jede Art von antibakteriellen Noxen, gilt inzwischen als die Hauptursache für eine Reihe von nur sehr unzureichend zu behandelnden chronischen Infektionen, wie zum Beispiel der Endokarditis lenta, der chronischen bakteriellen Prostatitis oder der mit der zystischen Fibrose assoziierten bakteriellen Infektion der tiefen Atemwege [17, 22] (Tabelle 1). Kürzlich wurde die Bildung von Biofilmen auf Gallensteinen durch Salmonella sp. als Ursache für das Auftreten von chronischen Salmonellen-Dauerausscheidern postuliert [74]. 1a 1b Biofilm-assoziierte Erkrankungen oral Karies Parodontitis marginalis Parodontitis apicalis systemisch Zystische Fibrose Otitis media Osteomyelitis Bakterielle Prostatitis Bakterielle Endokarditis Gallenwegsinfektionen u. a. Tabelle 1 Auflistung von häufigen biofilm-assoziierten Erkrankungen Auf Grund der großen in der Mundhöhle verfügbaren anorganischen Oberflächen spielen bakterielle Biofilme auch in der Pathogenese zahlreicher dentaler Erkrankungen, insbesondere der marginalen Parodontitis, eine entscheidende Rolle [21]. Der Zusammenhang zwischen der Ablagerung von sichtbaren oder nicht-sichtbaren bakteriellen Belägen, beispielsweise Plaque, im Bereich des marginalen Gingivasulcus als Folge einer unzureichenden Mundhygiene und der Ausbildung einer chronischen parodontalen Entzündung gilt allgemein als gesichert [67]. Inzwischen konnten zahlreiche Studien belegen, dass die Plaque ein klinisch sichtbares Korrelat eines bakteriellen Biofilms darstellt, der sich auf der anorganischen Zahnoberfläche angeheftet hat [53]. Eine Probe der Plaque der eigenen Zähne verwendete auch der Pionier der Mikrobiologie van Leeuwenhoek bei seinen bereits erwähnten frühen mikroskopischen Beobachtung von Bakterien [14]. Allgemein imponieren reife mikrobielle Biofilme bei Betrachtung mit bloßem Auge, ähnlich wie dentale Plaque, als schleimig feuchter, weitgehend fest auf der Unterlage haftender Überzug [17] (Abb. 1). Aber nicht nur in der Pathogenese der marginalen Parodontitis, sondern auch bei der Manifestation der dentalen Karies sowie bei der Etablierung persistierender, therapierefraktärer endodontogener Infektionen scheinen nach neueren Studien bakterielle Biofilme eine entscheidende Rolle zu spielen [28, 66, 82, 118]. Mit der für den Gesamtorganismus einmaligen Situation der dauerhaften Exposition einer anorganischer Körperoberfläche gegenüber einer bakteriell besiedelten Umwelt sowie der daraus unmittelbar resultierenden, starken Neigung zur Manifestation von bakteriellen Biofilmen finden sich in der Mundhöhle spezielle mikrobiologische Bedingungen. Diese besonderen Bedingungen wurden von Marsh als die gemeinsame Ursache der insgesamt sehr häufigen bakteriogenen Erkrankungen der Mundhöhle postuliert [60]. Nach diesem Modell ist jedoch weniger die Anwesenheit eines bakteriellen Biofilms als pathologischer Faktor anzusehen, als vielmehr die fließende Umwandlung des Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 1c Abbildung 1 Dentaler Biofilm, der als Folge einer unzureichenden Mundhygiene entstanden ist und klinisch als weicher Zahnbelag (Plaque) imponiert primär physiologischen, kommensalischen mikrobiellen Ökosystems in eine pathogene Bakterienflora. Die nachfolgende Übersicht versucht, die aktuellen Vorstellungen zur Manifestation und Funktion von mikrobiellen Biofilmen zusammenzufassen sowie neue therapeutische Ansatzpunkte zu erarbeiten. 2 Biofilme 2.1 Morphologischer Aufbau von bakteriellen Biofilmen Im allgemeinen werden Biofilme als Bakterienpopulationen definiert, die in eine durch die Bakterien selbst produzierte extrazelluläre Matrix polymerer Moleküle eingebettet sind und fest auf einer Unterlage haften [16]. Darüber hinaus zeigen die als Biofilm organisierten Bakterien eine völlige andere phänotypische Ausprägung sowie ein unterschiedliches 649 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm Abbildung 2 Schematische Darstellung des Aufbaus von bakteriellen Biofilmen: Auf der anorganischen Oberfläche bilden sich aus einer oder mehreren Bakterienspezies turm- oder pilzförmige Mikrokolonien. Zwischen den einzelnen Kolonien liegen Wasserkanäle, die eine primitive Flüssigkeitszirkulation im Biofilm gewährleisten und dadurch den Zu- und Abtransport von Nährstoffen und Metaboliten ermöglichen (modifiziert nach Stoodley et al. [89]) Wachstumsverhalten als Bakterien der identischen Art in planktonischer Kolonie [69, 118]. Einfacher ausgedrückt, setzen sich Biofilme aus zwei Komponenten zusammen, den eigentlichen Bakterienzellen (15 – 20%) und einer organischen polymeren Matrix (75 – 80%) [95]. Biofilme können von einer einzigen, mehreren oder vielen verschiedenen Bakterienspezies gebildet werden [29] und können auf Schichtstärken von mehr als 5 mm anwachsen [13]. Am Aufbau der Biofilme beteiligen sich als morphologische Grundeinheit sogenannte Mikrokolonien. Die bakteriellen Mikrokolonien sind meistens aus zahlreichen unterschiedlichen Bakterienspezies zusammengesetzt [13]. In der Betrachtung mit dem „confokalen laserscanning Mikroskop“ (CLSM) imponieren diese Einzelkolonien charakteristischerweise als pilzförmige oder turmartige Gebilde [89, 93] (Abb. 2). Die Mikrokolonien besitzen eine sehr feste basale Verankerung auf der besiedelten Oberfläche [95]. An der dem Umgebungsmedium zugewandten Seite zeigen die Ränder benachbarter Mikrokolonien fließende Übergänge ineinander, die wahrscheinlich durch die innige Verwebung der polymeren extrazellulären Matrix erreicht wird [8]. Zwischen den Einzelkolonien wird der Biofilm von einem Netzwerk von wasserführenden Kanälen durchzogen [55]. Innerhalb dieses Kanalsystems konnte ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom nachgewiesen werden, der wahrscheinlich dem Austausch bzw. Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten sowie zur Gewährleistung der Homöostase innerhalb des Biofilms dient [24, 25, 27, 92]. Möglicherweise kommt diesem Kanalsystem somit die Funktion eines primitiven Kreislaufs für den „Gesamtorganismus“ des Biofilms zu [15]. Nach Tolker-Nielsen et al. könnte das Kanalsystem auf dem Weg des unten näher erläuterten „quorum sensing“, also dem biochemischen Informationsaustausch zwischen den am Aufbau beteiligten Zellen, aktiv formiert werden [103]. Die Gestalt des Biofilms wird im Wesentlichen durch das Gerüst der extrazellulären Matrix aufrecht erhalten, das 650 gleichzeitig die einzelnen Bakterienzellen im Gesamtverband zusammenhält [39]. Die molekulare Struktur sowie die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix ist außerordentlich komplex und hängt von zahlreichen Faktoren ab, unter anderem von den am Aufbau des Biofilms beteiligten Bakterienarten, der besiedelten Oberfläche sowie der Reihenfolge der Besiedelung durch die beteiligten Bakterien [100]. Im allgemeinen besteht die extrazelluläre Matrix aber fast immer aus unterschiedlichen verzweigtkettigen Polysacchariden mit atypischen Glykosidverbindungen sowie Proteinen und Salzen [101]. Zusätzlich spielen offensichtlich auch speziell für die Matrix synthetisierte und extrazellulär abgelagerte DNA-Moleküle eine wichtige Rolle für den Aufbau des Biofilms [111]. Die extrazelluläre Matrix bietet nicht nur das Gerüst und die notwendige mechanische Stabilität für den Biofilm, sondern erfüllt gleichzeitig zusätzliche Aufgaben, wie den Schutz vor Austrocknung der Bakterien oder vor der Einwirkung antibakterieller Noxen [30]. Darüber hinaus übt die extrazelluläre Matrix eine Pufferfunktion aus und sorgt somit für ein kontinuierliches, von externen Schwankungen wenig abhängiges Angebot an spezifischen Nährsubstraten und freiem Wasser sowie für einen konstanten pH-Wert [31, 45]. Die extrazellulären Polysaccharide übernehmen außerdem eine wichtige Funktion bei der Anheftung von Bakterien an die besiedelte Oberfläche bzw. an einen bereits etablierten Biofilm [49, 79]. Insbesondere die extrazellulären Polysaccharide könnten auch als Nährstoff durch die im Biofilm anwesenden Bakterien herangezogen werden [100]. Obwohl der Abbau und die Einschleusung von extrazellulären