pT197: TWpTLCGTPEYLAPEIILSK - KOBRA

Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
UNTERSUCHUNG ZUM PHOSPHORYLIERUNGSSTATUS
DER KATALYTISCHEN UNTEREINHEIT DER PKA
MITTELS PROTEOMISCHER TECHNIKEN
angefertigt im
Fachbereich 10 – Mathematik
und Naturwissenschaften,
Abteilung Biochemie
der Universität Kassel
vorgelegt von
Susanne E. Hanke
Kassel im August 2011
1. Prüfer und Referent:
Prof. Dr. Friedrich W. Herberg
2. Prüfer und Koreferent:
Prof. Dr. Henning Urlaub
3. Prüfer:
Prof. Dr. Mireille Schäfer
4. Prüfer:
Dr. Anke Prinz
Tag der Disputation: 17. Oktober 2011
Der Weg ist das Ziel.
(Konfuzius)
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS:
1
Einleitung
1
1.1
Phosphorylierung von Proteinen
1
1.2
Die cAMP abhängige Proteinkinase PKA
5
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
1.2.7
PKA in der eukaryotischen Signaltransduktion
Das Modell- und Phosphoprotein PKA-Cα
Biologische Massenspektrometrie – ein wichtiges Werkzeug in der Phosphoproteomanalytik
Ionsierung von Proteinen und Peptiden mittels MALDI- und ESI
Peptidsequenzierung mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)
Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie und Proteindatenbanken
Identifizierung und Quantifizierung von Phosphorylierungsstellen und Phosphoformen mittels
Massenspektrometrie
6
7
10
11
12
15
15
2
Aufgabenstellung
20
3
Material & Methoden
22
3.1
Materialien
22
3.2
Molekularbiologische Methoden
24
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
3.3.7
3.3.8
3.3.9
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.4.5
3.4.6
3.4.7
3.4.8
Auftrennung von DNA mittels Agarosegelelektrophorese
Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Zellen
Reinigung und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA
Einfügen eines N-terminalen Histidin-Fusionsanteils für PKA-Cα S53D
Proteinexpression und Reinigung
Proteinexpression im 1 Liter Maßstab in E. coli
Reinigung von PKA-Cα mittels Kationenaustauscherchromatographie
Reinigung von PKA-Cα mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie
Pulldown Experimente mittels PKI5-24-Affinitätsmatrices
Reinigung von PKA-Cα mit Histidin-Fusionanteil mittels Metallionen-Affinitätschromatographie
Reinigung von PKA-Cα in Form eines Holoenzymkomplexes mittels MetallionenAffinitätschromatographie
Reinigung der zellfrei-exprimierten PKA-Cα mittels NTA-Magnetic Beads
Auftrennung von PKA-C Phosphoformen mittels Mono-S-Chromatographie
Reinigung von mit GST-Fusionsanteil versehenen Phosphatasen mittels Glutathion-Agarose
Biochemische Methoden
24
24
25
25
26
27
27
27
29
30
31
32
32
33
33
34
Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
34
TM
Auftrennung von Phosphoproteinen mittels Phos-tag SDS-PAGE
35
Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
36
Bestimmung der spezifischen Aktivität von PKA-Cα mittels eines spektrophotometrischen
Aktivitätstests (Cook-Assay)
36
Bestimmung der spezifischen Aktivität und Substratspezifität von PKA-Cα mittels eines chipbasierten microfluidic mobility-shift Assays
38
Nachweis der PKA-Cα-Phosphorylierung mittels Westernblot Analyse
40
(De-)Phosphorylierungsexperimente mit PKA-Cα Untereinheiten
42
Kinetische Analyse mittels Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) zur Untersuchung der Interaktion
zwischen PKA-Cα und PKI
43
i
Inhaltsverzeichnis
3.4.9
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
3.5.4
3.5.5
3.5.6
4
Nachweis von Proteinaggregationen mittels analytischer Gelfiltration
Massenspektrometrische Methoden
Enzymatischer Verdau von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen
In-Lösungs-Verdau von Proteinen
In-Lösungs-Verdau von Proteinen mittels FASP
Anreicherung von Phosphopeptiden
Proteinidentifizierung auf Peptidebene mittels nanoLC-ESI-MS/MS
Bestimmung des Molekulargewichtes mittels nanoLC-ESI-MS
Ergebnisse
45
45
45
47
48
48
51
53
54
4.1
Vergleich verschiedener Anreicherungsstrategien für Phosphopeptide der PKA-Cα
54
4.2
Nachweis verschiedener PKA-C Phosphoformen anhand von
Molekulargewichtsunterschieden
57
Untersuchung des dynamischen Phosphorylierungsstatus der PKA-Cα
59
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.4
4.4.1
4.4.2
Rekombinante murine PKA-Cα aus E. coli weist acht P-Stellen auf
Aus Geweben isolierte PKA-Cα ist nur an T197 und S338 phosphoryliert
Die N-terminale Myristoylierung beeinflusst den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Einfluss von Expressionsbedingungen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Einfluss von Reinigungsbedingungen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Einfluss von Phosphatasen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Autophosphorylierung als Ursache für die Hyperphosphorylierung von PKA-Cα in E. coli 76
Katalytisch inaktive PKA-Cα ist nicht phosphoryliert
Zellfrei exprimierte PKA-Cα zeigt trotz fehlender T197 Phosphorylierung eine
Autophosphorylierung an S338
4.5 Die Hyperphosphorylierung von PKA-Cα in E. coli beruht nicht ausschließlich auf
Autophosphorylierung
4.5.1
4.5.2
4.5.3
59
64
68
70
71
73
77
77
79
Die Coexpression mit λ-Phosphatase verringert die Anzahl der Phosphorylierungen an PKA-Cα 79
Die Coexpression mit λ-Phosphatase reduziert die Aktivität und PKI-Affinität von PKA-Cα
81
TM
Nachweis der Autophosphorylierung von PKA-CαCoPP mittels Phos-tag SDS-PAGE
84
4.6 Die Phosphorylierung von S53 - ein möglicher Regulationsmechanismus für die spezifische
Aktivität der PKA-Cα
90
5
Diskussion
5.1
5.1.1
5.2
5.2.1
5.2.2
5.3
5.3.1
5.3.2
Limitationen beim MS basierten Nachweis von Phosphorylierungsstellen der PKA-Cα
Überblick über alle mittels MS identifizierten P-Stellen der PKA-Cα
Vorhersage von Phosphorylierungsstellen mittels in silico Studien und
Datenbankvergleichen
Vorhersage von Phosphorylierungsstellen am Beispiel von PKA-Cα
Vergleich verschiedener Datenbankeinträge zum Phosphorylierungsstatus von PKA-Cα
Dynamik und Funktionalität einzelner PKA-Cα Phosphorylierungsstellen
97
97
100
101
102
106
109
PTMs sind an der Modulation des N-Terminus und einer möglichen Zelllokalisation der PKA-Cα
beteiligt
109
Modifikationen an der potenziellen Phosphorylierungsstelle S53 können die Aktivität der PKA-Cα
inhibieren
112
ii
Inhaltsverzeichnis
5.3.3
5.3.4
5.3.5
5.4
Vergleich der Dynamik des Phosphorylierungsstatus an rekombinanter und aus Gewebe
isolierter PKA-Cα
Einfluss der Expressions- und Reinigungsbedingungen auf den Phosphorylierungsstatus von
rekombinanter PKA-Cα
Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität und der Anzahl der PKA-Cα
Phosphorylierungsstellen
Ist die Phosphatase PP5 ein physiologischer Regulator der PKA-Cα?
114
118
119
120
6
Zusammenfassung
123
7
Summary
125
8
Literaturverzeichnis
127
9
Anhang
142
9.1
Abkürzungsverzeichnis
142
9.2
Zusatzinformationen zu endogener PKA-C aus Schweinegewebe
144
9.3
Übersicht über theoretisch berechnete Molekulargewichte für PKA-Cα
146
9.4
Übersicht über alle mittels MS/MS Sequenzierung identifizierten P-Stellen von PKA-Cα
147
9.5
MS/MS Spektren
148
9.6
Chemikalienliste
267
10 Danksagung
268
11 Erklärung
270
iii
1. Einleitung
1
1.1
EINLEITUNG
Phosphorylierung von Proteinen
Nahezu alle zentralen zellulären Prozesse, wie Stoffwechsel-, Wachstums-, Teilungs-,
Differenzierungs-, Beweglichkeitsvorgänge, wie auch der Transport von Organellen,
Muskelkontraktion, Funktion des Immunsystems, Lern- und Gedächtnisprozesse werden
u. a. über Proteinphosphorylierungen reguliert (Manning et al. 2002a; Manning et al.
2002b). Das kovalente und reversible Anfügen von Phosphatgruppen ist eine von
mittlerweile ca. 300 bekannten posttranslationalen Modifikationen (PTM) (Walsh et al.
2005), deren regulatorische Funktion am Beispiel von der mit dem Nobelpreis
ausgezeichneten Aktiverung der Glykogen Phosphorylase entdeckt worden ist (Krebs et al.
1955; Krebs 1993). Während in Eukaryoten hauptsächlich die Aminosäuren Serin (S, anteilig
zu 87 % phosphoryliert), Threonin (T, 11 %) und Tyrosin (Y, 2 %) phosphoryliert werden
(Olsen et al. 2006), tragen in Prokaryoten vorrangig Histidin und Aspartat diese Modifikation
(Chang et al. 1998). Außerdem wurden Phosphorylierungen an Lysin, Arginin und Cystein
nachgewiesen (Cozzone 1988; Stock et al. 1989; Chang et al. 1998). Eine eukaryotische Zelle
besitzt durchschnittlich 0,5 pmol des Elements Phosphor, welches hauptsächlich in Form von
organischem Phosphat, davon zu 17 % an Protein gebunden vorkommt (Lehmann 2010).
Katalysiert wird die Proteinphosphorylierung durch Proteinkinasen, welche das γ-Phosphat
von ATP auf ihr Proteinsubstrat übertragen. Die Gegenreaktion der Phosphorylierung wird
durch Proteinphosphatasen (PP) mittels Hydrolyse des Phosphosäureesters katalysiert
(s. Abb. 1). Beide Proteinfamilien lassen sich in S/T-, Y- und dualspezifische Kinasen bzw. PP
einteilen (Hanks et al. 1995; Alonso et al. 2004).
Abb. 1: Regulation der Phosphorylierung über
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen.
Pi: anorganisches Phosphat
Das Anfügen der Phosphatgruppen kann bereits während der Translation (cotranslational)
oder am nativen Protein (posttranslational), intermolekular zwischen verschiedenen
Molekülen (trans Phosphorylierung) oder intramolekular innerhalb eines Moleküls
(cis Phosphorylierung) erfolgen (s. Abb. 2). Die meisten Kinasen unterliegen Autophospho1
1. Einleitung
rylierungsprozessen, fungieren aber auch als Substrate für heterologe Kinasen. Derartige
Phosphorylierungskaskaden, wie z. B innerhalb des klassischen MAP-Kinase-Signalwegs
ermöglichen neben der Signalweiterleitung und –verstärkung auch die Wechselwirkung
zwischen verschiedenen Signalwegen (Nishida et al. 1993; Pelech et al. 1993).
Abb. 2: Die Proteinphosphorylierung kann während oder nach der Proteintranslation erfolgen.
Für weitere Erklärungen siehe Text.
Für die ca. 25.000 im menschlichen Genom kodierten Proteine (Stein 2004) wird die
Gesamtanzahl der Phosphorylierungsstellen (P-Stellen) auf >100.000 geschätzt (Zhang et al.
2002; Kalume et al. 2003), wobei ungefähr ein Drittel des menschlichen Proteoms zu jedem
Zeitpunkt phosphoryliert ist (Cohen 2000). Die ursprüngliche Definition des Proteoms als
„Proteinkomplement des statischen Genoms (Wasinger et al. 1995; Wilkins et al. 1996)“
muss um die Dynamik und Flexibilität der Proteinzusammensetzung in einer Zelle erweitert
werden (s. Abb. 3). Neben Proteinisoformen, die von unterschiedlichen Genen exprimiert
werden, müssen auch unterschiedlich prozessierte und modifizierte Proteinspezies innerhalb
eines biologischen Kompartiments zu einer bestimmten Zeit und unter definierten
Umgebungsbedingungen berücksichtigt werden (Jungblut et al. 2008). Beispielsweise kann
innerhalb des Phosphoproteoms der
Phosphorylierungsgrad
von
Proteinen
sehr
unterschiedlich sein und reicht von konstitutiven bis hin zu transienten, nur zu einem
äußerst geringen Prozentsatz modifizierten P-Stellen. Die Dynamik des Phosphorylierungszustandes kann räumlich und zeitlich reguliert werden und führt zum Auftreten von
verschiedenen Phosphoformen, die aus ein und demselben Protein hervorgegangen sind.
Obwohl der Phosphorylierung in der funktionellen Proteomforschung zunehmend mehr
Beachtung geschenkt wird, ist ein Großteil der aktuell in Proteindatenbanken katalogisierten
P-Stellen auf Hochdurchsatz Screening (high throughput screening, HTS) Experimente
2
1. Einleitung
zurückzuführen,
in
denen
der
Phosphorylierungsgrad
bzw.
das
Vorkommen
unterschiedlicher Phosphoformen keine Berücksichtigung findet (s. Abb. 3). In funktionellen
in vitro Studien werden rekombinante Proteine oft einem „fremden Kinom“ ausgesetzt, was
die physiologische Bedeutung dort detektierter P-Stellen in Frage stellt. Da sich das
Phosphoprotem einer Zelle nur selten in dem direkten Interaktionsverhalten zwischen
Kinasen und Substraten widerspiegelt, wird in systembiologischen Ansätzen eine zusätzliche
Berücksichtigung des zellulären Umfeldes und indirekter Regulationsmechanismen gefordert
(s. Übersicht in Ubersax et al. 2007): Dazu gehören die Kompartimentalisierung und
Colokalisationen von Kinasen und Substraten, die Regulation der Kinase über Ausbildung von
Komplexen mit Gerüst- und Adaptorproteinen, das Vorhandensein von positiven und
negativen Rückkopplungsschleifen, genauso wie die Kompetition zwischen verschiedenen
Substraten wie auch Fehlerkorrekturmechanismen von
off-target P-Stellen über
Phosphatasen. Erst unter diesen Voraussetzungen erkennt eine Kinase eine bis wenige
hunderte spezifische P-Stellen aus ca. 700.000 phosphorylierbaren Aminosäureresten in
einer eukaryotischen Zelle (Ubersax et al. 2007). Da derartige Untersuchungen mittels
funktioneller in vivo Studien experimentell meist schwer umsetzbar und extrem zeitaufwändig sind, konnte bislang nur einem relativ kleinen Anteil von P-Stellen überhaupt eine
regulatorische Funktion zugeordnet werden. Das bevorzugte Auftreten vieler P-Stellen in
flexiblen Regionen von nativen Proteinen lässt zudem auch Raum für Spekulationen über
nicht-funktionelle, sogenannte junk P-Stellen offen (Collins et al. 2008; Lienhard 2008;
Landry et al. 2009).
Abb. 3: Proteomexpansion und methodische Zugänglichkeit
des Phosphoproteoms.
(A) Der Expansion des Proteoms (blau) steht die (B) begrenzte
methodische Zugänglichkeit (grün) gegenüber. Der Großteil
der Informationen über das Phosphoproteom (pink) wurde
über Hochdurchsatz Screening (HTS) Experimente, in der
Regel
Massenspektrometrie basierte
Phosphoproteomanalysen in Geweben und Zellen gewonnen. Nur ein geringer
Anteil dieser Phosphorylierungen wurde funktionell in vitro
oder sogar in vivo untersucht.
Funktionelle Proteinphosphorylierungen ermöglichen es einer Zelle schnell auf extrazelluläre
Signale zu reagieren ohne auf die zeit- und energieaufwendige Neusynthese von Proteinen
angewiesen zu sein. Die Auswirkungen sind vielfältig und können die enzyma-tische
Aktivität, das Interaktionsverhalten und die zelluläre Lokalisation der betroffenen Proteine
3
1. Einleitung
beeinflussen (Johnson et al. 2001b). Neben Ladungsverschiebungen und allosterischen
Konformationsänderungen werden in Folge von Phosphorylierungen Interaktionsstellen
generiert, die über spezifische phosphatbindende Domänen erkannt werden: SH2 und PTB
Domänen binden an phosphorylierte Tyrosine, während FHA- (forkhead associated), WWund 14-3-3 Domänen Phosphoserin und –threonin erkennen (Pawson 2004; Miller et al.
2008). Auch die Regulation der Transkription und die Halbwertszeit von Proteinen können
mittels Phosphorylierungen reguliert werden (Hunter 2007). Eine zunehmende Beachtung
gewinnt die Regulation über multiple Phosphorylierungen und kombinatorische Effekte mit
anderen PTMs (Cohen 2000; Yang 2005; Hunter 2007) (s. Abb. 4).
Abb. 4: Regulation über multiple Phosphorylierung
und Wechselwirkung mit anderen PTMs (modifiziert
nach Salazar et al. 2007).
Die Regulation der Funktionen A, B und C kann über
kombinatorische, modulare oder individuelle Phosphorylierungen erfolgen. Eine hierarchische Abfolge
von PTMs (M) kann in Folge von positiven und
negativen Rückkopplungen entstehen.
Während der Proteinpyrophosphorylierung wird das
β-Phosphat von Inositolpyrophosphat auf einen
bereits zuvor phosphorylierten Serinrest übertragen
(Bhandari et al. 2007; Burton et al. 2009).
Dieser ursprünglich in Hefe entdeckte und vermutlich
auch im Säuger stattfindende Prozess ist eine
Ausnahme zu der sonst nur als Monoaddukt
auftretenden Phosphatgruppe.
Ein prominentes Beispiel für solch eine kombinatorische Regulation liefert die Dichte und
Verteilung von verschiedenen PTMs an Histonen, an deren Termini neben Phosphorylierungen auch Acetylierungen, Mono-, Di- und Trimethylierungen, Biotinylierungen,
Ubiquitinierungen, Neddylierungen und Sumoylierungen eine komplexe Regulation
ermöglichen (Latham et al. 2007). Bei derart mehrfach modifizierten Proteinen ist die
hierarchische Abfolge und mögliche Konnektivität zwischen verschiedenen PTMs von
besonderem Interesse: Sequenzielle Phosphorylierungsmuster können dabei u. a. über neu
4
1. Einleitung
generierte
Konsensusmotive
entstehen.
In
der
Glykogensynthase
Sequenz
SRTLpS(a)VSpS(b)LPGL erzeugt z. B. die initiale Phosphorylierung über PKA-Cα (a) ein neues
von der eingebrachten Phosphatgruppe abhängiges Phosphorylierunsmotiv für die
nachfolgende Phosphorylierung durch die Kinase CKI (casein kinase I) (b) (Flotow et al.
1990). Auch an humanem Spectrin (Tang et al. 2004), dem ribosomalen Protein S6
(Radimerski et al. 2000), der MAP Kinase (mitogen-activated kinase) (Schilling et al. 2009)
und FGFR1 (Fibroblast growth factor receptor 1) (Furdui et al. 2006) konnte eine konnektive
Abfolge von P-Stellen bereits gezeigt werden.
1.2
Die cAMP abhängige Proteinkinase PKA
Die cAMP abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) gehört in die Familie der
Proteinkinasen, die mittlerweile mit 518 bekannten Mitgliedern zu einer der größten
Proteinfamilien zählt (Manning et al. 2002b). Funktionell wird die PKA den Serin/Threonin
spezifischen Kinase innerhalb der AGC-Unterfamilie (PKA, PKG und PKC) zugeordnet (Hanks
et al. 1988; Parker et al. 2001). Das PKA Holoenzym im Säuger ist ein Heterotetramer aus
zwei katalytischen (PKA-C) und zwei regulatorischen Untereinheiten (PKA-R) (s. Abb. 5).
PKA Typ I und Typ II Holoenzym werden nach ihren PKA-R Isoformen benannt, von denen
PKA-RIα und -RIβ hauptsächlich im Zytoplasma vorkommen während die PKA-RII Isoformen
(RIIα und RIIβ) an verschiedene Zellkompartimente lokalisiert vorliegen (Pidoux et al. 2010).
Die PKA-R α-Isoformen werden ubiquitär exprimiert (Lee et al. 1983; Scott et al. 1987),
wohingegen die PKA Rβ-Isoformen eine bevorzugte Expression in neuronalem Gewebe und
in Reproduktionszellen aufweisen (Jahnsen et al. 1986; Clegg et al. 1988; Cadd et al. 1989).
Ein weiterer Unterschied der PKA-R Isoformen ist ihre Phosphorylierbarkeit: Während
PKA-RII ein echtes Substrat darstellt und über die katalytische Untereinheit an einem Serin
phosphoryliert werden kann, ist PKA-RI ein Pseudosubstrat, dass an dieser Position mit
Alanin eine nicht phosphorylierbare Aminosäure trägt (Takio et al. 1984; Titani et al. 1984).
Für die hochaffine Bindung zwischen PKA-RI und PKA-C wird - im Gegensatz zu der
PKA-C/PKA-RII Bindung - zusätzlich ATP/Mg2+ benötigt (Herberg et al. 1993b; Zimmermann
et al. 2008). Neben den vier PKA-R Isoformen, die alle über unabhängige Gene kodiert
werden, existieren für PKA-C zusäztlich zu den Isoformen PKA-Cα, -Cβ, -Cγ, PrKX und PrKY
weitere Spleißvarianten (Cα2, Cβ2, Cβ3, Cβ4, Cβ4ab, Cβ4abc) die sich hauptsächlich an ihren
C- und N-terminalen Enden unterscheiden (Showers et al. 1986; Beebe et al. 1990; Wiemann
et al. 1991; Klink et al. 1995; Zimmermann et al. 1999; Reinton et al. 2000; Orstavik et al.
5
1. Einleitung
2001). PKA-Cα1 und –Cβ1 werden ubiquitär exprimiert während die Expression von PKA-Cβ2
bevorzugt in Herz, Hirn und lymphatischen Geweben (Uhler et al. 1986; Thullner et al. 2000;
Orstavik et al. 2001), von PKA-Cα2 und –Cγ in Hodengewebe nachgewiesen worden ist
(Beebe et al. 1990; Nolan et al. 2004). Über die Expression und physiologische Funktion von
PrKX und PrKY wird kontrovers diskutiert: Während PrKX eine Rolle in der Embryonalentwicklung zu übernehmen scheint (Li et al. 2005), fehlen PrKY in Folge einer Gendeletion
wichtige funktionelle Bereiche innerhalb der konservierten Kinasedomäne (Klink et al. 1995).
1.2.1 PKA in der eukaryotischen Signaltransduktion
Während eine Phosphorylierung innerhalb der Aktivierungschleife vieler anderer Kinasen für
deren Aktivierung verantwortlich ist (Hanks et al. 1988; Hanks et al. 1995), ist T197 der
PKA-Cα konstitutiv phosphoryliert (s. 1.2.2). Die Regulation der Aktivität erfolgt hier über die
physiologischen Inhibitoren PKA-R und den im Zellkern lokalisierten Proteinkinaseinhibitor
PKI sowie die Colokalisation von Kinase und Substraten (s. Abb. 5): Die Aktivierung des PKA
Holoenzyms (PKA-R2C2) erfolgt dabei durch Dissoziation des Heterotetramers in ein Dimer
aus regulatorischen Untereinheiten und zwei freie katalytische Untereinheiten, wofür pro
PKA-R zwei Moleküle zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) benötigt werden (Taylor et
al. 2008). cAMP ist ein sekundärer Botenstoff, der innerhalb der cAMP abhängigen
Signaltransduktion ein extrazelluläres Signal in das Zellinnere weiterleitet und dort
amplifiziert (Antoni 2000; Newton et al. 2004): Durch Bindung eines Liganden (z. B das
Hormon Adrenalin) an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor, der mit sieben α-Helices die
Zellmembran (7-Transmembranrezeptor) durchspannt (Lefkowitz 2004), wird ein trimeres
G-Protein (Gαβγ) aktiviert (Yeagle et al. 2003). In Folge eines GDP nach GTP Austausches löst
sich die Gα Untereinheit von der Gβγ Untereinheit und aktiviert eine membranständige
Adenylylzyklase, die intrazellulär aus Adenosintriphosphat (ATP) cAMP bildet (Levitzki 1988).
Die Signaltermination erfolgt durch die Reassoziation des trimeren G-Proteins oder durch
cAMP abbauende Phosphodiesterasen (PDE) bzw. durch Phosphatgruppen entfernende
Proteinphosphatasen (PP). Neben CNG- (cyclicnucleotid-gated) und HCN- (hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide modulated) Ionenkanälen sowie Epac (exchange protein directly
activated by cAMP) gilt PKA als Hauptadressat von cAMP in eukaryotischen Zellen (Kawasaki
et al. 1998; Skalhegg et al. 2000; Kaupp et al. 2002).
6
1. Einleitung
Abb. 5: Aktivierung und Lokalisierung der
cAMP abhängigen Proteinkinase PKA in einer
eukaryotischen Zelle.
7TMR: 7-Transmembranrezeptor;
Gα, β, γ: heterotrimeres G-Protein;
AC: Adenylylzyklase; cAMP: zyklisches Adenosinmonophosphat PKA mit katalytischen (C)
und regulatorischen (R) Untereinheiten;
S: Substratprotein; P: Phosphat; PDE: Phospho
diesterase; AKAP: A-Kinase Ankerprotein;
PP: Proteinphosphatase; PKI: Proteinkinaseinhibitor. Für weitere Erklärungen s. Text.
Die regulatorischen Untereinheiten übernehmen nicht nur inhibierende Funktion sondern
lokalisieren PKA zusammen mit Multienzymkomplexen über A-Kinase Ankerproteine (AKAP)
an Zellorganellen und-membranen (Übersicht in Pidoux et al. 2010; Skroblin et al. 2010). Die
freien katalytischen Untereinheiten phosphorylieren ihre Substratproteine bevorzugt
innerhalb der Konsensussequenz RRxS/Ty, RKxS/Ty, KRxS/Ty, KKx-S/Ty (x entspricht einer
beliebigen, y einer hydrophoben Aminosäure) (Zetterqvist et al. 1976; Kemp et al. 1977;
Krebs et al. 1979). Wie auch PKA-RI ist der im Zellkern lokalisierte Proteinkinaseinhibitor PKI
ein Pseudosubstrat, das an der potenziellen P-Stelle ein nicht phosphorylierbares Alanin
besitzt. Die Inhibition verläuft 1:1 stöchiometrisch und ist ATP/Mg2+ abhängig (Herberg et al.
1993b; Zimmermann et al. 2008). Bei Interaktion mit PKA-C wird am C-terminalen Ende von
PKI eine Kernexportsequenz freigelegt, in Folge dessen der PKA-Cα/PKI Komplex aus dem
Zellkern exportiert wird (Fantozzi et al. 1994; Wen et al. 1995).
1.2.2 Das Modell- und Phosphoprotein PKA-Cα
Aufbau und Struktur der PKA-Cα
Seit der vollständigen Sequenzierung (Shoji et al. 1981) und Aufklärung ihrer dreidimensionalen Struktur gilt die in verschiedenen Organismen hochkonservierte katalytische Untereinheit PKA-Cα als Prototypkinase für die gesamte Proteinkinasefamilie (Knighton et al.
1991a; Knighton et al. 1991b; Taylor et al. 1993; Taylor et al. 2004): Die katalytische Kernregion (Aminosäure (AS) 40-300) besteht aus einem kleinen, vorrangig aus β-Faltblattstrukturen aufgebautem und einem großen α-Helices reichen Lobus. Zwischen beiden Loben
7
1. Einleitung
befinden sich in einer hydrophoben Tasche die ATP/Mg2+- und Substratbindestelle (Hanks et
al. 1988; Hanks et al. 1995) (s. Abb. 6). Das katalytische Zentrum ist bei allen Proteinkinasen
hoch konserviert und ermöglicht die Phosphatgruppenübertragung innerhalb eines ternären
ATP-Substrat-Enzymkomplexes (Übersicht in Johnson et al. 2001a; Taylor et al. 2004; Taylor
et al. 2011): Neben der glycinreichen Schleife (AS 41-54), die an der optimalen Orientierung
von den Phosphaten des ATP Moleküls beteiligt ist (s. 4.6, Abb. 37), koppelt das in Kinasen
hochkonservierte Lysin an Position 72 (K72) die Phosphate außerdem über E91 mit der
flexiblen C-Helix (signal integration motif) und orientiert diese optimal zu dem Aktivierungssegment (AS 184-208). Neben einer Phosphorylierung an Position T197 ist auch das im
Aktivierungssegment vorkommende Magnesium-positionierende D184 des DFG Motivs an
der Ausbildung einer aktiven Proteinkonformation beteiligt. Die P+1 Schleife (peptide
positioning loop) (AS 198-205) bindet neben zahlreichen distalen an der Proteinoberfläche
gelegenen Bindestellen das Substrat an der P+1 Position, wobei P die phosphorylierbare
Aminosäure (P0 Stelle) angibt. Aktuellen Erkenntnissen zu Folge äußert sich der aktive
Zustand einer Kinase dabei nicht, wie lange Zeit angenommen, über die offene oder
geschlossene Konformation der flexiblen Loben zueinander (Bossemeyer et al. 1993; Zheng
et al. 1993a). Sondern mit sogenannten Spines (spatially concerved hydrophobic motifs)
wurden räumlich konservierte, nicht aufeinander abfolgende hydrophobe Motive entdeckt,
die ausnahmslos in aktiven Kinasen vorhanden sind (Dixit et al. 2009; Masterson et al. 2011;
Taylor et al. 2011). Die PKA-C Isoform spezifischen N- (AS 1-39) und C-terminalen Enden
(AS 301-351) sind an der Proteinoberfläche lokalisiert, stabilisieren die Kernregion (Herberg
et al. 1997) und beeinflussen Protein-Protein-Interaktionen (Taylor et al. 2005).
Phosphorylierungen und andere Modifikationen der PKA-Cα
Bekannte chemische Modifikationen der PKA-Cα sind neben der Entfernung des
N-terminalen Methions (Boissel et al. 1988), die Myristoylierung des nachfolgenden Glycinrestes, die partielle Desaminierung von Asparagin zu Aspartat an Position 2 sowie
verschiedene Phosphorylierungen (Gesellchen et al. 2005) (s. Abb. 6). Während desaminierte PKA-Cα hauptsächlich im Zytoplasma, an dieser Position unmodifiziertes Protein
vorrangig im Zellkern nachgewiesen worden ist (Pepperkok et al. 2000), wird für die
cotranslational ablaufende Myristoylierung eine Beteiligung an Protein-Protein bzw. ProteinMembran Interaktionen kontrovers diskutiert (Steinberg 1991; Silverman et al. 1992;
8
1. Einleitung
Struppe et al. 1998; Gangal et al. 1999; Breitenlechner et al. 2004) (s. 5.3.1). Von den vier an
rekombinanter PKA-Cα identifizierten P-Stellen pS10, pS139, pT197 und pS338 sind bislang
nur pT197 und pS338 auch an Protein aus Säugergewebe nachgewiesen worden (Shoji et al.
1979; Yonemoto et al. 1993a; Yonemoto et al. 1997).
Abb. 6: Bekannte Modifikationen der
PKA-Cα.
Die Kristallstruktur ist über eine Oberflächenbzw. Röhrenansicht dargestellt. Zwischem
dem β-Faltblatt reichen kleinen Lobus
(schwarz) und dem α-Helices reichen großen
Lobus (grau) befindet sich das Aktivitätszentrum mit dem Peptid des Proteinkinaseinhibitors PKI5-24 (cyan). Neben den vollständig
modifizierten P-Stellen (rot), sind die
N-terminale Myristoylgruppe (myr: braun)
und die Desaminierung von Asparagin nach
Aspartat
(des: grün)
gezeigt.
Die
Visualisierung von PDB: 1CMK nach Zheng
et al. 1993b erfolgte über VMD 1.8.6
(Humphrey et al. 1996).
Neben diesen vollständig phosphorylierten P-Stellen wurden an rekombinanter PKA-Cα mit
pS14, pT48, pS53, pS212, pS259, pS325 sechs weitere nur substöchiometrisch modifizierte
P-Stellen entdeckt (Seidler et al. 2009) (s. 5.1). Die P-Stellen pT197 und pS338 der PKA-Cα,
gelten als metabolisch stabil sowie resistent gegenüber Säure- und Phosphatase-Einwirkung
(Bechtel et al. 1977; Chiu et al. 1978; Shoji et al. 1979; Toner-Webb et al. 1992; Liauw et al.
1996). Während die Lokalisation von pT197 und die Interaktion der Phosphatgruppe mit den
umliegenden Aminosäuren H87, R165, K189, T195 innerhalb der Kristallstruktur eine
strukturelle Erklärung für die Stabilität dieser P-Stelle liefert (Knighton et al. 1991b; Zheng
et al. 1993b; Humphries et al. 2005; Steichen et al. 2010) konnte für das stärker exponiert
liegende pS338 eine langsame in vitro Dephosphorylierung nachgewiesen werden
(Toner-Webb et al. 1992). Über NMR Studien konnte auch für die an rekombinanter PKA-Cα
zusätzlich detektierten P-Stellen pS10 und pS139 eine deutlich bessere Phosphatase
Zugänglichkeit gezeigt werden (Seifert et al. 2002). Funktionelle Konsequenzen sind bislang
nur für die im Säuger vorkommenden P-Stellen pT197 und pS338 bekannt: Die Erhöhung der
katalytischen Aktivität in Folge einer Phosphorylierung an T197 innerhalb der Aktivierungsschleife beruht bevorzugt auf einer für den Phosphatgruppentransfer optimierten
Konfiguration der Substratbindetasche und weniger auf einer verbesserten Substrataffinität
9
1. Einleitung
(Adams et al. 1995; Iyer et al. 2005b; Steichen et al. 2010). Außerdem wird vermutet, dass
die Phosphorylierung an T197 die Salzbrücke zwischen E208 innerhalb des APE-Motivs und
R280 in der αH-αI-Schleife stabilisiert und damit die Dynamik dieser beiden Motive
zueinander reguliert (Steichen et al. 2010). Eine insbesondere für Pseudosubstratkinasen,
welche den Phosphattransfer von ATP nicht katalysieren können, interessante Beobachtung
ist, dass die Phosphorylierung von T197 zudem eine von der Aktivität der PKA-Cα
unabhängige Interaktionsplattform ausbildet. So lässt sich z. B. die Affinität zu PKA-Cα für
beide physiologischen Inhibitoren PKA-R und PKI in Folge einer Phosphorylierung an T197
signifikant steigern (Adams et al. 1995; Iyer et al. 2005b; Kim et al. 2005; Steichen et al.
2010). Neben einer stabilisierenden Funktion fungiert die Phosphorylierung an S338 auch als
molekularer Schalter, der die potenzielle upstream Kinase PDK-1 zunächst über das
Ade-Motiv (adenine binding motif
327FD(x)1-2F/Y330)
über das HF-Motiv (hydrophobic motif:
348FxxF351)
und nach Phosphorylierung an S338
bindet (Yonemoto et al. 1997; Romano
et al. 2009).
1.2.3 Biologische Massenspektrometrie – ein wichtiges Werkzeug in der Phosphoproteomanalytik
Unter Massenspektrometrie (MS) versteht man allgemein eine Analysetechnik zur
Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum. Während die Nachweisgrenze
für die Identifizierung von Proteinen mittels MS mittlerweile im subfemtomolaren Bereich
liegt, erfordert der spezifische Nachweis von Proteinphosphorylierungen, wegen den hohen
Anforderungen an die Sequenzabdeckung meist noch picomolare Analytkonzentrationen
(Gafken 2009).
Abb. 7: Schematischer Aufbau eines Massenspektrometers.
Peptide werden über ESI (Elektrosprayionisierung), MALDI (matrixunterstützte Laser-Desorption/-Ionisierung)
oder ICP (Ionisierung über induktiv gekoppeltes Plasma) ionisiert und in einem Massenanalysator aufgetrennt.
Quadrupol-Instrumente, Ionenfallen, Flugzeit-Analysatoren (TOF, time of light), Fourier-Transform-IonenCyclotron-Resonanz (FT-ICR)-Geräte und Orbitrap Instrumente unterscheiden sich u. a. in ihrem Auflösungsvermögen (FWHM: Halbwertsbreite, full width at half maximum) (Balogh 2004; Nielen et al. 2007). Am
Detektor werden die elektrischen Signale digitalisiert und in MS Spektren übersetzt.
10
1. Einleitung
Der Aufbau eines Massenspektrometers besteht aus drei Teilen: (1.) einer Ionenquelle, in
der die zu untersuchenden Analyten ionisiert und in die Gasphase überführt werden, (2.)
einem Massenanalysator, in dem die Auftrennung von Ionen hinsichtlich des
Masse/Ladungs- (m/z-) Verhältnisses stattfindet und (3.) einem Detektor, der es ermöglicht
die elektrischen Signale zu digitalisieren und in einem Massenspektrum aufzuzeichnen
(s. Abb. 7).
1.2.4 Ionsierung von Proteinen und Peptiden mittels MALDI- und ESI
Der Durchbruch der Massenspektrometrie (MS) in der Protein- und Peptidanalytik erfolgte
mit der Entwicklung schonender Ionisierungsmethoden, wie ESI (Elektrosprayionisierung)
und MALDI (matrixunterstützte Laser-Desorption/-Ionisierung). Für die MALDI-MS werden
Analytmoleküle mit einer Matrix kokristallisiert und über einen gepulsten Laser
(z. B. Stickstofflaser oder Nd:YAG-Feststofflaser) ionisiert (Karas et al. 1988; Tanaka et al.
1988). Geeignete Matrices müssen ein Absorptionsmaximum im Bereich der eingestrahlten
Wellenlänge des verwendeten Lasers aufweisen und basieren meist auf einer aromatischen
Grundstruktur mit unterschiedlichen Substituenten (z. B. HCCA, α-cyano-4-hydroxy-cinnamic
acid; 2,5-DHB, 2,5-dihydroxybenzoic acid) (Strupat et al. 1991; Beavis et al. 1992). Der
Prozess der in dieser Arbeit verwendete Elektrosprayionisierung soll im Folgenden näher
beschrieben werden: Der Begriff Elektrospray beschreibt die Dispersion einer Analytlösung
in kleine geladene Tröpfchen in einem elektrischen Feld. In der ESI-MS kommt es dabei zur
Desolvatisierung, d. h. zum Transfer von Ionen aus der Analytlösung in die Gasphase
zwischen der Kapillarspitze und dem Eingang des Massenspektrometers. Das elektrische Feld
induziert die Disperion der Analytlösung und die Ausbildung eines Sprühkegels, dem sog.
Taylor-Konus. Durch Verdampfung des Lösungsmittels nimmt die Ladungsdichte auf der
Tröpfchenoberfläche kontinuierlich zu. In Folge der Abstoßung gleichnamiger Ladungen
(Coulomb-Abstoßung) bilden sich Mikrotröpfchen. Das charged-residue-Modell (Dole et al.
1968; Schmelzeisen-Redecker et al. 1989) und das ion-evaporation-Modell (Iribane et al.
1976; Thomson et al. 1979) liefern zwei Hypothesen für den anschließenden Übergang der
Analytionen in die Gasphase. Parallel erfolgt der Transfer der Ionen über das durch Stickstoffgas erzielte Vorvakuum in das Hochvakuum innerhalb des Massenanalysators. Die
Ionisierung über ESI ist sehr empfindlich gegenüber Kontamination mit Salzen oder
Detergenzien, was durch eine direkte Kopplung mit entsalzenden chromatographischen
11
1. Einleitung
Trenntechniken umgangen werden kann (s. 1.2.7). Mit der Entwicklung der nanoESI konnte
der Desolvatisierungsprozess und folglich die Ionisierungsausbeute noch weiter verbessert
werden (Wilm et al. 1994; Wilm et al. 1996). Vorteile sind neben der erhöhten Salztoleranz,
die reduzierte Flussrate (20 nl/min) und die damit verbundenen geringeren Analytvolumina
(ca. 1 µl) und -konzentrationen (<1 pM). Wohingegen mittels MALDI-MS nur einfach
geladenen Ionen detektiert werden, ist für die ESI-MS das Auftreten mehrfach geladener
Ionen typisch. Neben ESI und MALDI kann eine destruktive Ionisierung über ICP (inductively
coupled plasma) in der sogenannten Element MS/ICP MS eingesetzt werden, um sequenzunabhängig die absolute Menge eines Elements (z. B. von Metallen, aber auch von
Phosphor) in einer Probe nachzuweisen (Wind et al. 2001).
1.2.5 Peptidsequenzierung mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)
Fragmentierung von Peptiden
In klassischen MS Analysen werden aus Proteinen zunächst proteolytisch, z. B. mit der
Endoprotease Trypsin Peptide generiert. In Tandem-MS (MS/MS) Experimenten werden
einzelne Signale dieser Peptidionen aus den MS Spektren für eine weitere Fragmentationsanalyse ausgewählt (s. Methode in 3.5.5): Peptidfragmente können hier basierend auf der
Abfolge ihrer Aminosäuren sequenziert und die zugehörigen Proteine identifiziert werden.
In MS/MS Analysen werden zwei Massenanalysatoren durch eine Kollisionszelle voneinander
getrennt (s. Abb. 9, A). Im ersten Massenanalysator werden die Vorläuferionen selektiert
und anschließend durch Kollision mit Inertgas (z. B. Stickstoff oder Argon) fragmentiert (CID,
collision induced dissociation) (Shukla et al. 2000). Alternativ kann die Fragmentierung über
die Reaktionen mit Elektronen (ECD, electron capture dissociation) (Zubarev et al. 2000) oder
Elektronendonoren (ETD, electron transfer dissociation) (Good et al. 2007) erfolgen. Im
zweiten Massenanalysator werden die Fragmentionen analysiert. Für die Fragmentierung
von Peptiden hat sich eine spezielle Nomenklatur durchgesetzt, die sich daran orientiert, an
welcher Stelle das Peptidrückgrat bricht bzw. welche Bruchstücke entstehen (Roepstorff
et al. 1984; Biemann 1988) (s. Abb. 8). Nach CID sind die am häufigsten zu beobachtenden
Signale in einem Fragmentations-Spektrum (MS/MS Spektrum) auf b- und y-Ionen
zurückzuführen. Bei ihrer Entstehung wird das Peptidrückgrat nach dem Modell des mobilen
Protons an der Peptidbindung gespalten (Burlet et al. 1992; Dongré et al. 1996). Bleibt die
12
1. Einleitung
Ladung am N-Terminus des Peptids zurück, entsteht ein b-Ion; sitzt die Ladung am
C-Terminus entsteht ein y-Ion (s. Abb. 8).
Abb. 8: Nomenklatur für die
Fragmentierung von Peptiden
(Biemann 1988).
Bei der Fragmentierung innerhalb
des Peptidrückgrats enstehen
Fragmentionen, die den
N-Terminus (a-, b-, c-Ionen) bzw.
den C-Terminus (x-, y-, z-Ionen)
des Vorläuferions enthalten.
Für Peptide, die über einen klassisch tryptischem Verdau erzeugt werden, lassen sich so
bevorzugt Fragmentionen der y-Reihe detektieren, da diese Peptide C-terminal mit den
basischen Aminosäuren Arginin (R) oder Lysin (K) enden. Je vollständiger eine komplette
Reihe von Fragmentionen detektiert werden kann, desto genauer sind die Sequenzbestimmung der Peptidfragmente und die daraus resultierende Proteinidentifizierung
möglich. Während der CID treten zusätzlich interne Fragmentierungsreaktionen und Neutralverluste von kleinen Molekülen wie CO, H2O, NH3 und labilen PTMs auf, welche auch zur
Spektreninterpretation herangezogen werden können können.
Massenanalysatoren
In der Tandem-MS werden verschiedene Massenanalysatoren räumlich (Quadrupole, TOF,
FT-ICR, Orbitrap) bzw. zeitlich (Ionenfallen) miteinander kombiniert. In TOF-Analysatoren
wird das m/z-Verhältnis über die Geschwindigkeit der Peptidionen bestimmt, wobei Ionen
mit einem kleinen m/z-Verhältnis den Detektor am schnellsten erreichen (s. Abb. 9, C). Das
m/z-Verhältnis verhält sich dabei direkt proportional zu dem Quadrat der Zeit, welches ein
beschleunigtes Peptidion innerhalb der definierten Flugstrecke zwischen der Ionenquelle
und dem Detektor zurücklegt. Peptidionen können im Linearmodus oder im Reflektormodus
aufgetrennt werden, wobei im letztgenannten eine deutlich höhere Massenauflösung
(ca. 15.000 FWHM, Halbwertsbreite, full width at half maximum) erzielt werden kann (Nielen
et al. 2007). Der Quadrupol ist ein flexibler Massenanalysator, der Peptidionen mit einem
ausgewählten m/z-Verhältnis zum Detektor passieren lässt und dabei sowohl als Breitbandmassenfilter wie auch als spezieller Massenfilter eingesetzt werden kann (s. Abb. 9, B).
Ionenfallen bestehen aus einer Ringelektrode mit zwei Endkappen. Die Peptidionen werden
in einem dreidimensionalen elektrischen Feld eingeschlossen und über Regulation der
Hochfrequenzspannung in Abhängigkeit von ihren m/z-Verhältnis analysiert.
13
1. Einleitung
Abb. 9: Schematische Darstellung verschiedener MS/MS Analysemethoden (modifiziert nach Hsiao 2010).
