Identifizierung neuer immunogener Zielstrukturen bei malignen

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Universitätsklinikum Ulm
Klinik für Innere Medizin III
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hartmut Döhner
Identifizierung neuer immunogener Zielstrukturen
bei malignen myeloischen Erkrankungen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Vorgelegt von
Daria Ushmorova
geb. in Nowo-Dewjatkino, Russland
2013
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. Jochen Greiner
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. Michael Schmitt
Tag der Promotion:
25. Oktober 2013
II
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1 Akute myeloische Leukämie...........................................................................1
1.1.1 Definition und Einteilung............................................................................1
1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie; PLK1 als klinischer Marker..........................3
1.1.3 Klinischer Verlauf und Diagnose................................................................4
1.1.4 Prognose und Therapie.............................................................................5
1.2 Myelodysplastisches Syndrom.......................................................................6
1.2.1 Definition und Einteilung............................................................................6
1.2.2 Epidemiologie und Ätiologie.......................................................................8
1.2.3 Klinischer Verlauf und Diagnose................................................................9
1.2.4 Prognose und Therapie............................................................................10
1.2.5 5q- Syndrom.............................................................................................13
1.3 Identifizierung Leukämieassoziierter Antigene............................................17
1.4 Immuntherapie bei malignen hämatologischen Erkrankungen..................20
1.5 Zielsetzung.......................................................................................................23
2.
MATERIAL UND METHODEN
24
2.1 MATERIAL.......................................................................................................24
2.1.1 Allgemeine Laborgeräte..........................................................................24
2.1.2 Plastikwaren............................................................................................25
2.1.3 Chemikalien.............................................................................................26
2.1.4 Spezielle Chemikalien.............................................................................26
2.1.5 Puffer.......................................................................................................27
2.1.6 Ziellinien, Antikörper und Zytokine..........................................................28
2.1.7 Zellkulturmedien......................................................................................30
2.1.8 Peptide....................................................................................................30
2.1.9 Blutproben...............................................................................................31
2.2 METHODEN.....................................................................................................32
2.2.1 Anlage und Kultur von T2-Zellen.............................................................32
2.2.2 Probengewinnung...................................................................................32
III
2.2.3 Zellisolation/ Ficoll..................................................................................33
2.2.4 Typisierung der HLA- Oberflächenantigene mittels FACS- Analyse......34
2.2.5 Isolation der PBMC-Fraktion und die Durchführung der „Mixed
Lymphocyte Peptide Culture“ MLPC .....................................................36
2.2.6 Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten mittels ELISpot-Essay............39
2.2.7 Statistik...................................................................................................45
3.
ERGEBNISSE
46
3.1 HLA- Typisierung...........................................................................................46
3.2 Peptidepitop-Identifikation mittels SYFPEITHY und BIMAS......................47
3.3 Untersuchung der Immunogenität der PLK1...............................................49
3.3.1 Auswahl der Peptidsequenzen..............................................................49
3.3.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen PLK1............................49
3.3.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen PLK1.............................51
3.3.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen PLK1- Epitope bei gesunden
Probanden..............................................................................................52
3.4 Untersuchung der Immunogenität des RPS14............................................53
3.4.1 Auswahl der Peptidsequenzen...............................................................53
3.4.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen RPS14...........................54
3.4.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen RPS14...........................55
3.4.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen RPS14- abgeleitete
Peptidepitope bei gesunden Probanden................................................56
3.5 Zelluläre Immunantwort gegen RPS14 beim Patientenkollektiv;
zusätzlich Lenalidomidzugabe.....................................................................57
3.5.1 Immunogenität der beiden RPS14- abgeleiteten Peptide......................57
3.5.2 In vitro Effekt von Lenalidomid...............................................................59
3.5.3 In vivo Effekt von Lenalidomid................................................................67
4. DISKUSSION
71
5. ZUSAMMENFASSUNG
75
6. LITERATURVERZEICHNIS
77
IV
ABKÜRZUNGSVERUEICHNIS
µl
Mikroliter
µM
Mikromolar
allo-SCT
allogene Blutstammzelltransplantation
AML
akute myeloische Leukämie
APC
Antigepräsentierende Zelle
BAGE
B Melanoma Antigen
BCL2
B-cell lymphoma 2
BCIP
5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat
β2-MG
β2-Mikroglobulin
c-KIT
ein Stammzellfaktor-Rezeptor aus der Familie der RezeptorTyrosinkinasen
CA
Karzinom
CD
cluster of differentiation
CDR
chromosomal deleted region
CEBPA
CCAAT/enchancer bilding protein alpha
CG-AG
cancer-germline antigene
CLL
chronische lymphatische Leukämie
CML
chronische myeloische Leukämie
CMV
Aminosäurenonamer des CMVpp65-Peptid, Position 495-503
CTL
zytotoxische T-Lymphozyten
dl
Deciliter
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNMT3A
DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A
DRK
Deutsches Rotes Kreuz
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
ELISpot
enzyme-linked Immunospot
Fa.
Firma
FAB
French-American-British
FACS
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting
Durchflusszytometrie)
FCS
Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum)
V
(Fluoreszenz-
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FLT3-ITD
FMS-like tyrosine kinase 3- interne Tandemduplication
G-CSF
Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor
GvL
Graft versus Leukemia
GrB
Granzyme B
Gy
Gray
HCMV
humanes Zytomegalievirus
HLA
humanes Leukozytenantigen
HPLC
High Performance Liquid Chromatograph
HSP 70
ein
Zellwachstum
regulierendes
Gen
aus
der
Chaperonenfamilie
hTERT
human telomerase reverse transcriptase
HV
healthy volunteer (gesunder Proband)
IDH 1/2
Isocitrate dehydrogenase 1/2
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IMP
Aminosäurenonamer
des
Influenza-A
Matrixprotein
an
Position 58-66
IPSS
International Prognostic Scoring System
IFNγ
Interferon Gamma
JÜR
Jahres-Überlebensrate
l
Liter
LAA
Leukämieassoziierte Antigene
LAK-Zellen
Lymphokin-aktivierte Killerzellen
MACS
magnetic-activated cell sorting
MCV
minimal corpuscular volume
MDS
Myelodysplastisches Syndrom
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mM
Millimolar
MHC
major histocompatibility complex
MLC
megalencephalic leukoencephalopathy
MLPC
mixed lymphocyte peptide culture (gemischte LymphozytenPeptid-Kultur)
VI
MPP11
ein
Zellwachstum
regulierendes
Gen
aus
Chaperonenfamilie
MRD
Minimale Resterkrankung
N-RAS
neuroblastoma-RAS
NBT
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
NK-Zellen
natürliche Killerzellen
NPM1
Nucleophosmin 1
OFA-iLRP
oncofetal antigen immature laminin receptor protein
PBMC
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
PBS
phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PLK1
polo-like kinase 1
PRAME
Melanoma antigen preferentially expressed in tumors
RA
refraktäre Anämie
RAEB
refraktäre Anämie mit Exzess von Blasten
RAEB-T
refraktäre Anämie mit Blastenexcess in Transformation
RARS
refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten
RAS
rat sarcoma-gene
RHAMM
receptor for hyaluronan-mediated motility
RPS14
ribosomal protein s14
RUNX1
Runt-related transcription factor 1
SEREX
serologisches screening von rekombinanten cDNAExpressionsbanken
Sh-RNA
short hairpin RNA
SZT
Stammzellentransplantation
TAA
Tumorassoziierte Antigene
TET2
eine Methylcytosin-Dioxygenase
TKI
Tyrosinkinase-Inhibitior
TNFα
Tumor Nekrosefaktor alpha
TP53
Tumorprotein 53
UE
Untereinheit
w
well (engl. Zelle/ Plattenmulde)
WHO
Weltgesundheits-Organisation
WT1
Wilms-tumor 1 -GEN
VII
der
1. Einleitung
1. EINLEITUNG
1.1
Akute Myeloische Leukämie (AML)
1.1.1 Definition und Einteilung
Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne hämatologische
Erkrankung, die durch Entartung der hämatopoetischen Vorläuferzellen der
myeloischen Zellreihe gekennzeichnet ist. Es kommt zu Reifungs- und
Differenzierungsstörung
von
Erythrozyten,
Granulozyten,
Monozyten
und
Megakaryozyten. Kommt es zu einer klonalen Proliferation des entsprechenden
unreifen Zellklons, werden zum einen gesunde Blutzellen verdrängt, was zu einer
hämatopoetischen Insuffizienz führt, zum anderen kommt es zu einer Streuung
des malignen Zellklons ins Blut und in die blutbildenden Organe. Typische Folgen
sind Anämie, Granulozytopenie und Thrombozytopenie. Eine Leukozytose ist nicht
obligat [94].
Die Klassifizierung der AML hat sich gemeinsam mit der des Myelodysplastischen
Syndroms (MDS) entwickelt. Die veraltete French-American-British classification
(FAB-
Klassifikation)
wurde
auch
hier
von
der
Klassifikation
der
Weltgesundheitsorganisation (WHO-), welche nun zytogenetische und klinische
Kriterien zur Unterteilung der AML heranzog, weitestgehend abgelöst. Zuletzt
wurde diese Klassifikation 2008 überarbeitet (Tabelle 1) [23, 152]. Neu
hinzugekommen ist unter anderem die vorläufige Einteilung der AML mit
Mutationen im Nucleophosmin 1- (NPM1) oder CCAAT/ enhancer binding protein
alpha (CEBPA)- Gen in eine eigenständige provisorische Gruppe.
1
1. Einleitung
Tab. 1: World Health Organisation - Klassifikation der Akuten Myeloischen Leukämie [152]
AML mit spezifischen zytogenetischen Translokationen
Transkript
AML mit t(8;21)(q22;q22)
RUNX1-RUNX1T1
AML mit inv(16)(p13.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22)
CBFB-MYH11
AML mit t(15;17)(q22;q12)
PML-RARA
AML mit t(9;11)(p22;q23)
MLLT3-MLL
AML mit t(6;9)(p23;q34)
DEK-NUP214
AML mit inv(3)(q21q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2)
RPN1-EVI1
AML mit t(1;22)(p13;q13)
RBM15-MKL1
AML mit NPM1-Mutation*
Exon 12
AML mit CEBPA-Mutation*
AML mit myelodysplasie-assoziierten Änderungen
MDS in der Vorgeschichte
MDS-assoziierte zytogenetische Aberration
Multilineäre Dysplasie
Therapie-assoziierte myeloide Neoplasie
AML, nicht anderweitig klassifiziert
AML mit minimaler Differenzierung
AML ohne Ausreifung
AML mit Ausreifung
Akute myelomonozytäre Leukämie
Akute monoblastische/monozytäre Leukämie
Akute Erythroleukämie
Akute megakaryoblastische Leukämie
Akute Basophilenleukämie
Akute Panmyelose mit Myelofibrose
Myeloisches Sarkom
Myeloische Proliferationen, assoziert mit Trisomie 21
Blastische plasmozytoide Neoplasie der dendritischen
Zellen
* vorläufig als eigene Entität aufgenommen
AML: Akute Myeloische Leukämi; MDS: Myelodysplastisches Syndrom
2
1. Einleitung
1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie; polo-like-kinase1 (PLK1) als klinischer
Marker
Die AML ist eine relativ seltene Erkrankung, die Inzidenz liegt bei 2,4/100 000 pro
Jahr. Mit dem Alter steigt die Inzidenz jedoch kontinuierlich an. Bei über 65jährigen liegt sie bereits bei knapp 12,6/100 000 pro Jahr [94]. Das mittlere
Erkrankungsalter liegt dementsprechend bei etwa 70 Jahren [30, 33].
Für die Entstehung der AML sind, neben dem Alter der Patienten, verschiedene
Risikofaktoren bekannt. Eine durch Zigarettenrauch bedingte Benzolexposition
erhöht das Risiko, an einer AML zu erkranken und erniedrigt die mittlere
Überlebensdauer der Patienten [151, 164]. Das Risiko steigt bei einer sonstigen
Exposition mit Benzol, ebenso wie nach Exposition mit ionisierenden Strahlen,
Pestiziden oder organischen Lösungsmitteln [3, 71, 73, 96, 97]. Chemotherapie
mit Alkylantien oder Topoisomerase II-Inhibitoren ist als weiterer Risikofaktor
bekannt [67]. Eine AML entwickelt sich zudem häufig sekundär aus einem MDS
oder anderen hämatologischen Erkrankungen [152]. Auch bei Patienten mit
Trisomie 21 wird gehäuft die Entstehung dieser Erkrankung beobachtet [21, 82].
Man vermutet, dass chromosomale Instabilitäten hierfür verantwortlich sind.
PLK1
Es gibt viele molekulare Schlüsselereignisse, die zur Kanzerogenese führen
können. Dazu gehören gesteigerte Angiogenese, aberrante Signaltransduktion
und fehlregulierter Zellzyklus. Die Polo-like-Kinase1 (PLK1) aus der Familie der
Serin/Threonin Kinasen gehört zu den Zellzyklus-kontrollierenden Kinasen, welche
in die Mechanismen der Centrosomenreifung und Chromosomen-Segregation
involviert sind. Sie sind außerdem essentiell für die Zellantwort auf DNA-Schäden
und für den Übergang des Zellzyklus von der G2- in die M-Phase [65].
Die
Überexpression der PLK1 ist stark assoziiert mit verschiedenen humanen
Krebsarten, wie z. B. Blasen-CA [166], bestimmten Arten des Mamma-CA [134,
135, 163], Colorectalem-CA [140, 160], Endometrium-CA [141, 144], ÖsophagusCA [22, 38], Magen-CA [77, 78, 88], Gliomen [29], Hepatoblastomen [165],
Hepatozellulärem-CA [99], Melanomen [84, 139], NSCLC [93], Ovarial-CA [159],
Pankreas-CA [50, 162], Prostata-CA [161], Non-Hodgkin Lymphomen [98], sowie
verschiedenen Leukämieformen und speziell auch AML [14, 119]. Damit
3
1. Einleitung
qualifiziert sich die PLK1, als potentielles tumor-assoziiertes Antigen. Es gibt
schon länger Arbeiten und Forschungen mit Polo-like-Kinase-Inhibitoren. Diese
werden derzeit in klinischen Studien geprüft. In dieser Arbeit wurde mittels 8 TageMLPC und ELISpot-Verfahren an Blutproben gesunder Probanden untersucht, ob
die PLK1 für tumorimmunologische Behandlungsansätze als Zielstruktur in Frage
käme.
1.1.3 Klinischer Verlauf und Diagnose
Die klinischen Erscheinungsformen und Symptome der AML sind vielfältig und nur
wenig spezifisch, aber sie sind häufig konform mit der Infiltration des
Knochenmarkes und der daraus resultierenden Zytopenie. Wie auch bei dem MDS
stellen sich die Patienten typischerweise beim Arzt vor mit Symptomen wie
chronischer Müdigkeit, Hämorrhagien oder häufigen, von Fieber begleiteten
Infekten, verursacht durch die schwindende Anzahl roter Blutzellen, Blutplättchen
oder Leukozyten. Üblich sind auch Blässe und Dyspnoe bei Anstrengung. Eine
große Bandbreite weiterer Symptome kann durch die Infiltration der malignen
Zellen in verschiedene Gewebe und Organe verursacht werden, wie z.B. Leber mit
Hepathomegalie, die Milz mit Splenomegalie, die Haut mit „leukemia cutis“, die
Lymphknoten
mit
Lymphadenopathien,
die
Knochen,
begleitet
von
Knochenschmerzen, das Zahnfleisch und das Zentrale Nervensystem. Zudem
können isolierte Ansammlungen leukämischer Blasten in Form von granulozytären
Sarkomen vorkommen. Hyperleukozytose (ab 100.000 Leukozyten/mmÚ) kann zu
Leukostase führen. Die Folgen davon sind okuläre und cerebrovasculäre
Dysfunktionen oder Blutungen [94].
Den Kern der Diagnostik bildet, wie bei anderen myeloproliferativen Erkrankungen
auch, primär die Probengewinnung aus dem peripheren Blut und aus dem
Knochenmark.
Aus
diesen
Proben
kann
man
mittels
morphologischer,
zytochemischer und immunphänotypischer Untersuchungen die Abstammung der
neoplastischen Zellen definieren und beurteilen inwiefern diese Zellen zur
Ausdifferenzierung im Stande sind. Der Prozentanteil an Blasten bleibt dabei ein
praktisches Tool, um die myeloide Neoplasie zu charakterisieren und das Stadium
der Erkrankung bzw. ihr Fortschreiten zu beurteilen. Laut WHO-Schema spricht
4
1. Einleitung
ein Blastenanteil von 20% im peripheren Blut oder Knochenmark für das Vorliegen
einer AML. Es gibt jedoch auch Fälle, die mit spezifischen genetischen Mutationen
zusammenhängen, bei denen die AML- Diagnose ohne Bezug auf den
Blastenanteil gestellt werden muss. Der Blastenanteil von 20% ist also kein
absolutes Kriterium, um die AML-Therapie zu starten [30]. Die therapeutische
Entscheidung muss stets an der klinischen Situation orientiert sein und alle
Untersuchungsergebnisse berücksichtigen [33].
1.1.4 Prognose und Therapie
Der Genotyp ist neben dem Alter der Patienten ein entscheidender prognostischer
Faktor
für
das
Erreichen
einer
kompletten
Remission,
sowie
für
das
krankheitsfreie- und das Gesamt-Überleben [33]. In den letzten Jahren sind bei
der AML eine Reihe von Mutationen identifiziert worden, u.a. in den Genen FLT3,
NPM1, CEBPA, N-RAS, c-KIT, MLL, RUNX1, IDH 1/2, DNMT3A, TP53 and TET2
[30, 42, 110, 124, 145, 156]. Anhand dieser und weiterer zytogenetischer und
molekulargenetischer Marker wird die AML in verschiedene Risikogruppen
eingeteilt
[30].
In
Abhängigkeit
dieser
Risikostratifikation
wird
eine
Therapieentscheidung getroffen. Hierbei kommen kurative Therapieverfahren mit
intensiver Chemotherapie und/oder allogener Stammzellentransplantation (alloSCT), sowie die Hinzunahme von zielgerichteter Therapie mit ThyrosinkinaseInhibitoren (TKI) in Betracht. Bei Patienten, bei denen keine intensive Therapie
durchgeführt werden kann, wird eine palliative zytoreduktive Therapie angestrebt.
In der Mehrzahl der Fälle persistieren maligne Zellen jedoch auch nach
intensivierter
Therapie.
Trotz
primärem
Erreichen
einer
hämatologischen
Remission kommt es zu einem Rezidiv, die 5-Jahresüberlebensrate liegt daher bei
ca. 15-30% aller Patienten mit AML [112, 142]. Ein frühes Rezidiv ist prognostisch
ungünstig.
Diese
Zellen
einer
minimalen
Resterkrankung
(MRD)
können
mit
unterschiedlichen Methoden nachgewiesen werden [80]. Problematisch bleibt also
die Therapie der Patienten mit MRD, einem Rezidiv oder einer primär
Chemotherapie-refraktären AML, besonders bei älteren Patienten, die für eine
intensive Chemotherapie oder für eine Stammzelltransplantation nicht in Frage
5
1. Einleitung
kommen. Für diese Patienten ist aufgrund der schlechten Prognose die
Entwicklung neuer und/oder komplementärer Therapiekonzepte notwendig.
1.2
Myelodysplastisches Syndrom
1.2.1 Definition und Einleitung
Das myelodysplastische Syndrom (MDS) umfasst eine heterogene Gruppe
erworbener, klonaler Neoplasien des Knochenmarks. Das Krankheitsbild ist durch
qualitative und quantitative Veränderungen der Hämatopoese charakterisiert, was,
analog zu der AML, auf eine gestörte Proliferation und Differenzierung
hämatopoetischer Stammzellen der myeloischen Zellreihe zurückzuführen ist. Die
klonale Vermehrung der entarteten Zellen verdrängt das Knochenmark, als Folge
kommt es zu Dysplasien einer oder aller drei Zellreihen und im Regelfall auch zu
verminderter Zahl peripherer Blutzellen. Das MDS birgt, je nach Ätiologie,
außerdem ein erhöhtes Risiko in eine AML zu transformieren und wird daher auch
als präleukämische Form bezeichnet [146].