Polysacchariden in den eigenen Stoffwechsel der produzierenden Bakterien unwahrscheinlich ist, könnten andere, am Aufbau des Biofilms beteiligten Bakterienarten Polysaccharide aus fremder Synthese im Stoffwechsel nutzbar machen [101]. Der morphologische Aufbau bakterieller Biofilme wird wesentlich von den biochemischen und physikalischen Umgebungsbedingungen beeinflusst. Bei sehr ausgeprägter, turbulenter Strömung nimmt die durchschnittliche Gesamt- Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm stärke des Biofilms in der Regel ab [58, 106]. Gleichzeitig verändert sich die charakteristische pilzfömige Gestalt der Mikrokolonien, die mit dem basalen Ende auf der Unterlage angeheftet sind. Durch die starke Strömung wird das freie Ende der Mikrokolonie faserförmig ausgezogen und flottiert schließlich im Flüssigkeitsstrom [39, 89, 95]. Die Länge dieser Ausziehungen ist dabei umgekehrt korreliert zur Stärke der durch das Umgebungsmedium vermittelten Scherkräfte [89]. Die Ursachen für die Ausbildung der filamentösen Fortsätze konnten noch nicht abschließend geklärt werden. Grundsätzlich kommen dem strömungsabhängigen Umbau der Kolonie jedoch mehrere Vorteile zu: Zum einen verringert die Ausbildung von Filamenten den Strömungswiderstand der Mikrokolonie und kann somit das Risiko des strömungsbedingten Verlustes der Oberflächenhaftung deutlich herabsetzen [95]. Zum anderen trägt die Ausbildung von Filamenten zur Verbesserung der nutritiven Versorgung des Biofilms bei. Die Filamente vergrößern zudem die Gesamtoberfläche des Biofilms [90, 93] und erhöhen, durch die Vermittlung eines stärkeren Wasseraustausch an der Oberfläche des Biofilms, auch im internen Kanalsystems den Flüssigkeitsstrom [83]. Die morphologische Struktur und Gesamtstärke des Biofilms wird außerdem durch die Verfügbarkeit von Nahrungsstoffen sowie durch einwirkende elektrochemische Potentiale beeinflusst [91, 93]. Insgesamt ist der ultrastrukturelle Aufbau eines Biofilms nicht statisch, sondern zeigt eine sehr dynamische Anpassung an die ständig wechselnden natürlichen Lebensbedingungen [39]. 2.2 Funktionelle Kompartimentierung von bakteriellen Biofilmen Neben der komplexen morphologischen Architektur zeigen bakterielle Biofilme gleichzeitig auch eine funktionelle Kompartimentierung [13]. So finden sich in sehr engen räumlich benachbarten Bereichen des Biofilms Kompartimente mit unterschiedlichem elektrochemischen Potential, verschiedener Sauerstoffspannung oder pH-Wert [16, 26]. Diese Kompartimentierung des Biofilms in unterschiedliche funktionelle Nischen spiegelt auch die nähere Betrachtung der biologischen Aktivität wieder. Innerhalb des Biofilms sind Bereiche mit unterschiedlich starker Reproduktionsrate, Proteinexprimierung oder Verfügbarkeit energiereicher Verbindungen anzutreffen [46, 86, 116]. Eindrucksvolles Beispiel der Bildung von Bereichen mit unterschiedlichen Aufgabengebieten geben Biofilme mit Bakterien der Spezies Pseudoalteromonas S9, einer marinen Bakterienart [5]. Diese Bakterien zeigen innerhalb eines Biofilms eine Art von Arbeitsteilung, in dem nur eine Subpopulation Chitin-abbauende Enzyme bildet, während eine zweite Untergruppe sich auf die Zellteilung konzentriert und Tochterzellen freisetzt. Die zweite Subpopulation nützt dabei die durch die Chitinase-produzierenden Bakterien freigesetzten Stoffwechselprodukte aus dem Chitinabbau. Allgemein besetzen Bakterien der gleichen Spezies innerhalb eines Biofilms gleichzeitig verschiedene ökologische Mikronischen. Durch eine unterschiedliche phänotypische Ausprägung passen sich die Bakterien somit ideal an die vom Umgebungsmedium sowie durch die Wechselwirkung mit anderen Mikronischen determinierten spezifischen Lebensbedingungen an [13, 17]. Diese Anpassung erfolgt durch die selektive Regulation der Gentranskriptionsrate nicht nur im Rahmen der primären Entwicklung des Biofilms. Auch im Stadium der endgültigen Etablierung findet eine kontinuierliche, genetisch gesteuerte Adaption an die ständig wechselnden Lebensbedingungen statt [39, 80]. Im Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 Verlauf der Entwicklung und Erhaltung des Biofilms werden von den Bakterien der Spezies Streptococcus mutans spezielle Funktionen zum gezielten interzellulären Genaustausch, die sogenannte „genetische Kompetenz“, aktiviert [118]. Dadurch werden die Fähigkeiten der Bakterienzellen zur fortlaufenden Anpassung an die in der Mundhöhle extrem schwankenden Lebensbedingungen zusätzlich erweitert. Li et al. beispielsweise zeigen, dass die Regulation der Produktion von extrazellulären Polysacchariden von Streptococcus mutans durch den pH-Wert und die Verfügbarkeit von Kohlenhydratverbindungen im Umgebungsmedium auf Transkriptionsebene reguliert wird [56]. 2.3 Mechanische Eigenschaften von bakteriellen Biofilmen Die physikalischen Strömungsbedingungen im Umgebungsmedium determinieren nicht nur die Architektur des Biofilms, sondern stehen auch im engen Zusammenhang mit den physikalisch-mechanischen Eigenschaften des Biofilms [47]. Biofilme, die auf Grund einer stark turbulenten Strömung des Umgebungsmediums hohen Scherkräften ausgesetzt sind, zeigen in der Regel eine vergleichsweise hohe Spannungs- und Bruchfestigkeit [29]. Die Haftung des Biofilms auf der Unterlage ist außerordentlich hoch. So können sich Biofilme auch in Bereichen etablieren, in denen das flüssige Umgebungsmedium eine ausgeprägt turbulente Strömung von bis zu 5000 Reynolds zeigt und somit hohe Scherkräfte auf den Biofilm ausübt [29]. Das Elastizitätsmodul der mikrobiellen Biofilme ist dagegen mit Werten zwischen 27 – 60 N/m2 sehr niedrig [96]. Allgemein zeigen Biofilme ein viskoelastisches Verhalten bei Einwirken deformierender Kräfte [68, 71]. Bei Kräften bis zur zweifachen Größe der während der Entwicklung im Umgebungsmedium wirkenden mittleren Scherkraft, zeigt der Biofilm ein rein elastisches Verhalten gegen die Deformation. Bei größeren Kräften beginnt das Gesamtgebilde zu fließen [94]. Bei der Betrachtung des mechanischen Verhaltens von Biofilmen gegen deformierende Kräfte, muss auch die Dauer der Deformierung als Einflussgröße Berücksichtigung finden. So können auch kleinere Kräfte bei ausreichend langer Einwirkungsdauer zum Fließen des Biofilms führen und somit irreversible Formveränderungen induzieren [47]. Dieses Verhalten entspricht den allgemein bekannten Eigenschaften polymerer Hydrogele. 3 Entwicklung bakterieller Biofilme Die Entwicklung eines reifen Biofilms folgt einem komplexen Programm unterschiedlicher Prozesse, die von den am Aufbau beteiligten Bakterienzellen initiiert und getragen werden [70]. Die einzelnen an der Entwicklung beteiligten Vorgänge sind vorerst noch nicht im Detail aufgeklärt worden. Auf der Basis der bislang zur Verfügung stehenden Daten existiert jedoch ein allgemein anerkanntes Modell, das unabhängig von der Art des Biofilms, den formierenden Bakterien sowie dem Umgebungsmedium, Gültigkeit besitzt [39]. Einschränkend muss berücksichtigt werden, dass zentrale Aspekte dieses Modells im wesentlichen auf den Beobachtungen an Biofilmen von Pseudomonas spp. basieren. Nach diesem Modell kann die Etablierung von bakteriellen Biofilmen in drei Schritte unterteilt werden: Die primäre Adhäsion planktonischer Bakterien auf der besiedelten Oberfläche, die Proliferation und Formation von Mikrokolonien einschließlich der Ausbildung der charakteristischen Biofilmarchitektur sowie die Freisetzung von Tochterkolonien [17] (Abb. 3). 