Positionsklonierung des Gens für Bartter
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Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Positionsklonierung des Gens für Bartter-Syndrom mit Taubheit (BSND) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2004 von Eva Maria Frederike Ruf geboren in Stuttgart Dekan Prof. Dr. M. Werner 1. Gutachter Prof. Dr. F. Hildebrandt 2. Gutachter Prof. Dr. F. v. Weizsäcker Jahr der Promotion 2004 1 INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGEN ................................................................................................................................................. 3 1. EINLEITUNG.............................................................................................................................................. 5 1.1. DAS BARTTER-SYNDROM (BS) ................................................................................................................. 5 1.2. KLINIK ....................................................................................................................................................... 6 1.2.1. Anteatales Bartter Syndrom (aBS) .................................................................................................. 6 1.2.2. Antenatales Bartter Syndrom mit sensoneuraler Taubheit (SND)................................................... 6 1.2.3. Klassisches Bartter Syndrom (cBS)................................................................................................. 7 1.2.3. Gitelman Syndrom (GS) .................................................................................................................. 8 1.3. GENETIK .................................................................................................................................................... 9 1.3.1. BS Typ 1 .......................................................................................................................................... 9 1.3.2. BS Typ 2 .......................................................................................................................................... 9 1.3.3. BS Typ 3 ........................................................................................................................................ 10 1.3.4. BS Typ 4 ........................................................................................................................................ 10 1.3.5. Gitelman Syndrom......................................................................................................................... 10 1.4. PATHOLOGIE UND PATHOPHYSIOLOGIE ................................................................................................... 11 1.4.1. Pathophysiologie der Niere........................................................................................................... 11 1.4.2. Physiologie und Pathophysiologie des Ohres .............................................................................. 13 1.4.2.1. Aufbau und Funktion des Ohres ............................................................................................... 13 1.4.2.2. Genetische Ursachen für Taubheit ........................................................................................... 14 1.5. STRATEGIEN ZUR GENFINDUNG ............................................................................................................... 16 1.5.1. Physikalische Kartierung .............................................................................................................. 16 1.5.2. Kopplungsanalyse ......................................................................................................................... 17 1.5.3. Haplotypenanalyse ........................................................................................................................ 18 1.5.4. Kandidatengenanalyse .................................................................................................................. 18 2. ZIELE DIESER ARBEIT......................................................................................................................... 19 3. FAMILIEN, MATERIALIEN UND METHODEN................................................................................ 20 3.1. FAMILIEN................................................................................................................................................. 20 3.2. MEHRFACH VERWENDETE MATERIALIEN ................................................................................................ 21 3.2.1. Geräte............................................................................................................................................ 21 3.2.2. Lösungen ....................................................................................................................................... 21 3.2.3. Sonstige Materialien ..................................................................................................................... 21 3.3. METHODEN.............................................................................................................................................. 22 3.3.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).............................................................................................. 22 3.3.2. Agarose-Gelelektrophorese........................................................................................................... 23 3.3.3. Haplotypenanalyse ........................................................................................................................ 23 3.3.3.1. 32 3.3.3.2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................................................................................ 25 3.3.3.3. Autoradiographie ..................................................................................................................... 25 P-markierte PCR.................................................................................................................... 23 2 4. INHALTSVERZEICHNIS 3.3.4. Haplotype-Sharing-Analyse .......................................................................................................... 26 3.3.4. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) ..................................................................... 26 3.3.4.1. SSCP-Polyacrylamid-Gelektrophorese .................................................................................... 27 3.3.4.2. Silberfärbung............................................................................................................................ 27 3.3.5. automatische DNA-Sequenzierung................................................................................................ 28 3.3.6. Restriktionsverdau......................................................................................................................... 28 3.3.7. allelspezifische PCR...................................................................................................................... 29 ERGEBNISSE............................................................................................................................................ 30 4.1. HAPLOTYPENANALYSE ZUR WEITEREN EINGRENZUNG DES GENORTS ..................................................... 30 4.1.1. Eingrenzung mittels Homozygosity mapping ................................................................................ 30 4.1.2. Haplotype-Sharing-Analyse .......................................................................................................... 38 4.2. MUTATIONSANALYSE .............................................................................................................................. 39 5. 4.2.1. Ergebnisse der SSCP-Analyse....................................................................................................... 39 4.2.2. Ergebnisse der Sequenzierung ...................................................................................................... 46 DISKUSSION ............................................................................................................................................ 53 5.1. HAPLOTYPENANALYSE ............................................................................................................................ 53 5.1.1. Auswahl der Familien ................................................................................................................... 53 5.1.2. Haplotypenanalyse ........................................................................................................................ 53 5.1.3. Haplotype-Sharing-Analyse .......................................................................................................... 54 5.2. DAS HUMAN GENOME PROJEKT .............................................................................................................. 55 5.3. KANDIDATENGENE .................................................................................................................................. 56 5.3.1. funktionelle Kandidatengene......................................................................................................... 56 5.3.2. Positionelle Kandidatengene für BSND ........................................................................................ 58 5.3.3. Screening-Methoden...................................................................................................................... 59 5.3.3.1. SSCP als Screening-Methode ................................................................................................... 59 5.3.3.2. WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System..................................................................... 60 5.3.3.3. RT-PCR .................................................................................................................................... 61 5.3.3.4. direkte Sequenzierung .............................................................................................................. 61 5.4. CHARAKTERISIERUNG DES BSND-GENS .................................................................................................. 61 5.4.1. Position der Mutationen................................................................................................................ 62 5.5. AUSBLICK AUF WEITERFÜHRENDE ERGEBNISSE ...................................................................................... 63 6. ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................... 66 7. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................................. 67 3 ABKÜRZUNGEN θ Theta %(v/v) Volumenprozent %(w/v) Gewichtsprozent aBS antenatales Bartter Syndrom APS Ammonium Persulfat BAC bacterial artificial chromosome BS Bartter Syndrom BSND Bartter Syndrom mit sensoneuraler Taubheit bp Basenpaare cBS klassisches Bartter Syndrom cDNA “complementary DNA” cM centi Morgan ddNTP Didesoxynucleosidtriphosphat DAF “decay acceleration factor” DNA Desoxyribonucleinsäure dNTP Desoxynucleosidtriphosphat dRTA distal renale tubuläre Azidose EBV Epstein Barr Virus EDTA Ethylendiamintetraacetat EST “expressed sequence tag” Fa. Firma FISH Fluorescenz in-situ Hybridisierung GS Gitelman Syndrom JGA Juxtaglomerulärer Apparat kb Kilobase LOD-Score “logarithmic odds ratio” mRNA “messenger RNA” mTAL dicker aufsteigender Teil der Henle-Schleife NPH Nephronophtise PAC “P1-related artificial chromosomes” PGE2 Prostaglandin E2 PCR “polymerase chain reaction” ABKÜRZUNGEN 4 RNA Ribonucleinsäure SCR „short consensus repeat“ SND sensorineural deafness STS ”sequence tagged side” tAL dünner aufsteigender Teil der Henle-Schleife Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TEMED Tetramethylethylendiamin Tris Trishydroxymethylaminomethan U Unit YAC ”yeast artificial chromosoms” ABKÜRZUNGEN 5 1. EINLEITUNG EINLEITUNG 1.1. DAS BARTTER-SYNDROM (BS) Das Bartter-Syndrom ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit, die in vier Typen unterteilt werden kann, die sich im Manifestationsalter und der Schwere des klinischen Bildes voneinander unterscheiden. Bartter et al. beschrieben 1962 erstmals zwei Patienten mit hypokaliämischer hypochlorämischer metabolischer Alkalose sowie normotensivem Hyperaldosteronismus mit Hyperplasie des Juxtaglomerulären Apparates (JGA). Hervorgerufen durch einen renal tubulären Transportdefekt kommt es zu Polyurie mit erhöhter Ausscheidung von Na, K und Cl. Zusätzlich findet man histologisch eine Hyperplasie der interstitiellen Zellen der Medulla, die auf eine Erhöhung der renalen Prostaglandinproduktion zurückzuführen ist (Gill et al., 1976). 1966 berichteten Gitelman et al. über 3 erwachsene Patienten mit intermittierenden Episoden von Muskelschwäche und Tetanie, Hypokaliämie und Hypomagnesiämie, jedoch ohne Polyurie. Patienten mit neonataler Manifestation und schwererer klinischer Symptomatik als weitere Variante des klassischen Bartter-Syndroms wurden beschrieben (Marlow et al., 1982; Rodriguez et al., Ohlsson et al., 1984; Proesmans et al., 1985; Seyberth et al.). 6 EINLEITUNG 1.2. KLINIK 1.2.1. Antenatales Bartter Syndrom (aBS) Das antenatale BS (aBS) ist charakterisiert durch massive isoosmolare bis hypoosmolare Polyurie, die sich bereits intrauterin manifestiert und zu Polyhydramnion und Frühgeburtlichkeit in der 24.-30. SSW führt. In den ersten 4-6 Lebenswochen kommt es durch exzessiven renalen Salzverlust mit Ausscheidung von 12-50ml/kg/h hypoosmolaren Urins zu einem Gewichtsverlust von bis zu 25% und zu hypokaliämischer hypochlorämischer metabolischer Alkalose. Der Volumenmangel bedingt einen hyperreninämischen jedoch normotensiven Hyperaldosteronismus. Im weiteren Verlauf sind Hyperkalziurie, frühzeitige medulläre Nephrokalzinose und Hyperprostaglandinämie mit rezidivierenden Phasen lebensbedrohlicher Exsikkose und Fieber kennzeichnend. Bei zu spätem Therapiebeginn kommt es zu einer Wachstumsretardierung und einer Gedeihstörungen. Einige Patienten fallen durch eine dreieckige Gesichtsform mit hervorsthender Stirn, großen Augen, abstehenden Ohren und herunter hängenden Mund auf. Therapeutisch steht die Volumen- und Elektrolytsubstitution, insbesondere die Behandlung der Hypokaliämie mit KCl, im Vordergrund. Zum anderen werden kaliumsparende Diuretika wie Spironolacton eingesetzt. Durch Gabe von Indomethacin als Cyclooxygenasehemmer wird die Polyurie vermindert und die körperliche Entwicklung insgesamt begünstigt. (Ohlson et al. 1984, Proesmans et al. 1985; Seyberth et al. 1985, 1998). 