Die Klassifizierung der MDS hat sich über die Jahre stark weiterentwickelt. Die
1976
von
der
French-American-British
(FAB)
-Gruppe
vorgeschlagene
Klassifikation unterschied nur zwei Kategorien der sog. dysmyelopoetischen
Syndrome [11]. Im Jahr 1982 wurde sie nochmals überarbeitet. Basierte sie früher
auf zytomorphologischen und laborchemischen Kriterien, wie dem medullären und
peripheren Blastenanteil, sowie der Monozytenzahl im Blut, so kamen nun 5 neue
Subkategorien des MDS hinzu: refraktäre Anämie (RA), refraktäre Anämie mit
Ringsideroblasten (RARS), refraktäre Anämie mit Blastenexzess (RAEB) und die
refraktäre Anämie mit Blastenexzess in Transformation (RAEB-T) [10]. Bereits
Anfang der 1990er Jahre wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) eine
neue Klassifikation vorgeschlagen und 2001 überarbeitet, welche nun auch
molekular- und zytogenetische, sowie klinische Kriterien zur Unterteilung des MDS
heranzog [152].
2008 wurde diese Klassifikation erneut überarbeitet und aktualisiert (Tabelle 2).
6
1. Einleitung
Tab. 2: World Health Organization - Klassifikation der Myelodysplastischen Syndrome [152]
Kategorie
Abkür
periphä
Sonstige
KM-
zung
re
Blutbefunde
Blasten
Uni-
< 5%
Sonstige KM-Befunde
Sonstige
Befunde
Blasten
Refraktäre
Zytopenie
mit
RCDU
< 1%
Unilineären
oder
Bizytopenie
Dysplasien
Unilineäre Dysplasien
kein
>10% der Zellen einer Zellreihe,
del(5q)
<15% Ringsideroblasten
a)Refraktäre
mit
Anämie
RA
Unilineären
Dysplasien
b)Refraktäre
RT
Thrombozytopenie
mit
Unilineären Dysplasien
c)Refraktäre
RN
Neutropenie
mit
Unilineären Dysplasien
Refraktäre Anämie mit
RARS
0%
Uni-
Ringsidero-
oder
< 5%
Bizytopenie
Dyserythropoiese
kein
>15% Ringsideroblasten
del(5q)
blasten
Refraktäre
mit
Zytopenie
RCMD
< 1%
Multilineären
Dysplasien
Zytopenie,
< 5%
keine
>10% der Zellen in 2-3 Linien
Auerstäbchen,
keine
Monozyten
Ringsidero-
<1000/µl
MDS mit del(5q)
MDS
< 1%
Dysplasien
Uni-
Auerstäbchen
+
15%
blasten
oder
< 5%
Normale
oder
vermehrte
mit
Bizytopenie,
Megakaryo-
del(5q
oft
zyten, keine Auerstäbchen
)
Thrombozytos
Isolierte
del(5q)
e
Refraktäre Anämie mit
RAEB
Blastenexzess I
I
< 5%
Refraktäre Anämie mit
RAEB
Blastenexzess II
II
Unklassifizierte MDS
MDS-
<
U
1%
Zytopenie,
< 10%
keine
< 20%
Auerstäbchen,
Uni-
oder
Multilineäre
Dysplasien, keine Auerstäbchen
< 20%
Monozyten
<1000/µl
a)RCUD oder RCMD
1%-
Monozyten
<1000/µl
< 5%
RCUD oder RCMD mit 1%
kein
peripheren Blasten
del(5q)
RCUD mit Panzytopenie
mit 1% Blasten
b)RCUD
mit
Panzytopenie
Dysplasien in <10% der Zellen
einer
Zellreihe,
aber
zytogenetisch klonaler Befund
c) MDS-U
<10% Dysplastische Zellen, aber
Zytogenetisch
typischer
MDS
Befund
KM: Knochenmark
7
1. Einleitung
1.2.2 Epidemiologie und Ätiologie
Myelodysplastische Syndrome können Personen jeden Alters betreffen, Kinder
nicht ausgenommen [20, 64]. Tatsache ist jedoch, dass das Risiko MDS zu
entwickeln mit höherem Lebensalter ansteigt, da das Knochenmark älterer
Personen besonders vulnerabel ist. Die geschätzte Inzidenzrate liegt bei unter
einem Erkrankten pro 100.000 bei den unter 50-jährigen und ca. 2 pro 100.000 bei
den 50- bis 60-jährigen pro Jahr. Ab dem Alter von 60 Jahren steigt die
Inzidenzrate jedoch signifikant an auf ca. 8 Erkrankte pro 100.000 bei den 60- bis
70-jährigen und über 20 Erkrankte pro 100.000 bei den über 70 jährigen [121].
In über 90% der Fälle des diagnostizierten MDS handelt es sich um das sog.
primäre MDS, dessen Ätiologie unklar ist. Circa die Hälfte der Patienten weist
hierbei zytogenetische Aberrationen auf [114]. Bei dem sekundären MDS, das die
übrigen 10% ausmacht, haben über 85% der Patienten zytogenetische
Aberrationen [108]. Der überwiegende Großteil dieser Anomalien betrifft die
Deletion des langen Arms der Chromosomen 5 und/oder 7, darüber hinaus
können auch die Chromosome 8 und/oder 20 betroffen sein oder es können
komplexe Aberrationen, die bis zu 3 Chromosome betreffen, vorkommen [113].
Diese Aberrationen sind bei dem sekundären MDS durch verschiedene mögliche
vorausgegangene
Ereignisse
induziert.
Zytostatikatherapien,
v.a.
durch
Alkylantien, Topoisomerase II- Inhibitoren, Cisplatin, Fludarabin, Azathioprin und
andere, stellen insbesondere ein Risiko für die Entstehung eines MDS oder einer
AML dar. Auch Patienten, die chemischen Einflüssen am Arbeitsplatz oder in ihrer
Umwelt ausgesetzt waren, z.B. Pestiziden, Benzol oder physikalischen Einflüssen,
v.a. in Form einer Radiatio, sind hiervon betroffen [19, 41, 83, 85].
Der Begriff Dysplasie ist nicht spezifisch für das MDS, da sogenannte mono- oder
multilineäre sekundäre Dysplasien auch bei der megaloblastären Anämie, der
kongenitalen dyserythropoetischen Anämie und bei der Exposition mit Arsen,
Alkohol, dem Parvovirus B19 oder HIV entstehen können [92].
Es wird angenommen, dass die Ausprägung des MDS – Phänotyps zusätzlich
durch sekundäre Mutationen, genetischer Haploinsuffizienz und epigenetischen
Veränderungen bestimmt wird, was zu Veränderungen der Zytokinausschüttung,
der Immunantwort und des Knochenmark-Stromas führt [146].
8
1. Einleitung
1.2.3 Klinischer Verlauf und Diagnose
Die am MDS erkrankten Patienten stellen sich beim Arzt häufig mit Symptomen
vor, die eine hämatologische Erkrankung vermuten lassen. Dazu zählen
Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Blässe, rezidivierende Infektionen, vermehrte blaue
Flecken
oder
Blutungen.
Auf
diese
Anzeichen
sollte
eine
ausführliche
Blutuntersuchung folgen. Die individuelle Symptomatik kann sehr unterschiedlich
sein. Es kommt stark darauf an, welche der drei Zelllinien betroffen ist bzw. sind.
Alternativ
kann
es
zur
Diagnostizierung
von
MDS
aber
auch
bei
asymptomatischen Patienten während einer ärztlichen Untersuchung auf andere
Erkrankungen oder bei einer Routineuntersuchung kommen [92].
Am häufigsten ist die erythropoetische Zelllinie betroffen. So sind 80% bis 85%
aller MDS-Patienten anämisch bei der Erstdiagnose. Mehr als die Hälfte davon
haben einen Hb-Level von unter 10 g/dL [40].
In diesem Fall dominieren
symptomatisch Blässe, Abgeschlagenheit, Tachykardie und Hypotension. Kardiale
oder respiratorische Vorerkrankungen können sich verschlimmern. Ist die
Thrombopoese betroffen, so suchen die Patienten den Arzt meist wegen
Petechien, häufigen Nasen- und Zahnfleischblutungen, sowie blauen Flecken auf.
Wiederkehrende Infektionen und komplizierte Verläufe banaler Infekte weisen
eher auf Leukozytopenie hin. Weitere unspezifische Befunde eines MDS können
eine Splenomegalie oder Lymphadenopathie sein [8]. Valent et al. veröffentlichte
2007 die Mindestkriterien für die Diagnose MDS. Diese beinhalten eine refraktäre
Zytopenie über 2-6 Monate unter Ausschluss der Differentialdiagnosen, die
gleichzeitig mit dysplastischen Veränderungen in mindestens 10% der Zellen
mindestens einer hämatopoetischen Zellinie einhergeht [147].
Im klinischen Alltag spricht man von einem Verdacht auf MDS wenn eine nicht
anders erklärbare Anämie mit anderen Zytopenien, einem erhöhten MCV (mean
corpuscular volume) oder einem erhöhten Erythrozytenumsatz einhergeht. Der
absolute Goldstandard zur Diagnostik des MDS ist nach wie vor die Zytologie und
Biopsie des Knochenmarks [51,153]. In der zytologischen Untersuchung, nach
einer Färbung nach Pappenheim, kann man das Bild einer Blutbildungsstörung
beobachten mit abnorm lokalisierten, unreifen Vorstufen. Im Ausstrich des
peripheren
Blutes
zeigen
sich
ovale
Makrozyten,
eine
dysmorphe
Erythrozytenpopulation und/oder hyposegmentierte, hypogranulierte Neutrophile.
9
1. Einleitung
Sind > 10% der myeloischen Zellen in einer Zellreihe dysplastisch und zeigen
unterschiedliche
Differenzierungsgrade,
spricht
man
laut
der
WHO-
Klassifikationvon von einem MDS [152], wobei eine oder mehrere Zellreihen im
peripheren Blutausstrich oder im Knochenmark betroffen sein können. Das
Knochenmark ist typischerweise hyperzellulär, wobei 1/5 der Fälle hypozellulär
erscheinen können und differenzialdiagnostisch an eine aplastische Anämie
gedacht werden muss. Ab einem medullären oder peripheren Blastenanteil von
über 20% liegt nach der WHO-Definition eine AML vor. Des Weiteren wird aus
dem entnommenen Knochenmark eine Chromosomenanalyse durchgeführt, da
über 40% der MDS-Patienten zytogenetische Aberrationen aufweisen [79].
1.2.4 Prognose und Therapie
Die hämatologischen Erkrankungen aus der Gruppe der Myelodysplastischen
Syndrome haben, je nach Entität und Zytologie, eine sehr unterschiedliche
Prognose [12, 28]. Um diese objektiv einschätzen zu können, benutzt man
sogenannte Scoring-Systeme. Diese gewichten und kombinieren bestimmte
Einzelfaktoren und errechnen daraus die theoretische mittlere Lebnserwartung
des Patienten ohne Therapiemaßnahmen. Die beiden Scoring-Systeme, die bei
der MDS-Risikoeinteilung verwendet werden sind IPSS und WPSS.
Das klinisch meist verwendete System zur Prognosebesimmung bei MDS ist das
International Prognostic Scoring System (IPSS) (Tabelle 3), welches die Patienten
in niedrig-, intermediär 1-, intermediär 2- und Hochrisiko – Kategorien einteilt.
IPSS berücksichtigt drei Faktoren: den Blastenanteil im Knochenmark, den
Karyotyp und die Anzahl und Ausprägung der Zytopenien [51].
10
1. Einleitung
Tab. 3: International Prognostic Scoring System (IPSS) - Alter und mittleres Überleben (modifiziert
nach [51]) Risikoeinschätzung zur Evaluierung der Prognose von neu diagnostizierten MDS Patienten.
Score
Risikogruppe
Blasten
im
Knochen
mark
0
Niedrig
< 5%
0,5
Intermediär -1
5-10%
11-20%
2,0
Intermediär -2
≥ 2,5
Hoch
1,0
1,5
-
Karyotyp*
Zytopenien**
Gut
Intermediär
Arm
0 -1
2-3
Medianes
Überleben
in Jahren
Alter < 60
Jahre
11,8
Medianes
Überleben
in Jahre
Alter > 60
Jahre
4,8
5,2
2,7
1,8
1,1
0,4
0,5
>3
21-30%
* Gut: normal, -Y, del (5q), del (20q), Arm: komplex (> 3 Abnormalitäten) oder Chromosom 7
Abnormalitäten, Intermediär: andere Abnormalitäten.
** Hämoglobin < 10 g/dl, Leukozyten < 1,5 G/l, Thrombozyten < 100 G/l. del: Deletion, G: Giga, MDS:
Myelodysplasitsches Syndrom
WPSS (WHO adapted prognostic score system) berücksichtigt im Prinzip die
gleichen Risikofaktoren wie IPSS, es rechnet in die Risikoprofil-Bestimmung aber
statt der eventuell vorhandenen Zytopenien die Transfusionsabhängigkeit mit ein,
welche 2005 von Malcovati et al. als ein negativer prognostischer Faktor für die
niedrigeren MDS-Risikogruppen publiziert wurde.
Sekundäres und Therapie- induziertes MDS hat grundsätzlich eine schlechtere
Prognose als primäres MDS [33]. Eine AML die auf dem Boden eines MDS
entsteht, hat eine schlechte Prognose mit einem meist letalen Ausgang [129]. Bis
zu zwei Drittel der MDS-Patienten versterben nicht an der Erkrankung selbst,
sondern an ihren Komplikationen, zu denen unter anderem Transformation in eine
AML, Blutungen, und Infektionen zählen [27].
Je nach Alter der Patienten und ihrem IPSS-Risikoprofil werden beim MDS
unterschiedliche Therapiestrategien durchgeführt. Die aktuelle Therapie der MDS
beinhaltet supportive Therapie, wie Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentrate
und antibakterielle unterstützende Therapie, sowie die allogene hämatopoetische
Stammzell-Transplantation (allo-SCT). Generell haben die Niedrig-Risiko-MDSPatienten (Niedrig – und Intermedium1- Risikogruppen nach IPSS) eine bessere
Prognose und eine längere Überlebenszeit ohne Therapie. Für die HochrisikoMDS-Patienten (Intermedium2- und Hochrisikogruppen nach IPSS), die im
11
1. Einleitung
Allgemeinen eine schlechtere Prognose aufweisen, sind aggressivere Verfahren
wie die allo-SCT gerechtfertigt. Dabei benötigen nahezu alle MDS – Patienten
eine effektive supportive Therapie [8, 52]. Häufige Erythrozytenkonzentrate
können jedoch zu Eisenüberladung und damit zur Organschädigung führen [13,
37, 148]. Um dies zu vermeiden gilt es einen Transfusionsbedarf so lange wie
möglich
medikamentös
Medikamente,
wie
hinaus
Erythropoetin
zu
zögern.
Erythropoesestimulierende
und
Darbepoetin
in
Kombination
mit
Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktoren (G-CSF) gehören hierbei zur
Therapie der ersten Wahl [49, 74]. Weiterhin kommt die Therapie mit
Immunsuppressiva
wie
Antithymozytenglobulin
und
Ciclosporin,
hypomethylierenden Medikamenten wie Azacytidine und Decitabine, oder der
Immunmodulator Lenalidomid in Frage - je nach Risikogruppe, zytogenetischem
Muster und Fortschreiten der Erkrankung [91, 103, 137]. Immunsuppressive
Maßnahmen verhindern die Ausschüttung von Zytokinen durch autoreaktive
zytotoxische
T-Zellen
und
richten
sich
somit
gegen
die
eventuelle
autoimmunologische Komponente der Krankheitsentstehung [103]. Die klinischen
Effekte der hypomethylierenden Substanzen werden durch den Einfluss auf
Apoptose und Methylierung der DNA erreicht [137]. Azacydine hebt die
Hypermethylierung der DNA auf, indem es die im Zellkern befindlichen
Methyltransferasen hemmt. Niedrig-Risiko-Patienten mit einer Deletion im q-Arm
des Chromosoms 5 zeigen hohe erytropoetische Ansprechraten auf das
immunmodulierende Lenalidomid mit Langzeitverbesserungen [91]. Zusätzlich
spricht etwa ¼ der MDS-Niedrig-Risiko-Patienten ohne 5q- Syndrom auf
Lenalidomid an [118].
Die allo-SCT ist die einzige aktuell bekannte Therapie mit einem kurativen
Potential in der MDS-Therapie. Das mediane Erkrankungsalter der MDS-Patienten
beträgt, wie oben bereits erwähnt, allerdings 70 Jahre. Die meisten Patienten
weisen also häufig Komorbiditäten auf und damit ist für sie diese Art von Therapie,
der eine aggressive chemotherapeutische Behandlung vorangeht, nicht geeignet
[168]. Der Nutzen der allo-SCT bei jüngeren Patienten wird durch das erhebliche
Risiko der Therapie-assoziierten Morbidität und Mortalität gemindert [24, 158].
Weiterhin problematisch bleibt auch Behandlung von Patienten im Stadium RAEB
I/II (Refraktäre Anämie mit Exzess der Blasten I/II), die sich nicht für eine allogene
Transplantation qualifizieren. Gerade für all diese Patienten stellen die neuen,
12
1. Einleitung
experimentellen
Therapieformen
mit
Substanzen,
wie
Lenalidomid
oder
Azacytidine eine große Chance dar [39, 130].
1.2.5 Das 5q- Syndrom
1.2.5.1 Definition
Das 5q- Syndrom mit seiner streng linearen Genotyp – Phänotyp- Beziehung stellt
eine Besonderheit unter den myelodysplastischen Syndromen dar [18]. Es wurde
bereits 1974 von van den Berghe als die erste chromosomale Deletion, die zu
einem definierten Phänotyp einer Krebserkrankung führt, beschrieben. Es ist ein
Subtyp des MDS, der durch einen Defekt speziell in der erythroiden
Differenzierung charakterisiert ist [149]. Das Krankheitsbild ist geprägt durch eine
schwere makrozytäre Anämie, normale bis erhöhte Plättchenzahlen, normale bis
erniedrigte neutrophile Granulozyten Zahlen, erythroide Hypoplasie im KM und
hypogelappte Micromegakaryozyten [66]. Laut WHO liegt ein 5q- Syndrom vor,
wenn der Blastenanteil im Knochenmark weniger als 5% beträgt und gleichzeitig
eine Deletion des 5q [del(5q)] als einzige Karyotyp-Veränderung vorliegt [152].
1.2.5.2
Epidemiologie und das Krankheits-Gen RPS14
Das 5q- Syndrom macht 5-6% der myelodysplastischen Syndrome aus.
Jahrzehntelange Dokumentationen haben gezeigt, dass die Prävalenz bei Frauen
deutlich höher ist, als bei Männern [111]. Bei Patienten mit de novo MDS ist
[del(5q)] die häufigste chromosomale Deletion, dabei gehen 20% der MDSPatienten mit einer Deletion des q-Arms am Chromosom 5 mit weiteren
chromosomalen Aberrationen einher, 5–6% kommen als isoliertes 5q- Syndrom
vor [51].
Der Erkrankung liegt die Haploinsuffizienz des RPS14 Gens zugrunde, welches
sich auf dem DNA - Abschnitt befindet, das bei der Deletion abhanden kommt [31].
RPS14 wurde erstmals 2008 von der Ebert et al. Arbeitsgruppe mittels eines RNA
Interference Screen als das verantwortliche Gen für das 5q- Syndrom
13
1. Einleitung
beschrieben. Die Arbeitsgruppe entwarf für jedes Gen der CDR (chromosomal
deleted region) eine shRNA, die mittels Lentiviren in die CD34+ Zellen transfiziert
wurden. Nach 10 Tagen Inkubation konnte man den Effekt jeder shRNA auf die
Differenzierung mittels FACS beobachten. Es wurden Erythrozyten- und
Megakaryozytenspezifische Oberflächenmarker verwendet. Unter allen auf der
CDR liegenden Genen rekapitulierte allein die Suppression des RPS14 Gens das
5q- Syndrom in vitro.
