BD Modified CNA Agar • BD Modified CNA Agar with Crystal Violet
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GEBRAUCHSANWEISUNG– GEBRAUCHSFERTIGE PLATTENMEDIEN PA-255082.02 Rev.: Juni 2003 BD Modified CNA Agar • BD Modified CNA Agar with Crystal Violet VERWENDUNGSZWECK BD Modified CNA Agar (BD modifizierter CNA-Agar) ist ein selektives Medium zur Isolierung von grampositiven Bakterien aus klinischen Proben. BD Modified CNA Agar with Crystal Violet (BD modifizierter CNA-Agar mit Kristallviolett) wird zur Isolierung von Streptokokken und Enterokokken verwendet. Er hemmt das Wachstum von Staphylokokken und gramnegativen Bakterien. GRUNDLAGEN UND ERLÄUTERUNG DES VERFAHRENS Mikrobiologische Methode. Trypticase Soja-Agar (TSA) ist aufgrund seiner Nährstoffzusammensetzung ein häufig verwendetes Medium, sowohl ohne Zusatz als auch als Basis für Medien, die Blut enthalten.1 Trypticase Soja-Agar II (TSA II) ist eine verbesserte Version des ursprünglichen Produkts und liefert mit dem Zusatz von 5 % Schafblut besser abgrenzbare Hämolysezonen als Trypticase Soja-Agar (TSA). Es liefert ausgezeichnetes Wachstum und Hämolyse von betahämolytischen Streptokokken und anderen Organismen. Ellner und Kollegen haben herausgefunden, dass ein Medium, welches Colistin und Nalidixinsäure in einer mit 5 % Schafblut angereicherten Columbia-Agar-Basis enthält, das Wachstum von Staphylokokken, hämolytischen Streptokokken und Enterokokken unterstützt, während das Wachstum von Proteus-, Klebsiella- und Pseudomonas-Spezies gehemmt wird.2 Columbia-Agar-Basis hat einen relativ hohen Kohlenhydratgehalt, weshalb beta-hämolytische Streptokokken eine grünliche hämolytische Reaktion zeigen können, welche mit einer Alpha-Hämolyse verwechselt werden kann. Trypticase-Soja-Agar II resultiert in deutlicheren hämolytischen Reaktionen, ergibt jedoch üblicherweise kleinere Kolonien. In BD Modified CNA Agar und in BD Modified CNA Agar with Crystal Violet ist Trypticase-Soja-Agar das Basismedium, welches die Nährstoffe liefert und mit Colistin und Nalidixinsäure angereichert wurde, um die Selektivität für grampositive Bakterien zu erreichen. Schafblut und zusätzliches Kälberserum verbessern das Wachstum und erlauben den Nachweis von hämolytischen Reaktionen. Zusätzlich zu diesen Bestandteilen enthält BD Modified CNA Agar with Crystal Violet Kristallviolett, einen wirkungsvollen Hemmstoff für Staphylokokken. Aus diesem Grund wird dieses Medium zur Isolierung von Streptokokken und Enterokokken verwendet, welche durch diesen Farbstoff nicht gehemmt werden. REAGENZIEN Zusammensetzungen* pro Liter destilliertem Wasser BD Modified CNA Agar Pankreatisch abgebautes Casein Papainisch abgebautes Sojamehl Natriumchlorid Agar Wachstumsfaktoren Colistin Nalidixinsäure Kälberserum Schafblut, defibriniert 14,5 g 5,0 5,0 14,0 1,5 0,01 0,01 50,0 mL 5% pH 7,3 ± 0,2 Zusätzlich zu den obigen Bestandteilen enthält BD Modified CNA Agar with Crystal Violet 2 mg Kristallviolett pro Liter Medium. *Nach Bedarf abgestimmt und/oder ergänzt auf die geforderten Testkriterien. PA-255082.02 -1- VORSICHTSMASSNAHMEN . Nur für den professionellen Gebrauch. Agarplatten bei Anzeichen von mikrobieller Kontamination, Verfärbung, Austrocknung, Rissen oder sonstigen Anzeichen von Produktverfall nicht verwenden. Hinweise zur aseptischen Arbeitsweise, Biogefährdung und Entsorgung des Produkts sind der ALLGEMEINEN GEBRAUCHSANLEITUNG zu entnehmen. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Nach Erhalt Platten bis unmittelbar vor dem Gebrauch im Dunkeln bei 2 – 8 °C in der Originalverpackung lagern. Einfrieren und Überhitzen vermeiden. Die Platten können bis zum Verfallsdatum (s. Kennzeichnung auf der Verpackung) inokuliert und entsprechend den empfohlenen Inkubationszeiten inkubiert werden. Platten aus bereits geöffneten Stapeln mit jeweils 10 Platten können bei Lagerung in einem sauberen Bereich bei 2 – 8 °C bis zu einer Woche verwendet werden. QUALITÄTSSICHERUNG DURCH DEN ANWENDER Repräsentative Proben mit den nachfolgend aufgeführten Stämmen inokulieren (detaillierte Informationen siehe ALLGEMEINE GEBRAUCHSANLEITUNG). Platten 18 – 24 h bei 35 ± 2 °C vorzugsweise in einer mit Kohlendioxid angereicherten aeroben Atmosphäre inkubieren. Stämme BD Modified CNA Agar Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum, grünlich-graue Kolonien; Alpha-Hämolyse Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum; kleine weißliche Kolonien mit Beta-Hämolyse Staphylococcus aureus ATCC 25923 Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum; mittelgroße weiße bis gelbe Kolonien, mit oder ohne BetaHämolyse. Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum; weißliche Kolonien mit gräulicher Zone; keine Hämolyse Teilweise bis vollständig gehemmtes Wachstum; kein Schwärmen Rot (blutfarben) Enterococcus faecalis ATCC 29212 Proteus mirabilis ATCC 12453 Nicht inokuliert BD Modified CNA Agar with Crystal Violet Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum; gräulichgrünliche Kolonien; AlphaHämolyse Gutes bis ausgezeichnetes Wachstum; kleine blaugraue Kolonien; BetaHämolyse Vollständig gehemmtes Wachstum Mäßiges bis ausgezeichnetes Wachstum; kleine bläuliche Kolonien; keine Hämolyse Teilweise bis vollständig gehemmtes Wachstum; kein Schwärmen Rot (blutfarben); bläuliche Schattierung VERFAHREN Mitgeliefertes Arbeitsmaterial BD Modified CNA Agar oder BD Modified CNA Agar with Crystal Violet, beide als 90 mm Stacker-Platten erhältlich. Mikrobiologisch kontrolliert. Nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial Zusätzliche Kulturmedien, Reagenzien und Laborgeräte nach Bedarf. Probenarten BD Modified CNA Agar ist ein selektives Medium für viele grampositive Bakterien in der aeroben Bakteriologie und kann für alle bakteriologischen Probenarten verwendet werden. BD Modified CNA Agar with Crystal Violet ist ein selektives Medium für Streptokokken und Enterokokken und zeigt gegenüber Staphylokokken eine hemmende Wirkung. Es wird PA-255082.02 -2- hauptsächlich zum Nachweis von Streptokokken in Proben aus Körperbereichen, wo diese Organismen eine bedeutende Rolle als Infektionserreger spielen, verwendet, z.B. zum Nachweis von Streptokokken der Gruppe A (=Streptococcus pyogenes) in Proben aus den oberen Atemwegen. Es kann jedoch auch zum Nachweis dieser und anderer Streptokokokken in anderen klinischen Proben verwendet werden. Für weitere Informationen zu diesen Medien siehe auch LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN. Testverfahren Die Proben möglichst bald nach Eingang im Labor auf BD Modified CNA Agar oder BD Modified CNA Agar with Crystal Violet ausstreichen. Diese Platte wird hauptsächlich zur Isolierung von Reinkulturen aus Proben mit einer gemischten Flora verwendet. Falls das Material direkt von einem Tupfer kultiviert wird, Tupfer über einen kleinen Bereich am Rand der Oberfläche rollen; anschließend aus diesem inokulierten Bereich ausstreichen. Um den Nachweis aller in der Probe enthaltenen Erreger zu gewährleisten, müssen BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood, und, je nach Art der Probe, zusätzliche selektive Medien mit einbezogen werden.3,4 Da zur Erstisolierung vieler Erreger Kohlendioxid erforderlich ist, sollten die Platten in einer aeroben Atmosphäre mit etwa 3 – 10 % CO2 inkubiert werden. Platten bei 35 – 37 °C 18 – 24 h (oder länger, falls erforderlich) inkubieren. Ergebnisse Auf BD Modified CNA Agar weisen häufig isolierte Organismen typischerweise die folgende Koloniemorphologie auf: Streptokokken (außer Klein, weiß bis gräulich. Möglicherweise hämolytisch, Gruppe D) je nach Spezies Enterokokken (Gruppe D) Klein bis mittelgroß, jedoch größer als Streptokokken der Gruppe A, grau Staphylokokken Mittelgroß, weiß bis grau oder cremefarben bis gelb. Möglicherweise hämolytisch, je nach Spezies Mikrokokken Groß, weiß bis grau oder gelb bis orange Corynebakterien Klein bis groß, weiß bis grau oder gelb Candida spp. Klein, weiß Klein, grau, mit schwacher Beta-Hämolyse Listeria monocytogenes Gramnegative Bakterien Teilweise bis vollständig gehemmtes Wachstum Auf BD Modified CNA Agar with Crystal Violet wird das Wachstum von Staphylokokken und gramnegativen Bakterien teilweise bis vollständig gehemmt, während Streptokokken und Enterokokken die gleichen Wachstumsreaktionen produzieren wie auf BD Modified CNA Agar. Jedoch zeigen die Kolonien eine Tendenz, auf Grund der Akkumulation von Kristallviolett einen bläulichen Farbton anzunehmen. Andere grampositive Bakterien können Wachstum oder kein Wachstum zeigen, je nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber den Inhibitoren. Die entsprechende Literatur enthält detaillierte Informationen hierzu und zur Interpretation des Wachstums.4-7 LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN BD Modified CNA Agar wird zur Isolierung von grampositiven Bakterien verwendet, z.B. Streptokokken, Staphylokokken, coryneforme Bakterien, Listeria spp. und andere.2 BD Modified CNA Agar with Crystal Violet wird zur Isolierung von Streptokokken und Enterokokken verwendet. Staphylokokken werden auf