gentechnologie
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GENTECHNOLOGIE Was will die Gentechnik? Lebewesen mit neuen Eigenschaften schaffen, also Genome verändern, auch zunächst entschlüsseln. Beispiel: Heute schon können Bakterien menschliches Insulin produzieren. Künstliche Neukombination Genetischen Materials, der DNS Lebewesen mit biochemisch reKombinierter DNS vermehren = KLONEN Nicht zu verwechseln mit Biotechnologie Sie nützt den Stoffwechsel und die natürlichen Eigenschaften von Organismen technisch aus. Beispiel: Verwendung von Back- und Bierhefe. 1. Wie wird DNS künstlich = biochemisch rekombiniert Um DNS biochemisch zu rekombinieren braucht man Werkzeuge. Wichtige WERKZEUGE der Gentechnik sind: a) Scheren und Klebstoff b) Vehikel (Vektoren) zu a) Gentechnische Scheren = Schneideenzyme = Restriktionsenzyme Sie schneiden zwischen den Basen und Holmen der DNS durch, Fragmente mit einsträngigen = „klebrigen Enden“ (komplementär) entstehen. (Manchmal auch nichtklebrige Enden müssen „klebrig“ gemacht werden) Seite 92 © Florian Zeller 07/08 Eine Schere heißt z.B. Eco R1 (= aus Escherichia coli gewonnenes Restriktionsenzym Nr. 1) Anmerkung: Heute sind über 500 Schneideenzyme bekannt, aus Bakterien isoliert. Dort dienen sie zur Zerstörung von Fremd-DNS (Vieren-DNS!) einsträngige Enden (klebrig wegen der Möglichkeit der Ausbildung von H-Brücken) Dieser Teil kann kann natürlich auch von der DNS eines anderen Organismus stammen. (Wenn gleiche Schere verwendet wurde) führt zu REKOMBINATION Gentechnischer Klebstoff = Enzym Ligase Schließt einsträngige DNS-Enden des gleichen Organismus oder auch von verschiedenen: z.B. Mensch-Bakterium zu b) Vehikel = Vektoren Ein Vektor ist ein Vehikel für den Gentransfer von Zelle zu Zelle. von Außen in die Zelle. Viren-Vektoren, also Vieren als Vehikel kennen wir schon Plasmid-Vektoren: Plasmide sind ringförmige „Zusatzchromosomen“ in Bakterien. Die Vehikel können Passagiere transportieren, d.h. Plasmid-Vektoren können – wenn dieselben Restriktionsenzyme tätig sind – ein Fragment fremder DNS unter erneuter Ringbildung als Passagier aufnehmen! 2. Plasmid-Vektor pBR 322 Ein wichtiger Plasmid-Vektor hat die Bezeichnung pBR322. Er wurde speziell für Klonierungszwecke aus mehreren E.coli Plasmiden zusammengebaut. Seite 93 © Florian Zeller 07/08 Einbau eines Fremd-Gens und Klonierung Im Tetracylin-Resistenzgen existiert eine EcoR1-SchnittStelle, hier soll Fremd-DNS eingebaut werden: - Plasmid aufschneiden Im Reagenzglas mit versetzt geschnittenen DNS-Stücken vermischen Zufällige Rekombination über die „klebrigen“ Enden. Vektoren mit eingebauter Fremd-DNS = Hybridvektor Die Hybridvektoren müssen zur Vermehrung in Wirtszellen eingeschleust werden, z.B. durch Transformation: Blanke Hybridvektoren werden von Rezeptorproteinen auf der Zellwand vom Empfängerbakterium erkannt und anschließend aufgenommen. Klon: identische Nachkommen einer Zelle bzw. Gruppe erbgleicher Individuen Klonierung: Vorgang der Vermehrung bzw. Herstellen erbgleicher Individuen Suchaktion – Hybrid-Vektor-Klonselektion Problem: Bei der Transformation nimmt im ∅ nur jede 10 Millionste Bakterienzelle einen Vektor auf, und zwar gleichermaßen Vektoren mit und ohne Fremd-DNS!! Im Reagenzglas sind also Wirtsbakterien ohne Vektor mit Vektor (= unveränderter Vektor) mit Hybridvektor Suchaktion zur Auffindung all der Bakterien mit Hybridvektoren notwendig !!! Die Suche erfolgt in zwei Schritten aufgrund der Antibiotika-Resistenzen des Vektors mittels antibiotikahaltiger Nährböden nach der Kolonie-Stempel-Technik: Seite 94 © Florian Zeller 07/08 3. Identifizierung von Klonen mit best. DNS-Fragmenten Wiederholung der bisherigen Schritte: DNS eines lebewesens wurde mittels Restriktionsenzym zerschnitten, Fragmente in Plasmide eingebaut, Plasmide auf Wirtsbakterien übertragen, Klonierung, Hybrid-Vektorklonselektion durchgefürht Klone mit verschiedenen Hybridvektoren identifiziert (= „Genbank“) Problem jetzt: Welche Gene (oder Teile von Genen) befinden sich in den einzelnen Klonen? z.B. in welchem Klon steckt das Insulin-Gen? Dazu muss man z.B. die Aminosäuresequenz (oder einen Teil davon) des Insulins kennen. Dann ist eine „Rückübersetzung“ auf eine bestehende Basensequenz möglich: Beispiel Insolin: Teil der AS-Sequenz m-RNS DNS (codogener Strang) … Val – Leu – His – Ser – Gly … … GUA CUG CAU UCG GGA … … CAT GAC GTA AGC CCT … Auf chemischem Wege (im Reagenzglas) werden entsprechende einsträngige DNA-Stücke hergestellt und radioaktiv markiert (Einbau von 32 Phosphor) DNS-Sonde = markiertes einsträngiges Stück DNS Enthält die Sonde eine komplementäre Basensequenz des Insulingens, kann man damit Wirtsbakterien identifizieren, deren Hybridvektor das Insulingen (oder Teile davon) enthalten. Verfahren der Klon-Identifizierung: 1. Koloniemuster auf Folie überstempeln, Bakterien werden aufgelöst, DNA wird denaturiert, d.h. in Einzelstränge zerlegt 2. DNA-Sonden hybridisieren (= mischen sich) mit einem