(A) In Tandem-Massenspektrometern werden zwei Massenanalysatoren durch eine Kollisionszelle
voneinander getrennt; CID: collision induced dissociation. (B) Jeder Quadrupol innerhalb eines Triplequadrupol-Instruments kann variabel als spezifischer Massenfiter oder Breitbandmassenfilter (Scan Modus)
eingesetzt werden. Produktionen-Analysen gehören zu den am häufigsten verwendeten MS/MS
Experimenten, über die Peptidsequenzen identifiziert werden: In Quadrupol 1 (Q1) wird ein spezifisches
Vorläuferion ausgewählt, welches in der Kollisionszelle (q2) fragmentiert wird. In Q3 werden die Fragmentionen im Scan-Modus analysiert. In der Vorläuferionen-Analyse können gezielt Subkategorien von Peptiden
(z. B. Phosphopeptide) untersucht werden. Alle Vorläuferionen passieren sequenziell Q1 und werden in q2
fragmentiert während Q3 nur Fragmentionen mit definierten m/z-Werten passieren lässt (z. B. m/z von 79 für
eine Phosphatgruppe). In der Neutralverlust-Analyse arbeiten Q1 und Q3 im Scan-Modus, Q3 scannt
allerdings einen Massenbereich, der um die Masse des zu analysierenden Neutralverlusts versetzt ist. Nur
Vorläuferionen mit dem entsprechenden Neutralverlust werden am Detektor registriert. Der Verlust von
98 Da für H3PO4 kann z. B. zum Nachweis von Proteinphosphorylierungen genutzt werden. In SRM (selective
reaction monitoring) Analysen arbeiten Q1 und Q3 beide als Massenfilter und nur Ionen mit ausgewählten
Vorläufer-/Produkt-Übergängen werden in Abhängigkeit von der gewählten Fragmentierungsenergie
detektiert. (C) Q-TOF Instrumente werden meist für die Produktionen-Analyse verwendet. Das m/z-Verhältnis
wird hier über die Geschwindigkeit der Peptidionen bestimmt. Auch Vorläuferionen-Analysen sind möglich,
dauern aber wesentlich länger und sind weniger sensitiv als vergleichbare Messungen mit TriplequadrupolGeräten.
14
1. Einleitung
In FT-ICR und Oritrap Massenanalysatoren wird die Resonanzfrequenz von Peptidionen in
einem magnetischen bzw. in einem elektrischen Feld gemessen und diese erst über eine
Fouriertransformation (FT) in ein Massensignal übersetzt.
In dieser Arbeit wurden Q-Trap (Triplequadrupol) und Q-TOF Hybridgeräte verwendet
(s. Abb. 9). Q-Trap Geräte liefern mit Produktionen-, Vorläuferionen-, NeutralverlustAnalysen sowie SRM (selective reaction monitoring) vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten
in der Proteomanalytik. Dem gegenüber stehen die niedrige Auflösung sowie die relativ
schlechte Massenpräzision der einzelnen Quadrupol-Analysatoren. Durch Kombination mit
einem Flugzeit-Analysator bieten Q-TOF Hybridgeräte ein wesentlich höheres Auflösungsvermögen (>20.000 FWHM) sowie mit ca. 5 ppm eine bessere Massengenauigkeit (Balogh
2004) (vgl. Abb. 7). In Abhängigkeit von den Ansprüchen an die Sensitivität, Auflösung,
Massengenauigkeit und den Sequenzinformationsgehalt in den MS/MS Spektren müssen je
nach experimenteller Fragestellung geeignete Kombinationen von Massenanalysatoren
ausgewählt werden.
1.2.6 Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie und Proteindatenbanken
Die Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie beruht auf dem Vergleich der
experimentell ermittelten Molekülmassen von Peptid- bzw. Fragmentionen mit theoretisch
berechneten Molekülmassen aus Sequenzdatenbanken. Der klassische Peptidmassenfingerabdruck (PMF, peptide mass fingerprint) (James et al. 1993; Jensen et al. 1997), in dem
Proteine direkt über ihre Peptidmasse identifiziert werden, wird zunehmend durch die
akkuratere MS/MS Sequenzierungen von Peptidfragmenten abgelöst (s. 1.2.5). Für die
Identifizierung von Proteinen über MS/MS Spektren gibt es mit MASCOT (Matrix Sciences)
(Perkins et al. 1999), SONAR (Fenyo 2000) oder SEQUEST (Eng et al. 1994) mittlerweile eine
Vielzahl von Suchmaschinen, die in Form unterschiedlicher mathematischer Algorithmen für
jedes identifizierte Peptid bzw. Protein statistisch einen Trefferwert (Score) ermitteln, der
Aussagen über die Signifikanz der Identifizierung liefert.
1.2.7 Identifizierung und Quantifizierung von Phosphorylierungsstellen und Phosphoformen mittels Massenspektrometrie
Neben den traditionellen Methoden zum Nachweis von Proteinphosphorylierungen über
radioaktiv markiertes [γ-32P] ATP oder phosphospezifische Antikörper hat auch die
Massenspektrometrie Einzug in die Phosphoproteomanalytik gehalten (Übersicht in Goshe
15
1. Einleitung
2006; Gafken 2009; Macek et al. 2009). In MS und MS/MS Experimenten können Phosphorylierungen über die molekulare Masse der Phosphatgruppe an den entsprechenden
Aminosäuren nachgewiesen werden. Im negativen Ionenmodus lässt sich unter neutralen
Bedingungen eine Massendifferenz von 79 Da (PO3-) detektieren (Carr et al. 1996). Im
positiven Ionenmodus unter sauren Bedingungen wird sowohl an Vorläufer- wie auch an
Fragmentionen der auf β-Eliminierung beruhende Neutralverlust von m[H3PO4] = 98 Da für
die Identifizierung einer Phosphorylierung an Serin- oder Threoninresten herangezogen
(Huddleston et al. 1993). Die Fragmentierung der Phosphatgruppe an Phosphotyrosinen ist
weniger effizient. Hier erfolgt der Nachweis vorrangig über das typische PhosphotyrosinImmonium Fragmention (m/z = 216.04) (Tholey et al. 1999). Da die ESI-MS neben dem auch
mittels MALDI-MS gut detektierbaren Neutralverlust mehr Sequenzinformation liefert, hat
sich diese Methode in der MS basierten Phosphoproteomanalytik etabliert. Zusätzlich
ermöglichen gerätespezifische Parametereinstellungen z. B. in Vorläuferionen-, Neutralverlust- oder SRM-Analysen den gezielten Nachweis von Phosphopeptiden in komplexen
Phospo-/nicht Phosphopeptidgemischen (s. 1.2.5, Abb. 9).
Da viele P-Stellen nur substöchiometrisch phosphoryliert vorliegen, wird auch dem
quantitativen Nachweis der Proteinphosphorylierung immer mehr Bedeutung geschenkt.
Über einen Großteil der quantitativen MS Verfahren lassen sich, beruhend auf
unterschiedlicher Isotopenmarkierung von Protein- bzw. Peptidgemischen die relativen
Veränderungen in der Probenzusammensetzung oder auch dem Phosphorylierungsgrad
bestimmen. Die Markierung mit stabilen Isotopen kann dabei metabolisch (SILAC, stable
isotope labeling with amino acids in cell culture), enzymatisch (proteolytische
16 18
/ O
Markierung) oder chemisch (ICAT, TMT, iTRAQ, ICPL; isotope-coded affinity tag, tandem
mass tag, isobaric tag for absolute and relative quantitation, isotope-coded protein label) auf
Zell-, Protein- und/oder Peptidebene erfolgen (Ong et al. 2005; Macek et al. 2009). Relative
isotopenfreie Quantifizierungen sind über den direkten Vergleich der Signalintensitäten von
(Phospho-) Peptiden möglich, stellen jedoch hohe Anforderungen an die Reproduzierbarkeit
und Präzision der verwendeten LC-MS Geräte und Auswerteverfahren (Old et al. 2005;
Seidler et al. 2009; Zhu et al. 2010) (s. Diskussion in 5.1). Eine absolute Quantifizierung ist
nur mittels isotopenmarkierter interner Peptid- oder Proteinstandards möglich (Ong et al.
2005),
wobei
es
elegante
methodische
Ansätze
erlauben,
spezielle
one source
Peptid-/Phosphopeptidstandard Paare zu generieren (Hahn et al. 2010).
16
1. Einleitung
Für den Nachweis unterschiedlich modifizierter Proteinspezies, die in den klassischen
qualitativen aber auch quantitativen bottom up MS Analysen mittels MS/MS Sequenzierung
nicht berücksichtigt werden, ist die sogenannte top down Massenspektrometrie von Vorteil
(Kelleher 2004; McLafferty et al. 2007; Breuker et al. 2008; Doerr 2008). Dabei wird zunächst
das Molekulargewicht eines intakten Proteins bestimmt. Aus der Massendifferenz zwischen
dem auf der Aminosäuresequenz basierenden und dem experimentell ermittelten
Molekulargewicht lassen sich putative Modifikationen über ihre molekulare Masse
vorhersagen (z. B. mit Δm [HPO3] = 80 Da, s. Abb. 10, A). Mittels direkter Fragmentierung der
Proteine im Massenspektrometer werden die Modifikationen im Anschluss identifiziert und
lokalisiert.
Abb. 10: MS basierter
Nachweis von
(A) Phosphoformen oder
(B) P-Stellen eines
Proteins.
(C) Erst nach Vorfraktionierung der Probe können
P-Stellen definierten
Phosphoformen
zugeordnet werden.
Top down MS wurde u. a. bereits erfolgreich für die Untersuchung der vielfach modifizierten
Proteine Histon H4 (Pesavento et al. 2006) und Troponin (Zabrouskov et al. 2008) eingesetzt.
17
1. Einleitung
Die Anwendung von top down MS Analysen setzt jedoch voraus, dass die gereinigten
Proteine in Lösung vorliegen. Bisherige Versuche zur Extraktion von Proteinen aus
SDS-PAA-Gelen waren wenig erfolgreich (Schuhmacher et al. 1996; Cohen et al. 1997; Ehring
et al. 1997; Yefimov et al. 2000). Die hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung, MS
Instrumente sowie eine fehlende automatisierte Auswertungssoftware verhindern ein
Hochdurchsatzverfahren, wie es sich für MS/MS Sequenzierungen in den letzten Jahren
entwickelt hat.
Um auch über MS/MS Sequenzierungen Phosphorylierungen definierten Phosphoformen
eines Proteins zuordnen zu können, muss der MS/MS Analyse eine Vorfraktionierung der
Phosphoformen, z. B. über chromatographische Verfahren (Hunzinger et al. 2006) oder wie
in dieser Arbeit über Phos-tagTM SDS-PAGE (Kinoshita et al. 2007; Kinoshita et al. 2008)
vorausgehen (s. Abb. 10).
Strategien zur Auftrennung und Analyse komplexer (Phospho-) Proteingemische
Einen wichtigen Stellenwert in der MS basierten (Phospho-) proteomanalytik hat auch die
Probenvorbereitung, deren technische Herausforderung darin besteht, eine optimale
Vorfraktionierung der Probe zu gewährleisten, ohne dabei die aktuelle Zusammensetzung
des untersuchten (Phospho-) proteoms zu verändern (s. Diskussion in 5.1).
Eine gezielte Anreicherung von Subproteomen reduziert die Komplexität bereits innerhalb
der
Ausgangsprobe:
Mit
dem
Prinzip
der
Affinitätschromatographie
oder
der
Co-Immunopräzipitation lassen sich über spezifische Ligand-Protein-Wechselwirkungen
Proteine oder Proteinkomplexe mit ausgewählten Eigenschaften isolieren (Reinders et al.
2005; Witze et al. 2007). Kommerziell zu erwerbende Phospho-Tyrosin Antikörper sind z. B.
für die Isolierung von „Phosphotyrosin Omes“ eingesetzt worden (Rush et al. 2005),
wohingegen die weniger affinen Phosphoserin- und Phosphothreonin Antikörper für
derartige Anwendungen bislang nicht erfolgreich verwendet werden konnten (Mann et al.
2002). Bei einem Mangel an spezifischen Liganden, können PTMs auch chemisch derivatisiert
werden, so dass betroffene Proteine oder Peptide über die neu eingeführte funktionelle
Gruppe gereinigt werden können. Phosphoserin und Phosphothreoninreste können z. B.
mittels β-Eliminierung/Michael Addition für das Anfügen eines Biotin-Affinitätsfusionsanteils
modifiziert werden (Oda et al. 2001).
18
1. Einleitung
Neben der Anreicherung von Subproteomen können komplexe Proben auch mittels
eindimensionaler oder zweidimensionaler SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (1D-, 2DSDS-PAGE) vorfraktioniert werden. Da die eindimensionale Auftrennungskapazität nach dem
Molekulargewicht oft nicht ausreicht, werden Proteine in einer ersten Dimension meist
zusätzlich nach ihrem isolelektrischen Punkt aufgetrennt. Neben Radioimmunoblot und
Westernblot Analysen
ermöglicht
es
eine
phosphospezifische
Anfärbung
mittels
ProQ®-Diamond (Invitrogen) gezielt nur Phosphoproteine innerhalb einer SDS-PAGE zu
detektieren (Jacob et al. 2008). Aufgrund der allgemeinen Limitationen bezüglich
Reproduzierbarkeit und Sensitivität sowie nicht zuletzt dem hohen Material und Zeitaufwand, wurden in den letzten Jahren mit der Etablierung multidimensionalen
Chromatographien alternative gel-unabhängige Verfahren für die Auftrennung komplexer
Proteinproben entwickelt (McCormack et al. 1997; Yates et al. 1997). In der IonenaustauschChromatographie (SCX, strong cation exchange), dem am häufigsten verwendeten Trennverfahren, werden Peptide in Abhängigkeit von ihrer Ladung aufgetrennt. In der
Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) erfolgt die Auftrennung
in Abhängigkeit von den hydrophoben Eigenschaften der Peptide. In der MudPIT
(multidimensional protein identification technology) Analyse werden beide Verfahren auch
miteinander kombiniert eingesetzt (Link et al. 1999; Washburn et al. 2001). Für den
spezifischen Nachweis von Phosphopeptiden haben sich hier IMAC- (immobilised metall
affinity chromatography-) Techniken sowie die Anreicherung über Metalloxide, wie z. B. TiO2
und ZrO2 etabliert (Garcia et al. 2005; Reinders et al. 2005; Thingholm et al. 2009a; Dunn
et al. 2010). Wegen ihrer kontinuierlichen Arbeitsweise sind moderne ESI-MS Instrumente
heute meist direkt mit Flüssigkeitschromatographie- (LC-) bzw. nanoLC-Geräten gekoppelt,
was die Identifizierung von Proteinen und Peptiden durch gleichzeitige Analyse von
chromatographischem Verhalten und Molekülmasse erleichtert. In Abhängigkeit von der
gewählten Chromatographiemethode können die Analyten entsalzt, ankonzentriert oder
bestimmte Subproteome angereichert werden.
19
2. Aufgabenstellung
2
AUFGABENSTELLUNG
Die Phosphorylierungsstellen (P-Stellen) der Modellkinase PKA-Cα sind mit klassischen
Methoden bereits vielseitig untersucht worden: pT197 und pS338 wurden als die ersten
P-Stellen durch Sequenzierung mittels Edman-Abbau (Shoji et al. 1979), über radioaktive
Markierung der Phosphate mit *γ-32P] ATP (Yonemoto et al. 1993a) sowie über die phosphospezifischen Antikörper α-PKA-C-pT197 und α-PKA-C-pS338 nachgewiesen (Moore et al.
2002; Iyer et al. 2005b). Für an T197 phosphorylierte PKA-Cα konnte außerdem eine
Änderung des Laufverhaltens in SDS-PAA-Gelen beobachtet werden (Steinberg et al. 1993;
Liauw et al. 1996; Cauthron et al. 1998). Für die funktionelle Charakterisierung der P-Stellen
an S10, S139, T197, S338 wurden zielgerichtete Mutagenesen eingesetzt, um phosphomimetische und phosphoablative Proteine zu generieren (Yonemoto et al. 1997). Die ersten
massenspektrometrischen Studien beschränkten sich auf den qualitativen Nachweis der
bekannten P-Stellen pS10, pS139, pT197 und pS338 der PKA-Cα (Wind et al. 2001; Schlosser
et al. 2002; Chalmers et al. 2004; Shen et al. 2004). Mit der Bestimmung des
Molekulargewichtes intakter Proteine (Chait et al. 1992; Herberg et al. 1993a; Hemmer et al.
1997b; Jedrzejewski et al. 1998; Aimes et al. 2000; Shen et al. 2004; Iyer et al. 2005b;
Gesellchen et al. 2006) und der Auftrennung verschiedener PKA-Cα Proteinspezies über
Mono-S-Chromatographie (Herberg et al. 1993a; Steinberg et al. 1993; Yonemoto et al.
1993a; Schlosser 2002) gelang für PKA-Cα erstmalig der Nachweis verschiedener
Phosphoformen. Parallel zu der hier vorgestellten Arbeit wurden neben den nahezu
vollständig phosphorylierten Aminosäuren (pS10, pS139, pT197, pS338) sechs weitere
substöchiometrisch modifizierte P-Stellen (pS14, pT48, pS53, pS212, pS259, pS325) an
rekombinanter PKA-Cα beschrieben (Seidler et al. 2009).
In der vorliegenden Arbeit soll vor allem die Dynamik und die Regulation von
Phosphorylierungen der PKA-Cα auf der Ebene der bisher wenig untersuchten Phosphoformen betrachtet werden: Zunächst sollen verschiedene Anreicherungsstrategien für
Phosphopeptide getestet werden, um möglichst alle P-Stellen der PKA-Cα zu erfassen. Die
Verteilung
der
Phosphoformen
wird
über
Molekulargewichtsbestimmung
mittels
Massenspektrometrie sowie mit einer neuen, modifizierten Form der SDS-PAGE (Phos-tagTM
SDS-PAGE), welche die Auftrennung unterschiedlich stark phosphorylierter Proteinspezies
ermöglicht, untersucht. Dabei sollen die folgenden, in high troughput proteomischen
Studien generell vernachlässigten Parameter berücksichtigt werden: Aminosäuresequenz,
20
2. Aufgabenstellung
Ursprungsorganismus, Expressions- bzw. Reinigungsbedingungen, weitere kovalente
Modifikationen sowie der Einfluss von Phosphatasen. Geklärt werden soll weiterhin, ob die
neu entdeckten P-Stellen (1.) physiologische Bedeutung haben, (2.) an PKA-Cα aus Säugergewebe nachgewiesen werden können und (3.) bei rekombinanter Expression in E. coli
ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozesse zurückzuführen sind. Da eine Phosphorylierung innerhalb der hochkonservierten glycinreichen Schleife von Proteinkinasen eine
regulatorische Funktion hat, soll mittels Mutagenesestudien gezielt die Phosphorylierung an
der Position S53 der PKA-Cα untersucht werden.
Am Beispiel der mehrfach phosphorylierten PKA-Cα soll in dieser Arbeit aufgezeigt werden,
wie wichtig -neben der qualitativen Beschreibung von Phosphoproteomen- die quantitative
Untersuchung von Proteinphosphoformen ist, da erst durch deren Dynamik eine weitere
Regulationsebene in der eukaryotischen Signaltransduktion generiert werden kann.
21
3. Material & Methoden
3
MATERIAL & METHODEN
3.1
Materialien
Eine Chemikalienliste mit Herkunftsnachweis befindet sich im Anhang 9.6.
Proteine:
Abkürzung:
PKA:
Protein:
cAMP anhängige Proteinkinase, Proteinkinase A.
PKA-R:
regulatorische Untereinheit der PKA.
PKA-Cα:
katalytische Untereinheit alpha der PKA.
PKA-CαCoPP:
PKA-Cα mit lambda Proteinphosphatase in E. coli coexprimiert.
PKA-CαPKI5-24:
PKA-Cα, die mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie gereinigt worden ist.
PKA-CαKat:
PKA-Cα, die mittels Kationenaustauscherchromatographie gereinigt worden ist.
PKA-CαCoR/Ni2+:
PKA-Cα, die mittels Ni2+-Affinitätschromatographie über coexprimierte
His6- PKA-RIIα G337E in Form des Holoenzymkomplexes gereinigt worden ist.
His6- PKA-CαCo2+
PKA-Cα mit N-terminalem Hexahistidin-Fusionsanteil, die mittels
Co2+-Affinitätschromatographie gereinigt worden ist.
myr PKA-Cα:
N-terminal myristoylierte PKA-Cα.
PKA-Cα S53A:
PKA-Cα mit einer Mutation an der Aminosäure Serin 53 nach Alanin.
PKA-Cα S53E:
PKA-Cα mit einer Mutation an der Aminosäure Serin 53 nach Glutamat.
His6- PKA-Cα S53D:
PKA-Cα mit N-terminalem Hexahistidin-Fusionsanteil und einer Mutation an
der Aminosäure Serin 53 nach Aspartat.
His6- PKA-Cα K72H:
PKA-Cα mit N-terminalem Hexahistidin-Fusionsanteil und einer Mutation an
der Aminosäure Lysin 72 nach Histidin.
His6- PKA-Cα CFE:
PKA-Cα mit N-terminalem Hexahistidin-Fusionsanteil aus einem zellfreien
Expressionssystem (Roche).
end PKA-C:
endogene PKA-C aus Mäuseherzen (murin) und Schweinegeweben (porcin).
His6- RIIα G337E:
PKA-RIIα mit N-terminalem Hexahistidin-Fusionsanteil und einer Mutation an
der Aminosäure Glycin 337 nach Glutamat in der cAMP Bindetasche.
PKI:
hitzestabiler Proteinkinaseinhibitor.
GST-PKI:
hitzestabiler Proteinkinaseinhibitor mit N-terminalem
Gluthation-S-Transferase-Fusionsanteil.
λ-PP:
lambda Proteinphosphatase.
GST-λ-PP:
λ-PP mit N-terminalem Gluthation-S-Transferase-Fusionsanteil.
CIAP:
Alkalische Phosphatase (calf intestine alkaline phosphatase) von Roche
PDK-1:
Phosphoinositide abhängige Kinase 1.
NMT:
N-Myristoyltransferase
22
3. Material & Methoden
Vektoren:
kodiertes Protein:
Vektor:
Resistenz:
Herkunft:
murine PKA-Cα*
pRSETb
Ampicillin (100 µg/ml)
S. Taylor (San Diego)
murine His6- PKA-Cα*
pET15b
Ampicillin (100 µg/ml)
S. Taylor (San Diego)
humane PKA-Cα*
pET30a
Ampicillin (100 µg/ml)
S. Taylor (San Diego)
humane His6- PKA-RIIα G337E
pET30a
Kanamycin (30 µg/ml)
S. Taylor (San Diego)
NMT
pBB131
Kanamycin (30 µg/ml)
S. Taylor (San Diego)
λ-PP
pACYc
Chloramphenicol (34 µg/ml)
J. Elkins (Oxford)
GST-λ-PP
pGEX-6P
Ampicillin (100 µg/ml)
J. Elkins (Oxford)
GST-hPP5
pGEX4T-3
Ampicillin (100 µg/ml)
K. Muda
(Universität Kassel)
* Die murine bzw. humane Sequenz kodiert für KAPCA_MOUSE (P05132) bzw. KAPCA_HUMAN (P17612)
(siehe auch Sequenzalignment in 4.3.1).
Zellen & Gewebe:
Zellen/Gewebe:
E. coli TOP10
Herkunft:
Invitrogen, Karlsruhe
NovaBlue GigaSinglesTM
Merck, Darmstadt
E. coli BL21DE3
Novagen (Merck Biosciences), Bad Soden
E. coli BL21DE3 RIL Codon+
Stratagen, Heidelberg
E. coli BL21 AI
Invitrogen, Karlsruhe
Mäuseherzen
MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen
(Kooperation mit Prof. Dr. H. Urlaub)
Schweinegewebe
Schlachterei
Selektivnährmedien (in A. bidest autoklaviert):
LB-Medium (Luria Miller Broth):
1 % Trypton
0,5 % Hefeextrakt
1 % NaCl
SOC-Medium:
2%
0,5 %
10 mM
2,5 mM
10 mM
10 mM
20 mM
LB-Agar (Luria Miller Broth):
1 % Trypton
0,5 % Hefeextrakt
0,5 % NaCl
1,5 % Agar
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
KCl
MgCl2
MgSO4
Glukose
23
3. Material & Methoden
3.2
Molekularbiologische Methoden
3.2.1 Auftrennung von DNA mittels Agarosegelelektrophorese
Bei der Agarosegelelektrophorese werden geladene Moleküle, wie z. B. DNA Fragmente in
einem elektrischen Feld in Abhängigkeit von ihrer Größe aufgetrennt. Für die Kontrolle von
Klonierungsreaktionen wurden in der Regel 1 % Agarose-Gele verwendet. DNA Proben
wurden mit 6x°Auftragspuffer in einem Verhältnis von 1:5 vorbehandelt. Die Gelelektrophorese wurde bei 10 V pro cm Gel für 45 min durchgeführt (Gel-Apparatur Febikon). Als
Größenstandard
wurde
der
Gel-Elektrophorese
Marker
GeneRuler
1 kb
bzw.
GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) verwendet. Für die Detektion wurden die
Agarosegele für 30 min in einem Ethidiumbromidbad (0,5 mg pro ml 1x TAE-Puffer) inkubiert
und die DNA Fragmente unter UV-Licht dokumentiert (Gel Jet Imager, INTAS).
1x TAE Puffer:
40 mM
20 mM
1 mM
Tris (pH 8,5)
Essigsäure
EDTA
6x Auftragspuffer:
50 mM Tris-HCl (pH 7,6)
0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol
60 % Glycerol
3.2.2 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Zellen
Chemische Transformation
Speziell nach Klonierungsreaktionen wurden chemisch kompetente Zellen verwendet, um
eine möglichst hohe Transformationseffizienz zu gewährleisten: 1-10 ng Plasmid-DNA
wurden zu E. coli Zellen (20 µl GigaSinglesTModer 100 µl Rubidiumchlorid (RbCl) chemisch
kompetente TOP10) gegeben. Nach 5 min auf Eis wurden die Zellen für 30 sek einem
Hitzeschock von 42°C in einem Wasserbad ausgesetzt. Nach weiteren 2 min auf Eis erfolgte
die Zugabe von SOC Medium (250 µl für GigaSinglesTM; 900 µl für TOP10) und die
Zellsuspension wurde für 60 min bei 37°C und 400 rpm geschüttelt (Thermomixer 5436,
Eppendorf). Jeweils 10 µl und 50 µl der Zellsuspension wurden auf die entsprechenden
Selektivnährböden ausplattiert und für weitere 24 h bei 37°C inkubiert.
Elektrische Transformation
Für die Expression rekombinanter Proteine wurde die Plasmid-DNA über Elektroporation in
die Zellen eingebracht: 100 ng Plasmid-DNA wurden mit 40 µl elektrokompetenten E. coli
BL21 Zellen (s. 3.1) für 1 min auf Eis in Elektroporationsküvetten (2 mm, Biozym) inkubiert.
24
3. Material & Methoden
Nach Elektroporation für 5 msek bei 2500 V (Multiporator, Eppendorf) und nachfolgender
Zugabe von 1 ml SOC-Medium wurden die Zellen für 30 min bei 37°C und 400 rpm
geschüttelt (Thermomixer 5436, Eppendorf). 10 µl und 50 µl der Zellsuspension wurden auf
die entsprechenden Selektivnährböden ausplattiert und für weitere 24 h bei 37°C inkubiert.
3.2.3 Reinigung und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
Für die Amplifikation von Plasmid-DNA wurden E. coli Zellen in Flüssig-Selektivnährmedien
über Nacht bei 37°C angezogen und bei 4.000 rpm für 10 min geerntet (Tischzentrifuge
5810R, Eppendorf). In Abhängigkeit vom Volumen der Bakterienkultur wurde das EZNAPlasmid-Mini-Kit I (Omega Bio-Tek; < 5 ml), das PureYield-Plasmid-Midiprep (Promega;
< 250 ml) oder das Plasmid Plus Maxi Kit (Qiagen; < 200 ml) für die Plasmidpräparation nach
Herstellerangaben verwendet. Die DNA wurde in 30 µl Nuklease freies Wasser eluiert und
die Konzentration photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt
(Konzentration der doppelsträngigen DNA) = A260nm x 50 µg/ml x Verdünnungsfaktor). In der
Regel wurden 2 µl DNA in 98 µl A. bidest in Quarzküvetten (QS 1.000, Hellma) verdünnt.
Präparative Restriktionsverdaue der Plasmid-DNA wurden im Vorfeld einer Ligation
durchgeführt, um ausreichende Mengen an Insert bzw. Zielvektor zu erhalten. Für
analytische Restriktionsverdaue wurde deutlich weniger DNA eingesetzt, da nur die richtige
Plasmidgröße bzw. die Orientierung des Inserts über ein Agarosegel kontrolliert wurde
(s. Tab. 1).
Tab. 1: Zusammensetzung der Reaktionansätze für einen präparativen bzw. analytischen Restriktionsverdau.
Die Inkubationstemperatur ist abhängig von dem verwendeten Restriktionsenzym (s. Fermentas).
Plasmid-DNA
Enzym
10x Puffer
A. bidest
Inkubationszeit
präparativ
1 - 5 µg
2U/µl
1x
ad 40 µl
4-5 h
analytisch
0,5 - 1 µg
0,5 U/µl
1x
ad 10 µl
1-2 h
3.2.4 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA
Für die Herstellung der mutagenisierten PKA-Cα S53 Proteine (PKA-Cα S53A, PKA-Cα S53E,
His6- PKA-Cα S53D) wurde nach Kunkel 1985 eine ortsgerichtete Mutagenese auf das
Ausgangsplasmid pRSETb-mur PKA-Cα durchgeführt (s. 3.1): In einer round circle PCR mittels
Pfu-Polymerase (Promega) wurde das komplette Plasmid repliziert und die Mutation über
25
3. Material & Methoden
komplementäre Primer (s. Tab. 2 und Tab. 3) in die neu generierten Plasmide eingebracht.
Nach der PCR wurde der Reaktionsansatz für mindestens 30 min bei -20°C eingefroren. Es
folgte bei 37°C und über Nacht eine Behandlung mit 2 µl der methylierungssensitiven
Restriktionsendonuklease DpnI, die das methylierte und nicht mutagenisierte DNA Template
verdaut und somit auf die neu synthetisierte, nicht methylierte Plasmid-DNA selektioniert.
Nachdem der Reaktionsansatz ein weiteres Mal für mindestens 30 min bei -20°C eingefroren
worden war, erfolgte die Transformation der Plasmid-DNA in E. coli GigaSinglesTM. Der Erfolg
der Mutagenese-PCR wurde zunächst über Restriktionsverdau und anschließend mittels
DNA-Sequenzierung (Agowa) überprüft.
Tab. 2: PCR-Ansatz und PCR-Programm für die ortsgerichtete Mutagenese in pRSETb-mur PKA-Cα
* Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tab. 3 aufgeführt.
PCR-Ansatz:
1 µl DNA Template (50 ng/µl)
1 µl Primer 1* (10 pmol/µl)
1 µl Primer 2* (10 pmol/µl)
2,5 µl dNTP-Mix (10 mM)
5 µl 5x Pfu Puffer
37,5 µl A. bidest
1 µl Pfu Polymerase (2,5 U/µl)
PCR-Programm:
96°C 5 min
96°C
60°C
72°C
30 min
1 min
12 min
72°C
20 min
(18 Zyklen)
Tab. 3: Übersicht über verwendete Primer für die ortsgerichtete S53 Mutagenese in pRSETb-mur PKA-Cα.
Ursprungssequenz:
5’ GGC ACC GGC TCC TTT GGG CGA G 3’
PKA-Cα S53A Primer 1:
5’ GGC ACC GGC GCC TTT GGG CGA G 3’
PKA-Cα S53D Primer 1:
5’ GGC ACC GGC GAC TTT GGG CGA G 3’
PKA-Cα S53E Primer 1:
5’ GGC ACC GGC GAA TTT GGG CGA G 3’
PKA-Cα S53A Primer 2:
5’ C TCG CCC AAA GGC GCC GGT GCC 3’
PKA-Cα S53D Primer 2:
5’ C TCG CCC AAA GTC GCC GGT GCC 3’
PKA-Cα S53E Primer 2:
5’ C TCG CCC AAA TTC GCC GGT GCC 3’
3.2.5 Einfügen eines N-terminalen Histidin-Fusionsanteils für PKA-Cα S53D
Über einen sequenziellen Restriktionsverdau mit SdaI und NdeI (Fermentas) wurde nach
Herstellerangaben ein 284 bp langes, die Mutation enthaltendes DNA Fragment aus pRSETbmur PKA-Cα S53D herausgeschnitten und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen
behandelten Zielvektor pET15b-mur His6- PKA-Cα ligiert. Nach dem Restriktionsverdau
wurden das DNA-Fragment sowie der Zielvektor aus einem 1 % Agarosegel über Gelelution
(Wizard-SV-Gel-System, Promega) nach Herstellerangaben gereinigt und in 30 µl Nuklease
26
3. Material & Methoden
freies Wasser eluiert. Die Ligation der Fragmente erfolgte bei 16°C über Nacht mit T4-Ligase
(Fermentas) (s. Tab. 4). 1/10 des Ligationsansatzes wurde in RbCl-kompetente E. coli Zellen
transformiert. Der Erfolg der Umklonierung wurde zunächst über Restriktionsverdau der
Plasmide und anschließend mittels DNA-Sequenzierung (Agowa) überprüft.
Tab. 4: Zusammensetzung des Ligationsansatzes für pET15b-mur His6- PKA-Cα S53D.
Ligationsansatz:
9 µl (200 ng)
2,5 µl (25 ng)
1,5 µl
1 µl
1 µl
3.3
pET15b His6- Vektor
284 bp Insert
10x Ligase Puffer
T4-Ligase
A. bidest
Proteinexpression und Reinigung
3.3.1 Proteinexpression im 1 Liter Maßstab in E. coli
Das grundlegende Verfahren für die Expression rekombinanter PKA-Cα wurde 1989 von Slice
und Taylor beschrieben (Slice et al. 1989). Für die Expression im 1 Liter Maßstab wurde unter
sterilen Bedingungen ein Einzelklon von dem Selektivnährmedium in antibiotikahaltiges
LB-Flüssigmedium überimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert (Infors Multitron,
135 rpm). Bei einer Zelldichte (OD600 nm) von 0.6 wurde die Proteinexpression durch Zugabe
von Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Wenn nicht anders angegeben, wurden die
Zellen für weitere 18 h bei 22°C inkubiert (Innova 2300, 200 rpm). Am Folgetag wurden die
Literkulturen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm für 15 min (Beckman J6-HC) geerntet und
die Zellpellets bei -20°C gelagert.
3.3.2 Reinigung von PKA-Cα mittels Kationenaustauscherchromatographie
Die Reinigung von PKA-Cα erfolgte über eine Kationenaustauscherchromatographie mittels
Phosphozellulose-Säulenmaterial (P11-Harz, Whatmann) (Slice et al. 1989; Yonemoto et al.
1991; Herberg et al. 1993a). Das P11-Material (0,4 g Phosphozellulose/g Zellpellet) wurde
sequenziell in 1 Liter A. bidest, dann in dem 50 fachen Volumen an 0.5 M NaOH (5 min
Rühren) und nachfolgend mit A. bidest gewaschen, bis der pH-Wert unter 11 lag. Analog
wurde das P11-Material im Anschluss für 5 min mit dem 50 fachen Volumen an 0,5 M HCl
inkubiert und wiederum mit A. bidest gewaschen, bis der pH-Wert der Waschfraktion über 3
lag. Das Material wurde einmalig mit 10x Puffer A und nachfolgend bis zum Erreichen eines
pH-Wertes von 6.5 in 1x Puffer A gewaschen und gelagert.
27
3. Material & Methoden
Ein Zellpellet aus 1 Liter E. coli Expressionskultur wurde in 15 ml Lysepuffer resuspendiert
und homogenisiert (Glashomogenisator, Fortuna W.G.C.). Der Zellaufschluss erfolgte durch
dreimalige Lyse mit einer FRENCH® Pressure Cell Press (THERMO IEC). Um lösliche von
unlöslichen Zellbestandteilen zu trennen, wurde das Rohlysat für 30 min bei 4°C und
15.000 rpm zentrifugiert (SS34, Sorvall RC5C). Der lösliche Proteinüberstand wurde mit stark
verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 6.5 eingestellt und anschließend mit kaltem
A. bidest so lange verdünnt, bis die Konduktivität der Lösung zwischen 1.1 und 1.2 mS/m lag.
Dieser Überstand wurde mit dem vorbehandelten P11-Material für 2 h bei 4°C unter
Schwenken inkubiert. Anschließend wurde das beladene P11-Material in eine HPLC-Säule
gepackt (Biological Workstation, BioRad) und die Proteine über einen linearen Salzgradienten von 0-100% Puffer B in Puffer A eluiert. Die Elution wurde in Einzelfraktionen
aufgefangen (Fraction Collector, BioRad) und die Fraktionen über SDS-PAGE auf Reinheit des
Zielproteins untersucht.
Programmparameter (Programm für Reinigung von PKA-Cα aus 6 L E. coli Kultur):
BioRad Biological Workstation
Gradientenpumpe: 1ml/min
Inlet A: 100 %, Inlet B: 0 %
Druck: 0 - 100 psi
UV Detektion: an
Konduktivität: 200 mS/cm
UV Bereich: 1.0
SV3-2 at part 1, AV7-3 at part 4
Methode: 071004 Oli:
Fraktionen 120-340 à 3 ml
Volumen (Puffer A): 3x 40 ml = 120 ml
Volumen (Puffer A): 81-19% 2x 40 ml = 80 ml
Volumen (Puffer B): 0-100% 1x 40 ml = 40 ml
Lysepuffer:
30 mM
1 mM
50 mM
5 mM
MES (pH 6,5)
EDTA
KCl
β-Mercaptoethanol
1x Puffer B:
30 mM
1 mM
400 mM
5 mM
MES (pH 6,5)
EDTA
KPO4
β-Mercaptoethanol
10x Puffer A:
300 mM
10 mM
50 mM
MES (pH 6,5)
EDTA
β-Mercaptoethanol
28
3. Material & Methoden
3.3.3 Reinigung von PKA-Cα mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie
Für die Reinigung von PKA-Cα über PKI5-24-Affinitätschromatographie nach Olsen und Uhler
wird die außerordentlich hohe Affinität von PKA-Cα zu dem Proteinkinaseinhibitor PKI
genutzt (Olsen et al. 1989).
Kopplung von PKI5-24 an eine Dextranmatrix
Für die Herstellung einer Affinitätmatrix wurde ein 20 Aminosäuren langes synthetisches
Peptid PKI5-24 (TTYADFIASGRTGRRNAIHD, GL Biochem) über NHS-Chemie an Affigel 10
(Biorad) gekoppelt. 5 ml Affi-Gel 10 wurden in A. bidest und 50 mM HEPES äquilibriert. 5 mg
PKI5-24-Peptid, gelöst in 5 ml 50 mM HEPES, pH 6.5, wurden für 4 h bei 4°C und 30 rpm
(Stuard Rotator SB3) inkubiert. Nach dem Entfernen des ungebundenen Peptids wurden
freie Bindestellen durch Zugabe von 500 µl 1 M Ethanolamin-Lösung, pH 8.5 blockiert (1,5 h
bei 22°C und 30 rpm). Abschließend wurde die PKI5-24-Affinitätsmatrix je zwei Mal mit 50 mM
HEPES, A. bidest, und TMN50 gewaschen. Die Lagerung erfolgte bei 4°C in TMN50 Puffer.
Reinigung rekombinanter PKA-Cα aus E. coli Zellen mittels einer PKI5-24-Affinitätsmatrix
Ein Zellpellet aus 1 Liter E. coli Kultur wurde in 15 ml Lysepuffer 1 resuspendiert, homogenisiert (Glashomogenisator, Fortuna W.G.C.) und die Zellen über French Press lysiert. Der
lösliche Proteinüberstand wurde über Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 15.000 rpm
(SS34, Sorvall RC5C) von den unlöslichen Zellbestandteilen abgetrennt. Nach Zugabe von
3 mM ATP und 5 mM MgCl2 wurde der Proteinüberstand auf die in TMN50-Puffer
äquilibrierte PKI5-24-Affinitätsmatrix gegeben und für 2 h bei 4°C und 30 rpm (Stuard Rotator
SB3) inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen der PKI5-24-Affinitätsmatrix mit
dem vierfachen Säulenvolumen TMN50 + 400 µM ATP und dem sechsfachen Säulenvolumen
TMN250 + 400 µM ATP entfernt. Die Elution erfolgte mit dem fünffachen Säulenvolumen in
1 ml Mobicol-Säulen (Mobitec). Elutionspuffer 1 wurde für weitere biochemische Charakterisierungen des Proteins genutzt, in den MS-kompatiblen Elutionspuffer 2 wurden die
Proteine für die massenspektrometrische Bestimmung des Molekulargewichtes eluiert.
Reinigung endogener PKA-Cα aus Säuger-Gewebe mittels einer PKI5-24-Affinitätsmatrix
50 g Säugergewebe wurden zerkleinert, im Verhältnis 1:2 mit Lysepuffer 2 versetzt und
fünfmal für jeweils 1 min homogenisiert (Waring Blendor, MAGV GmbH). Nach erstmaliger
29
3. Material & Methoden
Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 13.000 rpm (GSA, Sorvall RC5C) wurde der lösliche
Proteinüberstand für weitere 30 min bei 4°C und 15.000 rpm (SS34, Sorvall RC5C)
zentrifugiert, um alle unlöslichen Zellbestandteile vollständig zu entfernen. Nach Zugabe von
3 mM ATP, 5 mM MgCl2 und 100 µM cAMP wurde der Proteinüberstand auf die in TMN50Puffer äquilibrierte PKI5-24-Affinitätsmatrix gegeben und für 2 h bei 4°C und 30 rpm (Stuard
Rotator SB3) inkubiert. Alle weiteren Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Lysepuffer 1:
50 mM
50 mM
2 mM
50 µl/g Zellen
Lysepuffer 2:
50 mM
50 mM
2 mM
1%
1 Tablette/ml
TMN 50:
50 mM
50 mM
2 mM
Tris-HCl (pH 7,4)
NaCl
MgCl2
Proteaseinhibitormix
(Sigma #P8849)
Tris-HCl (pH 7,4)
NaCl
MgCl2
Triton-X-100
Proteaseinhibitor
(Sigma, cOmplete)
Tris-HCl (pH 7,4)
NaCl
MgCl2
TMN 250:
50 mM
250 mM
2 mM
Tris-HCl (pH 7,4)
NaCl
MgCl2
Elutionspuffer 1:
50 mM Tris-HCl (pH 7,4)
50 mM NaCl
1 mM EDTA
200 mM Arginin
Elutionspuffer 2:
5 % ACN
0,1 % FA
3.3.4 Pulldown Experimente mittels PKI5-24-Affinitätsmatrices
Für die Untersuchung der Bindung von mutagenisierten PKA-Cα Untereinheiten an den
Proteinkinaseinhibitor PKI wurden Pulldown Experimente mit PKI5-24-Affinitätsmatrices
durchgeführt. Neben PKA-Cα wurde Rinderserumalbumin (BSA) als Kontrollprotein für den
Nachweis unspezifischer Bindung verwendet. Beide Proteine wurden in TMN50 Puffer
dialysiert (D-TubeTM Dialyzers Mini MWCO 12-14 kDa, Novagen). In Ansatz 1 wurden 50 µg
PKA-Cα und äquimolaren Mengen an BSA mit 50 µl PKI5-24-Affinitätsmatrix für 2 h bei 4°C
und 30 rpm (Stuard Rotator SB3) in Gegenwart von 3 mM ATP und 5 mM MgCl2 inkubiert. In
Ansatz 2 (Kontrollansatz für den Nachweis unspezifischer Bindung an die Agarosematrix)
wurden beide Proteine mit Ethanolamin behandeltem Affigel 10 (Biorad) inkubiert. Nach
zwei Waschschritten, wie in 3.3.3 beschrieben, wurden die gebundenen Proteine durch
Inkubation in 50 µl Elutionspuffer 1 für 30 min bei 4°C und 30 rpm (Stuard Rotator SB3)
eluiert. Die Matrices wurden ein weiteres Mal mit TMN250 + 400 µM ATP gewaschen und
die auf der Matrix verbliebenen Proteine direkt in 50 µl 2x SDS-Probenpuffer denaturiert.
30
3. Material & Methoden
Das Ergebnis des Pulldown Experimentes wurde über SDS-PAGE visualisiert. Die SDS-PAGE
Gelproben wurden jeweils im Verhältnis 1:2 mit 2x SDS-Probenpuffer versetzt und für 10 min
bei 105°C denaturiert.
3.3.5 Reinigung von PKA-Cα mit Histidin-Fusionanteil mittels Metallionen-Affinitätschromatographie
Katalytisch inaktive PKA-Cα (His6- PKA-Cα K72H, His6- PKA-Cα S53D) wurden N-terminal mit
einem Hexahistidin-Fusionsanteil versehen und über Metallionen-Affinitätschromatographie
gereinigt: Ein Zellpellet aus 1 Liter E. coli Kultur wurde in 15 ml Lysepuffer resuspendiert,
homogenisiert (Glashomogenisator, Fortuna W.G.C.) und die Zellen über French Press lysiert.
Der lösliche Proteinüberstand wurde über Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 15.000 rpm
(SS34, Sorvall RC5C) von den unlöslichen Zellbestandteilen abgetrennt. Der Proteinüberstand
wurde mit 500 µl HI--Select Cobalt Affinity Gel (Sigma, #H8162) für 2 h bei 4°C und 30 rpm
(Stuard Rotator SB3) inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen der
Co2+-Affinitätsmatrix mit dem 60 fachen Säulenvolumen Lysepuffer und dem 90 fachen
Säulenvolumen Waschpuffer entfernt. Die Elution erfolgte mit dem fünffachen Säulenvolumen in 1 ml Mobicol-Säulen (Mobitec). Für das Entfernen des hochkonzentrierten
Imidazols erfolgte ein Pufferaustausch mittels Gelfiltration (PD10-Säule, GE Healthcare) in
Lagerpuffer 1 (biochemische Charakterisierungen) bzw. Lagerpuffer 2 (MS Analyse).
