PD Dr. U.-C. Hipler, Klinik für Dermatologie und dermatologische
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Biomaterialien als Wundauflagen für chronisch stagnierende Wunden ‐ IGF 15997 BG ‐ U.-C. Hipler Wundtherapie Bereits 1570 v. Christus beschäftigten sich die Ägypter mit der Wundtherapie und beschrieben dies in dem Papyrus Ebers Leinenverbände wurden mit verschiedenen Stoffen bestrichen ( Honig, Wachs, Fett ) und für die Wundtherapie eingesetzt Der Römer Claudius Galenos beschreibt in seiner „ARS medica“ den Prozess der Wundheilung 2 Die Entstehung von Wunden Wunde - definiert als Gewebsdurchtrennung von Haut, Schleimhäuten oder Organen Wunden: mechanische, thermische oder chemische Ursachen physiologische Wundheilung: komplex, exakt reguliert vier zeitlich abgestimmte Phasen: 3 Wundheilungsphasen 30 Minuten 2 Tage 17 Tage 30 Tage 4 Wundheilung in der Exsudations‐ und Resorptiven Phase Verletzung Thrombozyten - Fibrinpfropf - Akute Entzündung Neutrophile Granulozyten Aktivierung von Makrophagen Autolytische Wundreinigung Entzündungsfördernde Zytokine Reaktive Sauerstoffspezies Wachstumsfaktoren 5 PDGF, EGF, IGF-1, TGF-ß, FGF >30 Zytokine sind an der Wundheilung beteiligt, sie regenerieren sich aus Makrophagen, Thrombozyten, Fibroblasten, epidermalen Zellen, neutrophilen Leukozyten Granulations‐ und Epithelisierungsphase Wachstumsfaktoren Bildung von Granulationsgewebe Angiogenese Reduktion entzündungsfördernder Zytokine und MMPs erhöhte Anzahl TIMPs Matrix-Aufbau Epithelisierung Gewebe-Remodeling Normale Wundheilung 6 Wundsekretuntersuchungen bei chronischen Wunden Definition: der Heilungsprozess eines chronischen Defektes zeigt über einen Zeitraum von 8-12 Wochen keinen Fortschritt Entstehung: Störung des physiologischen Gleichgewichts von betroffenen Geweben (Haut) aufgrund gestörter Mikro- und Makro-Zirkulationen Diabetisches Fußulcus Decubitalulcus Venöses Beinulcus 7 Chronisch‐stagnierende Wunde Ungleichgewicht: destruktive Vorgänge dominieren Abbauende Prozesse •• Proteasen Proteasen ↑↑ •• proentzündliche proentzündliche Zytokine Zytokine ↑↑ •• Zellteilung Zellteilung (Proliferation (Proliferation ↓) ↓) •• Wachstumsfaktoren Wachstumsfaktoren ↓↓ ••„aktive“ „aktive“ Fibroblasten Fibroblasten ↓↓ Aufbauende Prozesse •• Proteasen Proteasen ↓↓ •• proentzündliche proentzündliche Zytokine Zytokine ↓↓ •• Zellteilung Zellteilung (Proliferation (Proliferation ↑) ↑) •• Wachstumsfaktoren Wachstumsfaktoren ↑↑ ••„aktive“ „aktive“ Fibroblasten Fibroblasten ↑↑ •• Inhibitoren Inhibitoren modifiziert nach Schultz GS, Mast BA. Wounds (1998) 10 (Suppl F): 1F-9F 8 Teufelskreis der stagnierenden Wunde Wiederholung: Wiederholung: Trauma, Trauma, Infektion, Infektion, Unterversorgung, Unterversorgung, Ödem Ödem Aktivierung Aktivierung von von Entzündung Entzündung Anstieg Anstieg der der weißen weißen Blutkörperchen Blutkörperchen ↑↑ ↑↑ Anstieg Anstieg SauerstoffSauerstoffradikale radikale ↑↑ ↑↑ Aktivierung Aktivierung von von Makrophagen Makrophagen Proinflammatorische Proinflammatorische Zytokine Zytokine ↑↑ ↑↑ (TNF-α, IL-1β, (TNF-α, IL-1β, IL-6) IL-6) •• •• •• •• Abbau Abbau von von Wachstumsfaktoren Wachstumsfaktoren Abbau Abbau von von Proteinase-Inhibitoren Proteinase-Inhibitoren Matrix-Abbau Matrix-Abbau (z. (z. B. B. Kollagen) Kollagen) Gestörte Gestörte Epithelisierung Epithelisierung bewirkt die Bildung von Proteasen Proteasen ↑↑ ↑↑ MMPs, MMPs, Elastase Elastase Nwomeh et al. Clin Plast Surg 1998 9 In‐vitro‐Testmethoden Bindungsvermögen Bindungsvermögen für fürMediatoren Mediatoren Bindungsassays Bindungsassaysfür für Proteasen (Elastase, MMP-2, Proteasen (Elastase, MMP-2, MMP-13) MMP-13)und undZytokine Zytokine(IL-1β, (IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6) TNF-α, IL-8, IL-6) Antioxidative AntioxidativeWirkung Wirkung Assays Assayszur zurMessung Messungder der Inhibition