Genetische Tests in der Patientenversorgung 21 Hydroxylase
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Genetische Tests in der Patientenversorgung 21HydroxylaseMangel und andere Ursachen des kongenitalen adrenogenitalen Syndroms Wolfgang Höppner Labor für Molekulare Genetik, Bioglobe GmbH, Hamburg Abb 1 Position und phänotypische Auswir kung der wichtigsten AGSauslösenden Mu tationen im CYP21Gen bei homozygoter Kon stellation. Zusammenfassung Der Begriff kongenitales adrenogeni tales Syndrom AGS) (im Englischen „congenital adrenal hyperplasia“ – CAH) fasst mehrere autosomalrezes siv vererbte Stoffwechselerkrankun gen zusammen, die zum Cortisolman gel und inadäquaten Konzentrationen von Mineralocorticoiden und andro genen Steroiden führen. Hormonex zess oder mangelsyndrome können je nach Enzymdefekt auftreten. Der unbehandelte Cortisolmangel führt zur permanenten Stimulation der adrena len Hormonproduktion und dadurch zur Hyperplasie. Als Folge können Intersexualität bei Mädchen und Kna ben sowie Störungen des Mineral haushaltes auftreten. Die verschiedenen Formen des AGS können durch genetische Tests unter schieden werden. Die häufigste Ursa che für das AGS ist der 21Hydroxy laseMangel (über 90% der Fälle). Der molekularbiologische Nachweis die ser Form des AGS spielt in der pädia trischen und gynäkologischen Endo krinologie sowie in der humangeneti schen Beratung eine zentrale Rolle für die Bestätigung der Diagnose, die Ab schätzung des zu erwartenden Phä notyps und als Grundlage für die prä natale Therapie mit Dexamethason. Schlüsselwörter kongenitales adrenogenitales Syn drom, AGS, 21HydroxylaseMangel, HormonexzessSyndrom, Hormon mangelsyndrom 292 medgen 16 (2004) Hydroxylase deficiency and other forms of congenital adrenogenital syndrome Abstract The term congenital adrenogenital syndrome (also known as congenital adrenal hyperplasia – CAH) comprises several inborn errors of metabolism leading to cortisol deficiency and in adequate concentrations of mineralo corticoids and androgenic steroids. Hormone excess or deficiency syn dromes can occur according to the affected step of adrenal steroido genesis. If untreated, the lack of cortisol leads to a permanent stimu lation of hormone synthesis and sub sequently to adrenal hyperplasia. The clinical consequences can be am biguous genitalia in girls and boys as well as sodium imbalance. The different forms of AGS can be distinguished by genetic testing. The most common cause for AGS is 21 hydroxylase deficiency (more than 90%). The genetic test for this form of AGS plays a pivotal role in paediatric and gynaecological endocrinology as well as in genetic counselling. It is important for the confirmation of the diagnosis, prediction of the pheno type identification of heterozygous carriers and as a basis for a prenatal therapy with dexamethason. Keywords congenital adrenal hyperplasia, CAH, AGS, hormone excess syndrome, hormone deficiency syndrome Einleitung Unter dem Begriff „kongenitales adre nogenitales Syndrom (AGS)“ (Syn onym: congenitale adrenale Hyperpla sie (CAH); vor allem in der englisch sprachigen Fachliteratur verwendet) werden mehrere Stoffwechselerkran kungen zusammengefasst, die zu ei nem Cortisolmangel und zu inadä quater Synthese adrenaler Steroid hormone führen. Es handelt sich um autosomalrezes siv vererbte Defekte der Cortisolsyn these, die in allen sechs an der Syn these der Steroidhormone beteiligten Enzymen vorkommen können. Nur Cortisol ist als Endprodukt des Stoff wechselweges in der Lage im Hypo thalamus die Sekretion des Cortico tropinreleasingHormons (CRH) und in der Hypophyse die Sekretion des adrenocorticotropen Hormons (AC TH) abzuschalten. Der nicht behan delte Cortisolmangel führt zu einer permanenten Stimulation der Hor monproduktion in der Nebennieren rinde und damit zur Ausbildung einer Hyperplasie. Je nachdem, auf wel cher Stufe der Hormonsynthese der Defekt vorliegt, akkumulieren die Zwischenprodukte vor dem Block und es kommt zu inadäquaten Konzentra tionen von Mineralocorticoiden und androgenen Steroiden. Hormonex zess oder mangelsyndrome können je nach Enzymdefekt auftreten. Steroidbiosynthese Der Ausgangsmetabolit der Steroid hormonsynthese ist das Cholesterin. Die wichtigsten Endprodukte in der Nebennierenrinde sind