Identifizierung neuer immunogener Zielstrukturen bei malignen
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Universitätsklinikum Ulm Klinik für Innere Medizin III Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hartmut Döhner Identifizierung neuer immunogener Zielstrukturen bei malignen myeloischen Erkrankungen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Vorgelegt von Daria Ushmorova geb. in Nowo-Dewjatkino, Russland 2013 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Jochen Greiner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Michael Schmitt Tag der Promotion: 25. Oktober 2013 II INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 1.1 Akute myeloische Leukämie...........................................................................1 1.1.1 Definition und Einteilung............................................................................1 1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie; PLK1 als klinischer Marker..........................3 1.1.3 Klinischer Verlauf und Diagnose................................................................4 1.1.4 Prognose und Therapie.............................................................................5 1.2 Myelodysplastisches Syndrom.......................................................................6 1.2.1 Definition und Einteilung............................................................................6 1.2.2 Epidemiologie und Ätiologie.......................................................................8 1.2.3 Klinischer Verlauf und Diagnose................................................................9 1.2.4 Prognose und Therapie............................................................................10 1.2.5 5q- Syndrom.............................................................................................13 1.3 Identifizierung Leukämieassoziierter Antigene............................................17 1.4 Immuntherapie bei malignen hämatologischen Erkrankungen..................20 1.5 Zielsetzung.......................................................................................................23 2. MATERIAL UND METHODEN 24 2.1 MATERIAL.......................................................................................................24 2.1.1 Allgemeine Laborgeräte..........................................................................24 2.1.2 Plastikwaren............................................................................................25 2.1.3 Chemikalien.............................................................................................26 2.1.4 Spezielle Chemikalien.............................................................................26 2.1.5 Puffer.......................................................................................................27 2.1.6 Ziellinien, Antikörper und Zytokine..........................................................28 2.1.7 Zellkulturmedien......................................................................................30 2.1.8 Peptide....................................................................................................30 2.1.9 Blutproben...............................................................................................31 2.2 METHODEN.....................................................................................................32 2.2.1 Anlage und Kultur von T2-Zellen.............................................................32 2.2.2 Probengewinnung...................................................................................32 III 2.2.3 Zellisolation/ Ficoll..................................................................................33 2.2.4 Typisierung der HLA- Oberflächenantigene mittels FACS- Analyse......34 2.2.5 Isolation der PBMC-Fraktion und die Durchführung der „Mixed Lymphocyte Peptide Culture“ MLPC .....................................................36 2.2.6 Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten mittels ELISpot-Essay............39 2.2.7 Statistik...................................................................................................45 3. ERGEBNISSE 46 3.1 HLA- Typisierung...........................................................................................46 3.2 Peptidepitop-Identifikation mittels SYFPEITHY und BIMAS......................47 3.3 Untersuchung der Immunogenität der PLK1...............................................49 3.3.1 Auswahl der Peptidsequenzen..............................................................49 3.3.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen PLK1............................49 3.3.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen PLK1.............................51 3.3.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen PLK1- Epitope bei gesunden Probanden..............................................................................................52 3.4 Untersuchung der Immunogenität des RPS14............................................53 3.4.1 Auswahl der Peptidsequenzen...............................................................53 3.4.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen RPS14...........................54 3.4.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen RPS14...........................55 3.4.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen RPS14- abgeleitete Peptidepitope bei gesunden Probanden................................................56 3.5 Zelluläre Immunantwort gegen RPS14 beim Patientenkollektiv; zusätzlich Lenalidomidzugabe.....................................................................57 3.5.1 Immunogenität der beiden RPS14- abgeleiteten Peptide......................57 3.5.2 In vitro Effekt von Lenalidomid...............................................................59 3.5.3 In vivo Effekt von Lenalidomid................................................................67 4. DISKUSSION 71 5. ZUSAMMENFASSUNG 75 6. LITERATURVERZEICHNIS 77 IV ABKÜRZUNGSVERUEICHNIS µl Mikroliter µM Mikromolar allo-SCT allogene Blutstammzelltransplantation AML akute myeloische Leukämie APC Antigepräsentierende Zelle BAGE B Melanoma Antigen BCL2 B-cell lymphoma 2 BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat β2-MG β2-Mikroglobulin c-KIT ein Stammzellfaktor-Rezeptor aus der Familie der RezeptorTyrosinkinasen CA Karzinom CD cluster of differentiation CDR chromosomal deleted region CEBPA CCAAT/enchancer bilding protein alpha CG-AG cancer-germline antigene CLL chronische lymphatische Leukämie CML chronische myeloische Leukämie CMV Aminosäurenonamer des CMVpp65-Peptid, Position 495-503 CTL zytotoxische T-Lymphozyten dl Deciliter DMSO Dimethylsulfoxid DNMT3A DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A DRK Deutsches Rotes Kreuz EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELISpot enzyme-linked Immunospot Fa. Firma FAB French-American-British FACS Fluorescence Activated Cell Sorting Durchflusszytometrie) FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum) V (Fluoreszenz- FITC Fluoresceinisothiocyanat FLT3-ITD FMS-like tyrosine kinase 3- interne Tandemduplication G-CSF Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor GvL Graft versus Leukemia GrB Granzyme B Gy Gray HCMV humanes Zytomegalievirus HLA humanes Leukozytenantigen HPLC High Performance Liquid Chromatograph HSP 70 ein Zellwachstum regulierendes Gen aus der Chaperonenfamilie hTERT human telomerase reverse transcriptase HV healthy volunteer (gesunder Proband) IDH 1/2 Isocitrate dehydrogenase 1/2 Ig Immunglobulin IL Interleukin IMP Aminosäurenonamer des Influenza-A Matrixprotein an Position 58-66 IPSS International Prognostic Scoring System IFNγ Interferon Gamma JÜR Jahres-Überlebensrate l Liter LAA Leukämieassoziierte Antigene LAK-Zellen Lymphokin-aktivierte Killerzellen MACS magnetic-activated cell sorting MCV minimal corpuscular volume MDS Myelodysplastisches Syndrom mg Milligramm ml Milliliter mM Millimolar MHC major histocompatibility complex MLC megalencephalic leukoencephalopathy MLPC mixed lymphocyte peptide culture (gemischte LymphozytenPeptid-Kultur) VI MPP11 ein Zellwachstum regulierendes Gen aus Chaperonenfamilie MRD Minimale Resterkrankung N-RAS neuroblastoma-RAS NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid NK-Zellen natürliche Killerzellen NPM1 Nucleophosmin 1 OFA-iLRP oncofetal antigen immature laminin receptor protein PBMC Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PLK1 polo-like kinase 1 PRAME Melanoma antigen preferentially expressed in tumors RA refraktäre Anämie RAEB refraktäre Anämie mit Exzess von Blasten RAEB-T refraktäre Anämie mit Blastenexcess in Transformation RARS refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten RAS rat sarcoma-gene RHAMM receptor for hyaluronan-mediated motility RPS14 ribosomal protein s14 RUNX1 Runt-related transcription factor 1 SEREX serologisches screening von rekombinanten cDNAExpressionsbanken Sh-RNA short hairpin RNA SZT Stammzellentransplantation TAA Tumorassoziierte Antigene TET2 eine Methylcytosin-Dioxygenase TKI Tyrosinkinase-Inhibitior TNFα Tumor Nekrosefaktor alpha TP53 Tumorprotein 53 UE Untereinheit w well (engl. Zelle/ Plattenmulde) WHO Weltgesundheits-Organisation WT1 Wilms-tumor 1 -GEN VII der 1. Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1 Akute Myeloische Leukämie (AML) 1.1.1 Definition und Einteilung Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne hämatologische Erkrankung, die durch Entartung der hämatopoetischen Vorläuferzellen der myeloischen Zellreihe gekennzeichnet ist. Es kommt zu Reifungs- und Differenzierungsstörung von Erythrozyten, Granulozyten, Monozyten und Megakaryozyten. Kommt es zu einer klonalen Proliferation des entsprechenden unreifen Zellklons, werden zum einen gesunde Blutzellen verdrängt, was zu einer hämatopoetischen Insuffizienz führt, zum anderen kommt es zu einer Streuung des malignen Zellklons ins Blut und in die blutbildenden Organe. Typische Folgen sind Anämie, Granulozytopenie und Thrombozytopenie. Eine Leukozytose ist nicht obligat [94]. Die Klassifizierung der AML hat sich gemeinsam mit der des Myelodysplastischen Syndroms (MDS) entwickelt. Die veraltete French-American-British classification (FAB- Klassifikation) wurde auch hier von der Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO-), welche nun zytogenetische und klinische Kriterien zur Unterteilung der AML heranzog, weitestgehend abgelöst. Zuletzt wurde diese Klassifikation 2008 überarbeitet (Tabelle 1) [23, 152]. Neu hinzugekommen ist unter anderem die vorläufige Einteilung der AML mit Mutationen im Nucleophosmin 1- (NPM1) oder CCAAT/ enhancer binding protein alpha (CEBPA)- Gen in eine eigenständige provisorische Gruppe. 1 1. Einleitung Tab. 1: World Health Organisation - Klassifikation der Akuten Myeloischen Leukämie [152] AML mit spezifischen zytogenetischen Translokationen Transkript AML mit t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1 AML mit inv(16)(p13.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22) CBFB-MYH11 AML mit t(15;17)(q22;q12) PML-RARA AML mit t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL AML mit t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214 AML mit inv(3)(q21q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2) RPN1-EVI1 AML mit t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1 AML mit NPM1-Mutation* Exon 12 AML mit CEBPA-Mutation* AML mit myelodysplasie-assoziierten Änderungen MDS in der Vorgeschichte MDS-assoziierte zytogenetische Aberration Multilineäre Dysplasie Therapie-assoziierte myeloide Neoplasie AML, nicht anderweitig klassifiziert AML mit minimaler Differenzierung AML ohne Ausreifung AML mit Ausreifung Akute myelomonozytäre Leukämie Akute monoblastische/monozytäre Leukämie Akute Erythroleukämie Akute megakaryoblastische Leukämie Akute Basophilenleukämie Akute Panmyelose mit Myelofibrose Myeloisches Sarkom Myeloische Proliferationen, assoziert mit Trisomie 21 Blastische plasmozytoide Neoplasie der dendritischen Zellen * vorläufig als eigene Entität aufgenommen AML: Akute Myeloische Leukämi; MDS: Myelodysplastisches Syndrom 2 1. Einleitung 1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie; polo-like-kinase1 (PLK1) als klinischer Marker Die AML ist eine relativ seltene Erkrankung, die Inzidenz liegt bei 2,4/100 000 pro Jahr. Mit dem Alter steigt die Inzidenz jedoch kontinuierlich an. Bei über 65jährigen liegt sie bereits bei knapp 12,6/100 000 pro Jahr [94]. Das mittlere Erkrankungsalter liegt dementsprechend bei etwa 70 Jahren [30, 33]. Für die Entstehung der AML sind, neben dem Alter der Patienten, verschiedene Risikofaktoren bekannt. Eine durch Zigarettenrauch bedingte Benzolexposition erhöht das Risiko, an einer AML zu erkranken und erniedrigt die mittlere Überlebensdauer der Patienten [151, 164]. Das Risiko steigt bei einer sonstigen Exposition mit Benzol, ebenso wie nach Exposition mit ionisierenden Strahlen, Pestiziden oder organischen Lösungsmitteln [3, 71, 73, 96, 97]. Chemotherapie mit Alkylantien oder Topoisomerase II-Inhibitoren ist als weiterer Risikofaktor bekannt [67]. Eine AML entwickelt sich zudem häufig sekundär aus einem MDS oder anderen hämatologischen Erkrankungen [152]. Auch bei Patienten mit Trisomie 21 wird gehäuft die Entstehung dieser Erkrankung beobachtet [21, 82]. Man vermutet, dass chromosomale Instabilitäten hierfür verantwortlich sind. PLK1 Es gibt viele molekulare Schlüsselereignisse, die zur Kanzerogenese führen können. Dazu gehören gesteigerte Angiogenese, aberrante Signaltransduktion und fehlregulierter Zellzyklus. Die Polo-like-Kinase1 (PLK1) aus der Familie der Serin/Threonin Kinasen gehört zu den Zellzyklus-kontrollierenden Kinasen, welche in die Mechanismen der Centrosomenreifung und Chromosomen-Segregation involviert sind. Sie sind außerdem essentiell für die Zellantwort auf DNA-Schäden und für den Übergang des Zellzyklus von der G2- in die M-Phase [65]. Die Überexpression der PLK1 ist stark assoziiert mit verschiedenen humanen Krebsarten, wie z. B. Blasen-CA [166], bestimmten Arten des Mamma-CA [134, 135, 163], Colorectalem-CA [140, 160], Endometrium-CA [141, 144], ÖsophagusCA [22, 38], Magen-CA [77, 78, 88], Gliomen [29], Hepatoblastomen [165], Hepatozellulärem-CA [99], Melanomen [84, 139], NSCLC [93], Ovarial-CA [159], Pankreas-CA [50, 162], Prostata-CA [161], Non-Hodgkin Lymphomen [98], sowie verschiedenen Leukämieformen und speziell auch AML [14, 119]. Damit 3 1. Einleitung qualifiziert sich die PLK1, als potentielles tumor-assoziiertes Antigen. Es gibt schon länger Arbeiten und Forschungen mit Polo-like-Kinase-Inhibitoren. Diese werden derzeit in klinischen Studien geprüft. In dieser Arbeit wurde mittels 8 TageMLPC und ELISpot-Verfahren an Blutproben gesunder Probanden untersucht, ob die PLK1 für tumorimmunologische Behandlungsansätze als Zielstruktur in Frage käme. 1.1.3 Klinischer Verlauf und Diagnose Die klinischen Erscheinungsformen und Symptome der AML sind vielfältig und nur wenig spezifisch, aber sie sind häufig konform mit der Infiltration des Knochenmarkes und der daraus resultierenden Zytopenie. Wie auch bei dem MDS stellen sich die Patienten typischerweise beim Arzt vor mit Symptomen wie chronischer Müdigkeit, Hämorrhagien oder häufigen, von Fieber begleiteten Infekten, verursacht durch die schwindende Anzahl roter Blutzellen, Blutplättchen oder Leukozyten. Üblich sind auch Blässe und Dyspnoe bei Anstrengung. Eine große Bandbreite weiterer Symptome kann durch die Infiltration der malignen Zellen in verschiedene Gewebe und Organe verursacht werden, wie z.B. Leber mit Hepathomegalie, die Milz mit Splenomegalie, die Haut mit „leukemia cutis“, die Lymphknoten mit Lymphadenopathien, die Knochen, begleitet von Knochenschmerzen, das Zahnfleisch und das Zentrale Nervensystem. Zudem können isolierte Ansammlungen leukämischer Blasten in Form von granulozytären Sarkomen vorkommen. Hyperleukozytose (ab 100.000 Leukozyten/mmÚ) kann zu Leukostase führen. Die Folgen davon sind okuläre und cerebrovasculäre Dysfunktionen oder Blutungen [94]. Den Kern der Diagnostik bildet, wie bei anderen myeloproliferativen Erkrankungen auch, primär die Probengewinnung aus dem peripheren Blut und aus dem Knochenmark. Aus diesen Proben kann man mittels morphologischer, zytochemischer und immunphänotypischer Untersuchungen die Abstammung der neoplastischen Zellen definieren und beurteilen inwiefern diese Zellen zur Ausdifferenzierung im Stande sind. Der Prozentanteil an Blasten bleibt dabei ein praktisches Tool, um die myeloide Neoplasie zu charakterisieren und das Stadium der Erkrankung bzw. ihr Fortschreiten zu beurteilen. Laut WHO-Schema spricht 4 1. Einleitung ein Blastenanteil von 20% im peripheren Blut oder Knochenmark für das Vorliegen einer AML. Es gibt jedoch auch Fälle, die mit spezifischen genetischen Mutationen zusammenhängen, bei denen die AML- Diagnose ohne Bezug auf den Blastenanteil gestellt werden muss. Der Blastenanteil von 20% ist also kein absolutes Kriterium, um die AML-Therapie zu starten [30]. Die therapeutische Entscheidung muss stets an der klinischen Situation orientiert sein und alle Untersuchungsergebnisse berücksichtigen [33]. 