Das kleine Ribosomen –Untereinheits- Protein rpS14 bindet direkt die Helix 28 der
18s rRNa und ist essentiell für die Zusammensetzung der ribosomalen 40s
Untereinheit [89, 104]. Das RPS14 der Hefen wird für die endonucleolytische
Spaltung benötigt, bei der 200 Nucleotide vom 3`Ende der 20S pre-rRNA entfernt
werden, um eine reife 18S rRNA und funktionstüchtige ribosomale 40s
Untereinheiten zu schaffen [76]. Bei ungenügendem Vorkommen des RPS14 sieht
man eine Akkumulation der unreifen ribosomalen Proteine und prä-rRNA, die für
die 40S UE bestimmt sind, während die 60S UE –Zahl unbeeinträchtigt bleibt [31].
Als Schlüsselgen des 5q- Syndroms ist und bleibt RPS14 interessant für weitere
Forschungen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Peptidepitope des Gens als
Targets für zielgerichtete Immuntherapie geeignet wären.
1.2.5.3 Klinischer Verlauf und Diagnose
Da beim 5q- Syndrom eine deutliche Phänotyp-Genotyp- Korrelation besteht, kann
es häufig allein durch die Knochenmarkmorphologie und andere hämatologischmorphologische Untersuchungen relativ sicher diagnostiziert werden, bevor die
Ergebnisse aus der Zytogenetik fertig sind [111]. Typischerweise präsentiert sich
ein Bild des Knochenmarks eines MDS- Patienten hyperzellulär. Hingegen ist das
Knochenmark bei 20% der 5q- Patienten hypozellulär, bei 40% normozellulär und
nur bei 40% hyperzellulär. Beinahe die Hälfte aller Patienten hat eine gestörte
Erythropoese mit unter 20% Erythrozytenvorläuferzellen im KM. Dysplasien in den
Erythrozyten findet sich nur bei 15% der Patienten, Dysplasie in den Granulozyten
nur in 10%. Allerdings finden sich bei nahezu allen Patienten mononukleäre
Megakaryozyten mit deutlich kleinerem Durchmesser, als normale Zellen dieser
Art [46]. Sie werden daher auch Mikromegakaryozyten genannt.
14
1. Einleitung
Die Hauptursache für Morbidität und Mortalität der Patienten liegt in dem Defekt
der
Erythrozytenausdifferenzierung.
Die
Patienten
benötigen
häufige
Erythrozytenkonzentrat – Transfusionen, was schließlich, wie auch bei allen
anderen MDS- Patienten, zur Eisenüberladung im Gewebe und den damit
verbundenen Organdefekten führt [45].
1.2.5.4
Prognose und Therapie mit Lenalidomid
Die Prognose der Erkrankung bei Patienten, die den WHO-Kriterien des 5qSyndroms entsprechen ist als relativ günstig anzusehen [17, 47, 111]. Patienten,
die nicht eindeutig zu dieser Definition passen – z.B. weil sie weitere
Karyotypveränderungen, außer [del(5q)] aufweisen oder
wenn zusätzlich ein
Blastenexzess vorliegt, haben eine weitaus schlechtere Prognose [45].
Eine aktuelle Studie von Patnaik et al. beschreibt zusätzlich folgende
Risikofaktoren, die zu einer geringeren 5-JÜR bei Patienten mit einem 5qSyndrom laut WHO-Definition führen: Hohes Alter, Transfusionspflichtigkeit bei
Erstdiagnose und verminderte Granulopoese [111].
Tab. 4: Prognose der Myelodysplastischen Syndrome [44]
Subtyp
n (%)
Transformation
in AML, %
Mittlere
Lebenserwartung
Monaten
RA
107 (8.5)
7.5
69
RARS
138 (11)
1.4f
69
RCMD
306 (24)
10
33
RCMD-RS
183 (15)
13
32
RAEB-1
256 (21)
21
18
RAEB-2
235 (18.5)
34.5
10
MDS 5q-
28 (2.2)
8
116
RA: Refraktäre Anämie; RARS: Refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten; RCMD: Refraktäre
Zytopenie mit Multilineären Dysplasien; RCMD-RS: Refraktäre Zytopenie mit Multilineären
Dysplasien; Ringsideroblasten; RAEB: Refraktäre Anämie mit Blastenexzess; MDS 5q-:
Myelodysplastisches Syndrom mit der Deletion 5q
15
in
1. Einleitung
Bis vor kurzem hat man Patienten mit dem 5q- Syndrom nur durch konservative
Therapie – v.a durch regelmäßige Gabe von Erythrozytenkonzentraten behandelt.
Eine neue Substanz ist Lenalidomid, welches beachtliche therapeutische
Fortschritte bei Patienten mit isoliertem 5q- Syndrom und bei MDS-Patienten mit
zusätzlichen Deletionen am Chromosom 5 zeigt [9, 90, 132]. Lenalidomid ist ein 4amino-glutamyl
Analogon
von
Thalidomid,
und
gehört
zur
Gruppe
der
“immunomodulatory drugs” (IMiDs®). Die IMiDs® sind weitaus potenter als
Thalidomid in ihrer Wirkung als Inhibitoren von TNFα und IL-6. Sie stimulation
darüber hinaus die T-Zellen und regen die vermehrte Poduktion von Il-2 und IFNγ
an. Zudem haben sie weniger unerwünschte neurologische Nebenwirkungen, wie
Sedierung und Neuropathien [6, 7, 122]. Zwei relativ große Studien an MDS
Patienten mit [91] und ohne 5q-Deletion [118] bestätigen die hervorragende
Wirksamkeit für Lenalidomid bei einigen Formen von MDS. In beide Studien waren
Patienten eingeschlossen mit primär niedrigem oder Intermediär-1 Risiko MDS
nach dem IPSS (Tabelle 3), die bei Studienbeginn transfusionspflichtig waren. Die
Behandlung mit Lenalidomid führte bei 67% der Patienten mit 5q-Deletion und
26% ohne 5q-Deletion zum Aufheben der Transfusionspflichtigkeit und zur
Remissionsdauer von ca. 2 Jahren (mit 5q-) bzw. 9 Monaten (ohne 5q-). Eine
Zytogenetische Komplettremission (CR) wurde bei 45% mit [del(5q)] und 9% ohne
[del(5q)] beobachtet. Lenalidomid (10 mg/d) hat sich zudem therapeutisch auch
bei MDS Patienten mit einem hohen oder Intermediär-2 Risiko mit einer
zusätzlichen 5q-Deletion bewährt – v.a. wenn die Plättchenzahl höher als 100 x
10^9/L ist [1]. Bei den zahlreichen Studien hat sich gezeigt, dass das Ansprechen
der MDS Patienten mit zusätzlicher 5q-Deletion auf Lenalidomid, nicht signifikant
beeinflusst wird durch Alter, Geschlecht, FAB Typ, IPSS oder zytogenetische
Muster. Das Ansprechen auf Lenalidomid ist aber umso schlechter, je
ausgeprägter
die
Zytopenie
und
je
größer
die
Notwendigkeit
häufiger
Transfusionen ist.
16
1. Einleitung
Abb. 1. Wirkmechanismen von Lenalidomid, die zu therapeutischen Effekten bei inflammatorischen
Erkrankungen und Krebserkrankungen führen [87]. Die roten Pfeile zeigen die direkte Wirkung von
Lenalidomid, die hellblauen Pfeile die indirekte.
MM Cells: Multiples Myelom- Zellen; NK cells: Natürliche Killerzellen; TNF: Tumornekrose- Faktor;
IL: Interleukin; INF: Interferon; VCAM: vascular cell adhesion molecule; ICAM: intercellular
adhesion molecule
Lenalidomid hat eine große Breite an potentiellen Wirkungen, die schließlich den
Patienten in Remission führen können (Abbildung 1). Dazu gehören Inhibition des
TNFα und IL-6, sowie Anregung zur Angiogenese, Erythropoese und T- und NKZell Stimulation mittels Induktion von IL-2- und IFNγ-Ausschüttung [86, 132].
Dennoch bleibt der genaue Wirkmechanismus der hervorragenden Wirkung
dieses Medikaments bei Patienten mit einer 5q-Deletion unklar.
1.3
Identifizierung Leukämieassoziierter Antigene
Im Fall einer malignen Entartung einer zuvor gesunden Körperzelle kommt es zu
Verlust
von
Oberflächenproteinen,
Membranveränderungen
und/oder
zu
Überexpression von Peptiden, die unter normalen Bedingungen nur geringfügig
oder gar nicht exprimiert werden und zur Präsentation dieser auf den MHC I
Molekülen. Diese überexprimierten Peptide können dann bei den betroffenen
Patienten von spezifischen T-Lymphozyten als Antigene erkannt werden,
17
1. Einleitung
woraufhin eine Reaktionskette in Gang gesetzt wird, die zu einer Immunantwort
führt. Ziel einer Immuntherapie ist es, diese spezifischen T-Zellantwort gegen
Tumorzellen zu steigern. Antigene, wie z.B. Cancer–Germline–Antigene (CGAGs), könnten für eine Immuntherapie besonders geeignet sein, da sie in
Normalgeweben nicht exprimiert werden [61].
Schon in den 50er Jahren hat man bei Tierversuchen an der Maus erste Hinweise
auf die Existenz immunogener Strukturen in Tumoren gefunden. Bis zur gezielten
Suche nach den ersten Tumorassoziierten Antigenen (TAA) dauerte es weitere 30
Jahre. Seither ist die Identifizierung und immunologische Charakterisierung von
Tumorantigenen eines der vordringlichen Ziele, um eine antigenspezifische
Immuntherapie entwickeln zu können [16, 115, 150].
Gesteigerte
spezifische
Untersuchungen
der
T-Zell-Antworten
gegen
Patientenproben
vor
leukämische
und
nach
Blasten
bei
allogener
Stammzelltransplantation ließen die Existenz von immunogenen Antigenen auch
bei myeloischen Leukämien erwarten [102]. Das erste Leukämie-Assoziierte
Antigen (LAA) wurde 1997 von Ikeda et al. beschrieben [72]. Seither wurden
etliche LAAs entdeckt, die in verschiedenen Leukämieformen die T-Zell-Antwort
induzieren können. Bei den AML- Patienten sind es BAGE, BCL-2, OFA-iLRP,
FLT3-ITD, G250, human telomerase reverse transcriptase (hTERT), PRAME,
RHAMM, proteinase 3, survivin, und WT-1 [5, 15, 55, 62, 81, 100, 101, 105, 125,
131, 154, 155]. Einige Epitope in diesen LAAs induzierten Zelllyse bei den
autologen leukämischen Blasten durch die zytotoxischen T-Zellen [55, 62, 81, 100,
101, 154, 155]. Bei RHAMM und WT-1, sowie bei NPM1 konnten sogar eine
humorale, sowie eine zelluläre Immunantwort nachgewiesen werden [32, 55, 56,
59, 62, 126].
18
1. Einleitung
Abb. 2: In orange sind die relevanten leukämieassoziierten Antigene (LAAs) markiert, welche einen
positiven Effekt auf die Proliferation der Leukämiezellen haben (im oberen Bildbereich) oder die
Apoptose der malignen Zellen hemmen (unterer Bildbereich) und damit die Tumorlast in den
Patienten erhöhen [53]
RAR: retinoic acid receptor
Für die Antigencharakterisierung bei malignen hämatologischen Erkrankungen ist
die Identifizierung von Leukämieassoziierten Antigenen (LAA) und deren
Charakterisierung im Hinblick auf Immunantworten und Expressionsmuster
notwendig. Eine Methode zur Identifikation von TAAs/LAAs stellt das sogenannte
SEREX–Verfahren
(Serologisches
Screening
von
rekombinanten
cDNA–
Expressionsbanken) dar. Zunächst konnte die Durchführbarkeit von SEREX bei
der AML gezeigt werden [57]. Mittels SEREX wurden von der Gruppe
Tumorimmunologie Gruppe der Universität Ulm einige relevante immunogene
Antigenstrukturen bei Patienten mit einer AML identifiziert, wie z.B. MPP11,
RHAMM, HSP 70, HSJ-2, etc. [58, 59]. Auch bei anderen malignen
hämatologischen Erkrankungen wie der CML, CLL und den myeloproliferativen
Erkrankungen konnten spezifische zelluläre Immunantworten detektiert werden.
19
1. Einleitung
Eine Vielzahl von möglichen Immuntherapien ist bereits geprüft worden oder wird
aktuell in klinischen Studien aktiv geprüft [48, 68, 69].
Die funktionelle Rolle der LAAs in malignen Zellen ist sehr unterschiedlich. Viele
von ihnen spielen eine Rolle in dem Mechanismus für Zellteilung, Zellwachstum
und Differenzierung. Doch dies ist eine kontroverse Rolle: einerseits vermögen sie
das Zellwachstum zu steigern, andererseits stellen sie die Zielstruktur für eine
effektive Immunantwort gegen den betreffenden Tumor dar [53].
Bei der Suche nach geeigneten Strukturen für eine potentielle Immuntherapie
sind Mitoseassoziierte LAAs besonders interessant. SSX2IP oder RHAMM,
welches bereits die Phase 2 der Vakzinierungsstudien erreicht hat, sind nur ein
Beispiel dafür [60, 63]. Das PLK1- Gen, welches in dieser Arbeit unter anderem
als potentielles LAA untersucht wurde, gehört zu der Familie der Zellzykluskontrollierenden Kinasen und ist damit ebenfalls eines der Schlüsselgene der
Mitose.
1.4 Immuntherapie bei malignen hämatologischen Erkrankungen
Paul Ehrlich postulierte bereits Anfang des letzten Jahrhunderts die Theorie der
Immunüberwachung von Tumoren und setzte damit die Grundlage für die
Tumorimmunologie. Er ging davon aus, dass Veränderungen einer Zelle vom
Immunsystem als fremd erkannt und die betroffenen Zellen daraufhin vom
Immunsystem angegriffen würden. Somit käme es erst nach Überwindung der
Immunabwehr zur Manifestation eines Tumors.
Im Zentrum der Tumorabwehr steht die T-Zell-vermittelte zytotoxische Reaktion.
Diese erfolgt durch die Aktivierung der antigenspezifischen CD8+-T-Lymphozyten.
Werden die Tumorproteine auf MHC I präsentiert, aktivieren sie die CD8+-TZellen, die sich daraufhin zu zytotoxischen T-Zellen (CTL) differenzieren. Diese
erkennen nun die Tumorzellen über das gleiche Antigen, welches diese auf ihren
MHC I präsentieren. Die Tumorzelle kann nun lysiert werden. Werden die
Antigene auf MHC II präsentiert, was nur über die APCs passieren kann, so
aktivieren
sie
die
CD4+-T-Zellen.
Diese
induzieren
naive
B-Zellen
zur
antigenspezifischen Differenzierung, sodass reife Plasma B-Zellen spezifische
Antikörper sezernieren. Aktivierte CD8+-T-Zellen sind also für den direkten,
20
1. Einleitung
lytischen Angriff gegen Tumorzellen verantwortlich, die den entsprechenden MHCPeptid- Komplex auf der Oberfläche präsentieren. Aktivierte T-Helferzellen
dagegen sezernieren verschiedene Zytokine, die sowohl stimulatorische als auch
suppressive Effekte auf zytotoxischen T-Zellen, sowie auf andere Zellen des
Immunsystems ausüben [43, 95, 117]. Die Peptid-Präsentation ist allelspezifisch.
Ein von HLA-A2 präsentiertes Peptid kann also normalerweise nicht von HLA-A3
gebunden werden [35, 138].
Peptid - Vakzinierung
Die gezielte Immuntherapie durch Leukämie-Vakzinierung wird intensiv erforscht,
da sie Immunantworten gegen maligne Zellen zu erzeugen vermag unter
gleichzeitiger Schonung des körpereigenen Gewebes. Die Zielantigene für die
Graft-versus-Leukemia
–
Reaktion
(GvL)
scheinen
entweder
minor-
histocompatibility- Antigene zu sein [36] oder LAAs [54]. Die zweiteren werden vor
allem von den Leukämiezellen exprimiert, können aber auch im Normalgewebe
exprimiert werden. Optimale Zielstrukturen für eine Immuntherapie wären
Antigene, die ausschließlich in Leukämiezellen exprimiert würden. Nach dem
derzeitigen Forschungsstand sind jedoch Leukämie-restringierte Antigene, die
eine potente Immunreaktion auslösen können, selten [2].
Tumor-Vakzinierung kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: PeptidVakzinierung und Zell-Vakzinierung. Die Peptid-Vakzinierung ist HLA-restringiert
und erfordert die Identifizierung und Charakterisierung des Antigen-Epitops von
dem jeweiligen Zielprotein. Die Zell-Vakzinierung ist meist nicht HLA-restringiert
[25, 167].
In dieser Doktorarbeit soll es um die Peptid- Vakzinierungen gehen: Die PeptidVakzinierung fördert eine Antigen-spezifische Immunantwort, auch könnte eine
bereits bestehende Immunantwort stimuliert werden und so zum Beispiel ein MRD
kontrolliert werden. Dabei können die von einem immunogenen LAA abgeleiteten
Peptid-Epitope subkutan in die Nähe von Lymphknoten injiziert werden. Dort
werden sie von den Antigen-päsentierenden Zellen aufgenommen und den naiven
T-Zellen präsentiert. Treffen die so aktivierten T-Zellen dann auf einen
leukämischen Blasten, der ein gleichartiges LAA präsentiert, kann die T- Zelle mit
ihrem Rezeptor (TCR) dort binden und die leukämische Zelle lysieren.
21
1. Einleitung
Abb. 3: Schema der Peptid-Vakzinierung. Oben rechts: das Antigen-Peptid bindet an ein Klasse-IMolekül des major histocompatibility complex (MHC) einer Antigen-präsentierenden Zelle. Es wird
naiven T- Lymphozyten präsentiert. Um zu einer zytotoxischen T-Zelle (CTL) zu differenzieren,
bedarf es ebenfalls eines Signals durch costimulierende Moleküle (CD80 und CD86). Ohne diese
Costimulation bleibt die T-Zelle inaktiv, was die entscheidende Rolle der APCs in der Stimulierung
der Immunantwort unterstreicht. Erkennt eine stimulierte T-Zelle nun das LAA auf einer Tumorzelle,
kann der T-Zell-Rezeptor (TCR) des aktivierten T-Lymphozyten (CTL) binden, welcher auf oben
beschriebenem Weg für dieses LAA stimuliert wurde. Es kommt zur Sekretion von GrB, Perforin und
FasL und damit zur Lyse des Blasten [2]
Dieses Prinzip der Peptid-Vakzinierung wurde in mehreren klinischen Studien mit
verschiedenen Peptidepitopen überprüft. Die Sicherheit und Machbarkeit der
Peptid-Vakzinierung konnte gezeigt werden. Die niedrige Toxizität und die
einfache Überwachung hat sie für die Therapie der malignen Erkrankungen sehr
attraktiv gemacht, auch in Kombination mit einer Chemotherapie und der SZT.
22
1. Einleitung
Trotz ihrer Vorzüge haben es Peptid-Vakzinierungen noch nicht in die Guidelines
der Leukämie-Therapien geschafft aber es gibt bereits zahlreiche Berichte und
Studien über Langzeitremissionen nach Einsatz von Peptid-Vakzine [106, 120].
Die Vakzinierung mit LAA-abgeleiteten Peptiden erscheinet somit als
eine
erfolgversprechende Therapieoption. Die Suche nach den geeignetsten LAAs, den
Möglichkeiten einer Kombination mehrerer LAAs, sowie der richtigen Dosierung
und den besten Adjuvanzien sind Gegenstand weitergehender Forschung.