das Cortisol Stoffwechselstörung Inter sexuelles Genitale Salz Post Plasmasteroide verlust natale erhöht Virili sierung Lipoidhyperplasie (StARGen) Jungen Ja Nein HSD3B2Mangel Jungen Ja CYP21Mangel mit Salzverlust Mädchen Cyp21Mangel ohne Salverlust CYP11B1Mangel Plasmasteroide erniedrigt Nein Alle Steroide Ja DHEA, Pregnenolon, 17 OHPregnenolon Aldosteron, Cortisol,Testosteron, 17 OHProgesteron Ja Ja 17 OHProgesteron, Androstendion, Testosteron Aldosteron, Cortisol Mädchen Nein Ja 17 OHProgesteron, Androstendion, Testosteron Cortisol Mädchen Nein Ja Deoxycorticosteron, 11Desoxycorticosol, Aldosteron, Cortisol Jungen Nein Nein Desoxycorticosteron, Corticosteron Cortisol, Testosteron AldosteronsynthaseMangel Typ 2 Nein Ja Nein 18OHCorticosteron Aldosteron AldosteronsynthaseMangel Typ 1 Nein Ja Nein Desoxycorticosteron, Corticosteron Aldosteron CYP17Mangel als Stresshormon, das Aldosteron zur Regulation des Mineral und Wasser haushalts sowie Dehydroepiandrost eron (DHEA) und DHEASulfats (DHE AS), die als Vorläufermetabolite für androgene Steroide und Östrogen dienen. Die Nebennierenrinde besteht aus drei unterschiedlichen Schichten, der Zona glomerulosa, der Zona fas ciculata und der Zona reticularis, die als Kompartimente der Mineralocorti coid, der Glucocorticoid und der An drogensynthese dienen. Die Regula tion der Cortisolsynthese in der Zona fasciculata erfolgt im Wesentlichen durch ACTH. Fünf enzymatische Schritte (Abb. 2) sind ausgehend vom Cholesterin zur Bildung von Cortisol erforderlich. Daneben wird in der Zona fasciculata auch Corticosteron gebildet. Die Regulation der Aldosteronsynthe se in der Zona glomerulosa erfolgt über KaliumIonen und Angiotensin II. Die enzymatische Austattung der Zona glomerulasa entspricht weitge hend der der Zona fasciculata. Aller dings ist für die Aldosteronsynthese die Aldosteronsynthase (CYP11B2) in diesem Kompartiment von besonde rer Bedeutung. Die Zona reticularis setzt DHEA frei, welches in der Peri pherie in Testosteron oder Östrogen umgewandelt wird. DHEA selbst hat schwach androgene Wirkung. Klinik Einteilung und Symptome Hormonelle Änderungen Die genetischen Defekte in den ver schiedenen Enzymen der Steroidbio synthese resultieren typischerweise in unterschiedlichen Konstellationen von Über oder Unterproduktion bestimm ter Hormone (Tabelle1). Ein AGS mit Androgenüberproduktion entwickelt sich beim 21HydroxylaseMangel (CYP21) (White, 2000) und beim 11β HydroxylaseMangel (CYP 11B1) (Pe ter, 2002). Bei der Lipoidhyperplasie (20,22DesmolaseMangel, StARPro tein) (Stocco 2002), beim 17αHydro xylaseMangel (CYP17) (Miller, 2004) und beim 3βDehydrogenaseMangel (HSD3B2) (Simard, 2002) liegt eine CAH mit Androgenmangel vor. Nor male Cortisolspiegel sind bei be stimmten Defekten der CYP17 (17,20 LyaseMangel) und der Aldosteron synthase (CYP11B2) (White, 2004) zu erwarten. Defekte im CYP11B1 resul tieren in einer erhöhten Desoxycorti solProduktion, die den Aldosteron Mangel kompensiert (kein Salzverlust) und zu einem arteriellen Hypertonus mit möglichen Folgesymptomen wie Linksherzhypertrophie und Retinopa thie führen kann (Zhu 2003). Klassische Formen Bei den klassischen Formen der CAH sind die wichtigsten Symptome be reits bei der Geburt vorhanden. An drogenexzess führt zur pränatalen Vi rilisierung bei Mädchen (intersexuel les Genitale, Pseudohermaphroditi tismus) und einer Pseudopubertas praecox bei beiden Geschlechtern. Eine verminderte Androgenproduktion führt bei Knaben zu unzureichend vi rilisiertem Genitale. Verminderte Östro genproduktion bewirkt bei Mädchen eine Pubertas tarda mit primärer Amenorrhoe. Die verminderte Corti solproduktion führt zu Müdigkeit, Apathie, verminderter Stresstoleranz, Hypoglykämien, erhöhter Infektnei gung und Addisonähnlichen Krisen. Die verminderte Aldosteronproduktion resultiert in Hyperkaliämie, Hyponatri ämie, Salzverlustsyndrom, metaboli scher Azidose und Blutdruckabfall. Genetische Tests in der Patientenversorgung Tab 1 Klinische und biochemische Veränderungen bei kongenitaler adrenaler Hyperplasie Nicht klassische Formen Je nach Schwere des genetischen Defektes können sich die Symptome bei den nicht klassischen Formen der CAH, die mit Androgenexzess einher gehen, in unterschiedlichem Lebens alter manifestieren. Vor der Pubertät kann sich