komplementären DNS-Abschnitt des Insulin-Gens Seite 95 © Florian Zeller 07/08 3. Identifizierung durch Autoradiographie (Auflegen eines Röntgenfilms, wird durch radioaktive Strahlung geschwärzt) 4. Identifizierte Bakterien werden vermehrt. Schema zur Neukombination und Klonierung von DNS Seite 96 © Florian Zeller 07/08 4. EXPRESSION = Herstellung und Abtrennung des gewünschten Produkts z.B. von Insulin (DNS RNS Protein) Das in die Bakterienzelle eingeschleuste und bereits mittels Gensonden identifizierte menschliche Gen soll tätig werden. Das Gen braucht einen Regler (einen „Schalter“ zu „Anknipsen“). Baut man einen solchen Regler ins Plasmid ein, wandelt man dabei den HYBRIDVEKTOR um in einen EXPRESSIONSVEKTOR. Schalter = Regler = Genkombination für Enzyme zum lactoseabbau Der Expressionsvektor gelangt in die Bakterien. Anschalten des Expressionsvektors: Man gibt den Bakterien Lactose (= Milchzucker). Die Bakterien „kennen“ Lactose, sie bilden von selbst die Enzyme zum Abbau von Lactose, dazu muss natürlich die entsprechende Genkombination abgelesen werden. Da kein Stopp-Signal kommt, fährt die Transkriptase über das Ende der „Lac-Kombination“ hinaus und über das Insulingen! Mittels Transkription und Translation entsteht ein Protein aus zwei Teilen: 1. Teil Enzym zum Lactose-Abbau 2. Teil INSULIN Bakterien (zum Dank für alles) platzen lassen, zweiteiliges Protein isolieren und chemisch spalten und das Insulin = Humaninsulin ist fertig !!! Mit Hilfe solcher gentechnischer Verfahren (siehe 1. bis 4.) werden mittlerweise viele menschliche Proteine zu medizinischen Zwecken gewonnen, z.B. Somatostatin (ein Wachstumshormon), Interferon (Krebsmedikament), Faktor VIII (für Blutgerinnung). Genetischer Fingerabdruck (Genetic-DNA-fingerprintig) Blutgruppenuntersuchungen gestatten oft nur einen eindeutigen Vaterschaftsausschluss (oder Täterausschluss bei Gewaltverbrechen), aber keinen Beweis !! Die direkte Untersuchung von DNS aus Blut-, Gewebe- oder Spermaproben ermöglicht es heute, unsichere Väter und Verbrecher zu identifizieren !! Methode: Menschliche DNA enthält Gene, das sind die Basensequenzen, die über die Proteinbiosynthese realisiert werden, menschliche Proteine entstehen. Diese Gene sind für den genetischen Fingerabdruck uninteressant, da sie ja bei allen Menschen so ziemlich ähnlich sein müssen! Menschliche DNA enthält aber auch Basensequenzen die keine Genfunktion besitzen, also nicht realisiert werden. Diese Basensequenzen wiederholen sich sehr viele Male, ihre chemische Struktur variiert von Individuum zu Individuum in äußerst weiten Grenzen: Seite 97 © Florian Zeller 07/08 Länge und Abfolge der Sequenzen, Zahl der Wiederholungen und ihre Position in der DNA sind absolut individuumspezifisch! Diese Basensequenzen unterliegen ja nicht dem evolutionären Ausleseverfahren, können deshalb munter mutieren und daher so unterschiedlich sein!!! Diese Basensequenzen machen den genetischen Fingerabdruck aus. Schätzung: Unter 10 Milliarden Menschen findet man diese individuellen Basenabfolgen nur 1 mal !!!! Momentane Erdbevölkerung: 6 Milliarden Menschen, davon ca. 50 % ♂♂ Methoden des Gentransfers Mikroinjektion: Mit einer sehr feinen Kanüle werden die Zellund die Kernmembran durchstochen, und Fremd-DNA wird direkt in den Kern injiziert. Mit dieser Methode kann ein Gentransfer auch durch die Zellwand einer Pflanzenzelle erfolgen. Vieren: Das Fremdgen wird in ein wirtsspezifisches Virus eingebaut. Das Virus infiziert die Zelle und schleust dabei die Fremd-DNA ein. Verwendet man Retrovieren, wird das Fremdgen in das Wirtschromosom eingebaut. Liposomen: Fremd-DNA wird von einer künstlich hergestellten Doppel-Lipidschicht eingeschlossen. Die so entstehenden Vesikel werden als Liposomen bezeichnet. Sie verschmelzen mit der Doppel-Lipidschicht der Zellmembran und entlassen die DNA ins Zellinnere. UV-Laser: Mit Hilfe eines UV-Lasers werden kleine Löcher in Zellwand und Membranen gebrannt, die sich nach 5 Sekunden wieder schließen. In dieser Zeit kann Fremd-DNA eindringen. Partikelpistole: Kleine Goldpartikel werden mit Fremd-DNA beschichtet, und man beschießt damit die Zelle. Dabei gelangen beladene Partikel auch in den Zellkern. Mit der Partikelpistole können auch Pflanzenzellwände durchdrungen werden. PCR- eine bahnbrechende Methode Heute kann man bereits kleine DNA-Stücke mit der Methode der Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) unbegrenzt vermehren. Die PCR-Methode nutzt das Prinzip der DNA-Replikation: Isolierte doppelsträngige DNA, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält, wird in einem Reaktionsgefäß erhitzt. Es kommt zur Spaltung in die beiden Einzelstränge (= Denaturierung der DNA). An diese lagern sich bei niedriger Temperatur zwei synthetisierte DNA-Primer an. (= DNA-Hybridisierung). Seite 98 © Florian Zeller 07/08 Ihre Basensequenzen sind so gewählt, dass sie komplementär zu den DNA-Sequenzen passen, die den zu vermehrenden Bereich begrenzen. Daher müssen die Basensequenzen