Hals-Nasen-Ohrenklinik und Poliklinik
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Technische Universität München Hals-Nasen-Ohrenklinik und Poliklinik Klinikum rechts der Isar Analyse des Expressionsprofils von zellzyklusregulierenden Proteinen und Mitgliedern des EGF-Rezeptor-Signalwegs in Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs in Hinblick auf ihr Potenzial als prognostische Biomarker. Simone Gröber Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. H. A. Bier 2. Priv.-Doz. Dr. K. S. Götze Die Dissertation wurde am 31.10.2011 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 26.09.2012 angenommen. 2 Widmung Diese Arbeit ist meinem Freund Sebastian und meiner Familie gewidmet 3 Inhaltsverzeichnis WIDMUNG............................................................................................................................................................ 3 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................................... 8 2 EINLEITUNG.......................................................................................................................................... 13 2.1 PLATTENEPITHELKARZINOME DES KOPF-HALS-BEREICHES (HNSCC: HEAD AND NECK SQUAMOSA CELL CARCINOMA) ..... 13 2.2 KLASSIFIKATION .......................................................................................................................................... 13 2.3 PATHOLOGIE .............................................................................................................................................. 17 2.3.1 Makroskopisch ............................................................................................................................. 17 2.3.2 Mikroskopisch............................................................................................................................... 17 2.3.3 Molekularpathologie .................................................................................................................... 18 2.4 EPIDEMIOLOGIE .......................................................................................................................................... 19 2.5 ÄTIOLOGIE................................................................................................................................................. 22 2.5.1 Risikofaktor Tabak ........................................................................................................................ 22 2.5.2 Risikofaktor Betelnuss .................................................................................................................. 23 2.5.3 Risikofaktor Alkohol...................................................................................................................... 23 2.5.4 Risikofaktor virale Onkogene ....................................................................................................... 23 2.5.5 Weitere Risikofaktoren ................................................................................................................. 24 2.5.6 Feldkanzerisierung versus „wandernde Klonkrieger“ ................................................................... 24 2.6 DIAGNOSTIK/SYMPTOMATIK ......................................................................................................................... 25 2.7 THERAPIE .................................................................................................................................................. 25 2.7.1 Chirurgische Therapie ................................................................................................................... 25 2.7.2 Radiatio ........................................................................................................................................ 27 2.7.3 Chemotherapie ............................................................................................................................. 28 2.7.4 Target-Therapeutika .................................................................................................................... 29 2.8 ZELLZYKLUSREGULIERENDE PROTEINE.............................................................................................................. 30 4 2.8.1 Zellzyklus ...................................................................................................................................... 30 2.8.2 Survivin/ baculoviral IAP repeat-containing 5 (BIRC5) ................................................................. 31 2.8.3 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (yeast) (Bub1B) ................................... 33 2.8.4 Polo-like-kinase 1 (PLK-1) ............................................................................................................. 35 2.8.5 Aurora Kinase A (AURKA)/ STK15 ................................................................................................. 38 2.8.6 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67/mki 67/ ki67 ................................................... 39 2.8.7 cyclin D1 (CCND1) ......................................................................................................................... 40 2.8.8 Tumor protein 53 (TP53)/ p53 ...................................................................................................... 42 2.9 3 EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) UND NACHGESCHALTETE SIGNALWEGE ......................................... 45 2.9.1 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) .................................................................................. 47 2.9.2 V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) ......................................... 50 2.9.3 phospho mitogen activated protein kinase 1 + 3 (MAPK1 + 3; p-p44/42MAPK) .......................... 52 2.9.4 phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) .................................... 54 2.9.5 phospho akt murine thymoma viral oncogene homolog (pAKT); Proteinkinase B (PKB) ............. 56 2.10 PROBLEMSTELLUNG ................................................................................................................................ 59 2.11 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ........................................................................................................................ 60 MATERIAL & METHODEN ..................................................................................................................... 61 3.1 MATERIAL ................................................................................................................................................. 61 3.1.1 Studienkollektiv ............................................................................................................................ 61 3.1.2 Geräte........................................................................................................................................... 63 3.1.3 Chemikalien .................................................................................................................................. 64 3.1.4 Verbrauchsmaterial ...................................................................................................................... 65 3.1.5 Antikörper..................................................................................................................................... 66 3.2 METHODEN ............................................................................................................................................... 66 3.2.1 Tissue Micro Arrays ...................................................................................................................... 66 5 4 3.2.2 Immunhistochemie ....................................................................................................................... 68 3.2.3 Auswertung .................................................................................................................................. 68 3.2.4 Statistik......................................................................................................................................... 70 ERGEBNISSE ......................................................................................................................................... 71 4.1 CHARAKTERISIERUNG DES KOLLEKTIVS ............................................................................................................. 71 4.2 AUSWERTUNG DER IMMUNHISTOCHEMIE (IHC)................................................................................................ 72 4.2.1 Immunhistochemische Beispiele der zellzyklusregulierenden Marker ......................................... 73 4.2.2 Immunhistochemische Beispiele der Signaltransduktionsmarker ................................................ 75 4.3 5 STATISTISCHE AUSWERTUNG ......................................................................................................................... 76 4.3.1 Wilcoxon-Mann-Whitney-Test ..................................................................................................... 76 4.3.2 Korrelationsanalyse ...................................................................................................................... 79 4.3.3 Vier-Felder-Tafeln ......................................................................................................................... 83 4.3.4 Überlebenskurven......................................................................................................................... 94 DISKUSSION ....................................................................................................................................... 101 5.1 EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 101 5.2 STAND DER WISSENSCHAFTLICHEN FORSCHUNG .............................................................................................. 102 5.2.1 Micro-Array-Technologie............................................................................................................ 103 5.2.2 Genexpressionsprofil .................................................................................................................. 103 5.2.3 Proteinexpressionsprofil ............................................................................................................. 104 5.3 EINORDNUNG DER EIGENEN ARBEIT .............................................................................................................. 107 5.4 ERWARTUNGEN AN DIE ERGEBNISSE ............................................................................................................. 109 5.5 VERGLEICH DER ERWARTUNGEN MIT DEN ERGEBNISSEN ................................................................................... 109 5.5.1 Survivin ....................................................................................................................................... 110 5.5.2 PLK-1 ........................................................................................................................................... 112 5.5.3 Bub1B ......................................................................................................................................... 113 6 5.5.4 STK15 .......................................................................................................................................... 114 5.5.5 ki67 ............................................................................................................................................. 115 5.5.6 cyclin D1 ..................................................................................................................................... 116 5.5.7 p53.............................................................................................................................................. 117 5.5.8 EGFR ........................................................................................................................................... 119 5.5.9 ERBB2 ......................................................................................................................................... 122 5.5.10 p-p42/44MAPK ...................................................................................................................... 123 5.5.11 PTEN ...................................................................................................................................... 125 5.5.12 pAKT....................................................................................................................................... 126 5.5.13 Verbindungen zwischen den Marker ..................................................................................... 127 5.5.14 Probleme................................................................................................................................ 128 6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................................ 131 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................................. 133 8 TABELLENVERZEICHNIS ...................................................................................................................... 136 9 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................................... 139 10 ANHANG ............................................................................................................................................ 165 11 DANKSAGUNG ................................................................................................................................... 