1.1.4 Prognose und Therapie Der Genotyp ist neben dem Alter der Patienten ein entscheidender prognostischer Faktor für das Erreichen einer kompletten Remission, sowie für das krankheitsfreie- und das Gesamt-Überleben [33]. In den letzten Jahren sind bei der AML eine Reihe von Mutationen identifiziert worden, u.a. in den Genen FLT3, NPM1, CEBPA, N-RAS, c-KIT, MLL, RUNX1, IDH 1/2, DNMT3A, TP53 and TET2 [30, 42, 110, 124, 145, 156]. Anhand dieser und weiterer zytogenetischer und molekulargenetischer Marker wird die AML in verschiedene Risikogruppen eingeteilt [30]. In Abhängigkeit dieser Risikostratifikation wird eine Therapieentscheidung getroffen. Hierbei kommen kurative Therapieverfahren mit intensiver Chemotherapie und/oder allogener Stammzellentransplantation (alloSCT), sowie die Hinzunahme von zielgerichteter Therapie mit ThyrosinkinaseInhibitoren (TKI) in Betracht. Bei Patienten, bei denen keine intensive Therapie durchgeführt werden kann, wird eine palliative zytoreduktive Therapie angestrebt. In der Mehrzahl der Fälle persistieren maligne Zellen jedoch auch nach intensivierter Therapie. Trotz primärem Erreichen einer hämatologischen Remission kommt es zu einem Rezidiv, die 5-Jahresüberlebensrate liegt daher bei ca. 15-30% aller Patienten mit AML [112, 142]. Ein frühes Rezidiv ist prognostisch ungünstig. Diese Zellen einer minimalen Resterkrankung (MRD) können mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesen werden [80]. Problematisch bleibt also die Therapie der Patienten mit MRD, einem Rezidiv oder einer primär Chemotherapie-refraktären AML, besonders bei älteren Patienten, die für eine intensive Chemotherapie oder für eine Stammzelltransplantation nicht in Frage 5 1. Einleitung kommen. Für diese Patienten ist aufgrund der schlechten Prognose die Entwicklung neuer und/oder komplementärer Therapiekonzepte notwendig. 1.2 Myelodysplastisches Syndrom 1.2.1 Definition und Einleitung Das myelodysplastische Syndrom (MDS) umfasst eine heterogene Gruppe erworbener, klonaler Neoplasien des Knochenmarks. Das Krankheitsbild ist durch qualitative und quantitative Veränderungen der Hämatopoese charakterisiert, was, analog zu der AML, auf eine gestörte Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen der myeloischen Zellreihe zurückzuführen ist. Die klonale Vermehrung der entarteten Zellen verdrängt das Knochenmark, als Folge kommt es zu Dysplasien einer oder aller drei Zellreihen und im Regelfall auch zu verminderter Zahl peripherer Blutzellen. Das MDS birgt, je nach Ätiologie, außerdem ein erhöhtes Risiko in eine AML zu transformieren und wird daher auch als präleukämische Form bezeichnet [146]. Die Klassifizierung der MDS hat sich über die Jahre stark weiterentwickelt. Die 1976 von der French-American-British (FAB) -Gruppe vorgeschlagene Klassifikation unterschied nur zwei Kategorien der sog. dysmyelopoetischen Syndrome [11]. Im Jahr 1982 wurde sie nochmals überarbeitet. Basierte sie früher auf zytomorphologischen und laborchemischen Kriterien, wie dem medullären und peripheren Blastenanteil, sowie der Monozytenzahl im Blut, so kamen nun 5 neue Subkategorien des MDS hinzu: refraktäre Anämie (RA), refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten (RARS), refraktäre Anämie mit Blastenexzess (RAEB) und die refraktäre Anämie mit Blastenexzess in Transformation (RAEB-T) [10]. Bereits Anfang der 1990er Jahre wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) eine neue Klassifikation vorgeschlagen und 2001 überarbeitet, welche nun auch molekular- und zytogenetische, sowie klinische Kriterien zur Unterteilung des MDS heranzog [152]. 2008 wurde diese Klassifikation erneut überarbeitet und aktualisiert (Tabelle 2). 6 1. Einleitung Tab. 2: World Health Organization - Klassifikation der Myelodysplastischen Syndrome [152] Kategorie Abkür periphä Sonstige KM- zung re Blutbefunde Blasten Uni- < 5% Sonstige KM-Befunde Sonstige Befunde Blasten Refraktäre Zytopenie mit RCDU < 1% Unilineären oder Bizytopenie Dysplasien Unilineäre Dysplasien kein >10% der Zellen einer Zellreihe, del(5q) <15% Ringsideroblasten a)Refraktäre mit Anämie RA Unilineären Dysplasien b)Refraktäre RT Thrombozytopenie mit Unilineären Dysplasien c)Refraktäre RN Neutropenie mit Unilineären Dysplasien Refraktäre Anämie mit RARS 0% Uni- Ringsidero- oder < 5% Bizytopenie Dyserythropoiese kein >15% Ringsideroblasten del(5q) blasten Refraktäre mit Zytopenie RCMD < 1% Multilineären Dysplasien Zytopenie, < 5% keine >10% der Zellen in 2-3 Linien Auerstäbchen, keine Monozyten Ringsidero- <1000/µl MDS mit del(5q) MDS < 1% Dysplasien Uni- Auerstäbchen + 15% blasten oder < 5% Normale oder vermehrte mit Bizytopenie, Megakaryo- del(5q oft zyten, keine Auerstäbchen ) Thrombozytos Isolierte del(5q) e Refraktäre Anämie mit RAEB Blastenexzess I I < 5% Refraktäre Anämie mit RAEB Blastenexzess II II Unklassifizierte MDS MDS- < U 1% Zytopenie, < 10% keine < 20% Auerstäbchen, Uni- oder Multilineäre Dysplasien, keine Auerstäbchen < 20% Monozyten <1000/µl a)RCUD oder RCMD 1%- Monozyten <1000/µl < 5% RCUD oder RCMD mit 1% kein peripheren Blasten del(5q) RCUD mit Panzytopenie mit 1% Blasten b)RCUD mit Panzytopenie Dysplasien in <10% der Zellen einer Zellreihe, aber zytogenetisch klonaler Befund c) MDS-U <10% Dysplastische Zellen, aber Zytogenetisch typischer MDS Befund KM: Knochenmark 7 1. Einleitung 1.2.2 Epidemiologie und Ätiologie Myelodysplastische Syndrome können Personen jeden Alters betreffen, Kinder nicht ausgenommen [20, 64]. Tatsache ist jedoch, dass das Risiko MDS zu entwickeln mit höherem Lebensalter ansteigt, da das Knochenmark älterer Personen besonders vulnerabel ist. Die geschätzte Inzidenzrate liegt bei unter einem Erkrankten pro 100.000 bei den unter 50-jährigen und ca. 2 pro 100.000 bei den 50- bis 60-jährigen pro Jahr. Ab dem Alter von 60 Jahren steigt die Inzidenzrate jedoch signifikant an auf ca. 8 Erkrankte pro 100.000 bei den 60- bis 70-jährigen und über 20 Erkrankte pro 100.000 bei den über 70 jährigen [121]. In über 90% der Fälle des diagnostizierten MDS handelt es sich um das sog. primäre MDS, dessen Ätiologie unklar ist. Circa die Hälfte der Patienten weist hierbei zytogenetische Aberrationen auf [114]. Bei dem sekundären MDS, das die übrigen 10% ausmacht, haben über 85% der Patienten zytogenetische Aberrationen [108]. Der überwiegende Großteil dieser Anomalien betrifft die Deletion des langen Arms der Chromosomen 5 und/oder 7, darüber hinaus können auch die Chromosome 8 und/oder 20 betroffen sein oder es können komplexe Aberrationen, die bis zu 3 Chromosome betreffen, vorkommen [113]. Diese Aberrationen sind bei dem sekundären MDS durch verschiedene mögliche vorausgegangene Ereignisse induziert. Zytostatikatherapien, v.a. durch Alkylantien, Topoisomerase II- Inhibitoren, Cisplatin, Fludarabin, Azathioprin und andere, stellen insbesondere ein Risiko für die Entstehung eines MDS oder einer AML dar. Auch Patienten, die chemischen Einflüssen am Arbeitsplatz oder in ihrer Umwelt ausgesetzt waren, z.B. Pestiziden, Benzol oder physikalischen Einflüssen, v.a. in Form einer Radiatio, sind hiervon betroffen [19, 41, 83, 85]. Der Begriff Dysplasie ist nicht spezifisch für das MDS, da sogenannte mono- oder multilineäre sekundäre Dysplasien auch bei der megaloblastären Anämie, der kongenitalen dyserythropoetischen Anämie und bei der Exposition mit Arsen, Alkohol, dem Parvovirus B19 oder HIV entstehen können [92]. Es wird angenommen, dass die Ausprägung des MDS – Phänotyps zusätzlich durch sekundäre Mutationen, genetischer Haploinsuffizienz und epigenetischen Veränderungen bestimmt wird, was zu Veränderungen der Zytokinausschüttung, der Immunantwort und des Knochenmark-Stromas führt [146]. 8 1. Einleitung 1.2.3 Klinischer Verlauf und Diagnose Die am MDS erkrankten Patienten stellen sich beim Arzt häufig mit Symptomen vor, die eine hämatologische Erkrankung vermuten lassen. Dazu zählen Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Blässe, rezidivierende Infektionen, vermehrte blaue Flecken oder Blutungen. Auf diese Anzeichen sollte eine ausführliche Blutuntersuchung folgen. Die individuelle Symptomatik kann sehr unterschiedlich sein. Es kommt stark darauf an, welche der drei Zelllinien betroffen ist bzw. sind. Alternativ kann es zur Diagnostizierung von MDS aber auch bei asymptomatischen Patienten während einer ärztlichen Untersuchung auf andere Erkrankungen oder bei einer Routineuntersuchung kommen [92]. Am häufigsten ist die erythropoetische Zelllinie betroffen. So sind 80% bis 85% aller MDS-Patienten anämisch bei der Erstdiagnose. Mehr als die Hälfte davon haben einen Hb-Level von unter 10 g/dL [40]. In diesem Fall dominieren symptomatisch Blässe, Abgeschlagenheit, Tachykardie und Hypotension. Kardiale oder respiratorische Vorerkrankungen können sich verschlimmern. Ist die Thrombopoese betroffen, so suchen die Patienten den Arzt meist wegen Petechien, häufigen Nasen- und Zahnfleischblutungen, sowie blauen Flecken auf. Wiederkehrende Infektionen und komplizierte Verläufe banaler Infekte weisen eher auf Leukozytopenie hin. Weitere unspezifische Befunde eines MDS können eine Splenomegalie oder Lymphadenopathie sein [8]. Valent et al. veröffentlichte 2007 die Mindestkriterien für die Diagnose MDS. Diese beinhalten eine refraktäre Zytopenie über 2-6 Monate unter Ausschluss der Differentialdiagnosen, die gleichzeitig mit dysplastischen Veränderungen in mindestens 10% der Zellen mindestens einer hämatopoetischen Zellinie einhergeht [147]. Im klinischen Alltag spricht man von einem Verdacht auf MDS wenn eine nicht anders erklärbare Anämie mit anderen Zytopenien, einem erhöhten MCV (mean corpuscular volume) oder einem erhöhten Erythrozytenumsatz einhergeht. Der absolute Goldstandard zur Diagnostik des MDS ist nach wie vor die Zytologie und Biopsie des Knochenmarks [51,153]. In der zytologischen Untersuchung, nach einer Färbung nach Pappenheim, kann man das Bild einer Blutbildungsstörung beobachten mit abnorm lokalisierten, unreifen Vorstufen. Im Ausstrich des peripheren Blutes zeigen sich ovale Makrozyten, eine dysmorphe Erythrozytenpopulation und/oder hyposegmentierte, hypogranulierte Neutrophile. 9 1. Einleitung Sind > 10% der myeloischen Zellen in einer Zellreihe dysplastisch und zeigen unterschiedliche Differenzierungsgrade, spricht man laut der WHO- Klassifikationvon von einem MDS [152], wobei eine oder mehrere Zellreihen im peripheren Blutausstrich oder im Knochenmark betroffen sein können. Das Knochenmark ist typischerweise hyperzellulär, wobei 1/5 der Fälle hypozellulär erscheinen können und differenzialdiagnostisch an eine aplastische Anämie gedacht werden muss. Ab einem medullären oder peripheren Blastenanteil von über 20% liegt nach der WHO-Definition eine AML vor. Des Weiteren wird aus dem entnommenen Knochenmark eine Chromosomenanalyse durchgeführt, da über 40% der MDS-Patienten zytogenetische Aberrationen aufweisen [79]. 1.2.4 Prognose und Therapie Die hämatologischen Erkrankungen aus der Gruppe der Myelodysplastischen Syndrome haben, je nach Entität und Zytologie, eine sehr unterschiedliche Prognose [12, 28]. Um diese objektiv einschätzen zu können, benutzt man sogenannte Scoring-Systeme. Diese gewichten und kombinieren bestimmte Einzelfaktoren und errechnen daraus die theoretische mittlere Lebnserwartung des Patienten ohne Therapiemaßnahmen. Die beiden Scoring-Systeme, die bei der MDS-Risikoeinteilung verwendet werden sind IPSS und WPSS. Das klinisch meist verwendete System zur Prognosebesimmung bei MDS ist das International Prognostic Scoring System (IPSS) (Tabelle 3), welches die Patienten in niedrig-, intermediär 1-, intermediär 2- und Hochrisiko – Kategorien einteilt. IPSS berücksichtigt drei Faktoren: den Blastenanteil im Knochenmark, den Karyotyp und die Anzahl und Ausprägung der Zytopenien [51]. 10 1. Einleitung Tab. 3: International Prognostic Scoring System (IPSS) - Alter und mittleres Überleben (modifiziert nach [51]) Risikoeinschätzung zur Evaluierung der Prognose von neu diagnostizierten MDS Patienten. Score Risikogruppe Blasten im Knochen mark 0 Niedrig < 5% 0,5 Intermediär -1 5-10% 11-20% 2,0 Intermediär -2 ≥ 2,5 Hoch 1,0 1,5 - Karyotyp* Zytopenien** Gut Intermediär Arm 0 -1 2-3 Medianes Überleben in Jahren Alter < 60 Jahre 11,8 Medianes Überleben in Jahre Alter > 60 Jahre 4,8 5,2 2,7 1,8 1,1 0,4 0,5 >3 21-30% * Gut: normal, -Y, del (5q), del (20q), Arm: komplex (> 3 Abnormalitäten) oder Chromosom 7 Abnormalitäten, Intermediär: andere Abnormalitäten. ** Hämoglobin < 10 g/dl, Leukozyten < 1,5 G/l, Thrombozyten < 100 G/l. del: Deletion, G: Giga, MDS: Myelodysplasitsches Syndrom WPSS (WHO adapted prognostic score system) berücksichtigt im Prinzip die gleichen Risikofaktoren wie IPSS, es rechnet in die Risikoprofil-Bestimmung aber statt der eventuell vorhandenen Zytopenien die Transfusionsabhängigkeit mit ein, welche 2005 von Malcovati et al. als ein negativer prognostischer Faktor für die niedrigeren MDS-Risikogruppen publiziert wurde. Sekundäres und Therapie- induziertes MDS hat grundsätzlich eine schlechtere Prognose als primäres MDS [33]. Eine AML die auf dem Boden eines MDS entsteht, hat eine schlechte Prognose mit einem meist letalen Ausgang [129]. Bis zu zwei Drittel der MDS-Patienten versterben nicht an der Erkrankung selbst, sondern an ihren Komplikationen, zu denen unter anderem Transformation in eine AML, Blutungen, und Infektionen zählen [27]. Je nach Alter der Patienten und ihrem IPSS-Risikoprofil werden beim MDS unterschiedliche Therapiestrategien durchgeführt. Die aktuelle Therapie der MDS beinhaltet supportive Therapie, wie Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentrate und antibakterielle unterstützende Therapie, sowie die allogene hämatopoetische Stammzell-Transplantation (allo-SCT). Generell haben die Niedrig-Risiko-MDSPatienten (Niedrig – und Intermedium1- Risikogruppen nach IPSS) eine bessere Prognose und eine längere Überlebenszeit ohne Therapie. Für die HochrisikoMDS-Patienten (Intermedium2- und Hochrisikogruppen nach IPSS), die im 11 1. Einleitung Allgemeinen eine schlechtere Prognose aufweisen, sind aggressivere Verfahren wie die allo-SCT gerechtfertigt. Dabei benötigen nahezu alle MDS – Patienten eine effektive supportive Therapie [8, 52]. Häufige Erythrozytenkonzentrate können jedoch zu Eisenüberladung und damit zur Organschädigung führen [13, 37, 148]. Um dies zu vermeiden gilt es einen Transfusionsbedarf so lange wie möglich medikamentös Medikamente, wie hinaus Erythropoetin zu zögern. Erythropoesestimulierende und Darbepoetin in Kombination mit Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktoren (G-CSF) gehören hierbei zur Therapie der ersten Wahl [49, 74]. Weiterhin kommt die Therapie mit Immunsuppressiva wie Antithymozytenglobulin und Ciclosporin, hypomethylierenden Medikamenten wie Azacytidine und Decitabine, oder der Immunmodulator Lenalidomid in Frage - je nach Risikogruppe, zytogenetischem Muster und Fortschreiten der Erkrankung [91, 103, 137]. Immunsuppressive Maßnahmen verhindern die Ausschüttung von Zytokinen durch autoreaktive zytotoxische T-Zellen und richten sich somit gegen die eventuelle autoimmunologische Komponente der Krankheitsentstehung [103]. Die klinischen Effekte der hypomethylierenden Substanzen werden durch den Einfluss auf Apoptose und Methylierung der DNA erreicht [137]. Azacydine hebt die Hypermethylierung der DNA auf, indem es die im Zellkern befindlichen Methyltransferasen hemmt. Niedrig-Risiko-Patienten mit einer Deletion im q-Arm des Chromosoms 5 zeigen hohe erytropoetische Ansprechraten auf das immunmodulierende Lenalidomid mit Langzeitverbesserungen [91]. Zusätzlich spricht etwa ¼ der MDS-Niedrig-Risiko-Patienten ohne 5q- Syndrom auf Lenalidomid an [118]. Die allo-SCT ist die einzige aktuell bekannte Therapie mit einem kurativen Potential in der MDS-Therapie. Das mediane Erkrankungsalter der MDS-Patienten beträgt, wie oben bereits erwähnt, allerdings 70 Jahre. Die meisten Patienten weisen also häufig Komorbiditäten auf und damit ist für sie diese Art von Therapie, der eine aggressive chemotherapeutische Behandlung vorangeht, nicht geeignet [168]. Der Nutzen der allo-SCT bei jüngeren Patienten wird durch das erhebliche Risiko der Therapie-assoziierten Morbidität und Mortalität gemindert [24, 158]. Weiterhin problematisch bleibt auch Behandlung von Patienten im Stadium RAEB I/II (Refraktäre Anämie mit Exzess der Blasten I/II), die sich nicht für eine allogene Transplantation qualifizieren. Gerade für all diese Patienten stellen die neuen, 12 1. Einleitung experimentellen Therapieformen mit Substanzen, wie Lenalidomid oder Azacytidine eine große Chance dar [39, 130]. 