an diesen Enden des Ziel-DNA-Bereichs bekannt sein. Durch die Hybridisierung sind zwei kurze doppelsträngige DNA-Abschnitte entstanden, die als Starter für eine DNA-Polymerase dienen. Hierbei handelt es sich um ein hitzestabiles Enzym, das aus dem Bakterium Thermus aquaticus stammt. Der Vorteil der Verwendung der TaqPolymerase liegt in der einmaligen Zugabe zum PCRAnsatz, da das Enzym durch die nachfolgenden Erwärmungen nicht zerstört wird. Die hitzebeständige TaqPolymerase katalysiert nun bei etwa 72 °C die 5‘ – 3‘ DNA-Synthese an den Einzelsträngen. Dazu verwendet sie die ebenfalls im Reaktionsgefäß befindlichen vier DNA-Nucleotid-Sorten. Nach etwa vier Minuten wird die Replikation durch kurzfristige Temperaturerhöhung auf 94 °C (2 Minuten) abgebrochen, wodurch die Doppelhelix-Abschnitte wieder denaturiert werden. Temperaturerniedrigung (etwa 55 °C; 3 Minuten) führt erneut zur Anlagerung der in der Lösung befindlichen unverbrauchten Primer. Durch Temperaturerhöhung (etwa 72 °C; 4 Minuten) wird die TaqPolymerase wieder aktiv und vermehrt erneut den ZielDNA-Bereich. In der Regel lässt man diesen PCR-Zyklus mit den Reaktionsschritten Denaturierung der DNA, Pimerbindung und DNA-Synthese 30- bis 60-mal ablaufen. Nach 30 zyklen ist die Zielsequenz auf das 250 Millionen-fache vervielfältigt. Die Bedeutung der PCR-Methode liegt in einer schnellen Vermehrung winzigster DNAmengen. So konnte man DNA-Reste aus 80 Millionen Jahre alten Knochenfunden isolieren, mit der PCR-Methode vervielfältigen und auf die Verwandtschaft zu rezenten Lebewesen hin untersuchen. Auch in der medizinischen Diagnosen ist die PCR-Methode von Bedeutung. So kann z.B. anhand einer einzigen Zelle der Nachweis für eine Virusinfektion, einen genetischen Defekt oder Krebs geführt werden. Isolierte doppelsträngige DNA wird erhitzt Spaltung in die beiden Einzelstränge. An diese lagern sich bei niedriger Temperatur zwei synthetisierte DNA-Primer an. Durch die Hybridisierung sind zwei kurze doppelsträngige DNA-Abschnitte entstanden, die als Starter für eine hitzestabile DNA-Polymerase dienen. Die hitzebeständige Taq-Polymerase katalysiert die DNA-Synthese an den Einzelsträngen. Dazu verwendet sie die im Reaktionsgefäß befindlichen vier DNA-Nucleodit-Sorten. Nach etwa 4 Minuten wird die Replikation durch durch kurzfristige Temperaturerhöhung abgebrochen, wodurch auch die gebildeten Doppelhelix-Abschnitte wieder in Einzelstränge gespalten werden. Seite 99 © Florian Zeller 07/08 Temperaturerniedrigung führt erneut zur Anlagerung der in der Lösung befindlichen Primer. Die Taq-Polymerase verdoppelt wieder die einzelsträngigen DNA-Bereiche. In der Regel lässt man diesen PCR-Zyklus mit den Reaktionsschritten Denaturierung der DNA, Primerbindung und DNA-Synthese 30- bis 60-mal ablaufen. Sequenzierung der DNA Klonierung der DNA Ein zu untersuchender DNA-Abschnitt wird in ein Plasmid eingeschleust und in Bakterien vermehrt oder in vitro durch polymerase chain reaction (PCR) millionenfach vermehrt. Anschließend werden bei Temperaturen zwischen 50 °C und 80 °C Einzelstränge gebildet. Sequenzierung An die einsträngigen DNA-Abschnitte werden radioaktiv* markierte Primer (künstliche Startsequenzen) gebunden. Die DNA-Abschnitte werden auf 4 Reagenzgläser verteilt. In jedes Reagenzglas gibt man Nucleotide (alle 4 Sorten) und je eine Sorte von Abbruchnucleotiden. (z.B. ddGTP Didesoxyguanosintriposphat, fehlt eine OH-Gruppe am 3‘Ende, sodass kein weiteres Nucleotid mehr gebunden werden kann. Durch Zugabe von DNA-Polymerase wird die DNA-Synthese gestartet. Von Primer ausgehend bilden sich unterschiedlich lange, radioaktiv markierte DNAStränge, die in jedem Ansatz mit einem anderen Abbruchnucleotid enden. TGACCTGAATGA TTACT Die Elektrophorese Die Elektrophorese dient zur Trennung eines Gemisches geladener Teilchen (DNAFragmente, Peptide, Proteine, Aminosäuren). Sie ist eine unvollständige und verlangsamte Form der Elektrolyse. Bei der Elektrophorese wird ei Wanderschwindigkeit der geladenen Teilchen durch die Verwendung von elektrolytgetränktem Trägermaterial (Papier, CelluloseacetatFolie, Agar-Gel) stark herabgesetzt. Seite 100 © Florian Zeller 07/08 Beim Anlegen einer Spannung beginnen die geladenen Teilchen zu wander. Die Wandergeschwindigkeit eines Ions hängt von verschiedenen Faktoren ab. 1. Größe des Teilchens (große Ionen wandern langsamer als kleine Ionen) 2. Ladung des Ions 3. Größe der Spannung DNA-Fragmente unterscheiden sich nur in ihrer Größe, die Ladung (negativ) ist gleich groß. Suchen und Auffinden bekannter DNA-Fragmente mit Gensonden Um ein bekanntes DNA-Fragment zu finden wird die DNA aus den Zellen isoliert und mit Restriktionsenzymen in Bruchstücke zerlegt. Die entstandenen Fragmente werden durch Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Anschließend wird ein Nitrocellulose-Filter auf das Elektrophorese-Gel gelegt. Dadurch entsteht ein Abklatsch des Fragmentmusters. (Southern-Blotting) Durch Erhitzen auf 80 °C wird die