die Erkrankung bei Mäd chen in prämaturer Pubarche oder Adrenarche, akzeleriertem Knochen alter, Kleinwuchs und Klitorishypertro phie manifestieren. Bei erwachsenen Frauen treten Hirsutismus, Akne, Se borrhoe, tiefe Stimme, Klitorishyper trophie, temporärer Haarausfall, Stirn glatze, primäre oder sekundäre Ame norrhoe, Oligomenorrhoe als typische Symptome auf (Forest 2004). Kongenitale Lipoidhyperplasie (20,22$Desmolase$Mangel, StAR$ Protein) Knaben entwickeln ein phänotypisch weibliches oder intersexuelles Geni tale, während Mädchen ein normales Genitale aufweisen. Bei der Geburt sind die Nebennieren massiv vergrö ßert und mit Einlagerungen von Cho lesterinestern durchsetzt, wodurch die Krankheit ihren Namen bekom men hat. Auch wenn unmittelbar nach der Geburt noch Steroidhormonspie gel messbar sind, kommt es ohne Be handlung zu einem kompletten Aus medgen 16 (2004) 293 Genetische Tests in der Patientenversorgung costeronKonzentrationen. Deren mi neralocorticoide Wirkung führt zur Hypertonie, Hyperkaliämie, Hypona triämie und metabolischer Alkalose. Die PlasmaReninAktivität ist ernie drigt. 3 β$Hydroxysteroid$ Dehydrogenase$Mangel Der schwere HSD3B2Mangel führt zu einem Cortisol und Aldosteron Mangel sowie einer Störung der Tes tosteronbiosynthese. Klinisch tritt häufig ein schweres Salzverlustsyn drom auf. Männliche Neugeborene weisen aufgrund des AndrogenMan gels ein intersexuelles Genitale auf. Die hohen DHEAKonzentrationen, die bei diesem Krankheitsbild auftre ten, können wegen der leichten An drogenwirkung dieses Metaboliten bei weiblichen Neugeborenen leichte Vi rilisierungserscheinungen (Klitorishy pertrophie) auslösen. Der HSD3B2 Mangel ist für ca. 1% der klassischen Formen der CAH verantwortlich. Abb 2 Übersicht der Steroidbiosynthese Abb 3 Genlocus des 21HydroxylaseGens (Cyp21) und des Pseudogens (Cyp21P) auf dem langen Arm von Chromosom 6. C2, C4 Komplementfaktoren, Bf Properdinfaktor, RP1 nukleäres Protein mit unbekannter Funktion, RP2 verkürzte Kopie des RP1Gens, TNX Tenascin XGen, A/B Pseudogen /aktives Gen fall aller Nebennierensteroide und kli nisch zu einer akuten AddisonKrise. Diese Form der CAH ist sehr selten. 17 α$Hydroxylase$/12,20$Lyase$ Mangel Etwa 1% der klassischen Formen der CAH basieren auf Defekten im CYP17Gen. Patienten mit CYP17 294 medgen 16 (2004) Mangel können keine Geschlechts hormone bilden. Männliche Neugebo rene fallen durch ein intersexuelles Genitale auf. Bei Mädchen bleibt die spontane Pubertätsentwicklung aus, und es besteht ein primäre Amenor rhö. Die Blockade im Stoffwechsel weg der Steroidbiosynthese führt zu erhöhten Desoxycortisol und Corti Mehrere Autoren diskutieren, dass nichtklassische Formen des HSD3B2 Mangels wesentlich häufiger vorkom men und die Ursache von prämaturer Pubarche, Hirsutismus, Menstrua tionsstörungen und polycystischen Ovarien sind. 21$Hydroxylasemangel In über 90% der klassischen Formen des AGS liegt ein CYP21Mangel vor. Wegen der großen klinischen Rele vanz wird in dem vorliegenden Artikel auf diese Form des AGS ausführlicher eingegangenen. Die Heterozygotenfrequenz in der deutschen Bevölkerung liegt bei ca. 1:50, was in etwa auch mit anderen europäischen Ländern und Nordame rika übereinstimmt. Die Häufigkeit nichtklassischer Formen dürfte ca. bei 1:350 liegen, wobei davon auszu gehen ist, dass dieses Krankheitsbild unterdiagnostiziert ist. Der CYP21Mangel kann sich in drei Formen manifestieren. – Klassisches einfach virilisierendes AGS – Klassisches AGS mit Salzverlust syndrom – Nichtklassisches (lateonset) AGS Beim klassischen einfach virilisieren den AGS treten bereits in utero Virili sierungen bei weiblichen Feten auf. Das äußere Genitale kann dabei je nach Schweregrad des Enzymdefek tes von einer einfachen Klitorishyper trophie bis zu einer kompletten Fu sion der Labioskrotalfalten mit einer penisartigen Vergrößerung der Klito ris und Extension der Urethra auf die Glans penis reichen. Die Klassifizie rung der Missbildung erfolgt nach Prader. Das innere Genitale ist immer weiblich. Weibliche Neugeborene können bei der Geburt als Knaben verkannt werden. Das Genitale männ licher Neugeborener ist bis auf gele gentliche Pigmentierung des Skro tums unauffällig. Ohne Behandlung manifestiert sich bei den AGSKindern beiderlei Ge schlechts eine