Burkholderia cepacia bei CF-Patienten

Mikrobiologische
Untersuchungsmethoden
Infektiologie – DIM Assistenten-Weiterbildung in Blöcken
01. Dezember 2010
Reinhard Zbinden, Prof. Dr. med. et lic. phil. II
Leiter Diagnostik, FAMH Mikrobiologie
([email protected])
Institut für Medizinische Mikrobiologie (IMM)
Universität Zürich
Institutsdirektor Prof. Dr. med. E. C. Böttger
Mikrobiologische Untersuchungsmethoden
1. Institut für medizinische Mikrobiologie
2. Mikrobiologische Untersuchung
Entnahme  Verarbeitung  Resultat
3. Transport
4. KISIM
5. Mikrobiologischer Untersuchungsmethoden
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
•
•
Auftragsformular
Probenentnahme und Transportgefässe
7. Unnötige Untersuchungen
8. TBC Diagnostik Neuerungen
1. Institut für medizinische Mikrobiologie
• Wo sind wir?
Gloriastrasse 30/32, 8006 Zürich
Tel. 634 27 00, besser direkt Labor
• Was tun wir? Dienstleistung, Lehre, Forschung
Homepage: www.imm.uzh.ch
• Dienstzeiten Mo-Fr 8 – 20 Uhr; Sa/So 8 – 17 Uhr
• Notfall 24 Stunden (079/698’99’90)
• In Zusammenarbeit mit Interdisziplinären Notfalllabor (für
Mikrobiologie in der Hämatologie USZ) im Rahmen des
Universitären Zentrums für Labormedizin (UZL).
• Notfälle zu Dienstzeiten ankündigen: 079/698’99’90,
normales IMM-Auftragsformular schicken.
• Notfälle am Abend ab 19 Uhr bzw. am Sa/So und
Feiertage ab 16 Uhr direkt in die Hämatologie
mit speziellem Auftragsformular für Notfälle (elektronisch)
2. Mikrobiologische Untersuchung
Kommunikation ist sehr wichtig
• Information für Entnahme:
www.imm.uzh.ch/services/eVademecum.html
oder www.uzl-analysen.usz.ch
• Richtige Entnahme
• Auftragsformular mit Klinikangabe
» Spezielle Erreger vermerken
• Mikrobiologische Verarbeitung
• Mikroskopie
• Kultur
» wichtige Befunde werden telefoniert, KISIM
• Identifizierung und Resistenz
» Schriftlicher Bericht
• Resultat
• Resultatinterpretation mit Kommentar
» Infektiologie Konsiliardienst 104 181 124 255
» Rotationsassistent 104 181 142 412
3. Transport
• Kurier kommt
• Bei Notfällen
am Tage
wird Dienstakademiker
bei der Anmeldung den
Übergabeort
bekannt geben
oder selber
abholen
4. KISIM
Hauptaufgaben der med. Mikrobiologie
• Verarbeitung von Patientenmaterial zum
Erregernachweis gemäss klinischen Angaben
• Unterscheidung von Erreger und Besiedler
– Normalerweise sterile Materialien
• Alle isolierten Bakterien sind potentielle Erreger
– Materialien mit Normalflora
• Gezielte Erregersuche mit Selektivmedien
• Identifizierung und Resistenzprüfung
• Bericht an Arzt mit Interpretationshilfen
5. Mikrobiologische Untersuchungsmethoden
• Direktnachweis
– Gram-Präparat
– Antigen-Nachweis
• Kultur von Bakterien
– Anreicherungskultur
– Direkte Kultur
– Selektive Kultur
• Resistenztestung
a b c d e f
g h i
j
k l m n o p q
r
s
kb
– Konventionell
– Molekularbiologisch
1.0
0.5
0.4
0.3
0.2
Figure legend
a-h:
8 oxacillin-disk resistant strains
m-r:
6 oxacillin-disk resistant strains
i:
ATCC 43300, mecA-positive S. aureus
j:
BB 270, mecA-positive S. aureus
k:
ATCC 29213, mecA-negative S. aureus
l:
BB 255, mecA-negative S. aureus