1.2.2. Antenatales Bartter Syndrom mit sensoneuraler Taubheit (SND) Das antenatale BS mit sensoneuraler Taubheit ähnelt in seinem klinischen Erscheinungsbild sehr der antenatalen Form, ist jedoch zusätzlich durch Innenohrschwerhörigkeit gekennzeichnet. Ein weiteres differentialdiagnostisches Kriterium ist das Entwickeln eines chronischen Nierenversagens, das beim aBS normalerweise nicht auftritt (Jeck et al., 2001). Auf Behandlung mit Indomethacin sprechen die Patienten nur schlecht an, was für einen schwereren Verlauf der Krankheit spricht. Zum Teil müssen die Kinder über längere Zeit künstlich ernährt werden. 7 EINLEITUNG 1.2.3. Klassisches Bartter Syndrom (cBS) Patienten mit cBS entwickeln innerhalb der ersten Lebensjahre eine Polyurie, Polydipsie, rezidivierendes Erbrechen und tendieren zur Exsikkose. Der Krankheitsverlauf ist im Vergleich zur neonatalen Form insgesamt deutlich milder, eine Nephrokalzinose fehlt. Teilweise können ab der späten Kindheit Müdigkeit, Muskelschwäche, Krämpfe und rezidivierende Carpopedale Spasmen beobachtet werden. Wie bei der antenatalen Form besteht eine Hypokaliämie mit Blutkonzentrationen zwischen 1,5 und 2,5 mEq/l, meist begleitet von Hypochlorämie und metabolischer Alkalose. Die renale Ausscheidung von K, Na, und Cl ist erhöht. im Unterschied zum Gitelman Syndrom ist die renale Ausscheidung von Ca normal oder erhöht. Neonatales BS "Klassisches" BS Neonatales BS mit Gitelman- Syndrom Innenohrschwerhörigkeit Manifestations- neonatal alter SchwangerPolyhydramnion/ schaft Frühgeburtlichkeit frühe Kindheit neonatal Klinik Wachstumsretardierung z.Teil Exsikkose insgesamt milder Verlauf Wachstumsretardierung Exsikkose Nephrokalzinose Innenohrschwerhörigkeit terminales Nierenversagen intermittierende Muskelschwäche Tetanie metabolische Alklalose Hypokaliämie erhöhte renale NaCl- und CaAusscheidung hyperreninämischer Hyperaldosteronismus metabolische Alklalose Hypokaliämie stark erhöhte renale NaCl- und CaAusscheidung hyperreninämischer Hyperaldosteronismus metabolische Alkalose Hypokaliämie Hypomagnesiämie renale NaClAusscheidung normal bis leicht erhöht, CaAusscheigung vermindert hyperreninämischer Hyperaldosteronismus Wachstumsretardierung Exsikkose Nephrokalzinose Salz-/ Wasser- metabolische haushalt Alklalose Hypokaliämie stark erhöhte renale NaCl- und CaAusscheidung hyperreninämischer Hyperaldosteronismus oft Polyhydramnion/ Polyhydramnion/ Frühgeburtlichkeit Frühgeburtlichkeit Tab. 1.1 klinische Charakterisierung des Bartter Syndroms Kindheit oder Adoleszenz _ 8 EINLEITUNG 1.2.3. Gitelman Syndrom (GS) Die Symptomatik bei Patienten mit GS ist oft schwach ausgeprägt. Erste Symptome zeigen sich erst in der Adoleszenz bzw. im frühen Erwachsenenalter (Simon et al. 1996a). Es treten übergangsweise Episoden von Müdigkeit und Tetanie auf, die von Bauchschmerzen, Erbrechen und Fieber begleitet werden (Gitelman et al. 1966). Das Fehlen von Polyhydramnion und Frühgeburtlichkeit sowie Polyurie und Wachstumsretardierung sind wichtige Kriterien in der Differentialdiagnose zum cBS. Charakteristisch sind außerdem Hypomagnesiämie, Hypokaliämie, leichte metabolische Alkalose und hyperreninämischer Hyperaldosteronismus. Eine Hyposthenurie ist meist nicht vorhanden, jedoch können Hypermagnesiurie, Hyperkaliurie und eine verminderte Ca-Ausscheidung unter 0,5 mg/kg/Tag beobachtet werden (Rodriguez-Soriano et al., 1998). 9 EINLEITUNG 1.3. GENETIK Das BS ist eine heterogene Erkrankung, für die in den letzten Jahren für 3 Varianten des BS und das GS die verantwortlichen Gene identifiziert werden konnten (Tab. 1.2). Bei allen kann von einem autosomal-rezessiven Vererbungsmodus ausgegangen werden, da die Inzidenz bei beiden Geschlechtern gleich ist und die Eltern keine Krankheitszeichen zeigen. Erkrankung Locus Symbol BS Typ 1 15q15-21 Gen Genprodukt Klinisches Bild SLC12A1 aBS BS Typ 2 11q24-25 KCNJ1 BS Typ 3 1p36 CLCNKB BS Typ 4 Gitelman Syndrom 1p31 16q13 ? SLC12A3 Furosemid-sensitiver Na+-K+-2Cl-Kotransporter (NKCC2) luminaler ATPregulierter K+-Kanal basolateraler Cl-Kanal (CLC-Kb) ? Thiazid-sensitiver Na+/Cl--Kotransporter aBS CBS/ aBS aBS mit SND Gitelman Syndrom (GS) Tab. 1.2 genetische Charakterisierung des Bartter-Syndroms 1.3.1. BS Typ 1 Für das antenatale Bartter-Syndrom hat sich gezeigt, dass es sich um eine heterogene Erkrankung handelt. Im BS Typ 1 sind Mutationen in SLC12A1 beschrieben (Simon et al., 1996a). Das Gen, lokaliesiert auf Chromosom 15q15-21, enthält 24 Exone und kodiert für den Furosemid-sensitiven Na+-K+-2Cl--Kanal (NKCC2) im dicken aufsteigenden Teil der Henle Schleife (mTAL) (Abb. 1.1). 1.3.2. BS Typ 2 Defekte in KCNJ1, das für ROMK, kodiert führen ebenfalls zum klinischen Bild des aBS. (Simon et al., 1996b, International Collaborative Study Group for Bartter-like Syndromes, 1997, Vollmer et al., 1997) Bei ROMK handelt es sich um einen ATP-regulierten K+-Kanal im mTAL, der reabsorbiertes K+ zurück ins tubuläre Lumen zurück transportiert und so den 10 EINLEITUNG für die Funktion von NKCC2 notwendigen K+-Gradienten aufrecht erhält (Greger et al., 1981). 1.3.3. BS Typ 3 Für das cBS sind Deletionen, frame-shift, nonsense, missense oder splice Mutationen in CLCNKB, lokalisiert auf Chromosom 1p36, verantwortlich. Das Genprodukt von CLCNKB ist der spannungsgesteuerte basolaterale Cl--Kanal ClC-Kb (Abb. 1.1). 1.3.4. BS Typ 4 Brennan et al. identifizierten 1998 einen Genort auf Chromosom 1p31 mit einem Intervall von 3,4 cM zwischen den Markern D1S1661 und D1S2690 für das Bartter Syndrom assoziiert mit SND. Der Bereich konnte 1999 von Vollmer et al. mit den flankierenden Markern D1S2661 und D1S475 auf 2 cM weiter eingegrenzt werden. 1.3.5. Gitelman Syndrom Obwohl beim GS einzelne Fälle bekannt sind, in denen ein Elternteil eines Betroffenen auch erkrankt ist, kann auch hier von einer autosomal-rezessiv vererbten Krankheit ausgegangen werden (Betinelli et al., 1995). Bei nahezu allen Betroffenen können Mutationen in SLC12A3 gefunden werden. SLC12A3 kodiert für NCCT, einen Thiazid-sensitiven Na+-Cl-Kotransporter, der hauptsächlich im distalen Konvolut exprimiert wird (Abb. 1.1). proximales Konvolut Vas afferens Juxtaglomerulärer Filtration Apparat distales Konvolut Gitelman Syndrom Reab sorptio Sekretion Sammelrohr pars recta distaler Tubulus Bartter Syndrom 1-3 Überleitungsstück HENLE-Schleife Ausscheidung Abb.1.1. Expression der Genprodukte bei Bartter Syndrom Typ 1 – 3 und beim Gitelman Syndrom Die verantwortlichen Gene für BS Typ 1 – 3, NKCC2, ROMK und CLCNK-b werden im dicken aufsteigenden Teil der HenleSchleife exprimiert. Der dicke aufsteigende Teil der HenleSchleife ist für die Wasser- und Elektrolytreabsorption von Bedeutung. NCCT, das Gen, das Gitelman Syndrom verursacht, wird im distalen Konvolut (DCT) exprimiert. (Bartter et al., 1962, Clive 1995, Fanconi et al., 1971, Hildebrandt F, 1997, RodriguezSoriano, 1998, Stein, 1985) 11 EINLEITUNG 1.4. PATHOLOGIE UND PATHOPHYSIOLOGIE 1.4.1. Pathophysiologie der Niere Histologisch findet man beim aBS und beim cBS in der Niere eine Hyperplasie des juxtaglomerulären Apparates (JGA). In einigen Fällen ist zusätzlich noch eine Hyperplasie interstitieller medullärer Zellen zu erkennen. Beim aBS kann kein Tamm-Horsfall-Protein nachgewiesen werden. Als Langzeitfolge kann es zu glomerulärer Sklerose, tubulärer Atrophie, interstitieller Fibrose und Zystenbildung, die vor allem für BSND typisch ist, kommen. Das histologische Bild erinnert alles in allem stark an das Bild einer Nephronophtise, für die chronische renale Fibrose und Zystenbildung an der Grenze zwischen Rind und Mark charakteristisch sind. Bei Patienten mit GS ist der Biopsiebefund meist unauffällig. In Ausnahmefällen ist eine Hyperplasie des JGA zu sehen. (Rodriguez-Soriano et al., 1994) a b c Abb. 1.2. Morphologischer Befund der Niere von Patient II-1 der Familie F708 a, Der sonographischer Befund der rechten Niere im Alter von 20 Monaten zeigt ein echogenitätserhöhtes Parenchym mit Verlust der corticomedullären Differenzierung. b, Renale Histologie: der mikroskopische Überblick zeigt eine dichte mononucleäre Infiltration mit fokalen follikelartigen Clustern (Vergrößerung 160x). c, Bei höherer Vergrößerung (400x) erkennt man eine tubulointerstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie, die >40% des tubulointerstitiellen Raums betrifft. Ferner finden sich fokale Kalzifikationen und dichte mononukleäre Infiltrationen im Interstitium. Die Glomeruli sind zum Teil sklerosiert, wobei die anderen ein kollabiertes kapilläres Konvolut und eine Verdickung der Basalmembran am vaskulären Pol der Bowman-Kapsel aufweisen. (Jeck et al., 2001) Pathophysiologisch ist für das BS der gestörte Elektrolyttransport im mTAL verantwortlich. Der Flüssigkeits- und NaCl-Verlust führt durch die daraus folgende Hypovolämie zu einem normotensiven hyperreninämischen Hyperaldosteronismus. Die gesteigerte Reninsynthese bedingt eine Hyperplasie des JGA. Das verminderte Extrazellulärvolumen löst eine gesteigerte Prostaglandinproduktion aus, die zu Fieber führt und über den EP3-Rezeptor die 12 EINLEITUNG Adenylatcyclase inhibiert. Die gesteigerte intrazelluläre cAMP-Konzentration wiederum hemmt CLC-Kb und verschlechtert so zusätzlich den Elektrolyttransport. Der parazelluläre Ca++- und Mg++-Transport ist wegen des reduzierten elektrochemischen Gradienten gestört, es kommt zu einer Hypokalziämie. Abb. 1.3. Bisher sind Defekte in drei Transportern, die im dicken TUBULUS BLUT aufsteigenden Teil der Henle-Schleife (mTAL) exprimiert werden, bekannt, Furosemid die für das Bartter Syndrom 3Na+ verantwortlich sein können. Defekte in NKCC2, der für einen luminalen Na+ 2K+ NKCC2 K+ Na+K+2Cl--Cotransporter kodiert, der BS-Typ1 Cl 2ClCLCKB durch Furosemid gehemmt wird, führen K+ BS-Typ3 zu BS Typ 1. BS Typ 2 findet man ClROMK Mutationen in ROMK, dem luminalen K+ BS-Typ2 ATP-regulierten Kaliumkanal, der den cAMP K+-Gradienten, der für die Funktion von NKCC2 notwendig ist, aufrecht erhält. ATP Für BS Typ3 sind Defekte in CLC-Kb, Mg++, Ca++ Indomethacin einem basolateralen Chloridkanal, verantwortlich. In allen drei Fällen resultiert verminderte NaCl- Reabsorption und darauf folgend eine reduzierte Wasserretention, die den Verlust von Ca++ und Mg++, sowie den hyperreninämischen Hyperaldosteronismus bedingt. Durch das verminderte Extrazellulärvolumen wird die PGE2-Synthese gesteigert. PGE2 inhibiert über den renalen EP3-Rezeptor die Adenylatcyclase. Die dadurch verminderte intrazelluläre cAMP- Konzentration hemmt zusätzlich die Funktion von CLC-Kb. Indomethacin als Cyclooxigenasehemmer reduziert den PGE2-Spiegel im Blut und verbessert so indirekt die Funktion von CLC-Kb und damit auch die Elektrolyt- und Wasserreabsorption. (Hildebrandt, 2000) Beim GS ist der Elektrolyttransport im Gegensatz zum BS nicht im mTAL sondern im distalen Konvolut (DCT) gestört. Durch reduzierte NaCl-Rückresorption kommt es auch hier durch Wasser- und Na-Verlust zu hyperreninämischem Hyperaldosteronismus, der jedoch weniger stark ausgeprägt ist als beim BS. Die verminderte intrazelluläre Na-Konzentration führt zu einer vermehrten Ca++-Ausscheidung. Wie die für das GS charakteristische Hypomagnesiämie pathophysiologisch zustande kommt, ist bisher nicht bekannt. TUBULUS Thiazide NCCT Na+ Cl- Ca++ BLUT 3Na+ - Cl Ca++ Ca++ A 2K+ A 3Na+ Abb. 1.4. Die Na+-Cl--Rückresorption über den luminale Na+-Cl--Kotransporter NCCT wird sekundär durch die Na+-K+-ATPase angetrieben. NCCT wird pharmakologisch durch Thiazide gehemmt. Der Na+-Verlust führt zu hyperreninämischem Hyperaldosteronismus mit hypokaliämischer metabolischer Alkalose. Durch die verminderte Na+-Aufnahme in die Zelle wird die Aktivität des basolateralen Na+-Ca++Austauschers und gleichzeitig die luminale Ca++Rückresorption gesteigert. Dies führt zu Hypocalciurie. Der Entstehungsmechanismus der Hypomagnesiämie ist bisher nicht geklärt. (Hildebrandt, 2000) 13 1.4.2. EINLEITUNG Physiologie und Pathophysiologie des Ohres Da das Verständnis über die Entstehung von Taubheit mit gleichzeitiger Nierenbeteiligung für die spätere Bewertung von Kandidatengenen von Bedeutung ist, soll hier kurz auf Aufbau und Funktion der Ohren eingegangen werden. 1.4.2.1. Aufbau und Funktion des Ohres Die Cochlea besteht aus drei übereinander liegenden Gängen (Scala vestibuli, Scala tympani, Ductus cochlearis=Scala media), die alle flüssigkeitsgefüllt sind. Von der Scala vestibuli, die mit der Scala tympani am Helicotrema verbunden ist und die beide mit Perilymphe gefüllt sind, ist der Ductus chochlearis zu differenzieren, der mit Endolymphe gefüllt ist und blind endet. Die Perilymphe ähnelt eher einer extrazellulären Flüssigkeit, die Endolymphe, von der Stria vascularis gebildet, ist mit einem K+-Konzentration von 145mmol/l und einer Na+Konzentration von 1mmol/l besser mit einer intrazellulären Flüssigkeit zu vergleichen. Die Scala vestibuli wird gegen den Ductus chochlearis durch die Reissner’sche Membran abgegrenzt, zwischen Scala tympani und Ductus cochlearis liegt die Basilarmembran. Auf der Basilarmembran liegt das Corti-Organ, in welchem in Form von Haarzellen die Sinnesrezeptoren liegen. Es gibt drei Reihen äußere Haarzellen und eine Reihe innere Haarzellen. Als Hörsinneszellen fungieren nur die inneren Haarzellen von denen jede mit einer eigenen afferenten Faser verbunden ist. Über dem Corti-Organ liegt die Tektorialmembran, an der die Haarzellen durch “tip links” befestigt sind (Abb. 1.5.a). Scala media Tektorialmembran Reissner Membran Scala vestibuli Innere Haarzelle Stria Tektorial- vascularis membran Haarzellen Stereovilli äußere innere Haarzellen Basilarmembran Limulus Knochen Tunnel Stützzellen Pfeilerzellen Scala tympani Basilarmembran Nervenfasern Abb. 1.5.a Schemazeichnung eines histologischen Querschnitts durch das Coritorgan (ROCHE-Lexikon) Nervenfasern Abscherung der Stereovilli Auslenkung Abb. 1.5.b Abscherung der Stereovilli bei Schallreiz 14 EINLEITUNG Die in den äußeren Gehörgang eingetretenen Schallwellen treffen auf das Trommelfell, welches das Schallphänomen über die Gehörknöchelchenkette an die Perilymphe der Scala vestibuli weitergibt. Durch die Schwingungen des Stapes wird die inkompressible Perilymphflüssigkeit in der Scala vestibuli angestoßen. Zum Druckausgleich schwingt die Membran des ovalen Fensters gegenphasig mit. Diese winzigen Flüssigkeitsverschiebungen führen zu einer schallsynchronen Auf- und Abbewegung der Basilarmembran, den sog. Wanderwellen. Jede Welle hat ihr Amplkitudenmaximum und damit das Maximum der Schneckengangsauslenkung an einem für diese Frequenz ganz charakteristischen Punkt. Am Maximum der Amplitude kommt es durch die relativen Bewegungen zwischen Basilar- und Tektorialmembran zur Abscherung der Villi (Abb. 1.5.b), die durch resultierende Spannung der “tip links” zur Öffnung bestimmter Ionenkanäle führt. Dies löst durch Motormoleküle wie Aktin- und Myosinfilamente die aktive Kontraktion der Haarzelle aus. Diese Kontraktion erfüllt ein Verstärkerfunktion, die die Entstehung des Aktionspotentials je nach Tonfrequenz an der entsprechenden Stelle der Cochlea bewirkt. 