Lysepuffer:
50 mM
300 mM
10 mM
5 mM
50 µl/g Zellen
Elutionspuffer:
50 mM
300 mM
250 mM
5 mM
NaH2PO4 (pH 8,0)
NaCl
Imidazol
β-Mercaptoethanol
Proteaseinhibitormix
(Sigma #P8849)
NaH2PO4 (pH 8,0)
NaCl
Imidazol
β-Mercaptoethanol
Waschpuffer:
50 mM
300 mM
20 mM
5 mM
NaH2PO4 (pH 8,0)
NaCl
Imidazol
β-Mercaptoethanol
Lagerpuffer 1
20 mM
150 mM
5 mM
MOPS (pH 7,0)
NaCl
β-Mercaptoethanol
Lagerpuffer 2:
5 % ACN
0,1 % FA
31
3. Material & Methoden
3.3.6 Reinigung von PKA-Cα in Form eines Holoenzymkomplexes mittels MetallionenAffinitätschromatographie
Um PKA-Cα in Form eines Holoenzymkomplexes zu reinigen wurden nach Hemmer et al.
E. coli
Zellen
mit
zweierlei
DNA-Konstrukten
(pRSETb-mur PKA-Cα
und
pET30a-
hum His6- PKA-RIIα G337E) cotransformiert und PKA-Cα und PKA-RIIα in 1 Liter Kulturen
coexprimiert (Hemmer et al. 1997a). Zellaufschluss, Inkubation mit HIS-Select Nickel Affinity
Gel (Sigma, #P6611), Waschschritte der Matix und Elution der Proteine wurden wie unter
3.3.5 beschrieben, durchgeführt. Mittels hoher Konzentration an cAMP im Elutionspuffer
wurde die PKA-Cα Untereinheit aus dem immobilisierten Holoenzymkomplex gelöst und
eluiert.
Lysepuffer:
50 mM
5 mM
50 µl/g Zellen
Elutionspuffer:
50 mM
10 mM
25 mM
5 mM
NaH2PO4 (pH 8,0)
β-Mercaptoethanol
Proteaseinhibitormix
(Sigma #P8849)
Waschpuffer:
50 mM
25 mM
5 mM
NaH2PO4 (pH 8,0)
KCl
β-Mercaptoethanol
NaH2PO4 (pH 8,0)
cAMP
KCl
β-Mercaptoethanol
3.3.7 Reinigung der zellfrei-exprimierten PKA-Cα mittels NTA-Magnetic Beads
Die Reinigung der zellfrei exprimierten PKA-Cα wurde von Matthias Knape im Rahmen seiner
Diplomarbeit durchgeführt (Knape 2010): Als zellfreies Expressionssystem wurde das RTS100
E. coli HY Kit (Roche) genutzt, um PKA-Cα in einer in vitro Proteinsynthese herzustellen. Nach
Herstellerangaben wurde das Plasmid pET15b-mur His6- PKA-Cα verwendet um bei 30°C für
4 h Protein zu exprimieren (Roche 2007). Das mit Histidin-Fustionsanteil versehene Protein
wurde über 15 µl preäquilibrierte NTA Magnetic Beads (Qiagen) isoliert. Nach 1 h Inkubation
wurden die Magnetic Beads dreimal mit je 100 µl Waschpuffer gewaschen. Für den
Nachweis
einer
Autophosphorylierung
wurde
das
immobilisierte
Protein
in
Phosphorylierungspuffer A für 3 h bei 30°C inkubiert. Die Phosphorylierung mit PDK-1 wurde
nach Cheng et al. in Phosphorylierungspuffer B für 45 min bei 30° durchgeführt (Cheng et al.
1998). Anschließend wurden die Beads weitere dreimal mit je 100 µl Waschpuffer
gewaschen. Für die Untersuchung über SDS-PAGE wurde das immobilisierte Protein direkt in
32
3. Material & Methoden
30 µl 2x SDS-Probenpuffer (10 min 105°C) denaturiert. Für die massenspektrometrische
Bestimmung des Molekulargewichtes erfolgte eine Inkubation der NTA Magnetic Beads für
30 min in 200 µl 5 % ACN, 0.1 % FA inkubiert. Der Proteinüberstand wurde anschließend auf
20 µl eingeengt (Vakuumzentrifuge, Thermo Electron Corporation).
Waschpuffer:
50 mM
300 mM
10 mM
5 mM
NaH2PO2 (pH 8,0)
NaCl
Imidazol
β-Mercaptoethanol
Phosphorylierungspuffer A:
20 mM MOPS (pH 7,0)
150 mM NaCl
100 µM ATP
10 mM MgCl2
5 mM β-Mercaptoethanol
Phosphorylierungspuffer B:
50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
10 mM NaCl
25 µM ATP
10 mM MgCl2
1 mM Benzamidin
0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
1 mM DTT
10 % Glycerol
3.3.8 Auftrennung von PKA-C Phosphoformen mittels Mono-S-Chromatographie
Die Mono-S-Chromatographie wurde von Diana Lang im Rahmen ihrer Diplomarbeit
durchgeführt (Lang 2008): Für das über Kationenaustauscherchromatographie vorgereinigte
Protein (s. 3.3.2) erfolgte zunächst ein Pufferaustausch über eine Gelfiltrationssäule
(PD10-Säulen, GE Healthcare) in Laufpuffer A. Die Auftrennung von rekombinanter PKA-Cα in
ihre Phosphoformen erfolgte mit einer Mono-S 5/5-Säule (Amersham) über eine FPLCAnlage (Pharmacia Biotech) (Herberg et al. 1993a; Yonemoto et al. 1993a). Bei einer
konstanten Flussrate von 2 ml/min (Gradient von 0-35 % Laufpuffer B) wurden je 1 ml
Einzelfraktionen gesammelt und über SDS-PAGE und MS Analyse untersucht.
Laufpuffer A:
20 mM
BisTrisPropan (pH 8,6)
Laufpuffer B:
20 mM
1M
BisTrisPropan (pH 8,6)
KCl
3.3.9 Reinigung von mit GST-Fusionsanteil versehenen Phosphatasen mittels GlutathionAgarose
Mit GST fusionierte Proteinphosphatasen GST-hPP5 und GST-λ-PP wurden in E. coli
exprimiert und über Protino® Glutathione Agarose 4B (Macherey-Nagel) nach der in 3.3.3
beschriebenen Methode der Affinitätschromatographie in 1 ml Mobicol-Säulen (Mobitec)
gereinigt. Für das Entfernen des freien Glutathions erfolgte ein Pufferaustausch mittels
Gelfiltrationssäule (PD10-Säulen, GE Healthcare) in Lagerpuffer.
33
3. Material & Methoden
Lyse-/ Waschpuffer (1x PBS):
1,8 mM KH2PO4 (pH 7,3)
10 mM Na2HPO4
140 mM NaCl
2,7 mM KCl
50 µl/g Zellen Proteaseinhibitormix
(Sigma #P8849)
Lagerpuffer:
50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
0,1 mM EGTA
50 % Glycerol
3.4
Elutionspuffer:
50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
10 mM Glutathion
Biochemische Methoden
3.4.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die
eindimensionale
biochemische
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Methode,
um
Molekulargewicht,
Reinheit
(1-D-SDS-PAGE)
oder
ist
eine
Komplexität
von
Proteingemischen zu untersuchen. Proteinproben wurden 1:2 in 2x SDS-Probenpuffer oder
1:5 in 5x SDS-Probenpuffer aufgenommen und für 10 Minuten bei 105°C denaturiert. Die
negative Ladung der SDS-Proteinkomplexe sorgt dabei für eine vom Molekulargewicht
abhängige Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld (Laemmli 1970). Sammel- und
12 %ige Trenngele für die diskontinuierliche SDS-PAGE wurden nach Sambrook et al. 2001
hergestellt. Für die Bestimmung des Molekulargewichts wurde der Proteingrößenstandard
PageRulerTM Unstained Protein Ladder (#SM0661, Fermentas) verwendet. Die Gelelektrophorese wurde mit einem Mini-PROTEAN Tetra Cell Electrophoresis System (BioRad)
durchgeführt und lief für 1 h bei 200 V, 30 mA und 12 W bei 22°C in 1x Laufpuffer.
Anschließend wurde das Gel für 90 sek in A. bidest. in einer Mikrowelle aufgekocht und für
10 min bei 22°C unter Schwenken (GLF® 3013) abgekühlt. Die Färbung in kolloidaler
Coomassie-Färbelösung erfolgte entweder mittels Erhitzen für 90 sek in der Mikrowelle
(Schnellfärbung) oder bei 22°C über Nacht. Entfärbt wurden die Gele über Nacht in A. bidest.
Zur Dokumentation wurden die Gele photographiert (Gel Jet Imager, INTAS).
10x Laufpuffer:
25 mM Tris-HCl (pH 8,3)
192 mM Glycin
0,1 % SDS
Kolloidale Coomassie-Färbelösung:
0,1 % Comassie Brilliant Blue G250
2 % Phosphorsäure
5 % Aluminiumsulfat
34
3. Material & Methoden
2x SDS-Probenpuffer:
20 mM Tris-HCl (pH 6,8)
10 % SDS
20 % Glycerol
0,001 % Bromphenolblau
10 % β-Mercaptoethanol
5x SDS-Probenpuffer:
310 mM Tris-HCl (pH 6,8)
10 % SDS
50 % Glycerol
0,5 % Bromphenolblau
10 % β-Mercaptoethanol
3.4.2 Auftrennung von Phosphoproteinen mittels Phos-tagTM SDS-PAGE
Für das Auftrennen von Phosphoproteinen in Polyacrylamidgelen wurde die Phosphataffinitäts-SDS-PAGE (Kinoshita et al. 2007; Kinoshita et al. 2008; Kinoshita-Kikuta et al. 2010)
verwendet: Einem Polyacrylamidgel wird ein zweiwertiger Metallionenkomplex Phos-tagTM
(AAL-107; MW: 595 Da, Wako) als Copolymer hinzugefügt, der Phosphatgruppen an Serin-,
Threonin- und Tyrosin-Seitenketten binden kann und somit ein unterschiedliches Laufverhalten von Phosphoproteinen erzeugt. Die Phos-tagTM SDS-PAGE ermöglicht die
Unterscheidung von phosphoryliertem zu unphosphoryliertem Protein, aber auch die
Auftrennung verschiedener Phosphoformen eines Proteins, die sich in Anzahl und
Lokalisation der P-Stellen unterscheiden. Die optimalen Elektrophorese-Bedingungen, wie
Konzentration von Acrylamid und Phos-tagTM (5 µM–100 µM) sind von dem Molekulargewicht des zu analysierenden Proteins sowie der Anzahl der untersuchten P-Stellen
abhängig. Für eine optimale Bandenauftrennung der Phosphoformen der PKA-Cα wurde das
Trenngel mit 7,5 % Acrylamid und 100 µM Phos-tagTM hergestellt (s. Tab. 5). Die Gelelektrophorese erfolgte für 50 min bei 30 mA pro Gel im Mini-PROTEAN Tetra Cell Electrophoresis
System (BioRad) (s. 3.4.1). Für die Fixierung der Proteine wurden die Gele für 10 min in
Fixierlösung inkubiert, danach für 2 h in kolloidaler Comassie-Färbelösung angefärbt und bis
zur vollständigen Entfärbung des Hintergrundes in Entfärbelösung inkubiert.
TM
Tab. 5: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgelen für eine Phos-tag
Trenngel
H2O
30 % Acrylamidemix
1,5 M Tris (pH 8,8)
10 % SDS
TM
5 mM Phos-tag
10 mM MnCl2
10 % APS
TEMED
SDS-PAGE.
finale
Konzentration
1 Gel
[5 ml]
Sammelgel
7,5 %
375 mM
0,1 %
0,1 mM
0,2 mM
0,14 %
0,56 %
2,15
1,25
1,25
0,05
0,1
0,1
0,071
0,028
H2O
30 % Acrylamidemix
1 M Tris (pH 6,8)
10 % SDS
10 % APS
TEMED
finale
Konzentration
1 Gel
[2 ml]
5%
125 mM
0,1 %
0,1 %
0,01 %
1,4
0,33
0,25
0,02
0,02
0,002
35
3. Material & Methoden
Fixierlösung:
10 %
40 %
Essigsäure
Methanol
Entfärbelösung:
10 % Essigsäure
25 % Methanol
3.4.3 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
Die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford beruht auf der Bindung des
Triarylmethanfarbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 an die hydrophoben Bereiche eines
Proteins, wodurch sich das Adsorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 nm nach 595 nm
verschiebt (Bradford 1976). Nach dem Lambert-Beer’schen kann über diese Adsorption eines
Stoffes die zugehörige Konzentration bestimmt werden. Da es sich um ein relatives
Verfahren handelt, wurden eine zuvor aufgenommene Eichgerade mit bekannten
Konzentrationen des Proteinstandards Rinderserumalbumin (BSA) für die Konzentrationsbestimmung verwendet.
Die Konzentrationsbestimmung wurde in 1 ml Kunststoff-Einmal-Küvetten (Sarstedt)
durchgeführt. Das konzentrierte Bradford-Reagenz (BioRad) wurde im Verhältnis 1:5 mit
A. bidest und den Proteinproben in einem Endvolumen von 1 ml gemischt. Nach einer
Inkubationszeit von 15 min unter Lichtausschluss bei 22°C wurden die Proben bei 595 nm im
Zweistrahlphotometer (Specord 205, Analytik Jena) gegen einen Nullstandard vermessen.
Alle Proteinkonzentrationen wurden in Dreifachbestimmungen ermittelt.
3.4.4 Bestimmung der spezifischen Aktivität von PKA-Cα mittels eines spektrophotometrischen Aktivitätstests (Cook-Assay)
Für die Bestimmung der spezifischen Aktivität der PKA-Cα wurde der spektrophotometrische
Aktivitätsassay nach Cook et al. verwendet (Cook et al. 1982): Über drei 1:1 stöchiometrisch
ablaufende und enzymatisch miteinander gekoppelte Reaktionen wird indirekt die
Phosphorylierung des synthetischen Peptidsubstrates Kemptide (LRRASLG) vermessen: Das
bei der Phosphorylierung von Kemptide verbrauchte ATP wird in der nachfolgenden
Reaktion regeneriert, indem ADP und Phosphoenolpyruvat (PEP) durch eine Pyruvatkinase
zu ATP und Pyruvat umgesetzt werden. In einem dritten Reaktionsschritt wird das
entstandene Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) bei Anwesenheit des Kosubstrates
NADH+H+ zu Laktat und NAD+ oxidiert. Dieser letzte Schritt ist bei einer Wellenlänge von
340 nm messbar, da NADH+H+ bei 340 nm Licht absorbiert, das oxidierte NAD+ jedoch nicht.
36
3. Material & Methoden
Über die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit kann somit nach dem Lambert-Beer´schen
Gesetz die spezifische Aktivität der PKA-Cα wie folgt berechnet werden (s. Formel).
ΔE340/min:
Änderung der Extinktion bei 340 nm pro Minute
VG:
Gesamtvolumen (in μl)
VPKA-Cα:
Volumen der PKA-Cα (in μl)
εNADH+H+:
Extinktionskoeffizient von NADH + H bei 340 nm (6,28 x 10 L/mol cm)
cPKA-Cα:
Massenkonzentration der eingesetzten PKA-Cα (in mg/ml)
d:
Schichtdicke der Küvette (Photometer: 1 cm; Fusion : 0,64 cm)
[U/mg]:
Einheit der spezifischen Aktivität: Units/mg Enzym (1 Unit = µmol Substratumsatz/min)
+
3
TM
Durchführung des Cook-Assay im Zweistrahlphotometer
Für die Bestimmung der spezifischen Aktivität im Zweistrahlphotometer (Specord 205,
Analytik Jena) wurden pro Ansatz 100 µl 1x Assay-Mix mit 20 nM PKA-Cα in einer
Quarzküvette (QS 1.000, Hellma) gemischt. Gestartet wurde die Reaktion durch Zugabe von
260 µM Kemptide (Biosyntan). Die Veränderung der Extinktion bei 340 nm wurde bei 22°C
gegen eine Referenzprobe mit A. bidest für 30 sek mit Messintervallen von 0,5 sek verfolgt.
Für Untersuchungen der Inhibition der PKA-Cα durch PKA-R oder PKI wurden verschiedene
Ansätze mit 20 nM PKA-Cα in Gegenwart ansteigender Inhibitor-Konzentrationen (in der
Regel von 1 nM–50 nM) vermessen. Für eine Aktivierung des PKA-Holoenzyms wurden nach
2 min Vorinkubation 10 µM cAMP zugegeben. Die Auswertung der Messparameter erfolgte
mit GraphPadPrism 5.01.
1x Assay Mix:
100 mM
10 mM
1 mM
1 mM
15 U/ml
8,4 U/ml
0,2 mM
5 mM
MOPS (pH 7,0)
MgCl2
Phosphoenolpyruvat
ATP
Laktatdehydrogenase
Pyruvatkinase
NADH
β-Mercaptoethanol
37
3. Material & Methoden
Durchführung des Cook-Assay im Mikrotiterformat am FusionTM
Der Cook-Assay im Mikrotiterformat am FusionTM (Universal Microplate Analyzer mit NADH
Filter, Packard BioSciences GmbH) wurde für Titrationen der PKA-Cα in Gegenwart
ansteigenden Inhibitor-Konzentrationen (in der Regel von 1 nM–50 nM) verwendet. In einer
Messung konnten parallel bis zu zwölf unterschiedliche Konzentrationen in Doppelbestimmung nebeneinander vermessen werden. Der 2x Assay-Mix wurde nach Moll 2003
leicht modifiziert: Die NADH+H+ Konzentration wurde erhöht, um eine zum Photometer
vergleichbare Absorption von ca. 1,0 zu gewährleisten. Aufgrund der längeren Messdauer
wurde als zusätzliche Komponente BSA zum Blockieren von unspezifischer Bindung an die
Mikrotiterplatten zugegeben und außerdem die Kemptide-Konzentration leicht erhöht. Pro
Ansatz wurden 10 nM PKA-Cα mit verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen in einer
Mikrotiterplatte (96 well NBS plate clear, #3641, Corning) mit 100 µl 2x Assay-Mix gemischt.
Gestartet wurde die Reaktion durch Zugabe von 290 µM Kemptide (Biosyntan). Die Messung
erfolgte in einem Endvolumen von 200 µl in 1x Assay-Mix.
Die Veränderung der Extinktion bei 340 nm wurde bei 22°C für 2 Reihen mit jeweils 12 Wells
vermessen. Jedes einzelne Well wurde innerhalb einer 12 minütigen Messung 24 mal im
Abstand von jeweils 24 sek gemessen. Nach jeweils einem Messzyklus wurde die
Mikrotiterplatte automatisch geschüttelt. Die Auswertung der Messparameter erfolgte
mittels einer Excel-Vorlage nach Moll 2003 und GraphPadPrism 5.01.
2x Cook-Assay-Mix:
200 mM MOPS (pH 7,0)
20 mM MgCl2
2 mM Phosphoenolpyruvat
2 mM ATP
30 U/ml Laktatdehydrogenase
16,8 U/ml Pyruvatkinase
0,6 mM NADH
0,03 mM BSA
10 mM β-Mercaptoethanol
3.4.5 Bestimmung der spezifischen Aktivität und Substratspezifität von PKA-Cα mittels
eines chip-basierten microfluidic mobility-shift Assays
Die spezifische Aktivität sowie die Substratspezifität der PKA-Cα wurden mittels eines hochempfindlichen microfluidic mobility-shift Assay (Caliper EZ Reader; Caliper Life Sciences)
bestimmt: In einem Mikrochip werden dabei ein fluorenzenzmarkiertes Substrat und sein
38
3. Material & Methoden
phosphoryliertes Produkt elektrophoretisch voneinander getrennt und über LED induzierte
Fluoreszenz detektiert. Über den Quotienten der Signalintensitäten aus [Produkt] zu der
Summe aus [Produkt und Substrat] kann der Substratumsatz pro Zeit ermittelt werden
(CaliperLS 2007).
Nachweis der spezifischen Aktivität
Die Phosphorylierungsreaktion fand bei 30°C in 20 µl Ansätzen in einer 384 WellMikrotiterplatte (low volume non-binding surface, Corning LV) statt (off-chip mode): Nach
Verdünnung in Puffer 1 wurde PKA-Cα direkt in der Mikrotiterplatte im Verhältnis 1:2 mit
Puffer 2 versetzt. Acht unterschiedliche Konzentrationen in einem Bereich von 9 pM bis
700 nM Enzym (1:5 Verdünnungsschritte) wurden jeweils in Doppelbestimmung vermessen.
Als Substrat wurde das Heptapeptid Kemptide verwendet (90 µM nicht-markiertes Kemptide
(EZBiolab) und 10 µM FITC-Kemptide/FITC-ACP-LRRASLG (BIAFFIN GmbH & Co KG)). In
Kontrollansätzen wurden 45 pM PKA-Cα bzw. nur Puffer eingesetzt. Die Messung erfolgte für
2 h im Caliper EZ Reader (Caliper Life Sciences) bei einem Druck von -1,1 psi, upstream
voltage von -2.250 V, downstream voltage von -150 V, einer sample sip time von 0,2 sek bei
einem Anregungslevel von 100 % und einer Detektionsrate von 10 Hz.
Über den ermittelten prozentualen Substratumsatz wurde zunächst die absolute Stoffmenge
an phosphoryliertem Kemptide bestimmt. Für die Berechnung der spezifischen Aktivität
wurde die absolute Stoffmenge an Kemptide [in mol] durch die für den Substratumsatz
benötigte Zeit [in min] und die eingesetzte Menge an PKA-Cα [in mg] dividiert. Die
Auswertung der Messparameter erfolgte mit GraphPadPrism 5.01.
Nachweis der Substratspezifität für die synthetischen Heptapeptide LRRASLG und LRRATLG
Der Substratumsatz wurde indirekt über die Kompetitioneffizienz von unmarkiertem
Kemptide gegenüber dem fluoreszenzmarkiertem FITC-Kemptide (10 bzw. 1 µM, BIAFFIN
GmbH & Co KG) bestimmt. Als unmarkierte Peptide wurden (LRRASLG, S-Kemptide,
100 µM, EZBiolab) sowie das Threonin-enthaltende Derivat (LRRATLG, T-Kemptide,
5 mM, EZBiolab) verwendet.
Die Phosphorylierungsreaktion fand bei 30°C in 20 µl Ansätzen in einer 384 WellMikrotiterplatte (low volume non-binding surface, Corning LV) statt (off-chip mode). Pro
Ansatz wurden 50 pM PKA-Cα mit der entsprechenden Menge an markierten und nicht39
3. Material & Methoden
markierten Kemptide in Puffer 1 in der Mikrotiterplatte gemischt und in Doppelbestimmung
untersucht. Die Einstellung der Messungparameter und die Auswertung erfolgten wie oben
beschrieben.
TM
TM
Laufpuffer (Caliper ):
Electrode Working Solution
Seperations-Puffer (Caliper ):
100 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM EDTA
5 % DMSO
0,015% Brij 35
0,5 % Coating Reagenz 8
0,1 % Coating Reagenz 3
Puffer 1:
50 mM
100 mM
10 mM
1 mM
0,1 mg/ml
1 mM
Puffer 2:
50 mM
100 mM
10 mM
1 mM
0,1 mg/ml
1 mM
180 µM
20 µM
MOPS (pH 7,0)
NaCl
MgCl2
ATP
BSA
DTT
MOPS (pH 7,0)
NaCl
MgCl2
ATP
BSA
DTT
Kemptide
FITC-Kemptide
3.4.6 Nachweis der PKA-Cα-Phosphorylierung mittels Westernblot Analyse
In Westernblot Analysen lassen sich Proteine in geringen Konzentrationen über Antikörperreaktionen nachweisen. Phosphospezifische Antikörper ermöglichen dabei die Detektion des
betreffenden Proteins nur für den Fall, dass das zugehörige Epitop phosphoryliert vorliegt.
Proteine werden zunächst über SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran übertragen.
Proteintransfer über das Semidry-Verfahren
Folgende Komponenten wurden zunächst in Transfer-Puffer getränkt und dann in einem
Semi-Dry Elektroblotter (Peqlab) Richtung Anode übereinander gestapelt: drei Zellulosefilterpapiere (0,92 mm, Whatmann), in Methanol aktivierte PVDF Membran (Immobilon-P,
0,45 µm, Millipore), das SDS-PAA-Gel sowie drei weiter Lagen Zellulosefilterpapier. Der
Proteintransfer erfolgte für 60 min und 100 mA pro Gel.
Transfer-Puffer:
25 mM
192 mM
0,1 %
20 %
Tris-HCl (pH 8,3)
Glycin
SDS
Methanol
40
3. Material & Methoden
Proteintransfer über das Wet-Blot Verfahren
Das Wet-Blot Verfahren wurde speziell für Phos-TagTM-SDS-PAA-Gele (s. 3.4.2) empfohlen,
um einen optimalen Transfer der Phosphoproteine zu gewährleisten. Zum Entfernen der
Mangan-Ionen wurden die Gele nach der SDS-PAGE für 10 min in Transferpuffer mit 1 mM
EDTA inkubiert, gefolgt von einem weiteren 10 minütigen Waschschritt in Transferpuffer
(Kinoshita-Kikuta et al. 2010). Folgende Komponenten wurden zunächst in Transferpuffer
getränkt und dann in die Transferkassette der Tank Blot Apparatur (Biorad) Richtung Anode
übereinander geschichtet: ein Schaumstoffschwamm, ein Zellulosefilterpapier (0,34 mm,
Whatmann), in Methanol aktivierte PVDF Membran (Immobilon-P; 0,45 µm, Millipore), das
SDS-PAA-Gel eine weitere Lage Zellulosefilterpapier sowie ein Schaumstoffschwamm. Der
Proteintransfer erfolgte für 60 min, 100 V und 350 mA pro Gel.
Transfer-Puffer:
25 mM Tris-HCl (pH 8,3)
192 mM Glycin
Immunodetektion der Proteine auf einer PVDF-Membran
Nach dem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran wurden verbliebene freie
Bindungsstellen durch Inkubation der Membran in Blockierlösung abgesättigt (60 min bei
22°C oder über Nacht bei 4°C). Anschließend wurde die Membran mit dem Primärantikörper
inkubiert (über Nacht bei 4°C), 3x 5 min in 1x TBS-T gewaschen, mit dem Peroxidasegekoppelten Sekundärantikörper inkubiert (60 min bei 22°C) und für weitere 3x 5 min in
1x TBS-T gewaschen.
Der Nachweis der immunreaktiven Proteine auf der PVDF-Membran erfolgte durch einen
Chemilumineszenz-Nachweis unter Lichtausschluss (ECL, Perkin ElmerTM). Über einen
Röntgenfilm (Hyperfilm, Amersham) wird bei dieser Reaktion eine Lichtemission registriert,
die durch die an den Sekundärantikörper immobilisierte Persoxidase katalysiert wird.
Anschließend wurde der Film für ca. 2 min in Entwicklerlösung (Tetenal Roentgen liquid)
getaucht, mit A. bidest gespült und für 2 min in Fixierlösung (Tetenal Superfix) inkubiert.
1x TBS-T:
20 mM
140 mM
0,1 %
Tris/HCl (pH 7,5)
NaCl
Tween 20
41
3. Material & Methoden
Blockierlösung A:
20 mM
140 mM
0,1 %
1%
Blockierlösung B: (für den Nachweis mit
phosphospezifischen Antikörpern)
Tris/HCl (pH 7,5)
NaCl
Tween 20
Magermilchpulver
20 mM
140 mM
0,1 %
1%
Tris/HCl (pH 7,5)
NaCl
Tween 20
BSA
Primärantikörper:
α-PKA-C:
PKAa cat (C-20) #cs-903 lot 109, Santa Cruz Biotechnology, Epitope C-Term.
1:10.000 in Blockierlösung A
α-PKA-C-pT197:
Phospho-PKA-C(Thr197) #4781, Cell Signaling
1:1.000 in 5 % BSA TBS-T
α-PKA-C-pS338:
Phospho-PKA-C(Ser338) #44-988, Invitrogen
1:1.000 in 3 % BSA TBS-T
Sekundärantikörper:
ECL α-rabbit HRP
ECL α-rabbit horseradish peroxidase #NA 9340, GE Healthcare
1: 10.000 in Blockierlösung A oder B
Entfernen der Antikörper von der PVDF-Membran
Um auf einer PVDF-Membran immobilisierte Proteine nacheinander gegen verschiedene
Antikörper zu entwickeln, wurde die Membran nach der Chemilumineszenz-Reaktion 15 min
in 1x TBS-T gewaschen und für 15 min in heißen Stripping-Puffer (1 min bei 580 W) unter
Schwenken (GLF® 3013) inkubiert. Nach dem Waschen der Membran für 2x 5 min in 1x TBS-T
wurde das Entfernen der Antikörper über einen erneuten Chemilumineszenz-Nachweis
überprüft und anschließend die Immunodetektion erneut mit Blockierlösung gestartet.
Stripping-Puffer:
25 mM Glycin (pH 2,2)
1 % SDS
3.4.7
(De-)Phosphorylierungsexperimente mit PKA-Cα Untereinheiten
Autophosphorylierung von PKA-Cα
In Autophosphorylierungsexperimenten wurden 1-10 µM PKA-Cα in Kinasepuffer für
verschieden lange Inkubationszeiten bei 30°C und 400 rpm inkubiert. Um katalytisch inaktive
PKA-Cα Untereinheiten zu phosphorylieren wurde in den Ansatz zusätzlich 0,5-5 µM
His6- PKA-Cα hinzugefügt.
42
3. Material & Methoden
Kinasepuffer:
20 mM
150 mM
1 mM
10 mM
MOPS (pH 7,0)
NaCl
ATP
MgCl2
Dephosphorylierung von PKA-Cα
0,5 µM PKA-Cα wurden mit 1-2 U verschiedener Serin/Threonin Proteinphosphatasen (PP)
nach den jeweiligen Herstellerangaben bei 30°C und 400 rpm inkubiert. Von den nicht
kommerziell erworbenen Phosphatasen GST-hPP5 und GST-λ-PP (s. 3.3.9) wurden einfach
bzw. zehnfach äquimolare Mengen im Bezug auf PKA-Cα eingesetzt. GST-hPP5 wurde durch
Zugabe von 100 µM Arachidonsäure aktiviert und durch Zugabe von 0,1-10 µM Okadasäure
inhibiert.
Phosphatase-Puffer:
PP1 (NEB):
2+
2,5 U/µl (1 U: 1 nmol/min), Mn abhängig
1x NEB Puffer (pH 7,0)
1 mM MnCl2
GST-hPP5:
20 mM
0,1 mM
0,1 mM
PP2A (Promega):
0,5 U/µl (1 U: 1 nmol/min)
10 mM Tris-HCl (pH 7,0)
GST-λ-PP:
2+
(Mn abhängig)
20 mM MOPS (pH 7,0)
150 mM NaCl
0,1 mM EGTA
2 mM MnCl2
PP2Cα (Biaffin):
2+
8U/µl (1 U: 1 nmol/min), Mg abhängig
10 mM Tris-HCl (pH 7,0)
2 mM MgCl2
Tris-HCl (pH 7,0)
EDTA
EGTA
CIAP (Roche):
20 U/µl (1 U: 1 µmol/min)
20 mM MOPS (pH 7,0)
150 mM NaCl
0,1 mM EGTA
1 mM MgCl2
3.4.8 Kinetische Analyse mittels Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) zur Untersuchung
der Interaktion zwischen PKA-Cα und PKI
Mithilfe optischer Massendetektoren (Biacore, GE Healthcare) wurde die Interaktion
zwischen einem immobilisierten Liganden (hier: GST-PKI) und einem Analyten in der Flussphase (hier: PKA-Cα) basierend auf dem Prinzip der Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR,
surface plasmon resonance) untersucht. Das dabei detektierte SPR Signal ist abhängig von
43
3. Material & Methoden
der Änderung des Brechungsindex in Folge der Wechselwirkung zwischen dem Analyten und
dem auf der Sensorchip-Oberfläche immobilisierten Liganden. Ein SPR Signal von 1.000 RU
(resonance units) entspricht einer Oberflächenkonzentration von 1 ng/mm2 (Stensberg et al.
1991).
Die Datenaufzeichnung erfolgte mit einer BIACORE 3000 sowie der zugehörigen Control
Software (Biacore, GE Healthcare). Zur Berechnung der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation (ka) und Dissoziation (kd) sowie für die Bestimmung der
Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD (KD = kd/ka) wurde die BIAevalution Software 4.1
(Biacore, GE Healthcare) unter Annahme eines Langmuir 1:1 Bindungsmodells verwendet.
Für die Vorbereitung des Sensorchips wurden α-GST-Antikörper auf einer Carboxymethyldextran 5-Oberfläche (CM5-Sensorchip, Biacore) gekoppelt, über die GST-PKI
nachfolgend als Ligand nicht-kovalent gebunden werden konnte (S. Möller, Universität
Kassel). Die Konzentration an GST-PKI wurde so gewählt, dass ein SPR-Signal von 100 RU zu
detektieren war. Wenn nicht anders angegeben, wurde PKA-Cα beginnend mit der
niedrigsten Konzentration (1.2 nM bis 900 nM in 1:3 Verdünnungsschritten) bei einer
Flussrate von 25 µl/min in Laufpuffer über Kinject injiziert. Die Bindungsstudien wurden in
An- und Abwesenheit von 1 mM ATP und 10 mM MgCl2 durchgeführt (Laufpuffer A und B).
Die Assoziation und Dissoziation wurde jeweils für 5 min verfolgt. Für die Regeneration
wurde die Sensoroberfläche dreimal mit 15 µl 10 mM Glycin pH 2,2 behandelt. Für jede
Messung wurde ein Messsignal von einer Liganden-freien nur mit Antikörper besetzten
Referenzflusszelle subtrahiert.
Für die Bestimmung der kinetischen Bindungskonstanten der in Gegenwart von
λ-Phosphatase exprimierten PKA-Cα (PKA-CαCoPP) wurde die beschriebene Methode
modifiziert, so dass ATP und MgCl2 maschinell-gesteuert direkt vor jedem einzelnen
Messzyklus mit PKA-Cα vermischt wurden (S. Möller, Universität Kassel).
Laufpuffer A:
20 mM
150 mM
0,005 %
0,05 mM
MOPS (pH 7,0)
NaCl
P20
EDTA
Laufpuffer B:
20 mM
150 mM
0,005 %
0,05 mM
1 mM
10 mM
MOPS (pH 7,0)
NaCl
P20
EDTA
ATP
MgCl2
44
3. Material & Methoden
3.4.9 Nachweis von Proteinaggregationen mittels analytischer Gelfiltration
Über analytische Gelfiltration kann das apparente Molekulargewicht und bei Kenntnis des
theoretischen Molekulargewichts auch der Oligomerisierungzustand bzw. das Aggregationsverhalten von Proteinen bestimmt werden. Mittels einer FPLC (fast pressure liquid
chromatography) Apparatur (Biological DuoFlow F10 Workstation, Biorad) wurden Proteine
über eine analytische Gelfiltrationssäule (Superdex 200 HR 10/30, Amersham/Pharmacia)
untersucht. Als Laufpuffer wurde 1x NaMOPS mit einer kontinuierlichen Flussrate von
0,8 ml/min verwendet. Die Proteine wurden über eine 125 µl Schleife injiziert und auf die
Säule aufgetragen. Die Proteindetektion erfolgte über einen UV-Detektor (UV280nm). Als
Kontrolle wurden die folgenden Proteinmarker verwendet: Dextran Blau zur Bestimmung
des Auschlussvolumens (2.000 kDa; 1,5 µM) sowie Ovalbumin (43 kDa, 70 µM) und BSA
(66 kDa, 45 µM) zum Eingrenzen des Molekulargewichtsbereichs der PKA-Cα (41 kDa).
Laufpuffer:
20 mM
150 mM
5 mM
3.5
MOPS (pH 7,0)
NaCl
β-Mercaptoethanol
Massenspektrometrische Methoden
3.5.1 Enzymatischer Verdau von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen
Der Protein-in-Gel-Verdau aus SDS-Polyacrylamidgelen erfolgte nach der Methode von
Shevchenko (Shevchenko et al. 1996). Die im SDS-PAA-Gel denaturierten Proteine wurden in
Form von Gelbanden zunächst von der Coomassie-Färbelösung entfärbt, Disulfidbrücken
durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) reduziert und die freien Cysteinreste durch
Carbamidomethylierung mit Iodacetamid (IAA) blockiert. Nach Entfernen der DTT/IAALösung wurden die Proteine durch Zugabe von Endoproteasen, z. B. Trypsin enzymatisch
verdaut. Alle Schritte wurden zum Schutz vor Kontamination mit Fremdproteinen unter der
Clean Bench (M.D.H. InterMed) durchgeführt.
Protein-in-Gel-Verdau (langes Protokoll, MPI Göttingen)
Die zu untersuchenden Polyacrylamidgelbanden wurden ausgeschnitten, zerkleinert und in
ein 0,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf) überführt. Die Gelstücke wurden in H2O (LiChrosolv)
gewaschen (5 min bei 26°C und 1.050 rpm, Thermomixer 5436, Eppendorf). Nach dem
45
3. Material & Methoden
Entfernen des Überstands erfolgte die Zugabe von 150 µl Acetonitril (ACN, LiChrosolv) (5 min
bei 26°C und 1.050 rpm). Der Überstand wurde entfernt und die Gelstücke für 5 min
getrocknet (Vakuumzentrifuge, Eppendorf). Unterbrochen durch Zentrifugationsschritte
(5 min 13.000 rpm, 5415R, Eppendorf) und Entfernen des Überstandes wurden die Gelstücke
mit den folgenden Lösungen behandelt: 100 µl DTT-Lösung (50 min bei 56°C und 1.050 rpm),
150 µl ACN (5 min bei 26°C und 1.050 rpm), 100 µl IAA-Lösung unter Lichtausschluss (20 min
bei 26°C und 1.050 rpm), 150 µl Puffer 1 (15 min bei 26°C und 1.050 rpm), 2x 150 µl ACN
(15 min bei 26°C und 1.050 rpm). Abschließend wurden die Gelstücke für 10 min getrocknet
(Vakuumzentrifuge, Eppendorf), in einem möglichst kleinen Volumen (ca. 20 µl) Verdaupuffer 1 rehydriert (30 min bei 4°C) und nach Zugabe von 10 µl Verdaupuffer 2 über Nacht
bei 37°C inkubiert. Für die Extraktion der Peptide aus der Gelmatrix wurden 15 µl H2O
(LiChrosolv) (15 min bei 37°C und 1.050 rpm) und anschließend zusätzlich 50 µl ACN (15 min
bei 37°C und 1.050 rpm) zu dem Verdauansatz gegeben und der Überstand (Überstand 1)
aufbewahrt. Die Gelstücke wurden mit 50 µl 5 % Ameisensäure (FA) (15 min bei 37°C und
1.050 rpm) und zusätzlich 50 µl ACN (15 min bei 37°C und 1.050 rpm) versetzt und der
Überstand 2 mit Überstand 1 vereinigt. Die Gelstücke wurden verworfen und der Überstand
für 2 h vollständig getrocknet (Vakuumzentrifuge, Eppendorf).
Für die massenspektrometrische Analyse wurden die getrockneten Peptide in 2 µl
50 % ACN/0,1 % FA (vortexen und 1 min Ultraschall-Behandlung, Bandelin Sonorex RK 100)
und 10 µl 0,1 % FA (vortexen und Ultraschall-Behandlung) resuspendiert.
Puffer 1:
100 mM
NH4HCO3 (pH 8,0)
DTT-Puffer:
100 mM
10 mM
NH4HCO3 (pH 8,0)
Dithiothreitol (DTT)
IAA-Puffer:
100 mM
55 mM
NH4HCO3 (pH 8,0)
Iodacetamid (IAA)
Verdau-Puffer 1:
40 mM NH4HCO3 (pH 8,0)
12,5 ng/µl Trypsin
4 mM CaCl2
Verdau-Puffer 2:
40 mM NH4HCO3 (pH 8,0)
4 mM CaCl2
Protein-in-Gel-Verdau (Kurzprotokoll)
In dieser Arbeit wurde ein modifiziertes Protokoll des oben beschriebenen Protein-in-GelVerdaus durchgeführt. In Anlehnung an „Fertig-in-Gel-Verdau-Säulen (OMX-S®) wurden wie
46
3. Material & Methoden
in Bertinetti et al. 2009 beschrieben selbsthergestellte Reaktionsgefäße verwendet, in denen
die Gelstücke über eine 10 µl Pipettenspitze optimal zerkleinert werden (s. Abb. 11). Auf die
Schritte - Entfärben der Gelstücke, Reduzieren der Disulfidbrücken und Blockieren der freien
Cysteinreste - wurde verzichtet.
Abb. 11: Zusammensetzung der selbsthergestellten
Reaktionsgefäße für den Protein-in-Gel-Verdau.
Die zu untersuchenden Polyacrylamidgelbanden wurden ausgeschnitten und in den
selbsthergestellten Reaktionsgefäßen für 5 min bei 13.000 rpm (5415R, Eppendorf)
zentrifugiert. Zu den zerkleinerten Gelstücken wurden 25 µl Verdau-Puffer gegeben und der
Ansatz für 1-3 h bei 50°C und 1.050 rpm inkubiert (Thermomixer 5436, Eppendorf). Der
Überstand wurde mit 25 µl 0,3 % FA versetzt und für die massenspektrometrische Analyse
verwendet.
Verdau-Puffer:
50 mM
10 ng/µl
NH4HCO3 (pH 8,0)
Trypsin
3.5.2 In-Lösungs-Verdau von Proteinen
Für den Verdau in Lösung wurden die Proteine (c = 0,5-1 mg/ml) zunächst in 25 mM
NH4HCO3 (pH 8,0) dialysiert (D-TubeTM Dialyzers Mini MWCO 12-14 kDa, Novagen). Nach
Denaturieren in 10 %ACN (10 min bei 22°C) wurde Trypsin (Stocklösung: 0,1 µg/µl) im
Verhältnis 1:50 (w/w) (Trypsin:Protein) zugegeben und der Ansatz für 5 h bei 50°C inkubiert.
In Abhängigkeit vom Volumen der Probe wurde die Peptidlösung direkt angesäuert und
massenspektrometrisch analysiert oder zunächst vollständig getrocknet (Vakuumzentrifuge, Thermo Electron Corporation) und die Peptide dann in 2 µl 50 % ACN/0,1 % FA
(vortexen und 1 min Ultraschall-Behandlung, Bandelin Sonorex RK 100) und 10 µl 0,1 % FA
(vortexen und Ultraschall-Behandlung) resuspendiert.
47
3. Material & Methoden
3.5.3 In-Lösungs-Verdau von Proteinen mittels FASP
Bei der FASP- (filter-aided sample preparation-) Methode wird der in-Lösungs-Verdau von
Proteinen um eine Filtereinheit ergänzt, die als Multireaktor funktioniert (Wisniewski et al.
2009): Neben dem Ankonzentrieren der Proteine kann ein Pufferaustausch oder das
Entfernen von Detergenzien oder anderen störenden niedermolekularen Sustanzen parallel
zu dem enzymatischen Verdau innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden. 50 µg PKACα in 50 mM NH4HCO3 wurden auf eine zuvor mit 50 mM NH4HCO3 preäqulibrierte
Filtereinheit (Microcon YM-10, 0,5 ml, MWCO 10 kDa) gegeben und für 30 min bei
13.000 rpm (5415R, Eppendorf) zentrifugiert. Nach zwei Waschschritten mit je 100 µl 50 mM
NH4HCO3 wurde Trypsin (Stocklösung: c = 0,1 µg/µl) im Verhältnis von 1:100 (w/w)
zugegeben und der Ansatz für 4 h bei 22°C inkubiert. Nach dem Verdau wurden die Peptide
über Zentrifugation gesammelt (10 min bei 13.000 rpm). Nach Zugabe von weiteren 100 µl
50 mM NH4HCO3 auf die Filtereinheit (10 min bei 13.000 rpm) wurden beide Durchläufe
vereinigt und vollständig getrocknet (Vakuumzentrifuge, Thermo Electron Corporation). Die
getrockneten Peptide wurden in 2 µl 50 % ACN/0,1 % FA (vortexen und 1 min UltraschallBehandlung, Bandelin Sonorex RK 100) und 10 µl 0,1 % FA (vortexen und UltraschallBehandlung) resuspendiert.
3.5.4 Anreicherung von Phosphopeptiden
Die Anreicherung von Phosphopeptiden über IMAC (immobilised metall affinity chromatography) beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den negativ geladenen
Phosphatgruppen und immobilisierten positiv geladenen Metallionen (Andersson et al.
1986). Neuere Arbeiten zeigen, dass die Ausbildung eines bidentalen Komplexes zwischen
teilweise chelatierten Metalloxiden, wie z. B. Titaniumdioxid (TiO2) und Phosphatgruppen
eine noch höhere Selektivität für die Anreicherung von Phosphopeptiden ermöglicht
(Zhou et al. 2008; Thingholm et al. 2009b). Mit dem Zusatz von 2,5-Dihydroxybenzosäure
(DHB) (Larsen et al. 2005), α-Hydroxysäure (Sugiyama et al. 2007) oder vorhergegangener
Maskierung der Carboxylgruppen über Methylester (Simon et al. 2008) konnte die
unspezifische Bindung saurer Peptide zusätzlich minimiert werden.
