Burkholderia cepacia bei CF-Patienten
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Mikrobiologische Untersuchungsmethoden Infektiologie – DIM Assistenten-Weiterbildung in Blöcken 01. Dezember 2010 Reinhard Zbinden, Prof. Dr. med. et lic. phil. II Leiter Diagnostik, FAMH Mikrobiologie ([email protected]) Institut für Medizinische Mikrobiologie (IMM) Universität Zürich Institutsdirektor Prof. Dr. med. E. C. Böttger Mikrobiologische Untersuchungsmethoden 1. Institut für medizinische Mikrobiologie 2. Mikrobiologische Untersuchung Entnahme Verarbeitung Resultat 3. Transport 4. KISIM 5. Mikrobiologischer Untersuchungsmethoden 6. Spezielle Hinweise zu Materialien • • Auftragsformular Probenentnahme und Transportgefässe 7. Unnötige Untersuchungen 8. TBC Diagnostik Neuerungen 1. Institut für medizinische Mikrobiologie • Wo sind wir? Gloriastrasse 30/32, 8006 Zürich Tel. 634 27 00, besser direkt Labor • Was tun wir? Dienstleistung, Lehre, Forschung Homepage: www.imm.uzh.ch • Dienstzeiten Mo-Fr 8 – 20 Uhr; Sa/So 8 – 17 Uhr • Notfall 24 Stunden (079/698’99’90) • In Zusammenarbeit mit Interdisziplinären Notfalllabor (für Mikrobiologie in der Hämatologie USZ) im Rahmen des Universitären Zentrums für Labormedizin (UZL). • Notfälle zu Dienstzeiten ankündigen: 079/698’99’90, normales IMM-Auftragsformular schicken. • Notfälle am Abend ab 19 Uhr bzw. am Sa/So und Feiertage ab 16 Uhr direkt in die Hämatologie mit speziellem Auftragsformular für Notfälle (elektronisch) 2. Mikrobiologische Untersuchung Kommunikation ist sehr wichtig • Information für Entnahme: www.imm.uzh.ch/services/eVademecum.html oder www.uzl-analysen.usz.ch • Richtige Entnahme • Auftragsformular mit Klinikangabe » Spezielle Erreger vermerken • Mikrobiologische Verarbeitung • Mikroskopie • Kultur » wichtige Befunde werden telefoniert, KISIM • Identifizierung und Resistenz » Schriftlicher Bericht • Resultat • Resultatinterpretation mit Kommentar » Infektiologie Konsiliardienst 104 181 124 255 » Rotationsassistent 104 181 142 412 3. Transport • Kurier kommt • Bei Notfällen am Tage wird Dienstakademiker bei der Anmeldung den Übergabeort bekannt geben oder selber abholen 4. KISIM Hauptaufgaben der med. Mikrobiologie • Verarbeitung von Patientenmaterial zum Erregernachweis gemäss klinischen Angaben • Unterscheidung von Erreger und Besiedler – Normalerweise sterile Materialien • Alle isolierten Bakterien sind potentielle Erreger – Materialien mit Normalflora • Gezielte Erregersuche mit Selektivmedien • Identifizierung und Resistenzprüfung • Bericht an Arzt mit Interpretationshilfen 5. Mikrobiologische Untersuchungsmethoden • Direktnachweis – Gram-Präparat – Antigen-Nachweis • Kultur von Bakterien – Anreicherungskultur – Direkte Kultur – Selektive Kultur • Resistenztestung a b c d e f g h i j k l m n o p q r s kb – Konventionell – Molekularbiologisch 1.0 0.5 0.4 0.3 0.2 Figure legend a-h: 8 oxacillin-disk resistant strains m-r: 6 oxacillin-disk resistant strains i: ATCC 43300, mecA-positive S. aureus j: BB 270, mecA-positive S. aureus k: ATCC 29213, mecA-negative S. aureus l: BB 255, mecA-negative S. aureus s: molecular weight markers Bakterien-Direktnachweis mit Färbung • Meningokokken Staphylokokken Traditionelle bakteriologische Untersuchung • Beimpfen auf Nährboden mit Öse • Bebrüten über Nacht 37oC • Gram-Färbung Gram-positive Kokken • Biochemische Eigenschaften Normalflora im Untersuchungsmaterial • Einzelkolonien von Bakterien der normalen Mundflora auf verschiedenen Agarplatten: vorwiegend vergrünende Streptokokken