185 7 1 Abkürzungsverzeichnis Abkürzung APC/ C AR ATP AURKA BAD BAX BC BCL2 BIR BIRC5 B-Raf Bub 1B Bub2 Bub3 CA CA9 cd31/ PECAM-1 Cdc20 Cdc42 CDK CDKN2A CENP-E CHART CIAP-1/ -2 ciB/ kip CIN CIS c-met CML COX2 CP CPC CTX CUP DAG DIABLO DNA E2F Erklärung anaphase promoting complex amphiregulin Adenosintriphosphat Aurora Kinase A BCL2-associated agonist of cell death BCL2-associated X protein betacellulin B-cell lymphoma 2 baculovirus inhibitor of apoptosis repeat baculoviral IAP repeat-containing 5 v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 Budding uninhibited by benzimidazole 1 homolog beta Budding uninhibited by benzimidazole 2 homolog Budding uninhibited by benzimidazole 3 homolog Karzinom carbonic anhydrase 9 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule cell-division cycle protein 20 cell division cycle 42 Cyclin depending proteinkinase Genlokus für Protein p16 und Protein p14 centromere protein E kontinuierlicher hyperfraktionierter accerlerierter Radiotherapie baculoviral IAP repeat-containing 2/ 3 calcium and integrin binding 1 Familie chromosomalen Instabilität Carcinoma in situ ein proto-oncogen für den hepatocyte growth factor receptor (HGFR) chronisch myeloische Leukämie Cyclooxigenase 2 Zytoplasma Chromosomal Passenger Complex Chemotherapie Cancer of unkown primary Diacylglycerol Diablo homolog - Drosophila Desoxyribonukleinsäure ist eine Gruppe von Genen, die für eine Gruppe von Traskriptionsfaktoren in höheren Eukarionten codiert 8 E3 EBV EGF EGFR Emi1 EPR ERK FAK FFP FHIT G1 Phase G2 Phase GADD45A GDP GIST GPCR Grb2 GTP HB-EGF HBXIP Her 1/ ErbB1/ EGFR HER3/ ErbB3 HER4/ ErbB4 HER-neu/ ErbB2 HGFR HIF-1α HNSCC HPV I IAP ICD-10 IGF-1R IGF-BP3 IKK ILP-2 INCENP INK4 Ipl1 IRS Jak JNK/ MAPK8 Ki-S1 kras ubiquitin-protein ligase Ebstein-Barr-Virus Epidermal groth factor Epidermal growth factor Rezeptor early-mitotic-inhibitor-1 epiregulin extracellular signal-regulated kinases focal adhesion kinase 1 formalin fixed paraffin embedded fragil histidine triad gen G (engl. Gap) postmitotische Phase des Zellzyklus Postsynthesephase oder Prämitosephase des Zellzyklus growth arrest and DNA-damage-inducible-alpha Guanosindiphosphat Gastrointestinaler Stroma Tumor G-protein-coupled receptor mittels growth factor receptor-bound protein 2 Guanosintriphosphat heparin-binding EGF-like growth factor der Survivin- hepatitis B X interacting protein human epidermal growth factor receptor/ nach dem viralen Onkogen v-erbB des avian erythroblastosis Virus v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 hepatocyte growth factor receptor Hypoxia inducible factor 1 Plattenepithelkarzion des Kopf-Hals-Bereiches Humane Papilloma Virus Interphase/ Zwischenphase Apoptose-Inhibitor-Proteinfamilie Internationale Klassifikation der Krankheiten 10. Revision insulin-like growth factor 1 receptor insulin-like growth factor binding protein 3 I-kappa-B kinase-alpha baculoviral IAP repeat-containing 8 inner centromere protein Inhibitors of CDK4 Aurora Proteinkinase Immunreaktiver Score Janus kinase c-Jun amino terminal kinase/ mitogen-activated protein kinase 8 Topoisomerase IIa v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog 9 LK LOH M M. MAD1 MAD2 MAD3 mAK MALDI-TOF-MS MAPK MAPKK MAPKKK MCC mdm2 MDR1 MIB-1 MIB-5 mki67/ ki67 ML-IAP mMouse/ mRabbit MPF Mps 1 Kinase MRD MRP2 mTOR NAIP ND NFkB NOXA NSCLC oADT OMIM OSCC p15 p16 p18 p19 p21 p27 p38/ MAPK14 p42 MAPK p44 MAPK p53 Lymphknoten lost of heterocygothy/ genetische Instabiliät Mitose/ Zellteilung Membran mitotic arrest deficient-like 1 mitotic arrest deficient-like 2 mitotic arrest deficient-like 3 monoclonaler Antikörper matrix assisted LASER desorption ionisation time of flight Massenspecktrometrie mitogen-activated protein kinase mitogen-activated protein kinase kinase mitogen-activated protein kinase kinase kinase mitotic checkpoint complex murine double minute oncogene 2 multidrug resistance protein 1 mindbomb homolog 1 AK für ki67 Proliferations-assoziierter-Antigenen (antigen identified by monoclonal antibody Ki-67) baculoviral IAP repeat-containing 7 monoclonaler Antikörper aus einem Mausmodell/ Kaninchenmodel M-phase-promoting Factor Monopolar spindle 1 Kinase minimal residual disease Multidrug resistance-associated protein 2 mammalian target of rapamycin NLR family, apoptosis inhibitory protein Neck Dissection nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 Nicht Kleinzelliges Bronchial Karzinon oberer Aerodigestivtrakt Datenbank: online mendelian inheritance in man oral squamosa cell carcinoma (orales Plattenepithelkrazinom) activated RNA polymerase II transcription cofactor 4 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2C cyclin-dependent kinase inhibitor 2D Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B mitogen-activated protein kinase 14 mitogen-activated protein kinase 1 mitogen-activated protein kinase 3 Tumor Protein p53 10 p73 pAK pAKT/ rac PBD PCNA PECAM-1/ CD31 PEG2 PI3K PIP2 = PI3,4P PIP3 = PI3,4,5P PKB PKC PLC-gamma PLK Plk-1 Plk-2/ Snk Plk-3/ Fnk/ Prk Plk-4/ Sak pMouse/pRabbit PP PTEN PUMA Pyk2 ras RB RCTX RNA ROD RT RTK RTX S Phase SAPK SCC SELDI-TOF-MS SI Sig. SNAI2/SLUG sos Src STAT STK15 survivin-2B survivin-3B Transformation related protein 73 polyclonaler Antikörper phospho v-akt murine thymoma viral oncogene homolog Polo-Box Domain proliferating cell nuclear antigen Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule Prostaglandin2 phosphoinositide-3-kinase Phosphoinositide phosphatidylinositol 3,4 bisphosphate phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate Proteinkinase B Proteinkinase C Phospholipase C - gamma 1 Polo-like-Kinase Polo-like-kinase 1 Polo-like kinase 2 Polo-like kinase 3 Polo-like kinase 4 polyclonaler Antikörper aus einem Kaninchenmodel percentage points; dt. Prozentpunkte phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 Bcl-2 binding component 3 v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog Proto-Onkogen, dass für ein Guaninnucleotid-bindendes Protein (GTP-bindendes Protei Retinobalstomgen Kombination aus Strahlen- und simultaner Chemotherapie Ribonukleinsäure Rough Deal Raumtermperatur Rezeptor Thyrosin Kinase Strahelentherapie Synthesephase stress activated protein kinase squamosa cell carcinoma surface-enhanced-laser-desorption/ionization-time-of-flight-Massenspektrometrie staining intensity; dt. Färbeintensität Signifikanz snail homologue 2 son of sevenless v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog (avian) signal transducer and activator of transcription aurora kinase A Isoform von Survivin Isoform von Survivin 11 survivin-DeltaEx3 TEC-3 TF TGF alpha TNMKlassifikation TP53 TSA TTK UICC WAF1/ CIP1 XIAP XPA ZK Zw10 Isoform von Survivin AK für ki67 in fixiertem Gewebe Traskriptionsfaktor Growth factor alpha internationale Klassifikation der Tumerlokalisation und Ausdehnung im Rahmen des Staging Gen des Tumor Protein p53 thiol-specific antioxidant proteins Mps 1 Kinase Union internationale contre le cancer, Name der Organisation, die sich der Erforschung, Prävention und Behandlung von Krebserkrankungen widmet Inhibitior des CDK-4/ cyclinD-Komplexes X-linked inhibitor of apoptosis Xeroderma pigmentosum group A-complementing protein Zellkern Zeste-White 10 12 2 Einleitung 2.1 Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC: Head and neck squamosa cell carcinoma) Die Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC: Head and neck squamosa cell carcinoma) machen den Großteil aller Krebserkrankungen im Kopf-Hals-Bereich aus. Sie treten in den unterschiedlichen Etagen des oberen Aerodigestivtraktes auf. Man kann sie hinsichtlich ihrer anatomischen Lokalisation in Tumoren der Mundhöhle, des Pharynx (Naso-, Oro- und Hypopharynx) sowie des Larynx untergliedern. Klinisch zeigt sich folgendes anatomisches Verteilungsmuster (G. Mast 2009): • Mundhöhle 50 % • Pharynx 25 % • Larynx 25 % 2.2 Klassifikation Die Kopf-Hals-Karzinome sind nach dem ICD-10-Katalog in folgende Kategorien gegliedert (DIMDI 2008): • C00-C14,6 Bösartige Neubildungen der Lippe, der Mundhöhle und des Pharynx (C00 C14) • C30-C39 Bösartige Neubildungen der Atmungsorgane und sonstiger intrathorakaler Organe (C30-C32) Wie bei den meisten soliden Tumoren erfolgt die prätherapeutische Klassifikation des HNSCC nach ausführlicher klinischer Untersuchung, Bildgebung sowie Panendoskopie an Hand des TNM-Systems. Dabei steht „T“ für die Ausbreitung des Primärtumors, „N“ für die Ausbreitung in die lokoregionären Lymphknoten, „M“ für vorhandene Fernmetastasen, „R“ für den Resektionsstatus und „G“ für die Differenzierung und damit für den Malignitätsgrad des Tumors. Ein klein vorangestelltes „c“ bedeutet die klinische Einschätzung des Stadiums, 13 ein histologisch gesichertes TNM Stadium wird mit einem „p“ gekennzeichnet, während „y“ für den Zustand nach neoadjuvanter Therapie steht. Während das N-Stadium für alle Lokalisationen der HNSCC mit Ausnahme des Nasopharynxkarzinoms gleich ist, unterscheiden sich die T-Stadien je nach Tumorlokalisation (Sobin 2009). Stadium Ausdehnung TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 kein Anhalt für Primärtumor T1 Tumor ≤ 2cm T2 Tumor zw. 2 -4cm T3 Tumor > 4cm T4 Tumor mit Ausdehnung auf Nachbarorgane T4a Knochen, Skelettmuskulatur, Haut T4b zusätzlich Spatium masticatorium, Processus pterygoideus, Schädelbasis, A. carotis interna Tabelle 1: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle, Lippen und Oropharynx Stadium Ausdehnung TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 kein Anhalt für Primärtumor T1 Tumor auf einen Unterbezirk begrenz T1a Befall einer Stimmlippe T1b Befall beider Stimmlippen T2 Tumor auf 2 Unterbezirke ausgedehnt, Stimmlippe bei Befall eingeschränkt beweglich T3 Tumor in > 2 Unterbezirken, auf den Larynx begrenzt, Stimmlippe bei Befall fixiert T4 Einbruch in den Knorper oder Überschreiten der Organgrenzen Tabelle 2: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome des Larynx 14 Kehlkopfkarzinome werden nach der Ebene des Befalles weiter untergliedert in (Silver and Moisa 1990): • Supraglottische Tumoren • Suprahyoidale epiglottische Tumore, Tumore der aryepiglottische Falte, Tumore mit laryngealem Anteil, Tumore der Arytenoidgegend • Glottische Tumoren • Stimmlippentumoren (vordere und hintere Kommissur) • Subglottische Tumoren Stadium Ausdehnung TX Primärtumor histologisch nicht beurteilbar T0 kein Anhalt für Primärtumor T1 Tumor < 2cm und auf einen Unterbezirk begrenz T2 Tumor 2-4 cm, Befall von 2 Unterbezirke T3 Tumor in > 4cm und/oder Fixation des Hemilarynx T4 Tumor infiltriert Nachbarstruktur T4a Schildknorpel, Schilddrüse, Ösophagus T4b prävertebrale Faszie, Mediastinum, A. carotis interna Tabelle 3: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome des Hypopharynx Hypopharynxkarzinome werden nach dem genauen Befallsmuster weiter untergliedert in (Sobin 2009): • Karzinome des Recessus piriformis • Karzinome der Hypopharynxhinterwand • Karzinome der Postkrikoidgegend 15 Stadium Ausdehnung NX regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 solide, ipsilateral < 3cm N2a solide, ipsilateral > 3cm, aber < 6cm N2b multiple, ipsilateral < 6cm N2c bilateral/ kontralateral < 6cm N3 > 6cm Tabelle 4: N-Klassifikation für HNSCC Stadium Ausdehnung MX Fernmetastasen können histologisch nicht beurteilt werden M0 kein Anhalt für Fernmetastasen M1 Fernmetastasen Tabelle 5: M-Klassifikation für HNSCC Stadium Ausdehnung RX R0 R1 R2 Vorhndensein eines Residualtumors nicht beurteilbar kein Residualtumor mikroskopisch sichtbarer Residualtumor makroskopisch sichtbarer Residualtumor Tabelle 6: R-Klassifikation für HNSCC Grading GX G1 G2 G3 G4 Der Grad der Differenzierung kann nicht bestimmt werden Gut differenziert Mäßig differenziert Schlecht differenziert Undifferenziert Tabelle 7: Differenzierung von HNSCC Die Stadieneinteilung nach UICC gilt für alle Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches mit Ausnahme von Karzinomen des Nasopharynx und der Schilddrüse. 16 Stadien I II TNM T1, N0, M0 T2, N0, M0 T1-2, N0-1 M0 III T3, N1 M0 IVA IVB IVC T1-3, N2, M0 T1-4, N3, M0 T1-4 N0-3 M1 Tabelle 8: Stadieneinteilung nach UICC 2.3 Pathologie 2.3.1 Makroskopisch Die malignen Neoplasien des Kopf-Hals-Bereiches weisen histologisch unterschiedliche Differenzierungsmuster auf. Den größten Teil (90%) machen verhornende oder nicht verhornende Plattenepithelkarzinome aus, daneben gibt es sehr selten Adenokarzinome, anaplastische lymphoepitheliale Karzinome, Sarkome, Chondrosarkome, maligne Lymphome und Plasmozytome (Moisa, Mahdevia et al. 1991). Die meisten HNSCC zeigen makroskopisch ein endophytisches, ulzerierendes Wachstumsmuster, seltener wachsen sie exophytisch und papillär. Makroskopisch sichtbare Leuko- und Erythroplakien stellen prämaligne Dysplasien dar und können in ein invasives Karzinom münden (Silverman, Gorsky et al. 1984) (Hittelman, Voravud et al. 1993). 2.3.2 Mikroskopisch In der Entstehung dieser Karzinome zeigt sich histologsich häufig die Abfolge von bestimmten definierten Stadien. Von normalem Epithel zu Dysplasien unterschiedlichen Schweregrades entdifferenzieren die Zellen über das Carcinoma in situ (CIS) zum invasiven Karzinom. Auf mikroskopischer Ebene findet man eine gesteigerte zelluläre Pleomorphie, welche an der Basalzellschicht beginnt und sich kontinuierlich in die höheren Zellschichten ausbreitet. Je nach Stadium sind die Tumorzellen wenig bis mäßig differenziert. Je höher die Differenzierung der verhornenden Plattenepithelkarzinome ist, desto ausgeprägter ist ihre 17 Verhornung. Diese kann in Form von konzentrischen Hornperlen aber auch in Form von Einzellzellverhornung vorkommen (Shanmugaratnam 1978). HNSCC weisen vergrößerte, hyperchromatische Zellkerne mit prominenten Nucleoli und atypischen Mitosefiguren auf. Auch nimmt mit dem Fortschreiten der Stadien die strenge architektonische Gliederung des Plattenepithels ab (Shanmugaratnam 1978). 2.3.3 Molekularpathologie Die häufigste genetische Aberration in HNSCCs ist ein Verlust der Heterozygotie der chromosomalen Region 9p21-22. Dies kommt in etwa 70-80% der HNSCC vor (van der Riet, Nawroz et al. 1994) (Mao, Lee et al. 1996). Es scheint ein sehr frühes Ereignis in der Karzinogenese der HNSCCs zu sein, da diese Veränderung auch schon in dysplastischen Läsionen und in Plattenepithelhyperplasien zu finden ist. Auf Chromosom 9p21 befindet sich der codierende Genlokus CDKN2A für das Protein p16 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) und das Protein p14 (late endosomal/ lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 2). Diese beiden Proteine sind an der Ubiquitinierung von Protein p53 (tumor protein p53) und an der Regulation des Zellzyklus, welcher eine wichtige Rolle in der Karzinogenese spielt, mitbeteiligt (van der Riet, Nawroz et al. 1994) (Mao, Lee et al. 1996). Im Laufe der Entwicklung von einer dysplastischen zu einer malignen Zelle kommt es zur weiteren Anhäufung von genetischen Alterationen und zu einer zunehmenden Entdifferenzierung. Auf den Chromosomen 3p, 4, 5q, 6p, 8q, 11q (cyclinD1), 13q, 14q, 17p (TP53) und 18q wurden Bereiche mit einem gehäuften Allelverlust entdeckt, wobei der genaue Phänotyp dieser Veränderungen noch nicht für alle Chromosomen bekannt ist. (Garnis, Baldwin et al. 2003) (Masayesva, Ha et al. 2004) (Koy, Plaschke et al. 2008) (AbouElhamd and Habib 2008) (Gleich and Salamone 2002) 18 Abbildung 1: Hypothetisches Modell der Karzinogenese in HNSCCs modifiziert nach (Perez-Ordonez, Beauchemin et al. 2006) 2.4 Epidemiologie Weltweit haben Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches eine Inzidenz von 500.000 Fällen pro Jahr und stehen damit an sechster Stelle aller Tumorentitäten bei Männern (Hunter, Parkinson et al. 2005) (Ragin, Modugno et al. 2007). In den USA beträgt die Inzidenz 55.000/ Jahr (Han and Von Hoff 2006). In Deutschland liegt die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen für Männer bei 7.600 Fällen pro Jahr. Damit befinden sich die Tumoren des Kopf-HalsBereiches bezüglich ihrer Erkrankungshäufigkeit an siebter Stelle. Bei den Frauen hingegen belegt diese Tumorentität lediglich die fünfzehnte Stelle mit einer jährlichen Inzidenz von 2.800 Fällen, siehe Abbildung 2 und 3. Weltweit gesehen erkranken Männer siebenmal häufiger an einer Neoplasie im Mund-Rachenraum wie Frauen (Parkin, Bray et al. 2005). In der Altersgruppe von 55-65 Jahren liegt die höchste Erkrankungswahrscheinlichkeit. Der Anteil an allen Krebssterbefällen liegt geschlechterbezogen bei 3,1% für Männer bzw. 1,0% für Frauen, siehe Abbildung 4. Trotz Verbesserung der Diagnoseverfahren und des Krankheitsmanagments hat sich die 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit in den letzten 30 19 Jahren nicht wesentlich verbessert. Sie liegt in den meisten Studien bei 30-40%. Somit fallen HNSCCs in die Kategorie der Malignome mit sehr schlechter Prognose. Die Prognose variiert stark je nach Stadium: Patienten mit einem Karzinom in frühem Stadium (Stadium I) können mit einer durchschnittlichen 5-Jahres Überlebensrate von 85% rechnen, erreicht der Tumor aber eine größere lokale Ausdehnung und sind zusätzlich Lymphknoten befallen, reduziert sich die Überlebensrate durchschnittlich auf 30% (Lang, Wollenberg et al. 2002) (Al-Sarraf 2002) (Almadori, Bussu et al. 2008). Abbildung 2: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2004; Schätzung der Dokumentation Krebs des RKI (Robert-Koch-Institut 2008). 