48
3. Material & Methoden
Anreicherung von Phosphopeptiden der PKA-Cα über IMAC ZipTip®-Spitzen (MILLIPORETM)
Die Anreicherung wurde über IMAC ZipTip®-Spitzen der Firma MILLIPORETM mit
verschiedenen Metallionen (Me: Fe3+-, Cu2+-, Ga3+-, Ni2+-Ionen) und den zwei Eluenten
NH4OH (Millipore 2001) und 5 % Phosphorsäure (PA)/50 % ACN (Imanishi et al. 2007)
verglichen. Das Äquilibrieren, Beladen und Waschen der ZipTip®-Spitzen wurde manuell
durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in einem 10 µl Volumen durchgeführt: Nach
Äquilibrieren
in
Waschpuffer 1
(3x 10 µl)
wurden
die
ZipTip®-Spitzen
mit
den
entsprechenden Metallionen beladen (Auf- und Abpipettieren in 1 ml Me-Puffer). Es folgten
Waschschritte in Waschpuffer 2 und 3 (jeweils 3x 10 µl) sowie in Bindepuffer (5x 10 µl). Die
aus einem Protein-in-Lösungs-Verdau gewonnen Peptide in 25 mM NH4HCO3 (s. 3.5.2)
wurden 2:1 mit Bindepuffer versetzt und durch Zugabe von 0,5 M HCl-Lösung auf einen
Ph Wert von 4,5 eingestellt. Nach dem Beladen der ZipTip®-Spitzen mit 10 µl der
Peptidlösung wurden die Spitzen jeweils mit 3x 10 µl der folgenden Puffer gewaschen:
Bindepuffer, Waschpuffer 4 und Waschpuffer 5. Für die Elution wurden 10 µl Elutionspuffer
in ein 0,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und die Phosphopeptide durch mehrmaliges Auf- und
Abpipettieren eluiert. Für die massenspektrometrische Analyse wurden die Eluate mit 40 µl
0,1 % FA versetzt.
Puffer nach Millipore 2001:
Waschpuffer 1: 0,1 % Essigsäure
50 % ACN
Waschpuffer 2: H2O
Waschpuffer 3: 1 % Essigsäure
10 % ACN
Waschpuffer 4: 0,1 % Essigsäure
50 % ACN
Waschpuffer 5: H2O
Bindepuffer:
100 mM MES
10 % ACN
Me-Puffer:
200 mM Me*
10 mM HCl
Elutionspuffer:
0,3 N NH4OH
3+
2+
3+
Puffer nach Imanishi et al. 2007:
Waschpuffer 1: 0,1 % Essigsäure
50 % ACN
Waschpuffer 2: H2O
Waschpuffer 3: 1 % Essigsäure
30 % ACN
Waschpuffer 4: 70 mM Essigsäure
30 % ACN
Waschpuffer 5: H2O
Bindepuffer:
70 mM Essigsäure
30 % ACN
Me-Puffer:
200 mM Me*
10 mM HCl
Elutionspuffer:
5 % PA
50 % ACN
2+
*Me: Metallionen: Fe -, Cu -, Ga -, Ni -Ionen
Anreicherung von Phosphopeptiden der PKA-Cα über Material von Qiagen
Für die spezifische Anreicherung von Phosphopeptiden wurde IMAC-Material der Firma
Qiagen getestet, das nur in Form eines „Phosphoprotein-Purification-Kit“ (Qiagen 2006)
vermarktet wurde, aber auch auf Peptidebene getestet werden sollte. Das Material wurde in
49
3. Material & Methoden
Form selbst hergestellter ZipTips (Stensballe et al. 2001) und im Batchverfahren (Wolschin
et al. 2005) mit den Eluenten NH4OH (MILLIPORETM 2001) bzw. 5 % PA/50 % ACN (Imanishi
et al. 2007) getestet. Die Anreicherung über das Affinitätsmaterial in ZipTips erfolgte, wie
bereits für die IMAC ZipTips® beschrieben, ohne zusätzliches Beladen der Spitzen mit
Metallionen. Im Batchverfahren wurde die Anreicherung mit größeren Volumina (100 µl
verdautes Protein, 1 ml Waschpuffer) über 75 µl des Affinitätsmaterials in einem 1,5 ml
Reaktionsgefäß durchgeführt. Zum Entfernen der Waschpuffer wurde das Affinitätsmaterial
jeweils für 2 min bei 2.000 rpm zentrifugiert (5415R, Eppendorf). Die Elution erfolgte durch
Zugabe von 50 µl Eltionspuffer (10 min bei 22°C und 30 rpm, Stuard Rotator SB3). 10 µl des
Eluats wurden mit 40 µl 0,1 % FA versetzt und massenspektrometrisch analysiert.
Anreicherung von Phosphopeptiden der PKA-Cα über TiO2
Für die Anreicherung von Phosphopeptiden über TiO2 (Titansphere TiO2, 5 μm, GL Science)
wurden selbsthergestellte Microspin-Säulen verwendet (Hsiao 2010): 1 x 2 mm große
Kaffeefilter-Stücke wurden als Fritte in eine 10 µl Pipettenspitze gepresst und mit einer
3 mm dicken TiO2-Schicht überschichtet. Die vorpräparierte Pipettenspitze wurde
anschließend durch den Deckel eines 2 ml Reaktionsgefäßes gesteckt. Das TiO2-Material in
den Microspin-Säulen wurde in 60 µl Puffer B äquilibriert (5 min bei 5.000 rpm, 5415R,
Eppendorf). Die zuvor getrockneten Peptide wurden in 60 µl Puffer A durch 1 min vortexen
und 2 min Ultraschall-Behandlung (Bandelin Sonorex RK 100) resuspendiert und auf die
äqulibrierte Microspin-Säule gegeben (5 min bei 5.000 rpm). Zum Entfernen der unphosphorylierten Peptide wurde das TiO2-Material 3x mit jeweils 60 µl Puffer A und 4x mit Puffer B
gewaschen. Die 10 µl Pipettenspitze wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß umgesetzt und die
Phosphopeptide in 3x 40 µl Puffer C eluiert. Die Phosphopeptide wurden vollständig
getrocknet (Vakuumzentrifuge, Thermo Electron Corporation) und für die massenspektrometrische Analyse in 2 µl 50 % ACN/0,1 % FA (vortexen und 1 min Ultraschall-Behandlung)
und 10 µl 0,1 % FA (vortexen und 1 min Ultraschall-Behandlung) resuspendiert.
TiO2-Puffer:
0,1 %
80 %
Puffer B:
TFA
ACN
Puffer A
5%
0,1 %
0,2 mg/ml
TFA
ACN
DHB
5%
0,1 %
Puffer C:
0,3 N
TFA
ACN
NH4OH (pH > 10,5)
50
3. Material & Methoden
3.5.5 Proteinidentifizierung auf Peptidebene mittels nanoLC-ESI-MS/MS
nanoLC-ESI-MS/MS Analyse mit einem QTrap Massenspektrometer
Für die nanoLC-ESI-MS/MS Analyse wurde ein nanoLC-System (Nano-LC 1D Plus system,
eksigent) mit einem Q-Trap Massenspektrometer (QTrap 4000TM, ABI) verwendet. Die
Peptide wurden innerhalb einer Messdauer von 70 min über einen ACN Gradienten von
Puffer B in Puffer A (s. Tab. 6) mit einer Flussrate von 250 nl/min auf einer RP- (reversed
phase-) C18-Trennsäule (C18 PepMapTM 100, 5 µm, 100 Å, 75 µm x 15 cm, LC Packings)
aufgetrennt.
Während der DDA (data dependent aquisition) im positiven Ionenmodus wurden sequenziell
für jeweils 0,3 sek Übersichts-Massenspektren (MS Spektren) über einen Massenbereich von
m/z 400-1600 aufgenommen. Für ein bis dreifach geladene Vorläuferionen, welche die vier
stärksten Signalintensitäten generiert haben, wurden MS/MS Fragmentierungen in der
Kollisionszelle ausgelöst (CID, collision induced dissociation mit Stickstoffgas, m/z 100-2000).
Nach 4 sek wurde zurück in den Übersichtsscan-Modus umgeschaltet. Nach dem Ausschlussverfahren dynamic exclusion wurden Ionensignale, die in den vorangegangenen MS Analysen
bereits mehr als dreimal unter den stärksten vier Signalen waren für die Aufnahme der
Übersicht-Massenspektren für die darauffolgenden 90 sek ausgeschlossen.
Die Prozessierung der MS/MS Spektren erfolgte über Analyst 1.4.2 (ABI). Für den
Datenbankabgleich der Spektren mit der mass spectrometry database (MSDB vom 13/03/08
eingeschränkt auf den Organismus Säuger) wurde Mascot 2.2.04 (Matrix Sciences)
verwendet. Als Suchparameter waren Massentoleranzen von 1,2 Da auf MS Ebene bzw.
0,6 Da auf MS/MS Ebene sowie bis zu zwei enzymatische Fehlspaltungen erlaubt. Variable
Modifikationen wurden an Asparagin und Glutamin (Desaminierung), Methionin (Oxidation)
sowie Serin und Threonin (Phosphorylierung) zugelassen. Für eine signifikante Identifizierung
mussten der Mascot Score auf Proteinebene größer als 50, auf Peptid-Ebene größer als 10
sein. P-Stellen wurden über den Neutralverlust der Phosphatgruppe (∆m [H3PO4] = 98 Da) in
MS/MS Spektren nachgewiesen (s. Anhang 9.5).
51
3. Material & Methoden
Tab. 6: Acetonitril-Gradient für nanoLC-ESI-MS/MS Messungen.
ACN-Gradient:
% Puffer A
Zeit (min)
(0,1 % FA)
0
45
48
50
50
68
% Puffer B
(0,1 % FA/99,9 % ACN)
98
55,2
15,2
15,2
98
98
2
44,8
84,8
84,8
2
2
nanoLC-ESI-MS/MS Analyse mit einem Orbitrap Massenspektrometer
(Kooperation mit Prof. Dr. H. Urlaub, MPI für biophysikalische Chemie in Göttingen, Bioanalytische Massenspektrometrie)
Über ein Agilent 1100 nano-flow LC system (Agilent Technologies) wurden Peptide mit einer
Flussrate von 10 µl/min auf eine Vorsäule geladen (1.5 cm, 360 μm o. d., 150 μm i. d.,
Reprosil-Pur 120 Å, 5 μm, C18-AQ, Dr. Maisch GmbH) und anschließend mit einer Flussrate
von 300 nl/min auf einer RP-C18 Trennsäule (15 cm, 360 μm o. d., 75 μm i. d., Reprosil-Pur
120 Å, 5 μm, C18-AQ, Dr. Maisch GmbH) mit einem linearen 7,5 bis 37,5 % ACN Gradienten
in 0,1 % FA für 60 min aufgetrennt und im DDA-Modus massenspektrometrisch analysiert
(LTQ-Orbitrap XL, Thermo Scientific).
Übersichts-Massenspektren
wurden
über
einen
Massenbereich von m/z 350–1600 aufgenommen. Die fünf signalstärksten Vorläuferionen
wurden unter Berücksichtigung des Ausschlussverfahrens dynamic exclusion für eine MS/MS
Fragmentierung mittels CID ausgewählt.
Die Prozessierung der MS/MS Spektren erfolgte über XCalibur (Thermo Scientific). Für den
Datenabgleich der Spektren mit der Swissprot-Datendank (Version 51.6 mit 257.964
Sequenzen) wurde Mascot 2.2.04 (Matrix Sciences) verwendet. Als Suchparameter waren
Massentoleranzen von 50 ppm auf MS Ebene bzw. 0,25 Da auf MS/MS Ebene erlaubt, drei
enzymatische Fehlspaltungen und variable Modifikation an Asparagin und Glutamin
(Desaminierung), Methionin (Oxidation), Cystein (Carbamidomethylierung) sowie Serin und
Threonin (Phosphorylierung) wurden zugelassen. Für eine signifikante Identifizierung
mussten der Mascot Score auf Proteinebene größer als 50, auf Peptid-Ebene größer als 10
sein. P-Stellen wurden über den Neutralverlust der Phosphatgruppe (∆m [H3PO4] = 98 Da) in
MS/MS Spektren nachgewiesen (s. Anhang 9.5).
52
3. Material & Methoden
3.5.6 Bestimmung des Molekulargewichtes mittels nanoLC-ESI-MS
50–100 pmol unverdaute PKA-Cα wurden in 5 % ACN, 0,1 % FA auf eine selbstgepackte
C18 Vorsäule (ID 150 µm Länge 20 mm mit Reprosil-Pur C18 AQ 5 µm 120 A, Dr. Maisch)
geladen und über eine RP-C18-Trennsäule (Reprosil-Pur C18 AQ 5 µm 120 A, Dr. Maisch)
aufgetrennt. Die Proteine wurden bei einer Flussrate von 300 nl/min nach Flowsplit über
einen Zeitraum von 60 min mittels eines ACN Gradienten von Puffer B in Puffer A
(Agilent 1100 nanoflow LC system, Agilent Technologies) (s. Tab. 7) über eine Z-Spray
Ionenquelle direkt in das Massenspektrometer (Micromass Q-TOF UltimaTM, Waters)
injiziiert.
Im positiven Ionenmodus wurden 1 sek Übersichts-Massenspektren im Bereich von m/z 350
bis 1600 aufgenommen. Die MS Spektren wurden über einen Massenbereich von
35.000 bis 45.000 Da bei einer Auflösung von 0,5 Da pro Durchlauf dekonvoluiert
(MassLynx 4.1,
MaxEnt1 software,
Waters).
Die
Darstellung
der
dekonvoluierten
MS Spektren erfolgte mit GraphPadPrism 5.
Tab. 7: Acetonitril-Gradient für nanoLC-ESI-MS Messungen.
ACN-Gradient:
Zeit (min)
0
5,5
42,5
50,5
% Puffer A
% Puffer B
(0,1 % FA)
(0,1 % FA/95 % ACN)
100
92,5
5
100
0
7,5
95
0
53
4. Ergebnisse
4
ERGEBNISSE
Wie in 1.1 beschrieben, ist in der funktionellen Proteinanalytik neben dem qualitativen
Nachweis von Proteinphosphorylierungen, die Untersuchung der Dynamik einzelner
Phosphorylierungsstellen (P-Stellen) von entscheidender Bedeutung, da dies eine zusätzliche
Regulationsebene in der eukaryotischen Signaltransduktion darstellt. Um die Gesamtheit
aller P-Stellen der PKA-Cα zu erfassen, wurden in dieser Arbeit zunächst verschiedene
Anreicherungsstrategien für Phosphopeptide getestet (s. 4.1). Die Dynamik und Regulation
der PKA-Cα Phosphoformen wurde u. a. über Molekulargewichtsbestimmung mittels
Massenspektrometrie (MS) sowie mit einer neuen modifizierten Form der SDS-PAGE
(Phos-tagTM SDS-PAGE), welche die Auftrennung unterschiedlich phosphorylierter Proteinspezies ermöglicht, untersucht (s. 4.2 - 4.6).
4.1
Vergleich verschiedener Anreicherungsstrategien für Phosphopeptide der PKA-Cα
Für den Nachweis von P-Stellen an in E. coli exprimierter PKA-Cα wurden verschiedene
Anreicherungsstrategien für Phosphopeptide getestet und miteinander verglichen. Neben
den nahezu vollständig phosphorylierten Aminosäuren S10, S139, T197 und S338 (Seidler
et al. 2009) wurden zusätzliche Phosphorylierungen an S34, S53, S65 und S259 identifiziert.
Als Kriterium für die Effizienz der Phosphopeptidanreicherung wurde das prozentuale
Verhältnis der mittels Mascot identifizierten Phosphopeptide zu den nichtphosphorylierten
Peptiden betrachtet bzw. die Verteilung der angereicherten Phosphopeptide auf die acht
möglichen P-Stellen (pS10, pS34, pS53, pS65, pS139, pT197, pS259, pS338) berücksichtigt
(s. Abb. 12). Die Anreicherung von Phosphopeptiden erfolgte am effizientesten über
Titaniumdioxid (TiO2). Hier konnten Phosphopeptide für alle acht P-Stellen nachgewiesen
werden und der Anteil der Phosphopeptide im Gesamtpeptidgemisch von 17 % auf 75 %
erhöht werden (s. Abb. 12, C). Die Anreicherung über IMAC (immobilised metall affinity
chromatography) mittels ZipTip®-Spitzen (MILLIPORETM) zeigte sich für alle getesteten
Metallionen (Fe3+-, Cu2+-, Ga3+-, Ni2+-Ionen) als sehr selektiv für das pS338 enthaltende
Peptid. So betrug die Phosphopeptidausbeute nach Verwendung von Nickelionen und
NH4OH als Eluent zwar 61 %, wovon jedoch wiederum 75 % auf das pS338 enthaltende
Peptid entfielen (s. Abb. 12, A). Durch Variation des Eluenten auf 5 % PA/50 % ACN (Imanishi
et al. 2007) in Kombination mit Galliumionen konnte die Selektivität für das pS338
enthaltende Peptid geringfügig reduziert werden (s. Abb. 12, B).
54
4. Ergebnisse
A IMAC mit ZipTip®-Spitzen (MILLIPORETM): Elution mit NH4OH
B IMAC mit ZipTip®-Spitzen (MILLIPORETM): Elution mit 5 % PA/50 % ACN
C IMAC mit selbstgepackten Spitzen: Elution mit NH4OH und 5 % PA/50 % ACN
Abb. 12: Vergleich unterschiedlicher Anreicherungsstrategien für Phosphopeptide.
0,2 µM PKA-Cα wurden mittels Protein-in-Lösungs-Verdau mit Trypsin hydrolysiert. Die Phosphopeptide
TM
3+
2+
3+
wurden über IMAC ZipTip®-Spitzen (MILLIPORE ), beladen mit verschiedenen Metallionen (Fe -, Cu -, Ga -,
2+
Ni -Ionen) angereichert. Als Eluent wurde (A) NH4OH bzw. (B) 5 % Phosphorsäure (PA)/50 % Acetonitril (ACN)
verwendet. (C) Phosphopeptidanreicherung über IMAC Material der Firma Qiagen (PhosphoproteinPurification-Kit) und Titaniumdioxid (TiO2) in selbstgepackten Pipettenspitzen (Tip) (Hsiao 2010) oder im
Batchverfahren (Batch). Die Identifizierung der Phosphopeptide erfolgte über nanoLC-ESI-MS/MS
TM
(QTrap 4000 , ABI) und Sequenzdatenbankanalyse mittels Mascot. In den Balkendiagrammen wird das
prozentuale Verhältnis von Phosphopeptiden zu nichtphosphorylierten Peptide angegeben. Die Kreisdiagramme zeigen die Verteilung der Phosphopeptide auf maximal acht mögliche P-Stellen.
55
4. Ergebnisse
Bei Verwendung des IMAC-Materials der Firma Qiagen (PhosphoproteinPurificationKit)
ließen sich zwar nahezu alle P-Stellen der PKA-Cα nachweisen, aber die Ausbeute der
angereicherten Phosphopeptide lag nur zwischen 24-37 % (s. Abb. 12, C). Zusammenfassend
betrachtet, war es auffällig, dass ein hoher Phosphopeptidanteil nicht zwangsläufig mit der
Identifizierung aller PKA-Cα P-Stellen korrelierte und insbesondere mittels IMAC das
pS338-enthaltende Peptid sequenzspezifisch angereichert wurde.
Unabhängig von der verwendeten Probenvorbereitung über tryptischen Protein-in-GelVerdau,
Protein-in-Lösungs-Verdau
oder
Verdau
mittels
FASP
(filter-aided sample
preparation) (s. 3.5) ließen sich alle acht P-Stellen auch ohne vorausgegangenes Anreichern
der Phosphopeptide identifizieren. Ein Verzicht auf die Verwendung von Anreicherungsstrategien hat dabei den Vorteil, dass über das Verhältnis von Phosphopeptiden zu
Gesamtpeptiden ein Hinweis auf den Phosphorylierungsgrad an einer einzelnen Aminosäure
gegeben werden kann (s. Abb. 13).
Abb. 13: Phosphorylierungsgrad an verschiedenen P-Stellen der PKA-Cα.
Der Phosphorylierungsgrad wurde über quantitative Signalintensitätsmessung (*in Kooperation mit Dr. Jörg
Seidler, DKFZ Heidelberg nach Seidler et al. 2009) bestimmt (blau). Auch der prozentuale Anteil von
identifizierten Phosphopeptiden zu Gesamtpeptiden nach einer rein qualitativen MS/MS Analyse spiegelt ein
ähnliches Phosphorylierungsmuster wider. Proteinphosphorylierungen wurden nach Protein-in-Gel-Verdau
(lila), Protein-in-Lösungs-Verdau (dunkelrot) und Verdau mittels FASP (filter-aided sample preparation) (grau)
TM
über nanoLC-ESI-MS/MS (QTrap 4000 , ABI) und Sequenzdatenbankanalyse mit Mascot untersucht. Jeder
Datensatz basiert auf n = 3 exemplarischen Experimenten. Für den in-Lösungs-Verdau und den Verdau mittels
FASP wurden 0,2 µM PKA-Cα verwendet, im Protein-In-Gel-Verdau wurden 3 µg Protein verdaut.
Sowohl
die
von
Seidler et al.
über
vergleichende
Signalintensitätsmessung
von
phosphorylierten zu unphosphorylierten Peptidionensignalen (Seidler et al. 2009)
nachgewiesene 100 %ige Phosphorylierung an S10, S139, T197 und S338 sowie eine deutlich
verringerte Phosphorylierung an den restlichen Aminosäuren (vgl. 5.1) konnte hier auch in
einer rein qualitativen MS/MS Analyse beobachtet werden. Unter der Voraussetzung, dass
56
4. Ergebnisse
eine ausreichend große Proteinmenge als Ausgangsmaterial vorhanden ist, sind folglich
keine speziellen Anreicherungsstrategien für den Nachweis von Phosphorylierungen nötig.
4.2
Nachweis verschiedener PKA-C Phosphoformen anhand von
Molekulargewichtsunterschieden
Die Anwendung der klassischen MS/MS Analyse, bei der immer ein Gemisch an Proteinspezies nach enzymatischen Verdau untersucht wird, liefert keine Informationen über das
Vorhandensein und die Regulation verschiedener PKA-Cα Phosphoformen (s. 1.2.7).
Abb. 14: Bestimmung des Molekulargewichts der PKA-Cα Phosphoformen mittels nanoLC-ESI-MS.
(A) 50-100 pmol aus E. coli gereinigte murine PKA-Cα wurden über Flüssigkeitschromatographie aufgetrennt,
nach 25 min von einer C18-Säule eluiert (s. Pfeile) und massenspektrometrisch analysiert. (B) Die Signale im
MS Spektrum beruhen auf unterschiedlich geladenen Proteinspezies. Nach Dekonvolutieren der Signale lässt
sich das Molekulargewicht ermitteln (Ausschnitt oben rechts): (C) Molekulargewichtsbestimmung für drei
voneinander unabhängige technische Messungen der gleichen PKA-Cα Probe, (D) Molekulargewichtsbestimmung für drei voneinander unabhängige biologische Proteinpräparationen von PKA-Cα über
PKI5-24-Affinitätschromatographie. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da
verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen pro Phosphoform,
xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine N-terminale Modifikation mit Phosphoglukonsäure (Δm = 258 Da)
nachweisen (Erklärung s. 4.3.1). P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung
nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
57
4. Ergebnisse
Mittels Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS konnten in dieser Arbeit für in
E. coli exprimiertes Protein verschiedene PKA-Cα Phosphoformen mit einem jeweiligen
Massenunterschied von 80 Da ± 1 Da reproduzierbar, in Bezug auf technische Wiederholbarkeit und unabhängige biologische Präparationen, nachgewiesen werden (s. Abb. 14).
Um sicherzustellen, dass sich diese Methode nicht nur für die Identifizierung, sondern auch
für den quantitativen Nachweis von Phosphoformen eignet, wurden Phosphoformen der
PKA-Cα vor der Molekulargewichtsbestimmung über Mono-S-Chromatographie aufgetrennt
und die Verteilung der Phosphoformen in den verschiedenen Fraktionen untersucht
(s. Abb. 15).
Abb. 15: Quantitativer Nachweis verschiedener PKA-Cα Phosphoformen in Fraktionen einer
Mono-S-Chromatographie.
(A) Auftrennung der aus E. coli gereinigten murinen PKA-Cα Phosphoformen über Mono-S-Chromatographie.
Für die nachfolgende Charakterisierung wurden die Fraktionen # 16, 17, 18, 21 und 22 ausgewählt (s. Pfeile).
(B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer
Genauigkeit von ±3 Da verschiedenen Phosphoformen des PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen
pro Phosphoform, xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine zusätzliche N-terminale Modifikation mit
Phosphoglukonsäure (Δm = 258 Da) nachweisen (Erklärung s. 4.3.1). P-Stellen und zusätzliche Modifikationen
wurden über MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
Das Auftreten von PKA-Cα Phosphoformen mit zwei bis vier P-Stellen, mit den höher
phosphorylierten Proteinspezies in den frühen und den niedriger phosphorylierten in den
späten Elutionsfraktionen, bestätigt die Ergebnisse aus vorangegangenen Arbeiten: Nach
radioaktiver Markierung der Phosphopeptide (Herberg et al. 1993a; Yonemoto et al. 1993a),
58
4. Ergebnisse
massenspektrometrischen Untersuchungen (Chait et al. 1992; Wind et al. 2001) und
31
P NMR Spektroskopie (Seifert et al. 2002) wurden PKA-Cα Phosphoformen mit pS10,
pS139, pT197, pS338 (Isoform I); pS10, pT197, pS338 (Isoform II) und pT197 and pS338
(Isoform III) beschrieben. Gesellchen et al. und Schlosser et al. haben außerdem gezeigt,
dass es zusätzlich zu den beschriebenen Phosphoformen Indizien für Phosphoformen mit
einem höheren Phosphorylierungsgrad bzw. mit zusätzlichen N-terminalen Modifikationen
gibt (Schlosser 2002; Gesellchen et al. 2006). In Abb. 15 ist zu sehen, dass es neben
schwachen Signalen für fünffach phosphorylierte PKA-Cα auch Signale gibt, die sich über
eine zusätzliche N-terminale Modifikation mit Phosphoglukonsäure erklären lassen
(Erklärung s. 4.3.1). Obwohl sich in dieser Arbeit mittels klassischer MS/MS Sequenzierung
innerhalb der verschiedenen Fraktionen kein Unterschied in den nachgewiesenen P-Stellen
gezeigt
hat
(s. Anhang 9.4),
ließ
sich
über
Molekulargewichtsbestimmung
eine
unterschiedliche Verteilung der Phosphoformen nachweisen.
4.3
Untersuchung des dynamischen Phosphorylierungsstatus der PKA-Cα
4.3.1 Rekombinante murine PKA-Cα aus E. coli weist acht P-Stellen auf
Der Phosphorylierungsstatus der murinen PKA-Cα aus E. coli wurde mit einer Kombination
aus verschiedenen Methoden untersucht. Über klassische MS/MS Sequenzierung wurden
mit pS10, pS34, pS53, pS65, pS139, pT197, pS259; pS338 acht Aminosäuren phosphoryliert
nachgewiesen (s. Beispiel für pS53 in Abb. 16, für restliche MS/MS Spektren s. Anhang 9.4
bzw. 9.5). Die Phosphorylierung an T197 und S338 wurde über phosphospezifische
Antikörper in Westernblot Analysen verifiziert (s. Abb. 17). In Kooperation mit Dr. J. Seidler
wurden nach Seidler et al. 2009 die P-Stellen auch quantitativ über vergleichende Signalintensitätsmessungen
von
phosphorylierten
und
zugehörigen
unphosphorylierten
Peptidionen untersucht. Neben einer 100 %igen Phosphorylierung an pS10, pS139, pT197
und pS338, wurden die P-Stellen pS259 (45 %), pS53 (11 %) und pS34 (5 %) und pS65 (5 %)
nur substöchiometrisch phosphoryliert vorgefunden. Für den Nachweis der PhosphoformDiversität wurde PKA-Cα über eine spezielle Form der Gelelektrophorese (Phos-tagTM
SDS-PAGE, s. 3.4.2), in der Phosphoproteine nach Anzahl und Lokalisierung ihrer P-Stellen
aufgetrennt werden können, analysiert und unabhängig davon die Molekulargewichte über
nanoLC-ESI-MS bestimmt (s. Abb. 17).
59
4. Ergebnisse
Abb. 16: Nachweis der Phosphorylierung von S53 mittels MS/MS Sequenzierung.
++
Nach Fragmentierung des zweifach geladenen Vorläuferion [488,22] (s. Kasten) lassen sich im MS/MS
Spektrum die zugehörigen b- und y-Fragmentionen detektieren. Die Phosphorylierung lässt sich eindeutig der
Postion S53 zuweisen, da für die b2-, b3- und b4- Ionen kein Neutralverlust nachgewiesen werden konnte.
Weitere MS/MS Spektren sind im Anhang 9.5 aufgeführt.
Die im Phos-tagTM SDS-PAA-Gel vier separierten Proteinbanden wurden im Gel mit Trypsin
verdaut und mittels MS/MS Sequenzierung untersucht (s. 4.5.3, Abb. 35). Unterschiede in
der
hier detektierten Anzahl von
Molekulargewichtsbestimmung
maximal
nachgewiesenen
acht P-Stellen
sowie
Phospoformen
mit
den
drei
mittels
bis
fünf
Phosphorylierungen an einem Molekül, weisen darauf hin, dass nach Expression in E. coli ein
Gemisch verschiedener PKA-Cα Phosphoformen vorliegt (s. Diskussion in 5.3): Die ersten drei
stärksten
Signale
konnten
nach
Abgleich
mit
dem
theoretisch
berechneten
Molekulargewicht drei bis fünffach phosphoryliertem Protein zugeordnet werden
(Beispielrechnung für das theoretische Molekulargewicht von dreifach phosphoryliertem
Protein (Swissprot ID: P05132): 40.571 Da abzüglich der molaren Masse des Startmethionins
(ΔmMet = 132)  40.439 Da; 40.439 Da +3x 80 Da = 40.679 Da; für weitere theoretisch
berechnete Molekulargewichte s. Anhang 9.3) Die substöchiometrisch vor allem bei der
murinen PKA-Cα aufgetretenen aber regelmäßig verteilten Zwischensignale (40 ± 1 Da)
deuten auf eine zusätzliche Modifikation hin, die bislang über MS/MS Sequenzierung nicht
eindeutig identifiziert werden konnte. Da die gleichen Signale auch bei N-terminal
60
4. Ergebnisse
myristoylierter PKA-Cα auftraten (s. 4.3.3) konnte eine N-terminale Modifikation als Ursache
ausgeschlossen werden. Eine Acetylierung von Lysinresten, die eine Massenabweichung in
der gesuchten Größenordnung von 42 Da verursacht, wurde in einem Hochdurchsatz
Screening an der konservierten Aminosäure K267 der PKA-Cα identifiziert (Choudhary et al.
2009) und könnte die hier gefundene Signalabweichung verursachen. Kaliumaddukte, die
eine Massenzunahme von 39 Da verursachen, können ausgeschlossen werden, da der
Großteil der in dieser Arbeit verwendeten Puffer kaliumfrei war (s. 3.3).
Abb. 17: Posttranslationale Modifikationen der rekombinaten murinen PKA-Cα aus E. coli.
Rekombinante PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus E. coli gereinigt. (A) Proteindetektion
TM
über SDS-PAGE und (B) Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag
SDS-PAGE mit CoomassieFärbelösung (je 3 µg Protein). Identifizierung von 50 ng PKA-Cα über Westernblot Analysen mit α-PKA-C
Antikörper (1 min Belichtung s. 3.4.6). Phosphorylierungen an T197 und S338 wurden mit den phosphospezifischen Antikörpern α-PKA-C-pT197 (5 min) und α-PKA-C-pS338 (5 min) nachgewiesen.
(C) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer
Genauigkeit von ±1 Da verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen
pro Phosphoform, xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine N-terminale Modifikation mit Phosphoglukonsäure
(Δm = 258 Da) nachweisen. P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung
nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
Als Ursache für die Signale im höheren Molekulargewichtsbereich konnte eine weitere
N-terminale Modifikation mit Phosphoglukonsäure identifiziert werden, welche für die drei
bis fünffach phosphorylierten Proteinspezies eine zusätzliche Massenzunahme von 258 Da
61
4. Ergebnisse
verursacht
(s. Abb. 17; 3P*, 4P*, 5P*; für
theoretisch
berechnete
Molekulargewichte
s. Anhang 9.3, für MS/MS Spektren s. Anhang 9.5; S. 266 ff). Die Phosphoglukonsäuremodifikation wurde 1999 erstmals als eine nicht enzymatische Acylierung der N-terminalen
Aminogruppe eines in einer Bakterienzelle exprimierten Proteins durch 6-Phosphogluco-1,5lacton beschrieben (Geoghegan et al. 1999) und 2001 nach Bromcyanspaltung auch als
N-terminale Modifikation an rekombinanter boviner PKA-Cα identifiziert (Schlosser 2002).
Interessanterweise führte das Unterlassen der Induktion der Genexpression mit IPTG zum
Ausbleiben der Phosphoglukonsäuremodifikation (s. 4.3.4, Abb. 22). Außerdem war diese
Modifikation nicht an allen in E. coli exprimierten Proteinen zu detektieren: Während
Phosphoglukonsäure an der in dieser Arbeit verwendeten murinen und von Andreas
Schlosser untersuchten bovinen PKA-Cα (Schlosser 2002) nachgewiesen werden konnte, ließ
sich diese Modifikation nicht an humaner PKA-Cα detektieren (s. Abb. 18, C).
Abb. 18: Phosphorylierungsstatus der rekombinaten, in E. coli exprimierten humanen PKA-Cα.
Rekombinante PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus E. coli gereinigt. (A) Proteindetektion
TM
über SDS-PAGE und (B) Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag
SDS-PAGE mit CoomassieFärbelösung (je 3 µg Protein). Identifizierung von 50 ng PKA-Cα über Westernblot Analysen mit α-PKA-C
Antikörper (1 min Belichtung). Phosphorylierungen an T197 und S338 wurden mit den phosphospezifischen
Antikörpern α-PKA-C-pT197 (5 min) und α-PKA-C-pS338 (5 min) nachgewiesen. (C) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da
verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen pro Phosphoform.
P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
Ein Sequenzvergleich zeigt, dass alle drei PKA-Cα Sequenzen hoch konserviert sind und sich
nur in sieben Aminosäuren voneinander unterscheiden (s. Abb. 19). Das unterschiedliche
Auftreten der Phosphoglukonsäuremodifikation ist somit weniger auf die Sequenzunterschiede, sondern vielmehr auf Variationen im jeweiligen Expressionssystem zurück62
4. Ergebnisse
zuführen (u. a. abhängig von verwendeten Zellen, Vektoren, Induktion der Genexpression,
Expressionsbedingungen, Methode der Reinigung) (s. Diskussion in 5.3.4).
MS/MS Sequenzierungen (s. Anhang 9.4) und die Auftrennung der Phosphoformen über
Phos-tagTM SDS-PAGE (s. Abb. 18, B) zeigten für die humane PKA-Cα keine Unterschiede im
Phosphorylierungsstatus. Im dekonvoluierten MS Spektrum ließ sich ein zusätzliches Signal
für zweifach phosphoryliertes Protein detektieren. Eine reduzierte Phosphorylierung kann
auf den, in der humanen PKA-Cα zu beobachtenden Aminosäureaustausch von S34 nach A34
bzw. von S65 nach T65 zurückzuführen sein (s. Abb. 19). Für humane PKA-Cα lassen sich
außerdem Phosphoformen mit sechs und sieben Phosphorylierungen nachweisen. Diese
hoch phosphorylierten Proteinspezies könnten im dekonvoluierten MS Spektrum der
murinen PKA-Cα auch vorhanden sein, aber dort durch Signale von zusätzlich mit Phosphoglukonsäure modifizierten PKA-Cα überlagert werden.
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
S10 S14
S34
MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWENPAQNTAHLDQFERIKTL 50
MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWESPAQNTAHLDQFERIKTL 50
MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWETPSQNTAQLDQFDRIKTL 50
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
T48 S53
S65
GTGSFGRVMLVKHMETGNHYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVN 100
GTGSFGRVMLVKHKETGNHYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVN 100
GTGSFGRVMLVKHKESGNHYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVN 100
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
S139
FPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQ 150
FPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQ 150
FPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVAGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQ 150
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
T197
IVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLC
IVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLC
IVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLC
S212
GTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEK
GTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEK
GTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEK
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
S259
IVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFAT 300
IVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFAT 300
IVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFAT 300
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
S325
S338
TDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF 351
TDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF 351
TDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFTEF 351
P00517|KAPCA_BOVIN
P17612|KAPCA_HUMAN
P05132|KAPCA_MOUSE
200
200
200
250
250
250
Abb. 19: Sequenzvergleich von boviner, humaner und muriner PKA-Cα mit CLUSTAL 2.1 multiple sequence
alignment (Chenna et al. 2003).
blau: phosphorylierte Aminosäuren nach Seidler et al. 2009; rot: in dieser Arbeit als phosphoryliert identifizierte Aminosäuren. Sequenzunterschiede sind grau hinterlegt.
63
4. Ergebnisse
Seidler et al. haben mittels nano-UPLC-ESI-MS/MS Analyse für mit Histidin-Fusionsanteil
versehene bovine PKA-Cα insgesamt zehn P-Stellen identifiziert (Seidler et al. 2009)
(s. Abb. 19). Darunter sind mit pS14, pT48, pS212 und pS325 vier P-Stellen, die theoretisch
auch in der murinen und humanen PKA-Cα phosphoryliert vorliegen können, aber dort
bislang nicht gefunden wurden. Weitere Ursachen für die Unterschiede in der Anzahl der
detektierten P-Stellen könnten neben variablen Expressions- und Reinigungsbedingungen
auch die unterschiedliche Probenvorbereitungen für die massenspektrometrische Analyse
liegen (s. Diskussion in 5.1 und 5.3.4).
4.3.2 Aus Geweben isolierte PKA-Cα ist nur an T197 und S338 phosphoryliert
In den siebziger Jahren, vor Einführung der rekombinanten Proteinexpression, wurde PKA-Cα
aus Säugergeweben isoliert (Kochetkov et al. 1976; Bechtel et al. 1977; Peters et al. 1977).
Zahlreiche
Arbeiten
belegen,
dass
endogene
und
rekombinante
PKA-Cα
trotz
unterschiedlichen PTMs (s. 1.2.2) in ihren kinetischen Eigenschaften, wie u. a. der
spezifischen Aktivität sowie den Michaelis-Menten Konstanten (Km) für ATP, für das
synthetische Heptapeptid Kemptide und für die physiologischen Inhibitoren PKI und PKA-R
identisch sind (Slice et al. 1989; Toner-Webb et al. 1992; Herberg et al. 1993a; Yonemoto
et al. 1993a; Yonemoto et al. 1997).
Um die physiologische Relevanz der an rekombinantem Protein neu entdeckten P-Stellen zu
belegen, wurde der Phosphorylierungsstatus wie von Nimmo et al. 1977 und Krebs et al.
1979
gefordert
auch
an
aus
Gewebe
isolierter
PKA-Cα
untersucht.
Mittels
Westernblot Analysen und MS/MS Sequenzierung ließen sich Phosphorylierungen an den
stabilen P-Stellen pT197 und pS338 nachweisen. Sowohl die Analyse über Phos-tagTM
SDS-PAGE als auch die Molekulargewichtsbestimmung zeigten keine Phosphoformdiversität
(s. Abb. 20, A und B). Das Hauptsignal für die Molekulargewichte der PKA-Cα aus
Schweineherz und –skelettmuskel bei 40.836,5 ± 1 Da stimmt mit den über ESI-MS Analyse
experimentell ermittelten Molekulargewichten für PKA-Cα aus Schweineherz nach Herberg
et al. (~40.840 Da) und Jedrzejewski et al. (~40.835,5 Da) überein und lässt sich mit zweifach
phosphorylierten sowie N-terminal myristoylierten Proteinen erklären (Herberg et al. 1993a;
Jedrzejewski et al. 1998). Zusätzlich war mit 40.679,5 Da ein schwaches Signal für vollständig
unphosphorylierte PKA-Cα nachzuweisen.
64
4. Ergebnisse
Abb. 20: Phosphorylierungsstatus der aus Muskelgewebe gereinigten PKA-Cα.
Endogene PKA-C wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus Säugergeweben (Schweineherz,
Schweineskelettmuskel (P36887) und Mäuseherzen (P05132)) gereinigt. (A) Die Proteindetektion erfolgte über
SDS-PAGE: oben: Coomassie Färbung; Mitte: Westernblot Analysen über α-PKA-C Antikörper (20 sek
Belichtung), α-PKA-C-pT197 (30 sek) und α-PKA-C-pS338 (1 min); unten: Auftrennung der Phosphoformen über
TM
Phos-tag
SDS-PAGE. M: Molekulargewichtsstandard; (B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLCESI-MS. Das Molekulargewicht ließ sich mit einer Genauigkeit von ±2 Da nicht bzw. zweifach phosphoryliertem
Protein zuordnen (vgl. Jedrezejewski et al. 1998). xP*: neben xP-Stellen lässt sich eine Modifikation mit
Myristinsäure nachweisen. P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung
nachgewiesen (s. Anhang 9.4). (C) Die spezifischen Aktivitäten wurden in drei voneinander unabhängigen
TM
Messungen für die Phosphorylierung des Substrates Kemptide im Cook-Assay (Fusion ) ermittelt.
65
4. Ergebnisse
Die in der Swissprot-Datenbank angegebene Sequenz für PKA-Cα aus Schweinegewebe
(P36887) liegt nicht vollständig sequenziert vor und ist anteilig über Sequenzhomologien
ermittelt worden (Adavani et al. 1987; Buechler et al. 1989; Jedrzejewski et al. 1998). Nach
dem dort angegeben theoretischen Molekulargewicht von 40.617 Da müsste myristoyliertes
und zweifach phosphoryliertes Protein ein Molekulargewicht von 40.617 Da - ΔmMet
 40.485 Da; 40.485 Da + 210 Da + 2x 80 Da = 40.855 Da aufweisen, was 19 Da von dem
experimentell ermittelten Molekulargewicht abweicht (vgl. Anhang 9.3). Im dekonvoluierten
Massenspektrum der PKA-Cα aus Mäuseherzgewebe war ein Signal zu detektieren, welches
über das Molekulargewicht der myristoylierten (+210 Da) und zweifach phosphorylierten
(+ 2x 80 Da)
PKA-Cα
zugeordnet
werden
konnte
(40.571 - ΔmMet  40.439 Da;
40.439 Da + 210 Da + 2x 80 Da = 40.809 Da). Die schwachen Signale bei 40.677 Da und
40.855 Da ließen sich weder über weitere Phosphoformen noch über das Molekulargewicht
bekannter PKA-Cα Isoformen erklären (vgl. Tab. 8). Eine Aufteilung auf verschiedene
Phosphoformen, wie sie an rekombinantem Protein auftritt, ließ sich somit in keinem der
untersuchten Geweben nachweisen. Laut Literatur gibt es keinen Unterschied zwischen der
spezifischen Aktivität von rekombinanter PKA-Cα aus E. coli und endogener PKA-Cα aus
Säugergewebe. Dieser mittels eines spektrophotometrischen Aktivitätstest ermittelte Wert
variiert zwischen 20 und 30 U/mg (Slice et al. 1989; Herberg et al. 1993a). Die in dieser
Arbeit tendenziell niedrigere Aktivität der aus Gewebe isolierten PKA-Cα (s. Abb. 20, C)
beruht vermutlich weniger auf der unterschiedlichen Anzahl der P-Stellen als vielmehr auf
einer Kontamination mit anderen, katalytisch geringer aktiven PKA-C Isoformen. Nur die
Isoformen PKA-Cα1 und PKA-Cβ1 werden ubiquitär in allen Gewebetypen, letztere abundant
in Hirn exprimiert und sind aufgrund ihrer hohen Sequenzhomologie von 91 % und ähnlichen
physikalischen Eigenschaften in vivo nur schwer voneinander zu unterscheiden (Gamm et al.
1996). In Tab. 8 sind die aktuellen Einträge aus der Swissprot-Datenbank für die auf Proteinebene bestätigten PKA-C Isoformen aus Maus, Schwein und Mensch aufgeführt. Mittels
MS/MS Sequenzierung wurden in den untersuchten Geweben neben PKA-Cα auch eine
geringe Anzahl an isoform-spezifischen Peptiden für PKA-Cβ1 und PKA-Cβ2 entdeckt
(s. Anhang 9.2). Eine deutliche Bande im SDS-PAA-Gel bei 46 kDa, sowie eine zusätzliche
Bande im Phos-tagTM SDS PAGE (s. Abb. 20, A und B) wiesen auf das Vorhandensein der
größeren Isoform PKA-Cβ2 in Schweineherzgewebe hin.
66
4. Ergebnisse
Tab. 8: Vorkommen von PKA-C Isoformen in verschiedenen Geweben (Swissprot-Datenbank).
1
2
3
experimentell nicht belegt, Sequenz unvollständig, kein Datenbankeintrag, das Molekulargewicht wurde
über ein Sequenzalignement zu KAPCB_HUMAN Isoformen ermittelt, kA: keine Angabe.
