Moderne Komplementanalytik Methoden und Indikationen - gfid-ev
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Moderne Komplementanalytik! Methoden und Indikationen! Michael Kirschfink, Institut für Immunologie, Universität Heidelberg •! Einführung" " " Physiologie, Pathophysiologie and klinische Relevanz! •! Analytik des Komplementsystems" Das Immunsystem humoral zellulär spezifisch/angeboren unspezifisch/erworben T-Lymphozyten Makrophagen B-Lymphozyten NK-Zellen Antikörper Komplement C3b Komplementreaktion Klassischer Weg Immunkomplex C1 YY C3b Alternativweg Fremdoberfläche Lektin- Weg MBL MASP I MASP II C4, C2 C3 C5 C3a C5a C6, C7 C8, C9n C5b-9 DC Aktivierung und Rekrutierung von Entzündungszellen Lyse Regulation der spez. Immunantwort Opsonisierung IC RES Phagocytose Komplement als Mediatorsystem der Entzündungsreaktion Plasma MCP/CD46 DAF/CD55 CR1/CD35 CD59 C1-Inhibitor C4 bp ------Faktor H Faktor I ------Clusterin S-Protein ------Carboxypeptidase N Pathophysiologische Bedeutung des Komplementsystems Indikationen für Komplementanalytik Primäre Immundefekte 6,1% 7,4% 2,5% 23,8% 66,3% 17,6% 31,9% 2% 5% 7,4% 3,2% 13,6% 70,8% 23,8% 19,8% EUROPE N = 9612 JAPAN N = 678 AUSTRALIA N = 500 7,4% 4,9% 4,9% 26% Humoral Cellular / Combined 58% 2% 9% 5% LATIN AMERICA N = 1428 54,1% Phagocytic Complement 28,7% SOUTH AFRICA N = 122 Other I) Defekte des Komplementsystems C1-C8, B, P, MBL rezidivierende bakterielle Infekte C1, C2, C4 systemischer Lupus erythematodes C5-C8, P, MBL Neisserieninfekte C1 Inhibitor hereditäres Angioödem Faktor H (FI, MCP, C3) CD55, CD59 -- hämolytisch-urämisches Syndrom, MPGN paroxysmale nächtl. Hämoglobulinurie C1 Inhibitor-Defekt Hereditäres Angioödem = Quinke Ödem Ursache? Analytik: CH50, C4, C1q, C1Inh (F+P)! ! !(anti-C1Inh)! Komplement als Mediatorsystem der Entzündungsreaktion II) Erkrankungen mit gesicherter Komplementbeteiligung •! •! •! •! •! •! •! •! •! •! Infektionserkrankungen--Sepsis ARDS/MOF/SIRS Vaskulitiden Nephritiden Ischämie/Reperfusionsschaden Angioödem, Capillary Leak Syndrome Autoimmunerkrankungen (v.a. SLE, RA) Transplantatabstoßung Transfusionsreaktionen Erkrankungen des ZNS (MS, GBS) Komplement- Diagnostik Mannan! sens. SchafsE C1-Inhibitor Prot/Fkt!! YY C1 MBL,! ,MASPs! Alternativweg klassischer Weg C3nef keine Lyse Kaninchen/ Hühner E CH50 Einzelkomponenten C3a, C3d C3 AH50 C5 C6, C7 C8, C9n C5b-9 keine Lyse Einzelkomponenten SC5b-9 Algorhythmus der Komplementdiagnostik Gesamtfunktion Klassischer Weg Alternativer Weg Lektin Weg Primärer Defekt? Einzelfaktorenanalyse (Serum) Komponenten / Regulatoren: C1-C9, B, D, P, MBL C1-INH, fH, fI, SCPN - Protein - Funktion Auto-Antikörpernachweis Familienanalyse C3-Nephritisfaktor (Serum) Auto-anti-C1q Auto-anti-C1-INH Auto-anti-Faktor H Aktivierung? Komplementaktivierungsanalyse (EDTA-Plasma) Spaltprodukte: C3a, C3d, C4d, Ba, Bb Proteinkomplexe: C1r,s:C1-INH (klassischer Weg) C3b(Bb)P (alternativer Weg) sC5b-9 (terminale Sequenz) Funktionsanalyse im hämolytischen Test K50% ELISA für Komplementdefekte Klassischer wWeg C4 C2 Lectinweg C3 C4 C2 Alternativweg C3 C9 C1qrs C6 C5 IgM C7 C8 C9 MBL/MASPs C6 C5 Mannan C7 C8 P D C9 B C6 C3 LPS C5 C7 C8 Komplement- Parameter der Entzündungsdiagnostik im Gewebe/auf Zellen klassischer Weg Alternativweg YY C1 C1q P C4d C3 Methoden: - Immunhistochemie - Cytofluorometrie C3b, C3d C5 C6, C7 C8, C9n C5b-9 C5b-9 PNH:! CD55! CD59! Fall: SLE und C1q Defekt Kirschfink et al, 1993, Petry, Kirschfink et al, 1995 Fall: SLE und C1q Defekt Factor H binding to tissue Haemolytisch-Uraemisches Syndrom (HUS) D+ Typische Form •! Shiga-Toxin E. coli O157:H7 •! Kinder, Diarrhö assoziiert D- Atypische Form •! Genetisch; sporadisch and familiär •! Erwachsene, Nicht Diarrhoe-ass. Mikroangiopathie Thrombocytopenie Akutes Nierenversagen Analytik: CH50, APH50, C3, C3d! ! !FH, FI, MCP! Multiple Genetische Defekte bei aHUS •! Faktor H (~20 %) Warwicker et al. 1999, Neumann/Zipfel 2003, Noris et al. 2003) •! MCP Mutationen Richards et al. 2003, Noris et al. 2003 •! Faktor I Mutationen Dragon Durey et al. 2005 •! Faktor B Mutationen Rodriguez de Cordoba et al. 2006 •! C3 Mutationen Dragon Durey et al. 2008 •! CFHR1/CFHR3 Defekte Zipfel et al. 2007 •! Autoantikörper gegen Faktor H Dragon Durey et al. 2005, Jósi et al. 2007, Jószi et al. 2008 •! Mutationen bei ~ 60 % der aHUS Patienten aHUS Effekt von Dialysis und anti-C5 Antikörper (Eculizumab) Therapie Eculizumab 140 7000 120 6000 100 5000 80 4000 60 3000 2000 1000 0 40 20 0 SC5b-9 (ng/ml) CH50 (%) CH50 (%) SC5b-9 (ng/ml) Dialysis 8000 MPGN und Komplementdysregulation •! •! •! •! C3 Nephritisfaktor FaKtor H-Defekt (Maus, Schwein, Hund, Mensch) Autoantikörper gegen Faktor H C3 Mutation (fH Bindungsstelle) C3b Analytik: CH50, APH50, C3, C3d, C3NEF, FH Electron microscopic immunogold localization of Factor H along the glomerular basement membrane (GBM) of a normal human kidney specimen ! revealing a transmembrane gradient of Factor H across the GBM with maximum Factor H concentration on the blood side and minimum Factor H ! concentration on the urine side of the GBM. ! C3Nef C4Nef C3 Nef in MPGN Patienten Schwertz et al, 2001 Komplementprofil in MPGN Patientsen Schwertz et al, 2001 MPGN mit Faktor H Defekt 1 2 I II III IV V Pigs 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C518R R127L C431S C941Y C673S !K224 L493V I1166R Factor H Plasma Mutation Domain Comment Reference MPGN II Absent Ault et al, 1997 MPGN II absent CCP 9 CCP 16 CCP 2 FHL-1 present II C518R C941Y R127L III MPGN I absent C431S CCP 4 Dragon Durey et al. 2004 IV MPGN I absent C7673S CCP 11 Dragon Durey et al. 2004 V MPGN II present DK224 CCP 4 Licht et al. 2004 MPGN II absent L493V I1166R CCP 9 CCP 20 Hegasy et al. 2002 I pigs Dragon Durey et al. 2004 << Deletion of Lysin224 im Faktor H A Patient A Patient B Father Mother B I P S G N I V D P S K S Q I I Y K E N E R RP WF G Q L S Y P E T K S E I S 222 S Q K I I allele I: 737 tct cag --- att att allele II: tct cag --- att att S Q K I I tct cag aag att att tct cag --- att att C E V A D G R E S Y N M G Y E D ? K224 Y H 11 22 33 44 55 66 77 88 99 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 !"#$%&'($)'*++,'' MPGN: Deletion des Lys224 -- Komplementprofile C3 Glomerulopathien Figure 3 Schematic representation of the expanding spectrum of renal diseases associated with an abnormal control of the MPGN und AMD Faktor H-SCR7: Tyr402His = Riskofaktor für AMD klassischer Weg C1 YY SerinproteinaseInhibitoren C1-Inhibitor anti-C5 Inhibition srCR1 C3b C3 C5 C5a C5b-9 anti-C5a iEntzündung Gerinnungs-/. Kininsystem. Alternativweg http://www.klinikum.uni-heidelberg.de/Immunchemie.3097.0.html!