DNA einsträngig. Nun gibt man Gensonden, das sind radioaktiv oder mit Farbstoff markierte DNA-Einzelstränge, die komplementär zu den gesuchten DANN-Fragmenten sind, auf das Nitrocellulose-Filter. Die Gensonden hybridisieren mit den gesuchten DNA-Stücken. Die durch die Hybridisierung entstandenen Teilstücke können dann durch Autoradiographie oder Fluoreszenz sichtbar gemacht werden. Seite 101 © Florian Zeller 07/08 GENDIAGNOSE und GENTHERAPIE beim Menschen a) Gendiagnose = neues gentechnisches Verfahren zur Diagnose von Erbkrankheiten: Ein bestimmtes defektes Allel kann beim Erwachsenen, Neugeborenen oder bereits bei Embryonen aufgespürt werden. Man benötigt Blut oder Fruchtwasser und Gensonden: Auf eine besondere Folie gibt man pro Person 2 Tropfen DNS-Probelösung aus dem Zellkern. Diese Doppelstränge werden durch Erhitzen denaturiert. Zu einem Tropfen fügt man die Normalsonde, zum anderen die Mutationssonde. Zur Hybridisierung kommt es nur, wenn alle Basen komplementär sind. Nach dem Waschvorgang erfolgt die Autoradiographie. Beispiel: 3 mögliche Fälle bei einer Form der Bluterkrankheit (diploider Chromosomensatz !!) (A) normal (B) mutiert homozygot heterozygot gleiche Stränge radioaktiv markiert Vorteile der Gendiagnose: Der Rahmen der genetischen Beratung konnte beträchtlich erweitert werden. Bedenken: - Psychosozialer Druck auf Schwangere - Ablehnung Behinderter - Arbeitgeber und Versicherer könnten in Gesundheitszeugnissen Gendiagnosen verlangen b) Gentherapie Unter Gentherapie versteht man den Transfer und die Expression eines intakten Gens in Zellen, die ein defektes Gen enthalten. Man unterscheidet dabei zwischen somatischer (Körperzellen betreffender) Gentherapie und der Gentherapie von Keimbahnzellen (Zellen, die zu Geschlechtszellen werden, einschließlich der Zygote). Der Eingriff in Keimbahnzellen ist in der BRD aus ethischen Gründen nach dem Embryonenschutzgesetz verboten. Seite 102 © Florian Zeller 07/08 Die erste erfolgreiche somatische Gentherapie beim Menschen wurde 1990 an einem Mädchen durchgeführt, das an einer angeborenen schweren Immunschwäche (SCID) litt. Ursache ist ein defektes Gen für das Enzym Adenosindesaminase (ADA-Mangel) in den T-Lymphocyten. Anwendungsmöglichkeiten der Gentechnologie Bakterien: als „Reaktoren“ zur Herstellung von z.B. Insulin, Faktor VIII Pflanzen: - verbesserte Haltbarkeit - verbesserte Proteinproduktion (z.B. mehr Lysin = essentielle AS Fleischersatz) - Verlangsamung der Reifung (Anti-Matsch-Gen) - Herbizidresistenz, Vierenresistenz - Giftgene gegen Raupen Methode: die Gene werden mit Mikrokanülen in den Protoplasten (ohne Zellwand) eingebracht Tiere: - stärkeres Wachstum - bessere Fleischqualität - Krankheitsresistenz Methode: die Gene werden mit Mikrokanülen in Zygoten eingebracht (oder mit Vieren = Mensch: Transduktion) - Gendiagnose - Gentherapie Achtung: Eingriff in die Keimbahn verboten !! Methode: mit Retrovieren (RNS-haltig, Transduktion) Seite 103 © Florian Zeller 07/08 Das Immunsystem Vorstellung verschiedener Krankheitserreger Protozoen (= Eukaryonten z.B. Malariaerreger), Bakterien und Viren aber auch Giftstoffe und eine Vielzahl körperfremder Substanzen bis hin zu Holzsplittern und Asbestfasern bedrohen unsere Gesundheit. Der Körper hat dagegen eine Reihe von Abwehrmechanismen entwickelt. Unspezifische Abwehr (Resistenz) Hierunter sind Abwehrmechanismen zu verstehen, die sich gegen eine Vielzahl unterschiedlicher Erreger wenden. Resistenzfaktoren: Granulocyten – weiße Blutkörperchen, die Phagocytose betreiben - , Lysozym – bakterienauflösendes Enzym in der Tränenflüssigkeit - , Sekrete der Speicheldrüsen und der Nasenschleimhaut, Schleim der Bronchien und der Lungenalveolen, Sekrete der Talgdrüsen und der Schweißdrüsen, Magensäure. Spezifische Abwehr (Immunität) Viele Krankheitserreger sind mit den Resistenzfaktoren alleine nicht zu bezwingen. Deshalb wurden vom Körper Abwehrmechanismen entwickelt, die gezielt gegen ganz bestimmte Organismen oder Substanzen gerichtet sind. Humorale Immunität: In Körperflüssigkeiten vorkommende Antikörper (Immunglobuline) = spezielle Abwehrproteine, sie werden gegen Krankheitserreger (= Antigene) oder gegen Stücke der Oberfläche der Antigene (= Antigendeterminante) gebildet. Antigen: Ist allgemein ein Stoff, der eine Antikörperbildung hervorrufen kann !! Zelluläre Immunität: Durch Lymphocyten hervorgerufene Immunität (z.B. Aufspüren von Erregern in Zellen). Seite 104 © Florian Zeller 07/08 Bau eines Antikörpers - globuläres Protein, Y-Form, 4 Polypeptidketten (2 leichte, 2 schwere) Skizze: NH2 H2N H2N NH2 HOOC HOOC COOH COOH Konstanter Bereich: AS-Sequenz bei allen Antikörpern weitgehend identisch (Art Skelet) Variabler Bereich: - hier unterscheiden sich die verschiedenen Antikörper in der AS-Sequenz - an schwerer und leichter Kette Seite 105 © Florian Zeller 07/08 Hypervariabler Bereich: - kleiner Abschnitt innerhalb des variablen Bereichs - AS-Sequenz variiert hier besonders stark - diese Bereiche