1.5 Zielsetzung
Der
Großteil
der
Patienten
mit
AML,
der
häufigsten
Leukämie
im
Erwachsenenalter, sowie auch ein großer Teil der MDS Patienten, hat nach wie
vor eine schlechte Prognose. Dies liegt nicht zuletzt an dem meist höheren Alter
der Patienten, in dem die Indikationsstellung für aggressive Chemotherapie und
Stammzell-Transplantationen nur mit hohem Risiko durchgeführt werden können
oder gar nicht erst möglich sind. Trotz aggressiver Therapien, einschließlich einer
allogenen Stammzelltransplantation, sind Rezidive häufig. Als Ursache der
Rezidive sind chemotherapie-resistente maligne Zellen anzusehen, die für die
sogenannte minimale Resterkrankung (MRD) verantwortlich sind. Zellen des
Immunsystems können diese verbliebenen Tumor-/Leukämiezellen beseitigen.
Welche Antigenstrukturen hierfür relevant sind und wie diese Immunantworten
ausgelöst und gesteigert werden können, wird derzeit von vielen Arbeitsgruppen
untersucht.
Das PLK1- Gen spielt eine wichtige Rolle im Zellzyklus der AML und Mutationen
im RPS14-Gen wurden als relevant in der Pathogenese des 5q- Syndroms
identifiziert. Beide Gene sind daher interessante Kandidatengene für die
Entwicklung
einer
gezielten
Immuntherapie.
In
dieser
Arbeit
sollte
die
Immunogenität beider Gene untersucht werden. Da Lenalidomid bekanntermaßen
besonders effektiv bei der Behandlung des 5q- Syndroms wirkt, wurde in den
Versuchen seine mögliche Wirkung auf die spezifische T-Zell-Antwort der CD8+-TZellen in diesem Patientenkollektiv mitevaluiert.
23
2. Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1 Allgemeine Laborgeräte
Brutschrank
B 5042 E (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland)
ELISpot-Reader
Immuno Spot (C.T.L. Europe, Reutlingen, Deutschland)
FACS-Gerät:
FACScan,
Fa.
Becton
Dickinson
(Heidelberg,
Deutschland)
Gamma-Counter
145 Microbeta Plus, Liquid Scintillation Counter, Fa.
Wallac (Loughborough Leics, England)
Gefrierschrank
-20 °C: (Bosch GmbH, München, Deutschland)
-80 °C: Ultra Low (Sanyo Fischer GmbH, München,
Deutschland)
Magnetständer
MACS MultiStand (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch
Gladbach)
Mikroskop
Vergrößerung 3,2, 10, 16 und 100fach (Carl Zeiss AG,
Oberkochen, Deutschland)
Multi-Step-Pipetten
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
pH Messgerät
pH744 Meter (Metrohm)
Pipetten
0,5 – 10 µl; 10 – 100 µl; 50 – 250 µl und 200 – 1000 µl
Eppendorf
Reference
(Eppendorf
AG,
Hamburg,
Deutschland)
Pipettierhilfe
Nalge Nunc international, Roskilde, Dänemark
Sterile Arbeitsbank
Hera-Safe HS-18 und HLB 2448 (Heraeus Instruments,
Hanau, Deutschland)
Stickstofftank
M280 (Taylor-Warton GmbH, Husum, Deutschland)
Wasserbad
Julabo
U3/7
(Julabo
Labortechnik
GmbH,
Seelbach/West, Deutschland)
Zentrifugen
Beckmann
GS-6R
und
GS-15R
(Beckmann
Instruments, Fullerton, CA, USA)
24
2. Material und Methoden
2.1.2 Plastikwaren
Alle verwendeten Plastikwaren wurden von den Firmen steril bezogen.
Einfrier-Röhrchen
Nunc
Cryo
TubeTM
Vials
1,8
ml
(Nalge
Nunc
International, Roskilde, Dänemark)
Einmalspritzen
2 ml (Fa. Beckton Dickinson, Heidelberg, Deutschland)
ELISpot-Platten
MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well filtration and Assay
Plate (Millipore, Bedford, MA, USA)
Filter
MACS Pre-Separations-Filter (Milteny Biotech GmbH,
Bergisch Gladbach, Deutschland)
Gewebekulturflaschen
NUNCLONTM Surface 40, 160 und 400 ml (Nalge Nunc
International, Roskilde, Dänemark)
Multistep-PipettenPipettenspitzen
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Pipetten
FALCON Serologische Pipetten 2, 5, 10, 25 und 50 ml
®
(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)
Pipettenspitzen
epT.I.P.S. Standard 0,1 – 10 µl, 2 – 200 µl und 50 –
1000 µl (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
Platten
NUNCLONTM Surface 12, 24, 48 und 96 well (Nalge
Nunc International, Roskilde, Dänemark)
Reaktionsgefäße
Safe-Lock Tube 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 2 ml
(Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
Röhrchen
FALCON Polypropylen Tubes 15 ml und 50 ml (Becton
®
Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)
Sterilfilter
Minisart RC 15 (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland)
Trennsäule
MACS MS+ Separation Columns (Miltenyi Biotec
GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland)
Zählkammer
Neubauer 0,100mm Tiefe; 0,0025mm² (LO - Laboroptik
GmbH, Friedrichsdorf, Deutschland)
25
2. Material und Methoden
2.1.3 Chemikalien
Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von folgenden
Firmen bezogen:
Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland
Merck KGaA, Darmstadt
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA
Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland
GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland
Becton Dickinson, Sparks, USA
Cambrex Bio Science, Rockland, USA
USB Corporation, Cleveland, USA
Invitrogen, Carlsbad, USA
Dela Select GmbH, Pfullingen, Deutschland
2.1.4 Spezielle Chemikalien
AB-Serum
Deutsches Rotes Kreuz, Ulm
AEC-Substrat
BD Biosciences
Aqua Distillata Spüllösung
Braun, Melsungen
β2-Mikroglobulin
Sigma-Aldrich
Chemicals,
Deisenhofen,
Deutschland
Dimethylformid
DMF (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Färbetabletten
BCIP
und
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)
NBT
(nitroblue
tetrazolium
chloride)
Färbetabletten, Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO, USA
Fetales Kälberserum
GibcoBRLTM,
Life
Technologies,
Karlsruhe,
Deutschland
Ficoll Seperating Solution
Seromed-Biochrom AG, Berlin
GrB-Antikörper
BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA
IFNγ-Antikörper
Mabtech
26
2. Material und Methoden
IL-2/IL-7
Sigma-Aldrich
Chemicals,
Deisenhofen,
Deutschland
L-Glutamin
Seromed-Biochrom AG, Berlin
MicroBeads CD8
Miltenyi
Biotec
GmbH,
Bergisch
Gladbach,
Deutschland
PBS 10x (w/o Ca²+ and Mg²+)
GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland
Penicillin/Streptomycin
GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland
RPMI 1640
Seromed-Biochrom AG, Berlin
Tryptanblau-Lösung 0,4%
Sigma-Aldrich
Chemicals,
Deisenhofen,
Chemicals,
Deisenhofen,
Deutschland
Tween-20
Sigma-Aldrich
Deutschland
Zelllinien
Deutsche
Sammlung
Mikroorganismen
von
Zellen
und
(www.dszm.org)
Braunschweig, Deutschland
2.1.5 Puffer
Coating-Puffer
In 100 ml Aqua bidest wurden folgende Komponenten gelöst:
•
318 mg Natriumcarbonat
•
580 mg Natriumhydrogencarbonat
•
49 mg Natrium-Azid
Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und steril filtriert.
Substrat-Puffer
In 500 ml Aqua bidest wurden folgende Komponenten gelöst:
•
0,1 M TRIS (6,05 g/500ml)
•
0,1 M NaCl (2,9 g/500ml)
•
5 mM MgCl2 (237 g/500ml)
Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und steril filtriert.
27
2. Material und Methoden
Dilution-Puffer
In 500 ml PBS wurden 50 ml FCS (FCS-engl.: Fetal Calf Serum) gelöst, so dass
der Dilution-Puffer 10% FCS enthält.
PBS (engl. phosphate buffered saline)
In 1 l Aqua bidest wurden folgende Salze gelöst:
•
8,0 g Natriumchlorid
•
0,2 g Kaliumchlorid
•
1,44 g Natriumhydrogenphosphat
•
0,24 g Kaliumhydrogenphosphat.
Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und steril filtriert.
PBS/ Tween-Puffer
In 1 l PBS-Puffer wurden 0,5 ml Tween-20 gelöst.
Seperations-Puffer
500 ml PBS enthält folgende Substanzen:
•
2 mM EDTA
•
0,5% hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum FCS
Blockierungslösung für GrB-ELISpot
500 ml 1640 RPMI-Medium enthält folgende Substanzen:
•
50 ml hitzeinaktiviertes FCS
•
5 ml Penicillin/ Streptomycin
•
5 ml L-Glutamin
Blockierungslösung für IFN γ-ELISpot
In 500 ml PBS wurden 5 ml hitzeinaktiviertes AB-Serum gelöst.
2.1.6. Zelllinien, Antikörper und Zytokine
Für die Auflistung, Verwaltung und Bereitstellung humaner Zellinien ist in den
USA die American Type Culture Collection (ATCC) verantwortlich. Es ist ein
global agierendes, nicht profitorientiertes Zentrum für biologische Ressourcen.
28
2. Material und Methoden
Der Hauptsitz der Organisation befindet sich in Manassas. Auch in Deutschland
gibt
es
ein
entsprechendes
Institut:
Die
Deutsche
Sammlung
von
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Folgende dort verzeichnete Zelllinien
wurden verwendet:
T2- Zellinie
Die T2-Zelllinie mit der ATCC-Nummer: CRL-1992 ist eine Verwandte der T1Zelllinie, die unter Auswahl des monoklonalen Antikörpers SFR1-MI.3 hergestellt
wird (gegen eine monomorphe Determinante auf HLA DR). Es ist eine TAPdefiziente Hybride aus einer lymphoblastischen B- und T-Zelllinie. Die Zellen
synthetisieren zwar das HLA B5, exprimieren es aber nicht auf ihrer Oberfläche.
Die Zelllinie T2 ist wie auch die T1-Zelllinie nützlich für das Studium der T-ZellErkennung von HLA I Antigenen. Die Zelllinie exprimiert das Antigen HLA A2 und
CD7+. HLA II wird nicht exprimiert.
FACS-Antikörper
FITC konjugierter, muriner IgG1 Antikörper
Fa. Becton-Dickison
(Isotypenkontrolle)
FITC konjugierter α-Human HLA-A2 Antikörper
Fa. Becton-Dickison
Interleukin-2 (IL-2):
IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der für die T-Zellproliferation und deren
Erhaltung erforderlich ist. Darüber hinaus stimuliert IL-2 die Differenzierung von
T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen, Monozyten, Makrophagen und
Oligodentrozyten [107]. Aufgrund seiner wachstumsfördernden Eigenschaften auf
aktivierte T-Lymphozyten wurde IL-2 zur Langzeitkultivierung von T-Zelllinien
eingesetzt.
Interleukin-7 (IL-7):
IL-7
ist, als ein T-und B-Zell-Wachstumsfaktor,
erforderlich.
Er
stimuliert
außerdem
die
für die T-Zellproliferation
Differenzierung
von
B-Zellen,
Thymozyten und T-Zellen und hemmt die Differenzierung von CTL und
lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK-Zellen). Eingesetzt wurde IL-7 aufgrund
seiner wachstumsfördernden Eigenschaften auf T-Lymphozyten [4, 136].
29
2. Material und Methoden
2.1.7 Zellkulturmedien
Medium zur T-Zell-Kultivierung
Die T-Zellen wurden in 1640 RPMI-Medium kultiviert. Zu 500 ml 1640 RPMIMedium wurden folgende Zusätze gegeben:
 10% hitzeinaktiviertes und steril filtriertes, humanes AB-Serum.
 1% Penicillin/ Streptomycin
 1% L-Glutamin
Medium zur Kryokonservierung
Als Medium zur Kryokonservierung wurde das RPMI 1640-Medium verwendet. Zu
500 ml RPMI 1640-Medium wurden folgende Zusätze gegeben:
 20% AB-Serum
 10% DMSO
 1%
Penicillin / Streptomycin , 1% L-Glutamin
Methode zur Seruminaktivierung
Um die Komplementfaktoren aus den verwendeten Seren zu eliminieren, wurde
ihre Hitzeinstabilität ausgenutzt. Die für die Zellkultivierung verwendeten Seren
wurden in einem Wasserbad bei 56 °C für 30 Minuten erwärmt. Das
hitzeinaktivierte Serum wurde portioniert und bei -20 °C bis zur Verwendung
gelagert.
2.1.8 Peptide
Die Kriterien zur Auswahl der Peptide, sowie die Tabellen mit den
Aminosäuresequenten findet man im Ergebnisteil unter Punkt 3.2. Die
untersuchten Peptide wurden von der Firma Thermo Hybaid (Ulm, Deutschland)
bezogen.
Als Positivkontrollen wurden in dieser Arbeit folgende 2 Peptide verwendet: Das
virale Protein pp65, welches die antigenspezifische CTL-Immunantwort auf das
humane Zytomegalievirus (HCMV) auslöst (im Folgenden als CMV bezeichnet)
[133] und das Nonapeptid aus dem Influenza A-Matrixprotein (im Folgenden, als
30
2. Material und Methoden
IMP bezeichnet [34]. Es wurde davon ausgegangen, dass die Durchseuchung
durch diese beiden Erkrankungen in der erwachsenen Bevölkerung so hoch ist,
dass mindestens eines der beiden Peptide eine Immunantwort auslösen sollte.
Als Negativkontrolle wurde dem Zellengemisch kein Peptid beigefügt.
Tab. 5: Aminosäuresequenzen der Peptide für die Positivkontrollen; Negativkontrolle
Name
Sequenz
Restriktion
IMP
GILGFVFTL
HLA-A *0201
CMV
NLVPMVATV
HLA-A *0201
Negativkontrolle
kein Peptid
IMP: Influenza Matrix-Protein; CMV: Cytomegalie Virus
2.1.9 Blutproben
Da in dieser Arbeit die potentielle Immunogenität der Peptide erst am Blut
gesunder Probanden und dann an den Blutproben entsprechender Patienten
getestet werden sollte, wurde auf zwei unterschiedliche Blutprobequellen
zugegriffen.
Die Proben von gesunden Spendern (Healthy volunteers – HV) wurden von der
Blutbank des Deutschen Roten Kreuzes Ulm, Abteilung Transfusionsmedizin,
bezogen.
Die Blutproben der an MDS- und im speziellen am 5q- Syndrom Erkrankten
wurden von Patienten gewonnen, die im Rahmen ihrer Erkrankung an der
Universitätsklinik Ulm behandelt wurden. Eine Aufklärung über die Freiwilligkeit
der Teilnahme wurde stets im Voraus durchgeführt. Alle Patienten haben eine
Einverständniserklärung unterzeichnet, welche von der Ethik-Komission der
Universität Ulm approbiert war. Die beteiligten Patienten waren bereits im Rahmen
ihrer Behandlung auf eine mögliche Deletion des q-Arms am Chromosom 5
untersucht worden, der HLA-A – Status war entweder bekannt oder wurde mittels
FACS-Analyse erhoben.
31
2. Material und Methoden
Tab. 6: Daten der Patienten, deren Blutproben in dieser Arbeit verwendet wurden. Die Patienten
wurden im Rahmen ihrer Erkrankung an der Universität Ulm behandelt.
Diagnose
5q-
Patient
Geschlecht
Alter*
1
w
73
MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk
+
2
w
60
MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk
+
3
w
58
MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk
+
4
Studienpatient
k.a.
MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk
+
5
w
78
MDS; [del(5q)], n.a.
+
6
w
66
-
7
m
54
MDS; RAEB- 1/2, normaler Karyotyp,
IPSS: Intermediate-1
MDS; RCMD, normaler Karyotyp,
8
w
78
9
m
69
MDS; normaler Karyotyp
-
10
m
61
MDS; normaler Karyotyp
-
IPSS: Intermediate-1
MDS; RCMD, normaller Karyotyp;
IPSS: Low-risk
Deletion
-
* Stichtag 01.01.11
w: weiblich; m: männlich; MDS: Myelodysplastisches Syndrom; IPSS: International Prognostic
Scoring System; RAEB: Refraktäre Anämie mit Blastenexzess; RCMD: Refraktäre Zytopenie mit
multilineären Dysplasien
2.2
Methoden
2.2.1 Anlage und Kultur von T2-Zellen
Die T2-Zelllinie, welche für die zweite Phase der Mixed Lymphozyte Peptide
Culture (MLPC) von Bedeutung ist, wurde in T-Zell-Medium bei 37 °C und 5%
CO2 im Brutschrank kultiviert. Ein Mediumwechsel fand drei Mal pro Woche statt,
wobei je nach Bedarf die gesamte Kultur, die halbe oder 1/5 der Kultur
zentrifugiert und in neues T-Zell-Medium gegeben wurden. Die Zellzahl wurde
wöchentlich in der Neubauer-Zählkammer bestimmt.
2.2.2 Probengewinnung
Zur Durchführung der Versuche wurden periphere, mononukleäre Blutzelllen
(PBMC) von HVs, sowie von an MDS- und speziell an dem 5q- SyndromErkrankten benötigt.
32
2. Material und Methoden
Die HV-PBMCs wurden aus Buffy-Coats frischer Blutspenden gewonnen. BuffyCoats sind aufkonzentrierte, zelluläre Bestandteile des Blutes, sie beinhalten vor
allem mononukläre Zellen und Thrombozyten. Aus 450 ml einer Vollblutspende
lässt sich ein Buffy-Coat von 90 ml extrahieren. Das Verfahren zur Buffy-CoatGewinnung wird unter dem nächsten Registerpunkt (Zellseparation/ Ficoll)
beschrieben.
Die Patienten PBMCs wurden aus heparinisierten, frischen oder aufgetauten
Vollblutproben gewonnen. Dieses wurde nach Einverständnis des entsprechenden
Patienten mittels peripherer Venenpunktion entnommen. Alle Patienten hatten
eine Einverständniserklärung unterzeichnet.
2.2.3 Zellseparation/ Ficoll
Für die Versuche wurde vor allem der lymphozytäre Blutbestandteil benötigt.
Dieser musste aus den Blutproben isoliert werden. Die PBMC (Monozyten, B- und
T-Zellen,
Natürliche
Killerzellen
und
Thrombozyten)
haben
ein
anderes
spezifisches Gewicht, als die Eythrozyten, Granulozyten und tote Zellen und
können somit mit der Dichtegradientzentrifugation von dem Rest getrennt werden.
Die
verschiedenen
Zelltypen
sedimentieren
beim
Zentrifugieren
in
unterschiedliche Phasen. Ficoll, ein ungeladenes Sucrosepolymer mit dem
spezifischen Gewicht von 1,077 g/ml, dient dabei als Phasentrenner. Seine Dichte
ist nämlich so gewählt, dass Zellen höherer Dichte, wie die Erythrozyten oder tote
Zellen, die Ficoll-Lösung überwinden können. Granulozyten bleiben in der
Ficollschicht. Die PBMCs sammeln sich an der Plasma- Gradientengrenze.
Durchführung:
Das Vollblut wurde im Verhältnis 2:1 mit PBS-Puffer verdünnt, mit 15 ml FicollLösung geschichtet und für 20 Minuten mit 2000U/min bei Raumtemperatur (RT)
ungebremst zentrifugiert. Anschließend wurden die PBMC von der Interphase mit
einer sterilen Pipette abgesaugt. Um die noch enthaltenen Thrombozyten zu
entfernen, wurde das Substrat danach dreimal mit PBS-Puffer gewaschen
(Zentrifugation bei 1200 U/min, 10 Minuten, Raumtemperatur).