20 Abbildung 3: Inzidenzrate von Karzinomen in Mundhöhle und Pharynx in ausgewählten Ländern 2002; GlobocanSchätzung , RKI Schätzung für Deutschland 2002, 2004 (Robert-Koch-Institut 2008). Abbildung 4: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen Krebssterbefällen in Deutschland 2004; Amtliche Todesursachenstatistik, Statistisches Bundesamt, Wiesbaden (Robert-Koch-Institut 2008). 21 HNSCCs sind sehr aggressive Tumore, die bereits in frühen Stadien einen Anschluss an das Lymphgefäßsystem haben können, abgesehen von Stimmlippenkarzinomen. Somit können sich Lymphknotenmetastasen im zervikalen Bereich sowohl ipsilateral als auch bilateral bilden. Fernmetastasen treten meist spät in Lunge, Leber und Knochen auf. Sie sind neben den lokoregionären Tumorrezidiven, die in ca. 4-32% der HNSCCs trotz R0 Resektion auftreten, als lebenslimitierend zu betrachten. Die 5-Jahres Überlebensrate mit einem metastasierten HNSCC (M+) liegt bei 6,4% (Spector 2001) (Slootweg, Hordijk et al. 2002) (Chen, Emrich et al. 1987). Simultane, synchrone Zweitkarzinome treten meist im Kopf-Hals-Bereich auf, während metachrone Zweitkarzinome meist in Ösophagus und Lunge lokalisiert sind. Dabei scheint das Stadium des Primarius keine Rolle zu spielen (Licciardello, Spitz et al. 1989). 2.5 Ätiologie Die Ätiologie scheint multifaktoriell zu sein. Als Hauptrisikofaktoren gelten vor allem der exzessive Konsum von Tabak und Alkohol. Auch scheinen virale Onkogene wie das humane Papillomavirus (HPV) eine Rolle zu spielen. 2.5.1 Risikofaktor Tabak In den westlichen Ländern wird die Wahrscheinlichkeit an einem Krebsleiden der Mundhöhle oder des Rachens zu erkranken durch das Rauchen von Zigaretten, Zigarren oder Pfeife um ein Sechsfaches erhöht. Ein gleichzeitiger Alkoholabusus erhöht das Risiko zusätzlich (Hunter, Parkinson et al. 2005) (Meurman and Uittamo 2008) (Robert-KochInstitut 2008). Viele der Inhaltsstoffe von Tabak und Tabakrauch wurden als Kanzerogene erkannt. Diese zerstören die DNA, indem sie mit ihr kovalente Bindungen eingehen und Punktmutationen hervorrufen (Newcomb and Carbone 1992) (Biolchini, Pollastri et al. 2005). In der Literatur ist eine Beeinflussung unterschiedlicher Gene bzw. Proteine (Bsp.: p53, p16, Cyclooxigenase 2 (Cox-2), Prostaglandin2 (PEG2) und EGFR) beschrieben (Thomas, Nadiminti et al. 2005) (Khan, Lanir et al. 2008) (Wu, Zhong et al. 2007). 22 2.5.2 Risikofaktor Betelnuss In Südostasien stellt der orale Konsum von Betelnuss wahrscheinlich den Hauptrisikofaktor neben dem Rauchen dar. Dabei werden die unreifen Früchte dieser Palmenpflanze entweder in Kombination mit oder ohne Tabak im Mund gekaut und anschließend ausgespuckt. Der Hauptinhaltsstoff ist Arecolin welcher in Arecaidin und Methanol hydrolysiert wird und über die Schleimhaut aufgenommen wird. Auf Grund der häufigen Vermengung mit Tabak ist es nicht einfach, alleine den Inhaltsstoffen der Pflanze eine kanzerogene Wirkung nachzuweisen. Die Studienlage diesbezüglich bleibt uneinheitlich, auch ist der Wirkmechanismus der fraglichen kanzerogenen Substanzen der Pflanze nicht bekannt (Carpenter, Syms et al. 2005) (Yen, Lin et al. 2008) (Jacob, Straif et al. 2004) (Lee, Kuo et al. 2005). 2.5.3 Risikofaktor Alkohol Alkohol selbst ist kein Kanzerogen, er stellt aber einen unabhängigen co-kanzerogenen Risikofaktor dar. Obwohl noch nicht genau verstanden ist, wie Alkohol die Karzinomentstehung beeinflusst, ist bekannt, dass Alkohol den Lebermetabolismus beeinflusst und als direkter Enzyminduktor von Cytochrom P4502E1 wirkt (Poschl and Seitz 2004). Bei der Verstoffwechselung von Alkohol entstehen durch unterschiedliche Prozesse Acetaldehyd und freie Radikale, die als co-kanzerogene Stoffe angesehen werden. Acetaldehyd entsteht endogen durch die Alkoholdehydrogenase und Cytochrom P4502E1 wie auch durch orale und fäkale Bakterien. Auch bezüglich des zuletzt genannten Punktes wirken Alkohol- und Tabakkonsum synergistisch. Bei schlechter Mundhygiene und exzessivem Rauchen entsteht in der Mundhöhle ein optimales Milieu für diese Bakterien, die wiederum Acetaldehyd bilden (Shelton, Steelman et al. 2003) (Meurman and Uittamo 2008). 2.5.4 Risikofaktor virale Onkogene Eine HPV-Infektion gilt mittlerweile als gesicherter Risikofaktor für HNSCC in Mundhöhle und Oropharynx. Durch einen Nachweis von HPV-DNA kann innerhalb der HNSCCs eine Subgruppe an Tumoren (ca. 15%) abgegrenzt werden. Innerhalb dieser Subgruppe ist die häufigste Tumorlokalisation Tonsille und Zunge (45 - 67%) (Paz, Cook et al. 1997) (Strome, Savva et al. 2002) (Ringstrom, Peters et al. 2002). Desweiterhin kann zwischen den 23 unterschiedlichen Virustypen unterschieden werden. In 90-95% der HPV-positiven Tumoren kann der high-risk Typ HPV-16 identifiziert werden. Weitere häufige Virustypen sind HPV-18 und HPV-33 (Gillison, Koch et al. 2000) (Smith, Ritchie et al. 2004). In Studien, die sich eben mit dieser Subgruppe von HNSCCs beschäftigen, konnte eine signifikant höhere Anzahl an jüngeren Patienten, sowie an Nichtrauchern und Nichttrinkern nachgewiesen werden. Obwohl bei diesen Tumoren wohl bei Erstdiagnose bereits eine gehäuft lymphogene Metastasierung nachgewiesen werden kann, konnten Studien eine niedrigere krankheitsbezogene Mortalitätsrate in HPV-positiven Tumoren im Vergleich zu den restlichen Tumoren des Kopf-Hals-Bereiches nachweisen (Li, Thompson et al. 2003) (Gillison, Koch et al. 2000) (Ritchie, Smith et al. 2003). Damit scheinen diese Patienten ein anderes Risikoprofil und ggf. auch ein anderes Prognoseprofil zu haben. Es ist zu überlegen und sollte weiter geprüft werden, ob ein Nachweis von HPV-DNA zum Zeitpunkt der Diagnose als Prognosekriterium im klinischen Alltag eingesetzt werden könnte (Fakhry and Gillison 2006) (Hafkamp, Manni et al. 2004) (Ringstrom, Peters et al. 2002). Auch eine Infektion mit Epstein-Barr-Virus (EBV) gilt als Risikofaktor, insbesondere für das nasopharnygeale Plattenepithelkarzinom (Zheng, Li et al. 2007). 2.5.5 Weitere Risikofaktoren Neben den Hauptrisikofaktoren scheint es noch weitere Noxen zugeben, die bei der Entstehung des HNSCC mitwirken. Dazu scheint eine Exposition gegenüber Lacken, Farben, polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, Asbest- und Zementstäuben zu zählen. In Deutschland besteht die Möglichkeit der Anerkennung des Larynxkarzinoms als Berufskrankheit, wenn ein beruflicher Umgang mit Asbest nachgewiesen werden kann. Es gibt Hinweise, dass die häufig beobachteten frühen primäre Zweitkarzinome auf die ubiquitäre Einwirkung dieser Noxen im Bereich der kompletten oberen Atemwege zurück zu führen ist (Cooper, Pajak et al. 1989) (Licciardello, Spitz et al. 1989). 2.5.6 Feldkanzerisierung versus „wandernde Klonkrieger“ Dies würde die Theorie der Feldkanzerisierung, welche 1957 von Slaughter eingeführt wurde bekräftigen. Dabei geht man von unterschiedlichen genetischen Defekten und Prozessen mit hohem Entartungsrisiko an mehreren Stellen eines bestimmten Bereiches 24 („Feld“) aus. Je nach Stadium und Stimulation durch exogene oder endogene Faktoren kommt es dann zu einer malignen Entartung der einzelnen Zellen/Orte. Dies war langer Zeit das einzige Erklärungsmodell für die hohe Rezidivrate bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich (Slaughter, Southwick et al. 1953) (Tabor, Brakenhoff et al. 2001). Inzwischen gibt es ein konkurrierendes Model, welches von wandernden dysplastischen Zellklonen ausgeht. Diese Zellklone migrieren im Bereich der oberen Atemwege und können dort zu Zweittumoren führen (Bedi, Westra et al. 1996) (Califano, van der Riet et al. 1996). 2.6 Diagnostik/Symptomatik Tumoren des Kopf-Hals-Bereiches werden häufig spät erkannt, da sie sehr spät Symptome machen, eine Ausnahme diesbezüglich stellen jedoch Stimmlippenkarzinome dar. Häufig ist eine schmerzlose Schwellung der cervicalen Lymphknoten das erste und einzige Symptom, aber gleichzeitig schon ein Hinweis für eine lymphogene Metastasierung des Tumors. Weitere typische Symptome sind Heiserkeit, Dysphonie, Globusgefühl, Schluckstörungen, Otalgie, Reizhusten und Dyspnoe. Bei einem kleinen Prozentsatz von 3-9% der Patienten mit zervikalen Lymphknoten lässt sich der Primärtumor trotz Einsatz moderner bildgebender Verfahren nicht finden. Cancer of unkown primary (CUP; deutsch: Krebs bei unbekanntem Primärtumor) mit einem plattenepithelialem Ursprung machen 10% aller CUPs und 70% aller CUPs im Kopf-Hals-Bereich aus (Petrovic, Muzikravic et al. 2007) (Jungehulsing, Scheidhauer et al. 2000). 2.7 Therapie 2.7.1 Chirurgische Therapie Bis heute ist die wichtigste Therapieoption die chirurgische Resektion des Primarius. Je nach Lokalisation und Ausdehnung stehen verschiedene Zugangswege und Resektionstechniken zur Verfügung. Oberstes Ziel bei der chirurgischen Therapie sollte die vollständige Entfernung des Tumors inklusive Sicherheitsabstand (R0-Resektion) einschließlich der Lymphknotenmetastasen sein. Dies kann jedoch in Konflikt mit dem Organ- bzw. 25 Funktionserhalt sowie mit ästhetischen Aspekten stehen. Bei Karzinomen im Frühstadium ist ein transorales endoskopisches laserchirurgisches Verfahren möglich, oder auch eine alleinige Strahlentherapie (Hartl 2007) (Mendenhall, Parsons et al. 1990) (Garden, Morrison et al. 1996). In fortgeschrittenen Stadien kommt meistens eine uni- oder bilaterale Entfernung der Halslymphknoten (Neck Dissection (ND)) hinzu, um das Rezidivrisiko zu senken. Art und Umfang der Neck Dissection ist abhängig von der Anzahl, Größe und Lokalisation der Lymphknotenmetastasen und der Lage des Primärtumors. Nach der international anerkannten Klassifikation von Medina lassen sich unterschiedliche Varianten der ND definieren (Medina 1989) (Robbins, Medina et al. 1991) (Robbins, Shaha et al. 2008). Therapeutische ND: Stadium N+ • Radikale (komplette) ND: Ausräumung der Level I-V, Entfernung von V. jugularis interna, M. sternocleidomastoideus, N. accessorius. • Modifizierte radikale ND: o Ausräumung der Level sternocleidomastoideu I-V, Entfernung von V. o Ausräumung der Level I-V, M. sternocleidomastoideus o funktionelle: Ausräumung der Level I-V • Selektive ND: Ausräumung von zwei bis vier Lymphknotenleveln Elektive ND: Stadium N0 26 jugularis interna, M. Abbildung 5: Auch bei Anatomische Regionen von Halslymphknoten: Level IA/B submental/submandibuläre Lymphknoten (LK), Level II A/B obere juguläre LK-Gruppe, Level III mittlere juguläre LK-Gruppe, Level IV untere juguläre LKGruppe, VA/B hinteres Halsdreieck, VI anteriore zentrale Gruppe , VII superior mediastinale Gruppe. Modifiziert nach (Robbins, Shaha et al. 2008) (Gray 1918). einer klinischen N0 Einstufung kann eine Ausräumung bestimmter Lymphknotenstationen nötig sein (elektive ND) um ein Rezidiv durch okkulte Tumorzellen zu vermeiden. Studien konnten zeigen, dass bis zu 80% dieser klinisch als tumorfrei eingeschätzten Lymphknoten, welche bei einer elektiven ND oder bei Nachuntersuchungen entnommen wurden, tatsächlich doch Mikrometastasen enthielten (Rinaldo, Devaney et al. 2004) (Gourin, Conger et al. 2008). 2.7.2 Radiatio Eine alleinige Radiatio als Therapieoption kommt in seltenen Fällen neben der Laserchirurgie bei Karzinomen im Frühstadium sowie in palliativen Situationen bei HNSCCs in fortgeschrittenen Stadien (T3-4) in Frage (Garden, Morrison et al. 1996). Weitere Indikationen für die Radiatio können eine ossäre oder perineurale Infiltration, sowie ein Lymphknotenbefall (N2-3) sein. Tatsächlich wird die Radiatio deutlich häufiger als eine Kombinationtherapie aus Strahlen- und simultaner Chemotherapie (RCTX) verwendet. Studien konnten zeigen dass durch eine Kombination von Strahlentherapie und Chemotherapie das Gesamtüberleben sowie die lokale Tumorkontrolle bei Patienten mit fortgeschrittenen HNSCC signifikant verbessert werden kann (Budach W, Hehr T et al. 2006) 27 (Krstevska 2009). Ebenfalls wird sie als postoperative adjuvante oder additive Strahlentherapie (RTX) angewendet. Indikationen hierfür sind die R1-Resektion sowie perineurale, perivaskuläre, ossäre und lymphatische Infiltration, sowie eine Kapselüberschreitung in befallenen Lymphknoten. 2.7.3 Chemotherapie Die Chemotherapie wird meist wie oben bereits erwähnt als Kombinationstherapie aus RTX und CTX verwendet. Dabei kann dies die einzige Therapie sein, wie z.B. bei inoperablen Tumoren, sie kann aber auch einer vorherigem chirurgischen Resektion des Primärtumors folgen (Zelefsky, Kraus et al. 1996) (Kim, Wu et al. 2001). Zunehmend mehr Patienten mit einem Larynx CA entscheiden sich für die primäre RCTX. Mit dieser Therapieoption können sie einen Stimmverlust, wie dies nach einer radikalen Operation (Laryngektomie) der Fall ist vermeiden (Terrell, Fisher et al. 1998). Studien konnten belegen, dass eine primäre RCTX bezüglich Gesamtüberleben und rezidivfreiem Überleben eine Alternative zur chirurgischen Therapie darstellt (Urba, Wolf et al. 2006) (Fung, Lyden et al. 2005) (Lefebvre 2006). Andere Studien hingegen haben in Langzeitbeobachtungen von Patienten mit Larynxkarzinomen eine Verschlechterung des Gesamtüberlebens feststellen können (Hoffman, Porter et al. 2006). Diese Entwicklung könnte mit einer steigenden Tendenz zur nicht operativen Therapie zusammen hängen, was die Wertigkeit der primären RCTX im Vergleich zur Resektion in Frage stellen würde. Die klassischen Chemotherapeutika im Rahmen einer CTX oder RCTX sind Cisplatin und 5Fluorouracil (Kies 2007). Die Wirksamkeit einer zusätzlichen Anwendung von neueren Zytostatika (Taxane, Gemcitabin, und Vinorelbin) wird zurzeit noch in Studien geklärt (Aguilar-Ponce, Granados-Garcia et al. 2004) (Erjala, Zhang et al. 2007) (Hitt, Lopez-Pousa et al. 2005) (Pignon, Syz et al. 2004) (Denis, Garaud et al. 2003). Die alleinige Chemotherapie bleibt bislang nur rein palliativen Situationen vorbehalten, wenn weitere chirurgische oder strahlentherapeutische Maßnahmen nicht mehr möglich sind. 28 2.7.4 Target-Therapeutika Des Weiteren ist der EGFR-spezifische-monoklonale-Antikörper Cetuximab für die Therapie des HNSCC zugelassen (Astsaturov, Cohen et al. 2007). Er wird meist in Kombination mit CTX verwendet, da Studien Hinweise für eine durch Cetuximab ausgelöste Steigerung der CTXSensibilität zeigen konnten. Cetuximab wird aber auch in Kombination mit RTX eingesetzt. Unter dieser Kombinationtherapie konnte in Studien eine verbesserte lokale Tumorkontrolle sowie ein besseres Gesamtüberleben gezeigt werden (Harding and Burtness 2005) (Corvo 2007). Da etwa in 87-92% der Plattenepithelkarzinome ein positiver Nachweis für eine Überexpression von mRNA des EGFR vorliegt scheint dies wohl einer der erfolgversprechendsten Ansatzpunkte der spezifischen Therapie der HNSCC zu sein (Bei, Budillon et al. 2004) (Ongkeko, Altuna et al. 2005) (Grandis and Tweardy 1993). Derzeit befinden sich weitere monoklonale Antikörper gegen Mitglieder der EGF-Rezeptor-Familie in klinischen Phase II Studien, wie z.B. Trastuzumab und Pertuzumab (Albanell, Montagut et al. 2008) (Caponigro, Formato et al. 2005). Des Weiteren wurden Tyrosinkinaseinhibtoren entwickelt, die die nachfolgende Signalkaskade des EGFR hemmen sollen. Auch diese befinden sich derzeit in der klinischen Erforschung (Thomas, Rochaix et al. 2007) (Siu, Soulieres et al. 2007). Mit dem zunehmenden Verständnis für die molekulare Karzinogenese ergibt sich die Chance weitere Therapiemöglichkeiten auf molekularer Ebene zu entwickeln. Auch aus diesem Grund ist die Regulation des Zellzyklus ins Zentrum der Forschung gerückt. Seit Jahren beschäftigen sich viele Forschungsgruppen mit den unterschiedlichsten Proteinen bzw. Genen des Zellzyklus im Hinblick auf deren Rolle in der allgemeinen Karzinogenese und deren speziellen Bedeutung für die Entstehung des HNSCC. Auch in unserer Arbeit wurden unterschiedlichste Proteine und deren Potenzial als prognostische Biomarker in HNSCCs untersucht. Das folgende Kapitel soll einen Überblick über den aktuellen Forschungsstand der von uns untersuchten Proteine geben. 