Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für kleine Klauentiere und
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Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik und Institut für Pathologie ___________________________________________________________________________ Experimentelle Untersuchungen zur Pathogenität von Brachyspira innocens, Brachyspira murdochii und Brachyspira intermedia im Vergleich zur Brachyspira-hyodysenteriae-Infektion INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Tuyet Le Nguyen Thi aus Hanoi, Vietnam Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Michael Wendt Prof. Dr. Baumgärtner 1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Wendt 2. Gutachter: Prof. Dr. Josef Kamphues Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2008 Die vorliegende Arbeit wurde von der Vietnamesischen Regierung gefördert. Meinen Eltern und meiner Familie in Liebe und Dankbarkeit INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 18 2. SCHRIFTTUM 20 2.1 Taxonomie und allgemeine Eigenschaften der Brachyspiren 20 2.1.1 Taxonomie 20 2.1.2 Allgemeine Eigenschaften der Brachyspira-Arten 21 2.2 Brachyspira hyodysenteriae 23 2.2.1 Phenotypische Charakterisierung 23 2.2.2 Genetische Eigenschaften 24 2.2.3 Virulenzfaktoren 26 2.2.4 Schweinedysenterie 29 2.2.4.1 Epidemiologie 29 2.2.4.2 Pathogenese 31 2.2.4.3 Klinische Erscheinungen 32 2.2.4.4 Pathologie 32 2.2.4.5 Immunität 34 2.2.4.6 Diagnose 35 2.3 Weitere intestinale Brachyspiren beim Schwein 36 2.3.1 Brachyspira pilosicoli 36 2.3.2 Brachyspira innocens 37 2.3.3 Brachyspira intermedia 38 2.3.4 Brachyspira murdochii 39 2.4 Auslösende Faktoren für das klinische Bild der Schweinedysenterie 40 2.4.1 Stress auslösende Faktoren 40 2.4.2 Rolle des Futters 41 3. MATERIAL UND METHODEN 44 3.1 Versuchstiere 44 3.2 Futterration 45 3.3 Behandlung 46 3.3.1 Immunsuppressive Behandlung 46 3.3.2 Antiinfektive Behandlung 47 3.4 Brachyspira-Stämme 47 3.4.1 Asservierung der Brachyspira-Stämme 48 3.4.2 Reaktivierung der Brachyspira-Stämme 48 3.5 Infektionsmodell 49 3.5.1 Verwendete Medien für die Vorbereitung der Brachyspira-Suspension 49 3.5.2 Herstellung der Brachyspira-Infektionssuspension 49 3.5.3 Verdünnungsreihe für die Kontrolle der Infektionsdosis 51 3.5.4 Intragastrale Infektion der Schweine mit Brachyspiren 52 3.6 Versuchsdesign 53 3.6.1 Vorversuch 53 3.6.2 Versuch 1: Infektionsversuche mit Dexamethason-Behandlung 54 3.6.3 Versuch 2: Infektionsversuche mit Fütterung einer proteinreichen Ration („Sojafutter“) 56 3.6.4 Ablauf der Untersuchungen 58 3.7 Klinische Untersuchung 59 3.8 Mikrobiologische Untersuchung 60 3.8.1 Probenentnahme 60 3.8.2 Untersuchung auf Brachyspiren 60 3.8.2.1 Anlegen der Kulturen und Ablesen der Platten 60 3.8.2.2 Differenzierung der Brachyspira-Isolate 61 3.8.3 Untersuchung auf Salmonellen 63 3.8.4 Untersuchung auf hämolysierende E. coli 64 3.8.5 Untersuchung auf Lawsonia intracellularis 64 3.9 Sektion 65 3.9.1 Gewinnung von Probenmaterial und pathomorphologische Untersuchung 65 3.9.2 Histologische Untersuchung 67 3.10 Untersuchung klinisch-chemischer Parameter aus Blut- und Harnproben 70 3.10.1 Untersuchung von Blutparametern 70 3.10.2. Untersuchung von Harnparametern 71 3.10.3. Auswertung 73 3.11 Statistische Auswertung 74 4. ERGEBNISSE 76 4.1 Ergebnisse der Untersuchungen auf Brachyspiren 76 4.1.1 Vorversuch 76 4.1.2 Versuch 1 - Infektionsversuche mit Dexamethason-Behandlung 77 4.1.3 Versuch 2 - Infektionsversuch unter zusätzlicher Fütterung von Sojaextraktionsschrot 4.1.4 79 Vergleich der Ergebnisse bei der mit Dexamethason behandelten Gruppe (Versuch 1) und der mit „Sojafutter“ gefütterten Gruppe (Versuch 2) 81 4.2 Ergebnisse der klinische Untersuchung 82 4.2.1 Vorversuch 82 4.2.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) 85 4.2.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 87 4.2.4 Vergleich des Einflusses einer Dexamethason-Behandlung (Versuch 1: Kontrollfutter + Dexamethason-Gabe) und einer Sojaextraktionsschrot-Fütterung (Versuch 2: „Sojafutter“ ohne Dexamethason-Gabe) auf die Entwicklung klinischer Erscheinungen bei B.-hyodysenteriae-infizierten Schweinen 89 4.3 Ergebnisse zur täglichen Gewichtszunahme und zum Futteraufwand 90 4.3.1 Vorversuch 90 4.3.2 Versuch 1 (Kontrollfutter + Dexamethason-Behandlung) 91 4.3.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 92 4.3.4 Vergleich zwischen der täglichen Gewichtzunahme in Versuch 1 (Dexamethason- Behandlung) und in Versuch 2 („Sojafutter“) 93 4.4 Ergebnisse der pathologischen Untersuchung 94 4.4.1 Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung 94 4.4.2 Pathohistologische Untersuchung 98 4.4.2.1 Vorversuch 98 4.4.2.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) 102 4.4.2.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 105 4.5 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchung und der Nierenfunktionsprüfung 113 4.5.1 Vorversuch 113 4.5.1.1 Hämatologische Untersuchung 113 4.5.1.2 Nierenfunktionsparameter 113 4.5.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) 119 4.5.2.1 Hämatologische Untersuchung 119 4.5.2.2 Nierenfunktionsparameter 119 4.5.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 123 4.5.3.1 Hämatologische Untersuchung 123 4.5.3.2 Nierenfunktionsparameter 123 5. DISKUSSION 128 5.1 Vorversuch 128 5.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) 132 5.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 140 5.3.1 Infektion mit B. hyodysenteriae 140 5.3.2 Pathogenität der geprüften schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten 142 5.4 Veränderungen der hämatologischen Parameter und Nierenfunktionsparameter 146 5.4.1 Hämatologische Parameter 147 5.4.2 Nierenfunktionsparameter 148 5.5 Schlussfolgerungen 152 6. ZUSAMMENFASSUNG 154 7. SUMMARY 157 8. LITERATURVERZEICHNIS 160 9. ANHANG 199 TABELLENVERZEICHNIS Tab. 1: Die Zusammensetzung der experimentell verwendeten Futtermittelrationen 45 Tab. 2: Verwendete Brachyspiren-Stämme 48 Tab. 3: Nahrungskarenz für die Infektion 52 Tab. 4: Vorversuch: Infektionsversuche mit B. hyodysenteriae unter verschiedenen Fütterungs- und Behandlungsmethoden Tab. 5: Versuch 1: Infektionsversuche mit verschiedenen Brachyspiren-Arten bei Behandlung der Tiere mit Dexamethason Tab. 6: 55 Versuch 2: Infektionsversuche mit verschiedenen Brachyspiren-Arten bei Einsatz einer proteinreichen Ration („Sojafutter“) Tab. 7: 53 57 Beurteilung der klinischen Scores für die Parameter Rektaltemperatur, Kotkonsistenz, Allgemeinbefinden und Futteraufnahme 59 Tab. 8: Kulturell-biochemische Differenzierung der Brachyspira-Spezies 62 Tab. 9: Score für die makroskopische Bewertung der Dickdarmschleimhaut und des Darminhaltes 66 Tab.10: Histologischer Bewertungsscore für alle Dickdarmabschnitte 69 Tab. 11: In Blut und Plasma analysierte Messgrößen, dazugehörige Untersuchungsmethodik und Variationskoeffizienten (Vk) Tab. 12: Im Harn analysierte Messgrößen, dazugehörige Untersuchungsmethodik und Variationskoeffizienten (Vk) Tab. 13: 72 Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben Tab. 14: 71 76 Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae sowie mit B. innocens, B. intermedia und B. murdochii nach Dexamethason-Gabe (Versuch 1): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben Tab. 15: 78 Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae sowie mit B. innocens, B. intermedia und B. murdochii bei Einsatz des „Sojafutters“ (Versuch 2): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben 80 Tab. 16: Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) Tab. 17: 84 Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 1: Kontrollfutter + Dexamethason-Behandlung) Tab. 18: Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 2: „Sojafutter“) Tab. 19: 86 88 Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) Tab. 20: 90 Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 1: Kontrollfutter + Dexamethason-Gabe) Tab. 21: 91 Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 2: „Sojafutter“) Tab. 22: 92 Ergebnisse der pathologisch-anatomischen Untersuchung (Gesamtscore für vier Dickdarmabschnitte) nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) sowie nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 1 und 2) Tab. 23: 94 Ergebnisse der histologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Vorversuch nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, †† =p<0,001) 99 Tab. 24: Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) nach experimenteller Infektion mit verschiedenen Brachyspira-Arten (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05) Tab. 25: 103 Ergebnisse der pathohistologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Versuch 2 („Sojafutter“) nach experimenteller Infektion mit verschiedenen Brachyspira-Arten (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, Tab. 26: †† =p<0,001) 107 Mittelwerte und Standardabweichungen verschiedener Blutparameter von mit B.-hyodysenteriae- infizierten Schweinen aus dem Vorversuch und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe aus dem Vorversuch Tab. 27: 116 Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparameter von mit B.-hyodysenteriae-infizierten Tieren und Tieren aus der Negativ-Kontrollgruppe aus dem Vorversuch Tab. 28: Mittelwerte und Standardabweichung verschiedener Blutparameter von Schweinen aus dem Versuch 1 Tab. 29: 117-118 120 Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparameter von Tieren aus dem Versuch 1 (Mittelwerte und Standardabweichungen, x+s) Tab. 30: Mittelwerte und Standardabweichungen verschiedener Blutparameter von Schweinen aus dem Versuch 2 („Sojafutter“) Tab. 31: 121-122 125 Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparameter von Tieren aus dem Versuch 2 („Sojafutter“; Mittelwerte und Standardabweichungen, x+s) 126-127 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 1: Schematische Darstellung der Fütterung und Dexamethason-Behandlung 46 Abb. 2: Darstellung der Verdünnungsreihe für die Kontrolle der Infektionsdosis 52 Abb. 3: Schema der Untersuchung auf Salmonella spp. 63 Abb. 4: Vergleich des prozentualen Anteiles der Brachyspira-positiven Proben im zeitlichen Verlauf nach der Infektion in Versuch 1 Abb. 5: Vergleich des prozentualen Anteiles der Brachyspira-positiven Proben im zeitlichen Verlauf nach der Infektion in Versuch 2 Abb. 6: 79 81 Prozentsatz der Brachyspira-positiven Schweine nach experimenteller Infektion in Versuch 1 (Kontrollfutter + Dexamethason) und Versuch 2 („Sojafutter“ ohne Dexamethason-Gabe) Abb. 7: 82 Vergleich der Mittelwerte der klinischen Scores nach experimenteller B.- hyodysenteriae-Infektion bei der Dexamethason-behandelten Gruppe (Versuch1) und der „Sojafutter“-Gruppe (Versuch 2; Wilcoxon two-sample Test; ††=p<0,001) Abb. 8: 89 Einfluss der Dexamethason-Behandlung und Sojaschrot-Fütterung auf die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme (kg, x+s) nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*), p<0,01 (=†) und p<0,001 (=††) Abb. 9: 93 Makroskopischen Veränderungen am proximalen Kolon eines mit B.- hyodysenteriae-infizierten Schweines (Vorversuch, Dexamethason-Behandlung, Zustand nach 11 Durchfalltagen). Die Mukosa erscheint hyperämisch mit multifokalen Nekrosen und fibrinösen Belägen (fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend Score 3, s. 3.9.1) 95 Abb. 10: Makroskopische Veränderungen bei einem Schwein, das mit dem B.-hyodysenteriae-Feldstamm 7304/03 (Zustand nach 13 Durchfalltagen, Versuch 2) infiziert wurde. Die Schleimhaut ist bedeckt mit einer gelben Pseudomembran und zeigt oberflächliche flache Nekrosen (hochgradige fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend mit dem Score 3, s. 3.9.1) 96 Abb. 11: Makroskopische Veränderungen am proximalen Kolon eines Schweines 4 Tage nach Durchfallbeginn (B.-hyodysenteriae-Feldstamm 7304/03, Versuch 2): hyperämische Schleimhaut mit Fibrinauflagerungen (mittelgradige fibrinöse Kolitis entsprechend Score 2, s. 3.9.1) Abb. 12: 97 Makroskopische Veränderungen am distalen Kolon 3 Tage nach Durchfallbeginn (B. hyodysenteriae Referenzstamm B204, Versuch 2): verdickte Mukosa, bedeckt mit festhaftenden Belägen (hochgradige fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend Score 3, s. 3.9.1) Abb. 13: 97 Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier 11 Tage nach Durchfallbeginn (Vorversuch, Dexamethason-Behandlung). Distales Kolon (H.E., Vergrößerung 40fach). Nekrose an der Schleimhautoberfläche mit Fibrin und Gewebedetritus (Pfeile), Dilatation von Krypten (Sterne) und moderate zelluläre Infiltration der Lamina propria (Pfeilkopf) Abb. 14: 100 Distales Kolon (H.E. Vergrößerung 20fach). Unveränderte Darmschleimhaut bei einem Schwein der Negativ-Kontrollgruppe (Vorversuch) 100 Abb. 15: Vergleich der histologischen Veränderungen an den vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die mit B. hyodysenteriae im Vorversuch infiziert wurden, und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (Gesamtscore für eine Darmlokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *p<0,05, †† p<0,001 101 Abb. 16: Vergleich der histologischen Veränderungen an vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die experimentell mit B. hyodysenteriae, B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Versuch 1 infiziert wurden und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (Gesamtscore für eine Darmlokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05 Abb. 17: 104 Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 5 Durchfalltagen (Versuch 1, Dexamethason-Behandlung). Distales Kolon (H.E., Vergrößerung 40fach): die Schleimhaut zeigt eine geringgradige Hyperämie mit Fibrinauflagerungen (Sterne) und gering- bis mittelgradigen Ulzerationen (Pfeile) an der Schleimhautoberfläche sowie eine mittelgradige gemischtzellige Infiltration der Lamina propria (Pfeilkopf). Abb. 18: 105 Vergleich der histologischen Veränderungen an vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die experimentell mit B. hyodysenteriae, B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Versuch 2 („Sojafutter“) infiziert wurden, und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (histologischer Score für eine Darmlokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, ††=p<0,0001 Abb. 19: 106 Vergleich der histologischen Veränderungen an vier verschiedenen Darmabschnitten zwischen mit 2 unterschiedlichen B.-hyodysenteriaeStämmen (Referenzstamm B204, n=10; Feldstamm 7304/03, n=5) infizierten Versuchstieren aus dem Versuch 2. („Sojafutter“). Gleiche Buchstaben kennzeichnen statistisch nicht signifikante Unterschiede (p>0,05) Abb. 20: 108 Vergleich der histologischen Veränderungen zwischen B.-hyodysenteriaeinfizierten Tieren im Vorversuch (Dexamethason-Behandlung, n=5) und im Versuch 2 („Sojafutter“, n=15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, †=p<0,01, †† =p<0,001 109 Abb. 21: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 3 Durchfalltagen (Versuch 2 „Sojafutter“, Referenz-Stamm B 204). (A): Proximales Kolon (H.E., Vergrößerung 40fach): hochgradige, tiefe Ulzeration mit hochgradiger Infiltration von Entzündungszellen (Pfeile). (B): Proximales Kolon, (H.E,. Vergrößerung 100fach): Fibrinauflagerung im Bereich der erodierten Mukosa mit hochgradiger Infiltration von Entzündungszellen in der Lamina propria (Stern), Kryptdilatation, Krypten gefüllt mit neutrophilen Granulozyten (Kryptabszess) (Pfeilkopf) und Mukus (Pfeile) Abb. 22: 110 Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 13 Durchfalltagen (Versuch 2 „Sojafutter“, Feldstamm 7304/04). Distales Kolon (H.E,. Vergrößerung 100fach): Fibrinauflagerung (*) an der erodierte Schleimhautoberfläche, hochgradiger Dilatation von mit Mukus gefüllten Krypten (Pfeile) sowie hochgradiger Infiltration von Entzündungszellen in der Lamina propria Abb. 23: 111 Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-murdochii-infizierten Tier (Versuch 2 „Sojafutter“, Stamm S11287, Dänemark). Proximales Kolon, (H.E., Vergrößerung 200fach): hochgradige Fibrinauflagerung (*) und Ulzeration (Pfeil) der Schleimhaut sowie mittel- bis hochgradige Infiltration von Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen in der Lamina propria mucosa 111 Abb. 24: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-innocens-infizierten Tier (Versuch 2 „Sojafutter“, Stamm 1569/05). A: Proximales Kolon, (H.E., Vergrößerung 100fach): mittelgradige Dilatation der Krypten (Pfeile) sowie eine mittelgradige Infiltration von Lymphozyten mit einzelnen eosinophilen Granulozyten (Stern). B: Proximales Kolon (H.E., Vergrößerung 200fach), geringgradige. Fibrinauflagerung (Pfeil) ohne Ulzeration an der Schleimhautoberfläche 112 Abkürzungsverzeichnis Abb. = Abbildung Lpm = Lamina propria mucosae Aqu. dest. = Aqua destillata log = logarithmische Arcsin = arcsin (sqrt) Transformation B. = Brachyspira BHI = brain heart infusion BHZP = BundeshybridzuchtProgramm BIT = Brachyspira iron Transport BPLS = BrilliantgrünPhenolrot-Laktose Transformation Max. = Maximum MCHC = mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration mgr. = mittelgradig Min. = Minimum mitt. Kolon = mittleres Kolon ml = Milliliter n = Anzahl der Tiere NADH = Nicotinsäureamid- BSA = Bovines Serum Albumin bzw. = beziehungsweise Dexa. = Dexamethason dist. Kolon = distales Kolon o.b.B. = ohne besonderen Befund DMAC = Dimethyl- o = Grad Celsius OD = Optical density Aminocinamaldehyd Adenin-Dinucleotid NSP = Nicht-StärkePolysaccharide C E. coli = Escherichia coli o.g. = oben genannt et al. = et alii p. inf. = post infektionem FA = Futteraufwand PBS = Phosphat-gepufferte FISH = Fluoreszenz-in-situHybridisierung Salzlösung PCR = PolymeraseKettenreaktion FE = fraktionelle Exkretion incl. = inclusive JSR-Hybrid = Schweinezucht GmbH KbE/ml = Koloniebildende PCV2 = Porzines Circovirus Typ 2 Einheiten pro Milliliter PIS = Porzine Intestinale Kreat.-Clear. = Kreatinin-Clearance PCS = Porcine Colonic Spirochaetosis Spirochätose Pl = Plasma-Konzentration spez. Gew. = spezifisches Gewicht prox. Kolon = proximales Kolon spp. = species PSC = Porcine Spirochaetal s.u. = siehe unten Tab. = Tabelle Colitis RNA = ribonucleic acid TSA = Trypticase soy agar RS = resistente Stärke TZ = tägliche s. = siehe S. = Serpulina U = Harnkonzentration SCFA = kurzkettige Fettsäuren VFA = flüchtige Fettsäuren Gewichtszunahme (short chain fatty acids) (volatile fatty acids) SD = Schweinedysenterie vs = versus SES = Sojaextraktionsschrot x±s = Mittelwert ± Schw. = Schwein sNSP = lösliche Nicht-StärkePolysaccharide s.o. = siehe oben Standardabweichung z.T. = zum Teil Einleitung 1. EINLEITUNG Bei der Gattung Brachyspira (früher Serpulina, Treponema) handelt es sich um intestinale Spirochäten, die von erheblicher Bedeutung in der Veterinärmedizin sind. Einige Arten verursachen Durchfallerkrankungen und schlechte Wachstumsraten beim Schwein. Die bekannteste Spezies ist Brachyspira (B.) hyodysenteriae (STANTON et al. 1991; STANTON 1992; OCHIAI et al. 1997), der Erreger der Schweinedysenterie, der eine mukohämorrhagische Typhlocolitis verursachen und dadurch zu großen wirtschaftlichen Verlusten führen kann. Neben B. hyodysenteriae sind schwach hämolysierende Brachyspiren beschrieben worden wie B. innocens (KINYON u. HARRIS 1979), B. pilosicoli (TROTT et al. 1996), B. murdochii (STANTON et al. 1997) und B. intermedia (STANTON et al. 1997). B. pilosicoli wird für die sogenannte Spirochätendiarrhoe bei Schweinen, bei Vögeln und auch bei Menschen verantwortlich gemacht (GIRARD et al. 1995; TROTT et al. 1996; HAMPSON 2000). Die pathogene Bedeutung von B. intermedia, B. murdochii und B. innocens bei Schweinen ist hingegen bislang noch nicht endgültig geklärt, im Allgemeinen werden diese 3 BrachyspirenArten als apathogene Kommensalen im Darm des Schweines angesehen (KINYON u. HARRIS 1979; STANTON et al. 1997; VERSPOHL et al. 2001). Einige Autoren konnten jedoch diese Brachyspiren-Arten bei an Durchfall erkrankten Schweinen nachweisen, ohne einen direkten kausalen Zusammenhang darstellen zu können. Auch gelang ein Nachweis einer Invasion dieser Spirochäten in das Oberflächenepithel, was mit Anzeichen einer Colitis einherging (HUDSON et al. 1976; SPEARMAN et al. 1988; FELLSTRÖM u. GUNNARSSON 1995; JENSEN 2005; JENSEN u. BOYE 2005; WEISSENBÖCK et al. 2005). Krankheitsbilder, die mit diesen Erregern in Verbindung gebracht wurden, werden kollektiv als Porcine Spirochaetal Colitis (PSC) bezeichnet (HAMPSON u. TROTT 1995; TAYLOR u. TROTT 1997). Bei der experimentellen Infektion mit B.-innocens-Feldisolaten konnten NEEF et al. (1994) eine Typhlocolitis mit schleimiger Kotkonsistenz bei gnotobiotischen Ferkeln erzeugen. JENSEN et al. (2005) provozierten bei Absetzferkeln eine katarrhalische Colitis nach experimenteller Infektion mit einem dänischen B.-murdochii- Feldisolat. 18 Einleitung Darüber hinaus wird B. intermedia als pathogener Erreger bei Hühnern beschrieben (MCLAREN et al. 1997; FELLSTRÖM et al. 1999; SURIYAARCHCHI et al. 2000). Auch in Deutschland gibt es Hinweise darauf, dass B. innocens, B. murdochii und B. intermedia möglicherweise mit Durchfallerkrankungen beim Schwein im Zusammenhang stehen könnten. So berichteten ROTHKAMP et al. (2005) vom Untersuchungsgut des Institutes für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, in dem neben B. hyodysenteriae auch die schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten B. innocens, B. murdochii und B. intermedia regelmäßig aus Kotproben von Schweinen im nordwestdeutschen Raum in den Jahren 2002-2004 isoliert wurden. Danach enthielten von 1740 Brachyspira-positiven Proben 33,7 % B. hyodysenteriae, 3,3 % B. pilosicoli, 35,2 % B. innocens, 19,3 % B. murdochii und 7,4 % B. intermedia. Die 3 letzteren BrachyspirenArten wurden dabei auch aus Proben mit dem Vorbericht einer Durchfallproblematik isoliert, ohne dass weitere bakterielle Durchfallerreger isoliert werden konnten. Aus diesem Grunde sollten in der vorliegenden Arbeit solche potenziell krankmachenden Stämme mittels experimenteller Infektion bei Variation von Fütterungs- und Haltungsbedingungen auf ihre Pathogenität für das Schwein im Vergleich zu einer experimentellen B.-hyodysenteriae-Infektion überprüft werden. 19 Schrifttum 2. SCHRIFTTUM 2.1 Taxonomie und allgemeine Eigenschaften der Brachyspiren 2.1.1 Taxonomie Die Gattung Brachyspira gehört zu der Familie Brachyspiraceae. Diese Familie bildet zusammen mit den Familien Spirochaetaceae und Leptospiraceae die Ordnung Spirochaetales (OLSEN et al. 2000; PASTER u. DEWHIRST 2000). Die Mitglieder der Gattung Brachyspira werden von anderen Spirochäten aufgrund ihrer 16S-rDNA-Sequenz differenziert. Bisher sind für Brachyspiren die sieben Arten beschrieben worden: B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. murdochii, B. innocens, B. pilosicoli, B. alvinipulli und B. aalborgi. Zusätzlich sind zwei weitere Arten, B. pulli und B. canis, vorgeschlagen worden, aber sie wurden bislang noch nicht offiziell akzeptiert (FELLSTRÖM 2003; HAMPSON u. LA 2006). Darüber hinaus berichteten RÅSBÄCK et al. (2007) kürzlich über eine neue Art in der Gattung Brachyspira, die mit Hilfe der 16S-rRNA- und nox-GenSequenz differenziert und vorläufig als „Brachyspira suanatina“ sp. nov. bezeichnet wurde. Diese Art konnte sowohl aus Schweinen als auch aus Wildenten (Anas platyrhynchos) isoliert werden. Basierend auf Untersuchungen mittels Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE) Analyse wurden die intestinalen Spirochäten in sieben Gruppen unterteilt (LEE et al. 1993a,b; LEE u. HAMPSON 1994; STANTON et al. 1996). Gruppe I beinhaltet B.-hyodysenteriae-Stämme, während B.-intermedia-Isolate zu der Gruppe II gehören. B.-innocens-, B.-murdochii- und B- pilosicoli-Stämme sind jeweils der Gruppe III, V bzw. VI zuzuordnen. Gruppe IV besteht aus B. alvinipulli, einem Isolat aus einem Huhn, während B. aalborgi, beim Menschen vorkommend, die Gruppe VII vertritt. Aus Schweinen isolierte BrachyspirenStämme können auch in Bezug auf ihre biochemischen Eigenschaften (Hämolyse, Indolbildung, Hippurathydrolyse, Aktivitäten der α-Galaktosidase, α- und ß-Glucosidase) differenziert werden (FELLSTRÖM et al. 1995, FELTRUP et al. 1999a). Die biochemische Zuordnung zu den 5 Brachyspira-Spezies: B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. murdochii, B. innocens und B. pilosicoli konnte auf genetischer Basis durch 16S-rDNA-Sequenzanalyse 20 Schrifttum und Makrorestriktionsanalyse weitgehend bestätigt werden (PETTERSSON et al. 1996; FELTRUP et al. 1999b). Eine weitere Möglichkeit der Differenzierung der 5 beim Schwein vorkommenden Brachyspiren-Arten besteht in der auf einer Polymerase-Kettenreaktion basierenden Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-(RFLP)-Analyse des nox-Gens (ROHDE et al. 2002). B. hyodysenteriae und B. innocens wurden zunächst der Gattung Treponema zugeordnet, dann aber in die Gattung Serpula und kurz darauf in die Gattung Serpulina (S.) überführt (STANTON et al. 1991; STANTON 1992). B. pilosicoli wurde zunächst als Anguillina coli bezeichnet, später als Serpulina coli bzw. Serpulina pilosicoli beschrieben (DUHAMEL et al. 1993; TROTT et al. 1996). OCHIAI et al. (1997) führten S. hyodysenteriae, S. innocens und S. pilosicoli in B. hyodysenteriae, B. innocens und B. pilosicoli über. Diese neuen Namen wurden in der Validation List No. 64 berücksichtigt (OCHIAI et al. 1998). STANTON et al. (1997) beschrieben S. intermedia und S. murdochii als weitere intestinale Spirochäten, nach einer Reklassifizierung von HAMPSON und LA (2006) wurden S. murdochii und S. intermedia in B. murdochii und B. intermedia geändert. 2.1.2 Allgemeine Eigenschaften der Brachyspira-Arten Die ökologische Nische für alle bekannten Brachyspira-Arten ist der untere Verdauungstrakt (Zäkum und Kolon), in dem sie den intestinalen Mukus oder die Epithelzellen besiedeln. Brachyspiren sind gramnegative, spiralförmige Bakterien mit einer für Spirochäten typischen Zellstruktur und einem speziellen Bewegungsapparat. Die Zellstruktur besteht aus einer mehrschichtigen äußeren Hülle, die den sogenannten „protoplasmatischen Zylinder“ mit Zytoplasma, Organellen und einem Kernäquivalent umgibt. Brachyspiren zeichnen sich aus durch ein Bewegungsvermögen mittels periplasmatischen Flagellen, die zwischen äußerer Hülle und dem Protoplasmazylinder liegen (HOVIND-HOUGEN et al. 1990; HOLT et al. 1994). Ihre Motilität ist in einem viskösen Milieu besonders hoch und kommt durch schlangen- oder schraubenartige Bewegung zustande (CANALE-PAROLA 1984). Der Durchmesser und die Länge der Brachyspiren variieren zwischen den unterschiedlichen Arten. Ihr Durchmesser liegt zwischen 0,19-0,40 µm, die Länge zwischen 2,0-14,0 µm. Die 21 Schrifttum Zahl der periplasmischen Flagellen kann 4 bis 14 an jedem Ende des protoplasmatischen Zylinders betragen (SELLWOOD u. BLAND 1997). Brachyspiren sind Sauerstoff-tolerante, anaerob wachsende Spirochäten. Sie können Sauerstoff durch die NADH-Oxidase umwandeln (STANTON 1997). Die Kultivierung gelingt entweder auf nährstoffreichen Nährböden mit Serum- oder Blutzusatz oder in FlüssigNährmedien wie Trypticase-Soja-Bouillon, Brain-Heart-Infusion-Bouillon mit Serumzusatz (BHIS) sowie Heart-Infusion-Bouillon (STANTON u. CORNELL 1987; STANTON u. LEBO 1988). Die Anzucht der Brachyspiren gelingt bei 42°C und unter anaeroben Bedingungen mit weniger als 1% O2 (BINEK u. SZYNKIEWICZ 1984; STANTON 1997). Auf Nährböden mit Blutzusatz erscheint nach drei bis sieben Tagen Inkubation ein sichtbares schwärmendes Wachstum in Form eines dünnen Films mit verschiedenen Hämolyse-Formen in Abhängigkeit von der Brachyspira-Art (SELBITZ 2002). Brachyspira-Spezies können anhand ihrer kulturmorphologischen Eigenschaften nicht differenziert werden (BECKMANN 1990), jedoch aufgrund des Hämolyse-Vermögens (LEE et al. 1993a; FELLSTRÖM et al. 1995). Zur Isolierung von Brachyspiren aus Kotproben und Darminhalt werden zur Hemmung der Begleitflora bestimmte Selektiv-Medien, z.B. mit Spectinomycin oder einer Mischung von Spectinomycin, Colistin und Vancomycin, verwendet (ACHACHA u. MESSIER 1992; DUHAMEL u. JONES 1994; DÜNSER et al. 1997). Falsch negative Ergebnisse in der Kultur hängen häufig mit einer falschen Probenbehandlung in der Zeit zwischen Entnahme und Kultur zusammen (WALDMANN et al. 2000). Zur Differenzierung der fünf für das Schwein relevanten Brachyspira-Arten werden nach Isolierung in Reinkultur kulturell-biochemische Methoden mit der Beurteilung des Hämolysevermögens, der Aktivität von α-Galactosidase, α- und ß-Glucosidase, der Indolbildung sowie der Fähigkeit zur Hippuratspaltung durchgeführt (FELLSTRÖM u. GUNNARSSON 1995; TROTT et al. 1996; STANTON et al. 1997; FELTRUP et al. 1999a) (Tabelle 8). Nach den Untersuchungsergebnissen von FELLSTRÖM et al. (1997), STANTON et al. (1997) und FELTRUP et al. (1999a) steht ein Schema zur kulturellbiochemischen Differenzierung von Brachyspira-Spezies zur Verfügung. LEMCKE und BURROWS (1981) führten einen indirekten Fluoreszenzantikörpertest (IFAT) zur Diagnose der Schweinedysenterie (B. hyodysenteriae) durch, der aber eine mangelhafte 22 Schrifttum Sensitivität aufwies. Eine Studie von WALDMANN et al. (2000) zur Prüfung des Verfahrens der indirekten Immunfluoreszenztechnik zum Nachweis von Brachyspiren mittels eines polyklonalen Antikörpers zeigte, dass Brachyspiren zwar zuverlässig in Kotproben nachgewiesen werden konnten, jedoch eine Differenzierung der verschiedenen BrachyspiraArten aufgrund der Kreuzreaktionen mit diesem Verfahren nicht möglich ist. Auch verschiedene andere direkte und indirekte Methoden zum Nachweis von B. hyodysenteriae und schwach hämolysierenden Brachyspiren wie Objektträgeragglutination, MikrotiterAgglutinationstest, Immunodiffusionstest oder Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) haben sich in der Routinediagnostik nicht durchgesetzt, weil keine eindeutige Differenzierung wegen häufiger Kreuzreaktionen gelang, eine hohe Anzahl falsch-positiver Ergebnisse auftrat oder bei erhöhter Spezifität eine verminderte Sensitivität beobachtet wurde (AMTSBERG et al. 1984; TAYLOR 1992; DUHAMEL u. JOENS 1994; LEE u. HAMPSON 1996; TROTT et al. 2000; HAMPSON et al. 2000). Größere Bedeutung für den Erregernachweis und die Differenzierung der für das Schwein bedeutsamen Brachyspira-Arten haben mittlerweile molekulargenetische Methoden wie DNA-Sonden oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erlangt, mit denen Brachyspiren schneller identifiziert und falsch negative Ergebnisse bei der Kultur, z.B. im Falle nicht mehr vermehrungsfähiger Erreger, vermieden werden können. Doch die Sensitivität einer PCR zum direkten Nachweis von B. hyodysenteriae aus der Matrix Kot ist im Vergleich zur Kultur um den Faktor 1000 geringer (RÄSBÄCK et al. 2006). Weiterführende molekulare Charakterisierungen dienen darüber hinaus der Differenzierung zwischen und innerhalb der verschiedenen Brachyspira-Spezies und der Darstellung phylogenetischer Verwandtschaften (JENSEN 1997). 2.2 Brachyspira hyodysenteriae 2.2.1 Phenotypische Charakterisierung Brachyspira (B.) hyodysenteriae wurde erstmals 1971 isoliert und 1972 als Treponema hyodysenteriae beschrieben (TAYLOR u. ALEXANDER 1971; GLOCK u. HARRIS 1972). Der Erreger wurde später der neuen Gattung Serpula (STANTON et al. 1991), darauf der 23 Schrifttum Gattung Serpulina (STANTON 1992) zugerechnet und aktuell basierend auf 16S-rRNASequenzanalysen der Gattung Brachyspira zugeordnet (OCHIAI et al. 1997). B. hyodysenteriae ist ein relativ großer Spirochät mit einem Durchmesser von 320-380 nm und einer Länge von 6–8,5 µm. Das Bakterium besitzt 7-14 Endoflagellen an jedem Zellende (STANTON 1997). Bei älteren Kulturen oder unter suboptimalen Wachstumsbedingungen zeigt sich B. hyodysenteriae nicht nur in Form von schlanken, spiralförmigen Bakterien, sondern auch als sogenannte „spherical bodies“ (SELLWOOD u. BLAND 1997; WOOD et al. 2006). Diese „spherical bodies“ sind wahrscheinlich eine adaptive Überlebensform bei ungünstigen Umweltbedingungen (WOOD et al. 2006). B. hyodysenteriae lässt sich mit der Gram-Färbung relativ schlecht darstellen. Zur mikroskopischen Untersuchung eignen sich besser Silberimprägnierungstechniken (POHLENZ et al. 1983). Auf Nährböden mit Blutzusatz fällt B. hyodysenteriae durch eine starke ß-Hämolyse auf (SELBITZ 2002). Andere biochemische Eigenschaften sind in Tabelle 8 dargestellt (FELLSTRÖM et al. 1997; FELTRUP et al. 1999a; VERSPOHL et al. 2001). 2.2.2 Genetische Eigenschaften Das Genom von B. hyodysenteriae besteht aus einem einzigen ringförmigen Chromosom mit einer Größe von etwa 3,2 Mbp (ZUERNER u. STANTON 1994; ZUERNER 1997). Eine Reihe von Genorten wurden auf der physischen und genetischen Genomkarte des Typstammes B. hyodysenteriae B78 lokalisiert (ZUERNER u. STANTON 1994; HSU et al. 2001; ZUERNER et al. 2004): die kodierenden Gene für die 16S- und 23S-rRNA (STANTON et al. 2001), für die Flagella-Proteine flaA, flaB (KOOPMANN et al. 1992; KOOPMANN et al. 1993; ROSEY et al. 1996), für die Hämolysine tlyA, tlyB, tlyC, hlyA (MUIR et al. 1992; TER HUURNE et al. 1994), und für die NADH-Oxidase (nox) (STANTON u. JENSEN 1993; STANTON et al. 1995). Mehrer Autoren beschreiben das Vorkommen von Plasmiden (COMBS et al. 1992; ADACHI et al. 1994; BULLER u. HAMPSON 1994), doch HUMPHREY et al. (1995) vermuten, dass die DNA-Fragmente durch die Induktion des lysogenen Phagen VSH-1 entstanden sein könnten. Eine Reihe von Membranlipoprotein-Genen wie das 16kDa smpA-Gen (=bmpA-Gen oder bhlp16), das 17,6kDa smpB-Gen (=bhlp17,6) und das 29,7 kDa bmpB-Gen (= blpA-Gen oder 24 Schrifttum bhlp29,7) wurden gefunden und kloniert (THOMAS u. SELLWOOD 1993; CULLEN et al. 2003; HAMPSON et al. 2006; HOLDEN et al. 2006). Das smpB-Gen konnte ungefähr bei 50 % der untersuchten Stämme von B. hyodysenteriae gefunden werden, Stämme enthielten entweder das smpA-Gen oder das smpB-Gen, aber nicht beide zugleich. Das smpB-Gen liegt am gleichen Ort wie das smpA-Gen, die Majorität des Leserahmens zeigt jedoch keine signifikante Ähnlichkeit (HOLDEN et al. 2006). MCCAMAN et al. (2003) identifizierten bei B. hyodysenteriae 2 Gen-Cluster mit jeweils 4 Genen (vspA-D und vspE-H), die für homologe 39kDa-Oberflächenproteine (Vsp39 = variable surface proteins) kodieren. Es wird angenommen, dass diese Oberflächenproteine eine Rolle in der antigenetischen Variation spielen können, da jeweils nur einzelne der Proteine exprimiert werden (CULLEN et al. 2003; MCCAMAN et al. 2003; HAMPSON et al. 2006; WITCHELL et al. 2006). Ein mglB-Gen, das bei B. pilosicoli für das Glucose-Galactose Lipoprotein MglB kodiert (ZHANG et al. 2000) und eine Bedeutung für die Chemotaxis haben könnte, wurde auch bei B.-hyodysenteriae- und B.-innocens-Stämmen identifiziert (WALKER et al. 2003). ROTHKAMP (2003) beschreibt für B. hyodysenteriae ein aus mehreren Genen bestehendes, Fructose-spezifisches Phosphotransferase-Operon, das möglicherweise auch wichtig für die Chemotaxis ist. Weiterhin untersuchten DUGOURD et al. (1999) eine Genom-Region von B. hyodysenteriae, die für ein Eisen-Transportsystem (BIT: Brachyspira Iron Transport system) kodiert und bei B. pilosicoli und B. innocens nicht vorhanden ist. Jedoch konnte keine bedeutsame Differenz bei der Amplifikation von BIT-Genen zwischen pathogen und wenig bzw. apathogenen B.-hyodysenteriae-Feldstämmen festgestellt werden, so dass dem BIT-System keine Bedeutung als Virulenzfaktor beigemessen wurde (WALKER et al. 2003). Ein Ferritin-Protein (FtnA), für das ein ftnA-Gen kodiert, wurde zur Impfung gegen B. hyodysenteriae in einem Mäusemodell eingesetzt. Die Vakzination konnte jedoch die Mäuse nicht vor einer Erkrankung schützen (DAVIS et al. 2005). B.-hyodysenteriae-Zellen enthalten einen lysogenen Prophagen (VSH-1), der auch Genmaterial des Bakteriums beherbergen kann. VSH-1 ist in der Lage, Gene zwischen B.-hyodysenteriae-Zellen zu transferieren (gene transfer agent) und kann damit zur genetischen Diversität des Erregers beitragen. Auch Antibiotika-Resistenzgene können auf diese Weise übertragen werden (HUMPHREY et al. 1995; STANTON et al. 2005). 25 Schrifttum 2.2.3 Virulenzfaktoren Die Ausprägung klinischer Erscheinungen nach Infektion mit B. hyodysenteriae ist alters- und dosisabhängig. Latente Infektionen sind häufig anzutreffen (SONGER u. HARRIS 1978). Über mögliche Virulenzfaktoren von B. hyodysenteriae liegen bislang nur wenige Informationen vor. Verschiedene Autoren berichten über eine ausgeprägte Variabilität der Virulenz unter aus dem Feld isolierten B.