Für die Zellzahlbestimmung der gewonnenen PBMC wurde ein kleiner Teil der
PBMC-Lösung mit einer Färbelösung (Tryptanblau) in einem bestimmten
33
2. Material und Methoden
Verhältnis vermischt und in eine Neubauer-Zählkammer überführt. In 64
Kleinquadraten wurden die Zellen gezählt. Die Zellzahl wurde anschließend mit
folgender Formel berechnet:
Zahl der gezählten Zellen x Verdünnungsfaktor
x 104/ml
Zahl der ausgezählten Quadrate
Die so isolierten PBMCs wurden entweder sofort in entsprechenden Tests
weiterverwendet oder kryokonserviert. Für letzteres wurden die Zellen in
Einfriermedium (RPMI-Medium mit 20% AB-Serum, 1% L-Glutamin, 1%
Penicillin/Streptomycin, 10% DMSO) überführt und als Zellpellet mit je 5 x 107
Zellen in 1,5 ml Kryoröhrchen abgefüllt. Diese wurden zunächst bei – 80 °C und
ab dem folgenden Tag schließlich in Flüssigstickstoff gelagert.
2.2.4 Typisierung der HLA-Oberflächenantigene mittels FACS-Analyse
Die Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (engl.: fluorenscence-activated cell sorter,
FACS)
dient
der
Charakterisierung
von
Zellen
anhand
ihrer
Lichtstreuungseigenschaften. Diese variieren je nach Ausprägungsmuster von
Oberflächenmolekülen. Mithilfe von monoklonalen Antikörpern (AK), die entweder
direkt oder über sekundäre AK an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind, werden
die Oberflächenmoleküle markiert. Danach werden die markierten Zellen, die in
einer wässrigen Lösung als Einzelzellsuspension vorliegen müssen, über ein
Ansaugsystem in die Messkammer gesaugt. Nun wird die Zellsuspension durch
Vibration in feine Tröpfchen verteilt, die im Idealfall nur jeweils eine Zelle
enthalten. Die so hydrodynamisch fokussierten Zellen passieren in einem
Flüssigkeitsstrom in der Messkammer einen Laserstrahl mit monochromatischem
Licht.
Zum einen werden so die Fluorchrome der Antikörper zur Emission von
Fluoreszenzlicht angeregt, zum anderen streuen die Zellen selbst das auf sie
fallende Licht. Dabei sind Vorwärtsstreulicht (FCS) und Seitwärtsstreulicht (SSC)
zu unterscheiden. Ersteres wird in einem geringen Winkel von 3-10 Grad gestreut
34
2. Material und Methoden
und korreliert mit der Zellgröße. Zweiteres wird um ca. 90 Grad gestreut und
korreliert mit der Oberflächentfaltung der Zelle und der Membrangranularität. Das
von den markierten Antikörpern kommende Licht wird durch Spiegel und
Farbfilter in Fluoreszenzspektren aufgetrennt und wird dann auf speziellen
photosensitiven Detektoren, sogenannten Photomultiplern, aufgezeichnet.
Die in dieser Arbeit verwendeten FACS-Antikörper sind mit dem FluoreszenzFarbstoff Fluorescein (FITC) markiert. FITC wird bei einer Wellenlänge von 488
nm angeregt, das Emissionsmaximum liegt bei 530 nm (grün). Detektoren für das
Fluoreszenzlicht,
welches
beim
Auftreffen
des
Laserstrahles
auf
den
Fluoreszenzfarbstoff des Antikörpers entsteht, messen die Dichte der Antigene
auf der Zelloberfläche. Mittels FACS-Analyse wurde untersucht, ob die Zellen der
Proben das HLA-A2-Allel exprimieren.
Durchführung
Die Zellen aus den Blutproben der jeweiligen Probanden und MDS- Patienten
wurden für die Messung in AB-Medium aufgenommen und bei 1200 U/min für 10
Minuten zentrifugiert. Pro FACS-Röhrchen wurden mindestens 2 x105 Zellen
benötigt. Die Zellen wurden nach dem Waschschritt in 2 ml PBS mit 1% FCS
aufgenommen. Pro Patient wurden in 2 FACS-Röhrchen je 1 ml dieser
Zellsuspension gegeben und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen.
Zu
dem
Pellet
wurde
in
ein
FACS-Röhrchen
10
µl
des
Fluoreszenzantikörpers Mouse FITC pipettiert. In das zweite FACS-Röhrchen
kamen 2 µl des Fluoreszenzantikörpers HLA-A2 FITC hinzu. Diese wurden nun
dunkel und kühl für 20 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen
zweimal in PBS gewaschen. Abschließend erfolgte die Aufnahme der Zellen in
mindestens 200 µl PBS. Dieses Volumen wurde von der Zellzahl abhängig
gemacht, sodass die Durchflusszahl der Zellen am FACS-Gerät bei der Messung
bei
etwa
300
Zellen/
Sekunde
lag.
Unter
Verwendung
der
Software
„CellQuestTM“ wurde das Emissionsmuster der jeweiligen Zellen analysiert.
Als Positivkontrolle in den Messungen diente die HLA-A2- positive T2- Zelllinie,
als Negativkontrolle die HLA-A2- negative K562- Zelllinie.
35
2. Material und Methoden
2.2.5 Isolation der PBMC-Fraktion und Durchführung der „Mixed
Lymphocyte Peptide Culture“ MLPC
Die Mixed Lymphocyte Peptide Culture, im Folgenden MLPC bezeichnet wurde in
der vorliegenden Arbeit nach einem von Elke Jäger veröffentlichten Verfahren
durchgeführt [75]. Dieses Verfahren dient dazu, die CD8+-T-Zellpopulation von der
CD8- Zellpopulation zu trennen, die CD8- Zellen – also die APC – mit den zu
untersuchenden Peptiden in Kontakt zu bringen und sie soweit zu präparieren,
dass sie die Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren (Abbildung 4).
Tag 0
Die mittels Zellisolation mit Ficoll-Lösung gewonnenen Zellen wurden aus dem
eingefrorenen, katalogisierten Bestand genommen und im Wasserbad bei 37 °C
in wenigen Minuten aufgetaut. Daraufhin folgte eine dreimalige Zentrifugation für
jeweils 10 Minuten bei 1200 U/min bei 20 °C unter Zugabe des PBS- Puffer.
Anschließend erfolgte die Zählung der nach dem Auftauen noch lebenden Zellen
in der Neubauer-Zählkammer. Um aus dem monoklonalen Zellgemisch die
benötigten
CD8+-T-Zellen
Separationssystem
zu
verwendet.
extrahieren,
Die
MACS
wurde
MicroBeads
das
MicroBeads-
sind
monoklonale
Antikörper (in dieser Arbeit wurden Antikörper gegen CD8 verwendet), an die
magnetisch aktive Partikel gebunden sind. Die Antikörper und mit ihnen die
gewünschten Zellen können so in einer Magnetsäule von der restlichen
Zellpopulation, die nicht das gewünschte Antigen trägt, separiert werden.
Pro 1 x 107 Zellen wurden
80µl Separationspuffer und 20µl MicroBeads
zugegeben und diese Lösung 15 Minuten im Kühlschrank bei 7 °C inkubiert.
Währenddessen wurde die Separationssäule vorbereitet. Hierzu wurde diese unter
sterilen Bedingungen an einen Magnetständer gesteckt und mit 500 µl
Separationspuffer befeuchtet. Der Efflux wurde verworfen.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 5 ml Separationspuffer zur Zelllösung
hinzugegeben. Die Zellsuspension wurde in der Zentrifuge 10 Minuten bei 1200
U/min und 20 °C von den überflüssigen Antikörpern freigewaschen. Das Zellpellet
wurde dann in 500 µl Separationspuffer aufgenommen. Die gesamte Menge
36
2. Material und Methoden
wurde auf die vorbereitete Säule gegeben. Daraufhin folgte noch eine dreimalige
Nachspülung der Säule mit je 500 µl Separationspuffer.
Abb. 4: Separation von Zellen mittels MACSTM und Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur („Mixed
lymphocyte peptide culture“, MLPC) [127]
Erläuterung den Pfeilen folgend:
Zellen aus dem Buffycoat der Patienten werden mit magnetischen CD8-Antikörpern inkubiert und
durch eine magnetische Trennsäule gebracht. Hier bleiben die CD8+-Zellen hängen, während die
CD8- -Zellen durchlaufen, aufgefangen und bestrahlt werden. Nach der Bestrahlung werden sie mit
den jeweiligen Peptiden gepulst und in einem bestimmten Verhältnis mit den CD8+ -Zellen für 7 Tage
bei 37 °C inkubiert, wobei am ersten Tag noch Interleukine 2 und 7 hinzugegeben werden.
Die CD8+-T-Zellen blieben in der am Magneten befestigten Säule hängen,
während die CD8- Zellfraktion, welche bei der Inkubation keine Antikörper
gebunden hat, durch die Säule durchlief und unten in einem Falcon-Röhrchen
aufgefangen wurde. Die CD8+-T-Zellen mussten nun aus der Säule gewaschen
werden. Dafür wurde die Säule aus dem Magnetständer entfernt. Mit einem
Stempel drückte man rasch 1000 µl Separationspuffer durch die Säule. Daraufhin
wurde die Zellsuspension auf ein definiertes Volumen mit dem AB-Medium
37
2. Material und Methoden
aufgefüllt und in der Zentrifuge zweimal gewaschen. Nun ermittelte man die
gewonnene Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer.
Die CD8- Zelllfraktion sind die APC. Sie sollen die Peptide erkennen, aufnehmen
und auf ihrer Oberfläche zur Erkennung durch die CD8+-T-Zellen präsentieren. Sie
wurden dafür zuerst mit 30 Gy einer Cäsium-37-Quelle bestrahlt (Deutsches Rotes
Kreuz Ulm, Abteilung Transfusionsmedizin), um zu verhindern, dass die
mononukleären Zellen als Reaktion auf die T-Zellen aktiviert wurden und
proliferierten. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen in der Zentrifuge
gewaschen und auch ihre Zellzahl wurde in der Zählkammer bestimmt. Man
berechnete danach die Menge des AB-Mediums, in welchem man die Zellen
aufnehmen musste, damit jeweils je 2 x 106 Zellen auf 500 µl AB-Medium kamen.
Danach erfolgte die Zugabe von 2,5 µg/ml β2-Microglobulin und anschließend die
Aufteilung in verschiedene Röhrchen. Je Röhrchen erfolgte die Zugabe von 20
µg/ml des jeweiligen zu testenden Peptides bzw. keine Zugabe als Leerkontrolle.
Die Zellen wurden für 1,5 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 im Brutschrank
inkubiert.
Die CD8+ Zellfraktion wurde währenddessen auf 1 x 106 Zellen/ml mit AB-Medium
verdünnt und anschließend je 500 µl pro Well (Plattenmulde) auf die Well-Platte
gegeben.
Nach Ende der Inkubationszeit wurde die CD8- Zellfraktionen zentrifugiert und
wieder mit 500 µl AB-Medium je 2 x 106 Zellen gelöst. Hier befanden sich nun die
APC, welche zum ersten Mal mit dem Antigen in Kontakt gekommen sind. Sie
wurden zu den bereits auf der Well-Platte befindlichen CD8+ Zellfraktionen
pipettiert. Verhältnis CD8+ –T-Lymphozyten : APCs 1:4.
Die verbleibenden Wells der Well-Platte benetzte man mit je 1000 µl PBS-Puffer,
um eine Verdunstung der Zellsuspension zu verhindern. Es erfolgte die Inkubation
bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank über Nacht.
Tag 1
Die MLPC wurde mit Interleukin-2 (2,5 ng/ml) und Interleukin-7 (20 ng/ml)
stimuliert und für weitere 7 Tage im Brutschrank inkubiert.
38
2. Material und Methoden
Tag 8
Die stimulierten Zellen wurden aus den Wells der Platte resuspendiert und mit
frischem AB-Medium gewaschen. Anschließend wurden sie auf 1 x 104 Zellen/50
µl mit AB-Medium verdünnt und zur Auswertung mittels ELISpot-Assay verwendet.
2.2.6 Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten mittels ELISpot-Assays
Der Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des
ELISpot-Assays (enzyme-linked immunospot) durchgeführt. Der Assay basiert auf
dem sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und ist ein sehr
sensitiver Test zur Analyse von Zellaktivitäten auf Ebene der einzelnen Zelle [26].
Mithilfe des Tests können bei der Immunreaktion sezernierte Zytokin-Moleküle in
direkter Umgebung der aktivierten, zytokinproduzierenden T-Zellen nachgewiesen
werden. Im Falle der stimulierten CD8+-T-Lymphozyten sind dies unter anderem
Interferon-Gamma (IFNγ ) und Granzyme B (GrB).
In der vorliegenden Arbeit wurden also IFNγ- und GrB- ELISpot-Assays
durchgeführt. Das Grundprinzip des Assays basiert auf Antikörpern, die an ihre
Zielstrukturen gebunden werden und im Verlauf durch Färbung sichtbar gemacht
werden (Abbildung 5). Der Boden einer Well-Platte wird mit zytokinspezifischen
Antikörpern beschichtet. Werden die CD8+-T-Zellen und die Peptid-gepulsten
CD8--T-Zellen nach der zweiten Peptidzugabe hinzugegeben, so kommt es zu
einer Immunantwort und Freisetzung von Zytokinen, in diesem Fall unter anderem
IFNγ und GrB. Durch die Zugabe von Zweitantikörpern, an die ein Enzym
gebunden ist und schließlich durch die Zugabe eines Substrates für diese
Enzyme, werden die Zytokine nachgewiesen. An der Stelle einer spezifischen
Zelle entsteht im letzten Schritt der Reaktion ein sogenannter Spot. Die
Gesamtzahl aller Spots in einer Plattenmulde kann schließlich ausgezählt werden.
39
2. Material und Methoden
Capture Antibody
YYYYYYYYYY
Enzyme Conjugate
Blocking
Add Cells
YYYYYYYYYY
Detection
Antibody
YYYYYYYYYY
YYYYYYYYYY
Wash
YYYYYYYYYY
YYYYYYYYYY
Substrate Development
YYYYYYYYYY
Abb. 5: Funktionsprinzip eines ELISpot-Assays.
Beschreibung den Pfeilen folgend: Zuerst werden die Platten mit Capture-Antikörpern bedeckt, dann
kommt die Block-Lösung darauf, die für die Stabilität der Capture-Antikörper sorgt. Es werden
angeregte Immunzellen hinzugegeben, die Zytokine abgeben, welche an den Antikörpern haften
bleiben. Ein Detection-Antikörper wird hinzugegeben. Ein Enzym bindet daran und spaltet das
Substrat zu einem Produkt, welches nach dem Färbungsschritt als Farbpunkt auf dem Plattenboden
sichtbar wird.
Durchführung:
Bei allen Assays wurde eine Positiv- sowie Negativkontrolle mitgeführt. Als
Positivkontrolle diente das Influenza-Matrix-Peptid (IMP) - ein intravirales Proteinund/oder das Cytomegalievirus-Antigen (CMV). Die Auswahl der Positivkontrolle
wurde aufgrund von bereits vorliegenden früheren Tests mit den jeweiligen
Freiwilligen-Blutproben getroffen. Bei Assays mit Zellen aus Blutproben gesunder
Personen, die noch nicht auf Vorhandensein der Antikörper gegen CMV und IMP
getestet waren, testete man beide Positivkontrollen mit. Aufgrund der hohen
Durchseuchungsrate war stets damit zu rechnen, dass bei den Probanden
zytotoxische
T-Zellen
gegen
das
Influenza-Antigen
und/oder
das
Cytomegalievirus-Antigen vorhanden und im ELISpot nachweisbar sein würden.
Als Negativkontrolle inkubierte man einen Ansatz ohne Zugabe von Peptiden, d.h.
in dem Ansatz waren nur probandeneigene CD8+-T-Zellen.
Als eine positive
Reaktion wurden mindestens 10 Spots pro Well definiert in dem optimalen Fall,
dass die Negativkontrolle keinen oder nur geringen Hintergrund bildete. Zeigten
40
2. Material und Methoden
sich etwas mehr Spots in der Negativkontrolle, so war der Test nur dann positiv zu
werten, wenn mehr als das Doppelte der Hintergrund-Spots vorlag.
Interferon-γ ELISpot-Assay
Tag 1
Platte coaten
Die ELISpot-Platten wurden zunächst mit einem monoklonalen humanen IFNγAntikörper (Coating antibody 1-D1K, Mabtech AB) beladen. Dazu wurde der
genannte Antikörper mit Coating Buffer auf eine Konzentration von 15 µg/ml
verdünnt und hiervon wurde dann 85 µl in jede Well gegeben. Die ELISpot-Platte
stellte man danach zum Inkubieren bei 4 °C über Nacht in den Kühlraum.
Tag 2
Pulsen der T2-Zellen
Aus der regelmäßig kontrollierten T2-Zellkultur wurden 40 ml entnommen und
zentrifugiert (10 Minuten bei 1200 U/min, Raumtemperatur). Anschließend nahm
man das Zellpellet wieder in AB-Medium auf und die Zellzahl wurde in der
Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die T2-Zellen wurden auf eine Konzentration
von 4 x 105 pro 500 µl gebracht und 2,5 µg/ml β2-Mikroglobulin wurde
hinzugegeben. Anschließend wurde der Ansatz auf verschiedene FalconRöhrchen aufgeteilt, die Anzahl entsprechend den zu testenden Peptiden und
Kontrollen.
Nun wurde je Falcon-Röhrchen das entsprechende Peptid hinzugegeben (20
µg/ml). Die Zellen ließ man danach zwei Stunden bei 37 °C und 5% CO2 im
Brutschrank mit den Peptiden inkubieren.
Platte blocken
Die ELISpot-Platten wurden aus dem Kühlraum entnommen und zweimal mit PBS
gewaschen (200 µl/Well). Anschließend wurde jede Well mit 100 µl PBS + 10%
AB-Serum befüllt und zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Auf
diesem Weg erreichte man das Blocken der unspezifischen Bindungsstellen der
41
2. Material und Methoden
Anti-Zytokin- Antikörper auf der Platte. Schließlich wurden die Platte nochmals
sechsmal mit PBS gewaschen (200 µl/Well).
Platte beladen
Es war stets wichtig, zu koordinieren, dass Tag 2 der ELISpot-Assays immer auf
den Tag 8 der MLPC fiel, denn ab diesem Versuchsschritt kamen die Zellen aus
der MLPC wieder dazu. Die entsprechend gepulsten CD8+-Zellen aus der MLPC
und T2-Zellen wurden im Verhältnis 1 : 4 in Eppendorfröhrchen gemischt (CD8+Zellen : T-Zellen 1 x 104 : 4 x 104 pro Eppendorfröhrchen). In dem Assay wurden
pro Peptid jeweils drei Wells mit dem gleichen Zell-Gemisch versehen, um die
Wiederholbarkeit und Genauigkeit des Versuches sicherzustellen. Pro Well der
ELISpot-Platte pipettierte man dann 100 µl der Mischung. Zum Wärmeausgleich
wurde der Boden der Platte mit Alufolie umwickelt. Die Platte wurde über Nacht
bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert.
Tag 3
Vorbereitung zur Färbung
Die ELISpot-Platte wurde erst fünfmal mit PBS (200 µl/Well) gewaschen, dann
weitere fünfmal mit PBS und 0,05% Tween-20 (200 µl/Well).
Um die sezernierten Zytokine sichtbar zu machen, wurde ein biotinylierter,
monoklonaler, humaner IFNγ-Antikörper verwendet. Pro Well wurden 100 µl
dieses Antikörpers (Mabtech, 7-B6-1-biotin, Konzentration 1µg/µl, Verdünnung mit
PBS/Tween-20)
pipettiert.
Die
Lösung
musste
nun
zwei
Stunden
bei
Raumtemperatur inkubieren.
Danach wusch man die ELISpot-Platte sechsmal mit PBS und 0,05% Tween-20
(200 µl/Well) und inkubierte sie im nächsten Schritt bei Raumtemperatur für zwei
Stunden mit 100 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (Streptavidin-Alkaline
Phosphatase 1 : 1000 in PBS/Tween-20 verdünnt).