29 2.8 Zellzyklusregulierende Proteine 2.8.1 Zellzyklus Der Zellzyklus ist die immer wiederkehrende Abfolge von Ereignissen innerhalb der Lebenszeit einer Zelle. Dieser sich wiederholende Zyklus setzt sich bei einer proliferierenden Zelle aus einer Interphase/ Zwischenphase (I) und einer Mitose/ Zellteilungsphase (M) zusammen. Ausdifferenzierte Zellen hingegen können für Wochen, Monate oder für den Rest ihrer Lebenszeit in einer Art Ruhephase verbleiben, diese anhaltende G1 Phase wird dann als G0 Phase bezeichnet. Die Interphase wird weiter aufgeteilt in die G1, S, G2 Phase (Voorhees, Duell et al. 1976). • G1 Phase (G: engl. Gap) Diese Phase schließt sich unmittelbar an die Mitose an und wird daher als postmitotisch bezeichnet. In dieser Phase werden nach der Zellteilung die Zellbestandteile wieder vervollständigt. Zugleich ist dies aber auch die präsynthetische Phase, in welcher die DNA-Synthese vorbereitet wird. Dabei werden die dafür benötigten Bestandteile, wie zum Beispiel Replikationsenzyme zur Verfügung gestellt. • S Phase: In der Synthesephase erfolgt die Replikation der DNA und die Produktion der Histone. Anschließend liegt die DNA in Form von zwei Schwesterchromatiden vor. • G2 Phase: Wird auch als Postsynthesephase oder Prämitosephase bezeichnet, in der die Zellteilung vorbereitet wird. Es werden verstärkt zellteilungsspezifische Proteine gebildet. Des Weiteren werden innerhalb eines Zellverbandes Kontakte zu den Nachbarzellen gelockert. Die Mitose/M Phase wiederum setzt sich auch aus mehreren Abschnitten zusammen. Sie wird unterteilt in die Pro-, Prometa-, Meta-, Ana- und Telophase. Es erfolgt die Teilung der Chromosomen, des Zellkerns (Karyokinese) und des Zellkörpers (Zytokinese). Anschließend beginnen die beiden Tochterzellen im Regelfall eine neue Runde des Zellzyklus mit dem Eintritt in die G1 Phase. 30 Die Regulation und Kontrolle des Zellzyklus wird durch äußere sowie innere Faktoren bestimmt. Zu den äußeren Einflussfaktoren zählen Zellgröße, Nachbarschaft zu anderen Zellen, Verfügbarkeit von Nährstoffen und Regulationsmolekülen, wie z.B. Wachstumsfaktoren. Eine der wichtigsten zellinternen Steuermechanismen stellen die Kontrollpunkte, sogenannte Checkpoints dar. Sie überwachen den korrekten Ablauf der einzelnen Schritte innerhalb des Zellzyklus und bieten die Möglichkeit eines Zellzyklusarrestes. Damit können fehlgelaufene Schritte korrigiert oder ein programmierter Zelltod eingeleitet werden. An der genauen Regulation der einzelnen Schritte des Zyklus ist eine Vielzahl von Proteinen beteiligt. Auf eine Auswahl an Proteinen, die für unsere Arbeit relevant ist, da sie in HNSCCs häufig nachgewiesen werden können wird im Folgenden genauer eingegangen. Zur genauen Identifizierung der Proteine wird für das codierende Gen die MIM-Nummer aus der OnlineDatenbank „Online Mendelian Inheritance in Man“ (OMIM) angegeben. 2.8.2 Survivin/ baculoviral IAP repeat-containing 5 (BIRC5) Synonyme: API4; EPR-1 MIM: 603352 Survivin ist eines der acht Mitglieder der Apoptose-Inhibitor-Proteinfamilie (IAP), die im Menschen bereits identifiziert wurden. Alle Mitglieder dieser Proteinfamilie (X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP), baculoviral IAP repeat-containing 2/ 3 (CIAP-1/-2), baculoviral IAP repeat-containing 8 (ILP-2), NLR family, apoptosis inhibitory protein (NAIP), baculoviral IAP repeat-containing 7 (ML-IAP), apollon und Survivin) haben 1-3 N-terminale Zink-bindende baculovirale IAP Domänen (BIR; baculovirus inhibitor of apoptosis repeat). Damit ist ihnen eine Bindung an aktivierte Caspasen möglich. Somit können sie Zellen vom programmierten Zelltod abhalten. Einige haben des Weiteren eine C-terminale Ringdomäne (Salvesen and Duckett 2002). Survivin wird auf Chromosom 17q25 codiert und ist mit 17 kDa das kleinste Mitglied dieser Familie. Es besitzt nur eine BIR Domäne und eine C-terminale Alpha-Helix anstelle einer Ringdomäne (Ambrosini, Adida et al. 1997). Durch alternatives Splicing entstehen vier 31 Isoformen von Survivin (Survivin-DeltaEx3, Survivin-2B, Survivin-3B und Survivin). Dies ist eine mögliche Erklärung, warum man Survivin sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma nachweisen kann (Li 2005) (Knauer, Bier et al. 2007). Survivin wird in Abhängigkeit vom Zellzyklus exprimiert. Die Expression steigt während der G1 Phase an und erreicht ihr Maximum in der G2/M Phase (Otaki, Hatano et al. 2000). Bis heute konnten zwei Hauptaufgaben von Survivin charakterisiert werden: • Eine anti-apoptotische Eigenschaft, die jedoch kontrovers diskutiert wird (Tamm, Wang et al. 1998) (Marusawa, Matsuzawa et al. 2003) (Dohi, Okada et al. 2004). Die Entdeckung einer BIR Domäne in Survivin ließ die potentielle Möglichkeit einer Interaktion zwischen Survivin und Caspasen vermuten. Tatsächlich konnten die folgenden Studien zeigen, dass Survivin eher indirekt wie direkt den programmierten Zelltod auf unterschiedlichste Weise verhindert. Survivin bindet an sekundäre mitochondriale Aktivatoren von Caspasen. Das mitochondriale Protein Diablo homolog - Drosophila (DIABLO) wird ausgeschüttet, um IAP zu binden und so Apoptose zu ermöglichen. Survivin wiederum bindet den DIABLO-Komplex und verhindert somit dessen Interaktion mit IAP und damit Apoptose (Song, Yao et al. 2003). Des Weiteren kann es einen Komplex mit XIAP eingehen und dessen inhibierende Wirkung stabilisieren (Dohi, Okada et al. 2004). Auch zeigte eine Studie, dass ein Komplex aus hepatitis B X interacting protein (HBXIP) und Survivin an Procaspase 9 bindet und so die Möglichkeit hat, den programmierten Zelltod über den mitochondrial/ cytochrome-c-pathway zu hemmen (Marusawa, Matsuzawa et al. 2003). • Eine Beteiligung an der Zellzyklus-Kontrolle; siehe folgender Absatz. Zunächst konnte Survivin als ein Teil des Chromosomal Passenger Complex (CPC) zusammen mit Aurora B, Borealin und inner centromere protein (INCENP) identifiziert werden (Vagnarelli and Earnshaw 2004). Zusammen binden sie unabhängig vom Spindelcheckpoint in der Meta- bis Anaphase an Centromere um eine korrekte Interaktion zwischen den Microtubuli und dem Kinetochor zu ermöglichen. Dies stellt eine Qualitätskontrolle für den 32 vollständigen und fehlerfreien Ablauf der Chromosomenteilung und der Zellteilung dar (Lens and Medema 2003). Die Hochregulation von Survivin scheint ein frühes Ereignis in der Tumorgenese zu sein (Lo Muzio, Pannone et al. 2003). Die beobachtete Überexpression von Survivin in Tumorgewebe führte zu der Hypothese, dass es durch die verminderte Apoptoserate zu einem uneingeschränkten Tumorzellwachstum und damit zu Tumorzellimmigration kommen kann. Tatsächlich ist eine nachgewiesene Überexpression von Survivin in Tumoren mit einer Therapieresistenz gegen RCTX und mit einer schlechten Prognose assoziiert (Monzo, Rosell et al. 1999) (Tamm, Richter et al. 2004) (Freier, Pungs et al. 2007). 2.8.3 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (yeast) (Bub1B) Synonyme: SSK1; BUBR1; Bub1A; MAD3L; hBUBR1; BUB1beta MIM: 602860 Bub1B wird auf dem Chromosom 15q15 codiert und ist eine 119 kDa schwere Proteinkinase. Zusammen mit weiteren Proteinkinasen und nicht enzymatischen Proteinen gehört sie zum Komplex des Spindelcheckpoints, der zunächst in Hefen (S. cerevisiae) entdeckt wurde. Dieser Spindelcheckpointkomplex besteht aus (Hoyt, Totis et al. 1991) (Li and Murray 1991) (Taylor, Ha et al. 1998) (Li and Benezra 1996) (Weiss and Winey 1996) (Abrieu, MagnaghiJaulin et al. 2001) (Abrieu, Kahana et al. 2000) (Basto, Gomes et al. 2000) (Chan, Jablonski et al. 2000): • budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (Bub1) • budding uninhibited by benzimidazoles 2 homolog (Bub2) • budding uninhibited by benzimidazoles 3 homolog (Bub3) • MAD1 mitotic arrest deficient-like 1 (Mad1) • MAD2 mitotic arrest deficient-like 2 (Mad2) • budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta/ mitotic arrest deficient-like 3 (Bub1b/ Mad3) 33 • Monopolar spindle 1 Kinase (Mps1 Kinase) • centromere protein E (CENP-E) • Zeste-white 10/ Rough Deal (Zw10/ ROD) Sie alle sind dynamisch mit dem Kinetochor verbunden (Ditchfield, Johnson et al. 2003) (Kallio, McCleland et al. 2002). Zusammen überwachen sie den gesamten Prozess der korrekten Teilung der Chromosomen in die Schwester-Chromatide während der (Pro-) Metaphase (Nicklas 1997). Dies umfasst die korrekte Anlagerung der Microtubuli an die Chromosomen und die richtige Abstimmung der Spannung des Spindelapparates (Nicklas 1997) (Rieder, Cole et al. 1995). Bei fehlerhafter Aufteilung von nur einem Chromosom lösen sie ein Signal aus, welches den Beginn der Anaphase vorübergehend stoppt. Der genaue Mechanismus hierfür scheint noch nicht hundertprozentig verstanden zu sein. Versuche mit Anti-Mad2 und Anti-Bub1B Antikörper konnten zeigen, dass ein kompletter Verlust dieser Proteine den zeitlichen Ablauf der Mitose stört, auch wenn die Chromosomensegregation an sich korrekt abläuft (Canman, Salmon et al. 2002). Nach aktuellem Forschungsstand scheint Bub1B innerhalb des Spindelcheckpointkomplexes zwei gesicherte Aufgaben zu haben. Zum einen bindet es direkt an Kinetochore. Damit reguliert es die fehlerfreie Chromosomenanlagerung und die Spannung der Microtubuli des Spindelapparates in der Metaphase (Yao, Abrieu et al. 2000) (Ditchfield, Johnson et al. 2003) (Mao, Abrieu et al. 2003) (Zhang, Ahmad et al. 2007). Zum anderen führt es durch seine Katalaseaktivität als ein Teil des viergliedrigen mitotic checkpoint complex (MCC), bestehend aus Mad2, Bub1B, Bub3 und cell-division cycle protein 20 (Cdc-20) zu einer stabilen Bindung zu Cdc-20. Dies ist eine Untereinheit des anaphase promoting complex (APC/ C). APC/ C wiederum ist eine E3-ubiquitin Ligase, die für den Abbau von mitoseregulierenden Proteinen verantwortlich ist. Unabhängig vom Kinetochor kann somit das Ende der Mitose verzögert werden, indem die Ubiquitnierungsfähigkeit des APC/ C gehemmt wird (Wasch and Engelbert 2005) (Hwang, Lau et al. 1998) (Sudakin, Chan et al. 2001). 34 Bub1B wird in schnell proliferierenden Geweben, wie zum Beispiel Thymus und Milz abhängig vom Zellzyklus exprimiert (Burum-Auensen, Deangelis et al. 2007). In der G1 Phase ist Bub1B nicht dedektierbar, während es in der G2/M Phase sein Maximum erreicht (Davenport, Fernandes et al. 1999). Studien konnten zeigen das Bub1B auch in soliden Tumoren wie Blasenkarzinom, Mammakarzinom, und Pankreaskarzinom verstärkt nachweisbar ist (Yamamoto, Matsuyama et al. 2007) (Yuan, Xu et al. 2006) (Gladhaug, Westgaard et al. 2010). Sowohl der Nachweis von Bub1B-Mutationen wie auch von einer Proteinüberexpression in Tumoren ist häufig mit einer chromosomalen Instabilität (CIN), Aneuploidie (Veränderung der Chromosomenanzahl innerhalb des Genoms) und einer Amplifikation der Centrosomen assoziert (Yamamoto, Matsuyama et al. 2007) (Abal, Obrador-Hevia et al. 2007) (Hartwell and Kastan 1994). 2.8.4 Polo-like-kinase 1 (PLK-1) Synonyme: PLK; STPK13; PLK1 MIM: 602098 PLK-1 ist ein Schlüsselenzym für die Regulation von mehreren Schritten im Ablauf der Mitose und der Zellproliferation. Das codierende Gen für PLK-1 befindet sich auf Chromosom 16p12, das Protein ist 68 kD schwer (Golsteyn, Schultz et al. 1994). Es gehört zur Proteinfamilie der Polo-like-kinasen, die im Menschen aus vier Mitgliedern besteht: Polo-like kinase 1 (PLK-1), Polo-like kinase 2 (PLK-2/ Snk), Polo-like kinase 3 (PLK-3/ Fnk / Prk), Polo-like kinase 4 (PLK-4/ Sak). Diese wurde nach der ursprünglich entdeckten Polokinase in Drosophila melanogaster benannt (Clay, McEwen et al. 1993) (Lake and Jelinek 1993) (Fode, Motro et al. 1994) (Golsteyn, Schultz et al. 1994) (Li, Ouyang et al. 1996) (Hamanaka, Maloid et al. 1994) (Holtrich, Wolf et al. 1994) (Kauselmann, Weiler et al. 1999) (Sunkel and Glover 1988) (Llamazares, Moreira et al. 1991). Alle humanen PLKs sind Serin/Threonin Kinasen, deren Kinaseaktivität am N-terminalen Ende lokalisiert ist. Des Weiteren besitzen alle PLKs eine (PLK-4) beziehungsweise zwei (PLK-1-3) Polo-Boxen (PBD), die für die subzelluläre Lokalisation während der Mitose mitverantwortlich sind (Sillibourne and Bornens 2010) (Lowery, Lim et al. 2005) (Lee, Grenfell et al. 1998). 35 PLK-1 ist an der Regulation des Mitosebeginns mitbeteiligt. Neben M-phase-promoting Factor (MPF), bestehend aus CDK-1 und cyclin B scheint es einer der wichtigsten Cofaktoren zur Initiierung des Prozesses zu sein (Lane and Nigg 1996) (Roshak, Capper et al. 2000). Weitere Aufgaben von PLK-1 scheinen ein Teil der Organisation des Spindelapparates, der Chromosomenseparation und der Beendigung der Mitose zu sein. Auch scheint es Hinweise auf eine Beteiligung an der Cytokinese zu geben (Lee, Yuan et al. 1995) (Lane and Nigg 1996) (van Vugt, van de Weerdt et al. 2004). Zu den wichtigsten Aufgaben von PLK-1 zählen: • Die Beendigung der Mitose, als Gegenspieler von Inhibitoren des APC/C, wie zum Beispiel dem early-mitotic-inhibitor-1 (Emi1) und dem Spindelcheckpointkomplex. Dies führt indirekt zur Aktivierung des APC/C und somit zum Ende der Mitose (Moshe, Boulaire et al. 2004). • Die Herstellung einer Bindung zwischen Kinetochor und Mad2, um einen korrekten Ablauf der Chromosomenteilung zu gewährleisten (Kops, Weaver et al. 2005). • Die Phosphorylierung von Kinetochoren, die eine mangelhafte Spannung aufweisen. Dies wird von den weiteren Regulationsmechanismen des Zellzykluses als Zeichen einer fehlerhaften Chromosomenseparation gewertet (Ahonen, Kallio et al. 2005). • Die Beteiligung am S/ G2 Checkpoint (Smith, Wilson et al. 1997) (Jang, Ji et al. 2007). PLK-1 selbst wiederum ist ein Substrat von diversen regulatorischen Einheiten der Mitose. Eine Dysregulation dieser Proteinkinase scheint eine asymmetrische Chromosomen/Chromatidenseparation und damit eine Akkumulation von genetischen Defekten sowie genetische Instabilität und Aneuploidie mit sich zu bringen. In jedem Fall führt es zu einer Störung des korrekten Mitoseablaufes (Eckerdt, Yuan et al. 2005) (Castedo, Perfettini et al. 2004). Durch Studien konnte gezeigt werden, dass PLK-1 bei all seinen unterschiedlichen Aufgaben innerhalb des Ablauf des Zellzyklus ein breites Protein- bzw. mRNA-Expressionsmuster hat (Golsteyn, Schultz et al. 1994) (Lake and Jelinek 1993). Es akkumuliert zu Beginn der G2 36 Phase und erreicht sein Maximum am Übergang von der G2 zur M Phase. Gegen Ende der Mitose nimmt die Expression ab und bleibt während der Interphase und G1 Phase auf einem konstant niedrigen Niveau (Golsteyn, Schultz et al. 1994) (Dai and Cogswell 2003). Dabei lässt sich PLK-1 während des Zellzyklus in unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen nachweisen (Golsteyn, Schultz et al. 1994). Eine übermäßige Expression von PLK-1 konnte in unterschiedlichen soliden Tumoren (nichtkleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC), HNSCC, Mammakarzinom, Ovarialkarzinom, Ösophaguskarzinom und kolorektales Karzinom) nachgewiesen werden (Wolf, Elez et al. 1997) (Knecht, Oberhauser et al. 2000) (Wolf, Hildenbrand et al. 2000) (Weichert, Denkert et al. 2004) (Tokumitsu, Mori et al. 1999) (Macmillan, Hudson et al. 