Pseudopubertas prae cox mit frühem Auftreten von Pubes behaarung und Penis bzw. Klitorishy pertrophie. Der Androgenüberschuss führt zunächst zu einem akzelerierten Knochenwachstum, dann aber zu ei nem vorzeitigen Schluss der Wachs tumsfugen, so dass insgesamt ein Kleinwuchs resultiert. Nicht behandel te AGSMädchen bleiben primär ame norrhoisch. Das klassische AGS mit Salzverlust tritt auf, wenn ein (nahezu) komplet ter Verlust der CYP21Aktivität vor liegt. Zu den Virilisierungserscheinun gen kommt ein lebensbedrohendes Salzverlustsyndrom hinzu. Dieses ma nifestiert sich in der Regel erst in der zweiten bis dritten Lebenswoche durch Trinkschwäche, Erbrechen, Elektrolytveränderungen, Exsikkose, metabolische Azidose und zuneh mende Apathie. Bei nicht rechtzeitig angepasster Behandlung kann auch in späterem Lebensalter unter akuten StressSituationen (Infektionen, Fie ber, Gastroenteritis, Operationen) eine Salzverlustkrise auftreten. Das nichtklassische AGS kann sich sehr variabel manifestieren. Schwere re Formen führen bereits in der Ju gend zu prämaturer Pubarche, Groß wuchs und Klitorishypertrophie. Mil dere Formen werden meist nur bei weiblichen Genträgern manifest. Be troffene Männer mit entsprechender genetischer Veranlagung entwickeln nur selten klinische Symptome. Bei erwachsenen Frauen führen die Aus wirkungen der Hyperandrogenämie zu Symptomen wie Hirsutismus, Akne, Seborrhoe, tiefe Stimme, leichte Kli torishypertrophie, temporärem Haar ausfall, Stirnglatze, primäre oder se kundäre Amenorrhoe oder Oligome norrhoe. Von Bedeutung ist die diffe rentialdiagnostische Abgrenzung der milden nichtklassische Form des CYP21Mangels vom Syndrom der polyzystischen Ovarien (PCO). 11 β$Hydroxylase$Mangel Etwa 5% der klassischen Formen des AGS werden durch einen CYP11B1 Mangel hervorgerufen. Diese Form der adrenalen Hyperplasie zeichnet sich durch einen Androgen und Mi neralocorticoidExzess aus. Mädchen werden mit einem intersexuellen äu ßeren Genitale geboren. Bei betroffe nen Jungen entwickelt sich eine Pseudopubertas praecox. Das ver mehrt gebildete Desoxycorticosteron hat mineralocorticoide Wirkung und kompensiert den AldosteronMangel. Es kommt meist in den ersten Le bensjahren zu einer arteriellen Hyper tonie in dessen Folge sich später eine Linksherzhypertrophie und/oder Reti nopathie entwickeln kann. Da die Vi rilisierungssymptomatik sich von der des CYP21Mangels kaum unter scheidet, die Hypertonie aber be handlungsbedürftig ist, ist eine diffe rentialdiagnostische Klärung sehr wichtig. Neben der schweren klassi schen Form des CYP11B1Mangels werden ähnlich dem CYP21Mangel auch nichtklassische Formen postu liert. Aldosteronsynthase$Mangel Ein Hypoaldosteronismus bei norma lem Cortisol und AndrogenSpiegeln wird durch einen Mangel des Enzyms 11bHydroxylase Typ B2 (CYP11B2) hervorgerufen. Dieses Enzym wird für die letzen beiden Schritte der Aldo steronSynthese aus Desoxycorti costeron (Abb. 2) benötigt. Neugebo rene mit diesem Defekt erkranken in den ersten Lebenswochen an einer lebenbedrohlichen Salzverlustkrise, rezidivierendem Erbrechen und Ge deihstörungen. Mit zunehmendem Al ter nimmt die Schwere der Erkran kung ab und ist im Erwachsenenalter häufig auch ohne Behandlung asymp tomatisch. Dieses Krankheitsbild ist selten. Lediglich in bestimmten Be völkerungsgruppen tritt aufgrund kon sanguiner Ehen eine gewisse Häufung auf. Genetische Tests in der Patientenversorgung Die Inzidenz der klassischen Formen des 21Hydroxylasemangels wird mit 1:12.000 Geburten bei Kaukasiern an gegeben. In einigen ethnischen Grup pen liegt die Häufigkeit jedoch erheb lich höher (z.B. 1:700 bei Yupik Eski mos, Alaska). Molekulargenetik des AGS 20,22 Desmolase, StAR$Protein Bei diesem Defekt ist die Abspaltung der Seitenkette zwischen C20 und C22 des Cholesterins gestört, die zu Pregnenolon führt. Katalysiert wird diese Reaktion durch das SideChain CleavageEnzym (P450scc). Bei kei nem der Patienten mit Lipoid Hyper plasie wurden jedoch Mutationen im Gen für dieses Enzym gefunden. 