Salmonella Typhimurium live attenuated vaccine - ETH E

DISS. ETH NO. 20514
Salmonella Typhimurium live attenuated vaccine with
improved safety in immunocompromised mice
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Balamurugan Periaswamy
Master of Science in Biotechnology, University of Madras
Born on 25th Jan 1978
Citizen of India
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt (examiner)
Prof. Dr. Annette Oxenius (co-examiner)
Prof. Dr. Martin Ackermann (co-examiner)
Zurich 2012
Summary
Non-typhoidal Salmonella (NTS) species, Typhimurium and Enteritidis are gram negative, rod
shaped, facultative anaerobic, motile rods that can cause a self-limiting gastroenteritis in Humans.
NTS species commonly spread through contaminated food or water, contact with animals. They have
a broad host range and can infect a wide variety of wild and domestic animals including, birds, cattle
and amphibians. Approximately 93.8 million cases of human gastroenteritis are reported every year
and pose a significant health burden worldwide. In sub-Saharan Africa, a severe invasive form of the
Salmonellosis has been spreading resulting in blood stream infections, particularly affecting children,
people with primary or acquired immune-deficiencies. It was estimated that a substantial proportion of
HIV infected people (19-98% percent as per different studies) were diagnosed with NTS bacteremia in
Africa.
Invasive Salmonellosis is often lethal and requires antibiotic intervention to limit disease progression.
However resistance against commonly used antibiotics including Trimethoprim, Sulfamethoxazol and
Chloramphenicol are common. There is increasing evidence that the NTS species are even resistant
against fluoroquinolone antibiotics (Ciproflaxocin) and third generation Cephalosporins (Ceftriaxon).
Therefore, prophylactic approaches including prevention of a disease by maintaining proper
sanitation, quality control of food and water, prevention of zoonotic exposure and the development of
prophylactic vaccines are of importance.
The
current
thesis
comprises
a
general
introduction,
4
results
chapters
and
a
final
conclusions/discussion section. In the general introduction, the readers will be introduced to basics of
NTS species infection biology in relation to humans and mouse models, the general mechanisms of
pathogen invasion and host responses limiting the invasion. The mechanisms of intracellular survival
and systemic spread in the event of an invasive disease will be illustrated. Finally, the 2 most relevant
and notorious pathogens of the NTS species, S. Typhimurium and S. Enteritidis, were discussed with
respect to common features and pathogenetic differences.
Chapter 2 details the design and use of a high throughput screening procedure (Transposon
Mediated Differential Hybridization (TMDH)) to systematically identify virulence associated genes
during orogastric NTS infection. The project specifically aims at identifying genes that contribute for
1 relative fitness in immunodeficient cybb/nos2-/-mice, however dispensable or redundant in wt C57BL/6
mice. The screen identified many previously known virulence genes. However systematic verification
of randomly chosen top hits indicated that most of the genes identified in this screen were false
positives. Possible explanations, i.e., bottle necks in oral infection models are discussed.
Chapter 3 detailed the use of a novel screening procedure using tagged strains termed as WITS (Wild
Type Isogenic Tagged Strains). The tags are of 40 base pair length and used to uniquely identify and
also quantify a tagged strain from a mixed pool of differentially tagged strains. Precisely, isogenic
strains of S. Typhimurium were differentially WITS tagged and used to investigate whether isogenic
strains differed in their relative abundance to each other in the mouse internal organs, MLN and
Spleen following an oral coinfection. This analysis allowed to estimate the effects of bottle necks
during the infection and enabled us to arrive at an optimal dilution ratio for identifying true biological
phenotypes.
Chapter 4 shows how the previous findings were used to identify a WITS tagged super attenuated
strain (attenuated with 2 independent genetic mutations in genes SL1344_3093, ssaV) of S.
Typhimurium that was specifically attenuated in cybb/nos2-/- mice while remaining immunogenic in wt
C57BL/6 mice. The protective efficacy of the above strain Z234 was demonstrated using a previously
established vaccination protocol from our lab. Finally, the safety of Z234 was analyzed using a panel
of immunodeficient mouse lines. The chapter also discusses the possible functional roles of the above
uncharacterized gene SL1344_3093.