2001). Könnte man eine direkte Assoziation zwischen PLK-1, CIN und Tumorprogression verifizieren, so könnte PLK-1 ein Ansatzpunkt für einen neuen Tumorprognosemarker sein (Dai and Cogswell 2003). Abbildung 6: Regulation den Anaphase pormoting complex C durch PLK-1 modifiziert nach (Eckerdt and Strebhardt 2006) 37 2.8.5 Aurora Kinase A (AURKA)/ STK15 Synonyme: AIK; ARK1; AURA; BTAK; STK6; STK7; AURORA2; MGC34538 MIM: 603072 STK15 gehört zu den zellzyklusregulierenden Serin/ Threonin Kinasen und wird auf Chromosom 20q13.2 codiert (Sen, Zhou et al. 1997). Zusammen mit der Aurora B/ C Kinase stellt es eine Proteinfamilie dar, die sehr ähnlich zu der in Hefen vorkommenden Ipl1 und in Drosophila-Fliegen vorkommenden Aurora Kinase ist (Giet and Prigent 1999). STK15 ist 46 kDa schwer und wird während des gesamten Zellzyklus exprimiert mit einem deutlichen Maximum in der G2/M Phase. Der Aktivitätsgrad wird durch Phosphorylierung bestimmt, wobei die Autophosphorylierung wohl eine große Rolle spielt. Die Aufgaben von STK15 sind sehr vielseitig und erstrecken sich über unterschiedliche Phasen des Zellzyklus. Wie auch der Expressionsstatus vermuten lässt, zählt die Regulation der CentrosomenFunktion und der Chromosomenseparation zu den Hauptaufgaben. Des Weiteren ist die Proteinkinase an den Regulationsmechanismen des Ein- und Austritts in die Mitose beteiligt, wie auch an der Cytokinese. Die genauen Mechanismen hierfür sind jedoch noch nicht alle verstanden (Bischoff, Anderson et al. 1998) (Dar, Goff et al. 2010). Untersuchungen konnten zeigen, dass eine Überexpression von STK15 zu einer abnormalen Chromosomenverteilung und zu Aneuploidie führt (Zhou, Kuang et al. 1998) (Miyoshi, Iwao et al. 2001). Dies stellt ein häufig vorkommendes Charakteristikum für viele Tumoren dar und kann auch in über 90% der HNSCCs nachgewiesen werden (Bockmuhl and Petersen 2002). Ein weiterer Hinweis für eine Mitbeteiligung von STK15 an der Tumorgenese könnte der Nachweis einer DNA-Amplifikation auf Chromosom 20 in unterschiedlichen Tumorentitäten sein. Dabei scheinen diese Malignome überdurchschnittlich häufig ein aggressives Fortschreiten der Erkrankung zu zeigen. Da STK15 in diesem Bereich codiert wird, ist ein Zusammenhang durchaus denkbar (Sen, Zhou et al. 1997) (Lengauer, Kinzler et al. 1998). Daneben zeigt sich eine Überexpression von STK15 in Geweben mit hohem Mitose-Index (Thymus/ Embryo) und auch in vielen Tumorentitäten, wie z. B. in Ovarialkarzinomen, 38 kolorektalen Karzinomen, Ösophaguskarzinomen, NSCLC und HNSCC (Landen, Lin et al. 2007) (Bischoff, Anderson et al. 1998) (Tanaka, Hashimoto et al. 2005) (Ogawa, Takenaka et al. 2008). Korrelationen mit klinischen Daten von HNSCC-Patienten konnten zeigen, dass ein gesteigerter Nachweis von STK15 im Tumorgewebe in Zusammenhang mit einer schlechteren Prognose und vermehrten Aggressivität des Tumors steht (Reiter, Gais et al. 2006). Ebenfalls konnte ein Zusammenhang zwischen der Hochregulation von STK15 und einer verminderten Ansprechrate auf Chemotherapeutika (wie z.B. Taxane) in unterschiedlichen Tumorentitäten nachgewiesen werden (Hata, Furukawa et al. 2005) (Anand, Penrhyn-Lowe et al. 2003). Diese Chemotherapeutika intervenieren am Übergang von der G2 zur M Phase und sollen die Tumorzellen in den programmierten Zelltod leiten. Kommt es im Rahmen einer Überexpression von STK15 zu einer verminderten Aktivität des Spindelcheckpoints, so könnte es nach dieser Theorie trotz Fehlern in der Chromosomenverteilung zu einem Fortschreiten der Mitose kommen. Damit wäre die Apoptoserate zu diesem Zeitpunkt deutlich verringert und die Wirkung der CTX geschwächt (Hata, Furukawa et al. 2005) (Anand, Penrhyn-Lowe et al. 2003). Taxane befinden sich in der Therapie des HNSCC noch in der Studienphase. Mit einem Anti-STK15 Präparat könnte man also die Wirksamkeit der Taxane möglicherweise verbessern (Sano, Matsuda et al. 2006). 2.8.6 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67/mki 67/ ki67 Synonyme: KIA; MKI67 MIM: 176741 Als einer der wichtigsten Mechanismen der Tumorentstehung wird die unkontrollierte Zellproliferation betrachtet. Immer wieder wird diskutiert, wieweit die Stärke der Zellproliferation mit der Tumorprogression im Zusammenhang steht und ob daraus prognostische Aussagen abgeleitet werden können. Um dies genauer untersuchen zu können wurden Proliferationsmarker entwickelt. Die immunhistochemische Bestimmung von Proliferations-assoziierten-Antigenen, wie antigen identified by monoclonal antibody mki-67 (ki67), mindbomb homolog 1 (MIB-1), Topoisomerase IIa (Ki-S1), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), geminin ist eine der 39 wichtigsten Methoden für die Bestimmung des Proliferationsindexes (Gerdes, Schwab et al. 1983; Hirabayashi 1999) (Morris, Elston et al. 1995) (Mathews, Bernstein et al. 1984) (Wohlschlegel, Kutok et al. 2002). Ki67 ist ein 345 bzw. 395 kDa schweres nukleäres Antigen, das codierende Gen befindet sich auf Chromosom 10 (Duchrow, Schluter et al. 1996) (Schonk, Kuijpers et al. 1989). Es wird ausschließlich in proliferierenden Zellen (G1, S, G2 und M Phase) exprimiert und kann durch diverse Antikörper nachgewiesen werden (Scholzen and Gerdes 2000) (Gerdes, Schwab et al. 1983) (Cattoretti, Becker et al. 1992). Dieses Verfahren eignet sich besonders gut für Betrachtungen großer Fallzahlen von paraffinfixierten Schnitten und wird bei diversen Tumorentitäten angewandt (van Diest, van der Wall et al. 2004) (Kruse, Baak et al. 2001) (Feith, Stein et al. 2004) (Mulder, Van Hootegem et al. 1992). Dabei konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu normalen Geweben, in denen sich ki67-positive-Zellen in basalen oder parabasalen Gewebeschichten befindet, in dysplastischen Läsionen und in Carcinoma in situ die ki67-positive-Zellen über das gesamte Gewebe verteilt sind. In invasiven malignen Läsionen lassen sich diese positiven Zellen sogar bis in die Tumorperipherie nachweisen. Diese gesteigerte Nachweisbarkeit von ki67-positiven-Zellen deutet auf eine gesteigerte Zellzahl hin, die sich im aktiven Zellzyklus befindet (Hong, Laskin et al. 1995) (Liu and KleinSzanto 2000). Die Aufgabe von ki67 ist noch unklar; nicht zuletzt, weil bis heute kein weiteres vergleichbares Protein im menschlichen Organismus gefunden wurde. Es scheint aber für den Zellzyklus eine wichtige Rolle zu spielen, da eine artifiziell erzeugte Blockade von ki67 die Proliferation der Zellen zum Erliegen bringt (Schluter, Duchrow et al. 1993). Des Weiteren bestehen im strukturellen Aufbau Ähnlichkeiten zu anderen zellzyklusregulierenden Proteinen (Hofmann and Bucher 1995). 2.8.7 cyclin D1 (CCND1) Synonyme: BCL1; PRAD1; U21B31; D11S287E; CCND1 MIM: 168461 cyclin D1 gehört zu der großen Familie der cycline, wobei nicht alle Mitglieder für die Regulation des Zellzyklus zuständig sind. Es gibt drei Unterformen der D-cycline (D1, D2 und 40 D3). Davon ist cyclin D1 das Bestbeschriebenste. Es wird auf dem Chromosom 11q13 codiert und ist 34 kDa schwer (Sherr 1995). cyclin D1 bildet wie die übrigen cycline einen Komplex mit Serin/ Threoninkinasen, den cyclin-dependent protein kinases (CDKs). Dadurch wird deren Kinasefunktion aktiviert und sie können ihre Aufgaben als Schlüsselelemente der Zellzyklusregulation erfüllen. Im Gegensatz zu den CDKs werden die cycline zellzyklusabhängig exprimiert. Dabei bilden die D-cycline eine Ausnahme, da sie nicht in einer speziellen Phase des Zellzykluses, sondern während der G1, S, G2 und M Phase gebildet werden. Ihre Produktion hängt von EGFR-vermittelten Wachstumsstimuli ab (Assoian and Zhu 1997). Vornehmlich werden CDK4 und CDK6 von D-cyclinen gebunden, wobei andere Studien eine Assoziation mit anderen CDKs belegen können (Bates, Bonetta et al. 1994). Als zweigliedriger Komplex können sie das Tumorsuppressorgen Retinoblastoma Gen (RB) phosphorylieren. Daraufhin dissoziiert das Retinoblastoma Genprodukt von einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren (TF) ab, die Mitglieder der E2F-Familie sind. Diese TF ermöglichen ein uneingeschränktes Ablesen von Genen, deren Produkte für das Fortschreiten in die S Phase benötigt werden (z.B. cyclin A und E) (Rafferty, Fenton et al. 2001) (Ezhevsky, Ho et al. 2001). Negativ kontrolliert wird dieser Ablauf durch CDKInhibitoren und CDK-cyclin-Komplex-Inhibitoren, wie z.B. die Mitglieder der Inhibitors of CDK4-Familie (INK4). Dazu gehören activated RNA polymerase II transcription cofactor 4 (p15), cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16), cyclin-dependent kinase inhibitor 2C (p18), cyclin-dependent kinase inhibitor 2D (p19). Ebenfalls zählt zu diesen Inhibitoren die calcium and integrin binding 1 Familie (ciB/kip). Dazu gehören p21, p53 und cyclindependent kinase inhibitor 1B (p27) (Sherr and Roberts 1999) (Vidal and Koff 2000). Wie auch in vielen anderen Tumorentitäten konnte in HNSCC eine vermehrte Aktivität von cyclin-CDK-Komplexen nachgewiesen werden. Diese Tatsache wird mitverantwortlich gemacht für das unkontrollierte Wachstum dieser Tumoren, da die Checkpoint-Funktion am Übergang der G1 in die S Phase wegfällt und somit Zellen mit DNA-Defekten ungehindert den Zellzyklus weiter durchlaufen können. In Zellkultur konnte durch eine artifiziell erzeugte 41 cyclin D1-Überexpression eine verkürzte G1 Phase nachgewiesen werde (Quelle, Ashmun et al. 1993). Es wurden viele Untersuchungen durchgeführt, um die Ursache dieser Überaktivität zu erklären, dabei konnten unterschiedliche Mechanismen (Genamplifikation von cyclinen/ CDKs/ CDK-Inhibitoren und Protein-Überexpression) in diversen Tumorentitäten nachgewiesen werden (Malumbres and Barbacid 2001). Bei HNSCCs konnte eine cyclin D1-Überexpression bzw. Genamplifikation in 30-40% der Fälle festgestellt werden (Liu, Sauter et al. 1998) (Callender, el-Naggar et al. 1994) (Bellacosa, Almadori et al. 1996). Neuere in-vitro-Untersuchungen erbrachten Hinweise, dass diese Überexpression mit einer bestimmten Mutation im cyclin D1-Gen assoziiert ist, die für einen verminderten Export von cyclin D1 aus dem Zellkern verantwortlich ist (Alt, Cleveland et al. 2000). 2.8.8 Tumor protein 53 (TP53)/ p53 Synonyme: P53; LFS1; TRP53; FLJ92943 MIM: 191170 Eine der häufigsten Veränderungen im Genom von Tumorzellen liegt im Bereich des TP53Gens auf Chromosom 17p13.1. Über 50% der Tumoren im Menschen haben eine MissenseMutation in diesem Tumorsuppressor Gen (Hollstein, Rice et al. 1994) (Levine 1997). Auch bei HNSCC kann dies häufig (52-82%) schon in der Frühphase der Tumorgenese detektiert werden (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Ein Nachweis gelingt wohl nicht in normaler Mukosa, die nicht mit Kanzerogenen in Berührung gekommen ist (Tjebbes, Leppers vd Straat et al. 1999) (Lavieille, Gazzeri et al. 1998). Die Inzidenz dieser Mutation scheint mit zunehmender Invasivität des Tumors zu steigen (Boyle, Hakim et al. 1993). Das Protein p53 ist 43712 Da schwer und übernimmt viele verschiedene Aufgaben in der Zelle. Es ist entscheidend mitbeteiligt an Zellzyklusarrest, DNA Replikations- und Reparatursystem, Apoptose, zellulärer Antwort auf Stress, Zellproliferation und Hemmung der Angiogenese. 42 Die Halbwertszeit von p53 ist sehr kurz (ca. 20 min) und die intrazelluläre Konzentration ist niedrig. Das Protein im „Standby Modus“. Exogene und endogene Stresssignale können posttranskriptionelle Veränderungen ausgelösen, die zur Akkumulation des Proteins und somit zur Steigerung seiner Aktivität führen können (Appella and Anderson 2001). Solche Signale können z.B. Schäden an DNA, Expression von zellulären oder viralen Onkogenen, Verlust von Tumorsuppressorgenen, Ribonucleotid-Depletion, Zelladhäsion, Hypoxie und die Einwirkung von UV-Strahlung sein (Graeber, Osmanian et al. 1996) (Wagner, Kokontis et al. 1994) (Howes, Ransom et al. 1994) (Linke, Clarkin et al. 1996), (Nigro, Aldape et al. 1997) (Maltzman and Czyzyk 1984) (Qin, Livingston et al. 1994). Daraufhin kann die Zelle zwei Wege einschlagen: • Zellzyklusarrest: Dabei handelt es sich um eine Art Zwangspause des Zellzyklus am Checkpoint der G1/S Phase oder der G2/M Phase. Hier wirkt p53 als Transkriptionsfaktor, welcher p21 und WAF1/ CIP1 (Inhibitor des CDK-4/ Ceylan D-Komplexes) aktiviert. Diese Proteine sind daraufhin nicht mehr in der Lage RB zu phosphorylieren. Daraufhin bleibt der E2F-Transkriptionsfaktorkomplex am unphosphorylierten RB gebunden und kann nicht als Transkriptionsfaktor für weitere Prozesse des Zellzyklus agieren, wie normal im Zellzyklus vorgesehen (Bartek and Lukas 2001) (Mercer 1998) (Cross, Sanchez et al. 1995). • Apoptose: Ist der Schaden zu groß, um ihn mit einem angemessenen Aufwand reparieren zu können, wird der programmierte Zelltod eingeleitet. Die genauen Mechanismen der Aktivierung der Caspasen sind noch nicht sicher verstanden. Jedoch scheint auch hier p53 zum Teil als Transkriptionsfaktor von proapoptotischen Proteinen wie BCL2-associated X protein (BAX), Bcl-2 binding component 3 (PUMA) und phorbol-12-myristate-13-acetateinduced protein 1 (NOXA) zu wirken. Zusätzlich gibt es Hinweise, dass p53 auch auf anderem Wege zu Apoptose führen kann (Lowe, Ruley et al. 1993) (Mowat 1998) (Kuribayashi and El-Deiry 2008) (Schuler and Green 2001) (Sabbatini, Lin et al. 1995) (Wagner, Kokontis et al. 1994). Als Transkriptionsfaktor reguliert p53 etliche Proteine (p21, BAX, cyclin G, growth arrest and DNA-damage-inducible-alpha (GADD45A), insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse) (MDM2) und weitere. Hierfür liegt es im 43 Zellkern in seiner aktiven Form vor. Studien konnten p53 aber auch im Zytoplasma in inaktiver Form nachweisen (Sbisa, Catalano et al. 2007) (Tokino and Nakamura 2000). Mit den Erkenntnissen der aktuellen Forschung wird die Rolle von p53 in der Tumorgenese wie folgt erklärt. Durch einen Funktionsverlust von p53 kann der Zellzyklus der beschädigten Zelle nicht mehr gestoppt werden. Selbst wenn der Organismus eine Fehlregulation bzw. einen DNA-Schaden erkennt, kann die Proliferation solch einer neoplastischen Zelle nicht aufgehalten werden. Studien konnten belegen, dass eine homozygote Mutation im TP53 Gen zu einem deutlich gesteigerten Tumorwachstum führt (Symonds, Krall et al. 1994). Auf Grund der häufigen Nachweisbarkeit von p53 in unterschiedlichen Malignomen schien p53 lange Zeit der erhoffte Screening-Tumormarker mit hoher Aussagekraft zu sein. Mit diversen Nachweismethoden für TP53 Mutationen versuchte man in Speichel, Serum, Lymphknoten und Tumorresektionsrändern disseminierte okkulte Tumorzellen zu finden, dies stellte sich aber als nicht sonderlich zuverlässig heraus (Boyle, Mao et al. 1994) (Coulet, Blons et al. 2000) (Tjebbes, Leppers vd Straat et al. 1999) (Brennan, Mao et al. 1995). Die Verwendung von p53 als prognostischen Tumormarker wurde immer wieder kontrovers diskutiert. Weder eine TP53-Mutation noch eine p53-Überexpression konnte in mehreren großen Studien signifikant mit Überlebensrate, Rezidivrate und Therapieansprechen korreliert werden (Jin, Kayser et al. 1998) (Gonzalez-Moles, Galindo et al. 2001) (Georgiou, Gomatos et al. 2001) (Cabelguenne, Blons et al. 2000) (Temam, Flahault et al. 2000). 