1.2.5 Das 5q- Syndrom 1.2.5.1 Definition Das 5q- Syndrom mit seiner streng linearen Genotyp – Phänotyp- Beziehung stellt eine Besonderheit unter den myelodysplastischen Syndromen dar [18]. Es wurde bereits 1974 von van den Berghe als die erste chromosomale Deletion, die zu einem definierten Phänotyp einer Krebserkrankung führt, beschrieben. Es ist ein Subtyp des MDS, der durch einen Defekt speziell in der erythroiden Differenzierung charakterisiert ist [149]. Das Krankheitsbild ist geprägt durch eine schwere makrozytäre Anämie, normale bis erhöhte Plättchenzahlen, normale bis erniedrigte neutrophile Granulozyten Zahlen, erythroide Hypoplasie im KM und hypogelappte Micromegakaryozyten [66]. Laut WHO liegt ein 5q- Syndrom vor, wenn der Blastenanteil im Knochenmark weniger als 5% beträgt und gleichzeitig eine Deletion des 5q [del(5q)] als einzige Karyotyp-Veränderung vorliegt [152]. 1.2.5.2 Epidemiologie und das Krankheits-Gen RPS14 Das 5q- Syndrom macht 5-6% der myelodysplastischen Syndrome aus. Jahrzehntelange Dokumentationen haben gezeigt, dass die Prävalenz bei Frauen deutlich höher ist, als bei Männern [111]. Bei Patienten mit de novo MDS ist [del(5q)] die häufigste chromosomale Deletion, dabei gehen 20% der MDSPatienten mit einer Deletion des q-Arms am Chromosom 5 mit weiteren chromosomalen Aberrationen einher, 5–6% kommen als isoliertes 5q- Syndrom vor [51]. Der Erkrankung liegt die Haploinsuffizienz des RPS14 Gens zugrunde, welches sich auf dem DNA - Abschnitt befindet, das bei der Deletion abhanden kommt [31]. RPS14 wurde erstmals 2008 von der Ebert et al. Arbeitsgruppe mittels eines RNA Interference Screen als das verantwortliche Gen für das 5q- Syndrom 13 1. Einleitung beschrieben. Die Arbeitsgruppe entwarf für jedes Gen der CDR (chromosomal deleted region) eine shRNA, die mittels Lentiviren in die CD34+ Zellen transfiziert wurden. Nach 10 Tagen Inkubation konnte man den Effekt jeder shRNA auf die Differenzierung mittels FACS beobachten. Es wurden Erythrozyten- und Megakaryozytenspezifische Oberflächenmarker verwendet. Unter allen auf der CDR liegenden Genen rekapitulierte allein die Suppression des RPS14 Gens das 5q- Syndrom in vitro. Das kleine Ribosomen –Untereinheits- Protein rpS14 bindet direkt die Helix 28 der 18s rRNa und ist essentiell für die Zusammensetzung der ribosomalen 40s Untereinheit [89, 104]. Das RPS14 der Hefen wird für die endonucleolytische Spaltung benötigt, bei der 200 Nucleotide vom 3`Ende der 20S pre-rRNA entfernt werden, um eine reife 18S rRNA und funktionstüchtige ribosomale 40s Untereinheiten zu schaffen [76]. Bei ungenügendem Vorkommen des RPS14 sieht man eine Akkumulation der unreifen ribosomalen Proteine und prä-rRNA, die für die 40S UE bestimmt sind, während die 60S UE –Zahl unbeeinträchtigt bleibt [31]. Als Schlüsselgen des 5q- Syndroms ist und bleibt RPS14 interessant für weitere Forschungen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Peptidepitope des Gens als Targets für zielgerichtete Immuntherapie geeignet wären. 1.2.5.3 Klinischer Verlauf und Diagnose Da beim 5q- Syndrom eine deutliche Phänotyp-Genotyp- Korrelation besteht, kann es häufig allein durch die Knochenmarkmorphologie und andere hämatologischmorphologische Untersuchungen relativ sicher diagnostiziert werden, bevor die Ergebnisse aus der Zytogenetik fertig sind [111]. Typischerweise präsentiert sich ein Bild des Knochenmarks eines MDS- Patienten hyperzellulär. Hingegen ist das Knochenmark bei 20% der 5q- Patienten hypozellulär, bei 40% normozellulär und nur bei 40% hyperzellulär. Beinahe die Hälfte aller Patienten hat eine gestörte Erythropoese mit unter 20% Erythrozytenvorläuferzellen im KM. Dysplasien in den Erythrozyten findet sich nur bei 15% der Patienten, Dysplasie in den Granulozyten nur in 10%. Allerdings finden sich bei nahezu allen Patienten mononukleäre Megakaryozyten mit deutlich kleinerem Durchmesser, als normale Zellen dieser Art [46]. Sie werden daher auch Mikromegakaryozyten genannt. 14 1. Einleitung Die Hauptursache für Morbidität und Mortalität der Patienten liegt in dem Defekt der Erythrozytenausdifferenzierung. Die Patienten benötigen häufige Erythrozytenkonzentrat – Transfusionen, was schließlich, wie auch bei allen anderen MDS- Patienten, zur Eisenüberladung im Gewebe und den damit verbundenen Organdefekten führt [45]. 1.2.5.4 Prognose und Therapie mit Lenalidomid Die Prognose der Erkrankung bei Patienten, die den WHO-Kriterien des 5qSyndroms entsprechen ist als relativ günstig anzusehen [17, 47, 111]. Patienten, die nicht eindeutig zu dieser Definition passen – z.B. weil sie weitere Karyotypveränderungen, außer [del(5q)] aufweisen oder wenn zusätzlich ein Blastenexzess vorliegt, haben eine weitaus schlechtere Prognose [45]. Eine aktuelle Studie von Patnaik et al. beschreibt zusätzlich folgende Risikofaktoren, die zu einer geringeren 5-JÜR bei Patienten mit einem 5qSyndrom laut WHO-Definition führen: Hohes Alter, Transfusionspflichtigkeit bei Erstdiagnose und verminderte Granulopoese [111]. Tab. 4: Prognose der Myelodysplastischen Syndrome [44] Subtyp n (%) Transformation in AML, % Mittlere Lebenserwartung Monaten RA 107 (8.5) 7.5 69 RARS 138 (11) 1.4f 69 RCMD 306 (24) 10 33 RCMD-RS 183 (15) 13 32 RAEB-1 256 (21) 21 18 RAEB-2 235 (18.5) 34.5 10 MDS 5q- 28 (2.2) 8 116 RA: Refraktäre Anämie; RARS: Refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten; RCMD: Refraktäre Zytopenie mit Multilineären Dysplasien; RCMD-RS: Refraktäre Zytopenie mit Multilineären Dysplasien; Ringsideroblasten; RAEB: Refraktäre Anämie mit Blastenexzess; MDS 5q-: Myelodysplastisches Syndrom mit der Deletion 5q 15 in 1. Einleitung Bis vor kurzem hat man Patienten mit dem 5q- Syndrom nur durch konservative Therapie – v.a durch regelmäßige Gabe von Erythrozytenkonzentraten behandelt. Eine neue Substanz ist Lenalidomid, welches beachtliche therapeutische Fortschritte bei Patienten mit isoliertem 5q- Syndrom und bei MDS-Patienten mit zusätzlichen Deletionen am Chromosom 5 zeigt [9, 90, 132]. Lenalidomid ist ein 4amino-glutamyl Analogon von Thalidomid, und gehört zur Gruppe der “immunomodulatory drugs” (IMiDs®). Die IMiDs® sind weitaus potenter als Thalidomid in ihrer Wirkung als Inhibitoren von TNFα und IL-6. Sie stimulation darüber hinaus die T-Zellen und regen die vermehrte Poduktion von Il-2 und IFNγ an. Zudem haben sie weniger unerwünschte neurologische Nebenwirkungen, wie Sedierung und Neuropathien [6, 7, 122]. Zwei relativ große Studien an MDS Patienten mit [91] und ohne 5q-Deletion [118] bestätigen die hervorragende Wirksamkeit für Lenalidomid bei einigen Formen von MDS. In beide Studien waren Patienten eingeschlossen mit primär niedrigem oder Intermediär-1 Risiko MDS nach dem IPSS (Tabelle 3), die bei Studienbeginn transfusionspflichtig waren. Die Behandlung mit Lenalidomid führte bei 67% der Patienten mit 5q-Deletion und 26% ohne 5q-Deletion zum Aufheben der Transfusionspflichtigkeit und zur Remissionsdauer von ca. 2 Jahren (mit 5q-) bzw. 9 Monaten (ohne 5q-). Eine Zytogenetische Komplettremission (CR) wurde bei 45% mit [del(5q)] und 9% ohne [del(5q)] beobachtet. Lenalidomid (10 mg/d) hat sich zudem therapeutisch auch bei MDS Patienten mit einem hohen oder Intermediär-2 Risiko mit einer zusätzlichen 5q-Deletion bewährt – v.a. wenn die Plättchenzahl höher als 100 x 10^9/L ist [1]. Bei den zahlreichen Studien hat sich gezeigt, dass das Ansprechen der MDS Patienten mit zusätzlicher 5q-Deletion auf Lenalidomid, nicht signifikant beeinflusst wird durch Alter, Geschlecht, FAB Typ, IPSS oder zytogenetische Muster. Das Ansprechen auf Lenalidomid ist aber umso schlechter, je ausgeprägter die Zytopenie und je größer die Notwendigkeit häufiger Transfusionen ist. 16 1. Einleitung Abb. 1. Wirkmechanismen von Lenalidomid, die zu therapeutischen Effekten bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebserkrankungen führen [87]. Die roten Pfeile zeigen die direkte Wirkung von Lenalidomid, die hellblauen Pfeile die indirekte. MM Cells: Multiples Myelom- Zellen; NK cells: Natürliche Killerzellen; TNF: Tumornekrose- Faktor; IL: Interleukin; INF: Interferon; VCAM: vascular cell adhesion molecule; ICAM: intercellular adhesion molecule Lenalidomid hat eine große Breite an potentiellen Wirkungen, die schließlich den Patienten in Remission führen können (Abbildung 1). Dazu gehören Inhibition des TNFα und IL-6, sowie Anregung zur Angiogenese, Erythropoese und T- und NKZell Stimulation mittels Induktion von IL-2- und IFNγ-Ausschüttung [86, 132]. Dennoch bleibt der genaue Wirkmechanismus der hervorragenden Wirkung dieses Medikaments bei Patienten mit einer 5q-Deletion unklar. 1.3 Identifizierung Leukämieassoziierter Antigene Im Fall einer malignen Entartung einer zuvor gesunden Körperzelle kommt es zu Verlust von Oberflächenproteinen, Membranveränderungen und/oder zu Überexpression von Peptiden, die unter normalen Bedingungen nur geringfügig oder gar nicht exprimiert werden und zur Präsentation dieser auf den MHC I Molekülen. Diese überexprimierten Peptide können dann bei den betroffenen Patienten von spezifischen T-Lymphozyten als Antigene erkannt werden, 17 1. Einleitung woraufhin eine Reaktionskette in Gang gesetzt wird, die zu einer Immunantwort führt. Ziel einer Immuntherapie ist es, diese spezifischen T-Zellantwort gegen Tumorzellen zu steigern. Antigene, wie z.B. Cancer–Germline–Antigene (CGAGs), könnten für eine Immuntherapie besonders geeignet sein, da sie in Normalgeweben nicht exprimiert werden [61]. Schon in den 50er Jahren hat man bei Tierversuchen an der Maus erste Hinweise auf die Existenz immunogener Strukturen in Tumoren gefunden. Bis zur gezielten Suche nach den ersten Tumorassoziierten Antigenen (TAA) dauerte es weitere 30 Jahre. Seither ist die Identifizierung und immunologische Charakterisierung von Tumorantigenen eines der vordringlichen Ziele, um eine antigenspezifische Immuntherapie entwickeln zu können [16, 115, 150]. Gesteigerte spezifische Untersuchungen der T-Zell-Antworten gegen Patientenproben vor leukämische und nach Blasten bei allogener Stammzelltransplantation ließen die Existenz von immunogenen Antigenen auch bei myeloischen Leukämien erwarten [102]. Das erste Leukämie-Assoziierte Antigen (LAA) wurde 1997 von Ikeda et al. beschrieben [72]. Seither wurden etliche LAAs entdeckt, die in verschiedenen Leukämieformen die T-Zell-Antwort induzieren können. Bei den AML- Patienten sind es BAGE, BCL-2, OFA-iLRP, FLT3-ITD, G250, human telomerase reverse transcriptase (hTERT), PRAME, RHAMM, proteinase 3, survivin, und WT-1 [5, 15, 55, 62, 81, 100, 101, 105, 125, 131, 154, 155]. Einige Epitope in diesen LAAs induzierten Zelllyse bei den autologen leukämischen Blasten durch die zytotoxischen T-Zellen [55, 62, 81, 100, 101, 154, 155]. Bei RHAMM und WT-1, sowie bei NPM1 konnten sogar eine humorale, sowie eine zelluläre Immunantwort nachgewiesen werden [32, 55, 56, 59, 62, 126]. 18 1. Einleitung Abb. 2: In orange sind die relevanten leukämieassoziierten Antigene (LAAs) markiert, welche einen positiven Effekt auf die Proliferation der Leukämiezellen haben (im oberen Bildbereich) oder die Apoptose der malignen Zellen hemmen (unterer Bildbereich) und damit die Tumorlast in den Patienten erhöhen [53] RAR: retinoic acid receptor Für die Antigencharakterisierung bei malignen hämatologischen Erkrankungen ist die Identifizierung von Leukämieassoziierten Antigenen (LAA) und deren Charakterisierung im Hinblick auf Immunantworten und Expressionsmuster notwendig. Eine Methode zur Identifikation von TAAs/LAAs stellt das sogenannte SEREX–Verfahren (Serologisches Screening von rekombinanten cDNA– Expressionsbanken) dar. Zunächst konnte die Durchführbarkeit von SEREX bei der AML gezeigt werden [57]. Mittels SEREX wurden von der Gruppe Tumorimmunologie Gruppe der Universität Ulm einige relevante immunogene Antigenstrukturen bei Patienten mit einer AML identifiziert, wie z.B. MPP11, RHAMM, HSP 70, HSJ-2, etc. [58, 59]. Auch bei anderen malignen hämatologischen Erkrankungen wie der CML, CLL und den myeloproliferativen Erkrankungen konnten spezifische zelluläre Immunantworten detektiert werden. 19 1. Einleitung Eine Vielzahl von möglichen Immuntherapien ist bereits geprüft worden oder wird aktuell in klinischen Studien aktiv geprüft [48, 68, 69]. Die funktionelle Rolle der LAAs in malignen Zellen ist sehr unterschiedlich. Viele von ihnen spielen eine Rolle in dem Mechanismus für Zellteilung, Zellwachstum und Differenzierung. Doch dies ist eine kontroverse Rolle: einerseits vermögen sie das Zellwachstum zu steigern, andererseits stellen sie die Zielstruktur für eine effektive Immunantwort gegen den betreffenden Tumor dar [53]. Bei der Suche nach geeigneten Strukturen für eine potentielle Immuntherapie sind Mitoseassoziierte LAAs besonders interessant. SSX2IP oder RHAMM, welches bereits die Phase 2 der Vakzinierungsstudien erreicht hat, sind nur ein Beispiel dafür [60, 63]. Das PLK1- Gen, welches in dieser Arbeit unter anderem als potentielles LAA untersucht wurde, gehört zu der Familie der Zellzykluskontrollierenden Kinasen und ist damit ebenfalls eines der Schlüsselgene der Mitose. 1.4 Immuntherapie bei malignen hämatologischen Erkrankungen Paul Ehrlich postulierte bereits Anfang des letzten Jahrhunderts die Theorie der Immunüberwachung von Tumoren und setzte damit die Grundlage für die Tumorimmunologie. Er ging davon aus, dass Veränderungen einer Zelle vom Immunsystem als fremd erkannt und die betroffenen Zellen daraufhin vom Immunsystem angegriffen würden. Somit käme es erst nach Überwindung der Immunabwehr zur Manifestation eines Tumors. Im Zentrum der Tumorabwehr steht die T-Zell-vermittelte zytotoxische Reaktion. Diese erfolgt durch die Aktivierung der antigenspezifischen CD8+-T-Lymphozyten. Werden die Tumorproteine auf MHC I präsentiert, aktivieren sie die CD8+-TZellen, die sich daraufhin zu zytotoxischen T-Zellen (CTL) differenzieren. Diese erkennen nun die Tumorzellen über das gleiche Antigen, welches diese auf ihren MHC I präsentieren. Die Tumorzelle kann nun lysiert werden. Werden die Antigene auf MHC II präsentiert, was nur über die APCs passieren kann, so aktivieren sie die CD4+-T-Zellen. Diese induzieren naive B-Zellen zur antigenspezifischen Differenzierung, sodass reife Plasma B-Zellen spezifische Antikörper sezernieren. Aktivierte CD8+-T-Zellen sind also für den direkten, 20 1. Einleitung lytischen Angriff gegen Tumorzellen verantwortlich, die den entsprechenden MHCPeptid- Komplex auf der Oberfläche präsentieren. Aktivierte T-Helferzellen dagegen sezernieren verschiedene Zytokine, die sowohl stimulatorische als auch suppressive Effekte auf zytotoxischen T-Zellen, sowie auf andere Zellen des Immunsystems ausüben [43, 95, 117]. Die Peptid-Präsentation ist allelspezifisch. Ein von HLA-A2 präsentiertes Peptid kann also normalerweise nicht von HLA-A3 gebunden werden [35, 138]. Peptid - Vakzinierung Die gezielte Immuntherapie durch Leukämie-Vakzinierung wird intensiv erforscht, da sie Immunantworten gegen maligne Zellen zu erzeugen vermag unter gleichzeitiger Schonung des körpereigenen Gewebes. Die Zielantigene für die Graft-versus-Leukemia – Reaktion (GvL) scheinen entweder minor- histocompatibility- Antigene zu sein [36] oder LAAs [54]. Die zweiteren werden vor allem von den Leukämiezellen exprimiert, können aber auch im Normalgewebe exprimiert werden. Optimale Zielstrukturen für eine Immuntherapie wären Antigene, die ausschließlich in Leukämiezellen exprimiert würden. Nach dem derzeitigen Forschungsstand sind jedoch Leukämie-restringierte Antigene, die eine potente Immunreaktion auslösen können, selten [2]. Tumor-Vakzinierung kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: PeptidVakzinierung und Zell-Vakzinierung. Die Peptid-Vakzinierung ist HLA-restringiert und erfordert die Identifizierung und Charakterisierung des Antigen-Epitops von dem jeweiligen Zielprotein. Die Zell-Vakzinierung ist meist nicht HLA-restringiert [25, 167]. In dieser Doktorarbeit soll es um die Peptid- Vakzinierungen gehen: Die PeptidVakzinierung fördert eine Antigen-spezifische Immunantwort, auch könnte eine bereits bestehende Immunantwort stimuliert werden und so zum Beispiel ein MRD kontrolliert werden. Dabei können die von einem immunogenen LAA abgeleiteten Peptid-Epitope subkutan in die Nähe von Lymphknoten injiziert werden. Dort werden sie von den Antigen-päsentierenden Zellen aufgenommen und den naiven T-Zellen präsentiert. Treffen die so aktivierten T-Zellen dann auf einen leukämischen Blasten, der ein gleichartiges LAA präsentiert, kann die T- Zelle mit ihrem Rezeptor (TCR) dort binden und die leukämische Zelle lysieren. 