Chapter 5 is a comparative study that illustrated the differences in spatio temporal kinetics of a Type
Three Secretion System 2 dependent S. Typhimurium and S. Enteritidis infection, as observed in a
streptomycin pretreated mouse model. In brief, S. Enteritidis elicited a faster inflammation kinetic in
mouse models of acute infection and was found to be associated with an increased ability to colonize
the lamina propria. Furthermore, net bacterial loads in the MLN and the spleen of Enteritidis infected
mice were significantly higher at day 2 post infection compared to S. Typhimurium. Possible reasons
for increased virulence are discussed.
Final conclusions of the whole thesis and the future perspectives are discussed in the last chapter.
2 Zusammenfassung
Die nicht-typhoidalen Salmonella Spezies (NTS) S. Typhimurium und S. Enteritidis sind gramnegative, fakultativ anaerobe und bewegliche Stäbchen, die beim Menschen eine selbstlimitierende
Gastroenteritis verursachen. Die Vertreter der NTS verbreiten sich gewöhnlich über kontaminierte
Nahrungsmittel und Trinkwasser oder über den Kontakt mit infizierten Tieren. Sie besitzen ein breites
Spektrum an möglichen Wirtsorganismen darunter unterschiedliche Wild- und Haustiere, wie Vögel,
Rinder, Amphibien, etc. Nicht-typhoidale Salmonellen stellen ein signifikantes Gesundheitsrisiko darjährlich werden ungefähr 93.8 Millionen Fälle humaner Gastroenteritis gemeldet.
Im Afrika südlich der Sahara überwiegt eine invasive Art der Salmonellose, die zu einer
generalisierten Infektion durch Dissemination über den Blutkreislauf führt. Betroffen sind
insbesondere Kinder, sowie Menschen mit angeborenen oder erworbenen Immunschwächen. In
Afrika wurden bei einem beträchtlichen Anteil der HIV-Infizierten (19-98% je nach Studie) NTS
Bakteriämie diagnostiziert.
Die invasive Salmonellose verläuft oft letal und erfordert eine Behandlung mit Antibiotika, um das
Fortschreiten der Krankheit einzugrenzen. Antibiotikaresistenzen gegen häufig verwendete Antibiotika
wie Trimethoprim, Sulfamethoxazol und Chloramphenicol sind jedoch verbreitet. Die Hinweise häufen
sich, dass gewisse Vertreter der NTS sogar gegen Vertreter der Fluoroquinolone (Ciprofloxacin) und
Cephalosprine der dritten Generation wie Ceftriaxon resistent sind. Aus diesem Grunde sind
prophylaktische Maßnahmen wie die Krankheitsvermeidung durch eine verbesserte Hygiene, die
Qualitätskontrolle von Nahrung und Trinkwasser, eine verminderte Exposition der Menschen zu
infizierten Tieren und die Entwicklung prophylaktischer Impfstoffe unerlässlich.
Die vorliegende Doktorarbeit ist in eine allgemeine Einführung und vier darauffolgenden Kapitel sowie
einen abschließenden Schlussfolgerung-/Diskussionsabschnitt gegliedert. Die Einführung vermittelt
dem Leser die Grundlagen der Infektionsbiologie der NTS mit Fokus auf die Infektion des Menschen
und
des
Modellorganismus
Maus.
Zudem
wird
ein
Überblick
über
die
allgemeinen
Invasionsmechanismen der NTS, die Antwort des Wirtes auf eine NTS Infektion sowie über die
Mechanismen des intrazellulären Überlebens und der systemischen Ausbreitung gegeben. Ein
besonderer Schwerpunkt liegt dabei auf der invasiven Salmonellose, die vor allem im Afrika südlich
3 der Sahara beschrieben wird und die hier mit Hilfe eines Fallbeispiels erklärt wird. Zum Abschluss
werden die zwei relevantesten Pathogene der NTS, S. Typhimurium und S. Enteritidis miteinander
verglichen.