44 Abbildung 7: p53 im Zellzyklus modifiziert nach (Levine 1997) 2.9 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) und nachgeschaltete Signalwege Der EGF-Rezeptor (nach dem viralen Onkogen v-erbB des avian erythroblastosis Virus/ human epidermal growth factor receptor benannt) gehört zu der ERBB-/ HER-RezeptorTyrosin-Kinase-Familie (Ullrich and Schlessinger 1990). Zu dieser Familie gehören insgesamt 4 Mitglieder: • Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) • v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (HER-neu/ ERBB2) • v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (HER3/ ERBB3) • v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 (HER4/ ERBB4) Eine Ligandenbindung an diesen Rezeptoren führt zur Rekrutierung von Adapterproteinen und cytoplasmatischen Bestandteilen des weiteren Signalweges. Sie setzt eine Phosphorylierungs-Kaskade von hintereinander geschalteten Elementen in Gang (ras/ 45 mitogen-activated protein kinase (MAPK = ERK); phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/ protein kinase B (PKB = AKT); Janus kinase (Jak)/ signal transducer and activator of transcription (STATs); phospholipase C gamma 1 (PLC-γ)/ protein kinase C (PKC)). Somit werden extrazelluläre Signale an intrazelluläre Signalkaskaden gekoppelt, die diese in den Zellkern weiterleiten. Dort erfolgt die Transkription von Genen, welche entscheidend für die Steuerung von Zellproliferation, Apoptose, zellulärer Migration und Angiogenese sind (Rogers, Harrington et al. 2005) (Marmor, Skaria et al. 2004) (Pazin and Williams 1992). Es gibt nach heutiger Kenntnis vier nachgeschaltete Hauptsignalwege. • Der Ras - MAPK1/ 3 - Signalweg leitet einen pro-mitogenen-Effekt an das Zellinnere weiter. Die beiden anderen Signalwege über mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14 = p38) und c-Jun amino terminal kinase (JNK = MAPK8) führen zu einer antiproliferativen und damit pro-apoptotischen Zellantwort (Schlessinger 2000) (Kyriakis 1999) (Roberts and Der 2007) (Marmor, Skaria et al. 2004). • Die PI3K - AKT - Kaskade liefert Informationen für den Zellmetabolismus und die Proteinsynthese und übt somit einen Einfluss auf weitere Schritte des Zellzyklus aus (Schlessinger 2000) (Blanco-Aparicio, Renner et al. 2007) (Marmor, Skaria et al. 2004). • Die Traskriptionsfakoren des JAK - STAT - Signalweges werden direkt phosphoryliert und leiten unmittelbar die Signale direkt in den Zellkern. Dort kommt es zur Transkription von Genen, die Zellteilung, Zelltod, Motilität, Invasion und Adhäsion sowie DNAReparaturmechanismen regulieren (Schlessinger 2000) (Marmor, Skaria et al. 2004) (Kijima, Niwa et al. 2002). • Die PLC-γ - Calcium – Diacylglycerol (DAG) – PKC - Kaskade interagiert mit Phosphatidylinositol-4,5-Phosphat. Daraus resultiert ein intrazellulärer Calciumanstieg, der wiederum zur Aktivierung von Calcium-/ Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen und Phosphatasen führt. Somit werden Regulationsprozesse des Zellzyklus, der zellulären Mobilität und zellulären Invasion beeinflusst (Schlessinger 2000) (Marmor, Skaria et al. 2004) (Thomas, Coppelli et al. 2003). 46 Abbildung 8: EGFR mit nachgeschalteten Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) 2.9.1 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Synonyme: ERBB; HER1; mENA; ERBB1; PIG61 MIM: 131550 Dieser Rezeptor gehört wie eben beschrieben zur ERBB-Rezeptorfamilie und wird auf Chromosom 7p12 codiert. Er ist ein 175 kDa schweres monomeres transmembranöses Glycoprotein, das aus drei Teilen besteht, nämlich einer extrazellulär gelegenen Nterminalen Domäne, einem transmembranösen Segment und einer intrazellulär gelegenen C-terminalen Domäne mit Kinaseaktivität. Entscheidend für die autokrine oder parakrine Aktivierung dieses Rezeptors sind das richtige extrazelluläre Signal und die Fähigkeit zur Rezeptor-Dimer-Bildung. Den Mitgliedern der ERBB-Rezeptorfamilie ist es möglich, zehn verschiedene Hetero-/Homodimere zu bilden, die von unterschiedlichen Liganden gebunden werden (Olayioye, Neve et al. 2000). Auch ist eine Bildung von Rezeptordimeren mit anderen Rezeptoren außerhalb der ERBB-Familie möglich, wie z.B. mit G-protein-coupled receptors (GPCR), insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) und Zytokinrezeptoren. Je 47 nachdem aus welchen Partnern das Rezeptordimer besteht und welche Liganden binden, wird ein anderer Signalweg eingeschlagen (Marmor, Skaria et al. 2004). Epidermal Groth Factor (EGF), Growth factor alpha (TGFα), heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), amphiregulin (AR), betacellulin (BC), epiregulin (EPR), cripto und epigen haben alle eine vergleichbare strukturelle Untereinheit (30-50 Aminosäuren), die sie wohl zu einem adäquaten Signal für den EGFR macht. Jedoch scheint ihre Bindungsaffinität unterschiedlich zu sein (Riese and Stern 1998) (Strachan, Murison et al. 2001) (Salomon, Bianco et al. 1999). Dabei scheint die G1 Phase, die einzige vulnerable Phase zu sein, in welcher die Zelle für extrazelluläre Signale empfänglich ist. So scheint die G1 Phase die zeitliche Schnittstelle zwischen Zellzyklus und Wachstumssignal zu sein (Gladden and Diehl 2005). Wie in vielen anderen epithelialen Tumoren findet sich auch in HNSCCs eine abnorme Regulation und Überexpression von EGFR (Überexpression von mRNA in 87-92% und Überexpression von Protein in 38-47% der HNSCCs) (Bei, Budillon et al. 2004) (Ongkeko, Altuna et al. 2005) (Grandis and Tweardy 1993). Dabei scheint es mindestens vier potenzielle Mechanismen zu geben, die in diesem Zusammenhang zur Tumorentstehung beitragen können (Olayioye, Neve et al. 2000) (Holbro, Civenni et al. 2003). • gesteigerte Expression der EGFR-Liganden • eine Transaktivierung mit anderen als den üblichen Rezeptoren und mit Tyrosinkinasen ohne Rezeptorfunktion, wie z.B. (focal adhesion kinase 1 (FAK), v-src sarcoma (SchmidtRuppin A-2) viral oncogene homolog avian (Src), v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog (Pyk2) und JAKs) • Mutationen und Deletionen in Genen, die zur konstitutiven Aktivierung des Rezeptors führen • Amplifikation des EGFR-Gens Des Weiteren scheint es einen Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad bzw. dem Stadium des HNSCCs und dem Ausmaß der Hochregulation des EGFR zu geben. Auch in 48 dem angrenzenden gesunden Gewebe um den Tumor herum lässt sich eine gesteigerte Expression von EGFR nachweisen. Diese Beobachtung scheint auf dem Weg von einer Gewebedysplasie zu einem invasiven Karzinom stetig zu zunehmen (Shin, Ro et al. 1994) (Grandis and Tweardy 1993). Der EGFR und seine nachfolgenden Signalwege wurden in den letzten Jahren sehr genau untersucht, da man sie als möglichen Ansatzpunkt für eine neue molekulare Tumortherapie erkannt hat. Dabei waren die Hauptansatzpunkte für eine spezifische Inhibition dieses Signalweges: • spezifische intrazellulär, Tyrosinkinase-Inhibitoren. indem sie als Diese Konkurrenz blockieren zu die Signalkaskade Adenosintriphosphat (ATP) von die Autophosphorylierung der Tyrosinkinase verhindern. Vorteilhaft dabei ist die Ligandenunabhängige Hemmung des Signalweges (Shawver, Slamon et al. 2002). • monoklonale Antikörper gegen Rezeptormonomere. Sie verhindern die Dimerisierung und führen zur Internalisierung des Rezeptors. Sie haben eine deutlich höhere Affinität zu EGFR als die natürlichen Liganden (Rapidis, Vermorken et al. 2008) (Goldstein, Prewett et al. 1995). • siRNA- und Antisense-Therapie zur Inhibition der mRNA des EGFR-Gene (He, Zeng et al. 1998). • ligandenggebundene Toxine (Azemar, Schmidt et al. 2000). Bis in die klinische Anwendung sind bis heute die spezifische Antikörpertherapie und die Tyrosinkinase-Inhibitoren vorgedrungen. Der EGFR spezifische, monoklonale Antikörper Cetuximab wurde vor kurzem als Monotherapie bei metastasiertem fortgeschrittenem HNSCC und als adjuvante Therapie bei lokal fortgeschrittenem HNSCC zugelassen. Studien konnten eine Verbesserung der lokalen Tumorkontrolle und des Gesamtüberlebens belegen (Mehra, Cohen et al. 2008) (Bonner, Harari et al. 2010) (Specenier and Vermorken 2011) 49 2.9.2 V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) Synonyme: NEU; NGL; HER2; TKR1; CD340; HER-2; MLN 19; HER-2/neu MIM: 164870 ERBB2 ist ein weiteres Oncoprotein, das zur ERBB-Rezeptor-Tyrosinkinase-Familie gehört. Ein Großteil der Forschung wurde aus dem Blickwinkel der Brustkrebsforschung durchgeführt. Eine starke Überexpression dieses Rezeptors lässt sich aber nicht nur in Mammakarzinomen, sondern auch in Ovarialkarzinomen, Magenkarzinomen, kolorektalen Karzinomen und NSCLC nachweisen (Gutierrez C and R. 2011) (Tai W, Mahato R et al. 2010) (Roskoski 2004). Die Rolle von ERBB2 in HNSCCs wird noch kontrovers diskutiert. Wie auch die anderen Mitglieder der ERBB-Familie scheint sich ERBB2 in Tumoren des KopfHals-Bereich verstärkt nachweisen zu lassen (3-29% der HNSCCs), wenn auch nicht in dem Ausmaß wie EGFR. Dabei scheint die vermehrte Expression von ERBB2 auf der Zelloberfläche vor allem zu einer gesteigerten Heterodimerisierungen der ERB-Rezeptoren zu führen (Brennan, Kumagai et al. 2000) (Schartinger, Kacani et al. 2004) (Bei, Budillon et al. 2004). Der codierende Genabschnitt für ERBB2 liegt auf Chromosom 17q12. Dieser Rezeptor ist 137 kDa schwer und ähnelt im Aufbau sehr den anderen Familienmitgliedern. Dennoch unterscheidet ihn eine wichtige Tatsache: Bis heute gibt es lediglich Hinweise, jedoch keinen eindeutigen Beweis für einen nativen Liganden dieses Rezeptors (Lupu, Colomer et al. 1990). Die fehlende spezifische Ligandenbindung scheint jedoch kein Hindernis für eine Homo-/Heterodimerisierung der Rezeptoren zu sein. Im Gegenteil, ERBB2 gilt als bevorzugter Interaktionspartner der anderen ERBB-Mitglieder, dabei scheint er deren Affinität zu anderen Liganden zu steigern. Zusätzlich scheint er die intrazelluläre Signalweiterleitung zu erleichtern, sowie die Rezeptorinternalisierung zu reduzieren (Marmor, Skaria et al. 2004) (Brennan, Kumagai et al. 2000) (Graus-Porta, Beerli et al. 1997) (Karunagaran, Tzahar et al. 1996). Da ERBB2 hauptsächlich als Dimerpartner mit anderen Familienmitgliedern interagiert, läuft die nachgeschaltete Signalkaskade wie oben beschrieben ab (Marmor, Skaria et al. 2004). 50 Teile dieser durch ERBB-Rezeptoren induzierten Signalkaskade führen zu Regulationsmechansimen der Zelladhäsion und -Invasion. So könnte man bei einem gesteigertem Rezeptoraufkommen mit verstärkter Signalweiterleitung auf eine vermehrte Förderung migrierender Prozesse schließen. Tatsächlich konnten Studien belegen, dass eine Überexpression von ERBB2 in Tumoren positiv mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen korreliert (Yu, Wang et al. 1994) (Xia, Lau et al. 1999). Man erhoffte sich ähnlich wie in der Brustkrebsforschung auch bei den HNSCCs ERBB2 als unabhängigen Prognosemarker und als Angriffspunkt für eine „targeted therapy“ nutzen zu können (Ross and Fletcher 1998) (Slamon, Clark et al. 1987). Leider sind die Ergebnisse bis heute nicht eindeutig (Lim 2005) (Cavalot, Martone et al. 2007) (Khademi, Shirazi et al. 2002) (O-charoenrat, Rhys-Evans et al. 2002). Schon seit 1998 befindet sich der humanisierte anti-ERBB2-Antikörper Trastuzumab (Herceptin) bei metastasierendem ERBB2-überexprimierendem Mammakarzinom in klinischer Anwendung (de Bono and Rowinsky 2002). Weitere humanisierte und humane ERBB2-spezifische und EGFR-spezifische Antikörper wie z.B. Pertuzumab, Matuzumab, Nimotuzumab, Panitumumab und Zalutumumab befinden sich derzeit in klinischen Studien. Davon ausgehend erhoffte man sich auch bei anderen Tumoren mit einer nachgewiesenen ERBB2-Überexpression monoklonale Antikörper als Monotherapie oder als adjuvante Therapie anwenden zu können. Besonders von der additiven Therapie bei RCTX verspricht man sich die Verminderung des Anteils der therapieresistenten Patienten. Derzeit gibt es klinische Studien zur Anwendung bei Ösophaguskarzinomen und NSCLC (Johnson and Janne 2006) (Zinner, Kim et al. 2002). Im Bereich der HNSCC-Forschung wurden bislang in-vitro Untersuchungen durchgeführt (Erjala, Sundvall et al. 2006) (Kondo, Ishiguro et al. 2008) 51 2.9.3 phospho mitogen activated protein kinase 1 + 3 (MAPK1 + 3; pp44/42MAPK) • Synonyme: ERK; ERK2; p38; p40; p41; ERT1; MAPK2; PRKM1; PRKM2; P42MAPK; p41mapk; MAPK1 MIM: 176948 • Synonyme: ERK1; PRKM3; P44ERK1; P44MAPK; HS44KDAP; HUMKER1A; MGC20180; MAPK3 MIM: 601795 Der Ras - MAPK - Signalweg gehört zu den Hauptsignalwegen, die den Rezeptoren der ERBBFamilie nachgeschaltet sind. Die intrazellulär gelegenen Tyrosinkinasen sind mittels growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) und son of sevenless (sos), einem Adaptor-ProteinKomplex mit Ras verbunden. Ras ist ein kleines membrangebundenes Protein, dass durch den Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) gegen Guanosintriphosphat (GTP) mittels sos aktiviert wird. Ras in seiner aktiven Form führt über weitere Proteinkaskaden zu einer großen Bandbreite an intrazellulären Vorgängen. Über v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 (B-Raf) wird die MAPK-Phosphorylierungs-Kaskade (mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK), mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK) und MAPK) aktiviert, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung von etlichen cytoplasmatischen und nuklearen Prozessen führt. Je nachdem gebundenem Ligand wird eine andere der insgesamt 12 MAPK rekrutiert. Diese 12 Kinasen sind wiederum in 6 Subfamilien aufgeteilt. Über den ras - MAPK - Signalweg werden durch unterschiedliche Liganden drei dieser Subfamilien aktiviert (Johnson and Lapadat 2002) (Weston, Lambright et al. 2002) (Widmann, Gibson et al. 1999). • MAPK1/ MAPK3; p-p42/44MAPK werden hauptsächlich durch Wachstumsfaktoren aktiviert und tragen zur Regulation von Zellproliferation und Differenzierung bei. Desweiteren verhindern sie pro-apopotische Prozesse (Yoon and Seger 2006) (Yamamoto, Ebisuya et al. 2006). 52 • JNK werden durch Stressimpulse (z.B. UV-Strahlen, Zytokine, fehlende Stimulation durch Wachstumsfaktoren) und diversen GPCR aktiviert. Sie sind an der Regulation von Apoptose, Überleben und Zellwachstum beteiligt (Weston and Davis 2007). • MAPK14 (p38) werden hauptsächlich durch Zytokine, aber auch durch andere Stresssignale stimuliert und führen zu ähnlichen Prozessen wie JNKs. Zusätzlich sind sie an der Regulation der Zytokinproduktion beteiligt (Zarubin and Han 2005). Außerdem gelangen MAPKs selbst in den Zellkern, wo sie eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren phosphorylieren und somit Regulationsmechanismen des Zellzyklus, der Zellmigration, Proliferation, Differenzierung und des zytoskeletalen Aufbaus aktivieren (Marmor, Skaria et al. 2004). Diese Arbeit beschäftigt sich genauer mit der Expression von p-p42/44MAPK. Die beiden Proteine sind annähernd gleich groß (p-p42MAPK: 41390 Da; p-p44MAPK: 43136 Da). Sie werden jedoch auf unterschiedlichen Chromosomen codiert, p-p42MAPK auf Chromosom 22q11.2 und p-p44MAPK auf Chromosom 16p11.2. Oft wird diese Kaskade als eine einfache, streng eindimensionale Abfolge von Proteinkinasen betrachtet. Aber umso genauer sie beforscht wurde, umso mehr zeigte sich, dass sie wohl ein zentrales Element eines großen Netzwerkes mit vielen weiteren Interaktionspartnern ist (Kolch 2005) (Gutkind 1998). Daraus ergibt sich die Frage ob es denn überhaupt möglich ist mit der Blockade von nur einem Element dieses gigantischen Netzwerkes einen Erfolg in der Tumortherapie zu erzielen. In den letzten Jahren wurde gegen viele Bestandteile dieses Gesamtnetzwerkes Inhibitoren entwickelt. In einem Drittel aller untersuchter Tumoren ist der Ras-MAPK-Signalweg fehlreguliert, meist scheinen diese Dysregulationen im oberen Drittel des Signalweges vorzukommen. Dabei wurden die meisten Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), in Ras und Raf festgestellt, aber es scheint auch Veränderungen der Transkriptionsfaktoren zu geben. Die Tatsache, dass in soliden Tumoren dieser Signalweg auf mehreren Ebenen verändert ist, verdeutlicht seine wichtige Stellung innerhalb der Karzinogenese. Es zeigt aber auch seine Komplexität, die ihn zu einem sehr interessanten, aber auch schwierigen Angriffspunkt für die Tumortherapie macht (Sebolt-Leopold and Herrera 2004) (Kohno and Pouyssegur 2006). 