Nach Ende der Inkubationszeit folgten weitere sechs Waschvorgänge mit PBS
und 0,05% Tween-20, sowie zwei weitere mit Substrat-Puffer (jeweils 200 µl/Well).
Färbung
Zum Entwickeln der Spots wurde eine Substrat-Lösung angesetzt:
42
2. Material und Methoden
In lichtarmen Verhältnissen wurde eine Tablette 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) in 500 µl Dimethylformamid gelöst und eine Tablette nitroblue
tetrazolium chorid (NBT) in 1 ml Aqua destillata. Anschließend ließ man beide
Lösungen durch jeweils einen 0,45 µm Filter durchlaufen.
Das Substrat wurde nun unter ebenfalls lichtarmen Bedingungen wie folgt
zusammengesetzt: 10 ml Substratpuffer, 330 µl NBT-Stock, sowie 33 µl BCIPStock. Pro Well pipettierte man nun 100 µl. Durch das Zusammenspiel der
Streptavidin-Peroxidase und der Substrat-Lösung wurden dann nach und nach die
Zytokin-Moleküle als blauer Punkt (Spot) sichtbar.
Abstoppen der Enzymatischen Reaktion
Nach zwei bis fünf Minuten wurde die ELISpot-Platte dreimal mit 200 µl/Well Aqua
destillata gewaschen und über Nacht getrocknet.
Auswertung
Die Auswertung der Platten erfolgte mit dem ELISpot-Reader, einem Gerät,
welches durch ein Programm mit dem PC gekoppelt ist. Nach dem Einlegen der
Platte konnte diese mittels eines Motortisches bewegt werden. Es gibt definierte
Standarteinstellungen, wie die Platten gelesen werden sollen. Dazu gehören unter
anderem die Einstellung der minimalen Spot-Größe und die Sensitivität. Mit dem
Programm kann man genau steuern, welcher Teil der Platte gelesen werden soll.
Eine Farbkamera mit Autofokus digitalisiert jede Well einzeln. Die Daten wurden
anschließend mit einer Software ausgewertet und gespeichert.
GranzymeB ELISpot-Assay
Tag 1
Platte coaten
Die
Platten
für
den
Granzyme-B-ELISpot
wurden
zunächst
mit
einem
monoklonalen, antihumanen Granzyme-B-Antikörper (BD Bioscineces capture
antibody, Konzentration 1 mg/ml, Verdünnung 1 : 200 mit PBS-Puffer) beladen.
Dafür pipettierte man 100 µl des genannten Antikörpers pro Well. Anschließend
wurde die Platte bei 4 °C über Nacht im Kühlraum inkubiert.
43
2. Material und Methoden
Tag 2
Pulsen der T2-Zellen
Durchführung analog dem Vorgehen beim IFNγ-ELISpot am Tag 2.
Platte blocken
Die ELISpot-Platten aus dem Kühlraum wurden ein Mal mit 200 µl/Well
Blocklösung
gewaschen.
Anschließend
Bindungsstellen der Anti-Zytokin-Antikörper
wurden
die
unspezifischen
mit 200 µl Blocklösung pro Well
geblockt, indem man sie zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubierte.
Platte beladen
Durchführung erfolgte analog dem Vorgehen beim IFNγ-ELISpot am Tag 2.
Tag 3
Vorbereitung zur Färbung
Die Zellsuspension aus dem Brutschrank wurde dekantiert und die Platte zweimal
mit deionisiertem Wasser gewaschen. Eine Einwirkzeit von 3 Minuten war dabei
einzuhalten. Dann wusch man die Platte dreimal mit PBS und 0,05% Tween-20
(200 µl/Well).
Um das bei der Immunantwort freigesetzte GrB sichtbar zu machen, wurde ein
monoklonaler, antihumaner GrB-Antikörper (BD Bioscineces detection antibody,
Konzentration 0,5 mg/ml, Verdünnung 1 : 250 mit PBS und 10% FCS) verwendet.
Von diesem Antikörper wurden 100 µl pro Well pipettiert. Die Platte wurde dann
bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert.
Nach Ende der Inkubationszeit verwarf man die Lösung und die Wells wurden
dreimal mit 200 µl PBS/Tween-20 gewaschen. Eine Einwirkzeit von 2 Minuten
musste auch hier eingehalten werden.
Nun wurde in jede Well 100 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (BD
Bioscineces Streptavidin-HRP, Verdünnung 1 :100 mit PBS mit 10% FCS)
pipettiert und die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend dekantierte man die Lösung und die Platte wurde viermal mit
PBS/Tween-20, sowie zweimal mit PBS (jeweils 200 µl/Well) gewaschen.
44
2. Material und Methoden
Färbung
Zum „Entwickeln“ der Spots musste, wie auch bei dem IFNγ ELISpot-Assay, eine
Substrat-Lösung angesetzt werden. In diesem Assay bestand sie aus 5 ml einer
AEC-Substrat-Lösung (3-amino-9-ethyl-carbazol, BD Biosciences) sowie 100 µl
einer AEC-Chromogen-Lösung (BD Biosciences). Hiervon wurden dann in einem
abgedunkelten Raum 100 µl pro Well zügig pipettiert.
Abstoppen
Nach 5 bis 10 Minuten wurde die Platte dreimal mit 200 µl Aqua destillata pro Well
gewaschen und über Nacht getrocknet.
Auswertung
Die Auswertung erfolgte analog dem Vorgehen beim IFNγ ELISpot.
2.2.7 Statistik
Es wurden die Ergebnisse mehrerer Versuchsansätze, die unter gleichen
Bedingungen
(arithmetischer
abgelaufen
waren,
durch
Berechnung
Mittelwert
(empirische Standardabweichung
)
s
und
von
Mittelwerten
Standardabweichungen
=
)
zusammengefasst. Zur Erfassung und Berechnung der Daten wurde das
Computerprogramm Microsoft® Excel for Mac 2011 verwendet.
45
3. Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 HLA-Typisierung
Da alle Peptidepitope, mit denen gearbeitet wurde, HLA-A2 restringiert sind,
musste der HLA- Status der Probanden und Patienten vor den Versuchen getestet
werden. Es wurde mit dem HLA-A2 Modell gearbeitet, da dies der am weitesten
verbreitete HLA- Typ in der kaukasischen Bevölkerung ist [143].
Die Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (engl.: fluorenscence-activated cell sorter,
FACS) dient der Bestimmung der Expression von Oberflächenmolekülen auf
Zellen mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern. Zur Bestimmung der HLA-A2
Expression wurde eine Durchflusszytometrie mit dem HLA-A2 Antikörper
durchgeführt (BD, Heidelberg, Germany) (Abb. 6 und 7). Die Expression des HLAA2 Oberflächenproteins wäre gemeinsam mit dem Nachweis der PLK1- bzw. der
RPS14 mRNA im KM oder im peripheren Blut eine essentielle Voraussetzung für
das immunologische Ansprechen der Peptidvakzinierung.
Abb. 6: Ergebnis einer fluorenscence-activated cell sorter (FACS)-Analyse eines HLA-A2-negativen
Probanden. Linkes Bild: Eingerahmt sind die Lymphozyten, außerhalb des Rahmens sind Monozyten
und Detritus. Mittleres Bild: Kontrolle mit murinen IgG-Antikörpern. Die Probandenzellen, die diesen
Antikörper (AK) gebunden haben befinden sich oberhalb der Linie. Rechtes Bild: Zellen wurden mit
HLA-A2-Antikörpern inkubiert. Nur die Zellen oberhalb der linie haben diese AK auch gebunden.
46
3. Ergebnisse
Abb. 7: Ergebnis einer fluorenscence-activated cell sorter (FACS)-Analyse eines HLA-A2-positiven
Probanden. Linkes und mittleres Bild: siehe Abb. 6. Rechtes Bild: Fast die gesamte getestete
Zellpopulation befindet sich oberhalb der Linie, weil diese die HLA-A2-Antikörper gebunden hat.
3.2 Peptidepitop-Identifikation mittels SYFPEITHI und BIMAS
Die Peptidepitope für die Antigene PLK1 und RPS14 mit einer HLA*0201abhängigen Bindung wurden mit Hilfe der im Internet zugänglichen Algorithmen
„SYFPEITHI“ [116]
(http://www.syfpeithi.de)
und „BIMAS“ [109] (http://www-
bimas.cit.nih.gov/) ausgewählt. Bei „SYFPEITHI“ handelt es sich um eine
Datenbank von MHC-Liganden und Peptidmotiven. Sie analysiert PeptidSequenzen, die MHC-Moleküle der Klasse I und II binden. „BIMAS“ basiert auf
einem ähnlichen Prinzip wie „SYFPEITHI“. Aufgrund der Scores wurden die
vielversprechendsten Peptide ausgewählt. Für PLK1 wurden es vier Peptide, für
RPS14 zwei Peptide. Diese sind in Tabelle 7 und 8 dargestellt. Die Reinheit der
Peptide
beträgt
mindestens
95%,
was
mit
der
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kontrolliert wurde. Sie wurden
in DMSO gelöst und mit PBS verdünnt, sodass die Konzentration letztlich 1 µg/ml
betrug. Die Konzentration der Peptid-Lösungen, die zum Pulsen der Kulturen
verwendet wurden, betrug 20 µg/ml.
47
3. Ergebnisse
Tab. 7: Ergebnis einer SYFPEITI-Analyse für HLA-A*0201 restringierte PLK1- Epitope
HLA-A*0201
nonamers
Pos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
score
471
S L M K K I T L L
28
542
I L C P L M A A V
28
376
D M L Q Q L H S V
26
269
S I P K H I N P V
25
273
H I N P V A A S L
25
373
H L S D M L Q Q L
25
443
I L Y N D G D S L
25
426
Q L C D N S V G V
24
522
I L H L S N G S V
24
82
K I V P K S L L L
23
Tab. 8: Ergebnis einer SYFPEITI-Analyse für HLA-A*0201 restringierte RPS14- Epitope
HLA-A*0201
nonamers
Pos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
score
118
A L A R S G M K I
24
16
S L G P Q V A E G
22
92
A L H I K L R A T
22
89
G I T A L H I K L
21
111
G A Q S A L R A L
20
22
A E G E N V F G V
19
9
K K E E Q V I S L
18
13
Q V I S L G P Q V
48
3. Ergebnisse
3.3. Untersuchung der Immunogenität der PLK1
3.3.1 Auswahl der Peptidsequenzen
Die als Ergebnis der Internet-basierten Analyse ausgewählten und auf
Immunogenität getesteten Peptide des potentiellen Tumor-Antigens PLK1 sind in
Tabelle 9 aufgelistet.
Tab. 9: Eigenschaften der ausgewählten, von Polo-Like-Kinase-1 (PLK1) abgeleiteten Peptid-Epitope
Name
Sequenz
Restriktion
PLK1 Peptid 1
QLCDNSVGV
HLA-A *0201
PLK1 Peptid 2
ILCPLMAAV
HLA-A *0201
PLK1 Peptid 3
SLMKKITLL
HLA-A *0201
PLK1 Peptid 4
DMLQQLHSV
HLA-A *0201
Die Aminosäuresequenzen der für die Positivkontrollen verwendeten Peptide,
sowie die Methode zur Negativkontrolle sind Tabelle 5 zu entnehmen.
3.3.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen PLK1
Als Beispiel der 12 Versuche sind in Abbildung 8a die Messwerte für die GrBFreisetzung der T-Lymphozyten eines gesunden Probanden nach Stimulation mit
den PLK1-Peptiden 1 bis 4 mit IMP, CMV, sowie ohne Stimulation (NegativKontrolle) dargestellt. PLK1-1 steht dabei für das PLK1 abgeleitete Peptid-Epitop
1. Analog verhält es sich mit den Epitopen 2 bis 4. IMP und CMV sind die bereits
vorbeschriebenen Positivkontrollen. „No peptide“ ist die Bezeichnung des LeerAssays und stellt die Negativkontrolle dar.
49
3. Ergebnisse
Abb. 8a: GranzymeB- ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen vier Peptide des PLK1 eines
gesunden Probanden
PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW:
Mittelwert
Die höchste Zahl an gezählten Spots sieht man für Zellen, die mit dem
Cytomegalievirus-Antigen gepulst wurden. Somit liegt eine gelungene PositivKontrolle vor. Die Positivkontrolle mit dem Influenza-Major-Protein ist schwächer
ausgeprägt. Desweiteren lassen sich Spots für alle Peptide der PLK1 erkennen.
Gegen das PLK1 Peptid1 zeigt sich bei diesem Probanden die stärkste
Immunantwort. Die Negativkontrolle zeigt eine nur geringe Reaktion und wurde
als Negativ gewertet.
Abbildung 8b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch
den ELISpot-Reader.
50
No peptide
CMV
IMP
PLK1-4
PLK1-3
PLK1-2
PLK1-1
3. Ergebnisse
Abb. 8b: GranzymeB- ELISpot-Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden
PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle
3.3.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen PLK1
In Abbildung 9a sind die Messwerte für die IFNγ-Freisetzung in einer MLPC eines
gesunden Probanden nach Stimulation mit den PLK1-Peptiden 1 bis 4 mit IMP,
sowie ohne Stimulation (Negativ-Kontrolle) dargestellt.
Abb. 9a: Interferon γ-ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen vier Peptide der PLK1 eines
gesunden Probanden
PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW:
Mittelwert
51
3. Ergebnisse
Auch hier sieht man die höchste Zahl an Spots für T-Zellen, die mit dem
Cytomegalievirus-Antigen als Positivkontrolle gepulst wurden. Desweiteren sticht
PLK1 Peptid 1 auch hier durch eine höhere Zahl an Spots hervor und wurde als
positiv gewertet. Alle anderen Peptide, einschließlich der Leerkontrolle, zeigen
eine geringe, unspezifische Reaktion, die als negativ gewertet wurde.
Im Folgenden ist die fotografische Auswertung der ELISpot-Platte durch den
No peptide
CMV
IMP
PLK1-4
PLK1-3
PLK1-2
PLK1-1
ELISpot-Reader wiedergeben:
Abb. 9b: Interferon γ-ELISpot- Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden
PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle) ; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle
3.3.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen PLK1- Epitope bei gesunden
Probanden
Tabelle 10 veranschaulicht die Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen die 4
Peptidepitope der PLK1. Es wurden insgesamt 12 Proben gesunder Probanden
mit jeweils einem GrB- und einem IFNγ- Assay auf ihre Immunantwort gegen die
PKL1- Peptide untersucht. Bei keinem der 12 GrB-Assays war eine spezifische
Immunantwort gegen CD8- -T-Zellen nachzuweisen, sie zeigte sich allerdings bei 4
der 12 IFNγ- Assays. Bei allen dieser 4 Probanden konnte man aber eine deutliche
Steigerung der Immunantwort nach Peptidstimulation im IFNγ- Assay beobachten.
52
3. Ergebnisse
Die von PLK1 abgeleitete Peptide 3 und 4 zeigten in den Versuchen eine nur
geringe Frequenz spezifischer Immunantworten (Peptid-3 8% und Peptid-4 17%).
Bei den anderen beiden Peptiden konnte man eine höhere Frequenz beobachten
(Peptid-1 25% und Peptid-2 33%).
Tab. 10: Ergebnisse der ELISpot-Assays mit 4 Peptiden des PLK1
PLK1
Positive Assays
Prozent positiver Assays
CMV/IMP
12/12
100
1
3/12
25,0
2
4/12
33,3
3
1/12
8,3
4
2/12
16,6
Pepdidnummer
CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle)
3.4. Untersuchung der Immunogenität des RPS14
3.4.1 Auswahl der Peptidsequenzen
Die potentiell immunogenen Epitope des Ribosomal Protein S14 (RPS14) wurden
ebenfalls basierend auf den Ergebnissen der „SYFPEITHI“ Software ausgesucht
und sind in Tabelle 8 dargestellt. Dabei wurden 2 Epitope als besonders geeignet
eingestuft (Tabelle 11).
Tab. 11: Eigenschaften der ausgewählten, von Ribosomal Protein S14 (RPS14) abgeleiteten PeptidEpitope
Name
Sequenz
Restriktion
RPS14 Peptid 1
AEGENVFGV
HLA-A *0201
RPS14 Peptid 2
ALARSGMKI
HLA-A *0201
53
3. Ergebnisse
3.4.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen RPS14
Im Schaubild 10a sind die Daten eines der ausgewerteten Versuche
zusammengefasst, welches die Ausschüttung von GrB durch die CD8+-T-Zellen
darstellt. Dies geschieht nur, wenn eine Immunantwort stattfindet. RPS14-1
bezeichnet das RPS14 abgeleitete Peptid 1. Analog dazu verhält es sich mit
RPS14-2. CMV und IMP sind die beiden Positivkontrollen. No pep ist die
Negativkontrolle ohne Peptidzusatz.
Abb. 10a: Granzyme B - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide des
RPS14 eines gesunden Probanden
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW:
Mittelwert
Die ELISpot-Reader Software hat hier nur wenige Punkte bei „No peptide“, der
Negativkontrolle, sowie bei dem RPS14 – Peptid 2 und dem Influenza-MajorProtein ausgezählt. Die Immunreaktionen sind in diesem Fall als negativ zu
werten. Die meisten Spots wurden bei der Positivkontrolle in Form des CMVAntigens und bei dem RPS14-Peptid 1 gezählt. Diese beiden Peptide sind als
positiv zu werten.
Abbildung 10b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch
den ELISpot-Reader.
54
No peptide
CMV
IMP
RPS14-2
RPS14-1
3. Ergebnisse
Abb. 10b: Granzyme B - ELISpot-Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle
3.4.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assays gegen RPS14
Im Schaubild 11a sieht man das Verteilungsmuster der Interferon-gamma
Ausschüttung eines gesunden Probanden beim artifiziellen Herbeirufen einer
Immunantwort in vitro mit Zugabe der beiden RPS14 abgeleiteten Peptide.
Abb. 11a: Interferon γ - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide des
RPS14 eines gesunden Probanden
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; MW: Mittelwert
55
3. Ergebnisse
Mit über 600 gezählten Spots ist die Immunantwort auf das CytomegalievirusAntigen am ausgeprägtesten. Damit ist in diesem Versuch die Positivkontrolle
definitiv bestätigt. Teilweise war es bei so überschießenden Positiv-Reaktionen
schwierig, die genaue Spot-Zahl zu ermitteln, da das Programm Schwierigkeiten
hatte aus der homogen dunkel gefärbten Fläche eine Spotzahl zu errechnen. Bei
der Negativkontrolle waren in diesem Versuch beinahe keine Punkte zu
verzeichnen und damit ist auch diese bestätigt. Die beiden RPS14 abgeleiteten
Peptidepitope 1 und 2 zeigten eine Immunantwort mit im Durchschnitt 100 Spots.
Somit sind sie beide in diesem Versuch als Positiv zu werten.
Abbildung 11b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch
No peptide
CMV
RPS14-2
RPS14-1
den ELISpot-Reader.
Abb. 11b: Interferon γ - ELISpot- Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle
3.4.4 Ergebnisse
der
ELISpot-Assays
gegen
RPS14-
abgeleitete
Peptidepitope bei gesunden Probanden
Da die ELISpot-Assays gegen die beiden RPS14 abgeleiteten Peptide zusammen
mit den PLK1 Assays durchgeführt worden sind, sind die Angaben zu den
Immunreaktionen der Probanden-Zellen auf die probandeneigenen CD8--T-Zellen
ohne Peptidzugabe mit den PLK1-Versuchen identisch.
Anhand der Tabelle 12 kann man sehen, dass die Frequenz der positiv
gewerteten spezifischen Immunantworten gegen die RPS14- abgeleiteten Epitope
56
3. Ergebnisse
deutlich höher war, als gegen die PLK1. In den Versuchen konnte in 25% der Fälle
eine spezifische Immunantwort gegen Peptid-2 beobachtet werden. Gegen das
RPS14 abgeleitete Peptid-1 zeigten 50% der Probanden eine spezifische zelluläre
Immunantwort.