Kapitel 2 beschreibt das Design und die Durchführung einer High-Throughput Screening Methode
(Transposon-vermittelte differenzielle Hybridisierung). Die Methode dient der Erkennung von
systematisch Virulenz-assoziierten Genen einer oral verursachten Salmonellose. Ziel des Projektes
ist die Identifikation von Genen, die zur relativen Fitness in immungeschwächten cybb/nos2-/- Mäusen
beitragen, jedoch in wt C57BL/6 Mäusen nicht essentiell und/oder redundant sind. Rückblickend
konnten durch den Screen viele bereits bekannte Virluenzgene bestätigt werden. Jedoch konnten
zufällig gewählte Topp-Kandidaten-Gene in Validierungsexperimenten nicht reproduziert werden.
Deshalb werden zum Abschluss des Kapitels mögliche Ursachen und „bottle necks“ im oralen
Infektionsmodell diskutiert.
Kapitel 3 geht auf die Anwendung einer robusteren Screeningmethode ein, die markierte Stämme
(sogenannte WITS Stämme, sinngemäss: dem Wildtyp isogene, markierte Stämme) verwendet. Die
Markierungen bestehen aus einer 40 Basen langen Sequenz und werden dazu eingesetzt, die
Stämme aus einem Gemisch aus markierten Stämmen eindeutig zu identifizieren und ihre Häufigkeit
zu bestimmen. Jeder der isogenen S. Typhimurium- Stämme ist mit einer unterschiedlichen WITSMarkierung versehen. Somit ist es möglich herauszufinden, ob sich, nach oraler Koinfektion, die
isogenen Stämme in ihrem relativen Vorkommen in den inneren Organen der Maus (mesenterialer
Lymphknoten,
Leber)
unterscheiden.
Diese
Analyse
ermöglichte
es,
ein
optimales
Verdünnungsverhältnis zu bestimmen, innerhalb dessen die Chance, einen wahren biologisch
relevanten Phenotyp zu identifizieren, vernünftig erschien.
Kapitel 4 beschreibt die Identifizierung eines WITS-markierten super-attenuierten S. Typhimurium
Stammes (der zwei unabhängige genetische Mutationen in den Genen SL1344_3093 und ssaV trägt),
der spezifisch in cybb/nos2-/- Mäusen abgeschwächt ist, jedoch in wt C57BL/6 Mäusen immunogen
bleibt. Die Schutzwirkung des oben genannten Stammes Z234 konnte mittels eines in unserem Labor
bereits etablierten Vakzinierungsprotokolls nachgewiesen werden. Sicherheitsbedenken bezüglich
der Verwendung von Z234 als Immunisierungsstamm wurden mit Hilfe einer Auswahl Immunabwehr-
4 geschwächter Mauslinien analysiert. Des Weiteren werden in diesem Kapitel mögliche Funktionen
des bisher nicht charakterisierten Genes SL1344_3093 erörtert.
Kapitel 5 beinhaltet eine vergleichende Studie der Unterschiede in der räumlich-zeitlichen Kinetik von
Typ-II-Sekretionssystem-abhängigen S. Typhimurium und S. Enteritidis Infektionen in einem
Streptomyzin-Mausmodel. S. Enteritidis bewirkt in Mausmodellen akuter Infektionen eine schnellere
Entzündungskinetik und kolonisiert vermehrt die Lamina Propria. Des Weiteren sind zwei Tage nach
der Infektion die Keimzahlen in mesenterialen Lymphknoten und in der Leber der Enteritidis-infizierten
Mäuse signifikant höher im Vergleich zu S. Typhimurium-infizierten Tieren. Mögliche Ursachen für
diese erhöhte Virulenz werden im letzten Kapitel diskutiert.
Abschliessend werden die Schlussfolgerungen aus der gesamten Doktorarbeit diskutiert.
Acknowledgements
I sincerely thank Lisa Beate Maier and Pascale Vonäsch for their help in translating the English
summary version to German.
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