21 1. Einleitung Abb. 3: Schema der Peptid-Vakzinierung. Oben rechts: das Antigen-Peptid bindet an ein Klasse-IMolekül des major histocompatibility complex (MHC) einer Antigen-präsentierenden Zelle. Es wird naiven T- Lymphozyten präsentiert. Um zu einer zytotoxischen T-Zelle (CTL) zu differenzieren, bedarf es ebenfalls eines Signals durch costimulierende Moleküle (CD80 und CD86). Ohne diese Costimulation bleibt die T-Zelle inaktiv, was die entscheidende Rolle der APCs in der Stimulierung der Immunantwort unterstreicht. Erkennt eine stimulierte T-Zelle nun das LAA auf einer Tumorzelle, kann der T-Zell-Rezeptor (TCR) des aktivierten T-Lymphozyten (CTL) binden, welcher auf oben beschriebenem Weg für dieses LAA stimuliert wurde. Es kommt zur Sekretion von GrB, Perforin und FasL und damit zur Lyse des Blasten [2] Dieses Prinzip der Peptid-Vakzinierung wurde in mehreren klinischen Studien mit verschiedenen Peptidepitopen überprüft. Die Sicherheit und Machbarkeit der Peptid-Vakzinierung konnte gezeigt werden. Die niedrige Toxizität und die einfache Überwachung hat sie für die Therapie der malignen Erkrankungen sehr attraktiv gemacht, auch in Kombination mit einer Chemotherapie und der SZT. 22 1. Einleitung Trotz ihrer Vorzüge haben es Peptid-Vakzinierungen noch nicht in die Guidelines der Leukämie-Therapien geschafft aber es gibt bereits zahlreiche Berichte und Studien über Langzeitremissionen nach Einsatz von Peptid-Vakzine [106, 120]. Die Vakzinierung mit LAA-abgeleiteten Peptiden erscheinet somit als eine erfolgversprechende Therapieoption. Die Suche nach den geeignetsten LAAs, den Möglichkeiten einer Kombination mehrerer LAAs, sowie der richtigen Dosierung und den besten Adjuvanzien sind Gegenstand weitergehender Forschung. 1.5 Zielsetzung Der Großteil der Patienten mit AML, der häufigsten Leukämie im Erwachsenenalter, sowie auch ein großer Teil der MDS Patienten, hat nach wie vor eine schlechte Prognose. Dies liegt nicht zuletzt an dem meist höheren Alter der Patienten, in dem die Indikationsstellung für aggressive Chemotherapie und Stammzell-Transplantationen nur mit hohem Risiko durchgeführt werden können oder gar nicht erst möglich sind. Trotz aggressiver Therapien, einschließlich einer allogenen Stammzelltransplantation, sind Rezidive häufig. Als Ursache der Rezidive sind chemotherapie-resistente maligne Zellen anzusehen, die für die sogenannte minimale Resterkrankung (MRD) verantwortlich sind. Zellen des Immunsystems können diese verbliebenen Tumor-/Leukämiezellen beseitigen. Welche Antigenstrukturen hierfür relevant sind und wie diese Immunantworten ausgelöst und gesteigert werden können, wird derzeit von vielen Arbeitsgruppen untersucht. Das PLK1- Gen spielt eine wichtige Rolle im Zellzyklus der AML und Mutationen im RPS14-Gen wurden als relevant in der Pathogenese des 5q- Syndroms identifiziert. Beide Gene sind daher interessante Kandidatengene für die Entwicklung einer gezielten Immuntherapie. In dieser Arbeit sollte die Immunogenität beider Gene untersucht werden. Da Lenalidomid bekanntermaßen besonders effektiv bei der Behandlung des 5q- Syndroms wirkt, wurde in den Versuchen seine mögliche Wirkung auf die spezifische T-Zell-Antwort der CD8+-TZellen in diesem Patientenkollektiv mitevaluiert. 23 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Allgemeine Laborgeräte Brutschrank B 5042 E (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) ELISpot-Reader Immuno Spot (C.T.L. Europe, Reutlingen, Deutschland) FACS-Gerät: FACScan, Fa. Becton Dickinson (Heidelberg, Deutschland) Gamma-Counter 145 Microbeta Plus, Liquid Scintillation Counter, Fa. Wallac (Loughborough Leics, England) Gefrierschrank -20 °C: (Bosch GmbH, München, Deutschland) -80 °C: Ultra Low (Sanyo Fischer GmbH, München, Deutschland) Magnetständer MACS MultiStand (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) Mikroskop Vergrößerung 3,2, 10, 16 und 100fach (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) Multi-Step-Pipetten Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland pH Messgerät pH744 Meter (Metrohm) Pipetten 0,5 – 10 µl; 10 – 100 µl; 50 – 250 µl und 200 – 1000 µl Eppendorf Reference (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) Pipettierhilfe Nalge Nunc international, Roskilde, Dänemark Sterile Arbeitsbank Hera-Safe HS-18 und HLB 2448 (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) Stickstofftank M280 (Taylor-Warton GmbH, Husum, Deutschland) Wasserbad Julabo U3/7 (Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach/West, Deutschland) Zentrifugen Beckmann GS-6R und GS-15R (Beckmann Instruments, Fullerton, CA, USA) 24 2. Material und Methoden 2.1.2 Plastikwaren Alle verwendeten Plastikwaren wurden von den Firmen steril bezogen. Einfrier-Röhrchen Nunc Cryo TubeTM Vials 1,8 ml (Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark) Einmalspritzen 2 ml (Fa. Beckton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) ELISpot-Platten MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well filtration and Assay Plate (Millipore, Bedford, MA, USA) Filter MACS Pre-Separations-Filter (Milteny Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) Gewebekulturflaschen NUNCLONTM Surface 40, 160 und 400 ml (Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark) Multistep-PipettenPipettenspitzen Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipetten FALCON Serologische Pipetten 2, 5, 10, 25 und 50 ml ® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) Pipettenspitzen epT.I.P.S. Standard 0,1 – 10 µl, 2 – 200 µl und 50 – 1000 µl (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) Platten NUNCLONTM Surface 12, 24, 48 und 96 well (Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark) Reaktionsgefäße Safe-Lock Tube 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 2 ml (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) Röhrchen FALCON Polypropylen Tubes 15 ml und 50 ml (Becton ® Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) Sterilfilter Minisart RC 15 (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland) Trennsäule MACS MS+ Separation Columns (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) Zählkammer Neubauer 0,100mm Tiefe; 0,0025mm² (LO - Laboroptik GmbH, Friedrichsdorf, Deutschland) 25 2. Material und Methoden 2.1.3 Chemikalien Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von folgenden Firmen bezogen: Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland Becton Dickinson, Sparks, USA Cambrex Bio Science, Rockland, USA USB Corporation, Cleveland, USA Invitrogen, Carlsbad, USA Dela Select GmbH, Pfullingen, Deutschland 2.1.4 Spezielle Chemikalien AB-Serum Deutsches Rotes Kreuz, Ulm AEC-Substrat BD Biosciences Aqua Distillata Spüllösung Braun, Melsungen β2-Mikroglobulin Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland Dimethylformid DMF (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) Färbetabletten BCIP und (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) NBT (nitroblue tetrazolium chloride) Färbetabletten, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Fetales Kälberserum GibcoBRLTM, Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland Ficoll Seperating Solution Seromed-Biochrom AG, Berlin GrB-Antikörper BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA IFNγ-Antikörper Mabtech 26 2. Material und Methoden IL-2/IL-7 Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland L-Glutamin Seromed-Biochrom AG, Berlin MicroBeads CD8 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland PBS 10x (w/o Ca²+ and Mg²+) GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland Penicillin/Streptomycin GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland RPMI 1640 Seromed-Biochrom AG, Berlin Tryptanblau-Lösung 0,4% Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Chemicals, Deisenhofen, Deutschland Tween-20 Sigma-Aldrich Deutschland Zelllinien Deutsche Sammlung Mikroorganismen von Zellen und (www.dszm.org) Braunschweig, Deutschland 2.1.5 Puffer Coating-Puffer In 100 ml Aqua bidest wurden folgende Komponenten gelöst: • 318 mg Natriumcarbonat • 580 mg Natriumhydrogencarbonat • 49 mg Natrium-Azid Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und steril filtriert. Substrat-Puffer In 500 ml Aqua bidest wurden folgende Komponenten gelöst: • 0,1 M TRIS (6,05 g/500ml) • 0,1 M NaCl (2,9 g/500ml) • 5 mM MgCl2 (237 g/500ml) Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und steril filtriert. 27 2. Material und Methoden Dilution-Puffer In 500 ml PBS wurden 50 ml FCS (FCS-engl.: Fetal Calf Serum) gelöst, so dass der Dilution-Puffer 10% FCS enthält. PBS (engl. phosphate buffered saline) In 1 l Aqua bidest wurden folgende Salze gelöst: • 8,0 g Natriumchlorid • 0,2 g Kaliumchlorid • 1,44 g Natriumhydrogenphosphat • 0,24 g Kaliumhydrogenphosphat. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und steril filtriert. PBS/ Tween-Puffer In 1 l PBS-Puffer wurden 0,5 ml Tween-20 gelöst. Seperations-Puffer 500 ml PBS enthält folgende Substanzen: • 2 mM EDTA • 0,5% hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum FCS Blockierungslösung für GrB-ELISpot 500 ml 1640 RPMI-Medium enthält folgende Substanzen: • 50 ml hitzeinaktiviertes FCS • 5 ml Penicillin/ Streptomycin • 5 ml L-Glutamin Blockierungslösung für IFN γ-ELISpot In 500 ml PBS wurden 5 ml hitzeinaktiviertes AB-Serum gelöst. 2.1.6. Zelllinien, Antikörper und Zytokine Für die Auflistung, Verwaltung und Bereitstellung humaner Zellinien ist in den USA die American Type Culture Collection (ATCC) verantwortlich. Es ist ein global agierendes, nicht profitorientiertes Zentrum für biologische Ressourcen. 28 2. Material und Methoden Der Hauptsitz der Organisation befindet sich in Manassas. Auch in Deutschland gibt es ein entsprechendes Institut: Die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Folgende dort verzeichnete Zelllinien wurden verwendet: T2- Zellinie Die T2-Zelllinie mit der ATCC-Nummer: CRL-1992 ist eine Verwandte der T1Zelllinie, die unter Auswahl des monoklonalen Antikörpers SFR1-MI.3 hergestellt wird (gegen eine monomorphe Determinante auf HLA DR). Es ist eine TAPdefiziente Hybride aus einer lymphoblastischen B- und T-Zelllinie. Die Zellen synthetisieren zwar das HLA B5, exprimieren es aber nicht auf ihrer Oberfläche. Die Zelllinie T2 ist wie auch die T1-Zelllinie nützlich für das Studium der T-ZellErkennung von HLA I Antigenen. Die Zelllinie exprimiert das Antigen HLA A2 und CD7+. HLA II wird nicht exprimiert. FACS-Antikörper FITC konjugierter, muriner IgG1 Antikörper Fa. Becton-Dickison (Isotypenkontrolle) FITC konjugierter α-Human HLA-A2 Antikörper Fa. Becton-Dickison Interleukin-2 (IL-2): IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der für die T-Zellproliferation und deren Erhaltung erforderlich ist. Darüber hinaus stimuliert IL-2 die Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen, Monozyten, Makrophagen und Oligodentrozyten [107]. Aufgrund seiner wachstumsfördernden Eigenschaften auf aktivierte T-Lymphozyten wurde IL-2 zur Langzeitkultivierung von T-Zelllinien eingesetzt. Interleukin-7 (IL-7): IL-7 ist, als ein T-und B-Zell-Wachstumsfaktor, erforderlich. Er stimuliert außerdem die für die T-Zellproliferation Differenzierung von B-Zellen, Thymozyten und T-Zellen und hemmt die Differenzierung von CTL und lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK-Zellen). Eingesetzt wurde IL-7 aufgrund seiner wachstumsfördernden Eigenschaften auf T-Lymphozyten [4, 136]. 29 2. Material und Methoden 2.1.7 Zellkulturmedien Medium zur T-Zell-Kultivierung Die T-Zellen wurden in 1640 RPMI-Medium kultiviert. Zu 500 ml 1640 RPMIMedium wurden folgende Zusätze gegeben: 10% hitzeinaktiviertes und steril filtriertes, humanes AB-Serum. 1% Penicillin/ Streptomycin 1% L-Glutamin Medium zur Kryokonservierung Als Medium zur Kryokonservierung wurde das RPMI 1640-Medium verwendet. Zu 500 ml RPMI 1640-Medium wurden folgende Zusätze gegeben: 20% AB-Serum 10% DMSO 1% Penicillin / Streptomycin , 1% L-Glutamin Methode zur Seruminaktivierung Um die Komplementfaktoren aus den verwendeten Seren zu eliminieren, wurde ihre Hitzeinstabilität ausgenutzt. Die für die Zellkultivierung verwendeten Seren wurden in einem Wasserbad bei 56 °C für 30 Minuten erwärmt. Das hitzeinaktivierte Serum wurde portioniert und bei -20 °C bis zur Verwendung gelagert. 2.1.8 Peptide Die Kriterien zur Auswahl der Peptide, sowie die Tabellen mit den Aminosäuresequenten findet man im Ergebnisteil unter Punkt 3.2. Die untersuchten Peptide wurden von der Firma Thermo Hybaid (Ulm, Deutschland) bezogen. Als Positivkontrollen wurden in dieser Arbeit folgende 2 Peptide verwendet: Das virale Protein pp65, welches die antigenspezifische CTL-Immunantwort auf das humane Zytomegalievirus (HCMV) auslöst (im Folgenden als CMV bezeichnet) [133] und das Nonapeptid aus dem Influenza A-Matrixprotein (im Folgenden, als 30 2. Material und Methoden IMP bezeichnet [34]. Es wurde davon ausgegangen, dass die Durchseuchung durch diese beiden Erkrankungen in der erwachsenen Bevölkerung so hoch ist, dass mindestens eines der beiden Peptide eine Immunantwort auslösen sollte. Als Negativkontrolle wurde dem Zellengemisch kein Peptid beigefügt. Tab. 5: Aminosäuresequenzen der Peptide für die Positivkontrollen; Negativkontrolle Name Sequenz Restriktion IMP GILGFVFTL HLA-A *0201 CMV NLVPMVATV HLA-A *0201 Negativkontrolle kein Peptid IMP: Influenza Matrix-Protein; CMV: Cytomegalie Virus 2.1.9 Blutproben Da in dieser Arbeit die potentielle Immunogenität der Peptide erst am Blut gesunder Probanden und dann an den Blutproben entsprechender Patienten getestet werden sollte, wurde auf zwei unterschiedliche Blutprobequellen zugegriffen. Die Proben von gesunden Spendern (Healthy volunteers – HV) wurden von der Blutbank des Deutschen Roten Kreuzes Ulm, Abteilung Transfusionsmedizin, bezogen. Die Blutproben der an MDS- und im speziellen am 5q- Syndrom Erkrankten wurden von Patienten gewonnen, die im Rahmen ihrer Erkrankung an der Universitätsklinik Ulm behandelt wurden. Eine Aufklärung über die Freiwilligkeit der Teilnahme wurde stets im Voraus durchgeführt. Alle Patienten haben eine Einverständniserklärung unterzeichnet, welche von der Ethik-Komission der Universität Ulm approbiert war. Die beteiligten Patienten waren bereits im Rahmen ihrer Behandlung auf eine mögliche Deletion des q-Arms am Chromosom 5 untersucht worden, der HLA-A – Status war entweder bekannt oder wurde mittels FACS-Analyse erhoben. 31 2. Material und Methoden Tab. 6: Daten der Patienten, deren Blutproben in dieser Arbeit verwendet wurden. Die Patienten wurden im Rahmen ihrer Erkrankung an der Universität Ulm behandelt. Diagnose 5q- Patient Geschlecht Alter* 1 w 73 MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk + 2 w 60 MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk + 3 w 58 MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk + 4 Studienpatient k.a. MDS; [del(5q)]; IPSS: Low-risk + 5 w 78 MDS; [del(5q)], n.a. + 6 w 66 - 7 m 54 MDS; RAEB- 1/2, normaler Karyotyp, IPSS: Intermediate-1 MDS; RCMD, normaler Karyotyp, 8 w 78 9 m 69 MDS; normaler Karyotyp - 10 m 61 MDS; normaler Karyotyp - IPSS: Intermediate-1 MDS; RCMD, normaller Karyotyp; IPSS: Low-risk Deletion - * Stichtag 01.01.11 w: weiblich; m: männlich; MDS: Myelodysplastisches Syndrom; IPSS: International Prognostic Scoring System; RAEB: Refraktäre Anämie mit Blastenexzess; RCMD: Refraktäre Zytopenie mit multilineären Dysplasien 2.2 Methoden 2.2.1 Anlage und Kultur von T2-Zellen Die T2-Zelllinie, welche für die zweite Phase der Mixed Lymphozyte Peptide Culture (MLPC) von Bedeutung ist, wurde in T-Zell-Medium bei 37 °C und 5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Ein Mediumwechsel fand drei Mal pro Woche statt, wobei je nach Bedarf die gesamte Kultur, die halbe oder 1/5 der Kultur zentrifugiert und in neues T-Zell-Medium gegeben wurden. Die Zellzahl wurde wöchentlich in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. 2.2.2 Probengewinnung Zur Durchführung der Versuche wurden periphere, mononukleäre Blutzelllen (PBMC) von HVs, sowie von an MDS- und speziell an dem 5q- SyndromErkrankten benötigt. 32 2. Material und Methoden Die HV-PBMCs wurden aus Buffy-Coats frischer Blutspenden gewonnen. BuffyCoats sind aufkonzentrierte, zelluläre Bestandteile des Blutes, sie beinhalten vor allem mononukläre Zellen und Thrombozyten. Aus 450 ml einer Vollblutspende lässt sich ein Buffy-Coat von 90 ml extrahieren. Das Verfahren zur Buffy-CoatGewinnung wird unter dem nächsten Registerpunkt (Zellseparation/ Ficoll) beschrieben. Die Patienten PBMCs wurden aus heparinisierten, frischen oder aufgetauten Vollblutproben gewonnen. Dieses wurde nach Einverständnis des entsprechenden Patienten mittels peripherer Venenpunktion entnommen. Alle Patienten hatten eine Einverständniserklärung unterzeichnet. 