-hyodysenteriae-Stämmen (LYSONS et al. 1982; LEE et al. 1993a; ACHACHA et al. 1996; THOMSON et al. 2003). Experimentelle Infektionen bei gnotobiotischen Ferkeln lassen darauf schließen, dass B. hyodysenteriae seine Virulenz besonders im Synergismus mit anderen Bakterien, wie z.B. Bacteroides vulgatus, Fusobacterium necrophorum und Clostridium spp. entwickeln kann (WHIPP et al. 1979; POHLENZ et al. 1983). Eine Übersicht zu den zusammen mit B. hyodysenteriae bei experimenteller Infektion verabreichten Bakterienarten geben HARRIS und GLOCK (1981). Chemotaxis, Motilität und Adhäsion B. hyodysenteriae zeigt eine starke Beweglichkeit im intestinalen Mukus und weist eine hohe Affinität zu intestinalem Mukus auf, der sich auf dem Epithel und in den Krypten befindet. Diese Affinität wird durch Chemotaxis vermittelt. L-Fucose und L-Serin, beides Bestandteile der Mucus-Glykoproteine sind dabei starke Chemoattraktantien (KENNEDY u. YANCEY 1996). MILNER und SELLWOOD (1994) zeigten, dass virulente B.-hyodysenteriae-Stämme ein stärkeres chemotaktisches Verhalten aufwiesen als avirulente Stämme und B.-intermedia-, B.-pilosicoli- und B.-innocens-Stämme. B. hyodysenteriae kann sich effektiv mit hoher Geschwindigkeit durch visköses Material wie Muzin bewegen (KENNEDY et al. 1988). Die ausgeprägte Motilität wird durch periplasmatische Flagellen gegeben und kann die Penetration des Erregers bis zur Mukosa erleichtern. Experimentelle Mutationen an den für die Flagella-Proteine kodierenden Genen konnte die Motilität des Erregers deutlich einschränken (ROSEY et al. 1996; KENNEDY et al. 1997; GABE et al. 1998). Chemotaxis und Motilität sind damit wichtige Faktoren für die Besiedlung des Mukus durch den Erreger. 26 Schrifttum WILCOCK und OLANDER (1979) berichteten, dass B. hyodysenteriae sich in vitro an die Oberfläche einer Anzahl von verschiedenen Zelllinien anheften konnte. Im Gegensatz dazu fanden KENNEDY et al. (1988) keinen Beweis für eine Adhäsion an das Kolonepithel des Schweines. Es werden jedoch häufig Erreger in Epithelzellen, besonders in Becherzellen, und in der Lamina propria bei erkrankten Schweinen festgestellt. Ob Adhäsion bzw. Invasion der Mukosazellen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Läsionen spielen, ist bislang ungeklärt (GLOCK et al. 1974). Hämolysin Die starke Hämolyse von B. hyodysenteriae auf Blutagarplatten ist eine wichtige Eigenschaft, um den Erreger in der Routinediagnostik zu identifizieren. Erythrozyten können als eine Quelle für Cholesterin und Lipide das Wachstum von B. hyodysenteriae begünstigen (STANTON 1987). Die genaue Rolle von Hämolysin in der Pathogenese der Dysenterie ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt worden. Für ein Hämolysin von B. hyodysenteriae wurde die Zytotoxizität für Enterozyten sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen (KENT et al. 1988; LYSONS et al. 1991; MUIR et al. 1992). LYSONS et al. (1991) demonstrierten Schädigungen der Epithelzellen in Dünn- und Dickdarm von gnotobiotischen Ferkeln nach Inokulation des Hämolysins. Vier verschiedene Hämolysingene, tlyA, tlyB, tlyC und hlyA sind kloniert und sequenziert worden (MUIR et al. 1992; TER HUURNE et al. 1992, 1994; HSU et al. 2001). Die Studie von WALKER et al. (2003) zeigte auf, dass die Hämolysingene tlyA, tlyB and tlyC sowie hlyA auch bei schwach oder nicht pathogenen B.-hyodysenteriae-Feldstämmen nachzuweisen waren. HYATT et al. (1994) zeigten mit einer tlyA-Negativ-Mutante eine verringerte Enteropathogenität nach experimenteller Infektion von Schweinen im Gegensatz zu dem tlyA-positiven Stamm. NADH-Oxidase (NOX), Sauerstoff-Metabolismus Brachyspiren sind anaerobe Spirochäten, die jedoch zu einem gewissen Grad Sauerstofftolerant sind, da sie Sauerstoff durch die NADH-Oxidase zu Wasser reduzieren können. Diese 27 Schrifttum Eigenschaft ist von großer Bedeutung, um sich vor der Sauerstofftoxizität während der Kolonisation des Darmes zu schützen, da intestinales Gewebe Sauerstoff absondern kann. Bei nox-Mutanten mit stark reduzierter NOX-Aktivität wurde im Vergleich zum Wildtyp eine herabgesetzte Virulenz beobachtet (STANTON et al. 1999). Endotoxin (Lipopolysaccharid) Das aus der Zellwand von B. hyodysenteriae extrahierte Lipopolysaccharid (LPS) unterscheidet sich in der Zusammensetzung von dem LPS von E. coli oder Salmonella spp. und wurde deshalb auch als Lipooligosaccharid (LOS) bezeichnet (HALTER u. JOENS 1988, JOENS 1997). Eine Reihe von Autoren machen LPS/LOS für die Entstehung von Darmläsionen verantwortlich (NUESSEN et al. 1983; ALBASSAM et al. 1985). GREER und WANNEMUEHLER (1989a; 1989b) demonstrierten, dass LPS/LOS die Produktion entzündlicher Mediatoren (Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor) induziert und damit an der Entzündungsreaktion im Darm beteiligt sein dürfte. Auch im Mäuseversuch ergaben sich Hinweise auf die Beteiligung an Darmalterationen (NUESSEN et al. 1983; NIBBELINK u. WANNEMÜHLER 1991). GREER und WANNEMUEHLER (1989a) konnten jedoch keinen Unterschied in der biologischen Aktivität des LPS/LOS von B. hyodysenteriae und von B. innocens belegen. Jedoch zeigten andere Autoren, dass es einen Unterschied zwischen der biologischen Aktivität des Lipooligo-/Lipopolysaccharids von B. hyodysenteriae und von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae gibt (SCHMALL et al. 1983). Membranproteine und Lipoproteine der äußeren Zellmembran Die äußere Zellmembran kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese der B.-hyodysenteriaeInfektion spielen, da über sie eine Verbindung zwischen dem Erreger und der Wirtsschleimhaut hergestellt wird (WITCHELL et al. 2005). Die äußere Zellmembran von B. hyodysenteriae enthält verschiedene Membranproteine wie Vsp39 = variable surface proteins = Bhmp39 oder Smp (= Bmp, Bhlp), die eine Rolle dabei spielen können, der Immunabwehr des Wirtes zu entgehen und so chronische Infektionen hervorzurufen (MCCAMAN et al. 1999; TROTT et al. 2001; MCCAMAN et al. 2003). Das Lipoprotein SmpA von B. hyodysenteriae wird in vivo während der frühen Besiedlungsphase exprimiert 28 Schrifttum (THOMAS u. SELLWOOD 1992, 1993). Für die Membranproteine sind 8 kodierende Gene (vspA-H) bekannt. Es werden jeweils nur einzelne der Proteine exprimiert, was eine Rolle bezüglich der Antigen-Variation spielen kann (GABE et al. 1998; MCCAMAN et al. 1999; MCCAMAN et al. 2003; WITCHELL et al. 2005, 2006) 2.2.4 Schweinedysenterie B. hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie (SD). Die infektiöse Durchfallerkrankung kann alle Altersklassen betreffen, tritt jedoch besonders bei Absetzferkeln, Läufer- und Mastschweinen auf. Bei Zuchttieren und Saugferkeln ist die Erkrankung wesentlich seltener anzutreffen (WALDMANN 1992; WALDMANN u. PLONAIT 1997; JACOBSON et al. 2004; MERIALDI et al. 2005). Bei Wildschweinen wurden Brachyspira spp. bislang nicht nachgewiesen (JACOBSON et al. 2005). B. hyodysenteriae verursacht eine mukofibrinöse, hämorrhagische bis diphteroid- nekrotisierende Entzündung der Zäkum- und Kolonschleimhaut (POHLENZ 1991). SD wurde zuerst in Indiana, USA durch WHITING et al. (1921) beschrieben. 50 Jahre nach der ersten Beschreibung der Erkrankung konnte der Erreger der SD kulturell isoliert werden (TAYLOR u. ALEXANDER 1971) und wurde als Treponema hyodysenteriae bezeichnet (HARRIS et al. 1972). Die Erkrankung hat sich im klinischen Krankheitsbild im Laufe der Jahre nicht verändert und verursacht bedeutsame wirtschaftliche Verluste, die vor allem durch verminderte Gewichtszunahmen, längere Mastdauer und erhöhte Behandlungskosten entstehen (PRIEKSAT 2000). 2.2.4.1 Epidemiologie SD kommt weltweit in allen Ländern mit einer intensiven Schweineproduktion vor (HARRIS u. LYSONS 1992; FELLSTRÖM 2005). Es werden Herdenprävalenzen angegeben, die zwischen 10 % und 33 % liegen (HAMPSON 2000). Andere Studien berichten von Prävalenzen von 0 % bis 38,2 % (FELLSTRÖM et al. 1996, CARVAJAL et al. 2003) für B. hyodysenteriae, 0 % - 12,5 % für B. intermedia (FELLSTRÖM et al. 1996, STEGE et al. 2000), 2,7 % - 74 % für B. innocens (HEINONEN et al. 2000, MERIALDI et al. 2003). Ein 29 Schrifttum Trend zur Zunahme der Prävalenz von B. hyodysenteriae wurde durch MERIALDI et al. (2005) beschrieben. Das Schwein ist der Hauptwirt von B. hyodysenteriae und die wichtigste Infektionsquelle für andere Schweine. Latent infizierte Carrier-Tiere, die neu in einen Bestand verbracht werden, sind die häufigste Ursache für Neuausbrüche. Symptomlos infizierte Muttersauen müssen als häufige Ansteckungsquelle für die Ferkel angesehen werden. Neben dem Schwein stellen Schadnager auch ein ständiges Erregerreservoir dar (HARRIS 1982; BLAHA et al. 1984; DUHAMEL et al. 1992; FELLSTRÖM et al. 2004). Außerdem wurde B. hyodysenteriae bei Nandus (Rhea americana) mit nekrotisierender Typhlitis (SAGARTZ et al. 1992; JENSEN et al. 1996; BUCKLES et al. 1997), Wildenten (Anas platyrhynchos) (JANSSON et al. 2004, RÅSBÄCK et al. 2007), Hunden (WEGENER 1987) und Eintagsküken (SUEYOSHI u. ADACHI 1990) nachgewiesen. Die Infektion erfolgt entweder durch die perorale Aufnahme des Erregers mit dem Kot erkrankter oder latent infizierter Trägertiere oder über ein mit dem Erreger kontaminiertes Futter oder Wasser. Eine Übertragung durch andere belebte und unbelebte Vektoren (z.B. Personal, Gülle oder Fahrzeuge) ist auch zu berücksichtigen. Die Inkubationszeit beträgt durchschnittlich 6-14 Tage. Im Experiment können jedoch erste Symptome schon früher sichtbar sein (TAYLOR 1999; SOMCHIT et al. 2003). Die Erregerausscheidung über den Kot beginnt zwei Tage post infectionem (WALDMANN 1992; FELLSTRÖM 1996b). Die Morbidität kann bis zu 90% und die Letalität bei unbehandelten Tieren 50% erreichen (FELLSTRÖM 1996a). Zum klinischen Ausbruch der Dysenterie tragen resistenzmindernde Faktoren, wie z.B. Stallund Futterwechsel, Stressfaktoren, Managementfehler, Mängel in der Hygiene, ungünstiges Stallklima oder Überbelegung bei (HARRIS 1982; JACOBSON et al. 2004). B. hyodysenteriae zeigt eine variable Tenazität unter verschiedenen Umweltbedingungen. Die Überlebensdauer außerhalb des Darmes wird bei Wärme, Trockenheit oder erhöhtem Sauerstoffgehalt erheblich reduziert. CHIA und TAYLOR (1978) berichten, dass der Erreger im Kot an Dysenterie erkrankter Schweine bei Lagerung zwischen 0 und 10°C bis 48 Tage, nach Verdünnung mit Wasser (1:10) bei 5°C sogar bis zu 61 Tage überlebte. Mit zunehmender Temperatur reduzierte sich die Überlebenszeit (bis 7 Tage bei 25°C, max. 24 Stunden bei 37°C). Nach BOYE et al. (2001) überlebte der Erreger im Erdboden bei 10°C 30 Schrifttum über 10 Tage, bei Zusatz von Schweinekot 78 Tage und in Schweinekot allein über 112 Tage. Eine Studie von BARCELLOS et al. (2002) ergab, dass das durchschnittliche Überleben von B. hyodysenteriae in Kotproben bei 4°C 4,25 Tage, bei 24°C 2 Tage und bei 37°C 0,25 Tage betrug. 2.2.4.2 Pathogenese Die Mechanismen der Kolonisation von B. hyodysenteriae im Darm sind bisher noch nicht eindeutig geklärt (JENSEN et al. 1998). Die Fähigkeit zur Kolonisation von B. hyodysenteriae hängt von vielen Faktoren ab (siehe Kapitel 2.2.3 u. 2.4.). Zunächst wird B. hyodysenteriae mit dem kontaminierten Kot aufgenommen und wird bei der Magenpassage vor der Magensäure durch Schleim in dem dysenterischen Kot geschützt (TAYLOR 1995; HAMPSON et al. 1997). Die Brachyspiren dringen in die das Darmepithel bedeckende Mukusschicht ein und gelangen in die Krypten der Dickdarmschleimhaut. Dort beginnen sie sich innerhalb von zwei Stunden nach Aufnahme zu vermehren und provozieren eine übermäßige Schleimsekretion. Sie sind anschließend in defekten Becher- und Epithelzellen zu finden. Ob Adhäsion und Invasion auch an intakten Darmzellen stattfinden, ist unzureichend geklärt (GLOCK et al. 1974; KENNEDY et al. 1988). Durch Verlust des Oberflächenepithels werden Blutgefäße freigelegt und es kann zu Hämorrhagien kommen. Weitere Folgen sind eine Entzündung mit Schleimhautödem und muko-fibrinöser Exsudation im Bereich der Zäkum- und Kolonmukosa (POHLENZ et al. 1983; POHLENZ 1991). Es wird gemutmaßt, dass das von B. hyodysenteriae gebildete Hämolysin sowie das LOS (s. Kapitel 2.2.3) an der Entstehung der Schleimhautläsionen sowie sekundär auch andere Bakterien oder Protozoen (z.B. Balantidium coli) beteiligt sind, wobei sich das Spektrum der Darmflora deutlich von Gram-positiven zu Gram-negativen Bakterien verschiebt (POHLENZ et al. 1984). Der Durchfall tritt durch die Malabsorption von Wasser, Natrium- und Chloridionen auf, die mit der Zerstörung der epithelialen Transportmechanismen im Kolon zusammenhängt. Der Elektrolyt- und Flüssigkeitsverlust verursacht schließlich die systemische Dehydratation mit Azidose sowie Hyperkaliämie, in deren Folge es zum Tod des Tieres kommen kann (ARGENZIO et al. 1980; WALDMANN u. LINDEMANN 1991). 31 Schrifttum 2.2.4.3 Klinische Erscheinungen Im Anfangsstadium werden die ersten klinischen Anzeichen vor allem bei Einzeltieren beobachtet. Es werden Inappetenz, Appetitlosigkeit sowie häufig ein weicher, hell gefärbter Kot beobachtet (AMTSBERG u. MERKT 1986). Fieber tritt gelegentlich im Bereich von 39,5oC - 40,6oC auf (HARLIZIUS 1993; ALEXANDER 1996; SOMCHIT et al. 2003). Die Infektion breitet sich innerhalb des Bestandes zumeist langsam aus. Im weiteren Verlauf kommt es zum Absatz von breiigem, schleimig-blutigem Kot, der im Weiteren wässrig-schleimig und mit Blut und Fibrinfetzen vermischt ist. Der Kot kann von grau- oder zementfarben bis kakao- oder schokoladenfarben variieren. Vermehrte Schleimproduktion und Blutungen aus den arrodierten Darmwandgefäßen sind die Ursache für die mukohämorrhagische bis fibrinöse Beschaffenheit des Dysenterie-Kotes in der akuten Phase (WALDMANN u. LINDEMANN 1991). Die an Durchfall erkrankten Schweine zeigen eingefallene Flanken aufgrund der schnellen Entleerung des Dickdarmes, sind zunehmend kraftlos, dehydrieren und verlieren an Gewicht. Ohne Behandlung magern die Tiere stark ab, kümmern und können verenden (AMTSBERG u. MERKT 1986; HARRIS u. LYSONS 1992; TER HUURNE u. GAASTRA 1995; WALDMANN u. PLONAIT 1997). Der Durchfall hält in der Regel über 6 bis 10 Tage an. Die erkrankten Tiere können nach ein bis zwei Wochen von selbst ausheilen, aber auch nach Genesung werden die Erreger noch bis zu 10 Wochen ausgeschieden (FISHER u. OLANDER 1981; WALDMANN 1992). Mischinfektionen mit anderen bakteriellen Erregern von Darminfektionen kommen vor, sind aber relativ selten anzutreffen (HERBST et al. 2004; WENDT et al. 2006) 2.2.4.4 Pathologie Makroskopische Veränderungen Die pathologischen Veränderungen sind typischerweise im Zäkum und Kolon, selten auch im Rektum lokalisiert. Die Läsionen beginnen an den zentrifugalen und zentripetalen Windungen nahe der Spitze des Kolons und können sich dann über das ganze Kolon und von Tag 4 an bis zum Zäkum erstrecken. In der akuten Phase können eine Verdickung der Mukosa und der Submukosa mit Hyperämie und Ödembildung, eine vermehrte Sekretion von Schleim, und 32 Schrifttum oberflächliche Nekrose der Mukosa häufig beobachtet werden. Die Veränderungen an der Schleimhautoberfläche entwickeln sich über eine katarrhalische Entzündung zu einer mukohämorrhagischen bis diphtheroid-nekrotisierenden Typhlocolitis. In chronischen Fällen treten darüber hinaus Pseudomembranen bestehend aus Entzündungszellen, Detritus, Fibrin und Mukus auf. Die Lymphknoten erscheinen vor allem hyperplastisch und ödematisiert. Bei klinisch latenten Infektionen zeigen sich lediglich umschriebene Schleimhautrötungen, die mit Schleim bedeckt sind, der Darminhalt weist dann eine normale Konsistenz auf (KINYON et al. 1977; POHLENZ et al. 1983; HARRIS u. LYSONS 1992; DUHAMEL u. JOENS 1994; HAMPSON et al. 1997; JACOBSON et al. 2004). Mikroskopische Veränderungen Die ersten histologischen Veränderungen in der akuten Phase der Dysenterie bestehen aus einer Hyperämie und Ödembildung in der Lamina propria sowie einer Hyperplasie des Kryptepithels. Die Becherzellen in den Krypten zeigen eine Hyperplasie und sind stark mit Mukus gefüllt. Weiterhin treten üblicherweise Nekrosen und Erosionen in Verbindung mit fibrinösen Exsudaten an der Oberfläche der Schleimhaut auf. Dort, wo durch Ablösung des Epithels Blutgefäße freigelegt werden, kann es zu kapillären Blutungen kommen. Die oberflächliche Nekrose der Schleimhaut kann ausgedehnt sein, tiefe Ulzerationen sind jedoch nicht typisch für SD (WILCOCK u. OLANDER 1979; POHLENZ et al. 1983; ALBASSAM et al. 1985; HARRIS u. LYSONS 1992) In der Mukosa und Submukosa finden sich darüber hinaus Infiltrationen mit Leukozyten, zumeist Lymphozyten. Um die Kapillaren nahe dem Lumen werden gehäuft neutrophile Granulozyten beobachtet. In der Folge entstehen Pseudomembranen im Bereich der erodierten Mukosa, die aus nekrotischen Epithelzellen, Fibrin, Leukozyten, Erythrozyten und Bakterien gebildet werden. Brachyspiren befinden sich im Lumen sowie in den Krypten des Epithels und können in Becherzellen und abgestoßenen Epithelzellen sowie in die Lamina propria eindringen. Ultrastrukturelle Veränderungen sind an den Epithelzellen in Form von Alterationen der Mikrovilli, Schwellung der Mitochondrien und des endoplasmatischen Retikulums erkennbar (GLOCK et al. 1974; HARRIS u. LYSONS 1992; JACOBSON et al. 2004; HAMPSON et al. 2006). 33 Schrifttum 2.2.4.5 Immunität Bislang haben sich nur wenige Studien auf die Immunität bezüglich der Schweinedysenterie konzentriert (JONASSON et al. 2004). Schweine, die sich von einer Erkrankung entweder natürlich oder nach medikamenteller Behandlung nach schwerem Krankheitsverlauf erholt haben, sind in einigen Fällen gegen eine erneute Infektion mit B. hyodysenteriae geschützt (JOENS u. GLOCK 1979; HARRIS u. LYSONS 1992). Nach der Studie von JOENS et al. (1983, 1984) und REES et al. (1989) waren genesene Schweine bei nachfolgender experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae für bis zu 17 Wochen geschützt. Ein Teil der Tiere (7 - 43 %) blieben jedoch empfänglich, 10 % der Schweine erlangten erst nach dreimaliger Infektion einen vollständigen Immunschutz. Die Autoren vermuteten, dass diese Immunität LOS-serotypspezifisch ist. Nur wenige Untersucher berichten über einen Schutz gegen heterologe Serotypen. Dies könnte ein Hinweis dafür sein, dass auch andere Komponenten des Bakteriums für den Immunschutz verantwortlich sind (NUESSEN u. JOENS 1982). Einige Autoren beschreiben eine B-zellvermittelte humorale Immunantwort mit spezifischen IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern im Serum und eine lokale Produktion von IgA im Gewebe der Schleimhaut, das gegen die äußeren Membranproteine und Lipopolysaccharide von B. hyodysenteriae gerichtet ist. Die humoralen Antikörper korrelieren jedoch nur wenig mit einem Immunschutz gegen B. hyodysenteriae (JOENS u. GLOCK 1979; ADACHI et al. 1984; REES et al. 1989). Nach JACOBSON et al. (2004) kann der Erreger im Darm von Schweinen ohne die Stimulierung des Immunsystems persistieren, und die Tiere sind später für eine neue Infektion voll empfänglich. WATERS et al. (2000) identifizierten eine Proliferation von CD8+ααCD4--Zellen bei Schweinen nach experimentell erzeugter Dysenterie und stellten die These auf, dass diese Zellen einen Einfluss auf die Genesung der Tiere besitzen sowie eine protektive Wirkung haben könnten. Weiterhin weisen die Studien von JONASSON et al. (2004, 2006) darauf hin, dass die Empfänglichkeit für eine Dysenterie-Erkrankung von der vor Infektion vorhandenen Lymphozyten-Subpopulation abhängt. Bei nach experimenteller Infektion erkrankten Tieren konnte zuvor eine vermehrte Zirkulation von γδ-T-Zellen und eine nur geringe Menge von CD8+-Zellen und CD4+CD8--T-Zellen nachgewiesen werden. Ein Anstieg von Monozyten 34 Schrifttum und CD4+CD8+-T-Zellen konnte als wesentliche Lymphozytenantwort während der Erkrankung beobachtet werden. HONTECILLAS et al. (2005) stellten einen auffälligen CD4+-T-Zell-Respons nach Infektion mit B. hyodysenteriae fest. 2.2.4.6 Diagnose Eine Verdachtsdiagnose kann aufgrund der klinischen Erscheinungen und des Sektionsbildes gestellt werden. Differentialdiagnostisch müssen Darmerkrankungen bedacht werden, die ein ähnliche Erscheinungsbild besitzen, wie die porzine proliferative Enteropathie (PPE, verursacht durch Lawsonia intracellularis), Colidiarrhoe, Salmonellose und porzine Coronavirus-Infektionen (BAUMANN u. BILKEI 2002). Auch die porzine intestinale Spirochätose (PIS, porcine colonic spirochaetosis PCS), verursacht durch B. pilosicoli, muss in Betracht gezogen werden (DUFRESNE 1998). Der Nachweis von B. hyodysenteriae in Kot- oder Darmproben wird in der Routinediagnostik aufgrund der kulturell-biochemischen Untersuchung (s. 2.1.2 u. Tab. 8) durchgeführt. Die für das Schwein relevanten Brachyspira-Arten haben jedoch einige gemeinsame biochemische Eigenschaften und es ist von einigen atypischen Resultaten berichtet worden (THOMSOM et al. 2001; FOSSI et al. 2004). Außerdem misslingt der Nachweis oft, wenn die Erregermenge zu gering ist oder die Brachyspiren in der Probe nicht mehr vermehrungsfähig sind (WALDMANN et al. 2000). Aus diesem Grund wird heute vielfach auf Diagnoseverfahren mittels PCR-Methode (Polymerase Chain Reaction) übergegangen. Zahlreiche PCR-basierte Systeme für den Nachweis von B. hyodysenteriae wurden in den letzten Jahren entwickelt. Diese Systeme basieren auf dem Nachweis des 23S-rRNA Gens (LESER et al. 1997; THOMSON et al. 2001), des nox-Gens (ATYEO et al. 1999; LA et al. 2003, 2006) oder des tlyA-Gens (FELLSTRÖM et al. 2001; RÅSBÄCK et al. 2006). Während ein Nachweis aus Kulturmaterial problemlos ist, können Schwierigkeiten bei der DNAIsolierung den Direkt-Nachweis aus der Kotprobe erschweren (HUE 2005). Der mikroskopische Nachweis von Spirochäten im Kot anhand der charakteristischen Spiralform mittels Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie erlaubt nur eine Verdachtsdiagnose (HARRIS u. GLOCK 1981). Die Anwendung eines direkten oder indirekten Immunfluoreszenz-Antikörpertests (IFAT) bereitet in der Regel ebenfalls 35 Schrifttum Probleme, da bei Nutzung polyklonaler Antikörper häufig Kreuzreaktionen mit den anderen Brachyspiren-Arten auftreten (FELTRUP 1998; WALDMANN et al. 2000). Die Verwendung monoklonaler Antikörper zur immunomagnetischen Separierung des Erregers konnte die Sensitivität gegen über der Kultur bzw. der PCR nicht verbessern (CORONA-BARRETA et al. 2004). Der Nachweis von Spirochäten in Gewebeschnitten gelingt mit klassischen Färbemethoden, wie z.B. die Warthin-Starry-Silberfärbung, jedoch ist keine Differenzierung möglich. Die Entwicklung von immunhistochemischen Methoden basierend auf monoklonalen Antikörpern für den spezifischen Nachweis von Brachyspiren ist ebenfalls schwierig wegen der starken Kreuzreaktionen unter den Brachyspiren-Arten (JENSEN 2005). Zur Identifizierung der Brachyspiren in formalinfixierten, paraffineingebetteten intestinalen Gewebeproben wurde die Anwendung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit gegen 16S- oder 23S-rRNA gerichteten Oligonucleotid-Sonden als eine einfache, kostengünstige und verlässliche Methode vorgeschlagen (JENSEN 2005). Effektive serologische Methoden für die Erfassung von Antikörpern gegen B. hyodysenteriae sind derzeit nicht verfügbar (FELLSTRÖM 2005). 2.3 Weitere intestinale Brachyspiren beim Schwein 2.3.1 Brachyspira pilosicoli Brachyspira (B.) pilosicoli, eine schwach hämolysierende Brachyspiren-Art, ist der Erreger der porzinen intestinalen Spirochätose (PIS, porcine colonic spirochaetosis PCS), welche vor allem bei Ferkeln 1-2 Wochen nach dem Absetzen auftritt, aber auch bei Mastschweinen und selten bei Zuchttieren (TAYLOR 1992; DUHAMEL et al. 1993; GIRARD et al. 1995; TROTT et al. 1996). PIS ist eine Schweinedysenterie-ähnliche, aber milder verlaufende Darmerkrankung. Die betroffenen Schweine können latent infiziert sein oder zeigen milden, wässrig-schleimigen Durchfall, der Kot ist grün-braun und meist ohne Blutbeimengungen. Klinisch können außerdem Fieber, schlechtere Futterverwertung und mangelnde Gewichtszunahmen mit verlängerter Mastdauer beobachtet werden. Die Schweine genesen oft nach mehreren Tagen, die Mortalität ist in der Regel gering (DUHAMEL et al. 1996; TROTT et al. 1996; HAMPSON u. DUHAMEL 2006). Ein typischer Befund bei der PIS ist der 36 Schrifttum sogenannte „falsche Bürstensaum“ (false brush border) an der Schleimhautoberfläche. Damit wird die Adhäsion der Spirochäten umschrieben, die mit einem Ende am Kolonepithel festsitzen und dabei einen dichten Rasen bilden (TAYLOR et al. 1980; SPEARMAN et al. 1988; DUHAMEL et al. 1993; GIRARD et al. 1995). Als wesentliche pathohistologische Veränderung wird eine katarrhalische, erosive bis ulzerative Colitis genannt, bei der die Schleimhaut verdickt und ödematös ist. Die Krypten sind dilatiert und verlängert sowie mit Mukus und Zelldetritus gefüllt (HAMPSON u. DUHAMEL 2006). B. pilosicoli kann ebenfalls eine intestinale Spirochätose bei Menschen (TRIVETT-MOORE et al. 1998; JENSEN et al. 2001), bei Geflügel (STEPHENS u. HAMPSON 2002; SHIVAPRASAD u. DUHAMEL 2005) und bei Hunden (DUHAMEL et al. 1998; FELLSTRÖM et al. 2001) verursachen. Außerdem wurde B. pilosicoli beim Pferd isoliert (HAMPSON et al. 2006). Zur Differenzierung von B. pilosicoli von anderen Brachyspira-Arten können die kulturellbiochemische Methode und PCR-basierende Systeme verwendet werden B. pilosicoli zeigt die Fähigkeit zur Hippuratspaltung und α-Galaktosidase-Aktivität (Tab. 8) (FELTRUP et al. 1999a). Jedoch berichteten FOSSI und SKRZYPCZAK (2005), dass einige B.-pilosicoli-Stämme Hippurat-negativ sind. 2.3.2 Brachyspira innocens B. innocens ist eine schwach hämolysierende Brachyspira-Art, die im Schweinekolon vorkommt und als apathogen gilt (KINYON u. HARRIS 1979). Schon früh haben Autoren bereits dargestellt, dass einige Spirochäten, die bei Fällen von Schweinedysenterie isoliert worden sind, trotz gleicher Morphologie und serologischer Kreuzreaktivität nicht mit B. hyodysenteriae identisch waren (HUDSON et al. 1976). Durch DNA-DNAHybridisierungsversuche berichteten andere Autoren, dass Stämme dieser Art weniger als 40% Homologien mit B. hyodysenteriae hatten (STANTON et al. 1991). Diese Gruppe von Stämmen wurde in Folge als eine neue Spezies, B. innocens beschrieben (KINYON u. HARRIS 1979). B. innocens kann Fruktose fermentieren, aber nicht Indol bilden. Weiterhin wird B. innocens üblicherweise sowohl bei gesunden als auch bei an Durchfall erkrankten Schweinen (LEE et al. 1993b; ROTHKAMP et al. 2005, WENDT et al. 2006) isoliert. Auch 37 Schrifttum bei Hühnern konnte der Erreger nachgewiesen werden, es konnte jedoch keine Pathogenität bei experimenteller Infektion von Eintagsküken beobachtet werden (TROTT et al. 1995; MCLAREN et al. 1997). Im Mäuseinokulationstest B.-hyodysenteriae-Infektion mittels B. konnten im Gegensatz zur innocens keine klinischen Symptome oder pathomorphologischen Veränderungen im Darm erzeugt werden (JOENS 1980). Einer Arbeitsgruppe gelang es, mittels experimenteller Infektion von gnotobiotischen Ferkeln mit 3 von 5 B.-innocens-Feldisolaten (aus Herden mit unspezifischer Diarrhoe und Typhlocolitis) nach Vorinfektion mit Bacteroides vulgatus Durchfall mit Schleim- und Blutbeimengungen zu erzeugen. Zwei der B.-innocens-Stämme wurden an konventionell gehaltenen Schweinen getestet, ohne dass Veränderungen auftraten (NEEF et al. 1994). JENSEN und BOYE (2005) stellten Untersuchungen zur Ätiologie von Colitis-Erkrankungen bei 140 Schweinen aus Problembetrieben an. Durch eine In-situ-Hybridisationsmethode konnten sie in 11 Fällen Infektionen mit B. innocens nachweisen, eine Monoinfektion mit Invasion der Erreger in Krypt- und Oberflächenepithelien des Kolons konnte in 2 Fällen beobachtet werden. 2.3.3 Brachyspira intermedia Für eine andere Art der schwach hämolysierenden Spirochätengruppe, B. intermedia, zeigte sich in einer Studie mit Hilfe von DNA-DNA-Hybridisation, dass die Sequenzhomologie zwischen B. hyodysenteriae und B. intermedia ungefähr 60% beträgt (STANTON et al. 1997). Es ist nicht möglich, B. hyodysenteriae und B. intermedia phänotypisch zu unterscheiden (STANTON et al. 1997). B. intermedia besitzt ähnliche biochemische Eigenschaften wie B. hyodysenteriae, kann aber aufgrund der Hämolyse-Qualität unterschieden werden. Weiterhin kann B. intermedia von anderen schwach β-hämolysierenden Spirochäten aufgrund der Indolproduktion unterschieden sowie durch die PCR-Methodik differenziert werden. B. intermedia wurde bei Schweinen mit Durchfall und Colitis isoliert (HUDSON et al. 1976; BINEK u. SZYNKIEWICZ 1984; FELLSTRÖM u. GUNARSSON 1995; STANTON et al. 1997; JENSEN u. BOYE 2005; ROTHKAMP et al. 2005; WENDT et al. 2006). Im Gegensatz zum Geflügel, bei dem mit B. intermedia die intestinale Spirochätose experimentell erzeugt werden kann (GRIFFITHS et al. 1987; MCLAREN et al. 1997), war 38 Schrifttum mit B. intermedia beim Schwein experimentell bislang kein Durchfall auszulösen (HUDSON et al. 1976; NEEF et al. 1994). JENSEN und BOYE (2005) belegten jedoch bei bestehender Colitis eine Invasion der Lamina propria durch B. intermedia. Deswegen wird die mögliche Pathogenität von B. intermedia beim Schwein noch kontrovers diskutiert. 2.3.4 Brachyspira murdochii B. murdochii, ebenfalls eine schwach hämolysierende Spirochäte, wird zumeist als apathogen für Schweine angesehen. Diese Brachyspira-Art zeigte eine DNA-Homologie von nur 27% im Vergleich mit B. hyodysenteriae (STANTON et al. 1997). Die Spezies kann von B. innocens biochemisch und durch molekularbiologische Methoden unterschieden werden (LEE u. HAMPSON 1994; STANTON et al. 1997, Tab. 8). B. murdochii wird häufiger aus Darminhalt von gesunden Schweinen sowie Wild- und Laborratten isoliert (TROTT et al. 1996). Bei Eintagsküken konnte durch experimentelle Infektion keine Erkrankung hervorgerufen werden (TROTT u. HAMPSON 1998). Andererseits wird B. murdochii immer wieder auch aus diagnostischen Proben von Schweinen, die an Durchfall erkrankt sind, isoliert (ROTHKAMP et al. 2005; WENDT et al. 2006). Dabei lagen nicht nur Misch-, sondern auch Monoinfektionen vor, bei denen eine Invasion des Erregers in Krypt- und Oberflächenepithelzellen beobachtet wurde (JENSEN u. BOYE 2005). JENSEN et al. (2005) berichten über eine experimentelle Infektion des Dickdarms von Schweinen mit B. murdochii. Der Erreger wurde 6 Tage p. inf. erstmalig wieder mit dem Kot ausgeschieden, die Ausscheidung hielt bis zum Tag 25 p. inf. an. Durch In-situ- Hybridisierung konnte das Eindringen von B. murdochii in den Mukus der Kolonoberfläche sowie in die Kryptepithelien belegt werden. Diese Ergebnisse führten die Autoren zu dem Schluss, dass B. murdochii die Dickdarmmukosa von Schweinen besiedeln und eine katarrhalische Kolitis hervorrufen kann. HAMPSON et al. (1999) gelang als Besonderheit die Isolierung von B. murdochii aus dem Hüftgelenk eines lahmen Schweines. Dies demonstriert die Fähigkeit von B. murdochii auch extra-intestinale Körperlokalisationen zu besiedeln. 39 Schrifttum 2.4 Auslösende Faktoren für das klinische Bild der Schweinedysenterie Ob die Infektion mit B. hyodysenteriae latent verläuft oder ob sich eine klinische Symptomatik mit unterschiedlichem Schweregrad bis hin zu Totalverlusten entwickelt, hängt von zahlreichen Faktoren ab, wie z.B. von der Virulenz der B.-hyodysenteriae-Stämme, von verschiedenen Umweltfaktoren, Haltungsbedingungen, der Fütterung sowie der Zusammensetzung der Darmflora (HARRIS u. GLOCK 1981; HEINRITZI 2002; PLUSKE et al. 2002; THOMSON et al. 2003; CIZEK et al. 2005). Jedoch sind die genauen Pathomechanismen der SD bisher noch nicht bekannt (HAMPSON et al. 1992; MHOMA et al. 1992). Die Virulenzfaktoren (s. Kapitel 2.2.3) und die resistenzmindernden Faktoren können einerseits zwar die Kolonisation des Erregers begünstigen, aber bei experimentellen Studien zeigten sich keine verlässlichen Faktoren, die die klinischen Erscheinungen und Läsionen der Schweinedysenterie immer erfolgreich und bei allen Tieren induzieren können. 2.4.1 Stress auslösende Faktoren Zahlreiche Studien haben die wichtige Rolle von Stress- und resistenzmindernden Faktoren für die Provokation der klinischen Erscheinungen bei der Schweinedysenterie identifiziert (ERIKSEN u. ANDERSEN 1970; MORENG et al. 1980). Cortisol, das in der Nebennierenrinde produziert wird, ist ein häufig benutzter Marker bei Schweinen für verschiedene Stresssituationen wie physischen Stress und chirurgischen Stress (SOMCHIT et al. 2003). ERIKSEN und ANDERSON (1970) berichteten, dass SD bei den Schweinen besonders gut reproduziert werden konnte, die vor und nach der experimentellen Infektion eine intramuskuläre Corticosteroid-Injektion erhielten. Diese Schweine zeigten schwerere klinische Symptome als die Vergleichsgruppen, es war häufiger blutiger Kot sowie eine kürzere Inkubationsperiode zu beobachten. AMTSBERG et al. (1984) stellten in ihrem Infektionsversuch mit B. hyodysenteriae fest, dass das Krankheitsbild der Schweinedysenterie experimentell nur bei gleichzeitiger Prednisolon-Applikation hervorgerufen werden konnte. Im Gegensatz dazu konnten JACOBSON et al. (2004) durch wiederholte Injektionen von Dexamethason bei Läuferschweinen klinische Erkrankungen nach experimenteller Infektion nicht erfolgreich hervorrufen. In vielen erfolgreichen Infektionsversuchen wurden die 40 Schrifttum Schweine natürlichem Stress durch eine Hungerperiode vor der Infektion ausgesetzt (KINYON et al. 1977; MORENG et al. 1980; ZAHN 1989). Nach HEINRITZI (2002) kann die Infektionsrate bei experimenteller oraler Infektion von 60% bei Nahrung aufnehmenden Tieren bis auf 100% erhöht werden, wenn die Tiere zwei Tage vor bis zwei Tage nach der Infektion hungern. JACOBSON et al. (2004) beobachteten im Experiment mehr klinisch erkrankte Tiere bei Gruppenhaltung als bei Einzelhaltung, jüngere Schweine waren anfälliger als ältere Tiere. Durch Gabe weiterer Bakterien (E. coli O141, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Fusobacterium necrophorum) konnten sie die Erkrankung nur bei 30% der Versuchstiere erzeugen. Des Weiteren muss die Infektionsdosis und die Aufbereitung des Inokulates berücksichtigt werden (WILCOCK u. OLANDER 1979; MORENG et al. 1980). Daneben kann die klinische Manifestation der B.-hyodysenteriae-Infektion durch andere belastende Faktoren wie z.B. Transport, Stallwechsel, Zusammenstellung neuer Tiergruppen, Überbelegung, ungünstiges Stallklima, Futterumstellung oder zootechnische Maßnahmen begünstigt werden (WALDMANN 1992; HEINRITZI 2002; JACOBSON et al. 2004). 2.4.2 Rolle des Futters In neuerer Zeit beschäftigt sich eine Reihe von Publikationen mit dem Einfluss des Futters auf die Entwicklung einer klinischen Dysenterie. Ein Bericht von PROHÁSZKA u. LUKÁCS (1984) zeigte auf, dass eine Zellulose/Hemizellulose-Ration auf der Basis von Mais-Silage mit hohem Gehalt an verdaulicher Rohfaser eine Herabsetzung der pH-Werte und erhöhte Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren im Dickdarm verursacht. Diese Veränderungen führten zu einer Hemmung der Motilität von B. hyodysenteriae und unterdrückten eine Aktivierung der latenten Infektion im Betrieb. SIBA et al. (1996) verglichen unter den Bedingungen einer experimentellen Infektion Rationen, die entweder Weizen oder Reis enthielten und mit geschälten Lupinen oder tierischem Protein kombiniert waren. Im Gegensatz zum Ergebnis von PROHÁSZKA und LUKÁCS (1984) stellten SIBA et al. (1996) fest, dass die rohfaserreiche Ration (basierend auf Weizen und Lupinen) zur höchsten Inzidenz von SD führte. Als mögliche Erklärung wurde vermutet, dass der erhöhte Gehalt an Nicht-Stärke-Polysacchariden (NSP), Oligosacchariden und resistenter Stärke die Fermentierung im Dickdarm (niedrigerer pH, 41 Schrifttum vermehrte VFA) stimulierte und damit B. hyodysenteriae die Kolonisation erleichterte. Im Gegensatz dazu erkrankte keines der Tiere, die eine hoch verdauliche Futterration (basierend auf gekochtem Reis und tierischen Proteinen) erhielten, nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae, da die Fermentierung im Dickdarm durch die Ration stark reduziert war und deshalb die Vermehrung von B. hyodysenteriae behindert wurde. Die Untersuchungen von PLUSKE et al. (1996, 1998) sowie DURMIC et al. (1998) demonstrierten jedoch, dass eine Ration aus gekochtem Reis, die hohe Konzentrationen an löslichen Nicht-Stärke-Polysacchariden (sNSP) oder resistenter Stärke (RS) enthält, eine stark Erhöhung der Fermentierung im Zäkum und Kolon hervorrief und im Gegensatz zu einer reinen Reis-Ration nicht protektiv gegen eine Dysenterie-Erkrankung wirkte. Es wurde spekuliert, dass die höhere Fermentationsrate die Provokation von SD durch die Begünstigung einer synergistischen Kolonflora (Fusobacterium spp.) bewirkte. In späteren Studien von DURMIC et al. (2000, 2002) wurde der Einfluss einer Getreideextrusion (Weizen, Hirse) sowie der Zusatz von RS- und sNSP- degradierenden Enzymen auf die klinische Expression von SD geprüft. Diese Maßnahmen konnten jedoch die Entstehung klinischer Dysenterie-Symptome nicht verhindern. Eine gemeinsame Auswertung aller Versuche ergab aber, dass niedrige RS- und sNSP-Gehalte mit einer geringeren Kolonisierung von B. hyodysenteriae und weniger klinischer Symptomatik der SD korreliert waren. Ein hemmender Einfluss auf die klinische Erkrankung wurde außerdem durch einen sehr feinen Vermahlungsgrad der Hirse vermutet, da RS in geringerem Maße den Dickdarm erreicht. Entgegen der oben angeführten Untersuchungsergebnisse haben andere Autoren berichtet, dass Rationen basierend auf gekochtem Reis die Entwicklung von SD bei experimenteller Infektion nicht verhindern konnte. Als mögliche Einflussfaktoren werden mögliche Unterschiede in der residenten Darmflora und in der Virulenz der benutzten B.