Selektivnährböden mit Hemmstoffen • Normalflora wird unterdrückt – Selektion der krankmachenden Bakterien z. B. Salmonellen auf Hectoen-Agarplatte als schwarze Kolonien neben gelben Kolonien der Normalflora Anreicherungs-Flüssigmedien • Punktate auch in Blutkulturen • Bouillon mit Gewebe – gemörsert / ganz BacT/Alert-Blutkulturatuomat • Automatische Detektion von Bakterienwachstum Anzeige an Display Wachstum im Anreicherungsmedium • Subkultur auf Festmedien • Von Einzelkolonien biochemische Reihe zur Identifizierung Empfindlichkeitsprüfung der Bakterien • Suspension beimpfen • AntibiotikaBlättchen auflegen • Bebrüten • Hemmzonen messen Kein Hemmhof Automaten zur Identifikation • Miniaturisierung der Identifikationssysteme und der Resistenzprüfung • Grosse Automaten Diagnostik der Legionellose • Legionellen verursachen Lungenentzündung • Kultur aus Atmungstrakt möglich • Ausscheidung eines bakteriellen Bestandteils mit dem Urin • Nachweis mit Schnelltest mit Immunchromatographie • Auch für andere Bakterien anwendbar: Pneumokokken Eubakterielle PCR Universalprimer für alle Bakterien (16S rRNA Gen, konstante Region) Nach Amplifikation Sequenzierung Eubakterielle PCR als Zusatzmethode • Gute Erfahrungen mit eubakterieller PCR bei der Diagnostik von Endocarditis – PCR besser als Kultur • PCR in 18 Fällen positiv, Kultur 4x positiv, Gram 8x pos. – Goldenberger et al. JCM (1997) 35:2733-9 – Anschliessende retrospektive Untersuchung • 34 von 88 (39%) Kultur-negativen Proben waren PCR + • 3 von 37 PCR+ Proben auch Kultur positiv • 9 von 37 PCR+ Proben auch im Gram positiv – Weitere Untersuchung an Herzklappen bei 49 Patienten • Sens. Kultur 17.6% • Sens. PCR 94.1% – Bosshard et al. CID (2003) 37:167-172 Resistenztestung von Staphylococcus aureus • Häufigkeit von MRSA abhängig von Region (2000) • MSSA • MRSA • Multiresistente MRSA Behandlung schwierig Nachweis des mecA Gens und des PBP 2' • mecA Gen in Staphylokokken produziert Penicillin-bindendes Protein 2' (PBP 2') phänotypische Methicillin-Resistenz • Polymerase-Ketten-Reaktion zur Amplifikation des mecA Gens a b c d e f g h i j k l m n o p q r s Figure legend kb 1 .0 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 a-h: 8 oxacillin-disk resistant strains m-r: i: 6 oxacillin-disk resistant strains ATCC 43300, mecA-positive S. aureus j: BB 270, mecA-positive S. aureus k: ATCC 29213, mecA-negative S. aureus l: BB 255, mecA-negative S. aureus s: molecular weight markers • Latex-Agglutination für PBP 2' Nachweis der resistenten Bakterien • GenXpert für MRSA-Nachweis mittels PCR Extended spectrum beta-lactamase ESBL • Resistent gegen Cephalosporine 3./4. Gen. – Vor allem bei K. pneumoniae und E. coli • ESBL hemmbar durch Clavulansäure Empfindlichkeit von K. pneumoniae auf verschiedenen Stationen 2001 Chirurgie UnfallIPS Verbrennung ChirugieIPS NeuroChirugie HerzChirugie Medizin MedizinIPS Ampicillin 0 0 0 0 0 0 0 0 Amox. / Clav. 96 90 63 88 100 75 91 89 Cefalotin 85 79 50 88 92 71 82 78 Cefuroxim 95 81 83 100 89 80 89 75 Ceftriaxon 100 93 100 100 100 89 95 100 Ceftazidim 100 100 100 100 100 86 95 100 Imipenem 100 100 100 100 100 100 100 100 Pip. / Tazob. 