Inhibitionreaktiver reaktiverSauerstoffSauerstoffund undStickstoffspezies Stickstoffspezies Antimikrobielle Antimikrobielle Wirksamkeit Wirksamkeit Bestimmung Bestimmungder derHemmung Hemmung des Wachstums des Wachstumsvon von Mikroorganismen nach Mikroorganismen nachdem dem JIS JISLL1902:2002 1902:2002und undder der DIN DINEN ENISO ISO27027 27027 Biofunktionalit ät Biofunktionalität WachstumsfaktorWachstumsfaktorAssay Assay Bindungskapazität Bindungskapazitätund und Wiederfreisetzung von Wiederfreisetzung von PDGF-BB PDGF-BB Bestimmung Bestimmungder der biologischen biologischenWirksamkeit Wirksamkeit auf aufhumane humaneFibroblasten Fibroblasten Co-Kultur-Modell Co-Kultur-Modell Anforderung Anforderungan anWundverbände Wundverbände Biokompatibilit ät Biokompatibilität Zellkultur Zellkultur Infektion Infektionvon vonHaCaTHaCaTKeratinozyten Keratinozytenmit mit Staphylococcus Staphylococcusaureus aureus zur zurTestung Testungder der antibakteriellen Aktivität antibakteriellen Aktivität ininAnwesenheit Anwesenheitvon von humanen Zellen humanen Zellen Bestimmung Bestimmungder derProliferation Proliferationvon vonhumanen humanenKeratinozyten, Keratinozyten, HaCaTZellen und Fibroblasten (zelluläres HaCaT- Zellen und Fibroblasten (zelluläresATP, ATP,dsDNA, dsDNA,Protein) Protein) Messung Messungvon vonNekrose Nekrose(LDH) (LDH)und undApoptose Apoptose(Caspase (Caspase8,8, Caspase Caspase9,9,Caspase Caspase3/7) 3/7) Evaluierung der inflammatorischen Wirkung Evaluierung der inflammatorischen Wirkung(IL-6, (IL-6,IL-8) IL-8) 10 Zellkulturmodelle für die in vitro - Testung HaCaTKeratinozyten Fibroblasten Pilze Bakterien Leukozyten (Basophile) Humane Keratinozyten 11 Schema der in vitro - Toxizitäts- Assays Aussäen Zellen Zugabe Assay ErgebnisReagenzien daten Zugabe Substanz oder Extrakt Equilibration 0 - 48 h Inkubation Assay 4 h - 5 Tage 10 min - 24 h Ergebnis versus Kontrolle Keine Wirkung Proliferative Wirkung Cytotoxische Wirkung - Apoptose - Nekrose 12 Messprinzipien zur Evaluierung von Wundmaterialien Photometrie Fluoreszenz Chemilumineszenz Nephelometrie 13 Biokompatibilität ‐ Quantitative Zellproliferationsassays ATP + D-Luciferin + O2 Luciferase AMP + PPi + Oxyluciferin + CO2 + Licht Mg2+ 1 0 9 dsDNA + PicoGreen® 8 Fluoreszenz Lumineszenz Absorption 7 6 5 4 Protein + CuSO4/Bicinchoninsäure 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 Zelldichte [Wiegand C et al. (2009) Skin Pharmacol Physiol 22:74-82] 14 7 8 9 1 0 Struktur der Cyclodextrin‐Komplexe Mol-masse [g/mol] Hohlraumdurchmesser [Å] Hohlraum-höhe [Å] Außendurchmesser [Å] Hohlraumvolumen [mL/mol] Wassermoleküle im Käfig α−Cyclodextrin 972 4,7 – 5,3 7,9 13,7 174 6 β−Cyclodextrin 1135 6,0 – 6,5 7,9 15,3 262 11 γ−Cyclodextrin 1297 7,5 – 8,3 7,9 16,9 472 17 PHMB Chlorhexidin Jod 15 α‐Cyclodextrin (A), β‐Cyclodextrin (B) und γ‐Cyclodextrin (C) und ihre Komplexe mit Polihexanid (I), Chlorhexidindiacetat (II) und Iod (III) A B C AI BI CI AII BII CII AIII BIII CIII 16 Zytotoxizität / Proliferation der Cyclodextrine * 120 140 p<0,05 =* p<0,01=** * * 100 * 24 h * ** 48 h ** 80 ** 60 ** 40 20 A T P (% d er K o n tro lle) A T P (% d er K o n tro lle) 140 0 0,01% 0,10% 0,50% 1% p<0,01 =** 24h * 100 80 60 48h * ** ** 40 ** 20 ** Medium α− Cyclodextrin-Konzentration (%) A T P (% d er K o n tro lle) p<0,05 = * 0 Medium 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 120 24h ** 0,10% 0,50% β -Cyclodextrinkonzentration (%) p<0,05 =* p<0,01 =** ** 0,01% 48h ** ** * Medium 0,01% 0,10% 0,50% 1% Schönfelder et al. Exp Dermatol 2006; 15:883-890 γ -Cyclodextrin-Konzentration (%) Hipler et al. J Biomed Mater Res A 2007; 83:70-79 17 1% Proliferationsuntersuchungen Polihexanid (PHMB) Polihexanid NH •breites bakterizides Spektrum •spezifische Wirkung gegen die sauren Lipide in der Bakterienmembran NH N H N (CH2)6 N H n HaCaT-Zellen unter Einfluss