1995 wurden Mutationen im Gen für das StARProtein (Steroidogenic acute re gulatory protein) nachgewiesen, das für den Cholesterintransport zur äu ßeren Mitochondrienmembran verant wortlich ist. Dieses Protein scheint so essentiell für den ersten Schritt der Steroidhormonbiosynthese zu sein, dass inaktivierende Mutationen das Krankheitsbild auslösen. Das StAR Gen ist auf Chromosom 8 (8p11.2) lo kalisiert und besteht aus 7 Exons. Als pathogene Mutationen werden Mis sense und NonsenseMutationen so wie kleinere Deletionen und Insertio medgen 16 (2004) 295 Genetische Tests in der Patientenversorgung nen bei Patienten mit congenitaler Li poidhyperplasie nachgewiesen. 17 α$Hydroxylase/17,20$Lyase (CYP17) Das Enzym CYP17 ist ein Protein mit zwei katalytischen Aktivitäten. Es be sitzt sowohl 17αHydroxylaseAkti vität als auch 17,20LyaseAktivität und kann damit sowohl die 17α Hydroxylierung von Pregnenolon und Progesteron zu 17αHydroxypregne nolon und 17αHydroxyprogesteron katalysieren als auch deren weitere Umwandlung zu DHEA bzw. Andro stendion (Abb. 2) durch die 17,20Ly aseAktivität. Die meisten Defekte in diesem Gen verhindern die Hydroxy lierung an C17 und die 17,20Lyase Aktivität. Damit ist die Synthese der Vorstufen des Cortisols und des DHEA und Androstendion blockiert. Weder Cortisol noch Testosteron und Östrogen können gebildet werden. In seltenen Fällen ist aber auch nur die 17,20LyaseAktivität durch die Muta tionen beeinträchtigt, so dass norma le Cortisolspiegel bei Testosteron und Östrogenmangel vorliegen. Das CYP17Gen ist auf Chromosom 10 (10q24.3) lokalisiert und besteht aus acht Exons. In allen Exons können pathogene Mutationen vorkommen. 3 β$Hydroxysteroid$ Dehydrogenase (HSD3B2) Die 3βHydroxysteroidDehydrogena se ist als Schlüsselenzym sowohl für die Minearolocorticoide, das Cortisol als auch für die Synthese der Ge schlechtshormone notwendig. Es hat IsomeraseEigenschaften und kann die Reaktion in beide Richtungen ka talysieren. Es gibt zwei Gene, die En zyme mit 3βHydroxysteroidDehy drogenaseAktivität kodieren: HSD3 B1, das in der Plazenta, Haut und Fettgewebe exprimiert wird und HSD3B2, das in der Nebenniere und den Gonaden aktiv ist und in dem in aktivierende Mutationen zum AGS führen können. Das HSD3B2Gen ist auf Chromosom 1 (1p13.1) lokalisiert und besteht aus vier Exons, von de nen jedoch nur drei für das Protein kodieren. Krankheitsauslösende Mu tationen können in allen kodierenden Exons vorkommen. 296 medgen 16 (2004) 21$Hydroxylase$Mangel (Cyp21) Das Cyp21Gen ist auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 (6p21.3) mit ten im Genort für den HLAHistokom patibilitätskomplex und den Komple mentfaktor C4 lokalisiert (Abb. 3). Sei ne Struktur ist vollständig aufgeklärt. Neben dem aktiven Gen befindet sich in unmittelbarer Nachbarschaft (Ab stand ca. 30 kB) ein Pseudogen so wohl für das CYP21Gen (Cyp21P) als auch für das Gen des Komple mentfaktors C4 (C4A). Beide sind wahrscheinlich in der frühen Entwick lungsgeschichte des Menschen durch eine Duplikation gemeinsam entstan den und dann durch die Akkumulation von Mutationen inaktiv geworden. Die Sequenzhomologie zwischen aktivem Gen und Pseudogen beträgt im Be reich der Exons 98%. Das CYP21 Gen besteht aus 10 Exons und hat eine Größe von 3,1 kB. Die Anwesenheit der Pseudogene in unmittelbarer Nachbarschaft der akti ven Gene und die hohe Sequenzho mologie ist der Grund für die Häufig keit von inaktivierenden Mutationen im CYP21Gen. Zwei Mechanismen sind für pathogene Veränderungen verantwortlich: 1) In etwa 2025% der klassischen AGSFälle liegt eine Deletion von ca. 30 kb des Cyp21 und C4Gens vor. Diese Art von Mutation ent steht wahrscheinlich durch ein un gleiches Crossingover während der Meiose. Der Bruchpunkt liegt in der Regel irgendwo zwischen Exon 3 und 8 des Cyp21 und überspannt den Bereich des Cyp21 und C4 Gens bis zur entsprechenden Stel le im Cyp21P. 2) Bei 75% liegen eine oder mehrere Mutationen vor, die durch Genkon versionen aus dem Pseudogen stammen (TusiéLuna 1995). Die verschiedenen aus dem Pseudo gen stammenden Mutationen sind biochemisch danach charakterisiert, wie viel enzymatische Restaktivität noch vorliegt. Daraus lassen sich Re geln für eine GenotypPhänotypKor relation ableiten (Abb. 1). Mutationen, die dazu führen, dass kein aktives Enzym gebildet werden kann, führen in homozygoter Form zur schweren Form des AGS mit Salzver lust (SW: salt wasting). Eine Restakti vität von 2–4% reicht aus, genügend Aldosteron zu bilden, um ein Salzver lustsyndrom zu verhindern. Solche Mutationen führen in homozygotem Zustand phänotypisch zu einer ein fach virilisierenden Formen (SV: sim ple virilizing) des AGS. Mutationen, bei denen im Protein noch deutlich enzymatische Restaktivität vorhanden ist, lassen in homozygotem Zustand ein nichtklassisches AGS (NC: non classical AGS) erwarten (Abb. 1). Bei gemischt heterozygoten Genträ gern gilt die Regel, dass sich der Phänotyp nach der milderen Muta tion, also nach dem Allel richtet, wel ches zu einem Enzym mit höherer Restaktivität führt. 