legen sich an den Enden beider Arme zu einer räumlich höchst spezifischen Aussparung zusammen = Antigenbindungsstelle Merke: Die Spezifität eines Antikörpers hängt von der räumlichen Struktur und der chemischen Zusammensetzung der Antigen-Bindungsstelle ab !!! Das genetische Kartenspiel oder molekulare Ursachen der Antikörpervielfalt Das menschliche Immunsystem kann 10 – 100 Millionen verschiedener Antikörper herstellen. Es kommt mit ca. 500 Genstücken aus, die sich beliebig kombinieren lassen so wird die riesige Zahl verschiedener Immunglobuline möglich! Die Neukombination der Genstücke läuft auf zwei Ebenen ab: 1) Bei der Reifung der B-Lymphocyten im Knochenmark = Rearrangement 2) Bei der PBS der reifen B-Zellen, die schon durch den Körper marschiert = Splicing Beides sind somatische Rekombinationsvorgänge! Die Vielfalt der Antikörper hat ihre Ursache in einer komplizierten Rekombination der Antikörpergene (-genstücke). Achtung: SOMATISCHE REKOMBINATIONSPROZESSE !!!! Antikörper-Gene sind sogenannte Mosaikgene: Die Nucleotidsequenzen für die verschiedenen Teile (C,V) des fertigen Antikörpers sind in viele kleine, weit auseinanderliegende Stücke aufgeteilt. Herstellung einer leichten Antikörperkette Auf der DNS finden sich 3 Gensorten: V-Gene: codieren für variablen Bereich (mehrere hundert verschiedene) C-Gene: codiert für konstanten Bereich J-Gene: joining Gene, codieren für Verbindungsstück zwischen V- und C-Bereich So steht es auf der „normalen“ (= Keimzellen) DNA geschrieben. Seite 106 © Florian Zeller 07/08 Nun sind 4 Schritte notwendig, bis zum Schluss tatsächlich eine leichte Antikörperkette gebildet ist (Nur eine leichte Antikörperkette, kein ganzer Antikörper !!!): 1. 2. 3. 4. Rekombination (Rearrangement) Transkription Spleißen der DNA Translation Exon Intron Exon: wird verwirklicht Intron: wird nicht verwirklicht, uninteressante Genstücke Die zusammenhängende Information für eine Antikörper-Kette entsteht in vier Schritten: (1) Rekombination: zuerst wird je ein zufällig ausgewähltes V- und J-Gen (hier V2 und J2) mit Hilfe von Enzymen verbunden, die den gesamten dazwischenliegenden DNA-Abschnitt entfernen (hier das Stück mit V3, V4 und J1, so dass V2 und J2 zusammenkommen). (2) Transkription: anschließend wird die DNA auf ganzer Länge vom Start des ausgewählten V-Gens (hier V2) bis zum Ende des C-Gens in eine RNA umgeschrieben. (3) Spleißen: spezielle Enzyme im Zellkern schneiden dann den RNA-Abschnitt vom Ende des J2-Gens bis zum Beginn des C-Gens heraus. Dabei entsteht die Boten-RNA (mRNA) mit der zusammenhängenden Information für die Antikörper-Kette. (4) Translation: diese Boten-RNA steuert die Herstellung der Antikörper-Kette. Durch dieses Verfahren ergeben sich weit über 10.000 Kombinationsmöglichkeiten. Leichte und schwere Ketten zusammen können wahrscheinlich mehr als 10 Millionen verschiedene Antikörper-Moleküle hervorbringen. Die Vielfalt der Antikörper beruht auf der natürlichen Neukombination von Mosaikgenen. Die Vielfalt, die durch diese kombinatorischen Prozesse zustande kommt, wird durch zwei Faktoren nochmals vergrößert. - Erstens arbeiten die Enzyme, die die DNA-Abschnitte miteinander verbinden, etwas ungenau, so dass sich die Verbindungsstelle um einige Basenpaare verschieben kann = Rastermutation. - Zweitens treten während der B-Zellenreifung in den DNA-Abschnitten, die für die variablen Bereiche codieren, spontane Mutationen auf = Punktmutationen. Seite 107 © Florian Zeller 07/08 Diese verschiedenen Mechanismen zur Erzeugung der Antikörper-Vielfalt treten zu verschiedenen Zeitpunkten der BZellenreifung in Erscheinung. - Zuerst werden die verschiedenen Antikörper-Gene kombiniert. Dieser Prozess ist abgeschlossen, wenn die Zellen erstmals mit Antigenen in Kontakt kommen. Aus der großen Variationsbreite der B-Zellen werden durch jedes Antigen die wenigen Antigen-spezifischen Zellen selektiert. - Während der Reifung dieser ausgewählten B-Zellen zu Plasmazellen wird der Mutationsmechanismus tätig und nimmt die Feinabstimmung der Immunantwort vor: durch geringfügige Änderungen der Basensequenz entstehen Antikörper-Gene, deren Produkte noch besser zum Antigen passen. Die B-Zelle lager Plasma an, wird größer und so zur Plasmazelle. Aufgrund ihrer Größe kann sie nun mit der Produktion von Antikörpern beginne und anfangen, diese auszustoßen. Ablauf von Antigen-Antikörperreaktionen Präzipitation: Lösliche Antigene, wie z.B. Proteine, werden zu großen Aggregaten vereinigt und ausgefällt. Da ein Antigen zwei Bindungsstellen besitzt, kann es auch zwei Antigene binden. Dadurch kommt es zur Zusammenballung tausender Antigenmoleküle. Agglutination: Unlösliche Antigene, wie z.B. Blutkörperchen oder Bakterien, werden nach dem gleichen Mechanismus großen Aggregaten vereinigt und ausgefällt. Zytolyse: Antikörper lösen in Verbindung mit dem Komplementsystem Erregerzellen auf. Das Komplementsystem besteht aus 20 verschiedenen Proteinen (C1 bis C20), die in der Leber gebildet werden. Die Proteine C1 bis C9 koppeln sich an einen Antikörper, der sich an ein Antigen geheftet hat, bilden einen Ring und lösen ein Loch in die Zelle. c) manche Gifte = lösliche Antigene werden zusammengeballt und ausgefällt. Unlösliche Antigene werden agglutiniert = Agglutination lösliche Antigene = Präzipitation Antigendeterminante Seite 108 © Florian Zeller 07/08 Seite 109 © Florian Zeller 07/08 Erworbene Immunität - Übersicht Entwicklung und Aufgaben der Zellen der gezielten Immunreaktion: B-Gedächtniszellen Voraussetzung für eine gezielte Immunreaktion: Erreger muss als solcher erkannt werden: nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip !!! zu T-Lymphocyten 1. 