53 Abbildung 9: EGFR nachgeschalteter MAPK Signalweg Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) 2.9.4 phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) Synonyme: BZS; DEC; GLM2; MHAM; TEP1; MMAC1; PTEN1; 10q23del; MGC11227; PTEN MIM: 601728 PTEN ist ein Tumorsuppressorgen, das wie der Name impliziert auf Chromosom 10q23 lokalisiert ist. Desweiteren ist PTEN der Haupt-Antagonist von PI3K (Li, Yen et al. 1997). Das Protein ist 47 kDa schwer. Als PI (phosphoinositide) 3-Phosphatase führt PTEN zum Recycling von PIP3 und PIP2 mittels Dephosphorylierung an der D3-Position des Inositolringes. Somit wirkt es als Gegenspieler den AKT-aktivierenden Effekten von PI3K entgegen. Durch die beiden Komponenten (PTEN, PI3K) des Regelmechanismuses um PIP3/PIP2 ist eine feine Balance innerhalb der Regulation von Wachstumsprozessen möglich. Eine Aktivierung von PTEN führt zur Unterdrückung wachstumsfördernder Stimuli 54 durch Zellzyklusarrest in der G1 Phase oder zur Apoptose. Der genaue Ablauf ist aber noch nicht vollständig verstanden. Mögliche Ansatzpunkte könnten eine PTEN-induzierte Expression von p27, einem CDK-Inhibitor sein, oder eine durch PTEN ausgelöste verminderte nukleare Akkumulation von cyclin D1. Dabei ist noch nicht geklärt in wie weit diese Mechanismen AKT abhängig sind (Ramaswamy, Nakamura et al. 1999) (Cheney, Neuteboom et al. 1999) (Diehl, Cheng et al. 1998) (Liu, Sheng et al. 2005) (Bruni, Boccia et al. 2000). Vermutlich ist PTEN unabhängig von seiner Phosphatase-Aktivität zusätzlich an der Regulation von Zellmotilität beteiligt (Sulis and Parsons 2003) (Maehama and Dixon 1998). In unterschiedlichen Zelltypen lässt sich PTEN in vivo und in vitro im Zytoplasma, an der Zellmembran und im Zellkern nachweisen. Ob die zelluläre Verteilung mit unterschiedlichen Aufgaben korreliert, wird diskutiert (Sano, Lin et al. 1999) (Perren, Komminoth et al. 2000) (Lachyankar, Sultana et al. 2000) (Chung and Eng 2005). PTEN ist eines der häufigsten inaktivierten Tumorsuppressorgene in Malignomen. Nachweislich ist es in ZNS-Tumoren, Mammakarzinomen, Endometriumkarzinomen, Prostatakarzinomen, Blasentumoren, Bronchialkarzinomen, kolorektalen Karzinomen und in weiteren soliden Tumoren inaktiviert (Li, Yen et al. 1997) (Sano, Lin et al. 1999) (Cairns, Evron et al. 1998) (Soria, Lee et al. 2002) (Risinger, Hayes et al. 1997) (Zhou, Loukola et al. 2002). Im pleomorphen autosomal dominant vererbten neoplastischen Syndrom, dem Cowden-Syndrom wurde eine wohl ursächliche Mutation in PTEN gefunden. Dieses Syndrom geht mit einem gesteigerten Risiko für Harmatome des gastrointestinalen Trakts, Mammakarzinomen und Schilddrüsentumoren einher (Eng 2003). Diese Tumorentitäten zeigen aber außerhalb dieses Syndroms kein gehäuftes Vorkommen von PTEN Mutationen (Dahia, Marsh et al. 1997) (Feilotter, Coulon et al. 1999) (Bruni, Boccia et al. 2000). Obwohl das PTEN Gen auf Grund seiner Mutation in Gliomen (Li, Yen et al. 1997) und Endometriumkazinomen (Risinger, Hayes et al. 1997) entdeckt wurde, lässt sich in vielen anderen Tumorentitäten keine Mutation im PTEN Gen sondern lediglich eine verringerte oder aufgehobene PTEN-Expression nachweisen (Soria, Lee et al. 2002) (Zhou, Loukola et al. 2002). Folglich wurde nach anderen Mechanismen gesucht, die für eine verminderte PTEN Expression verantwortlich sind. Ein eindeutiger Mechanismus konnte bis jetzt noch nicht 55 identifiziert werden, jedoch gibt es Hinweise, dass epigenetische Mechanismen wie eine PTEN-Methylierung eine Rolle spielen könnten (Dahia, Aguiar et al. 1999) (Whang, Wu et al. 1998). In HNSCC findet man in 20-43% einen Verlust der Heterozygotie (LOH) des Chromosom 10 (Nawroz, van der Riet et al. 1994) (Gasparotto, Vukosavljevic et al. 1999) (Okami, Wu et al. 1998). Ob innerhalb dieses Verlustes das PTEN-Gen mitbeteiligt ist, konnte in den aktuellen Studien noch nicht sicher dargelegt werden (Gasparotto, Vukosavljevic et al. 1999) (Poetsch, Lorenz et al. 2002). Jedoch konnten Studien Hinweise für eine positive Assoziation zwischen Verlust der Heterozygotie des Chromosom 10 und zunehmender Invasisität von HNSCC finden (Gasparotto, Vukosavljevic et al. 1999). 2.9.5 phospho akt murine thymoma viral oncogene homolog (pAKT); Proteinkinase B (PKB) • Synonyme pAKT1: AKT; PKB; RAC; PRKBA; MGC99656; PKB-ALPHA; RAC-ALPHA; AKT1 MIM: 164730 • Synonyme pAKT2: PKBB; PRKBB; PKBBETA; RAC-BETA; AKT2 MIM: 164731 • Synonyme pAKT3: PKBG; PRKBG; STK-2; PKB-GAMMA; RAC-gamma; RAC-PK-gamma; DKFZp434N0250; AKT3 MIM: 611223 Die AKT-Familie gehört zu einem weiteren nachgeschalteten Signalweg der ERBB-RezeptorFamilie. Die 3 Isoformen pAKT1, pAKT2 und pAKT3 werden durch unterschiedliche Gene auf Chromosom 14q32.32, 19q13.1 und 1q44 codiert. Sie scheinen unterschiedliche zelluläre Prozesse wie Zellüberleben, Proliferation, Migration und Differenzierung zu regulieren. Diese Serin-Threonin-Kinasen sind Haupteffektoren von PI3K. PI3K wird durch eine Vielzahl von Stressstimuli mittels RTKs und GPCRs aktiviert und führt selbst zur Rekrutierung von pAKT und PDK1 mittels Phosphorylierung von Phosphatidylinositol-Lipiden. Die daraus entstehenden Phosphoinositid-phosphatidylinositol 3,4 Bisphosphate (PIP2 = PI3, 4P) und phosphatidylinositol 3,4,5 Trisphosphate (PIP3 = PI3, 4,5P) dienen als „second messenger“. An der Zellmembran erfolgt die Phosphorylierung und damit Aktivierung von pAKT. Dies 56 bewirkt den Anstoß einer Vielzahl von zytoplasmatischen Prozessen. pAKT wandert aber auch in den Zellkern zu einer Reihe von nuklearen Effektoren. Durch diverse Mechanismen und Effektorproteine führt die Aktivierung von pAKT zur Förderung der Zellproliferation (Datta, Brunet et al. 1999) (Kandel and Hay 1999). Zum einen kommt es zur Hemmung von pro-apoptotischen Mechanismen. Durch Phosphorylierung von Elementen des Apoptose-Apparates (z.B. BCL2-associated agonist of cell death (BAD), Caspase 9) kann pAKT direkt eingreifen. Es wirkt aber auch indirekt über Veränderungen der Gen-Expression von pro-apoptotischen Proteinen. So wird z.B. I-kappa-B kinase-alpha (IKK) und nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NFκB)Regulator von pAKT auf DNA-Ebene reguliert (Meier and Hemmings 1999) (Datta, Dudek et al. 1997) (Danielsen and Maihle 2002) (Kane, Shapiro et al. 1999). Zum anderen werden Inhibitoren des Zellzyklus wie p27 und p21 gehemmt und eine Translokation von proliferationsfördernden Proteinen wie cyclin D1 gefördert (Mirza, Gysin et al. 2004) (Diehl, Cheng et al. 1998) (Zhou, Liao et al. 2001) (Viglietto, Motti et al. 2002). Des Weiteren wird über den PI3K/AKT-Signalweg mammalian target of rapamycin (mTOR) aktiviert. mTOR selbst ist ein Aktivator der Translation von Proteinen. Dieser verknüpft extra- und intrazelluläre Signale und ist mitbeteiligt an der Regulation von biologischen Prozessen wie Zellwachstum und Proliferation (LoPiccolo, Blumenthal et al. 2008) (Yang and Guan 2007). Zusätzlich geht mit einer Aktivierung von pAKT eine verstärkte Phosphorylierung von murine double minute oncogene (MDM2) und damit eine verstärkte MDM2 vermittelte Ubiquitinierung einher. Dies ist ein weiterer Punkt, an dem die Signaltransduktion über pAKT einen Anschluss an die Zellzykluskontrolle hat. In diesem Fall ist der Verknüpfungspunkt der Spindelcheckpoint (Zhou, Liao et al. 2001). All diese Mechanismen können den Zelltod trotz bestehender zellulärer und genetischer Defekte verhindern. Für die Tumorgenese könnte eine Überexpression von pAKT und damit eine verminderte Apoptoserate und eine gesteigerte zelluläre Proliferation ggf. eine 57 Tumorprogression und eine verminderte RCTX-Sensibilität bedeuten (West, Castillo et al. 2002) (Jiang and Liu 2008). Tatsächlich konnte in Studien an unterschiedlichen soliden Tumoren eine verstärkte Aktivität von pAKT nachgewiesen werden, so z.B. in Mammakarzinomen, Ovarialkarzinomen, kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen und HNSCC (Zhou and Hung 2002) (Kanamori, Kigawa et al. 2001) (Fraser, Leung et al. 2003) (Roy, Olusola et al. 2002) (Malik, Brattain et al. 2002) (Nakayama, Ikebe et al. 2001). In HNSCC wird pAKT in 5781% der Fälle überexprimiert (Ongkeko, Altuna et al. 2005). Auf Grund der Expressionsnachweise und der Vorstellung einer pAKT-vermittelten Verminderung der RCTX-Sensibilität beschäftigt sich die Forschung seit geraumer Zeit mit der Entwicklung von Inhibitoren dieses Signalweges. Mögliche Ansatzpunkte sind dabei PI3K, pAKT und mTOR, es wird aber ständig nach weiteren Mitgliedern des Netzwerkes um pAKT und damit nach neuen Angriffspunkten für eine Tumortherapie gesucht. Rapamycin/ Sirolimus (ein Immunsuppressivum mit Makrolidstruktur) das mTOR hemmt und somit zu einem Zellzyklusarrest in der G1 Phase führt, ist wohl das bis dato bekannteste. Der stärkste natürliche negative Regulator von pAKT ist PTEN. PTEN ist in Tumoren meist parallel inaktiviert und führt so zu einer vermehrten Aktivierung von pAKT (Di Cristofano and Pandolfi 2000) (Stambolic, Suzuki et al. 1998). Daneben gibt es noch weitere Proteine, die die Aktivität von pAKT mindern (Maira, Galetic et al. 2001) (Leslie, Biondi et al. 2001). 58 Abbildung 10: EGFR nachgeschalteter AKT Signalweg Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) 2.10 Problemstellung Für Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Halsbereich hat sich die Prognose über die letzten drei Jahrzehnte, trotz Weiterentwicklung der Therapieoptionen und besserem Patientenmanagment, sowie Nachsorge nicht deutlich verbessert (Boehm, Wichmann et al. 2010). Aus diesem Grund ist die aktuelle Forschung bemüht geeignete Parameter zur besseren Prognoseeinschätzung und damit zur individuellen Therapieoptimierung zu finden. Bisher scheint die TNM-Klassifikation der beste Anhaltspunkt für eine Prognoseeinschätzung bei Erstdiagnose zu sein. Allerdings lässt sich diese Prognose nur schwer auf den individuellen Patienten übertragen. Beispielsweise kommt es in 50% der fortgeschrittenen HNSCC trotz adäquater multimodaler Therapie zu einem Lokalrezidiv oder zu einer weiteren Metastasierung (Gasparotto and Maestro 2007) (Gath and Brakenhoff 1999). Die Antwort auf die Frage, welche Patienten zu einem Tumorprogress neigen und welche nicht, bleibt bis 59 dato offen. Daher werden Prognosemarker benötigt, die individuelle Risikovorhersagen ermöglichen und ggf. eine individuelle Therapieentscheidung zulassen. Mit einem zunehmenden Verständnis für die molekulare Tumorgenese der HNSCCs rücken einzelne Gene und Proteine ins Zentrum der Forschung. Diese Proteine und deren Zusammenspiel im Rahmen der Zellzyklusregulation und Signalvermittlung scheinen eine wichtige Rolle in der Karzinogenese zu spielen. So liegt der Gedankengang nahe, dass diese Proteine auch als Prognosemarker genutzt werden könnten. 2.11 Zielsetzung der Arbeit Ausgehend von der Hypothese, dass es auch in HNSCC Proteine gibt, deren Expressionsmuster eine Aussage bezüglich Überlebensprognose und Krankheitsverlauf zulassen, untersuchten wir 12 unterschiedliche Proteine aus dem Bereich der Zellzykluskontrolle und EGFR-vermittelten Signaltransduktion. Aus Forschungsbereichen anderer Tumorentitäten weiß man, dass es solche Assoziationen bei einem Teil dieser Proteine gibt und diese z.T. auch schon im klinischen Alltag angewendet werden. Das wohl bekannteste Beispiel ist der ERBB2-Nachweis in Mammakarzinomen. Dieser ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert und geht bei positivem Rezeptornachweis mit einer zusätzlichen Antikörper-Therapie einher (Ross and Fletcher 1998) (de Bono and Rowinsky 2002). Eine Überexpression des EGFR, ebenfalls ein ERBB-Rezeptor wird in 38-92% der HNSCCs beobachtet (Bei, Pompa et al. 2001) (Ongkeko, Altuna et al. 2005) (Mehra, Cohen et al. 2008). Daher wurden die Bemühungen in der Forschung um eine Anti-EGFR-Therapie stark forciert. Seit 2007 ist Cetuximab bei fortgeschrittenen HNSCC zugelassen (Specenier and Vermorken 2011). Aus diesem Grund nahmen auch wir diese beide Proteine und 3 weitere Proteine aus dessen nachgeschalteten Signalweg in unsere Arbeit auf. Zusätzlich wurden Proteine aus unterschiedlichen Bereichen der Zellzykluskontrolle gewählt. Die allgemeine Vorstellung geht im Moment von einer Dysregulation des Zellzyklus im Rahmen der Tumorprogression aus. Auch sind diese Proteine vermehrt in HNSCC und 60 anderen Tumorentitäten nachweisbar. Allen voran p53, das wohl bekannteste Tumorsuppressorgen, welches in 50% aller Tumoren und in 52-82% aller HNSCC eine Mutation aufweist. Ziel dieser Arbeit soll es nun sein, Proteine zu identifizieren, deren Überexpression mit der Prognose bzw. Gesamtüberleben signifikant assoziiert sind. Zusätzlich sollen Assoziationen zwischen klinischen Charakteristika und Proteinexpressionsmustern gefunden werden, um an Hand dessen die HNSCCs möglicherweise in unterschiedliche Subgruppen mit unterschiedlichem Risikoprofil einteilen zu können. Damit könnte im Optimalfall eine Therapieindividualisierung möglich werden. 