-hyodysenteriae-Stämme sowie die Behandlung des Reis genannt (KIRKWOOD et al. 2000; LESER et al. 2000; HAMPSON et al. 2001; LINDECRONA et al. 2003). LINDECRONA et al. (2003) zeigten außerdem, dass eine Erhöhung des Gehaltes an NSP oder RS in der Ration zwar nicht zur häufigerem Vorkommen der Erkrankung oder vermehrter Ausscheidung der Erreger über den Kot führte, aber die klinischen Symptome und pathologischen Veränderungen schwerer waren. Die geringste Krankheitsinzidenz erzielten 42 Schrifttum die Autoren trotz eines hohen Gehaltes an NSP mit einem üblichen Standardfutter, das als flüssiges vorfermentiertes Futter angeboten wurde. Ebenso wie die Studie von LINDECRONA et al. (2003) bestätigten THOMSEN et al. (2007), dass eine Ration, deren Gehalt an totalen NSP und löslichen NSP höher als bei der Ration in den Versuchen von PLUSKE et al. (1996) war, die Entwicklung von SD nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae verhindern kann. Diese Ration wies einen hohen Gehalt an fermentierbaren Kohlenhydraten auf und bestand aus Triticale und Gerste sowie aus Zichorienwurzeln und süßen Lupinen. Darüber hinaus können Art und Konzentration von Protein im Mischfutter Einfluss auf die Entstehung einer Dysenterie-Erkrankung nehmen (PLUSKE et al. 2002). Die Verwendung von Sojaextraktionsschrot und Rationen basierend auf Soja und Mais stellen eine Prädisposition für Durchfall bei Absetzferkeln dar (DEWEY 1993; NEEF et al. 1994). Zu in diesem Zusammenhang diskutierten Mechanismen gehören Hypersensivitätsreaktionen, Interferenzen mit der Bioverfügbarkeit von Mineralstoffen, die Verdaulichkeit von Proteinen und Kohlenhydraten, die Bindung an Rezeptoren und die Akkumulation von Flüssigkeiten, die durch Prostanoide verursacht wird (JACOBSON 2003). Eine Studie von JACOBSON et al. (2004) demonstrierte, dass ein hoher Anteil an Sojaextraktionsschrot (50% der Ration) sowie die Haltung der Schweine in Gruppen die wichtigsten Faktoren waren, die eine klinische Dysenterie nach experimenteller Infektion provozierten. Ursächlich wird die Beeinflussung der Begleitflora im Dickdarm sowie ein hoher Gehalt an NSP im Sojaextraktionsschrot diskutiert, der für eine vermehrte Dickdarmfermentation verantwortlich sein kann. 43 Material und Methoden 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 Versuchstiere Die Versuchstiere wurden von dem Lehr- und Forschungsgut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Ruthe (Bundeshybridzuchtprogramm, BHZP-Hybrid) oder von einem niedersächsischen Erzeugerbetrieb mit geschlossenem System (JSR-Hybrid) bezogen und wurden im Tierhaus der Klinik für kleine Klauentiere gehalten. Für die Studie stand eine Gesamtzahl von 131 Hybrid-Läuferschweinen beiderlei Geschlechts mit einem durchschnittlichen Gewicht von 16,6 ± 2,9 kg (x±s) zur Verfügung. Die Tiere wurden zur Adaptation eine Woche vor dem Versuchsbeginn aufgestallt. Die Versuchstiere waren durch Ohrmarken und Kliniknummern individuell gekennzeichnet. Direkt nach der Ankunft der Schweine wurden eine Allgemeinuntersuchung durchgeführt und Kotproben entnommen, die auf das Vorhandensein von Brachyspira spp., Salmonella spp., hämolysierenden E. coli sowie Lawsonia intracellularis untersucht wurden (s. 3.7). Die mikrobiologischen Untersuchungen auf Brachyspiren, Salmonellen und E. coli wurden im Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover, und der Nachweis von Lawsonia intracellularis in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Schweine wurden bei Ankunft und dann im wöchentlichen Intervall gewogen. Die Schweine wurden nach dem Zufallsprinzip den Versuchsgruppen zugeteilt. Die Haltung erfolgte gruppenweise in räumlich getrennten Abteilen mit planbefestigtem Betonboden und abhängig von der Versuchsgruppe mit bzw. ohne Stroheinstreu. Die Stalltemperatur betrug während des ganzen Versuches zwischen 20oC und 24oC. Die Tiere wurden täglich zweimal gefüttert und Trinkwasser stand ad libitum zur Verfügung. Über dem Liegebereich der Tiere waren bei strohloser Haltung Infrarotstrahler in ca. 1 m Höhe angebracht, die jedoch in den Sommermonaten nach Bedarf ausgestellt wurden. Das jeweilige Abteil war im Eingangsbereich mit einer Desinfektionswanne ausgestattet, für jedes Abteil wurde separate Schutzkleidung angelegt, die im Stall verblieb. 44 Material und Methoden 3.2 Futterration Zur Ermittlung des Einflusses der Futterzusammensetzung auf die Ansiedlung der Brachyspiren wurde zum einen (Vorversuch) ein Mischfutter zur Beeinflussung der Dickdarmflora mit einem erhöhten Anteil an grob geschrotetem Mais und damit erhöhtem Gehalt an resistenter Stärke (PLUSKE et al. 1996, 1998; TOPPING u. CLIFTON 2001, DURMIC et al. 2002) sowie Weizenkleie, bezeichnet als „Maisfutter“ genutzt. Zum anderen (Versuch 2) wurde eine Futterration verwendet, die mit einem erhöhten Anteil an Sojaextraktionsschrot (bezeichnet als „Sojafutter“) versehen wurde. Sie enthielt damit einen erhöhtem Gehalt an Protein und bestimmten, nur im Dickdarm mikrobiell abbaubaren Oligosacchariden (Raffinose, Stachyose, Verbascose) (LOSAND et al. 2003; MÖBIUS u. DAMME 2004). Die Zusammensetzung der beiden experimentell verwendeten Versuchsfuttermittelmischungen und des Kontrollfutters (Vorversuch, Versuch 1) sind in Tabelle 1 dargestellt. Tab. 1: Die Zusammensetzung der experimentell verwendeten Futtermittelrationen Versuchsfutter (%) „Sojafutter“ Komponente Kontrollfutter „Maisfutter“ (50 % Kontrollfutter + 50% Sojaextraktionschrot) (%) Gerste, geschrotet 79 35 39,5 Sojaextraktionsschrot 15 18 57,5 Mineralfutter 3 2 1,5 Sojaöl 3 - 1,5 Mais, grob geschrotet - 35 - Weizenkleie - 10 - „Maisfutter“ bzw. Kontrollfutter wurden den Tieren zweimal täglich per Futtertrog, 0,04-0,05 kg/kg Körpergewicht (KGW) über den gesamten Versuchszeitraum gegeben. Bei den Versuchen mit „Sojafutter“ bekamen die Schweine morgens nur Kontrollfutter und abends 45 Material und Methoden nur Sojaextraktionsschrot über insgesamt 7 Tage, beginnend 4 Tage vor der ersten Infektion mit Brachyspiren (JACOBSON et al. 2004). Danach erhielten sie für den Rest der Versuchsperiode Kontrollfutter (s. Abb. 1). Abb. 1: Schematische Darstellung der Fütterung und Dexamethason-Behandlung 3.3 Behandlung 3.3.1 Immunsuppressive Behandlung Um die Erkrankung der Schweinedysenterie experimentell hervorzurufen, wurden bei Experimenten anderer Autoren die Versuchstiere mit Dexamethason behandelt, um eine Immunsuppression zu induzieren (ERIKSEN u. ANDERSEN 1970; AMTSBERG et al. 1984; JACOBSON et al. 2004). In den eigenen Untersuchungen wurden Tiere im Vorversuch und in der Versuchsreihe 1 mit Dexamethason-Lösung (Dexamethason®, Fa. Vetoquinol, Ravensburg) täglich mit einer Dosis von 0,4 mg/kg KGW intramuskulär behandelt. Die Behandlungsdauer betrug insgesamt 14 Tage, und zwar beginnend 3 Tage vor erster Infektion bis 11 Tage danach (ERIKSEN u. ANDERSEN 1970; s. Abb. 1). 46 Material und Methoden 3.3.2 Antiinfektive Behandlung In zwei Tierlieferungen wurden bei einer Reihe von Schweinen Spirochäten mittels eines Nativpräparates unter dem Phasenkontrastmikroskop vor der Infektion nachgewiesen, diese konnten aber nicht in Reinkultur gebracht werden. Diese Gruppen aus der Versuchsreihe 1 wurden vor Versuchsbeginn deswegen mit Tiamulin (Tiamutin® Pulver 10%, Fa. Novartis, München) über das Futter in einer Dosis von 10 mg/kg KGW für 14 Tage behandelt. In einer Gruppe von Schweinen (Versuch 2) wurden vor der Infektion hämolysierende Escherichia coli zum einen mit Genen für den Fimbrientyp F18 und dem Shigatoxin 2e (Verotoxin), zum anderen mit den Enterotoxinen LTI, STI und STII isoliert. Diese Tiere wurden mit Marbofloxacin (Marbocyl® 2%, Fa. Vetoquinol, Ravensburg) in einer Dosierung von 2 mg/kg KGW intramuskulär für 4 Tage behandelt. Der Versuchsbeginn bei allen betroffenen Tieren wurde auf eine Woche nach Beendigung der Behandlung terminiert. 3.4 Brachyspira-Stämme Alle verwendeten Bakterienstämme und ihre Herkunft sind in Tabelle 2 aufgeführt. Für die Versuche wurden insgesamt 13 Brachyspira-Feldstämme verwendet, die mit mittel- bis hochgradigen Keimgehalt aus Einzelkotproben bzw. dem Koloninhalt von Schweinen im Rahmen der Routinediagnostik im Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, der Tierärztlichen Hochschule Hannover isoliert und differenziert wurden (s. Anhang 9.2). Die Proben wurden gleichzeitig negativ bezüglich enteropathogener E. coli, Lawsonia intracellularis und Salmonella spp. getestet. Ein B.-murdochii-Stamm wurde aus Dänemark zur Verfügung gestellt. Der Stamm B. hyodysenteriae B204 wurde als Referenzstamm verwendet. Vor dem Einsatz in den Infektionsversuchen wurden die verwendeten Stämme mittels der kulturell-biochemischen Differenzierung (FELLSTRÖM et al. 1997, STANTON et al. 1997) und der RFLP-PCR (auf einer Polymerase-Kettenreaktion basierte Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse) des nox-Gens (ROHDE et al. 2002) verifiziert. 47 Material und Methoden 3.4.1 Asservierung der Brachyspira-Stämme Die Brachyspira-Stämme wurden entweder im Microbank®-System (Fa. PRO-LAB diagnostics, Neston, Wirral, UK) nach Angaben des Herstellers oder als Glyzerinkultur bei -70oC konserviert. Das Microbank®-System besteht aus sterilen Kryogefäßen mit KeramikKügelchen in einem speziellen Kryomedium. Für die Glyzerinkultur wurden 1 Teil Brain-Heart-Infusion (BHI)-Medium (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg), 1 Teil Glyzerin (Fa. Merck, Darmstadt) und 2 Teile Pferdeserum (Fa. WDT, Garbsen) gemischt und je 1ml davon in Kryoröhrchen abgefüllt. Die zu konservierenden Stämme wurden mit einem sterilen Wattestäbchen bis zu einer deutlichen Trübung resuspendiert und bei -70 oC eingefroren. Tab. 2: Verwendete Brachyspiren-Stämme Stamm B 204 7304/03 3900/04 3828/04 1569/05 3407/05 7405/05 1618/03 543/06 2317/03 5139/04 3626/05 7185/05 S11287 3.4.2 Referenzstamm Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Feldisolat Spezies Herkunft B. hyodysenteriae B. hyodysenteriae B. innocens B. innocens B. innocens B. innocens B. innocens B. intermedia B. intermedia B. murdochii B. murdochii B. murdochii B. murdochii B. murdochii USA1 Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Tierärztlichen Hochschule Hannover Dänemark2 Reaktivierung der Brachyspira-Stämme Für die Vorbereitung der Brachyspira-Suspension für die Infektion der Schweine wurden die Brachyspiren-Stämme aus dem Microbank-System bzw. der Glyzerinkultur für die 1 Freundlicherweise überlassen von T.B. Stanton und S.B. Humphrey, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, US Department of Agriculture, Ames, USA 2 Freundlicherweise überlassen von Tim K. Jensen, Danish Institute for Food and Veterinary Research, Copenhagen, Denmark 48 Material und Methoden Reaktivierung entnommen, und auf Columbia-Agar Platten aufgetragen und bei 42°C über 3-5 Tage in Anaerobier-Töpfen bebrütet. 3.5 Infektionsmodell 3.5.1 Verwendete Medien für die Vorbereitung der Brachyspira-Suspension Bei den vorliegenden Infektionsversuchen wurden die folgenden Medien für die Vorbereitung der Brachyspiren-Infektionssuspension sowie für die Isolierung von Brachyspiren verwendet (die Zusammensetzung ist dem Anhang zu entnehmen): - Columbia-Blutagar (Fa. OXOID, Wesel) mit 5% Schafblutzusatz - Brain-Heart-Infusion-Bouillon (BHI-Bouillon, Fa. DIFCO, Becton Dickinson, Heidelberg) - Brachyspira-Selektiv-Agar (BSA, selektiver Trypticase-Soja-Agar supplementiert mit 0,1 % Hefe-Extrakt, 5 % Rinderblut, Vancomycin, Colistin, Rifampicin, Spiramycin und Spectinomycin modifiziert nach DÜNSER et al. 1997) - Trypticase-Soja-Agar (TSA, Becton Dickinson, Heidelberg) mit 10% Rinderblutzusatz Sonstige verwendete Chemikalien, Reagenzien und die apparative Ausstattung werden im Anhang Kapitel 9.1 vorgestellt. 3.5.2 Für Herstellung der Brachyspira-Infektionssuspension die Infektion der Schweine mit Brachyspiren wurde die Brachyspiren- Infektionssuspension nach folgenden zwei Methoden hergestellt: Methode 1: Für die Infektion wurden die Brachyspiren unter strengen anaeroben Verhältnissen in Anaerobier-Töpfen bei 42°C auf Columbia-Blutagar-Platten 3-5 Tage kultiviert. Danach 49 Material und Methoden wurde auf jede Platten 1-2ml BHI-Medium gegeben, mit einem sterilen Gasspachtel wurden die Bakterien resuspendiert und dann in insgesamt 50 ml BHI-Medium überführt. Für jede Brachyspira-Infektionssuspension wurden jeweils 8-10 Platten abgeerntet. Um die O2-Exposition für die Brachyspiren zu minimieren, wurden jeweils nur zwei 50mlErlenmeyerkolben mit Brachyspira-Infektionssuspension für die Infektion von 2 Schweinen gleichzeitig hergestellt und diese direkt zur Infektion der Tiere gebracht. Die optische Dichte (OD) dieser Suspension wurde bei 950 nm im McFarland-Densimat (Fa. bioMérieux, Nürtingen) ermittelt, und die Keimkonzentration der Brachyspira-Inokula varierte im Bereich von 108-109 KbE/ml (McFarland 2,0 – 3,5). Vor der oralen Infektion der Schweine wurden zur Reinheitskontrolle der Suspension jeweils 100 µl Bakteriensuspension auf zwei Columbia-Blutagarplatten getropft. Eine dieser Platten wurde aerob bei 37°C und die andere anaerob bei 42°C für mindestens 48 Stunden bebrütet. Nach der Infektion wurde eine Verdünnungsreihe von der letzten Brachyspira-Infektionssuspension durchgeführt, um die Infektionsdosis zu kontrollieren (s. 3.5.3) Für die Infektion wurden die Erlenmeyerkolben der Brachyspira-Suspension mit Parafilm abgeklebt und bei Zimmertemperatur zu den Schweinen transportiert. Methode 2: Die Brachyspiren-Stämme wurden aus dem Microbank-System bzw. den Glyzerinkulturen auf Columbia-Agarplatten aufgetragen und bei 42°C über 3-5 Tage in Anaerobiertöpfen bebrütet. Die weitere Anzucht erfolgte dann in der Anaerobier-Kammer. Die verwendeten Medien wurden zeitig vor dem Gebrauch in die Anaerobenkammer verbracht, um deren Anaerobiose zu gewährleisten. Die Brachyspiren wurden mit sterilen Wattetupfern von den Columbia-Agarplatten abgenommen und in Röhrchen mit 5 ml BHI-Medium mit 10% Rinderserumzusatz resuspendiert. Diese wurden dann für etwa 24 Stunden unter kräftigem Rühren auf einem Magnetrührer bei 40°C in der Kammer bebrütet. Am nächsten Tag wurden Nativpräparate hergestellt und unter dem Phasenkontrastmikroskop auf Kontamination der Flüssigkulturen und auf die Bewegungsfähigkeit der Brachyspiren geprüft. Anschließend wurden die Brachyspiren in 50 ml BHI-Medium vermehrt. Zunächst wurden 5-10 ml Brachyspiren- 50 Material und Methoden Vorkultur in 50 ml BHI-Medium (mit 10% Rinderserumzusatz) in einem 100mlErlenmeyerkolben überführt und dann für weitere 24 Stunden unter starkem Rühren bei 40oC anaerob kultiviert. Die OD der Flüssigkulturen wurde am folgenden Tag mit dem McFarlandDensimat (Fa. bioMérieux, Nürtingen) gemessen. Parallel hierzu erfolgte die Reinheits- und Vitalitätskontrolle der Brachyspiren-Kulturen mittels Nativpräparat unter dem Phasenkontrastmikroskop. Für die Infektion wurden die Erlenmeyerkolben der BrachyspiraFlüssigkulturen unter anaeroben Bedingungen mit Parafilm abgeklebt und auf Eis zu den Schweinen transportiert. Die Flüssigkulturen von den eingesetzten B.-hyodysenteriae- und B.-intermedia-Stämmen erreichten eine optische Dichte von McFarland-Standard 2,0-3,5; das entspricht 108-109 KbE/ml. Es wurden 50 ml Suspension pro Läufer appliziert. Die B.-innocens- und B.-murdochii-Feldisolate zeigten zum Teil ein deutlich schlechteres Wachstum während der Kultivierung im Flüssigmedium, es wurde nur eine optische Dichte McFarland 0,4 -2,0 (zwischen 105-108 KbE/ml) erreicht. Daher wurde bei diesen Arten in Abhängigkeit von der Dichte jeweils eine Infektionsdosis von 50 oder 100 ml eingesetzt. Es wurde jeweils eine Verdünnungsreihe von der Brachyspira-Infektionssuspension vor und nach der Infektion zur Kontrolle der Infektionsdosis hergestellt (s. 3.5.3). 3.5.3 Verdünnungsreihe für die Kontrolle der Infektionsdosis Zur Vorbereitung der Verdünnungsreihe wurden 8 Röhrchen mit je 4,5 ml BHI-Medium benötigt. Zunächst wurde 0,5 ml Brachyspiren-Suspension entnommen und in das erste BHI-Röhrchen gegeben. Nach Durchmischen wurde dann aus dem ersten Röhrchen wieder 0,5 ml Suspension entnommen und in das zweite Röhrchen gegeben. Diese Prozedur wird bis zum achten Röhrchen mit immer neuen Glaspipetten fortgesetzt (s. Abb. 2). Danach wurden 0,1 ml jeder Verdünnungsstufe von 10-5 bis 10-8 auf ColumbiaBlutagar und TSA-Agarplatte (mit 10% Blut) aufgebracht. Nach 5-6tägiger Bebrütung in Anaerobier-Töpfen bei 42oC wurden die Anzahl der KbE in der Ausgangssuspension berechnet. 51 Material und Methoden Abb. 2: 3.5.4 Die Darstellung der Verdünnungsreihe für die Kontrolle der Infektionsdosis Intragastrale Infektion der Schweine mit Brachyspiren Schweine wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen intragastral per Magenschlundsonde (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) in Abhängigkeit von der Brachyspiren-Art (s. 3.5.2) mit 50 oder 100 ml Brachyspiren-Suspension infiziert. Die Tiere wurden am Tag vor und an den 3 Tagen der Infektion jeweils nur einmal gefüttert (0,04-0,05 kg Futter/kg KGW), im Vorversuch und Versuch 1 direkt im Anschluss nach der Infektion, im Versuch 2 erst 4-6 Stunden nach der Infektion (Tab. 3). Tab. 3: Nahrungskarenz für die Infektion Nahrungskarenz Morgens Nachmittags (*Vorversuch, Versuch 1, **Versuch 2) 1. Tag vor Infektionsbeginn füttern nüchtern 1. Infektionstag nüchtern füttern (direkt p.inf.* oder 4-6 Std. p.inf.**) 2. Infektionstag nüchtern füttern (direkt p.inf.* oder 4-6 Std. p.inf.**) 3. Infektionstag nüchtern füttern (direkt p.inf.* oder 4-6 Std. p.inf.**) füttern füttern 1. Tag nach der Infektion 52 Material und Methoden 3.6 Versuchsdesign 3.6.1 Vorversuch Das Ziel dieses Vorversuches war es, Infektionsmodelle mit B. hyodysenteriae zu überprüfen, wobei verschiedene auslösende Faktoren für die Provokation einer klinischen Erkrankung getestet wurden. Neben einer Negativ-Kontrollgruppe und einer Challenge-Kontrollgruppe, die beide nur Kontrollfutter erhielten und nicht behandelt wurden, erhielt eine weitere Challenge-Gruppe Dexamethason zur Immunsuppression (s. 3.3.1). Darüber hinaus wurde eine weitere ChallengeGruppe statt mit Kontrollfutter mit „Maisfutter“ gefüttert. (s. 3.2). Die Versuchstiere wurden randomisiert in 4 Gruppen zu jeweils 5 Schweinen aufgeteilt (Tab. 4). Tab. 4: Vorversuch: Infektionsversuche mit B. hyodysenteriae unter verschiedenen Fütterungs- und Behandlungsmethoden (BHZP-Hybrid-Schweine, 19,7 ±1,5 kg KGW) Gr.- Fütterung Nr. 1 2 Kontrollfutter „Maisfutter“ Anzahl Behandlung infiziert mit der vor der B.-hyodysenteriae- Schweine Infektion Feldstamm 5 ohne 7304/03 Methode 1 7304/03 Methode 1 7304/03 Methode 1 nicht infiziert, NegativKontrolle 5 3 Kontrollfutter 5 4 Kontrollfutter 5 ∑ ohne Dexamethason ohne Infektions- Haltung dosis 50 ml/Schw. 8 9 10 -10 KbE/ml Betonboden mit Stroh 20 Die Allgemeinuntersuchung dieser Schweine nach der Ankunft ergab keinen Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Weiterhin konnte bei der mikrobiologische Untersuchung vor Versuchsbeginn keine Infektion mit Salmonella spp., hämolysierenden L. intracellularis sowie bekannten Brachyspira-Arten nachgewiesen werden. 53 E. coli, Material und Methoden Die Challenge-Gruppen wurden mittels der in Kapitel 3.5.2 beschriebenen Infektionsmethode 1 infiziert. Während das Stroh täglich gewechselt wurde, wurde der Boden der Schweinebuchten während und nach der Infektion (insg. 7 Tage) nicht gereinigt, und dann wöchentlich einmal gereinigt und mit Wasser ausgespritzt. Dieser Versuch dauerte 35 Tage. 3.6.2 Versuch 1: Infektionsversuche mit Dexamethason-Behandlung Diese Versuchsreihe wurde nach Auswertung der Ergebnisse des Vorversuches durchgeführt, in dem bei Behandlung der Tiere mit Dexamethason das klinische Bild der Dysenterie erzeugt werden konnte. Es sollte die Pathogenität verschiedener schwach hämolysierender Brachyspiren-Arten B. innocens, B. murdochii und B. intermedia überprüft werden. Es wurden insgesamt 44 Läuferschweine (BHZP und JSR-Hybrid) mit einem durchschnittlichen Gewicht von 16,5 ± 2,3 kg (x±s) für die Versuchsreihe 1 benötigt. Die Gruppen wurden randomisiert zusammengestellt. Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung vor der Infektion ergaben keine Infektion mit Salmonella spp., hämolysierenden E. coli, L. intracellularis oder bekannten Brachyspira-Arten. Bei einzelnen Gruppen wurde jedoch ein geringgradiger Keimgehalt an Brachyspira spp. mittels Untersuchung eines Nativpräparates unter dem Phasenkontrastmikroskop beobachtet, aber mit der Kultur und RFLP-PCR direkt von Kulturmaterial nicht nachgewiesen. Aus diesem Grund wurden diese Tiere vor Versuchsbeginn mit Tiamulin (s. 3.3.2) behandelt (s. Kennzeichnung in Tab. 5). Die Versuchsschweine erhielten eine immunsuppressive Behandlung wie im Vorversuch (Dexamethason, s. 3.3.1). Für die Infektion wurde die Brachyspiren-Suspension nach der Methode 1 (s. 3.5.2 und 3.5.4) hergestellt. In diesem Versuch wurden die Ergebnisse der Versuchsgruppen (Infektion mit schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten) mit der Positiv-Kontrollgruppe (Infektion mit B. hyodysenteriae) und Negativ-Kontrollgruppe (nicht infiziert) verglichen. Dieser Versuch dauerte 35 Tage und ist in Tabelle 5 zusammengefasst. 54 Material und Methoden Tab. 5: Versuch 1: Infektionsversuche mit verschiedenen Brachyspiren-Arten bei Behandlung der Tiere mit Dexamethason (*=BHZP-Hybrid-Schweine und **=JSR-Hybrid-Schweine, 16,5 ± 2,3 kg KGW). Tiamulin wurde ggf. vor Versuchsbeginn verabreicht Versuchs- Anzahl Brachyspira- gruppe Schweine Stämme B. 3* 7304/03 Tiamulin 50 ml/Schw. hyodysenteriae 3* 7304/03 Dexamethason 108-109 KbE/ml 5** 7304/03 Dexamethason 5* 1618/03 Tiamulin 50 ml/Schw. Dexamethason 108 KbE/ml Tiamulin 50 ml/Schw. Dexamethason 108 KbE/ml Dexamethason 50 ml/Schw. B. intermedia Behandlung Infektions- Haltung dosis Gruppen5* 3828/04 B. innocens 5** 3900/04 haltung auf Betonboden mit 8 5* 2317/03 Tiamulin B. murdochii 5** 5139/04 10 KbE/ml Stroh 50 ml/Schw. (Siehe 8 Dexamethason 10 KbE/ml Kapitel Dexamethason 50 ml/Schw. 3.1.) 108 KbE/ml Negativ- 3* nicht infiziert Tiamulin - Kontrolle 3* nicht infiziert Dexamethason - 2** nicht infiziert Dexamethason - ∑ 44 55 Material und Methoden 3.6.3 Versuch 2: Infektionsversuche mit Fütterung einer proteinreichen Ration („Sojafutter“) In der Literatur wird die Fütterung von Sojaextraktionsschrot als prädisponierender Faktor für die Entwicklung der Schweinedysenterie nach einer experimentellen Infektion mit B. hyodysenteriae beschrieben (JACOBSON et al. 2004). Der Versuchsaufbau wird in Tabelle 6 dargestellt. Die mit B. hyodysenteriae infizierte Gruppe galt als Positivkontroll-Gruppe und die nicht infizierte Gruppe als Negativkontrolle. Die Versuchsdauer betrug 33 Tage. Für diese Versuchsreihe wurden 67 Läuferschweine mit einem durchschnittlichen Gewicht 15,6 ± 3,1 kg (BHZP-Hybrid-Schweine) verwendet. Die Haltungsbedingungen wurden in Kapitel 3.1 beschrieben. In dieser Versuchsreihe wurden die Tiere in Gruppen von fünf Schweinen (Negativ-Kontrolle: n=3, eine Versuchsgruppe B. murdochii: n=4) randomisiert eingeteilt und in einer Bucht mit Betonspaltenboden ohne Stroheinstreu gehalten. Nach der Ankunft ergab die Allgemeinuntersuchung dieser Schweine keinen Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Die mikrobiologische Untersuchung vor Beginn des Versuch zeigte eine Infektion mit hämolysierenden E. coli mit den Genen für den Fimbrientyp F18 und dem Shigatoxin 2e bei 10 Schweinen (s. 3.3.2). 5 Schweine entwickelten danach Ödeme der Augenlider und des Nasendrückens, Fieber bis 40oC und Durchfall mit graubraunem Kot ohne Blutbeimengungen. Nach intramuskulärer Behandlung mit Marbofloxacin (s. 3.3.2) zeigten die erkrankten Tiere keine Symptome mehr, mikrobiologisch wurden auch keine hämolysierenden E.-coli-Stämme oder andere darmpathogene Bakterien bei den 10 Schweinen (s. Kennzeichnung in Tab. 6) isoliert. Bei dieser Versuchsreihe wurden alle verwendete Brachyspira-Stämme für die Infektion im Flüssigmedium (s. 3.5.2) kultiviert. Den Tieren wurden ab 4 Tage vor der ersten Infektion mit Brachyspiren und an den 3 Tagen, an denen sie infiziert wurden, eine Futterration mit erhöhtem Anteil an Sojaextraktionsschrot gefüttert (s. Kapitel 3.2.). Die Versuchstiere wurden intragastral über eine Ernährungssonde infiziert (s. Kapitel 3.5.). Der Boden der Buchten wurde für eine Woche nach der 1. Infektion nicht gereinigt, und dann wöchentlich mit Wasser ausgespritzt und gesäubert. 56 Material und Methoden Tab. 6: Versuch 2: Infektionsversuche mit verschiedenen Brachyspiren-Arten bei Einsatz einer proteinreichen Ration („Sojafutter“) (BHZP-Hybrid- Schweine, 15,6 ± 3,1kg KGW). Mit* gekennzeichnete Tiere wurden vor Versuchsbeginn mit Marbofloxacin behandelt Gruppe Anzahl Brachyspira- Infektionsdosis Nr. Schweine Stämme pro Schwein 1 10 B. hyodysenteriae B 204 2 5 3 3 4 5 50ml 8 5 6 5 50ml 8 5* 10 -10 KbE/ml Negativkontrolle nicht infiziert Sojafutter 100ml Sojafutter B. innocens 5* 10 KbE/ml 100ml 6 10 11 12 4 5 5 5 13 5 50ml ∑ Sojafutter 10 KbE/ml 50ml 8 Sojafutter 9 10 -10 KbE/ml B. intermedia 50ml Sojafutter 8 10 KbE/ml B. murdochii 100ml Sojafutter 5 5139/04 10 KbE/ml B. murdochii 100ml 7185/05 106-107 KbE/ml B. murdochii 50ml 3626/05 108 KbE/ml B. murdochii 50ml 7 Sojafutter Sojafutter Sojafutter 8 10 -10 KbE/ml B. murdochii 100ml 5 6 10 -10 KbE/ml 67 57 Betonboden ohne Stroh 8 B. intermedia S11287 Sojafutter 7 B. innocens 7185/05 Haltung auf 10 -10 KbE/ml 543/06 9 Gruppen- 6 B. innocens 1618/03 8 Sojafutter 9 7304/03 1569/05 7 Sojafutter 9 B. hyodysenteriae 7405/05 Haltung 10 -10 KbE/ml 3407/04 5 Fütterung Sojafutter Material und Methoden 3.6.4 Ablauf der Untersuchungen Vorversuch und Versuchsreihe 1 und 2 liefen jeweils über vier Wochen, wobei folgende Untersuchungen vorgenommen wurden: - tägliche klinische Untersuchung (Allgemeinbefinden, Kotkonsistenz, siehe Kapitel 3.7) - Blut- und Harnprobengewinnung vor experimenteller Infektion sowie am Ende der Versuchsperiode (Parameter der Blut- und Harnuntersuchung siehe Kapitel 3.10.) - Kotprobenentnahme und bakteriologische Kotuntersuchung (siehe Kapitel 3.8) bei Ankunft in der Klinik, direkt vor und am dritten Tag der experimentellen Infektion, beginnend 4 Tage nach der letzten Infektion im wöchentlichen Rhythmus (n=6x), ggf. zusätzlich bei Auftreten von klinischen Durchfallsymptomen - Sektion am Versuchsende nach 4 Wochen (einzelne, schwer erkrankte Schweine wurden vorzeitig eingeschläfert), pathologisch-anatomische und, pathohistologische Untersuchungen verschiedener Darmabschnitte sowie bakteriologische Untersuchung des Kolons (s. Kapitel 3.8 und 3.9), - Wiegen (wöchentlich), Berechnung der durchschnittlichen täglichen Zunahme (TZ) der einzelnen Versuchstiere aus Anfangs- und Endgewicht: Endgewicht (kg) – Anfangsgewicht (kg) TZ (kg/Tag) = Versuchszeit (Tage) - Futteraufwand (FA): Die Daten zum Futteraufwand geben Auskunft darüber, wie viel kg Futter für 1 kg Körpermassezuwachs benötigt wird. Der Gesamtfutterverbrauch wurde gruppenweise am Versuchsende festgehalten. Der Futteraufwand wurde je Tiergruppe berechnet: Gesamtfutteraufnahme (von Beginn bis Versuchsende) (kg) FA = Gesamtzuwachs (von Beginn bis Versuchsende) (kg) 58 Material und Methoden 3.7 Klinische Untersuchung Nach der Infektion wurden die Tiere täglich klinisch auf ihren Allgemeinzustand untersucht. Zu den täglichen Untersuchungen zählten die Kontrolle der rektalen Körpertemperatur mit einem digitalen Thermometer sowie die Beurteilung des Allgemeinbefindens und der Kotkonsistenz. Das Gewicht der Tiere wurde bei Ankunft der Tiere, einmal vor und dann nach der Infektion wöchentlich ermittelt. Die klinischen Erscheinungen der Tiere wurden dann nach folgendem Bewertungsscore beurteilt (s. Tab. 7). Tab. 7: Beurteilung der klinischen Scores für die Parameter Rektaltemperatur, Kotkonsistenz, Allgemeinbefinden und Futteraufnahme Rektaltemperatur Kotkonsistenz 0= 1= ≤ 39,9oC Fieber (≥ 40,0oC) 0= 1= 2= normal (Kot fest, geformt) weich/dickbreiig, gelblich-graugrün oder zementfarben dünnbreiig mit Schleim und Schleimhautfetzen in wechselnden Mengen, zementfarben dünnbreiig bis wässrig mit Schleim, Schleimhautfetzen und frischem Blut, Blutbeimengungen oder Fibrinfäden vermischt, milchkaffeefarben bis schokoladenfarben 3= Allgemeinbefinden 0 = (Verhalten, 1= Haltung, Ernährungs2= zustand) Futteraufnahme 0= 1= 2= 3= unauffällig (physiologisch) Abgeschlagenheit, reduzierte Aktivität, langsame Bewegungen, normaler Ernährungszustand häufiges Liegen, Apathie, Abmagern, eingefallene Flanken, gewölbter Rücken Normal verzögerte, aber vollständige Futteraufnahme, reduzierte Futteraufnahme, erhöhte Wasseraufnahme absolute Futterverweigerung, Abmagern maximaler klinischer Gesamtscore für vier Parameter = 9 59 Material und Methoden 3.8 Mikrobiologische Untersuchung 3.8.1 Probenentnahme Die Kotproben wurden mit einem Einmalhandschuh rektal entnommen, alle Kulturen wurden sofort nach der Entnahme angelegt. Bei der Sektion wurde bei allen Tieren ein Stück des Kolons für die bakteriologische Untersuchung entnommen (s. 3.9.1). Die Untersuchung auf Lawsonia intracellularis wurde in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt, weitere Untersuchungen auf darmpathogene Bakterien wurden im Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover vorgenommen. 3.8.2 Untersuchung auf Brachyspiren Die Untersuchung auf Brachyspiren wurde basierend auf der Untersuchungsanweisung für den „Nachweis, Differenzierung und Resistenzprüfung von Brachyspiren“ des Institutes für Mikrobiologie der Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. 3.8.2.1 Anlegen der Kulturen und Ablesen der Platten Für die Untersuchung auf Brachyspiren wurden die Kotproben jeweils auf eine ColumbiaAgarplatte (Fa. OXOID, Wesel) und auf zwei BSA-Platten (Brachyspira-Selektivagar) angelegt. Vor dem Beimpfen der Platten wurden mit einer sterilen Öse parallele Gräben in den Nährboden gezogen. Die Proben wurden jeweils auf einem Drittel aller drei Platten rechtwinkelig zu den Gräben aufgetragen. Die beimpften Nährböden wurden bei 42oC in Anaerobier-Töpfen unter anaeroben Bedingungen bebrütet. Nach 6-tägiger Bebrütung wurden die Kulturen zunächst auf schwärmendes und hämolysierendes Wachstum kontrolliert und von solchen Wachstumszonen Nativpräparate hergestellt. Diese Nativpräparate wurden bei 1000-facher Vergrößerung im Phasenkontrastmikroskop auf bewegliche Spirochäten untersucht. Beim Nachweis von beweglichen Spirochäten erfolgte die Beurteilung des Gehaltes anhand des schwärmenden und hämolysierenden Wachstums auf der BSA-Platte: - als geringgradig (+): Wachstum nur im Bereich des Auftragens der Probe 60 Material und Methoden - als mittelgradig (++): schwärmendes Wachstum bis etwa zur Mitte der Platte/ der Gräben - als hochgradig (+++): schwärmendes Wachstum entlang der Gräben bis zur anderen Seite der Platte 3.8.2.2 Differenzierung der Brachyspira- Isolate Beurteilung der Hämolyse (Ringphänomen) Die hämolysierende Eigenschaft der Brachyspiren wurde auf TSA-Platten mit 10% Rinderblutzusatz beurteilt. Zum Nachweis des Ringphänomens wurde nach dem Beimpfen ein Agar-Blöckchen von ca. 0,5-1 cm Kantenlänge ausgestanzt. Danach wurden die Platten bei 42oC in Anaerobier-Töpfen für 2 Tage anaerob bebrütet. Das Ringphänomen wurde am Randbezirk des ausgestanzten Blöckchens bewertet. Im positiven Fall zeigte sich eine Hämolyse-Verstärkung mit einer 1-2 mm breiten Aufhellung entlang der Ausstanzungslinie. Nur bei B. hyodysenteriae ist das Ringphänomen positiv (AMTSBERG et al. 1984). Biochemische Differenzierung Zur Differenzierung der Brachyspiren kamen neben der Beurteilung des HämolyseVermögens biochemische Methoden zur Anwendung. Zunächst wurden Subkulturen auf 3 Columbia-Agar-Platten angelegt und bei 42oC für 2 Tage anaerob angezüchtet. Dann erfolgte die Überprüfung auf die Fähigkeit zur Hippuratspaltung (Hippurat-Hydrolase), der Nachweis der Enzyme α-Galaktosidase, α-Glucosidase und β-Glucosidase mittels Rosco Diagnostic Tablets sowie der Indolnachweis. Für den Nachweis der Enzyme Hippurat-Hydrolase, α-Galaktosidase, α-Glucosidase und β-Glucosidase wurde von den 2 Tage alten Reinkulturen eine Suspension in 0,85%iger NaClLösung hergestellt. Die Trübung sollte dem McFarland Standard 1,0 entsprechen und wurde mit Hilfe des Densimaten eingestellt. Pro Stamm wurde je 0,25 ml dieser Suspension in 4 Röhrchen pipettiert und die oben genannten Enzym-Tabletten dazugegeben. Diese Röhrchen wurden für 24 Stunden bei 37oC bebrütet. Ein positiver Nachweis der Enzyme α-Galaktosidase, α-Glucosidase und β-Glucosidase zeigte sich in der gelben Verfärbung der 61 Material und Methoden Medien. Zum Nachweis der Hydrolyse von Hippurat wurden in das bebrütete Röhrchen 3-4 Tropfen Ninhydrin-Lösung gegeben. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C zeigte sich eine positive Reaktion in einer tiefblauen Verfärbung des Mediums. Für den Indolspottest wurde Koloniematerial einer Reinkultur mit einem sterilen Wattetupfer aufgenommen und auf diesen Tupfer wurde anschließend DMAC-Reagenz (DimethylAminocinamaldehyd) getropft. Eine positive Reaktion zeigt sich in der Türkisfärbung des Tupfers. Die Artdifferenzierung der Brachyspiren erfolgte nach einem modifizierten Schema von FELTRUP et al. (1999a; Tab. 8). Tab. 8: Kulturell-biochemische Differenzierung der Brachyspira-Spezies (nach FELTRUP et al. 1999) Spezies Hämolyse Ring- Indol- Hippurat- phänomen bildung hydrolyse α- α- β- Galakto- Gluco- Gluco- sidase sidase sidase B. Stark + -/+ - - -/+ + B. intermedia Schwach - + - - + + B. murdochii Schwach - - - - -/+ + B. innocens Schwach - - - + -/+ -/+ B. pilosicoli Schwach - -/+ + -/+ -/+ -/+ hyodysenteriae Differenzierung mittels RFLP-PCR des nox-Gens Ergab die kulturell-biochemische Untersuchung keine eindeutigen Differenzierungsergebnisse, so wurde die Untersuchung mittels der RFLP-PCR des nox-Gens der Brachyspiren (RHODE et al. 2002) durchgeführt. Für diese Untersuchung wurde eine Suspension von einer Reinkultur in Aqua destillata (Aqua dest.) mit einer Trübung, die den Mc Farland Standard 1,0 entspricht, hergestellt und 0,5 ml dieser Suspension der Untersuchungsanweisung folgend weiterverarbeitet. 62 Material und Methoden 3.8.3 Untersuchung auf Salmonellen Die Untersuchung von Kot- und Darmproben auf Salmonellen erfolgte durch Voranreichung in Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon und Rappaport-Vassiliadis- Medium-Anreicherungslösung mit anschließender Isolierung auf Brilliantgrün-PhenolrotLaktose-Agar (BPLS-Agar) und Rambach®-Agar nach 24 und 48 Stunden. Salmonellenverdächtige Kolonien wurden nach Subkultivierung biochemisch (Api®20E, Fa. BioMérieux) überprüft und nach dem Kauffmann-White-Schema mit spezifischen Seren serotypisiert (Fa. Dade Behring, Marburg; Fa. Sifin, Berlin). - Rappaport-Vassiliadis-Medium 42°C - Tetrathionat-Brillantgrün-Galle-Bouillon 37°C - Bebrütung / bis 48 Std, aerob. nach 24 und 48 Std. (37°C/24 Std, aerob) Salmonellen-verdächtige (42°C/24 Std, aerob) Kolonien: kirschrot Salmonellen-verdächtige Kolonien: rot Subkulturvierung Subkulturvierung - Miniatursystem Api® 20E - O/F Test +/+, Oxidase - Objektträgerschnellagglutination mit poly- und monovalenten Seren Abb. 3: Schema der Untersuchung auf Salmonella spp. 63 Material und Methoden 3.8.4 Untersuchung auf hämolysierende E. coli Kotproben und Darmproben wurden parallel auf Columbia-Blutagarplatten und auf GassnerPlatten (beide Fa. Oxoid, Wesel) als Selektivnährboden ausgestrichen, 2-fach fraktioniert und bei 37oC für 24 Stunden aerob inkubiert. Nach 24 Stunden Bebrütung zeigten sich E.