Swissprot ID:
HUMAN:
KAPCA_HUMAN
KAPCB_HUMAN
Isoform-Bezeichnung
Aminosäuren
Molekulargewicht (Da)
Expression
P17612-1
Isoform 1
351
40.590
ubiquitär
P17612-2
343
39.822
Spermienzellen
P22694-1
Isoform 2 / C-alpha-2 /
C-alpha-S
Isoform 1
351
40.623
Gehirn
P22694-2
Isoform 2
398
46.236
Thymus, Milz, Niere
2
Isoform 3
339
39.477
Hirn
2
Isoform 4
338
39.379
Hirn
P22694-5
2
Isoform 5
354
40.947
kA
P22694-6
Isoform 6
357
41.296
kA
P22694-7
Isoform 7
355
41.046
kA
P22694-3
P22694-4
1
P22694-8
Isoform 8
257
29.696
kA
KAPCG_HUMAN
P22612
Isoform 1
351
40.434
Spermienzellen
MAUS:
KAPCA_MOUSE
P05132-1
Isoform 1 / C-alpha-1
351
40.571
ubiquitär
P05132-2
343
39.803
Spermienzellen
P68181-1
Isoform 2 / C-alpha-2 /
C-alpha-S
Isoform 1 / Beta-1
351
40.708
P68181-2
Isoform 2 / Beta-2
338
39.449
ubiquitär, am
höchsten im Hirn
Hirn
P68181-3
Isoform 3 / Beta-3
339
39.520
Hirn
P68181-4
Isoform 4 / Beta-4
398
46.014
-
KAPCA_PIG
P36887
Isoform 1
351
40.617
ubiquitär
KAPCB_PIG
P05383
KAPCB_MOUSE
1
SCHWEIN:
Isoform 1
351
40.594
ubiquitär
3
Isoform 2
398
46.205
kA
3
Isoform 3
339
39.446
kA
3
Isoform 4
338
39.348
kA
3
Isoform 5
354
40.916
kA
3
Isoform 6
357
41.265
kA
3
Isoform 7
355
51.015
kA
3
Isoform 8
257
29.665
kA
3
Isoform 1
351
40.246
-
kA
kA
kA
kA
kA
kA
kA
KAPCG_PIG
kA
Da PKA-Cβ2 nicht Gegenstand der Untersuchung war, wurde dieser hohe Molekulargewichtsbereich für die Untersuchung der Phosphoformen der PKA-Cα nicht berücksichtigt. Daher
ergaben die dekonvoluierten MS Spektren keinen Hinweis auf PKA-Cβ2. Jedoch war auch
über Molekulargewichtsbestimmung ein geringer Anteil an PKA-Cβ1 in Schweineherzgewebe
67
4. Ergebnisse
zu detektieren (s. Abb. 20, B; Pfeil). Wie auch für PKA-Cα tritt eine Diskrepanz zwischen dem
über die Swissprot-Datenbank berechneten Molekulargewicht und dem experimentell
gemessenen Molekulargewicht auf, jedoch weist die detektierte Massenabnahme von
Δm = 22 Da auf die 23 Da kleinere PKA-Cβ Isoform hin. In den anderen untersuchten
Geweben ergaben sich sowohl aus der Phos-tagTM SDS-PAGE, wie auch über die Molekulargewichtsbestimmung keine signifikanten Hinweise auf andere Isoformen neben der PKA-Cα
(vgl. Tab. 8). Weitere Gründe für die unterschiedliche spezifische Aktivität werden in 5.3.5
diskutiert. PKA-C aus Schweineleber und -niere wiesen ebenfalls Phosphorylierungen an
T197 und S338 auf (s. Anhang 9.4). Die experimentell ermittelten Molekulargewichte und
Phos-tagTM SDS-PAGE zeigten jedoch keine Phosphoformdiversität auf (s. Anhang 9.2). Die
Hauptsignale bei 40.172,5 Da bzw. 40.314,5 Da ließen sich mit keinem der theoretisch
berechneten Molekulargewichte für Iso- bzw. Phosphoformen der PKA-C erklären und
beruhen vermutlich auf Proteindegradation (vgl. Tab. 8). Da mit ~15 U/mg keine signifikante
Veränderung der spezifischen Aktivität nachzuweisen war sowie mittels MS/MS Analyse 8090 % der PKA-Cα Sequenz identifiziert werden konnten (s. Anhang 9.2), ist es
unwahrscheinlich, dass in den betroffenen Geweben unbekannte Prozessierungsschritte
oder Modifikationen auftreten, wodurch kleinere gewebsspezifische PKA-C Isoformen
entstanden sein könnten.
Die Identifizierung von nur zwei Phosphatresten an endogener PKA-Cα aus Maus- und
Schweinegewebe werden durch frühere Untersuchungen gestützt, in denen etwa 2 mol
Phosphat pro mol PKA-Cα aus Säugerskelettmuskel detektiert wurden (Bechtel et al. 1977;
Bossemeyer et al. 1993). Auch in der Dissertation von Andreas Schlosser und einer Arbeit
von Herberg et al. wurde PKA-Cα aus Säugerherz isoliert und über ESI-MS Analyse als
N-terminal myristoyliert und nur zweifach phosphoryliert identifiziert (Herberg et al. 1993a;
Schlosser 2002).
4.3.3 Die N-terminale Myristoylierung beeinflusst den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Um den Einfluss der an PKA-Cα aus Säugergewebe vorkommenden N-terminalen
Modifikation mit Myristinsäure zu untersuchen, wurde PKA-Cα zusammen mit einer
N-Myristoyltransferase in E. coli exprimiert (Carr et al. 1982; Duronio et al. 1990; Yonemoto
et al. 1993b). Mittels MS/MS und Westernblot Analysen konnte im Vergleich zu dem nicht
myristoyliertem Protein kein Unterschied in der Anzahl der phosphorylierten P-Stellen
68
4. Ergebnisse
detektiert werden (s. Anhang 9.4). Die Molekulargewichtsbestimmung zeigt jedoch ein
Vorkommen von geringer modifizierten Proteinspezies mit einer Verschiebung von drei bis
siebenfach zu zwei- bis fünffach modifizierten Phosphoformen (vgl. Abb. 18 und Abb. 21).
Abb. 21: Phosphorylierungsstatus der rekombinanten, in E. coli exprimierten myristoylierten humanen
PKA-Cα.
Rekombinante PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus E. coli gereinigt. (A) Proteindetektion
TM
über SDS-PAGE und (B) Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag
SDS-PAGE mit CoomassieFärbelösung (je 3 µg Protein). Identifizierung von 50 ng PKA-Cα über Westernblot Analysen mit α-PKA-C
Antikörper (1 min Belichtung). Phosphorylierungen an T197 und S338 wurden mit den phosphospezifischen
Antikörpern α-PKA-C-pT197 (5 min) und α-PKA-C-pS338 (5 min) nachgewiesen. (C) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±2 Da
verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch
eine Modifikation mit Myristinsäure nachweisen. P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über
MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
Die bereits für die unmyristoylierte PKA-Cα nachgewiesenen regelmäßig aufgetretenen, aber
von ihrer Ursache her unbekannten Zwischensignale (40 ± 1 Da) waren auch hier zu
detektieren. Das Vorhandensein weniger hoch phosphorylierter PKA-Cα in Anwesenheit der
Myristoylierung konnte auch über eine tiefer laufende Bande in einer Phos-tagTM SDS-PAGE
nachgewiesen werden (s. Abb. 21, B). Da die Myristinsäure den N-Terminus des Proteins
blockiert, ist für das myristoylierte Protein keine Phosphoglukonsäuremodifikation
nachweisbar. Yonemoto et al. konnten über Quantifizierung eines radioaktiven Signals auf
Phosphopeptidebene eine signifikante Verringerung der Phosphorylierung an pS10 und
69
4. Ergebnisse
pS139 in Folge der Myristoylierung nachweisen (Yonemoto et al. 1993a). Neben höher
phosphorylierten Phosphoformen beinhaltet rekombinante myristoylierte PKA-Cα folglich
auch zweifach an T197 und S338 phosphoryliertes Protein, wie es in Säugergewebe auftritt.
Zusätzliche Phosphorylierungen wurden an S10, S53, S139 und S259 gefunden (s. Abb. 21).
Die spezifische Aktivität lag im Vergleich zu unmyristoyliertem Protein unverändert bei
25 U/mg (Yonemoto et al. 1993b). Eine mögliche regulatorische Beteiligung der
Myristoylgruppe an einer initialen Membranverankerung der PKA-Cα sowie die Freisetzung
von der Membran in Folge einer transienten Phosphorylierung an S10 werden in 5.3.1
diskutiert.
4.3.4 Einfluss von Expressionsbedingungen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Unter Standardbedingungen wurde die Expression von muriner PKA-Cα bei einer Zelldichte
von OD600 = 0,6 mit 400 µM IPTG induziert und die E. coli Zellen nach weiteren 18 h
Inkubation bei 22°C geerntet. Unter diesen Voraussetzungen waren PKA-Cα Phosphoformen
mit drei bis fünf Phosphorylierungen und einer zusätzlichen N-terminalen Phosphoglukonsäuremodifikation zu detektieren (s. Abb. 22, B). Ein vollständiger Verzicht auf die
Induktion mit IPTG lieferte geringe Mengen an PKA-Cα mit drei bis fünf P-Stellen. Die
Modifikation mit Phosphoglukonsäure war nicht mehr nachweisbar und scheint im
Zusammenhang mit der Induktion der Genexpression über IPTG zu stehen. Möglicherweise
nutzen E. coli Zellen das überschüssige IPTG als Zuckergrundgerüst für den Aufbau der
Phosphoglukonsäure. Ein Verkürzen der Expressionszeit nach Induktion mit 400 µM IPTG von
24 h auf 2 h führte zum zusätzlichen Auftreten von zweifach phosphorylierter PKA-Cα mit
und ohne zusätzlicher Phosphoglukonsäuremodifikation. Westernblot Analysen und
MS/MS Sequenzierung zeigten für die untersuchten Proteine keinen Unterschied in der
Anzahl der detektierten P-Stellen (s. Anhang 9.4). Die untersuchten Proteine besaßen eine
spezifische Aktivität von ca. 25 U/mg. Die Reinigung von PKA-Cα aus weniger Zellmaterial, in
Folge einer verkürzten Expressionsdauer bei gleichzeitigem Unterlassen der Induktion blieb
erfolglos.
70
4. Ergebnisse
Abb. 22: Abhängigkeit des PKA-Cα Phosphorylierungsstatus von der Expressionsdauer und der IPTG
Konzentration
Murine PKA-Cα (P05132) wurde in E. coli exprimiert und über PKI5-24-Affinitätschromatographien gereinigt. Für
verwendete Zellen und Vektoren s. 3.1. (A) Die Proteindetektion im Zelllysat erfolgte über SDS-PAGE: oben:
Coomassie Färbung; Mitte: Westernblot Analysen über α-PKA-C Antikörper (10 min Belichtung),
α-PKA-C-pT197 (10 min) und α-PKA-C-pS338 (15 min); unten: Auftrennung der Phosphoformen über
TM
Phos-tag SDS-PAGE. (B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen
sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3):
xP: xP-Stellen pro Phosphoform, xP*: eben xP-Stellen lässt sich noch eine Modifikation mit Phosphoglukonsäure (Δm = 258 Da) nachweisen. x: Signal wird von einem kontaminierendem Protein (His6- PKA-Cα K72H) aus
einem nanoLC-ESI-MS Vorlauf verursacht. P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS
Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
4.3.5 Einfluss von Reinigungsbedingungen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Neben der Reinigung über PKI5-24-Affinitätschromatographie (Olsen et al. 1989) wurde
murine PKA-Cα auch über Kationenaustauscherchromatographie (Herberg et al. 1993a) und
in Form des PKA-Holoenzymkomplexes (Hemmer et al. 1997a) gereinigt. Alle Proteine
71
4. Ergebnisse
zeigten eine spezifische Aktivität von 30 U/mg. MS/MS Sequenzierungen (s. Anhang 9.4),
Westernblot Analysen sowie der Nachweis der Phosphoformen über Phos-tagTM SDS-PAGE
und Molekulargewichtsbestimmung zeigten für diese unterschiedlich gereinigte PKA-Cα
keinen Unterschied im Phosphorylierungsstatus (s. Abb. 23). Um sicher zu stellen, dass über
PKI5-24-Affinitätschromatographie nicht nur die aktiven PKA-Cα Phosphoformen erfasst
worden sind (Steinberg et al. 1993; Cauthron et al. 1998; Steichen et al. 2010), wurde auch
mit Histidin-Fusionsanteil versehene PKA-Cα über Co2+-Affinitätschromatographie gereinigt
(His6- PKA-CαCo2+) und auf ihren Phosphorylierungsstatus hin überprüft. Klassische MS/MS
Sequenzierung (s. Anhang 9.4) und Westernblot Analysen (s. Abb. 23, A) zeigten einen
unveränderten Phosphorylierungsstatus. Höher modifizierte Phosphoformen ließen sich zum
einen aufgrund nicht aufzutrennender His6- PKA-Cα in der Phos-tagTM SDS-PAGE vermuten,
zum anderen wiesen die detektierten Molekulargewichte auf hochphosphorylierte
Proteinspezies mit sechs bis zehn Phosphorylierungen ohne zusätzliche Phosphoglukonsäuremodifikationen hin (s. Abb. 23, B). Du et al. haben das Auftreten von Phosphorylierungen innerhalb von Histidin-Fusionsanteilen an rekombinant exprimierten, (auto-)
katalytisch aktiven Kinasen, darunter auch an humaner PKA-Cα untersucht. Die Anzahl der
Phosphorylierungen innerhalb des Histidin-Fusionsanteils variierte von einer bis fünf, wobei
hauptsächlich ein vierfach phosphorylierter Histidin-Fusionsanteil detektiert werden konnte
(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH, Δm = 2.163 Da) (s. Anhang 9.5; S. 264 ff) (Du et al. 2005a; Du
et al. 2005b). Abzüglich dieser vier P-Stellen lassen sich damit für His6- PKA-Cα
Proteinspezies mit zwei bis sechs Phosphorylierungen nachweisen. Das Einbringen eines
Histidin-Fusionsanteils erschwert somit zwar den Phosphoform-Nachweis, hat jedoch keinen
signifikanten Einfluss auf die Identität der in der PKA-Cα Sequenz vorhandenen P-Stellen.
Geringer phosphorylierte und somit möglicherweise inaktive Phosphoformen ließen sich für
His6- PKA-Cα nicht detektieren.
72
4. Ergebnisse
Abb. 23: Abhängigkeit des PKA-Cα Phosphorylierungsstatus von der Reinigungsmethode.
Murine PKA-Cα (P05132) wurde in E. coli exprimiert und über PKI5-24-Affinitätschromatographie (PKA-CαPKI5-24),
Kationenaustauscherchromatographie (PKA-CαKat) oder als mit Histidin-Fusionsanteil versehenes Protein über
2+
Co -Affinitätschromatographie (His6- PKA-CαCo2+) gereinigt. Für die Reinigung in Form des Holoenzym2+
komplexes wurden PKA-Cα und und His6- PKA-RIIα G337E coexprimiert und über Ni -Affinitätschromatographie isoliert (PKA-CαCoR/Ni2+). Für verwendete Zellen und Vektoren s. 3.1. (A) Die Proteindetektion erfolgte
über SDS-PAGE: oben: Coomassie Färbung; Mitte: Westernblot Analysen über α-PKA-C Antikörper
(2 min Belichtung), α-PKA-C-pT197 (30 min) und α-PKA-C-pS338 (10 min); unten: Auftrennung der
TM
Phosphoformen über Phos-tag SDS-PAGE. (B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die
Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα
zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen pro Phosphoform, xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine weitere
N-terminale Modifikation nachweisen; links: Histidin-Fusionsanteil (Δm = 2.163 Da); rechts: Phosphoglukonsäure (Δm = 258 Da); x: Signal wird von einem kontaminierendem Protein verursacht. P-Stellen und
zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
4.3.6 Einfluss von Phosphatasen auf den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus
Eine kritische Betrachtung der Enzymregulation über Phosphorylierung und Dephosphorylierung wurde bereits 1970 von Krebs & Beavo gefordert (Krebs et al. 1979). Auch der
Phosphorylierungszustand eines Proteins in vivo spiegelt das Zusammenspiel von Kinasen
und Phosphatasen wider. Fehlende Phosphatasen wurden demnach als Ursache für die
Hyperphosphorylierung der rekombinant in E. coli exprimierten PKA-Cα untersucht.
Die unterschiedliche Dephosphorylierungsrate von rekombinanter sowie von endogener, aus
Säugergewebe isolierter PKA-Cα wurde in Gegenwart von CIAP (calf intestine alkaline
phosphatase, Roche) und λ-Phosphatase (s. 3.3.9) über Phos-tagTM SDS-PAGE kombiniert mit
Westernblot Analysen untersucht (s. Abb. 24). An PKA-Cα aus Säugergewebe war erst nach
73
4. Ergebnisse
24 h Behandlung mit λ-Phosphatase eine Dephosphorylierung über eine deutlich tiefer
laufende Proteinbande nachzuweisen. Die dabei entstandene Phosphoform zeigte eine
verbleibende Phosphorylierung an T197 jedoch nicht an S338.
TM
Abb. 24: Nachweis einer in vitro Dephosphorylierung von PKA-Cα über Phos-tag SDS-PAGE kombiniert mit
Westernblot Analyse.
0,5 µM PKA-Cα wurde mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie aus E. coli (links) bzw. aus Schweineskelettmuskelgewebe (rechts) gereinigt und bei 30°C in einer zeitabhängigen Dephosphorylierungsreaktion mit
zehnfach äquimolaren Überschuss an λ-Phosphatase (s. 3.3.9) und CIAP (Roche) untersucht: Zu den ZeitTM
punkten t = 0, 30 min, 2 h und 24 h wurden Proben entnommen und auf ein Phos-tag SDS-PAGE aufgetragen.
Für den Proteinnachweis über Westernblot Analysen wurden 300 ng Protein pro Spur aufgetragen und die
Proteine über α-PKA-C Antikörper (10 min Belichtung), α-PKA-C-pT197 (30 min) und α-PKA-C-pS338 (2 min)
detektiert. K: Kontrollansatz: Inkubation von PKA-Cα mit λ-Phosphatase für 24 h ohne Zugabe von MnCl2.
An
rekombinantem
Protein
zeigten
sich
schon
nach
30 min
unterschiedlich
dephosphorylierte Phosphoformen, die nur noch partiell an T197 und S338 modifiziert
waren. Nach 24 h Dephosphorylierung mit λ-Phosphatase ließ sich weder T197 noch S338
phosphoryliert nachweisen. In Gegenwart von CIAP war die unterschiedlich effiziente
Dephosphorylierungsrate noch auffälliger. Während sich PKA-Cα aus Säugergewebe weder
an pT197 noch an pS338 dephosphorylieren ließ, zeigte sich an rekombinantem Protein nur
noch ein geringer Phosphorylierungsgrad an beiden P-Stellen (s. Abb. 24, A). Die
beschleunigte Dephosphorylierung auch an den phospatasestabilen P-Stellen pT197 und
74
4. Ergebnisse
pS338 kann hier zum Teil auf das Fehlen der Myristylgruppe an der rekombinanten PKA-Cα
zurückgeführt werden (Liauw et al. 1996). Für eine effiziente Regulation der PKA-Cα
P-Stellen müssen die Phosphatasen möglicherweise bereits während der Proteinsynthese
aktiv sein, um cotranslational angefügte Phosphatgruppen entfernen zu können
(s. Diskussion in 5.3.3). Diese Vermutung wird durch die in dieser Arbeit gewonnenen
Beobachtungen unterstützt, in denen eine Dephosphorylierung von PKA-Cα während einer
Coexpression mit λ-Phosphatase noch deutlich effizienter funktioniert (s. 4.5.1). Auch wenn
sich rekombinante PKA-Cα hier in vitro nicht vollständig dephosphorylieren lässt, könnte das
Fehlen von Phosphatasen für den Hyperphosphorylierungsstatus in E. coli verantwortlich
sein. Bestärkt wird diese Hypothese dadurch, dass im Säuger ausschließlich die
phosphatasestabilen P-Stellen pT197 und pS338 nachgewiesen werden können.
PP5 dephosphoryliert T197 nur an PKA-Cα, die aus Säugergewebe gereinigt wurde
Obwohl die Aktivierung über Phosphorylierung innerhalb der Aktivierungsschleife in Kinasen
einen bekannten Regulationsmechanismus darstellt (Hanks et al. 1988; Morgan et al. 1994;
Yan et al. 1994; Hanks et al. 1995), sind bis heute keine Phosphatasen bekannt, die pT197 an
PKA-Cα dephosphorylieren können. Diskutiert wird, ob eine Konformationsänderung der
PKA-Cα unter bestimmten physiologischen Bedingungen eine Dephosphorylierung von
pT197 ermöglicht (Liauw et al. 1996; Humphries et al. 2005) (s. 5.4).
Verschiedene Serin/Threonin-Proteinphosphatasen mit breiter Substratspezifität (PP1, PP2A,
PP2Ca, PP5, CIAP) wurden in dieser Arbeit auf ihre Fähigkeit hin untersucht, pT197 an
rekombinantem und endogenem Protein aus Muskelgewebe zu dephosphorylieren. Analog
zu Liauw et al., die eine pT197 Dephosphorylierung mit PP1, PP2A und CIAP nicht an nativen,
sondern erst an mit Urea behandeltem Protein detektieren konnten (Liauw et al. 1996), ließ
sich
an
rekombinanter
PKA-Cα
mit keiner
der getesteten
Phosphatasen
eine
Dephosphorylierung für pT197 nachweisen (s. Abb. 25, B). Interessanterweise war jedoch
die Phosphatase PP5 in der Lage, in Anwesenheit von Arachidonsäure eine Dephosphorylierung von pT197 an aus Säugergewebe isolierter PKA-Cα zu erzielen (s. Abb. 25, A). Die
Dephosphorylierungsreaktion war zeit- und konzentrationsabhängig und ließ sich durch
Okadasäure, einem spezifischen Proteinphosphataseinhibitor inhibieren. pS338 hingegen
wurde von PP5 nur zu einem geringeren Anteil dephosphoryliert. An rekombinanter PKA-Cα
konnte PP5 nur einen Anteil der über Phos-tagTM SDS-PAGE aufgetrennten Proteinspezies
75
4. Ergebnisse
dephosphorylieren (s. Abb. 25, B). Auch hier verlief die Abnahme der P-Stellen,
nachgewiesen über die schnellere Laufgeschwindigkeit der geringer phosphorylierten
Proteine, in Abhängigkeit von Arachidon- (PP5-Aktivator) bzw. Okadasäure (PP5-Inhibitor).
Der Unterschied in der Effizienz der Dephosphorylierung zwischen rekombinanter und aus
Gewebe isolierter PKA-Cα könnte dabei zum einen an der in E. coli auftretenden
Hyperphosphorylierung liegen oder aber auch durch die fehlende Myristoylierung des
rekombinanten Proteins beeinflusst werden.
Abb. 25: Nachweis einer in vitro Dephosphorylierung von pT197 an PKA-Cα mit verschiedenen
Phosphatasen.
Links: 0,5 µM PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus (A) Schweineskelettmuskel bzw. aus
(B) E. coli gereinigt und bei 30°C für 1 h nach Herstellerangaben mit verschiedenen Proteinphosphatasen (PP)
behandelt. PP5 wurde mit Arachidonsäure (Ara) aktiviert und mit Okadasäure (OA) inhibiert. Mitte, rechts: Für
PP5 in Anwesenheit von Arachidonsäure wurde die Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit der Dephosphorylierungsreaktion untersucht. PKA-CαCoPP: dephosphoryliertes Kontrollprotein nach Coexpression mit
λ-Phosphatase (0P) (s. 4.5.1). Für den Proteinnachweis über Westernblot Analysen wurden 50 ng Protein pro
TM
Spur (SDS-PAGE) bzw. 300 ng Protein pro Spur (Phos-tag SDS-PAGE) aufgetragen und die Proteine über
α-PKA-C Antikörper (10 min Belichtung), α-PKA-C-pT197 (20 min) und α-PKA-C-pS338 (20 min) detektiert.
4.4
Autophosphorylierung als Ursache für die Hyperphosphorylierung von PKA-Cα in
E. coli
Da durch Punktmutationen inaktivierte PKA-Cα in E. coli keinerlei Phosphorylierungen
aufweist, wird vermutet, dass sich derartige Modifikation nur über einen autokatalytischen
Prozess von Seiten aktiver PKA-Cα erklären lassen (Yonemoto et al. 1993a; Yonemoto et al.
1997; Iyer et al. 2005a; Iyer et al. 2005b). Zudem sind Kinasen, die aktiv in Bakterien
76
4. Ergebnisse
exprimiert werden können meist autokatalytisch aktive Enzyme. Die geringe Effizienz und
Konzentrationsabhängigkeit der Autophosphorylierung während der Expression in E. coli und
in vitro unterstützen dabei einen intermolekularen Phosphorylierungsmechanismus, der
möglicherweise cotranslational initiert wird (s. Diskussion in 5.3.3) (Herberg et al. 1993a;
Steinberg et al. 1993; Girod et al. 1996; Cauthron et al. 1998).
Um auszuschließen, dass die vollständig unterdrückte Phosphorylierung bei KinaseTotmutanten nicht auf einen durch die Mutation ausgelösten Nebeneffekt zurückzuführen
ist, wurde auch der Phosphorylierungsstatus einer zellfrei exprimierten His 6- PKA-Cα
untersucht. Dort nachgewiesene Phosphorylierungen müssen auf Autophosphorylierungsprozessen beruhen, da mittels zellfreier, auf einem E. coli Lysat basierender Expression keine
posttranslationalen Modifikationen möglich sind.
4.4.1 Katalytisch inaktive PKA-Cα ist nicht phosphoryliert
Die in E. coli exprimierte katalytisch inaktive Kinase-Totmutante His6- PKA-Cα K72H wurde
mittels Phos-tagTM SDS-PAGE, Westernblot und MS Analysen als vollständig unphosphoryliert nachgewiesen (s. Abb. 26, A und C; für MS/MS Sequenzierung s. Anhang 9.4). Die
höher laufende Bande im Phos-tagTM Gel ließ sich auf eine Kontamination mit dem Hitzeschockprotein Hsp60 zurückführen. Ein zweites Signal im dekonvoluiertem MS Spektrum mit
einer Massenabweichung von 76,5 Da ist vermutlich in Folge der Probenpräparation, die hier
in Gegenwart von ß-Mercaptoethanol erfolgt ist, entstanden und stellt ein zusätzliches
ß-Mercaptoethanoladdukt dar (Krishna et al. 1993; Papov et al. 1994).
4.4.2 Zellfrei exprimierte PKA-Cα zeigt trotz fehlender T197 Phosphorylierung eine
Autophosphorylierung an S338
His6- PKA-Cα wurde in einem zellfreien Expressionssystem (RTS100 E. coli HY Kit von Roche)
exprimiert (Knape 2010), in dem laut Herstellerangabe ohne Addition weiterer Zusätze keine
PTMs möglich sind (Roche 2007). Ein möglicher Phosphatgruppendonor steht jedoch in Form
des für die in vitro Proteinsynthese zugesetzten 1 mM ATP zur Verfügung (persönliche
Mitteilung von Roche). Die Molekulargewichtsbestimmung für His6- PKA-Cα zeigte, wie für
die Kinase-Totmutante His6- PKA-Cα K72H ein Signal für vollständig unphosphoryliertes
Protein. Das zweite Signal mit einer Massenabweichung von 76,5 Da wurde auch hier in
einer zusätzlichen Modifikation mit ß-Mercaptoethanol vermutet (s. Abb. 26, B).
77
4. Ergebnisse
Abb. 26: Nachweis von Phosphorylierungen an in E. coli exprimierter muriner His6- PKA-Cα K72H und an
His6- PKA-Cα, die in einem zellfreien Expressionssystem exprimiert wurde (His6- PKA-Cα CFE).
(A, B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer
Genauigkeit von ±1 Da (für His6- PKA-Cα K72H) und ±7 Da (für His6- PKA-Cα CFE) unphosphorylierter PKA-Cα
zuordnen (vgl. Anhang 9.3). Für die Signale mit einer Massendifferenz von 76,5 Da wurde eine β-MercaptoTM
ethanolmodifikation (β-ME) vermutet. Der Einschub zeigt die Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag
SDS-PAGE. Die Detektion erfolgte für 3 µg His6- PKA-Cα K72H mit Coomassie-Färbelösung. Die höher laufende
Bande ließ sich auf eine Kontamination mit dem Hitzeschockprotein Hsp60 zurückführen. 100 ng
His6- PKA-Cα CFE wurden aufgrund der geringen Proteinkonzentration über Westernblot Analyse mit α-PKA-C
Antikörper (10 min Belichtung) nachgewiesen. P-Stellen und zusätzliche Modifikationen wurden über MS/MS
Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4). (C) In vitro Autophosphorylierung (Auto-P) und PDK-1 Phosphorylierung (PDK-1-P). (D) Nachweis der S338 Phosphorylierung an His6- PKA-Cα CFE in Anwesenheit von 40 µM
PKI bzw. 200 µM H89 (ergänzt und modifiziert nach Knape 2010). Identifizierung von 50 ng PKA-Cα über
Westernblot Analysen mit α-PKA-C Antikörper (2 min Belichtung), α-PKA-C-pT197 (5 min) und α-PKA-C-pS338
(5 min).
Das schnelle Laufverhalten der His6- PKA-Cα CFE innerhalb der Phos-tagTM SDS-PAGE sowie
die MS/MS Analyse (s. Anhang 9.4) wiesen auf gering bzw. nur noch an S338 phosphoryliertes Protein hin. Die Autophosphorylierung an S338 ließ sich nach Zugabe des
78
4. Ergebnisse
ATP Analogs H89 oder in Gegenwart des Proteinkinaseinhibitors PKI während der Proteinexpression inhibieren (s. Abb. 26, D). T197 hingegen konnte erst durch nachträgliche PDK-1
Behandlung phosphoryliert werden (s. Abb. 26, C und D). In dem spektrophotometrischen
Aktivitätstest nach Cook et al. (Cook et al. 1982) konnte für His6- PKA-Cα CFE keine
spezifische Aktivität nachgewiesen werden. Im direkten Vergleich mit der Kinase-Totmutante
ließ sich aber in Westernblot Analysen mit α-Phospho-PKA-Substrat Antikörper eine
vergleichbar geringe Substratphosphorylierung von PKA-RIIβ durch His6- PKA-Cα CFE zeigen
(Knape 2010). Diese war von der T197 Phosphorylierung unbeeinflusst. Eine Autophosphorylierung an S338 scheint somit schon bei geringen PKA-Cα Konzentrationen möglich zu sein
und anders als bislang angenommen, nicht von einer initialen Phosphorylierung an T197
abzuhängen (Iyer et al. 2005b; Pickin et al. 2008). Ein erweitertes Vorhersagemodell für die
phosphorylierungsabhängige Aktivierung der PKA-Cα wird in 5.3.3 diskutiert.
4.5
Die Hyperphosphorylierung von PKA-Cα in E. coli beruht nicht ausschließlich auf
Autophosphorylierung
Um gering phosphoryliertes, aber, anders als für His6- PKA-Cα K72H und His6- PKA-Cα CFE,
noch aktives Enzym zu erhalten, wurde PKA-Cα in Gegenwart von λ-Phosphatase in E. coli
coexprimiert (PKA-CαCoPP) und anschließend in vitro Autophosphorylierungsexperimente mit
PKA-CαCoPP durchgeführt.
4.5.1 Die Coexpression mit λ-Phosphatase verringert die Anzahl der Phosphorylierungen an
PKA-Cα
Nach Reinigung über PKI5-24-Affinitätschromatographie konnten Proteinspezies von
PKA-CαCoPP ohne und mit maximal einer Phosphorylierung über Molekulargewichtsbestimmung nachgewiesen werden. pT197 und pS338 wurden über MS/MS Sequenzierung
(s. Anhang 9.4) und Westernblot Analyse (s. Abb. 27) beide als P-Stellen identifiziert. Eine in
Kooperation mit Dr. Jörg Seidler durchgeführte quantitative Auswertung über Signalintensitätsmessung nach Seidler et al. 2009 ergab mit 34 % Phosphorylierung an T197 und
18 % Phosphorylierung an S338 jedoch auch eine deutliche Abnahme der Modifikation an
den beiden als phosphatase-stabil beschriebenen P-Stellen.
79
4. Ergebnisse
Abb. 27: Phosphorylierungsstatus der rekombinanten, in E .coli exprimierten murinen PKA-Cα nach
Coexpression mit λ-Phosphatase.
Rekombinante PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus E. coli gereinigt. (A) Proteindetektion
TM
über SDS-PAGE und (B) Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag SDS-PAGE mit Coomassie-Färbelösung (je 3 µg Protein). Identifizierung von 50 ng PKA-Cα über Westernblot Analysen mit α-PKA-C Antikörper
(1 min Belichtung). Phosphorylierungen an T197 (α-PKA-C-pT197; 5 min) und S338 (α-PKA-C-pS338, 5 min)
wurden mit phosphospezifischen Antikörpern nachgewiesen. (C) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLCESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da verschiedenen Phosphoformen
der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen pro Phosphoform. P-Stellen und zusätzliche
Modifikationen wurden über MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4).
Über Co2+-Affinitätschromatographie gereinigte His6-PKA-CαCoPP zeigte im Vergleich zu der
über
PKI5-24-Affinitätschromatographie
isolierter
PKA-CαCoPP
eine
unveränderte
Phosphorylierung an T197, während S338 hier zu einem höheren Prozentsatz phosphoryliert
vorlag (Abb. 28). Proteinspezies, die zwar an S338, nicht jedoch an T197 phosphoryliert sind,
lassen sich demzufolge nur mit geringer Effizienz über PKI5-24-Affinitätschromatographie
reinigen (s. Diskussion in 5.3.4) (Steinberg et al. 1993; Cauthron et al. 1998; Steichen et al.
2010). Wider Erwarten ließen sich jedoch auch für PKA-CαCoPP vollständig unphosphorylierte
Proteinspezies über PKI5-24-Affinitätschromatographie reinigen, welches aufgrund der
höheren Reinheit bevorzugt verwendet wurde (s. Abb. 28). Letztlich war es erst aufgrund der
reduzierten aber nicht vollständig unterdrückten Phosphorylierung an T197 und S338
möglich, anders als bei vollständig inaktivem Enzym, eine direkte in vitro Autophosphorylierung von PKA-CαCoPP zu verfolgen (s. 4.5.3).
80
4. Ergebnisse
Abb. 28: PKA-CαCoPP und His6- PKA-CαCoPP zeigen
unterschiedlich starke Phosphorylierung an S338.
PKA-Cα wurde aus E. coli gereinigt und über SDS-PAGE
aufgetrennt. Für die Proteindetektion mit Coomassie-Färbung
wurde 1 µg Protein, für Westernblot Analysen 50 ng Protein
pro Spur aufgetragen: α-PKA-C Antikörper (2 min Belichtung),
α-PKA-C-pT197 (30 min) und α-PKA-C-pS338 (10 min).
M: Molekulargewichtsstandard.
4.5.2 Die Coexpression mit λ-Phosphatase reduziert die Aktivität und PKI-Affinität von
PKA-Cα
Die spezifische Aktivität von PKA-CαCoPP betrug im Vergleich zu der unter Standardbedingungen in E. coli exprimierten PKA-Cα nur 26 % (s. 4.5.3, Abb. 34). Eine weniger affine
PKI-Bindung wurde qualitativ in einem Pulldown Experiment mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie nachgewiesen (s. Abb. 29): Aus einem Proteingemisch mit äquimolaren
Mengen PKA-Cα und Rinderserumalbumin als unspezifisch bindendem Protein ließ sich
PKA-CαCoPP im Vergleich zu PKA-Cα nicht vollständig über PKI5-24-Affinitätsmatrix aus dem
Proteinüberstand entfernen (s. Abb. 29, Spur 2). Auf eine verringerte PKI-Affinität von
PKA-CαCoPP weist außerdem der größere Anteil an eluiertem Protein hin (s. Abb. 29, Spur 5).
Zur quantitativen Bestimmung der Geschwindigkeitsratenkonstanten für Assoziation (k a) und
Dissoziation (kd) sowie der Gleichgewichtsbindungskonstante (KD) in Gegenwart von
ATP/Mg2+ wurde mittels SPR (surface plasmon resonance) die Bindungen von PKA-Cα
(Konzentrationsreihe von 1,2 nM–900 nM) an GST-PKI untersucht. PKA-CαCoPP zeigte im
Gegensatz zu PKA-Cα ein biphasisches Kurvenverhalten (s. Abb. 30, A und B), welches auf
eine konzentrationsabhängige, während der Messung stattfindende Autophosphorylierung
des Proteins in Anwesenheit von ATP/Mg2+ zurückgeführt werden konnte (vgl. Abb. 32).
81
4. Ergebnisse
Abb. 29: Untersuchung der Bindung zwischen
PKA-Cα und PKI in einem Pulldown Experiment
mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie.
(A) 6 µM PKA-Cα bzw. (B) PKA-CαCoPP wurden mit
äquimolaren Mengen Rinderserumalbumin (BSA)
versetzt und anschließend mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie (5, 6) bzw. über eine Kontrollmatrix
(EtNH2-Gel) (7, 8) in Gegenwart von 3 mM ATP/5 mM
2+
Mg isoliert. Für die Proteindetektion wurden die
Proben über SDS-PAGE aufgetrennt und mit
Coomassie-Färbelösung nachgewiesen.
M: Molekulargewichtsstandard.
Direktes Injizieren von ATP/Mg2+ vor jedem einzelnen Messzyklus minimierte das
biphasische Kurvenverhalten (s. Abb. 30, C). Die verringerte PKI Affinität von PKA-CαCoPP
(KD von 43 nM gegenüber KD für PKA-Cα von 0,6 nM) ließ sich auf eine zehnfach
verlangsamte
Assoziation
und
eine
fünffach
schneller
Dissoziation
zurückführen
(s. Abb. 30, G). Nach 6 h in vitro Autophosphorylierung von PKA-CαCoPP lag der KD für PKI mit
3,6 nM wieder im einstellig nanomolaren Bereich und damit in der Größenordnung der
Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD von PKA-Cα. Für die Messung der GST-PKI Bindung
von PKA-CαCoPP in Abwesenheit von ATP/Mg2+ ließ sich auch im mikromolaren Bereich kein
für PKA-Cα typisches transientes Bindungsverhalten (s. Abb. 30, E und F) nachweisen.
Eine Aggregation von PKA-CαCoPP als mögliche Ursache für die weniger affine PKI-Bindung
konnte in einer analytischen Gelfiltration nicht nachgewiesen werden. Selbst bei Proteinkonzentrationen im mikromolaren Bereich zeigte PKA-CαCoPP ein zu PKA-Cα unverändertes
Elutionsverhalten (s. Abb. 31). Neben dem Hauptsignal bei 41 kDa war ein Signal in späteren
Elutionsfraktionen zu erkennen, das von einer möglichen Proteindegradation verursacht
werden kann, bei PKA-CαCoPP im Vergleich zu PKA-Cα jedoch nicht verstärkt aufgetreten ist.
82
4. Ergebnisse
Abb. 30: Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Interaktion zwischen PKA-Cα und GST-PKI
mittels SPR.
Verschiedene Konzentrationen an PKA-Cα (grau hinterlegt) bzw. PKA-CαCoPP wurden in An- (A-D) und
2+
Abwesenheit (E,F) von 1 mM ATP/10 mM Mg auf ihr Bindungsverhalten an den auf einem SPR-Oberflächenchip immobilisierten Proteinkinaseinhibitor (GST-PKI) getestet. Die Messungen erfolgten bei einer Flussrate von
25 µl/min, wobei Assoziations- und Dissoziationsphase jeweils für 5 min verfolgt wurden. (A, B und D)
2+
ATP/Mg wurde unter Standardbedingungen (maximale Inkubationsdauer 3 h) dem Verdünnungs- und Laufpuffer zugesetzt bzw. (C) direkt vor jedem einzelnen Messzyklus injiziert (Inkubationsdauer 10 min). (G) Unter
Verwendung der BiaEvaluation Software Version 4.1 und Annahme eines Langmuir 1:1 Bindungsmodells
wurden Assoziations- (ka), Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten (kd) und Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für die Bindung von GST-PKI an PKA-Cα bestimmt (genutzter Konzentrationsbereich:
11-300 nM).
83
4. Ergebnisse
Abb. 31: Analytische
Gelfitration
zum
Nachweis
einer
möglichen
Proteinaggregation von PKA-CαCoPP.
6 µM PKA-Cα (pink) bzw. PKA-CαCoPP (lila)
wurden einer Gelfiltration (Superdex 200)
unterzogen. Als Kontrolle wurden Dextran
Blau (1,5 µM), BSA (45 µM) und Ovalbumin
(70 µM) und der verwendete Lagerpuffer
(200 mM Argininpuffer) injiziert. Ihre
Elutionsmaxima sind als Pfeile dargestellt.
4.5.3 Nachweis der Autophosphorylierung von PKA-CαCoPP mittels Phos-tagTM SDS-PAGE
Eine zeitabhängige Autophosphorylierung von PKA-CαCoPP wurde über Phos-tagTM SDS-PAGE
untersucht und die Phosphoformen über MS/MS Sequenzierung (s. Anhang 9.4) und
Molekulargewichtsbestimmung
(s. Abb. 33)
sowie
Westernblot Analysen
(s. Abb. 35)
analysiert. In Abwesenheit von ATP ließ sich über Phos-tagTM SDS-PAGE keine PKA-Cα Autophosphorylierung nachweisen (s. Abb. 32, A). Der deutliche Proteinverlust nach mehrstündiger Inkubation bei 30°C weist hier auf eine verringerte Thermostabilität für das
dephosphorylierte Proteins hin (Yonemoto et al. 1997). Der Zusammenhang zwischen der
Autophosphorylierungseffizienz und der PKA-Cα Konzentration (vgl. Abb. 32, B und C) deutet
auf einen intermolekularen Phosphorylierungsmechanismus hin (Herberg et al. 1993a;
Steinberg et al. 1993; Girod et al. 1996; Cauthron et al. 1998) (s. Diskussion in 5.3.3). Auch
eine mögliche Phosphorylierung in trans über His6- PKA-Cα (s. Abb. 32, D) befürwortet diese
Hypothese. His6- PKA-Cα lässt sich dabei wegen seines zusätzlich phosphorylierten HistidinFusionsanteils nicht über Phos-tagTM SDS-PAGE auftrennen, wodurch die von PKA-CαCoPP
generierten Signale unbeeinflusst bleiben (s. Abb. 32, D und E).
Der Vergleich von PKA-CαCoPP zu der unter Standardbedingungen in E. coli exprimierten
PKA-Cα zeigt, dass auch nach 24 h Autophosphorylierung die dominant vorherrschende
Phosphoform nur zwei Phosphorylierungen trägt (s. Abb. 33) und somit den im Säuger
identifizierten Phosphorylierungszustand widerspiegelt. Der innerhalb der Phos-tagTM
SDS-PAGE aufgetretene Laufunterschied zwischen in vitro phosphorylierter PKA-CαCoPP und
endogener PKA-Cα aus Herzmuskelgewebe (s. Abb. 32, F) kann auf die zusätzliche
Modifikation mit Myristinsäure im Säuger zurückzuführen sein. Auch für die zweifach
84
4. Ergebnisse
phosphorylierte PKA-Cα, die aus Schweineskelettmuskel isoliert wurde, ließ sich die Anzahl
der P-Stellen mittels in vitro Autophosphorylierungs nicht weiter erhöhen (s. Abb. 32, G).
TM
Abb. 32: Nachweis der PKA-Cα in vitro (Auto-) phosphorylierung über Phos-tag SDS-PAGE.
PKA-Cα wurde in Gegenwart von λ-Phosphatase exprimiert, über PKI5-24-Affinitätschromatographie gereinigt
und in verschiedenen Phosphorylierungsansätzen bei 30°C untersucht. (A-E) Zu den Zeitpunkten t = 5 sek, 5, 15,
TM
30, 60 min, 3, 6 und 24 h wurden Proben entnommen und über Phos-tag SDS-PAGE (3 µg Protein pro Spur,
Coomassie-Färbung) aufgetrennt. (F) Vergleich der Wanderungsgeschwindigkeiten von PKA-CαCoPP nach 24 h
in vitro Autophosphorylierung (24 h), mit PKA-Cα, die unter Standardbedingungen in E. coli exprimiert bzw. aus
Schweineherzmuskelgewebe gereinigt worden ist (end PKA-Cα). (G) In vitro Autophosphorylierung von aus
Schweineherzmuskelgewebe gereinigter PKA-Cα. Für den Proteinnachweis mittels Westernblot Analyse wurden
300 ng Protein pro Spur über einen α-PKA-C Antikörper (30 min Belichtung) detektiert.
85
4. Ergebnisse
Abb. 33: Nachweis verschiedener PKA-Cα Phosphoformen während einer in vitro Autophosphorylierung.
PKA-Cα wurde in Gegenwart von λ-Phosphatase exprimiert, über PKI5-24-Affinitätschromatographie gereinigt
und in einer zeitabhängigen Phosphorylierungsreaktion bei 30°C untersucht: Zu den Zeitpunkten t = 0, 5 sek, 5,
30 min, 6 und 24 h wurden Proben entnommen und das Molekulargewicht mittels nanoLC-ESI-MS bestimmt.
Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±4 Da verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα
TM
zuordnen (vgl. Anhang 9.3). Die Gelausschnitte zeigen die Auftrennung von 3 µg Protein über Phos-tag
SDS-PAGE.
Abb. 34: Die spezifische Aktivität der PKA-Cα ist vom
Phosphorylierungsstatus abhängig.