100 100 88 100 100 93 93 89 Ciprofloxacin 100 100 88 100 100 100 88 100 Cotrimoxazol 85 97 63 88 100 86 79 100 Netilmicin 100 100 88 100 100 100 93 100 Antibiotikum 6. Spezielle Hinweise zu Materialien • Auftragsformular enthält wichtigste Punkte – Genaue Anforderung ankreuzen – Spezielle Erreger erwähnen – Allenfalls Vademecum konsultieren – Hinweis auf gefährliche Erreger wichtig für Laborsicherheit – Nach Möglichkeit pro Material ein Formular – Bei speziellen Anforderungen zuerst Rücksprache 6. Spezielle Hinweise zu Materialien Probenentnahme und Transportgefässe • Punktat in Anaerobiertransportmedium – Mit Spritze und aufgesetzer Nadel durch Gummikappe ins Anaerobiertransportmedium – Punktate zusätzlich nativ oder in Blutkulturen – Punktate besser als Abstriche – Abstriche nur als Notlösung (in Agarmedium) • Neue Alternative E-Swab, kein Agar • Gewebeproben / Biopsien nativ einschicken • Materialien möglichst rasch ins Labor Transportmedien oder Probentransport Sicherheitsfragen • Probenpackung (Demo) muss dicht sein • Für Strassentransport und Posttransport benötigt man für diagnostische, potentiell infektiöse Proben UN 3373 • Plastiktüten werden jetzt innerhalb des USZ benützt • Einschlussverordnung im Labor beachten 6. Spezielle Hinweise zu Materialien • Intravenöse Katheter – Nativ einsenden, nicht in Agar – semiquantitative Ausrollmethode – < 5 Kolonien: Septikämie unwahrscheinlich • Liquor nativ einsenden, falls auch Pilze oder TBC separat je 2-3 ml einsenden » 1 MO/Oelimmersionsfeld entspricht 105 /ml » Zytospinpräparat zur besseren Sensitivität » Antigen - Direktnachweis für Pneumokokken möglich • Punktate und Tiefe Wunden (Drainagen, Abszesse) – Wenn immer möglich Punktion statt Abstrich; Abstriche tief in Agartransportmedium geben für Direktpräparat, Kultur (aerob/anaerob) 6. Spezielle Hinweise zu Materialien Blutkulturen • Eine Blutkulturentnahme besteht aus einer aeroben und anaeroben Flasche, d.h. zwei Flaschen. Für jede Entnahme nach Möglichkeit separate Punktion. – 2 bis 3 Blutkulturen innerhalb 2 bis 24 Stunden, d.h. 4 bis 6 Flaschen zu je 5 - 10 ml Blut • Bei Neugeborenen 1 Blutkultur mit 1-3 ml – Bakteriämie bei Erwachsenen <10CFU/ml – bei Kindern > 10 CFU/ml: eine Flasche!! • Spezielle Erreger unbedingt mitteilen. 6. Spezielle Hinweise zu Materialien Blutkulturen • Indikation der Blutkulturen: – bei Fieber unklarer Genese, Leukozytose – Brucellose, Typhus, Endokarditisverdacht – auch bei Pneumonie, Meningitis, Arthritis,Epiglottitis, Osteomyelitis, Abszesse innerer Organe • Entnahmen durch iv-Katheter zeigen häufiger Kontaminanten; unbedingt verschiedene Entnahmestellen (Beurteilung!!!) – Koagulasenegative Staphylokokken (SKN), Propionibakterien, Corynebakterien sind typische Hautkontaminanten, wenn in 1 von 4 oder 6 Flaschen isoliert. Cave bei Mehrfachisolation! 6. Spezielle Hinweise zu Materialien Blutkulturen • Entnahmen durch iv-Katheter zeigen häufiger Kontaminanten; unbedingt verschiedene Entnahmestellen (Beurteilung!) • Pseudobakteriämie bei ungenügender Desinfektion • 10% aller Blutkulturen sind positiv – 25 - 35% SKN, Corynebakterien, Bacillus meistens Kontamination – ca. 30% Enterobacteriaceae, selten Kontamination – ca. 10% P. aeruginosa und ähnliches selten Kontamination – 10-20% S. aureus, Enterokokken, vergr. Streptokokken, oft Kontamination – 5 -10% Anaerobier, Kontamination abhängig von Erreger 6. Spezielle Hinweise zu Materialien Blutkulturen • Erreger aus Blutkultur geben Hinweise auf Krankheit • Vergründene Streptokokken an Endocarditis denken • Streptococcus milleri (quasi nie Kontaminante) Abszess suchen • S. aureus Endokarditis bei Drogenabusus ? • Fehler bei der Blutkulturabnahme – – – – – Antibiotikagabe vor Abnahme der Blutkultur Interpretation von Kontaminanten als Erreger Unterlassen der Fokussuche Unterlassen der MHK Bestimmung bei Indikation Fehlender Auftrag bezüglich spezielle Erreger 6. Spezielle Hinweise zu