–coliKeime als im Durchmesser etwa 3 - 4 mm große, graue, feucht-glänzende Kolonien mit Hämolyse auf dem Colombia-Blutagar. Auf der Gassner-Platte stellten sich E. coli als bläuliche Kolonien dar. Der Gehalt der Probe an hämolysierenden E. coli wurde nach folgendem Score bewertet: • geringgradig (+): Wachstum der hämolysierenden E. coli nur im Bereich des Auftragens der Probe • mittelgradig (++): Wachstum der hämolysierenden E. coli auch im Bereich der 1. Fraktionierung • hochgradig (+++): Wachstum der hämolysierenden E. coli auch im Bereich der 2. Fraktionierung Die isolierten hämolysierenden E.-coli-Stämme wurden auf Columbia-Blutagarplatten subkultiviert und nachfolgend die Virulenzgene für die Fimbrientypen F4, F5, F6 und F41, die Enterotoxine STI, STII und LTI sowie das Shigatoxin Stx2e mittels PCR bestimmt (BOSWORTH u. CASEY 1997; WIELER 2002). 3.8.5 Untersuchung auf Lawsonia (L.) intracellularis Im vorliegenden Versuch wurde L. intracellularis aus Kot- und Darmproben (Ileum, Abklatschpräparate) mittels indirektem Immunfluoreszenztest ermittelt, der im Folgenden beschrieben wird (WENDT et al. 2000): 1. Aus Kot- oder Darmproben wurde jeweils ein Objektträgerausstrich angefertigt, luftgetrocknet und in Azeton bei -20oC für 15 min. fixiert und anschließend getrocknet. 2. Die Primärantikörper (monoklonaler-Maus-Hybridom-Antikörper) wurde 1:1000 mit PBS-Puffer (pH 7,6) verdünnt. Das Konjugat (Fluoreszein-Isothiocyanat konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG, Fa. Dianova, Hamburg) wurde ebenfalls mit PBS-Puffer (pH 7,6) 1:800 verdünnt. 64 Material und Methoden 3. Die Objektträger wurden mit jeweils 100 µl verdünntem Primärantiserum überschichtet und in einer feuchten Kammer für 60 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Objektträger mit PBS-Puffer (pH 7,6) abgespült und in einer lichtgeschützten Kammer mit PBS-Puffer (pH 7,6) unter Schütteln 2mal für 10 min gewaschen und wiederum im Brutschrank getrocknet. 4. Die Ausstriche wurden mit 100 µl Konjugat überschichtet und für 30 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert und wie bei Schritt 3 abgespült und gewaschen. 5. Die Ausstriche wurden nach dem Trocknen mit Glycerin (1:30 verdünnt mit PBSPuffer) eingedeckt und mit einem Deckglas versehen, dann unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 495 nm untersucht. Lawsonien wurden mit einer brillanten Randfluoreszenz als positiv nachgewiesen. 3.9 Pathologische Untersuchung Die Tiere wurden nach dem Versuchende (4 Wochen nach Infektion) mit Pentobarbital (Eutha 77®, Fa. Essex Tierarznei, München) eingeschläfert und am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover seziert. Tiere mit erheblichen Krankheitssymptomen wurden aus Tierschutzgründen bereits vor Ablauf der vorgesehenen Versuchszeit euthanasiert und seziert. 3.9.1 Gewinnung von Probenmaterial und pathomorphologische Untersuchung Der Tierkörper wurde in Rückenlage verbracht und in der Medianen die Bauchhöhle eröffnet. Die Speiseröhre wurde nach ihrem Durchtritt durch das Zwerchfell mit einer doppelten Ligatur abgebunden und kranial durchtrennt. Anschließend wurde das Rektum abgebunden und kaudal durchtrennt. Danach wurde der gesamte Gastrointestinaltrakt an seiner dorsalen Befestigung herauspräpariert und in toto mit Magen, Dünn- und Dickdarm aus der Körperhöhle entfernt. Anschließend wurden ca. 10 cm lange Darmproben für die mikrobiologische Untersuchung steril durch Abbinden wie folgt entnommen: - Eine Probe vom Jejunum zur Untersuchung auf Salmonella spp. und hämolysierende E. coli 65 Material und Methoden - Eine Probe vom Ileum zur Untersuchung auf Lawsonia intracellularis - Eine Probe vom Zäkum zur Untersuchung auf Brachyspira spp. - Zwei Proben vom Kolon (proximales und distales Kolon) zur Untersuchung auf Brachyspira spp. Die Darmproben wurden gekühlt zum Institut für Mikrobiologie und zur Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover transportiert und auf Brachyspiren, Salmonellen, Lawsonia intracellularis und hämolysierende E. coli untersucht. Nach der Probenentnahme wurde der gesamte Gastrointestinaltrakt mit der Schere der Länge nach eröffnet und die Mukosa mit Wasser vorsichtig abgespült. Mögliche pathologische Veränderungen der Dickdarmschleimhaut sowie des Darminhalts wurden dann nach folgendem Bewertungsscore makroskopisch erfasst (Tab. 9; BILIC u. BILKEI 2003). Tab. 9: Score für die makroskopische Bewertung der Dickdarmschleimhaut und des Darminhaltes 0= ohne besonderen Befund (o.b.B.) 1= Darmschleimhaut erscheint hyperämisch und ödematisiert, Darminhalt dickbreiig - gering- bis mittelgradige, katarrhalische Kolitis 2= milde Mukosaverdickung mit oberflächlichem Mukus und Fibrin sowie fokalen Schleimhautblutungen, Darminhalt breiig-pastös - gering- bis mittelgradige, fibrinöse Kolitis 3= deutliche Mukosaverdickung, bedeckt mit Mukus oder mukofibrinöser Pseudomembran sowie oberflächlichen herdförmigen Nekrosen; Darminhalt dünnbreiig bis flüssig, zementfarben - mittel - bis hochgradige, fibrinösnekrotisierende Kolitis Weiterhin wurden alle übrigen Organe makroskopisch auf pathologische Veränderungen untersucht. 66 Material und Methoden 3.9.2 Histologische Untersuchung Für die histologischen Untersuchungen wurden je Darmabschnitt ein etwa 10 cm langes, geschlossenes Stück aus folgenden Lokalisationen entnommen und mit Fixierungslösung gespült: - proximales Duodenum und mittleres Jejunum - Ileum: ca. 10 cm vor der Ileozäkalklappe - Zäkum: die makroskopisch deutlichste Veränderung oder frei entnommen - proximales Kolon: die makroskopisch deutlichste Veränderung oder 10 cm nach Ileozäkalklappe - mittleres Kolon: die makroskopisch deutlichste Veränderung oder frei entnommen - distales Kolon: die makroskopisch deutlichste Veränderung oder frei entnommen - Mesenteriallymphknoten von Dickdarm Fielen makroskopische Veränderungen am Darm auf, wurden entsprechende Proben von den am deutlichsten veränderten Lokalisationen entnommen. Von den übrigen Organen wurden nur im Fall von makroskopischen Veränderungen repräsentative Proben fixiert. Die Gewebeproben wurden im Labor des Instituts für Pathologie der Tierärztliche Hochschule Hannover in 10%igem ungepufferten Formalin (Fa. CVH Chemie Vertrieb, Hannover) für mindestens 24 Stunden fixiert. Zur Einbettung in Paraffin wurde eine Scheibe des Darmquerschnittes in der Stärke 3-4 mm an der am stärksten veränderten Stelle zugeschnitten und in Einbettungskapseln verbracht. Die Entwässerung der fixierten Gewebeproben erfolgte nach einem standardisierten Laborprotokoll mit Hilfe eines Gewebeeinbettungsautomaten (Pathcentre, Fa. Thermo Electron Cooperation, Dreieich). Danach wurde die Einbettung in Metallschalen mit 60°C warmem Paraffin (Histokomb Plus®, Fa. Vogel, Gießen) durchgeführt. Aus den Paraffinblöcken wurden mit einem Schlittenmikrotom (Fa. Mikrom, Heidelberg) 1 bis 4 µm dicke Schnitte angefertigt, in einem Wasserbad bei 55°C gestreckt und auf SuperFrost-Objektträger aufgezogen und bei 37°C im Wärmeschrank getrocknet. Nach der automatisierten Entparaffinierung in einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Präparate mit der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung (s. Anhang unter 9.3) in einem Färbeautomaten (Fa. Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Nussloch) gefärbt und im 67 Material und Methoden Eindeckautomat (Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000, Fa. MEDITE, Burgdorf) mit Deckgläschen eingedeckt. Lichtmikroskopische Beurteilung von histologischen Schnitten Die histologischen Veränderungen der Darmschleimhaut wurden mit Hilfe eines Lichtmikroskops im Bereich von Ileozäkalklappe, Zäkum, proximalem und distalem Kolon nach den in Tabelle 10 aufgeführten Kriterien semiquantitativ beurteilt. Dabei erfolgte die Bewertung der Veränderungen „Mukosaverdickung“, „Kryptdilatation“, „Kryptabszess“ und „Ulzeration“ bei 100facher Vergrößerung im Lichtmikroskop. Der Parameter „Fibrinauflagerungen“ wurden bei 40facher Vergrößerung evaluiert. Die Anzahl von „Entzündungszellen in der Lamina propria mucosae“ wurde mit Hilfe eines Zählfeldokulars geschätzt und mit denen der unbehandelten Kontrollgruppen verglichen. Dabei wurden alle Lymphozyten, Makrophagen, neutrophile Granulozyten und eosinophile Granulozyten gezählt und gleichwertig berücksichtigt. Lymphozyten wurden nicht näher nach ihren Subtypen differenziert. Als Normalwert („normal“) wurde die durchschnittliche Anzahl der Leukozyten in den untersuchten Darmabschnitten der Kontrolltiere definiert. Mit diesem Wert wurden die Ergebnisse der Versuchsgruppen verglichen. Als „geringgradig“ (score „1“) wurde ein Anstieg von 1 % - 50 % an Infiltraten in der Lamina propria mucosa bewertet im Vergleich zum Durchschnittswert bei den Kontrolltieren. Als „mittel- bis hochgradig“ (score „2“) galten Tiere mit einem Anstieg an Entzündungszellinfiltraten in der Lamina propria mucosa von mehr als 50 %. Die Anzahl der Becherzellen pro Krypte wurde quantitativ erfasst. Dabei wurden als „normal“ 7 –15 Becherzellen pro Krypte (Score 0) und als „Becherzellhyperplasie“ > 15 Becherzellen pro Krypte (Score 1) definiert. Außerdem wurden die Veränderungen in Submukosa und Serosa ebenfalls notiert und qualitativ beschrieben. Die histologischen Veränderungen der anderen Darmabschnitte (Duodenum, Jejunum und Ileum) sowie Veränderungen in anderen Organen wurden nicht nach dem Scoresystem, sondern nur qualitativ beurteilt und dokumentiert. 68 Material und Methoden Tab. 10: Histologischer Bewertungsscore für alle Dickdarmabschnitte Kriterien Bewertungsscore Mukosaverdickung Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 4 0= 1= nicht vorhanden (≤ als 1/2 des mikroskopischen Gesichtsfeldes*) vorhanden (> als 1/2 des mikroskopischen Gesichtsfeldes*) Kryptdilatation Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 8 0= 1= 2= Keine mäßig ausgeprägt (1-3 dilatierte Krypten/Gesichtsfeld*) deutlich ausgeprägt (> 3 dilatierte Krypten/Gesichtsfeld*) Kryptabszess Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 8 0= 1= 2= Keine 1 bis 5 Kryptabszesse je Gesichtsfeld* mehr als 5 Kryptabszesse je Gesichtsfeld* Ulzeration Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 8 0= 1= 2= nicht vorhanden lokal, geringgradig (1 bis 3 Ulzerationen gefunden/Gesichtsfeld*) diffus, mittelgradig bis hochgradig (> 3 Ulzerationen gefunden /Gesichtsfeld*) Becherzellhyperplasie Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 4 0= nicht vorhanden (normale Verteilung der zwischen 7- 15 Becherzellen/Krypte vorhanden (mehr als 15 Becherzellen/Krypte) Pseudomembran/ Fibrinauflagerungen Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 12 0= 1= 2= 1= 3= Entzündungzellen in 0 = der Lamina propria 1= Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 8 2= Hyperämie Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 8 Max. gesamter Score für 4 Darmabschnitte = 60 0= 1= 2= Becherzellen nicht vorhanden 1 Lokalisation mit einer Fläche von max. ¼ Gesichtsfeld. 2-4 fibrinöse Herde über einer Fläche von jeweils max. ¼ Gesichtsfeld oder ein einzelner mit einer Fläche von max. ½ Gesichtsfeld** 5 fibrinöse Herde über eine Fläche von jeweils max. ¼ Gesichtsfeld** oder ein einzelner mit einer Fläche von mehr als ½ Gesichtsfeld** Normal (Durchschnitt der Anzahl der Entzündungszellen der Kontrolltiere) geringgradig vermehrte Entzündungszellinfiltrate (1-50 % über dem Durchschnitt) mittel- und hochgradig vermehrte Entzündungszellinfiltrat (>50 % über dem Durchschnitt) nicht vorhanden 1 bis 3 Lokalisationen (lokal) mehr als 3 Lokalisationen (diffus) Max. Score für einen Darmabschnitt = 15 * Gesichtsfeld = Bildausschnitt im Mikroskop bei 100facher Vergrößerung für Parameter „Mukosaverdickung“, „Kryptdilatation“, „Kryptabszess“ und „Ulzeration“; ** Gesichtsfeld = Bildausschnitt im Mikroskop bei 40facher Vergrößerung für Parameter „Fibrinauflagerungen“ 69 Material und Methoden 3.10 Untersuchung klinisch-chemischer Parameter aus Blut- und Harnproben 3.10.1 Untersuchung von Blutparametern Die Blut- und Harnproben wurden vor experimenteller Infektion bzw. am Ende der Versuchsperiode jeweils parallel entnommen. Zur Durchführung der Blutentnahme wurden die Schweine auf dem Rücken liegend von einer Hilfsperson fixiert, so dass eine Blutprobe aus der Vena cava cranialis oder Vena jugularis mit steriler Einmalkanüle entnommen werden konnte. Dazu wurden jeweils eine EDTA-, Heparin- und Serumprobe (Monovette® 4,5 ml LH, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) entnommen. Das Blut wurde bei 4000 U/min (2000 G, 15 min) zentrifugiert, das Plasma abpipettiert und bei -20°C im Eppendorfhütchen eingefroren. Die Bestimmung der Blutparameter (s. Tabelle 11, incl. Variationskoeffizienten für den methodischen Fehler) wurden im Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. 70 Material und Methoden Tab. 11: In Blut und Plasma analysierte Messgrößen, dazugehörige Untersuchungsmethodik und Variationskoeffizienten (Vk) Parameter Blut: Erythrozyten Leukozyten Analysemethode Die Ermittlung der Leukozytenzahl, Erythrozytenzahl und Hämoglobin erfolgten mittels Blutbildanalysegerät (Modell MEK-6108G Fa. Nihon Kohden Europe GmbH, Rosbach). Das Prinzip der Zellzählung beruht auf einem Impedanzänderungsverfahren Vk (%) 0,89 0,75 Hämoglobin Cyanhämiglobin, Coulter Counter (Fa. Nihon Kohden, Kleinmachow) 0,91 Hämatokrit Mikrozentrifugation bei 1300 g/min für 12 min (Biofuge haemo Fa. Heraeus Instruments, Hanau) 1,24 MCHC =Hämoglobin (mmol/l) x100 / Hämatokrit (l/l) - enzymatischer Farbtest, PAP-Methode (Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin), Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). 5,76 Harnstoff Urease (Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin) , Reflotron (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) 10,30 Kalzium O-Kresolphtalein (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim), Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). 3,49 Phosphor 3,82 Natrium Molybdänblau (Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin), Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). Flammenphotometer (Fa. Bayer Diagnostics, Fernwald) 0,57 Kalium Flammenphotometer (Fa. Bayer Diagnostics, Fernwald) 0,92 Plasma: Kreatinin 3.10.2 Untersuchung von Harnparametern Vor Beginn der experimentellen Infektion wurde zunächst die Entnahme der Harnproben gleichzeitig mit der Blutentnahme durchgeführt. Die Harngewinnung erfolgte durch präpubale Punktion der Harnblase mittels steriler Einmalkanülen und Spritzen. Am Versuchsende 71 Material und Methoden wurden die Harnproben bei der Sektion direkt nach der Eröffnung der Bauchhöhle aus der Harnblase gewonnen. Bezüglich der Harnaufbereitung ist zu ergänzen, dass vor dem Zentrifugieren der Harn mit 0,36 normaler Perchlorsäure im Verhältnis 1:6 für das Auflösen von mineralischem Sediment angesäuert wurde. Die Zentrifugation wurde mit 1300 U/min (200 G) für 10 min durchgeführt. Die Bestimmung der Parameter (s. Tab. 12) in den Harnproben erfolgte im Labor der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover Tab. 12: Im Harn analysierte Messgrößen, dazugehörige Untersuchungsmethodik und Variationskoeffizienten (Vk). Parameter Analysemethode Protein Teststreifen (Combur-9-Test®, Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) Spez. Gewicht Kreatinin URICON-N Refraktometer (Fa. Atago, Japan) Kalzium Phosphor Vk (%) - enzymatischer Farbtest, PAP-Methode (Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin). - Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). - Cobas Mira Plus (Fa. Roche, Mannheim)* O-Kresolphtalein (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) - Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). - Cobas Mira Plus (Fa. Roche, Mannheim)* Natrium Molybdänblau (Fa. Labor und Technik, Eberhardt Lehmann, Berlin) - Spektralphotometer Uvikon 930 (Fa. Bio-Tek Instruments, Neufahrn). - Cobas Mira Plus (Fa. Roche, Mannheim)* Flammenphotometer (Fa. Bayer Diagnostics, Fernwald) Kalium Flammenphotometer (Fa. Bayer Diagnostics, Fernwald) 3,66 5,94 3,58 5,72 3,76 0,88 0,97 * Ab Oktober 2006 wurde die Bestimmung der gekennzeichneten Harnparameter aus labortechnischen Gründen mit dem Autoanalyser Cobas Mira Plus vorgenommen. 72 Material und Methoden 3.10.3 Auswertung Die endogene Kreatinin-Clearance wurde durch Schätzung der renalen Exkretion des Kreatinins (ohne quantitative Harnsammlung) und Bestimmung der Plasma-KreatininKonzentration (Pl-Kreat) ermittelt. Unter der Annahme einer konstanten KreatininFreisetzung aus der Muskulatur in das Plasma und einer ausschließlich renalen KreatininElimination aus dem Plasma kann ohne die aufwändige Messung des Harnzeitvolumens (Vu) die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) als endogene Kreatininclearance, das Vu und damit auch die renale Clearance und Ausscheidung anderer Substanzen (Exkretion (E)) geschätzt werden, wenn E-Kreat der betreffenden Tierart und Alters- bzw. Gewichtsgruppe bekannt ist und Plasma (Pl)- sowie Harn (U)-Konzentrationen der betreffenden Substanzen bestimmt werden (WALDMANN et al. 1991): GFR = E-Kreat/Pl-Kreat (μl/min/kg) Vu = E-Kreat/U-Kreat (μl/min/kg) Clr-Na = (E-Kreat/U-Kreat) x (U-Na/Pl-Na) (μl/min/kg) E-Na = (E-Kreat/U-Kreat) x U-Na (nmol/min/kg) E-Kreat wurde als gewichtsabhängige Konstante geschätzt und sowohl das Harnzeitvolumen als auch die GFR daraus ermittelt. Die entsprechende Formel für diese Schätzung wurde aus einer Arbeit an 79 Schweinen im Gewichtsbereich zwischen 1,5 und 230 kg, in der eine enge Korrelation zwischen E-Kreat und dem Körpergewicht bewiesen werden konnte, übernommen (WALDMANN et al. 1991): E-Kreat (nmol/min/kg) = 83,6 x lg (Gewicht(kg)) + 86,1 Elektrolyte werden sowohl glomerulär filtriert als auch tubulär sezerniert und reabsorbiert. Zur Bestimmung des prozentualen Anteils der tatsächlich ausgeschiedenen Menge an der 73 Material und Methoden glomerulär filtrierten Gesamtmenge eines Stoffes wird die fraktionelle Exkretion (FE) herangezogen. FE-Wasser (%) = (Pl-Kreatinin / U-Kreatinin) x 100 FE-Na (%) = (Pl-Kreatinin / U-Kreatinin) x (U-Na / Pl-Na) x 100 Für Ca, P und K wurde die fraktionelle Exkretion ebenso wie für die Berechnung von FE-Na ermittelt. 3.11 Statistische Auswertung Die Datenerfassung wurde in Microsoft® Excel Version 2002 für Windows durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des SAS®-Computerprogramms (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) mit freundlicher Unterstützung des Institutes für Biometrie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die gewonnenen Ergebnisse wurden zunächst deskriptiv dargestellt. Die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung aus Kot- und Darmproben wurden als prozentualer Anteil positiver Tiere angegeben. Die Parameter der klinischen Untersuchung (Fieber, Kotkonsistenz, Verhalten, Futteraufnahme, Gewichtszunahme und Futterauswertung), die pathologischen (makroskopisch, histologisch) Veränderungen bzw. die dazugehörigen Scores und die Parameter der Blut- und Harnuntersuchung wurden als Mittelwerte (X), Standardabweichungen (s), Median, Minimum (Min) und Maximum (Max) dargestellt. Es wurde die Normalverteilung der Daten durch vier verschiedene Tests (Shapiro-Wilk-Test, Kolmogorov-Smirnov-Test, Cramer-von-Mises-Test, Anderson-Darling-Test) (Proc Univariate) geprüft. Bei den normalverteilten Daten wurde die Feststellung von statistischen Unterschieden zwischen zwei oder mehreren Gruppen mittels Student-t-Test bzw. Ein-WegVarianzanalyse-Test mit dem Statistisches Auswertungssystem (proc TTest und Proc GLM) bestimmt. Das Signifikanzniveau wurde auf 5% (p < 0,05) festgelegt. Bei den nicht annähernd standard-normalverteilten Daten erfolgte der Gruppenvergleich durch einen Kruskal-WallisTest und der Paarvergleich mittels Wilcoxon-Zwei-Stichproben-Test (proc NPR1WAY ). 74 Material und Methoden Die Messwerte der Blut- und Harnparameter wurden zum einen mit den Referenzwerten von gesunden Schweinen (WALDMANN 1994, HEINRITZI u. PLONAIT 2004) verglichen, zum anderen erfolgte ein Vergleich der Ausgangswerte vor Infektion mit den Werten zum Zeitpunkt der Sektion innerhalb der Gruppen sowie ein Vergleich zwischen Versuchsgruppen und Kontrollgruppe. Zum Vergleich der hämatologischen Werte und Nierenfunktionsparameter wurden die Messwerte bei fehlender Normalverteilung transformiert (log-Transformation oder ArcsinTransformation (Prozent-Werte)). Der Student t-Test für paarige Stichproben wurde daraufhin verwendet, um die Parameter vor der Infektion und am Ende des Versuches (Sektion) zu vergleichen. Zusätzlich wurde der statistische Vergleich der verschiedenen Versuchsgruppen mittels Ein-Weg-Varianzanalyse-Test durchgeführt. Statistische Differenzen wurden durch Markierung mit unterschiedlichen Buchstaben (a, b und c) angegeben, die bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p < 0,05 mit (*), bei p<0,01 † mit ( ) und p<0,001 mit (††) gekennzeichnet wurden. Die Werte, die mit dem gleichen Buchstaben gekennzeichnet sind, wurden als statistisch nicht signifikant definiert. Für die graphischen Darstellungen wurde das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft® Excel Version 2002 verwendet. Das Versuchsvorhaben wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit unter dem Aktenzeichen 33-42502-03/681 genehmigt. 75 Ergebnisse 4. ERGEBNISSE Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden drei Versuche (Vorversuch, Versuch 1 und Versuch 2) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden nach den jeweiligen Untersuchungsparametern dargestellt, um die Versuchsgruppen vergleichen zu können. 4.1 Ergebnisse der Untersuchungen auf Brachyspiren 4.1.1 Vorversuch Mit dem Ziel, das Infektionsmodell mit B. hyodysenteriae bezüglich möglicher auslösender Faktoren für die Provokation einer klinischen Erkrankung überprüfen zu können, wurden drei Versuchsgruppen, die mit dem B.-hyodysenteriae-Feldstamm 7304/03 infiziert wurden, und eine Kontrollgruppe untersucht. Die mikrobiologischen Untersuchungen vor Versuchsbeginn, während der Versuchsperiode und am Ende des Versuches zeigten keine Hinweise auf das Vorkommen von Salmonella spp., hämolysierenden E. coli sowie Lawsonia intracellularis in den Kotproben bzw. den Darmproben. Die Ergebnisse der Untersuchung auf B. hyodysenteriae wurden in der Tabelle 13 dargestellt. Tab. 13: Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben Versuchsgruppe Anzahl der Tiere (n) 1 5 2 5 3 5 4 5 experimentelle Infektion Futterration bzw. Behandlung vor der Infektion B. hyodysenteriae 7304/03 B. hyodysenteriae 7304/03 B. hyodysenteriae 7304/03 nicht infiziert (Kontrollgruppe) Kontrollfutter “Maisfutter” Kontrollfutter Dexamethason Kontrollfutter 76 Anzahl der B.hyodysenteriaepositiven Schweine KotDarmproben proben Gesamtzahl (Prozent) der positiven Schweine 0 0 0 0 0 0 5 5 5 (100) 0 0 0 Ergebnisse Bei den nur mit Kontrollfutter- bzw. „Maisfutter“ gefütterten Gruppen wurden B. hyodysenteriae während der Versuchsdauer weder aus Kot- noch aus Dickdarmproben isoliert. B. hyodysenteriae konnte dagegen bei allen Versuchstieren (100%) der Gruppe 3 (mit Dexamethason behandelte Gruppe) sowohl aus Kotproben beginnend zwei Wochen nach der Infektion als auch aus Dickdarmproben am Versuchende reisoliert werden. Die Untersuchung auf Brachyspiren ergab bei der Kontrollgruppe immer ein negatives Ergebnis. 4.1.2 Versuch 1 - Infektionsversuche unter Dexamethason-Behandlung Versuch 1 erfolgte unter Berücksichtigung der Ergebnisse des Vorversuches, um die Pathogenität der schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten B. innocens, B. intermedia und B. murdochii zu überprüfen. Alle Versuchstiere wurden mit Dexamethason drei Tage vor erster Infektion bis elf Tage danach behandelt und mit Kontrollfutter gefüttert. In diesem Versuch galt die mit B.-hyodysenteriae-Stamm 7304/03 infizierte Gruppe als positive Kontrollgruppe. Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen vor Versuchsbeginn, während der Versuchsperiode und am Ende des Versuches zeigten keine Hinweise auf das Vorkommen von Salmonella spp., hämolysierenden E. coli sowie Lawsonia intracellularis in den Kotproben bzw. den Darmproben. Jedoch wurde bei einer Reihe von Versuchstieren vor Versuchsbeginn mikroskopisch ein geringgradiger Keimgehalt an Spirochäten nachgewiesen. Diese Spirochäten konnten aber nicht in Reinkultur gebracht werden bzw. ließen sich nicht subkultivieren. Auch mittels einer PCR von dem Kulturmaterial konnte keine bekannte Brachyspira-Art nachgewiesen werden. Diese Tiere wurden vor dem Versuch mit Tiamulin behandelt (s. 3.3.2, Tiamulin-Behandlung). Die Resultate der Untersuchung auf Brachyspiren wurden in der Tabelle 14 aufgeführt. 77 Ergebnisse Tab. 14: Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae sowie mit B. innocens, B. intermedia und B. murdochii nach Dexamethason-Gabe (Versuch 1): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben Anzahl der Brachyspirapositiven Schweine Anzahl der Tiere (n) Behandlung B. hyodysenteriae 11 B. innocens* Versuchsgruppe Gesamtzahl (Prozent) der positiven Schweine Kotproben Darmproben Dexamethason 2 3 3/11 (27) 10 Dexamethason 7 7 7/10 (70) B. intermedia 5 Dexamethason 1 1 1/5 (20) B. murdochii* 10 Dexamethason 6 6 6/10 (60) Kontrolle 8 Dexamethason 0 0 0 (0) *Es wurden 2 verschiedene Feldstämme für die experimentelle Infektion verwendet (s. 3.6.2) Der Anteil der Brachyspira-positiven Schweine war in der mit B. hyodysenteriae infizierten Gruppe mit 27 % deutlich geringer als im Vorversuch. Die Häufigkeit der Reisolierung nach der Infektion war am höchsten bei der mit B. innocens infizierten Gruppe (70%), es folgten die mit B. murdochii (60%) und die mit B. intermedia infizierten Gruppen (20%). Die Abbildung 4 zeigt die unterschiedlichen Ausscheidungsraten von Brachyspiren über den Kot im Verlaufe des Versuches bei den Versuchsgruppen. B. innocens und B. murdochii wurden erstmals 2-4 Tage nach der letzten Infektion aus dem Kot wieder isoliert und weiter bis zur vierten Woche ausgeschieden. Dagegen konnten die ersten positiven Proben bei den B.-hyodysenteriae- und B.-intermedia-infizierten Gruppen erst in der dritten bzw. vierten Woche p. inf. nachgewiesen werden. Der Prozentsatz der positiven Isolate aus den bei der Sektion gewonnenen Darmproben unterschied sich bezüglich der Lokalisationen (Zäkum-, proximale und distale Kolonschleimhaut) nur bei den mit B. murdochii und B. innocens infizierten Gruppen (siehe Abb. 4). Brachyspiren konnten bei der Kontrollgruppe in keiner Probe nachgewiesen werden. 78 Anteil der Brachyspiren-positiven Schweine (%) Ergebnisse 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 3. InfektionsTag 2-4 Tage p.inf. Woche 1 p.inf. Woche 2 p.inf. Woche 3 p.inf. Woche 4 p.inf. Zäkum prox. Kolon dist. Kolon Zeitpunkt der Entnahme der Kotproben bzw. Dickdarmproben B.hyo B. hyo hyodysenteriae B. intermedia B. intermedia B. innocens B. innocens B. murdochii B. murdochii Kontrolle Kontrolle Abb. 4: Vergleich des prozentualen Anteiles der Brachyspira-positiven Proben im zeitlichen Verlauf nach der Infektion in Versuch 1. 4.1.3 Versuch 2 - Infektionsversuch unter zusätzlicher Fütterung von Sojaextraktionsschrot In diesem Versuch wurden alle Tiere vier Tage vor Versuchsbeginn bis drei Tage danach mit dem „Sojafutter“ (50 % Kontrollfutter + 50 % Sojaextraktionsschrot) versorgt, um den Einfluss auf die Entwicklung einer klinischen Erkrankung bei den Versuchstieren zu prüfen (JACOBSON et al. 2004). Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen vor Versuchsbeginn, während der Versuchsperiode und am Ende des Versuches zeigten keine Hinweise auf das Vorkommen von Salmonella spp. sowie Lawsonia intracellularis in den Kotproben bzw. den Darmproben. Jedoch konnte vor Versuchsbeginn eine Infektion mit hämolysierenden E. coli bei zehn Schweinen nachgewiesen werden, die antibiotisch behandelt wurden (s. 3.3.2). Während der Versuchsdauer bzw. am Versuchsende ergaben sich keine Hinweise auf das Vorkommen von hämolysierenden E. coli in den untersuchten Kot- und Darmproben. 79 Ergebnisse Die Daten von Tabelle 16 zeigen eine hohe Wiederfindungsrate aus Kot- und Dickdarmproben bei den mit B. hyodysenteriae und B. innocens infizierten Gruppen (100 % der Tiere), während B. intermedia bei 9 von 10 Tieren (90%) und B. murdochii bei 18 von 24 Schweinen (75%) aus Kot- und Darmproben kulturell nachgewiesen werden konnten. Bei der Kontrollgruppe wiesen die Untersuchungen auf Brachyspiren über den Versuchszeitraum immer ein negatives Ergebnis auf. Tab. 15: Ergebnisse nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae sowie mit B. innocens, B. intermedia und B. murdochii bei Einsatz des „Sojafutters“ (Versuch 2): Untersuchung von Kot- und Dickdarmproben Versuchsgruppe Anzahl der Tiere Anzahl der Brachyspira-positiven Schweine Fütterung Kotproben Darmproben Gesamtzahl (Prozent) der positive Schweine B. hyodysenteriae* 15 “Sojafutter“ 15 15 15/15 (100) B. innocens** 15 “Sojafutter“ 15 15 15/15 (100) B. intermedia* 10 “Sojafutter“ 9 9 9/10 (90) B. murdochii*** 24 “Sojafutter“ 18 18 18/24 (75) Kontrolle 3 “Sojafutter“ 0 0 0 (0) Anzahl der für die experimentelle Infektion verwendeten Stämme: * 2, ** 3, *** 4 (s. 3.6.3) Abbildung 5 gibt einen Überblick über die Nachweisrate von Brachyspiren zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten und bei der Sektion. Bei allen vier Versuchsgruppen wurden Brachyspiren am dritten Infektionstag erstmalig im Kot gefunden (Abb. 5). Eine fäkale Ausscheidung von B. hyodysenteriae konnte schon nach einer Woche p. inf. für 100% der Tiere belegt werden und hielt weiter bis zum Ende des Versuches an. Im Vergleich dazu wurde die höchste Ausscheidungsrate für B. intermedia zur 3. Woche, für B. innocens und B. murdochii zur 4. Woche p. inf. beobachtet. Darüber hinaus gab es einen 80 Ergebnisse Unterschied in der Nachweisrate von Brachyspiren aus Zäkum- und Kolonproben bei den mit den schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten infizierten Gruppen. Der Nachweis gelang Anteil der Brachyspiren-positiven Schweine (%) demnach häufiger aus den Kolonabschnitten als aus den Zäkum (Abb. 5). 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 3. InfektionsTag 2-4 Tage p.inf. Woche 1 p.inf. Woche 2 p.inf. W oche 3 p.inf. W oche 4 p.inf. Zäkum prox. Kolon dist. Kolon Zeitpunk der Zeitpunkt derEntnahme Entnahmevon vonKotKot- und Dickdarmproben B.hyodysenteriae B. hyodysenteriae B. intermedia B.innocens B. innocens B.murdochii B. murdochii Kontrolle Abb. 5: Vergleich des prozentualen Anteiles der Brachyspira-positiven Proben im zeitlichen Verlauf nach der Infektion in Versuch 2 4.1.4 Vergleich der Ergebnisse für die mit Dexamethason behandelte Gruppe (Versuch 1) und die mit „Sojafutter“ gefütterte Gruppe (Versuch 2) Abbildung 6 zeigt vergleichend den Anteil Brachyspira-positiver Versuchstiere bei den mit Dexamethason behandelten und den mit „Sojafutter“ gefütterten Gruppen. Die Reisolierung von B. hyodysenteriae, B. innocens und B. intermedia bei den mit „Sojafutter“ gefütterten Gruppen gelang häufiger als bei den mit Dexamethason-behandelten Gruppen, während sich die Nachweisrate von B. murdochii in beiden Versuchen kaum unterschied (s. Abb. 6). 81 Ergebnisse Anteil der Brachyspira-positiven Tiere (%) 100 100 90 100 90 75 70 80 70 70 60 50 40 27.3 20 30 20 10 0 0 0 Dexa.-behandelte Gruppe B. hyodysenteriae "Sojafutter"-Gruppe B. innocens B. intermedia B. murdochii Kontrolle Abb. 6: Prozentsatz der Brachyspira-positiven Schweine nach experimenteller Infektion in Versuch 1 (Kontrollfutter + Dexamethason) und Versuch 2 („Sojafutter“ ohne Dexamethason-Gabe) 4.2 Ergebnisse der klinischen Untersuchung Die klinische Symptomatik nach der Infektion ist ein wichtiger Parameter zur Einschätzung der Pathogenität der geprüften Brachyspiren. Die klinischen Untersuchungen erfolgten täglich nach dem Scoresystem wie in Kapitel 3.7 beschrieben. 4.2.1 Vorversuch Die Ergebnisse der klinischen Untersuchung der Versuchstiere nach der Infektion mit B. hyodysenteriae (Feldstamm 7304/03) wurden in der Tabelle 16 dargestellt. Die Tiere der Dexamethason-behandelten Gruppe zeigten einen signifikant höheren mittleren klinischen Gesamtscore (p<0,05) im Vergleich mit den anderen Versuchsgruppen bzw. mit der Kontrollgruppe. 82 Ergebnisse Im Verlauf des Beobachtungszeitraums waren Symptome einer Schweinedysenterie nur bei der Dexamethason-behandelten Gruppe zu erkennen (einzige Gruppe mit Nachweis von B. hyodysenteriae). Nach einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 20,5 Tagen (Variation von 16 bis 25 Tage) wiesen vier von fünf Dexamethason-behandelten Tieren ein deutlich gestörtes Allgemeinbefinden mit muko-hämorrhagischen Diarrhoesymptomen auf. Die Veränderungen hinsichtlich der Kotkonsistenz und -farbe variierten von dünnbreiigem, zementfarbenen bis zu dünnflüssigem, dunkelbraunen Kot, in dem gering- bis hochgradige Mukus- und Blutbeimengungen erkennbar waren. Der Durchfall konnte für 9 bis 19 Tage jeweils bis zur Sektion beobachtet werden. Anhand der nachstehenden Tabelle 16 wird deutlich, dass ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) in den Scores für Kotkonsistenz zwischen den Dexamethason-behandelten Tieren und den übrigen Gruppen beobachtet werden konnte. Auch einzelne Tiere der „Maisfutter“-Gruppe ließen zeitweilig (1 bis 2 Tage) einen milden Durchfall erkennen. Nur bei den Dexamethason-behandelten Tieren war das Allgemeinbefinden gestört und die Futteraufnahme deutlich herabgesetzt oder eingestellt (0,65±0,30 und 0,95±0,48 versus 0,0 ± 0,0 bei den übrigen Gruppen). Nur bezüglich des Versuchsgruppen Parameters und Fieber war Kontrollgruppe Dexamethason-behandelten Tiere zu variierte Durchfallgeschehens. 83 kein signifikanter beobachten. Die von bis 36,6 Unterschied zwischen Körpertemperatur 40,1oC während der des Ergebnisse Tab. 16: Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) Mittlerer klinischer Score für einen Versuchstag1 Kontrollfutter- „Maisfutter“Gruppe Gruppe Dexamethasonbehandelte Gruppe +Kontrollfutter n=5 NegativKontrollgruppe n=5 n=5 0,14a ±0,04 0,14 0,07 - 0,19 0,77b*±0,27 1,17c*±0,33 0,11a±0,08 0,89 0,44 - 1,0 1,03 0,85 - 1,71 0,07 0,02 - 0,23 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,65±0,30 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 0,68 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,29 - 1,06 0,0 - 0,0 0,0± 0,0 0,0 0,0± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,95±0,48 1,15 0,29 – 1,50 0,0± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 x ±s Median 0,03a±0,04 0,23 a ±0,27 0,02a ±0,017 0,02 0,11 0,03 0,04 a ±0,02 0,05 Min – Max 0,0 - 0,29 0,0 - 0,56 0,0 - 0,03 0,02 - 0,08 n=5 Kotkonsistenz (Score 0-3) x ±s Median Min – Max Verhalten (Score 0-2) x ±s Median Min – Max Futteraufnahme (Score 0-3) x ±s Median Min – Max Fieber (Score 0-1) Gesamtscore (aller vier Parameter) x ±s 0,17a± 0,03 0,22a ± 0,05 2,79b*±1,05 0,15a ±0,10 Median Min –Max 0,16 0,13 - 0,21 0,21 0,14 - 0,29 3,03 1,62 - 4,26 0,09 0,07 - 0,31 1 Für die Ermittlung des durchschnittlichen klinischen Scores für einen Versuchstag wurden die täglich bestimmten Scores für den jeweiligen klinischen Parameter aufaddiert und durch die Anzahl der Versuchstage geteilt. Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*) 84 Ergebnisse 4.2.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) Die Ergebnisse der klinischen Untersuchung von mit Dexamethason behandelten Versuchsgruppen nach der Infektion mit vier Brachyspira-Arten wurden in der Tabelle 17 zusammengefasst. Der Vergleich der klinischen Gesamtscores der vier Versuchsgruppen zur Kontrollgruppe zeigte, dass ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,01) zwischen Versuchsgruppen (außer der mit B. intermedia infizierten Gruppe) und Kontrollgruppe bestand. Dabei konnten signifikante Veränderungen der Kotkonsistenz während des Untersuchungszeitraums bei den mit B. hyodysenteriae (p<0,001), B. innocens (p<0,001) und B. murdochii infizierten Gruppen (p<0,01) im Vergleich zur mit B. intermedia infizierten Gruppe und Kontrollgruppe festgestellt werden. Bei zwei von 11 B.-hyodysenteriaeinfizierten Tieren wurde ein dünnbreiiger, schleimiger Durchfall für 2 bis 5 Tage, erstmalig nach 25 Tagen p. inf. beobachtet, wobei keine Blutbeimengungen im Kot zu erkennen waren. Bei der B.-innocens- und B.