s:
molecular weight markers
Bakterien-Direktnachweis mit Färbung
•
Meningokokken
Staphylokokken
Traditionelle bakteriologische
Untersuchung
• Beimpfen auf Nährboden mit Öse
• Bebrüten über Nacht 37oC
• Gram-Färbung
Gram-positive
Kokken
• Biochemische
Eigenschaften
Normalflora im Untersuchungsmaterial
• Einzelkolonien
von Bakterien
der normalen
Mundflora auf
verschiedenen
Agarplatten:
vorwiegend
vergrünende
Streptokokken
Selektivnährböden mit Hemmstoffen
• Normalflora wird unterdrückt
– Selektion der
krankmachenden
Bakterien
z. B. Salmonellen
auf Hectoen-Agarplatte
als schwarze Kolonien
neben gelben Kolonien
der Normalflora
Anreicherungs-Flüssigmedien
• Punktate auch in
Blutkulturen
• Bouillon mit Gewebe
– gemörsert / ganz
BacT/Alert-Blutkulturatuomat
• Automatische Detektion
von Bakterienwachstum 
Anzeige an Display
Wachstum im Anreicherungsmedium
• Subkultur auf Festmedien
• Von Einzelkolonien
biochemische Reihe
zur Identifizierung
Empfindlichkeitsprüfung der
Bakterien
• Suspension
beimpfen
• AntibiotikaBlättchen
auflegen
• Bebrüten
• Hemmzonen
messen
Kein Hemmhof
Automaten zur Identifikation
• Miniaturisierung der Identifikationssysteme
und der Resistenzprüfung
• Grosse Automaten
Diagnostik der Legionellose
• Legionellen verursachen Lungenentzündung
• Kultur aus Atmungstrakt möglich
• Ausscheidung eines bakteriellen Bestandteils
mit dem Urin
• Nachweis mit Schnelltest
mit Immunchromatographie
• Auch für andere Bakterien
anwendbar: Pneumokokken
Eubakterielle PCR
Universalprimer für alle Bakterien
(16S rRNA Gen, konstante Region)
Nach Amplifikation Sequenzierung
Eubakterielle PCR als Zusatzmethode
• Gute Erfahrungen mit eubakterieller PCR
bei der Diagnostik von Endocarditis
– PCR besser als Kultur
• PCR in 18 Fällen positiv, Kultur 4x positiv, Gram 8x pos.
– Goldenberger et al. JCM (1997) 35:2733-9
– Anschliessende retrospektive Untersuchung
• 34 von 88 (39%) Kultur-negativen Proben waren PCR +
• 3 von 37 PCR+ Proben auch Kultur positiv
• 9 von 37 PCR+ Proben auch im Gram positiv
– Weitere Untersuchung an Herzklappen
bei 49 Patienten
• Sens. Kultur 17.6%
• Sens. PCR 94.1%
– Bosshard et al. CID (2003) 37:167-172
Resistenztestung
von Staphylococcus aureus
• Häufigkeit von MRSA abhängig von Region (2000)
• MSSA
• MRSA
• Multiresistente MRSA Behandlung schwierig
Nachweis des mecA Gens und des
PBP 2'
• mecA Gen in Staphylokokken produziert
Penicillin-bindendes Protein 2' (PBP 2')
 phänotypische Methicillin-Resistenz
• Polymerase-Ketten-Reaktion zur
Amplifikation des mecA Gens
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m
n o
p
q
r
s
Figure legend
kb
1 .0
0 .5
0 .4
0 .3
0 .2
a-h:
8 oxacillin-disk resistant strains
m-r:
i:
6 oxacillin-disk resistant strains
ATCC 43300, mecA-positive S. aureus
j:
BB 270, mecA-positive S. aureus
k:
ATCC 29213, mecA-negative S. aureus
l:
BB 255, mecA-negative S. aureus
s:
molecular weight markers
• Latex-Agglutination für PBP 2'
Nachweis der
resistenten Bakterien
• GenXpert für MRSA-Nachweis mittels
PCR
Extended spectrum beta-lactamase
ESBL
• Resistent gegen Cephalosporine 3./4. Gen.