Materialien • Respiratorische Proben – Sputum nativ, kein Sammelsputum, bei 4oC lagern – bei Pneumonie parallel Blutkultur sinnvoll – Direktpräparat: Falls mehr als 25 Epithelzellen/100er Gesichtsfeld, dann keine Verarbeitung – Kultur Beurteilung in Relation zur Normalflora – Untersuchung auf Anaerobier nicht sinnvoll. – Sputum ist Standardmaterial für Tuberkulose-Untersuchung – Trachealsekret und Bronchialsekrete sind besser – Spezielle Erreger vermerken: Pilze, Nocardien, Legionellen, Aktinomyceten. Diese werden unabhängig von normaler Mundflora gesucht. – Bronchalveoläre Lavage – quantitativer Ansatz Qualität des Sputums wichtig für Kultur • Gram-Präparat Sputum >25 Epithelzellen im 100er Gesichtfeld. Probe nicht verwertbar für allgemeine Bakteriologie, aber für Suche nach Mycobacterium tuberculosis immer akzeptieren • Gleiche Mikroorganismen in der 100 x 10 = 1000er Vergrösserung weisen auf Erreger hin. • Bakterien vom Sputum, aber auch von Trachealsekret können nur Besiedler sein – Abgrenzung von Erregern nicht immer einfach – Während Transport – Postweg – können sich Bakterien vermehren und andere überwuchern. Sputum in der 100-Vergrösserung (10x10) • Zu viele Epithelzellen (Bakterienklumpen) 1000er Vergrösserung von vorherigem Bild • Normalerweise vorkommende Bakterien Entsprechend Platten mit normalen Mundkeimen • Vor allem vergrünende Streptokokken Anzahl Bakterien bei einer Pneumonie bei beatmeten Patienten: 105-6/ml • Quantitative bakteriologische Untersuchung (Baselski et al. Clin Microbiol Newsletter (1994) 16: 65-69) Material Volumen Endvolumen Verdünnung Cutoff • Tracheal- einige ml einige ml keine 106/ml sekret • Geschützte einige µl 1ml 1000 103/ml Bürste • BAL 1ml 10-100ml 10-100 104/ml • Bei Trachealsekret entspricht semiquantitative Fraktionierung gut überein mit der quantitativen Fraktionierung: – Wachstum nur in der 1. Fraktion entspricht 103-4/ml; – Wachstum auch in der 2. Fraktion entspricht 104-5/ml – Wachstum auch in der 3. Fraktion entspricht 105-6/ml. 6. Spezielle Hinweise zu Materialien • Rachenabstrich – normalerweise nur Suche nach betahemolysierenden Streptokokken der Gruppe A – Bei Neugeborenen Streptokokken der Gruppe B möglich • Für Mycoplasma pneumoniae und Chlamydophila pneumoniae PCR verlangen – Bei Neugeborenen auch Chlamydia trachomatis (PCR)und Ureaplasma urealyticum (Kultur) aus respiratorischen Materialien suchen • Für Legionellen Antigen-Nachweis im Urin Transportmedien für Stuhlbakteriologie • Röhrchen mit Transportmedium Cairy-Blair erlaubt bessere Isolation von Bakterien • Für Clostridium difficile-Toxin Nachweis ist Nativstuhl besser. (Für Virusnachweis auch) Clostridium difficile Cytotoxin B • Normale Fibroblasten-Kultur (MRC-5) • Cytotoxischer Effekt auf Fibroblasten Vacutainer Urin Kultur Kit • Vacutainer für den Transfer von Urin vom Gefäss in ein Röhrchen • Das Röhrchen enthält Borat, um die Anzahl Bakterien stabil zu halten, aber dies nicht absterben zu lassen. • Vacutainer-Röhrchen auch für die klinische Chemie verfügbar Vorteile des Nativurins – allenfalls in konservierender Borsäure • Direkte Inokulation auf Agar-Platten – bessere Quantifizierung möglich • 1 µl Öse Urin auf Platte Anzahl Kolonien x 1000 = Keime/ml • 10 µl Öse Urin auf Platte Anzahl Kolonien x 100 = Keime/ml – Erkennnen von Mischkultur einfacher – Erfassen schlecht kultivierbarer Keime • Aerococcus urinae, Gardnerella vaginalis – Erfassen seltener Keime • Lactobacillen, coryneforme Bakterien – Ansatz von Spezialmedien für Mycoplasmen Vorteil von Nativurin • Direkte