1.4.2.2. Genetische Ursachen für Taubheit Taubheit ist eine relativ häufiger vererbter Defekt. Ungefähr eines von 800 Kindern wird mit deutlichem Hörverlust geboren. Bei den über 70-jährigen leiden sogar über 60% an einem nicht syndromische Taubheit Molekül Gen Protein connexin 26 GJB2 Kanalkomponente KCNQ 4 KCNQ4 Kanalkomponente Myosin 7A MYO7A Motormolekül diaphanous DIAPH1 Protein des Cytoskeletts POU3F4 POU3F4 Transkriptionsfaktor Kollagen11α2 COLL11A2 Extrazelluläre Matrix Otoferlin OTOF Synaptische Komponente Claudin 14 CLDN14 Junction Protein Otocadherin CDH23 Cadherin Tab. 5.1 nicht syndromische Taubheitsgene 15 EINLEITUNG Hörverlust von 25dB oder mehr (Steel et al., 2001). Über die Hälfte der Fälle von Taubheit im Kindesalter sind monogen vererbt. Hingegen ist Taubheit im Alter eher multifaktoriell bedingt. Daher sind neue Erkenntnisse über die Entstehung von Taubheit von großer Bedeutung. Bis 1996 waren noch keine nicht-syndromischen Taubheitsgene identifiziert. Inzwischen sind 19 neue Gene bekannt, die Taubheit ohne weitere organische Manifestationen auslösen. Einige Beispiele hierfür sind in Tab. 5.1 dargestellt. Mit Taubheit assoziierte Syndrome sind in großer Zahl bekannt. Bisher sind über 400 verschiedene Syndrome, die mit Hörverlust einhergehen, beschrieben. Der genetische Defekt kann sich hierbei neben dem Ohr in unterschiedlichen Organen oder Geweben manifestieren. syndromische Taubheit Molekül Gen Connexin 32 GJB1 zusätzlich betroffene Protein Strukturen periphere Nerven Kanalkomponente ATP6B1 ATP6B1 renale Azidose Ionen Pumpe KvLQT1 KCNQ1 Herz Kanalkomponente IsK KCNE1 Herz Kanalkomponente Myosin 7A MYO 7A Retina Motormolekül EYA1 EYA1 Niere, Kiefer Transkriptionsfaktor Kollagen 4 COL4A3/4/5 Niere Kollagen 2 COL2A1 Harmonin USH1C Otocadherin CDH23 Augen, Gelenke, Gaumen Retina Retina Tab. 5.2 syndromische Taubheitsgene Extrazelluläre Matrix Extrazelluläre Matrix Syndrom Charcot-MarieSyndrom dRTA mit Taubheit Jervell und Lange-Nielsen Jervell und Lange-Nielsen Usher-Syndrom 1B branchio-otorenales Syndrom Alport-Syndrom SticklerSyndrom PDZ Clustering Protein Usher-Syndrom 1C Cadherin Usher-Syndrom 1D 16 EINLEITUNG 1.5. STRATEGIEN ZUR GENFINDUNG 1.5.1. Physikalische Kartierung Die Lokalisierung von Markern auf Klonen und die Position verschiedener Klone zueinander, die z.B. durch STS content mapping bestimmt werden kann (Theorie siehe Sambrook et al., 1989), gibt eine räumliche (physikalische) Lokalisierung der Marker. Eine Serie überlappender Klone wird Contig genannt (engl. contiguous). Von der Größe der verwendeten Klone, YACs („yeast artificial chromosomes“, genomische Fragmente mit einer Größe bis 2000kb), BACs („bacterial artificial chromosome“) und PACs („P1-related artificial chromosome“, Größe bis 150 kb), wird die Auflösung der physikalischen Karte bestimmt. Die höchstmögliche physikalische Auflösung wird durch die DNA-Sequenz erreicht. Inzwischen stehen im Internet im Rahmen des Human Genome Project über 90% der Sequenz des menschlichen Genoms zur Verfügung. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/guide/human/) Der Region können ESTs („expressed sequence tags“) oder cDNAs zugeordnet werden. Zur Identifikation vorhandener Gene stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung (Parrish und Nelson, 1993): • Zoo-Blotting: Hybridisierung humaner DNA-Klone mit Säugetier-DNA (kodierende Sequenzen sind stärker konserviert als nicht kodierende) (Monaco et al., 1986) • CpG-Inseln: am 5‘-Ende von Genen gehäuftes Auftreten von unmethylierten CG-reichen Sequenzabschnitten (Cross und Bird 1995) • Hybridisierung mit mRNA/cDNA: Hybridisierung von Klonen mit mRNA aus verschiedenen Zelllinien („Northern Blotting“) oder Screening mit cDNA-Banken (Rommens et al., 1989) • Exonidentifikation: Subklonierung genomischer DNA-Klone in einen Expressionsvektor und künstliches Splicen („exon trapping“) (Duyk et al., 1990) • cDNA-Selektion (Lovett et al., 1991) • Computeranalyse von DNA-Sequenzen: Suche nach Sequenzhomlogien von PACSequenzen in Datenbanken und Vorhersage von Exonen mittels Computerprogrammen (http://www.genome.dkfz-heidelberg.de/cgi-bin/GENSCAN/genscan.cgi/) 17 • EINLEITUNG Inzwischen stehen Genkarten exprimierter Gene des menschlichen Genoms zur Verfügung (http://www.sciencemap.org/genome2001, http://www.sanger.ac.uk/HGP/Genes/, http://www.nature.com/genomics/human/) den Vorteil, dass die DNA-Abschnitte, die genetische Information enthalten, meist den interessanteren und medizinisch/biologisch bedeutsameren Teil darstellen. 1.5.2. Kopplungsanalyse Unter Kopplung versteht man die gemeinsame Vererbung von zwei oder mehreren Allelen auf die Nachkommen (cosegregation) wegen der engen physischen Nachbarschaft ihrer Loci auf dem Genom. Genetische Karten geben Auskunft über die Rekombinationshäufigkeit zwischen Markern. Die Rekombinationsrate wird mit dem griechischen Buchstaben θ (theta) bezeichnet. Zwei Loci, die voneinander unabhängig segregieren, sind nicht gekoppelt und weisen zwischen sich eine Rekombinationsrate von θ = ½ auf. Die Rekombinationsrate θ zwischen gekoppelten Loci ist < ½. Bei immer enger werdender Kopplung strebt θ gegen 0, d.h. ein Rekombinationsereignis zwischen den beiden Loci wird immer unwahrscheinlicher. Das Ziel einer Kopplungsanalyse ist es, θ zu schätzen und die Hypothese „keine Kopplung“ ( = ½) gegen die Hypothese „Kopplung“ ( < ½) zu testen. Zur Durchführung einer Kopplungsanalyse werden polymorphe Mikrosatelliten-Marker, verteilt über das ganze Genom mit einem Abstand von durchschnittlich 10cM, an mehreren Familien bzw. einer großen Familie untersucht. Ein cM entspricht dabei dem Auftreten einer Rekombination in 100 Meiosen. Anhand aufgetretener Rekombinationen zwischen Mikrosatelliten-Markern in verschiedenen Generationen kann im Vergleich zwischen Betroffenen und Gesunden der Genort eingegrenzt werden. Durch Berechnung des LOD-Scores für einen Marker kann die Kopplungswahrscheinlichkeit des Krankheitsgenes an den Genort bestimmt werden. Ein positives Kopplungsverhältnis zwischen Marker und Erkrankung wird angenommen, wenn der LOD-Score >3 ist. Ein LODScore <-2 schließt diesen Genort nahezu aus. 18 EINLEITUNG 1.5.3. Haplotypenanalyse Unter einem Haplotypen versteht man ein Allel-Muster für verschiedene, benachbarte Loci auf dem gleichen Chromosom. Zur Haplotypenanalyse werden hoch polymorphe SatellitenMarker, die repetitive di-, tri-, oder tetranukleoid-Sequenzen enthalten, verwendet (Weber und May, 1989). Die Basis dieser genetischen Untersuchung ist die Tatsache, dass sämtliche Gene bzw. Allele eines Chromosoms eine Kopplungsgruppe darstellen und so während der Meiose als Einheit weitergegeben werden. Dieses theoretisch absolute Kopplungsverhältnis wird durch Rekombination zwischen mütterlichen und väterlichen Allelen (Crossover) gebrochen. Die Stärke einer Kopplung wird durch die Rekombinationsfraktion θ beurteilt. θ nimmt für den Fall einer absoluten Kopplung den Wert 0 an, während θ = 0,5 die unabhängige Segregation zeigt. Befindet sich ein polymorpher Marker in der Nähe des Krankheitsgens, so ist die Wahrscheinlichkeit, dass er mit dem Gen gemeinsam vererbt wird, sehr hoch. So kann das Intervall, das als Genort in Frage kommt weiter eingegrenzt werden. 1.5.4. Kandidatengenanalyse Es gibt die Möglichkeit der funktionellen und der positionellen Kandidatengenanalyse. Funktionelle Kandidaten stehen pathogenetisch mit der Krankheit in direktem Zusammenhang. Positionelle Kandidaten dagegen sind all die Gene, die in der durch Eingrenzung definierten kritischen Region liegen. Zur Untersuchung der Kandidaten können verschiedene Methoden eingesetzt werden: • SSCP („single strand conformation polymorphism“) (Orita et al., 1989) • WAVE® Nucleic Acid Fragment Analysis (Taylor et al., 2000) • RT-PCR • direkte Sequenzierung 19 2. ZIELE DIESER ARBEIT ZIELE DIESER ARBEIT Zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass der Genort für BSND auf Chromosom 1p31 liegt (Landau et al., 1995). Das kritische Intervall war von Vollmer et al. (2000) bereits auf ca. 2 Mb eingegrenzt worden und wurde durch ein PAC-Kontig überspannt: 654h19, 167a19, 845c20, 705f19, 277a12, RP5-1099n07, RP11-12c17, 109i2 und 633h17: zwischen den Klonen RP11-12c17 und 109i2 lag eine Lücke, von der im Rahmen des Human Genom Projekts noch keine Sequenz bekannt war, die jedoch durch Screening der human genomic BAC library BAC-5331 (GenomSystemsInc, St. Louis, Missouri) durch einen Klon (GS1118i2) überbrückt wurde. Ziel dieser Arbeit war zunächst, das als Genort in Frage kommende Intervall auf Chromosom 1p31 weiter einzugrenzen. Hierzu sollte zunächst eine Haplotypenanalyse an einer nicht konsanguinen und 9 konsanguinen Familien durch homozygosity-mapping durchgeführt werden. Im Anschluss daran unter der Hypothese, dass die Familien untereinander entfernt verwandt sind eine Sharing-Analyse durchgeführt werden, um den Bereich eventuell noch weiter verkleinern zu können. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Gene, die in dem eingegrenzten Intervall als Kandidaten in Frage kommen. Dabei sollten die Gene mittels SSCP und direkter Sequenzierung untersucht werden. Nach Identifizierung des Gens sollte bei allen anderen Betroffenen eine Mutationsanalyse durchgeführt werden. 20 3. FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN FAMILIEN, MATERIALIEN UND METHODEN 3.1. FAMILIEN Untersucht wurden 10 Familien, bei 9 war Konsanguinität bekannt. Fünf der Familien waren türkischer Abstammung, zwei tunesischer, eine libanesischer und je eine französischer bzw. britischer Abstammung. Die Klinik 6 dieser Familien mit insgesamt 8 Betroffenen wurde von Jeck et al. 2001 veröffentlicht. Alle Patienten zeigten eine schwere Form des aBS kombiniert mit Innenohrschwerhörigkeit. Die Kinder kamen in der 27-33 SSW auf die Welt und hatten ein Geburtsgewicht zwischen 1100g und 1700g. Die Patienten hatten eine eingeschränkte glomeruläre Funktion und mit Ausnahme eines Patienten erhöhte Serum-Kreatininwerte zwischen 1 und 6 mg/dl. Die Fähigkeit zur Harnkonzentrierung war fast komplett aufgehoben. Ab einem Alter von 6 Monaten konnte durchweg sonographisch eine gesteigerte Echogenität sowohl im Cortex als auch in der Medulla der Nieren gezeigt werden. Bei 2 Kindern konnte eine Nephrokalcinose festgestellt werden. Bemerkenswert ist, dass alle 8 Patienten ein chronisches Nierenversagen entwickelten. Zwei der Patienten wurden im Alter von 4 bzw. 14 Jahren wegen terminalen Nierenversagens transplantiert und zeigten im 2 und 4 Jahre Followup eine normale Funktion des Spenderorgans. Durch frühen Beginn einer Indomethacin-Therapie konnte bei 4 von 5 therapierten Kindern ein Rückgang des Flüssigkeits- und Salzverlustes beobachtet. Die günstige Auswirkung der Indomethacin-Therapie auf die Verbesserung der Symptome und den Rückgang der hypokaliämischen Alkalose war jedoch sehr viel geringer als bei Indomethacin-behandelten Bartter-Patienten, bei denen Mutationen in NKCC2 oder ROMK beschrieben sind. (Seyberth et al., 1987) 21 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN 3.2. MEHRFACH VERWENDETE MATERIALIEN 3.2.1. Geräte Thermal cycler: cyclogene PHC-3, Techne, Thermo-Dux GmbH, Wertheim Eppendorf-Zentrifuge: Biofuge 15, Heraeus Instruments Brutschrank: Typ b 6200, Heraeus Instruments 3.2.2. Lösungen 10×TBE: 108 g Tris Base, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) Nukleotid-Stammlösungen: Ultrapure dNTP Set, 100 mM Solutions, Pharmacia Biotech Taq-Polymerase: Thermus aquaticus DNA Polymerase, 5000 U/ml, (Gibco) HotStarTaq: DNA-Polymerase, 50 U/ml, (Quiagen) 10×PCR Puffer: 500 mM KCL, 15 nM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 TE -Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 EDTA (0,5 M): 186,1 g EDTA auf 800 ml Aqua dest.(steril) gefüllt mit NaOH auf pH 8,0 titriert, Aqua dest. (steril) ad 1000 ml, vor Gebrauch autoklaviert 100 Base Pair Ladder: Konzentration 1µg/µl (Pharmacia Biotech, Freiburg) APS (10 %): 300 mg Ammoniumpersulfat (Kodak, New Haven,USA) Aqua dest. (steril) ad 3000 µl TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (Sigma Aldrich, Steinheim) 3.2.3. Sonstige Materialien Mikrotiterplatten: 96 well, Techne, Ltd. Whatman Papier: GB002, Schleicher & Schuel 22 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN 3.3. METHODEN 3.3.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Mit Hilfe der PCR können bestimmte DNA-Fragmente zu verschiedenen Versuchszwecken exponentiell vermehrt werden. (Saiki et al. 1985; Mullis et al. 1986; Mullis and Faloona 1987) PCR-Protokoll für ein Reaktionsvolumen von 15µl: • 3 µl genomische DNA (10 ng/µl) • 1,5 µl je Primer (forward und reverse) (10 pmol/µl) • 1,5 µl 10×PCR-Puffer • 1,5 µl einer 2mM dATP-dCTP-dGTP-dTTP-Stammlösung (von Gibco) • 0,1 µl Taq-Polymerase (5U/µl) (von Gibco) • 0,5 µl 50mM MgCl2-Lösung • Aqua bidest ad 15 µl Dieser Ansatz wurde in eine Mikrotiterplatte mit 96 wells pipettiert und mit einem Tropfen Mineralöl (Firma Sigma) vor dem Verdunsten geschützt. Der Thermal Cycler wurde folgendermaßen programmiert: Zyklen 1 Dauer [sec] Temperatur [°C] Initiale Denaturierung 240 94 30 94 Annealing 30 54-72 Extension 60 72 final Extension 600 72 25-32 Denaturierung 1 Die Annealing-Temperatur variiert bei den verschiedenen Primern je nach Länge (18-30 Nukleotide) und GC-Gehalt. Je länger die Primer sind, desto spezifischer ist ihre Bindung und desto höher kann die Annealing-Temperatur gewählte werden. Die Annealingtemperatur kann annäherungsweise nach der folgenden Formel berechnet werden: T = 4(C+G) + 2(A+T) 23 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN Zum Design der Primer wurde das Computer-Programm des Zeno HTTP server verwendet. (http://zeno.well.ox.ac.uk:8080/git-bin/primer3.www.cgi) 3.3.2. Agarose-Gelelektrophorese Die PCR-Produkte werden mit Probenpuffer (30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylenxyanol, 5-fach konzentriert) vermischt und je nach Größe auf einem 0,8 - 2%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromidzusatz bei ca. 120V für eine Stunde elektrophoretisch aufgetrennt. (ultraPURE Agarose von Gibco, in TBE-Puffer: 90 mM Trisborat, 2 mM EDTA pH 8,0). Als Längenmarker wurde 1µl „ReadyLoad“ 100 bp DNA Ladder bzw. 1 kb DNA Ladder (beides von Gibco) aufgetragen. Die ethidiumbromidgefärbten Banden wurden unter UV-Licht abfotografiert (Bio Print DS System, CCD Kameramodul (mit Objektiv und UV-Filter), CN-TFX Dunkelkammer, Aufnahmesoftware: BioCapt 97, Videoprinter: Mitsubishi Electronic LTF Labortechnik GmbH, Deutschland). 