-murdochii-infizierten Gruppe wurde nach der Infektion in Einzelfällen dick-breiiger, zementfarbener Kot für 3 bis 18 Tage beobachtet, zeitweise war der Kot auch dünnbreiig mit geringgradigen Mukusbeimengungen. Bei diesen Tieren wurde B. innocens und B. murdochii mit hochgradigem Keimgehalt reisoliert. Veränderungen des Verhaltens wurden nur bei mit B. hyodysenteriae infizierten Tieren beobachtet. Eine signifikant eingeschränkte Futteraufnahme (p<0,05) bestand ebenfalls nur bei dieser Gruppe. Hinsichtlich der Köpertemperatur lagen im Verlauf des Beobachtungszeitraums keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen vor. Die B.-intermedia-infizierten Tiere und die Kontrolltiere zeigten keinerlei klinische Krankheitserscheinungen im Verlauf des gesamten Versuchs. 85 Ergebnisse Tab. 17: Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 1: Kontrollfutter + Dexamethason-Behandlung) B.Mittlerer hyodysenteriaeklinischer Gruppe Score für einen Versuchstag1 n=11 B.innocensGruppe B.murdochiiGruppe B.intermediaGruppe NegativKontrollgruppe n=10 n=10 n=5 n=8 0,38b†±0,25 0,26b†±0,18 0,22b*±0,17 0,20ab ±0,19 0,05a±0,09 0,36 0,20 0,21 0,21 0,02 0,0 - 0,88 0,09 - 0,67 0,03 -0,62 0,0 -0,42 0,0-0,25 0,09±0,16 0,0± 0,0 0,0± 0,0 0,0± 0,0 0,0± 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - 0,45 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,13a*±0,15 0,03b±0,03 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,08 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - 0,45 0,0 - 0,08 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,01a ±0,01 0,01a ±0,02 0,01a ±0,01 0,0 ± 0,0 0,004a±0,01 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - 0,03 0,0 - 0,06 0,0 - 0,03 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,61b†±0,52 0,30b†±0,20 0,22b*±0,16 0,20ab ±0,19 0,06a±0,09 0,53 0,24 0,22 0,21 0,02 0,0-1,79 0,06-0,75 0,06-0,62 0,0-0,42 0,0-0,28 Kotkonsistenz (Score 0-3) x ±s Median Min -Max Verhalten (Score 0-2) x ±s Median Min-Max Futteraufnahme (Score 0-3) x ±s Median Minimum Fieber (Score 0-1) x ±s Median Min -Max Gesamtscore (aller vier Parameter) x ±s Median Min –Max 1 Für die Ermittlung des durchschnittlichen klinischen Scores für einen Versuchstag wurden die täglich bestimmten Scores für den jeweiligen klinischen Parameter aufaddiert und durch die Anzahl der Versuchstage geteilt. Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*) und p<0,01 (=†). 86 Ergebnisse 4.2.3 Versuch 2 („Sojafutter“) In diesem Versuch wurden die Ergebnisse für die klinische Untersuchung der Versuchsgruppen wegen der kleinen Tieranzahl (n=3) nicht mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Tabelle 18 zeigt, dass der mittlere klinische Gesamtscore der B. hyodysenteriae infizierten Gruppe signifikant höher lag (p<0,001) als bei den übrigen Versuchsgruppen. Zwischen den 3 mit schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten infizierten Gruppen war kein statistisch signifikanter Unterschied bei den klinischen Gesamtscores zu erkennen. Im einzelnen konnte eine signifikante Veränderung der Kotkonsistenz (p<0,001) bzw. eine signifikante Erhöhung der Köpertemperatur (p<0,001) bei mit B. hyodysenteriae infizierten Tieren im Vergleich mit den übrigen drei Versuchsgruppen beobachtet werden. Dagegen gab es keinen signifikanten Unterschied in den Scores für Kotkonsistenz und Fieber zwischen den B.-innocens-, B.-murdochii- und B.-intermedia-Gruppen. Bei der B.-hyodysenteriae-Gruppe trat eine muko-hämorrhagische Diarrhoe nach einer Inkubationszeit von 1-13 Tagen auf. Die Kotkonsistenz variierte von dünnbreiigzementfarben bis dünnflüssig bei dunkelbrauner oder Schokoladenfarbe. Blut und Schleim fanden sich im Kot in hochgradigen Mengen, teilweise in Form fadenartiger, hellgrauer homogener Schleimüberzüge. 3-9 Tage nach dem Auftreten der blutigen Diarrhoe wurden die Tiere einer Sektion zugeführt. Fieber trat bei fast allen Durchfalltieren im Bereich von 40,0oC - 40,7oC auf. Die Durchfalltiere zeigten einen Gewichtsverlust von 1-4 kg während der Durchfallperiode. Aus der Tabelle 18 wird erkennbar, dass Veränderungen der Parameter Verhalten und Futteraufnahme nur bei Tieren der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe bei Scorewerten von 0,86±0,32 bzw. 1,12±0,44 festgestellt wurden. Die Tiere der übrigen Versuchsgruppen wiesen keine klinischen Erscheinungen auf. Bei der Kontrollgruppe waren ebenfalls während des gesamten Untersuchungszeitraums keine klinisch auffälligen Symptome zu beobachten. 87 Ergebnisse Tab. 18: Ergebnisse der klinischen Untersuchung nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 2: „Sojafutter“,) B.innocensGruppe n=15 B.murdochii Gruppe n=24 B.intermediaGruppe n=10 NegativKontrollgruppe n=3 1,45a††±0,59 0,19b±0,23 0,09b ±0,08 0,08b±0,06 0,03±0,05 1,35 0,09 0,12 0,10 0,0 0,71 - 2,40 0,0 - 0,94 0,0 – 0,33 0,0 - 0,15 0,0-0,09 0,86±0,32 0,0 0,0 0,0 0,0± 0,0 0,95 0,0 0,0 0,0 0,0 0,27 - 1,40 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 1,12±0,44 0,0 0,0 0,0 0,0 ± 0,0 1,09 0,0 0,0 0,0 0,0 0,35 - 1,80 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 0,24a††±0,20 0,01b±0,02 0,02b±0,03 0,01b±0,01 0,0± 0,0 Median 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Min -Max 0,71 0,09 0,09 0,03 0,0 - 0,0 3,67a††±1,45 0,19b±0,25 0,11b ±0,09 0,09b ±0,06 0,03±0,05 3,14 0,12 0,12 0,10 0,0 1,08-5,80 0,0-1,03 0,0-0,33 0,0-0,15 0,0-0,09 Mittlerer klinischer Score für einen Versuchstag1 B.hyodysenteriae -Gruppe n=15 Kotkonsistenz (Score 0-3) x ±s Median Min -Max Verhalten (Score 0-2) x ±s Median Min -Max Futteraufnahme (Score 0-3) x ±s Median Maximum Fieber (Score 0-1) x ±s Gesamtscore (aller vier Parameter) x ±s Median Min -Max 1 Für die Ermittlung des durchschnittlichen klinischen Scores für einen Versuchstag wurden die täglich bestimmten Scores für den jeweiligen klinischen Parameter aufaddiert und durch die Anzahl der Versuchstage geteilt. Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*), p<0,01 (=†) und p<0,001 (=††) 88 Ergebnisse 4.2.4 Vergleich des Einflusses einer Dexamethason-Behandlung (Versuch 1: Kontrollfutter + Dexamethason-Gabe) und einer SojaextraktionsschrotFütterung (Versuch 2: „Sojafutter“ ohne Dexamethason-Gabe) auf die Entwicklung klinischer Erscheinungen bei B.-hyodysenteriae-infizierten Schweinen Bei den Versuchen 1 und 2 wurden zum einen Dexamethason-Gaben, zum anderen ein erhöhter Anteil an Sojaextraktionsschrot in der Ration als mögliche Einflussfaktoren für die Entwicklung klinischer Erscheinungen bei mit B. hyodysenteriae infizierten Versuchstieren verwendet. Der Vergleich dieser Einflüsse auf die klinische Symptomatik wurde in der Abbildung 7 dargestellt. Es wird dabei deutlich, dass die Krankheitserscheinungen bei der „Sojafutter“-Gruppe für alle Untersuchungsparameter (Kotkonsistenz, Verhalten, Futteraufnahme und Fieber) im Mittel signifikant deutlicher ausgeprägt waren als bei Tieren, die kein „Sojafutter“, sondern Kontrollfutter und Dexamethason-Gaben erhielten (p<0,001). Klinischer (x (x ± s)± s) KlinischerScore Score 2.5 b†† 2 b†† 1.5 b†† a a 1 a b†† 0.5 a 0 Dexa.-behandelte Gruppe (Kontrollfutter+Dexa) Sojafutter-Gruppe (ohne Dexa) Versuchsgruppe Versuchsgruppe Kotkonsistenz Kotkonsistenz Abb. 7: Vergleich der Verhalten Verhalten Mittelwerte Futteraufnahme Futteraufnahme der klinischen Fieber Fieber Scores nach experimenteller B.-hyodysenteriae-Infektion bei der Dexamethason-behandelten Gruppe (Versuch 1) und der „Sojafutter“-Gruppe (Versuch 2; Wilcoxon two-sample Test; 89 †† =p<0,001) Ergebnisse 4.3 Ergebnisse zur täglichen Gewichtszunahmen und zum Futteraufwand 4.3.1 Vorversuch Tabelle 19 zeigt die Mittelwerte der durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme und des Futterverbrauchs der Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe innerhalb der vier Versuchswochen. Die Ergebnisse belegen, dass die Schweine der Dexamethason-behandelten Gruppe eine durchschnittliche Zunahme von 0,24 ± 0,17 kg pro Tag sowie einen sehr hohen Futteraufwand von 5,08 kg/kg Zuwachs aufwiesen. Im Vergleich zu den übrigen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe ergab sich für diese Ergebnisse ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05). Zwischen der Kontrollfutter- und „Maisfutter“-Gruppe sowie der Negativ-Kontrollgruppe bestanden keine signifikanten Differenzen. Tab. 19: Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) Parameter KontrollfutterGruppe „Maisfutter“Gruppe n=5 n=5 Dexamethasonbehandelte Gruppe +Kontrollfutter n=5 NegativKontrollgruppe +Kontrollfutter n=5 TZ (kg) 0,51a ± 0,14 0,59a ± 0,17 0,24b* ± 0,17 0,59a ± 0,1 0,25 – 0,67 0,29 – 0,76 0,15 – 0,53 0,48 – 0,77 3,10 2,67 5,08 2,69 (x ± s) Min - Max Durchschnittlicher Futteraufwand (kg) je kg Zuwachs Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen, mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*) 90 Ergebnisse 4.3.2 Versuch 1 (Kontrollfutter + Dexamethason-Behandlung) Die Daten in der Tabelle 20 lassen erkennen, dass für die durchschnittliche Gewichtszunahme pro Tag bei den Versuchsgruppen kein statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden konnte. Unterschiede zwischen den Brachyspirainfizierten Gruppen waren ebenfalls statistisch nicht abzusichern. Weiterhin zeigte der Futterverbrauch je kg Zuwachs für die Versuchsgruppen nur geringe Unterschiede im Vergleich mit der Kontrollgruppe auf. Beim Vergleich der Versuchsgruppen untereinander war der Futteraufwand der B.-murdochii-infizierten Gruppe (3,15 kg/kg Zuwachs) nur geringgradig höher als bei den übrigen Versuchsgruppen (p>0,05). Tab. 20: Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand verschiedenen nach experimenteller Infektion Brachyspira-Arten (Versuch 1: mit den vier Kontrollfutter + Dexamethason-Gabe) Gruppe TZ (kg) (x ± s) Min - Max Durchschnittlicher Futteraufwand (kg) je B. B. B. B. Negativ- hyodysenteriae innocens intermedia murdochii Kontrolle n=15 n=15 n=10 n=24 n=3 0,40a ± 0,09 0,37a ± 0,08 0,45a ± 0,07 0,35a ± 0,07 0,44a ± 0,05 0,25 - 0,56 0,22 - 0,47 0,32– 0,53 0,26-0,54 0,36- 0,53 3,01 2,77 3,15 2,70 2,85 kg Zuwachs Gleiche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen statistisch nicht signifikante Unterschiede (p>0,05) 91 Ergebnisse 4.3.3 Versuch 2 („Sojafutter“) Anhand der nachstehenden Tabelle 21 wird deutlich, dass die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme in der B.-hyodensenteriae-infizierten Gruppe signifikant geringer war als bei den übrigen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe (p<0,05). Bei dieser Gruppe fiel ein durchschnittlicher Gewichtsverlust von 0,04 kg pro Tag auf. Während der Durchfallphase nahmen die Schweine kein Futter auf. Signifikante Differenzen (p<0,05) konnten auch für die B.-innocens-infizierte Gruppe im Vergleich zur B.-intermedia- und B.-murdochii-Gruppe sowie der Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Tiere dieser Gruppe wiesen eine geringe durchschnittliche Gewichtszunahme von 0,20 kg pro Tag und einen hohen Futteraufwand von 3,88 kg/kg Zuwachs auf. Darüber hinaus konnte kein statistisch signifikanter Unterschied im durchschnittlichen täglichen Zuwachs bei der B.-murdochii- und der B.-intermedia-infizierten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Die Futteraufwand beider Gruppen war ungünstiger als bei der Kontrollgruppe (3,11 kg und 2,99 kg vs. 2,79 kg/kg Zuwachs). Tab. 21: Ergebnisse zur durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (TZ) und zum Futteraufwand nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 2: „Sojafutter“) Gruppe B. B. B. B. Negativ- hyodysenteriae innocens intermedia murdochii Kontrolle n=15 n=15 n=10 n=24 n=3 -0,04c* ± 0,08 0,20b† ± 0,07 0,33a ± 0,04 0,30a ± 0,07 0,33a ± 0,05 -0,19- 0,14 0,11- 0,35 (-)1 3,88 TZ (kg) (x ± s) Min - Max Durchschnittlicher Futteraufwand (kg) je kg Zuwachs 0,21- 0,35 0,12- 0,39 3,11 2,99 0,28- 0,36 2,79 Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen, mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*) und p<0,01 (=†). 1 Die Tiere zeigten keine Futteraufnahme während der Durchfallphase. 92 Ergebnisse 4.3.4. Vergleich zwischen der täglichen Gewichtszunahme in Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) und in Versuch 2 („Sojafutter“) Abbildung 8 verdeutlicht, dass die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme bei den Tieren aus den zusätzlich mit Sojaextraktionsschrot gefütterten Gruppen deutlich geringer als bei den entsprechenden, mit Dexamethason behandelten Gruppen ausfiel. Dieser Unterschied war statistisch hoch signifikant (p<0,001) bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe und signifikant bei der B.-innocens- und B.-intermedia-Gruppe (p<0,01). Allerdings bestand ebenfalls beim Vergleich der Kontrollgruppen eine schwach signifikante Differenz (p<0,05). Lediglich bei den B.-murdochii-infizierten Gruppen konnte der Unterschied statistisch nicht belegt werden. Durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme (kg/Tag) 0.6 0.5 aa a a aa b* 0.4 a b †† b †† b†† 0.3 0.2 0.1 bb†††† 0.0 -0.1 Negativ-Kontrolle Negativ-Kontrolle B. B. intermedia intermedia B. B. innocens innocens B. B. murdochii murdochii B. B. hyodysenteriae hyodysenteriae Versuchsgruppe Dexamethason-Behandlung (Kontrollfutter+Dexa.) Abb. 8: Sojafutter (ohne “Sojafutter” (ohneDexa.) Dexa.) Einfluss der Dexamethason-Behandlung und Sojaschrot-Fütterung auf die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme (kg, x+s) nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*), p<0,01 (=†) und p<0,001 (=††) 93 Ergebnisse 4.4.1 Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchungen 4.4.2 Pathologisch-anatomische Untersuchung Die makroskopische Bewertung für die vier verschiedenen Dickdarmlokalisationen (Ileozäkalklappe, Zäkum, proximales Kolon und distales Kolon) erfolgte anhand eines Scoresystems, wobei auf Veränderungen der Darmschleimhaut und des Darminhaltes geachtet wurde (s. 3.9.1). Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte mit Standardabweichungen sowie als Median-, Maximum- und MinimumWerte der makroskopischen Scores in der Tabelle 22 dargestellt. Tab. 22: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen Untersuchung (Gesamtscore für vier Dickdarmabschnitte) nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Vorversuch) sowie nach experimenteller Infektion mit den vier verschiedenen Brachyspira-Arten (Versuch 1 und 2). Unterschiedliche Buchstaben in einer Zeile kennzeichnen die statistischen Differenzen, *=p<0,05, ††=p<0,001 Versuchsgruppe Gesamtscore für path.-anatomische Veränderungen an vier verschiedenen Dickdarmlokalisationen (Ileozäkalklappe, Zäkum, prox. Kolon u. dist. Kolon) x± s Median Min – Max Vorversuch (B. hyodysenteriae) Kontrollfutter (n=5) „Maisfutter“ (n=5) Dexa.-Behandlung (n=5) Negativ-Kontrollgruppe (n=5) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 4,8 ± 2,2 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 2,0 - 8,0 0,0 - 0,0 1,3a ± 1,6 1,2a ± 0,8 1,1a ± 1,0 0,4a ± 0,9 0,6a ± 0,9 0,0 1,0 1,0 0,0 0,0 0,0 - 4,0 0,0 - 2,0 0,0 - 3,0 0,0 - 3,0 0,0 - 2,0 8,8c†† ± 1,2 1,6b* ± 1,2 1,3b* ± 1,1 0,6a ± 1,3 0,0 ± 0,0 9,0 2,0 2,0 0,0 0,0 6,0 - 10,0 0,0 - 3,0 0,0 - 3,0 0,0 - 3,0 0,0 - 0,0 Versuch 1 (Dexamethason-Gabe + Kontrollfutter) B. hyodysenteriae (n=11) B. innocens (n=10) B. murdochii (n=10) B. intermedia (n=5) Negativ-Kontrollgruppe (n=8) Versuch 2 („Sojafutter“) B. hyodysenteriae (n=15) B. innocens (n=15) B. murdochii (n=24) B. intermedia (n=10) Negativ-Kontrollgruppe (n=3) 94 Ergebnisse Vorversuch: Im Vorversuch konnten pathologisch-anatomische Veränderungen nur bei den B.-hyodysenteriae-infizierten Tieren, die mit Dexamethason behandelt wurden (4,80±0,16), beobachtet werden. Die Läsionen waren auf den Dickdarm beschränkt und variierten von geringgradiger katarrhalischer bis zu hochgradiger, fibrinös-nekrotisierender Kolitis und entsprachen somit dem typischen Bild der Schweinedysenterie (s. Abb. 9). Abb. 9: Makroskopischen Veränderungen am proximalen Kolon eines mit B.-hyodysenteriae-infizierten Schweines (Vorversuch, Dexamethason-Behandlung, Zustand nach 11 Durchfalltagen). Die Mukosa erscheint hyperämisch mit multifokalen Nekrosen und fibrinösen Belägen (fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend Score 3, s. 3.9.1) Versuch 1 Im Versuch 1 waren keine typischen Veränderungen im Sinne der Schweinedysenterie an der Dickdarmschleimhaut zu erkennen. Die mittleren Score-Werte der makroskopischen Beurteilung der mit B.-hyodysenteriae, B.-innocens und B.-murdochii-infizierten Gruppen waren geringgradig höher als bei der B.-intermedia-infizierten Gruppe bzw. bei der Kontrollgruppe, der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. 95 Ergebnisse Im Gegensatz zum Vorversuch zeigten nur zwei von elf B.-hyodysenteriae-infizierten Schweinen im Versuch 1 Veränderungen. Bei ihnen lag eine geringgradige bis mittelgradige fibrinöse Kolitis vor, während die Tiere der übrigen Gruppen keine Läsionen an der Dickdarmschleimhaut aufwiesen. Versuch 2 Bei diesem Versuch konnte ein statistischer Vergleich zur Kontrollgruppe hinsichtlich der pathohistologischen Veränderungen auf Grund der kleinen Tieranzahl (n=3) nicht durchgeführt werden. Ausgeprägte makroskopische Veränderungen lagen bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe (Score: 8,8 ± 1,21 mit eine Schwankung von 6 bis 10) vor (Tabelle 23). Diese Befunde entsprachen typischen makroskopischen Veränderungen der Schweinedysenterie (Abb. 10-12), der Score wies im Vergleich zur den anderen Versuchsgruppen einen hochsignifikanten Unterschied auf (p<0,001). Die makroskopischen Veränderungen bei den B.-innocens- und B.-murdochii-infizierten Gruppen waren dagegen eher geringgradig und unterschieden sich nicht (Score: 1,58 ± 1,08 gegenüber 1,6 ± 1,24). Jedoch war die Differenz zur B.-intermedia-Gruppe noch signifikant (p<0,05). Die Darmschleimhaut aller Kontrolltiere war bei der Sektion unauffällig. Abb. 10: Makroskopische Veränderungen bei einem Schwein, das mit dem B.- hyodysenteriaeFeldstamm 7304/03 infiziert wurde (Zustand nach 13 Tagen Durchfall, Versuch 2). Die Schleimhaut ist bedeckt mit einer gelben Pseudomembran und zeigt oberflächliche flache Nekrosen (hochgradige fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend Score 3, s. 3.9.1) 96 Ergebnisse Abb. 11: Makroskopische Veränderungen am proximalen Kolon eines Schweines 4 Tage nach Durchfallbeginn (B.-hyodysenteriae-Feldstamm 7304/03, Versuch 2): hyperämische Schleimhaut mit Fibrinauflagerungen (mittelgradige fibrinöse Kolitis entsprechend Score 2, s. 3.9.1) Abb. 12: Makroskopische Veränderungen am distalen Kolon 3 Tage nach Durchfallbeginn (B. hyodysenteriae Referenzstamm B204, Versuch 2): verdickte Mukosa, bedeckt mit festhaftenden pseudomembranösen Belägen (hochgradige fibrinös-nekrotisierende Kolitis entsprechend Score 3, s. 3.9.1) 97 Ergebnisse 4.4.2 Die Pathohistologische Untersuchung histologische Bewertung Untersuchungsparameter an erfolgte der anhand Darmmukosa eines für Scoresystems jeweils vier für acht verschiedene Darmlokalisationen (Ileozäkalklappe, Zäkum, proximales Kolon und distales Kolon) (s. Kapitel 3.9.2). 4.4.2.1 Vorversuch In Tabelle 23 sind die Mittelwerte mit den Standardabweichungen, dem Median, sowie dem Maximum und Minimum für die histologischen Scores zu den jeweiligen Parametern dargestellt (Gesamtscore für 4 Darmabschnitte). Vergleichbar mit den makroskopischen Veränderungen wurden typische histologische Veränderungen in diesem Versuch nur bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe unter Dexamethason-Behandlung beobachtet. Bei dieser Gruppe konnten ausgeprägte pathohistologische Veränderungen im Sinne einer Schweinedysenterie in Form von Mukosaverdickung (2,28 ± 1,19), Kryptdilatation (4,76 ± 2,35), Ulzeration (4,0 ± 1,40), Becherzellhyperplasie (2,66 ± 1,29) und Pseudomembranbildung (4,2 ± 3,16) diagnostiziert werden (s. Abb. 13). Kryptabszesse und Hyperämie wurden sowohl bei den Versuchsgruppen als auch bei der Kontrollgruppe nachgewiesen, jedoch gab es jeweils nur bei der mit Dexamethason behandelten Gruppe einen statistisch gesichert höheren Score (p<0,01 bis p<0,001). Eine statistisch signifikante Erhöhung der Anzahl von Entzündungszellen in der Lamina propria mucosa konnte ebenfalls nur in der mit Dexamethason behandelten Gruppe nachgewiesen werden (p<0,001). Bei den übrigen Versuchsgruppen lag bezüglich dieser Parameter kein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe vor. 98 Ergebnisse Tab. 23: Ergebnisse der histologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Vorversuch nach experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, †† =p<0,001) Vorversuchsgruppe 1 Beurteilungsparameter Mukosaverdickung x±s Median Min – Max Kryptdilatation x±s Median Min – Max Kryptabszess x±s Median Min – Max Ulzeration x±s Median Min – Max Becherzellhyperplasie x±s Median Min – Max Dexamethason n=5 Kontrollfutter „Maisfutter“ n=5 n=5 NegativKontrolle n=5 2,28 ± 1,19 2,0 1,0 – 3,8 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 4,76 ± 2,35 3,6 2,6 – 7,4 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 1,80a*± 0,28 1,8 1,4 – 2,2 0,48b± 0,30 0,6 0,0 - 2,0 0,64b±0,17 0,6 0,0 – 0,8 0,52b±0,33 0,6 0,0 – 0,8 4,00± 1,40 3,60 2,40 – 6,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 2,66 ± 1,29 3,0 2,20 – 3,80 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 4,2 ± 3,16 3,60 1,0 – 9,20 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 4,40a††±1,49 4,40 2,40 – 6,20 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,12b ± 0,27 0,0 0,0 – 0,60 0,16b±0,36 0,0 0,0 - 0,80 3,44a††± 2,6 3,40 0,80 – 6,20 0,12b ± 0,27 0,0 0,0 – 0,60 0,80b ± 0,54 0,8 0,0 – 1,0 0,28b±0,26 0,4 0,0 - 0,60 Pseudomembran/Fibrinauflagerung x±s Median Min – Max Entzündungszellen in der Lpm x±s Median Min – Max Hyperämie x±s Median Min – Max 1 : histologischer Gesamtscore für den jeweiligen Beurteilungsparameter = durchschnittliche Summe der Scores für die vier einzelnen Darmlokalisationen 99 Ergebnisse ▼ * * Abb. 13: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier 11 Tage nach Durchfallbeginn (Vorversuch, Dexamethason-Behandlung). Distales Kolon (H.E. Vergrößerung 40fach): Nekrose an der Schleimhautoberfläche mit Fibrin und Gewebedetritus (Pfeile), Dilatation von Krypten (Sterne) und moderate zelluläre Infiltration der Lamina propria (Pfeilkopf) Abb. 14: Distales Kolon (H.E. Vergrößerung 40fach): unveränderte Darmschleimhaut bei einem Schwein der Negativ-Kontrollgruppe (Vorversuch) 100 Ergebnisse Ein Vergleich der Ergebnisse der pathohistologischen Beurteilung für die vier einzelnen Dickdarmschnitte (Ileozäkalklappe, Zäkum, proximales Kolon und distales Kolon) wurde in Abbildung 15 dargestellt (Gesamtscore für alle 8 Parameter). Die höchsten Mittelwerte für den histologischen Gesamtscore konnten bei allen vier Darmabschnitten: Ileozäkalklappe (4,76 ± 2,48), Zäkum (5,44 ± 3,40), proximales Kolon (8,48 ± 3,45) und distales Kolon (9,12 ± 3,46) in der Dexamethason-behandelten Gruppe festgestellt werden. Im Vergleich zeigten diese Befunde einen hochsignifikanten Unterschied (p<0,05 bis p<0,001) zu den übrigen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe auf, bei denen nur geringgradige Veränderungen an der Ileozäkalklappe und im Kolonbereich beobachtet wurden. Histologische Veränderungen im Zäkum wurden nur bei den B.-hyodysenteriae-infizierten Tieren in der Dexamethason- Gruppe beobachtet. Bei den übrigen Versuchsgruppen zeigte das Zäkum keinerlei Läsionen. 14.0 a †† a †† Histologischer Score 12.0 10.0 8.0 a* 6.0 4.0 2.0 bb b b b b b b bb 0.0 Dexa-Behandlung Kontrollfutter Maisfutter Negativ-Kontrolle Versuchsgruppen Ileozäkalklappe Abb. 15: Zäkum prox. Kolon dist. Kolon Vergleich der histologischen Veränderungen an vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die mit B. hyodysenteriae im Vorversuch infiziert wurden, und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (Gesamtscore für eine Darmlokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, ††=p<0,001 101 Ergebnisse 4.4.2.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) Für den Versuch 1 wurden die Ergebnisse der pathohistologischen Veränderungen der acht Untersuchungsparameter in der Tabelle 24 zusammengefasst (Gesamtscore für vier Darmabschnitte). Eine Mukosaverdickung konnte bei keinem Tier der Versuchsgruppen oder der Kontrollgruppe beobachtet werden, während für die Parameter Ulzeration (0,33 ± 0,61), Becherzellhyperplasie (0,18 ± 0,35) und Pseudomembran/Fibrinauflagerung (0,35 ± 0,87) nur bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe auffällige Befunde nachgewiesen wurden (Abb. 17). Darüber hinaus konnte bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) bezüglich des Parameters Kryptdilatation im Vergleich zur anderen Versuchsgruppen bzw. zur Kontrollgruppe aufgezeigt werden. Für die übrigen Parameter wie Kryptabszess, Entzündungszellen und Hyperämie wurden bei allen Gruppen nur leichte Veränderungen festgestellt, aber es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen diesen Gruppen. 102 Ergebnisse Tab. 24: Ergebnisse der histologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) nach experimenteller Infektion mit verschiedenen Brachyspira-Arten (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05) Versuchsgruppe Beurteilungsparameter Mukosaverdickung x ±s Median Min – Max Kryptdilatation x±s Median Min – Max Kryptabszess x±s Median Min – Max Ulzeration x±s Median Min – Max Becherzellhyperplasie x± s Median Min – Max B. B. hyodysenteriae innocens n = 11 n = 10 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 B. B. murdochii intermedia n = 10 n=5 NegativKontrolle n=8 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,18b ± 0,25 0,0 0,0 – 0,6 0,89a* ± 0,98 0,24b ±0,36 0,16b ±0,27 0,4 0,0 0,0 0,0 –3,0 0,0 -1,0 0,0 -0,6 0,85a ± 0,43 0,78a ±0,52 0,82a±0,45 0,56a ±0,36 0,60a ± 0,42 1,0 0,8 0,8 0,80 0,7 0,0 – 1,4 0,0 – 1,8 0,0 – 1,6 0,0 – 0,8 0,0 – 2,0 0,33 ± 0,61 0,0 0,0 – 1,8 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,18 ± 0,35 0,0 0,0 – 1,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,35 ± 0,87 0,0 0,0 – 2,6 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,08a ± 0,21 0,0 0,0 – 0,6 Pseudomembran/Fibrinauflagerung x±s Median Min – Max Entzündungszellen in der Lpm x± s Median Min – Max Hyperämie x±s Median Min – Max 0,58a ± 0,79 0,26a ±0,45 0,14a ±0,33 0,2 0,0 0,0 0,0 – 2,4 0,0 – 1,4 0,0 - 1,0 0,58a ± 0,62 0,52a±0,48 0,56a±0,89 0,12a ±0,27 0,25a ± 0,42 0,40 0,40 0,30 0,0 0,0 0,0 – 1,8 0,0 – 1,4 0,0 – 2,8 0,0 – 0,6 0,0 – 1,2 1 : histologischer Gesamtscore für den jeweiligen Beurteilungsparameter = durchschnittliche Summe der Scores für die vier einzelnen Darmlokalisationen 103 Ergebnisse Abbildung 16 gibt einen Überblick über die Verteilung der pathohistologischen Veränderungen für die vier einzelnen Dickdarmschnitte (Ileozäkalklappe, Zäkum, proximales Kolon und distales Kolon; Gesamtscore für alle 8 Parameter) bei den Versuchstieren. Es ist erkennbar, dass im Ileozäkal- und Zäkum-Bereich für die histologischen Veränderungen kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Versuchsgruppen bzw. im Vergleich zur Kontrollgruppe besteht. Im Bereich des proximalen Kolons ist ein signifikanter Unterschied (p<0,05) bezüglich der pathohistologischen Befunde nur bei der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen, für das distale Kolon bestand jeweils ein abgesicherter Unterschied zwischen der B.-hyodysenteriae-Gruppe und der B.-intermedia, der B.- murdochii- bzw Negativ-Kontrollgruppe (p<0,05). Histologischer Score 8.0 6.0 4.0 a* a 2.0 a a a a ab ab a a ab a a a ab b a b a b 0.0 B. hyodysenteriae B. innocens B. intermedia B. murdochii Negativ-Kontrolle Versuchsgruppe Ileozäkalklappe Abb. 16: Vergleich der Zäkum histologischen prox. Kolon Veränderungen dist. Kolon an vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die experimentell mit B. hyodysenteriae, B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Versuch 1 infiziert wurden, und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (Gesamtscore für einen Darmlokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05 104 Ergebnisse * * ▼ Abb. 17: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 5 Durchfalltagen (Versuch 1, Dexamethason-Behandlung). Distales Kolon (H.E. Vergrößerung 40fach): die Schleimhaut zeigt eine geringgradige Hyperämie mit Fibrinauflagerungen (Sterne) und gering- bis mittelgradigen Ulzerationen (Pfeile) an der Schleimhautoberfläche sowie eine mittelgradige gemischtzellige Infiltration der Lamina propria (Pfeilkopf) 4.4.2.3 Versuch 2 („Sojafutter“) Die Ergebnisse der pathohistologischen Beurteilung im Versuch 2 sind in der Tabelle 25 und Abbildung 18 dargestellt. In diesem Versuch konnte ein statistischer Vergleich zur Kontrollgruppe hinsichtlich der pathohistologischen Veränderungen auf Grund der kleinen Tieranzahl (n=3) nicht durchgeführt werden. In der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe konnte eine hochgradige, fibrinös-nekrotisierende Kolitis mit pseudomembranösen Auflagerungen, Ulzerationen und hochgradigen Infiltration von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten festgestellt werden (Abb. 21, 22). Ein signifikant erhöhter histologischer Gesamtscore konnte für alle acht Untersuchungsparameter (Tab. 25) und an allen vier Darmabschnitten (Abb. 18) (p<0,05 bis 105 Ergebnisse p<0,001) bei dem Vergleich der pathohistologischen Befunde zwischen der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe und den übrigen Versuchsgruppen beobachtet werden. Bei den Gruppen, die mit schwach hämolysierenden Brachyspiren (B.-innocens-, B.-murdochii- und B.- intermedia-Gruppe) infiziert wurden, sowie der Kontrollgruppe konnten insgesamt nur sehr geringe histologische Veränderungen nachgewiesen werden. Wie in Tabelle 25 dargestellt, zeigten einige Tiere dieser Gruppen eine geringgradige, lymphohistiozytäre Enteritis mit Kryptdilatation, Kryptabzsessen sowie Hyperämie der Lamina propria mucosae. Bei 3 Tieren der B.-innocens- und 5 Tieren der B.-murdochiiinfizierten Gruppen konnten zudem geringgradige fokale Ulzerationen sowie eine Erhöhung der Entzündungszellzahl und z. T. auch geringgradige, fokale Fibrinauflagerungen beobachtet werden. Dabei waren entweder nur die Ileozäkalklappe oder das Kolon betroffen (s. Abb. 23, 24). Eine leichte Erhöhung der Anzahl von Becherzellen war darüber hinaus bei 2 der mit B. murdochii infizierten Schweine festzustellen. 14.0 †† a†† a Histologischer Score Histologischer Score 12.0 10.0 a†† †† a 8.0 6.0 4.0 b 2.0 b b b b 0.0 B. hyodysenteriae B. innocens c* b b B. intermedia b b b b B. murdochii Negativ-Kontrolle Versuchsgruppe Versuchsgruppe Ileozäkalklappe Ileozäkalklappe Abb. 18: Zäkum Zäkum prox.Kolon prox. Kolon prox.Kolon dist. dist.Kolon Kolon Vergleich der histologischen Veränderungen an den vier verschiedenen Darmabschnitten von Schweinen, die experimentell mit B. hyodysenteriae, B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Versuch 2 („Sojafutter“) infiziert wurden, und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe (histologischer Score für eine Darm-lokalisation = durchschnittliche Summe aller Scores für 8 Parameter, max. Gesamtscore = 15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, ††=p<0,0001 106 Ergebnisse Tab. 25: Ergebnisse der histologischen Untersuchung der Dickdarmschleimhaut von Tieren im Versuch 2 („Sojafutter“) nach experimenteller Infektion mit verschiedenen Brachyspira-Arten (Gesamtscore für vier Darmabschnitte, unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, †† =p<0,001) Versuchsgruppe Beurteilungsparameter1 Mukosaverdickung x± s Median Min – Max Kryptdilatation x± s Median Min – Max Kryptabszess x± s Median Min – Max Ulzeration x± s Median Min – Max Becherzellhyperplasie x± s Median Min – Max n = 15 B. innocens n = 15 B. murdochii n = 24 B. intermedia n = 10 NegativKontrolle n=3 3,21 ± 0,81 3,60 2,0 - 4,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 – 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 B. hyodysenteriae 5,28a††± 1,43 0,43b ±0,49 5,20 0,40 3,4 – 7,4 0,0 -1,6 0,39b±0,49 0,18b ± 0,19 0,13± 0,23 0,20 0,1 0,0 0,0 -2,0 0,0 – 0,4 0,0 – 0,4 1,73c* ± 0,75 1,15b* ±0,44 0,92b* ±0,41 0,63a ± 0,19 0,93± 0,23 1,60 1,20 0,8 0,60 0,8 0,8 – 3,8 0,6 - 2,0 0,0 – 1,8 0,0 – 0,8 0,8 - 1,2 5,68b††±1,21 0,04a ± 0,08 0,09a ± 0,14 6,0 0,0 0,0 3,4 – 7,2 0,0 – 0,02 0,0 – 0,6 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 3,09b††± 0,63 3,20 1,8 – 4,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 0,0 - 0,0 0,03a ± 0,07 0,0 0,0 – 0,2 Pseu.Mem./Fibrinauflagerung x± s 9,2b†† ± 2,07 0,01 ± 0,05 0,09a ± 0,18 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Median 9,60 0,0 0,0 0,0 0,0 Min – Max 5,0 – 11,4 0,0 – 0,02 0,0 – 0,8 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 Entzündungszellen in der 5,36b††± 1,24 0,32a ± 0,43 0,38a ± 0,52 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Lpm x ± s Median 5,40 0,0 0,2 0,0 0,0 Min – Max 2,8 – 7,4 0,0 – 1,4 0,0 – 1,6 0,0 - 0,0 0,0 - 0,0 Hyperämie x± s 3,11b†† ±1,19 1,32a ± 0,85 0,95a ± 0,83 0,88a ± 0,67 0,20± 0,35 Median 3,0 1,40 1,0 0,10 0,0 Min – Max 1,4 - 6,2 0,0 – 2,8 0,0 – 2,6 0,0 – 2,0 0,0 – 0,6 1 : histologischer Gesamtscore für den jeweiligen Beurteilungsparameter = durchschnittliche Summe der Scores für die vier einzelnen Darmlokalisationen 107 Ergebnisse Abbildung 19 gibt einen Überblick über den Vergleich der pathohistologischen Veränderungen für die vier einzelnen Dickdarmschnitte (Ileozäkalklappe, Zäkum, proximales Kolon und distales Kolon; Gesamtscore für alle 8 Parameter) zwischen den beiden im Versuch 2 verwendeten B.-hyodysenteriae-Stämmen (Referenzstamm B204, n=10 und Feldstamm 7304/03, n=5). Es ist erkennbar, dass bei den histologischen Veränderungen kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen Stämmen besteht. Histologischer Score 12.0 a a 10.0 8.0 a a a a a a 6.0 a a 4.0 a a a a a a 2.0 0.0 Mukosa-dicke Krypt-Dilatation Krypt-abszess Referenzstamm B204 Abb. 19: Vergleich der Ulzeration Becherzellhyperplasie Pseudomembran/ Entzündungszellen Fibrinauflagerug Hyperämie Feldstamm 7304/03 histologischen Veränderungen an vier verschiedenen Darmabschnitten zwischen mit 2 unterschiedlichen B.-hyodysenteriae-Stämmen (Referenzstamm B204, n=10, Feldstamm 7304/03, n=5) infizierten Versuchstieren aus dem Versuch 2 („Sojafutter“). Gleiche Buchstaben kennzeichnen statistisch nicht signifikante Unterschiede (p>0,05) Der Einfluss der Dexamethason-Behandlung (Vorversuch) und der zusätzlichen Fütterung von Sojaextraktionsschrot (Versuch 2) auf die pathologischen Veränderungen bei den B.-hyodysenteriae-Gruppen wurde in Abb. 20 verglichen. Die Veränderungen in der Dickdarmschleimhaut bei der Sektion waren bei der „Sojafutter“-Gruppe stärker ausgeprägt als bei den Dexamethason-behandelten Tieren (Gesamtscore für vier Dickdarmabschnitte 8,8 ±1,21 vs 4,8 ±0,16, Tab. 23) 108 Ergebnisse Für typische SD-Alterationen wie Mukosaverdickung, Schleimhautulzeration und Pseudomembranbildung fiel der Score in Versuch 2 dabei signifikant höher aus (p<0,05 bis p<0,001), bei den anderen Parametern zeigten sich gleichwertige Veränderungen für Versuch 2 und Vorversuch (Abb. 20). 12.0 b†† Histologischer Score 10.0 8.0 a 6.0 4.0 2.0 a b †† a a a a b* a a a a a a a 0.0 tion ung ess rdick tdilata tabsz sav e Kryp Kryp Muko rung ati on lasie r Lpm flage Ulzer in de yper p ri nau ellen ib rzell h z e /F g h n n c Be ündu mbra Entz dom e P seu Dexamethason Gruppe (Kontrollfutter + Dexa.) Dexamethason-Gruppe rämie Hype Sojafutter-Gruppe Sojafutter “Sojafutter”Gruppe Gruppe (ohne (ohne Dexa.) Dexa.) Abb. 20: Vergleich der histologischen Veränderungen bei B.- hyodysenteriae-infizierten Tieren im Vorversuch (Dexamethason-Behandlung, n=5) und im Versuch 2 („Sojafutter“, n=15). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistische Unterschiede, *=p<0,05, †=p<0,01, †† 109 =p<0,001 Ergebnisse * * A * B Abb. 21: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 3 Durchfalltagen (Versuch 2, „Sojafutter“, Referenz-Stamm B 204). (A): Proximales Kolon (H.E. Vergrößerung 40fach): hochgradige, tiefe Ulzeration mit hochgradige Infiltration von Entzündungszellen (Sterne). (B): Proximales Kolon, (H.E. Vergrößerung 100fach): Fibrinauflagerung im Bereich der erodierten Mukosa mit hochgradige Infiltration von Entzündungszellen in der Lamina propria (Stern), Kryptdilatation, Krypten gefüllt mit neutrophilen Granulozyten (Kryptabszess) (Pfeilkopf) und Mukus (Pfeile) 110 Ergebnisse * * Abb. 22: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-hyodysenteriae-infizierten Tier nach 13 Durchfalltagen (Versuch 2, „Sojafutter“, Feldstamm 7304/04). Distales Kolon (H.E. Vergrößerung 100fach): Fibrinauflagerung (*) an der erodierte Schleimhautoberfläche, hochgradiger Dilatation von mit Mukus gefüllten Krypten (Pfeile) sowie hochgradiger Infiltration von Entzündungszellen in der Lamina propria * Abb. 23: * Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-murdochii-infizierten Tier (Versuch 2, „Sojafutter“, Stamm S11287, Dänemark). Proximales Kolon, (H.E. Vergrößerung 200fach): hochgradige Fibrinauflagerung (*) und Ulzerationen (Pfeil) der Schleimhaut sowie mittel- bis hochgradiger Infiltration von Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen in der Lamina propria mucosa 111 Ergebnisse * * A B Abb. 24: Mikroskopische Veränderungen bei einem B.