651 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm Abbildung 3 Schematische Darstellung der Etablierung von Biofilmen der Spezies Pseudomonas aeruginosa: (a) Übergang von Bakterienzellen aus planktonischer Kolonie und primäre Adhäsion an die freie Oberfläche; (b) Ausbildung eines Monolayers aus Bakterienzellen; (c) Formation von Mikrokolonien aus den angehefteten Zellen durch aktive Bewegung („twitching mobility“); (d) reifer Biofilm aus mehreren Mikrokolonien, die aus Bakterienzellen und extrazellulärer Matrix gebildet werden; (e) Freisetzung von Tochterkolonien und einzelnen Zellen in das Umgebungsmedium (modifiziert nach Costerton et al. [17]) 3.1 Initiale Adhäsion Die Etablierung von bakteriellen Biofilmen auf Oberflächen beginnt mit der Anheftung von frei flottierenden Bakterienzellen an eine natürliche oder künstliche Oberfläche [39]. Wahrscheinlich steht die Wechselwirkung von Bakterienzellen in planktonischer Kolonie mit einer freien Oberfläche in Abhängigkeit vom Einfluss unterschiedlicher Regulationsgrößen, wie zum Beispiel dem Nährstoffgehalt des Umgebungsmediums [72, 114]. Für eine Reihe von gram-negativen Bakterien ist die Verfügbarkeit von funktionierenden Mobilitätssystemen an der Zelloberfläche eine wichtige Voraussetzung zur frühen Kolonisation von freien Oberflächen und somit für den Übergang aus dem planktonischen Stadium in eine Biofilmpopulation. Bakterien der Spezies Pseudomonas aeruginosa, die durch Mutation die Fähigkeit zur Exprimierung von Flagellen verloren haben, sind auch über längere Zeiträume nicht in der Lage sich auf einer freien Oberfläche anzuheften [70, 80]. Ähnliche Beobachtungen wurden für Mutanten der Spezies Vibrio cholerae berichtet, die ebenfalls keine flagellären Zellstrukturen ausbilden und deshalb Oberflächen nur sehr unzureichend besiedeln konnten [110]. Die genaue Funktion der Flagellen-assoziierten Mobilität gram-negativer Bakterien im Rahmen des Aufbaus von bakteriellen Biofilmen konnte bislang noch nicht endgültig geklärt werden. Grundsätzlich könnten den Flagellen jedoch insbesondere zwei Aufgaben während der frühen Kolonisation von Oberflächen zukommen: Einerseits könnten die Flagellen die Rolle eines Adhäsins übernehmen, also einer 652 Art von molekularem Anker, der mit spezifischen, komplementären Strukturen der zu besiedelnden Oberfläche in Wechselwirkung tritt [54]. Andererseits könnten die Flagellen dabei helfen, abstoßende Kräfte der besiedelten Oberfläche zu überwinden und somit zur festen Anheftung beitragen [63]. Allerdings scheinen Strukturen der zelleigenen Mobilität nicht in gleicher Weise für alle Bakterienarten für die frühe Adhäsion auf freien Oberflächen notwendig zu sein. Einige nicht bewegliche, gram-positive Bakterienarten, unter anderem des Genus Staphylococcus, Streptococcus und Mycobacterium exprimieren an der Zelloberfläche spezielle Adhäsine, die eine stabile Anheftung an die Oberfläche vermitteln. Als Adhäsine dienen meistens Proteine oder Polysaccharide, wie das von Staphylococcus epidermidis gebildete „polysaccharide intercellular adhesine/hemagglutinine“ (PIA/HA) oder das auf der Zelloberfläche von Staphylococcus aureus zu findende „biofilm-associated protein“ (bap) [20, 79]. Im Gegensatz zu den Adhäsinen gram-negativer Bakterien können diese Strukturen nicht zur Zellmobilität beitragen (Abb. 4). Bei den Adhäsinen von oralen Streptokokkenspezies handelt es sich häufig um lektinähnliche Proteine, die bevorzugt mit Kohlenhydratverbindungen, häufig mit Galaktosidverbindungen, in eine einfache, nicht-kovalente stereochemische Wechselwirkung treten und durch diese Rezeptor-Ligand-Reaktion eine mechanische Verbindung ausbilden [49, 78]. Die Etablierung bakterieller Biofilme auf frisch gereinigten Zahnoberflächen beginnt mit der Ablagerung der Pellicle-Schicht aus unterschiedlichen Glykoproteinen, Muzinen und Enzymen des Speichels [36, 37]. In diesen Speichelver- Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm Abbildung 4 Primäre Adhäsion von neu besiedelnden Bakterien: (a) Anheftung der kolonisierenden Bakterienzelle an Strukturen der freien Oberfläche durch Flagellen (z.B. Pseudomonas aeruginosa); (b) Anheftung der kolonisierenden Bakterienzelle an spezifische Rezeptoren der Pellicle-Schicht (z.B. Streptococcus mutans) Neben der Adhäsin-vermittelten Anlagerung an die Pellicle-Schicht, ist auch die Ablagerung von unlöslichen Polysacchariden an der Anheftung von oralen Bakterien auf Oberflächen beteiligt. Insbesondere Bakterien der Spezies Streptococcus mutans sezernieren ein klebriges α-1,3-Glykanmolekül auf die Zahnoberfläche, das den besiedelnden Zellen die Anheftung erleichtert [104, 105]. Die Etablierung eines bakteriellen Biofilms auf einer freien Oberfläche kann außerdem auch durch die Ausbreitung der Randbereiche eines präformierten, reifen Biofilms oder durch die Ablösung und anschließende erneute Anheftung größerer Zellkonglomerate des Biofilms erfolgen [89, 97]. Dieser Weg bietet den Vorteil der unmittelbaren Ausbreitung von Bakterien im geschützten Milieu des reifen Biofilms ohne den aufwendigen Umweg über die planktonische Lebensform [39]. 3.2 Proliferation und Reifung des Biofilms Nach der initialen Besiedelung der freien Oberfläche findet in Anpassung an die spezifischen Umgebungsbedingungen eine Reifung der Strukturen des Biofilms statt. An der Reifung und der damit verbundenen Ausbildung der individuellen phänotypischen Eigenschaften der Bakterienzelle sind zahlreiche Prozesse beteiligt, die bislang nur exemplarisch aufgeklärt wurden. Abbildung 5 Ko-Aggregation von Bakterien durch „bridging“: (a) Anheftung der neu besiedelnFür orale Biofilme, die aus zahlreichen verden Bakterienzelle (Bakt. 2) unmittelbar an eine bereits auf der Oberfläche haftende Zelle schiedenen Bakterienspezies gebildet werden, (Bakt. 1). Die zweite Zelle kann durch die Anlagerung an den Biofilm einer weiteren Bakterienzelle (Bakt. 3) die Adhäsion am Biofilm vermitteln; (b) indirekte Anheftung einer neu kolonisiemuss zunächst die Anheftung aller konstituierenden Bakterienzelle (Bakt. 2) an eine vorhandene Zelle (Bakt. 1) durch gemeinsame Anlagerenden Bakterien an den präformierten Biorung an extrazelluläre Matrixmoleküle film erfolgen [78]. Die kontinuierliche Erweiterung der am Aufbau des Biofilms beteiligten bindungen finden sich sehr viele prolinreiche Proteindomä- Bakterienspezies verläuft in dentalen Biofilmen in der Regel nen, die durch ein C-terminales Prolin-Glutamin-Dipeptid über mehrere Wochen. Während in der frühen Entwickeine Rezeptorstruktur für orale Bakterienarten bilden [37]. lungsphase des Biofilms die Adhäsion von Bakterien unVor allem orale Streptokokkenspezies tragen Adhäsine, die mittelbar an die freie Oberfläche (Zelle-Oberfläche) übermit diesen Rezeptorstrukturen in Wechselwirkung treten wiegt, erfolgt die Anheftung neu hinzutretender Bakterienkönnen. spezies in späteren Stadien vor allem auf dem Weg der sogeBakterien der Spezies Streptococcus sanguinis sind wahr- nannten Ko-Aggregation [49]. Die Ko-Aggregation vermittelt scheinlich die ersten Kolonisatoren der Pellicle-Schicht [78]. eine indirekte Anheftung (Zelle-Zelle) der neuen KolonisatoDie Bakterien bilden in zwei Schritten eine stabile Verbin- ren an die besiedelte Oberfläche durch Anbindung an die dung zu spezifischen Rezeptordomänen der organischen primär mit der Pellicle-Schicht verbundenen Bakterienzellen Pellicle-Moleküle aus. Zunächst findet eine noch wenig sta- [50]. Dabei können sich die neu hinzutretenden Bakterien bile nicht-kovalente Anlagerung über hydrophobe Wechsel- entweder direkt an die Zelloberfläche der bereits im Biofilm wirkungen und elektrostatische Anziehung statt. In einer vorhandenen Bakterien binden. Alternativ kann die Adhäzweiten Phase erfolgt schließlich die Festigung der Bindung sion auch auf dem Weg des sogenannten „bridging“ unter über eine nicht-kovalente stereochemische Verbindung zwi- Zwischenschaltung einer oder mehrerer speziesfremder schen den Adhäsinen der Zelloberfläche und den Rezeptor- Bakterienzellen zu Stande kommen [44] (Abb. 5). strukturen der Pellicle-Schicht [19]. Bei der sekundären Besiedelung kommt dem bereits für Die Adhäsionsvermittlung ist aber offenbar nicht die ein- die primäre Kolonisation beschriebenen Prozess der Adhäzige Aufgabe der Adhäsine. So dienen die Adhäsine zusätz- sionsvermittlung durch die Produktion unlöslicher, fest haflich als Sensoren, die eine optimale Anpassung der phänoty- tender extrazelluärer Polysaccharide, insbesondere durch die pischen Eigenschaften der Bakterienzelle an die Umgebung Vertreter der Streptokokken-sp., eine wichtige Rolle zu. Die ermöglichen [11]. Beispielsweise wird durch die Art der an vermehrte Produktion von extrazellulären Polysacchariden der Zelloberfläche vorhandenen Adhäsine eine Selektion von erleichtert die Anheftung von neu besiedelnden BakterienAnsiedelungsstellen vorgenommen, die möglicherweise cha- spezies auf dem Weg des „bridging“ [78]. rakteristisch für bestimmte Umgebungsbedingungen sind. Vergleichbar den Vorgängen während der primären BeUmgekehrt konnte gezeigt werden, dass die Adhäsine als siedelung wird die Ko-Aggregation im wesentlichen durch membranständige Rezeptoren auch Signale in die Bakterien- Adhäsine vermittelt [49]. Die Ausbildung von Adhäsinen zur zelle vermitteln und dadurch Einfluss auf die Regulation der interzellulären Ko-Aggregation ist für orale MikroorganisGentranskription ausüben können [43]. men ein weit verbreitetes Phänomen, das für über 700 orale Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 653 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm Bakterienspezies nachgewiesen werden konnte [113]. Ungeachtet der Vielzahl von Adhäsinen auf oralen Bakterienspezies erfolgt die interzelluläre Adhäsion dennoch sehr selektiv. Diese hohe Selektivität spiegelt sich in der Beobachtung wider, wonach von den zahlreichen, rechnerisch möglichen Bindungsmöglichkeiten nur ein sehr geringer Anteil tatsächlich in vivo angetroffen wird [49]. Unmittelbare Folge dieser selektiven Ko-Aggregation ist das überzufällig häufige Antreffen von diskreten Kombinationen mehrerer Bakterienspezies in dentalen Biofilmen [85]. Die Ausbildung der für Biofilme charakteristischen pilzbzw. turmförmigen Mikrokolonien in der Reifungsphase kann auf zwei Wegen erfolgen: Die im Biofilm eingebetteten Bakterienzellen vermehren sich durch Zellteilung und bilden schließlich ultrastrukturell sichtbare Mikrokolonien. Pionierzellen der Spezies Streptococcus sanguinis bauen unmittelbar nach der Anheftung an die Pellicleschicht durch Proliferation pallisadenförmige Bakterienkolonien auf, die auch nach der Reifungsphase des Biofilms nur über die Mutterzelle bzw. wenige Tochterzellen auf der besiedelten Oberfläche verankert sind [52]. Ein komplexerer Prozess liegt demgegenüber der Formierung von Mikrokolonien in Biofilmen zu Grunde, die durch Pseudomonas aeruginosa gebildet werden [17]. Diese Bakterien heften sich zunächst in Form eines Monolayers an die freie Oberfläche an und gruppieren sich später, innerhalb von ca. drei Stunden, in einzelnen Mikrokolonien [70]. Voraussetzung für die Gruppierung der bereits an die Oberfläche angehefteten Bakterienzellen in Kolonien ist eine an Typ IV-Pili gebundene Mobilität. Diese spezielle Form der Mobilität, die sogenannte „twitching mobility“, ermöglicht im Rahmen der Etablierung des Biofilms die Bildung der Mikrokolonien. Auch für Biofilme der Spezies Vibrio cholerae, scheint die Ausbildung von Mikrokolonien zumindestens teilweise auf einer spezifischen, zellgebundenen Form der Mobilität zu basieren [110]. Die frühe Phase der Bildung von Mikrokolonien (< 6 h) bietet den Bakterien optimale Bedingungen für die Entwicklung der sogenannten „genetischen Kompetenz“, also der genetisch induzierten und gesteuerten Fähigkeit zum interzellulären Genaustausch [57]. In diesem Stadium stehen die Bakterienzellen in enger räumlicher Nähe zueinander und gleichzeitig finden sich noch vergleichsweise geringe Mengen an extrazellulären Matrixmolekülen, die den genetischen Austausch behindern könnten. Neben dem direkten und gezielten Genaustausch zwischen zwei Zellen bietet die große Gemeinschaft des Biofilms zusätzlich auch die Möglichkeit DNA-Moleküle aufzunehmen, die von lebenden Zellen freigesetzt wurden oder aus untergegangenen Zellen stammen [57]. Im Rahmen der Reifung werden durch die am Aufbau des Biofilms beteiligten Bakterienzellen schließlich, in Abhängigkeit von den spezifischen Umgebungsbedingungen, unterschiedliche extrazelluläre Matrixpolysaccharide produziert und freigesetzt [23]. Diesen Matrixmolekülen kommt unter anderem die Aufgabe der Stabilisierung der Architektur des Biofilms zu [49]. Für die sinnvolle Koordination der während der Reifung des Biofilms stattfindenden Einzelprozesse ist die sequentielle Exprimierung unterschiedlicher Genprodukte notwendig. Um die Genexprimierung jeweils zum richtigen Zeitpunkt in Gang zu setzen und somit eine dem Gesamtorganismus „Biofilm“ dienende, effektive Kooperation zwischen den einzelnen Bakterien und Mikrokolonien zu ermöglichen, findet zwischen den Bakterien eine interzelluläre Kommunikation statt. Diese Kommunikation basiert auf dem unten beschriebenen „quorum sensing“ [35]. 654 3.3 Freisetzung von Tochterkolonien Zur Ausbreitung des Lebensraumes spalten sich von reifen Biofilmen kontinuierlich Tochterkolonien ab [17]. Grundsätzlich erfolgt die Freisetzung von Tochterkolonien durch zwei Prozesse, die Erosion oder die Abschilferung [98]. Während die Erosion den Vorgang des gleichmäßigen Abtrags einzelner oder mehrerer Zellen umschreibt, werden durch die Abschilferung größere Zellkonglomerate aus dem Verbund des Biofilms herausgelöst. In der Regel sind beide Prozesse gleichzeitig anzutreffen. Die größeren Zellkonglomerate können einen Durchmesser bis zu 500 µm sowie eine Fläche von ca. 1000 µm2 aufweisen und ca. 1000 Zellen enthalten [98]. Zahlreiche humanpathogene Bakterienspezies können durch die Freisetzung einer einzigen größeren Tochterkolonie eine ausreichende Dosis zur erfolgreichen Infektionsübertragung abgeben. Die Ausbreitung durch einzelne große Kolonien bietet den Bakterien den Vorteil, auch nach der Ablösung aus der Gemeinschaft des Biofilms während des Transports zu einem neuen Siedlungsgebiet vor dem Einfluss antibakterieller Noxen geschützt zu sein [89]. Insgesamt ist die Freisetzung von Tochterkolonien ein sehr dynamischer Prozess. Diese Aussage wird durch die Beobachtung verdeutlicht, wonach innerhalb von 200 h bis zu 97 % der ursprünglichen Gesamtmasse des Biofilms in die Umgebung abgegeben werden [5]. Auch der Prozess der Abgabe von Tochterkolonien erfordert den Ablauf eines genetisch vorgegebenen Programms. Beispielsweise ist für die gezielte Ablösung von Tochterkolonien aus dem Verbund des Biofilms die enzymatische Durchtrennung der extrazellulären Matrix um die präformierte Kolonie notwendig [17]. Auch zur gesteuerten und für den Gesamtverbund des Biofilms sinnvollen Ablösung von Tochterkolonien findet wiederum eine Form der interzellulären Kommunikation auf dem Weg des „quorum sensing“ statt [17, 75]. 4 Interzelluläre Kommunikation durch „quorum sensing“ Zur Etablierung großer bakterieller Ökosysteme und zur Anpassung an die ständig wechselnden Umgebungsbedingungen, ist der Informationsaustausch zwischen den am Aufbau beteiligten Bakterien notwendig. Oberstes Ziel dieses Informationsaustausches ist die Regulation der Genexpression, die letztendlich den geordneten Aufbau des Biofilmsystems erst ermöglicht [34]. Der interzelluläre Informationsaustausch wird als „quorum sensing“ bezeichnet und basiert im wesentlichen auf der kontinuierlichen Abgabe von Signalmolekülen durch die Bakterienzellen in niedriger Konzentration [73]. In Abhängigkeit von der Zelldichte steigt die Konzentration der Signalmoleküle im Umgebungsmedium an und induziert nach dem Überschreiten einer kritischen Schwellenkonzentration in den Bakterienzellen die Transkription spezifischer Genprodukte, die zur gezielten Änderung der phänotypischen Funktionen des Mikroorganismus führen [99]. Allgemein stellt das „quorum sensing“ ein weit verbreitetes Phänomen dar, das für zahlreiche Bakterienarten nachgewiesen werden konnte. Unabhängig von der Bakterienart folgen die dem „quorum sensing“ zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen einem identischen Grundschema. Zur besseren Veranschaulichung kann als Modell die am längsten bekannte durch „quorum sensing“ vermittelte Regulation der Biolumineszenz in Bakterienpopulationen von Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm halten. So konnten zum Beispiel für Bakterien der Spezies Pseudomonas aeruginosa bislang zwei getrennte