Wachstum von Mikroorganismen

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V09
Wachstum von Mikroorganismen
Thema: Mikroorganismen, Konservierung
1. Einleitung
Unser Körper ist täglich zahlreichen Krankheitserregern ausgesetzt. Hierbei
handelt es sich um krankmachende Mikroorganismen (Viren, Bakterien,
Hefen, Pilze), die überall in der Umwelt vorhanden sind. Unser Immunsystem
kann jedoch viele dieser krankmachenden Keime abwehren.
Wieso wird bei verschiedenen Konservierungsverfahren dennoch ein großer
Aufwand betrieben, um Mikroorganismen im Lebensmittel abzutöten?
2. Grundlagen
Eine Möglichkeit das Bakterienwachstum in einer Kultur zu überprüfen, ist
die Ermittlung der optischen Dichte der Kultur über einen bestimmten
Zeitraum. Die optische Dichte kann mit einem Photometer gemessen
werden.
Info:
Optische Dichte = Extinktion
Abnahme der Lichtintensität
beim Durchtritt durch ein
Medium aufgrund von
Adsorption
Licht wird von verschiedenen Stoffen adsorbiert. Wird ein Lichtstrahl einer
bestimmten Wellenlänge durch eine Küvette mit einer Lösung / einer
Suspension geschickt, so kann ein Teil des Lichtes durch das Medium / die
Partikel adsorbiert werden. Die Intensität des ausfallenden Lichtes (I1) ist
dann geringer, als die des einfallenden Lichtes (I0).
Der Zusammenhang zwischen der Adsorption des Lichtes und der
Konzentration des Stoffes wird durch das Lambert-Beer‘sche Gesetz
beschrieben. Es zeigt, dass die Verringerung der Lichtmenge abhängig ist von:



Der Menge der adsorbierenden Substanz in der Flüssigkeit
(Konzentration)
Dem Weg, den das Licht durch die Flüssigkeit zurücklegen muss
Der Wahrscheinlichkeit dass das Licht durch die Substanz adsorbiert
wird (ist abhängig vom Adsorptions- oder Extinktionskoeffizient der
jeweiligen Substanz).
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Zusatzinformation:
Lambert-Beer’sches Gesetz:
Mit:
A: Adsorption
Ԑ: Extinktionskoeffizient
d: Pfadlänge in cm
c: Konzentration der
adsorbierenden Substanz
I0: einfallendes Licht
I1: ausfallendes Licht
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In geringen Konzentrationsbereichen ist die Adsorption proportional zur
Stoffkonzentration.
Werden Werte über OD = 1 erreicht muss verdünnt werden. Die optische
Dichte wird dann mithilfe des Verdünnungsfaktors ausgerechnet. Wurde
beispielsweise 1:10 verdünnt, so wird die gemessene OD mit 10 multipliziert.
Steriles Arbeiten:
autoklavieren:
Mikrobiologische Arbeiten werden in der Regel gezielt mit einem bestimmten
Mikroorganismus durchgeführt. Um sicher zu stellen, dass es nicht zu einer
Infektion mit einem anderen Mikroorganismus aus der Umwelt kommt,
müssen solche Arbeiten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
Dazu werden die benötigten Gegenstände entweder autoklaviert oder
abgeflammt. Auf weitere Besonderheiten wird in der Versuchsdurchführung
hingewiesen.
= Erhitzen unter Druck
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Bei normalem Umgebungsdruck
können wässrige Flüssigkeiten
nur auf 100°C erhitzt werden, da
das Wasser dann verdampft.
Bei höherem Umgebungsdruck
steigt der Siedepunkt des
Wassers und es kann auf höhere
Temperaturen erhitzt werden.
Dieser Effekt wird z.B. beim
Dampfkochtopf genutzt.
Im Labor wird hierfür ein
sogenannter Autoklav
eingesetzt.
Für mikrobiologische Arbeiten
werden die Gegenstände
üblicherweise 15 min bei 121°C
autoklaviert.
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3. Versuchsdurchführung
Nährmedium:
Material













Übernachtkultur E.coli K12, DSM 498
Nährmedium (5,0 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro L H2Odest oder
alternativ „Nutrient Broth“ der Fa. Merck nach Vorschrift zubereitet)
Kulturkolben oder Erlenmeyer-Kolben (250 ml) mit passendem
Wattestopfen und Alu-Folie
sterile 1 ml-Pipette (ideal sind Feinpipetten mit auswechselbaren Spitzen)
Dest. H2O
1 Laborwaage
1 Messzylinder 100 ml
Rührfisch
Autoklav
Wärmeschrank (37°C) mit Rührplatte
Photometer (Adsorption bei 660 nm), Küvetten
1 Bunsenbrenner
Alufolie
Ein Nährmedium dient der
Kultur von Mikroorganismen
Kulturkolben mit Nährmedium und
Magnetrührer, verschlossen mit
Wattestopfen und Alufolie
Aufgabenstellung
Ermittle optische Dichte der Bakterienkultur in Abhängigkeit von der Zeit.
Versuchsdurchführung
Nährmedium vorbereiten:
Das Nährmedium muss in einer Unterrichtsstunde vorher vorbereitet werden!