3.3.3. Haplotypenanalyse Die Haplotypenanalyse beruht auf Genotypisierung mit Mikrosatelliten-Markern betroffener Familien. Bei konsanguinen Familien findet man durch gemeinsame Abstammung bei autosomal rezessiver Vererbung homozygote Bereiche. Nach diesen homozygoten Bereichen sucht man, da das Krankheitsgen nur dort lokalisiert sein kann, setzt man voraus, dass das zweite krankmachende Allel nicht aus dem allgemeinen Genpool stammt. 3.3.3.1. 32 P-markierte PCR Zur Haplotypenbestimmung mit Mikrosatelliten-Markern wurden die PCR-Produkte durch 32 radioaktives dCTP ( P-dCTP) markiert. Zum Teil wurden Mikrosatelliten-Marker aus der Gènèthon-Mikrosatelliten-Karte (Dib et al. 1996) eingesetzt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/guide/human/). Zusätzlich wurden in der Umgebung von di-, tri-, oder tetranukleotidRepeats neue Primer generiert. 24 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN Die PCR wurde pro Reaktionsansatz (10µl) durchgeführt mit: • 3 µl genomisch DNA (10 ng/µl) • 1 µl je Primer (forward, reverse) (10pmol/µl) • 1 µl 4×dNTP (2 mM dATP, dGTP, dTTP; 0,027 mM dCTP) • 0,1µl 32P-dCTP (10 Ci/µl; Amershman Life Science) • 1 µl 10×PCR-Puffer • 0,3 µl 50mM MgCl2 • 0,06 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) • Aqua bidest ad 10 µl Reaktionszyklen siehe 3.2.1. I = normales Allel = krankes Allel II III IV Abb.3.1 Prinzip der Homozygotie durch Abstammung. Ein normales Allel ist mit einem Strich markiert, ein krank machendes Allel mit einem Kreuz. Die Großmutter vererbt an ihre beiden Söhne gemeinsam mit den umgebenden Allelen ein krank machendes Allel. Die Söhne geben das defekte Allel wiederum an ihre Nachkommen weiter. Nachkommken einer konsaguinen Ehe in der III. Generation können nun von Vater und Mutter das krank machende Allel vererbt bekommen und mit diesem die Allele in der direkten Umgebung. Durch Rekombinationen im Verlauf der Meiose verändern sich die dem Lokus entfernt liegenden DNAAbschnitte, die dem Lokus naheliegenden bleiben gleich, d.h. sie sind homozygot durch Abstammung. Das Krankheitsgen muss also in einem homozygoten Bereich liegen. (Hildebrandt, 2000) 25 3.3.3.2. FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur Auftrennung der radioaktiv markierten PCR-Produkte wurde ein 8 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel hergestellt: 8 %iges Instagel: 100 ml Accugel 19:1 [40 % (19:1) Acrylamid: Bisacrylamid Solution (gas stabilized), National Diagnostics] 250 g Harnstoff 50 ml 10×TBE ad 500 ml mit Aqua dest. 60 ml des Instagels wurden zur Initiation der Polymerisation 300 µl 10 %iges APS (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) und 30 µl TEMED (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) zugesetzt und vermischt. Die Proben wurden im Verhältnis 1:1 mit Ladepuffer [980 µl Formamid, 20 µl 0,5 M EDTA, 5 l Bromphenolblau 10 % (w/v), 2 µl Xylencyanol 10 % (w/v)] vermischt und 5 min bei 94°C denaturiert. Je 5 µl wurden auf das Gel aufgetragen und bei 55 W elektrophoretisch je nach Produktlänge 3 – 6 h aufgetrennt (Spannungsquelle: Pharmacia LKB ECPS 3000/150; GIBCO BRL PS 9009). 3.3.3.3. Autoradiographie Das Gel wurde auf Whatman-Papier (GB002, Schleicher & Schall) unter Vakuum bei 80 °C für ca. 30 min getrocknet. Zwischen Geltrockner (Modell 583, BIO-RAD) und Vakuumpumpe war eine Kühlfalle zwischengeschaltet. Auf das Gel wurde ein Röntgenfilm (100 NIF, 35×43 cm, Kodak) aufgelegt und in einer lichtdichten Pappkassette für 6 – 24 h bei Raumtemperatur exponiert. Die Übertragung der Haplotypen mit Hilfe des Computerprogramms Cyrillic (Version 2.1) in Stammbäume erleichtert die Auswertung, da homozygote Bereiche deutlich werden. 26 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN 3.3.4. Haplotype-Sharing-Analyse Diese Methode beruht auf dem Prinzip des "Identity by descent". In einer geeigneten Isolatpopulation erwartet man, dass ein Teil der Patienten von einem oder wenigen mutationstragenden Vorfahren ( foundern ) abstammen. Die Patienten haben die Mutation von einem founder und teilen sich ein Chromosomensegment um die Mutation. An dieser Stelle sind sie also "identical by descent". Während übliche kopplungsanalytische Verfahren die Beziehungen zwischen einzelnen Markern und einem Mutationslocus betrachten, macht sich die Haplotype-Sharing-Analyse die Informationen ganzer Chromosomensegmente zu Nutze. Vorteil von der Haplotype-Sharing-Analyse ist, dass die Verwandtschaft weiter entfernt ist als beim Homozygosity-mapping und der identische Bereich deshalb kleiner. 3.3.4. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Die SSCP ist eine Methode, die zur schnellen Detektion von Mutationen verwendet werden kann. Sie wurde erstmals 1989 von Orita beschrieben (Orita et al., 1989; Sheffield et al., 1993). Das Prinzip beruht auf der Tatsache, dass die Konformation eines DNA-Moleküles schon durch einen einzelnen Basenaustausch verändert sein kann. Hierzu amplifiziert man mittels PCR aus genomischer DNA-Fragmente mit einer Größe bis zu 250 bp. Diese Fragmente werden auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Liegt bei einem Individuum eine Mutation vor, so kann man dies aufgrund des veränderten Laufverhaltens des Fragments im Vergleich zu einem Kontrollindividuum erkennen. Die Proben, bei denen ein „Shift“ gefunden wurde, werden mittels direkter Sequenzierung weiter untersucht. So lassen sich Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen innerhalb des amplifizierten Produktes sichtbar machen. 27 3.3.4.1. FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN SSCP-Polyacrylamid-Gelektrophorese Da mit Hilfe der SSCP als Screening-Verfahren nur ca. 70% der vorhandenen Mutationen gefunden werden (Grompe et al.,1993), wird die Elektrophorese bei zwei unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt, um eine höhere Sensitivität zu erreichen: für zwei 5 %ige (10 %ige) SSCP-Gele (0,5xTBE, 8% Acrylamid): 12,5 ml (10 ml) H2O 2,5 ml (5 ml) Glycerin wasserfrei 25 ml 1xTBE 10 ml Accugel (29:1) [40% (29:1) Acrylamid:Bisacrylamid Solution] 250 µl APS 10% (w/v) 25 µl TEMED Die PCR-Produkte wurden 1:1 mit SSCP-Ladepuffer [9,8 ml Formamid, 500 µl EDTA 0,5 molar; 50 µl Bromphenolblau(w/v); 20 µl Xylencyanol 10% (w/v)] versetzt, 5 min bei 94°C denaturiert und anschließend zur Minimierung der Renaturierung sofort auf Eis gestellt. Die Elektrophorese wurde in einer Elektrophoresekammer (Multigel Long, Biometra, Göttingen) durchgeführt, die an eine Kühlanlage (Pharmacia LKB MultiTemp II, Freiburg) und eine Spannungsquelle (Biometra Power Pack P25) angeschlossen war. Zu diesem Zweck wurden die Gele mit 6 – 8 µl der vorbereiteten Proben beschickt und bei 150 V und einer Lauftemperatur von 14°C für 6 h elektrophoretisch aufgetrennt. 3.3.4.2. Silberfärbung Die Banden wurden mittels einer Silberfärbung der Gele sichtbar gemacht. (Hiort et al.1994) Zur Fixierung wurden die Gele für 10 min in eine 10 %ige Ethanollösung (v/v) gelegt. Um die Silberbindung an die DNA vorzubereiten, folgte eine 3 minütige Behandlung mit 1 %iger Salpetersäure (w/v). Nach zweimaligem Spülen mit Aqua bidest. wurden die Gele für 20 – 30 min in 0,2 %iger Silbernitratlösung inkubiert. Nach zwei weiteren Waschgängen in Aqua bidest. wurde die Entwicklerlösung [23 g Natriumcarbonat (Na2Co3), 540 µl 37% Formaldehyd (v/v), 1 l Aqua bidest.] zugegeben und abgewartet, bis die Banden zu sehen 28 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN waren. Die Entwicklungsreaktion wurde mit 10 %iger Essigsäure (v/v) gestoppt, die abschließend mit Wasser abgespült wurde. Die gefärbten Gele wurden auf Whatman-Papier geblottet und für ca. 1 h auf einem Vakuumtrockner (Fa. Biorad, Darmstadt) getrocknet. 3.3.5. automatische DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach der Methode des „Flourescence-based didesoxy DNA cycle sequencing“ (Sanger et al., 1977; Ansorge et al., 1987). Hierfür wurden der BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems) und der ABI PRISMTM Taq Dye DeoxyTM CycleSequencing Kit (PE Applied Biosystems) verwendet. Eingesetzt wurden 0,2 bis 1 µg template DNA und 10 pmol Primer in einem 20 µl Reaktionsansatz, vermischt mit 4 µl BigDyeTM. Die Sequenzierreaktion wurde im Thermal cycler nach folgendem Zyklus durchgeführt: Zyklen 25 Dauer [sec] Temperatur [°C] Initiale Denaturierung 240 94 Denaturierung 30 94 Annealing 30 50-60 Extension 240 60 Das Reaktionsprodukt wurde mit 75 % Isopropanol gefällt. Die elektrophoretische Auftrennung wurde von der „core facility“ am Zentrum für Klinische Forschung der Universitätsklinik Freiburg übernommen. 3.3.6. Restriktionsverdau Restriktionsendonukleasen sind in der Lage, spezifische DNA-Sequenzen zu erkennen und zu schneiden. Durch Mutationen können neue Schnittstellen entstehen oder vorhandene verloren gehen. Der Restriktionsverdau ist eine Methode, mit der schnell viele Individuen auf Vorhandensein eines Basenaustauschs, der durch Sequenzanalyse bei Betroffenen gefunden wurde, untersucht werden können. 29 FAMILIEN, MATERIAL UND METHODEN Das Enzym wurde unter Verwendung des vom Hersteller angegebenen Puffers dem aufgereinigten PCR-Produkt in einer Konzentration von 1 U pro µg der zu verdauenden DNA zugesetzt. Der Ansatz wurde bei dem jeweiligen Temperaturoptimum des Enzyms ca. 2 h inkubiert. Die Proben wurden anschließend durch Agarose-Gelektrophorese aufgetrennt. 3.3.7. allelspezifische PCR Die allel- bzw. sequenzspezifischen PCR ist eine molekulargenetische Methode, die die direkte Feststellung einer Punktmutation durch ein einfaches PCR-Experiment erlaubt. Ein Basen-Mismatch zwischen 3‘-Terminus eines PCR-Primers und DNA-Matrize verhindert unter geeigneten Versuchsbedingungen die die Amplifikation des PCR-Produkts. Zunächst amplifiziert man ein Produkt, das die zu untersuchende Mutation enthält. Dieses verwendet man in einer zweiten PCR mit einem geschachtelten (nested) sequenzspezifischen Primerpaar als Template. Ein Produkt erhält man nur, wenn die Matrizen-Sequenz auch am 5‘-Ende komplementär zur Primersequenz ist. Als interne Kontrolle amplifiziert man zusätzlich im gleichen PCR-Ansatz ein Fragment, dessen Länge sich deutlich von den allelspezifischen Fragmenten unterscheidet (Sommer et al., 1992). Die PCR-Reaktion wird mit HotStarTaqTM (Quiagen) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Zyklen Dauer [sec] Temperatur [°C] 1 Initiale Denaturierung 240 94 25 Denaturierung 30 94 Annealing 30 62 Extension 60 72 final Extension 600 72 1 30 4. ERGEBNISSE ERGEBNISSE 4.1. HAPLOTYPENANALYSE ZUR WEITEREN EINGRENZUNG DES GENORTS 4.1.1. Eingrenzung mittels Homozygosity mapping Der auf Chromosom 1p31 lokalisiert Genort (Landau et al., 1995) war 2000 von Vollmer et al. zwischen die Marker D1S2661 und D1S475 auf ca. 4kb eingegrenzt worden. Ziel war nun auf dem nahezu lückenlosen Kontig durch Design neuer polymorpher Mikrosatelliten-Marker diese Eingrenzung weiter einzugrenzen. Untersucht wurden 9 Familien, die Eltern waren mit einer Ausnahme konsanguin. Von 21 neu entworfenen Mikrosatelliten-Marker waren 8 polymorph: 277A12-a, 277A12-b, 109I2-b, 101C11-e, 319F11-a, 845C20-a, 845C20-b und DJ1099N07-c (Tab. 4.1). Außerdem wurden die kommerziellen Marker der Region aus der Gènèthon Map bei allen Familien untersucht, für die bisher noch keine Ergebnisse vorlagen. Mit den Markern wurde ein Bereich von ca. 3,5 Mb abgedeckt. Im folgenden sollen die durch Genotypisierung erhaltenen Daten in Form von Haplotypen für die untersuchten Familien dargestellt werden (Abb. 4.1-4.5). Tab.4.1 Polymorphe Mikrosatellitenmarker Marker Forward - Primer Repeat Größe Temp. Allelanzahl taa 183 58° nicht polymorph gaat 142 58° polymorph at 136 58° polymorph gcc 217 58° nicht polymorph aac 151 58° nicht polymorph Reverse - Primer 997D24A2 5'-cag tgg cat acg cct gta gtt cc-3' 5'-tcc ctg aat ggt gga cat tg-3' 277a12-a 5'-ctg gcc aca gca gat act caa aa-3' 5'-cta gtg gct att gta ttg ggc a-3' 277a12-b 5'-gtt ctg ggt ttt aat ata gtc aac-3' 5'-aca gag caa gcc ttg tct cta-3' 277a12-c 5'-cct ttg cct ttg gca aac atg g-3' 5'-ctt tga cag ctg gaa tga gc-3' 277a12-d 5'-gca aca aga gcg aaa ctc cg-3' 5'-cag gtg ttc tgc ctg cct t-3' 31 Marker F-Strang-Primer ERGEBNISSE Repeat Größe Temp. Allelanzahl gaat 170 58° nicht polymorph gt 212 58° nicht polymorph tg 179 58° nicht polymorph ac 123 58° polymorph gatt 164 58° nicht polymorph aac 164 58° nicht polymorph ca 174 58° nicht polymorph tg 175 58° nicht polymorph caat 145 58° nicht polymorph ca 112 52° nicht polymorph gt 150 58° polymorph tc 132 58° nicht polymorph gt 146 58° polymorph ac 212 58° polymorph ggaa 203 58° polymorph ct 173 58° polymorph R-Strang-Primer 240d10-a 5'-cca gca cat agc aca tgg ca-3' 5‘-tgt gcc tgg cca gaa tta ac-3' 240d10-b 5'-agg agg cag aga ttg cag tg-3' 5'-cac tga cat cct act gta tgc-3' 109i2-a 5'-tgc tga gct gct cca gtt tc-3' 5'-tgg agt ctg gag gat ggt-3' 109i2-b 5'-gct tta gct tct ctc tct gtc-3' 5'-gga gtc aga tgt ctt gac at-3' 109i2-c 5'-cca agt gct ggg att aca gg-3' 5'-tga gct gag att gct cca ct-3' 109i2-d 5'-gga act tgt cat agc cac gg-3' 5'-caa agt gct gag ata aca ggc-3' 101c11-a 5'-aca cag aga cct ctg ata cc-3' 5'-tct ctg gtt tga ctt gtg cc-3' 101c11-b 5'-gtc aga tgt ctt gac att tgc-3' 5'-cga tga aca ctt gta tac cc-3' 101c11-c 5'-aga ttg ctc cac tgt act cc-3' 5'-gga tta cag gca tga gcc act-3' 101c11-d 5'-ccc att caa aga gta cta cc-3' 5'-gtg ggt cat aat cat cag tg-3' 101c11-e 5'-ggt aga aat cta gac tcc cg-3' 5'-ctg tac tct act cta gcc aaa cac c 1043g4-a 5'-tat tgt gct tgc cga cct cc-3' 5'-tt ctc cag aga aac aga acc-3' 319f11-a 5'-gtt gct aca atc cac aga gc-3' 5'-gct act gga agc tac aga ta-3' 845c20-a 5'-caa aca gcc ctg agc aaa tac g-3' 5'-atg cct atc ctc agc tca gcg-3' 845c20-b 5'-ctt ctc ccg ctt cct aat gct c-3' 5'-gcc ttg aaa gga acgt tga tgg-3' DJ1099n07-c 5'-gag ttg gag ataa cca atg ag-3' 5'-ctt ctc agt gcc aca gct tg-3' 32 ERGEBNISSE F791 I:1 II:3 II:1 III:4 IV:2 I:2 II:2 III:1 III:5 II:4 III:2 III:3 III:6 IV:1 IV:4 IV:2 IV:3 D1S2661 845C20a 845C20 845C20b 845C20 277A12a 277A12 277A12b 277A12 DJ1099N0 DJ1099N07c D1S41 D1S417 D1S2652 109I2 109I2b 101C11e 101C11 319F11a 319F11 633H17g 633H17 D1S47 D1S475 D1S20 D1S200 D1S2690 1 2 ? 