von PHMB (ATP) 140 120 ATP (% Kontrolle) 100 80 1h *** 60 24 h *** 48 h 40 *** *** 20 *** *** *** *** 0,05 mg/mL PHMB 0,1 mg/mL PHMB 0,2 mg/mL PHMB 0 Kontrolle 0,006 mg/mL PHMB 18 0,01 mg/mL PHMB 0,02 mg/mL PHMB Proliferationsuntersuchungen Polihexanid (PHMB) Polihexanid NH •breites bakterizides Spektrum •spezifische Wirkung gegen die sauren Lipide in der Bakterienmembran NH N H N (CH2)6 N H n HaCaT-Zellen unter Einfluss von PHMB (Protein) 160 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 120 100 1h 80 24 h *** 48 h 60 *** *** *** *** 0,02 mg/mL PHMB 0,05 mg/mL PHMB 0,1 mg/mL PHMB 0,2 mg/mL PHMB 40 20 0 Kontrolle 0,006 mg/mL PHMB 19 0,01 mg/mL PHMB Proliferationsuntersuchungen α‐CD‐PHMB‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-PHMB (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-PHMB (Protein) 140 120 120 ATP [% Kontrolle] 100 *** *** *** *** 80 1h *** 60 *** 24 h *** *** *** *** 48 h 40 20 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 100 80 1h *** *** *** *** *** *** *** *** 60 48 h 40 20 0 0 Kontrolle 0,1 mg/mL αCD- 0,5 mg/mL αCDPHMB PHMB 1 mg/mL αCD- 1,5 mg/mL αCDPHMB PHMB 2 mg/mL αCDPHMB Kontrolle 20 24 h 0,1 mg/mL αCD- 0,5 mg/mL αCD- 1 mg/mL αCD- 1,5 mg/mL αCD- 2 mg/mL αCDPHMB PHMB PHMB PHMB PHMB Proliferationsuntersuchungen β‐CD‐PHMB‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-PHMB (Protein) 120 140 100 120 80 1h 60 24 h *** *** *** *** *** *** *** *** *** 48 h 40 20 Proteingehalt [% Kontrolle] ATP [% Kontrolle] HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-PHMB (ATP) 100 80 1h 24 h *** *** 60 *** *** *** *** *** *** *** *** *** 40 20 0 0 Kontrolle 0,1 mg/mL βCD- 0,5 mg/mL βCDPHMB PHMB 1 mg/mL βCD- 1,5 mg/mL βCDPHMB PHMB 2 mg/mL βCDPHMB Kontrolle 21 0,1 mg/mL βCD- 0,5 mg/mL βCDPHMB PHMB 1 mg/mL βCD- 1,5 mg/mL βCDPHMB PHMB 2 mg/mL βCDPHMB 48 h Proliferationsuntersuchungen γ‐CD‐PHMB‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-PHMB (Protein) 120 140 100 120 80 *** 1h 24 h 60 48 h 40 *** *** *** *** *** *** *** *** 20 Proteingehalt [% Kontrolle] ATP [% Kontrolle] HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-PHMB (ATP) 100 80 1h *** 60 40 *** *** *** *** *** *** 24 h *** *** 48 h *** 20 0 Kontrolle 0,1 mg/mL γCD- 0,5 mg/mL γCDPHMB PHMB 1 mg/mL γCD- 1,5 mg/mL γCDPHMB PHMB 0 2 mg/mL γCDPHMB Kontrolle 22 0,1 mg/mL γCD- 0,5 mg/mL γCDPHMB PHMB 1 mg/mL γCD- 1,5 mg/mL γCDPHMB PHMB 2 mg/mL γCDPHMB Proliferationsuntersuchungen Chlorhexidindiacetat (CHX) HaCaT-Zellen unter Einfluss von CHX (Protein) HaCaT-Zellen unter Einfluss von CHX (ATP) 180 140 160 ATP [% Kontrolle] 100 80 1h 24 h 60 48 h *** 40 *** *** *** *** *** 20 Proteingehalt [% Kontrolle] 120 140 120 1h 100 24 h 80 *** *** *** *** *** 0,01 mg/mL CHX 0,02 mg/mL CHX *** 60 40 20 0 0 Kontrolle 0,0025 mg/mL CHX 0,005 mg/mL CHX 0,01 mg/mL CHX 0,02 mg/mL CHX 0,2 mg/mL CHX Kontrolle 23 0,0025 mg/mL CHX 0,005 mg/mL CHX 0,2 mg/mL CHX 48 h Proliferationsuntersuchungen α‐CD‐CHX‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-CHX (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-CHX (Protein) 140 120 120 ATP [% Kontrolle] 100 1h 80 *** *** *** 24 h 48 h 60 40 20 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 100 80 1h 24 h 60 48 h 40 20 0 Kontrolle 0,5 mg/mL αCDCHX 1 mg/mL αCD-CHX 1,5 mg/mL αCDCHX 0 2 mg/mL αCD-CHX Kontrolle 24 0,5 mg/mL αCDCHX 1 mg/mL αCD-CHX 1,5 mg/mL αCDCHX 2 mg/mL αCD-CHX Proliferationsuntersuchungen β‐CD‐CHX‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-CHX (Protein) HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-CHX (ATP) 160 120 140 ATP [% Kontrolle] 100 1h 80 24 h 48 h 60 40 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 120 100 1h 80 24 h *** 60 40 20 20 0 0 Kontrolle 0,5 mg/mL βCDCHX 1 mg/mL βCD-CHX 1,5 mg/mL βCDCHX Kontrolle 2 mg/mL βCD-CHX 25 0,5 mg/mL βCD-CHX 1 mg/mL βCDCHX 1,5 mg/mL βCD-CHX 2 mg/mL βCDCHX 