diesem Medium gehemmt. Andere grampositive Bakterien können Wachstum oder kein Wachstum zeigen, je nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber den Inhibitoren. Die meisten gramnegativen Bakterien, wie z.B. Enterobacteriaceae, werden auf diesen Medien gehemmt. Funktionsergebnisse In einer internen Untersuchung wurden Stämme der folgenden Spezies auf Wachstum und hämolytische Reaktionen auf diesen Medien getestet. BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep PA-255082.02 -3- Blood wurde als Wachstumsreferenz verwendet. Die Platten wurden 20 h bei 35 – 37 °C in einer mit Kohlendioxid angereicherten aeroben Atmosphäre inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Verfahrensbeschränkungen Obwohl sie zu den grampositiven Bakterien gehören, können aerobe Sporenbildner (Bacillus spp. und verwandte Genera) auf diesen Medien gehemmt werden. Diese Medien zeigen gegenüber Pilzen keine hemmende Wirkung. Es gibt eine hohe Anzahl und zahlreiche Arten bakterieller Spezies, die Infektionskrankheiten hervorrufen. Bevor diese Medien routinemäßig für selten isolierte oder neu beschriebene Mikroorganismen verwendet werden, muss ihre Eignung daher zunächst durch den Anwender anhand der Kultivierung von Reinkulturen des betreffenden Organismus getestet werden. Obwohl bestimmte diagnostische Tests direkt auf diesen Medien durchgeführt werden können, sind für eine vollständige Identifizierung biochemische und, falls indiziert, immunologische Tests unter Verwendung von Reinkulturen notwendig. Tabelle 1: Leistungsergebnisse Spezies BD Modified CNA Agar Wachstum, BetaHämolyse Wachstum, BetaStreptococcus agalactiae Hämolyse Streptococcus pneumoniae Wachstum, AlphaHämolyse Wachstum, Streptococcus sanguis schwache AlphaHämolyse Wachstum Enterococcus faecalis Wachstum, BetaStaphylococcus aureus Hämolyse Staphylococcus epidermidis Wachstum Wachstum, Listeria monocytogenes schwache BetaHämolyse Kein Wachstum Escherichia coli Sehr schwaches Proteus mirabilis Wachstum, gehemmtes Schwärmen Kein Wachstum Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pyogenes BD Modified CNA Agar with Crystal Violet Wachstum, BetaHämolyse Wachstum, BetaHämolyse Wachstum, AlphaHämolyse Wachstum, schwache AlphaHämolyse Wachstum Kein Wachstum Kein Wachstum Kein Wachstum Kein Wachstum Sehr schwaches Wachstum, gehemmtes Schwärmen Kein Wachstum BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood Wachstum, BetaHämolyse Wachstum, BetaHämolyse Wachstum, AlphaHämolyse Wachstum, schwache AlphaHämolyse Wachstum Wachstum, BetaHämolyse Wachstum Wachstum, sehr schwache BetaHämolyse Kein Wachstum Sehr schwaches Wachstum, gehemmtes Schwärmen Kein Wachstum LITERATUR 1. Vera, H.D., and D.A. Power. 1980. Culture media, p. 969. In: E.H. Lennette, A. Balows, W.J. Hausler, Jr., and J.P. Truant (ed.), Manual of clinical microbiology, 3rd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Ellner, P.D., C.J. Stoessel, E. Drakeford, and F. Vasi. 1966. A new culture medium for medical bacteriology. Am. J. Clin. Pathol. 45:502-504. 3. Forbes, B.A. and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Baron, E. J, L. R. Peterson, and S. M. Finegold. 1994. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 9th ed., p. 415. Mosby-Year Book, Inc. St. Louis, MO. 5. Isenberg, H. D. (ed.). 1992. Interpretation of aerobic bacterial growth on primary culture media, Clinical microbiology procedures handbook, vol.1, p. 1.6.1-1.6.7. American Society for Microbiology, Washington, D.C. PA-255082.02 -4- 6. Ruoff, K. L., R.A. Whiley, and D. Beighton. 2003. Streptococcus. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Teixeira, L.M., and R.R. Facklam. 2003. Enterococcus. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. VERPACKUNG/LIEFERBARE PRODUKTE BD Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood Best.-Nr. 255082 Gebrauchsfertige Plattenmedien, 20 Platten BD Modified CNA Agar with Crystal Violet and 5% Sheep Blood Best.-Nr. 255086 Gebrauchsfertige Plattenmedien, 20 Platten WEITERE INFORMATIONEN Weitere Informationen erhalten Sie bei Ihrer örtlichen BD-Vertretung. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 [email protected] BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès 38800 Le Pont de Claix/France Tel: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292 http://www.bd.com BD, BD logo, Trypticase and Stacker are trademarks of Becton, Dickinson and Company ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection 2003 Becton, Dickinson and Company PA-255082.02 -5-