2 1 2 1 3 1 ? ? 1 1 1 1 1 ? ? ? ? ? 2 1 ? ? ? ? 1 2 1 1 1 ? 2 2 2 2 1 ? ? ? 2 2 3 2 1 1 ? 2 2 3 2 1 3 ? ? 1 1 2 1 1 ? ? ? ? ? 2 1 ? ? ? ? 1 2 1 ? 2 ? 2 1 2 ? ? ? ? ? 1 ? ? ? 1 1 ? 1 3 1 1 2 ? ? ? 2 2 2 2 V:4 V: V:3 V:2 D1S2661 845C20a 845C20b 277A12a 277A12b DJ1099N07c D1S417 D1S2652 109I2b 101C11e 319F11a 633H17g D1S475 D1S200 D1S2690 IV:3 ? 1 ? 1 3 2 ? ? ? ? ? 2 ? ? ? 1 1 4 2 2 2 2 1 3 5 2 2 2 3 2 1 1 4 2 2 2 2 1 3 5 4 1 1 2 1 Abb. 4.1. Haplotypen der Familie F791. Marker, die bei den Eltern homozygot waren und somit nicht informativ sind, sind als farblose Balken dargestellt. Der homozygote Bereich bei dem betroffenen Kind V-4 ist eingerahmt. Flankierender Marker war 319F11a. Die Haplotypen des verstorbenen Cousin wurde nicht weiter untersucht. 4 1 3 3 3 3 ? 1 1 ? ? 1 ? 2 ? D1S2661 845C20a 845C20b 277A12a 277A12b DJ1099N07c D1S417 D1S2652 109I2b 101C11e 319F11a 633H17g D1S475 D1S200 D1S2690 1 3 4 4 1 4 ? 2 2 ? ? 2 ? 1 ? 4 1 3 3 3 3 1 1 3 1 4 1 2 2 4 II:1 3 2 1 1 2 3 1 1 3 1 4 1 2 2 4 3 2 1 1 2 3 ? 1 1 ? ? 1 ? 2 ? I:2 1 1 2 2 4 3 ? 2 2 ? ? 2 ? 3 ? 4 2 1 1 5 2 1 1 2 ? ? 1 1 1 2 1 2 1 1 5 2 2 1 2 ? ? 1 1 2 3 1 3 3 1 5 1 2 2 2 ? ? 3 1 2 3 II:1 II:1 I:1 I:1 1 2 1 1 5 2 2 1 2 ? ? 1 1 2 3 F730 ? 3 3 1 5 1 2 2 2 ? ? 3 1 ? ? 2 2 1 1 5 2 1 1 2 ? ? 1 1 2 3 II:2 II:2 I:2 I:2 ? 2 2 2 5 3 2 3 1 ? ? 2 2 ? ? 1 2 2 2 5 3 2 3 1 ? ? 2 3 3 1 . 4.2. Haplotypen der Familien F591 und F730. Flankierender Marker war bei F591 277A12-b, bei Familie F730 war der gesamte ich homozygot . Der Marker 277A12-b war telomerisch neuer flankierender Marker und konnte den Bereich weiter eingrenzen. D1S2661 845C20a 845C20b 277A12a 277A12b J1099N07c D1S417 D1S2652 109I2b 101C11e 319F11a 633H17g D1S475 D1S200 D1S2690 I:1 F591 33 ERGEBNISSE 34 ERGEBNISSE 35 ERGEBNISSE 36 ERGEBNISSE 37 ERGEBNISSE Die 5 Marker DJ1099n07-c, D1S417, D1S2652, 109i2-b und 101c11-e waren bei allen Betroffenen konsanguiner Familien homozygot. Neue flankierende Marker waren telomerisch 277a12-b, der bei F591 und F813 heterozygot war, und centromerisch 319f11-a, heterozygot bei F791. Der Bereich, der noch mit Kopplung vereinbar war und so als Genort für BSND in Frage kam, verkleinerte sich durch diese neue Eingrenzung auf ca. 0,8 Mb (Abb. 4.6). tel D1S1661 67664 Kbp D1S2661 61155 Kbp 277a12b 61913 Kbp D1S417 62218 Kbp D1S2652 62371 Kbp 101c11e 62850 Kbp D1S475 D1S200 62974 Kbp 63100 Kbp D1S2690 64867 Kbp cen 0,9Mb Landau Vollmer F197 F591 F813 Abb. 4.6 Kopplungsintervall auf 1p31 links sind die Mikrosatellitenmarker aufgetragen, rechts die Position auf Chromosom 1. Die Balken symbolisieren die Ergebnisse des Homozygosity mappings. Heterozygote Bereiche sind hellblau markiert, homozygote orange. Das Intervall, das 1999 von Vollmer et al. auf 4cM eingegrenzt worden konnte auf weniger als 900 kb verkleinert werden. Neue flankierende Marker (fett gedruckt) sind 277A12b und 101c11e. 38 ERGEBNISSE 4.1.2. Haplotype-Sharing-Analyse Die fünf Familien türkischer Abstammung zeigten ein ausgedehntes Haplotype-Sharing. Der Sharing-Haplotype erstreckte sich über 14 Marker zwischen D1S2661 und D1S200. Für die Marker DJ1099n07-c, D1S417 und D1S2652 teilten alle fünf Familien den gleichen Haplotypen. Nach telomerisch bzw. centromerisch setzte sich der gemeinsame Haplotyp bei einzelnen Familien weiter fort. Das fehlende Sharing bei F314 für den Marker 109i2-b grenzte das bestehende Intervall auf weniger als 900 kb weiter ein. Bei F197 und F813 waren die Haplotypen der beiden Marker D1S417 und D1S2652 identisch, jedoch distal davon keine Gemeinsamkeiten zu finden. Die beiden betroffenen Kinder von F708 und F662 und F206 teilten die Haplotypen für 3 Marker: DJ1099n07-c, D1S417 und D1S2652. F708 und F662 hatten zusätzlich noch den Marker 109i2-b und heterozygot 277A12-b gemeinsam (Abb 4.7). F791 D1S2661 845C20a 845C20b 277A12a 277A12b DJ1099N07c D1S417 D1S2652 109I2b 101C11e 319F11a 633H17g D1S475 D1S200 D1S2690 2 4 4 2 4 4 1 1 3 5 4 2 2 1 3 2 4 4 2 4 4 1 1 3 5 2 1 1 2 4 F314 2 4 4 2 3 4 1 1 2 5 2 1 1 2 4 2 4 4 2 3 4 1 1 2 5 2 1 1 2 4 F591 2 4 4 2 3 4 1 1 3 1 4 1 2 2 4 3 5 5 5 4 4 1 1 3 1 4 1 2 2 4 F730 3 2 1 3 5 4 1 1 3 1 4 1 2 2 2 3 2 1 3 5 4 1 1 3 1 4 1 2 2 2 F786 2 4 4 1 3 4 1 1 3 1 4 3 2 3 4 2 4 4 1 3 4 1 1 3 1 4 3 2 3 4 F197 1 3 4 2 4 3 3 3 4 3 4 2 2 2 1 2 3 4 2 4 3 3 3 4 4 4 2 2 2 4 F813 1 5 7 2 1 6 3 3 1 4 4 1 2 1 4 3 6 2 5 4 6 3 3 1 4 4 1 2 1 4 F708 II-1 F708 II-2 F662 1 3 4 2 4 ? 2 2 3 5 5 1 2 5 4 2 3 2 6 2 1 2 2 3 5 5 1 2 5 4 2 3 2 6 2 1 2 2 3 5 5 1 2 5 4 2 3 2 6 2 1 2 2 3 5 5 1 2 5 4 3 1 2 3 4 1 2 2 3 5 4 1 1 3 4 3 2 6 3 5 5 2 2 3 5 4 1 1 3 4 F206 1 1 4 6 2 5 2 2 3 1 5 3 1 5 4 2 2 4 6 2 5 2 2 3 1 5 3 1 5 4 Abb. 4.7 Haplotype Sharing Analyse bei den 10 untersuchten Familien. Die flankierenden neuen Marker sind kursiv gedruckt. Die Marker DJ1099N07-c, D1S417 und D1S2652 waren bei allen Familien homozygot. Haplotypen die distal dieser Marker kontinuierlich Homozygotie zeigen, sind unterlegt. Farblich markiert sind Allele, die mindestens zwei Patienten in Kontinuität mit den 3 homozygoten Markern teilen. Auffällig ist das ausgedehnte Hyplotype-Sharing bei den fünf türkischen Familien F791, F314, F591, F730 und F786 (orange markiert), das sich über 14 Marker erstreckt. 39 ERGEBNISSE 4.2. MUTATIONSANALYSE In dem Intervall von 900 kb zwischen den Markern DJ1099n07-c und 109i2-b, das durch Haplotypenanalyse eingegrenzt worden war, konnten mit Hilfe des Computerprogramms GENSCAN (http://genome.dkfz-heidelberg.de/cgi-bin/GENSCAN/genscan.cgi) 9 Gene identifiziert werden, 6 davon waren unbekannt: die Ubiquitin spezifische Protease 24 Hs.7243; DKFZp564M2423, ein hypothetisches Gen, zu dem ein homologes Gen bei der Maus bekannt ist (Hyaluron-bindendes Protein); ein unbekanntes Gen, zu dem Homologe bei Maus und Rind bekannt und ESTs aus der Niere vorhanden waren; Hs.112554, für das es 13 ESTs gab, von denen 9 aus der Niere kamen; eine endogene Retrovirus W Sequenz; Hs.75616 KIAA0018, ein diminuto-like Protein; FJL20619 (Hs. 127723, Hs.16230, DKFZp586J211); FJL21931 (Hs.13036, DKFZp727A071) und ein weiteres hypothetisches Proteine. Da keines dieser Proteine ein guter funktioneller Kandidat für BSND war, sollten sie bei den 11 Patienten mittels SSCP und direkter Sequenzierung von Exon-PCR-Produkten und RTPCR-Produkten von cDNA EBV-transformierter Lymphozyten nacheinander untersucht werden. 4.2.1. Ergebnisse der SSCP-Analyse Proteine, für die keine ESTs bekannt waren und die deshalb nicht durch RT-PCR untersucht werden konnten, sollten mittels SSCP gescreent werden. Die Exone mussten zum Teil wegen ihrer Größe in mehrere Fragmente geteilt werden. Dabei wurden die Primer so gewählt, dass die einzelnen Fragmente überlappten, um die komplette Exon-Sequenz abzudecken. Es wurden 5 Proteine bei den 9 Patienten und jeweils 3 gesunden Kontrollindividuen gescreent. Bei Auftreten eines Band-Shifts, wurde der Versuch anschließend erst mit 20 weiteren Kontrollen wiederholt. Wurde der Shift auch bei gesunden Individuen gefunden, konnte von einem Polymorphismus ausgegangen werden. Es wurden drei Proteine, die auf dem PAC DJ1099N07 lagen, zwei Proteine auf dem PAC RP11-12c17 und ein Protein auf dem PAC 109I2 mit Hilfe der SSCP untersucht. Tab. 4.1 zeigt die Primer, die zur Amplifizierung der untersuchten Proteine verwendet wurden. 40 ERGEBNISSE Tab. 4.1 SSCP-Primer Primer Sequenz 109I2P1E1.1(F) 5‘-ggc agg aca gca acc tct c-3‘ 109I2P1E1.1(R) 5‘-gcc tcc cac ccc tac acc-3‘ 109I2P1E2.1(F) 5‘-ttg ctg ggt ttc ttc cat gt-3‘ 109I2P1E2.1(R) 5‘-ccc agc cct atc agg aag t-3‘ 109I2P1E3.1(F) 5‘-atc agg taa ggc cag gct gt-3‘ 109I2P1E3.1(R) 5‘-ggc aga gca aat gga ttc ag-3‘ 109I2P1E4.1(F) 5‘-gcc tgg gat gtg ctc tgt ag-3‘ 109I2P1E4.1(R) 5‘-acc tcc agg atg ggg ata tg-3‘ 109I2P1E5.1(F) 5‘-cag cca cct gct gat ttg t-3‘ 109I2P1E5.1(R) 5‘-cca ggt cca gat gga gag ag-3‘ 109I2P1E6.1(F) 5‘-aac cat cac tct gtg cct gt-3‘ 109I2P1E6.1(R) 5‘-gag tag agg cag gca tcg tc-3‘ 109I2P1E6.2(F) 5‘-gcc tgg agt tta ttc gga aa-3‘ 109I2P1E6.2(R) 5‘-ccc acg tgc cac aag aag-3‘ 109I2P1E7.1(F) 5‘-cct ctc ttg ggc tcc ttt ct-3‘ 109I2P1E7.1(R) 5‘-aca gac cct gac tgc caa ag-3‘ 109I2P1E8.1(F) 5‘-ggg cca tca cca tct ttc-3‘ 109I2P1E8.1(R) 5‘-ggt cac aca gac ctc cca ag-3‘ 109I2P1E9.1(F) 5‘-gcc ctc ctc tct cct acc at-3‘ 109I2P1E9.1(R) 5‘-cga agg agg ggt aca gtc ac-3‘ 109I2P1E10.1(F) 5‘-gtc cct ttc tgt gtt ttc aaa g-3‘ 109I2P1E10.1(R) 5‘-tgg gtg cat aag gag aaa gag-3‘ 109I2P1E11.1(F) 5‘-cca gca ttt cac atc tga gc-3‘ 109I2P1E11.1(R) 5‘-cac aga aaa gct gtg cag ga-3‘ 109I2P1E12.1(F) 5‘-gat gtc gga ggg aga aat ga-3‘ 109I2P1E12.1(R) 5‘-gat ggc aac ggc tgt cac-3‘ 109I2P1E12.2(F) 5‘-gag ggc tgg acc ctg act-3‘ 109I2P1E12.2(R) 5‘-agg gac aag tcg gaa cca tt-3‘ T Größe 61° 260 60° 284 60° 266 60° 282 59° 258 59° 263 60° 296 60° 297 59° 270 59° 258 59° 299 60° 286 60° 250 60° 275 41 Primer Sequenz DJ1099P1E1.1 (F) 5‘-caa aca tgg gga acc acc ag-3‘ ERGEBNISSE T Größe 59° 254 59° 273 58° 280 58° 272 60° 251 60° 289 59° 268 58° 295 58° 257 60° 260 58° 287 59° 291 60° 264 60° 278 58° 255 60° 271 DJ1099P1E1.1 (R) 5‘-cag gct tgc taa tgt cct g-3‘ DJ1099P1E1.2 (F) 5‘-gtt ctg caa cag gga gag gat g-3‘ DJ1099P1E1.2 (R) 5‘-cca cct tac tgc agt atg ac-3‘ DJ1099P1E2.1 (F) 5‘-gac gac tac aag cca agg aac-3‘ DJ1099P1E2.1 (R) 5‘-gtt ggt gcc tct agg atc tg-3‘ DJ1099P1E3.1 (F) 5‘-gga caa aga ggc ttt ggt gtt g-3‘ DJ1099P1E3.1 (R) 5‘-cct ctc cag att tca-3‘ DJ1099P1E4.1 (F) 5‘-ccc aag act gag ata ttc cc-3‘ DJ1099P1E4.1 (R) 5‘-ctc aca tca caa taa gaa gca-3‘ DJ1099P1E4.2 (F) 5‘-ggg ttt cgg gga agt tta g-3‘ DJ1099P1E4.2 (R) 5‘-gat gcc cca ttg ctt ttc tc-3‘ DJ1099P1E5.1 (F) 5‘-gtc ctt ggg ttc aaa tcc cag-3‘ DJ1099P1E5.1 (R) 5‘-ctt atg ggc act act cca tg-3‘ DJ1099P1E5.2 (F) 5‘-gac taa cac cct tca acc c-3‘ DJ1099P1E5.2 (R) 5‘-cat cac ctc tgc tgt gct gta g-3‘ DJ1099P1E5.3 (F) 5‘-ctt ttg aag aag tag gtg ccg g-3‘ DJ1099P1E5.3 (R) 5‘-gta acc cat aca cca agc tg-3‘ DJ1099P1E5.4 (F) 5‘-gaa tga gac cgg tcc cag gca ttc-3‘ DJ1099P1E5.4 (R) 5‘-caa gcg gac acc ctg aaa atc-3‘ DJ1099P1E6.1 (F) 5‘-gaa tga att tgt tgg gca ccc-3‘ DJ1099P1E6.1 (R) 5‘-ctt ctt cct gcg tgg att ttc c-3‘ DJ1099P1E6.2 (F) 5‘-ctt ttg ctc ctg tgc caa gag-3‘ DJ1099P1E6.2 (R) 5‘-cag tac cag gcc atc atg aaa g-3‘ DJ1099P1E6.3 (F) 5‘-cag caa tgg aca gga aga c-3‘ DJ1099P1E6.3 (R) 5‘-ctc caa aga gac ctg ctt c-3‘ DJ1099P1E6.4 (F) 5‘-cac ctc ctt cat cag ctt ctt c-3‘ DJ1099P1E6.4 (R) 5‘-gtc acg att gca ctt tga gtg-3‘ DJ1099P1E7.1 (F) 5‘-ctc cac agt cct tac caa tac c-3‘ DJ1099P1E7.1 (R) 5‘-cac tac tat tcc act ctg tct c-3‘ DJ1099P1E7.2 (F) 5‘-ctg gaa cac agt agg tga gag-3‘ DJ1099P1E7.2 (R) 5‘-ccc agg gtt ctt tta cca tc-3‘ 42 Primer Sequenz DJ1099P1E8.1 (F) 5‘-ggc tca gcc ctg tgt gta gct-3‘ ERGEBNISSE T Größe 60° 280 58° 275 60° 291 60° 267 60° 267 58° 290 60° 255 60° 289 59° 279 60° 276 62° 294 61° 276 60° 261 59° 271 60° 245 60° 253 DJ1099P1E8.1 (R) 5‘-cat gag gga aag cca gga tg-3‘ DJ1099P1E8.2 (F) 5‘-gtt cca gcc atg agc tc-3‘ DJ1099P1E8.2 (R) 5‘-caa gaa ggg cca tta cat ctg-3‘ DJ1099P1E8.3 (F) 5‘-ctt gtc cgt gca cat ttt cag-3‘ DJ1099P1E8.3 (R) 5‘-ctc agt ttc cca tca gca caa g-3‘ DJ1099P4E1.1(F) 5‘-cac cca acc aca tct cct tct c-3‘ DJ1099P4E1.1(R) 5‘-cct tga ggt gca cag atg agt g-3‘ DJ1099P4E2.1(F) 5‘-gtg aca ctt agg atg ggg atg-3‘ DJ1099P4E2.1(R) 5‘-agt gct cct tct cag ttt ag-3‘ DJ1099P4E3.1(F) 5‘-ac cca gga agt aca ctt ac-3‘ DJ1099P4E3.1(R) 5‘-ctt tct act atg cca ctg gg-3‘ DJ1099P4E3.2(F) 5‘-cat tca cag tat tcc ctc tgc c-3‘ DJ1099P4E3.2(R) 5‘-cat ccc cca acc tta caa ag-3‘ DJ1099P4E4.1(F) 5‘-caa gaa cca acc tcc cat c-3‘ DJ1099P4E4.1(R) 5‘-ctg gcc ctt gtt ctc tga tcc-3‘ DJ1099P4E5.1(F) 5‘-gag cag aga gga agg cag ag-3‘ DJ1099P4E5.1(R) 5‘-gcc tgg caa gga gta aac ag-3‘ DJ1099P4E6.1(F) 5‘-gag agg gtg gga atg agt ga-3‘ DJ1099P4E6.1(R) 5‘-ctt gat gcg cag gca ctt-3‘ DJ1099P4E6.2(F) 5‘-aac cag gcg ctg gtg ttc-3‘ DJ1099P4E6.2(R) 5‘-cgc ggg gta ctt gtc ctg-3‘ DJ1099P4E6.3(F) 5‘-cag tgg agc cag gca cag-3‘ DJ1099P4E6.3(R) 5‘-gca cct gag ccc tag aat ga-3‘ DJ1099P4E7.1(F) 5‘-tgg atg cca aat gaa gtg aa-3‘ DJ1099P4E7.1(R) 5‘-gtg tgg cag gag gag ctg-3‘ DJ1099P4E9.1(F) 5‘-atg agg cca gga gtt caa ga-3‘ DJ1099P4E9.1(R) 5‘-aca agt tcc cag gtg aca ca -3‘ DJ1099P4E10.1(F) 5‘-gct tca tgg tgt tgg aac ac-3‘ DJ1099P4E10.1(R) 5‘-gtc ttc ccg aag gtt ctg tg-3‘ DJ1099P4E10.2(F) 5‘-ctt gca ggt ttc acc act gtg-3‘ DJ1099P4E10.2(R) 5‘-ctg cat ctc ctg vgtc tat c-3‘ 43 Primer Sequenz DJ1099P4E10.3(F) 5‘-cat ata ccg tcc gtg cca tg-3‘ ERGEBNISSE T Größe 60° 272 58° 260 58° 273 59° 265 58° 284 60° 277 60° 265 59° 288 59° 298 60° 271 60° 245 60° 289 58° 276 58° 288 58° 257 59° 294 DJ1099P4E10.3(R) 5‘-gaa gct gct tgt agg aca gt-3‘ DJ1099P4E10.4(F) 5‘-gcc tta att gcc tcc cag aag-3‘ DJ1099P4E10.4(R) 5‘-cat cac aca cca ggc tgt ag-3‘ DJ1099P4E10.5(F) 5‘-gta cac ctt tga ctc ctc c-3‘ DJ1099P4E10.5(R) 5‘-caa gca ggg cag ttc att tg-3‘ DJ1099P4E10.6(F) 5‘-cat gga gac act aga ctt gtc-3‘ DJ1099P4E10.6(R) 5‘-gga caa agt ctt cag tag aga g-3‘ DJ1099P4E10.7(F) 5‘-gat ctt ggc tgc tgc cat tg-3‘ DJ1099P4E10.7(R) 5‘-ctc aaa atg tgc agg gtc ctc-3‘ DJ1099P5E1.1 (F) 5‘-gat ggg agt gtg tgc atg tc-3‘ DJ1099P5E1.1 (R) 5‘-cct gat tac agt gcc tgc aac-3‘ DJ1099P5E1.2 (F) 5‘-gaa ctg gag caa agg cat g-3‘ DJ1099P5E1.2 (R) 5‘-cct aga gct gaa tcc tca g-3‘ DJ1099P5E2.1 (F) 5‘-ctg gcc cat ctc ttc ttt g-3‘ DJ1099P5E2.1 (R) 5‘-cag at agg caa gga cat g-3‘ DJ1099P5E3.1 (F) 5‘-gtc gta aac agg acc ctc tg -3‘ DJ1099P5E3.1 (R) 5‘-gaa atg ctc ctg tct gtc ctc-3‘ DJ1099P5E4.1 (F) 5‘-cct aca ctc gtt acc aag tc-3‘ DJ1099P5E4.1 (R) 5‘-ctt gaa tga gga ttt ggg ac-3‘ DJ1099P5E5.1 (F) 5‘-cag cag tgt gaa aat gga c-3‘ DJ1099P5E5.1 (R) 5‘-caa cta cta acc gtt gcc atc-3‘ DJ1099P5E6.1 (F) 5‘-gtt ccc aac aag ctt cac ag-3‘ DJ1099P5E6.1 (R) 5‘-gtt gga tag agg cca gag at-3‘ DJ1099P5E7.1 (F) 5‘-gag aga cac aat ctt ggg-3‘ DJ1099P5E7.1 (R) 5‘-gta ctg gct ggt agt tgg tg-3‘ DJ1099P5E8.1 (F) 5‘-cct tag tct ggg ttt ctg g-3‘ DJ1099P5E8.1 (R) 5‘-gca gat cct gat ttg aat gc-3‘ DJ1099P5E8.2 (F) 5‘-cag ata gta ctg tgc tgc tg-3‘ DJ1099P5E8.2 (R) 5‘-cgc ttt ggt gtg tca tat ag-3‘ DJ1099P5E9.1 (F) 5‘-caa tca gaa cgc ttc taa ccc-3‘ DJ1099P5E9.1 (R) 5‘-cat gga att gga tct gct cag-3‘ 44 Primer Sequenz DJ1099P5E10.1 (F) 5‘-cag gga tct ggg att gaa gga g-3‘ ERGEBNISSE T Größe 58° 266 60° 270 59° 265 60° 301 60° 275 59° 261 59° 287 59° 260 58° 251 60° 270 60° 272 58° 256 60° 255 58° 278 59° 281 59° 291 DJ1099P5E10.1 (R) 5‘-ggc atc agc tat gga aca ac-3‘ DJ1099P5E10.2 (F) 5‘-atg acg tcg tct gag ctg gga tc-3‘ DJ1099P5E10.2 (R) 5‘-cac ccc aaa agc att cga ag-3‘ DJ1099P5E11.1 (F) 5‘-ctg