48 h Proliferationsuntersuchungen γ‐CD‐CHX‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-CHX (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-CHX (Protein) 160 160 140 ATP [% Kontrolle] 140 120 1h 100 24 h *** 80 48 h *** 60 40 Proteingehalt [% Kontrolle] 180 120 100 1h 80 24 h *** 60 40 20 20 0 0 Kontrolle 0,5 mg/mL γCD-CHX 1 mg/mL γCD-CHX 1,5 mg/mL γCD-CHX 2 mg/mL γCD-CHX 5 mg/mL γCD-CHX 10 mg/mL γCD-CHX Kontrolle 26 0,5 mg/mL γCD-CHX 1 mg/mL γCD-CHX 1,5 mg/mL γCD-CHX 2 mg/mL γCD-CHX 5 mg/mL γCD-CHX 10 mg/mL γCD-CHX 48 h Proliferationsuntersuchungen Iod HaCaT-Zellen unter Einfluss von Iod (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von Iod (Protein) 160 120 140 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 ATP [% Kontrolle] 100 80 1h 24 h 48 h 60 *** *** 40 20 120 100 1h 24 h 80 48 h 60 40 20 0 0 Kontrolle 0,1 mg/mL Iod 0,2 mg/mL Iod 0,3 mg/mL Iod 0,6 mg/mL Iod Kontrolle 1,3 mg/mL Iod 27 0,1 mg/mL Iod 0,2 mg/mL Iod 0,3 mg/mL Iod 0,6 mg/mL Iod 1,3 mg/mL Iod Proliferationsuntersuchungen α‐CD‐Iod‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-Iod (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von αCD-Iod (Protein) 140 140 120 ATP [% Kontrolle] 120 100 1h 80 24 h 48 h 60 40 Proteingehalt [% Kontrolle] 160 *** *** 20 100 1h 80 24h 48h 60 *** *** 40 20 0 0 Kontrolle 0,1 mg/mL αCD- 0,5 mg/mL αCDIod Iod 1 mg/mL αCD- 1,5 mg/mL αCDIod Iod 2 mg/mL αCDIod Kontrolle 28 0,1 mg/mL αCD- 0,5 mg/mL αCDIod Iod 1 mg/mL αCD- 1,5 mg/mL αCDIod Iod 2 mg/mL αCDIod Proliferationsuntersuchungen β‐CD‐Iod‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-Iod (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von βCD-Iod (Protein) 120 160 140 Proteingehalt [% Kontrolle] ATP [% Kontrolle] 100 *** 80 1h 24 h 60 48 h 40 *** *** *** *** *** *** 20 120 100 1h 24 h 80 48 h 60 *** 40 *** 20 0 0 Kontrolle 4,5 mg/mL βCD-Iod 9 mg/mL βCD-Iod 13,5 mg/mL βCDIod 18 mg/mL βCD-Iod Kontrolle 29 4,5 mg/mL βCD-Iod 9 mg/mL βCD-Iod 13,5 mg/mL βCDIod 18 mg/mL βCD-Iod Proliferationsuntersuchungen γ‐CD‐Iod‐Komplex HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-Iod (ATP) HaCaT-Zellen unter Einfluss von γCD-Iod (Protein) 140 180 160 120 ATP [% Kontrolle] 80 1h *** *** *** 24 h 48 h 60 40 Proteingehalt [% Kontrolle] 140 100 120 1h 100 24 h 80 48 h 60 40 20 20 0 0 Ko ntro lle 5 mg/mL γCD-Io d 10 mg/mL γCD-Io d 15 mg/mL γCD-Io d 20 mg/mL γCD-Io d Ko ntro lle 30 5 mg/mL γCD-Io d 10 mg/mL γCD-Io d 15 mg/mL γCD-Io d 20 mg/mL γCD-Io d Proliferationsuntersuchungen mit dem ATP‐Assay nach 48 h Wirkstoff IC50# Wirkstoff [ mg/mL] PHMB CHX Iod IC50 Cyclodextrin-Wirkstoff-Komplexe IC50 αCDWirkstoffKomplex# [mg/mL] IC50 βCDWirkstoffKomplex# [mg/mL] IC50 γCDWirkstoffKomplex# [mg/mL] 0,01 ± 0,001 1,27 ± 0,73 0,35 ± 0,05 0,04 ± 0,01 0,0043 ± 0,0003 0,85 ± 0,09 1,02 ± 0,14 6,2 ± 1,3 0,55 ± 0,003 1,9 ± 4,5 > 2,0 * > 2,0 * (* keine Inhibition im untersuchten Konzentrationsbereich bis 2 mg/mL) Bei der Beurteilung des Effektes auf humane Zellen ist ein hoher IC50-Wert wünschenswert, da dies auf eine gute Zellverträglichkeit in den Anwendungskonzentrationen schließen lässt. # 31 In‐vitro‐Testmethoden Bindungsvermögen Bindungsvermögen für fürMediatoren Mediatoren Bindungsassays Bindungsassaysfür für Proteasen (Elastase, MMP-2, Proteasen (Elastase, MMP-2, MMP-13) MMP-13)und undZytokine Zytokine(IL-1β, (IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6) TNF-α, IL-8, IL-6) Antioxidative AntioxidativeWirkung Wirkung Assays Assayszur zurMessung Messungder der Inhibition Inhibitionreaktiver reaktiverSauerstoffSauerstoffund undStickstoffspezies Stickstoffspezies Antimikrobielle Antimikrobielle Wirksamkeit Wirksamkeit Bestimmung Bestimmungder derHemmung Hemmung des Wachstums des Wachstumsvon von Mikroorganismen nach Mikroorganismen nachdem dem JIS JISLL1902:2002 1902:2002und undder der DIN DINEN ENISO ISO27027 