2. 3. 4. T-Killer-Zellen: vernichten infizierte Körperzellen T-Helfer-Zellen: Kontrollfunktion T-Suppressor-Zellen: Unterdrücken bzw. beenden die Immunantwort T-Gedächtnis-Zellen Wir werden nun die speziellen Aufgaben dieser Zellen weiter verfolgen. Schema: (T- und) B-Lymphocyten Rezeptoren in der Membran, also „membranbeständige“ Antikörper hat Antigene auf der Oberfläche, wenn diese körperfremd sind Erreger wird nach dem SchlüsselSchloss-Prinzip erkannt !!! Seite 110 © Florian Zeller 07/08 Wie schafft es nun ein B-Lymphocyt tatsächlich exakt auf den Erreger zu reagieren ??? Antwort darauf gibt die „klonale Selektion“ B-ZELLEN, KLONALE SELEKTION Durch das „genetische Kartenspiel“ gibt es Millionen verschiedener B-Lymphocyten, die durch den Körper wandern, jeder präsentiert sein Y, also seinen ganz speziellen membranständigen Antikörper auf seiner Oberfläche. Diese räumlich hochspezifischen Antiköper (Rezeptoren) sind Versuchskaninchen, die sich vorsorglich gegen alle möglichen und unmöglichen Antigene richten. Einige der Millionen verschiedenen B-Zellen Passt ein Rezeptor zufällig auf ein Antigen Passt ein Rezeptor zufällig nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip zu einem Antigen, wird das Antigen gebunden! Nachdem T-Helfer-Zellen die Erlaubnis gegeben haben (siehe später), vermehrt sich der B-Lymphocyt vielfach, es entsteht ein KLON ERBGLEICHER B-ZELLEN PLASMA ZELLEN Heftige Antikörper-Produktion werden groß, lagern viel Plasma ein für Ribosomen zur Antikörper-Bildung B-GEDÄCHTNISZELLEN bleiben in Reservestellung, ermöglichen bei erneuter Infektion mit demselben Antigen eine raschere und stärkere Antikörper-Reaktion! Infektion kann gekappt werden, ehe sie sich ausbreitet Antigen-Determinanten Ein Antigen hat meist mehrere charakteristische Bereiche = Determinanten, die zufällig zu verschiedenen Rezeptoren passen meist mehrere Typen von B-Lymphocyten werden zur Klonbildung angeregt. Seite 111 © Florian Zeller 07/08 B-Zellen-klonäre Selektion - humorale Immunabwehr Klon-Selektions-Theorie B-Lymphocyten, die Rezeptoren für das Antigen besitzen, werden durch Bindung des Antigens aktiviert… Joachim, Jürgen, Josef = B-Lymphocyten verschiedener Spezifität. … und verwandeln sich zu antikörperbildende Plasmazellen. Die anderen bleiben inaktiv. Seite 112 © Florian Zeller 07/08 Die „Erkennungsmoleküle“ des Immunsystems sind: Abb. 120.2 Wichtige Typen von Erkennungsmolekülen des Immunsystems Als Antikörper auch frei ! Nur 1 Antigenbindungsstelle, stets in der Zellmembran verankert. Nehmen Antigene auf und präsentieren sie den T-ZellRezeptoren. individuumsspezifische Moleküle (siehe auch „Fehlreaktion 2 Varianten je nach T-Zell-Typus des Immunsystems“) Primäre und Sekundäre Immunantwort Seite 113 © Florian Zeller 07/08 Primäre Immunantwort: B-Lymphocyt mit passendem Rezeptor muss das Antigen erst einmal „treffen“ alle Prozesse bis zur Plasmazellbildung müssen ablaufen Antikörper-Sekretion der B-Plasmazellen. Sekundäre Immunantwort: „Gedächtniszellen“ = ruhende, reife B-Zellen, können zu einem späteren Zeitpunkt, wenn das Antigen erneut auftaucht, viel rascher reagieren und eine stärkere Antikörperproduktion bewirken. Gründe: 1. Durch die Klonbildung bei der Erstinfektion steht bereits eine größere Zahl Antigenspezifischer „Gedächtniszellen“ zur Verfügung ! 2. Diese ruhenden, aber reifen B-Gedächtniszellen benötigen nur wenige Teilungsschritte, bis sie zu Plasmazellen werden und die Antikörpersekretion starten kann ! Aktivierung von Killer-T- und Helfer-T-Zellen durch Kontakt mit präsentiertem Antigen B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen bezeichnet man als die Effektorzellen der humoralen Immunantwort. Die von ihnen abgegebenen Antikörper binden gelöste und membrandständige Antigendeterminanten. T-Lymphozyten binden mit ihren Rezeptoren dagegen nur an Antigendeterminanten, die ihnen von Präsentiermolekülen auf einer Zellmembran angeboten werden. „Killer-T-Zelle“ „Helfer-T-Zelle“ Ein Virus befällt eine Zelle. Seine Hülle bleibt in der Zellmembran, seine Kapsel wird im Plasma zerlegt. Teile davon werden auf Präsentiermolekülen nach außen befördert. Ein passender T-Zell-Rezeptor bindet daran. Sein Hilfsrezeptor (CD8) stabilisiert die Bindung. Das davon ausgehende Signal veranlasst die T-Zelle, ein