Tab. 12: Ergebnisse der ELISpot-Assays mit 2 Peptiden des Rps14
RPS14- Peptid-Nr
Positive Assays
Prozent positive Assays
CMV/IMP
12/12
100
1
6/12
50
2
3/12
25
CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle)
3.5
Zelluläre Immunantwort gegen RPS14 beim Patientenkollektiv;
zusätzlich Lenalidomidzugabe
3.5.1 Immunogenität der beiden RPS14- abgeleiteten Peptide
Mit Hilfe des ELISpot-Assays wurden spezifische zelluläre Immunantworten gegen
RPS14 -abgeleitete Peptid-Epitope nachgewiesen. Der nächste sinnvolle Schritt
war es, die Epitope in den etablierten ELISpot-Assays mit Zellen aus Blutproben
von Patienten zu testen. Es wurden Blutproben von MDS Patienten mit einer
Deletion am q-Arm des Chromosom 5 (5q- MDS), sowie von MDS Patienten ohne
einer solchen Deletion (non-5q- MDS) verwendet. In den folgenden Versuchen
wurde zusätzlich auch die Wirkung des Immunmodulators Lenalidomid, welcher
als „First-line-Therapie“ bei dem 5q- Syndrom eingesetzt wird, auf seine Wirkung
bei der zellulären Immunantwort getestet. Die Assays wurden also stets im
gleichen Versuch mit und ohne Lenalidomid-Zugabe durchgeführt. Vier der
Patienten, deren Blutproben in den Versuchen verwendet wurden, haben sich
einer Lenalidomidtherapie unterzogen, von ihnen hat man Blutproben vor und
nach der Lenalidomidtherapie entnommen. Diese wurden auf Veränderungen der
Intensität der zellulären Immunantwort untersucht.
Da ein Leitsymptom des MDS Panzytopenie ist, war es teilweise sehr schwierig
Blutproben mit ausreichender Zellzahl für die Versuche zu gewinnen. Sofern die
vorhandene Zellzahl nicht zum Testen aller Peptide mit und ohne Lenalidomid
57
3. Ergebnisse
reichte, wurde Peptid 2 (RPS14-2) weggelassen und nur Peptid 1 (RPS14-1)
getestet, da dieses erfolgversprechendere Ergebnisse bei gesunden Probanden
gezeigt hatte. Die optimale Konzentration von Lenalidomid wurde sorgfältig
anhand von Titrationsversuchen ausgesucht und betrug in allen Versuchen 50mM.
Auch in diesen Versuchen wurde eine Positivkontrolle mit Influenza-Matrix-Protein
und dem Cytomegalievirus-Antigen, sowie ein Leerassay als Negativkontrolle
mitgeführt.
Insgesamt wurden 10 Patienten-Proben untersucht: Fünf 5q- MDS-Patienten und
fünf non-5q- MDS-Patienten (ihre Charakteristika siehe Tabelle 6). Die Ergebinsse
einer 5q- MDS-Patientin waren dabei aufgrund von zu zahlreichen Spots in der
Negativkontrolle nicht auswertbar. In alle Auswertungen gehen daher nur 9
Patienten mit ein.
Sowohl gegen das Peptid 1, als auch das Peptid 2 des RPS14 konnte in vitro eine
zelluläre Immunantwort ausgelöst werden (Tabelle 13 und 14).
Tab. 13: Positive Granzyme B Assays bei 5q- und non-5q- MDS- Patienten
Granzyme B
RPS14
Positive Assays
Prozent positive Assays
CMV/IMP
9/9
100
1
3/9
33,3
2
3/6
50,0
Pepdidnummer
CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle)
Tab. 14: Positive Interferon γ- Assays bei 5q- und non-5q- MDS- Patienten
Interferon Gamma
RPS14
Positive Assays
Prozent positive Assays
CMV/IMP
9/9
100
1
5/9
55,5
2
4/6
66,6
Pepdidnummer
CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle)
58
3. Ergebnisse
Die GrB und IFNγ- Assays eines Patienten wurden stets parallel durchgeführt.
Eine Immunantwort durch die Ausschüttung des Interferon- Gamma konnte jedoch
insgesamt häufiger nachgewiesen werden, als durch das GrB. In den Tabellen 13
und 14 kommt ebenfalls zur Darstellung, dass das Peptid 2 mit 50% in den GrBAssays und 66,6% in den IFNγ- Assays etwas häufiger zur positiven
Immunreaktion führte, als das Peptid 1 mit 33,3% in den GrB- Assays und 55,5%
in den Interferon-Gamma- Assays.
Beim Vergleich der Gesamthäufigkeit der positiv gewerteten Assays unter den
beiden Patientengruppen 5q- MDS und non-5q- MDS konnte man zeigen, dass
diese mit 45% zu 50% beinahe gleich sind. In den Versuchen mit den Blutproben
der 5q- MDS-Patienten konnte eine spezifische Immunantwort gegen Peptid 2
häufiger, als gegen das Peptid 1 beobachtet werden. Bei den non-5q- MDSPatienten gab es keine solche Dominanz eines Peptids. Die Häufigkeit der
positiven Reaktion beider Peptide in den Versuchen im Vergleich zu der Häufigkeit
der positiven Reaktion nur eines der beiden Peptide betrug 50%.
3.5.2 In vitro Effekt von Lenalidomid
Das Einbringen des Immunmodulators Lenalidomid in die Versuche war anfangs
nur experimentell gedacht, doch nachdem sich erste positive Ergebnisse gezeigt
hatten, wurden weitere Versuche unternommen. Bei jedem Patienten wurden
schließlich, soweit die Zellzahlen ausreichten, die Versuche mit und ohne in vitro
Lenalidomidzugabe durchgeführt. Abbildungen 12a bis 13b zeigen das IFNγ
ELISpot-Assay der Patientin Nr. 10 und das GrB- Assay- Pendant dazu – jeweils
mit den dazugehörenden ELISpot-Platten. Steht hinter der Substanzbezeichnung
ein „+L“ (z.B. RPS14-1+L), so bedeutet dies, dass in diesen Wells Lenalidomid als
Zusatz erfolgte.
59
3. Ergebnisse
Abb. 12a: Interferon γ (IFNγ) - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide
des RPS14 eines non-5q- MDS-Patienten.
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle);
IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well
(Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Die ELISpot-Reader-Softwear hat eine deutlich höhere Spotzahl in den Wells mit
Lenalidomid gezählt, als in den Wells ohne. Außer bei Peptid 2 des RPS14- Gens,
welches durch die Zugabe des Medikaments gleichbleibend positiv reagiert,
No peptide
IMP+L
CMV+L
RPS14-2+L
RPS14-1+L
IMP
CMV
RPS14-2
RPS14-1
stimuliert die in vitro Lenalidomidzugabe in diesem Versuch die Immunantwort.
Abb. 12b: Interferon γ - ELISpot- Platte. Immunreaktion des Patienten Nr. 10
60
3. Ergebnisse
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle);
IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro Zugabe von Lenalidomid
Die Wells der rechten Plattenhälfte (ausgenommen die Negativkontrolle ganz
rechts) zeigen mehr Spots, als die der linken Plattenhälfte. In der rechten
Plattenhälfte wurde Lenalidomid in vitro hinzugefügt (+L).
Abb. 13a: Die Abbildung zeigt die Auswertung des Granzyme B (GrB) - Assay- Pendant zu dem
Interferon γ - Assay aus Abb. 12a
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle);
IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle: w: well
(Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Auch dieses Assay zeigt, dass die in vitro Zugabe von Lenalidomid die
Immunantwort gegen die meisten Peptide stimuliert (rechte Bildhälfte). Die
Immunantwort gegen Peptid 2 des RPS14-Gens wird unter Lenalidomidzugabe
eher unterdrückt.
61
No peptide
IMP+L
CMV+L
RPS14-2+L
RPS14-1+L
IMP
CMV
RPS14-2
RPS14-1
3. Ergebnisse
Abb. 13b: Zugehörige ELISpot-Platte zu dem Granzyme B- Assay des Schaubildes 13a
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle);
IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro Zugabe von Lenalidomid
Die vorgestellten Assays des Patienten Nr. 10 zeigen, dass die in vitro
Lenalidomidzugabe immunstimulierend wirken kann. Vor allem bei dem InterferonGamma- Assay (Abb. 12a und 12b) wird deutlich sichtbar, dass die Anzahl der
Spots in dem rechten Bildteil der Platte zugenommen hat. Das Peptid 1 des
RPS14 und CMV, die man in diesem Fall ohne Lenalidomidzugabe als nicht
immunogen
beschrieben
hätte,
lösen
unter
dem
in
vitro
Zusatz
des
Immunmodulators eine deutliche Immunreaktion aus.
Der immunstimulierende Effekt konnte allerdings nicht in allen Versuchen
homogen nachgewiesen werden.
Ganz im Gegensatz zu der positiven Wirkung von Lenalidomid auf die
Immunreaktion, die hier am Beispiel des Patienten Nr. 10 dargestellt wurde,
konnte sich Lenalidomid auch negativ auf die zelluläre Immunantwort auswirken.
Ein Beispiel dafür zeigen ein Interferon-Gamma- Assay und ein Granzyme-BAssay von der Patientin Nr. 6 mit den dazugehörenden ELISpot-Platten
(Abbildungen 14a bis 15).
62
3. Ergebnisse
Abb. 14a: Interferon γ (IFNγ ) -ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen das RPS14abgeleitete Peptid 1 eines non-5q- MDS-Patienten.
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; w: well (plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von
Lenalidomid
Aufgrund von bestehender Panzytopenie konnte der Versuch mit den Blutproben
dieser Pateintin nur mit einem der beiden Peptide und nur mit IMP als
Positivkontrolle durchgeführt werden. Die Spotzahl in den Wells ohne Lenalidomid
ist in diesem Versuch deutlich höher, als in den Wells mit Lenalidomid. Bei dieser
Patientin wirkt sich der Immunmodulator immunsupprimierend auf die T-ZellAntwort aus. Das Peptid 1 des RPS-14-Gens löste in diesem Versuch keine
No peptide
IMP+L
RPS14-1+L
IMP
RPS14-1
Immunantwort aus.
Abb. 14b: Fotografisch ausgelesene Platte des Interferon γ - ELISpot-Assays der Patientin Nr. 6
63
3. Ergebnisse
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Die Wells der rechten Plattenhälfte zeigen weniger Spots, als die der linken
Plattenhälfte. In der rechten Plattenhälfte wurde Lenalidomid in vitro hinzugefügt
(+L). An der Positivkontrolle (IMP) sieht man, dass in diesem Fall die in vitro
Zugabe von Lenalidomid immunsuppressive Wirkung auf die T-Zell- Antwort hatte.
Bei der Positivkontrolle IMP ist die Spotszahl so groß, dass diese konfluieren und
die Wells homogen dunkelblau imponieren, während IMP+L zwar ebenfalls positiv
gewertet werden kann, jedoch ist die Spotszahl hier deutlich geringer.
Abb. 15a: Auswertung eines Granzyme B (GrB) - ELISpot-Assay der Patientin Nr. 6 mit und ohne in
vitro Lenalidomidzugabe (+L)
RPS14-: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide:
Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von
Lenalidomid
Die ausgezählte Spotzahl in den Wells ohne Lenalidomid ist deutlich größer, als in
den Wells mit Lenalidomid. Bei dieser Patientin wirkt sich der Immunmodulator
immunsupprimierend auf die T-Zell- Antwort aus.
64
No peptide
IMP+L
RPS14-1+L
IMP
RPS14-1
3. Ergebnisse
Abb. 15b: Platte des Granzyme B - ELISpot- Assays der Patientin Nr. 6
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Die Positivkontrolle IMP löst korrelierend mit der IFNγ- Assay (Abb. 14b) eine
schwächere Immunreaktion unter Lenalidomidzugabe aus, als ohne Lenalidomid.
In den oben abgebildeten GrB und Interferon-γ ELISpot-Assays und den
dazugehörenden Platten sieht man, dass die Intensität und Dichte der Spots ohne
Lenalidomidzugabe (in der linken Bildhälfte) deutlich stärker ist, als unter Zugabe
des Immunmodulators (rechte Bildhälfte). Die in vitro zelluläre Immunantwort
dieser Patientin wurde also durch das Medikament unterdrückt. Unter Betrachtung
der ELISpot-Assays der Patienten Nr. 10 und Nr. 6, konnten wir folglich zeigen,
dass Lenalidomid die zelluläre Immunantwort in vitro sowohl steigern, als auch
supprimieren kann.
Die zusätzliche in vitro Lenalidomidzugabe erfolgte bei 9 von 10 Patienten. Die
Auswertungen der Lenalidomidwirkung in den Patientenassays ist der folgenden
Tabelle 15 zu entnehmen.
65
3. Ergebnisse
Tab. 15: Lenalidomidwirkung auf die Immunantwort in den ELISpot-Assays mit Patientenproben
Patientennummer,
MDS-Art
1. 5q- MDS
2. 5q- MDS
3. 5q- MDS
3.
nach
Lenalidomidtherapie
4. 5q-MDS
4. Ztp.1 nach
Lenalidomidtherapie
4. Ztp.2 nach
Lenalidomidtherapie
5. 5q- MDS
6. non-5q- MDS
6.
nach
Lenalidomidtherapie
7. non-5q- MDS
8. non-5q- MDS
8.
nach
Lenalidomidtherapie
9. non-5q- MDS
10. non 5q- MDS
Interferon-Gamma
RPS14-1
RPS14-2
+-+
⇑
⇑
++-
++-
CMV
IMP
⇓
⇑
+⇓
++-
+-
Gr-B
RPS14-1
++-
RPS14-2
++-
CMV
IMP
⇓
⇑
++-
++-
++-
+⇓
+-
KEINE LENALIDOMID-ZUGABE WEGEN ZELLMANGEL
⇓
++++-
⇓
⇓
⇓
NICHT AUSWERTBAR, POSITIVE NEGATIVKONTROLLE
⇓
++⇓
++-
⇓
+++-
+-
⇑
⇑
⇑
⇑
+-
⇑
⇑
+-
+-
+-
+++-
⇓
+-
KEINE LENALIDOMID-ZUGABE WEGEN ZELLMANGEL
⇑
⇑
⇓
+++-
Erläuterung:
In dieser Tabelle ist die Lenalidomidwirkung auf die Immunantwort der Patientenproben dargestellt.
Ein Pfeil nach oben (⇑) bedeutet eine Zunahme der Spotzahl um mindestens das Doppelte des
Ausgangswertes nach der in vitro Lenalidomidzugabe. Ein Pfeil nach unten (⇓) bedeutet
dementsprechend die Abnahme der Spotzahl um mindestens das Doppelte des Ausgangswertes. Mit
dem Symbol „+-„ ist keine signifikante Veränderung der Spotzahl nach der in vitro
Lenalidomidzugabe gekennzeichnet. Ist ein Feld durchgestrichen, so bedeutet dies, dass das Peptid
nicht mituntersucht wurde. Patienten, bei denen man Blutproben vor und nach Lenalidomidtherapie
untersucht hat, sind grau unterlegt. Hat die Spotzahl nach der in vivo Lenalidomideinnahme in den
Versuchen insgesamt zugenommen, wurde das Feld mit der Patientennummer mit einem dunkleren
Grauton unterlegt
Da die Zellzahlen sogar zu niedrig waren, um in jedem Versuch alle essentiellen
Peptide zu untersuchen , konnten schließlich nur 4 5q- MDS-Patienten und 4 non5q- MDS-Patienten auf die in vitro Wirkung von Lenalidomid untersucht werden.
Die in vitro Zunahme von Lenalidomid steigerte die Immunantwort auf das Peptid
RPS14-1 in den Interferon-Assays der Patienten Nr. 2 und Nr. 10 und auf das
Peptid RPS14-2 nur in dem Interferon-Assay von dem Patienten Nr. 2. In den
GranzymeB-Assays
konnte
bei
keinem
Patienten
eine
Steigerung
der
Immunantwort auf ein Peptid unter in vitro Lenalidomid beobachtet werden.
66
3. Ergebnisse
Bei den Positivkontrollen bewirkte die Zugabe von Lenalidomid bei 4 von 9
Patienten eine Abnahme der Immunantwort bei weiteren 4 von 9 eine Zunahme.
Bei einem Patienten konnte keine Veränderung beobachtet werden.
3.5.3 In vivo Effekt von Lenalidomid
Wie bereits erwähnt, konnte man bei 4 Patienten Blutproben mit genügender
Zellzahl vor und nach einer Behandlung mit Lenalidomid gewinnen. Die Patientin
Nr. 6, deren ELISpot-Ergebnisse in den Abbildungen 14a bis 15b dargestellt und
besprochen wurden, war eine davon.
Folgende Bilder 16a bis 17b zeigen die ELISpot-Assays der gleichen Patientin
nach abgeschlossener Lenalidomidtherapie. Bei fortgeschrittener Panzytopenie
wurden nur das Peptid 1 und die Positivkontrolle mit und ohne in vitro
Lenalidomidzugabe getestet.
Abb. 16a: Interferon γ (IFNγ) - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen das RPS14abgeleitete Peptid 1 eines non-5q- MDS-Patienten (Patientin Nr. 6) nach Lenalidomidtherapie. In der
rechten Bildhälfte ist der gleiche Versuch unter in vitro Lenalidomidzugabe (+L) ausgewertet
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von
Lenalidomid
67
3. Ergebnisse
Die Negativkontrolle in diesem Versuch wurde mit durchschnittlich 30 Spots pro
Well ausgewertet und festgelegt. Somit kann nach den Auswertungskriterien nur
die Positivkontrolle ohne Lenalidomidzugabe (IMP) als eindeutig T-Zellimmunogen gewertet werden, da hier deutlich über 60 Spots gezählt wurden.
Unter Zugabe von Lenalidomid (IMP+L) kann sie nur noch als grenzwertig positiv
No peptide
IMP+L
RPS14-1+L
IMP
RPS14-1
gewertet werden.
Abb. 16b: Zu dem Interferon γ - Assay aus der Abb. 16a gehörende digital-fotografisch eingelesene
ELISpot- Platte
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Im Vergleich zu dem IFNγ- Assay mit der Blutprobe der gleichen Patientin vor ihrer
Therapie mit Lenalidomid ist ein deutlicher Spotzahl-Rückgang zu beobachten
(Abb. 14a und b).
68
3. Ergebnisse
Abb. 17a: Auswertung eines Granzyme B ( GrB) - Assays der Patientin Nr. 6 nach abgeschlossener
Lenalidomidtherapie
RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein
(Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter
in vitro - Zugabe von Lenalidomid
Wie man in der Auswertung der Negativkontrolle (no pep) sieht, war hierbei
keinerlei spezifische Immunantwort gegen CD8+-T-Zellen nachzuweisen. Die
Positivkontrollen sind mit und ohne Lenalidomitzusatz bei dem niedrigen Spothintergrund der Negativkontrolle als positiv zu werten, mit Lenalidomid jedoch
No peptide
IMP+L
RPS14-1+L
IMP
RPS14-1
deutlich schwächer ausgeprägt.
Abb. 17b: Zu dem Granzyme B - Assay aus der Abb. 17a gehörende ELISpot- Platte
RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No
Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid
69
3. Ergebnisse
Im Vergleich zu dem GrB- Assay der gleichen Patientin vor der Therapie mit
Lenalidomid ist - analog der IFNγ- ELISpot- Platte - ein deutlicher SpotzahlRückgang zu beobachten (Abb. 15b).
Insgesamt konnte man beobachten, dass der in vitro Effekt bei zwei von vier
Patienten weitestgehend mit dem in vivo Effekt korrelierte und zwar bei dem oben
beschriebenen Patienten Nr. 6. (non-5q- MDS), dessen Spotzahlen unter
Lenalidomid in vivo, sowie in vitro zurückgingen und bei dem Patienten Nr. 8 (non
5q- MDS), bei dem Lenalidomid in vivo und in vitro die Immunantwort steigerte. Bei
den anderen zwei Patienten änderte sich die Spotzahl nach der in vivo
Lenalidomid-Einnahme nicht signifikant (Patient Nr. 3 und Nr. 4 ). Bei diesen
Patienten bewirkte Lenalidomid in vitro eine Abnahme der Immunantwort. Beide
sind 5q- MDS- Patienten.