27027 Biofunktionalit ät Biofunktionalität WachstumsfaktorWachstumsfaktorAssay Assay Bindungskapazität Bindungskapazitätund und Wiederfreisetzung von Wiederfreisetzung von PDGF-BB PDGF-BB Bestimmung Bestimmungder der biologischen biologischenWirksamkeit Wirksamkeit auf aufhumane humaneFibroblasten Fibroblasten Co-Kultur-Modell Co-Kultur-Modell Anforderung Anforderungan anWundverbände Wundverbände Biokompatibilit ät Biokompatibilität Zellkultur Zellkultur Infektion Infektionvon vonHaCaTHaCaTKeratinozyten Keratinozytenmit mit Staphylococcus Staphylococcusaureus aureus zur zurTestung Testungder der antibakteriellen Aktivität antibakteriellen Aktivität ininAnwesenheit Anwesenheitvon von humanen Zellen humanen Zellen Bestimmung Bestimmungder derProliferation Proliferationvon vonhumanen humanenKeratinozyten Keratinozytenund und Fibroblasten (zelluläres ATP, dsDNA, Fibroblasten (zelluläres ATP, dsDNA,Protein) Protein) Messung Messungvon vonNekrose Nekrose(LDH) (LDH)und undApoptose Apoptose(Caspase (Caspase8,8, Caspase 9, Caspase 3/7) Caspase 9, Caspase 3/7) Evaluierung Wirkung Evaluierungder derinflammatorischen inflammatorischen Wirkung(IL-6, (IL-6,IL-8) IL-8) 32 Biofunktionalität ‐ Testung auf antimikrobielle Aktivität Agardiffusionstest (DIN 58940-3) Bildung eines Hemmhofes qualitative Aussage über die antimikrobielle Wirksamkeit Suspensionstest (JIS L 1902:2002) direkte Applikation der Bakterien auf das zu testende Material Quantitative Aussage über die antimikrobielle Aktivität Nephelometrie (NCCLS M27-A2, DIN EN 27027) Bestimmung der Trübung der Lösung Quantitative Aussage über bakterielles Wachstum 33 Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität der CD‐Wirkstoffkomplexe mittels Mikrotiterplatten‐Lasernephelometrie (MLN) und BacTiter‐Glo™ 34 Antibakterielle Wirkung gegen S. aureus – MLN‐Ergebnisse α-Cyclodextrin-Chorhexidindiacetat α-Cyclodextrin-Iod 12.000 5.000 10.000 Trübung [RNU] Trübung [RNU] 4.000 3.000 2.000 1.000 0 8.000 6.000 4.000 2.000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Zeit [h] Zeit [h] Kontrolle 5 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL Kontrolle 100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 40 µg/mL 50 µg/mL 60 µg/mL 70 µg/mL 80 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 800 µg/mL 900 µg/mL 1000 µg/mL ß-Cyclodextrin-Chlorhexidindiacetat 500 µg/mL ß-Cyclodextrin-Iod 12.000 12.000 10.000 10.000 8.000 8.000 Trübung [RNU] Trübung [RNU] 12 -2.000 -1.000 6.000 4.000 2.000 6.000 4.000 2.000 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 22 23 24 -2.000 -2.000 Zeit [h] Zeit [h] Kontrolle 120 µg/mL 130 µg/mL 140 µg/mL 150 µg/mL 160 µg/mL Kontrolle 1 mg/mL 2 mg/mL 3 mg/mL 4 mg/mL 170 µg/mL 180 µg/mL 190 µg/mL 200 µg/mL 210 µg/mL 220 µg/mL 5 mg/mL 6 mg/mL 7 mg/mL 8 mg/mL 9 mg/mL γ-Cyclodextrin-Chlorhexidindiacetat γ-Cyclodextrin-Iod 8.000 6.000 7.000 5.000 6.000 Trübung [RNU] Trübung [RNU] 7.000 4.000 3.000 2.000 1.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0 -1.000 -1.000 Zeit [h] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Zeit [h] Kontrolle 250 µg/mL 270 µg/mL 290 µg/mL 310 µg/mL 330 µg/mL 350 µg/mL 370 µg/mL 390 µg/mL 410 µg/mL 35 0 Kontrolle 13 mg/mL 1 mg/mL 16 mg/mL 4 mg/mL 19 mg/mL 7 mg/mL 22 mg/mL 10 mg/mL 25 mg/mL Antibakterielle Wirkung gegen S. aureus – MLN‐Ergebnisse α-Cyclodextrin-Polihexanid 1h 7.000 6.000 24h Trübung [RNU] 5.000 4.000 3.000 HaCaT control 2.000 1.000 0 0 -1.000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 -2.000 Zeit [h] Kontrolle 0,6 µg/mL 1,25 µg/mL 2,5 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL 20 µg/mL 25 µg/mL 30 µg/mL ß-Cyclodextrin-Polihexanid HaCaT + S. aureus 7.000 6.000 Trübung [RNU] 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 -1.000 Zeit [h] Kontrolle 1,0 µg/mL 1,5 µg/mL 2,0 µg/mL 2,5 µg/mL 3,0 µg/mL 3,5 µg/mL 4,0 µg/mL 4,5 µg/mL 5,0 