Inokulation von Spezialagarmedien • Inokulation mit kalibrierter Öse (1 or 10 µl) quantitative Auszählung der Kolonien • Bakteriengemische werden besser erfasst als mit Eintauchnährböden • Nachweis von antimikrobiellen Substanzen im Urin – 10 µl Urin auf leeres Filterblättchen – Blättchen auf Agarplatte mit Bacillus subtilis – Inkubation über Nacht: Inhibitionszone weist auf das Vorhandensein von Antibiotika hin 7. Unnötige Untersuchungen • Nasenabstriche – repräsentieren nicht die Flora einer Sinusitis » Punktat ist wichtig – nur sinnvoll bei Suche nach Trägertum für Staphylococcus aureus, insbesondere methicillinresistente S. aureus, Streptokokken, Pneumokokken, Meningokokken • Die Erreger einer Mittelohrentzündung finden sich zwar im Nasen-Rachensekret, aber keine spezifische Aussage möglich. Ohreiter testen. – Nasen-Rachensekret aber sehr wichtig für Virologie. • Fistelmaterial representiert nicht unbedingt die Flora in der Tiefe Punktion nötig • Urinkultur aus DK bei asymptom. Patienten 7. Unnötige Untersuchungen 8. TBC Diagnostik Neuerungen Zeitlicher Ablauf der Tuberkulose-Diagnostik Alte Methoden Was braucht wieviel Zeit ? • Mikroskopie z. B. Ziehl-Neelsen-Färbung – Vorteil: Schnell ohne Dekontamination + Anreicherung ca. 1 Stunde nach Eintreffen im Labor – Nachteil: Mangelnde Sensitivität (>105/ml), keine Speziesdiagnose • Kultur auf Festmedien – Vorteil: sensitiv, Spezies- und Resistenzbestimmung – Nachteil: sehr langwierig (ca. 3-8 Wochen) • Kultur auf Flüssigmedien – Vorteil: wie Festmedien, schneller positiv (1-2 Wochen) – Nachteil: Kontaminationen wachsen auch MGIT-Flüssigkultur für Mykobakterien, auch für Resistenzen benützt Neuere Teste für den Nachweis einer latenten Tuberkulose • Nachweis der M. tuberculosis spezifischen T-Zellen – Keine Kreuzreation mit M. bovis (M. kansasii, M. marinum, M. szulgai) – ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) – CFP-10 (culture filtrate protein) – Positive Mitogen-Kontrolle, ob Lymphozyten stimulierbar • Kann Tuberkulintest für Serokonversion ersetzen • Kein Ersatz für Erregernachweis Neue Methoden für den Nachweis und Resistenzprüfung • Direktnachweis des Genoms von Mycobacterium tuberculosis Komplex – PCR Methode • Sensitiv und Speziesidentifizierung – Innerhalb von 1 Tag möglich • Teure Methode, welche nicht jeden Tag gemacht wird • Direktnachweis von bestimmten Resistenzen direkt aus dem Sputum (viele SFS vorhanden) – PCR und Sonden • INH-Resistenz und Rifampicin-Resistenz – Ausnahme-Untersuchung, die bei Verdacht auf resistente TB gemacht werden kann – Teuer und unregelmässige Durchführung Neue Methoden für die Identifizierung • Von gewachsener flüssiger oder fester Kultur PCR für Mycobacterium tuberculosis Komplex und Mykobakterien generell 1. Differenzierung – Oft bereits nach 1 Woche möglich • Wenn Mycobacterium tuberculosis Komplex, dann Unterscheidung von Mycobacterium tuberculosis oder Mycobacterium bovis – 1-2 Tage nach obigem Test • Sequenzierung für nicht tuberkulöse Mykobakterien – 1-4 Tage nach 1. Differenzierung Identifizierung von Mykobakterien Identifizierung von Mykobakterien Spitalhygienisch relevante alte Methoden • Stämme von Patienten werden verglichen, ob Übertragung statt gefunden hat – Die Stämme müssen vorliegen – Aufgabe des nationalen Zentrums für Mykobakterien • Resistenzprüfung für resistente M. tuberculosis • Allenfalls neben klinischer Untersuchung von Kontaktpersonen auch Tuberkulintest – Nachteil von Beeinflussung durch frühere BCGImpfung – Neuere Teste statt Tuberkulinttest