Berechne, wie viel Pepton und Fleischextrakt, bzw. Nutrient Broth du für
100 ml fertiges Nährmedium benötigst.

Wiege die entsprechende Menge in eine Kulturkolben ein

Gib 100 ml H2Odest dazu
Achtung:

Gib den Magnetrührer ebenfalls in den Kolben und verschließe diesen mit
Autoklavenbedienung
dem Wattestopfen und der Alufolie.
gemäß Anweisung des

Packe eine 1 ml Pipette in Alufolie ein, und gib diese mit in den Autoklaven
Lehrers
(falls keine Feinpipetten mit sterilen Spitzen vorhanden sind)

Autoklaviere das Ganze 15 min bei 121°C.
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Animpfen

Schalte das Photometer ein und wähle die Längenwelle 660 nm.

Stelle den Blindwert mit H2Odest ein.

Entnimm unter sterilen Bedingungen 1 ml der Übernachtkultur E.coli und
gib diese ebenfalls steril in das angesetzte Nährmedium. Dazu wird alles um
den Bunsenbrenner platziert. Den Bunsenbrenner anzünden, Kulturkolben
öffnen, Flaschenhals durch die Flamme ziehen und Probe entnehmen ohne
mit der Pipette an den Kolbenhals zu kommen. Danach den Kolbenhals und
den Stopfen kurz durch die Flamme ziehen und wieder verschließen.

Den Auslass der Pipette ebenfalls kurz durch die Flamme ziehen und wieder
Achtung:
Verwendung des
Bunsenbrenners gemäß
Anweisung des Lehrers
leicht in die Alufolie einpacken. (Bei Feinpipetten mit auswechselbaren
Spitzen jedes Mal eine neue, sterile Spitze verwenden.)

Beginne dann gleich mit der Zeitmessung.

Stelle den Kolben bei 37°C in einen Wärmeschrank und schalte die
Rührplatte ein.

Entnimm im Abstand von 15 min 1 Probe und miss die optische Dichte.

Trage die gemessenen Werte in eine Tabelle in dein Heft ein.
exponentiell:
gemäß einer Exponentialfunktion verlaufend
2,E+06
y = 2x
1,E+06
Aufgaben:
5,E+05
a) Wieso muss der Magnetrührer vor dem Autoklavieren zugegeben werden?
b) Erstelle aus der Datentabelle eine Excel-Graphik, bei der die Optische
Dichte über der Kultivierungsdauer aufgetragen wird.
c) Kopiere die Graphik auf ein zweites Datenblatt und wähle eine
logarithmische Skalierung für die y-Achse.
d) In welchem Bereich findet ein exponentielles Wachstum statt?
e) Recherchiere im Internet, welche Symptome die Krankheitserreger
Salmonella typhimurium (Salmonellen), Campylobacter jejuni und Listeria
monocytogenes (Listerien) beim Menschen verursachen.
f) Salmonellen teilen sich unter günstigen Bedingungen alle 20 min. Wie viele
Salmonellen sind nach 5 h gewachsen?
4.
Weiterführende Literatur:
0
10
20
Graph der Funktion y=2x
(lineare Auftragung der y-Achse)
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
y = 2X
0
10
20
Graph der Funktion y=2x
Schlegel, H. G., Allgemeine Mikrobiologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1992
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0,E+00
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(logarithmische Auftragung
der y-Achse)
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5.
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Kurzbeschreibung
Mittels der Bestimmung der optischen Dichte wird das Wachstum von Bakterien
in einem Nährmedium verfolgt. Bei diesem Versuch soll erkannt werden, dass sich
Mikroorganismen unter günstigen Umständen exponentiell vermehren. Dies stellt
ein besonderes Risiko für bestimmte Lebensmittel dar.
6.
Lernziel