µg/mL 5,5 µg/mL 6 µg/ml HaCaT + S. aureus + PHMB γ-Cyclodextrin-Polihexanid 7.000 6.000 Trübung [RNU] 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Wiegand C. et al. Wound Rep Reg 2009b -1.000 Zeit [h] Kontrolle 0,25 µg/mL 0,3 µg/mL 0,35 µg/mL 0,4 µg/mL 0,45 µg/mL 0,5 µg/mL 1,0 µg/mL 1,5 µg/mL 2,0 µg/mL 36 48h Antibakterielle Wirkung gegen E. coli – BacTiter‐Glo™ Luciferase ATP + D-Luciferin + O2 AMP + PPi + Oxyluciferin + CO2 + Licht Mg2+ + Detergenz und Zusatz zum Auflösen der Zellwand von Bakterien und Pilzen ß-Cyclodextrin-Iod α-Cyclodextrin-Iod γ-Cyclodextrin-Iod 2800 5000 4500 2000 1800 2400 4000 1600 2000 1200 1500 800 600 400 200 37 22 mg/mL 19 mg/mL 13 mg/mL 10 mg/mL 0 4 mg/mL 6 mg/mL 5 mg/mL 4 mg/mL 3 mg/mL 2 mg/mL 1 mg/mL 0,5 mg/mL 0,25 mg/mL 0,125 mg/mL 0 Kontrolle 900 µg/mL 800 µg/mL 700 µg/mL 600 µg/mL 500 µg/mL 400 µg/mL 300 µg/mL 200 µg/mL 400 100 µg/mL 0 800 1 mg/mL 500 1000 0,5 mg/mL 1000 1200 0,25 mg/mL 2000 1400 1600 Kontrolle 2500 ATP in [nM] ATP [nM] 3000 Kontrolle ATP [nM] 3500 0 250 µg/mL 230 µg/mL 210 µg/mL 38 390 µg/mL 350 µg/mL 310 µg/mL 290 µg/mL 270 µg/mL 160 µg/mL 150 µg/mL 140 µg/mL 130 µg/mL 120 µg/mL 110 µg/mL 100 µg/mL 70 µg/mL 60 µg/mL ATP [nM] 70 µg/mL 60 µg/mL 50 µg/mL 40 µg/mL 30 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL 5 µg/mL 2,5 µg/mL Kontrolle 0 190 µg/mL Kontrolle 0 0 µg/mL ATP [nM] ATP [nM] Antibakterielle Wirkung gegen E. coli – BacTiter‐Glo™ 3600 α-Cyclodextrin-Chlorhexidindiacetat 3000 2400 1800 1200 600 3500 ß-Cyclodextrin-Chlorhexidindacetat 3000 2500 2000 1500 1000 500 5000 γ-Cyclodextrin-Chlorhexidindiacetat 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0,5 µg/mL 0,45 µg/mL 0,4 µg/mL 0,35 µg/mL 0,3 µg/mL 0,25 µg/mL 39 2,0 µg/mL 1,5 µg/mL 1,0 µg/mL 0 1200 1000 800 600 400 200 15 µg/ml 10 µg/ml 5 µg/ml 2,5 µg/ml 1,25 µg/ml 0,625 µg/ml Kontrolle 30 µg/ml 1400 8 µg/mL 1600 25 µg/ml 1800 7 µg/mL ß-Cyclodextrin-Polihexanid 20 µg/ml 2000 6 µg/mL 5 µg/mL 4 µg/mL 3 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL Kontrolle ATP [nM] 0 Kontrolle ATP [nM] ATP [nM] Antibakterielle Wirkung gegen E. coli – BacTiter‐Glo™ 3000 α-Cyclodextrin-Polihexanid 2500 2000 1500 1000 500 5000 γ-Cyclodextrin-Polihexanid 4500 4000 gramnegatives Bakterium 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Zusammenfassung der antibakteriellen Wirksamkeit von CD‐Wirkstoff‐Komplexen Staphylococcus aureus IC50 Wirkstoff# [µg/mL] Wirkstoff IC50 CD-Wirkstoff-Komplex# [µg/mL] α-CD β-CD γ-CD PHMB 0,13 ± 0,02 0,18 ± 0,04 10,64 ± 1,63 12,63 ± 2,65 6,96 ± 0,01 6,41 ± 1,76 0,69 ± 0,13 0,66 ± 0,26 CHX 0,86 ± 0,08 0,87 ± 0,09 44,03 ± 4,55 43,83 ± 2,16 160,59 ± 18,25 167,57 ± 7,71 341,37 ± 1,98 374,65 ± 13,23 163,72 ± 37,07 238,61 ± 39,88 663,21 ± 172,71 854,46 ± 0,00 2988,50 ± 356,48 4654,58 ± 129,10 12563,79 ± 1038,44 16276,33 ± 488,16 Iod Escherichia coli IC50 Wirkstoff # [µg/mL] Wirkstoff IC50 CD-Wirkstoff-Komplex# [µg/mL] α-CD β-CD γ-CD PHMB 0,11 ± 0,01 0,24 ± 0,09 16,97 ± 1,85 16,36 ± 2,06 5,90 ± 1,13 6,00 ± 1,06 0,77 ± 0,24 0,78 ± 0,16 CHX 0,91 ± 0,00 0,88 ± 0,11 36,43 ± 1,51 38,87 ± 0,46 111,18 ± 5,77 117,50 ± 2,16 312,94 ± 25,50 265,14 ± 27,52 170,25 ± 24,90 173,64 ± 22,25 737,35 ± 0,00 625,84 ± 17,21 2387,50 ± 216,75 3505,16 ± 336,23 8200,90 ± 3955,95 8760,25 ± 3660,27 Iod MLN-Messung (1.Wert, in blau dargestellt); BacTiter-Glo™-Assay (2.Wert, in rot dargestellt) # Bei der Beurteilung des antimikrobiellen Effektes ist ein niedriger IC50-Wert wünschenswert, da dies auf eine hohe antimikrobielle Aktivität in den Anwendungskonzentrationen schließen lässt. 