aag gac tgc agt tgt tc-3‘ DJ1099P5E11.1 (R) 5‘-caa aag tgg cag ggt tga g-3‘ DJ1099P5E11.2 (F) 5‘-ctg tgc tgt tgg tgt ctg ta-3‘ DJ1099P5E11.2 (R) 5‘-caa tgt ctg gag atg ctt ctg-3‘ DJ1099P5E12.1 (F) 5‘-cac tgt gat tct act cac tg-3‘ DJ1099P5E12.1 (R) 5‘-cat ctc tga gga act ctg gtc-3‘ DJ1099P5E13.1 (F) 5‘-agg tgc tga aag ggc tag ag-3‘ DJ1099P5E13.1 (R) 5‘-gat ggg caa ttg gtt cct ctg-3‘ DJ1099P5E14.1 (F) 5‘-ctg tat cct gca gag ttg tgc ttg-3‘ DJ1099P5E14.1 (R) 5‘-cag gat act aaa ggc tct gag -3‘ DJ1099P5E15.1 (F) 5‘-cat tgc aaa tct cca aga gg-3‘ DJ1099P5E15.1 (R) 5‘-ctc agt tag gct att ggc c-3‘ DJ1099P5E16.1 (F) 5‘-gtt aac gta aaa aga ggt gcg ccc-3‘ DJ1099P5E16.1 (R) 5‘-ctc tga atc agc cgc agt gag tg-3‘ DJ1099P5E17.1 (F) 5‘-ccc caa ggt agt aaa aga cc-3‘ DJ1099P5E17.1 (R) 5‘-gaa gaa cat ggt tgg gat gc-3‘ DJ1099P5E17.2 (F) 5‘-ctt gaa gac agc ctt gag gtt g-3‘ DJ1099P5E17.2 (R) 5‘-ggc cac caa gtt cat ttc ag-3‘ DJ1099P5E18.1 (F) 5‘-gtg aag ctc tgt cct tcc tc-3‘ DJ1099P5E18.1 (R) 5‘-ctc agc ctg gca agt aat gac-3‘ DJ1099P5E19.1 (F) 5‘-atc gtc caa gct gca cac ca-3‘ DJ1099P5E19.1 (R) 5‘-ctc ctt ttc tgc ctc ctc-3‘ DJ1099P5E20.1 (F) 5‘-gta ttg tgg gag gaa aga gc-3‘ DJ1099P5E20.1 (R) 5‘-gaa gtg ctc tct gtg agt cag-3‘ DJ1099P5E21.1 (F) 5‘-ctc aag tca ctt gtt tcc cc-3‘ DJ1099P5E21.1 (R) 5‘-gaa cca cca acc ttt gct g-3‘ DJ1099P5E22.1 (F) 5‘-cat agg aga aat gac cag tg-3‘ DJ1099P5E22.1 (R) 5‘-cag tgt cac aag caa atc cc-3‘ 45 Primer Sequenz DJ1099P5E23.1 (F) 5‘-gtc tga aga tcc tga ggt c-3‘ ERGEBNISSE T Größe 60° 263 58 253 60 282 58 263 58 236 59 257 60 233 58 271 58 238 58 275 59 266 58 292 60 270 60 294 DJ1099P5E23.1 (R) 5‘-gag gtc tta att gcc ttg tc-3‘ 12C17P1E1.1 (F) 5‘-gat gcc tga cca ctc aca cgt gt-3‘ 12C17P1E1.1 (R) 5‘-gag aag tgg gtg agg acg cca-3‘ 12C17P1E2.1 (F) 5‘-tca ttc ccc tgg agc agt acc c-3‘ 12C17P1E2.1 (R) 5‘-ggt aga cct ggg tag acc agg g-3‘ 12C17P1E3.1 (F) 5‘-tgg atg tcg ttt tgg aag gtg tg-3‘ 12C17P1E3.1 (R) 5‘-gaa aaa acc aac aag ggt tg-3‘ 12C17P1E4.1 (F) 5‘-gga gcc agg gct aca gaa ag-3‘ 12C17P1E4.1 (R) 5‘-tca gcc tgc aga caa gcg cc-3‘ 12C17P1E5.1 (F) 5‘-cac tca tgc ctc ccc agt ctt-3‘ 12C17P1E5.1 (R) 5‘-ggg tga act tgg cac aga tag cc-3‘ 12C17P1E5.2 (F) 5‘-gta gag cag ccc ttc cac gaa gt-3‘ 12C17P1E5.2 (R) 5‘-aga att gat gtg ttg tga gaa acc t-3‘ 12C17P1E6.1 (F) 5‘-gag gag cca cct ccc tga c-3‘ 12C17P1E6.1 (R) 5‘-gga gag ctg tgg gta cag ggt-3‘ 12C17P1E7.1 (F) 5‘-ttg gct aaa atc atc tcc cta tga gtc-3‘ 12C17P1E7.1 (R) 5‘-ctt gct acc ctg ctc ctt cca tt-3‘ 12C17P1E7.2 (F) 5‘-tac ttc ccg aca cgt agt gag ac-3‘ 12C17P1E7.2 (R) 5‘-agc aag gct gac aga aaa gcc-3‘ 12C17P1E8.1 (F) 5‘-gcg cac gcc gcc tcc ggc cct g-3‘ 12C17P1E8.1 (R) 5‘-cgg taa gcg ctg cgg gtt cgc-3‘ 12C17P1E9.1 (F) 5‘-cag cct ggg aaa cag ggt ag-3‘ 12C17P1E9.1 (R) 5‘-ggt cga agt gag ttt ttc ttg ctg-3‘ 12C17P2E1.1 (F) 5‘-ggt gga ctc cta gct cta ctg-3‘ 12C17P2E1.1 (R) 5‘-tgc tgc acc cga aca ttt c-3‘ 12C17P2E2.1 (F) 5‘-gtg ttt agg ctg aac tac-3‘ 12C17P2E2.1 (R) 5‘-ccc tat cct tta gtt gtc atc-3‘ 46 ERGEBNISSE Abb. 4.9 zeigt das Beispiel eines SSCP-Gels, bei dem man bei den Familien F206 und F708 einen bandshift in Exon 6.1 von 109I2P1 sieht, der bei den gezeigten Kontrollen nicht zu erkennen ist. Die Untersuchung von 20 weiteren gesunden Individuen zeigte jedoch, dass es sich um einen Polymorphismus handelt. 4.2.2. Ergebnisse der Sequenzierung Neu bekannte Sequenz vom Sanger Center des BACs GS1-118i5 schloss die noch bestehenden Lücke zwischen den Klonen RP11-12c17 und 109i2 und ermöglichte mit Hilfe des Programms GENESCAN die Vorhersage von zwei weiteren mutmaßlichen Genen. Bei der direkten Sequenzierung der 4 Exone eines dieser beiden Gene fanden sich 7 unterschiedliche Mutationen bei den Betroffenen der 10 BSND-Familien. Zum amplifizieren der Exone wurden folgende Primer verwendet: Tab. 4.2 Primer zur Amplifikation der Exone Primer Sequenz S P5 Ex1 F 5‘-gag cag aga gaa gac cga gtc-3‘ T Länge 58° 359 58° 290 58° 426 58° 612 S P5 Ex1 R 5‘-tgt ctt ctc tcc ctg tgt aag c-3‘ S P5 Ex2 F 5‘-tgc cta act cac aga att gag ag-3‘ S P5 Ex2 R 5‘-aca gag gct gtc tct cct ttg-3‘ S P5 Ex3 F 5‘-ctc tcc ttt tta acc ctt gaa ctg-3‘ S P5 Ex3 R 5‘-gac cac ata ccc aaa gca aac-3‘ S P5 Ex4 F 5‘-cca ttt tgc aga tag gga aac-3‘ S P5 Ex4 R 5‘-cgg gaa ggt gga tta tcc tac-3‘ Zu diesem Gen waren 3 menschliche ESTs von renalen Tumoren, ein menschliches EST aus der Niere, zwei Maus – ESTs aus der Niere und ein EST aus fetaler Niere des Rindes bekannt. Die Sequenz der menschlichen cDNA hatte eine Länge von 1596 bp. 47 ERGEBNISSE GAGAGGGCAAGGAGTAAAGGTGGCTGGGTGTGGGTCCGTTGAAGCGAGCCGCCTCCAGCCCTG 1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241 261 281 301 321 TTGAACTGGTGGGCCCAGGGACTGGAGCGGGATTGAAAGGGATCTTGCTCTCCCTTGAAG CCTCGAGTTGCAGCGATTTCAGTGTCTTCTCTCCCTGTGTAAGCCTGTCTGGGTGTTTAG GCTGAACTACAGCCACCCCCTCTCCCGGGGGTGTGCAGGCCAGGGACTGGCCAGGCAGCC ATGGCTGACGAGAAGACCTTCCGGATCGGCTTCATTGTGCTGGGGCTTTTCCTGCTGGCC 60 M A D E K T F R I G F I V L G L F L L A * * * * * * * * * * * * * * * * * * * S CTCGGTACGTTCCTCATGAGCCATGATCGGCCCCAGGTCTACGGCACCTTCTATGCCATG 120 L G T F L M S H D R P Q V Y G T F Y A M * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * GGCAGCGTCATGGTGATCGGGGGCATCATCTGGAGCATGTGCCAGTGCTACCCCAAGATC 180 G S V M V I G G I I W S M C Q C Y P K I * * * * * * * * V * * * * * * * * * * * ACCTTCGTCCCTGCTGACTCTGACTTTCAAGGCATCCTCTCCCCAAAGGCCATGGGCCTG 240 T F V P A D S D F Q G I L S P K A M G L * * * * * * * * * * * * * * * * * L S * CTGGAGAATGGGCTTGCTGCCGAGATGAAGAGCCCCAGTCCCCAGCCGCCCTATGTAAGG 300 L E N G L A A E M K S P S P Q P P Y V R * * A * * - S * V * - - * * * * * * * * CTGTGGGAGGAAGCCGCCTATGACCAGAGCCTGCCTGACTTCAGCCACATCCAGATGAAA 360 L W E E A A Y D Q S L P D F S H I Q M K * * * * * * * * * * * * * * T * * * * * GTCATGAGCTACAGTGAGGACCACCGCTCCTTGCTGGCCCCTGAGATGGGGCAGCCGAAG 420 V M S Y S E D H R S L L A P E M G Q P K * * G * * * * P * P * * * * * L - - - * CTGGGAACCAGTGATGGAGGAGAAGGTGGCCCTGGCGACGTTCAGGCCTGGATGGAGGCT 480 L G T S D G G E G G P G D V Q A W M E A T * A * S V R * * E * R T A * * * * * * GCCGTGGTCATCCACAAGGGCTCAGACGAGAGTGAAGGGGAAAGACGCCTAACTCAGAGC 540 A V V I H K G S D E S E G E R R L T Q S P * * V * R * * * * N * * * K S H S * * TGGCCCGGCCCCCTGGCCTGTCCCCAGGGCCCTGCCCCCTTGGCTTCCTTCCAAGATGAC 600 W P G P L A C P Q G P A P L A S F Q D D - - S * S V G * * * S * * * * * * H * * CTGGACATGGACTCCAGTGAAGGCAGCAGCCCCAATGCATCTCCACATGACAGGGAGGAA 660 L D M D S S E G S S P N A S P H D R E E * * V G * * * * * * L Q P * * N R D * GCTTGTTCCCCACAACAGGAACCTCAGGGCTGCAGGTGCCCGCTGGACCGCTTCCAAGAC 720 A C S P Q Q E P Q G C R C P L D R F Q D - - P H R * V * W A S * G * * * * * S * TTTGCCCTGATTGATGCCCCAACGTTGGAGGATGAGCCCCAAGAGGGGCAGCAGTGGGAA 780 F A L I D A P T L E D E P Q E G Q Q W E * * * * D* T * * S * * T V L D * * A R * ATAGCCCTGCCCAACAACTGGCAGCGGTACCCAAGGACAAAGGTGGAGGAGAAGGAGGCT 840 I A L P N N W Q R Y P R T K V E E K E A A * * * P K Q * W S L * M * G * T V Q * TCGGACACAGGTGGGGAGGAACCTGAGAAGGAAGAGGAAGACCTGTACTATGGGCTGCCA 900 S D T G G E E P E K E E E D L Y Y G L P R - - - A * * * * Q * * * * * * * * * * GATGGAGCCGGGGACCTCCTCCCGGACAAGGAGCTGGGTTTTGAGCCTGACACCCAAGGC 960 D G A G D L L P D K E L G F E P D T Q G * S P * N P * * * * * * * * * * * I * * TGAGATGTTTGTGCTCCGTAGCTTTTAGTCTGGAACTGCTGCTGACCCCTGTGTGACATC 1220 * * ACAGGGCCTCAGTTTCCCTATTTGCAAAATGGGATGATATGGAGGTTCAATGAGATGGTG 1280 GCATTTTGAGAATGGTAAAGAAATACCCAGGGAGGGGATGATGCCTAAAAAAAAAAAAAA 1340 AAAAAAAAAAAAA 1353 Abb. 4.10 Menschliche cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von Mensch und Maus. Start und Stopkodon sind fett gedruckt, die identifizierten Mutationen eingerahmt. Exon 2 und 4 sind gestrichelt unterstrichen. Die vorhergesagten mutmaßlichen Transmembrandomänen sind unterstrichen. 48 ERGEBNISSE Bei den den Betroffenen der fünf türkischen Familien F314, F591, F730, F786 und F791 fand sich im Startkodon homozygot ein 1A→T Basenaustausch, der zu einer Substitution von Methionin durch Leucin führt (Abb. 4.11). Diese Mutation im Startkodon wird die Initiation der Translation stören oder gar ganz verhindern. Leu Ala Met Ala * Abb. 4.11 Mutation 1A→T, die bei den Familien F314, F591, F730, F786 und F791 identifiziert wurde. Rechts Wildtypsequenz mit intaktem Startkodon ATG. NcoI schneidet: CCATGG GGTACC Durch den Basenaustausch von A nach T an Position 1 wird eine NcoI-Schnittstelle abgeschafft. Bei 100 gesunden Kontrollindividuen konnte die Mutation durch Verdau des PCR-Produkts von Exon 1 mit NcoI ausgeschlossen werden. 49 ERGEBNISSE Die Sequenzierung von Exon 1 bei F813 zeigte homozygot einen 22C→T Basenaustausch, der zu einer Substitution von Tryptophan durch Arginin an Position 8 führt (Abb. 4.12). Bei den Eltern war dieser Basenaustausch heterozygot zu finden. Trp Phe Ile Arg Phe Gly Ile Gly * Abb. 4.12 Links die Sequenz des betroffenen Kindes von F813 mit der homozygoten Mutation 22C→T, die zu einer Substitution von Tryptophan durch Arginin an Position 8 führt. Rechts die Sequenz eines gesunden Individuums. Das betroffene Kind der Familie F206 zeigte einen homozygoten 23G→T Basenaustausch, der ebenfalls an Position 8 einen Austausch von Arginin durch Leucin verursacht (Abb. 4.13). Phe Leu Ile Gly Phe Arg Ile Gly * Abb. 4.13 Sequenz des betroffenen Kindes von F206 mit homozygotem 23G→T Basenaustausch und normale Sequenz bei einem gesunden Individuum. Durch die beiden Mutationen an Position 22 und 23 bei F813 und F206 wird eine BspISchnittstelle abgeschafft. Kontrollindividuen Zum untersucht. Ausschluss Die eines Schnittstelle Polymorphismus war bei allen wurden 100 vorhanden. 50 ERGEBNISSE Bei Familie F197 gingen durch eine 41 bp große Deletion (157-IVS1+20del41) die letzten 21 Basenpaare von Exon 1 und die ersten 20 Basenpaare von Intron 1 verloren (Abb. 4.14a). Dadurch verändert sich das splice-Verhalten. Das um 41 Basenpaare kleinere PCR-Produkt von Exon 1 des betroffenen Kindes konnte gelelektrophoretisch von dem Produkt mit normaler Größe getrennt werden (Abb. 4.14b). Bei 100 gesunden Kontollindividuen wurde keine Deletion gefunden. g t a g g t g g t a g t g g g g c t g g g t g g g gc c a g g t ca g c AT t g g g gc c ag g bp g t g g g gc c S F M II-1 II-2 N 500 400 300 Abb. 4.14 a Abb. 4.14 b Abb.4.14a zeigt die 41 bp-Deletion bei F197. Oben dargestellt ist die WT-Sequenz, unten die Sequenz des betroffenen Kindes, bei dem 21 bp von Exon 1 und 20 bp von Intron 1 fehlen. In Abb.4.14b ist die gelelekrophoretische Auftrennung dargestellt. Bei den Eltern und dem gesunden Geschwisterkind (II-2) ist das deletierte Produkt heterozygot vorhanden, bei dem betroffene Kind II-2 homozygot, bei der dargestellten Normalperson und 100 weiteren Kontrollen war die kurze Bande nicht vorhanden. 51 ERGEBNISSE Bei Familie F708 ließen sich initial die Exone 3 und 4 nicht amplifizieren. Mit folgenden Primern, die diese beiden Exone flankierten, konnte ein ca. 400 bp großes PCR-Produkt amplifiziert werden (Tab. 4.3). Tab. 4.3 Primer zur Amplifizierung des Deletionsfragments bei Familie F708 Primer Sequenz T del 708 (F) atg gca cag cca aga atg ctc cag del 708 (R) atc tgg gca cag gcg atc tca agg t Länge 70°C 3483 bp Durch Sequenzierung des Produkts erhielt man den proximalen Bruchpunkt 885 bp vor Exon 3 und den distalen Bruchpunkt 579 bp distal von Exon (Abb. 4.15a und b). bp S F M II-1II-2 N 4000 3000 500 400 300 Abb. 4.15a Darstellung der Sequenz des Bruchpunkts der Deletion bei F708. Oben und unten ist die Sequenz im Bereich des Bruchpunkts eines nicht betroffenen Individuums dargestellt, in der Mitte die Sequenz von F708, II-1. Abb.4.15b Auftrennung der durch PCR amplifizierten Fragmente, die die Deletion von Exon 3 und 4 bei F708 mit einschließen. Man sieht das deletierte Fragment mit einer Länge von ca. 400 bp bei den Eltern F und M heterozygot und bei den beiden betroffenen Kinder II-1 und II-2 homozygot. Das nicht betroffene Normalindividuum zeigt homozygot das nicht deletierte Fragment mit einer Länge von ca. 3500bp. 52 ERGEBNISSE 4.2.3. Übersicht über die identifizierten Mutationen Die Mutationsanalyse bei den ergab 7 verschiedene Mutationen bei den 11 Patienten (Tab. 4.4). Davon handelte es sich bei Hierbei handelte es sich zum einen um 5 verschiedene Punktmutationen, die zu einem Basenaustausch führten. In 2 Fällen lag diese Punktmutation im Startkodon. Die anderen 3 identifizierten Punktmutationen fanden sich alle in Exon 1. Außerdem konnte eine kleinere Deletion von 41bp, die ebenfalls Exon 1 betraf, sowie eine Deletion von Exon 3 und 4 festgestellt werden. Bei den 5 Patienten türkischer Abstammung, bei denen aufgrund des Haplotype-Sharings eine entfernte Verwandtschaft angenommen worden war, handelte es sich in allen Fällen um die Mutation 1A→T, die zur Abschaffung des Startkodons führt. Tab. 4.4. Übersicht über alle identifizierten Mutationen Familie Konsanguinität Herkunft homozygote heterozygote Mutation Mutationen Exon F197 ja Frankreich 157_IVS1+20del41 1 F314 ja Türkei 1A→T 1 F591 ja Türkei 1A→T 1 F730 ja Türkei 1A→T 1 F786 ja Türkei 1A→T 1 F791 ja Türkei 1A→T 1 F206 ja Frankreich 23G→T 1 F813 ja Tunesien 22C→T 1 F708 ja Libanon Ex3_Ex4del 3 und 4 F662 nein GB 3G→A und 28G→A 1 53 5. DISKUSSION DISKUSSION 5.1. HAPLOTYPENANALYSE 5.1.1. Auswahl der Familien Zur Identifikation und Eingrenzung eines Genorts für eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung durch Haplotypenanalyse ist es wichtig, Familien zu untersuchen, bei denen durch klinische und gegebenenfalls histologische Daten die Diagnose gesichert ist. Besteht Konsanguinität, kommen als Genort in der Regel nur die homozygoten Regionen in Frage. Es ist also günstig, möglichst viele konsanguine Familien zu untersuchen. Auch gesunde Kinder werden in die Untersuchung mit eingeschlossen, da Regionen, in denen sie die gleichen Haplotypen haben wie die betroffenen Geschwister, als Genort ausgeschlossen werden können. Dabei muss beachtet werden, bis zu welchem Alter sich die untersuchte Krankheit manifestiert. Da BSND bereits intrauterin auftritt, die Kinder postnatal früh durch ihre massive Polyurie auffallen und innerhalb des ersten Lebensjahres sensoneurale Taubheit diagnostiziert werden kann, die sonst bei keinem der Typen 1 - 3 des BS auftritt, können falsch negativ diagnostizierte Kinder hier nahezu ausgeschlossen werden. 5.1.2. Haplotypenanalyse Liegen in dem gekoppelten Bereich des Genorts mehrere Kandidatengene, ohne dass ein geeignetes Kandidatengen ausgemacht werden kann, ist es sinnvoll, die Region weiter einzugrenzen. So können möglichst viele Gene ausgeschlossen und deren nähere Untersuchung unterlassen werden. Ferner bestand die Möglichkeit durch weitere Eingrenzung durch Haplotypisierung das Teilstück, für das lange keine Sequenz vorlag, als Genort auszuschließen. Da jedoch das identifizierte Gen genau in dieser Lücke liegt, konnte dieses Ziel nicht erreicht werden. Der Bereich konnte aber durch Familie F591 und F813 telomerisch und Familie F197 zentromerisch zwischen die Marker 277a12-b und 319f11-a eingegrenzt werden. 