7.
Grundlagen Lebensmittelkonservierung, mikrobielle Risiken
Mikrobiologisches Arbeiten
Versuchsdauer
Ansetzen des Nährmediums in der Stunde vorher (ca. 30 min). Das Medium muss
danach autoklaviert werden und wieder abkühlen.
Die Aufnahme der optischen Dichte zieht sich über einen Zeitraum von ca. 6 h.
8.
Beispiellösungen
a) Wieso muss der Magnetrührer vor dem Autoklavieren zugegeben werden?
Damit er mit sterilisiert wird.
b) Erstelle aus der Datentabelle eine Excel-Graphik, bei der die Optische
Dichte über der Kultivierungsdauer aufgetragen wird.
OD 660 nm
0,6
0,5
0,4
0,3
1 ml
0,2
10 ml
0,1
0
0
100
200
300
400
500
Kultivierungsdauer / min
Abb. 1: Optische Dichte in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer,
einmal mit 1 ml der Übernachtkultur angeimpft, einmal mit 10 ml
der Übernachtkultur angeimpft
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c) Kopiere die Graphik auf ein zweites Datenblatt und wähle eine
logarithmische Skalierung für die y-Achse.
OD 660 nm
1
0,1
1 ml
10 ml
0,01
0,001
0
100
200
300
400
Kultivierungsdauer / min
500
Abb. 2: Optische Dichte in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer,
einmal mit 1 ml der Übernachtkultur angeimpft, einmal mit 10 ml
der Übernachtkultur angeimpft
d) In welchem Bereich findet ein exponentielles Wachstum statt?
Exponentielles Wachstum ist dort, wo der Kurvenverlauf bei der
logarithmischen Auftragung in etwa linear ist. Das ist bei der Kurve, bei der
mit 10 ml angeimpft wurde etwa die ersten 140 min, bei der Kurve, bei der
mit 1 ml angeimpft wurde etwa in den ersten 220 min.
e) Recherchiere im Internet, welche Symptome die Krankheitserreger
Salmonella typhimurium (Salmonellen), Campylobacter jejuni und Listeria
monocytogenes (Listerien) beim Menschen verursachen.
Salmonella typhimurium:
„Die Salmonellose manifestiert sich meist als akute Darmentzündung mit
plötzlich einsetzendem Durchfall, Kopf- und Bauchschmerzen, Unwohlsein
und manchmal Erbrechen. Häufig tritt leichtes Fieber auf. Die Symptome
halten oft über mehrere Tage hinweg an. Bei Kleinkindern oder älteren
Erwachsene kann die resultierende Dehydrierung stark ausgeprägt sein. In
seltenen Fällen kann die initiale Darmentzündung einen septischen Verlauf
mit zum Teil hohem Fieber annehmen. Von fokalen Absiedlungen der
Erreger kann jedes Organ betroffen sein. Abszesse, septische Arthritis,
Cholezystitis, Endokarditis, Meningitis, Perikarditis, Pneumonie, Pyodermie
oder Pyelonephritis können als Komplikationen auftreten (21) –
insbesondere bei Menschen über 60 Jahren. Die Gesamtletalität liegt bei <
0,1%, es sterben vornehmlich ältere sowie abwehrgeschwächte Personen.“
www.rki.de (Ratgeber für Ärzte)
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Campylobacter jejuni:
„Viele Infektionen verlaufen asymptomatisch. Manifeste Erscheinungen
einer Infektion mit C. jejuni bieten gewöhnlich das Bild einer akuten
Enteritis, die nicht von Enteritiden anderer Genese zu unterscheiden ist.
Häufig bestehen 12–24 Stunden vor Auftreten der enteritischen Symptome
Prodromi mit Fieber (38–40 °C), Kopfschmerzen, Myalgien, Arthralgien und
Müdigkeit. Die häufigsten Symptome sind Diarrhoen, Abdominalschmerzen
bzw. -krämpfe, Fieber, Müdigkeit. Die Diarrhoe kann breiig bis massiv
wässrig, nicht selten auch blutig sein. Die Krankheit dauert in der Regel bis
zu einer Woche, mitunter auch länger. Die seltenen protrahierten oder
chronischen Verläufe betreffen meist resistenzgeminderte und
immungeschwächte Personen. Als seltene Komplikation können das
Guillain-Barré-Syndrom sowie reaktive Arthritiden auftreten. Ob eine
antibiotische Therapie geeignet ist, die Häufigkeit solcher Komplikationen zu
beeinflussen, ist nicht bekannt.“ www.rki.de (Ratgeber für Ärzte)
Listeria monocytogenes:
„Die Aufnahme von Listerien führt u. U. nur zu einer lokalen Besiedlung des
Intestinaltraktes. Bei immunkompetenten Menschen kommt es selten zu
einer Infektion und noch seltener zu einer Erkrankung, die häufig nur als
leichte, uncharakteristische fieberhafte Reaktion verläuft. Neuere Studien