40 Baumwollstoffe mit unterschiedlicher Ausstattung: A ausgerüstet mit β‐ CD/Iod, B ausgerüstet mit β‐CD /PHMB und C ausgerüstet mit β‐CD/CHX A B C 41 Prüfung der mit CD‐Wirkstoff‐Komplexen ausgerüsteten textilen Materialien auf antimikrobielle Aktivität nach dem JIS L 1902:2002 Escherichia coli Escherichia coli 120 stark 8 100 m ikrobielles W achstum [% ] R ed u ktio n d es m ikro b iellen W ach stu m s [lo g cfu ] 10 6 signifikant stark 4 2 80 *** 60 40 20 0 *** 0 Polyester Baumwolle (BW) BW+β-CD BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX BW+β-CD/Iod 42 Polyester Baumwolle (BW) BW+β-CD BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX BW+β-CD/Iod Prüfung der mit CD‐Wirkstoff‐Komplexen ausgerüsteten textilen Materialien auf antimikrobielle Aktivität nach dem JIS L 1902:2002 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 120 100 stark m ikrob ielles W ach stum [% ] 8 stark 6 stark 4 2 ** 80 ** 60 40 20 leicht *** 0 0 Polyester Baumwolle (BW) BW+β-CD BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX Polyester BW+β-CD/Iod Baumwolle (BW) K o n tro lle 10 mikrobielles Wachstum [log cfu] R e d u k tio n d e s m ik ro b ie lle n W a c h s tu m s [lo g c fu ] 10 A lg in a t A lg in a t + io n is c h e s S ilb e r 8 A lg in a t + n a n o k ris ta llin e s S ilb e r 6 4 2 0 0 5 10 15 I n k u b a t io n s z e it [ h ] 43 20 25 BW+β-CD *** BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX BW+β-CD/Iod Prüfung der mit CD‐Wirkstoff‐Komplexen ausgerüsteten textilen Materialien auf antimikrobielle Aktivität nach dem JIS L 1902:2002 Candida albicans Candida albicans 120 100 8 m ikrobielles W achstum [% ] R ed uktion d es m ikrob iellen W achs tum s [log ] 10 stark 6 4 signifikant 2 80 *** 60 40 20 0 Polyester Baumwolle (BW) BW+β-CD BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX *** 0 BW+β-CD/Iod Polyester 44 Baumwolle (BW) BW+β-CD BW+β-CD/PHMB BW+β-CD/CHX BW+β-CD/Iod Prüfung der mit CD‐Wirkstoff‐Komplexen ausgerüsteten textilen Materialien auf antimikrobielle Aktivität nach dem JIS L 1902:2002 Baumwolle unbehandelt + β-CD +β-CD/PHMB +β-CD/CHX +β-CD/Iod Wirkung gegen S. aureus E. coli C. albicans Reduktion [log cfu] 0,09 0,14 0,18 Inhibition [%] 98,7 ± 2,2 98,3 ± 0,8 97,3 ± 2,5 Beurteilung keine keine keine Reduktion [log cfu] 0,99 0 0 Inhibition [%] 85,8 ± 2,3 104,1 ± 1,2 102,9 ± 1,8 Beurteilung leicht keine keine Reduktion [log cfu] 6,96 8,07 6,50 Inhibition [%] 100 100 100 Beurteilung stark stark stark Reduktion [log cfu] 6,96 3,20 2,37 Inhibition [%] 100 60,4 ± 3,7 63,5 ± 3,7 Beurteilung stark stark signifikant Reduktion [log cfu] 3,51 2,57 0,22 Inhibition [%] 49,6 ± 11,5 68,2 ± 22,8 96,7 ± 2,0 Beurteilung stark signifikant keine 45 In‐vitro‐Testmethoden Bindungsvermögen Bindungsvermögen für fürMediatoren Mediatoren Bindungsassays Bindungsassaysfür für Proteasen (Elastase, MMP-2, Proteasen (Elastase, MMP-2, MMP-13) MMP-13)und undZytokine Zytokine(IL-1β, (IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6) TNF-α, IL-8, IL-6) Antioxidative AntioxidativeWirkung Wirkung Assays Assayszur zurMessung Messungder der Inhibition Inhibitionreaktiver reaktiverSauerstoffSauerstoffund undStickstoffspezies Stickstoffspezies Antimikrobielle Antimikrobielle Wirksamkeit Wirksamkeit Bestimmung Bestimmungder derHemmung Hemmung des Wachstums des Wachstumsvon von Mikroorganismen nach Mikroorganismen nachdem dem JIS JISLL1902:2002 1902:2002und undder der DIN DINEN ENISO ISO27027 27027 Biofunktionalit ät Biofunktionalität WachstumsfaktorWachstumsfaktorAssay Assay Bindungskapazität Bindungskapazitätund und Wiederfreisetzung von Wiederfreisetzung von PDGF-BB PDGF-BB Bestimmung Bestimmungder der biologischen biologischenWirksamkeit Wirksamkeit auf aufhumane humaneFibroblasten Fibroblasten Co-Kultur-Modell Co-Kultur-Modell Anforderung Anforderungan anWundverbände Wundverbände Biokompatibilit ät Biokompatibilität Zellkultur Zellkultur Infektion Infektionvon vonHaCaTHaCaTKeratinozyten Keratinozytenmit mit Staphylococcus Staphylococcusaureus aureus zur zurTestung Testungder der antibakteriellen Aktivität antibakteriellen Aktivität ininAnwesenheit Anwesenheitvon von humanen