54 DISKUSSION 5.1.3. Haplotype-Sharing-Analyse Um bei den fünf Familien türkischer Abstammung eine eventuelle Verwandtschaft abzuklären, wurde an die Haplotypen-Analyse ein Sharing-Analyse angeschlossen. Es zeigte sich, dass bei diesen fünf Familien in unterschiedlicher Ausprägung der gleiche Haplotyp vorlag. Bei Familie F591 findet man zwischen den Markern D1S2661 und D1S200 für fast den gesamten untersuchten Bereich den Sharing-Haplotypen, der bei Familie F730 p-terminal für den Marker 277a12-b und bei Familie F314 zentromerisch für den Marker 109i2-b abbricht. Bei den Familien F786 und F791 zeigen für die hochpolymorphen Marker 277a12-a bzw. 277a12-b vom Sharing-Haplotypen abweichende Allele, die folgenden Allele sind jedoch wieder mit dem Sharing-Haplotypen vereinbar. Hier kann davon ausgegangen werden, dass es sich nicht um den Abbruch des Sharing-Haplotypen sondern um ansestrale Mutationen handelt. Die Familien F708 und F662 teilten die Haplotypen für die folgenden 5 Marker: DJ1099n07-c, D1S417, D1S2652, 109i2-b und 319f11-a. Hier fehlt jedoch die Fortsetzung des Sharing-Haplotypen proximal bzw. distal dieser Marker. Da der Bereich der 5 Marker mit dem Sharing-Haplotypen weniger als 0,9Mb groß ist und sich weder nach telomerisch noch nach centromerisch fortsetzt, kann man davon ausgehen, dass das „Sharing“ dieser fünf Marker zufällig ist und nicht auf gemeinsame Abstammung zurückzuführen ist. Das Vorkommen von ansestralen Mutationen und „zufälligem“ Sharing, macht die Interpretation schwierig. Zum Beispiel besteht die Gefahr, durch eine ansestrale Mutation die Region falsch einzugrenzen und dadurch das Krankheitsgen fälschlicherweise auszuschließen. Da es sich bei BSND jedoch um eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung handelt, man also bei vorhandener Konsanguinität homozygote Haplotypen erwartet, und die HaplotypeSharing-Analyse nur eine ergänzende Methode darstellt, konnte die weitere Eingrenzung mit dem neuen flankierenden Marker 109i2-b als richtig angenommen werden. Ferner konnte bei den beschriebenen Familien aufgrund der gemeinsamen ethnischen Herkunft und des ausgeprägten Sharings über 14 Marker von einer entfernten Verwandtschaft ausgegangen werden. Bei der Mutationsanalyse wurde später tatsächlich bei den genannten türkischen Familien die gleiche Mutation identifiziert. Dies bestätigt die Annahme, dass die Familien miteinander verwandt sind und der genetische Defekt von einem gemeinsamen Vorfahren an die Familien weitergegeben wurde. 55 DISKUSSION 5.2. DAS HUMAN GENOME PROJEKT Durch die nahezu vollständig vorhandene Sequenz des menschlichen Genoms in öffentlichen Datenbanken seit Februar 2001 (International Human Genome Sequencing Consortium, Venter et al., 2001) können Gene immer leichter identifiziert werden. Da jedoch die meisten PACs noch aus mehreren Fragmenten bestehen, die durch kleine Lücken voneinander getrennt sind, ist die Orientierung und Reihenfolge der Fragmente oft unklar. Dies wird bei der Anwendung Von Programmen wie GENESCAN zum Problem. Wenn sich die Exone auf unterschiedlichen Fragmenten und sich dadurch nicht in der richtigen Reihenfolge befinden, kann das Programm das Gen nicht identifizieren. Zudem werden Exone, die einer Lücke zwischen zwei PACs liegen, übersehen. Obwohl also statistisch gesehen, die Sequenz des menschlichen Genoms nahezu vollständig vorliegt, werden mit Programmen wie GENESCAN immer noch nicht alle Gene identifiziert. Nachdem in dem durch Haplotypenanalyse eingegrenzten Bereich durch die Sequenz des Klons GS1-118i2, der beim Sanger Center zum Sequenzieren eingereicht worden war, die Lücke zwischen den PACs RP11-12c17 und 109i2 geschlossen war, identifizierte das Programm Genescan in diesem Bereich zusätzlich zu einem einzelnen Exon auf dem PAC 109i2 die Exone zwei, drei und vier von BSND. Da zu diesem Gen 3 menschliche ESTs von renalen Tumoren, ein menschliches EST aus der Niere, zwei Maus – ESTs aus der Niere und ein EST aus fetaler Niere des Rindes bekannt waren, war es als Kandidat besonders interessant. 56 DISKUSSION 5.3. KANDIDATENGENE Funktionelle Kandidaten für BSND sind vor allem Gene, deren Genprodukt den Elektrolyttransport in Niere und Ohr beeinflusst. Dabei könnte es sich um Kanäle oder Transporter oder auch Trankriptionsfaktoren, die deren Produktion regeln, handeln. Alternativ wäre es auch möglich, dass zwei nahe zusammen liegende Gene zum Beispiel durch eine größere Deletion betroffen sind, wovon das eine für den Phänotyp in der Niere, das andere für die Taubheit verantwortlich ist. Betrachtet man verschiedene bisher bekannte Taubheitsgene und die Gene, die die ersten drei Typen des BS und das GS verursachen, erscheint diese Möglichkeit jedoch unwahrscheinlich. Man kann eher von einem pleiotropen Effekt eines einzelnen Gendefekts ausgehen, der sich in Ohr und Niere manifestiert. 5.3.1. funktionelle Kandidatengene Bei den ersten drei identifizierten Genen, deren Defekt zu BS führt und beim GS handelt es sich um Transporter bzw. Ionenkanäle, die für den Elektrolyttransport der Niere von Bedeutung sind. Vor diesem Hintergrund liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei BSND auch um einen Kanal oder Transporter handeln könnte. Diskutiert wurde zum Beispiel ein basolateraler K+-Cl--Transporter im mTAL, für den bisher keine Mutationen beschrieben waren. Eine weitere Möglichkeit wäre zum Beispiel ein Protein, dass direkt mit einem der Kanäle interagiert und dessen Funktion beeinflusst. Bedenkt man, dass Furosemid, Inhibitor von NKCC2 in der Niere, als Nebenwirkung Innenohrschäden und teilweise auch Gleichgewichtsstörungen verursacht, wäre z.B. ein gemeinsames Regulator-Protein von NKCC2 und NKCC1, das im Ohr exprimiert wird, ein geeigneter Kandidat für BSND (Vargish et al., 1970). Bei dem renale NKCC2 handelt es sich um die absorptive Form des Transporters, bei NKCC1 im Innenohr um die sekretorische Form. Mit einer gestörten Funktion der beiden Transporter könnte ein verschobenes Elektrolytgleichgewicht in Ohr und Niere sowohl die Innenohrschwerhörigkeit als auch der Wasser- und Elektrolytverlust erklärt werden. Taubheitsgene, die die Entwicklung bzw. die Funktion des Innenohres beeinträchtigen, sind hauptsächlich Ionenkanäle, Kollagene, Motormoleküle wie z.B. Actin- oder Myosinmoleküle, um Proteine, die für den Zell-Zell-Kontakt von Bedeutung sind sowie Proteine, die durch Interaktion mit anderen Proteinen die Hörfunktion beeinflussen. 57 DISKUSSION Kollagene bzw. Actin- oder Myosinmoleküle kamen als Kandidaten für BSND weniger in Frage, da der nephrologische Phänotyp mit dem massiven Flüssigkeits- und Salzverlustes nicht erklärbar wäre. Korrelation verschiedener Merkmalen haben oft Pleiotropie als genetische Ursache. Durch den pleiotropen Effekt eines einzelnen Gendefekts können mehrere phänotypische Merkmale in verschiedenen Organen, z.B. in Ohr und Niere wie bei BSND, gleichzeitig ausgelöst werden. Eine Erklärung hierfür ist die Expression eines Genes in verschiedenen Organen mit spezifischen Aufgaben. Der Defekt löst dann je nach Organfunktion unterschiedliche phänotypische Merkmale aus. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass ein Genprodukt z.B. im Blut zirkuliert und in den verschiedenen Organen zur Wirkung kommt. Die gleichzeitige Manifestation in Ohr und Niere kommt außer bei BSND auch bei anderen Syndromen vor: • distal renal tubulärere Azidose (dRTA) (Konigsmark et al., 1966) ist charakterisiert durch beeinträchtigte renale Säuresekretion, die zu metabolischer Azidose führt. Klinische Symptome sind Nephrocalcinose, Nephrolithiasis und Osteomalazie. Es existiert eine Variante, bei der parallel eine Innenohrschwerhörigkeit vorliegt. Hierbei liegt eine Mutation in ATP6B1 zugrunde (Karet et al., 1999). ATP6B1 kodiert für die β−Untereinheit einer apikalen Protonenpumpe, die im distalen Nephron die Säuresekretion reguliert und auch in der Cochlea und im Endolymphraum exprimiert wird, wo es den pH der Endolymphe beeinflusst. • Alport Syndrom (ATS), phänotypisch charakterisiert durch Nephritis, die oft zu progressivem Nierenversagen führt, Hämaturie und sensoneurale Taubheit (Alport et al., 1927). Beim ATS kann man Heterogenität beobachten. Es existiert eine autosomal dominante Form (Jefferson et al., 1997), eine autosomal rezessive Form (Gubler et al., 1995) sowie eine X-chromosomal vererbte Form (O’Neill et al., 1978). Als verantwortliche Gene sind bisher COL4A3, COL4A4 und COL4A5 identifiziert, die für Typ IV-Kollagene codieren. • Fechtner Syndrom (FTNS), eine Variante des Alport Syndroms, das mit Nephritis, Taubheit, congenitalem Katarakt und hämatologischen Veränderungen wie Makrothrombozytopathie und Leukozyten-Einschlüssen einhergeht (Peterson et al., 1985). Aufgrund der phänotypischen Gemeinsamkeiten zwischen dem Fechtner-Syndrom und der May-Hegglin-Anomalie und des Ergebnisses, dass die Loci beider Erkrankungen auf einer überlappender Region auf Chromosom 22 kartieren, ergab sich die Hypothese, dass 58 DISKUSSION es sich um verschiedene Mutationen in einem Gen handeln könnte. Diese Vermutung wurde durch die Ergebnisse des May-Hegglin/Fechtner Syndrome Consortiums (2000) bestätigt. Es wurden 6 Mutationen in MYH9, das in Thrombocyten exprimiert wird, bei 7 nicht verwandten Probanden, die jeweils an einem dieser Syndrome litten, identifiziert. • branchio-oto-renales Syndrom (BOR), bezeichnet eine autosomal-dominat vererbte Störung, die durch Hörverlust, bilaterale branchiale Fisteln und bilaterale Nierendysplasie charakterisiert ist (Melnick et al., 1976). Abdelhak et al. haben 1997 Mutationen in EYA1 beschrieben (Abdelhak et al., 1997), das wahrscheinlich ein Rolle in der Entwicklung aller Komponenten des Innenohrs spielt und auch in der embryonalen Niere exprimiert wird. Diese Syndrome haben mit BS Typ 4 gemeinsam, dass sie alle sowohl zu einem nephrologischen Phänotyp als auch zu Taubheit führen. Dennoch ist der Pathomechanismus und somit auch das klinische Bild sehr unterschiedlich. Ferner sind Syndrome beschrieben, bei denen Taubheit mit anderen Störungen assoziiert ist. Beim Jervell und Lange-Nielsen Syndrom z.B. findet man Mutationen in KCNQ1 oder KCNE1, die zu Taubheit und kardialen Funktionsstörungen (verlängerte QT-Zeit) führen. Das Usher-Syndrom ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die durch sensoneurale Taubheit und Retinitis pigmentosa charakterisiert ist. Es sind vier klinische Subtypen bekannt, die durch unterschiedliche Gendefekte ausgelöst werden (Smith et al., 1994). 5.3.2. Positionelle Kandidatengene für BSND Keines der Gene, die in dem eingegrenzten Intervall lagen, war aufgrund seiner Funktion ein interessanter Kandidat für BSND. Von den 11 vorhergesagten Genen waren nur drei bekannt. Keines dieser Gene schien funktionell mit BSND in Verbindung zu stehen. Zu den anderen Genen waren zum Teil ESTs bekannt Daher war es erforderlich, die unbekannten Gene bei allen Betroffenen mittels SSCP und RTPCR zu screenen, um eine Mutation zu finden. 59 DISKUSSION 5.3.3. Screening-Methoden Zum Auffinden von Mutationen stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die unterschiedliche Vorteile haben. Wenn kein guter funktioneller Kandidat vorhanden ist, ist primär wichtig, dass möglichst schnell alle Gene, die positionell in Frage kommen, gescreent werden. Ferner ist die Wahl der Methode abhängig von der Anzahl der untersuchten Familien. Je mehr Familien untersucht werden, desto mehr verschieden Mutationen werden erwartet und desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, auch mit weniger sensitiven Methoden Auffälligkeiten zu entdecken. Ist das verantwortliche Gen identifiziert, können alle Exone bei den Betroffenen direkt sequenziert werden. 5.3.3.1. SSCP als Screening-Methode Die SSCP ist eine Methode, mit der relativ schnell und einfach viele Patienten untersuchen werden können. Jedoch ist die Sensitivität der Methode eher gering. Bei einer Produktlänge von ca.180 bp werden 90% der Mutationen erkannt, bei einer Länge von >300bp sind es nur noch ca. 60% (Sarkar et al., 1992). Um die Sensitivität zu erhöhen wird unter verschiedenen Versuchsbedingungen gearbeitet, jedoch kann auch damit nicht erreicht werden, dass alle Mutationen detektiert werden können. Über die Art und die Position der Mutationen, die sich hinter einem bandshift verbergen, können keine Aussagen gemacht werden. Ein Großteil der Shifts ist auf Polymorphismen zurückzuführen, die keine Krankheitsrelevanz haben. Daher wurden parallel drei gesunde Kontrollindividuen untersucht. Wurde ein Shift bei einem Patienten gefunden, der bei keinem der Kontrollindividuen zu erkennen war, wurden 20 weitere Kontrollen mittels SSCP und gegebenenfalls Sequenzierung untersucht, um zu entscheiden, ob es sich um einen Polymorphismus oder eine Mutation handelt. Polymorphismen finden sich häufig im Bereich des Introns, da dort Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) durch den fehlenden Selektionsdruck öfter vorkommen. Die SSCP ist alles in allem eine Methode, die zum aufsuchen neuer Mutationen nur noch eingeschränkt zu empfehlen ist, da Mutationen leicht übersehen werden. Da aufgrund der Sharing-Analyse nur 4 – 6 unterschiedliche Mutationen zu erwarten waren, wäre es durchaus möglich gewesen, dass die entscheidenden Mutationen unerkannt geblieben wären. Daher war 60 DISKUSSION es erforderlich, zusätzlich aufwendigere und teurere Methoden wie RT-PCR und direkte Sequenzierung anzuwenden. 