AHL-Regulationskreisläufe analog dem LuxI/LuxR-System nachgewiesen werden [23]. Das LasI/LasR-System ist neben der Expression verschiedener extrazellulärer Virulenzfaktoren, wie zum Beispiel Exotoxin A, auch am Aufbau der charakteristischen Architektur von Biofilmen von P. aeruginosa beteiligt [41]. Das zweite, RhlI/RhlR-Regulationssystem übt demgegenüber Einfluss auf die Produktion verschiedener Metabolite aus. Inzwischen wird angenommen, dass die AHL-gestützten Regulationskreisläufe eine sehr spezifische Wirkung ausüben und insgesamt nur in wenigen gram-negativen Bakterienspezies zur Anwendung kommen [34]. Diese Hypothese wird durch Beobachtungen gestützt, wonach Bakterien der Spezies Escherichia coli und Salmonella typhimurium, keine Abbildung 6 Interzelluläre Kommunikation („quorum sensing“) am Beispiel des LuxI/LuxR-Sys- Acyl-Homoserinlactone als Autoinduktoren produzieren [99]. Diese Bakterien scheinen tems von Vibrio fischeri: Durch die Bakterienzellen werden die beiden Lux-Proteine synthetisiert. LuxI sorgt als Enzym für die Produktion des Autoinduktors 1 (AI 1) (Acyl-Homoserinlacton: überwiegend einen zweiten Autoinduktor (AI AHL). Das AHL wird in geringen Mengen in die Umgebung abgegeben. Bei Überschreiten einer II) (Furanosyl-Boratdiester) als Signalmoleküle kritischen Schwellenkonzentration verbindet sich der Autoinduktor 1 mit dem LuxR-Protein. Der zu verwenden, der schon früher für die Spezies LuxR-AHL-Komplex erhöht die Transkription des Lumineszenz-Gens sowie des lux-Gens. Durch Vibrio harveyi beschrieben wurde [10, 81]. Der die erhöhte Transkriptionsrate des lux-Gens erfolgt eine positive Regulationsverstärkung im LuxI/LuxR-System Autoinduktor II scheint sowohl unter gram-negativen als auch gram-positiven Bakterien sehr Vibrio fischeri durch das LuxI/LuxR-System herangezogen weit verbreitet zu sein [76]. Auf Grund des sehr häufigen werden [35] (Abb. 6). Nachweises gilt das Autoinduktor-II-System als nicht-speDie Fähigkeit zur Biolumineszenz dieser gram-negativen ziesspezifisch [32]. Unter anderem wird das Autoinduktor-IIBakterien wird durch das lux-Gen kodiert. Durch das LuxI- System auch von Bakterien der Spezies Porphyromonas gingiProtein von V. fischeri wird ein N-Acyl-Homoserinlacton valis zur Signaltransduktion verwendet [33]. (AHL) produziert, das als Signalmolekül mit dem RezeptorIn einigen gram-positiven Bakterien, zum Beispiel in verprotein LuxR in Wechselwirkung tritt. Der AHL-LuxR-Kom- schiedenen Streptococcus spp., dienen kleine Peptidmoleküle plex aktiviert die Transkription des lux-Gens und sorgt da- zur interzellulären Signaltransduktion [3, 40, 48]. Unter andurch für die Induktion der Biolumineszenz. Durch die derem ist die bereits erwähnte Entwicklung der „genetischen gleichzeitig aktivierte Exprimierung des LuxI-Proteins findet Kompetenz“ durch die am Aufbau von dentalen Biofilmen eine positive Verstärkung der Regulation statt, da die Synthe- beteiligten Bakterien an die Abgabe von Signalpeptiden, wie se des N-Acyl-Homoserinlacton durch das LuxI-Protein er- das „competence-stimulating peptide“ (CSP), gebunden [57]. folgt. Das N-Acyl-Homoserinlacton verstärkt somit seine eigene Produktion, weshalb das N-Acyl-Homoserinlacton auch 5 Resistenz von Biofilmen gegen antibakterielle als Autoinduktor bezeichnet wird [99]. In gram-negativen Noxen Bakterien existieren viele AHL-induzierte Signalkaskaden für das „quorum sensing“ die sich lediglich hinsichtlich der In der Regel beruht die Resistenz von Bakterien in planktoniMolekülstruktur der N-Acyl-Homoserinlacton-Verbindung scher Lebensform gegen die antibakteriellen Wirkungen von unterscheiden [35]. Meistens variiert nur die chemische Antibiotika auf genetisch kodierten Fähigkeiten, wie zum Struktur der Acyl-Gruppe des N-Acyl-Homoserinlactons [41] Beispiel der Produktion von Enzymen, die den antibioti(Tabelle 2). schen Wirkstoff abbauen [51, 59, 109]. Im Gegensatz dazu Wahrscheinlich werden in Bakterien einer Spezies sind Bakterien in Biofilmen häufig auch ohne genetisch kogleichzeitig zahlreiche verschiedene Signalkaskaden unter- dierte Resistenzmechanismen weitgehend unempfindlich gegen die Einwirkung von köpereigenen AbwehrvorAcyl-Homoserinlacton-(AHL)-basierte Regulationssysteme des „quorum sensing“ gängen oder einer aggressiven antibiotischen TheBakterienspezies Regulationssystem Signalmoleküle Autoinduktor Funktion rapie [38]. Vibrio fischeri LuxI/LuxR N-3-(Oxohexanoyl)VAI-1 Biolumineszenz Homoserinlacton Obwohl die klassischen, genetisch kodierAinS/AinR N-3-(Octanoyl)-LVAI-2 Proteinsynthese Homoserinlacton ten Faktoren möglicherPseudomonas aeruginosa LasI/LasR N-3-(Oxododecanoyl)-L- PAI-1 Exotoxin A, Virulenzfaktoren weise zu einem kleinen Homoserinlacton Teil zur Resistenz von RhiI/RhiR N-(Butyryl)-LPAI-2 Rhamnolipidsynthese Bakterien in Biofilmen Homoserinlacton beitragen, scheint vor alAgrobacterium tumefaciens TraI/TraR-TraM N-3-(Oxooctanoyl)-LAAI Konjugation, Plasmide lem der multizelluläre Homoserinlacton Aufbau des Biofilms für die typische Resistenz Tabelle 2 Übersicht verschiedener „quorum sensing“-Systeme und der als Autinduktor im verwendeten Acyl-Homoserinlactone (moifiziert nach Fuqua et al. 1996) entscheidend zu sein [87]. Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 655 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm Abbildung 7 Resistenzmechanismen in bakteriellen Biofilmen: (a) Behinderung der Penetration des Antibiotikums durch ungünstige chemische Lösungsbedingungen; (b) Abschirmung durch funktionelle Kompartimentierung im Biofilm; (c) sporenähnliches Stadium (mod. n. Stewart et al. [87]) Der Verbund aus mehreren Zellen könnte auf drei unterschiedlichen Wegen eine erhöhte Resistenz gegen Antibiotika vermitteln (Abb. 7): Zum einen kann die Dicke des Biofilms die vollständige Diffusion eines antibiotischen Wirkstoffs verhindern. Obwohl der Biofilm auf Grund seines Aufbaus und des hydrophilen Innenmilieus für gelöste Wirkstoffe keine impermeable Barriere darstellt, könnte die Penetration von elektrisch geladenen Antibiotikamolekülen in tiefere Schichten durch ein Überwiegen von entgegengesetzten Ladung in den oberflächlichen Schichten des Biofilms behindert werden [65]. Eine von der Oberfläche des Biofilms eintretende antibiotische Verbindung kann zudem auch durch primär resistente Bakterien in den oberen Schichten metabolisiert werden. Bei nicht zu hoher Konzentration des Wirkstoffs im Umgebungsmedium würde das Antibiotikum vor dem Durchdringen der oberen Schichten des Biofilms durch die dort anwesenden Bakterien abgebaut werden. In tieferen Schichten anzutreffende nicht-resistente Bakterien werden dadurch vor den antibakteriellen Wirkungen des Antibiotikums geschützt [1]. Ein zweiter Resistenzmechanismus basiert auf der funktionellen Kompartimentierung des Biofilms [115]. Durch die Kompartimentierung entstehen im Biofilm Räume mit stark divergierenden chemischen bzw. physikalischen Lebensbedingungen [26]. So finden sich innerhalb eines Biofilms Kompartimente mit unterschiedlichem pH-Wert oder 656 elektrochemischen Potential [16, 26]. Einige Bakterienspezies zeigen in Abhängigkeit von den spezifischen Lebensbedingungen, beispielsweise aerobe oder anaerobe Bedingungen, eine unterschiedlich große Empfindlichkeit gegen einen antibiotischen Wirkstoff [87]. Die Folgen der funktionellen Kompartimentierung für die Wirksamkeit von Antibiotika kann durch folgendes Beispiel veranschaulicht werden: Aus der unterschiedlichen Verfügbarkeit von Nährstoffen in den funktionellen Kompartimenten des Biofilms resultiert eine ungleiche metabolische sowie reproduktive Aktivität der Bakterien [42, 86]. Antibiotika, die sich gegen die Synthese von Zellbestandteilen der Bakterien richten, wie zum Beispiel Penicillin, werden bei verminderter reproduktiver Aktivität eine deutlich geringere Wirksamkeit in den betreffenden Kompartimenten entfalten [61]. Als weiterer Mechanismus der Antibiotikaresistenz in Biofilmen wurde schließlich die Existenz einer Sporen-ähnlichen Lebensform für einen kleinen Teil der am Aufbau des Biofilm beteiligten Bakterien vermutet [87]. In einem Sporen-ähnlichen Stadium müssten die Bakterien eine starke Resistenz gegen die Einwirkung antibakterieller Noxen besitzen. Nach theoretischen Modellen würde das Überleben von weniger als 1 % der ursprünglich vorhandenen Bakterien in einem Sporen-ähnlichen Stadium ausreichen, um nach dem Einwirken des Antibiotikums den Biofilm rasch wieder reetablieren zu können [12]. Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm 6 Perspektiven der Therapie von Infektionen in Biofilmen Im Gegensatz zu den konventionellen Antibiotika, die meistens den Stoffwechsel oder die Reproduktionsfähigkeit einzelner Bakterienzellen stören, müssen sich antibiotische Verbindungen, die in Biofilmen wirksam sind, gezielt gegen die am Aufbau und Erhaltung des Biofilms beteiligten Prozesse richten [87]. Stewart postuliert im wesentlichen vier Ansatzpunkte für zukünftige antibiotische Wirkungsprinzipien: (1) Die Störung der primären Adhäsion der Bakterien auf der besiedelten Oberfläche, (2) die Verringerung der bakteriellen Reproduktion, (3) die Behinderung der interzellulären Kommunikation sowie (4) die Zerstörung der extrazellulären Matrixmoleküle [88]. Die primäre Anheftung der Bakterien könnte beispielsweise durch die Verringerung des im Umgebungsmedium zur Verfügung stehenden Eisengehalts erreicht werden. So konnte gezeigt werden, dass Bakterien der Spezies Pseudomonas aeruginosa bei zu geringem Eisenangebot keine effektive Bildung von Mikrokolonien gelingt [84]. Die Störung der interzellulären Kommunikation, das „quorum sensing“, kann durch die Anwesenheit von spezifischen Inhibitoren der Autoinduktion gelingen. Durch den Einsatz von natürlich vorkommenden Furanon-Verbindungen ist eine sehr effektive Unterbindung der interzellulären Kommunikation von Bakterien der Spezies Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Bacillus subtilis bereits gelungen. Bakterien dieser Spezies waren auf Grund der Störung der interzellulären Kommunikation durch die Furanon-Verbindungen nicht mehr in der Lage, einen stabilen Biofilm aufzubauen [41, 76]. Die Etablierung von Biofilmen durch Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus kann durch den Einsatz eines Peptids, des „RNAIII-inhibiting peptides“ (RIP), gehemmt werden [4]. Eine Verringerung der Synthese der extrazellulären Matrixmoleküle von Pseudomonas aeruginosa kann durch das Makrolidantibiotikum Clarithromycin vermittelt werden [117]. Obwohl das Antibiotikum nur eine sehr schwache primäre antibakterielle Wirkung gegen Pseudomonas aeruginosa besitzt, wird durch die Anwesenheit dieses Wirkstoffs ein zentraler Schritt der Synthese der extrazellulären Matrix von Pseudomonas aeruginosa gezielt gehemmt [88]. 7 Schlussfolgerung Die Organisation als Biofilm kann zur Persistenz von bakteriellen Infektionen an zahlreichen Organen des menschlichen Körpers beitragen. In der Mundhöhle werden bakterielle Biofilme als weiche Beläge, als dentale Plaque klinisch sichtbar. Die weichen Beläge besitzen als Auslöser der zwei häufigsten oro-dentalen Erkrankungen, der Karies und Parodontitis, eine wichtige pathogenetische Rolle. Darüber hinaus könnten bakterielle Biofilme auch für die Persistenz endodontogener Infektionen verantwortlich gemacht werden. Unabhängig von der Erkrankungsentität, sind alle oralen Biofilme einer mechanischen und antibiotischen Elimination nur sehr schlecht zugänglich. Da die ursächlichen bakteriellen Biofilme nur sehr unzureichend beseitigt werden können, manifestieren sich in vielen Fällen, trotz umfangreicher therapeutischer Bemühungen, häufig Rezidive der biofilm-assoziierten oro-dentalen Erkrankungen. Die teilweise sehr komplexen Prozesse, die am Aufbau von Biofilmen beteiligt sind, könnten jedoch durch neue therapeutische Strategien gezielt gestört werden. Neben dem Einsatz von neuen antibiotischen Wirkstoffen, die sich gezielt gegen bakterielle Infektionen in Biofilmen richten, ist beispielsweise auch die Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 Entwicklung neuer Füllungswerkstoffe denkbar, die eine Etablierung von Biofilmen behindern. Möglicherweise gelingt durch die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien zukünftig eine deutlich effektivere Elimination von oro-dentalen Infektionen und somit eine verbesserte Therapie der Karies und Parodontitis. Literatur 1. Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S.: Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother 44, 1818 (2000). 2.Atlas, R. M., Williams, J. F., Huntington, M. K.: Legionella contamination of dental-unit waters. Appl Environ Microbiol 61, 1208 (1995). 3.Balaban, N., Goldkorn, T., Gov, Y., Hirshberg, M., Koyfman, N., Matthews, H. R., Nhan, R. T., Singh, B., Uziel, O.: Regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNAIII-activating Protein (TRAP). J Biol Chem 276, 2658 (2001). 4.Balaban, N., Gov, Y., Bitler, A., Boelaert, J. R.: Prevention of Staphylococcus aureus biofilm on dialysis catheters and adherence to human cells. Kidney Int 63, 340 (2003). 5.Baty, A. M., Eastburn, C. C., Techkarnjanaruk, S., Goodman, A. E., Geesey, G. G.: Spatial and temporal variations in chitinolytic gene expression and bacterial biomass production during chitin degradation. Appl Environ Microbiol 66, 3574 (2000). 6.Boe-Hansen, R., Martiny, A. C., Arvin, E., Albrechtsen, H. J.: Monitoring biofilm formation and activity in drinking water distribution networks under oligotrophic conditions. Water Sci Technol 47, 91 (2003). 7. Brown, M. R. W., Gilbert, P.: Sensitivity of biofilms to antimicrobial agents. J Appl Bacteriol 74, 875 (1995). 8.Caldwell, D. E., Korber, J. R., Lawrence, D. R.: Analysis of biofilm formation using 2D vs. 3D digital imaging. J Appl Bacteriol 74, S52 (1993). 9.Ceri, H., Olson, M. E., Stremick, C., Read, R. R., Morck, D., Buret, A.: The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol 37, 1771 (1999). 10. Chen, X., Schauder, S., Potier, N., Van Dorsselaer, A., Pelczer, I., Bassler, B. L., Hughson, F. M.: Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature 415, 545 (2002). 11. Cleary, P., Retnoningrum, D.: Group A streptococcal immunoglobulin-binding proteins: adhesins, molecular mimicry or sensory proteins? Trends Microbiol 2, 131 (1994). 12. Cochran, W. L., McFeters, G. A., Stewart, P. S.: Reduced susceptibility of thin Pseudomonas aeruginosa biofilms to hydrogen peroxide and monochloramine. J Appl Microbiol 88, 22 (2000). 13. Costerton, J. W., Cook, G., Lamont, R..: The community architecture of biofilms:dynamic structures and mechanisms in: Newman, H.N., Wilson, M.: Dental plaque revisited – oral biofilms in health and disease. Bioline, University College London, p. 5-14 (1999). 14. Costerton, J. W., Geesey, G. G., Cheng, K.: How bacteria stick. Sci Am 238, 86 (1978). 15. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D.R ., Lappin-Scott, H. M.: Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol 49, 711 (1995). 16. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., DeBeer, D., Caldwell, D., Korber, D., James, G.: Biofilms, the customized microniche. J Bacteriol 176, 2137 (1994). 17. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P.: Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318 (1999). 18. Costerton, J. W., Stewart, P. S.: Battling biofilms. Sci Am 285, 74 (2001). 19. Cowan, M. M., Taylor, K. G., Doyle, R. J.: Energetics of the initial phase of adhesion of Streptococcus sanguis to hydroxylapatite. J Bacteriol 169, 2995 (1987). 20.Cucarella, C., Solano, C., Valle, J., Amorena, B., Lasa, I., Penades, J. R.: Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. J Bacteriol 183, 2888 (2001). 21. Darveau, R. P., Tanner, A., Page, R. C.: The microbial challenge in periodontitis. Periodontology 2000 14, 12 (1997). 22.Davey, M. E., O’Toole, A.: Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev 64, 847 (2000). 23.Davies, D. G., Geesey, G. G.: Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. Appl Environ Microbiol 61, 860 (1995) 24.DeBeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z.: Liquid flow and mass transfer in heterogenous biofilms. Water Res 30, 2761 (1996). 