11 β$Hydroxylase (CYP11B1, CYP11B2) Die CYP11 katalysiert die Umwand lung von 11Desoxycortisol in Corti sol aber auch die Umwandlung von Desoxycorticosteron (DOC) in Corti costeron. Es wurden zwei Gene ent deckt, die für Enzyme mit CYP11Ak tivität kodieren. Zunächst wurde das Gen auf Chromosom 8 (8q21) lokali siert (CYP11B1). Es hat eine Größe von ca. 7 kB und besteht aus neun Exons. Später wurde ein homologes Gen kloniert, das in unmittelbarer Nähe auf Chromosom 8 (8q21) lokali siert ist. Es unterscheidet sich vom Isoenzym CYP11B1 dadurch, dass neben der 11HydroxylaseAktivität zusätzlich eine 18OxidaseAktivität vorhanden ist und 11Desoxycorti costeron zunächst zu Corticosteron und dann weiter zu Aldosteron umge wandelt werden kann. Die Größe bei der Gene ist nahezu identisch und es besteht in den kodierenden Bereichen eine Homologie von 95%. Molekulare Diagnostik des AGS Da für alle Varianten des AGS die ver ursachenden Gene vollständig be kannt sind, kann im Prinzip jede Form bei entsprechendem klinischen und biochemischem Verdacht durch eine molekulare Diagnostik überprüft und bestätigt werden. Dabei wird in der Regel eine komplette Sequenzierung des jeweiligen Gens notwendig sein, da es bis auf wenige Ausnahmen kei Bei der molekularen Diagnostik ist zu beachten, dass die meisten Enzyme der Steroidbiosynthese zur Familie der CytochromP450Oxidasen gehö ren und daher verwandte Gene mit hoher Sequenzhomologie existieren. Für mehrere Enzyme gibt es Isoenzy me, deren Gene ebenfalls weitgehend homolog sind, und für das StARGen und das CYP21Gen existieren Pseu dogene mit Homologien über 95%. Beim Aufbau von molekulargeneti schen Tests basierend auf der Poly meraseKettenReaktion (PCR) muss daher besonders auf die Spezifität der Amplifikationsreaktionen geach tet werden. In der klinischen Routine spielt der molekulargenetische Nachweis des CYP21Mangels wegen der großen Häufigkeit, der teilweise schwierigen Diagnostik über klinische und bioche mische Parameter und nicht zuletzt wegen der therapeutischen Konse quenzen, insbesondere der pränata len Therapie, die mit Abstand wichtig ste Rolle. Molekulare Diagnostik des CYP21$ Mangels Die verschiedenen Arten von mög lichen Mutationen und die Anwesen heit des Pseudogens (CYP21P) mit hoher Sequenzhomologie (≈98%) zum aktiven Gen (CYP21) machen die mo lekulare Diagnostik des CYP21Man gels recht kompliziert. Nachweis von Deletionen, Duplikatio nen und Hybridgenen des CYP21 Um komplette oder partielle Deletio nen oder Duplikationen des aktiven Gens bzw. Pseudogens zu erfassen, ist eine quantitative PCR oder eine SouthernBlotAnalyse notwendig. Für die quantitative PCR müssen die verwendeten OligonukleotidPrimer sowohl im Pseudo als auch im akti ven Gen binden. Die Amplifikate müs sen aber bezüglich ihrer Herkunft unterscheidbar sein, d.h. z.B. in der Größe differieren, um die Relation von aktivem Gen zu Pseudogen abschät zen zu können. Damit auch partielle Deletionen bzw. Hybridgene zu erfas sen, ist es notwendig, an zwei bis drei Positionen PCRPrimer zu positionie ren. Sequenzanalyse des CYP21 Zum Nachweis von Punktmutationen oder kleineren Genkonversionen durch DNASequenzierung müssen PCRPrimer spezifisch im aktiven Gen binden. Aus den für das CYP21 Gen spezifischen Amplifikaten kann dann eine direkte Sequenzierung er folgen. Dabei sind die Primerpositio nen sehr sorgfältig auszuwählen, da neben den pathologisch relevanten Mutationen auch eine Reihe von funk tionell nicht relevanten Mutationen aus dem Pseudogen (“Polymorphis men”) im aktiven Gen vorkommen können und das Hybridisieren der Pri mer verhindern könnte. Wegen des Auftretens von Hybridgenen zwischen aktivem Gen und Pseudogen und der Möglichkeit partieller Deletionen, kann es passieren, dass ein solches defektes Allel nicht amplifiziert wird