zeigten, dass sich nach dem Verzehr kontaminierter Lebensmittel auch bei
Gesunden innerhalb weniger Stunden bis zu 2 Tagen eine schwere,
fieberhafte, selbstlimitierende Gastroenteritis einstellen kann.
Die Gefahr einer manifesten Erkrankung besteht hauptsächlich für
abwehrgeschwächte Personen wie Neugeborene, alte Menschen, Patienten
mit chronischen Erkrankungen (z. B. Tumoren, AIDS) oder GlukokortikoidTherapie, Transplantierte und Schwangere. Die manifeste Listeriose äußert
sich mit grippeähnlichen Symptomen wie Fieber, Muskelschmerzen sowie u.
U. auch Erbrechen und Durchfall. Es kann zur Sepsis kommen, die klinisch
nicht von einer Sepsis anderer Genese unterschieden werden kann. Eine
weitere wesentliche Manifestation ist die eitrige Meningitis (Fallbericht s.
Epidemiologisches Bulletin 38/96: 260 – 261). Vereinzelt kommt es
ausschließlich zu einer Enzephalitis, meistens einer protrahiert verlaufenden
Rhombenzephalitis, mit diversen neurologischen Ausfällen, Ataxie und/oder
Bewusstseinsstörung. Grundsätzlich kann im Verlauf einer Listeriose jedes
Organ befallen werden und es können verschiedene lokalisierte, eitrige
Infektionen wie z. B. Arthritis, Endokarditis oder Konjunktivitis auftreten.
Nach Kontakt mit infizierten Tieren oder kontaminiertem Erdboden kann es
zum Auftreten von lokalen papulösen oder pustulösen Hautläsionen
kommen.
Bei Schwangeren verläuft die Erkrankung in der Regel unter einem relativ
unauffälligen grippeähnlichen Bild oder zum Teil sogar symptomfrei. Dabei
besteht die Möglichkeit eines Überganges der Infektion auf das ungeborene
Kind mit der Gefahr, dass das Kind infiziert zur Welt kommt oder es zu einer
Früh- oder Totgeburt kommt. Bei der neonatalen Listeriose werden eine
Frühinfektion (Auftreten der Symptomatik in der 1. Lebenswoche) und eine
Spätinfektion (Auftreten der Symptomatik ab der 2. Lebenswoche)
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unterschieden. Die Frühinfektion ist durch Sepsis, Atemnotsyndrom und
Hautläsionen gekennzeichnet (Granulomatosis infantiseptica). Säuglinge
mit einer Spätinfektion werden meist zum regulären Termin geboren und
nehmen den Erreger auf, während sie den Geburtskanal passieren. Sie
erkranken häufig an einer Meningitis. .“ www.rki.de (Ratgeber für Ärzte)
f)
Salmonellen teilen sich unter günstigen Bedingungen alle 20 min. Wie viele
Salmonellen sind aus einer Salmonelle nach 5 h gewachsen?
5 h: 15 Vermehrungszyklen → 215
9. Anmerkungen für projektorientiertes / forschendes Arbeiten
Die Aufnahme der Wachstumskurve zieht sich über einen längeren Zeitraum. Hier
könnte getestet werden, ob es mittels des Eintauchphotmeters des Cassy-Systems
möglich ist, die optische Dichte bei 600 nm oder 578 nm automatisch
aufzuzeichnen.
10. FAQ / Tips & Tricks
Im Versuchstest wurde mit dem Bakterienstamm E.coli K12 DSM 498 gearbeitet.
Der Versuch kann generell auch mit anderen Mikroorganismen durchgeführt
werden, E.coli ist besonders geeignet, das er sich sehr rasch vermehrt. Bei Einsatz
von anderen Mikroorganismen muss das Nährmedium entsprechend an den
eingesetzten Stamm angepasst werden (Info gemäß Angaben der DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) oder Literaturquellen).
Eine Übernachtkultur muss am Tag zuvor angesetzt werden.
In der Literatur gibt es verschiedene Angaben für die Wellenlänge zur Bestimmung
der optischen Dichte OD 570, 600 oder 660 nm
11. Bezugsquellen
Der Bakterienstamm E. coli K12 DSM 498 kann beim Leibnitz-Institut DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganimsen und Zellkulturen GmbH in
Braunschweig bezogen werden (http://www.dsmz.de/)
Nutrient broth bei der Fa. VWR
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12.
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Versuchslegende
Herausgeber:
Technikinitiative NwT
Hochschule Furtwangen | Furtwangen University
Jakob-Kienzle-Str. 17
78054 Villingen-Schwenningen
http://technikinitiative-nwt.de/
[email protected]
Autor:
Erstellt:
Dipl.-Ing. (FH) Ursula Eschenhagen
Juni 2012
In Zusammenarbeit mit:
Max Pfaff
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