– Vor allem bei K. pneumoniae und E. coli
• ESBL hemmbar durch Clavulansäure
Empfindlichkeit von K. pneumoniae
auf verschiedenen Stationen 2001
Chirurgie
UnfallIPS
Verbrennung
ChirugieIPS
NeuroChirugie
HerzChirugie
Medizin
MedizinIPS
Ampicillin
0
0
0
0
0
0
0
0
Amox. / Clav.
96
90
63
88
100
75
91
89
Cefalotin
85
79
50
88
92
71
82
78
Cefuroxim
95
81
83
100
89
80
89
75
Ceftriaxon
100
93
100
100
100
89
95
100
Ceftazidim
100
100
100
100
100
86
95
100
Imipenem
100
100
100
100
100
100
100
100
Pip. / Tazob.
100
100
88
100
100
93
93
89
Ciprofloxacin
100
100
88
100
100
100
88
100
Cotrimoxazol
85
97
63
88
100
86
79
100
Netilmicin
100
100
88
100
100
100
93
100
Antibiotikum
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
• Auftragsformular enthält wichtigste Punkte
– Genaue Anforderung ankreuzen
– Spezielle Erreger erwähnen
– Allenfalls Vademecum konsultieren
– Hinweis auf gefährliche Erreger wichtig für
Laborsicherheit
– Nach Möglichkeit pro Material ein Formular
– Bei speziellen Anforderungen zuerst
Rücksprache
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
Probenentnahme und Transportgefässe
• Punktat in Anaerobiertransportmedium
– Mit Spritze und aufgesetzer Nadel durch
Gummikappe ins Anaerobiertransportmedium
– Punktate zusätzlich nativ oder in Blutkulturen
– Punktate besser als Abstriche
– Abstriche nur als Notlösung (in Agarmedium)
• Neue Alternative E-Swab, kein Agar
• Gewebeproben / Biopsien nativ einschicken
• Materialien möglichst rasch ins Labor
Transportmedien
oder
Probentransport Sicherheitsfragen
• Probenpackung (Demo) muss dicht sein
• Für Strassentransport und Posttransport
benötigt man für diagnostische, potentiell
infektiöse Proben UN 3373
• Plastiktüten werden jetzt innerhalb des USZ
benützt
• Einschlussverordnung im Labor beachten
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
• Intravenöse Katheter
– Nativ einsenden, nicht in Agar
– semiquantitative Ausrollmethode
– < 5 Kolonien: Septikämie unwahrscheinlich
• Liquor
nativ einsenden, falls auch Pilze
oder TBC
 separat je 2-3 ml einsenden
» 1 MO/Oelimmersionsfeld entspricht 105 /ml
» Zytospinpräparat zur besseren Sensitivität
» Antigen - Direktnachweis für Pneumokokken möglich
• Punktate und Tiefe Wunden
(Drainagen, Abszesse)
– Wenn immer möglich Punktion statt Abstrich;
Abstriche tief in Agartransportmedium geben
für Direktpräparat, Kultur (aerob/anaerob)
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
Blutkulturen
• Eine Blutkulturentnahme besteht aus einer
aeroben und anaeroben Flasche, d.h. zwei
Flaschen. Für jede Entnahme nach Möglichkeit
separate Punktion.