-innocens-infizierten Tier (Versuch 2, „Sojafutter“, Stamm 1569/05). A: Proximales Kolon, (H.E., Vergrößerung 100fach): mittelgradige Dilatation der Krypten (Pfeile) sowie eine mittelgradige Infiltration von Lymphozyten mit einzelnen eosinophilen Granulozyten (Stern). B: Proximales Kolon (H.E. Vergrößerung 200fach): geringgradige Fibrinauflagerung (Pfeil) ohne Ulzeration an der Schleimhautoberfläche 112 Ergebnisse 4.5 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchung und Nierenfunktionsprüfung In der vorliegenden Arbeit wurden die ermittelten Werte hinsichtlich der Hämatologie sowie Nierenfunktion mit Referenzwerten für gesunde Tieren (WALDMANN 1994, HEINRITZI u. PLONAIT 2004) verglichen, außerdem erfolgte ein Vergleich der Ausgangswerte vor Infektion mit den Werten zum Zeitpunkt der Sektion innerhalb der Gruppen sowie ein Vergleich zwischen Versuchsgruppen und Kontrollgruppe. 4.5.1 Vorversuch 4.5.1.1 Hämatologische Untersuchung In der Tabelle 26 sind die Laborwerte für die hämatologischen Parameter bei den Tieren des Vorversuchs mit entsprechenden Referenzbereichen (s.o.) dargestellt. Es ist erkennbar, dass bei der Dexamethason-Gruppe die durchschnittliche Leukozytenanzahl zu Beginn des Versuches schon über dem Normalbereich lag und zum Ende des Versuches noch etwas angestiegen war (p>0,05). Im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen war die Leukozytose zum Versuchsende signifikant. In dieser Gruppe zeigte sich außerdem eine leichte Tendenz zur Hämokonzentration im Verlaufe des Versuches. Ähnlich wie die Dexamethason-Gruppe zeigte auch die Negativ-Kontrollgruppe eine leicht erhöhte mittlere Leukozytenzahl im Vergleich zur Referenz, allerdings nur zu Versuchsbeginn. In dieser Gruppe war am Ende des Versuchs außerdem eine leichte Anämie anhand von erniedrigten Hämatokrit- und Hämoglobinwerten feststellbar. Bei den Parametern Hämoglobin, Hämatokrit, MCHC und Erythrozytenzahl zeigten sich weder im Verlauf des Versuches innerhalb der Gruppen noch zwischen den Gruppen signifikante Differenzen. Parameter, bei denen trotzdem einzelne Tiere Werte außerhalb des Normbereichs aufwiesen, wurden für die verschiedenen Gruppen bei der Angabe für Minimal- und Maximalwerte (Min-Max) farblich gekennzeichnet (Tab. 26). 4.5.1.2 Nierenfunktionsparameter Die Ergebnisse der Bestimmung der Nierenfunktionsparameter im Vorversuch wurden in der Tabelle 27 dargestellt. Deutlichere Abweichungen ergaben sich für die Parameter der 113 Ergebnisse Nierenfunktionen bei den Durchfalltieren der Dexamethason Gruppe. So war ein signifikanter Anstieg der Mittelwerte für Pl-Kreatinin (p<0,01) und Pl-Harnstoff (p<0,05) am Ende des Versuches augenfällig, der für das Pl-Kreatinin über den oberen Referenzbereich hinausging. Es bestand ebenfalls eine signifikante Differenz der Pl-Kreatinin-Werte (p<0,05) im Vergleich zwischen den Versuchsgruppen. Die Kreatinin-Clearance zeigt bei dieser Gruppe parallel dazu einen hochsignifikanter Abfall im Vergleich zum Zeitpunkt vor der Infektion (p<0,001, bis unter die Normgrenze). Für die fraktionelle Exkretion von Wasser waren sowohl in der Negativ-Kontrollgruppe (Versuchsende) als auch in der „Maisfutter“-Gruppe (Versuchsanfang und –ende) leicht erhöhte Werte zu beobachten (p>0,05). Bei Untersuchung des Elektrolythaushaltes (Tabelle 27) wurden Abweichungen bezüglich der Kalium-Konzentration im Plasma bei Einzeltieren aller Gruppen nachgewiesen. Die Betrachtung der Mittelwerte der Plasma-Kalium-Konzentration ließ eine beginnende Hyperkaliämie über den oberen Referenzbereich bei der Dexamethason- (Versuchsbeginn und –ende) und „Maisfutter“-Gruppe (Versuchsende) erkennen. Die Werte unterschieden sich statistisch signifikant (p<0,05) von der Kontrollfutter- und Negativ-Kontrollgruppe. Die fraktionelle Exkretion von Kalium wies dagegen keine auffälligen Veränderungen auf. Bei der Dexamethason-Gruppe war darüber hinaus eine leichte Hyperkalzämie am Versuchsende zu verzeichnen. Für die fraktionelle Exkretion von Kalzium konnte ein Anstieg in der Kontrollfutter- und Negativ-Kontrollgruppe nachgewiesen werden (p<0,05), der bei der Kontrollfutter-Gruppe im Mittel leicht über den Referenzbereich hinausging. 114 Ergebnisse Erklärung zu Tabellen 26 bis 31 1 : vor der Infektion 2 : am Ende des Versuches MCHC = mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration; Kreat.-Clear. = Kreatinin-Clearance; spez. Gew. = spezifisches Gewicht Pl = Plasma-Konzentration; U = Harn-Konzentration; FE = fraktionelle Exkretion; log = logarithmische Transformation, arcsin = arcsin(sqrt) Transformation für statistische Berechnungen. grau unterlegt: Daten außerhalb des jeweiligen Referenzbereiches n.u. = nicht untersucht Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen die statistischen Differenzen zwischen den Versuchsgruppen, mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 (=*), p<0,01 (=†) und p<0,001 (=††). Statistische Unterschiede innerhalb der Versuchsgruppe (vor bzw. am Ende des Versuches) sind bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 mit *, p<0,01 mit p<0,001 mit †† gekennzeichnet. 115 † und Ergebnisse Tab. 26: Mittelwerte und Standardabweichungen verschiedener Blutparameter von mit B.-hyodysenteriae- infizierten Schweinen und Tieren der Negativ-Kontrollgruppe aus dem Vorversuch Parameter (Referenzbereich) Kontrollfutter n=5 „Maisfutter“ n=5 DexamethasonBehandlung n=5 Negativ-Kontrolle n=5 x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Hämoglobin (108-148 g/l) Vor1 128,2± 5,1 121 - 133 130,6 ±5,2 125 - 135 111,8±2,3 108 - 113 113,0±8,3 103 – 123 Ende2 117,6±13,5 108 - 120 124,4 ± 4,2 120 - 131 133,4±19,9 105 - 150 106,0±3,7 103 - 110 Hämatokrit (0,33-0,45 l/l) Vor1 0,37±0,02 0,35 – 0,39 0,39±0,02 0,37-0,40 0,34±0,01 0,33 – 0,35 0,33±0,03 0,30–0,37 Ende2 0,35 ± 0,04 0,31 – 0,42 0,38 ±0,03 0,35-0,41 0,40±0,07 0,31 – 0,47 0,32 ± 0,01 0,31-0,33 MCHC (300-400 g/l) Vor1 346,4±9,0 336 – 367 338,6±1,3 338 - 341 329,0±7,7 323 – 342 338,2±5,1 332 – 343 Ende2 341,4±70,0 327 - 455 330,6±8,7 320 - 343 335,4±16,7 317- 353 325,2±12,9 303 - 333 Erythrozyten (5,8-8,2 T/l) Vor1 7,5±0,3 7,1- 7,9 7,8±0,3 7,5 – 8,1 6,9±0,2 6,7 – 7,1 6,8±0,5 6,1 – 7,5 Ende2 7,1±0,8 6,3 – 8,5 7,5±0,5 7,1 – 8,3 8,1±1,5 6,3 – 9,5 6,6±0,2 6,3 – 6,9 Leukozyten (10,0-22,0 G/l) Vor1 20,1±4,6 15,5 – 27,1 17,9±2,3 15,4 - 21,1 24,8±4,6 17,8 – 30,5 23,8 ±3,8 * 20,6 -29,9 15,9b – 18,6 17,6 b±3,7 13,6 – 21,7 28,5a ±12,8 * 17,8 -49,3 15,3 b±0,6 14,4 -16,0 Ende2 16,9 b±1,2 116 Ergebnisse Tab. 27: Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparameter von mit B.-hyodysenteriaeinfizierten Tieren und Tieren aus der Negativ-Kontrollgruppe aus dem Vorversuch (Mittelwerte und Standardabweichungen x±s) Parameter (Referenzbereich) Pl-Kreatinin (40-130 mmol/l) Kreat.-Clear.(1,684,68ml/min/kg) log FE-Wasser (0,2-3,2 %) arcsin Pl-Harnstoff (3,0-8,0 mmol/l) log U-Protein (≤ 0,3 g/l) log spez. Gew. (g/ml) Kontrollfutter n=5 „Maisfutter“ n=5 (Harnproben vor der Infektion=4) DexamethasonBehandlung n=5 Negativ-Kontrolle n=5 (Harnproben vor der Infektion=3) x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Vor1 107,0±12,1 87 – 123 116,4±21,6 97 – 144 92,4†±17,3 76 – 119 86,0±7,5 82 – 95 Ende2 108,0 b±10,5 97 – 121 104,0b±11,5 90 - 119 144,8a*±32,2 116 – 194 91,2b±17,1 74 - 118 Vor1 1,90±0,20 1,63 – 2,06 1,80±0,30 1,39 – 2,06 2,13 ±0,36 1,61 – 2,49 2,38±0,23 2,10- 2,66 Ende2 2,10±0,17 1,89 – 2,32 2,20±0,29 1,77 – 2,54 1,47±0,34 1,03 – 1,79 2,56±0,47 1,96 – 3,16 Vor1 1,4 ± 1,3 0,5 – 3,7 3,9±3,5 0,4 – 8,7 1,2±0,7 0,6 – 2,4 0,7 ± 0,3 0,4 – 1,1 Ende2 1,6a ± 0,4 1,3 – 2,3 2,9a ±2,2 0,9 – 6,7 0,9b* ±0,2 0,5 – 1,1 3,2a ± 3,9 0,8 – 9,1 Vor1 4,4±1,3 3,3 – 6,4 3,6±0,4 3,3 – 4,2 3,7 ±0,7 3,3 – 4,9 4,8±0,9 3,2 – 5,5 Ende2 4,3±0,7 3,3 – 5,1 4,3±1,2 3,3 – 6,3 5,8 ±1,3 4,7 -7,9 4,2±0,6 3,3 – 4,9 Vor1 n.u Ende2 0,14±0,09 Vor1 n.u Ende2 1,016±0,001 n.u 0,0-0,30 0,04±0,06 1,017±0,002 117 * n.u 0,0-0,10 n.u 1,014-1,019 * 0,03 ±0,06 n.u 0,0 – 0,10 n.u 1,015-1,018 1,021±0,006 0,04 ±0,05 0,0 – 0,10 n.u 1,016-1,029 1,010±0,006 1,005-1,014 Ergebnisse Fortsetzung Tab. 27 Parameter (Referenzbereich) 1 Kontrollfutter n=5 „Maisfutter“ n=5 (Harnproben vor der Infektion=4) DexamethasonBehandlung n=5 Negativ-Kontrolle n=5 (Harnproben vor der Infektion=4) x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max 2,5±0,1 2,4 – 2,6 2,5±0,2 2,4 – 2,5 2,7±0,2 2,5 – 2,8 2,6±0,1 2,4 – 2,6 Pl-Ca Vor (2,4-3,0 mmol/l) Ende2 2,9a±0,2 2,6 – 3.2 2,8a±0,2 2,4 – 2,9 3,1a ±0,2 2,8 – 3,5 2,8 a ±0,4 2,3 – 3,1 FE-Ca Vor1 0,9*±0,7 0,1 – 1,9 0,8±0,5 0,1 – 1,3 1,5±0,6 0,7 – 2,2 1,9*±1,9 0,2-4,1 (0-18 %) arcsin Ende2 21,4b*±16,7 0,7 – 44,4 0,8a±0,5 0,5 – 1,7 4,6a±4,6 1,3 – 12,6 16,3a±15,1 2,7 - 39,9 Pl-P Vor1 2,3 ±0,2 2,0 – 2,4 2,3±0,2 2,2 – 2,5 2,1±0,1 1,9 – 2,2 2,4±0,5 1,6 -2,7 (1,3-3,3 mmol/l) Ende2 1,7 ±0,2 1,4 – 2,0 2,0 ±0,1 1,9 – 2,1 1,8±0,3 1,6 – 2,4 1,9 ±0,2 1,6 – 2,1 11,9 ± 2,9 9,0 – 16,4 9,5±6,6 2,7 – 16,3 2,3±1,5 1,0 – 4,7 2,5±2,7 0,3 – 5,5 1 FE-P Vor (0,2-55,6 %) arcsin Ende2 1,3±1,1 0,1 – 3,1 4,2±2,6 0,9 – 8,1 15,8±11,6 7,2 – 36,0 1,1±0,6 0,2 – 1,8 Pl-Na Vor1 144,9±2,8 142,5-150,5 147,7 ±3,2 140 – 148 146,8±2,2 144 – 150 144,9±4,2 143,5-154,5 (140-160 mmol/l) Ende2 147,3±4,3 140,0 -153,0 149±5,3 140 – 150 142,4±4,4 139 - 150 145,3±1,4 143,5-146,5 FE-Na Vor1 0,09±0,07 0,01 – 0,16 0,07±0,04 0,0 – 0,10 0,22±0,08 0,12 – 0,31 0,10±0,04 0,07 – 0,15 (0-1,1 %) arcsin Ende 0,32±0,22 0,04 – 0,62 0,03±0,02 0,01 – 0,05 0,36±0,33 0,01 – 0,8 0,39±0,27 0,06 – 0,69 Pl-K Vor1 4,1±0,4 3,7 – 4,7 4,5*±0,5 3,7 - 5,1 5,7±0,6 4,6 – 6,4 4,2±0,5 3,7-4,9 (4,0–5,0 mmol/l) Ende2 4,9b±0,5 4,5 – 5,7 5,8a*±0,2 5,5 – 6,0 5,4ab±0,7 4,2 – 5,9 4,8b±0,5 4,3 – 5,6 FE-K Vor1 8,4±3,5 2,9 – 11,4 9,9±3,4 6,7 – 14,7 5,4±1,9 1,9 – 10,5 25,4±20,5 3,3 – 43,7 (0,5-55 %) arcsin Ende2 26,4±10,1 17,6 – 42,9 15,6±5,9 9,0 – 25,0 4,4±1,8 0,8 – 8,7 17,4±5,1 15,2 – 23,7 2 118 Ergebnisse 4.5.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) 4.5.2.1 Hämatologische Untersuchung Tabelle 28 zeigt die Laborwerte für die hämatologischen Parameter bei den Tieren aus dem Versuch 1 mit den dazugehörigen Referenzbereichen auf. Bei diesem Versuch waren Veränderungen in Bezug auf das rote Blutbild nur bei einzelnen Versuchstieren zu sehen (Hämoglobin und/oder Hämatokrit geringgradig unterhalb der Norm), die Mittelwerte der geprüften Parameter lagen zu den Untersuchungszeitpunkten im Bereich der Norm. Die mittlere Leukozytenzahl lag bei allen Gruppen außer bei der B.-intermedia-Gruppe zum Zeitpunkt vor der Infektion am oberen Rande des Referenzbereiches oder darüber (NegativKontrolle). Am Ende des Versuches waren die Wert deutlich abgesunken (p<0,001) und befand sich wieder im Normbereich. 4.5.2.2 Nierenfunktionsparameter In der Tabelle 29 werden die Nierenfunktionsparameter der Versuchstiere aus Versuch 1 mit ihren Referenzbereichen dargestellt. Die Werte für Pl-Kreatinin, Kreatinin-Clearance und Pl-Harnstoff waren im Durchschnitt unauffällig und ergaben keine Hinweise auf Nierenfunktionsstörungen. Geringgradig erhöhte Kreatinin-Werte konnten nur bei Einzeltieren verschiedener Gruppen vor Infektion beobachtet werden. Lediglich für die mittlere fraktionelle Exkretion von Wasser ergab sich bei einer Gruppe (B. innocens, vor Infektion) ein Wert, der leicht oberhalb des Referenzbereiches lag. Bei der Überprüfung der Mineralstoffe und Elektrolyte konnten nur für die Pl-KaliumKonzentrationen Abweichungen nachgewiesen werden. Mittlere Werte im Sinne einer leichten Hyperkaliämie waren in allen Gruppen zu beiden Untersuchungszeitpunkten zu belegen, Unterschiede zur Negativ-Kontrollgruppe bestanden nicht. Die Werte zu Beginn und zum Ende des Versuchs ergaben keine signifikanten Differenzen. Die Plasmawerte für Ca, P und Na sowie die Werte für die fraktionellen Exkretionen verhielten sich bis auf Einzelwerte unauffällig. 119 Ergebnisse Tab. 28: Mittelwerte und Standardabweichung verschiedener Blutparameter von Schweinen aus dem Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung + Kontrollfutter) Parameter (Referenzbereich) Hämoglobin (108-148 g/l) Hämatokrit (0,33-0,45 l/l) MCHC B. hyodysenteriae n = 11 B. innocens n = 10 B. intermedia n=5 B. murdochii n = 10 Negativ-Kontrolle n=8 x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Vor1 118,9±6,1 109-128 114,1±10,9 100-136 115,4±9,0 103-128 116,4±11,7 103-134 118,9±7,1 112-133 Ende2 117,9±6,7 110-132 115,6±8,3 105-134 119,8±4,9 113-126 110,5±14,5 71-122 115,7±8,9 101-125 Vor1 0,35±0,02 0,32-0,37 0,35±0,03 0,30-0,41 0,35±0,03 0,32-0,40 0,34±0,02 0,32-0,38 0,35±0,01 0,33-0,37 Ende2 0,35±0,02 0,32-0,39 0,34±0,02 0,30-0,38 0,37±0,02 0,34-0,38 0,34±0,02 0,30-0,37 0,34±0,03 0,30-0,38 Vor1 338,9±13,2 319-363 330,9±16,4 309-356 326,2±5,0 320-332 338,0±20,9 312-368 343,1±10,9 326-359 Ende2 336,9±7,1 326-346 341,2±10,5 328-353 327,6±5,9 319-332 326,9±38,8 322-358 337,0±11,3 317-354 Vor1 7,1±0,3 6,5-7,5 7,1±6,5 6,1-8,3 7,2±0,6 6,5-7,5 7,0±0,4 6,5-7,7 7,0±0,3 6,7-7,5 Ende2 7,10±0,4 6,5-7,9 6,90 ±0,5 6,1-7,7 7,4 ±0,3 6,9-7,7 6,7 ±0,5 6,1-7,5 7,0 ±0,5 6,1-7,7 Vor1 21,7†±3,1 17,5-21,1 20,3†±4,9 13,0-29,5 18,7±4,3 13,8-25,0 21,5†±3,6 16,0-29,2 27,5†±7,1 18,0-40,9 Ende2 15,0±2,8 10,8-19,6 15,5±2,8 11,5-20,3 12,7 ±0,9 11,7-13,8 16,5±3,2 11,1-21,5 13,02±2,7 9,6-17,9 (300-400 g/l) Erythrozyten (5,8-8,2 T/l) Leukozyten (10,0-22,0 G/l) 120 Ergebnisse Tab. 29: Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparameter von Tieren aus dem Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung + Kontrollfutter; Mittelwerte und Standardabweichungen, x ±s) B. hyodysenteriae n = 11 B. innocens n = 10 B. murdochii n = 10 Negativ-Kontrolle n=8 (Harnproben vor der Infektion=5) (Harnproben vor der Infektion=6) (Harnproben vor der Infektion=7) (Harnproben vor der Infektion=4) x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Vor1 100,9±25,7 77-142 105,7±28,8 76-166 74,0±12,9 60-95 112,6±28,5 70-152 84,0±32,2 57-156 Ende2 96,9±16,8 65-129 84,3±12,9 67-113 89,6±10,9 80-105 104,8±13,1 86-124 87,4±14,4 74-110 Kreat.-Clear. (1,68-4,68 ml/min/kg)3 Vor1 1,94±0,46 1,30-2,50 1,90±0,46 1,20-2,50 2,60±0,44 1,90-3,20 1,77± 0,49 1,20-2,80 2,43±0,60 1,25-3,00 Ende2 2,23±0,50 1,55-3,30 2,54±0,30 1,89-3,20 2,38±0,30 2,02-2,66 2,01±0,30 1,64-2,40 2,47±0,40 1,25-3,04 FE-Wasser (0,2-3,2 %) 3 arcsin Vor1 0,9±0,5 0,5-1,8 3,8±2,8 1,5-9,2 2,8±2,5 1,3-7,2 0,9±0,3 0,5-1,3 1,0±0,5 0,2-1,8 Ende2 0,8± 0,2 0,4-1,1 0,8± 0,3 0,4-1,2 2,0±1,5 0,7-4,6 0,7±0,2 0,3-1,1 0,6±0,2 0,4-1,0 Pl-Harnstoff (3,0-8,0 mmol/l)3 Vor1 4,4±1,2 2,0-6,4 5,1±1,7 3,0-7,7 4,7±0,7 4,1-5,9 6,4±1,4 4,6-8,7 5,7±0,9 4,3-7,2 Ende2 4,6±0,9 3,3-6,5 3,8±0,6 3,3-5,1 4,4 ±0,9 3,6-5,9 4,7±1,3 3,3-7,1 4,6 ±1,2 3,3-6,3 U-Protein (≤0,3 g/l)3 log Vor1 0,0 0,0 0,0 0,0 n.u n.u 0,03± 0,06 0,0-0,1 0,0 0,0 0,08±0,09 0,00-0,30 0,09±0,10 0,00-0,30 0,05-0,06 0,00-0,10 0,04±0,06 0,00-0,30 0,08±0,07 0,00-0,20 1,025 ± 0,013 1,022 ±0,005 1,0101,035 1,0151,032 1,011 ±0,006 1,018 ± 0,006 1,0041,019 1,0101,025 n.u. n.u 1,016 ± 0,011 1,0041,024 1,029 ± 0,005 1,028 ± 0,006 1,0241,034 1,0181,035 1,014 ± 0,01 1,025 ±0,008 1,0051,023 1,0111,032 Parameter (Referenzbereich) Pl-Kreatinin (40-130 mmol/l) 3 Ende2 Vor spez. Gew. (g/ml) 1 Ende2 121 B. intermedia n=5 Ergebnisse Fortsetzung Tab. 29 Parameter (Referenzbereich) 1 B. hyodysenteriae n = 11 B. innocens n = 10 (Harnproben vor der Infektion=5) (Harnproben vor der Infektion=6) x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s 2,9 ±1,0 2,3-5,9 2,6±0,2 2,3-2,9 B. intermedia n=5 B. murdochii n = 10 Negativ-Kontrolle n=8 (Harnproben vor der Infektion=7) (Harnproben vor der Infektion=4) Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max 2,7±0,1 2,5-2,8 2,6±0,2 2,3-2,8 2,6 ±0,1 2,5-2,8 Pl-Ca Vor (2,4-3,0 mmol/l) Ende2 2,7±0,2 2,4-2,8 2,5±0,2 2,4-2,8 2,8±0,1 2,7-2,8 2,6 ±0,2 2,2-2,9 2,5 ±0,3 1,7-2,8 FE-Ca Vor1 0,9± 0,3 0,3-1,3 2,3± 2,1 0,4-7,1 0,8± 0,6 0,2-1,6 2,5±1,9 1,0-6,4 3,8± 3,4 0,0-7,1 (0-18,0 %) arcsin Ende2 2,5±1,9 0,4-6,1 3,4± 2,7 0,8-6,4 0,7± 0,6 0,3-1,7 3,9± 2,7 0,7-7,3 2,8± 2,6 0,3-6,5 Pl-P Vor1 2,3 ±0,3 2,0-2,9 2,1±0,2 1,8-2,5 2,5 ±0,3 2,4-2,7 2,2 ±0,2 1,9-2,6 2,4 ±0,3 2,1-2,8 (1,3-3,3 mmol/l) Ende2 2,7±0,5 1,9-3,3 2,4 ±0,5 1,8-3,1 2,6±0,2 2,3-2,8 2,4±0,43 1,8-3,2 2,3±0,2 1,9-2,5 FE-P Vor1 12,7±3,8 7,7-17,1 11,9±5,7 7,4-22,5 10,9±4,0 5,4-14,2 6,7±3,1 1,5-11,4 5,7 ±4,4 0,4-11,1 (0,2-55,6 %) arcsin Ende2 3,9± 3,0 0,1-8,5 3,8± 3,3 0,2-8,0 4,2± 3,0 0,3-7,7 5,4± 4,9 0,1-11,8 4,2±1,9 0,1-7,03 1 Pl-Na Vor 146,1±3,1 141-152 144,3±4,5 137-152 140,5±3,5 136-141 146,5±3.1 143-152 148,2±4,7 143-155 (140-160 mmol/l) Ende2 145,7±3,6 143-152 142,2±2,3 137-147 143,8±1,5 136-145 145,5±2,1 141-149 140,9±7,6 126-152 FE-Na (0-1,1 %) arcsin Vor1 0,54±0,87 0,01-2,2 0,5±0,9 0,01-2,5 0,46± 0,59 0,05-1,5 0,03± 0,04 0,0-0,11 0,2±0,4 0,01-0,8 Ende2 0,3 ± 0,3 0,01-0,12 0,08±0,09 0,01-0,3 0,29± 0,28 0,05-0,7 0,15±0,12 0,04-0,3 0,04±0,04 0,01-0,12 6,6 ±0,5 5,9-7,3 6,5±0,42 5,99-7,1 5,5±0,82 4,8-6,8 6,3±0,75 5,5-7,4 4,9±0,7 3,9-6,3 1 Pl-K Vor (4,0-5,0 mmol/l) Ende2 5,46±0,55 4,4-6,2 5,6±0,75 4,6-6,9 5,2 ±0,3 4,6-5,4 5,72±0,4 5,3-6,1 5,3±0,7 4,5-6,3 FE-K Vor1 13,4±10,0 1,1-24,3 13,3±12,9 0,6-36,5 23,5±7,1 13,4-29,7 8,9± 6,7 1,7-22,3 23,3±22,2 11,4-62,8 (0,5-55,0 %) arcsin Ende2 14,1± 6,3 9,1-27,3 11,3±4,7 1,8-15,3 10,3±3,0 7,0-14,5 16,6±4,1 11,6-21,4 8,5± 4,1 3,1-15,9 122 Ergebnisse 4.5.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 4.5.3.1 Hämatologische Untersuchung Bei Betrachtung der Mittelwerte aus Tabelle 30 konnten deutliche Veränderungen einiger hämatologischer Parameter bei der B.-hyodysenteriae-Gruppe festgestellt werden. Hämoglobin- und Erythrozyten-Werte zeigten einen hochsignifikanten (p<0,001), der Hämatokrit-Wert einen tendenziellen Anstieg zum Ende des Versuchs. Dagegen waren die Hämoglobin- und Hämatokrit-Werte bei den übrigen Gruppen vor der Infektion eher erniedrigt und hielten sich, bis auf die B.-intermedia-Gruppe, bei der auch ein Anstieg der Hämoglobin-Konzentration zu verzeichnen war, auf niedrigem Niveau. Die mittlere Leukozytenzahl bei den mit B. hyodysenteriae infizierten Tieren war zum Zeitpunkt des Versuchsendes über den Normalbereich hinaus angestiegen. Diese Leukozytose war signifikant (p<0,001) im Vergleich zum Zeitpunk vor der Infektion, ebenfalls signifikant unterschiedlich (p<0,05) im Vergleich zu den übrigen Versuchsgruppen. Eine erhöhte Leukozytenzahl konnte vor Versuchsbeginn auch bei einer Reihe von Tieren der übrigen Versuchsgruppen beobachtet werden: B.-innocens- (n=9/15), B.-murdochii- (n=9/15), B.-intermedia-infizierten Gruppe (n=5/10) bzw. bei der Kontrollgruppe (n=1/3). Zum Versuchsende war die Leukozytenzahl aber bei fast allen Tieren dieser Gruppen wieder im Referenzbereich. 4.5.3.2 Nierenfunktionsparameter Bei Betrachtung der Messwerte aus Tabelle 31 war bei der mit B. hyodysenteriae infizierten Gruppe eine Einschränkung der Nierenfunktion erkennbar. Der Mittelwert des Pl-Kreatinins war bei dieser Gruppe am Versuchende über den oberen Referenzbereich hinaus erhöht (p<0,001), im Einzelfall lagen Werte bis zu 638 µmol/l vor. Aufgrund einer starken Streuung der Werte war der Unterschied zu den anderen Gruppen am Versuchsende jedoch nicht signifikant. Die Erhöhung der Kreatinin-Konzentration ging mit einer verminderten Kreatinin-Clearance bei sechs Versuchstieren einher. Ebenso war bei einzelnen Tieren (n=4) der Harnstoffgehalt 123 Ergebnisse zum Versuchsende hin erhöht, die mittlere Konzentration befand sich jedoch im Normbereich. Für die übrigen Versuchsgruppen und die Negativ-Kontrollgruppe konnten zu Versuchsbeginn vor der Infektion mittlere Harnstoff-Konzentrationen knapp über dem Referenzbereich festgestellt werden, diese lagen aber zum Versuchsende im Normbereich. Bei der Überprüfung der Mineralstoff- und Elektrolyt-Konzentrationen in Versuch 2 ergaben sich allgemein bei allen Gruppen Kalium-Werte, die im Mittel sowohl vor Infektion als auch am Versuchsende über der Norm lagen. Die fraktionelle Exkretion von Kalium ging zum Versuchsende hin in allen Gruppen, z.T. signifikant, zurück. Kalzium- und Phosphor-Werte im Blut waren unauffällig, die mittlere FE-Phosphor ließ in allen Gruppen einen signifikanten Anstieg erkennen, die Werte blieben jedoch im Normbereich. Für die B.-hyodysenteriae-Gruppe konnte bei der Beprobung vor der Sektion eine deutliche Hyponatriämie im Vergleich zur Ausgangssituation nachgewiesen werden (p<0,001), dieser Unterschied bestand auch zu den anderen Versuchsgruppen und der Negativ-Kontrollgruppe (p<0,05). Eine Veränderung der fraktionellen Exkretion ergab sich dabei für Natrium aber nicht in dieser Gruppe. Werte oberhalb des Referenzbereiches für FE-Natrium konnten zu Versuchsbeginn bei der B.-innocens-Gruppe und am Versuchsende bei der B.-murdochiiGruppe gefunden werden. 124 Ergebnisse Tab. 30: Mittelwerte und Standardabweichungen verschiedener Blutparameter von Schweinen aus dem Versuch 2 („Sojafutter“) Parameter (Referenzbereich) Hämoglobin B. hyodysenteriae n = 15 B. innocens n = 15 B. intermedia n = 10 B. murdochii n = 24 Negativ-Kontrolle n=3 x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Vor1 115,7 ±10,4 †† 87-127 109,6 ±5,6 98-118 109,7††±5,6 101-120 108,8±9,1 95-125 104,3 ±8,5 98-114 Ende2 133,0±10,9 112-152 107,3 ±9,2 93 - 125 117,7±5,3 109-126 108,4±7,3 95-125 113,7±4,9 108-117 Vor1 0,35±0,03 0,29-0,38 0,33±0,02 0,31-0,37 0,33±0,02 0,31-0,36 0,32±0,02 0,28-0,37 0,32±0,03 0,32-0,35 Ende2 0,40±0,03 0,34-0,44 0,32± 0,03 0,28-0,36 0,34± 0,02 0,32-0,37 0,33±0,02 0,29-0,37 0,34± 0,02 0,32-0,35 Vor1 331,7±15,8 300-359 330,6±10,0 316-344 329,3±5,0 320-336 338,2±10,9 323-361 330,0±6,1 334-341 Ende2 332,3±10,9 316-356 338,1±15,6 321-372 345,2±10,2 331-359 333,1±7,1 324-350 337,7±3,5 334-341 Vor1 7,1 ±0,5 5,9-7,7 6,7 ±0,33 6,3-7,5 6,7 ±0,33 6,3-7,3 6,5 ±0,4 5,7-7,5 6,4±0,6 6,5-7,1 Ende2 8,1±0,5 6,9-8,9 6,5 ±0,5 5,7-7,3 6,9±0,3 6,5-7,5 6,6 ±0,4 5,9-7,5 6,8±0,3 6,5-7,1 Vor1 18,8 ±2,4 †† 14,0-22,0 21,4±3,9 12,5-27,0 22,8±3,0 18,2-26,5 21,7±3,3 14,3-29,5 22,7±4,05 19,6-27,3 Ende2 28,8a*±8,4 14,1-42,7 20,5b±3,3 14,4-26,2 18,2b±1,2 16,1-21,2 18,1b ±2,4 13,3-21,2 18,7b ±2,4 16,4-21,2 (108-148 g/l) Hämatokrit (0,33-0,45 l/l) MCHC (300-400 g/l) Erythrozyten (5,8-8,2 T/l) Leukozyten (10,0-22,0 G/l) †† 125 Ergebnisse Tab. 31: Ergebnisse der Prüfung verschiedener Blutparameter und Nierenfunktionsparametern von Tieren aus dem Versuch 2 („Sojafutter“; Mittelwerte und Standardabweichungen, x ±s) Parameter (Referenzbereich) B. hyodysenteriae n = 15 B. innocens n = 15 B. intermedia n =10 B. murdochii n = 24 (Harnproben vor der Infektion=13) (Harnproben vor der Infektion=14, am Versuchende n=10) (Harnproben vor der Infektion=5, am Versuchende n=9) (Harnproben vor der Infektion=16, am Versuchende n=18) x ±s 1 Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max 86,0139,0 67,0638,0 86,1 ±16,9 93,3a ±19,2 57,9119,0 71,0134,0 80,5 ±13,5 96,1a ±15,4 59,0105,0 75,0 124,0 97,7 ±24,6 116,0a ±25,1 51,0153,0 68,0182,0 80,0 ±5,6 103,3 a ±14,6 74,085,0 88,0117,0 (40-130 mmol/l) 3 log Ende2 101,4 ±15,6 136,8a ±140,4 Kreat.-Clear. (1,68-4,68 ml/min/kg)3 Vor1 1,87±0,24 1,41-2,18 2,16±0,45 1,44-3,24 2,11±0,70 0,32-2,72 2,04±0,55 1,24-3,64 2,25±0,17 2,08-2,43 Ende2 1,80±0,57 0,27-2,69 2,16±0,41 1,40-2,84 2,18±0,34 1,62-2,73 1,85±0,43 1,13-2,48 1,98±0,30 1,71-2,31 Vor1 1,7±2,7 0,4-10,2 1,6±0,8 0,5-3,1 3,6±5,3 0,8-13,0 2,3±2,5 0,8-10,8 1,1±0,2 0,9-1,3 Ende2 0,9±0,5 0,0-2,0 0,7±0,2 0,3-0,8 0,7±0,2 0,5-1,2 2,4±5,2 0,6-23,0 0,7±0,2 0,6-0,9 Pl-Harnstoff Vor1 6,9±1,6 5,3-9,9 10,3±2,4 6,3-13,6 10,0±1,7 6,4-12,5 9,3±1,7 6,9-12,1 9,7±2,7 7,1-12,5 (3,0-8,0 mmol/l) 3 Ende2 7,2± 4,8 3,5-23,1 5,2±1,1 3,3-6,5 5,5±0,8 4,5-7,0 5,3±1,2 3,3-7,8 4,5±0,7 3,8-5,1 U-Protein Vor1 0,12±0,08 0,00-0,30 0.14±0,11 0,00-0,30 0,16±0,09 0,10-0,30 0,10±0,11 0,00-0,30 0,07±0,06 0,00-0,10 (<0,3 g/l) 3 log Ende2 0,19±0,10 0,00-0,30 0,14±0,12 0,00-0,30 0,11±0,12 0,00-0,30 0,07±0,05 0,00-0,10 spez. Gew. (g/ml) Vor1 1,024 ±0,011 1,0021,035 1,021 ±0,009 Ende2 1,025 ±0,005 1,0151,033 1,028 ±0,005 Pl-Kreatinin FE-Wasser (0,2-3,2 %) 3 arcsin Vor * Negativ-Kontrolle n=3 0,0-0,0 0,0-0,0 1,0111,035 1,028 ±0,002 1,0261,031 1,020 ±0,008 1,0041,026 1,026 ±0,001 1,0251,027 1,0221,037 1,024 ±0,004 1,0161,029 1,022 ±0,007 1,0031,034 1,020 ±0,003 1,0161,022 126 Ergebnisse Fortsetzung Tab. 31 Parameter (Referenzbereich) Pl-Ca (2,4-3,0 mmol/l)3 3 B. innocens n = 15 B. intermedia n =10 B. murdochii n = 24 (Harnproben vor der Infektion=13) (Harnproben vor der Infektion=14, am Versuchende n=10) (Harnproben vor der Infektion=5, am Versuchende n=9) (Harnproben vor der Infektion=16, am Versuchende n=18) Negativ-Kontrolle n=3 x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max x ±s Min-Max Vor1 2,8±0,2 2,5-3,1 2,6±0,2 2,4-2,9 2,8±0,1 2,6-3,0 2,8±0,3 2,3-3,4 2,8±0,1 2,7-2,9 Ende2 2,6 ±0,4 1,4-3,1 2,8±0,3 2,4-3,3 2,8±0,1 2,6-3,0 2,7± 0,3 2,1-3,2 2,4± 0,1 2,3-2,5 1,5±1,8 0,0-6,0 1,4±1,0 0,3-3,6 10,0±16,2 1,4-38,9 2,8±2,1 0,0-7,6 2,7±1,6 0,9-4,0 Vor FE-Ca B. hyodysenteriae n = 15 1 (0-18,0 %) arcsin Ende2 0,8±0,7 0,1-2,7 1,9 ± 1,2 0,8-4,2 0,8±0,6 0,3-1,8 2,8±2,6 0,1-7,7 0,2±0,03 0,1-0,2 Pl-P Vor1 2,0-0,5 1,1-2,8 2,1±0,4 1,7-2,7 2,7±0,5 1,7-3,5 2,3±0,3 1,9-2,7 2,2±0,2 1,9-2,4 Ende2 2,3±0,8 1,2-4,1 2,6±0,2 2,1-2,94 2,8±0,4 2,14-3,4 2,8±0,24 2,3-3,3 2,8±0,1 2,7-2,9 (1,3-3,3 mmol/l) 3 Vor FE-P 3 1 †† * 0,92 ±1,27 0,07-4,23 0,49 ±0,51 0,00-1,48 2,10±1,09 0,50-3,59 1,12*±1,19 0,09-3,55 0,09*±0,00 0,08-0,09 (0,2-55,6 %) arcsin Ende 18,77±13,24 0,09-47,06 5,88±3,27 1,62-11,55 7,18±2,13 3,31-10,42 9,13±4,70 2,96-18,2 8,10±3,39 5,97-12,00 Pl-Na Vor1 141,6 ±8,7 †† 126-150 141,9±2,8 136-145 148,5±4,9 141-154 142,9±2,3 139-149 141,0±3,0 138-144 Ende2 129,5c*±8,9 117-141 145,3a±2,2 142-149 140,4b±2,7 138-145 146,7a±3,4 140,5-152 145,3±1,5 144-147 Vor1 0,02±0,04 0,00-0,14 0,01±0,01 0,00-0,03 0,014±0,03 0,00-0,06 0,07±0,10 0,00-0,26 0,01±0,01 0,00-0,01 2 (140-160 mmol/l) FE-Na 3 3 2 (0-1,1 %) arcsin Ende 0,02±0,02 0,00-0,07 0,13±0,20 0,01-0,69 0,07±0,06 0,00-0,15 0,50±0,50 0,01-1,62 0,17±0,03 0,15-0,20 Pl-K Vor1 5,7±0,7 4,3-6,8 5,4±0,7 4,1-6,4 6,1±0,9 4,8-7,4 5,53±0,7 4,2-6,7 6,1±1,1 4,9-7,2 Ende2 5,6±1,1 3,9-8,3 6,1±1,0 4,7-8,3 5,4±0,7 4,2-6,2 5,5±0,6 4,5-6,8 5,5±0,0 5,4-5,5 † (4,0–5,0 mmol/l) FE-K (0,5-55,0 %)3 arcsin 3 Vor 1 2 Ende * 15,3 ±6,7 6,3-28,5 19,9±9,0 2,7-31,8 69,9 ±104,0 7,7-276,3 23,2±13,6 1,3-60,3 26,8 ±4,3 22,5-31,1 0,6±1,3 0,0-5,3 6,9±2,2 4,1-11,2 9,1±2,7 5,2-12,8 16,8±14,1 0,97-63,7 5,6±0,8 4,8-6,4 127 * Diskussion 5 DISKUSSION 5.1 Vorversuch Im Vorversuch sollte zunächst eine Methode zur experimentellen B.-hyodysenteriae-Infektion etabliert werden, mit der das klinische Bild der Dysenterie zuverlässig erzeugt werden kann. Dies ist im Zusammenhang damit zu sehen, dass B.-hyodysenteriae-Infektionen auch häufig latent verlaufen können, und dass eine klinische Erkrankung nur unter bestimmten Bedingungen zu beobachten ist (KINYON et al. 1980; ALBASSAM et al. 1985; HAMPSON et al. 1992). Diese Bedingungen sollten für das Modell definiert werden, um sicher zu stellen, dass im zweiten Schritt bei der Testung der schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten auf Pathogenität Voraussetzungen gegeben waren, die zumindest bei der als pathogen bekannten Brachyspira-Art zum klinischen Krankheitsbild führen. Im Vorversuch wurde B. hyodysenteriae nur bei den 5 Tieren der mit Dexamethason behandelten Gruppe nach der Infektion reisoliert, während bei den mit einem handelsüblichen Futter (Kontrollfutter) bzw. mit „Maisfutter“ gefütterten Gruppen B. hyodysenteriae weder in Kot- noch in Darmschleimhaut-Proben gefunden werden konnte. Dies lässt darauf schließen, dass die experimentelle Infektion bei den letztgenannten Gruppen nicht zu einer erfolgreichen Besiedelung der Darmschleimhaut mit B. hyodysenteriae führte. Eine zweite Möglichkeit wäre, dass die Keimzahl an B. hyodysenteriae im Kot bzw. im Darm zu gering war, um mittels der Kultur nachgewiesen zu werden. RÅSBÄCK et al. (2005) konnten zeigen, dass der kulturelle Nachweis ab einer Erregermenge von 1000 KbE/g Kot für B. hyodysenteriae gelingt. Dagegen berichteten CALDERARO et at. (2005) über eine Nachweisgrenze von 102 bis 107 KbE pro g Kot für Brachyspira spp. nach zwei Tagen in Kultur. Über den Einfluss des Futters auf die Entwicklung einer klinischen Dysenterie-Erkrankung ist bereits von vielen Autoren berichtet worden (PROHASZKA u. LUKACS 1984; SIBA et al. 1996; PLUSKE et al. 1996, 1998; DURMIC et al. 1998; KIRKWOOD et al. 2000; BILIC u. BILKEI 2003; JACOBSON et al. 2004; THOMSEN et al. 2007). Die Studien von PLUSKE et al. (1996, 1998) haben gezeigt, dass neben einem hohen Anteil löslicher Nicht-Stärke-Polysaccharide (sNSP) die Kolonisation von B. hyodysenteriae auch durch hohe Gehalte an resistenter Stärke (RS) im Futter begünstigt wird, wodurch eine 128 Diskussion synergistische Kolonflora (z.B. Fusobacterium spp.) unterstützt wird. Deshalb wurde im Vorversuch eine Gruppe mittels einer Ration mit erhöhtem Anteil an grob geschrotetem Mais, der einen erhöhten RS-Gehalt besitzt, gefüttert. RS ist die Stärke, die der Verdauung in Dünndarm entgeht und unverdaut in das Zäkum und Kolon gelangt (ANNISON u. TOPPING 1994). Es werden drei Unterarten der resistenten Stärke unterschieden: 1) RS1 - physikalisch eingeschlossene Stärke, die in ganzen oder teilweise geschroteten Getreidekörnern gefunden wird. Der Zugang der verdauungsfördernden Enzyme zur Stärke kann verhindert oder verzögert sein; 2) RS2 –nicht gelatinierte StärkeGranula, die gegen die Verdauung durch α-Amylase bis zur Gelatinierung hoch resistent sind und 3) RS3- Retrogradierte Stärke, die beim Erhitzen und anschließendem Abkühlen von Stärke entsteht (MUIR et al. 1993). RS kann die Fermentierung im Dickdarm und die Konzentration an kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) sowohl in vitro (WANG u. GIBSON 1993) als auch in vivo (TOPPING u. CLIFTON 2001) erhöhen und bei Absetzferkeln zu Diarrhoe führen (AUMAITRE et al. 1995). Sowohl die Fütterung als auch die Mikroflora können die Produktion von Muzin im Dickdarm beeinflussen (SHARMA et al. 1995). Auch die SCFA bewirken eine vermehrte Mukussekretion im Dickdarm (CUMMINGS u. MACFARLANE 1991; SHIMOTOYODOME et al. 2000). Dies kann die Bedingungen für die Ansiedlung von B. hyodysenteriae im Kolon verbessern (PLUSKE et al. 1998), da B. hyodysenteriae sich in intestinalem Mukus gut bewegen kann, um die Schleimhaut zu besiedeln (MILNER u. SELLWOOD 1994). Des Weiteren berichteten DURMIC et al. (1998), dass RS den Gehalt an Bakterien im Kolon insgesamt vermehrte und das Wachstum Gram-negativer Bakterien stimuliert wurde. Die Veränderungen der Mikroflora im Kolon schaffen anscheinend bessere Bedingungen für die Ansiedelung und Vermehrung von B. hyodysenteriae. Die Veränderung der Mikroflora kann auch über deren Metabolisierungsvorgänge und damit durch anfallende Neben- und Endprodukte einen Einfluss auf das intestinale Milieu haben. In der eigenen Studie zeigte sich jedoch, dass entgegen der Hypothesen bei der Verfütterung der Maisschrotration im Vorversuch keine Kolonisierung des Darms mit B. hyodysenteriae erzielt wurde. Zwar konnte bei einzelnen Tieren der Gruppe kurzzeitig eine dünnbreiige 129 Diskussion Kotkonsistenz (maximal für 2 Tage) beobachtet werden, jedoch entstand keine länger persistierende Durchfallerkrankung bei den Versuchstieren. Das Ausbleiben einer nachweisbaren Infektion und einer klinischen Erkrankung bei Verfütterung eines handelsüblichen Futters (Kontrollfutter) bestätigte die Beobachtung, dass es unter günstigen Bedingungen trotz Aufnahme des Erregers oft nicht zum Ausbruch einer Dysenterie-Erkrankung kommt, sondern erst, wenn belastende Faktoren wie Stallwechsel, Transport, ungünstige Futterzusammensetzung, Futterwechsel, ungünstiges Stallklima, Überbelegung oder zootechnische Maßnahmen hinzukommen (WALDMANN 1992; HARRIS et al. 1999). Im Gegensatz zur Gruppe, die für die experimentelle Infektion nur das Kontrollfutter erhielt, wurde bei allen Tieren, die im Vorversuch neben dem Kontrollfutter eine DexamethasonBehandlung erhielten, eine erfolgreiche Kolonisation (100 %) von B. hyodysenteriae nach der Infektion mit anschließender klinischer Erkrankung nachgewiesen. Dieses kann durch den Einfluss von Dexamethason als ein Immunsuppression induzierender Faktor erklärt werden (ERIKSEN u. ANDERSEN 1970; AMTSBERG et al. 1984; JACOBSON 2004). Die klinischen Erscheinungen bei den Dexamethason-behandelten Tieren im Vorversuch entsprachen den Beobachtungen im Feld und den Ergebnissen einiger anderer Arbeitsgruppen, die experimentelle Infektionen unter ähnlichen Umständen durchführten (ERIKSEN u. ANDERSON 1970; AMTSBERG et al. 1984; AMTSBERG u. MERKT 1986; BAUMANN u. BILKEI 2002; LINDECRONA et al. 2003). Nach AMTSBERG et al. (1984) wurden bei Schweinen, die vor und nach der Infektion Prednisolon erhielten, schwerere klinische Erscheinungen mit häufigem Auftreten von blutigem Kot bzw. kürzere Inkubationszeiten beobachtet. Vier von fünf Schweinen waren im Allgemeinbefinden gestört und entwickelten eine dünnflüssige, muko-hämorrhagische Diarrhoe 16-25 Tage p.inf. Die Inkubationszeit war damit länger als in vorherigen Studien beschrieben (WILCOCK u. OLANDER 1979; AMTSBERG et al. 1984; TAYLOR 1999; SOMCHIT et al. 2003). Bei einem Tier normalisierte sich die Kotkonsistenz nach acht Durchfalltagen, während bei den drei übrigen Tieren die Diarrhoe bis zur Sektion (über 9 bis 19 Tage) anhielt. Die Tiere der Dexamethason-Gruppe wiesen eine um mehr als 50 % niedrigere durchschnittliche tägliche Körpermassezunahme (0,24 ± 0,17 kg/Tag) mit einem sehr hohen 130 Diskussion Futteraufwand von 5,08 kg/kg Zuwachs im Vergleich zu den Negativ-Kontrolltieren bzw. zu den übrigen Versuchsgruppen auf. Bei drei Durchfalltieren war dabei sogar ein Körpermasseverlust von 2-3 kg während der Durchfallperiode festzustellen. Die pathomorphologischen Veränderungen am Dickdarm entsprachen in der Dexamethasonbehandelten Gruppe dem typischen Bild der Dysenterie mit Schleimhautschwellung, oberflächlicher Nekrose, Blutungen, Fibrinexsudation und mukofibrinöser Pseudomembranbildung (fibrinös-nekrotisierende Typhlocolitis). Die histologischen Veränderungen konzentrierten sich hauptsächlich auf die Mukosa und Submukosa von Zäkum und Kolon. Im Bereich der Ileozäkalklappen waren die Schleimhautveränderungen nur bei stärkerem Durchfall zu finden. Eine Mukosaverdickung in Verbindung mit Hyperämie und einer Dilatation des Kryptepithels sowie einer Becherzellhyperplasie wurde häufig bei allen Durchfalltieren beobachtet (GLOCK et al. 1974; WILCOCK u. OLANDER 1979). Die Verlängerung von Krypten wird durch eine erhöhte Regeneration der Zellen in den Bereichen mit Oberflächennekrose erklärt (WILCOCK u. OLANDER 1979). Jedoch wurde bei der vorliegenden Studie die Kryptdilatation auch unabhängig von Erosionen gefunden, wie auch von JENSEN et al. (1998) beschrieben. Weiterhin kam es auf der Schleimhautoberfläche häufig zu Nekrosen, allerdings waren tiefe Ulzerationen in der Regel nicht vorhanden. Bei diesen Tieren wurde ebenfalls eine Pseudomembranbildung beobachtet, eine erhöhte Mitoserate war dagegen selten zu erkennen (WILCOCK u. OLANDER 1979). In der Lamina propria und z.T. in der Submukosa konnte wie bei JONASSON et al. (2004, 2006) eine Infiltration von neutrophilen Granulozyten, Monozyten und insbesondere Lymphozyten festgestellt werden. Diesbezüglich weisen jedoch HARRIS und GLOCK (1975) auf die Schwierigkeit hin, die Zellinfiltration quantitativ zu bestimmen, da sich auch in der Dickdarmschleimhaut gesunder Schweine Leukozyten relativ zahlreich befinden. Kryptabszesse waren sehr häufig auszumachen, diese wurden jedoch auch bei den Kontrolltieren festgestellt, so dass dieser Veränderung keine große Bedeutung für die Diagnostik zukommt. Bei den übrigen Gruppen des Vorversuchs waren keine pathomorphologischen Läsionen vorhanden, die pathohistologischen Befunde zeigten nur untypische, sehr dezente Veränderungen, die sich nicht von der Negativ-Kontrollgruppe unterschieden. 