PKA-Cα wurde in Gegenwart von λ-Phosphatase exprimiert,
über PKI5-24-Affinitätschromatographie gereinigt und in einer
zeitabhängigen Phosphorylierungsreaktion in Anwesenheit
2+
von 1 mM ATP/10 mM Mg untersucht: Zu den Zeitpunkten
t = 0, 5, 30 min, 6 h und 24 h wurde die spezifische Aktivität
mittels Cook-Assay ermittelt sowie Proteine über SDS-Page
TM
bzw. Phos-tag SDS-PAGE (beide Coomassie gefärbt)
aufgetrennt (n = 3).
86
4. Ergebnisse
Nach enzymatischen Verdau der im Phos-tagTM Gel aufgetrennten Proteinbanden und
anschließender MS/MS Analyse konnten einzelne P-Stellen den voneinander getrennten
Phosphoformen zugewiesen werden (s. Abb. 35). Die Phosphoformen unterschieden sich
dabei nicht nur in der Anzahl, sondern auch in der Lokalisation ihrer P-Stellen. Die in Folge
der Autophosphorylierung beobachtete Aktivitätssteigerung (s. Abb. 34) sowie die
verringerte Laufgeschwindigkeit innerhalb der SDS-PAGE lieferten Anzeichen für eine
Phosphorylierung an T197 (Steinberg et al. 1993; Liauw et al. 1996; Cauthron et al. 1998).
Die Kombination von Phos-tagTM SDS-PAGE und Westernblot Analyse mit den phosphospezifischen Antikörpern α-PKA-C-pT197 und α-PKA-C-pS338 zeigte jedoch, dass, obwohl
ursprünglich nur 34 % der Proteinspezies an T197 phosphoryliert sind (vgl. 4.5.1), es an
dieser Stelle zu keiner weiteren signifikanten Phosphorylierung kommt, während S338
exzessiv phosphoryliert wird (s. Abb. 35). Dies unterstützt die Theorie, wonach die
Phosphorylierung an T197 cotranslational erfolgen muss und diese Stelle an vollständig
gefaltetem Protein nicht nachträglich modifiziert werden kann (Girod et al. 1996). S10 und
S338 waren die einzigen Aminosäuren, die in vitro autophosphoryliert werden konnten. Die
Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tagTM SDS-PAGE zeigte Phosphoformen, die an
S338, jedoch nicht an T197 phosphoryliert waren (s. Abb. 35). Dies widerspricht dem
sequenziellen Phosphorylierungsmodell, wonach die Phosphorylierung an T197 eine
Voraussetzung für die nachfolgende intramolekulare Phosphorylierung an S338 darstellt
(Iyer et al. 2005b; Pickin et al. 2008). Die hier gewonnenen Erkenntnisse erforderten ein
modifiziertes Modell für die hierachische Abfolge und Dynamik der PKA-Cα P-Stellen
(s. Diskussion in 5.3.3).
87
4. Ergebnisse
TM
Abb. 35: Nachweis der in vitro Autophosphorylierung von PKA-Cα mittels Phos-tag SDS-PAGE.
PKA-Cα wurde in Gegenwart von λ-Phosphatase exprimiert, über PKI5-24-Affinitätschromatographie gereinigt
2+
und in einer zeitabhängigen Phosphorylierungsreaktion bei 30°C in Anwesenheit von 1 mM ATP/10 mM Mg
untersucht: Zu den Zeitpunkten t = 0 sek, 5, 15, 30, 60 min, 3 h und 6 h wurden Proben entnommen und über
TM
Phos-tag
SDS-PAGE aufgetrennt. Mittels Molekulargewichtsbestimmung identifizierte Phosphoformen
(vgl. Abb. 33) bzw. über MS/MS nachgewiesene P-Stellen (s. Anhang 9.4) sind für die Banden 1-9 angegeben.
Für den Proteinnachweis über Coomassie-Färbung wurden 3 µg Protein pro Spur verwendet. Für Westernblot
Analysen wurden 300 ng Protein pro Spur aufgetragen und die Proteine über α-PKA-C Antikörper (15 min
Belichtung), α-PKA-C-pT197 (30 min) und α-PKA-C-pS338 (30 min) detektiert.
88
4. Ergebnisse
Optimierte Reinigungsbedingungen reduzieren die Phosphorylierung an T197 und
verlangsamen die in vitro Autophosphorylierung
Ein geringer Prozentsatz der an T197 und S338 verbliebenen Autophosphorylierung von
PKA-CαCoPP ließ sich auf die Gegenwart von 3 mM ATP/5 mM Mg2+ während der
PKI5-24-Affinitätschromatographie zurückführen. Um diese artifiziell herbeigeführte Autophosphorylierung der PKA-CαCoPP zu minimieren, wurde die PKI5-24-Affinitätschromatographie in Anwesenheit von der Phosphatase CIAP (Roche) in Lyse- und Waschpuffer
durchgeführt. Über phosphospezifische Antikörper ließen sich neben einer unveränderten
Phosphorylierung an S338 geringere Mengen an pT197 detektieren (s. Abb. 36, A). Mittels
Molekulargewichtsbestimmung konnte eine Reduzierung der einfach phosphorylierten
Proteinspezies gezeigt werden (s. Abb. 36, B).
Abb. 36: Die Zugabe von CIAP während der Reinigung von PKA-CαCoPP reduziert die Phosphorylierung an
T197 und verringert die Effizienz der nachfolgenden in vitro Autophosphorylierung.
(A) Nachweis der Phosphorylierung über SDS-PAGE und Westernblot Analyse mit α-PKA-C Antikörper (10 min
Belichtung), α-PKA-C-pT197 (10 min) und α-PKA-C-pS338 (10 min). (B) Molekulargewichtsbestimmung über
nanoLC-ESI-MS. Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von ±1 Da verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα zuordnen (vgl. Anhang 9.3). (C) Vergleich der Autophosphorylierungseffizienz: Während
2+
einer zeitabhängigen Phosphorylierungsreaktion in Anwesenheit von 1 mM ATP/10 mM Mg wurden zu den
TM
Zeitpunkten t = 0, 5, 30 min, 6 h und 24 h Proteine über SDS-PAGE bzw. Phos-tag SDS-PAGE aufgetrennt.
Die Zugabe von CIAP während der Reinigung der PKA-CαCoPP zeigte keinen signifikanten
Einfluss auf die spezifische Aktivität, die im Vergleich zu der unter Standardbedingungen
gereinigten PKA-Cα unverändert bei ca. 10 U/mg lag, sich jedoch nach Autophosphorylierung
89
4. Ergebnisse
nicht weiter steigern ließ. Der Vergleich der Autophosphorylierungsreaktionen über
Phos-tagTM SDS-PAGE zeigt, dass in Folge der verringerten Phosphorylierung an T197 die
Autophosphorylierung nur noch stark verlangsamt abläuft (s. Abb. 36, C). Diese Beobachtung
unterstützt die Theorie nach Iyer et al., wonach die initiale Phosphorylierung an T197 eine
nachfolgende Autophosphorylierung an S338 fördert (Iyer et al. 2005b) (s. Diskussion in
5.3.3). Letztendlich muss, wie für PKA-CαCoPP gezeigt ein gewisser Prozentsatz an T197
phosphoryliertem Protein vorhanden sein, damit die hier gezeigten Autophosphorylierungsexperimente durchgeführt werden können.
4.6
Die Phosphorylierung von S53 - ein möglicher Regulationsmechanismus für die
spezifische Aktivität der PKA-Cα
Von den neu entdeckten P-Stellen wurde S53 für weiterführende funktionelle Studien
ausgewählt. Seine räumlich flexible Position innerhalb der in Kinasen hoch konservierten
glycinreichen Schleife (49LGTGSFGRV57) (Hanks et al. 1988; Hanks et al. 1995; Hemmer et al.
1997b; Grant et al. 1998; Aimes et al. 2000), die unmittelbare Nähe zu pT197 und
Positionierung nahe des katalytischen Zentrums lassen eine regulatorische Funktion dieser
Aminosäure vermuten.
Die glycinreiche Schleife fungiert nach Bindung von ATP und Substrat als ein molekularer
Klappmechanismus und ermöglicht innerhalb der geschlossenen Konformation der PKA-Cα
eine optimale Positionierung des ATP sowie einen Phosphatgruppentransfer unter
Wasserausschluss (Hemmer et al. 1997b). Kristallstrukturen des ternären ATP-SubstratEnzymkomplexes zeigen, dass neben den konservierten Glycinen G50, G52, G55 auch S53 an
der Stabilisierung dieses Übergangzustandes beteiligt ist (Knighton et al. 1991a; Knighton
et al. 1991b; Bossemeyer et al. 1993; Bossemeyer 1994; Narayana et al. 1997) (s. Abb. 37):
Über eine Wasserstoffbrücke zwischen der Aminogruppe des Peptidrückgrates von S53 und
dem γ-Phosphat wird das ATP Molekül optimal zu seinem Substrat positioniert (Grant et al.
1998; Aimes et al. 2000). Eine mögliche Beteiligung der Hydroxylseitengruppe von S53 an
der Substratbindung wird kontrovers diskutiert (Bossemeyer 1994; Aimes et al. 2000).
Mutagenesestudien widerlegen eine direkte Beteiligung von S53 an der Regulation der
Aktivität sowie der Inhibitorbindung von PKI und PKA-R (Aimes et al. 2000).
90
4. Ergebnisse
Abb. 37: Kristallstruktur der PKA-Cα im Komplex mit ATP und PKI (PDB: 3FJQ nach Thompson et al. 2009)
visualisiert über VMD 1.8.6 (Humphrey et al. 1996).
Hervorgehoben sind verschiedene Strukturen innerhalb des katalytischen Zentrums, die in die ATP- und
Substratbindung involviert sind (modifiziert nach Grant et al. 1998 und Aimes et al. 2000). Ausschnitt: Neben
der glycinreichen Schleife (grau) sind die katalytische Schleife (lila) und die PKI-Inhibitorsequenz (P-3 bis P-1
Position, blau) mit der hervorgehobenen potenziellen P-Stelle (orange) in einer ribbon-Ansicht dargestellt.
2+
Zusätzlich zu den konservierten Glycinen (grün) und K72 (weiß) sind mit K168, N171, und dem Mg
Koordinator D184 auch Aminosäuren des großen Lobus an der Positionierung des ATP-Moleküls beteiligt.
Katalytisch aktives D166 bildet eine Wasserstoffbrücke zu der Hydroxylgruppe des Substrates aus (Zhou et al.
1997). S53 (rot) sitzt an der Spitze der glycinreichen Schleife. Das Kristallstrukturmodell sagt Wasserstoffbrückenbindungen zwischen (1) der Aminogruppe innerhalb des Peptidrückgrats von S53 und dem y-Phosphat
des ATPs sowie zwischen (2) der Hydroxylseitenkette und der Carboxylgruppe der P-Stelle voraus, wobei nur
ersteres experimentell belegt ist.
Während in E. coli maximal 11-15 % der PKA-Cα Proteinspezies an S53 phosphoryliert
vorliegen (Seidler et al. 2009) (s. 5.1), blieb diese womöglich transiente P-Stelle im Säuger
bislang unentdeckt. Obwohl andere Kinasen, wie z. B. CDKs (cyclin-dependent kinases)
nachweislich über Phosphorylierung innerhalb der glycinreichen Schleifen negativ reguliert
werden (Atherton-Fessler et al. 1993; De Bondt et al. 1993) (s. Diskussion in 5.3.2), wurde
eine indirekte Regulation der PKA-Cα über Phosphorylierung an S53 bislang nicht untersucht.
Mittels molekulargenetischer Methoden wurden phosphomimetische (PKA-Cα S53E,
His6- PKA-Cα S53D) und phosphoablative Proteine (PKA-Cα S53A) der PKA-Cα generiert, um
den Einfluss einer Phosphorylierung an der Aminosäure S53 zu untersuchen. Erste Auffälligkeiten zeigten sich bereits während der Expression und Reinigung der mutagenisierten
Proteine: PKA-Cα S53A ließ sich nicht in E. coli BL21DE3, sondern nur in BL21AI Zellen, in
denen die Proteinexpression unter strikter Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren
Promotors steht, exprimieren. Auch Aimes et al. vermuteten einen „undichten“ T7-Promotor
91
4. Ergebnisse
und toxisches Protein als Ursache für Expressionsprobleme einer PKA-Cα S53G (Aimes et al.
2000). PKA-Cα S53D ließ sich im Gegensatz zu den beiden anderen Proteinen weder über
Kationenaustauscherchromatographie, noch über PKI5-24-Affinitätschromatographie reinigen.
Auch die Reinigung in Form des Holoenzymkomplexes die für inaktive, innerhalb der
glycinreichen Schleife mutagenisierte PKA-Cα eingesetzt worden ist (Hemmer et al. 1997a;
Grant et al. 1998), zeigte hier keinen Erfolg. Daher wurde über Metallionen-Affinitätschomatographie gereinigte His6- PKA-Cα S53D für die vergleichenden Charakterisierungen
ausgewählt. Die Molekulargewichtsbestimmung ergab für die mutagenisierten Proteine,
basierend auf dem Aminosäureaustausch, eine Massenabweichung von -16 Da für
PKA-Cα S53A, von +42 Da für PKA-Cα S53E sowie von +28 Da und zusätzlich +2.163 Da für
den Histidin-Fusionsanteil für His6- PKA-Cα S53D (s. Abb. 38, B, vgl. Anhang 9.3). Neben
einem im Vergleich zu PKA-Cα unveränderten Phosphorylierungsstatus von PKA-Cα S53A
zeigte PKA-Cα S53E eine deutliche Reduzierung der hoch abundant phosphorylierten
Proteinspezies während für His6- PKA-Cα S53D fast ausschließlich zweifach phosphoryliertes
Protein detektiert wurde. Die signifikant verringerte Anzahl an Phosphorylierungen der
His6- PKA-Cα S53D wurde über die Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tagTM
SDS-PAGE sowie über MS/MS Analyse bestätigt (s. Anhang 9.4). Über Signalintensitätsmessung wurde weniger als 5 % verbleibende Phosphorylierung an T197 und S338 detektiert
(s. Abb. 38, C).
Interessanterweise
ließ
sich
pS338,
nicht
jedoch
pT197
über
Westernblot Analysen an His6- PKA-Cα S53D nachweisen (s. Abb. 38, A). Außerdem konnte
für His6- PKA-Cα S53D eine im Vergleich zu PKA-Cα um 9°C verringerte Thermostabilität
nachgewiesen werden (persönliche Mitteilung von J. Elkins, Universität Oxford).
Abb. 38: Vergleich des Phosphorylierungsstatus der an S53 mutagenisierten PKA-Cα.

Rekombinante PKA-Cα wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie (PKA-Cα S53A und S53E) bzw. über
Metallionen-Affinitätschromatographie (His6- PKA-Cα S53D) aus E. coli gereinigt. (A) Identifizierung von je
50 ng PKA-Cα über Westernblot Analysen mit α-PKA-C Antikörper (5 min Belichtung). Phosphorylierungen an
T197 und S338 wurden mit phosphospezifischen Antikörpern (α-PKA-C-pT197, 30 min bzw. α-PKA-C-pS338,
10 min) nachgewiesen. Proteindetektion über SDS-PAGE und Auftrennung der Phosphoformen über
TM
Phos-tag SDS-PAGE mit Coomassie-Färbelösung (je 3 µg Protein). (B) Molekulargewichtsbestimmung über
nanoLC-ESI-MS. oben: Vergleich der Molekulargewichte von PKA-Cα (schwarz) mit Molekulargewichten der an
S53 mutagenisierten PKA-Cα (farbig). unten: Die Molekulargewichte ließen sich mit einer Genauigkeit von
±1 Da (PKA-Cα S53A und S53E) bzw. ±7 Da (His6- PKA-Cα S53D) verschiedenen Phosphoformen der PKA-Cα
zuordnen (vgl. Anhang 9.3): xP: xP-Stellen pro Phosphoform, xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine
Modifikation mit Phosphoglukonsäure (Δm = 258 Da) nachweisen. (C) P-Stellen und zusätzliche Modifikationen
wurden über MS/MS Sequenzierung nachgewiesen (s. Anhang 9.4). Die relative Quantifizierung der P-Stellen
wurde von Dr. J. Seidler nach Seidler et al. 2009 über Signalintensitätsmessung durchgeführt. Die
Prozentangaben geben den jeweiligen Anteil des Phosphopeptids zu der Gesamtanzahl der gefundenen
Peptide in Prozent wieder. An der Position S53 wurde in Folge der Mutation (mut) keine Phosphorylierung
nachgewiesen.
92
4. Ergebnisse
PKA-Cα S53A und PKA-Cα S53E zeigten im Cook-Assay eine unveränderte, durch PKI und alle
PKA-R Isoformen inhibierbare Phosphorylierung von dem synthetischen Heptapeptid
Kemptide (s. Abb. 39, A). Für His6- PKA-Cα S53D konnte ein Substratumsatz erst für
Konzentrationen im dreistellig nanomolaren Bereich mittels eines hochempfindlichen
93
4. Ergebnisse
microfluidic mobility-shift Assay nachgewiesen und eine um vier Größenordnungen
reduzierte Restaktivität von 7 nmol/ min-1 mg-1 bestimmt werden (s. Abb. 40).
Abb. 39: Vergleich der spezifischen Aktivitäten und Substratspezifitäten von an S53 mutagenisierter PKA-Cα
(A) Die spezifischen Aktivität für die Phosphorylierung von S-Kemptide wurden im Cook-Assay ohne Inhibitoren
und in Gegenwart von äquimolaren Mengen an PKI und PKA-R ermittelt. Für die Aktivierung des Holoenzyms
*
wurden 10 µM cAMP eingesetzt. Für His6- PKA-Cα S53D ließ sich keine spezifische Aktivität ermitteln (nd ).
(B) Die spezifischen Aktivitäten für die Phosphorylierung von T-Kemptide wurden im Cook-Assay (mit
Erweiterung des Messfensters auf 60 min) ermittelt. (C) Der direkte Vergleich des Substratumsatzes von S- bzw.
T-Kemptide erfolgte über ein Kompetitionsexperiment mit fluoreszenzmarkiertem FITC-Kemptide (FITC-K) in
einem microfluidic mobility-shift Assay.
Für die katalytisch aktiven PKA-Cα S53A und S53E konnte eine von Aimes et al. diskutierte
Beteiligung von S53 an einer Veränderung der Serin- bzw. Threonin-Substratspezifität
ausgeschlossen werden (Aimes et al. 2000): Innerhalb der Konsensussequenz RRxS/Ty,
RKxS/Ty, KRxS/Ty, KKx-S/Ty (x entspricht einer beliebigen, y einer hydrophoben Aminosäure), werden von PKA-Cα bevorzugt Serinreste phosphoryliert (Kemp 1990; Walsh et al.
1992; Walsh et al. 1994). Mittels eines radioaktiven Phosphorylierungs-Assay konnte eine
100 fach geringere Phosphorylierungseffizienz von LRRATLG gegenüber LRRASLG gezeigt
werden (Aimes et al. 2000). In dem hier verwendeten und weniger sensitiven Cook Assay
war für PKA-Cα lediglich ein Unterschied um den Faktor 10 zu detektieren (vgl. Abb. 39,
A und B). Für den direkten Vergleich des Substratumsatzes von PKA-Cα, PKA-Cα S53A und
94
4. Ergebnisse
S53E wurde der microfluidic mobility-shift Assay verwendet: Die Kompetition von
fluoreszenzmarkiertem FITC-Kemptide war dabei mit dem Kemptide-Derivat (LRRATLG,
T-Kemptide) deutlich ineffizienter als mit dem Standardpeptid (LRRASLG, S-Kemptide): Um
ca. 60 % des Umsatzes von 10 bzw. 1 µM FITC-Kemptide zu kompetieren mussten 100 µM
S-Kemptide bzw. 5 mM T-Kemptide eingesetzt werden. Keines der getesten Proteine zeigte
jedoch weder für S-Kemptide noch für T-Kemptide einen signifikant veränderten
Substratumsatz (s. Abb. 39, C).
Abb. 40: His6- PKA-Cα S53D zeigt im Vergleich zu
PKA-Cα einen um vier Größenordnungen verringerten Substratumsatz.
Der Substratumsatz von fluorenzenzmarkiertem
Kemptide (FITC-Kemptide) zu Phospho-Kemptide mit
His6- PKA-Cα S53D (orange, je zwei unabhängige
Proteinpräparationen) wurde für Konzentrationen im
Bereich von 9 pM bis 100 nM (gezeigt: 45 pM, 140 nM,
700 nM) in einem microfluidic mobility-shift Assay
untersucht. Im direkten Vergleich wurde der Substratumsatz mit 45 pM PKA-Cα (grau, je zwei unabhängige
Proteinpräparationen) bestimmt.
His6- PKA-Cα S53D bindet nicht an den Proteinkinaseinhibitor PKI
Der Verlust der für PKA-Cα spezifischen Affinität zu dem Proteinkinaseinhibitor PKI wurde für
His6- PKA-Cα S53D in voneinander unabhängigen Pulldown und SPR Experimenten gezeigt:
Aus einem Proteingemisch, bestehend aus äquimolaren Mengen PKA-Cα und Rinderserumalbumin als unspezifisch bindendem Protein, ließen sich nur geringe Mengen an
His6- PKA-Cα S53D mittels PKI5-24-Affinitätschromatographie entfernen (s. Abb. 41, Spur 2).
Der im Vergleich zu PKA-Cα geringe Proteinanteil, der sich über PKI5-24-Affinitätschromatographie reinigen ließ (s. Abb. 41, Spur 6) war dabei auf eine unspezifische Bindung
an die Agarosematrix zurückzuführen (s. Abb. 41, Spur 8).
Auch an den auf einem SPR-Oberflächenchip immobilisierten Proteinkinaseinhibitor
(GST-PKI) war für His6- PKA-Cα-S53D selbst im mikromolaren Konzentrationsbereich in Anund Abwesenheit von ATP/Mg2+ keine Bindung zu detektieren (s. Abb. 42). Die Beobachtung,
dass sich das Protein auch nicht in Form des Holoenzymkomplexes mit His6- PKA-RIIα G337E
reinigen ließ, lässt zudem eine Beeinträchtigung der Affinität zu PKA-R vermuten.
95
4. Ergebnisse
Abb. 41: Untersuchung der Bindung zwischen PKACα und PKI in einem Pulldown Experiment mittels
PKI5-24 –Affinitätschromatographie.
(A) 6 µM PKA-Cα bzw. (B) His6- PKA-Cα S53D wurden
mit äquimolaren Mengen Rinderserumalbumin (BSA)
versetzt und anschließend mittels PKI5-24 -Affinitätschromatographie (5, 6) bzw. über eine Kontrollmatrix
(EtNH2-Gel) (7, 8) in Gegenwart von 3 mM ATP/5 mM
2+
Mg isoliert. Für die Proteindetektion wurden die
Proben über SDS-PAGE aufgetrennt und mit
Coomassie-Färbelösung nachgewiesen.
M: Molekulargewichtsstandard.
Abb. 42: Interaktionsanalysen von PKA-Cα Untereinheiten an GST-PKI mittels SPR.
Verschiedene Konzentrationen von PKA-Cα bzw. His6- PKA-Cα S53D wurden in An- (A, B) und Abwesenheit
2+
(C, D) von 1 mM ATP/10 mM Mg auf ihr Bindungsverhalten an den auf einem SPR-Oberflächenchip
immobilisierten Proteinkinaseinhibitor (GST-PKI) getestet. Die Messungen erfolgten bei einer Flussrate von
25 µl/min, wobei Assoziations- und Dissoziationsphase jeweils für 5 min verfolgt wurden.
96
5. Diskussion
5
5.1
DISKUSSION
Limitationen beim MS basierten Nachweis von Phosphorylierungsstellen der PKA-Cα
Trotz stetiger Fortschritte in der Phosphoproteomanalytik erschweren nach wie vor
verschiedene Arbeitsschritte in der Probenvorbereitung, -behandlung und –analyse die
Identifizierung von Proteinphosphorylierungen (Übersicht in Mann et al. 2002; Lehmann
2010; Beck et al. 2011) (s. Abb. 43): Schon während der Isolierung von Phosphoproteinen
können durch die Zelllyse colokalisierende Proteinphosphatasen die Phosphatgruppen
entfernen. Im enzymatischen Verdau kann die Spaltungseffizienz durch Phosphatgruppen
gestört werden: Die tryptische Spaltung nach Lysin (K) und Arginin (R) wird neben Prolin an
Position +1 (relativ zur Spaltstelle) auch durch pS/pT sowie Aspartat (D) und Glutamat (E)
innerhalb der Position -3 bis +3 inhibiert (Benore-Parsons et al. 1989; Xia et al. 2008; Winter
et al. 2009a). Folglich ist der Verdau mit Trypsin innerhalb der PKA Konsensusmotive
RRxS/Ty, RKxS/Ty, KRxS/Ty, KKx-S/Ty (x entspricht einer beliebigen, y einer hydrophoben
Aminosäure) sehr ineffizient, und erfordert
-wie in dieser Arbeit verwendet- hohe
Konzentrationen an Protease sowie lange Inkubationszeiten. Um die Identifizierung einer
P-Stelle abzusichern, können alternativ andere Proteasen in einem Multiprotease Ansatz
eingesetzt werden (Schlosser et al. 2005). Anreicherungen von Phosphopeptiden über
teilweise chelatierte Metall (-oxide) können insbesondere bei der Identifizierung von
substöchiometrischen P-Stellen hifreich sein. Die unterschiedliche Effizienz der Methoden
und eine zu beobachtende Sequenzabhängigkeit verhindern, dass sich alle P-Peptide
vergleichbar effizient anreichern lassen (Bodenmiller et al. 2007). Dies konnte auch für
Phosphopeptide der PKA-Cα gezeigt werden (s. 4.1). Die Beobachtung, dass vorallem
mehrfach phosphorylierte Peptide in LC-MS/MS Analysen unterrepräsentiert sind, liegt
vermutlich an einer irreversiblen Adsorption von P-Peptiden an Metallionen innerhalb des
LC-Systems, deren Quelle in den verwendeten Lösungsmitteln und Proben liegt (Winter et al.
2009b). Durch Addition von Phosphorsäure (Kim et al. 2004) EDTA oder Citrat (Qing et al.
2006; Winter et al. 2009b; Seidler et al. 2011), konnte eine Unterdrückung von Phosphopeptiden minimiert werden. Schon zu Beginn der neunziger Jahren wurde eine geringere
Ionisierungseffizienz für Phosphopeptide diskutiert (Resing et al. 1997). Aktuelle Arbeiten
mit Peptid/Phosphopeptid Paaren zeigen jedoch nur eine tendeziell um 80-90 % schlechtere
Ionisierbarkeit (Übersicht in Lehmann 2010, Kapitel 2 und 7), die u. a. von der Peptidsequenz
abhängt: Phosphopeptide mit mehr als zwei basischen Aminosäuren lassen sich z. B. generell
97
5. Diskussion
besser ionisieren (Steen et al. 2005), was aufgrund der konservierten Arginine bzw. Lysine
innerhalb der PKA-Konsensussequenz auf einen Großteil der PKA-Cα Phosphopeptide
zutrifft. Nach ungünstigen Voraussetzungen während der LC und Ionisierung, werden
Phosphopeptide auch in der MS Analyse benachteiligt: In der vielfach verwendeten DDA
(data dependent aquisition)-Methode werden jeweils nur die signalstärksten Peptidionen für
Fragmentierungen in MS/MS Analysen ausgewählt, zu denen Phosphopeptide aus den
bereits diskutierten Gründen oftmals nicht gehören. Außerdem können sequenzabhängige
Fragmentierungsereignisse an den Peptidfragmentenden zu einem, dem Neutralverlust von
m(H3PO4) = 98 Da ähnlichen Massenverlust und damit zu falschpositiven Ergebnissen führen
(z. B.: Prolin: -97 Da, Valin: -99 Da, Threonin: -101 Da) (Lehmann et al. 2007).
Letztendlich verursachen die Dynamik und die nicht selten substöchiometrische Verteilung
von P-Stellen Unterschiede im Phosphorylierungsstatus, die in Abhängigkeit von
untersuchten Organismen, Geweben und Zellen, sowie auch von verwendeten Expressionsbedingungen, Reinigungsmethoden und unterschiedlich sensitiven MS Geräten eine direkte
Vergleichbarkeit von phosphoproteomischen Studien erschweren.
Abb. 43: Allgemeine Limitationen in der MS basierten Phosphoproteomanalytik.

Der klassische Nachweis von Proteinphosphorylierungen erfolgt mittels MS/MS Sequenzierung. Nach
Reinigung und Vorfraktionierung der Proteine werden diese enzymatisch verdaut und optional auf Phosphopeptide hin selektiert. Das (Phospho-) Peptidgemisch wird chromatographisch aufgetrennt und die P-Stellen
mittels MS Analyse identifiziert. LC (liquid chromatography), CID (collision induced dissociation), ETD (electron
transfer dissociation), ECD (electron capture dissociation), DDA (data dependent aquisition), SRM (selective
reaction monitoring).
98
5. Diskussion
99
5. Diskussion
5.1.1 Überblick über alle mittels MS identifizierten P-Stellen der PKA-Cα
Der substöchiometrische Charakter vieler P-Stellen sowie die niedrige Auflösung und
Massengenauigkeit der ersten MS Instrumente sind nicht die alleinige Ursache dafür, dass
seit der Identifizierung von PKA-Cα als Phosphoprotein fast zwei Jahrzehnte lang nur die
bereits bekannten P-Stellen pS10, pS139, pT197 und pS338 nachgewiesen werden konnten.
In den ersten MS basierten Studien wurden zunächst immer chromatographisch
vorfraktionierte
Phosphoformen
verwendet:
Schlosser et al. 2002 (4P Phosphoform),
Chalmers et al. 2004 (3P), Shen et al. 2004 (3P). Erst 2009 wurden mit pS14 (10 % Phosphorylierung), pT48 (20 %), pS53 (15 %), pS212 (<5 %), pS259 (26 %) und pS325 (<5 %) sechs
weitere substöchiometrisch modifizierte P-Stellen an boviner PKA-Cα publiziert (Seidler et al.
2009). Die Ursache für die Unterschiede zu den in dieser Arbeit identifizierten P-Stellen soll
im Folgenden diskutiert werden (s. Abb. 44): Die P-Stellen pS34 und pS65 konnten aufgrund
von Sequenzunterschieden zwischen der hier verwendeten murinen bzw. der von Seidler
et al. untersuchten bovinen PKA-Cα Sequenz nur an muriner PKA-Cα identifiziert werden
(vgl. 4.3.1, Abb. 19). Die vier zusätzlichen, nur von Seidler et al. detektierten P-Stellen (pS14,
pT48, pS212 und pS325) lassen sich u. a. auf die von dieser Arbeitsgruppe optimierte
Probenvorbereitung zurückführen. Auf den Einsatz multipler Proteasen und die Zugabe von
Citrat während der chromatographischen Auftrennung der Peptide wurde in dieser Arbeit
verzichtet (s. Abb. 44). Da mit PKA-Cα Konzentrationen im picomolaren Bereich ausreichend
Ausgangsmaterial zur Verfügung stand, war hier -anders als bei Analyten im
subfemtomolaren Bereich- kein signifikanter Verlust in Folge unspezifischer Adsorption an
das LC System zu erwarten (Lehmann 2010). Möglicherweise liefert dies jedoch eine
Erklärung für die von Seidler et al. entdeckten P-Stellen pS14 und pT48, die beide in doppelt
phosphorylierbaren Peptidsequenzen liegen und aufgrund der höheren Affinität von
mehrfach phosphorylierten Peptiden zu Metallionen innerhalb des LC Systems verloren
gegangen sein können. pS212 konnte ausschließlich nach proteolytischem Verdau mit
Elastase nachgewiesen werden (persönliche Mitteilung von Dr. Jörg Seidler). Für pS325 gibt
es neben dem äußerst geringen Phosphorylierungsgrad von weniger als 5 % keine
offensichtliche Erklärung, warum das entsprechende Phosphopeptid in dieser Arbeit nicht
gefunden werden konnte. Bezug nehmend auf den Phosphorylierungsgrad fällt auf, dass
P-Stellen, die zu mehr als 10 % phosphoryliert vorliegen generell in beiden Arbeiten
100
5. Diskussion
detektiert worden sind und der Phosphorylierungsgrad dabei mit dem Vorhandensein eines
Konsensusmotivs korreliert (s. Abb. 44).
Abb. 44: Vergleich der über MS Analyse identifizierten P-Stellen an boviner und muriner PKA-Cα.
(A) Experimentelle Unterschiede in der Probenvorbereitung. (B) Der Phosphorylierungsgrad wurde an
Phosphopeptiden von muriner und boviner PKA-Cα nach Seidler et al. 2009 über Signalintensitätsmessung
bestimmt (rot: ~100 % Phosphorylierung). K: P-Stelle innerhalb eines PKA-Cα Konsensusmotivs, invK: P-Stelle
innerhalb eines invertierten PKA-Cα Konsensusmotivs.
5.2
Vorhersage von Phosphorylierungsstellen mittels in silico Studien und
Datenbankvergleichen
Über zahlreiche direkte und indirekte Mechanismen wird die extrem hohe Spezifität
zwischen Kinase und ihrem zu phosphorylierendem Substrat gewährleistet (s. 1.1). Mittels
synthetischer Peptiddatenbanken (Übersicht in Kemp 1990) und Kristallisierungsstudien
(Songyang et al. 1994; Pinna et al. 1996) wurde gezeigt, dass das katalytische Zentrum einer
Kinase einen Bereich von 7-12 Aminosäuren um die P-Stelle des Substrats kontaktiert. Auf
Grundlage dieser sogenannten Kinase-spezifischen Konsensussequenz als minimale
strukturelle Voraussetzung ist es möglich, potenzielle Autophosphorylierungsstellen
(Auto-P-Stellen) vorherzusagen.
101
5. Diskussion
5.2.1 Vorhersage von Phosphorylierungsstellen am Beispiel von PKA-Cα
Von den experimentell ermittelten P-Stellen der PKA-Cα liegen pS10, pT48, pS65, pS139,
pT197, pS259 und pS338 innerhalb einer klassische PKA-Cα Konsensussequenz RRxS/Ty,
RKxS/Ty, KRxS/Ty, KKx-S/Ty (x entspricht einer beliebigen, y einer hydrophoben Aminosäure), (Übersicht in Shabb 2001) (s. Abb. 45). Neben dieser klassischen, auch als
Pyruvatkinase Typ bezeichneten Konsensussequenz (Zetterqvist et al. 1976; Kemp et al.
1977; Krebs et al. 1979) wurden die phosphorylierten Sequenzen auch mit einem
erweitertem Konsensusmotiv RxKRxxSy verglichen, welches bislang nur in der β-Untereinheit
der Phosphorylase Kinase gefunden worden ist (Feramisco et al. 1980; Zetterqvist et al.
1982).
A
B
Abb. 45: Vorhersage von P-Stellen der
PKA-Cα.
(A) Vergleich der PKA-Cα Konsensussequenzen
für
alle
experimentell
ermittelten P-Stellen: Pyruvat Kinase,
PK Typ bzw. Phosphorylase Kinase, PhKβ
Typ; schwarz: Konsensussequenz; grün:
keine bzw. invertierte Konsensussequenz.
[T48] wurde in Seidler et al. 2009 als
zusätzliche P-Stelle innerhalb eines
PKA-Cα Konsensusmotivs identifiziert.
(B) Darstellung der PKA-Cα Konsensussequenz über ein Sequenzlogomotiv
(übernommen aus PhosphoSitePlus®).
Sequenzalignment von 1.017 potenziellen
Substraten im Bereich ±7 Aminosäuren
vor und hinter der phosphorylierten
Aminosäure (S/T). Die Höhe des Buchstabenstapels gibt die Konservierung der
Aminosäuren an dieser Positon wieder
(gemessen als Entropie in bit).
Die Buchstabengröße symbolisiert die
relative Häufigkeit der einzelnen Aminosäuren.
Ein hier an Position P-6 erforderliches Arginin ist ausschließlich innerhalb der
Konsensussequenz für pS139 zu finden (s. Abb. 45, A). Vereint man die Bedingungen beider
Konsensusmotive dann müssen relativ zu dem phosphorylierbaren Rest P0 C-terminal im
Bereich P-1 bis P-6 ein bis zwei basische Aminosäuren liegen und N-terminal an Position P+1
102
5. Diskussion
eine hydrophobe Aminosäure (y) positioniert sein. Während für pS53 eine invertierte
Konsensussequenz mit einem Arginin an P+3 diskutiert wird, trifft auf die P-Stelle um pS34
keines der Sequenzmotive zu (Seidler et al. 2009).
Das Programm NetPhos 2.0 basiert auf einem künstlich erstellten neuronalen Netzwerk,
durch das auf Grundlage bekannter Substrate ±7 Aminosäuren lange kinase-spezifische
Konsensussequenzen generiert werden (s. Abb. 45, B), welche für die Vorhersage von S/T/YP-Stellen in Eukaryoten genutzt werden (Blom et al. 1999). Die Anzahl der über NetPhos 2.0
als signifikant vorhergesagten P-Stellen der PKA-Cα ist fast doppelt so groß, wie die Anzahl
der in dieser Arbeit experimentell identifizierten P-Stellen an rekombinanter PKA-Cα
(15 gegenüber 8 P-Stellen; s. Abb. 46)
Abb. 46: Vergleich der (A) experimentell ermittelten mit (B) in silico vorhergesagten P-Stellen der PKA-Cα.
(Auto-P-Stellen: farbig; P-Stellen von heterologen Kinasen: grau)
(b1) Für einen in silico Nachweis von potenziellen S/T/Y-P-Stellen (pS: rot, pT: grün, pY: lila) wurde die primäre
Aminosäuresequenz der PKA-Cα (P05132, KAPCA_MOUSE) mittels softwarebasierter Analyse über NetPhos 2.0
untersucht. Die Wahrscheinlichkeit eines Phosphorylierungsereignisses wird mit einem Wert zwischen 0 und 1
bewertet. Der Schwellenwert für eine signifikante Phosphorylierung liegt bei 0,5. (b2) Zugehörige Kinasen
wurden unter Berücksichtigung der Kinasen PKA, PKC, PKG, CKII, Cdc2, CaM-II, ATM, DNA PK, Cdk5, p38 MAPK,
GSK3, CKI, PKB, RSK, INSR, EGFR und Src über NetPhosK 1.0 ermittelt. (b3) Nach Herabsetzen des SchwellenX
wertes auf 0,25 erhöht sich der Anteil der möglichen PKA-Cα Auto-P-Stellen. 446 zusätzliche P-Stellen von
heterologen Kinasen sind hier nicht gezeigt. (b4) Vorhersage von in Bakterien auftretenden P-Stellen über
NetPhosBac 1.0. * Vorhergesagte P-Stellen, die experimentell nicht nachgewiesen worden und in keiner
Proteindatenbank aufgeführt sind (vgl. Abb. 48).
Unter Berücksichtigung der Kinasen PKA, PKC, PKG, CKII, Cdc2, CaM-II, ATM, DNA PK, Cdk5,
p38 MAPK, GSK3, CKI, PKB, RSK, INSR, EGFR und Src wurden über NetPhosK 1.0 (Blom et al.
2004; Hjerrild et al. 2004) zusätzlich direkte Kinase-Substrat Beziehungen untersucht: Neben
103
5. Diskussion
vier Auto-P-Stellen (pS65, pT197, pS259 und pS338) ließen sich 15 weitere kinase-spezifische
P-Stellen vorhersagen (s. Abb. 46, b2), die im rekombinanten System zu vernachlässigen
sind, im eukaryotischen Organismus jedoch eine bislang noch unentdeckte regulatorische
Funktion übernehmen könnten. Durch die in dieser Arbeit verwendete rekombinante und
artifizielle Überexpression in E. coli ist eine deutlich verringerte Spezifität der PKA-Cα
Phosphorylierung zu vermuten. Nach dem Herabsetzen des für eine signifikante
Phosphorylierung genutzten Schwellenwertes von 0,5 auf 0,25 lassen sich mit Ausnahme von
pS34 alle experimentell ermittelten P-Stellen als Auto-P-Stellen innerhalb der Primärsequenz
der PKA-Cα vorhersagen (s. Abb. 46, b3).
Eine andere Erklärung für die, gegenüber aus Säugergewebe isolierter PKA-Cα, erhöhte
Anzahl von P-Stellen an rekombinantem Protein können E. coli Kinasen liefern, die in der
NetPhosK 1.0 Vorhersage nicht berücksichtigt werden. Phosphorylierungen an Histidin und
Aspartat, die für das Zweikomponentensystem von Prokaryoten beschrieben sind (Cozzone
1988; Stock et al. 1989; Chang et al. 1998), wurden mittels MS/MS Sequenzierung
untersucht und konnten für PKA-Cα nicht nachgewiesen werden. Nicht auszuschließen ist,
dass auch Serin/Threoninkinasen aus E. coli den PKA-Cα Phosphorylierungsstatus im
rekombinanten Expressionssystem beeinflussen (Deutscher et al. 2005; Macek et al. 2008).
Aus der Vorhersage mittels NetPhosBac 1.0, einem auf experimentellen Befunden
basierenden Vorhersageprogramm für P-Stellen speziell in Bakterien (Miller et al. 2009)
ergeben sich zehn signifikante P-Stellen, von denen sechs (pS53, pS139, pS159, pT195,
pS259, pS338) auch als Auto-P-Stellen der PKA-Cα vorgesagt sind (s. Abb. 46, C). Diese große
Überschneidung ist überraschend, da die meisten der 150 in Bakterien detektierten und für
die Vorhersage genutzten P-Stellen nicht die für eukaryotische Kinasen typischen Konsensusmotive zeigen (Miller et al. 2009). Die Beobachtungen, dass diese sechs P-Stellen an
katalytisch inaktiven PKA-Cα nicht detektiert wurden (vgl. 4.4.1), zum anderen Phosphorylierungen an Serin und Threoninresten in Bakterien deutlich seltener auftreten als in
eukaryotischen Zellen (Macek et al. 2007; Macek et al. 2008), unterstützen jedoch eher den
zuerst diskutierten autokatalytischen Prozess von Seiten aktiver PKA-Cα.
Das Vorhandensein einer Konsensussequenz ist letzlich nur ein Hinweis, jedoch keine
zwingende Voraussetzung für die Erzeugung eines guten Phosphosubstrats. Tatsächlich
besitzen sogar nur die Hälfte aller physiologischer Substrate der PKA-Cα die vorhergesagte
Konsensussequenz RRxS/Ty, RKxS/Ty, KRxS/Ty, KKx-S/Ty (Shabb 2001). Die Einschränkungen,
104
5. Diskussion
betreffend der Vorhersage von P-Stellen auf Grundlage der primären Aminosäureabfolge,
beruhen auf Vernachlässigung der dreidimensionalen Proteinkonformation und der damit
verbundenen Zugänglichkeit der zu phosphorylierenden Aminosäuren (Langan 1973;
Kemp 1990; Kemp et al. 1990; Kennelly et al. 1991). Von den potenziellen Auto-P-Stellen
erscheinen pT48, pS114, pS159 und pT195 in der dreidimensionalen Struktur der PKA-Cα
schlecht zugänglich (s. Abb. 47). Während eine Phosphorylierung an S114 und S159
experimentell nicht belegt ist, konnten T48 und T195 substöchiometrisch phosphoryliert
nachgewiesen werden (s. 5.2.2, Tab. 9). Möglich ist, dass die Autophosphorylierung an
diesen Stellen nur während der Proteinsynthese und –faltung über sekundäre mature
PKA-Cα aber nicht nachträglich in vitro erfolgen kann (s. Diskussion in 5.3.3).
Abb. 47: Zugänglichkeit der über NetPhosK 1.0 (Score>0,25) vorhergesagte Auto-P-Stellen innerhalb der
dreidimensionalen Konformation der PKA-Cα.
P-Stellen (rot: Serin; grün: Threonin), die N-terminale Myristoylgruppe (myr: braun) und PKI5-24 (blau) sind an
der Oberflächenstruktur der PKA-Cα dargestellt (PDB: 1CMK nach Zheng et al. 1993b visualisiert über
VMD 1.8.6 (Humphrey et al. 1996)). Die Aminosäuren >T48<, >S114<, >S159< und >T195< erscheinen in der
dreidimensionalen Struktur schlecht zugänglich.
Die Aminosäuren S65 und S259 der PKA-Cα besitzen mit Signifikanzwerten von 0,64 und 0,73
eine relativ hohe Wahrscheinlichkeit autophosphoryliert zu sein und erscheinen auch bei
Betrachtung der dreidimensionalen Struktur der PKA-Cα als gut zugängliche P-Stellen
(s. Abb. 47). Keine dieser beiden potenziellen P-Stellen konnte jedoch bislang an aus Gewebe
isolierter PKA-Cα identifiziert werden und tritt auch an rekombinantem Protein nur
substöchiometrisch auf (vgl. 4.3). Neben der Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur
können auch die fehlende Colokalisation von Kinasen und Substraten sowie eine starke
105
5. Diskussion
Gegenregulation über Phosphatasen im Säuger für die Diskrepanz zwischen Vorhersage und
experimentellen Befund der P-Stellen verantwortlich sein.
5.2.2 Vergleich verschiedener Datenbankeinträge zum Phosphorylierungsstatus von
PKA-Cα
Der direkte Vergleich der PKA-Cα P-Stellen anhand existierender Einträge in Proteindatenbanken wird durch die in 4.3 nachgewiesene Dynamik des Phosphorylierungsstatuses
erschwert. Exemplarisch wurden fünf verschiedene Proteindatenbanken ausgewählt und
deren Angaben zum PKA-Cα Phosphorylierungsstatus miteinander verglichen (s. Abb. 48).