– 2 bis 3 Blutkulturen innerhalb 2 bis 24 Stunden,
d.h. 4 bis 6 Flaschen zu je 5 - 10 ml Blut
• Bei Neugeborenen 1 Blutkultur mit 1-3 ml
– Bakteriämie bei Erwachsenen
<10CFU/ml
– bei Kindern > 10 CFU/ml: eine Flasche!!
• Spezielle Erreger unbedingt mitteilen.
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
Blutkulturen
• Indikation der Blutkulturen:
– bei Fieber unklarer Genese, Leukozytose
– Brucellose, Typhus, Endokarditisverdacht
– auch bei Pneumonie, Meningitis, Arthritis,Epiglottitis,
Osteomyelitis, Abszesse innerer Organe
• Entnahmen durch iv-Katheter zeigen häufiger
Kontaminanten; unbedingt verschiedene
Entnahmestellen (Beurteilung!!!)
– Koagulasenegative Staphylokokken (SKN),
Propionibakterien, Corynebakterien sind typische
Hautkontaminanten, wenn in
1 von 4 oder 6 Flaschen isoliert.
Cave bei Mehrfachisolation!
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
Blutkulturen
• Entnahmen durch iv-Katheter zeigen häufiger
Kontaminanten; unbedingt verschiedene
Entnahmestellen (Beurteilung!)
• Pseudobakteriämie bei ungenügender
Desinfektion
• 10% aller Blutkulturen sind positiv
– 25 - 35%
SKN, Corynebakterien, Bacillus
meistens Kontamination
– ca. 30%
Enterobacteriaceae, selten Kontamination
– ca. 10%
P. aeruginosa und ähnliches
selten Kontamination
– 10-20%
S. aureus, Enterokokken, vergr. Streptokokken,
oft Kontamination
– 5 -10%
Anaerobier, Kontamination abhängig von Erreger
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
Blutkulturen
• Erreger aus Blutkultur geben Hinweise auf
Krankheit
• Vergründene Streptokokken  an Endocarditis denken
• Streptococcus milleri (quasi nie Kontaminante)  Abszess
suchen
• S. aureus  Endokarditis bei Drogenabusus ?
• Fehler bei der Blutkulturabnahme
–
–
–
–
–
Antibiotikagabe vor Abnahme der Blutkultur
Interpretation von Kontaminanten als Erreger
Unterlassen der Fokussuche
Unterlassen der MHK Bestimmung bei Indikation
Fehlender Auftrag bezüglich spezielle Erreger
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
• Respiratorische Proben
– Sputum nativ, kein Sammelsputum, bei 4oC lagern
– bei Pneumonie parallel Blutkultur sinnvoll
– Direktpräparat: Falls mehr als 25 Epithelzellen/100er Gesichtsfeld, dann keine
Verarbeitung
– Kultur  Beurteilung in Relation zur Normalflora
– Untersuchung auf Anaerobier nicht sinnvoll.
– Sputum ist Standardmaterial für Tuberkulose-Untersuchung
– Trachealsekret und Bronchialsekrete sind besser
– Spezielle Erreger vermerken: Pilze, Nocardien, Legionellen, Aktinomyceten.
Diese werden unabhängig von normaler Mundflora gesucht.
– Bronchalveoläre Lavage – quantitativer Ansatz
Qualität des Sputums wichtig für Kultur
• Gram-Präparat
Sputum >25 Epithelzellen
im 100er
Gesichtfeld.
Probe nicht verwertbar für
allgemeine Bakteriologie,
aber für Suche nach Mycobacterium tuberculosis
immer akzeptieren
• Gleiche Mikroorganismen in der 100 x 10 =
1000er Vergrösserung weisen auf Erreger hin.
• Bakterien vom Sputum, aber auch von
Trachealsekret können nur Besiedler sein
– Abgrenzung von Erregern nicht immer einfach
– Während Transport – Postweg – können sich Bakterien
vermehren und andere überwuchern.