und die Sequenzierung des vorhan denen intakten Allels zu dem Schluss führt, dass beide Genkopien vorhan den sind. Es lägen dann alle polymor phen Stellen in diesem Bereich an scheinend homozygot vor, obwohl es sich in Wirklichkeit um eine “hemizy gote” Sequenz handelt und der Pa tient heterozygoter Anlageträger für AGS ist. Es ist daher sinnvoll, mit mehreren überlappenden PCRFrag menten und unter Zuhilfenahme des Ergebnisses der quantitativen PCR eine Abschätzung der vorhandenen Verhältnisse vorzunehmen. Indikationen für die molekulare Diagnostik des 21$Hydroxylase$ Mangels Neugeborenenscreening In der Vergangenheit wurden Fami lien, in denen die Eltern heterozygote Anlageträger für AGS sind, meist erst durch die Geburt eines betroffenen Kindes entdeckt. Werden Mädchen mit intersexuellem Genitale geboren, so ist die Ver dachtsdiagnose zunächst der CYP21 Mangel, da dieses mit Abstand die häufigste Ursache ist (Therell 2001). Männliche Neugeborene fallen in der Regel nur auf, wenn es zu Gedeihstö rungen im Rahmen eines Salzverlust syndroms kommt. Gelegentlich liegt eine Pigmentierung des Scrotums vor. Man kann davon ausgehen, dass in der Vergangenheit hinter manch ei nem plötzlichen Kindstod von Knaben ein nicht erkanntes AGS mit Salzver lust steckte. Bis vor wenigen Jahren war man davon ausgegangen, dass Mädchen und Knaben im Verhältnis 3:1 betroffen sind. Tatsächlich gibt es keine Geschlechtspräferenz für den CYP21Mangel. Genetische Tests in der Patientenversorgung ne häufigen Mutationen gibt. Ausnah men stellen abgeschlossene um schriebene Bevölkerungsgruppen dar, in denen einzelne Mutationen durch Konsanguinität eine starke Verbrei tung haben. Eine weitere Ausnahme ist das CYP21Gen, bei dem über 90% der vorkommenden Mutationen aus dem Pseudogen (CYP21P) stam men. In den kodierenden Regionen des CYP21PGens liegen insgesamt 13 Sequenzabweichungen vom akti ven Gen vor, die zu einer kompletten oder teilweisen Aktivitätsminderung führen und pathogenetisch von Be deutung sind. Die Verteilung der Mu tationen im Gen führt dazu, dass de facto eine komplette Sequenzierung notwendig ist. Es wird daher heute ein flächende ckendes Neugeborenenscreening ge fordert, um Betroffene in den ersten Lebenstagen zu erkennen und recht zeitig zu substituieren. Als Parameter dient zunächst das basale 17Hy droxyprogesteron, das aus den ge trockneten Bluttropfen der für das NeugeborenenScreening verwende ten GuthrieKarten bestimmt werden kann. Bei erhöhten Werten ist sofort eine zweite Bestimmung aus Blut er forderlich und bei weiterhin erhöhten Werten eine molekularbiologische Ab klärung indiziert. Wenn es sich nicht um einen CYP21Mangel handelt, kann durch die Hormonprofile im Plasma und Urin eine weitere Einen gung des Enzymdefektes erfolgen. Beim CYP21Mangel ist vor allem wichtig, dass man aus der Kenntnis der vorliegenden Mutationen ab schätzen kann, ob es zu einem Salz verlust kommen wird. Für diesen Fall würde zusätzlich zum Hydrocortison eine Substitution mit Fluorocortison (Astonin H) durchgeführt. Das mole kulargenetische Ergebnis ist gleich medgen 16 (2004) 297 Genetische Tests in der Patientenversorgung zeitig Grundlage für eine genetische Beratung des Paares und der Ab schätzung des Wiederholungsrisikos bei weiteren Schwangerschaften. Pränatalscreening und therapie Haben Eltern bereits ein Kind mit AGS oder ist aus anderen Gründen bekannt, dass beide Eltern Träger von Mutationen im CYP21Gen sind, ist eine humangenetische Beratung bei Kinderwunsch in Hinblick auf eine pränatale Diagnostik und Therapie in diziert. Tragen beide Eltern Mutatio nen im CYP21Gen, die zu einem ein fach virilisierenden AGS oder zu ei nem AGS mit Salzverlust führen kön nen (Abb 1), sollte mit Bekanntwerden der Schwangerschaft Dexamethason als plazentagängiges Cortisolderivat gegeben werden. Die Synthese von androgenen Steroiden im Feten wird dadurch supprimiert. Diese Behand lung muss vor der 6. Schwanger schaftswoche beginnen, da zu die sem Zeitpunkt die Geschlechtsdiffe renzierung des Urogenitalsystems be gonnen hat. In der 10.