5.3.3.2. WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System Da die Suche nach krankheitsverursachende Mutationen immer weiter zunimmt und andere einfache Methoden wie beispielsweise die SSCP den Anforderungen nur noch bedingt genügen, war es notwendig, nach anderen schnellen, empfindlichen und preisgünstigen Möglichkeiten zum Auffinden von DNA-Polymorphismen zu suchen (Schwarzer et al., 2000). Bei dem WAVE-DNA-System handelt es sich um einen temperaturmodulierten Hochleistungsflüssigkeits-chromatographen, durch das ca. 93% der Mutationen aufgefunden werden können (Klein et al., 2000). Das Prinzip beruht auf Heteroduplexbildung bei der gemeinsamen Abkühlung von auf 95°C erhitzten Wildtyp- und Mutanten-DNA-Fragmenten, die nur zustande kommt, wenn ein DNA-Polymorphismus in dem amplifizierten Fragment vorhanden ist. Die DNA-Fragmente werden auf eine Säule aufgetragen und bei nicht denaturierender Temperatur (d.h. 50 – 51°C) aufgetrennt. Da Homo- und Heteroduplices unter nicht denaturierenden Bedingungen dieselbe Retentionszeit haben, erhält man nur einen Peak. Bei erhöhter Temperatur nahe der Schmelztemperatur kommt es zur Trennung der Homoduplices von den Heteroduplices, weil letztere teilweise denaturieren. Dies führt zur früheren Elution der Heteroduplices und zum Entstehen von zwei Peaks. Wildtyp und Mutanten können anhand der unterschiedlichen Chromatogramme unterschieden werden. Sind keine Mutationen oder Polymorphismen in dem amplifizierten Fragment vorhanden, erhält man unabhängig von der Temperatur stets nur einen Peak. Bei Anwesenheit von Heteroduplices sieht man nahe der Schmelztemperatur einen zweiten Peak. Auffällige Fragmente müssen durch Sequenzierung weiter untersucht werden. Da die WAVE-DNA-Analyse automatisiert abläuft, stellt sie ein schnelles und einfaches System dar, es müssen lediglich die PCR-Produkte amplifiziert werden und die Ergebnisse anschließend mit geeigneten Computer-Programmen ausgewertet werden. Aufgrund der höheren Sensitivität ist diese Methode der SSCP wohl sicher überlegen und daher vorzuziehen. 61 5.3.3.3. DISKUSSION RT-PCR EBV-transformierte Lymphocyten, die aus Patienten-Blut gewonnen werden, exprimieren unter geeigneten Bedingungen mRNA von bestimmten Genen. Mit Hilfe von Reverser Transkriptase (RT) wird diese zunächst in komplementäre cDNA umgeschrieben und anschließend mit der PCR amplifiziert. Die RT-PCR hat den Vorteil, dass die cDNA direkt sequenziert werden kann und somit nicht jedes einzelne Exon amplifiziert werden muss, sondern je nach Größe die komplette cDNA sequenziert werden kann. Nachteile sind, dass in Lymphocyten nicht alle Gene exprimiert werden und die RNA außerdem sehr instabil ist, da sie schnell durch RNasen abgebaut wird. 5.3.3.4. direkte Sequenzierung Die direkte Sequenzierung ist die genauste Methode, da die Sequenz der einzelnen Patienten direkt und auf einzelne Basen genau untersucht wird. Da die Methode jedoch auch relativ aufwendig und teuer ist, ist der Einsatz zum Screening nur eingeschränkt sinnvoll. 5.4. CHARAKTERISIERUNG DES BSND-GENS Über das BSND–Gen waren bisher keine weiteren Informationen bekannt. Es war keine nähere Verwandtschaft zu bekannten Genfamilien beschrieben. Es besteht aus vier Exonen, und ist mit einer kompletten cDNA-Länge von 1596 bp ein relativ kleines Gen. Das Programm TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) sagte am Nterminalen Ende zwei mutmaßliche membrandurchgängige Helices, wobei es sich bei der ersten alternativ, vorhergesagt von dem Programm SMART, (http://smart.embl-heidelberg.de) auch um ein Signal Peptid handeln könnte. Weitere funktionelle Domänen konnten mit Hilfe von den verwendeten Programmen nicht vorhergesagt werden. 62 DISKUSSION 5.4.1. Position der Mutationen Bei den fünf türkischen Familien fand sich eine Mutation im Startcodon. Dies hat zur Folge, dass das Gen gar nicht exprimiert werden kann oder ein alternatives ATG-Triplet in der Nähe als Startcodon eintritt und ein verändertes Protein entsteht. Ähnliches kann sich auch im Fall der 41 bp Deletion bei Familie F197 einstellen, da durch das Fehlen der letzten 21 bp des ersten Exons die richtige splice site verloren geht. Bei den Mutationen, die bei Familie F813 und Familie F206 gefunden wurden, fällt auf, dass sie sich im Bereich der vorhergesagten Signal-Peptid-Sequenz befinden. Dies spricht für die Wichtigkeit dieses Sequenzabschnitts, da Punktmutationen das Protein so verändern, dass es seine Funktion nicht mehr richtig erfüllen kann. Auch eine der beiden Mutationen, die bei dem betroffenen Kind der Familie F662 identifiziert wurde, liegt in diesem Bereich. Die zweite Mutation bei diesem Patienten betrifft ebenfalls das Startcodon. Dass die Deletion von Exon 3 und 4 bei Familie F708 die Funktion des Proteins beeinträchtigt ist ebenfalls einleuchtend, da dadurch die beiden größten Exone und das Stopcodon verloren gehen (Abb. 5.2). 28G->A 1A->T 3G->A 157_IVS1+20del41 Exon 1 Exon 2 EX3_EX4del Exon 3 Exon 4 22C->T 23G->T Abb. 5.2. Position der Mutationen: Auffällig ist, dass die Punktmutation die Aminosäuren 8 und 10 am Beginn von Exon 1 und das Startkodon betreffen. 63 DISKUSSION 5.5. AUSBLICK AUF WEITERFÜHRENDE ERGEBNISSE Nach der Identifikation eines Genes für eine bestimmte Krankheit schließt sich die Frage nach der Funktion des Proteins an. Ist wie im Falle des BSND-Gens über die Funktion nichts oder nur wenig bekannt, gibt es verschiedene Ansätze für weitere Untersuchungen. Bei BSND war zunächst interessant zu klären wo es exprimiert wird. Eine Northern blot Analyse bestätigte die hauptsächliche Expression in der Niere. In situ Hybridisierung mit Nieren adulter Mäuse, die von einem kooperierenden Labor in Hannover durchgeführt wurden, zeigte starke Signale im inneren und äußeren Streifen der äußeren Medulla. Dieses Signal zeigt auffallende Homologien zur Expression von murinem NKCC2 (Igarashi et al., 1995). Daher ist anzunehmen, dass es wahrscheinlich eine Expression im mTAL darstellt. Ferner konnte eine Hybridisierung in einem Teil der kortikalen Tubuli gezeigt werden, die ähnlich auch für die Isoform B des murinen NKCC2 beschrieben wurde und das distale Konvolut darstellt.Diese Ergebnisse sind gut mit dem klinischen Bild von BSND vereinbar, da die Gene, deren Defekte die anderen Formen des aBS auslösen, NKCC2, ROMK und CLCNKB alle im mTAL von Säugetiernieren exprimiert werden (Yoshikawa et al., 1999; Kobayashi et al., 2001; Kohda et al., 1998). Die Expression im mTAL war aufgrund der physiologischen Funktion dieses Abschnitts des Nephrons und dem beobachteten renalen Phänotyp, der den Phänotypen der anderen Formen des BS stark ähnelt, bereits hypothetisch angenommen worden. Zusätzlich zeigte sich noch ein starkes Hybridisierungssignal in der inneren Medulla der Niere. Dieses Signal war nicht kontinuierlich bis in die Spitze der Papille vorhanden. Dies spricht nicht für eine Expression im Sammelrohr, sondern eher für Expression im dünnen aufsteigenden Teil der Henle-Schleife (tAL). Für diesen Nephronabschnitt ist nur die Expression von CLC-K1, das murine Äquivalent zum humanen CLCNKA, beschrieben (Yoshikawa et al., 1999). Der dünne aufsteigende Teil der Henle-Schleife ist vor allem für den Konzentrationsmechanismus des Gegenstromprinzips von Bedeutung. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, dass die Erkrankung schwerer verläuft als bei den anderen Formen des aBS (Abb. 5.3). Eine weitere offene Frage ist die Pathogenese des chronischen Nierenversagens, das bei BSND regelmäßig eintritt. Es wird spekuliert, ob es infolge der hohen renalen Prostaglandinproduktion entsteht. Die histologischen Ähnlichkeiten zur Nephronophtise, die auch zu chronischem Nierenversagen führt, legen die Hypothese nahe, dass ein paralleler Entstehungsweg vorhanden sein könnte. Neue Erkenntnisse über die Pathogenese bei BSND könnten in analog auch für die Nephronophtise zutreffen. 64 DISKUSSION Abb. 5.3 In situ-Hybridisierungsanalyse von murinem Bsnd. a Expression in der Niere einer adulten Maus mit einer stärkeren Vergrößerung in b, c und d. Besonders im inneren (is) und äußeren Streifen (os) der äußeren Medulla (OM) kann man starke Signale erkennen, wobei es sich um Expression im dicken aufsteigenen Teil der Henle-Schleife handeln könnte. e, f Expression von Bsnd im Innenohr 18,5Tage alter Mausembryonen, bei der ein starkes Signal in den Marginalzellen der Stria vascularis sowie in der Crista ampullaris des Vestibulärorgans zu erkennen ist. Ca, crista ampullaris, cd, cochlear duct, Co, organ of Corti, Rm, Reissner membrane, sct, scala tympani, scv, scala vestibuli, sv, stria vascularis. (Birkenhäger et al., 2002) 65 DISKUSSION Da bei BSND neben dem renalen Phänotyp auch das Auftreten sensoneuraler Taubheit typisch ist, war außer der renalen Expression die Expression im Innenohr von Interesse. In situ Hybridisierung mit muriner fetaler Cochlea von Tag 18,5 p.c. bestätigte die Expression in den chromophilen Zellen der Stria vascularis. Da die Stria vascularis in das K+-Recycling mit einbezogen ist und so am Erhalt der hohen K+-Konzentration der Endolymphe beteiligt sind, ist die Taubheit als phänotypische Ausprägung des Gendefekts begründbar. Die primär aktive Na-K-ATPase in der apikalen Membran der Marginalzellen der Stria vascularis ist direkt für den K+-Rücktransport verantwortlich. Unterstützt wird dieser Transport von NKCC1, dem sekundär aktiven sekretorischen Na-K-2Cl-Kotransporterin der basolateralen Membran der chromophilen Zellen (Delpire et al., 1999). Ein Maus-Modell, bei dem Nkcc1 (Slc12A2) ausgeschaltet ist, zeigt phänotypisch Taubheit, da durch das Fehlen von Endolymphe im Ductus cochlearis die Reissner Membran zusammenfällt. Zusätzlich zeigt sich ein vestibulärer Defekt. Auch eine Regulator-Funktion von CLC-Kb und CLC-Ka oder ROMK käme als Mechanismus des Proteins in Betracht, da der Transport über NKCC2 von der Funktion dieser Kanäle abhängig ist. Das weitere Vorgehen bei der näheren Charakterisierung des Proteins erfordert die Identifikation von Interaktionspartnern beispielsweise mit Hilfe von Yeast two hybrid, Western Plot Analysen und Immunpräzipitation oder Koexpression in Xenopus Oozyten. Ein weiteres Ziel ist es, z.B. durch Kristallisation Informationen über die Struktur des Proteins herauszufinden. 66 6. ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG Das Bartter Syndrom BS ist eine autosomal-rezessiv vererbte Nierenerkrankung, die in verschiedenen Formen auftritt. Es handelt sich um eine renale Salzverlusttubulopathie, die durch Defekte in verschiedenen Kanälen bzw. Transportern, die im dicken aufsteigenden Teil der Henle-Schleife exprimiert werden, ausgelöst werden. Klinisch bildet sich eine hypokaliämische metabolische Azidose mit normotensivem hyperreninämischem Hyperaldosteronismus aus, die auf die gestörte Na+Cl--Resorption zurückzuführen ist. Hinzu kommen bei der antenatalen Form massive Polyurie, die zu Polyhydramnion und Frühgeburtlichkeit führt, Hyperkalziurie, erhöhte renale Prostaglandin E2 Produktion und die Entwicklung einer Nephrokalzinose. Für drei Typen sind bereits Gendefekte beschrieben, für eine vierte Variante des aBS, die mit Taubheit assoziiert ist, wurde ein Genlokus auf 1p31 lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die bestehende Eingrenzung dieses 2 MB großen Intervalls mit Hilfe von 15 polymorphen Mikrosatellitenmarkern durch Homozygosity mapping und Haplotype Sharing Analyse auf weniger als 900 kb eingegrenzt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass 5 der Familien ein ausgeprägtes Haplotype Sharing über bis zu 14 der 15 untersuchten Marker aufwiesen. In diesem Bereich wurden 9 Gene und mehre hypothetische Gene identifiziert. Für 6 von den Proteinen war keine Funktion bekannt. 6 Proteine wurden mittels SSCP an 10 Betroffenen untersucht. In mehreren Exonen wurden bandshifts entdeckt, die sich jedoch alle als auch bei Gesunden Kontrollindividuen vorkommende Polymorphismen erwiesen. In einem neuartigen Gen, bestehend aus vier Exonen, wurden bei den Betroffenen 7 verschiedene Mutationen identifiziert, die mit einem Funktionsverlust einhergehen. Die Identifikation dieses Gens bildet die Grundlage zu weiteren funktionellen Untersuchungen des in Niere und Innenohr exprimierten Proteins, die neue Erkenntnisse über die Physiologie dieser beiden Organe und insbesondere über die Entstehung von sensoneuraler Taubheit liefern können. 67 7. LITERATURVERZEICHNIS LITERATURVERZEICHNIS Abdelhak, S.; Kalatzis, V.; Heilig, R.; Compain, S.; Samson, D.; Vincent, C.; Weil, D.; Cruaud, C.; Sahly, I.; Leibovici, M.; Bitner-Glindzicz, M.; Francis, M.; Lacombe, D.; Vigneron, J.; Charachon, R.; Boven, K.; Bedbeder, P.; Van Regemorter, N.; Weissenbach, J.; Petit, C. (1997) A human homologue of the Drosophila eyes absent gene underlies branchio-oto-renal (BOR) syndrome and identifies a novel gene family. Nature Genet. 15: 157-164. Ansorge W, Sproat B, Stegemann J, Schwager C, Zenke M. (1987) Automated DNA sequencing: ultrasensitive detection of fluorescent bands during electrophoresis. 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Mein Dank gilt auch Frau Anita Imm für ihre vielfältige Hilfe, ihre guten Tipps in allen Lebenslagen und ihr immer offenes Ohr, nicht nur für molekulargenetische Probleme. Herrn PD Dr. von Weizsäcker danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens und dafür, dass er sich sogar in den Pfingstferien Zeit für das Promotionskolloquium nimmt. Außerdem möchte ich mich ganz herzlich bei allen Labormitarbeitern und meinen Mitdoktoranden Frauke Weidanz, Achim Becker und Kathleen Schorn bedanken. Insbesondere für die immer gute Stimmung. In diesem guten Team hat die Arbeit sehr viel Freude gemacht! Danken möchte ich auch Tina Tomann für die gründliche Korrektur meiner Arbeit und Edda Fischer, die mich immer wieder daran erinnert hat, dass es auch noch ein Leben außerhalb des Labors gibt. Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Bruder Rainer, der mein Interesse für die Forschung geweckt hat, sowie meinen Eltern. Sie haben mich stets sehr unterstützt und ohne ihre Hilfe wäre mein ganzes Studium in dieser Form wohl nicht möglich gewesen. 75 LEBENSLAUF 9. LEBENSLAUF Persönliche Daten Name Ruf Vorname Eva Maria Frederike gerboren 09.07.1977 in Stuttgart Schulbildung 1984-1989 Pestalozzi-Grundschule, Stuttgart 1989-1997 Hegel-Gymnasium, Stuttgart 1997 Abitur Hochschulbildung 1997-1999 Medizinstudium an der Eberhard-Karls-Universität, Tübingen August 1999 Physikum Seit 1999 Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg August 2000 1. Staatsexamen April 2003 2. Staatsexamen Famulaturen 02-03/00 Famulatur im Klinikum Prenzlauer Berg, Berlin (Chirurgie) 09/01 Famulatur am Peter Lougheed Center, Calgary, Canada (Innere Medizin) 10-11/01 Famulatur am Rarotonga Hospital, Rarotonga, Cook Islands (Pädiatrie) 01/02 Famulatur am Royal Brisbane Hospital, Brisbane, Ausralien, (klinische Genetik) 05/02 Famulatur im Josefs-Krankenhaus, Freiburg (Anästhesie) 07-08/02 Famulatur an der Universtiäts-Frauenklinik Tübingen (Gynäkologie und Geburtshilfe) Dissertation 09/00 – 08/01 „Positionsklonierung des Gens (BSND) für Bartter-Syndrom mit Taubheit“ im molekulargenetischen Labor der Albert-LudwigsUniversität Freiburg bei Herrn Prof. Dr. med. Hildebrandt. Methoden: PCR, Haplotypenanalyse, SSCP, direkte Sequenzierung 76 LEBENSLAUF