Sputum in der
100-Vergrösserung (10x10)
• Zu viele Epithelzellen (Bakterienklumpen)
1000er Vergrösserung von
vorherigem Bild
• Normalerweise vorkommende Bakterien
Entsprechend Platten mit
normalen Mundkeimen
• Vor allem vergrünende Streptokokken
Anzahl Bakterien bei einer Pneumonie
bei beatmeten Patienten: 105-6/ml
• Quantitative bakteriologische Untersuchung
(Baselski et al. Clin Microbiol Newsletter (1994) 16: 65-69)
Material
Volumen
Endvolumen
Verdünnung Cutoff
• Tracheal- einige ml einige ml
keine
106/ml
sekret
• Geschützte einige µl
1ml
1000
103/ml
Bürste
• BAL
1ml
10-100ml
10-100
104/ml
• Bei Trachealsekret entspricht semiquantitative
Fraktionierung gut überein mit der quantitativen
Fraktionierung:
– Wachstum nur in der 1. Fraktion entspricht 103-4/ml;
– Wachstum auch in der 2. Fraktion entspricht 104-5/ml
– Wachstum auch in der 3. Fraktion entspricht 105-6/ml.
6. Spezielle Hinweise zu Materialien
• Rachenabstrich
– normalerweise nur Suche nach betahemolysierenden Streptokokken der Gruppe A
– Bei Neugeborenen Streptokokken der Gruppe B
möglich
• Für Mycoplasma pneumoniae und
Chlamydophila pneumoniae PCR
verlangen
– Bei Neugeborenen auch Chlamydia trachomatis
(PCR)und Ureaplasma urealyticum (Kultur) aus
respiratorischen Materialien suchen
• Für Legionellen Antigen-Nachweis im Urin
Transportmedien für
Stuhlbakteriologie
• Röhrchen mit
Transportmedium
Cairy-Blair erlaubt
bessere Isolation von
Bakterien
• Für Clostridium
difficile-Toxin
Nachweis ist
Nativstuhl besser.
(Für Virusnachweis
auch)
Clostridium difficile Cytotoxin B
• Normale
Fibroblasten-Kultur
(MRC-5)
• Cytotoxischer Effekt
auf Fibroblasten
Vacutainer Urin Kultur Kit
• Vacutainer für den Transfer
von Urin vom Gefäss in ein
Röhrchen
• Das Röhrchen enthält
Borat, um die Anzahl
Bakterien stabil zu halten,
aber dies nicht absterben
zu lassen.
• Vacutainer-Röhrchen auch
für die klinische Chemie
verfügbar
Vorteile des Nativurins – allenfalls in
konservierender Borsäure
• Direkte Inokulation auf Agar-Platten
– bessere Quantifizierung möglich
• 1 µl Öse Urin auf Platte 
Anzahl Kolonien x 1000 = Keime/ml
• 10 µl Öse Urin auf Platte 
Anzahl Kolonien x 100 = Keime/ml
– Erkennnen von Mischkultur einfacher
– Erfassen schlecht kultivierbarer Keime
• Aerococcus urinae, Gardnerella vaginalis
– Erfassen seltener Keime
• Lactobacillen, coryneforme Bakterien
– Ansatz von Spezialmedien für Mycoplasmen
Vorteil von Nativurin
• Direkte Inokulation von Spezialagarmedien
• Inokulation mit kalibrierter Öse (1 or 10 µl)
 quantitative Auszählung der Kolonien
• Bakteriengemische werden besser erfasst als mit
Eintauchnährböden
• Nachweis von antimikrobiellen Substanzen im
Urin
– 10 µl Urin auf leeres Filterblättchen
– Blättchen auf Agarplatte mit
Bacillus subtilis
– Inkubation über Nacht:
Inhibitionszone weist auf
das Vorhandensein von
Antibiotika hin
7. Unnötige Untersuchungen
• Nasenabstriche
– repräsentieren nicht die Flora einer Sinusitis
» Punktat ist wichtig
– nur sinnvoll bei Suche nach Trägertum für
Staphylococcus aureus, insbesondere
methicillinresistente S. aureus, Streptokokken,
Pneumokokken, Meningokokken
• Die Erreger einer Mittelohrentzündung finden
sich zwar im Nasen-Rachensekret, aber keine
spezifische Aussage möglich. Ohreiter testen.