–12. Schwan gerschaftswoche sollte aus einer Chorionzottenbiopsie das Geschlecht des Feten und der Genotyp bezüglich der Mutationen im CYP21Gen be stimmt werden. Nur bei weiblichen Feten, die homozygot oder gemischt heterozygot für die AGSMutationen sind, ist die Fortführung der Dexame thasonBehandlung bis zum Ende der Schwangerschaft indiziert. Andern falls ist zur Vermeidung von Neben wirkungen bei der Mutter die Behand lung abzubrechen (New 2001). Molekulare Diagnostik bei nichtklas sischem AGS im Kindesalter Pseudopubertas pracox ist die auffäl ligste Manifestation des nichtklassi schen AGS bei Mädchen und Kna ben. Hinzu kommt das akzelerierte Knochenalter und zunächst beschleu nigte Längenwachstum. Bei entspre chendem Verdacht sollte das Kind ei nem pädiatrischen Endokrinologen vorgestellt werden. Nach biochemi scher Bestätigung über einen ACTH Test und Ermittlung des Profils der Steroidhormone sollte gezielt eine molekulargenetische Bestätigung er folgen. Das Ergebnis hat Einfluss auf die Therapiewahl (z.B. Cortisol oder Antiandrogene je nach Schwere der 298 medgen 16 (2004) Mutationen) und dient als Grundlage für die genetische Beratung der Fami lie. Literatur Forest MG, Nicolino M, David M, Morel Y (2004) The virilized female: endocrine background BJU Int. 93 Supll 3:3543 Molekulare Diagnostik bei nichtklas sischem AGS bei erwachsene Frauen In der Gynäkologie ergibt sich der Verdacht auf ein nichtklassisches AGS bei der differentialdiagnosti schen Abklärung von Hyperandrogen ämien. Bei Hirsutismus, Akne, Sebor rhoe, tiefer Stimme, Klitorishypertro phie, temporärem Haarausfall, Stirn glatze, primärer oder sekundärer Amenorrhoe oder Oligomenorrhoe muss auch ein nichtklassisches AGS in Erwägung gezogen werden. Ursa che können gemischt heterozygote milde Mutationen oder Heterozygotie für schwerwiegende Mutationen im 21HydroxylaseGen sein; in seltenen Fällen auch im HSD3B oder im CYP11B1Gen. Da die basalen 17OHPWerte oft nicht aussagekräf tig sind, sollte in der frühen Follikel phase ein ACTHTest erfolgen. Bei pathologischem Anstieg des 17OHP (≥ 2,6 ng/ml) ist eine molekulargene tische Bestätigung indiziert. Die Be deutung der molekulargenetischen Bestätigung liegt nicht so sehr in der Therapieentscheidung, die zumeist ohnehin empirisch erfolgt, sondern in der Tatsache, dass bisher nicht be kannte Anlageträgerinnen von CYP21 Mutationen erkannt werden und im Rahmen einer humangenetischen Be ratung darauf hingewiesen werden können, dass wegen der hohen Fre quenz heterozygoter Genträger bei ei nem Kinderwunsch der Genträgersta tus des Partners überprüft werden sollte und gegebenenfalls die Mög lichkeit einer pränatalen Diagnostik und Therapie besteht. Da man davon ausgehen kann, dass viele Frauen mit Mutationen im CYP21Gen im Laufe ihres Lebens gynäkologischendokri nologische Probleme bekommen, be steht in der Erfassung dieser Fälle die Chance die unerwartet auftretenden AGSFälle bei Neugeborenen deutlich zu reduzieren. Miller WL (2004) Steroid 17alphahydroxylase deficiency – not rare everywhere. J Clin Endocri nol Metab. 89:402 New MI (2001) Antenatal diagnosis and treat ment of congenital adrenal hyperplasia. Curr Urol Rep. 2:118 Peter M (2002) Congenital adrenal hyperplasia: 11betahydroxylase deficiency. Semin Reprod Med. 20:249254 Simard J, Moisan AM, Morel Y (2002) Congeni tal adrenal hyperplasia due to 3betahydroxyste roid dehydrogenase/Delta(5)Delta(4) isomerase deficiency. Semin Reprod Med. 20:25576 Stocco DM (2002) Clinical disorders associated with abnormal cholesterol transport: mutations in the steroidogenic acute regulatory protein. Mol Cell Endocrinol. 191:1925 Therell BL (2001) Newborn screening for conge nital adrenal hyperplasia (2001) Endocrinol Meta bol Clin North Am. 30:1530 TusiéLuna MT, White PC (1995) Gene conver sions and unequal crossovers between CYP21 (steroid 21hydroxylase gene) and (CYP21P in volve different mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA 92:1079610800 White PC (2004) Aldosterone deficiency and re lated disorders. Mol Cell Endocrinol. 217:817 White PC, Speiser PW (2000) Congenital adre nal hyperplasia due to 21hydroxylase deficien cy. Endocrine Reviews 21:245291 Zhu YS, Cordero JJ, Cai LQ, Herrera C, DeFillo Ricart M, Shackleton C, ImperatoMcGinley J (2003) Am J Med Genet. 122A:193200 Korrespondenzadresse Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Höppner Labor für Molekulare Genetik Bioglobe GmbH Grandweg 64 22529 Hamburg Tel. 04046069313 Fax 04046069310 [email protected]