Enzym abzugeben, das die infizierte Zelle zerstört. Man bezeichnet diese Gruppe von T-Zellen deshalb als Killer-T-Zellen. Sie sind die Effektorzellen der zellulären Immunantwort. T-Lymphozyten, die den anderen Hilfsrezeptor (CD4) besitzen, docken auf Präsentiermolekülen von Makrophagen an, die Antigendeterminanten aufgenommener und zerlegter Vieren zeigen. Sie helfen dann durch Abgabe von Zell-Botenstoffen mit, aktivierte Killer-T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen zu Abwehrleistungen anzuregen. Deshalb bezeichnet man sie als Helfer-T-Zellen. Sie sind die wichtigsten regulatorischen Zellen des Immunsystems. Seite 114 © Florian Zeller 07/08 Aktivierung von B-Lymphozyten B-Lymphozyten können zwar durch den Kontakt ihrer Rezeptoren mit löslichem Antigen stimuliert werden. Damit sie sich aber wirksam vermehren und in Plasmazellen differenzieren, die dann in großer Menge die Antikörper abgeben, bedürfen sie zusätzlich der Mitwirkung von Helfer-T-Lymphozyten: Helfer-T-Zelle Eine Helfer-T-Zelle, die durch eine Antigendeterminante aktiviert wurde, die ein Makrophage präsentiert hatte, nimmt mit einem B-Lymphozyten Kontakt auf, der dasselbe Antigen präsentiert. B-Lymphozyten sind nämlich in der Lage, Antigene, die sie an ihren Rezeptoren gebunden haben, zu phagozytieren und mittels Präsentiermolekül auf der Oberfläche zu zeigen. Die Prüfung der präsentierten Antigendeterminante durch die Helfer-T-Zellen stellt sicher, dass B-Lymphozyten, die ja nicht in die „Thymusschule“ gegangen sind und deshalb auch Eigenpeptide aufschnappen können, keinesfalls dadurch allein aktiviert werden. Nur wenn an B-Zell-Rezeptoren und an T-Zell-Rezeptoren aktivierter Helfer-Zellen dieselbe Antigendeterminante gebunden ist, werden die Startsignale zur Vermehrung dieser B-Zellen erteilt. Dies geschieht in Form von ZellBotenstoffen, die von der Helfer-Zelle abgegeben werden. Gleichzeitig sondert die T-Zelle weitere Botenstoffe ab, die einen lokalen Entzündungsprozess auslösen und Makrophagen anlocken sowie den Zell-Botenstoff Interferon, das Makrophagen aktiviert und befähigt, aufgenommene Erreger zu zerstören. Durch Interferon aktivierte Makrophagen geben ihrerseits einen Tumor-Nekrose-Faktor ab, der eine unspezifische Sorte von Killerzellen unmittelbar mobilisiert, Virus-infizierte Zellen und Tumorzellen zu zerstören. Darauf beruht die Anwendung von Interferon und des Tumor-Nekrose-Faktors bei der Bekämpfung bestimmter Tumore (S. 124). Fehlreaktionen des Immunsystems - Autoimmunerkrankung Eine wesentliche Voraussetzung für das Funktionieren des Immunsystems ist seine offensichtliche Fähigkeit, fremde Peptide, die als Antigendeterminanten wirken, von eigenen unterscheiden zu können. Heute weiß man, dass embryonale T-Lymphozyten diese Fähigkeit während ihres Reifungsaufenthalts in der „Schule“ des Thymus in einem harten Ausleseprozess „lernen“ müssen. Dort werden ihnen nämlich von Epithelzellen auf den „Selbst“spezifischen Präsentiermolekülen körpereigene Peptide zur Wahl angeboten. T-Zellen, die aufgrund ihrer Rezeptorstruktur das Angebot wahrnehmen, werden zerstört! Gelegentlich versagt dieser Zerstörungsprozess. Dann kommt es zu Autoimmunerkrankungen. So greifen z.B. bei einer Form der Zuckerkrankheit Killer-T-Zellen die eigenen insulinproduzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse an. Seite 115 © Florian Zeller 07/08 - Abstoßungsreaktion bei Gewebetransplantationen Die für ein Individuum spezifischen Präsentiermoleküle auf den Zellen sind ursprünglich als Ursache für Abstoßungsreaktionen bei Gewebetransplantationen entdeckt worden. T-Killer-Zellen des Empfängers erkennen Präsentiermoleküle auf Spender-Zellen als fremd und zerstören die Zellen. Nur eineiige Zwillinge besitzen identische Präsentiermoleküle. Wegen der hohen Zahl der Varianten hat zufallsbedingt auch jede 10.000- bis 100.000ste nichtverwandte Person gleichartige Präsentiermoleküle. Zwischen solchen Individuen werden Transplantationen vom Immunsystem toleriert. - Allergien Antikörper einer anderen Klasse (IgE) kennt man als Verursacher von Allergien. Darunter versteht man Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems bei einzelnen Personen. Aus familiärer Häufung schließt man auf eine genetische Disposition. Andererseits zeigt die Häufung der Fälle in Ballungsgebieten mit starker Luftverschmutzung sowie bei Rauchern die Wirkung von Umwelteinflüssen, welche insbesondere Zellen der Atmungsorgane schädigen. IgE-Antikörper, die von verschiedenen Plasmazellen stammen, sind mit ihren Stielen in zufälliger Mischung an eine besondere Sorte von Leukozyten gebunden, die in lockeres Gewebe eingenistet, als Mastzellen bezeichnet werden. Kontakt mit Allergie auslösenden Antigenen, sog. Allergenen, wie Pollen, Tierhaare, Hausstaubmilben, aber auch mit Nahrungsmittelallergenen, Arzneimittelallergenen, Kosmetika oder Insektengiften, kann den Inhalt der Grana explosionsartig entleeren lassen. Es handelt sich dabei um Stoffe wie