25.DeBeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z.: Liquid flow in heterogenous biofilms. Biotechnol Bioeng 44, 636 (1994a). 26.DeBeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z.: Effects of biofilm structures on oxygen distribution and mass transport. Biotechnol Bioeng 43, 1131 (1994b). 27. DeBeer, D., Stoodley, P.: Relation between the structure of an aerobic biofilm and mass transport phenomena. Wat Sci Tech 32, 11 (1995). 28.Distel, J. W., Hatton, J. F., Gillespie, M. J.: Biofilm formation in medicated root canals. J Endod 28, 689 (2002). 29.Donlan, R. M., Costerton, J. W.: Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 15, 167 (2002) 30.Flemmig, H. C., Wingender, J., Mayer, C., Koerstgens, V., Borchard, W.: Cohesiveness in biofilm matrix polymers. In: Allison, D., Gilbert, P., Lappin-Scott, H.M., Wilson, M.: Community structure and cooperation in biofilms. Cambridge University Press p. 87-105 (2000). 657 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm 31. Freeman, C., Lock, M. A.: The biofilm polysaccharid matrix: a buffer against changing organic substrate supply? Limnol Oceanograph 40, 273 (1995). 32.Freeman, J. A., Bassler, B. L.: A genetic analysis of the function of LuxO, a twocomponent response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi. Mol Microbiol 31, 665 (1999). 33.Frias, J., Olle, E., Alsina, M.: Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules. Infect Immun 69, 3431 (2001). 34.Fuqua, C., Greenberg, E .P.: Cell-to-cell communication in Escherichia coli and Salmonella typhimurium: they may be talking, but who’s listening? Proc Natl Acad Sci 95, 6571 (1998). 35.Fuqua, C., Winans, S. C., Greenberg, E. P.: Census and consensus in bacterial ecosystems: The LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol 50, 727 (1996). 36.Gibbons, R. J., Hay, D. I., Cisar, J. O., Clark, W. B.: Adsorbed salivary proline-rich protein 1 and statherin: receptors for type 1 fimbriae of Actinomyces viscosus T14V-J1 on apatitic surfaces. Infect Immun 56, 2990 (1998). 37. Gibbons, R .J., Hay, D .I., Schlesinger, D. H.: Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun 59, 2948 (1991). 38.Gilbert, P., Allison, D. G., McBain, A. J.: Biofilms in vitro and in vivo: do singular mechanisms imply cross-resistance? Symp Ser Soc Appl Microbiol 98S (2002). 39.Hall-Stoodley, L., Stoodley, P.: Developmental regulation of microbial biofilms. Curr Opin Biotechnol 13, 228 (2002). 40.Havarstein, L. S., Hakenbeck, R., Gaustad, P.: Natural competence in the genus Streptococcus: evidence that streptococci can change pherotype by interspecies recombinational exchanges. J Bacteriol 179, 6589 (1997). 41. Hentzer, M., Riedel, K., Rasmussen, T. B., Heydorn, A., Andersen, J. B., Parsek, M. R., Rice, S. A., Eberl, L., Molin, S., Hoiby, N., Kjelleberg, S., Givskov, M.: Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound. Microbiology 148, 87 (2002). 42.Huang, C. T., Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S.: Spatial patterns of alkaline phosphatase expression within bacterial colonies and biofilms in response to phosphate starvation. Appl Environ Microbiol 64, 1526 (1998). 43.Hudson, M. C., Curtiss, R.: Regulation of expression of Streptococcus mutans genes important to virulence. Infect Immun 58, 464 (1990). 44.Jenkinson, H. F., Lamont, R. J.: Streptococcal adhesion and colonization. Crit Rev Oral Biol Med. 8, 175 (1997). 45.Jouon, N., Rinaudo, M., Milas, M., Desbrieres, J.: Hydration of hyaluronic acid as a function of the counterion type and relative humidity. Carbohydr Polymers 26, 69 (1995). 46.Kinniment, S. L., Wimpenny, J. W.: Measurements of the distribution of adenylate concentrations and adenylate energy charge across Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol 58, 1629 (1992). 47. Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P.: Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng 80, 289 (2002). 48.Kleerebezem, M., Quadri, L.E., Kuipers, O. P., de Vos, W. M.: Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria. Mol Microbiol 24, 895 (1997). 49.Kolenbrander, P. E., London, J.: Adhere today, here tomorrow: oral bacterial adherence. J Bacteriol 175, 3247 (1993). 50.Kolenbrander, P. E., London, J.: Ecological significance of coaggregation among oral bacteria. Adv Microb Ecol 12, 183 (1992). 51. Kurenbach, B., Bohn, C., Prabhu, J., Abudukerim, M., Szewzyk, U., Grohmann, E.: Intergeneric transfer of the Enterococcus faecalis plasmid pIP501 to Escherichia coli and Streptomyces lividans and sequence analysis of its tra region. Plasmid 50, 86 (2003). 52.Lai, C. H,. Listgarten, M. A., Rosan, B.: Immunoelectron microscopic identification and localization of Streptococcus sanguis with peroxidase-labeled antibody: localization of Streptococcus sanguis in intact dental plaque. Infect Immun 11, 200 (1975). 53.Lamont, R. J., Jenkinson, H. F.: Life below gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol Mol Biol Rev 62, 1244 (1998). 54.Lawrence, J. R., Delaquis, P. J., Korber, D. R., Caldwell, D. E.: Behavior of Pseudomonas fluorescence within the hydrodynamic boundary layers of surface microenvironments. Microbiol Ecol 14, 1 (1987). 55.Lewandowski, Z., Altobelli, S. A., Majors, P. D., Fukushima, E.: NMR imaging of hydrodynamics near microbially colonized surfaces. Wat Sci Tech 26, 577 (1992). 56.Li, Y., Burne, R. A.: Regulation of the gtfBC and ftf genes of Streptococcus mutans in biofilms in response to pH and carbohydrate. Microbiology 147, 2841 (2001a). 57. Li, Y. H., Lau, P. C., Lee, J. H., Ellen, R. P., Cvitkovitch, D. G.: Natural genetic transformation of Streptococcus mutans growing in biofilms. J Bacteriol 183, 897 (2001b). 58.Liu, Y., Tay, J. H.: Metabolic response of biofilm to shear stress in fixed-film culture. J Appl Microbiol 90, 337 (2001). 59.Maira-Litran, T., Allison, D. G., Gilbert, P.: Expression of the multiple antibiotic resistance operon (mar) during growth of Escherichia coli as a biofilm. J Appl Microbiol 88, 243 (2000). 60.Marsh, P. D.: Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology 149, 279 (2003). 61. McDermott, P. F., Walker, R. D., White, D. G.: Antimicrobials: modes of action and mechanisms of resistance. Int J Toxicol 22, 135 (2003). 62.Mills, S. E., Karpay, R. I.: Dental waterlines and biofilm — searching for solutions. Compend Contin Educ Dent 23, 237 (2002). 63.Mills, S. E., Lauderdale, P. W., Mayhew, R. B.: Reduction of microbial contamination in dental units with povidone-iodine 10%. J Am Dent Assoc 113, 280 (1986). 658 64.Murdoch-Kinch, C. A., Andrews, N. L., Atwan, S., Jude, R., Gleason, M. J., Molinari J. A.: Comparison of dental water quality management procedures. J Am Dent Assoc 128, 1235 (1997). 65.Nichols, W. W., Dorrington, S. M., Slack, M. P., Walmsley, H. L.: Inhibition of tobramycin diffusion by binding to alginate. Antimicrob Agents Chemother 32, 518 (1998). 66.Noiri, Y., Ehara, A., Kawahara, T., Takemura, N., Ebisu, S.: Participation of bacterial biofilms in refractory and chronic periapical periodontitis. J Endod 28, 679 (2002). 67. Offenbacher, S.: Periodontal disease: pathogenesis. Ann Periodontol 1, 821 (1996). 68.Ohashi, A., Harada, H.: Adhesion strength of biofilm developed in an attached-growth reactor. Water Sci Technol 29, 281 (1994). 69.O’Toole, G. A., Gibbs, K. A., Hager, P. W., Phibbs, P. V., Kolter, R.: The global carbon metabolism regulator Crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 182, 425 (2000). 70. O’Toole, G. A., Kolter, R.: Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 30, 295 (1998). 71. Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J.: Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnol Bioeng 20, 205 (2001). 72. Pratt, L. A., Kolter, R.: Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol Microbiol 30, 285 (1998). 73. Prosser, J. I.: Quorum sensing in biofilms. in: Newman, H.N., Wilson, M.: Dental plaque revisited – oral biofilms in health and disease. Bioline, University College London, p. 79-88 (1999). 74. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S.: Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun 70, 2640 (2002). 75. Puskas, A., Greenberg, E. P., Kaplan, S., Schaefer, A. L.: A quorum-sensing system in the free-living photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. J Bacteriol 179, 7530 (1997). 76. Ren, D., Sims, J. J., Wood, T. K.: Inhibition of biofilm formation and swarming of Bacillus subtilis by (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone. Lett Appl Microbiol 34, 293 (2002). 77. Roberts, S. K., Bass, C., Brading, M., Lappin-Scott, H., Stoodley, P.: Biofilm formation and structure: What’s new? in: Newman, H.N., Wilson, M.: Dental plaque revisited – oral biofilms in health and disease. Bioline, University College London, p. 15-36 (1999). 78. Rosan, B., Lamont, R. J.: Dental plaque formation. Microbes Infect 2, 1599 (2000). 79. Rupp, M. E., Ulphani, J. S., Fey, P. D., Mack, D.: Characterization of Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin in the pathogenesis of intravascular catheter-associated infection in a rat model. Infect Immun 67, 2656 (1999). 80.Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G.: Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm. J Bacteriol 184, 1140 (2002). 81. Schauder, S., Shokat, K., Surette, M. G., Bassler, B. L.: The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule. Mol Microbiol 41, 463 (2001). 82.Shu, M., Wong, L., Miller, J. H., Sissons, C. H.: Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system. Arch Oral Biol 45, 27 (2000). 83.Siegrist, H., Gujer, W.: Mass transfer mechanisms in a heterotrophic biofilm. Water Res 19, 1369 (1985). 84.Singh, P. K., Parsek, M. R., Greenberg, E. P., Welsh, M. J.: A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature 417, 552 (2002). 85.Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L: Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 25, 134 (1998). 86.Sternberg, C., Christensen, B. B., Johansen, T., Toftgaard-Nielsen, A., Andersen, J. B., Givskov, M., Molin, S.: Distribution of bacterial growth activity in flowchamber biofilms. Appl Environ Microbiol 65, 4108 (1999). 87. Stewart, P. S., Costerton, J. W.: Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet 358, 135 (2001). 88.Stewart, P. S.: New ways to stop biofilm infections. Lancet 361, 97 (2003). 89.Stoodley, P., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M.: Biofilm structure and behaviour: influence of hydrodynamics and nutrients. in: Newman, H.N., Wilson, M.: Dental plaque revisited – oral biofilms in health and disease. Bioline, University College London, p. 63-72 (1999d). 90.Stoodley, P., DeBeer, D., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M.: Evolving perspectives of biofilm structure. Biofouling 14, 1 (1999e). 91. Stoodley, P., DeBeer, D., Lappin-Scott, H. M.: The influence of electric fields and pH on biofilm structure as related to the bioelectric effect. Antimicrob Agents Chemother 41, 1876 (1997). 92.Stoodley, P., DeBeer, D., Lewandowski, Z.: Liquid flow in biofilm systems. Appl Environ Microbiol 60, 2711 (1994). 93.Stoodley, P., Dodds, I., Lewandowski, Z., Cunningham, A. B., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M.: Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol 85, 19S (1999c). 94.Stoodley, P., Jacobsen, A., Dunsmore, B. C., Purevdorj, B., Wilson, S., LappinScott, H. M.: Costerton, J.W.: The influence of fluid shear and AICI3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Sci Technol 43, 113 (2001). 95.Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D,, Lappin-Scott, H. M.: Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnol Bioeng 57, 536 (1998). Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 M. Folwaczny, R. Hickel: Biofilm 96.Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M.: Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng 65, 83 (1999a). 97. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M.: The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environ Microbiol 1, 447 (1999b) 98.Stoodley, P., Wilson, S., Hall-Stoodley, L., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M., Costerton, J. W.: Growth and detachment of cell clusters from mature mixed-species biofilms. Appl Environ Microbiol 67, 5608 (2001b). 99.Surette, M. G., Miller, M. B., Bassler, B. L.: Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production. Proc Natl Acad Sci 96, 1639 (1999). 100. Sutherland, I. W.: Biofilm matrix polymers – role in adhesion. in: Newman, H.N., Wilson, M.: Dental plaque revisited – oral biofilms in health and disease. Bioline, University College London, p. 49-62 (1999). 101. Sutherland, I. W.: The biofilm matrix—an immobilized but dynamic microbial environment. Trends Microbiol 9, 222 (2001). 102. Tall, B. D., Williams, H. N., George, K. S., Gray, R. T., Walch, M.: Bacterial succession within a biofilm in water supply lines of dental air-water syringes. Can J Microbiol 41, 647 (1995). 103. Tolker-Nielsen, T., Brinch, U. C., Ragas, P. C., Andersen, J. B., Jacobsen, C. S., Molin, S.: Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms. J Bacteriol 182, 6482 (2000). 104. Vickerman, M. M., Clewell, D. B., Jones, G. W.: Sucrose-promoted accumulation of growing glucosyltransferase variants of Streptococcus gordonii on hydroxyapatite surfaces. Infect Immun 59, 3523 (1991). 105. Vickerman, M. M., Jones, G. W.: Sucrose-dependent accumulation of oral streptococci and their adhesion-defective mutants on saliva-coated hydroxyapatite. Oral Microbiol Immunol 10, 175 (1995). 106. Vieira, M. J., Melo, L. F., Pinheiro, M. M.: Biofilm formation: hydrodynamic effects on internal diffusion and structure. Biofouling 7, 67 (1993). 107. Vieira, M. J., Melo, L. F.: Intrinsic kinetics of biofilms formed under turbulent flow and low substrate concentrations. Bioprocess Engineering 20, 369 (1999). 108. Walker, J. T., Bradshaw, D. J., Fulford, M. R., Marsh, P. D.: Microbiological evaluation of a range of disinfectant products to control mixed-species biofilm contamination in a laboratory model of a dental unit water system. Appl Environ Microbiol 69, 3327 (2003). 109. Walsh, C.: Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775 (2000). Deutsche Zahnärztliche Zeitschrift 58 (2003) 12 110. Watnick, P. I., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Croal, L., Kolter, R.: The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae O139. Mol Microbiol 39, 223 (2001). 111. Whitchurch, C. B., Tolker-Nielsen, T., Ragas, P. C., Mattick, J. S.: Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science 295,1487 (2002). 112. Whitehouse, R. L. S., Peters, E., Lizotte, J., Lilge, C.: Influence of biofilms on microbial contamination in dental unit water. J Dent 19, 290 (1991). 113. Whittaker, C. J., Klier, C. M., Kolenbrander, P. E.: Mechanisms of adhesion by oral bacteria. Annu Rev Microbiol 50, 513 (1996). 114. Wimpenny, J. W. T., Colasanti, R.: A unifying hypothesis for the structure of microbial biofilms based on cellular automaton models. FEMS Microbiol Ecol 22, 1 (1997). 115. Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S.: Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology 146, 547 (2000). 116. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A.: Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microbiol 64, 4035 (1998). 117. Yasuda, H., Ajiki, Y., Koga, T., Kawada, H., Yokota, T.: Interaction between biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and clarithromycin. Antimicrob Agents Chemother 37, 1749 (1993). 118. Yoshida, A., Kuramitsu, H. K.: Multiple Streptococcus mutans Genes Are Involved in Biofilm Formation. Appl Environ Microbiol 68, 6283 (2002). ❚ Korrespondenzadresse: PD Dr. med. Dr. med. dent. Matthias Folwaczny Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie Ludwig-Maximilians-Universität München Goethestr. 70 D-80336 München Tel.: 089/5160-3134 FAX: 089/5160-5344 e-mail: [email protected] 659