Die Swissprot-Datenbank (Swiss Institute of Bioinformatics) (http://www.uniprot.org) als
eine manuell annotierte Proteindatenbank, liefert neben allgemeinen Informationen über
die Herkunft, Klassifizierung und Funktionalität von Proteinen auch Angaben über deren
PTMs. Für PKA-Cα sind acht verschiedene P-Stellen verzeichnet, von denen fünf auch
experimentell in dieser Arbeit nachgewiesen worden sind. Zusätzliche P-Stellen sind in den
phosphospezifischen
www.phosida.de),
Proteindatenbanken
Phospho.ELM
Phosida
(Diella et al. 2008)
(Gnad et al. 2011)
(Version 9.0,
(http://
September 2010,
8.718 Substrate , http://phospho.elm.eu.org) und PhosphoSitePlus® (Hornbeck et al. 2004)
(http://www.phosphosite.org) katalogisiert.
Abb. 48: Vergleich der (A) experimentell ermittelten mit (B) in Proteindatenbanken erfassten P-Stellen der
PKA-Cα.
P-Stellen: pS: rot, pT: grün, pY: lila. * Experimentell ermittelte P-Stellen, die nicht vorhergesagt worden sind
(vgl. Abb. 46).
106
5. Diskussion
Mit dem Einzug der Massenspektrometrie in die Phosphoproteomanalytik werden verstärkt
riesige Datenmengen in Hochdurchsatz Experimenten (HTS, high throughput screening)
gewonnen und Phosphorylierungen als Modifikation in Proteindatenbanken katalogisiert,
ohne deren Ursprung und biologische Relevanz weiter zu hinterfragen. In der Phospho.ELM
Datenbank sind fünf PKA-Cα P-Stellen erfasst. Ein Vorteil dieser Proteindatenbank ist die
gesonderte Angabe von P-Stellen, die ausschließlich in HTS Experimenten identifiziert
worden sind. Außerdem bietet ein direkter Querverweis auf Phospho3D (Zanzoni et al. 2011)
die Möglichkeit, mittels Kristallstrukturdaten und DSSP (database of secondary structure
assignments for proteins) (Kabsch et al. 1983) die Zugänglichkeit von P-Stellen in der dreidimensionalen Struktur zu berechnen. Für die experimentell ermittelten P-Stellen der
PKA-Cα lassen sich nach Miller et al. 1987 die folgenden Oberflächenzugänglichkeits-Werte
ermitteln: S10 (~100 %; ohne Myristoylierung), S34 (42 %), S139 (50 %), T197 (47 %), S338
(48 %). Zusätzlich sind Strukturvorhersagen für die, die P-Stelle umgebende Sequenz,
Querverweise zu Konsensusmotiven und MS Spektren zum Nachweis der Phosphorylierung
möglich. Obwohl sich die Datenbank Phosida auf nur neun Organismen beschränkt, werden
acht P-Stellen für PKA-Cα in dieser Proteindatenbank angegeben. Zusätzlich sind
Strukturvorhersagen für die die P-Stelle umgebende Sequenz, Querverweise zu
Konsensusmotiven und Nachweise von Phosphorylierungen über MS Spektren möglich. Den
mit Abstand umfassendsten Überblick über die P-Stellen der PKA-Cα liefert die
PhosphoSitePlus® Proteindatenbank. Die zahlreichen Querverweise auf verwendete
Sequenzen, Organismen, genutzte Expressionsbedingungen sowie die Probenaufbearbeitung
erleichtern es die Signifikanz der Phosphorylierungen einschätzen zu können (s. Tab. 9). Mit
Ausnahme von pS65 sind alle in dieser Arbeit experimentell ermittelten P-Stellen hier
erfasst. Zusätzlich werden mit pS14, pT48, pT183, pT195, pT201, pS212 und pS325 sieben
weitere P-Stellen angegeben. Neben T197 und S338 sind auch die Aminosäuren S34, T48,
T183, T195 und T201 an PKA-Cα aus eukaryotischen Zellen bzw. Geweben in HTS
Experimenten phosphoryliert nachgewiesen worden (s. Tab. 9). Ob es sich hier um
Falschpositive oder um funktionelle, nur substöchiometrisch modifizierte P-Stellen handelt,
muss in Zukunft untersucht werden. Für pS34 und pT201 sind Phosphorylierungen über die
heterologe Kinasen, DNA PK (DNA abhängige Proteinkinase; Signifikanzwert 0,64) und GSK3
(Glykogen Synthase Kinase; Signifikanzwert 0,5) vorhergesagt (vgl. 5.2.1, Abb. 46, b2).
107
5. Diskussion
Tab. 9: Detaillierter Herkunftsnachweis der PKA-Cα P-Stellen (Quelle: PhosphoSitePlus®).
blau: P-Stellen, die in eukaryotischen Zellen oder Geweben nachgewiesen werden konnten; grau: konstitutive
P-Stellen an T197 und S338. SS: Nachweis mittels site-specific methods, in denen gezielt die P-Stellen der
PKA-Cα untersucht worden sind (z. B. mittels Sequenzierung, zielgerichteter Mutagenesestudien, phosphospezifischer Antikörper oder MS/MS Analyse); HTS MS: high throughput screening MS, in der Regel MS basierte
Phosphoproteomanalysen in Zellen und Geweben.
in vitro
(rekombinant)
x
in vivo
(Zellen/Gewebe)
-
bovin
x
-
SS
porcin
bovin
murin
human
bovin
bovin
murin
x
x
x
x
x
Leber
HeLa S3 Zellen
-
SS
SS
HTS MS
HTS MS
SS
SS
SS
bovin
x
-
SS
pT183
murin
-
C2C12 Myoblast
HTS MS
pT195
human
-
Leber
HTS MS
-
HeLa (S3) Zellen
HTS MS
-
Hirn
HTS MS
-
C2C12 Myoblast
HTS MS
SS/
HTS MS
HTS MS
HTS MS
HTS MS
SS
SS
SS
SS/
HTS MS
pS10
pS14
pS34
pT48
pS53
pS139
Sequenz
murin
murin
pT197
murin
x
ubiquitär
pT201
human
pS212
pS259
pS325
murin
bovin
bovin
bovin
x
x
x
COS Zellen
HeLa Zellen
Hirn
-
pS338
murin
x
ubiquitär
Methode
SS
Literatur
Yonemoto et al. 1993
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Seidler et al. 2009
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Seidler et al. 2009
Seidler et al. 2009
Shoji et al. 1979,
Yonemoto et al. 1993
108
5. Diskussion
5.3
Dynamik und Funktionalität einzelner PKA-Cα Phosphorylierungsstellen
Neben den konstitutiven P-Stellen pT197 und pS338 wird für die P-Stelle pS10 eine
Beteiligung an der Modulation des N-Terminus diskutiert (s. 5.3.1). Außerdem wurden in
dieser Arbeit ein möglicher Zusammenhang zwischen einer potenziellen Phosphorylierung
an S53 und der Regulation der enzymatischen Aktivität der PKA-Cα entdeckt (s. 5.3.2). Über
die funktionellen Konsequenzen der anderen an rekombinanter PKA-Cα entdeckten P-Stellen
(pS34, pS65, pS139, pS259) ist bislang nichts bekannt. Ihr substöchiometrisches Auftreten
und die gute Zugänglichkeit an der Proteinoberfläche (s. 5.2.1, Abb. 47) weisen jedoch auf
eine mögliche modulatorische Funktion für Protein-Protein-Interaktionen oder ProteinMembran-Interaktionen hin. Über den sogenannten PhosphoMotif Finder (Amanchy et al.
2007) lassen sich z. B. für drei der in 5.2.1 vorhergesagten P-Stellen Interaktionsstellen
nachweisen, die in Folge einer Phosphorylierung generiert werden: An Position T201
entsteht das WW Motiv pT201/P (Lu et al. 1999), an S259 das 14-3-3 Motiv RxxpS259
(Tzivion et al. 2001) und an Position S263 ein BRCT- (carboxyl-terminal domain of the Breast
Cancer Gene 1) (Rodriguez et al. 2003) bzw. Plk1 (Polo-like kinase 1) PDB Motiv (Elia et al.
2003).
Der Nachweis von multiplen P-Stellen an rekombinanter PKA-Cα wirft die Frage nach der
molekularen Dynamik derselbigen auf. Die Diskrepanz in der Anzahl der P-Stellen, die über
Molekulargewichtsbestimmung (Phosphoformen mit drei bis fünf P-Stellen) und über
MS/MS Sequenzierung nachgewiesen wurden (acht P-Stellen) (s. 4.3.1, Abb. 17), lässt eine
gegenseitige Beeinflussung dieser PTMs vermuten, wonach sich bestimmte P-Stellen
gegenseitig ausschließen und einen dynamischen Phosphorylierungsstatus erzeugen
(s. 5.3.3). Nicht auszuschließen ist, dass die in E. coli entdeckten P-Stellen auch im Säuger
substöchiometrisch auftreten und dort eine zeitlich oder räumlich regulierte Funktion
übernehmen.
5.3.1 PTMs sind an der Modulation des N-Terminus und einer möglichen Zelllokalisation
der PKA-Cα beteiligt
Die mit Myristylierung (Carr et al. 1982), Phosphorylierung (Toner-Webb et al. 1992) und
Desaminierung (Kinzel et al. 2000) zahlreichen Modifikationen am N-Terminus, genauso wie
das Vorkommen zahlreicher N-terminaler Spleißvarianten (Orstavik et al. 2001) deuten auf
109
5. Diskussion
eine wichtige Funktion dieser Region im Bezug auf Protein-Protein-Interaktionen
und -Lokalisationen hin.
Eine Autophosphorylierung an S10 konnte zwar in vitro an aus Säugergewebe isolierter
PKA-Cα nachgewiesen werden, jedoch ist die in vivo Signifikanz bislang nicht geklärt
(Toner-Webb et al. 1992). In E. coli ist an S10 mutagenisiertes Protein (PKA-Cα S10A und
S10E) in Ab- und Anwesenheit von Myristinsäure nicht aktiv, unlöslich und nicht
phosphoryliert (Yonemoto et al. 1997) während hingegen die komplette Deletion des
N-Terminus (PKA-Cα Δ1-14) keinen Einfluss auf Aktivität, Löslichkeit und Phosphorylierung
des Proteins zeigt (Yonemoto et al. 1993b; Herberg et al. 1997). Zu vermuten ist, dass in
E. coli eine Phosphorylierung an S10 unabhängig von dem Vorhandensein einer
Myristoylierung zu einer aktiven Enzymkonformation führt. Interessanterweise scheint dies
jedoch auf einem indirekten Effekt zu beruhen, da ein Enzym mit zwei weiteren
phosphomimetischen Mutagenesen an den P-Stellen pS139 (PKA-Cα S10A/S139D) und
pS338
(PKA-Cα S10A/S338D)
die
gleichen
kinetischen
Eigenschaften
wie
nicht
mutagenisierte PKA-Cα aufweist (Langer et al. 2005). Die Phosphorylierung an S10 scheint
folglich Konformationsänderungen zu induzieren, welche eine Voraussetzung für die
nachfolgenden Autophosphorylierungen an S139 und S338 sind.
Als transiente Modifikation könnte pS10 eine Rolle bei der Strukturierung des N-Terminus
spielen: Mittels 31P NMR Spektroskopie konnte diese Aminosäure als eine sehr flexible und
für Phosphatasen gut zugängliche P-Stelle charakterisiert werden (Seifert et al. 2002;
Gaffarogullari et al. 2011). Tholey et al. und Breitenlechner et al. konnten anhand
synthetischer Peptide bzw. über den ersten vollständig aufgelösten N-Terminus in einer
Kristallstruktur zeigen, dass die Abwesenheit der Phosphorylierung an S10 eine
Voraussetzung für die Ausbildung der helikalen Struktur am N-Terminus ist. Die Phosphorylierung von S10 innerhalb des Helix Cap Motivs
10SEQE13
führt hingegen zu einer
Destabilisierung des N-Terminus (Tholey et al. 2001; Breitenlechner et al. 2004). Als weiterer
Modulator innerhalb des flexiblen N-Terminus ist die Desaminierung von Asparagin (N) zu
Aspartat (D) an Position 2 bekannt, die in Säugermuskelgewebe an 30 % der PKA-Cα
nachgewiesen werden konnte (Jedrzejewski et al. 1998; Kinzel et al. 2000). Während der
Desaminierung von Proteinen verallgemeinert oft die Funktion als molekularer Zeitgeber
zugewiesen wird (Robinson 2002), hat diese Modifikation für PKA-Cα einen Einfluss auf die
intrazelluläre Lokalisation. Nicht modifiziertes Protein tritt dabei abundant im Zellkern auf
110
5. Diskussion
und desaminierte PKA-Cα ist verstärkt im Zytoplasma lokalisiert (Pepperkok et al. 2000).
Strukturelle Veränderung des N-Terminus, die allein auf einer Desaminierung beruhen,
konnten bislang weder in Kristallstrukturen (Übersicht in Seifert et al. 2002) noch in Peptidexperimenten (Tholey et al. 2001) nachgewiesen werden. Breitenlechner et al. haben
anhand der verschiedenen, für die Flexibilität des N-Terminus verantwortlichen
Modulatoren ein Modell entwickelt, wonach die Proteinfaltung der myristoylierten PKA-Cα
zunächst membranassoziiert abläuft (Breitenlechner et al. 2004) (s. Abb. 49): Erst die
Desaminierung an N2 ermöglicht im Säuger die Phosphorylierung an S10 (Toner-Webb et al.
1992; Jedrzejewski et al. 1998). Über das Einbringen der negativen Ladung beider
Modifikationen und dem Destabilisieren der Helixstruktur erfolgt die PKA-Cα Freisetzung von
der Membran. Im Zytoplasma werden die Phosphatgruppen an pS10 dephosphoryliert und
die amphipathische Helix A wird über die Myristinsäure in der PKA-Cα eigenen hydrophoben
Bindungstasche verankert (Bossemeyer et al. 1993; Zheng et al. 1993b). Diese Umstrukturierung ist letztendlich auch für die nachgewiesene höhere Thermostabilität des
myristoylierten Proteins verantwortlich (Yonemoto et al. 1993b; Herberg et al. 1997). Ein
ähnlicher als myristoyl-electrostatic switch beschriebener Prozess ist für das Freisetzen der
myristoylierten Tyrosinkinase src in Folge einer Phosphorylierung beschrieben (Walker et al.
1993; McLaughlin et al. 1995). Für PKA-Cα wurde die Exposition der Myristoylgruppe auch in
Folge der Bindung von PKA-RII gezeigt und ermöglicht dort die Lokalisation von PKA an
Lipidvesikeln. Nach Bindung von PKA-RI wird die Myristoylgruppe hingegen in der
hydrophoben Bindungstasche der PKA-Cα verankert (Gangal et al. 1999).
Abb. 49: Der myristoyl electrostatic
switch ermöglicht das Freisetzen der
PKA-Cα von der Membran (Modell
nach Breitenlechner et al. 2004).
Der N-Terminus der PKA-Cα wird über
(1) Myristoylierung (myr; braun), (2)
Desaminierung (grün) und (3) Phosphorylierung (rot) moduliert.
111
5. Diskussion
In PKA-negativen S49 Mauslymphomzellen wird die Ursache für eine stark reduzierte PKA-Cα
Aktivität (ca. 5 U/mg) in der Falschfaltung und Unlöslichkeit des Enzyms vermutet, was
möglicherweise mit einer fehlerhaften Prozessierung an der Membran zusammenhängt
(Steinberg 1991; Cauthron et al. 1998). Während PKA-C über AKIPs (A-Kinase interagierende
Proteine) auch im Zellkern lokalisiert wird (Sastri et al. 2005), konnte eine Membranverankerung jedoch bis heute nur indirekt über die regulatorischen Untereinheiten im
Holoenzymkomplex mit AKAPs (A-Kinase Ankerproteine) nachgewiesen werden (Pidoux et
al. 2010; Skroblin et al. 2010).
5.3.2 Modifikationen an der potenziellen Phosphorylierungsstelle S53 können die Aktivität
der PKA-Cα inhibieren
Die in dieser Arbeit untersuchte Phosphorylierung an S53 offenbart einen zusätzlichen
Regulationsmechanismus für die Kontrolle der enzymatischen Aktivität der PKA-Cα. Obwohl
eine Phosphorylierung an S53 bislang nicht an aus Säugergewebe isolierter PKA-Cα
nachgewiesen werden konnte, ist eine transiente Phosphorylierung, wie sie auch für S10
diskutiert wird, denkbar (vgl. 5.3.1). Mutagenesen der konservierten Glycine in der in
Kinasen hoch konservierten glycinreichen Schleife zeigen, dass gerade diese Aminosäuren
eine kritische Funktion während der Substratbindung und Katalyse übernehmen (Lee et al.
1992; Grant et al. 1998). Auch PKA-Cα, die an den konservierten Glycinresten (G50, G52)
innerhalb der glycinreichen Schleife mutagenisiert wurde, brachte zweifach (pT197, pS338)
und einfach (pS338) phosphorylierte Proteinspezies hervor, die sich mit den klassischen
Reinigungsmethoden nicht isolieren ließen (Hemmer et al. 1997b). Die einfach an S338
phosphorylierten Proteinspezies zeigten die auffälligsten Einbußen bezüglich der Aktivität
und Thermostabilität. Da die kinetischen Parameter in der Größenordnung von
veröffentlichte Daten für katalytisch inaktive PKA-Cα T197A lagen, wurden diese Effekte
vorrangig auf das Fehlen der Phosphorylierung an T197 und somit nur indirekt auf die
Mutationen innerhalb der glycinreichen Schleife zurückgeführt (Steinberg et al. 1993; Adams
et al. 1995). Da für His6- PKA-Cα S53D nur substöchiometrische Mengen an T197 phosphoryliertem Protein detektiert wurden (<5 %, vgl. 4.6), war es schwierig, den Einfluss der
Mutation unabhängig von der fehlenden Phosphorylierung an T197 zu betrachten.
Eine direkte Beteiligung der Hydroxylgruppe von S53 an der Substratbindung wurde
ausgeschlossen (Aimes et al. 2000). Jedoch könnte eine Phosphorylierung als negativer
112
5. Diskussion
Regulator die Verschiebung der glycinreichen Schleife erzwingen, wodurch die
Wasserstoffbrückenbildung zwischen der Aminogruppe des S53 und dem γ-Phosphat des
ATP gestört und somit der ternäre Übergangszustand zwischen Enzym, ATP und Sustrat
destabilisiert wird (vgl. 4.6, Abb. 37). Zu klären bleibt, ob der für His6- PKA-Cα S53D Verlust
der enzymatischen Aktivität und Inhibitorbindung von PKA-R und PKI tatsächlich auf einer
möglichen Phosphorylierung innerhalb der glycinreichen Schleife beruht oder aber ähnlich
wie für PKA-Cα G52A/S die Mutation zu einer sterischen Behinderung und damit
eingeschränkter Flexibilität der glycinreichen Schleife führt (Grant et al. 1998). Doch zeigt die
Tatsache, dass sich die beiden Phosphomimetika grundlegend in ihren kinetischen
Parametern unterscheiden und katalytisch aktives (PKA-Cα S53E) bzw. inaktives Protein
(His6- PKA-Cα S53D) generieren, dass diese flexible Region innerhalb der glycinreichen
Schleife schon über minimale Veränderungen reguliert werden kann und somit eine
interessante Position für das Anfügen von PTMs darstellt.
CDKs (cyclin-dependent kinases) repräsentieren eine Familie von Kinasen, bei denen eine
Phosphorylierung an T14/Y15 (analoge Position zu S53 in PKA-Cα, s. Abb. 50) in der glycinreichen Schleife zu einer Konformationsänderungen innerhalb des Aktivitätszentrums und
damit verbunden zu einer falschen Orientierung des ATP Moleküls und Öffnen der Substratbindetasche führt. Die Aktivierung von CDK2 über die Dephosphorylierung an Y15 ist an der
zeitlich korrekten Regulierung des Zellzyklus beteiligt (Bartova et al. 2004; Bartova et al.
2008). Da auch PKA in zahlreiche Waschstums- und Differenzierungsprozesse involviert ist
(Manning et al. 2002a; Manning et al. 2002b), ist auch hier eine zellzyklus abhängige
Regulierung mittels Phosphorylierung denkbar.
Interessanterweise wird die Wahrscheinlichkeit für eine Phosphorylierung an S53 durch PKC
(Proteinkinase C) höher bewertet (NetPhosK 1.0 Score 0,6) als durch PKA-Cα (Score 0,36)
(vgl. 5.2.1, Abb. 46, B). Ein möglicher Regulationsmechanismus über eine Phosphorylierung
an S53 bleibt somit nicht auf eine PKA-Cα Autophosphorylierung beschränkt, sondern
denkbar ist auch eine Beteilgung von heterologen upstream Kinasen, wie z. B. PKC.
113
5. Diskussion
Abb. 50: Kristallstrukturen von PKA-Cα (PDB: 3FJQ nach Thompson et al. 2009) und CDK2 (PDB: 1QMZ nach
Brown et al. 1999) visualisiert über VMD 1.8.6 (Humphrey et al. 1996).
Vergleich der Orientierung von glycinreicher Schleife (grau) mit phosphorylierbaren Aminosäuren (rot), ATP
(schwarz) und Peptidsubstrat PKI5-24 (cyan) mit P-Stelle (orange).
Letztendlich zeigen in silico Modelle, dass die in Phosphomimetika durch Aspartat und
Glutamat
ersetzten
Aminosäuren
nicht
immer
den
tatsächlichen
Effekt
einer
Phosphorylierung wiedergeben (Groban et al. 2006). Auch die Beobachtung, dass an
unphosphorylierter PKA-Cα die Hydroxylgruppe von T197 selbst an der Stabilisierung des
Aktivitätszentrum beteiligt ist, stellt dabei in Frage, ob gezielte Mutagenesen der P-Stelle,
wie für PKA-Cα T197A immer geeignete Methoden in der funktionellen Phosphoproteomanalytik sind (Steichen et al. 2010). Elegante experimentelle Ansätze, um insbesondere Autophosphorylierungsprozesse zu unterbinden, können durch das mutagenese-gerichtete
Zerstören der Konsensussequenz erzielt werden: So ist z. B. PKA-Cα R194A nicht mehr zur
Autophosphorylierung von T197 in der Lage, kann aber über die heterologe Kinase PDK-1
weiterhin trans-phosphoryliert werden (Steichen et al. 2010).
5.3.3 Vergleich der Dynamik des Phosphorylierungsstatus an rekombinanter und aus
Gewebe isolierter PKA-Cα
Sequenzielle Phosphorylierung der PKA-Cα am Beispiel von pS10, pT197 und pS338
Kristallstrukturen sind für den Nachweis von sequenziellen Phosphorylierungen nur bedingt
aussagekräftig, weil sie die Proteinkonformation nur in einer Momentaufnahme abbilden
und nicht die molekulare Dynamik von Proteinen widerspiegeln. Iyer et al. haben durch
rekombinante Expression von PKA-Cα in Gegenwart des inhibitorisch wirkenden ATP Analogs
114
5. Diskussion
H89 Protein exprimiert, welches vollständig unphosphoryliert ist (Chijiwa et al. 1990; Iyer
et al. 2005b). Nach in vitro Phosphorylierung von T197 mittels PDK-1 konnte sich dieses
aktivierte Protein im Gegensatz zu der Kinase-Totmutante PKA-Cα K72H anschließend an
S338 autophosphorylieren (Iyer et al. 2005a). PKA-Cα K72H hingegen ist nach T197 Phosphorylierung zwar wieder zur Bindung von Substraten und Inhibitoren fähig, bleibt aber inaktiv
und lässt sich auch nicht über heterologe PKA-Cα an S338 phosphorylieren (Iyer et al.
2005a). Dies und die Beobachtungen, dass mutagenisierte PKA-Cα S338A an T197
phosphoryliert, PKA-Cα T197A jedoch vollständig unphosphoryliert vorliegt (Steinberg et al.
1993; Iyer et al. 2005a), führten zu der Vorhersage eines 2-Schritt-Aktivierungsmodells, in
dem zunächst T197 autophosphoryliert wird und sich nur die so aktivierte PKA-Cα
anschließend intramolekular an S338 cis-phosphoryliert (Iyer et al. 2005b; Pickin et al. 2008).
Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse bezüglich des PKA-Cα Phosphorylierungsstatuses fordern unterschiedliche Vorhersagemodelle für die sequenzielle Phosphorylierung
an rekombinant exprimierter und aus Säugergewebe isolierter PKA-Cα (s. Abb. 51): Im
Säuger ist die transiente und deswegen bislang noch nicht nachgewiesene Phosphorylierung
an S10 am Freisetzen der während der Proteinsynthese an der Membran verankerten
PKA-Cα beteiligt (s. 5.3.1). pS10 wird an der im Zytoplasma lokalisierten PKA-Cα
dephosphoryliert während T197 von PDK-1 oder einer PDK-1-ähnlichem Kinase
trans-phosphoryliert wird (Cauthron et al. 1998; Cheng et al. 1998; Moore et al. 2002;
Breitenlechner et al. 2004). Aufgrund der geringen Enzymkonzentration tritt im Säuger die
von Iyer et al. und Pickin et al. postulierte Autophosphorylierung von S338 vermutlich
bevorzugt in cis auf (Iyer et al. 2005b; Pickin et al. 2008) (s. Abb. 51, A1). Die gegenseitige
Beeinflussung der P-Stellen erscheint allein bei der Betrachtung von pT197 und pS338 jedoch
noch komplexer: So konnten Romano et al. zeigen, dass nicht nur das Ade-Motiv
(adenine binding motif
327FD(x)1-2F/Y330)
sondern
der
in
Folge
(hydrophobic motif:
als konservierte PDK-1 Interaktionsstelle fungiert,
Phosphorylierung
348FxxF351)
von
S338
das
sogenannte
HF-Motiv
der PKA-Cα eine weitere Interaktionsplattform für PDK-1
präsentiert (Romano et al. 2009). Der für die Phosphorylierung von T197 und von S338
beschriebene sequenzielle Aktivierungsmechanismus könnte somit auch in umgekehrter
Reihenfolge ablaufen oder aber nach einer Dephosphorylierung von pT197 eine schnelle und
cAMP unabhängige Reaktivierung des Enzyms ermöglichen (s. Abb. 51, A2). Auch für die
AGC Kinase S6K1 (P70 ribosomale Protein-S6-kinase 1) wurde erst vor kurzem gezeigt, dass
115
5. Diskussion
die Phosphorylierung innerhalb des turn Motivs (pS338 in PKA-Cα) einer Phosphorylierung in
der Aktivierungsschleife (pT197 in PKA-Cα) vorausgeht (Keshwani et al. 2011).
In PKA-negativen S49 Mauslymphomzellen wurde hingegen eine PKA-Kinase-Aktivität
entdeckt von der T197 nur phosphoryliert werden konnte, wenn das Protein zuvor keinerlei
Serinphosphorylierung aufwies (Cauthron et al. 1998).
Abb. 51: Modell für die Aktivierung von
PKA-Cα über funktionelle P-Stellen
(modifiziert nach Breitenlechner et al.
2004; Iyer et al. 2005b).
weiß: unphosphorylierte Aminosäure,
orange: phosphorylierte Aminosäure:
(A) Die sequenzielle Phosphorylierung der
PKA-Cα im Säuger beginnt mit einer
Phosphorylierung an S10. Über eine
Konformationsänderung wird die Myristoylgruppe (myr) in einer hydrophoben Bindungstasche verankert und die PKA-Cα von
der Membran freigesetzt. Im Zytoplasma
wird die transiente P-Stelle pS10 von einer
Proteinphosphatase (PP) entfernt und (A1)
T197 über eine an das Ade-Motiv bindende
PDK-1-ähnliche Kinase phosphoryliert. Die
folgende Autophosphorylierung (Auto-P) an
S338 geschieht intramolekular. (A2) Die Phosphorylierung an S338 kann alternativ über die Exposition des
HF-Motivs eine weitere Erkennungsstelle für PDK-1 ausbilden und somit einer Phosphorylierung an T197
vorausgehen. (B) Bedingt durch die hohen Enzymkonzentrationen findet in E. coli eine ungeordnete
Autophosphorylierung statt, wobei die Auto-P von T197 nur während der Proteinfaltung erfolgen kann und im
Vergleich zu einer Phosphorylierung über PDK-1-ähnliche Kinasen sehr ineffizient ist. (C) In einem zellfreien
Expressionssystem kann die Autophosphorylierung von S338 ohne eine vorausgegangene initiale
Phosphorylierung an T197 erfolgen.
Wegen den in E. coli expressionsbedingten hohen Enzymkonzentrationen spielt die
sequenzielle Phosphorylierung in Abhängigkeit von der Expressionsdauer hier eine eher
untergeordnete Rolle (s. Abb. 51). Die Autophosphorylierung findet auch in trans und
116
5. Diskussion
zunächst an Serinresten statt (vgl. 4.5.3, Abb. 32 und Abb. 35) (Steinberg et al. 1993;
Yonemoto et al. 1993a; Girod et al. 1996). Da T197 von PKA-Cα deutlich weniger effizient als
von PDK-1 phosphoryliert wird, erfolgt die Phosphorylierung von diesem Threoninrest in
E. coli konzentrationsabhängig, nimmt daher mit der Expressionsdauer zu (Cauthron et al.
1998) und muss möglicherweise bereits während der Proteinfaltung erfolgen (Girod et al.
1996). Die in dieser Arbeit durchgeführten in vitro Autophosphorylierungsexperimente
bestätigen, dass zwar S10 und S338 nicht jedoch T197 an nativer PKA-Cα phosphoryliert
werden können (vgl. 4.5.3, Abb. 35). Auch das Auffinden von Phosphoformen der
His6-PKA-CαCoPP, die zwar an S338, jedoch nicht an T197 phosphoryliert sind, unterstützt die
Ineffizienz der T197 Phosphorylierung in E. coli (vgl. 4.5.1, Abb. 28). Möglicherweise erlaubt
auch in E. coli erst die, durch die N-terminale Myristoylgruppe induzierte Konformation eine
Phosphorylierung von T197 an nativem Protein, denn Cauthron et al. gelang der Nachweis
einer -wenn auch weiterhin ineffizienten- intermolekularen Autophosphorylierung nur an
myristoyliertem Protein (Cauthron et al. 1998). Für das in Anwesenheit des spezifischen PKA
Inhibitors H89 in E. coli exprimierte und unphosphorylierte Protein lässt die aktuelle
Datenlage offen, ob - in Gegenwart ausreichend hoher ATP-Konzentrationen - die
Phosphorylierung an T197 über PDK-1 zwingend für die nachfolgende Phosphorylierung an
S338 vorhanden sein muss (Cauthron et al. 1998). Unabhängige Arbeiten mit
mutagenisierten PKA-Cα die trotz fehlender T197 Phosphorylierung an S338 phosphoryliert
sind, weisen darauf hin, dass in E. coli eine initiale Phosphorylierung an T197 die Autophosphorylierung der anderen P-Stellen zwar beschleunigt, aber nicht zwingend notwendig
ist (Hemmer et al. 1997b; Steichen et al. 2010). Mit zellfrei exprimierter His6- PKA-Cα CFE
(vgl. 4.4.2) und in vitro autophosphorylierter PKA-Cα (vgl. 4.5.3, Abb. 35) konnten hier
erstmalig auch an nicht mutagenisierter PKA-Cα Phosphoformen beschrieben werden, die
ausschließlich an S338 autophosphoryliert sind. Im Säuger sind derartige Phosphoformen
bislang nicht beschrieben, könnten aber in Folge der Abwesenheit oder Inaktivität von PDK-1
oder PDK-1 ähnlichen Kinasen auftreten.
117
5. Diskussion
5.3.4 Einfluss der Expressions- und Reinigungsbedingungen auf den Phosphorylierungsstatus von rekombinanter PKA-Cα
Die in dieser Arbeit exzessive in vitro Autophosphorylierung von S338 an PKA-CαCoPP (s. 4.5.3,
Abb. 35) ist auf verschiedene Schritte während der Reinigung zurückzuführen (s. Abb. 52):
Während der PKI5-24-Affinitätschromatographie kommt es zunächst zum Verlust von nicht an
T197 phosphorylierten Proteinspezies, da diese eine geringere Affinität zu PKI besitzen
(Steinberg et al. 1993; Cauthron et al. 1998; Steichen et al. 2010). Nur die Phosphorylierung
an S338, nicht jedoch an T197, konnte anschließend in Autophosphorylierungsexperimenten
regeneriert werden. Über die zusätzliche Autophosphorylierung an S10 (im vereinfachten
Modell in Abb. 52 nicht gezeigt) lassen sich die nach in vitro Autophosphorylierung
detektierten 2P- (pS10 + pS338, pS338 + pT197) und 3P- (pS10 + pT197 + pS338) Phosphoformen erklären (vgl. 4.5.3, Abb. 33).
Abb. 52: Einfluss der Expressions- und Reinigungsbedingungen auf den
Phosphorylierungsstatus von rekombinanter PKA-Cα am Beispiel der
funktionellen P-Stellen pT197 und pS338.
Die Größe der schematisch dargestellten PKA-Cα gibt den prozentualen
Anteil der Phosphoformen an: weiß: unphosphorylierte Aminosäure,
orange: phosphorylierte Aminosäure: Die unterschiedliche Effizienz der
Autophosphorylierung führt dazu, dass (A) bei kurzen Expressionszeiten
(<1 h) vorrangig an S338 phosphorylierte Proteinspezies vorhanden sind.
(B) Erst nach ca. 8 h Expression sind T197 und S338 an allen Proteinspezies
vollständig phosphoryliert. (C) In Folge der Coexpression der PKA-Cα mit
λ-Phosphatase (λ-PP) liegen neben vollständig unphosphorylierter PKA-Cα
geringe Mengen an Proteinspezies vor, welche an T197 bzw. an S338
phosphoryliert sind. Gleichzeitig an T197 und S338 phosphorylierte
Phosphoformen konnten über Molekulargewichtsbestimmung nicht
nachgewiesen werden. Durch die PKI5-24-Affinitätschromatographie geht
der Großteil der nicht an T197 phosphorylierten Phosphoformen verloren.
Neben unphosphoryliertem Protein lassen sich über quantitative MS 34 %
der Proteinspezies an T197 und 18 % an S338 phosphoryliert nachweisen.
Eine nachträgliche in vitro Autophosphorylierung (Auto-P, rote P-Stelle)
findet nur an S338, nicht an T197 statt.
118
5. Diskussion
Hingegen früherer Beobachtungen ließen sich interessanterweise auch vollständig
unphosphorylierte PKA-Cα über PKI5-24-Affinitätschromatographie anreichern. Die Ursache
liegt vermutlich zum einen in der hohen Ausgangskonzentration dieser Phosphoform und
zum anderen in der für die PKI5-24-Affinitätschromatographie verwendeten höheren ATP
Konzentration (3 mM ATP/5 mM Mg2+ gegenüber 50-100 µM ATP/2-5 mM Mg2+ (Steinberg
et al. 1993; Cauthron et al. 1998)). Die Aktivierung über Phosphorylierung an T197 erhöht
folglich zwar die Affinität, ist aber keine zwingende Voraussetzung für eine Bindung an PKI.
Um speziell für die gering phosphorylierten PKA-Cα den nachweislich auf ATP beruhenden
Autophosphorylierungseffekt zu umgehen (s. 4.5.3, Abb. 36), sollten für diese Phosphoformen alternative Reinigungstrategien, wie z. B. eine Immunopräzipitation, eine Reinigung
über Fusionsanteile oder aber Isolierung von PKA-Cα aus dem Holoenzymkomplex (Bertinetti
et al. 2009) bevorzugt genutzt werden. Bei der Verwendung von Fusionskonstrukten muss
dabei sichergestellt werden, dass der Fusionsanteil keine phosphorylierbaren Aminosäuren
besitzt, welche die Analyse des Phosphorylierungstatus weiter verkomplizieren können
(s. 4.3.5, Abb. 23).
Letztendlich hat die PKI5-24-Affinitätschromatographie nur Einfluss auf die Reinigung von
gering phosphorylierten PKA-Cα gezeigt. Unter Standardbedingungen exprimiertes Protein
ist vollständig phosphoryliert und lässt sich im direkten Vergleich zu einer über HistidinFusionsanteil gereinigten PKA-Cα ohne Verluste über PKI5-24-Affinitätschromatographie
isolieren (s. 4.3.5).
5.3.5 Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität und der Anzahl der PKA-Cα
Phosphorylierungsstellen
Anders als ursprünglich beschrieben, wurde in dieser Arbeit eine Aktivitätssteigerung in
Folge der Hyperphosphorylierung von PKA-Cα in E. coli beobachtet (maximal 40 U/mg
gegenüber dem Literaturwert von 20-30 U/mg (Slice et al. 1989; Herberg et al. 1993a)
(s. Abb. 53): Vermutlich haben die im Vergleich zu Vorarbeiten ausgeführten langen
Expressionszeiten (hier: 18 h genüber Slice/Herberg: 8h), erst eine exzessive Autophosphorylierung und damit verbundene Aktivitätssteigerung ermöglicht.
Während sich die fehlende Aktivität der Kinase-Totmutante (PKA-Cα K72H) auf eine nahezu
vollständig reduzierte Phosphorylierung der konstitutiven P-Stellen pT197 und pS338
zurückführen lässt (Yonemoto et al. 1997), können auch andere P-Stellen die Aktivität
119
5. Diskussion
beeinflussen. Da sich für über Mono-S-Chromatographie aufgetrennte Phosphoformen
(2P: pT197, pS338;
3P: pS10, pT197, pS338;
4P:
pS10, pT197, pS338, pS139)
keine
Unterschiede in ihren spezifischen Aktivitäten zeigten, kann ausgeschlossen werden, dass
pS10 bzw. pS139 für eine Aktivitässteigerung verantwortlich sind (Herberg et al. 1993a).
Auch die in dieser Arbeit funktionell untersuchte P-Stelle pS53 hat keinen aktivierenden
sondern inhibierenden Einfluss auf die spezifische Aktivität gezeigt (vgl. 4.6). Von den
verbleibenden nur substöchiometrisch modifizierten P-Stellen pS34, pS65, pS259 ist ein
Einfluss auf die spezifische Aktivität für letztgenannte am wahrscheinlichsten, da diese
Position mit maximal 45 % zu einem relativ hohen Prozentsatz phosphoryliert vorliegt
(vgl. 5.1).
Auch die in 4.3.6 untersuchte unterschiedliche Sensitivität gegenüber Phosphatasen äußert
sich indirekt über die Unterschiede in den spezifischen Aktivitäten: Die Beobachtung, dass
PKA-Cα, die bereits während der Coexpression dephosphoryliert wird (PKA-CαCoPP) auch nach
in vitro Autophosphorylierung nur zu ca. 50 % aktiv ist, beruht auf der äußerst ineffizienten
Autophosphorylierung an T197 (vgl. 4.5.3, Abb. 35). Hingegen ist die Aktivität von in vitro dephosphoryliertem Protein nahezu unverändert (Humphries et al. 2005), was vorrangig auf
die Phosphatasestabilität von pT197 und pS338 an nativer PKA-Cα zurückzuführen ist
(s. Abb. 53).
Abb. 53: Zusammenhang zwischen der spezifischen Aktivität und der Anzahl der PKA-Cα P-Stellen.
PKA-CαCoPP: PKA-Cα nach Coexpression mit lambda Phosphatase (λ-PP).
5.4
Ist die Phosphatase PP5 ein physiologischer Regulator der PKA-Cα?
Das ein Fehlen von säugerspezifischen Phosphatasen für den Hyperphosphorylierungsstatus
der PKA-Cα in E. coli verantwortlich ist, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht
ausgeschlossen werden (vgl. 4.3.6). Obwohl andere Kinasen über Phosphorylierung und
Dephosphorylierung in ihrer Aktivitätsschleife reguliert werden, ist bislang keine
120
5. Diskussion
Phosphatase bekannt, welche die konstitutive und für die Aktivität essenzielle Phosphorylierung von T197 effizient an nativer PKA-Cα entfernen kann (Hanks et al. 1988; Morgan
et al. 1994; Yan et al. 1994; Hanks et al. 1995). Die Stabilität der T197 Phosphorylierung hat
ihre Ursache in zahlreichen Interaktionen des Phosphats mit den umliegenden Aminosäuren
H87, R165, K189, T195 (Knighton et al. 1991b). Diskutiert wird, ob eine Konformationsänderung
der
PKA-Cα
unter
bestimmten
physiologischen
Bedingungen
eine
Dephosphorylierung von pT197 ermöglicht: So ließ sich PKA-Cα z. B. in Folge einer Oxidation
oder Thiolmodifikation an der nukleophilen Position C199 (Humphries et al. 2005) oder nach
Urea-Behandlung (Liauw et al. 1996) erfolgreich an T197 dephosphorylieren.
Von den verschiedenen in dieser Arbeit untersuchten Phosphatasen zeigte sich PP5 als
besonders interessant, da es mit dieser Phosphatase in Anwesenheit von Arachidonsäure
erstmals in vitro gelang, pT197 an nativer PKA-Cα zu dephosphorylieren. Möglicherweise ist
auch die Ende der neunziger Jahre in S49 Mauslymphomzellen entdeckte unbekannte
zelluläre Proteinphosphatase Aktivität mit der pT197 in vitro unter bestimmten
physiologischen Bedingungen dephosphoryliert werden konnte (Liauw et al. 1996), auf PP5
zurückzuführen.
Aufgrund ihrer geringen Basalaktivität wurde PP5 erst Ende der neunziger Jahre von drei
unabhängigen Forschergruppen als Serin/Threonin-Proteinphosphatase entdeckt (Becker
et al. 1994; Chen et al. 1994; Chinkers 1994). Im Gegensatz zu anderen Proteinphosphatasen
sind bei PP5 katalytische und regulatorische Funktionen in einem Polypeptid vereint (Price
et al. 1999). Die Sequenzhomologie zu anderen Proteinphosphatasen innerhalb der
Phosphatasedomäne beträgt 40 % (Chen et al. 1994). PP5 wird ubiquitär und mit hohen
Expressionsspiegeln vorrangig im Gehirn exprimiert (Becker et al. 1994; Bahl et al. 2001).
Trotz dem Vorhandensein eines Kernlokalisationssignals wurde die Phosphatase auch im
Zytoplasma nachgewiesen (Chen et al. 1994; Chinkers 1994; Chen et al. 1996; Galigniana
et al. 2002; Zeke et al. 2005), außerdem wird eine mögliche Membranenverankerung
diskutiert (Chen et al. 1997). Die niedrige Basalaktivität beruht auf den N-terminalen
PP5-spezifischen autoinhibitorischen Tetratricopeptid-(TRP)-Domänen, die das katalytische
Zentrum blockieren (Becker et al. 1994; Chen et al. 1994; Chinkers 1994). Sowohl die
Deletion der TRP-Domänen (Sinclair et al. 1999), wie auch die Bindung von
Hitzeschockproteinen (Hsp90) (Yang et al. 2005) oder von ungesättigten Fettsäuren, wie z. B.
Arachidonsäure an diese Domänen führen in vitro zu einer Aktivierung der PP5 (s. 4.3.6,
121
5. Diskussion
Abb. 25) (Chen et al. 1997; Skinner et al. 1997; Kang et al. 2001; Ramsey et al. 2002; Beaufils
et al. 2008). Die physiologische Bedeutung derartiger Aktivierungsmechanismen ist jedoch
noch ungeklärt (Becker et al. 1994; Swingle et al. 2004). In verschiedenen Tumoren aus
Säugern konnte eine auf Proteinebene erhöhte PP5 Expression nachgewiesen werden
(Shirato et al. 2000; Periyasamy et al. 2007; Golden et al. 2008). Lebensfähige Mäuse nach
einem PP5 knock down über RNA Interferenz weisen hingegen weniger auf eine essenzielle,
sondern mehr auf eine modulatorische Funktion von PP5 hin (Yong et al. 2007; Hinds et al.
2008). Die breite Substratspezifität von Phosphatasen auf der einen und die geringe
Basalaktivität von PP5
auf der anderen Seite erschweren die Suche nach ihren
physiologischen Substraten (Becker et al. 1994; Chen et al. 1994; Chinkers 1994). Bekannt
ist, dass die Dephosphorylierung von ASK1 (Apoptosis-signal-relating-kinase-1) über PP5 z. B.
eine Schlüsselrolle bei der Inaktivierung des MAP Kinase ASK1-JNK/p38 Signalweges spielt
(Morita et al. 2001) während über PP5 dephosphorylierte CKIε (Casein kinase I) an der
Aufrechterhaltung des zirkadianen Rhythmus beteiligt ist (Partch et al. 2006). Ähnlich wie
PKA ist PP5 in zahlreiche metabolische Prozesse involviert, wie u. a. in die DNA-Reparatur
und Apoptose, in Zellzykluskontrolle und die Regulation von Ionenkanälen und Steroidhormonrezeptoren (Übersicht in Chinkers 2001). Ein direkter Zusammenhang zwischen PP5
und PKA-Cα wurde jedoch bislang nicht beschrieben. In der Dissertation von F. Werner wird
ein Überblick über potenzielle Substrate der PP5 in Mäuseherzen gegeben (Werner 2010).
Eine dort nachgewiesene in vitro Phosphorylierung von PP5 durch PKA ist aufgrund der
geringen Umsatzrate physiologisch eher irrelevant (Werner 2010). Eine Dephosphorylierung
von PKA-Cα durch PP5 in Anwesenheit des Aktivators Arachidonsäure wurde in dieser Arbeit
erstmalig gezeigt, ist aufgrund der regulatorischen Funktion von pT197 äußerst interessant,
und sollte in weiteren Studien näher auf ihre physiologische Signifikanz hin untersucht
werden.
122
6. Zusammenfassung
6
ZUSAMMENFASSUNG
Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr
ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und
Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung
auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun
Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC-MS/MS Analysen oftmals
schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen
Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen).
Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an
der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen
identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über
quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige
Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad
für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte.
Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung
definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der
primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den
gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und
pS338 auf. Auch
in vitro autophosphorylierte
rekombinante
PKA-Cα, die
zuvor
dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im
Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv
phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das
Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in
E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht
phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde.
Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung
sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338
phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die
Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende
Phosphorylierung an S338 ist.
123
6. Zusammenfassung
Ferner
konnte
über
phosphomimetische
Mutagenese
die
Funktionalität
der
Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein
potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer
möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war,
die bislang als phosphatasestabil beschriebene P-Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von
zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für
rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde.
Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur
identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen
differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.
124
7. Summary
7
SUMMARY
Investigating the dynamic phosphostatus of single proteins, cells or tissues is of pivotal
importance to understand protein function on a molecular level - hence, it is a major
challenge in proteomics: In general, phosphorylation status analyses are performed on
phosphopeptide level following protein cleavage. However, such phosphosite specific
screens show limitations, since they do not sufficiently consider - apart from the variability the generally low abundance and substoichiometry of phosphoproteins as well as the fact
that phosphopeptides are often suppressed when applying LC-coupled mass spectrometry
(MS). Using a classical MS approach in combination with phosphospecific enrichment
strategies, a total of eight phosphorylation sites (P-sites) could be identified on the model
kinase PKA-Cα when expressed in E. coli. In collaboration with Dr. J. Seidler signal intensity
measurements were performed to quantify the stoichiometry of P-sites: While pS10, pS139,
pT197 and pS338 were found to be completely phosphorylated, the phosphorylation degree
for residual P-sites at pS34, pS53, pS65 and pS259 varied between <5 and 45 %.
On intact protein level, PKA-Cα reveals certain distinct phosphoforms displaying a different
molecular weight depending on the primary amino acid sequence, on the introduction of
additional protein modifications as well as the chosen expression conditions and purification
strategies. Interestingly, endogenous mammalian PKA-Cα purified from animal tissue
displayed only a single phosphoform with two P-sites at pT197 and pS338. Several results
from this work argue that hyperphosphorylation of PKA-Cα in E. coli is exclusively based on
autophosphorylation, which earlier was concluded from a kinase death mutant (PKA-Cα
K72H) that does not exhibit any phosphorylation at all. In an in vitro autophosphorylation
assay on recombinantly expressed and dephosphorylated PKA-Cα, however, the dominant
phosphoform turned out to be phosphorylated only twice - as was PKA-C isolated from
animal tissue. During autophosphorylation, no further modification was detected at T197,
while S10 and S338 were found to be excessively phosphorylated. Concerning the functional
P-sites at pT197 and pS338, these data, as well as data from protein expressed in a cell-free
expression system that displayed only a single P-site at S338, also do challenge the long
accepted hypothesis that phosphorylation at T197 is a prerequisite for phosphorylation of
S338.
Phosphorylation in the glycine-rich loop of PKA-Cα was investigated via phosphomimetic
mutagenesis of S53 and might be involved in fine-tuning the enzyme’s specific activity.
125
7. Summary
Protein phosphatase 5 could be identified as a putative upstream regulator of PKA-Cα, which
in vitro was able to efficiently dephosphorylate the predicted phosphatase stable P-site
pT197.
Finally, this work demonstrates that the overall phosphorylation pattern of a protein
depends on various internal and external conditions – a fact that should be generally
considered when working on the phosphostatus of recombinant proteins, especially of
enzymatically active kinases. In the future, general shotgun phosphoproteomic studies will
have to draw deeper attention to the physiological background of a given protein while
identifying P-sites and phosphoforms as well as quantifying their phosphorylation degree.
126
8. Literaturverzeichnis
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141
9. Anhang
9
ANHANG
9.1
Abkürzungsverzeichnis
In dieser Arbeit wurden Einheiten nach dem Internationalen Einheitensystem (SI) verwendet. Aminosäuren wurden nach dem Einbuchstabencode abgekürzt
und Elemente entsprechend der Nomenklatur des Periodensystems der Elemente benannt.
AA
Acrylamid
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
LC
ACN
Acetonitril
EGTA
Ethylenglycoltetraacetat
m/z
APS
Ammoniumperoxidsulfat
ESI
Elektrospray Ionisation
MALDI
Ara
AS
Arachidonsäure
Aminosäure
ETD
FA
MES
2+
Mg
Asp-N
ATP
Endoproteinase (Flavastacin)
Adenosintriphosphat
FPLC
FWHM
MgCl2
min
Magnesiumchlorid
Minute
Auto-P-Stelle
bp
BSA
GST
h
H89
MOPS
MS
MS/MS
3-(Morpholino)-propansulfonsäure
Massenspektrometrie
Tandem-Massenspektrometrie
HCCA
MSDB
mass spectrometry protein sequence database
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
MW
C-Terminus
Autophosphorylierungsstelle
Basenpaare
Rinderserumalbumin
(bovine serum albumin)
zyklisches Adenosinmonophosphat
(adenosine 3'5' cyclic
monophosphate)
Kollisionsinduzierte Dissoziation
(collision induced dissociation)
Carboxyl-Terminus
electron transfer dissociation
Ameisensäure
(formic acid)
fast pressure liquid chromatography
Halbwertsbreite
(full width at half maximum)
Glutathion-S-Transferase
Stunde
unspezifischer PKA- und Rho-Kinase-Inhibitor
(ATP Analog)
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid
Flüssigkeitschromatographie
(liquid chromatography)
Verhältnis von Masse zu Ladung
(mass-to-charge ratio)
Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation
(matrix-assisted laser desorption/Ionisation)
2-(Morpholino)-ethansulfonsäure
Magnesiumionen
HPLC
myr
DDA
data dependent aquisition
HTS
NHS
N-Hydroxysuccinimid
des
Desaminierung
IAA
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(high pressure liquid chromatography)
Hochdurchsatz Screening
(high throughput screening)
Iodacetamid
Molekulargewicht
(molecular weight)
Myristoylierung
NMR
DHB
2,5-Dihydroxybenzosäure
IMAC
NTA
DNA
IPTG
N-Terminus
Amino-Terminus
DTT
Desoxyribonukleinsäure
(deoxyribonucleic acid)
Dithiothreitol
Metallchelatchromatographie
(immobilised metal ion affinity chromatography)
Isopropylthiogalaktosid
Kernspinresonanz
(nuclear magnetic resonance)
Nitrilotriessigsäure
Kat
Kationenaustauscherchromatographie
OA
E. coli
ECD
Escherichia coli
electron capture dissociation
kb
kDa
Kilo-Basenpaare
Kilodalton
OD
P-
Okadasäure
(okadaik acid)
optische Dichte
Phospho-
cAMP
CID
142
9. Anhang
P20
PA
PAA
PAGE
PCR
Pfu
PGlk
PMF
PP
ppm
pS, pT, pY
PTM
PVDF
Q
RP
rpm
RU
SDS
sek
SPR
SRM
TCA
TEMED
TFA
TiO2
TOF
Tris
U
UV
Polyoxyethylenesorbitan
Phosphorsäure
(phosphoric acid)
Polyacrylamid
Polyacrylamidgelelektrophorese
Polymerase Kettenreaktion
(polymerase chain reaction)
Pyrococcus furiosus
Phosphoglukonsäure
Peptidmassenfingerabdruck
(peptide mass fingerprint)
Proteinphosphatasen
-6
10
(parts per million)
Phosphoserin, Phosphothreonin,
Phosphotyrosin
Posttranslationale Modifikation
Polyvinylidenfluorid
Quadrupol
Umkehrphase
(reversed phase)
Umdrehungen pro Minute
rounds per minute)
Resonanzeinheiten
(resonance units)
Natriumdodecylsulfat
(sodium dodecyl sulfate)
Sekunde
Oberflächenplasmonresonanz
(surface plasmon resonance)
selective reaction monitoring
Trichloressigsäure
(trichloroacetic acid)
Tetramethylenethylendiamid
Trifluoressigsäure
(trifluoroacetic acid)
Titaniumdioxid
Flugzeit
(time-of-flight)
Tris (hydroxymethyl-) aminomethan
Unit
ultraviolet
v/v
w/v
Volumen pro Volumen
Gewicht pro Volumen
β-ME
β-Mercaptoethanol
143
9. Anhang
9.2
Zusatzinformationen zu endogener PKA-C aus Schweinegewebe
A1: Proteinidentifizierung von PKA-C aus Schweineleber und-niere.
Endogene PKA-Cα (P36887) wurde über PKI5-24-Affinitätschromatographie aus verschiedenen Schweinegeweben gereinigt. (A) Die Proteindetektion erfolgte über
SDS-PAGE: oben: Coomassie Färbung; Mitte: Westernblot Analysen über α-PKA-C Antikörper (20 sek Belichtung), α-PKA-C-pT197 (30 sek) und α-PKA-C-pS338 (1 min);
TM
unten: Auftrennung der Phosphoformen über Phos-tag SDS-PAGE; (B) Molekulargewichtsbestimmung über nanoLC-ESI-MS. xP*: neben xP-Stellen lässt sich noch eine
Modifikation mit Myristinsäure nachweisen. Nicht markierte molekularen Massen lassen sich keinem der theoretisch berechneten Molekulargewichte für PKA-C Iso- bzw.
Phosphoform zuordnen (vgl. 4.3.2, Tab. 8); (C) ESI-MS/MS Sequenzierung (für MS/MS Spektren s. Anhang 9.5) und Identifizierung von PKA-Cα über einen Sequenzdatenbankabgleich mittels Mascot (Matrix Sciences): nachgewiesene Sequenz (rot). Die spezifischen Aktivitäten (grün) wurden in drei voneinander unabhängigen Messungen für
TM
die Phosphorylierung des Substrates Kemptide im Cook-Assay (Fusion ) ermittelt.
144
9. Anhang
murine PKA-C:
porcine PKA-C:
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
------------MGNAAAAKK--------------GSEQES--------------------------------------M--------------ASSSND------------------------------MGN-TAIAK-------------KGSEVES----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------MGL---------MAAHKELSSGQHSGTPTALQKLEGFASRLFHRHSRGTAQEHRAALEDDGLRASEHTASWD
15
7
15
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
--VKEFLAKAKEDFLKKWETPSQNTAQLDQFDRIKTLGTGSFGRVMLVKHKESGNHYAMK
--VKEFLAKAKEDFLKKWETPSQNTAQLDQFDRIKTLGTGSFGRVMLVKHKESGNHYAMK
--VKEFLAKAKEDFLRKWENPPPSNAGLEDFERKKTLGTGSFGRVMLVKHKATEQYYAMK
MNVKEFLAKAKEDFLRKWENPPPSNAGLEDFERKKTLGTGSFGRVMLVKHKATEQYYAMK
--LKEFLAKAKEDFLRKWENPPPSNAGLEDFERKKTLGTGSFGRVMLVKHKATEQYYAMK
KSMKEFLAKAKEDFLRKWENPPPSNAGLEDFERKKTLGTGSFGRVMLVKHKATEQYYAMK
73
65
73
60
61
120
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVAGGEMFSHL
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVAGGEMFSHL
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVEFPFLVRLEYSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHL
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVEFPFLVRLEYSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHL
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVEFPFLVRLEYSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHL
ILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVEFPFLVRLEYSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSHL
133
125
133
120
121
180
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVK
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGYIQVTDFGFAKRVK
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDHQGYIQVTDFGFAKRVK
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDHQGYIQVTDFGFAKRVK
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDHQGYIQVTDFGFAKRVK
RRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDHQGYIQVTDFGFAKRVK
193
185
193
180
181
240
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVS
253
245
253
240
241
300
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFATTDWIAIYQRKVEA
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFATTDWIAIYQRKVEA
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFATTDWIAIYQRKVEA
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFATTDWIAIYQRKVEA
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFATTDWIAIYQRKVEA
GKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFATTDWIAIYQRKVEA
313
305
313
300
301
360
Cα1:
Cα2:
Cβ1:
Cβ2:
Cβ3:
Cβ4:
PFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFTEF
PFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFTEF
PFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEEIRVSITEKCGKEFCEF
PFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEEIRVSITEKCGKEFCEF
PFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEEIRVSITEKCGKEFCEF
PFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEEIRVSITEKCGKEFCEF
351
343
351
338
339
398
3
60
Cα1: MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWENPAQNTAHLDQFERIKTLGTGSFGRVML 60
Cβ1: MGNAATAKKGSEVESVKEFLAKAKEDFLKKWENPAPNNAGLEDFERKKTLGTGSFGRVML 60
Cα1: VKHKETGNHFAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVKLEYSFKDNSNLYMV 120
Cβ1: VKHKATEQYYAMKILDKQKVVKLKQIEHTLNEKRILQAVNFPFLVRLEFSFKDNSNLYMV 120
Cα1: MEYVPGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDQQGY 180
Cβ1: MEYVPGGEMFSHLRRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLIDHQGY 180
Cα1: IQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFF 240
Cβ1: IQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAVDWWALGVLIYEMAAGYPPFF 240
Cα1: ADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFAT 300
Cβ1: ADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFAT 300
Cα1: TDWIAIYQRKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF 351
Cβ1: TDWIAIYQRKVEAPFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEDIRVSITEKCGKEFCEF 351
A2: Nachweis von PKA-Cβ Isoformen mittels MS/MS Sequenzierung und
Sequenzdatenbankabgleich mittels Mascot (Matrix Sciences).
Peptide, über die eindeutig PKA-Cß Isoformen identifiziert werden konnten, sind
in einem Sequenzvergleich rot hervorgehoben (CLUSTAL 2.1 multiple sequence
alignment (Chenna et al. 2003)). Sequenzunterschiede sind grau hinterlegt. Die für
den jeweiligen Organismus bekannten Sequenzen wurden der Swissprot-Proteindatenbank entnommen. murine PKA-C: Cα1 (P05132-1), Cα2 (P05132-2), Cβ1
(P68181-1), Cβ2 (P68181-2), Cβ3 (P68181-3), Cβ4 (P68181-4); porcine PKA-C: Cα1
(P36887),Cβ1 (P05383).
145
9. Anhang
9.3
Übersicht über theoretisch berechnete Molekulargewichte für PKA-Cα
Protein
MW
murine
PKA-Cα
murine
PKA-Cα
S53A
murine
PKA-Cα
S53E
murine
His6 -PKA-Cα
murine
His6 -PKA-Cα
S53D
murine
His6 -PKA-Cα
K72H
humane
PKA-Cα
humane myr
PKA-Cα
porcine
PKA-Cα
porcine myr
PKA-Cα
Swissprot ID
P05132
P05132
P05132
P05132
P05132
P05132
P17612
P17612
P36887
P36887
Molekulargewicht
Startmethionin
His6 -Fusionsanteil
Mutation K72H
Mutation S53A/E/D
Myristyolierung (myr)
0P
1P
2P
3P
4P
5P
6P
7P
8P
9P
10P
0P
0P +PGlk
1P +PGlk
2P +PGlk
3P +PGlk
4P +PGlk
5P +PGlk
6P +PGlk
7P +PGlk
8P +PGlk
9P +PGlk
10P +PGlk
40.571
40.439
40.439
40.519
40.599
40.679
40.759
40.839
40.919
40.999
41.079
41.159
41.239
40.439
40.697
40.777
40.857
40.937
41.017
41.097
41.177
41.257
41.337
41.417
41.497
40.571
40.439
40.423
40.423
40.503
40.583
40.663
40.743
40.823
40.903
40.983
41.063
41.143
41.223
40.423
40.681
40.761
40.841
40.921
41.001
41.081
41.161
41.241
41.321
41.401
41.481
40.571
40.439
40.481
40.481
40.561
40.641
40.721
40.801
40.881
40.961
41.041
41.121
41.201
41.281
40.481
40.739
40.819
40.899
40.979
41.059
41.139
41.219
41.299
41.379
41.459
41.539
40.571
40.439
42.602
42.602
42.682
42.762
42.842
42.922
43.002
43.082
43.162
43.242
43.322
43.402
42.602
42.860
42.940
43.020
43.100
43.180
43.260
43.340
43.420
43.500
43.580
43.660
40.571
40.439
42.602
42.630
42.630
42.710
42.790
42.870
42.950
43.030
43.110
43.190
43.270
43.350
43.430
42.630
42.888
42.968
43.048
43.128
43.208
43.288
43.368
43.448
43.528
43.608
43.688
40.571
40.439
42.602
42.611
42.611
42.691
42.771
42.851
42.931
43.011
43.091
43.171
43.251
43.331
43.411
42.611
42.869
42.949
43.029
43.109
43.189
43.269
43.349
43.429
43.509
43.589
43.669
40.590
40.458
40.458
40.538
40.618
40.698
40.778
40.858
40.938
41.018
41.098
41.178
41.258
40.458
40.716
40.796
40.876
40.956
41.036
41.116
41.196
41.276
41.356
41.436
41.516
40.590
40.458
40.668
40.668
40.748
40.828
40.908
40.988
41.068
41.148
41.228
41.308
41.388
41.468
40.668
40.926
41.006
41.086
41.166
41.246
41.326
41.406
41.486
41.566
41.646
41.726
40.617
40.485
40.485
40.565
40.645
40.725
40.805
40.885
40.965
41.045
41.125
41.205
41.285
40.485
40.743
40.823
40.903
40.983
41.063
41.143
41.223
41.303
41.383
41.463
41.543
40.617
40.485
40.695
40.695
40.775
40.855
40.935
41.015
41.095
41.175
41.255
41.335
41.415
41.495
40.695
40.953
41.033
41.113
41.193
41.273
41.353
41.433
41.513
41.593
41.673
41.753
-132 Da
+2163 Da
+9 Da
-16/+42/+28 Da
+210 Da
+80 Da
+160 Da
+240 Da
+320 Da
+400 Da
+480 Da
+560 Da
+640 Da
+720 Da
+800 Da
+258 Da
+338 Da
+418 Da
+498 Da
+578 Da
+658 Da
+738 Da
+818 Da
+898 Da
+978 Da
+1058 Da
Die angegebenen Molekulargewichte (MW) für Proteine und Proteinsequenzen wurden über PEPTIDEMASS (Wilkins et al. 1997) berechnet und basieren auf Sequenzen aus der
Swissprot-Datenbank. Da auf das Startmethionin ein Glycinrest folgt, war ein Entfernen des Methionins als zelluläre Prozessierung zu erwarten (Boissel et al. 1988; Shen et al.
2004). (P) Phosphorylierung; (PGlk) Phosphoglukonsäure.
146
9. Anhang
9.4
Übersicht über alle mittels MS/MS Sequenzierung identifizierten P-Stellen von PKA-Cα
Variable
#
Sequenz
MS/MS
N-terminaler
Fusionsanteil
Protein
Reingunsmethode
Expressionsort
Expressionsbedingungen
P-Stellen
O
S10 S34 S53 S65
Reinigung
Expression
Autophosphorylierung
TM
über Phos-tag
SDS-PAGE
Sequenz
N-terminale Modifkation
Organismus
Mutagenese
1
2
3
4
5a
5b
5c
5d
5e
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
murin
human
human
murin
porcin
porcin
porcin
porcin
murin
murin
murin
murin
His6
-
o
His6
His6
myr
myr
myr
myr
myr
myr
His6
His6
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-CαCoR
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-CαCoPP
PKA-CαCoPP
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-CαCoPP
PKA-CαCoPP
PKA-CαCoPP
PKA-CαCoPP
PKA-CαCoPP
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα
PKA-Cα K72H
PKA-Cα S53A
PKA-Cα S53E
PKA-Cα S53D
PKI5-24
Kat
2+
Co
2+
Ni
MonoS F. 16
MonoS F. 17
MonoS F. 18
MonoS F. 21
MonoS F. 22
PKI5-24
PKI5-24
2+
Ni
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
PKI5-24
2+
Co
PKI5-24
PKI5-24
2+
Co
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
CFE
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Herz
Herz
Skelettmuskel
Leber
Niere
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
0 µM IPTG 24h
400 µM IPTG 2 h
Standard
Standard
Bande 1*
Bande 2*
Bande 3*
Bande 4*
Bande 5*
Bande 6*
Bande 7*
Bande 8*
Bande 9*
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
S139 T197 S259 S338
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
p
np
p
p
p
p
p
p
p
np
p
p
p
p
p
np
p
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p
p
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p
p
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p
p
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p
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p
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p
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p
p
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p
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p
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p
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p
p
p
p
np
p
p
p
p
p
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p
p
p
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np
np
np
np
np
np
p
np
np
np
np
np
p
np
p
np
np
np
np
np
p
np
p
p
p
p
np
p
p
p
p
p
p
p
np
p
p
p
p
p
np
p
np
p
p
p
p
p
np
p
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np
p
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p
p
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p
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p
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p
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p
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p
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p
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p
nm
p
nm
p
p
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p
nm
p
nm
p
p
p
p
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np
np
p
p
np
p
np
nm
np
nm
np
p
np
p
np
nm
np
nm
np
p
np
p
np
nm
np
nm
np
p
np
p
np
nm
np
nm
np
p
np
p
np
np
np
np
np
np
np
np
p
p
mut
p
p
p
p
p
p
p
mut
p
p
p
p
p
np
np
mut
np
np
np
np
np
(#) Verweis auf MS/MS Spektren im Anhang 9.5; ( ) eine Phosphorylierung an S65 wurde nur über Orbitrap MS detektiert, die nur für PKA-Cα und PKA-Cα S53A/E durchgeführt
worden ist; (*) für Bandenbezeichnung s. 4.5.3, Abb. 35. (p) Phosphorylierung detektiert; (np) Phosphorylierung nicht detektiert; (nm) Phosphorylierung aufgrund von
sequenzbasiertem Aminosäureaustausch nicht möglich; (mut) Phosphorylierung aufgrund von auf Mutagenese-basiertem Aminosäureaustausch nicht möglich.
147
9. Anhang
9.5 MS/MS Spektren
Die Proteinidentifizierung und der Nachweis von Phosphorylierungsstellen
und anderen PTMs erfolgte an tryptischen Peptiden über nanoLC-ESI-MS/MS
mit einem QTrap 4000TM, ABI (Universität Kassel, Abteilung Biochemie) und
grün: unphosphorylierte Aminosäure,
einem LTQ-Orbitrap XL, Thermo Scientific (in Kooperation mit Prof. Dr. H.
rot: phosphorylierte Aminosäure,
Urlaub, MPI Göttingen, Bioanalytische Massenspektrometrie) wie unter
blau: Aminosäureaustausch,
3.5.5 beschrieben. Jedes Protein wurde in Mehrfachbestimmungen
(O) Nachweis über Orbitrap MS.
(mindestens n=3) untersucht. Für P-Stellen, die ausschließlich in
Ion Score (IS) Werte unter 10 sind gesondert angegeben.
unphosphorylierter Form identifiziert werden konnten, sind MS/MS
Spektren für die entsprechend zugehörigen unmodifizierten Peptide gezeigt.
148
9. Anhang
1) murine PKA-Cα (PKI5-24)
pS10:
KGpSEQESVK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
(O)
149
9. Anhang
1) murine PKA-Cα (PKI5-24)
pS53:
TLGTGpSFGR
pS65:
HKEpSGNHYAMK
(O)
150
9. Anhang
1) murine PKA-Cα (PKI5-24)
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
151
9. Anhang
1) murine PKA-Cα (PKI5-24)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
152
9. Anhang
2) murine PKA-Cα (Kat)
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
(O)
153
9. Anhang
2) murine PKA-Cα (Kat)
pS53:
TLGTGpSFGR
pS65:
VMLVKHKEpSGNHYAMK
(O)
154
9. Anhang
2) murine PKA-Cα (Kat)
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
155
9. Anhang
2) murine PKA-Cα (Kat)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
156
9. Anhang
3) murine His6- PKA-Cα (Co2+)
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
157
9. Anhang
3) murine His6- PKA-Cα (Co2+)
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
158
9. Anhang
3) murine His6- PKA-Cα (Co2+)
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
159
9. Anhang
3) murine His6- PKA-Cα (Co2+)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
160
9. Anhang
4) murine PKA-CαCoR (Ni2+)
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
161
9. Anhang
4) murine PKA-CαCoR (Ni2+)
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
162
9. Anhang
4) murine PKA-CαCoR (Ni2+)
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
163
9. Anhang
4) murine PKA-CαCoR (Ni2+)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
164
9. Anhang
5 a-e) murine PKA-Cα Mono-S Fraktionen
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
WETPSQNTAQLDQFDR
165
9. Anhang
5 a-e) murine PKA-Cα Mono-S Fraktionen
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
ESGNHYAMK
166
9. Anhang
5 a-e) murine PKA-Cα Mono-S Fraktionen
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
167
9. Anhang
5 a-e) murine PKA-Cα Mono-S Fraktionen
S259:
FPSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
168
9. Anhang
6) murine PKA-Cα 0 µM IPTG 24 h
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
169
9. Anhang
6) murine PKA-Cα 0 µM IPTG 24 h
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
170
9. Anhang
6) murine PKA-Cα 0 µM IPTG 24 h
pS139:
IGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
171
9. Anhang
6) murine PKA-Cα 0 µM IPTG 24 h
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
172
9. Anhang
7) murine PKA-Cα 400 µM IPTG 2 h
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
173
9. Anhang
7) murine PKA-Cα 400 µM IPTG 2 h
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
174
9. Anhang
7) murine PKA-Cα 400 µM IPTG 2 h
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
175
9. Anhang
7) murine PKA-Cα 400 µM IPTG 2 h
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
176
9. Anhang
8) murine His6- PKA-Cα CFE (Ni2+)
S10:
GSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
177
9. Anhang
8) murine His6- PKA-Cα CFE (Ni2+)
S53:
TLGTGSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
178
9. Anhang
8) murine His6- PKA-Cα CFE (Ni2+)
S139:
FSEPHAR
T197:
TWTLCGTPEYLAPEIILSK
179
9. Anhang
8) murine His6- PKA-Cα CFE (Ni2+)
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
180
9. Anhang
9) murine PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S10:
GSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
181
9. Anhang
9) murine PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S53:
TLGTGSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
182
9. Anhang
9) murine PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
183
9. Anhang
9) murine PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
184
9. Anhang
10) murine His6- PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S10:
KGSEQESVKEFLAK
pS34:
WETPSQNTAQLDQFDR
185
9. Anhang
10) murine His6- PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S53:
TLGTGSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
186
9. Anhang
10) murine His6- PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
187
9. Anhang
10) murine His6- PKA-CαCoPP (PKI5-24)
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
188
9. Anhang
11) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 1
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
189
9. Anhang
11) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 1
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
ESGNHYAMK
190
9. Anhang
11) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 1
pS139:
IGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
191
9. Anhang
11) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 1
pS259:
FPpSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
192
9. Anhang
12) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 2
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
193
9. Anhang
12) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 2
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
ESGNHYAMK
194
9. Anhang
12) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 2
pS139:
IGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
195
9. Anhang
12) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 2
pS259:
FPpSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
196
9. Anhang
13) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 3
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
197
9. Anhang
13) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 3
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
ESGNHYAMK
198
9. Anhang
13) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 3
pS139:
FpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
199
9. Anhang
13) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 3
pS259:
FPpSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
200
9. Anhang
14) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 4
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
201
9. Anhang
14) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 4
pS53:
TLGTGpSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
202
9. Anhang
14) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 4
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
203
9. Anhang
14) murine PKA-Cα (PKI5-24) – Bande 4
pS259:
VRFPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
204
9. Anhang
15) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 5
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
205
9. Anhang
15) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 5
S53:
TLGTGSFGR
S65:
HKESGNHYAMK
206
9. Anhang
15) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 5
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
207
9. Anhang
15) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 5
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
208
9. Anhang
16) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 6
S10:
KGSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
209
9. Anhang
16) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 6
S53:
TLGTGSFGR
S65:
ESGNHYAMK
210
9. Anhang
16) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 6
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
211
9. Anhang
16) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 6
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
212
9. Anhang
17) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 7
S10:
KGpSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
213
9. Anhang
17) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 7
S53:
TLGTGSFGR
S65:
ESGNHYAMK
214
9. Anhang
17) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 7
S139:
FSEPHAR
T197:
GRTWTLCGTPEYLAPEIILSK
215
9. Anhang
17) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 7
S259:
VRFPSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
216
9. Anhang
18) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 8
S10:
KGSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
217
9. Anhang
18) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 8
S53:
TLGTGSFGR
S65:
ESGNHYAMK
218
9. Anhang
18) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 8
S139:
FSEPHAR
T197:
TWTLCGTPEYLAPEIILSK
219
9. Anhang
18) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 8
S259:
VRFPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
220
9. Anhang
19) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 9
S10:
KGSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
221
9. Anhang
19) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 9
S53:
TLGTGSFGR
S65:
ESGNHYAMK
222
9. Anhang
19) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 9
S139:
FSEPHAR
T197:
TWTLCGTPEYLAPEIILSK
223
9. Anhang
19) murine PKA-Cα (PKI5-24) nach in vitro Autophosphorylierung – Bande 9
S259:
VRFPSHFSSDLKDLLR
S338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEK
224
9. Anhang
20) humane PKA-Cα (PKI5-24)
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS53:
TLGTGpSFGR
225
9. Anhang
20) humane PKA-Cα (PKI5-24)
pS139:
IGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
226
9. Anhang
20) humane PKA-Cα (PKI5-24)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
227
9. Anhang
21) humane myr PKA-Cα (PKI5-24)
pS10:
KGpSEQESVKEFLAK
pS53:
TLGTGpSFGR
228
9. Anhang
21) humane myr PKA-Cα (PKI5-24)
pS139:
IGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
229
9. Anhang
21) humane myr PKA-Cα (PKI5-24)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
230
9. Anhang
22) murine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Mäuseherz
S10:
GSEQESVKEFLAK
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
231
9. Anhang
22) murine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Mäuseherz
S53:
TLGTGSFGR
S65:
ESGNHYAMK
232
9. Anhang
22) murine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Mäuseherz
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
233
9. Anhang
22) murine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Mäuseherz
S259:
FPSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
234
9. Anhang
23) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineherz
S10:
GSEQESVKEFLAK
S53:
TLGTGSFGR
235
9. Anhang
23) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineherz
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
236
9. Anhang
23) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineherz
S259:
FPSHFSSDLK
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
237
9. Anhang
24) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineskelettmuskel
S10:
GSEQESVKEFLAK
S53:
TLGTGSFGR
238
9. Anhang
24) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineskelettmuskel
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
239
9. Anhang
24) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineskelettmuskel
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
240
9. Anhang
25) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineleber
S10:
KGSEQESVKEFLAK
S53:
TLGTGSFGR
241
9. Anhang
25) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineleber
S139:
FSEPHAR
T197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
242
9. Anhang
25) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineleber
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
243
9. Anhang
26) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineniere
S10:
GSEQESVKEFLAK
S53:
TLGTGSFGR
244
9. Anhang
26) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineniere
S139:
FSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
245
9. Anhang
26) porcine myr PKA-Cα (PKI5-24) aus Schweineniere
S259:
FPSHFSSDLK
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
246
9. Anhang
27) murine His6- PKA-Cα K72H (Co2+)
Mutation K72H:
ESGNHYAMHILDK
S10:
KGSEQESVKEFLAK
H
247
9. Anhang
27) murine His6- PKA-Cα K72H (Co2+)
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
S53:
TLGTGSFGR
248
9. Anhang
27) murine His6- PKA-Cα K72H (Co2+)
S65:
ESGNHYAMHILDK
S139:
FSEPHAR
H
249
9. Anhang
27) murine His6- PKA-Cα K72H (Co2+)
T197:
TWTLCGTPEYLAPEIILSK
S259:
FPSHFSSDLKDLLR
250
9. Anhang
27) murine His6- PKA-Cα K72H (Co2+)
S338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEK
251
9. Anhang
28) murine PKA-Cα S53A (PKI5-24)
Mutation S53A:
IKTLGTGAFGR
pS10:
KGpSEQESVK
Nur Orbi!
A
(O)
(O)
252
9. Anhang
28) murine PKA-Cα S53A (PKI5-24)
pS34:
WETPpSQNTAQLDQFDR
pS65:
HKEpSGNHYAMK
Nur Orbi!
(O)
(O)
253
9. Anhang
28) murine PKA-Cα S53A (PKI5-24)
pS139:
(O)
FpSEPHAR
pT197:
(O)
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
254
9. Anhang
28) murine PKA-Cα S53A (PKI5-24)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: GPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
Nur Orbi!
(O)
(O)
255
9. Anhang
29) murine PKA-Cα S53E (PKI5-24)
Mutation S53E:
IKTLGTGEFGR
pS10:
KGpSEQESVK
Nur Orbi!
E
(O)
(O)
256
9. Anhang
29) murine PKA-Cα S53E (PKI5-24)
pS34:
KWETPpSQNTAQLDQFDR
pS65:
HKEpSGNHYAMK
Nur Orbi!
(O)
(O)
257
9. Anhang
29) murine PKA-Cα S53E (PKI5-24)
pS139:
(O)
RIGRFpSEPHAR
pT197:
TWpTLCGTPEYLAPEIILSK
258
9. Anhang
29) murine PKA-Cα S53E (PKI5-24)
pS259:
FPpSHFSSDLK
pS338: FKGPGDTSNFDDYEEEEIRVpSINEK
Nur Orbi!
(O)
(O)
259
9. Anhang
30) murine His6- PKA-Cα S53D (Co2+)
Mutation S53D:
TLGTGDFGR
S10:
KGSEQESVKEFLAK
D
260
9. Anhang
30) murine His6- PKA-Cα S53D (Co2+)
S34:
KWETPSQNTAQLDQFDR
S65:
ESGNHYAMK
261
9. Anhang
30) murine His6- PKA-Cα S53D (Co2+)
S139:
FSEPHAR
T197*:
TWTLCGTPEYLAPEIILSK
* <5 % Phosphorylierung über Signalintensitätsmessung nachgewiesen (in Kooperation mit Dr. J. Seidler, DKFZ Heidelberg)
262
9. Anhang
30) murine His6- PKA-Cα S53D (Co2+)
S259:
VRFPSHFSSDLKDLLR
S338*: GPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEK
* <5 % Phosphorylierung über Signalintensitätsmessung nachgewiesen (in Kooperation mit Dr. J. Seidler, DKFZ Heidelberg)
263
9. Anhang
murine His6- PKA-Cα (Co2+)
Phosphorylierter His6-Fusionsanteil
(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH):
MGSpSHHHHHHpSpSGLVPR
Phosphorylierter His6-Fusionsanteil
(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH):
GpSHMGNAAAAKK
IS=7
D
D
264
9. Anhang
murine His6- PKA-Cα K72H, S53D, CFE (Co2+/Ni2+)
unphosphorylierter His6-Fusionsanteil
(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH):
GSHMGNAAAAK
265
9. Anhang
murine bzw. humane PKA-Cα (PKI5-24)
Phosphoglukonsäure (PGlk):
(∆m=258 Da)
PGlk-GNAAAAK
Myristinsäure (myr):
(∆m=210 Da)
myr-GNAAAAK
266
9. Anhang
9.6
Chemikalienliste
Acrylamid (Rotiphoresegel R Gel 30)
2-Morpholino-Ethansulfonsäure (MES)
3-Morpholino-Propansulfonsäure (MOPS)
Agarose
Aluminiumsulfat
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Ampicillin
Arachidonsäure
Arginin
ATP
Benzamidin
Bromphenolblau
Calciumchlorid (CaCl2)
cAMP
Chloramphenicol
Coomassie Brilliant Blau R250
Dextran Blau
Dikaliumhydrogensulfat (K2HPO4)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dinatriumhydrogensulfat (Na2HPO4)
Dithiothreitol (DTT)
EDTA, EGTA
Essigsäure
Ethanol (>99,8 %)
Ethanolamin
Ethidiumbromid-Lösung
Glutathion
Glycerol
Glycin
HEPES
Imidazol
Iodacetamid
IPTG
Isopropanol
Kaliumchlorid (KCl)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Kanamycin
Laktatdehydrogenase
Roth, Karlsruhe
AppliChem, Darmstadt
AppliChem, Darmstadt
Peqlab, Erlangen
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Sigma-Aldrich, Steinheim
AppliChem, Darmstadt
Biomol, Hamburg
AppliChem, Darmstadt
Fluka, Deisenhofen
Merck, Darmstadt
Biolog, Bremen
Serva, Heidelberg
Serva, Hamburg
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
Fluka, Deisenhofen
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
AppliChem, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
AppliChem, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Fermentas, St. Leon-Rot
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Roche, Penzberg
LB-Medium
Magermilchpulver
Magnesiumchlorid (MgCl2)
Manganchlorid (MnCl2)
Methanol
Natriumchlorid (NaCl)
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Nikotinamidadenindinukleotid
Okadasäure
Ovalbumin
P20
Phenylmethylsulfonylfluorid
Phosphoenolpyruvat (PEP)
Phosphorsäure
Ponceau S
Pyruvatkinase
Restriktionsendonukleasen
Rinderserumalbumin (BSA)
Rubidiumchlorid (RbCl)
Salzsäure (HCl)
TEMED
Trichloressigsäure (TCA)
Tris (Ultra)
Triton-X-100
Tween 20
β-Mercaptoethanol
Roth, Karlsruhe
Heirler
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Biomol, Hamburg
Sigma-Aldrich, Steinheim
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Fluka, Deisenhofen
Roche, Penzberg
Fermentas, St. Leon-Rot
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Gerbu, Gailsberg
Serva, Heidelberg
Roth, Karlsruhe
MS Analyse*:
Acetonitril (ACN) Merck, Darmstadt
Ameisensäure (FA) Fluka, Deisendorf
Ammoniak (NH4OH) Sigma, Steinheim
Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) Sigma, Deisenhofen
Dihydroxybenzosäure Sigma, Steinheim
H2O Biosolve, Valkenswaard (NL)
Methanol Biosolve, Valkenswaard (NL)
Trifluoressigsäure (TFA) Fluka, Deisendorf
Trypsin (sequencing grade modified) Promega, Mannheim
*Für die MS Analysen wurden Chemikalien mit dem höchsten Reinheitsgrad verwendet.
267
10. Danksagung
10 DANKSAGUNG
Ich möchte meinem Doktorvater Prof. Dr. Friedrich Herberg danken, dass er meine wissenschaftliche Arbeit
immer unterstützt hat. Als Doktorvater, Freund, kritischer Betrachter, aber auch Motivator hat er mir immer
wieder neue Herausforderungen gestellt. Danke dafür, dass Du Deinen Doktoranden nicht nur Wissenschaft
vermittelst, sondern ihnen zusätzlich einen Einblick in das politische und wirtschaftliche Denken -was oft so eng
mit der Wissenschaft verbunden ist- ermöglichst und Ihnen auch dort die Möglichkeit gibst,
Verantwortung zu übernehmen.
Meinem Zweitkorrekteur Prof. Dr. Henning Urlaub möchte ich dafür danken, dass er als Kooperationspartner
alle Höhen und Tiefen dieser Arbeit begleitet hat. Danke für die freundliche Aufnahme in Eurem Labor, die
Beschaffung der Mäuseherzen, aber auch für die Ausrichtung einer Proteomics Summer School für junge
Wissenschaftler. Viel meines Wissens über die Theorie der Massenspektrometrie und der Proteomics habe ich
über die Jahre dort erworben. Danke, dass Du immer wieder Zeit hattest, um meine Ergebnisse von einem
anderen Blickwinkel zu betrachten und danke letztendlich für deine unaufhörliche Motivation.
ARBEITSGRUPPE BIOCHEMIE
Antje, an dem Tag an dem ich erfuhr, dass wir beide zeitgleich unsere Doktorarbeit in der Abteilung machen
würden, habe ich Luftsprünge gemacht…und das hat sich bis heute nicht geändert. Waren unsere
wissenschaftlichen Themen auch sehr verschieden, so waren wir doch immer füreinander da. Ohne Dich und
die vielen kleinen und großen Aufmunterungen zwischendurch, wäre die Zeit doppelt schwer und nur halb so
schön gewesen. Danke auch für Deine methodischen Hilfestellungen,
was SPR- und Caliper-Messungen anbelangte.
Dani, danke, dass ich in den letzten Jahren nie ein „ich habe jetzt keine Zeit“ von Dir zu hören bekommen habe.
Wissenschaftlich haben wir die wundervolle Welt der cAMPomics geteilt, aber eine Doktorarbeit braucht mehr
als nur Fachwissen: Der Umgang mit Kollegen, Studenten und Kooperationspartnern aber auch mit nützlichen
Programmen wie Word, Excel, Endnote, Prism, Corel & Co. sind Bereiche,
in denen ich – nicht zuletzt dank Dir- viel dazu gelernt habe.
Oli und die Massenspektrometrie, untrennbar miteinander verbunden. Danke für die Einführung in das
interessante Feld der Massenspektrometrie, die fortwährende technische Hilfestellung für links- und rechts
drehende Probleme. Danke für Deine vielen spontanen Ideen und Unterstützung,
wenn mal wieder Not am Man(n) war.
Anke, Mandy und Steffi gehören mit zu den Urgesteinen der Abteilung Biochemie. Ich danke Euch für die
kollegiale und freundschaftliche Zusammenarbeit und jeglichen wissenschaftlichen Rat.
Diana danke ich für die gemeinsame Forscherzeit, die wir in Kassel, Berlin und Göttingen auf dem Gebiet der
Massenspektrometrie miteinander verbracht haben, zu zweit war vieles einfacher! Die Auftrennung der PKA-Cα
Phosphoformen über Mono-S-Chromatographie sind im Rahmen ihrer Diplomarbeit durchgeführt worden.
Sumi, ohne eine Sekretärin geht auch in der Wissenschaft gar nichts. Danke für die allumfassende Hilfe rund
um das Organisatorische meiner Doktorarbeit, das immer offene Ohr, die Vermittlung zwischen
Susanne-Verwaltung und Susanne-Chef Kommunikationsproblemen.
Michaela & Irmtraud, unseren treuen TA’s im Labor, danke ich herzlich für die vielseitige praktische
Unterstützung meiner Arbeit und das Bändigen des alltäglichen Laborchaos.
Dank Uschi wusste ich schließlich den Luxus eines blitzblanken Labors zu würdigen und das meditative Spitzenstecken gehörte der Vergangenheit an. Danke Dir Uschi!
268
10. Danksagung
Matthias danke ich für die Durchführung der zellfreien Expressionsexperimente, die wertvollen Diskussionen
um das Thema PKA-C-Phosphorylierung sowie die Übernahme der Koordination des Proteomics Day.
Stefan Möller danke ich für die Hilfestellung bei speziellen SPR-Anwendungen, Kathrin für die Unterstützung im
Grundpraktikum und die viele Schoki zwischendurch und Maike für die gute Laune im Büro
und die vielen Lichtblicke in der Schreibphase.
Meiner allerersten Praktikantin und jetzigen Kollegin Jenni möchte ich für Ihre Geduld und tolle Unterstützung
danken, genauso wie allen Großpraktikanten, die an meiner Arbeit mitgewirkt haben: Alexander, René, Nicole,
Carsten, Sandra, Dominik, Thomas und Kerstin. Ein besonderer Dank gebührt Sandra M., die in meiner letzten
„heißen Laborphase“ so oft Licht ins Dunkle gebracht hat.
Nicht zu vergessen sind die vielen wechselnden Diplomanden und ehemaligen Kollegen –Silke, Alex, Frank,
Laura, Sonja und Micha -, die alle für ein positives Arbeitsklima gesorgt haben.
Lieben Dank auch allen Biaffin-Miarbeitern. Cornelia danke ich besonders für die Hilfestellung bei meinen
ersten Caliper-Messungen, Steffi für das Verschicken der vielen FedEx-Pakete und Bastian & Micha für
wertvolle Diskussionen um das Thema PKA.
KOOPERATIONSPARTNER
Danken möchte ich auch der Abteilung Bioanalytische Massenspektrometrie des MPI Göttingen: He-Hsuan,
Uwe, Monika, Carla, Johanna danke, dass Ihr mich so nett aufgenommen habt und mir bei Fragen rund um das
Thema Massenspektrometrie immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden habt.
Prof. Dr. Wolf-Dieter Lehmann & Dr. Jörg Seidler vom DKFZ Heidelberg danke ich für wichtige Diskussionen rund
um die Themen Massenspektrometrie & PKA-Phosphorylierung. Besonderen Dank gilt Jörg Seidler für das
Durchführen der quantitativen Untersuchungen zum Phosphorylierungsstatus der S53-Mutanten.
Jonathan Elkins von der Oxford University danke ich für regen Informations- und Plasmidaustausch, aber auch
die Optimierung der PKA-Cα S53D Reinigung sowie Versuchen zur Thermostabilität und Kristallisation.
Ein Dank geht an Dr. Eckhard Nordhoff für die praktische und theoretische Unterstützung
in der (MALDI)-Massenspektrometrie.
FREUNDE & FAMILIE
Ein besonderer Dank gebührt meiner Mentorin Dr. Marianne Gräfin Schmettow, die mich in der letzten Phase
meiner Doktorarbeit unterstützt, mir immer wieder Mut gemacht
und bei schwierigen Entscheidungen zur Seite gestanden hat.
Meinem Basketball-Team möchte ich für das immer offene Ohr,
die nötige Ablenkung und sportliche Betätigung danken.
Meiner Familie und Freunden danke ich für die vielseitige Unterstützung in den letzten vier Jahren.
Meinem Freund und Mann Matthias danke ich dafür, dass Ihn „mein kleines Zeitfenster“ während der
Doktorarbeit nicht davon abgehalten hat, mir in guten wie auch in schlechten Zeiten zur Seite zu stehen.
Danke, dass Du immer für mich da warst, meine Entscheidungen respektiert hast
und mir immer wieder Mut gemacht hast.
269
11. Erklärung
11 ERKLÄRUNG
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe
angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle
Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als
solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder
Habilitationsverfahren verwendet worden.
Unterschrift
270