Histamin, Enzyme und Zytokine, welche die Durchlässigkeit der Blutkapillaren erhöhen, Schwellungen, Schleimbildung und Kontraktionen glatter Muskelzellen fördern sowie Makrophagen anlocken. Unter Kontrolle in Maßen ausgeführt, mögen diese Reaktionen die Zugriffsmöglichkeiten der normalen Immunabwehr am Infektionsort verbessern. Bei überschießender Antwort kommt es dagegen je nach Allergieform zu allergischen Reaktionen wie Heuschnupfen, Zuschwellen der Augen, Asthmaanfällen oder Koliken. Eine mögliche Ursache könnte im Versagen von Suppressor-T-Zellen liegen. Mit Testallergenen kann man feststellen, welche davon Reaktionen auslösen. Mit einem Immuno-Test kann man die Konzentration an IgE im Blutserum ermitteln: Anti-IgE-Antikörper aus einer immunisierten Maus fangen aus einer Serumprobe IgE-Antiköper heraus. Monoklonale Anti-IgE-Antikörper mit einem Enzym am Fußende bindne an die gefangenen IgE-Moleküle. Das Enzym katalysiert eine Farbreaktion, deren Stärke die IgE-Konzentration anzeigt. - AIDS Die erworbene Immunschwächekrankheit AIDS (acquired immune deficiency virus), von der heute weltweit mehrere Millionen Menschen befallen sind, wurde 1981 als eine tödlich verlaufende Krankheit bekannt. Die Ansteckung erfolgt in erster Linie durch ungeschützten Geschlechtsverkehr mit einem infizierten Partner oder bei Drogenabhängigen durch die gemeinsame Benützung von Injektionsnadeln. Durch den konzentrierten Einsatz gentechnischer und immunologischer Verfahren konnte bereits 1983 der Erreger, ein Retrovirus (S. 112), identifiziert und charakterisiert werden. Er wurde HIV (human immuno deficiency virus) genannt. Die fatale Besonderheit die- Seite 116 © Florian Zeller 07/08 ses Virus besteht darin, dass die Protein-Noppen seiner Hülle komplementär zu den CD4-Molekülen der Helfer-TLymphozyten sind, so dass es gezielt auf diesen Zellen landet. Nach der Aufnahme werden seine beiden RNSMoleküle mit der beigepackten reversen Transkriptase in DNS umgeschrieben, und diese wird dann in das menschliche Genom als Provirus integriert. In dieser Form kann es sich 1 bis 10 Jahre versteckt halten ohne sichtbare Schäden zu verursachen. Gelegentlich wird die Virus-DNS aktiviert. Sie wird gesondert repliziert, transkriptiert und in die Hüllproteine translatiert, wobei die Protein-Noppen in die Zellmembran gelangen. Indem kurzfristig freie Viren auftreten, aber auch durch Fusion von infizierten mit nicht infizierten Helfer-T-Zellen können nun weitere Helfer-T-Zellen infiziert werden. Gegen die virusspezifischen Protein-Noppen auf den Helferzellen werden Antikörper produziert und Killer-T-Lymphozyten mobilisiert, welche gemeinsam befallenen Helfer-T-Zellen zerstören. So wird die Immunabwehr zunehmend lahmgelegt. Bisher eher harmlose und durch das Immunsystem in Schach gehaltene Infektionen durch Viren, Bakterien und Pilze breiten sich aus, und maligne entartete Zellen bilden Tumore wie das Kaposi-Sarkom. Damit ist das Vollbild von AIDS erreicht, und innerhalb von ein bis zwei Jahren ist mit dem Tod zu rechnen. Trotz weltweiter intensiver Bemühungen ist noch kein überzeugend wirksames Mittel gegen HIV entwickelt worden. Ablauf der Immunreaktion 1. Erkennungsphase a) Antigene werden von Makrophagen phagocytiert, Teile des Antigens werden auf der Makrophagenoberfläche präsentiert. b) B-Lymphocyten mit passenden Oberflächenstrukturen binden ebenfalls diese Antigene, bauen sie ab und präsentieren Teile davon an ihrer Oberfläche. 2. Differenzierungs- und Vermehrungsphase a) T-Lymphocyten binden sich an die Makrophagen und differenzieren sich unter dem Einfluss von Interleukin zu T8-Killerlymphocyten und T4-Helferzellen. b) T4-Helferzellen binden sich an B-Lymphocyten und fördern durch Interleukinabgabe deren Differenzierung zu antikörperproduzierenden Plasmazellen. c) Von allen Lymphocytentypen werden Gedächtniszellen gebildet. 3. Wirkungsphase a) Humorale (=Flüssigkeit) Immunität: Antikörper bekämpfen Antigene durch Präzipitation, Agglutination und zusammen mit dem Komplementsystem durch Zytolyse. b) Zelluläre Immunität: T8-Killerzellenlymphocyten lösen antigeninfizierte Zellen durch Perforin auf. 4. Abschaltphase Wenn keine Antigene mehr da sind, gibt es keine Erkennung und Differenzierung mehr. T4-Helferzellen hemmen die weitere Bildung von Plasmazellen und induzieren die Bildung von T8Suppressorzellen, die T8-Killerlymphocyten und Plasmazellen hemmen. Übungsaufgabe: Unterscheide bei der Proteinbiosynthese zwischen Pro- und Eukaryonten Prokaryonten ringförmige DNS Eukaryonten „gestreckte“ DNS Ort Transkription & Translation im Cytoplasma Prozess Transkription & Translation laufen kombiniert ab 70 s (Polysomen) wird nicht geschnitten (keine Introns) Transkription im Zellkern Translation im Zellplasma liegt eine Pause dazwischen weil mRNA erst ins Plasma wandern muss 80 s wird zwischen Transkription und Translation gespleißt, Introns herausgeschnitten DNS (die abzulesen ist) Ribosomentyp m-RNA Seite 117 © Florian Zeller 07/08