2.2.3 Zellseparation/ Ficoll Für die Versuche wurde vor allem der lymphozytäre Blutbestandteil benötigt. Dieser musste aus den Blutproben isoliert werden. Die PBMC (Monozyten, B- und T-Zellen, Natürliche Killerzellen und Thrombozyten) haben ein anderes spezifisches Gewicht, als die Eythrozyten, Granulozyten und tote Zellen und können somit mit der Dichtegradientzentrifugation von dem Rest getrennt werden. Die verschiedenen Zelltypen sedimentieren beim Zentrifugieren in unterschiedliche Phasen. Ficoll, ein ungeladenes Sucrosepolymer mit dem spezifischen Gewicht von 1,077 g/ml, dient dabei als Phasentrenner. Seine Dichte ist nämlich so gewählt, dass Zellen höherer Dichte, wie die Erythrozyten oder tote Zellen, die Ficoll-Lösung überwinden können. Granulozyten bleiben in der Ficollschicht. Die PBMCs sammeln sich an der Plasma- Gradientengrenze. Durchführung: Das Vollblut wurde im Verhältnis 2:1 mit PBS-Puffer verdünnt, mit 15 ml FicollLösung geschichtet und für 20 Minuten mit 2000U/min bei Raumtemperatur (RT) ungebremst zentrifugiert. Anschließend wurden die PBMC von der Interphase mit einer sterilen Pipette abgesaugt. Um die noch enthaltenen Thrombozyten zu entfernen, wurde das Substrat danach dreimal mit PBS-Puffer gewaschen (Zentrifugation bei 1200 U/min, 10 Minuten, Raumtemperatur). Für die Zellzahlbestimmung der gewonnenen PBMC wurde ein kleiner Teil der PBMC-Lösung mit einer Färbelösung (Tryptanblau) in einem bestimmten 33 2. Material und Methoden Verhältnis vermischt und in eine Neubauer-Zählkammer überführt. In 64 Kleinquadraten wurden die Zellen gezählt. Die Zellzahl wurde anschließend mit folgender Formel berechnet: Zahl der gezählten Zellen x Verdünnungsfaktor x 104/ml Zahl der ausgezählten Quadrate Die so isolierten PBMCs wurden entweder sofort in entsprechenden Tests weiterverwendet oder kryokonserviert. Für letzteres wurden die Zellen in Einfriermedium (RPMI-Medium mit 20% AB-Serum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10% DMSO) überführt und als Zellpellet mit je 5 x 107 Zellen in 1,5 ml Kryoröhrchen abgefüllt. Diese wurden zunächst bei – 80 °C und ab dem folgenden Tag schließlich in Flüssigstickstoff gelagert. 2.2.4 Typisierung der HLA-Oberflächenantigene mittels FACS-Analyse Die Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (engl.: fluorenscence-activated cell sorter, FACS) dient der Charakterisierung von Zellen anhand ihrer Lichtstreuungseigenschaften. Diese variieren je nach Ausprägungsmuster von Oberflächenmolekülen. Mithilfe von monoklonalen Antikörpern (AK), die entweder direkt oder über sekundäre AK an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind, werden die Oberflächenmoleküle markiert. Danach werden die markierten Zellen, die in einer wässrigen Lösung als Einzelzellsuspension vorliegen müssen, über ein Ansaugsystem in die Messkammer gesaugt. Nun wird die Zellsuspension durch Vibration in feine Tröpfchen verteilt, die im Idealfall nur jeweils eine Zelle enthalten. Die so hydrodynamisch fokussierten Zellen passieren in einem Flüssigkeitsstrom in der Messkammer einen Laserstrahl mit monochromatischem Licht. Zum einen werden so die Fluorchrome der Antikörper zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, zum anderen streuen die Zellen selbst das auf sie fallende Licht. Dabei sind Vorwärtsstreulicht (FCS) und Seitwärtsstreulicht (SSC) zu unterscheiden. Ersteres wird in einem geringen Winkel von 3-10 Grad gestreut 34 2. Material und Methoden und korreliert mit der Zellgröße. Zweiteres wird um ca. 90 Grad gestreut und korreliert mit der Oberflächentfaltung der Zelle und der Membrangranularität. Das von den markierten Antikörpern kommende Licht wird durch Spiegel und Farbfilter in Fluoreszenzspektren aufgetrennt und wird dann auf speziellen photosensitiven Detektoren, sogenannten Photomultiplern, aufgezeichnet. Die in dieser Arbeit verwendeten FACS-Antikörper sind mit dem FluoreszenzFarbstoff Fluorescein (FITC) markiert. FITC wird bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt, das Emissionsmaximum liegt bei 530 nm (grün). Detektoren für das Fluoreszenzlicht, welches beim Auftreffen des Laserstrahles auf den Fluoreszenzfarbstoff des Antikörpers entsteht, messen die Dichte der Antigene auf der Zelloberfläche. Mittels FACS-Analyse wurde untersucht, ob die Zellen der Proben das HLA-A2-Allel exprimieren. Durchführung Die Zellen aus den Blutproben der jeweiligen Probanden und MDS- Patienten wurden für die Messung in AB-Medium aufgenommen und bei 1200 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Pro FACS-Röhrchen wurden mindestens 2 x105 Zellen benötigt. Die Zellen wurden nach dem Waschschritt in 2 ml PBS mit 1% FCS aufgenommen. Pro Patient wurden in 2 FACS-Röhrchen je 1 ml dieser Zellsuspension gegeben und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Zu dem Pellet wurde in ein FACS-Röhrchen 10 µl des Fluoreszenzantikörpers Mouse FITC pipettiert. In das zweite FACS-Röhrchen kamen 2 µl des Fluoreszenzantikörpers HLA-A2 FITC hinzu. Diese wurden nun dunkel und kühl für 20 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen. Abschließend erfolgte die Aufnahme der Zellen in mindestens 200 µl PBS. Dieses Volumen wurde von der Zellzahl abhängig gemacht, sodass die Durchflusszahl der Zellen am FACS-Gerät bei der Messung bei etwa 300 Zellen/ Sekunde lag. Unter Verwendung der Software „CellQuestTM“ wurde das Emissionsmuster der jeweiligen Zellen analysiert. Als Positivkontrolle in den Messungen diente die HLA-A2- positive T2- Zelllinie, als Negativkontrolle die HLA-A2- negative K562- Zelllinie. 35 2. Material und Methoden 2.2.5 Isolation der PBMC-Fraktion und Durchführung der „Mixed Lymphocyte Peptide Culture“ MLPC Die Mixed Lymphocyte Peptide Culture, im Folgenden MLPC bezeichnet wurde in der vorliegenden Arbeit nach einem von Elke Jäger veröffentlichten Verfahren durchgeführt [75]. Dieses Verfahren dient dazu, die CD8+-T-Zellpopulation von der CD8- Zellpopulation zu trennen, die CD8- Zellen – also die APC – mit den zu untersuchenden Peptiden in Kontakt zu bringen und sie soweit zu präparieren, dass sie die Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren (Abbildung 4). Tag 0 Die mittels Zellisolation mit Ficoll-Lösung gewonnenen Zellen wurden aus dem eingefrorenen, katalogisierten Bestand genommen und im Wasserbad bei 37 °C in wenigen Minuten aufgetaut. Daraufhin folgte eine dreimalige Zentrifugation für jeweils 10 Minuten bei 1200 U/min bei 20 °C unter Zugabe des PBS- Puffer. Anschließend erfolgte die Zählung der nach dem Auftauen noch lebenden Zellen in der Neubauer-Zählkammer. Um aus dem monoklonalen Zellgemisch die benötigten CD8+-T-Zellen Separationssystem zu verwendet. extrahieren, Die MACS wurde MicroBeads das MicroBeads- sind monoklonale Antikörper (in dieser Arbeit wurden Antikörper gegen CD8 verwendet), an die magnetisch aktive Partikel gebunden sind. Die Antikörper und mit ihnen die gewünschten Zellen können so in einer Magnetsäule von der restlichen Zellpopulation, die nicht das gewünschte Antigen trägt, separiert werden. Pro 1 x 107 Zellen wurden 80µl Separationspuffer und 20µl MicroBeads zugegeben und diese Lösung 15 Minuten im Kühlschrank bei 7 °C inkubiert. Währenddessen wurde die Separationssäule vorbereitet. Hierzu wurde diese unter sterilen Bedingungen an einen Magnetständer gesteckt und mit 500 µl Separationspuffer befeuchtet. Der Efflux wurde verworfen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 5 ml Separationspuffer zur Zelllösung hinzugegeben. Die Zellsuspension wurde in der Zentrifuge 10 Minuten bei 1200 U/min und 20 °C von den überflüssigen Antikörpern freigewaschen. Das Zellpellet wurde dann in 500 µl Separationspuffer aufgenommen. Die gesamte Menge 36 2. Material und Methoden wurde auf die vorbereitete Säule gegeben. Daraufhin folgte noch eine dreimalige Nachspülung der Säule mit je 500 µl Separationspuffer. Abb. 4: Separation von Zellen mittels MACSTM und Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur („Mixed lymphocyte peptide culture“, MLPC) [127] Erläuterung den Pfeilen folgend: Zellen aus dem Buffycoat der Patienten werden mit magnetischen CD8-Antikörpern inkubiert und durch eine magnetische Trennsäule gebracht. Hier bleiben die CD8+-Zellen hängen, während die CD8- -Zellen durchlaufen, aufgefangen und bestrahlt werden. Nach der Bestrahlung werden sie mit den jeweiligen Peptiden gepulst und in einem bestimmten Verhältnis mit den CD8+ -Zellen für 7 Tage bei 37 °C inkubiert, wobei am ersten Tag noch Interleukine 2 und 7 hinzugegeben werden. Die CD8+-T-Zellen blieben in der am Magneten befestigten Säule hängen, während die CD8- Zellfraktion, welche bei der Inkubation keine Antikörper gebunden hat, durch die Säule durchlief und unten in einem Falcon-Röhrchen aufgefangen wurde. Die CD8+-T-Zellen mussten nun aus der Säule gewaschen werden. Dafür wurde die Säule aus dem Magnetständer entfernt. Mit einem Stempel drückte man rasch 1000 µl Separationspuffer durch die Säule. Daraufhin wurde die Zellsuspension auf ein definiertes Volumen mit dem AB-Medium 37 2. Material und Methoden aufgefüllt und in der Zentrifuge zweimal gewaschen. Nun ermittelte man die gewonnene Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer. Die CD8- Zelllfraktion sind die APC. Sie sollen die Peptide erkennen, aufnehmen und auf ihrer Oberfläche zur Erkennung durch die CD8+-T-Zellen präsentieren. Sie wurden dafür zuerst mit 30 Gy einer Cäsium-37-Quelle bestrahlt (Deutsches Rotes Kreuz Ulm, Abteilung Transfusionsmedizin), um zu verhindern, dass die mononukleären Zellen als Reaktion auf die T-Zellen aktiviert wurden und proliferierten. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen in der Zentrifuge gewaschen und auch ihre Zellzahl wurde in der Zählkammer bestimmt. Man berechnete danach die Menge des AB-Mediums, in welchem man die Zellen aufnehmen musste, damit jeweils je 2 x 106 Zellen auf 500 µl AB-Medium kamen. Danach erfolgte die Zugabe von 2,5 µg/ml β2-Microglobulin und anschließend die Aufteilung in verschiedene Röhrchen. Je Röhrchen erfolgte die Zugabe von 20 µg/ml des jeweiligen zu testenden Peptides bzw. keine Zugabe als Leerkontrolle. Die Zellen wurden für 1,5 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die CD8+ Zellfraktion wurde währenddessen auf 1 x 106 Zellen/ml mit AB-Medium verdünnt und anschließend je 500 µl pro Well (Plattenmulde) auf die Well-Platte gegeben. Nach Ende der Inkubationszeit wurde die CD8- Zellfraktionen zentrifugiert und wieder mit 500 µl AB-Medium je 2 x 106 Zellen gelöst. Hier befanden sich nun die APC, welche zum ersten Mal mit dem Antigen in Kontakt gekommen sind. Sie wurden zu den bereits auf der Well-Platte befindlichen CD8+ Zellfraktionen pipettiert. Verhältnis CD8+ –T-Lymphozyten : APCs 1:4. Die verbleibenden Wells der Well-Platte benetzte man mit je 1000 µl PBS-Puffer, um eine Verdunstung der Zellsuspension zu verhindern. Es erfolgte die Inkubation bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank über Nacht. Tag 1 Die MLPC wurde mit Interleukin-2 (2,5 ng/ml) und Interleukin-7 (20 ng/ml) stimuliert und für weitere 7 Tage im Brutschrank inkubiert. 38 2. Material und Methoden Tag 8 Die stimulierten Zellen wurden aus den Wells der Platte resuspendiert und mit frischem AB-Medium gewaschen. Anschließend wurden sie auf 1 x 104 Zellen/50 µl mit AB-Medium verdünnt und zur Auswertung mittels ELISpot-Assay verwendet. 2.2.6 Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten mittels ELISpot-Assays Der Nachweis spezifischer T-Zell-Antworten wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des ELISpot-Assays (enzyme-linked immunospot) durchgeführt. Der Assay basiert auf dem sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und ist ein sehr sensitiver Test zur Analyse von Zellaktivitäten auf Ebene der einzelnen Zelle [26]. Mithilfe des Tests können bei der Immunreaktion sezernierte Zytokin-Moleküle in direkter Umgebung der aktivierten, zytokinproduzierenden T-Zellen nachgewiesen werden. Im Falle der stimulierten CD8+-T-Lymphozyten sind dies unter anderem Interferon-Gamma (IFNγ ) und Granzyme B (GrB). In der vorliegenden Arbeit wurden also IFNγ- und GrB- ELISpot-Assays durchgeführt. Das Grundprinzip des Assays basiert auf Antikörpern, die an ihre Zielstrukturen gebunden werden und im Verlauf durch Färbung sichtbar gemacht werden (Abbildung 5). Der Boden einer Well-Platte wird mit zytokinspezifischen Antikörpern beschichtet. Werden die CD8+-T-Zellen und die Peptid-gepulsten CD8--T-Zellen nach der zweiten Peptidzugabe hinzugegeben, so kommt es zu einer Immunantwort und Freisetzung von Zytokinen, in diesem Fall unter anderem IFNγ und GrB. Durch die Zugabe von Zweitantikörpern, an die ein Enzym gebunden ist und schließlich durch die Zugabe eines Substrates für diese Enzyme, werden die Zytokine nachgewiesen. An der Stelle einer spezifischen Zelle entsteht im letzten Schritt der Reaktion ein sogenannter Spot. Die Gesamtzahl aller Spots in einer Plattenmulde kann schließlich ausgezählt werden. 39 2. Material und Methoden Capture Antibody YYYYYYYYYY Enzyme Conjugate Blocking Add Cells YYYYYYYYYY Detection Antibody YYYYYYYYYY YYYYYYYYYY Wash YYYYYYYYYY YYYYYYYYYY Substrate Development YYYYYYYYYY Abb. 5: Funktionsprinzip eines ELISpot-Assays. Beschreibung den Pfeilen folgend: Zuerst werden die Platten mit Capture-Antikörpern bedeckt, dann kommt die Block-Lösung darauf, die für die Stabilität der Capture-Antikörper sorgt. Es werden angeregte Immunzellen hinzugegeben, die Zytokine abgeben, welche an den Antikörpern haften bleiben. Ein Detection-Antikörper wird hinzugegeben. Ein Enzym bindet daran und spaltet das Substrat zu einem Produkt, welches nach dem Färbungsschritt als Farbpunkt auf dem Plattenboden sichtbar wird. Durchführung: Bei allen Assays wurde eine Positiv- sowie Negativkontrolle mitgeführt. Als Positivkontrolle diente das Influenza-Matrix-Peptid (IMP) - ein intravirales Proteinund/oder das Cytomegalievirus-Antigen (CMV). Die Auswahl der Positivkontrolle wurde aufgrund von bereits vorliegenden früheren Tests mit den jeweiligen Freiwilligen-Blutproben getroffen. Bei Assays mit Zellen aus Blutproben gesunder Personen, die noch nicht auf Vorhandensein der Antikörper gegen CMV und IMP getestet waren, testete man beide Positivkontrollen mit. Aufgrund der hohen Durchseuchungsrate war stets damit zu rechnen, dass bei den Probanden zytotoxische T-Zellen gegen das Influenza-Antigen und/oder das Cytomegalievirus-Antigen vorhanden und im ELISpot nachweisbar sein würden. Als Negativkontrolle inkubierte man einen Ansatz ohne Zugabe von Peptiden, d.h. in dem Ansatz waren nur probandeneigene CD8+-T-Zellen. Als eine positive Reaktion wurden mindestens 10 Spots pro Well definiert in dem optimalen Fall, dass die Negativkontrolle keinen oder nur geringen Hintergrund bildete. Zeigten 40 2. Material und Methoden sich etwas mehr Spots in der Negativkontrolle, so war der Test nur dann positiv zu werten, wenn mehr als das Doppelte der Hintergrund-Spots vorlag. Interferon-γ ELISpot-Assay Tag 1 Platte coaten Die ELISpot-Platten wurden zunächst mit einem monoklonalen humanen IFNγAntikörper (Coating antibody 1-D1K, Mabtech AB) beladen. Dazu wurde der genannte Antikörper mit Coating Buffer auf eine Konzentration von 15 µg/ml verdünnt und hiervon wurde dann 85 µl in jede Well gegeben. Die ELISpot-Platte stellte man danach zum Inkubieren bei 4 °C über Nacht in den Kühlraum. Tag 2 Pulsen der T2-Zellen Aus der regelmäßig kontrollierten T2-Zellkultur wurden 40 ml entnommen und zentrifugiert (10 Minuten bei 1200 U/min, Raumtemperatur). Anschließend nahm man das Zellpellet wieder in AB-Medium auf und die Zellzahl wurde in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die T2-Zellen wurden auf eine Konzentration von 4 x 105 pro 500 µl gebracht und 2,5 µg/ml β2-Mikroglobulin wurde hinzugegeben. Anschließend wurde der Ansatz auf verschiedene FalconRöhrchen aufgeteilt, die Anzahl entsprechend den zu testenden Peptiden und Kontrollen. Nun wurde je Falcon-Röhrchen das entsprechende Peptid hinzugegeben (20 µg/ml). Die Zellen ließ man danach zwei Stunden bei 37 °C und 5% CO2 im Brutschrank mit den Peptiden inkubieren. Platte blocken Die ELISpot-Platten wurden aus dem Kühlraum entnommen und zweimal mit PBS gewaschen (200 µl/Well). Anschließend wurde jede Well mit 100 µl PBS + 10% AB-Serum befüllt und zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Auf diesem Weg erreichte man das Blocken der unspezifischen Bindungsstellen der 41 2. Material und Methoden Anti-Zytokin- Antikörper auf der Platte. Schließlich wurden die Platte nochmals sechsmal mit PBS gewaschen (200 µl/Well). Platte beladen Es war stets wichtig, zu koordinieren, dass Tag 2 der ELISpot-Assays immer auf den Tag 8 der MLPC fiel, denn ab diesem Versuchsschritt kamen die Zellen aus der MLPC wieder dazu. Die entsprechend gepulsten CD8+-Zellen aus der MLPC und T2-Zellen wurden im Verhältnis 1 : 4 in Eppendorfröhrchen gemischt (CD8+Zellen : T-Zellen 1 x 104 : 4 x 104 pro Eppendorfröhrchen). In dem Assay wurden pro Peptid jeweils drei Wells mit dem gleichen Zell-Gemisch versehen, um die Wiederholbarkeit und Genauigkeit des Versuches sicherzustellen. Pro Well der ELISpot-Platte pipettierte man dann 100 µl der Mischung. Zum Wärmeausgleich wurde der Boden der Platte mit Alufolie umwickelt. Die Platte wurde über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Tag 3 Vorbereitung zur Färbung Die ELISpot-Platte wurde erst fünfmal mit PBS (200 µl/Well) gewaschen, dann weitere fünfmal mit PBS und 0,05% Tween-20 (200 µl/Well). Um die sezernierten Zytokine sichtbar zu machen, wurde ein biotinylierter, monoklonaler, humaner IFNγ-Antikörper verwendet. Pro Well wurden 100 µl dieses Antikörpers (Mabtech, 7-B6-1-biotin, Konzentration 1µg/µl, Verdünnung mit PBS/Tween-20) pipettiert. Die Lösung musste nun zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Danach wusch man die ELISpot-Platte sechsmal mit PBS und 0,05% Tween-20 (200 µl/Well) und inkubierte sie im nächsten Schritt bei Raumtemperatur für zwei Stunden mit 100 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (Streptavidin-Alkaline Phosphatase 1 : 1000 in PBS/Tween-20 verdünnt). Nach Ende der Inkubationszeit folgten weitere sechs Waschvorgänge mit PBS und 0,05% Tween-20, sowie zwei weitere mit Substrat-Puffer (jeweils 200 µl/Well). Färbung Zum Entwickeln der Spots wurde eine Substrat-Lösung angesetzt: 42 2. Material und Methoden In lichtarmen Verhältnissen wurde eine Tablette 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) in 500 µl Dimethylformamid gelöst und eine Tablette nitroblue tetrazolium chorid (NBT) in 1 ml Aqua destillata. Anschließend ließ man beide Lösungen durch jeweils einen 0,45 µm Filter durchlaufen. Das Substrat wurde nun unter ebenfalls lichtarmen Bedingungen wie folgt zusammengesetzt: 10 ml Substratpuffer, 330 µl NBT-Stock, sowie 33 µl BCIPStock. Pro Well pipettierte man nun 100 µl. Durch das Zusammenspiel der Streptavidin-Peroxidase und der Substrat-Lösung wurden dann nach und nach die Zytokin-Moleküle als blauer Punkt (Spot) sichtbar. Abstoppen der Enzymatischen Reaktion Nach zwei bis fünf Minuten wurde die ELISpot-Platte dreimal mit 200 µl/Well Aqua destillata gewaschen und über Nacht getrocknet. Auswertung Die Auswertung der Platten erfolgte mit dem ELISpot-Reader, einem Gerät, welches durch ein Programm mit dem PC gekoppelt ist. Nach dem Einlegen der Platte konnte diese mittels eines Motortisches bewegt werden. Es gibt definierte Standarteinstellungen, wie die Platten gelesen werden sollen. Dazu gehören unter anderem die Einstellung der minimalen Spot-Größe und die Sensitivität. Mit dem Programm kann man genau steuern, welcher Teil der Platte gelesen werden soll. Eine Farbkamera mit Autofokus digitalisiert jede Well einzeln. Die Daten wurden anschließend mit einer Software ausgewertet und gespeichert. GranzymeB ELISpot-Assay Tag 1 Platte coaten Die Platten für den Granzyme-B-ELISpot wurden zunächst mit einem monoklonalen, antihumanen Granzyme-B-Antikörper (BD Bioscineces capture antibody, Konzentration 1 mg/ml, Verdünnung 1 : 200 mit PBS-Puffer) beladen. Dafür pipettierte man 100 µl des genannten Antikörpers pro Well. Anschließend wurde die Platte bei 4 °C über Nacht im Kühlraum inkubiert. 43 2. Material und Methoden Tag 2 Pulsen der T2-Zellen Durchführung analog dem Vorgehen beim IFNγ-ELISpot am Tag 2. Platte blocken Die ELISpot-Platten aus dem Kühlraum wurden ein Mal mit 200 µl/Well Blocklösung gewaschen. Anschließend Bindungsstellen der Anti-Zytokin-Antikörper wurden die unspezifischen mit 200 µl Blocklösung pro Well geblockt, indem man sie zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubierte. Platte beladen Durchführung erfolgte analog dem Vorgehen beim IFNγ-ELISpot am Tag 2. Tag 3 Vorbereitung zur Färbung Die Zellsuspension aus dem Brutschrank wurde dekantiert und die Platte zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Eine Einwirkzeit von 3 Minuten war dabei einzuhalten. Dann wusch man die Platte dreimal mit PBS und 0,05% Tween-20 (200 µl/Well). Um das bei der Immunantwort freigesetzte GrB sichtbar zu machen, wurde ein monoklonaler, antihumaner GrB-Antikörper (BD Bioscineces detection antibody, Konzentration 0,5 mg/ml, Verdünnung 1 : 250 mit PBS und 10% FCS) verwendet. Von diesem Antikörper wurden 100 µl pro Well pipettiert. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit verwarf man die Lösung und die Wells wurden dreimal mit 200 µl PBS/Tween-20 gewaschen. Eine Einwirkzeit von 2 Minuten musste auch hier eingehalten werden. Nun wurde in jede Well 100 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (BD Bioscineces Streptavidin-HRP, Verdünnung 1 :100 mit PBS mit 10% FCS) pipettiert und die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend dekantierte man die Lösung und die Platte wurde viermal mit PBS/Tween-20, sowie zweimal mit PBS (jeweils 200 µl/Well) gewaschen. 44 2. Material und Methoden Färbung Zum „Entwickeln“ der Spots musste, wie auch bei dem IFNγ ELISpot-Assay, eine Substrat-Lösung angesetzt werden. In diesem Assay bestand sie aus 5 ml einer AEC-Substrat-Lösung (3-amino-9-ethyl-carbazol, BD Biosciences) sowie 100 µl einer AEC-Chromogen-Lösung (BD Biosciences). Hiervon wurden dann in einem abgedunkelten Raum 100 µl pro Well zügig pipettiert. Abstoppen Nach 5 bis 10 Minuten wurde die Platte dreimal mit 200 µl Aqua destillata pro Well gewaschen und über Nacht getrocknet. Auswertung Die Auswertung erfolgte analog dem Vorgehen beim IFNγ ELISpot. 2.2.7 Statistik Es wurden die Ergebnisse mehrerer Versuchsansätze, die unter gleichen Bedingungen (arithmetischer abgelaufen waren, durch Berechnung Mittelwert (empirische Standardabweichung ) s und von Mittelwerten Standardabweichungen = ) zusammengefasst. Zur Erfassung und Berechnung der Daten wurde das Computerprogramm Microsoft® Excel for Mac 2011 verwendet. 45 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 HLA-Typisierung Da alle Peptidepitope, mit denen gearbeitet wurde, HLA-A2 restringiert sind, musste der HLA- Status der Probanden und Patienten vor den Versuchen getestet werden. Es wurde mit dem HLA-A2 Modell gearbeitet, da dies der am weitesten verbreitete HLA- Typ in der kaukasischen Bevölkerung ist [143]. Die Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (engl.: fluorenscence-activated cell sorter, FACS) dient der Bestimmung der Expression von Oberflächenmolekülen auf Zellen mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern. Zur Bestimmung der HLA-A2 Expression wurde eine Durchflusszytometrie mit dem HLA-A2 Antikörper durchgeführt (BD, Heidelberg, Germany) (Abb. 6 und 7). Die Expression des HLAA2 Oberflächenproteins wäre gemeinsam mit dem Nachweis der PLK1- bzw. der RPS14 mRNA im KM oder im peripheren Blut eine essentielle Voraussetzung für das immunologische Ansprechen der Peptidvakzinierung. Abb. 6: Ergebnis einer fluorenscence-activated cell sorter (FACS)-Analyse eines HLA-A2-negativen Probanden. Linkes Bild: Eingerahmt sind die Lymphozyten, außerhalb des Rahmens sind Monozyten und Detritus. Mittleres Bild: Kontrolle mit murinen IgG-Antikörpern. Die Probandenzellen, die diesen Antikörper (AK) gebunden haben befinden sich oberhalb der Linie. Rechtes Bild: Zellen wurden mit HLA-A2-Antikörpern inkubiert. Nur die Zellen oberhalb der linie haben diese AK auch gebunden. 46 3. Ergebnisse Abb. 7: Ergebnis einer fluorenscence-activated cell sorter (FACS)-Analyse eines HLA-A2-positiven Probanden. Linkes und mittleres Bild: siehe Abb. 6. Rechtes Bild: Fast die gesamte getestete Zellpopulation befindet sich oberhalb der Linie, weil diese die HLA-A2-Antikörper gebunden hat. 3.2 Peptidepitop-Identifikation mittels SYFPEITHI und BIMAS Die Peptidepitope für die Antigene PLK1 und RPS14 mit einer HLA*0201abhängigen Bindung wurden mit Hilfe der im Internet zugänglichen Algorithmen „SYFPEITHI“ [116] (http://www.syfpeithi.de) und „BIMAS“ [109] (http://www- bimas.cit.nih.gov/) ausgewählt. Bei „SYFPEITHI“ handelt es sich um eine Datenbank von MHC-Liganden und Peptidmotiven. Sie analysiert PeptidSequenzen, die MHC-Moleküle der Klasse I und II binden. „BIMAS“ basiert auf einem ähnlichen Prinzip wie „SYFPEITHI“. Aufgrund der Scores wurden die vielversprechendsten Peptide ausgewählt. Für PLK1 wurden es vier Peptide, für RPS14 zwei Peptide. Diese sind in Tabelle 7 und 8 dargestellt. Die Reinheit der Peptide beträgt mindestens 95%, was mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kontrolliert wurde. Sie wurden in DMSO gelöst und mit PBS verdünnt, sodass die Konzentration letztlich 1 µg/ml betrug. Die Konzentration der Peptid-Lösungen, die zum Pulsen der Kulturen verwendet wurden, betrug 20 µg/ml. 47 3. Ergebnisse Tab. 7: Ergebnis einer SYFPEITI-Analyse für HLA-A*0201 restringierte PLK1- Epitope HLA-A*0201 nonamers Pos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 score 471 S L M K K I T L L 28 542 I L C P L M A A V 28 376 D M L Q Q L H S V 26 269 S I P K H I N P V 25 273 H I N P V A A S L 25 373 H L S D M L Q Q L 25 443 I L Y N D G D S L 25 426 Q L C D N S V G V 24 522 I L H L S N G S V 24 82 K I V P K S L L L 23 Tab. 8: Ergebnis einer SYFPEITI-Analyse für HLA-A*0201 restringierte RPS14- Epitope HLA-A*0201 nonamers Pos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 score 118 A L A R S G M K I 24 16 S L G P Q V A E G 22 92 A L H I K L R A T 22 89 G I T A L H I K L 21 111 G A Q S A L R A L 20 22 A E G E N V F G V 19 9 K K E E Q V I S L 18 13 Q V I S L G P Q V 48 3. Ergebnisse 3.3. Untersuchung der Immunogenität der PLK1 3.3.1 Auswahl der Peptidsequenzen Die als Ergebnis der Internet-basierten Analyse ausgewählten und auf Immunogenität getesteten Peptide des potentiellen Tumor-Antigens PLK1 sind in Tabelle 9 aufgelistet. Tab. 9: Eigenschaften der ausgewählten, von Polo-Like-Kinase-1 (PLK1) abgeleiteten Peptid-Epitope Name Sequenz Restriktion PLK1 Peptid 1 QLCDNSVGV HLA-A *0201 PLK1 Peptid 2 ILCPLMAAV HLA-A *0201 PLK1 Peptid 3 SLMKKITLL HLA-A *0201 PLK1 Peptid 4 DMLQQLHSV HLA-A *0201 Die Aminosäuresequenzen der für die Positivkontrollen verwendeten Peptide, sowie die Methode zur Negativkontrolle sind Tabelle 5 zu entnehmen. 3.3.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen PLK1 Als Beispiel der 12 Versuche sind in Abbildung 8a die Messwerte für die GrBFreisetzung der T-Lymphozyten eines gesunden Probanden nach Stimulation mit den PLK1-Peptiden 1 bis 4 mit IMP, CMV, sowie ohne Stimulation (NegativKontrolle) dargestellt. PLK1-1 steht dabei für das PLK1 abgeleitete Peptid-Epitop 1. Analog verhält es sich mit den Epitopen 2 bis 4. IMP und CMV sind die bereits vorbeschriebenen Positivkontrollen. „No peptide“ ist die Bezeichnung des LeerAssays und stellt die Negativkontrolle dar. 49 3. Ergebnisse Abb. 8a: GranzymeB- ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen vier Peptide des PLK1 eines gesunden Probanden PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW: Mittelwert Die höchste Zahl an gezählten Spots sieht man für Zellen, die mit dem Cytomegalievirus-Antigen gepulst wurden. Somit liegt eine gelungene PositivKontrolle vor. Die Positivkontrolle mit dem Influenza-Major-Protein ist schwächer ausgeprägt. Desweiteren lassen sich Spots für alle Peptide der PLK1 erkennen. Gegen das PLK1 Peptid1 zeigt sich bei diesem Probanden die stärkste Immunantwort. Die Negativkontrolle zeigt eine nur geringe Reaktion und wurde als Negativ gewertet. Abbildung 8b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch den ELISpot-Reader. 50 No peptide CMV IMP PLK1-4 PLK1-3 PLK1-2 PLK1-1 3. Ergebnisse Abb. 8b: GranzymeB- ELISpot-Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle 3.3.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assay gegen PLK1 In Abbildung 9a sind die Messwerte für die IFNγ-Freisetzung in einer MLPC eines gesunden Probanden nach Stimulation mit den PLK1-Peptiden 1 bis 4 mit IMP, sowie ohne Stimulation (Negativ-Kontrolle) dargestellt. Abb. 9a: Interferon γ-ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen vier Peptide der PLK1 eines gesunden Probanden PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW: Mittelwert 51 3. Ergebnisse Auch hier sieht man die höchste Zahl an Spots für T-Zellen, die mit dem Cytomegalievirus-Antigen als Positivkontrolle gepulst wurden. Desweiteren sticht PLK1 Peptid 1 auch hier durch eine höhere Zahl an Spots hervor und wurde als positiv gewertet. Alle anderen Peptide, einschließlich der Leerkontrolle, zeigen eine geringe, unspezifische Reaktion, die als negativ gewertet wurde. Im Folgenden ist die fotografische Auswertung der ELISpot-Platte durch den No peptide CMV IMP PLK1-4 PLK1-3 PLK1-2 PLK1-1 ELISpot-Reader wiedergeben: Abb. 9b: Interferon γ-ELISpot- Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden PLK1- 1 bis 4: Peptid 1 bis 4 der vier PLK1- abgeleiteten Peptide; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle) ; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle 3.3.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen PLK1- Epitope bei gesunden Probanden Tabelle 10 veranschaulicht die Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen die 4 Peptidepitope der PLK1. Es wurden insgesamt 12 Proben gesunder Probanden mit jeweils einem GrB- und einem IFNγ- Assay auf ihre Immunantwort gegen die PKL1- Peptide untersucht. Bei keinem der 12 GrB-Assays war eine spezifische Immunantwort gegen CD8- -T-Zellen nachzuweisen, sie zeigte sich allerdings bei 4 der 12 IFNγ- Assays. Bei allen dieser 4 Probanden konnte man aber eine deutliche Steigerung der Immunantwort nach Peptidstimulation im IFNγ- Assay beobachten. 52 3. Ergebnisse Die von PLK1 abgeleitete Peptide 3 und 4 zeigten in den Versuchen eine nur geringe Frequenz spezifischer Immunantworten (Peptid-3 8% und Peptid-4 17%). Bei den anderen beiden Peptiden konnte man eine höhere Frequenz beobachten (Peptid-1 25% und Peptid-2 33%). Tab. 10: Ergebnisse der ELISpot-Assays mit 4 Peptiden des PLK1 PLK1 Positive Assays Prozent positiver Assays CMV/IMP 12/12 100 1 3/12 25,0 2 4/12 33,3 3 1/12 8,3 4 2/12 16,6 Pepdidnummer CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle) 3.4. Untersuchung der Immunogenität des RPS14 3.4.1 Auswahl der Peptidsequenzen Die potentiell immunogenen Epitope des Ribosomal Protein S14 (RPS14) wurden ebenfalls basierend auf den Ergebnissen der „SYFPEITHI“ Software ausgesucht und sind in Tabelle 8 dargestellt. Dabei wurden 2 Epitope als besonders geeignet eingestuft (Tabelle 11). Tab. 11: Eigenschaften der ausgewählten, von Ribosomal Protein S14 (RPS14) abgeleiteten PeptidEpitope Name Sequenz Restriktion RPS14 Peptid 1 AEGENVFGV HLA-A *0201 RPS14 Peptid 2 ALARSGMKI HLA-A *0201 53 3. Ergebnisse 3.4.2 Etablierung eines GrB ELISpot-Assays gegen RPS14 Im Schaubild 10a sind die Daten eines der ausgewerteten Versuche zusammengefasst, welches die Ausschüttung von GrB durch die CD8+-T-Zellen darstellt. Dies geschieht nur, wenn eine Immunantwort stattfindet. RPS14-1 bezeichnet das RPS14 abgeleitete Peptid 1. Analog dazu verhält es sich mit RPS14-2. CMV und IMP sind die beiden Positivkontrollen. No pep ist die Negativkontrolle ohne Peptidzusatz. Abb. 10a: Granzyme B - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide des RPS14 eines gesunden Probanden RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW: Mittelwert Die ELISpot-Reader Software hat hier nur wenige Punkte bei „No peptide“, der Negativkontrolle, sowie bei dem RPS14 – Peptid 2 und dem Influenza-MajorProtein ausgezählt. Die Immunreaktionen sind in diesem Fall als negativ zu werten. Die meisten Spots wurden bei der Positivkontrolle in Form des CMVAntigens und bei dem RPS14-Peptid 1 gezählt. Diese beiden Peptide sind als positiv zu werten. Abbildung 10b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch den ELISpot-Reader. 