131 Diskussion Aufgrund der Untersuchungsergebnisse im Vorversuch wurde die Dexamethason-Behandlung als ein wichtiger Faktor zur Auslösung des klinischen Bildes der Dysenterie bei allen Versuchsgruppen des Versuchs 1 durchgeführt. 5.2 Versuch 1 (Dexamethason-Behandlung) Im Versuch 1 wurden alle Versuchstiere vor der Infektion sowie die Negativ-Kontrolltiere nach Maßgabe des Vorversuchs mit Dexamethason behandelt. Im Gegensatz zur Dexamethason-Gruppe im Vorversuch konnte B. hyodysenteriae nur bei 27 % der infizierten Tiere (3 von 11) entweder aus dem Kot und/oder aus dem Dickdarm isoliert werden. Der erste Nachweis gelang in der dritten Woche p. inf. Auch bei den übrigen Versuchsgruppen war nicht bei allen Schweinen eine Besiedelung des Darms nachzuweisen (20 % der B.-intermedia-, 60 % der B.-murdochii- und 70 % der B.- innocens-Gruppe). Durchfall trat nur bei 2 der mit B. hyodysenteriae infizierten Tiere auf, während ein Schwein latent infiziert war. Die Diarrhoe wurde erst nach 25 Tagen p. inf. apparent und hielt 2-5 Tage an, zeigte aber entgegen dem Vorversuch keinen hämorrhagischen Charakter. Störungen des Allgemeinbefindens waren nur bei den Durchfalltieren der B.-hyodysenteriae-Gruppe erkennbar. Ein signifikanter Unterschied bezüglich der durchschnittlichen Körpermassezunahmen zwischen den Gruppen und zur Negativkontrollgruppe bestand dabei nicht. Pathomorphologisch waren bei den B.-hyodysenteriae-infizierten Tieren keine Veränderungen im Sinne einer Dysenterie auszumachen. Das Bild beschränkte sich bei den 3 positiven Tieren auf eine milde katarrhalische Kolitis. Histologisch waren dagegen typische Läsionen wie Kryptdilatation, Becherzellhyperplasie, Ulzeration und Pseudomembranausbildung zu beobachten, der Grad der Veränderungen war jedoch im Vergleich zum Vorversuch deutlich geringer (Tab. 23, 24). Bei den übrigen Versuchsgruppen beschränkten sich Veränderungen auf geringgradige unspezifische Läsionen, die auch bei der Negativ-Kontrollgruppe zu finden waren. Insgesamt gesehen konnte zwar mit der Methodik der Dexamethason-Gabe in Versuch 1 bei einzelnen Tieren eine Besiedelung des Darms mit Brachyspiren erreicht werden, jedoch konnte gerade mit der B.-hyodysenteriae-Infektion kein regelmäßiger Erfolg bei der 132 Diskussion Reisolierung wie im Vorversuch erzielt werden. Die Entwicklung klinischer Symptome blieb darüber hinaus aus oder fiel eher moderat aus, so dass die Vorgabe für das Infektionsmodell zur Überprüfung der Pathogenität schwach hämolysierender Brachyspira-Arten, eine regelmäßige klinische Erkrankung bei B.-hyodysenteriae-Infektion hervorzurufen, doch nicht gegeben war. Ähnliche Erfahrungen machten JACOBSON et al. (2004) nach DexamethasonBehandlung vor experimenteller Infektion mit B. hyodysenteriae. Nach 5 Tagen Dexamethason-Behandlung konnten die Autoren nur bei zwei von sechs Tieren den Erreger reisolieren, wobei lediglich ein Schwein nach 26 Tage p. inf. Durchfall ohne blutige Beimengungen entwickelte. Deshalb wurden in der eigenen Untersuchung vor Beginn des Versuchs 2 verschiedene methodische Versuchsparameter (Haltungsbedingungen, Vorbehandlung, Methodik der experimentellen Infektion, Fütterung) hinsichtlich eines möglichen Einflusses diskutiert bzw. auch verändert. - Haltungsbedingungen Die Haltung im Vorversuch und dem Versuch 1 erfolgte gruppenweise in räumlich getrennten Abteilen mit planbefestigtem, kunststoffbeschichtetem Boden mit Stroheinstreu. Die Stroheinstreu wurde täglich gewechselt. Dagegen wurden die Tiere im Versuch 2 ohne Stroheinstreu gehalten, der Stallboden wurde einmal wöchentlich gereinigt. Die veränderte Haltungsform in Versuch 2 wurde gewählt, da regelmäßige Einstreu und häufiges Reinigen des Stalls Einfluss auf den Verlauf der experimentellen Infektion nehmen können. Über die Einstreu ist außerdem eine zusätzliche Rohfaseraufnahme möglich, die Verdauungsvorgänge und Darmmilieu beeinflussen und protektiv wirken kann (PLUSKE et al. 1998), die aber auch für ein besseres Mikroklima im Bereich der Tiere sorgt. Über die einstreulose Haltung wurde der mögliche Effekt der Rohfaseraufnahme eliminiert sowie ein gewisser Stressfaktor (kühlere Liegefläche) geschaffen. Stress kann den klinischen Verlauf einer Infektion mit B. hyodysenteriae ebenfalls beeinflussen (WALDMANN 1992). Die geringere Reinigungsfrequenz erhöhte die mögliche Erregeraufnahme durch Kontakt mit infiziertem Kot. 133 Diskussion - Versuchstiere und Vorbehandlung Auswahlkriterien für die Versuchstiere waren ein ungestörtes Allgemeinbefinden sowie der Ausschluss des Vorhandenseins von darmpathogenen Bakterien (JACOBSON et al. 2004, THOMSEN et al. 2007) vor Versuchsbeginn. Eine Allgemeinuntersuchung sowie eine bakteriologische Kotuntersuchung wurden direkt nach der Ankunft der Schweine durchgeführt. Ein wesentlicher Einfluss der kommensalen Mikroflora ist in vielen Studien gezeigt worden. Die Besiedlung der Darmschleimhaut mit B. hyodysenteriae kann von der Synergie mit anderer Bakterien (Fusobacterium spp., Bacteroides spp., E. coli, Clostridium spp. oder Lactobacillus spp.) bzw. der Zusammensetzung und der Funktion der intestinalen anaeroben Mikroflora abhängen (WHIPP et al. 1979; JACOBSON et al. 2004). Die synergistische Wirkung anderer Bakterien zu B. hyodysenteriae könnte einerseits in Interaktionen der Bakterien mit der Darmmukosa bestehen, andererseits könnten Synergisten ohne Gewebekontakt günstige Bedingungen für das Wachstum und die Besiedlung von B. hyodysenteriae schaffen (WHIPP et al. 1979). Um das Vorhandensein möglicher Synergisten zu begünstigen, wurden keine gnotobiotischen, sondern Schweine aus konventionellen Herden für die eigenen Untersuchungen genutzt. Aus diesem Grunde musste aber auch mit möglichen latenten Infektionen durch darmpathogene Erreger gerechnet werden. In dieser Studie zeigten jedoch die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung zum Zeitpunkt des Versuchsbeginns bei keinem Schwein eine Infektion mit Salmonella spp., hämolysierenden E. coli, L. intracellularis oder Brachyspira spp. Im Versuch 1 ergab die Allgemeinuntersuchung bei mehreren der insgesamt 44 Schweine nach der Ankunft einen Verdacht auf Bronchopneumonie mit den Symptomen spontaner Husten, Dyspnoe und Fieber (bis 40oC). Bei diesen Tieren wurde auch eine geringgradige bis mittelgradige Pneumonie bei der Sektion am Ende des Versuches nachgewiesen. Diese Veränderungen erklären die z.T. erhöhten Leukozytenzahlen, die zu Versuchsbeginn festgestellt wurden. Außerdem wurde bei einer Reihe von Versuchstieren aus dem Versuch 1 vor Versuchsbeginn mikroskopisch ein geringgradiger Keimgehalt an Spirochäten (nach 6-tägiger Kultivierung 134 Diskussion auf BSA-Agarplatten) nachgewiesen. Jedoch konnten diese Spirochäten nicht in Reinkultur gebracht und biochemisch differenziert werden. Auch mittels PCR vom Kulturmaterial konnte keine der 5 beim Schwein vorkommenden Brachyspira-Arten identifiziert werden. Aufgrund des Befundes wurde bei diesen Tieren vor Beginn des Versuchs Tiamulin (Tiamutin® Pulver 10 %, Fa. Novartis, München; s. 3.3.2) über das Futter verabreicht, um vor dem Infektionsversuch die Spirochäten zu eliminieren. Eine Nachkontrolle verlief entsprechend negativ. VERSPOHL et al. (2001) berichteten, dass in routinemäßig untersuchten Kotproben 13,6 % der aufgefundenen Spirochäten trotz wiederholter biochemischer Untersuchung bzw. nach mehrmaligen Versuchen der Reinzüchtung nicht näher bestimmt werden konnten. Diese Spirochäten können als kommensale Bakterien in der Normalflora des Intestinaltraktes vorkommen. Da die Spirochäten nicht näher bestimmt werden konnten, kann nicht völlig ausgeschlossen werden, dass die vor Versuchsbeginn vorhandenen Spirochäten zu einer Immunität der Tiere führten, die den nachfolgenden Infektionsversuch beeinflusst hat. Es wird in der Literatur berichtet, dass Schweine, die eine Infektion mit B. hyodysenteriae durchgemacht haben, gegen einen homologen Challenge geschützt sind (JOENS et al. 1979; JOENS et al. 1983). Im Vorversuch wurde bei zwei Tieren der mit Dexamethason behandelten Gruppe, bei einem Tier der Kontrollfutter-Gruppe und bei vier Tieren der „Maisfutter“-Gruppe B. murdochii an einzelnen Untersuchungstagen nach der experimentellen Infektion mit B. hyodysenteriae nachgewiesen. Eine mögliche Erklärung für das Vorkommen von B. murdochii ist, dass diese Bakterien bereits vor Versuchsbeginn latent in einer geringen Anzahl im Dickdarm vorhanden waren und nicht kontinuierlich über den Kot ausgeschieden wurden. Der Nachweis von B. hyodysenteriae und die klinischen Erkrankungen in der Dexamethason-Gruppe weisen jedoch darauf hin, dass zwischen diesen Brachyspiren-Arten keine Kreuzimmunitäten bestanden. Untersuchungen von JACOBSON et al. (2004) bestätigen, dass die Anwesenheit von B. murdochii das Angehen einer experimentellen Infektion mit B. hyodysenteriae nicht beeinflusst. Im Versuch 2 ergab die Allgemeinuntersuchung nach der Ankunft der Schweine keinen Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Die mikrobiologische Untersuchung vor Beginn des Versuchs zeigte jedoch eine Infektion mit hämolysierenden E. coli bei zehn Schweinen. Die Gene für das Shigatoxin Stx2e (Verotoxin) und die Enterotoxine LTI, STI und STII wurden 135 Diskussion bei allen isolierten hämolysierenden E.-coli-Stämmen mittels PCR nachgewiesen. Fünf Schweine entwickelten danach die Symptome der Enterotoxämie wie Ödeme der Augenlider und des Nasenrückens, Fieber bis 40oC und Durchfall mit graubraunem Kot ohne Blutbeimengungen. Nach intramuskulärer Behandlung mit Marbofloxacin (s. 3.3.2) zeigten die erkrankten Tiere keine Symptome mehr, bei der mikrobiologischen Nachkontrolle wurden auch keine hämolysierenden E.-coli-Stämme oder andere darmpathogene Bakterien bei den insgesamt 10 Schweinen isoliert. Aufgrund der antibiotischen Behandlungen vor Versuchsbeginn in Versuch 1 und 2 kann eine Beeinflussung der Darmflora, die ihrerseits einen synergistischen Effekt auf das Angehen der experimentellen Infektion haben kann (s.u.), nicht völlig ausgeschlossen werden (HAENEL 1982; KNOKE u. BERNHARDT 1986). ELDER et al. (1994) erwähnen einen möglichen störenden Einfluss von Medikamenten beim Kulturversuch von Brachyspiren aus Kotproben. Für Versuch 1 kommt hinzu, dass die Behandlung mit Tiamulin durchgeführt wurde, einem Wirkstoff, für den Brachyspiren zumeist sensibel sind. Der Versuchsbeginn wurde deshalb für alle vorbehandelten Tiere auf eine Woche nach Beendigung der Behandlung gelegt, um einen möglichen direkten Einfluss zu minimieren. Eine Kolonisation mit Brachyspiren konnte dann auch bei den mit Tiamulin vorbehandelten Tieren nach der Infektion für alle BrachyspirenArten nachgewiesen werden, jedoch nicht so häufig und mit weniger intensiven klinischen Erscheinungen wie im Vorversuch oder in Versuch 2. - Methode der experimentellen Infektion Eine Standardmethode, die häufig in experimentellen Studien zur SD bei Schweinen verwendet wurde, ist die orale Inokulation mit B.-hyodysenteriae-Kulturmaterial (HAMPSON et al. 1993). Für die eigenen Untersuchungen wurde eine intragastrale Verabreichung per Sonde gewählt, um eine möglichst sichere Applikation ohne Verlust von Keimsuspension zu gewährleisten. Die Versuchstiere wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit 50-100 ml (107-109 KbE/ml) Brachyspiren-Suspension infiziert (HAMPSON et al. 1993; PLUSKE et al. 1996; LINDECRONA et al. 2003). Die Infektion wurde dreimal wiederholt, um sicherzugehen, dass die Zahl der inokulierten Bakterien nicht ein Begrenzungsfaktor war (ACHACHA et al. 1996). 136 Diskussion Eine mangelnde Nahrungsaufnahme der Schweine scheint einen wichtigen Einfluss auf die Manifestation der Infektion zu haben. In vielen erfolgreichen Infektionsversuchen wurden die Schweine natürlichem Stress durch eine Hungerperiode vor der Infektion ausgesetzt (KINYON et al. 1977; MORENG et al. 1980; ZAHN 1989). Nach Meinung anderer Autoren (SIBA et al. 1996; HEINRITZI 2002) kann die Infektionsrate bei experimenteller intragastraler Infektion deutlich erhöht werden, wenn die Tiere sowohl vor als auch nach der Infektion hungern. Die Sekretion von Magensäure sowie der dadurch erniedrigte pH-Wert im Magen bei Einsetzen der Fütterung können zu einer Abtötung von oral aufgenommenen Keimen führen (SAVAGE 1980). Bei nüchternem Magen ist dagegen ein höherer pH-Wert zu erwarten, der das Überleben der Brachyspiren begünstigt. Ein gutes Wachstum zeigen Brachyspiren bei pH-Werten zwischen 5,6 und 8 (TROTT et al. 1996). Es muss jedoch nach Futteraufnahme nicht immer zum Absinken des pH-Wertes im gesamten Magem kommen, wie KAMPHUES (1987) zeigen konnte. Bei schneller Aufnahme größerer Futtermengen nach Nahrungskarenz beschränkt sich der Anteil des Mageninhaltes mit intensiver Durchsäuerung auf Randbezirke inder Fundus- und Drüsenregion. In der eigenen Studie wurde für die Tiere im Vorversuch und im Versuch 1 eine Nahrungskarenz vor der Infektion eingehalten, nach der Infektion wurden die Tiere direkt gefüttert. Um ein Absinken des Magen-pHs durch Fütterung kurz nach Verabreichung der Keimsuspension zu vermeiden, erhielten die Tiere in Versuch 2 nach der Nahrungskarenz vor der Infektion erst 4-6 Stunden nach der Infektion wieder Futter. JACOBSON et al. (2004) stellten dagegen fest, dass ein erhöhter gastrische pH-Wert wenig Einfluss auf das Angehen einer Infektion mit B. hyodysenteriae hatte. Eine Verbesserung der Infektionsrate bei experimenteller Infektion durch Gabe von Antacida, um eine mögliche negative Wirkung der Magensäure einzuschränken, konnte von diesen Autoren nicht erreicht werden. Des Weiteren kann die Aufbereitung des Inokulates den Erfolg der experimentellen Infektion beeinflussen (KINYON et al. 1977; MORENG et al. 1980; ZAHN 1989). Für die verwendeten Brachyspira-Stämme wurden in der eigenen Studie nur 3 Kulturpassagen vorgenommen, um eine verminderte Virulenz durch häufigere Kulturpassagen zu vermeiden (BLAHA et al. 1984, JACOBSON et al. 2004). Die Challenge-Gruppen des Vorversuchs und des Versuchs 1 wurden mittels der Infektionsmethode 1 infiziert. 137 Diskussion Bei der Methode 1 (s. 3.5.2) wurde die Brachyspiren-Suspension durch Resuspendierung der bei 42oC über 3-5 Tage kultivierten Blutagar-Platten mit BHI-Medium vorbereitet (TAYLOR et al. 1980; BAUMANN u. BILKEI 2002) und bei Zimmertemperatur zu den Schweinen transportiert. Ein möglicher Störfaktor dieser Methode besteht darin, dass die Suspensionen bei Zimmertemperatur aerob vorbereitet wurden, für die Herstellung einer Suspension wurden ungefähr 15 Minuten benötigt. Dies könnte sich negativ auf die Vitalität der Brachyspiren ausgewirkt und damit die Infektion beeinträchtigt haben. Jedoch zeigte die Dosiskontrolle (Restsuspension nach erfolgter Infektion) eine Keimkonzentration der Brachyspira-Inokula entsprechend in der Literatur beschriebenen Methoden von 108-109 KbE/ml (BAUMANN u. BILKEI 2002; LINDECRONA et al. 2003; JACOBSON et al. 2004; THOMSEN et al. 2007). Außerdem konnte die Bewegung der Brachyspiren als Vitalitätskontrolle in Nativpräparaten unter dem Phasenkontrastmikroskop nach jeder Verarbeitung bestätigt werden. Diese Kontrollen wurden im Vorversuch jedoch nicht durchgeführt, sondern nur für Versuch 1 und 2. Es lässt sich aber nicht ausschließen, dass die Brachyspiren mittels der Methode 1 zwar noch lebensfähig, jedoch in ihrem Vermögen den Darm zu besiedeln durch den erhöhten Sauerstoffstress beeinflusst waren. Um die Methodik zu optimieren, wurden für den Versuch 2 alle verwendeten BrachyspiraStämme für die Inokulation im Flüssigmedium (Methode 2, s. 3.5.2) kultiviert (PLUSKE et al. 1998; LINDECRONA et al. 2003), womit eine aerobe Bearbeitung entfiel. Anschließend wurde die Suspension auf Eis zu den Tieren transportiert. Die beiden B.-hyodysenteriaeStämme zeigten bei dieser Verarbeitung ein gutes Wachstum und erreichten eine hohe Infektionsdosis von 108-109 KbE/ml, die wiederum den Angaben in der Literatur entspricht (s.o.). WILCOCK und OLANDER (1979) beschrieben, dass für B. hyodysenteriae eine Keimkonzentration von 105-106 KbE/g Mukosa erforderlich ist, um Läsionen zu erzeugen. Mukosa ohne Läsionen enthielt 105 KbE/g oder weniger. Auch JOENS (1997) teilte mit, dass mindestens 106 lebensfähige Spirochäten pro cm2 Dickdarmschleimhaut als effektive Dosis benötigt werden. Die Kolonisationsdichte von Brachyspiren auf der Darmschleimhaut nach der Infektion wurde jedoch in der eigenen Studie nicht geprüft. 138 Diskussion Es ist denkbar, dass die Brachyspiren durch die unterschiedliche Aufbereitung der Infektionsdosis ein unterschiedliches Vermögen bezüglich der Kolonisation oder Pathogenität besaßen. Dieses wurde hier nicht weiter getestet. Um auszuschließen, dass der verwendete B.-hyodysenteriae-Feldstamm eine zu geringe Pathogenität aufweist, wurde in Versuch 2 neben diesem Stamm vergleichend auch der von anderen Arbeitsgruppen genutzte Referenzstamm B 204 verwendet. - Futterration Für Versuch 2 wurde außerdem nochmals der Ansatz gewählt, über die Zusammensetzung des Futters den Verlauf der experimentellen Infektion zu beeinflussen. Zu diesem Zweck wurde eine Ration an die Versuchstiere verfüttert, die 50 % Sojaextraktionsschrot enthielt. Auch der Proteingehalt der Ration kann Einfluss auf die Entstehung einer DysenterieErkrankung nehmen (PLUSKE et al. 2002). Nach ETHERIDGE et al. (1984) kann Futter, das einen erhöhen Gehalt an Proteinen aufweist, sich auf den Schweregrad einer Diarrhoe auswirken. DEWEY (1993) und NEEF et al. (1994) berichteten, dass die Verwendung von Sojaextraktionsschrot und Rationen basierend auf Soja und Mais eine Prädisposition für Durchfall bei Absetzferkeln darstellt. BINDER et al. (1984) berichteten, dass eine primäre ablaufende nutritive Diarrhoe die Ansiedlungschancen von B. hyodysenteriae verbessert bzw. die Vermehrung durch synergistische Interaktionen fördert und somit das klinische Auftreten der SD begünstigt. Sojaextraktionsschrot (SES) ist die wichtigste Eiweißquelle in der intensiven Schweinefütterung. Normalerweise enthalten Sojabohnen daneben auch sowohl lösliche als auch nicht lösliche Kohlenhydrate. Zur Gruppe der löslichen Kohlenhydrate gehören Oligosaccharide wie Raffinose, Stachyose und Verbascose, die wegen fehlender Enzyme nicht im Dünndarm verdaut werden können. Diese Soja-Oligosaccharide gelangen daher intakt in das Kolon, wo sie von Mikroorganismen gespalten werden. Dies verursacht eine Erhöhung des osmotischen Druckes im Dickdarm, der zur osmotischen Diarrhoe führen kann (MAKINDE et al. 1996; LOSAND et al. 2003). 139 Diskussion Nach einer Studie von IRISH und BALNAVE (1993) enthält SES 160 bis 220 g Nicht-StärkePolysaccharide (NSP) je kg Trockensubstanz. Es wird berichtet, dass NSP die mikrobielle Fermentierung und die Produktion von flüchtigen Fettsäuren (VFA) im Dickdarm erhöhen können und dadurch eine klinische SD provoziert wird (SIBA et al. 1996). Eine Studie von JACOBSON et al. (2004) hat ergeben, dass ein hoher Anteil an Sojaextraktionsschrot (50 % der Ration) sowie die Haltung der Schweine in Gruppen die wichtigsten Faktoren waren, die eine klinische Dysenterie nach experimenteller Infektion provozierten. Ursächlich wird die Beeinflussung der Begleitflora (Fusobacterium spp., Clostridium spp., Bacteroides spp.) im Dickdarm sowie wiederum ein hoher Gehalt an NSP im Sojaextraktionsschrot diskutiert, der für eine vermehrte Dickdarmfermentation verantwortlich ist. Daneben vermuten STOKES et al. (1984), dass eine Hypersensibilität durch bestimmte Sojaproteine (Glycinin und ß-Conglycinin) eine Malabsorption und damit Durchfall beim Absetzferkel hervorrufen kann. 5.3 Versuch 2 („Sojafutter“) 5.3.1 Infektion mit B. hyodysenteriae Im Versuch 2 konnte für die experimentelle B.-hyodysenteriae-Infektion ein erfolgreiches Angehen der Infektionen beobachtet werden. Der Erreger konnte bei allen 15 Versuchstieren dieser Gruppe frühzeitig in Kotproben und am Ende des Versuches auch in Dickdarmschleimhautproben (Zäkum und Kolon) wieder reisoliert werden. Die ersten Nachweise gelangen schon am dritten Tag nach der Inokulation, nach einer Woche schieden alle Schweine den Erreger mit dem Kot aus. Im Gegensatz zum Vorversuch und Versuch 1 wurde bei allen 15 B.-hyodysenteriaeinfizierten Tieren von Versuch 2 eine hochgradige muko-hämorrhagische Diarrhoe festgestellt. Die Inkubationszeit war mit 1-13 Tagen deutlich kürzer und die Krankheitssymptomatik fiel bei dieser Gruppe wesentlich stärker aus. Die Durchfalltiere zeigten außerdem ein deutlich gestörtes Allgemeinbefinden mit Fieber zwischen 40,0 und 40,7oC. Bei zwei Durchfalltieren lag die Köpertemperatur an elf Tagen über 40,0oC. Über 140 Diskussion fieberhaft verlaufende SD-Erkrankungen wurde auch von anderen Autoren berichtet (HARLIZIUS 1993; ALEXANDER 1996; SOMCHIT et al. 2003). Weiterhin wiesen die Durchfalltiere einen Körpermasseverlust von 1-4 kg während der Durchfallsdauer auf. Im Vergleich mit den vorausgegangenen Versuchen waren in dieser Gruppe keine Zunahmen, sondern ein durchschnittlicher Körpermasseverlust von 0,4 kg pro Tier und Tag zu verzeichnen. Dabei ist zu beachten, dass eine Reihe von Tieren aufgrund der hochgradigen Symptomatik schon vorzeitig für die Sektion getötet wurde. Die Entwicklung einer Dysenterie ist häufig mit schweren Gewichtsverlusten verbunden, die vermutlich einerseits durch Appetitlosigkeit und andererseits durch einen geänderten Metabolismus aufgrund der intestinalen Störung verursacht werden (SOMCHIT et al. 2003). Für B. hyodysenteriae wurde zunächst an 10 Tieren der Referenzstamm B 204 geprüft, danach wurde der zuvor verwendete eigene Feldstamm 7304/03 eingesetzt. Mit beiden Stämmen wurde ein sich entsprechendes klinisches Bild erzeugt. Damit konnte gezeigt werden, dass sowohl der Feldstamm als auch der Referenzstamm eine ausreichende Pathogenität besaßen. Die klinischen Erscheinungen bei der B.-hyodysenteriae-Gruppe in Versuch 2 entsprechen insgesamt den in der Literatur beschriebenen Symptomen der SD (AMTSBERG u. MERKT 1986; BAUMANN u. BILKEI 2002; LINDECRONA et al. 2003; JACOBSON et al. 2004; THOMSEN et al. 2007). Vergleicht man das pathomorphologische Bild der B.-hyodysenteriae-infizierten Tiere in Vorversuch und Versuch 1 (Dexamethason + Kontrollfutter) mit Versuch 2 („Sojafutter“), ist erkennbar, dass unter den Bedingungen des Versuchs 2 die ausgeprägtesten makroskopischen Veränderungen entstanden (Gesamtscore 8,8 ± 1,21 (Versuch 2) vs. 4,8 ± 0,16 (Vorversuch) und 1,3 ± 1,6 (Versuch 1; Tab. 22). In Abb. 20 ist vergleichend der Score für die histologischen Läsionen, die im Vorversuch bzw. im Versuch 2 beobachtet wurden, dargestellt. Für typische SD-Alterationen wie Mukosaverdickung, Schleimhautulzeration und Pseudomembranbildung fiel der Score in Versuch 2 dabei signifikant höher aus (p<0,05 bis p<0,001), bei den anderen Parametern zeigten sich gleichwertige Veränderungen für Versuch 2 und Vorversuch. Die Ergebnisse der B.-hyodysenteriae-Infektion in Versuch 2 ließen erkennen, dass unter den gegebenen Bedingungen im Vergleich zur Dexamethason-Behandlung bei Kontrollfuttergabe (Versuch 1) eine regelmäßige Besiedlung des Dickdarmes bei den Tieren stattfand und dabei 141 Diskussion ebenso regelmäßig eine SD-typische klinische Erkrankung erzeugt werden konnte. Damit waren die angestrebten Voraussetzungen gegeben, um die schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten bezüglich ihrer Pathogenität zu testen. Es kann angenommen werden, dass die geänderten Versuchsparameter im Versuch 2 für die optimale Versuchsergebnisse im Vergleich zu Versuch 1 verantwortlich sind. Es ist schwierig zu beurteilen, welche der geänderten Versuchsbedingungen letztlich dazu beigetragen haben, da die Bedingungen nicht im Einzelversuch getestet wurden. - Methode 2 kann als effektive Aufbereitung der Brachyspira-Infektionssuspension, aufgrund der hohen Reisolierungsrate nach der Infektion angesehen werden. Im Versuch 2 zeigten die Brachyspiren bei der Dosis- und Vitalitätskontrolle vor und nach der Infektion eine optimale Beweglichkeit in der Suspension. - Die zusätzliche Fütterung von Sojaextraktionsschrot 4 Tage vor und 3 Tage nach Versuchsbeginn und die damit verbundene Veränderung von Darmmilieu und Darmflora erscheint als sehr wichtiger Einflussfaktor, den auch andere Autoren für die experimentelle Infektion erfolgreich nutzten (JACOBSON et al. 2004). - Die geänderten Haltungsbedingungen (strohlose Haltung, Nüchterung vor und nach Infektion) können ebenfalls als positive Einflussfaktoren für eine erfolreiche experimentelle Infektion angesehen werden, wie im vorhergehendne Kapitel diskutiert. Allerdings konnten auch unter den Haltungsbedingungen im Vorversuch eine Besiedlung des Darms mit B. hyodysenteriae sowie eine klinische Durchfallerkrankung beobachtet werden. - Die antibiotische Vorbehandlung der Schweine dürfte nur einen geringen Einfluss gehabt haben, da nicht alle Tiere vorbehandelt wurden und da eine ausreichende Wartezeit bis zum Einsetzen des Versuches eingehalten wurde. Andere Bakterien sowie L. intracellularis, hämolysierende E. coli und Salmonella spp., die ein ähnliches Krankheitsbild wie SD verursachen (BAUMANN u. BILKEI 2002), wurden in dieser Studie bei keinem der Versuchstiere nachgewiesen. Auf eine mögliche Infektion mit porzinem Circovirus Typ 2 (PCV2), das ein potenzieller Co-Faktor für die Entstehung einer klinischen SD sein könnte (WEISSENBÖCK et al. 2005; JENSEN u. BOYE 2005), wurde im Rahmen der Arbeit nicht untersucht. Das Vorhandensein von Balantidium coli in der Dickdarmschleimhaut war häufig bei den mit B. hyodysenteriae infizierten Durchfalltieren, aber auch bei den mit schwach hämolysierenden 142 Diskussion Brachyspiren infizierten Gruppen zu beobachten. Diese Protozoen werden im Allgemeinen als nicht pathogen bzw. als wahrscheinlich sekundäre Besiedler der Kolon-Läsionen bei Schweinen betrachtet (FERGUSON et al. 1980; HAMPSON et al. 1997; HAMPSON u. TROTT 1999). 5.3.2 Pathogenität der geprüften schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten Die Auswahl der Stämme für die experimentellen Infektionen erfolgte aus diagnostischem Material von Betrieben mit vorberichtlicher Durchfallproblematik, das zur mikrobiologischen Untersuchung an das Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule gesandt wurde. Es kamen Stämme zum Einsatz, für die eine Monoinfektion im Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden konnte, weitere pathogene Darmbakterien (L. intracellularis, Salmonella spp. oder hämolysierende E. coli) wurden dabei nicht gefunden. Dies schließt jedoch nicht aus, dass eventuell trotzdem andere Darmpathogene an dem Geschehen im Bestand beteiligt gewesen sein können. Außerdem wurde ein B.-murdochii-Stamm geprüft, der auch schon von einer dänischen Arbeitsgruppe eingesetzt wurde und zu einer katarrhalischen Kolitis sowie mildem Durchfall führte (JENSEN et al. 2005). Die Ergebnisse zu den schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten aus Versuch 1 können nur unter dem Vorbehalt interpretiert werden, dass die gewünschten Versuchsvoraussetzungen für das regelmäßige Auftreten von klinischen Erscheinungen bei der B.-hyodysenteriae-Infektion nicht gegeben waren. So lagen die Nachweisraten für die 3 geprüften Brachyspira-Arten (B. innocens, B. intermedia, B. murdochii) in Versuch 1 deutlich niedriger als in Versuch 2. Die Reisolierungsrate in Versuch 1 lag zwischen 20 und 70 % (B. intermedia 1 von 5, B. murdochii 6 von 10 und B. innocens 7 von 10 Tieren), während in Versuch 2 eine Rate von 75-100 % erreicht werden konnte (B. murdochii 18 von 24, B. intermedia 9 von 10 und B. innocens 15 von 15 Tieren). Bei Tieren der mit den schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten infizierten Gruppen gelang der Nachweis häufiger aus den Kolonabschnitten als aus den Zäkum. Diese Ergebnisse wurden erzielt, obwohl das Wachstum für einige Stämme von B. innocens und B. murdochii in der Flüssigkultur (Methode 2) schwächer war und deshalb z.T. nur eine geringere Infektionsdosis zur 143 Diskussion Verfügung stand (Tab. 6). Die Infektionsdosis für die B.-innocens-Stämme variierte deswegen im Bereich von 105-108 KbE/ml, hier konnte jedoch bei allen Tieren eine Besiedlung des Darms nachgewiesen werden. Bei den B.-murdochii-Stämmen lag die Dosis ebenfalls zwischen 105-108 KbE/ml, jedoch gelang gerade bei der niedrigen Dosierung bei allen Tieren eine Reisolierung der Keime. Dosierungen unter 108 KbE/ml wurden auch laut Angaben in der Literatur mit Erfolg verwendet. JENSEN et al. (2005) demonstrierten die Kolonisation und Vermehrung von B. murdochii im Dickdarm bei allen Versuchstieren nach einer Infektion mit der Dosis von 106 KbE/ml. Ein Einfluss der Keimdosis auf den klinischen Verlauf der Infektionen in der eigenen Studie kann trotzdem nicht völlig ausgeschlossen werden. Auch konnte in Versuch 2 eine Erregerausscheidung im Kot in der Regel früher festgestellt werden als im Versuch 1 (Abb. 4 u. 5) entsprechend der Ergebnisse bei der B.-hyodysenteriae-Infektion. Störungen des Allgemeinbefindens traten bei den Versuchstieren unabhängig von der Brachyspiren-Art weder in Versuch 1 noch in Versuch 2 auf. Lediglich waren in Versuch 1 bei einzelnen Tieren, von denen B. innocens oder B. murdochii reisoliert werden konnte, kurzzeitig leichte Kotkonsistenzveränderungen auffällig (zumeist dickbreiig, selten dünnbreiig). Ebenso war in Versuch 2 bei der B.-innocens- und B.-murdochii-Gruppe im Einzelfällen kurzzeitig eine dickbreiige Kotkonsistenz zu beobachten. In keinem Fall wurden dünnflüssiger Kot oder Mukus- bzw. Blutbeimengungen gesehen. Allerdings ergab sich für die B.-innocens-Gruppe in Versuch 2 etwas geringere mittlere Tageszunahmen im Vergleich zur Negativkontrollgruppe und den beiden anderen Versuchsgruppen. Pathomorphologisch lag bei allen Tieren, die mit schwach hämolysierenden Stämmen von B. innocens, B. murdochii oder B. intermedia infiziert wurden (Versuch 1 und 2), maximal eine leichte Hyperämie vor, weitere makroskopische Veränderungen konnten nicht beobachtet werden. Bei der histologischen Untersuchung waren für die Infektion mit B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Versuch 1 nur sehr moderate Veränderungen in Form einer geringgradigen, lymphohistiozytären Enteritis mit Kryptdilatation, Kryptabzsessen sowie Hyperämie der Lamina propria mucosa erkennbar (Abb. 22), die sich nicht signifikant in ihrem Schweregrad von den Befunden bei den Negativkontrolltieren unterschieden (Abb. 14). Im Versuch 2 waren ähnliche Befunde auszumachen, wobei die Veränderungen bei Tieren aus 144 Diskussion der B.-murdochii-Gruppe im Vergleich zu Versuch 1 durchschnittlich etwas häufiger zu diagnostizieren waren. Abweichend davon traten bei einzelnen Tieren der B.-innocens(n=3, Stämme 1569/05, 3407/05) und B. murdochii-Gruppe (n=8, Stämme: 5139/04, 3626/05, 7185/05, DK S11287) auch histologische Veränderungen an sehr vereinzelten Lokalisationen in Form milder oberflächlicher Schleimhautulzerationen und/oder geringgradiger Fibrinauflagerungen (mittlere Werte für den Bewertungsscore 0,2-0,8), bei drei Tieren (B. murdochii, Stämme: 7185/05, DK S11287) auch zusätzlich eine lokale Becherzellhyperplasie), entweder im Bereich der Ileozäkalklappe oder vom Kolon, auf (Abb. 21). B. innocens, B. murdochii und B. intermedia werden üblicherweise sowohl bei gesunden als auch bei an Durchfall erkrankten Schweinen isoliert (HUDSON et al. 1976; BINEK u. SZYNKIEWICZ 1984; FELLSTRÖM u. GUNARSSON 1995; STANTON et al. 1997; JENSEN u. BOYE 2005; ROTHKAMP et al. 2005; WENDT et al. 2006). Während mit B. intermedia beim Schwein experimentell bislang kein Durchfall produzierbar war (HUDSON et al. 1976; NEEF et al. 1994), wurde die mögliche Pathogenität von B. innocens und B. murdochii beim Schwein jedoch bislang noch kontrovers diskutiert. ANDREWS und HOFFMAN (1982) vermuteten, dass schwach pathogene Brachyspiren unfähig sind, typische Symptome der Schweinedysenterie zu produzieren, aber den Dickdarm besiedeln und eine milde Erkrankung bei den Schweinen verursachen können Einer Arbeitsgruppe gelang es, mittels experimenteller Infektion von gnotobiotischen Ferkeln mit 3 von 5 B.-innocens-Feldisolaten (aus Herden mit unspezifischer Diarrhoe und Typhlocolitis) nach Vorinfektion mit Bacteroides vulgatus Durchfall mit Schleim- und Blutbeimengungen zu erzeugen. Zwei der B.-innocens-Stämme wurden an konventionell gehaltenen Schweinen getestet, aber ohne dass Veränderungen auftraten (LYSONS et al. 1992; NEEF et al. 1994). Des Weiteren stellten JENSEN und BOYE (2005) Untersuchungen zur Ätiologie von Colitis bei 140 Schweinen aus Problembetrieben an. Durch eine In-situHybridisierung konnten sie in 11 Fällen Infektionen mit B. innocens demonstrieren, eine Monoinfektion mit Invasion der Erreger in Krypt- und Oberflächenepithelien des Kolons konnte dabei in 2 Fällen nachgewiesen werden. JENSEN et al. (2005) berichten über eine experimentelle Infektion des Dickdarms von Schweinen mit B. murdochii. Der Erreger wurde 6 Tage p. inf. erstmalig wieder mit dem Kot 145 Diskussion ausgeschieden, die Ausscheidung hielt bis zum Tag 25 p. inf. an. 3 von 8 Tieren zeigten kurzzeitig leichten Durchfall. Bei zwei von 8 experimentell infizierten Schweinen wurde eine geringgradige multifokale, katarrhalische Kolitis mit eine milden Krypthyperplasie ohne Vermehrung von Becherzellen in der Dickdarmschleimhaut diagnostiziert. In diesen Fällen wurde B. murdochii sowohl in den Krypten als auch innerhalb der oberflächlichen Epithelzellen aufgefunden. Diese Ergebnisse führten die Autoren zu dem Schluss, dass B. murdochii die Dickdarmmukosa von Schweinen besiedeln und eine katarrhalische Kolitis hervorrufen kann. Im Rahmen der eigenen Arbeit wurde ein Infektionsversuch an 5 Schweinen mit dem von JENSEN et al. (2005) verwendeten dänischen B.-murdochii-Stamm (S11287) durchgeführt (s.o.). Dabei konnten keine klinischen Durchfallerscheinungen über den gesamten Versuchszeitraum beobachtet werden. Bei der mikroskopischen Beurteilung wurde aber bei 2 Tieren fokal eine milde erosive Kolitis nachgewiesen. Weiterhin war bei sechs Versuchstieren, die mit den B.-murdochii-Feldstämmen 7185/04 (n=2), 5139/04 (n=3) und 3626/05 (n=1) infiziert wurden, fokal auch eine milde katarrhalische Kolitis nachzuweisen. Die eigenen Ergebnisse erlauben den Schluss, dass die geprüften Stämme der schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten eine Besiedlung der Dickdarmschleimhaut nach Infektion hervorrufen können und im Kot ausgeschieden werden, aber keine klinische Durchfallerkrankung hervorrufen. Im Dickdarm konnten im Einzelfall geringgradige histologische Veränderungen im Sinne einer Kolitis nachgewiesen werden, die aber nicht den Veränderungen einer B.-hyodysenteriae-Infektion entsprachen. Eine allgemeine Aussage zur Pathogenität von B. innocens, B. murdochii und B. intermedia ist jedoch noch nicht abschließend möglich. 5.4 Veränderungen der hämatologischen Parameter und Nierenfunktionsparameter Ziel der Bestimmung der Blut- und Harnparameter war es, mögliche Veränderungen hinsichtlich der hämatologischen und Nierenfunktions-Parameter im Zusammenhang mit klinischen Befunden und pathologischen Veränderungen bei den Versuchstieren nach der experimentellen Infektion mit verschiedenen Brachyspira-Arten nachweisen. WALDMANN 146 Diskussion (1994) beschrieb Nierenfunktionsstörungen bei Durchfallerkrankungen für Infektionen mit TGE-Virus, Clostridium perfringens Typ C, E. coli und B. hyodysenteriae. 5.4.1 Hämatologische Parameter Im Vorversuch ergab die Analyse der hämatologischen Parameter hinsichtlich der Durchfalltiere der Dexamethason-Gruppe Hämokonzentration (leichter Anstieg einen tendenziellen Hinweis des Hämatokrit-Wertes für eine (Htk), der Hämoglobinkonzentration (Hb) und der Erythrozyten-Konzentration (Tab. 26). Diese Veränderungen waren aber statistisch nicht signifikant. Dagegen wiesen die übrigen Versuchsgruppen keine Abweichungen hinsichtlich des roten Blutbildes auf, bei der NegativKontrollgruppe bestand eher die Tendenz zu einer leichten Anämie. Im Versuch 1 konnten weder bei der B.-hyodysenteriae- noch den anderen Versuchsgruppen oder der Negativ-Kontrollgruppe Abweichungen im Bereich des roten Blutbildes beobachtet werden. Lediglich bei wenigen Einzeltieren aller Gruppen zeigten sich Hinweise für eine geringgradige Anämie. Eine Hämokonzentration, die im Vorversuch bei Durchfalltieren tendenziell sichtbar war, konnte in Versuch 2 anhand z. T. signifikanter Veränderungen am roten Blutbild (Hb, Erythrozyten, tendenziell HTK) bei den Durchfalltieren der B.