– Nasen-Rachensekret aber sehr wichtig für Virologie.
• Fistelmaterial representiert nicht unbedingt
die Flora in der Tiefe  Punktion nötig
• Urinkultur aus DK bei asymptom. Patienten
7. Unnötige Untersuchungen
8. TBC Diagnostik Neuerungen
Zeitlicher Ablauf der Tuberkulose-Diagnostik
Alte Methoden Was braucht wieviel Zeit ?
• Mikroskopie z. B. Ziehl-Neelsen-Färbung
– Vorteil: Schnell ohne Dekontamination + Anreicherung
ca. 1 Stunde nach Eintreffen im Labor
– Nachteil: Mangelnde Sensitivität (>105/ml),
keine Speziesdiagnose
• Kultur auf Festmedien
– Vorteil: sensitiv, Spezies- und Resistenzbestimmung
– Nachteil: sehr langwierig (ca. 3-8 Wochen)
• Kultur auf Flüssigmedien
– Vorteil: wie Festmedien, schneller positiv (1-2 Wochen)
– Nachteil: Kontaminationen wachsen auch
MGIT-Flüssigkultur für Mykobakterien,
auch für Resistenzen benützt
Neuere Teste für den Nachweis
einer latenten Tuberkulose
• Nachweis der
M. tuberculosis spezifischen
T-Zellen
– Keine Kreuzreation mit M.
bovis (M. kansasii, M.
marinum, M. szulgai)
– ESAT-6 (early secretory
antigenic target 6)
– CFP-10 (culture filtrate
protein)
– Positive Mitogen-Kontrolle, ob
Lymphozyten stimulierbar
• Kann Tuberkulintest für
Serokonversion ersetzen
• Kein Ersatz für
Erregernachweis
Neue Methoden für den Nachweis und
Resistenzprüfung
• Direktnachweis des Genoms von
Mycobacterium tuberculosis Komplex
– PCR Methode
• Sensitiv und Speziesidentifizierung
– Innerhalb von 1 Tag möglich
• Teure Methode, welche nicht jeden Tag gemacht wird
• Direktnachweis von bestimmten Resistenzen
direkt aus dem Sputum (viele SFS vorhanden)
– PCR und Sonden
• INH-Resistenz und Rifampicin-Resistenz
– Ausnahme-Untersuchung, die bei Verdacht auf
resistente TB gemacht werden kann
– Teuer und unregelmässige Durchführung
Neue Methoden für die Identifizierung
• Von gewachsener flüssiger oder fester Kultur
PCR für Mycobacterium tuberculosis Komplex
und Mykobakterien generell  1. Differenzierung
– Oft bereits nach 1 Woche möglich
• Wenn Mycobacterium tuberculosis Komplex, dann
Unterscheidung von Mycobacterium tuberculosis
oder
Mycobacterium bovis
– 1-2 Tage nach obigem Test
• Sequenzierung für nicht tuberkulöse
Mykobakterien
– 1-4 Tage nach 1. Differenzierung
Identifizierung von Mykobakterien
Identifizierung von Mykobakterien
Spitalhygienisch relevante alte
Methoden
• Stämme von Patienten werden verglichen, ob
Übertragung statt gefunden hat
– Die Stämme müssen vorliegen
– Aufgabe des nationalen Zentrums für Mykobakterien
• Resistenzprüfung für resistente M. tuberculosis
• Allenfalls neben klinischer Untersuchung von
Kontaktpersonen auch Tuberkulintest
– Nachteil von Beeinflussung durch frühere BCGImpfung
– Neuere Teste statt Tuberkulinttest