54 No peptide CMV IMP RPS14-2 RPS14-1 3. Ergebnisse Abb. 10b: Granzyme B - ELISpot-Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle 3.4.3 Etablierung eines IFNγ-ELISpot-Assays gegen RPS14 Im Schaubild 11a sieht man das Verteilungsmuster der Interferon-gamma Ausschüttung eines gesunden Probanden beim artifiziellen Herbeirufen einer Immunantwort in vitro mit Zugabe der beiden RPS14 abgeleiteten Peptide. Abb. 11a: Interferon γ - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide des RPS14 eines gesunden Probanden RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; MW: Mittelwert 55 3. Ergebnisse Mit über 600 gezählten Spots ist die Immunantwort auf das CytomegalievirusAntigen am ausgeprägtesten. Damit ist in diesem Versuch die Positivkontrolle definitiv bestätigt. Teilweise war es bei so überschießenden Positiv-Reaktionen schwierig, die genaue Spot-Zahl zu ermitteln, da das Programm Schwierigkeiten hatte aus der homogen dunkel gefärbten Fläche eine Spotzahl zu errechnen. Bei der Negativkontrolle waren in diesem Versuch beinahe keine Punkte zu verzeichnen und damit ist auch diese bestätigt. Die beiden RPS14 abgeleiteten Peptidepitope 1 und 2 zeigten eine Immunantwort mit im Durchschnitt 100 Spots. Somit sind sie beide in diesem Versuch als Positiv zu werten. Abbildung 11b zeigt die fotografische Auswertung derselben ELISpot-Platte durch No peptide CMV RPS14-2 RPS14-1 den ELISpot-Reader. Abb. 11b: Interferon γ - ELISpot- Platte. Immunreaktion eines gesunden Probanden RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle 3.4.4 Ergebnisse der ELISpot-Assays gegen RPS14- abgeleitete Peptidepitope bei gesunden Probanden Da die ELISpot-Assays gegen die beiden RPS14 abgeleiteten Peptide zusammen mit den PLK1 Assays durchgeführt worden sind, sind die Angaben zu den Immunreaktionen der Probanden-Zellen auf die probandeneigenen CD8--T-Zellen ohne Peptidzugabe mit den PLK1-Versuchen identisch. Anhand der Tabelle 12 kann man sehen, dass die Frequenz der positiv gewerteten spezifischen Immunantworten gegen die RPS14- abgeleiteten Epitope 56 3. Ergebnisse deutlich höher war, als gegen die PLK1. In den Versuchen konnte in 25% der Fälle eine spezifische Immunantwort gegen Peptid-2 beobachtet werden. Gegen das RPS14 abgeleitete Peptid-1 zeigten 50% der Probanden eine spezifische zelluläre Immunantwort. Tab. 12: Ergebnisse der ELISpot-Assays mit 2 Peptiden des Rps14 RPS14- Peptid-Nr Positive Assays Prozent positive Assays CMV/IMP 12/12 100 1 6/12 50 2 3/12 25 CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle) 3.5 Zelluläre Immunantwort gegen RPS14 beim Patientenkollektiv; zusätzlich Lenalidomidzugabe 3.5.1 Immunogenität der beiden RPS14- abgeleiteten Peptide Mit Hilfe des ELISpot-Assays wurden spezifische zelluläre Immunantworten gegen RPS14 -abgeleitete Peptid-Epitope nachgewiesen. Der nächste sinnvolle Schritt war es, die Epitope in den etablierten ELISpot-Assays mit Zellen aus Blutproben von Patienten zu testen. Es wurden Blutproben von MDS Patienten mit einer Deletion am q-Arm des Chromosom 5 (5q- MDS), sowie von MDS Patienten ohne einer solchen Deletion (non-5q- MDS) verwendet. In den folgenden Versuchen wurde zusätzlich auch die Wirkung des Immunmodulators Lenalidomid, welcher als „First-line-Therapie“ bei dem 5q- Syndrom eingesetzt wird, auf seine Wirkung bei der zellulären Immunantwort getestet. Die Assays wurden also stets im gleichen Versuch mit und ohne Lenalidomid-Zugabe durchgeführt. Vier der Patienten, deren Blutproben in den Versuchen verwendet wurden, haben sich einer Lenalidomidtherapie unterzogen, von ihnen hat man Blutproben vor und nach der Lenalidomidtherapie entnommen. Diese wurden auf Veränderungen der Intensität der zellulären Immunantwort untersucht. Da ein Leitsymptom des MDS Panzytopenie ist, war es teilweise sehr schwierig Blutproben mit ausreichender Zellzahl für die Versuche zu gewinnen. Sofern die vorhandene Zellzahl nicht zum Testen aller Peptide mit und ohne Lenalidomid 57 3. Ergebnisse reichte, wurde Peptid 2 (RPS14-2) weggelassen und nur Peptid 1 (RPS14-1) getestet, da dieses erfolgversprechendere Ergebnisse bei gesunden Probanden gezeigt hatte. Die optimale Konzentration von Lenalidomid wurde sorgfältig anhand von Titrationsversuchen ausgesucht und betrug in allen Versuchen 50mM. Auch in diesen Versuchen wurde eine Positivkontrolle mit Influenza-Matrix-Protein und dem Cytomegalievirus-Antigen, sowie ein Leerassay als Negativkontrolle mitgeführt. Insgesamt wurden 10 Patienten-Proben untersucht: Fünf 5q- MDS-Patienten und fünf non-5q- MDS-Patienten (ihre Charakteristika siehe Tabelle 6). Die Ergebinsse einer 5q- MDS-Patientin waren dabei aufgrund von zu zahlreichen Spots in der Negativkontrolle nicht auswertbar. In alle Auswertungen gehen daher nur 9 Patienten mit ein. Sowohl gegen das Peptid 1, als auch das Peptid 2 des RPS14 konnte in vitro eine zelluläre Immunantwort ausgelöst werden (Tabelle 13 und 14). Tab. 13: Positive Granzyme B Assays bei 5q- und non-5q- MDS- Patienten Granzyme B RPS14 Positive Assays Prozent positive Assays CMV/IMP 9/9 100 1 3/9 33,3 2 3/6 50,0 Pepdidnummer CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle) Tab. 14: Positive Interferon γ- Assays bei 5q- und non-5q- MDS- Patienten Interferon Gamma RPS14 Positive Assays Prozent positive Assays CMV/IMP 9/9 100 1 5/9 55,5 2 4/6 66,6 Pepdidnummer CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle) 58 3. Ergebnisse Die GrB und IFNγ- Assays eines Patienten wurden stets parallel durchgeführt. Eine Immunantwort durch die Ausschüttung des Interferon- Gamma konnte jedoch insgesamt häufiger nachgewiesen werden, als durch das GrB. In den Tabellen 13 und 14 kommt ebenfalls zur Darstellung, dass das Peptid 2 mit 50% in den GrBAssays und 66,6% in den IFNγ- Assays etwas häufiger zur positiven Immunreaktion führte, als das Peptid 1 mit 33,3% in den GrB- Assays und 55,5% in den Interferon-Gamma- Assays. Beim Vergleich der Gesamthäufigkeit der positiv gewerteten Assays unter den beiden Patientengruppen 5q- MDS und non-5q- MDS konnte man zeigen, dass diese mit 45% zu 50% beinahe gleich sind. In den Versuchen mit den Blutproben der 5q- MDS-Patienten konnte eine spezifische Immunantwort gegen Peptid 2 häufiger, als gegen das Peptid 1 beobachtet werden. Bei den non-5q- MDSPatienten gab es keine solche Dominanz eines Peptids. Die Häufigkeit der positiven Reaktion beider Peptide in den Versuchen im Vergleich zu der Häufigkeit der positiven Reaktion nur eines der beiden Peptide betrug 50%. 3.5.2 In vitro Effekt von Lenalidomid Das Einbringen des Immunmodulators Lenalidomid in die Versuche war anfangs nur experimentell gedacht, doch nachdem sich erste positive Ergebnisse gezeigt hatten, wurden weitere Versuche unternommen. Bei jedem Patienten wurden schließlich, soweit die Zellzahlen ausreichten, die Versuche mit und ohne in vitro Lenalidomidzugabe durchgeführt. Abbildungen 12a bis 13b zeigen das IFNγ ELISpot-Assay der Patientin Nr. 10 und das GrB- Assay- Pendant dazu – jeweils mit den dazugehörenden ELISpot-Platten. Steht hinter der Substanzbezeichnung ein „+L“ (z.B. RPS14-1+L), so bedeutet dies, dass in diesen Wells Lenalidomid als Zusatz erfolgte. 59 3. Ergebnisse Abb. 12a: Interferon γ (IFNγ) - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen die beiden Peptide des RPS14 eines non-5q- MDS-Patienten. RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Die ELISpot-Reader-Softwear hat eine deutlich höhere Spotzahl in den Wells mit Lenalidomid gezählt, als in den Wells ohne. Außer bei Peptid 2 des RPS14- Gens, welches durch die Zugabe des Medikaments gleichbleibend positiv reagiert, No peptide IMP+L CMV+L RPS14-2+L RPS14-1+L IMP CMV RPS14-2 RPS14-1 stimuliert die in vitro Lenalidomidzugabe in diesem Versuch die Immunantwort. Abb. 12b: Interferon γ - ELISpot- Platte. Immunreaktion des Patienten Nr. 10 60 3. Ergebnisse RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro Zugabe von Lenalidomid Die Wells der rechten Plattenhälfte (ausgenommen die Negativkontrolle ganz rechts) zeigen mehr Spots, als die der linken Plattenhälfte. In der rechten Plattenhälfte wurde Lenalidomid in vitro hinzugefügt (+L). Abb. 13a: Die Abbildung zeigt die Auswertung des Granzyme B (GrB) - Assay- Pendant zu dem Interferon γ - Assay aus Abb. 12a RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle: w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Auch dieses Assay zeigt, dass die in vitro Zugabe von Lenalidomid die Immunantwort gegen die meisten Peptide stimuliert (rechte Bildhälfte). Die Immunantwort gegen Peptid 2 des RPS14-Gens wird unter Lenalidomidzugabe eher unterdrückt. 61 No peptide IMP+L CMV+L RPS14-2+L RPS14-1+L IMP CMV RPS14-2 RPS14-1 3. Ergebnisse Abb. 13b: Zugehörige ELISpot-Platte zu dem Granzyme B- Assay des Schaubildes 13a RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; CMV: Cytomegalie Virus (Positivkontrolle); IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro Zugabe von Lenalidomid Die vorgestellten Assays des Patienten Nr. 10 zeigen, dass die in vitro Lenalidomidzugabe immunstimulierend wirken kann. Vor allem bei dem InterferonGamma- Assay (Abb. 12a und 12b) wird deutlich sichtbar, dass die Anzahl der Spots in dem rechten Bildteil der Platte zugenommen hat. Das Peptid 1 des RPS14 und CMV, die man in diesem Fall ohne Lenalidomidzugabe als nicht immunogen beschrieben hätte, lösen unter dem in vitro Zusatz des Immunmodulators eine deutliche Immunreaktion aus. Der immunstimulierende Effekt konnte allerdings nicht in allen Versuchen homogen nachgewiesen werden. Ganz im Gegensatz zu der positiven Wirkung von Lenalidomid auf die Immunreaktion, die hier am Beispiel des Patienten Nr. 10 dargestellt wurde, konnte sich Lenalidomid auch negativ auf die zelluläre Immunantwort auswirken. Ein Beispiel dafür zeigen ein Interferon-Gamma- Assay und ein Granzyme-BAssay von der Patientin Nr. 6 mit den dazugehörenden ELISpot-Platten (Abbildungen 14a bis 15). 62 3. Ergebnisse Abb. 14a: Interferon γ (IFNγ ) -ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen das RPS14abgeleitete Peptid 1 eines non-5q- MDS-Patienten. RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Aufgrund von bestehender Panzytopenie konnte der Versuch mit den Blutproben dieser Pateintin nur mit einem der beiden Peptide und nur mit IMP als Positivkontrolle durchgeführt werden. Die Spotzahl in den Wells ohne Lenalidomid ist in diesem Versuch deutlich höher, als in den Wells mit Lenalidomid. Bei dieser Patientin wirkt sich der Immunmodulator immunsupprimierend auf die T-ZellAntwort aus. Das Peptid 1 des RPS-14-Gens löste in diesem Versuch keine No peptide IMP+L RPS14-1+L IMP RPS14-1 Immunantwort aus. Abb. 14b: Fotografisch ausgelesene Platte des Interferon γ - ELISpot-Assays der Patientin Nr. 6 63 3. Ergebnisse RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Die Wells der rechten Plattenhälfte zeigen weniger Spots, als die der linken Plattenhälfte. In der rechten Plattenhälfte wurde Lenalidomid in vitro hinzugefügt (+L). An der Positivkontrolle (IMP) sieht man, dass in diesem Fall die in vitro Zugabe von Lenalidomid immunsuppressive Wirkung auf die T-Zell- Antwort hatte. Bei der Positivkontrolle IMP ist die Spotszahl so groß, dass diese konfluieren und die Wells homogen dunkelblau imponieren, während IMP+L zwar ebenfalls positiv gewertet werden kann, jedoch ist die Spotszahl hier deutlich geringer. Abb. 15a: Auswertung eines Granzyme B (GrB) - ELISpot-Assay der Patientin Nr. 6 mit und ohne in vitro Lenalidomidzugabe (+L) RPS14-: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Die ausgezählte Spotzahl in den Wells ohne Lenalidomid ist deutlich größer, als in den Wells mit Lenalidomid. Bei dieser Patientin wirkt sich der Immunmodulator immunsupprimierend auf die T-Zell- Antwort aus. 64 No peptide IMP+L RPS14-1+L IMP RPS14-1 3. Ergebnisse Abb. 15b: Platte des Granzyme B - ELISpot- Assays der Patientin Nr. 6 RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Die Positivkontrolle IMP löst korrelierend mit der IFNγ- Assay (Abb. 14b) eine schwächere Immunreaktion unter Lenalidomidzugabe aus, als ohne Lenalidomid. In den oben abgebildeten GrB und Interferon-γ ELISpot-Assays und den dazugehörenden Platten sieht man, dass die Intensität und Dichte der Spots ohne Lenalidomidzugabe (in der linken Bildhälfte) deutlich stärker ist, als unter Zugabe des Immunmodulators (rechte Bildhälfte). Die in vitro zelluläre Immunantwort dieser Patientin wurde also durch das Medikament unterdrückt. Unter Betrachtung der ELISpot-Assays der Patienten Nr. 10 und Nr. 6, konnten wir folglich zeigen, dass Lenalidomid die zelluläre Immunantwort in vitro sowohl steigern, als auch supprimieren kann. Die zusätzliche in vitro Lenalidomidzugabe erfolgte bei 9 von 10 Patienten. Die Auswertungen der Lenalidomidwirkung in den Patientenassays ist der folgenden Tabelle 15 zu entnehmen. 65 3. Ergebnisse Tab. 15: Lenalidomidwirkung auf die Immunantwort in den ELISpot-Assays mit Patientenproben Patientennummer, MDS-Art 1. 5q- MDS 2. 5q- MDS 3. 5q- MDS 3. nach Lenalidomidtherapie 4. 5q-MDS 4. Ztp.1 nach Lenalidomidtherapie 4. Ztp.2 nach Lenalidomidtherapie 5. 5q- MDS 6. non-5q- MDS 6. nach Lenalidomidtherapie 7. non-5q- MDS 8. non-5q- MDS 8. nach Lenalidomidtherapie 9. non-5q- MDS 10. non 5q- MDS Interferon-Gamma RPS14-1 RPS14-2 +-+ ⇑ ⇑ ++- ++- CMV IMP ⇓ ⇑ +⇓ ++- +- Gr-B RPS14-1 ++- RPS14-2 ++- CMV IMP ⇓ ⇑ ++- ++- ++- +⇓ +- KEINE LENALIDOMID-ZUGABE WEGEN ZELLMANGEL ⇓ ++++- ⇓ ⇓ ⇓ NICHT AUSWERTBAR, POSITIVE NEGATIVKONTROLLE ⇓ ++⇓ ++- ⇓ +++- +- ⇑ ⇑ ⇑ ⇑ +- ⇑ ⇑ +- +- +- +++- ⇓ +- KEINE LENALIDOMID-ZUGABE WEGEN ZELLMANGEL ⇑ ⇑ ⇓ +++- Erläuterung: In dieser Tabelle ist die Lenalidomidwirkung auf die Immunantwort der Patientenproben dargestellt. Ein Pfeil nach oben (⇑) bedeutet eine Zunahme der Spotzahl um mindestens das Doppelte des Ausgangswertes nach der in vitro Lenalidomidzugabe. Ein Pfeil nach unten (⇓) bedeutet dementsprechend die Abnahme der Spotzahl um mindestens das Doppelte des Ausgangswertes. Mit dem Symbol „+-„ ist keine signifikante Veränderung der Spotzahl nach der in vitro Lenalidomidzugabe gekennzeichnet. Ist ein Feld durchgestrichen, so bedeutet dies, dass das Peptid nicht mituntersucht wurde. Patienten, bei denen man Blutproben vor und nach Lenalidomidtherapie untersucht hat, sind grau unterlegt. Hat die Spotzahl nach der in vivo Lenalidomideinnahme in den Versuchen insgesamt zugenommen, wurde das Feld mit der Patientennummer mit einem dunkleren Grauton unterlegt Da die Zellzahlen sogar zu niedrig waren, um in jedem Versuch alle essentiellen Peptide zu untersuchen , konnten schließlich nur 4 5q- MDS-Patienten und 4 non5q- MDS-Patienten auf die in vitro Wirkung von Lenalidomid untersucht werden. Die in vitro Zunahme von Lenalidomid steigerte die Immunantwort auf das Peptid RPS14-1 in den Interferon-Assays der Patienten Nr. 2 und Nr. 10 und auf das Peptid RPS14-2 nur in dem Interferon-Assay von dem Patienten Nr. 2. In den GranzymeB-Assays konnte bei keinem Patienten eine Steigerung der Immunantwort auf ein Peptid unter in vitro Lenalidomid beobachtet werden. 66 3. Ergebnisse Bei den Positivkontrollen bewirkte die Zugabe von Lenalidomid bei 4 von 9 Patienten eine Abnahme der Immunantwort bei weiteren 4 von 9 eine Zunahme. Bei einem Patienten konnte keine Veränderung beobachtet werden. 3.5.3 In vivo Effekt von Lenalidomid Wie bereits erwähnt, konnte man bei 4 Patienten Blutproben mit genügender Zellzahl vor und nach einer Behandlung mit Lenalidomid gewinnen. Die Patientin Nr. 6, deren ELISpot-Ergebnisse in den Abbildungen 14a bis 15b dargestellt und besprochen wurden, war eine davon. Folgende Bilder 16a bis 17b zeigen die ELISpot-Assays der gleichen Patientin nach abgeschlossener Lenalidomidtherapie. Bei fortgeschrittener Panzytopenie wurden nur das Peptid 1 und die Positivkontrolle mit und ohne in vitro Lenalidomidzugabe getestet. Abb. 16a: Interferon γ (IFNγ) - ELISpot-Messwerte einer Immunreaktion gegen das RPS14abgeleitete Peptid 1 eines non-5q- MDS-Patienten (Patientin Nr. 6) nach Lenalidomidtherapie. In der rechten Bildhälfte ist der gleiche Versuch unter in vitro Lenalidomidzugabe (+L) ausgewertet RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid 67 3. Ergebnisse Die Negativkontrolle in diesem Versuch wurde mit durchschnittlich 30 Spots pro Well ausgewertet und festgelegt. Somit kann nach den Auswertungskriterien nur die Positivkontrolle ohne Lenalidomidzugabe (IMP) als eindeutig T-Zellimmunogen gewertet werden, da hier deutlich über 60 Spots gezählt wurden. Unter Zugabe von Lenalidomid (IMP+L) kann sie nur noch als grenzwertig positiv No peptide IMP+L RPS14-1+L IMP RPS14-1 gewertet werden. Abb. 16b: Zu dem Interferon γ - Assay aus der Abb. 16a gehörende digital-fotografisch eingelesene ELISpot- Platte RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Im Vergleich zu dem IFNγ- Assay mit der Blutprobe der gleichen Patientin vor ihrer Therapie mit Lenalidomid ist ein deutlicher Spotzahl-Rückgang zu beobachten (Abb. 14a und b). 