-hyodysenteriae-infizierten Gruppe belegt werden. Die Hämokonzentration ist im direkten Zusammenhang mit dem hochgradigen Durchfall zu sehen, der aufgrund der Flüssigkeitsverluste zu einer Dehydratation führte, die auch von anderen Autoren für die Dysenterie beschrieben wurde (SEEGER et al. 1984; ARGENZIO 1985; LINDEMANN 1990; WALDMANN 1994). Da der Grad des Durchfalls im Vorversuch bei der mit Dexamethason behandelten Gruppe schwächer war, können Blutverluste über den Darm durch die zeitweise hämorrhagische Diarrhoe diese Hämokonzentration hier überdeckt haben. Das Zusammenspiel von durchfallbedingtem Flüssigkeits- und Elektrolytverlust einerseits und Blutverlust andererseits kann je nach Krankheitsverlauf den Htk- und Hb-Wert unterschiedlich beeinflussen (LINDEMANN 1990). Hinsichtlich des weißen Blutbildes fiel bei der Dexamethason-Gruppe im Vorversuch am Versuchsende eine signifikante Erhöhung der Leukozytenzahl (p<0,05) auf, ein Befund, der 147 Diskussion ebenfalls bei der mit B. hyodysenteriae infizierten Gruppe in Versuch 2 sehr deutlich war (p<0,01) und somit in Verbindung mit der Infektion gesehen werden muss. Auch bei der Untersuchung von JACOBSON et al. (2004) konnten ähnliche Ergebnisse erfasst werden. Bei der Kontrollfutter-Gruppe und der Negativ-Kontrollgruppe des Vorversuches sowie bei fast allen Gruppen in Versuch 1 (außer der B.-intermedia-Gruppe) war zunächst eine leichte Leukozytose zu Versuchsbeginn auffällig, die Leukozytenzahl sank aber zum Ende des Versuchs in allen Gruppe wieder in den Normalbereich ab. Ein ähnliches Bild ergab sich für die mit schwach hämolysierenden Brachyspiren infizierten Gruppen sowie die NegativKontrollgruppe des Versuchs 2. Für die Leukozytose zu Versuchsbeginn können zum einen andere Infektionen (Pneumonien, Enterotoxämie) verantwortlich gewesen sein, die bei einer Reihe von Tieren zu diesem Zeitpunkt klinisch sichtbar waren. Zum anderen können diese Veränderungen bei entsprechenden Gruppen mit der Dexamethason-Behandlung (drei Tage vor der Infektion bis elf Tage danach) erklärt werden, da die Gabe von Dexamethason die zirkulierende Menge von Granulozyten erhöht (MINTON u. BLECHA 1991; FLAMING et al. 1994; SCHULD et al. 2001). 5.4.2 Nierenfunktionsparameter Bei den im Vorversuch mit Dexamethason behandelten Schweinen konnten nach der Infektion mit B. hyodysenteriae Störungen der Nierenfunktion anhand eines signifikanten Anstiegs des Plasma-Kreatinins (p<0,01) und einer verminderten Kreatinin-Clearance (glomeruläre Filtrationsrate (GFR), p<0,001) diagnostiziert werden. Der mittlere Harnstoffwert bei dieser Gruppe lag noch im Normalbereich, aber deutlich höher (p<0,05) als vor der Infektion (Tab. 27). Dagegen blieben diese Parameter bei den anderen 3 Gruppen des Vorversuchs im Mittel unverändert. Gleichzeitig fiel bei der Dexamethason-Gruppe eine signifikant niedrigere fraktionelle Wasserexkretion am Versuchsende (p<0,05) im Vergleich zu den Negativ-Kontrolltieren auf, die jedoch im Bereich der physiologischen Norm lag, während bei der „Maisfutter“- und Kontrollgruppe eine geringfügig erhöhte FE-Wasser zu sehen war. Auch bei der B.-innocens- 148 Diskussion Gruppe in Versuch 1 (Dexamethason) lag zu Anfang des Versuchs eine erhöhte FE-Wasser vor. Bei der Bestimmung der Nierenfunktionsparameter in Versuch 1 konnten erwartungsgemäß aufgrund der nur geringen oder nicht vorhandenen klinischen Erkrankung bei keiner Gruppe Veränderungen hinsichtlich der Plasma-Kreatinin-Konzentration und der GFR sowie der Plasma-Harnstoff-Werte nach der Infektion nachgewiesen werden. Ein leichter Abfall der Kreatinin-Clearance nach der Infektion war lediglich bei einem einzelnen B.-hyodysenteriaeinfizierten Tier zu beobachten. Dieses Tier zeigte aber keine klinischen Erscheinung bzw. pathologischen Befunde. Im Versuch 2 konnte bei den mit B. hyodysenteriae infizierten Tieren analog zu der Dexamethason-Gruppe im Vorversuch eine Erhöhung des Plasma-Kreatinins (p<0,01) zum Versuchsende festgestellt werden, wobei jedoch ein Tier mit einem Extremwert von 638 µmol/l auffiel. Die durchschnittliche glomeruläre Filtrationsrate (GFR) blieb unverändert, ging jedoch bei sechs Tieren mit einer verminderten Kreatinin-Clearence einher, wobei das oben genannte Tier parallel zum erhöhten Pl-Kreatinin einen sehr stark erniedrigten GFRWert (0,3 ml/min/kg) hatte (Tab. 31). Die Plasma-Hanstoff-Werte blieben im Mittel unverändert, wobei lediglich wieder bei dem o.g. Einzeltier ein starker Anstieg (23,1 mmol/l) zu verzeichnen war. Keine Abweichungen waren bei den Plasma-Kreatinin-Werten und der Kreatinin-Clearance der übrigen Gruppen (ohne klinische Erkrankung) nachweisbar, nur ein Tier aus der B.-murdochii-Gruppe hatte eine herabgesetzte GFR (1,13 ml/min/kg). Zum Zeitpunkt vor der Infektion lagen jedoch erhöhte Plasma-Harnstoff-Werte bei diesen Gruppen inklusive der Negativ-Kontrollgruppe vor, deren Ursache unklar blieb. Es könnte ein Zusammenhang mit der Nahrungskarenz bestehen (s. Kapitel 3.5.4), jedoch bestand kein erhöhter Wert bei der B.-hyodysenteriae-Gruppe. Insgesamt muss von einer geringgradigen, im Einzelfall auch hochgradigen Filtrationsstörung bei klinisch an SD erkrankten Schweinen ausgegangen werden. Diese Ergebnisse entsprechen den Studien von LINDEMANN (1990) und WALDMANN (1994), die auch entsprechende Nierenfunktionsstörungen bei der Dysenterie fanden. Sie erklären die glomerulären Filtrationsstörungen als Resultat der durch den Durchfall bedingten Dehydratation, die eine herabgesetzte renale Perfusion nach sich zieht. Im Gegensatz zu der eigenen Studie konnten 149 Diskussion WALDMANN und LINDEMANN (1991) auch eine erhöhte fraktionelle Wasserausscheidung bei den Dysenterie-kranken Schweinen darstellen. Die erhöhte fraktionelle Wasserexkretion bei der „Maisfutter“- und Kontrollgruppe im Vorversuch sowie der B.-innocens-Gruppe in Versuch 1 war nicht im Zusammenhang mit klinischen und pathologischen Krankheitssymptomen zu sehen (Tab. 27, 29). Bei Beurteilung des Elektrolythaushaltes fiel zunächst auf, dass häufig schon bei Versuchsbeginn, fast immer aber bei Versuchsende bei den meisten Gruppen aller Versuche eine Hyperkaliämie vorlag. Die fraktionelle Exkretion wies keine Auffälligkeiten auf. Bei verschiedenen Durchfallerkrankungen wie auch der Dysenterie kann es zur Hyperkaliämie kommen (WALDMANN 1994). Die Hyperkaliämie kann hauptsächlich auf zwei Ursachen zurückgeführt werden. Einerseits ist die Ausscheidung über die Nieren nicht ausreichend, ein zweiter Grund ist die Verschiebung des Kaliums aus dem Intrazellular- in den Extrazellularraum. Bei schweren Durchfällen führt die Dehydratation zu einer metabolischen Azidose, die wiederum mit einem erhöhten Austausch von extrazellulärem Wasserstoff und intrazellulärem Kalium einhergeht. Die mit Hyperkaliämie verbundene Dehydratation und die metabolische Azidose sind die wichtigsten Todesursachen bei Durchfallschweinen (AGENZIO 1984; SCHARRER 1986). Da jedoch die Hyperkaliämie nicht nur bei den Durchfalltieren auftrat, sondern bei fast allen Gruppen einschließlich der Negativ-Kontrollgruppen, z.T. auch schon vor Versuchsbeginn, muss außerdem ursächlich an eine Entnahme bedingte Hämolyse gedacht werden, die aber makroskopisch an den Proben nicht nachvollzogen werden konnte. Die Plasma-Natrium-Konzentrationen sowie die FE-Natrium blieben sowohl im Vorversuch als auch im Versuch 1 bei allen Gruppen unauffällig. Dagegen entwickelte sich im Versuch 2 bei der B.-hyodysenteriae-Gruppe eine deutliche Hyponatriämie (p<0,001), ohne dass die FENatrium verändert war. Die erniedrigte Na-Konzentration zeigte auch eine signifikante Differenz zu den übrigen Gruppen. Eine Hyponatriämie beschreibt auch WALDMANN (1994) bei seinen Untersuchungen für die Dysenterie und besonders für die E.-coli-Diarrhoe. Da dabei ebenfalls die FE-Natrium eine ungestörte tubuläre Funktion anzeigte, ist davon auszugehen, dass es sich um enterale Natrium-Verluste aufgrund des Durchfallgeschehens handelt. 150 Diskussion Bezüglich des Mineralstoffhaushaltes waren in allen Versuchen keine oder nur geringgradige Verschiebungen ersichtlich, die sich im Referenzbereich abspielten. Wie bei WALDMANN (1994) lagen keine Hinweise für stärkere Veränderungen bei den an Durchfall erkrankten Tieren vor. Von einigen Wirkungen der Kortikosteroide auf den Wasser- und Elektrolythaushalt muss angenommen werden, dass sie über den Glukokortikoidrezeptor vermittelt werden. Unter Kortisol ist die glomeruläre Filtration gesteigert, und die renale Ausscheidung von Wasser über Vasopressinabhängige und –unabhängige Mechanismen wird erhöht. Glukokortikoide hemmen auch die Resorption von Kalzium über die Nieren. Diese Mechanismen sowie die erhöhte Phosphat-Clearance bewirken eine vermehrte Kalzium- und Phosphatausscheidung und fördern die Entwicklung einer Osteoporose. Die hypokalzämische Wirkung wird beim Gesunden kompensiert, kann aber therapeutisch bei Hyperkalzämien genutzt werden (OETTEL 1996; KNEPEL 2005). 151 Diskussion 5.5 Schlussfolgerungen Bei der Evaluation des Modells zur experimentellen B.-hyodysenteriae-Infektion konnte festgestellt werden, dass die Erzeugung einer klinischen Symptomatik mit DexamethasonGaben zur Immunsuppression nur eingeschränkt gelang (Vorversuch, Versuch 1). Ein erhöhter Gehalt an grob geschrotetem Mais und Weizenkleie in der Ration zeigte keinen Einfluss auf die Provokation einer klinischen Dysenterie-Erkrankung. Sehr gute Ergebnisse wurden dagegen in Versuch 2 erzielt (100 % Reisolierung bei hochgradiger klinischer Durchfallsymptomatik, kurze Inkubationszeit). Nach den vorliegenden Untersuchungen kann vermutet werden, dass der erhöhte Anteil von Sojaextraktionsschrot (50 % der Ration) einen wesentlichen Einfluss auf die Entstehung einer klinisch apparenten Durchfallerkrankung hat. Als mögliche Ursachen werden die Beeinflussung der Begleitflora und des pH-Wertes im Dickdarm sowie eine vermehrte Dickdarmfermentation durch einen hohen Gehalt an NSP im Sojaextraktionsschrot diskutiert. Die im Sojaextraktionsschrot enthaltenen Oligosaccharide sowie der hohe Proteingehalt können ebenfalls als Hilfsfaktoren angesehen werden. Als weitere potenzielle Einflussfaktoren müssen die Haltungsbedingungen (strohlos, infrequente Buchtenreinigung), die Nahrungskarenz vor und nach Infektion, die Kultivierungsmethode für die Brachyspiren (Flüssigmedium) sowie eine antibiotische Vorbehandlung vor Versuchsbeginn berücksichtigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 5 B.-innocens-Stämme, 5 B.-murdochii-Stämme und 2 B.-intermedia-Stämme auf mögliche ihre Pathogenität getestet, diese Stämme wurden in mittel- bis hochgradigem Keimgehalt aus Diagnostikproben aus Betrieben mit Durchfallproblematik isoliert, ohne dass weitere pathogene Darmbakterien nachgewiesen werden konnten. Eine Beteiligung weiterer darmpathogener Erreger kann jedoch nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Da die Erzeugung einer klinischen Erkrankung nach B.-hyodysenteriae-Infektion als Voraussetzung für das Infektionsmodell galt, um die Pathogenität der verwendeten schwach hämolysierenden Brachyspira-Stämme beurteilen zu können, sind die diesbezüglichen Resultate aus dem Versuch 1 im Gegensatz zu Versuch 2 nur sehr vorsichtig zu interpretieren. 152 Diskussion Eine Besiedlung der Dickdarmschleimhaut konnte für alle 3 schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten nachgewiesen, jedoch keine klinische Durchfallerkrankung erzeugt werden. Auch histologisch zeigten die Versuchsschweine nur geringgradige Veränderungen am Darm, ähnlich der Kontrollgruppe. Nur bei einzelnen Tieren (B. innocens n=3, B. murdochii n=8) konnten darüber hinaus an vereinzelten Lokalisationen Anzeichen einer Colitis mit geringgradiger Schleimhautulzeration, Fibrinauflagerung und, nur bei B. murdochii, mit geringgradiger Becherzellhyperplasie nachgewiesen werden. Eine allgemeine Aussage zur Pathogenität der schwach ß-hämolysierenden Brachyspiren-Arten B. innocens, B. murdochii und B. intermedia ist deshalb aufgrund der vorliegenden Untersuchungen noch nicht abschließend möglich. 153 Zusammenfassung 6. ZUSAMMENFASSUNG Tuyet Le Nguyen Thi: Experimentelle Untersuchungen zur Pathogenität von Brachyspira innocens, Brachyspira. murdochii und Brachyspira intermedia im Vergleich zur Brachyspirahyodysenteriae-Infektion Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, ein Infektionsmodell für die experimentelle Infektion mit Brachyspira (B.) hyodysenteriae zu etablieren und damit die Pathogenität von Stämmen der 3 Brachyspira-Arten B. innocens, B. murdochii und B. intermedia im Vergleich zur B.-hyodysenteriae-Infektion bei Schweinen zu überprüfen. Zuerst wurde in einem Vorversuch die Bedeutung der Futterzusammensetzung und einer Immunsuppression für die Provokation einer klinischen Erkrankung nach einer experimentellen B.-hyodysenteriae-Infektion eruiert. Die Versuchstiere wurden randomisiert in 4 Gruppen zu jeweils 5 Läuferschweinen (durchschnittliche Körpermasse 19,7 kg) aufgeteilt. Neben der Challenge-Kontrollgruppe und der Negativ-Kontrollgruppe, die beide nur Kontrollfutter (Gerste, Sojaextraktionsschrot, Mineralstoffe) erhielten, wurde einer weiteren Gruppe Futter mit einem zusätzlichen Anteil an Maisschrot und Weizenkleie beginnend 2 Tage vor der Infektion bis zum Versuchsende verabreicht. Darüber hinaus bekam eine vierte Gruppe neben dem Kontrollfutter Dexamethason (0,4 mg/kg KGW/Tag) i.m. über 14 Tage (beginnend 3 Tage vor der Infektion) zur Immunsuppression verabreicht. Für die Infektion erhielten alle Versuchstiere an 3 aufeinanderfolgenden Tagen intragastral 50 ml einer B.-hyodysenteriaeSuspension (108-109 KbE/ml, Feldstamm 7304/03), nachdem die Tiere über mindestens 18 Stunden kein Futter erhalten hatten. Ein Nachweis des Erregers in Kot- und Darmproben sowie eine klinische Durchfallerkrankung waren nur bei den mit Dexamethason behandelten Tieren zu beobachten. Vier von fünf Schweinen dieser Gruppe entwickelten einen muko-hämorrhagischen Durchfall nach 16-25 Tagen p. inf. Diese Schweine zeigten für eine SD typische makro- und mikroskopische Läsionen der Dickdarmschleimhaut im Sinne einer fibrinös-nekrotisierenden Typhlocolitis. Darüber hinaus war eine geringe durchschnittliche Körpermassezunahme von 0,24 ± 0,17 kg/Tag und ein hoher Futteraufwand von 5,08 kg je kg Zuwachs in dieser Gruppe 154 Zusammenfassung zu beobachten. Die Untersuchungsparameter bei den übrigen Versuchsgruppen unterschieden sich nicht von der Negativ-Kontrollgruppe. Aufgrund der Ergebnisse im Vorversuch wurde die Dexamethason-Behandlung als eine Möglichkeit zur Auslösung des klinischen Bildes der Dysenterie bei allen Versuchsgruppen des Versuchs 1 in Kombination mit der experimentellen Infektion durchgeführt. Für Versuch 1 wurden 44 Läuferschweine mit einer durchschnittlichen Körpermasse von 16,5 kg in 5 Gruppen analog dem Vorversuch aufgestallt. In diesem Versuch wurden die Ergebnisse der Versuchsgruppen (Infektion mit den schwach hämolysierenden Brachyspiren-Arten B. innocens n=10, B. murdochii n=10 und B. intermedia n=5) mit der Positiv-Kontrollgruppe (n=11; Infektion mit B.-hyodysenteriae-Feldstamm 7304/03) und einer Negativkontrollgruppe (n=8; nicht infiziert) verglichen. Inklusive der Negativ-Kontrollgruppe erhielten alle Tiere eine immunsuppressive Behandlung mit Dexamethason für 14 Tage wie im Vorversuch. Nach experimenteller Inokulation war eine Brachyspiren-Infektion nur jeweils bei einem Teil der Tiere nachweisbar (B. hyodysenteriae 27 %, B. innocens 70 %, B. murdochii 60 % und B. intermedia 20 %). Eine klinische Durchfallsymptomatik konnte nur bei 2 mit B. hyodysenteriae infizierten Tieren beginnend 25 Tage p. inf. beobachtet werden, der Kot wies weder Blut- noch Mukusbeimengungen auf. Während nach B.-innocens- und B.-murdochiiInfektion nur bei einzelnen Tieren kurzzeitig eine leicht veränderte Kotkonsistenz zu erkennen war, blieben die mit B. intermedia infizierten Tiere klinisch völlig unauffällig. Die täglichen Zunahmen und der Futteraufwand aller Versuchsgruppen unterschieden sich nicht von der Kontrollgruppe. Pathologische Veränderungen am Dickdarm konnten nur bei den 2 Schweinen mit Durchfall nach B.-hyodysenteriae-Infektion zwar nicht makroskopisch, aber histologisch im Sinn einer Dysenterie (fibrinöse Kolitis) nachgewiesen werden. Im Versuch 1 zeigte die immunsuppressive Behandlung mit Dexamethason keine optimalen Ergebnisse zur Erzeugung einer klinisch apparenten Dysenterie. Deshalb wurden im Versuch 2 verschiedene Versuchsbedingungen geändert (strohlose Haltung, erhöhter Sojaextraktionsschrotanteil in der Ration, Anzüchtung und Inokulation der Brachyspiren mit Flüssigmedium, Nüchterung vor und nach Infektion). Im Versuch 2 erhielten alle Versuchstiere (n=67, durchschnittliche Körpermasse 15,6 kg) eine Futterration mit 50 % Sojaextraktionsschrot für 7 Tage (Beginn 4 Tage vor der ersten Infektion). Die Tiere der B.-hyodysenteriae-Gruppe (n=15) erhielten 50 ml einer Suspension 155 Zusammenfassung (108-109 KbE/ml; Feldstamm 7304/03, n=5 oder Referrenzstamm B204, n=10) intragastral, während die Kontrollgruppe (n=3) nicht infiziert wurde. Für die Untersuchung der Pathogenität der schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten wurden 3 Gruppen (B. innocens, n=15; B. murdochii, n=24; B. intermedia, n=10) intragastral mit 50-100 ml (105108 KbE/ml) einer Suspension mit jeweils ausgewählten Feldisolaten infiziert. Der Anteil der Schweine, bei denen Brachyspiren in Kot- und Darmproben reisoliert werden konnten, betrug 100 % in der B.-hyodysenteriae- und B.-innocens-infizierten Gruppe, in der B.-intermedia- und B.-murdochii-infizierten Gruppe 80 bzw. 75 %. Die Inkubationszeit bei den Schweinen der B.-hyodysenteriae-Gruppe war signifikant kürzer als im Vorversuch und Versuch 1 (muko-hämorrhagische Diarrhoe beginnend 1-13 Tage p. inf.). Des Weiteren zeigten diese Tiere auch makroskopisch und histologisch sehr stark ausgeprägte pathologische Veränderungen im Sinne einer Dysenterie (hochgradige fibrinös-nekrotisierende Typhlocolitis). Fieber trat bei fast allen Durchfalltieren im Bereich von 40,0oC-40,7oC auf. Diese Gruppe nahm kein Futter während der Durchfallphase auf und erlitt einen durchschnittlichen Körpermasseverlust von 0,04 kg pro Tier und Tag. Im Gegensatz zur B.-hyodysenteriae-Infektion war kein Durchfall bei den mit schwach hämolysierenden Brachyspiren infizierten Gruppen zu beobachten (nur ggr. veränderte Kotkonsistenz). Diese Gruppen zeigten auch keine Unterschiede bezüglich der Zunahmen bzw. des Futteraufwands. Ebenso wurden keine Dysenterie-typischen pathologischen Veränderungen im Kolon gefunden. In den B.-innocens- und B.-murdochii-infizierten Gruppen konnten bei 3 bzw. 8 Tieren nur an einzelnen Lokalisationen histologische Veränderungen in Form leichter oberflächlicher Schleimhautulzerationen und/oder geringgradiger Fibrinauflagerungen beobachtet werden, 3 der mit B. murdochii infizierten Schweine wiesen außerdem eine geringgradige Becherzellhyperplasie im Kolon auf. Nach den vorliegenden Ergebnissen kann gesagt werden, dass die geprüften Stämme der schwach hämolysierenden Brachyspira-Arten nach experimenteller Infektion die Dickdarmschleimhaut besiedeln können und im Kot ausgeschieden werden, aber keine klinisch auffällige Durchfallerkrankung hervorrufen. Im Dickdarm konnten im Einzelfall fokal geringgradige, histologische Veränderungen im Sinne einer Colitis nachgewiesen werden. Eine allgemeine Aussage zur Pathogenität von B. innocens, B. murdochii und B. intermedia ist jedoch noch nicht abschließend möglich. 156 Summary 7. SUMMARY Tuyet Le Nguyen Thi: Pathogenicity study of Brachyspira innocens, Brachyspira murdochii and Brachyspira intermedia in comparison to a Brachyspira hyodysenteriae infection The aim of the present study was to establish an infection model for the experimental infection with Brachyspira (B.) hyodysenteriae. Based on this model the pathogenicity of three weak β-haemolytic Brachyspira species (B. innocens, B. murdochii and B. intermedia) should be examined in pigs. First, a Preliminary Experiment was performed to evaluate the influence of diets and immunsuppression as provocative factors on producing the clinical disease after infection with B. hyodysenteriae. The experimental animals were divided into four groups (five pigs per group, with an average bodyweight of 19.7 kg). Two groups served as challenged control and negative control respectively. Both groups received only control feed (barley, extracted soybean meal and minerals), while a third group received a maize meal and wheat bran containing diet beginning two days before infection until the last day of the experiment. The fourth group received also control feed, but dexamethasone was given i.m. (0.4 mg/kg/day) for 14 days (beginning three days before inoculation) for the purpose of immunsuppression. For the infection, all experimental pigs were inoculated intragastrically on three consecutive days with 50 ml of a B. hyodysenteriae suspension (108-109 cfu/ml, field strain 7304/03). Feed was withheld for at least 18 hours before inoculation. After infection, B. hyodysenteriae was only reisolated in faeces and intestinal samples from all pigs treated with dexamethasone. Four pigs in this group developed a mucohaemorrhagic diarrhea 16-25 days after inoculation. These pigs showed typical gross and microscopic lesions in term of a fibrinous-necrotizing typhlocolitis. In addition, a low average weight gain of 0.24 ± 0.17kg/day and a poor feed conversion rate of 1:5.08 were observed in this group. In contrast, in the remaining experimental groups, the study parameters did not differ from the negative control group. According to these results, dexamethasone treatment was used in all 157 Summary groups of Experiment 1 as an important factor to facilitate the infection and predispose clinical pictures of dysentery. In Experiment 1, 44 weaned pigs with an average bodyweight of 16.5 kg were randomly divided into five groups and housed as in the preliminary Experiment. In this experiment, the results of the experimental groups (infection with weakly haemolytic Brachyspira species B. innocens, n=10, B. murdochii, n=10 and B. intermedia,.n=5) were compared with those of the positive control group (n=11; infection with B. hyodysenteriae, field isolate 7304/03) and the negative control group (n=8; no inoculation). All experimental pigs including the negative control group received a dexamethasone treatment for 14 days similar to the preliminary Experiment. The reisolation rate for the inoculated Brachyspira species varied in the experimental groups (B. hyodysenteriae 27 %, B. innocens 70 %, B. murdochii 60 % and B. intermedia 20 %) after inoculation. A watery diarrhea without any blood and mucous content was observed 25 days p.inf. only in two pigs given B. hyodysenteriae, while short periods of pasty or semi-liquid faecal consistency were recorded in single animals inoculated with B. innocens and B. murdochii. Moreover, all experimental groups showed no significant difference in the average daily weight gain as well as the feed conversion rate compared to the negative control group. Pathological lesions of the large intestine were detected only histologically in the two pigs with diarrhea inoculated with B. hyodysenteriae demonstrating a fibrinous colitis. In the Experiment 1, the immunsuppressive treatment with dexamethasone showed not optimal results with regard to the provocation of clinically apparent dysentery. Therefore, in Experiment 2 some of the experimental conditions were changed (no straw-bedded floor, increased quantities of extracted soybean meal in the diet, liquid medium for preparation of Brachyspira suspension, no feeding before and after experimental infection). In the Experiment 2 (n=67, average bodyweight of 15.6 kg), all pigs were fed a diet containing 50 % extracted soybean meal for seven days (beginning four days before the first inoculation). Animals in the B. hyodysenteriae group (positive control) were inoculated intragastrically with 50 ml (108-109 cfu/ml) suspension of B. hyodysenteriae (field isolate 7304/03, n=5 and reference strain B 204, n=10), while the negative control group (n=3) was not inoculated. To study the pathogenicity of weakly haemolytic Brachyspira species, the animals in three experimental groups (B. innocens, n=15, B. murdochii, n=24 and 158 Summary B. intermedia, n=10) received 50-100 ml suspension of the different selected field isolated strains (105-108 cfu/ml) intragastrically for 3 consecutive days. The reisolation rate for Brachyspira after experimental infection was 100 % for B. hyodysenteriae and B. innocens, 80 % for B. intermedia and 75 % for B. murdochii. All 15 pigs inoculated with B. hyodysenteriae developed a mucohaemorrhagic diarrhea after an incubation period of one to 13 days. These animals showed macroscopically and histologically more severe pathological changes (fibrinous-necrotizing typhlocolitis) than those in the preliminary Experiment and Experiment 1. Fever occurred in most pigs with diarrhea (40.0-40.7oC). This group showed no feed intake during the diarrhea period and an average weight loss of 0.04 kg per animal and day. Therefore the study design of experiment 2 seemed to be highly recommendable for the experimental infection model. In contrast, diarrhea could not be detected in the three groups inoculated with weakly haemolytic Brachyspira species. These groups showed also no significant difference in the average weight gain and feed conversion rate among themselves. Moreover, no pathological findings typical for dysentery could be observed in the large intestine of these groups. However, in the groups inoculated with B. innocens and B. murdochii, in single locations very mild microscopic changes in the form of superficial ulceration and/or small amounts of fibrin were observed in three and eight pigs respectively. A mild hyperplasia of goblet cells was detected additionally in three of the B. murdochii infected pigs. It can be concluded that the examined strains of weakly haemolytic Brachyspira species could colonize and proliferate in the mucosa of the large intestine after the experimental infection. Faecal shedding occurred regularly, but no clinical symptoms of diarrhea could be produced in experimental pigs. In single animals focal changes of mild colitis could be detected. However, a general statement on the pathogenicity of B. innocens, B. murdochii and B. intermedia is still not possible. 159 Literaturverzeichnis 8. LITERATURVERZEICHNIS ACHACHA, M., u. S. MESSIER (1992): Comparison of six different culture media for isolation of Treponema hyodysenteriae. J. Clin. Microbiol. 30, 249-251. ACHACHA, M., S. MESSIER u. K.R. MITTAL (1996): Development of an experimental model allowing discrimination between virulent and avirulent isolates of Serpulina (Treponema) hyodysenteriae. Can. Vet. J. Res. 60, 45–49. ADACHI, Y., T. TANAKA u. H. 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Nach dem Abkühlen auf 54°C Zugabe von 100 ml Rinderblut und in Petrischalen gießen. Brachyspirenselektivagar (BSA) Aqua dest. 875 ml TSA Agar 40 g Hefe–Extrakt 1g Den Agar bei 121°C für 15 Minuten autoklavieren. Nach Abkühlung auf 55°C Zugabe folgender Lösungen und in Petrischalen gießen. Die Konzentration der Antibiotika: Finale Konzentration (μg/ml): Vancomycinlösung 12,5 ml (0,12g in 250ml Aqua dest.) 6,25 Colistinlösung 12,5 ml (0,125g in 250ml Aqua dest.) 6,25 Rifampicinlösung 12,5 ml (0.25 g in 50 ml 96% ethanol) 12,5 Spiramycinlösung 12,5 ml (0.305 g in 50 ml 96% 25 Ethanol + 200ml Aqua dest.) Spectinomycinlösung 25 ml (2 g in 250 ml A. dest.) Rinderblut 200 50 ml 199 Anhang BPLS-Agar (Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar) Aqua dest. 1000 ml BPLS-Agar 50 g Nach Herstellerangaben herstellen und in Petrischalen gießen. Tetrathionat-Brillantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon (TBG-Bouillon) Aqua dest. 1000 ml TBG 63 g Nach Herstellerangaben herstellen. Rappaport-Vassiliadis-Medium (RVS) Aqua dest. 1000 ml RVS (Fa. Oxoid, Wesel) 26,75 g Nach Herstellerangaben herstellen. Rambach®-Agar Nach Herstellerangaben herstellen. Gebrauchsmaterial, Gerät und Substanz Hersteller Anaerobenkammer MAKS MG Anaerobier Arbeitsstation Don Whitley Scientific Limited, Shipley, West Yorkshire, England, GB OXOID, Wesel Anaerobier-Töpfe Api-20-E-System bioMérieux, Nürtingen BPLS-Agar OXOID, Wesel Brain-Heart-Infusion (BHI) Becton Dickinson, Heidelberg Colistin (Sigma C-1511) Sigma, Seelze Columbia-Blutagar, gebrauchsfertig OXOID, Wesel TM Diatabs Tabletten Rosco Diagnostica, Taastrup, DK 200 Anhang DMACA Indole Reagent Stain Dropper TM Gaspacks, AnaeroGen Becton Dickinson, Heidelberg 2,5l; 3,5l OXOID, Wesel Gassner-Agarplatten, gebrauchsfertig OXOID, Wesel Hefe–Extrakt OXOID, Wesel McFarland Densimat bioMérieux, Nürtingen Petrischalen Nerbe plus, Winsen/Luhe Phasenkontrastmikroskop Leitz, Wetzlar Rambach®-Agar Merck, Darmstadt Rifampicin (Sigma R-3501) Sigma, Seelze Rinderblut WDT, Memsen Rinderserum WDT, Memsen RVS (Rappaport-Vassiliadis-Medium) OXOID, Wesel Spectinomycin (Sigma S-9007) Sigma, Seelze Spiramycin (Sigma S-9132) Sigma, Seelze TBG (Tetrathionat-Brillantgrün-GalleAnreicherungsbouillon) Merck, Darmstadt Trypticase-Soja-Agar Becton Dickinson, Heidelberg Vancomycin (Sigma V-2002) Sigma, Seelze 201 Anhang 9.2. Stamm Auswahl der für die experimentelle Infektion verwendeten Brachyspira-Feldisolate Vorbericht 7304/03 B. hyo. 1618/03 B. inter. - Mastschweine, 60-70kg, akut blutiger Durchfall 3900/04 B. inno. 3828/04 B. inno. 2317/03 B. murd. 5139/04 B.murd. - Mastschwein., 50kg, hgr. Durchfälle nach Futterumstellung 3407/05 B. inno. 7405/05 B. inno 3626/05 B.murd. Biochemie Häm Ri ng In d. Hi p. +++ + -/+ - αGal αGlu - 2 Schweine aus Flatdeck u. Vormast, , - Therapie resistenter Durchfall - Mastschweine, 2x mgr,. 1x hgr. Durchfall, 1x Kümmern - Mastläufer, 30kg, mgr. Durchfall, Verdacht auf Dysenterie - Mastschwein, - vorbehandelt mit Tylosin -Durchfall (leicht)+leichter Husten -Behandlung mit Tiamutin+Hygienemaßnahmen - Schwein aus Vormastbereich, Durchfall, auch in Endmast - chronisches. Bestandsproblem - Tylosin eingesetzt "keine Problem mehr - nach Absetzen "6 Tiere verendet - Hygieneproblem in der Flüssigfütterung - Sammelkotprobe, Schweine zeigen nach Umstallung von der Anfangsmast zur Mittelmast Durchfall - Tier wachsen auseinander - Mastschweine, Verdacht auf Dysenterie, 143 Tiere betroffen, - Behandlung mit Colistin +Lincomycin - vorher schon mal Probleme mit PIA 202 + - - - + - - - + - - - + - - + - - + PCR Häm E.coli Sal. Law. B.hyo 02.3.05 B.inter 21.4.04 n.d. n.d. US auf Laws. 1x ggr häm (serolo. neg) neg. neg. neg neg 2x häm. (PCR neg) neg neg neg neg neg βGlu B.inno. 30.8.04 B.inno. 30.8.04 B. mur. 30.8.04 B.murd 02.3.05 + + + + + + + B. inno 14.9.05 - + + + B.inno 2.12.05 - - + + B.murd 14.9.05 +++häm E.coli PCR (-) Anhang 543/06 B. inter 1569/05 B.inno. 7185/05 B. murd 2317/03 B. murd - Läuferschwein z.T. breiiger Durchfall bei älteren Läuferschweinen bisher kein Lawsonia-Nachweis Behandlung mit Tylosin. bei Einstallung ---> keine Probleme mehr - früher in dem Bestand Probleme mit B.hyo, danach Komplettsanierung vor etwa 1,5 Jahren - bei Routine-Untersuchung wurde bei Jungsauen B.innocens nachgewiesen ohne Klinik - Mastschweine mit chronischem. Durchfall - Rein-Raus-Verfahren, ~ 1000 Plätze - Ferkel aus 3-5 verschiedenen Herkünften - vor 3 Jahren Probleme mit B.hyo, danach strenge Hygienenmaßnahmen, Problem beseitigt - 03/05 zenmentfarbener Durchfall, ohne Blutbeimengung - 05/05 ähnliche Probleme, Behandlung mit Lincomycin zeigte Besserung), 3 Ferkel verendet - Ivermectin bei Einnstallung, Entwurmung mit 30+65kg KGW - parasitologische Unertsuchung nicht durchgeführt -Fliegenproblematik, schwer in den Griff zu bekommen, Alzugur im Einsatz - Jungsauenaufzuchtbetrieb - PRRS-frei, Salm. neg., regelm. Entwurmung - immer wieder Einzeltiere mit breiigem Durchfall - Therapie mit Tiamutin nicht zufriedenstellend - Anfang 2005 Lawsonia-intracellularis-Nachweis - Impfung gegen Law. intracellularis im Aufzuchtbetrieb ⇒ Durchfall wird besser, aber nicht ganz weg - Nachweis von B. innocens und B. murdochii - 27.06.05 B. innocens (4360/05, 1 x ++, 1 x +) - 14.09.05 u. 20.10.05 Lawsonia-PCR 2 x neg - 31.10.05 B. murdochii (7185/05, 2 x +++) - 10.02.06 B. innocens (688/06, 7 x +++, 1 x Br nzi, 2 x neg) - 03.02.06 Lawsonia-PCR 6 x pos, 4 x neg (Tiere sind gegen PIA geimpft) - 06.02.06 Brachyspiren neg - Durchfall, Dysenterie-Verdacht - Mast 30 kg 203 + - + - - + + B.inter 27.2.06 + - - - + - + B.inno. 14.9.05 + - - - - - + B. murd 2.12.05 + - - - - + + B. murd 30.08.04 neg neg Anhang 9.3 Hämatoxylin-Eosin (H.E.) Färbung Hämatoxylin und Eosin-Färbung wurde im Färbeautomat Fa. Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Nussloch) durchgeführt und umfasste folgende Schritte: 1. Entparaffinierung und Rehydratation: - Xylol 5 min - Xylol 2 min - Xylol 2 min - 100 %iger Alkohol 2 min - 96 %iger Alkohol 2 min - 80 %iger Alkohol 1 min - 70 %iger Alkohol 1 min - Aqua dest. 1 min 2. Kernfärbung in Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) für 3 min 3. Zum Bläuen 10 min fließend wässern 4. Zur Gegenfärbung; wässriges Eosin (Fa. Thermo Shandon, Frankfurt am Main) für 5 min 5. Fließend wässern für 5 Sekunden 6. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: 7. - 70 %iger Alkohol 1 min - 80 %iger Alkohol 1 min - 96 %iger Alkohol 1 min - 100 %iger Alkohol 1 min - 100 %iger Alkohol 2 min - Xylol 1 min - Xylol 3 min - Xylol 3 min Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg, Deutschland) 204 Danksagung DANKSAGUNG Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Univ.-Prof. Dr. Michael Wendt für die Überlassung des spannenden Themas, die hervorragende und geduldige Betreuung der Arbeit und auch für das Vertrauen und die fachliche Förderung, die er mir jederzeit entgegenbrachte. Ein großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. für die Möglichkeit, diese Arbeit auch am Institut für Pathologie anfertigen zu dürfen. Ganz herzlich bedanken möchte ich mich auch bei meinem unmittelbaren Betreuerinnen, Frau Dr. Anja Rothkamp and Frau Dr. Jutta Verspohl aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tiho Hannover für die nette Zusammenarbeit und freundliche Unterstützung, für die vielfältigen Tipps bzw. ihre Anregungen. Herrn Dr. Frank Seeliger danke ich herzlich für seine freundliche und unermüdliche Unterstützung bei der Durchführung der Sektionen, den histologischen Untersuchungen und der Anfertigung der Bilder. Den Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin danke ich ganz herzlich für die freundliche Aufnahme und Hilfsbereitschaft bei der Durchführung meiner Untersuchungen. Besonders Barbara Schwert, Thekla Großmann, Marion Balk danke ich für die freundliche Unterstützung bei der Untersuchung meiner Blut- und Harnproben, für ihr Verständnisse und ihre Anregungen sowie ihre moralische Hilfe. Eva Nerbas und Daniel Brandt die mich aufgemuntert haben. Bei Frau Petra Röhrig bedanke mich für ihre Unterstützung bei der Untersuchung auf Lawsonia intracellularis. Den Tierpflegern der Klinik danke ich für die Betreuung meiner Schweine. Ein großes Dankeschön gilt allen Mitarbeitern des diagnostischen Labors, der Nährbodenund Spülküche, Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tiho Hannover für ihre geduldige, freundliche Unterstützung bei allen aufkommenden Fragen und Problemen und für das ebenso angenehme Arbeitsklima. Weiterhin bedanke ich mich herzlich bei allen Mitarbeitern und Doktoranden des Instituts für Pathologie der Tiho Hannover für ihre Freundlichkeit und Hilfsbereitschaft während der Durchführung dieser Arbeit. Besonders danke ich Frau Bettina Buck für Ihre nette 205 Danksagung labortechnische Unterstützung. Bei Frau Dr. Ute Kaim bedanke ich mich für Ihre hilfreiche Beratung bei der pathologischen Beurteilung. Viele Personen, die mir bei dieser Arbeit ebenfalls geholfen haben, sind ungenannt geblieben. Auch ihnen sei an dieser Stelle Dank gesagt. Als Promotionsstipendiat bedanke ich mich sehr beim vietnamesischen Ministerium für Ausbildung. Es hat mir diesen Aufenthalt in Deutschland sowie die intensive und ungestörte Beschäftigung mit den Forschungsaufgaben ermöglicht. Zuletzt möchte ich noch meinen ganz persönlichen Dank an meine Eltern, meinen Ehemann und meinen Sohn richten, die mich während meines gesamten Studiums stets nach allen Kräften und in jeder Hinsicht unterstützt haben. 206