Es ist in den Versuchen damit eindeutig gezeigt worden, dass Lenalidomid sich
auf die T-Zell-vermittelte Immunantwort auswirken kann und es ist durchaus im
Rahmen des Denkbaren, dass dieses Medikament aus nicht geklärten Gründen
individuell abhängig wirken kann. Eine Hypothese wäre dabei, dass die in vitro
und in vivo Wirkung von Lenalidomid nicht nur miteinander, sondern auch mit der
Klinik des Patienten korreliert. Die Patientin Nr. 6, deren Immunreaktionen auf das
RPS14- abgeleitete Peptid-Epitop 1 in den Abbildungen 14a bis 17b dargestellt
sind, hat nicht nur in vitro und in vivo mit einer geringeren Immunreaktion unter
Lenalidomid
reagiert,
sondern
zeigte
sich
bei
ihr
auch
klinisch
eine
Verschlechterung unter dem Medikament, sodass die Therapie mit dem
Immunmodulator abgebrochen werden musste. Die Blutproben der anderen
Patienten, die sich der Therapie unterzogen haben, wurden zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nach der Therapie entnommen und somit bleibt offen, ob der
Zeitpunkt der Entnahme ebenfalls einen Einfluss auf das Ergebnis hatte.
70
4. Diskussion
4. Diskussion
Derzeit
entwickeln
sich
eine
Vielzahl
neuer
und
interessanter
Therapiemöglichkeiten myeloischer Neoplasien, wie der AML und dem MDS.
Unter anderem zeigen Immuntherapien vielversprechende Ergebnisse. Zur
Weiterentwicklung dieser Therapieform ist die Identifikation und Charakterisierung
geeigneter Targetstrukturen notwendig [70].
Bei der AML wurden deshalb in der vorliegenden Arbeit vier mögliche
immunogene Epitope von PLK1 aus der Familie der Serin/Threonin Kinasen
untersucht.
Die
Überexpression
dieses
in
die
Mechanismen
der
Centrosomenreifung und Chromosomen-Segregation involvierten Gens wird in der
Literatur bei vielen Tumorerkrankungen und speziell auch AML, sowie weiteren
Leukämieformen beschrieben [14, 119].
Bei dem 5q- Syndrom wurden zwei Epitope von RPS14 als potentielle
Zielstrukturen einer Immuntherapie untersucht. RPS14 ist das Schlüsselgen des
5q-
Syndroms
[31].
Diesem
in
der
Literatur
beschriebene
längere
erkrankungsfreien Überleben und Gesamtüberleben der Patienten mit dieser
speziellen MDS-Form könnte möglicherweise eine spezifische Immunreaktion
gegen RPS14 zugrunde liegen.
Methoden und Durchführung
Im Rahmen der Immunogenitätsprüfung der beiden potentiellen Zielstrukturen
wurden GrB und IFNγ- ELISpot- Assays gegen die PLK1- und RPS14- Epitope
etabliert. ELISpot-Assays sind seit Langem als etablierte Tests zum Nachweis von
spezifischen T-Zell-Antworten gegen LAAs anerkannt [123, 128].
Da in der kaukasischen Bevölkerung HLA-A2 mit über 40% den häufigsten HLAGenotyp darstellt, wurden in der vorliegenden Arbeit ausschließlich HLA-A*0201
restringierte Peptide verwendet [143]. Durch diese Maßnahme sollte eine breitere
Anwendbarkeit der potentiellen peptidgerichteten Immuntherapie erreicht werden.
Vor Auswahl der Probanden- und der Patientenproben wurde daher stets eine
HLA- Typisierung durchgeführt.
Da die Patientenproben rar sind, wurde die T-Zell-Antwort auf die ausgewählten
Peptidepitope sowohl für PLK1, als auch für RPS14 zunächst an Blutproben 12
gesunder Probanden untersucht.
71
4. Diskussion
PLK1 als potentielle Targetsrtuktur der Immuntherapie
Bei der Untersuchung der PLK1- abgeleiteten Peptidepitope zeigten dabei 4 von
12 ELISpot- Assays (33,3%) eine deutlich über der Negativ-Kontrolle liegende
Spot-Zahl für das Peptid 2. Das Peptid 1 lag mit 3 von 12 positiven ELISpotAssays (25,0%) knapp darunter. Gegen die anderen getesteten Peptide konnte
keine relevante Häufigkeit von Immunantworten gezeigt werden. Da die Frequenz
niedriger liegt, als bei den am meisten etablierten Antigenen, wie z.B. RHAMM,
WT1 oder NPM1, welche ebenfalls von der Tumorimmunologie-Gruppe Ulm im
Rahmen der LAA- Forschung untersucht wurden, ist PLK1 von der Arbeitsgruppe
zunächst nicht weiter verfolgt worden [55, 120, 126, 156]. PLK1 ist als
Targetstruktur für die Tumortherapieforschung aufgrund der häufigen Expression
dieses Gens und der Bedeutung im Zellzyklus dennoch spannend und wird in
klinschen Studien mit PLK-Inhibitoren von der Industrie derzeit untersucht.
Möglicherweise eignen sich die in dieser Arbeit identifizierten Peptide gut für einen
polyvalenten Therapieansatz [157], bei dem neben den etablierten Epitopen von
WT-1, RHAMM, Proteinase 3, eben auch die beiden interessanten von PLK1abgeleiteten Epitope für eine derartige Immuntherapie verwendet werden könnten.
Hierzu werden derzeit von unserer Tumorimmunologiegruppe eine Reihe von
Vorarbeiten geleistet.
RPS14 als potentielle Targetstruktur der Immuntherapie
Bei der Untersuchung der beiden RPS14-abgeleiteten Peptide zeigten 6 von 12
ELISpot- Assays eine positive Antwort gegen das Peptid 1 (50,0%) und 3 von 12
gegen das Peptid 2 (25,0%).
Beide Peptidepitope wurden anschließend in 10 Assays mit 5q- und non-5q- MDSPatientenproben getestet. 9 davon waren auswertbar. Bei Patientenproben mit
einer
geringen
Lymphozytenanzahl
wurde
Peptid
1
bevorzugt,
da
es
vielversprechende Ergebnisse in den Versuchen mit den Proben gesunder
Probanden zeigte. Somit wurde Peptid 2 in nur 6 Versuchen mitgeführt. Es zeigte
sich jedoch, dass gerade das RPS14-abgeleitete Peptid 2 mit 3 von 6 positiven
GrB-Assays (50,0%) und 4 von 6 positiven IFNγ-Assays (66,6%) die höchste
Frequenz spezifischer Immunantworten in den ELISpot-Analysen mit Proben von
an 5q- und non-5q- Deletion-MDS erkrankten Patienten zeigte. Das Peptid 1 löste
in 3 von 3 GrB-Assays (33,3%) und in 5 von 9 IFNγ-Assays (55,5%) eine zelluläre
72
4. Diskussion
Immunreaktion aus. Damit könnte dieses Peptid ebenfalls als Kandidat für eine
Peptidvakzinierung in Betracht kommen. Interressanterweise konnte in den
Versuchen mit den Blutproben der 5q- MDS-Patienten eine spezifische
Immunantwort gegen Peptid 2 häufiger, als gegen das Peptid 1 beobachtet
werden.
Die längere Überlebensdauer der Patienten mit 5q- MDS, gemessen an der
Gesamtgruppe der MDS- Erkrankungen, lässt sich unter Umständen mit einer
besseren Kontrolle des Immunsystems, vielleicht auch durch eine Immunantwort
gegen RPS14 abgeleitete Epitope zurückführen. Zum Nachweis dieser Annahme
sind jedoch weitere Studien notwendig.
In vitro- und in vivo- Hinzunahme von Lenalidomid
Im Rahmen der Versuche mit den RPS14-abgeleiteten Peptiden wurde zusätzlich
noch die Auswirkung von Lenalidomid auf die zelluläre Immunantwort untersucht.
Lenalidomid ist ein Thalidomid-Analogon und hat seit einigen Jahren den
weltweiten Einzug in die Therapie einiger MDS- Formen eingehalten. Seine
Wirkung entfaltet sich vor allem bei MDS-Patienten mit einer 5q- Deletion. Der
Wirkmechanismus erstreckt sich von Inhibition des TNFα und IL-6 bis zur
Anregung zur Angiogenese, Erythropoese, sowie T- und NK- Zell- Stimulation
mittels Induktion von IL-2 und IFNγ Ausschüttung [86, 132]. Warum Lenalidomid
gerade bei Patienten mit dem 5q- Syndrom hervorragende Ergebnisse zeigt, ist
noch weitgehend unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun seine Wirkung auf
die T-Zell-Antwort näher untersucht werden. So wurden die Versuche mit den
Blutproben der 5q- und non 5q- MDS-Patienten mit und ohne Zusatz von
Lenalidomid durchgeführt. Aufgrund der bereits beschriebenen zellarmen
Blutproben konnten schließlich 4 Versuche mit 5q- MDS- und 4 mit non- 5q- MDSPatientenproben in die Auswertung eingehen. Dabei zeigte der in vitro Zusatz des
Immunmodulators bei nur zwei Patienten eine immunsteigernde Wirkung auf ein
Peptidepitop, und zwar das RPS14-1. Die Immunantwort auf die Positivkontrollen
wurde durch Lenalidomid ebenso häufig deutlich gesteigert wie unterdrückt. Von
den 4 Patienten, bei denen die Immunantwort auf die Positivkontrollen gesteigert
wurde, waren 3 aus der non-5q- MDS Gruppe, einer hatte das 5q- MDS.
Zusätzlich zu dem in vitro Effekt, konnte auch der in vivo Effekt untersucht werden.
Es konnten bei 4 Patienten Blutproben vor und nach einer Lenalidomidbehandlung
73
4. Diskussion
gewonnen
werden.
Bei
einem
Patienten
konnte
der
beobachtete
immunsupprimierende in vitro- Effekt nach der Lenalidomidbehandlung in
gesteigerter Form in vivo nachgewiesen werden. Bei einem anderen Patienten
verhielt es sich genau umgekehrt mit einer Immunantwortsteigerung. Bei den
übrigen 2 Patientenproben wurde sowohl in vitro, als auch in vivo weder eine
Steigerung, noch Verminderung der Immunantwort durch die Hinzunahme von
Lenalidomid
beobachtet. Leider war es nicht möglich Blutproben von mehr
Patienten zu gewinnen, die in vitro positiv auf den Immunmodulator reagiert
haben, um den in vivo- Effekt bei diesen Patienten zu untersuchen. Dies liegt zum
einen daran, dass Lenalidomid ein relativ neues Medikament ist und nicht in die
Behandlung eines jeden 5q- MDS- Patienten eingeht und noch nicht zugelassen
ist, und zum anderen an der seltenen Entität der Erkrankung.
In diesen Versuchen konnte ein Zusammenhang zwischen Lenalidomid und der TZell-vermittelten Immunantwort gezeigt werden. Da sich der Zusatz des
Immunmodulators teils immunstimulierend, teils immunsupprimierend in den
einzelnen Versuchen zeigte, ist anzunehmen, dass weitere Faktoren bei der
Reaktionskaskade eine Rolle spielen. Es ist weiterhin nicht auszuschließen, dass
Lenalidomid in vitro auch zytotoxisch wirken kann und daher in einigen Fällen zur
Abnahme der Immunantwort führte. Die Blutproben der Patienten, die sich der
Therapie unterzogen haben, wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der
Therapie entnommen und somit bleibt offen, ob der Zeitpunkt der Entnahme nicht
ebenfalls einen Einfluss auf das Ergebnis hatte.
Eine weitere Hypothese wäre die Korrelation der Lenalidomidwirkung auf die
Immunantwort auf zellulärer Ebene mit der Klinik des jeweiligen Patienten, da bei
einer Patientin, deren CD8+-T-Zellen durch die Lenalidomidzugabe im Versuch
supprimiert wurden auch klinisch unter Lenalidomid eine Verschlechterung
beobachtet werden konnte. Weitere Untersuchungen dieser Ergebnisse mit
höherer Testzahl sind erstrebenswert.
74
5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war die Identifikation neuer immunogener Antigenstrukturen der
Akuten Myeloischen Leukämie (AML) und des Myelodysplastischen Syndroms
(MDS), die immunologische anti-leukämische Effekte induzieren und zur Kontrolle
der minimalen Resterkrankung (MRD) beitragen könnten. Zur Identifizierung
möglicher immunogener Zielstrukturen bei der AML testeten wir vier polo-likekinase 1 (PLK1)- abgeleitete Peptidpitope. Bei MDS Patienten mit oder ohne
Deletion am q-Arm des Chromosom 5 untersuchten wir Peptide, die von ribosomal
protein s14 (RPS14) abgeleitet wurden. Darüber hinaus untersuchten wir den
Einfluss der immunmodulatorischen Substanz Lenalidomid auf die T-Zellvermittelte Immunantwort bei MDS Patienten in Kombination mit diesen Peptiden.
Zielstrukturen, wie PLK1 oder RPS14 erscheinen deshalb als interessante
Targetstrukturen, da sie in wichtige Mechanismen der Pathogenese der beiden
Erkrankungen involviert sind. Die Immunantworten wurden mittels enzyme-linked
immunospot (ELISpot)- Assays quantifiziert. Bei den Versuchen mit den PLK1Peptiden fanden sich am häufigsten Immunantworten gegen das Peptid 2 (4/12)
und Peptid 1 (3/12). Somit fanden wir zwar Immunantworten gegen PLK1, die
Frequenzen liegen allerdings niedriger, als bei den wichtigsten bislang bei der
AML bekannten immunogenen Antigenen, wie RHAMM, WT-1, Proteinase 3 oder
Survivin.
Gegen Peptide, die von RPS14 abgeleitet wurden, identifizierten wir ebenfalls
positive (wenn auch nicht hoch-titrige) spezifische Immunantworten. Bei gesunden
Probanden fanden wir dabei häufiger Immunantworten gegen Peptid 1 (6/12) im
Vergleich zu Peptid 2 (3/12). Bei MDS Patienten war die Frequenz spezifischer TZell-Antworten gegen Peptid 2 höher, als gegen Peptid 1 (3/6 vs. 3/9 für
Granzyme B und 4/6 vs. 5/9 für Interferon γ). Die Frequenz der positiven
Immunantworten war bei 5q- MDS Patienten im Vergleich zu non-5q- MDS
Patienten nicht signifikant unterschiedlich. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptid
2 ein interessanter Kandidat für eine Immuntherapie sein könnte.
In-vitro konnten wir bei Hinzunahme von Lenalidomid in den ELISpot-Assays bei
Proben von MDS-Patienten nur bei 4 Patienten eine Zunahme der Immunantwort
auf die Positivkontrolle und nur bei 2 Patienten auf ein untersuchtes Peptid –
RPS14-1 feststellen. Da Lenalidomid in vitro auch zytotoxisch wirken kann,
75
5. Zusammenfassung
untersuchten wir auch Blutproben von Patienten vor und nach Einnahme von
Lenalidomid. An diese Proben zu kommen ist jedoch schwierig, da dieses
Medikament für diese Indikation noch nicht zugelassen ist. Dennoch konnten wir
Proben von 4 Patienten vor und nach Einnahme von Lenalidomid analysieren. Nur
1 Patient zeigte dabei eine Zunahme der Immunantwort. Die LenalidomidWirkung scheint nicht über eine immunstimulatorische Wirkung gegen RSP14
Peptid
induziert
zu
sein,
hier
spielen
andere
Targetstrukturen
oder
Immunmechanismen eine Rolle. Allerdings sollte diese Fragestellung in einer
größeren Zahl von Proben untersucht werden, die nur im Rahmen einer
kontrollierten Studie gewonnen werden können.
In der vorliegenden Arbeit konnten wir neue immunogene Zielstrukturen von PLK1
und RPS14 identifizieren, die für eine Immuntherapie bei AML und MDS Patienten
in Frage kommen.
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99
Danksagung
Danksagung
Zuallererst möchte ich mich bei Prof. Dr. med. H. Döhner bedanken, der Recht
behielt, als er mir eines Tages sagte, ich würde schon noch zur Vernunft kommen
und meine Dissertation in seiner Abteilung schreiben.
Und so geschah es. Teils durch Zufall, teils wohl durch diese Worte ermuntert
wechselte ich meine Doktorandenstelle in die Abteilung der Hämatologie- und
Onkologie der Universität Ulm und habe es nicht bereut.
Mein Doktorvater Professor J. Greiner leitete mich in den folgenden Jahren
unermüdlich, geduldig und stets gut gelaunt durch das Labyrinth der
Tumorimmunologie. Ohne seine konstruktive Kritik und ohne der unzähligen
Stunden seiner Zeit ( begleitet von mindestens genausovielen Tassen Kaffe ) in
denen wir an Details feilten, Theorien erstellten und sie wieder verwarfen,
Möglichkeiten erwogen, Lösungsvorschläge entwarfen und einfach nur über Gott
und die Welt philosophierten, hätte ich das Licht am Ende der Doktorarbeit wohl
niemals erblickt. Dafür möchte ich mich von Herzen bedanken!
Der nächste große Dank gebührt Frau Marlies Götz. Nur mit ihrer erstklassigen
Betreuung und der Step-by-step Einweihung in die Labor-Geheimnisse ist es mir
gelungen als Frischling auf einem vollkommen neuen Gebiet Fuß zu fassen und
zu wachsen. Ob Probleme mit dem Brutschrank, mit den Quellenangaben oder mit
PowerPoint – Marlies hat immer eine Lösung und ich fühlte mich in Ihrer schlauen
Welt immer willkommen. Großes Merci auch an Cornelia Herbst für die geduldigen
Orientierungshilfen im Labor und an Vanessa Schneider, Adrian Hack und
Johannes Broschewitz für die gemeinsamen Schlachten gegen Kühlräume,
Computerprogramme, widerspenstige Zellkulturen und Stunden des Wartens auf
die Blocklösung oder die Zentrifuge. Es war immer schön mit euch!
Für die kostenlose Rund-um-die-Uhr-Sorgenhotline danke ich Johanna Färbinger,
Dr. med. Melanie Kilzheimer, Alexandra Kahn und Ise Töpper. Sie haben ohne
Murren mit an ein Wunder grenzender Geduld alle meine wissenschaftlichwertvollen und weniger wertvollen Sorgen ertragen und ihnen aktive Sterbehilfe
geleistet.
Danke
auch
an
Carmen
Kremmler,
die
mit
ihren
Augen
Buchstabendreher gefunden hat, die mein Gehirn nicht mehr wahrnehmen konnte.
Last but not least danke ich meiner Familie, die mich mit allen meinen Launen
ertragen und mich durch Dick und Dünn begleitet hat, mir Rückendeckung und
Rückenwind
gab.
Ohne
euch
drei
gäbe
es
diese
Dissertation
nicht.
100
Curriculum Vitae
Curriculum Vitae
Persönliche Daten
Name:
Daria Ushmorova
Geburtsdatum, -ort:
1986 in Nowo-Dewjatkino, Kreis St. Petersburg,
Russland
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulischer Werdegang
09/1993 – 05/1997
Gymnasium Nr. 74, St. Petersburg, Russland
05/1997 – 11/1999
Bunsengymnasium, Heidelberg
11/1999 – 07/2005
Hans- und Sophie Scholl Gymnasium, Ulm
07/2005
Schulabschluss: Abitur
Hochschulbildung
10/2005 – 10/2012
Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm,
Universität Bern und der Université des Antilles et de la
Guyane
04/2008
Erstes Staatsexamen der Humanmedizin
10/2012
Abschluss des Studiums mit dem zweiten
Staatsexamen der Humanmedizin
11/2012
Approbation als Ärztin
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