68 3. Ergebnisse Abb. 17a: Auswertung eines Granzyme B ( GrB) - Assays der Patientin Nr. 6 nach abgeschlossener Lenalidomidtherapie RPS14-1 und -2: RPS14 – abgeleitete Peptide 1 und 2; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; w: well (Plattenmulde); MW: Mittelwert; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid Wie man in der Auswertung der Negativkontrolle (no pep) sieht, war hierbei keinerlei spezifische Immunantwort gegen CD8+-T-Zellen nachzuweisen. Die Positivkontrollen sind mit und ohne Lenalidomitzusatz bei dem niedrigen Spothintergrund der Negativkontrolle als positiv zu werten, mit Lenalidomid jedoch No peptide IMP+L RPS14-1+L IMP RPS14-1 deutlich schwächer ausgeprägt. Abb. 17b: Zu dem Granzyme B - Assay aus der Abb. 17a gehörende ELISpot- Platte RPS14-1: RPS14 – abgeleitetes Peptid 1; IMP: Influenza Matrix-Protein (Positivkontrolle); No Peptide: Negativkontrolle; +L: unter in vitro - Zugabe von Lenalidomid 69 3. Ergebnisse Im Vergleich zu dem GrB- Assay der gleichen Patientin vor der Therapie mit Lenalidomid ist - analog der IFNγ- ELISpot- Platte - ein deutlicher SpotzahlRückgang zu beobachten (Abb. 15b). Insgesamt konnte man beobachten, dass der in vitro Effekt bei zwei von vier Patienten weitestgehend mit dem in vivo Effekt korrelierte und zwar bei dem oben beschriebenen Patienten Nr. 6. (non-5q- MDS), dessen Spotzahlen unter Lenalidomid in vivo, sowie in vitro zurückgingen und bei dem Patienten Nr. 8 (non 5q- MDS), bei dem Lenalidomid in vivo und in vitro die Immunantwort steigerte. Bei den anderen zwei Patienten änderte sich die Spotzahl nach der in vivo Lenalidomid-Einnahme nicht signifikant (Patient Nr. 3 und Nr. 4 ). Bei diesen Patienten bewirkte Lenalidomid in vitro eine Abnahme der Immunantwort. Beide sind 5q- MDS- Patienten. Es ist in den Versuchen damit eindeutig gezeigt worden, dass Lenalidomid sich auf die T-Zell-vermittelte Immunantwort auswirken kann und es ist durchaus im Rahmen des Denkbaren, dass dieses Medikament aus nicht geklärten Gründen individuell abhängig wirken kann. Eine Hypothese wäre dabei, dass die in vitro und in vivo Wirkung von Lenalidomid nicht nur miteinander, sondern auch mit der Klinik des Patienten korreliert. Die Patientin Nr. 6, deren Immunreaktionen auf das RPS14- abgeleitete Peptid-Epitop 1 in den Abbildungen 14a bis 17b dargestellt sind, hat nicht nur in vitro und in vivo mit einer geringeren Immunreaktion unter Lenalidomid reagiert, sondern zeigte sich bei ihr auch klinisch eine Verschlechterung unter dem Medikament, sodass die Therapie mit dem Immunmodulator abgebrochen werden musste. Die Blutproben der anderen Patienten, die sich der Therapie unterzogen haben, wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Therapie entnommen und somit bleibt offen, ob der Zeitpunkt der Entnahme ebenfalls einen Einfluss auf das Ergebnis hatte. 70 4. Diskussion 4. Diskussion Derzeit entwickeln sich eine Vielzahl neuer und interessanter Therapiemöglichkeiten myeloischer Neoplasien, wie der AML und dem MDS. Unter anderem zeigen Immuntherapien vielversprechende Ergebnisse. Zur Weiterentwicklung dieser Therapieform ist die Identifikation und Charakterisierung geeigneter Targetstrukturen notwendig [70]. Bei der AML wurden deshalb in der vorliegenden Arbeit vier mögliche immunogene Epitope von PLK1 aus der Familie der Serin/Threonin Kinasen untersucht. Die Überexpression dieses in die Mechanismen der Centrosomenreifung und Chromosomen-Segregation involvierten Gens wird in der Literatur bei vielen Tumorerkrankungen und speziell auch AML, sowie weiteren Leukämieformen beschrieben [14, 119]. Bei dem 5q- Syndrom wurden zwei Epitope von RPS14 als potentielle Zielstrukturen einer Immuntherapie untersucht. RPS14 ist das Schlüsselgen des 5q- Syndroms [31]. Diesem in der Literatur beschriebene längere erkrankungsfreien Überleben und Gesamtüberleben der Patienten mit dieser speziellen MDS-Form könnte möglicherweise eine spezifische Immunreaktion gegen RPS14 zugrunde liegen. Methoden und Durchführung Im Rahmen der Immunogenitätsprüfung der beiden potentiellen Zielstrukturen wurden GrB und IFNγ- ELISpot- Assays gegen die PLK1- und RPS14- Epitope etabliert. ELISpot-Assays sind seit Langem als etablierte Tests zum Nachweis von spezifischen T-Zell-Antworten gegen LAAs anerkannt [123, 128]. Da in der kaukasischen Bevölkerung HLA-A2 mit über 40% den häufigsten HLAGenotyp darstellt, wurden in der vorliegenden Arbeit ausschließlich HLA-A*0201 restringierte Peptide verwendet [143]. Durch diese Maßnahme sollte eine breitere Anwendbarkeit der potentiellen peptidgerichteten Immuntherapie erreicht werden. Vor Auswahl der Probanden- und der Patientenproben wurde daher stets eine HLA- Typisierung durchgeführt. Da die Patientenproben rar sind, wurde die T-Zell-Antwort auf die ausgewählten Peptidepitope sowohl für PLK1, als auch für RPS14 zunächst an Blutproben 12 gesunder Probanden untersucht. 71 4. Diskussion PLK1 als potentielle Targetsrtuktur der Immuntherapie Bei der Untersuchung der PLK1- abgeleiteten Peptidepitope zeigten dabei 4 von 12 ELISpot- Assays (33,3%) eine deutlich über der Negativ-Kontrolle liegende Spot-Zahl für das Peptid 2. Das Peptid 1 lag mit 3 von 12 positiven ELISpotAssays (25,0%) knapp darunter. Gegen die anderen getesteten Peptide konnte keine relevante Häufigkeit von Immunantworten gezeigt werden. Da die Frequenz niedriger liegt, als bei den am meisten etablierten Antigenen, wie z.B. RHAMM, WT1 oder NPM1, welche ebenfalls von der Tumorimmunologie-Gruppe Ulm im Rahmen der LAA- Forschung untersucht wurden, ist PLK1 von der Arbeitsgruppe zunächst nicht weiter verfolgt worden [55, 120, 126, 156]. PLK1 ist als Targetstruktur für die Tumortherapieforschung aufgrund der häufigen Expression dieses Gens und der Bedeutung im Zellzyklus dennoch spannend und wird in klinschen Studien mit PLK-Inhibitoren von der Industrie derzeit untersucht. Möglicherweise eignen sich die in dieser Arbeit identifizierten Peptide gut für einen polyvalenten Therapieansatz [157], bei dem neben den etablierten Epitopen von WT-1, RHAMM, Proteinase 3, eben auch die beiden interessanten von PLK1abgeleiteten Epitope für eine derartige Immuntherapie verwendet werden könnten. Hierzu werden derzeit von unserer Tumorimmunologiegruppe eine Reihe von Vorarbeiten geleistet. RPS14 als potentielle Targetstruktur der Immuntherapie Bei der Untersuchung der beiden RPS14-abgeleiteten Peptide zeigten 6 von 12 ELISpot- Assays eine positive Antwort gegen das Peptid 1 (50,0%) und 3 von 12 gegen das Peptid 2 (25,0%). Beide Peptidepitope wurden anschließend in 10 Assays mit 5q- und non-5q- MDSPatientenproben getestet. 9 davon waren auswertbar. Bei Patientenproben mit einer geringen Lymphozytenanzahl wurde Peptid 1 bevorzugt, da es vielversprechende Ergebnisse in den Versuchen mit den Proben gesunder Probanden zeigte. Somit wurde Peptid 2 in nur 6 Versuchen mitgeführt. Es zeigte sich jedoch, dass gerade das RPS14-abgeleitete Peptid 2 mit 3 von 6 positiven GrB-Assays (50,0%) und 4 von 6 positiven IFNγ-Assays (66,6%) die höchste Frequenz spezifischer Immunantworten in den ELISpot-Analysen mit Proben von an 5q- und non-5q- Deletion-MDS erkrankten Patienten zeigte. Das Peptid 1 löste in 3 von 3 GrB-Assays (33,3%) und in 5 von 9 IFNγ-Assays (55,5%) eine zelluläre 72 4. Diskussion Immunreaktion aus. Damit könnte dieses Peptid ebenfalls als Kandidat für eine Peptidvakzinierung in Betracht kommen. Interressanterweise konnte in den Versuchen mit den Blutproben der 5q- MDS-Patienten eine spezifische Immunantwort gegen Peptid 2 häufiger, als gegen das Peptid 1 beobachtet werden. Die längere Überlebensdauer der Patienten mit 5q- MDS, gemessen an der Gesamtgruppe der MDS- Erkrankungen, lässt sich unter Umständen mit einer besseren Kontrolle des Immunsystems, vielleicht auch durch eine Immunantwort gegen RPS14 abgeleitete Epitope zurückführen. Zum Nachweis dieser Annahme sind jedoch weitere Studien notwendig. In vitro- und in vivo- Hinzunahme von Lenalidomid Im Rahmen der Versuche mit den RPS14-abgeleiteten Peptiden wurde zusätzlich noch die Auswirkung von Lenalidomid auf die zelluläre Immunantwort untersucht. Lenalidomid ist ein Thalidomid-Analogon und hat seit einigen Jahren den weltweiten Einzug in die Therapie einiger MDS- Formen eingehalten. Seine Wirkung entfaltet sich vor allem bei MDS-Patienten mit einer 5q- Deletion. Der Wirkmechanismus erstreckt sich von Inhibition des TNFα und IL-6 bis zur Anregung zur Angiogenese, Erythropoese, sowie T- und NK- Zell- Stimulation mittels Induktion von IL-2 und IFNγ Ausschüttung [86, 132]. Warum Lenalidomid gerade bei Patienten mit dem 5q- Syndrom hervorragende Ergebnisse zeigt, ist noch weitgehend unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun seine Wirkung auf die T-Zell-Antwort näher untersucht werden. So wurden die Versuche mit den Blutproben der 5q- und non 5q- MDS-Patienten mit und ohne Zusatz von Lenalidomid durchgeführt. Aufgrund der bereits beschriebenen zellarmen Blutproben konnten schließlich 4 Versuche mit 5q- MDS- und 4 mit non- 5q- MDSPatientenproben in die Auswertung eingehen. Dabei zeigte der in vitro Zusatz des Immunmodulators bei nur zwei Patienten eine immunsteigernde Wirkung auf ein Peptidepitop, und zwar das RPS14-1. Die Immunantwort auf die Positivkontrollen wurde durch Lenalidomid ebenso häufig deutlich gesteigert wie unterdrückt. Von den 4 Patienten, bei denen die Immunantwort auf die Positivkontrollen gesteigert wurde, waren 3 aus der non-5q- MDS Gruppe, einer hatte das 5q- MDS. Zusätzlich zu dem in vitro Effekt, konnte auch der in vivo Effekt untersucht werden. Es konnten bei 4 Patienten Blutproben vor und nach einer Lenalidomidbehandlung 73 4. Diskussion gewonnen werden. Bei einem Patienten konnte der beobachtete immunsupprimierende in vitro- Effekt nach der Lenalidomidbehandlung in gesteigerter Form in vivo nachgewiesen werden. Bei einem anderen Patienten verhielt es sich genau umgekehrt mit einer Immunantwortsteigerung. Bei den übrigen 2 Patientenproben wurde sowohl in vitro, als auch in vivo weder eine Steigerung, noch Verminderung der Immunantwort durch die Hinzunahme von Lenalidomid beobachtet. Leider war es nicht möglich Blutproben von mehr Patienten zu gewinnen, die in vitro positiv auf den Immunmodulator reagiert haben, um den in vivo- Effekt bei diesen Patienten zu untersuchen. Dies liegt zum einen daran, dass Lenalidomid ein relativ neues Medikament ist und nicht in die Behandlung eines jeden 5q- MDS- Patienten eingeht und noch nicht zugelassen ist, und zum anderen an der seltenen Entität der Erkrankung. In diesen Versuchen konnte ein Zusammenhang zwischen Lenalidomid und der TZell-vermittelten Immunantwort gezeigt werden. Da sich der Zusatz des Immunmodulators teils immunstimulierend, teils immunsupprimierend in den einzelnen Versuchen zeigte, ist anzunehmen, dass weitere Faktoren bei der Reaktionskaskade eine Rolle spielen. Es ist weiterhin nicht auszuschließen, dass Lenalidomid in vitro auch zytotoxisch wirken kann und daher in einigen Fällen zur Abnahme der Immunantwort führte. Die Blutproben der Patienten, die sich der Therapie unterzogen haben, wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Therapie entnommen und somit bleibt offen, ob der Zeitpunkt der Entnahme nicht ebenfalls einen Einfluss auf das Ergebnis hatte. Eine weitere Hypothese wäre die Korrelation der Lenalidomidwirkung auf die Immunantwort auf zellulärer Ebene mit der Klinik des jeweiligen Patienten, da bei einer Patientin, deren CD8+-T-Zellen durch die Lenalidomidzugabe im Versuch supprimiert wurden auch klinisch unter Lenalidomid eine Verschlechterung beobachtet werden konnte. Weitere Untersuchungen dieser Ergebnisse mit höherer Testzahl sind erstrebenswert. 74 5. Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war die Identifikation neuer immunogener Antigenstrukturen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) und des Myelodysplastischen Syndroms (MDS), die immunologische anti-leukämische Effekte induzieren und zur Kontrolle der minimalen Resterkrankung (MRD) beitragen könnten. Zur Identifizierung möglicher immunogener Zielstrukturen bei der AML testeten wir vier polo-likekinase 1 (PLK1)- abgeleitete Peptidpitope. Bei MDS Patienten mit oder ohne Deletion am q-Arm des Chromosom 5 untersuchten wir Peptide, die von ribosomal protein s14 (RPS14) abgeleitet wurden. Darüber hinaus untersuchten wir den Einfluss der immunmodulatorischen Substanz Lenalidomid auf die T-Zellvermittelte Immunantwort bei MDS Patienten in Kombination mit diesen Peptiden. Zielstrukturen, wie PLK1 oder RPS14 erscheinen deshalb als interessante Targetstrukturen, da sie in wichtige Mechanismen der Pathogenese der beiden Erkrankungen involviert sind. Die Immunantworten wurden mittels enzyme-linked immunospot (ELISpot)- Assays quantifiziert. Bei den Versuchen mit den PLK1Peptiden fanden sich am häufigsten Immunantworten gegen das Peptid 2 (4/12) und Peptid 1 (3/12). Somit fanden wir zwar Immunantworten gegen PLK1, die Frequenzen liegen allerdings niedriger, als bei den wichtigsten bislang bei der AML bekannten immunogenen Antigenen, wie RHAMM, WT-1, Proteinase 3 oder Survivin. Gegen Peptide, die von RPS14 abgeleitet wurden, identifizierten wir ebenfalls positive (wenn auch nicht hoch-titrige) spezifische Immunantworten. Bei gesunden Probanden fanden wir dabei häufiger Immunantworten gegen Peptid 1 (6/12) im Vergleich zu Peptid 2 (3/12). Bei MDS Patienten war die Frequenz spezifischer TZell-Antworten gegen Peptid 2 höher, als gegen Peptid 1 (3/6 vs. 3/9 für Granzyme B und 4/6 vs. 5/9 für Interferon γ). Die Frequenz der positiven Immunantworten war bei 5q- MDS Patienten im Vergleich zu non-5q- MDS Patienten nicht signifikant unterschiedlich. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptid 2 ein interessanter Kandidat für eine Immuntherapie sein könnte. In-vitro konnten wir bei Hinzunahme von Lenalidomid in den ELISpot-Assays bei Proben von MDS-Patienten nur bei 4 Patienten eine Zunahme der Immunantwort auf die Positivkontrolle und nur bei 2 Patienten auf ein untersuchtes Peptid – RPS14-1 feststellen. Da Lenalidomid in vitro auch zytotoxisch wirken kann, 75 5. Zusammenfassung untersuchten wir auch Blutproben von Patienten vor und nach Einnahme von Lenalidomid. An diese Proben zu kommen ist jedoch schwierig, da dieses Medikament für diese Indikation noch nicht zugelassen ist. Dennoch konnten wir Proben von 4 Patienten vor und nach Einnahme von Lenalidomid analysieren. Nur 1 Patient zeigte dabei eine Zunahme der Immunantwort. Die LenalidomidWirkung scheint nicht über eine immunstimulatorische Wirkung gegen RSP14 Peptid induziert zu sein, hier spielen andere Targetstrukturen oder Immunmechanismen eine Rolle. Allerdings sollte diese Fragestellung in einer größeren Zahl von Proben untersucht werden, die nur im Rahmen einer kontrollierten Studie gewonnen werden können. In der vorliegenden Arbeit konnten wir neue immunogene Zielstrukturen von PLK1 und RPS14 identifizieren, die für eine Immuntherapie bei AML und MDS Patienten in Frage kommen. 76 6. Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis 1. 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Ohne seine konstruktive Kritik und ohne der unzähligen Stunden seiner Zeit ( begleitet von mindestens genausovielen Tassen Kaffe ) in denen wir an Details feilten, Theorien erstellten und sie wieder verwarfen, Möglichkeiten erwogen, Lösungsvorschläge entwarfen und einfach nur über Gott und die Welt philosophierten, hätte ich das Licht am Ende der Doktorarbeit wohl niemals erblickt. Dafür möchte ich mich von Herzen bedanken! Der nächste große Dank gebührt Frau Marlies Götz. Nur mit ihrer erstklassigen Betreuung und der Step-by-step Einweihung in die Labor-Geheimnisse ist es mir gelungen als Frischling auf einem vollkommen neuen Gebiet Fuß zu fassen und zu wachsen. Ob Probleme mit dem Brutschrank, mit den Quellenangaben oder mit PowerPoint – Marlies hat immer eine Lösung und ich fühlte mich in Ihrer schlauen Welt immer willkommen. Großes Merci auch an Cornelia Herbst für die geduldigen Orientierungshilfen im Labor und an Vanessa Schneider, Adrian Hack und Johannes Broschewitz für die gemeinsamen Schlachten gegen Kühlräume, Computerprogramme, widerspenstige Zellkulturen und Stunden des Wartens auf die Blocklösung oder die Zentrifuge. Es war immer schön mit euch! Für die kostenlose Rund-um-die-Uhr-Sorgenhotline danke ich Johanna Färbinger, Dr. med. Melanie Kilzheimer, Alexandra Kahn und Ise Töpper. Sie haben ohne Murren mit an ein Wunder grenzender Geduld alle meine wissenschaftlichwertvollen und weniger wertvollen Sorgen ertragen und ihnen aktive Sterbehilfe geleistet. Danke auch an Carmen Kremmler, die mit ihren Augen Buchstabendreher gefunden hat, die mein Gehirn nicht mehr wahrnehmen konnte. Last but not least danke ich meiner Familie, die mich mit allen meinen Launen ertragen und mich durch Dick und Dünn begleitet hat, mir Rückendeckung und Rückenwind gab. Ohne euch drei gäbe es diese Dissertation nicht. 100 Curriculum Vitae Curriculum Vitae Persönliche Daten Name: Daria Ushmorova Geburtsdatum, -ort: 1986 in Nowo-Dewjatkino, Kreis St. Petersburg, Russland Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Schulischer Werdegang 09/1993 – 05/1997 Gymnasium Nr. 74, St. Petersburg, Russland 05/1997 – 11/1999 Bunsengymnasium, Heidelberg 11/1999 – 07/2005 Hans- und Sophie Scholl Gymnasium, Ulm 07/2005 Schulabschluss: Abitur Hochschulbildung 10/2005 – 10/2012 Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm, Universität Bern und der Université des Antilles et de la Guyane 04/2008 Erstes Staatsexamen der Humanmedizin 10/2012 Abschluss des Studiums mit dem zweiten Staatsexamen der Humanmedizin 11/2012 Approbation als Ärztin 101