Zellen humanen Zellen Bestimmung Bestimmungder derProliferation Proliferationvon vonhumanen humanen Keratinozyten,HaCaT-Zellen und Fibroblasten Keratinozyten,HaCaT-Zellen und Fibroblasten(zelluläres (zelluläresATP, ATP, dsDNA, dsDNA,Protein) Protein) Messung Messungvon vonNekrose Nekrose(LDH) (LDH)und undApoptose Apoptose(Caspase (Caspase8,8, Caspase 9, Caspase 3/7) Caspase 9, 46Caspase 3/7) Evaluierung Evaluierungder derinflammatorischen inflammatorischenWirkung Wirkung(IL-6, (IL-6 IL-8) IL-8) Biochemische Charakterisierung chronischer Wunden im Wundsekret ► hohe Konzentrationen an Proteasen [Wiegand C. et al. (2010) Arch Dermatol Res (6) 419-28 ] 47 Untersuchung mit dem CD‐PHMB‐Komplex ausgerüsteter Stoffproben auf Hemmung der Elastase‐Aktivität PP-Elastase-Aktivität nach Inkubation von 0,1 U/mL PP-Elastase mit 2 0,5 cm Textilproben (MoBiTec EnzChek) PP-Elastase-Aktivität nach Inkubation von 0,1 U/mL PP-Elastase mit 2 0,16 0,14 0,14 PP-Elastase-Aktivität [U/mL] 0,16 0,12 0,1 Kontrolle Baumwolle (Überstand) 0,08 Baumwolle (Eluat) 0,06 0,04 0,12 Kontrolle 0,1 0,08 Baumwolle + βCD (Überstand) 0,06 Baumwolle + βCD (Eluat) 0,04 0,02 0,02 0 0 0 5 10 15 20 25 0 30 5 10 PP-Elastase-Aktivität nach Inkubation von 0,1 U/mL PP-Elastase mit 2 0,5 cm Textilproben (MoBiTec EnzChek) 0,14 0,12 0,1 Kontrolle 0,08 Baumwolle + βCD-PHMB (Überstand) 0,06 Baumwolle + βCD-PHMB (Eluat) 0,04 0,02 0 0 15 20 Inkubationszeit [h] Inkubationszeit [h] PP-Elastase-Aktivität [U/mL] PP-Elastase-Aktivität [U/mL] 0,5 cm Textilproben (MoBiTec EnzChek) 5 10 15 20 25 Inkubationszeit [h] 48 30 25 30 Die Rolle von ROS/RNS in der Wundheilung Erhöhung der bakteriziden Aktivität Modulation von Vasodilatation, Reepithelisierung, Umbau extrazellulärer Matrix Überproduktion involviert in der Pathogenese entzündlicher Reaktionen und Wundheilungsstörungen Nichtradikalische Spezies Singulett-Sauerstoff 1O2 Peroxynitrit OONOWasserstoffperoxid H2O2 Mitochondrien 49 Radikale Superoxidradikalanion O2·Hydroxylradikal OH● Stickstoffmonoxid NO● Peroxidradikale ROO● Antioxidative Eigenschaften von Wundmaterialien N-(Ethoxycarbonyl)-3-(4morpholinyl)-sydnonimin (SIN-1) 100 Peroxynitrit: ONNO- Peroxynitrit (RNS) Superoxid-Anion (ROS) Inhibition freier Radikale [%] 80 60 40 20 Superoxid-Anion: O2•- 0 Kollagen Bakteriencellulose Alginat Xanthin/Xanthinoxidase [Wiegand C et al. (2006) Cellulose 13:689-696, Wiegand C et al. (2009) Wound Rep Reg 17:511-21] 50 Chitosan Untersuchung mit CD‐Wirkstoff‐Komplexen ausgerüsteter Stoffproben auf antioxidative Wirkung 2 Antioxidative Wirkung - ROS 2 Baumwolle (0,2cm ) in Abhängigkeit von ihrer Ausrüstung (ABEL Antioxidant Test mit Pholasin) Antioxidative Wirkung von Baumwolle (0,2cm ) auf Peroxynitrit in Abhängigkeit von ihrer Ausrüstung (ABEL Antioxidant Test mit Pholasin) 120 Antioxidative Wirkung [% Inhibierung] Antioxidative Wirkung [% Inhibierung] 120 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 0 0 unbehandelt βCD βCD-PHMB βCD-CHX unbehandelt βCD-Iod βCD βCD-PHMB Baumwolle Baumwolle 51 βCD-CHX βCD-Iod Zusammenfassung Cyclodextrine • Antiseptika bilden Komplexe mit Cyclodextrinen • Verbesserte Zellkompatibilität der Komplexe • Alle untersuchten CD-Wirkstoff-Komplexe waren antimikrobiell wirksam, es traten jedoch Unterschiede im Verhältnis zwischen dem IC50 gegenüber Mikroorganismen und humanen Zellen auf (Verhältnis für PHMB – α = 1:120, β = 1:60, γ = 1:60; für CHX – α = 1:19, β = 1:9, γ = 1:20; für Iod – α = 1:3, β = n.d., γ = n.d.) • Ausgezeichnete Übereinstimmung von MLN und BacTiter-Glo™ • Der mit einem β-CD-PHMB-Komplex ausgerüstete Baumwollstoff zeigt eine • sehr gute antimikrobielle Wirksamkeit, • eine gute antioxidative Wirkung und • Hemmung der Elastase-Aktivität 52 Danksagung AIF-Projekt 15997 BG – Forschungskuratorium Textil e.V. „Textilien für die kosmetische und pharmazeutische Nutzung“ 53