3 Material & Methoden 3.1 Material 3.1.1 Studienkollektiv Die Gewebe, die in dieser Arbeit verwendet wurden, wurden in den Kliniken und Polikliniken für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der TU München, Klinikum rechts der Isar sowie der Universitätsklinik Regensburg im Rahmen einer Studie gewonnen, die durch die WilhelmSander-Stiftung und das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert wurde. Es handelt sich um Operationspräparate (Exstirpation des Primärtumors, funktionelle oder radikale Neck-dissection und normales Plattenepithel) aus dem Zeitraum von 1993 bis 1997 (Steuer-Vogt, Bonkowsky et al. 2001) (Steuer-Vogt, Bonkowsky et al. 2006). Diese beiden Projekte unterschieden sich lediglich in der Standardtherapie: bei nicht metastasierten Tumoren wurde eine ausschließlich chirurgische Therapie gewählt (SanderProjekt). Bei lymphatisch metastasierten, resektablen Tumoren wurde zusätzlich zur Operation eine postoperative konventionelle Radiatio durchgeführt (BMBF-Projekt). Der dritte Arm der ursprünglichen Studie bestand aus Patienten mit HNSCC, die ausschließlich durch eine Radiochemotherapie behandelt wurden. Jedoch wurden aufgrund von zu geringen Fallzahlen und mangelndem Material diese Patienten aus unserer Studie 61 ausgeschlossen. So ergab sich insgesamt eine Fallzahl von 180 Patienten in unserem Kollektiv. Die Nachbeobachtungszeit betrug durchschnittlich 13,3 Jahre. Einschlusskriterien: • Alter: 18-87 Jahre • Histologisch gesichertes Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich o Mundhöhle o Lippe o Oropharynx o Hypopharynx o Larynx Ausschlusskriterien: • Simultanes Zweitkarzinom • Fernmetastasen • Vorherige Malignome (Ausnahme: dermales Basaliom) • R2-Resektion • Schwangerschaft • Psychiatrische Erkrankung • Schwere arterielle Hypertonie • Gestörte Nierenfunktion (Kreatinin-Clearance unter 150 µmol/l) • gestörte Leberfunktion, (Serum-Bilirubin über 1 mg/100 ml oder 30 mmol/l, SGOT über 100 U/l, SGPT über 100 U/l) • ausgeprägte Hypertriglyzerinämie, Hypercholesterinämie oder Hyperkalzämie • insulinpflichtiger Diabetes mellitus • frühere immunstimulierende Therapien • hämatologische Systemerkrankungen • rheumatische Systemerkrankungen und/oder regelmäßige antiphlogistische Therapie • Allergien mit regelmäßiger Antihistaminika-Einnahme 62 • bekannte HIV-Infektion • Tuberkulose 3.1.2 Geräte Geräte Hersteller Mikrotom: Microm HM 355 S Microm International GmbH; D-69190 Walldorf, Deutschland Feather-Klingen Microtome Blades S35 Novoglas Labortechnik Bern, Schweiz Paraffin Streckbad TFB 35 Medite Medizintechnik GmbH; D-31303 Burgdorf, Deutschland Objektträgerstrecktisch OTS 40 Stanze „Tissue Arrayer“ Beecheronstruments Inc.; Sun Prairie, USA Trockenschrank Memmert GmbH + Co. KG ;D-91107 Schwabach, Deutschland Mikroskop Axioplan 2 Carl Zeiss, Jena, Deutschland Kamera Sony AVT Horn, Deutschland Pipetten Eppendorf, Hamburg, Deutschland Tischzentrifuge 5415D Schüttler Heidolph, Kelheim, Deutschland Waage Sartorius, Göttingen, Deutschland Orbital Shaker IKA-VIBRAX-VXR IKA Labortechnik Staufen, Deutschland Glasschaukel Färbeküvette Neolab, Heidelberg, Deutschland Färbekammer ("Feuchtkammer") Kochplatte AFK Deutschland GmbH; Düsseldorf, Deutschland Kochtopf Vitavit Fissler GmbH, Idar-Oberstein, Deutschland Tabelle 9: verwendete Geräte 63 3.1.3 Chemikalien Chemikalien Hersteller Dako REAL Antibody Diluent Goat Serum (Normal) Dako Deutschland GmbH; D-22083 Hamburg, Deutschland REAL™ Detection System Peroxidase/DAB+ Saures Hämalaun nach Mayer Apotheke des Klinikums rechts der Isar, Deutschland Xylol Aug. Hedinger GmbH & Co. KG; D-70327 Stuttgart, Deutschland Pertex® Eindeckmedium Medite Medizintechnik GmbH; D-31303 Burgdorf, Deutschland Citrogensäure Monohydrat Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH; D-30926 Seelze, Deutschland Wasserstoffperoxid 30% Ethanol 96% Ethanol 70% Isopropanol p.a. Carl Roth GmbH + Co KG; D-76185 Karlsruhe, Deutschland Tris Base Natriumchlorid Salzsäure Natriumhydroxyd Tabelle 10: verwendete Chemikalien 64 Puffer: 10x Triss-Puffer 60,5g Tris-Base 90g NaCl pH 7,6 mit HCl einstellen, ad 1000ml H2O Citrat Puffer 2,1 g Citronensäuremonohydrat, pH 6,0 mit NaOH einstellen, ad 1000 ml H2O Tabelle 11: verwendete Pufferlösungen 3.1.4 Verbrauchsmaterial Verbrauchsmaterial Hersteller Blöcke Engelbrecht Medizin und Labortechnik GmbH, Edermünde, Deutschland Obejektträger Superfrost Plus R. Langenbrick Labor und Medizintechnik, Teningen, Deutschland Deckgläser 24x60 mm Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG; D-38116 Braunschweig, Deutschland Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Reaktionsgefäße (1,5ml) Tabelle 12: verwendetes Verbrauchsmaterial 65 3.1.5 Antikörper Anttikörper Clone Verdünpositiv Kontrolle nung mAK Maus-Anti-survivin 12C4 1:20 Colon CA mAK Maus-Anti-p53 D07 1:200 Mamma CA mAK Maus-Anti-ki 67 MB-1 1:100 Tonsille mAK Maus-Anti-HER2-pY 1248 PN2A 1:300 Mamma CA pAK Kaninchen-Anti-plk-1 (8-21) 1:10 Colon CA Calbiochem/Merck KGaA; Darmstad, Deutschland pAK Kaninchen-Anti-BubR1 1:50 Cervix CA (Adeno CA) USBiological; Massachusetts, USA Firma Dako Deutschland GmbH; Hamburg, Deutschland mAK Maus-Anti-STK15 JLM28 1:100 Tonsille Novocastra; Newcastle Upon Tyne, United Kingdom mAK Maus-Anti-cyklin D1 DCS6 1:400 Mamma CA Cell Signaling Technology, Inc.; Massachusetts , USA 1:200 Mamma CA Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Kalifornien, USA mAK Kaninchen-Anti-Phospho-p44/42 20G11 1:100 MAPK (Thr202/Tyr204) Prostata CA mAK Maus-Anti-PTEN 26H9 1:300 Prostata CA pAK Kaninchen-Anti-AKT Ser473 736 E 11 1:50 Lungen CA pAK Kaninchen-Anti-EGFR Cell Signaling Technology, Inc.; Massachusetts, USA Tabelle 13: verwendete Antikörper mit positiver Kontrolle 3.2 Methoden 3.2.1 Tissue Micro Arrays Bei der Herstellung der Tissue Micro Arrays (TMA) in dem pathologischen Institut der Technischen Universität München wurde zunächst von den Parraffinblöcken je ein Standardschnitt mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um eine Referenz für die Stanzung zu erhalten. 66 Dabei wurden je 3 µm Schnitte mit einem Mikrotom angefertigt und auf Glasobjektträger aufgezogen und anschließend 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe deparaffiniert (Xylol, Propanol, Ethanol 96%, Ethanol 70%, Aqua dest.) und in TRIS-Puffer gewaschen. Nach der Inkubation mit Hämatoxylin und anschließendem Waschen mit Leitungswasser wurden die Schnitte mit Eosin inkubiert. Durch eine aufsteigende Alkoholreihe erfolgte die Entwässerung. Zum Schluss wurden die Schnitte mit Deckgläsern versehen. Diese Referenzschnitte wurden von einem Oberarzt des pathologischen Instituts beurteilt und die Areale von Interesse markiert (HNSCC, Lymphknoten Gewebe und normales Plattenepithel der Kopf-Hals Bereiches). Anschließend erfolgte die Übertragung der Markierung auf die Paraffinblöcke. Mit einem Stanzgerät wurden Stanzen von 1 mm Durchmesser aus dem ausgewählten Bereich auf Leerblöcke übertragen. Zusätzlich wurden zwei Stanzen aus normalem Lebergewebe zur Orientierung auf jeden Leerblock aufgebracht. Es entstanden vier Blöcke mit Tumorgewebe, drei Blöcke mit normalem Plattenepithel und zwei Blöcke mit infiltriertem Lymphknoten Material. Die Blöcke wurden 48 Stunden bei 37,0 °C inkubiert. O O O O O O O O O O • O O O O O O O O O O • O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O Abbildung 11: Beispiel eines Blockes mit TMA- Stanzen; Ο = Tumorgewebe, Lymphknotengewebe oder Plattenepithel; • = Lebergewebe (Markierung) 67 3.2.2 Immunhistochemie Mit einem Mikrotom wurden aus den Blöcken 1,5 μm dicke, in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebeschnitte angefertigt. Diese wurden anschließend auf Objektträger aufgezogen und über Nacht in einem Ofen bei 58°C getrocknet. Anschließend wurden sie in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und rehydriert. Zunächst wurden sie für 3 x 10 min in Xylol entparaffiniert, und anschließend für 2 x 5 min in Isopropanol und für jeweils 5 min in 96 % Ethanol, in 70 % Ethanol und in Aqua dest. rehydriert. Eine ausreichende Antigenität der Proteine wird durch die Demaskierung der Epitope gesichert. Dies erfolgte durch das Kochen der Schnitte in Citrat-puffer (pH 6,0) im Dampfkochtopf für 7 min. Anschließend wurden die Schnitte 5 min in TRIS-Puffer (pH 7,6) gewaschen. Um die endogene Peroxidase zu quenchen wurden die Schnitte in 3 % H2O2 für 15 min im Dunkeln inkubiert und anschließend erneut 3 x 2 min in TRIS-Puffer (pH 7,6) gewaschen. Um unspezifische Bindungen des Primärantikörpers zu vermeiden wurden die Schnitte mit 5 % Ziegenserum für 30 min behandelt. Es folgte die Inkubation mit entsprechend verdünnten Primärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur (RT) in feuchter Kammer. Nach 3 x 2 min Waschen mit TRIS-Puffer folgte die Inkubation mit biotinyliertem Sekundär- und Streptavidin-Peroxidase-Tertiär-Antikörper für jeweils 30 min. Anschließenden wurde ein weiterer Waschvorgang für 3 x 2 min vorgenommen. Als Substrat für die Peroxidase wurde DAB-Chromogen zugegeben und nach einer definierten Zeitdauer mit TRIS-Puffer wieder abgespült und anschließend für 10 min gewaschen. Mit Haemalaun wurden die Zellkerne und der Gewebehintergrund gegengefärbt und unter fließendem Wasser für 10 min differenziert. Abschließend erfolgte die Dehydrierung durch eine aufsteigende Alkoholreihe mit 70%, 96% Ethanol und Isopropanol und schließlich das Eindeckeln mit Deckglas und Pertex Eindeckmedium. 3.2.3 Auswertung Die anschließende Auswertung der Schnitte erfolgt durch 2 unabhängige Untersucher im pathologischen Institut der Technischen Universität München. Dies erfolgte semiquantitativ 68 unter Berücksichtigung des Prozentsatzes an positiven Zellen und der Färbeintensität in Anlehnung an den Immunreaktiven Score (IRS) (Remmele and Schicketanz 1993) (Schauer, Rothe et al. 1988). Dieser dient der Quantifizierung von Progesteron- und Östrogenrezeptoren auf der Oberfläche von Tumorzellen von Mammakarzinomen. Hierbei wird der prozentuale Anteil (PP = percentage points; dt. Prozentpunkte) der rezeptorpositiven Zellen mit der der Intensität der Färbung (SI = staining intensity; dt. Färbeintensität) multipliziert. IRS (Immunreaktiver Score) = PP x SI SI Negativ schwach positiv mässig positiv stark positiv PP 0 1 2 3 negativ < 10% 11 - 50% 51 - 80% > 80% IRS 0 1 2 3 4 negativ schwach positiv mäßig positiv strak positiv 0-2 3-4 5-8 9-12 Tabelle 14: Immunreaktiver Score (IRS = PP x SI) nach (Remmele and Schicketanz 1993) (Schauer, Rothe et al. 1988) In unserer Arbeit wurde der prozentualen Anteil (PP = percentage points) der positive gefärbten Zellen mit der der Intensität der Färbung (SI = staining intensity) addiert. Score = PP + SI SI Negativ schwach postiv mässig positiv stark positiv PP 0 1 2 3 negativ < 10% 11-30% 31-60% > 60% Score 0 1 2 3 4 Tabelle 15: Verwendeter Score (SI + PP = Score) 69 negativ 0 schwach positiv 2-3 mäßig positiv 4-5 stark positiv 5-7 3.2.4 Statistik Die Statistik wurde mit der Software SPSS Version 18/ 19 von IBM durchgeführt. Für alle statistischen Tests wurde ein Signifikanz-Niveau von 5% festgelegt. Zunächst wurde mittels eines nichtparametrischen Tests (WILCOXON-Test) die Verteilung des Expressionsprofiles der einzelnen Marker zwischen Tumor und Normalgewebe, Lymphknoten und Normalgewebe sowie Tumor und Lymphknotengewebe untersucht und zum Teil in Histogrammen veranschaulicht. Für diejenigen Marker, bei denen eine Färbung an mehreren intrazellulären Lokalisationen vorlag, wurde der überwiegende Lokalisationsort als Grundlage für die Auswertung verwendet. In der Spearman-Correlation wurden dann alle Marker untereinander bezüglich einer Korrelation (bivariant) verglichen. Die Ergebnisse wurden mittels dreidimensionalen Streudiagrammen veranschaulicht. Die Marker wurden ebenfalls mit den klinischen Daten Raucherstatus und Alkoholkonsum korreliert und die Ergebnisse in Balkendiagrammen dargestellt. Für die Untersuchung der übrigenbrigen klinischen Daten (T-Klassifikation, Rezidivrate, Lymphknotenmetastasierung, Fernmetastasierung, Rate an Zweitkarzinomen) mittels Kreuzanalyse/ Vier-Felder-Tafel (ChiQuadrat-Test, exakter Test nach Fischer) wurde bezüglich des Färbescores ein cut-off Wert von 2 gesetzt. Damit galten alle Stanzen (HNSCCs, Normalgewebe und Lymphknoten) mit jeglichem Markernachweis unabhängig von der Anzahl der positiv gefärbten Zellen oder von der Färbeintensität als positiv (Score ≥ 2). Die Subjektivität, ein Problem der immunhistochemischen Auswertung wurde damit relativiert. Die Überlebensanalysen für die einzelnen Marker wurden mittels Kaplan-Meier-Kurven und Log Rank Test durchgeführt. Ebenfalls wurde hier ein cut-off Wert von 2 verwendet. Anschließend wurden Multivariant-Analysen mittels Cox-Regressionsmodel zur Verifizierung der Ergebnisse durchgeführt. 70 4 Ergebnisse 4.1 Charakterisierung des Kollektivs Charakteristika Daten Alter Mittleres Alter 69 Jahre Range 45-87 Jahre Geschlecht Männlich/ Weiblich 165/ 15 91,67/ 8,33% Raucher/ Nichtraucher 109/ 40 60,56/ 22,22% keine Angaben 31 17,22% regelmäßig/ nicht regelmäßig 92/ 37 51,11/ 20,56% keine Angaben 51 28,33% 21 11,67% Tabakkonsum Alkoholmenge TNM-Klassifikation pT-Klassifikation pT1 pT1a (Stimmlippenkarzinom) 3 1,67% pT1b (Stimmlippenkarzinom) 1 0,56% pT1 gesamt 25 13,89% pT2 66 36,67% pT3 48 26,67% pT4* 41 22,78% pN0/ pN+ 94/ 86 52,22/ 47,78% pN1 23 12,78% pN2a 2 1,11% pN2b 39 21,67% pN2c 20 11,11% pN2 gesamt 41 22,78% cM0 180 100% M1 0 0% 10/ 110/ 60 5,56/ 61,11/ 33,3% pN-Klassifikation cM-Klassifikation Grading G1/ G2/ G3 71 anatomische Lokalisation Mundhöhle 33 18,33% Oropharynx 58 32,22% Hypopharynx 33 18,33% Larynx 56 31,11% Tabelle 16: Charakterisierung des Patientenkollektives zum Zeitpunkt der Erstellung des Kollektives *nach alter WHOKlassifikation 1997 4.2 Auswertung der Immunhistochemie (IHC) Die komplette immunhistochemische Auswertung der zellzyklusregulierenden Marker ist im Anhang in Tabelle 1, die Auswertung der EGFR nachgeschaltenen Signaltransduktionsmarker in Tabelle 2 im Anhang dargestellt. Die jeweilige Lokalisation der Markerfärbung stellt die folgende Tabelle dar. Marker Survivin PLK-1 Bub1B STK15 cyclin D1 p53 ki67 EGFR ERBB2 p-p42/44MAPK pAKT PTEN Zellkern pos. pos.* pos. pos. pos.* pos. pos. Cytoplasma Zellmembran pos. pos. pos. pos.* pos. pos.* pos.* pos. (LK) pos. pos. Tabelle 17: Lokalisation der Markerdedetion; * die für die Auswertung gültige Färbung. Im Folgenden werden immunhistochemische Beispiele der Markerfäbungen gezeigt. 72 4.2.1 Immunhistochemische Beispiele der zellzyklusregulierenden Marker Abbildung 12: Immunhistochemische Darstellung von Survivin. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe Abbildung 13: Immunhistochemische Darstellung von PLK-1. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe Abbildung 14: Immunhistochemische Darstellung von Bub1B. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe 73 Abbildung 15: Immunhistochemische Darstellung von STK15. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe Abbildung 16: Immunhistochemische Darstellung von cyclin D1. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe Abbildung 17: Immunhistochemische Darstellung von p53. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe 74 Abbildung 18: Immunhistochemische Darstellung von Ki67. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe 4.2.2 Immunhistochemische Beispiele der Signaltransduktionsmarker Abbildung 19: Immunhistochemische Darstellung von EGFR. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe Abbildung 20: Immunhistochemische Darstellung von pAKT. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe 75 Abbildung 21: Immunhistochemische Darstellung von p-p42/44MAPK. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe Abbildung 22: Immunhistochemische Darstellung von PTEN. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe 4.3 Statistische Auswertung 4.3.1 Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Im Wilcoxon-Mann-Whitney-Test wird der jeweilige Median des Expressionsscores eines Markers in den zu untersuchenden Geweben bestimmt und jeweils zwischen 2 Gewebearten miteinander verglichen. Liegt der Median des Expressionsscores im Tumorgewebe statistisch signifikant über dem Median des entsprechenden Normalgewebes, so wird dies als Überexpression gewertet. Liegt dieser statistisch signifikant darunter wird dies als 76 verminderte Expression gewertet. • Eine Überexpression in Tumorgewebe verglichen mit normalem Plattenepithel lag für die Marker STK15, p53, ki67, EGFR und pAKT vor • Eine verminderte Expression hingegen lag für die Marker: Survivin, p-p42/44MAPK und PTEN vor • Es ergab sich kein Unterschied der Mediane und damit des Expressionsprofiles für die Marker PLK-1, Bub1B und cyclin D1. ERBB2 wurde weder in Normal- noch Tumorgewebe exprimiert. Da die zur Verfügung stehende Fallzahl für den Vergleich zwischen Lymphknotengewebe und Normalgewebe sehr klein war (im Schnitt 11 Fälle), wurde vor allem Wert auf einen Vergleich des Expressionsstatus zwischen Tumor- und Lymphknotengewebe gelegt. Survivin zeigte im Vergleich zum Normalgewebe eine verminderte Expression in Tumor- und Lymphknotengewebe. Wobei diese im Lymphknotengewebe stärker nachweisbar war, als in HNSCCs. cyclin D1, Bub1B und PLK-1 zeigen in allen drei Gewebetypen ein vergleichbares, sehr starkes Expressionsmuster. Bei isolierter Betrachtung des Expressionsprofiles von PLK-1 in Lymphknoten- und Normalgewebe, zeigte sich jedoch eine leicht verminderte Expression im Lymphknoten im Vergleich zum korrespondierenden Normalgewebe. Jedoch ist hier auf die deutlich reduzierte Fallzahl (N=12) zu achten. Für STK15, ki67, EGFR und pAKT lag eine signifikant Überexpression sowohl in Tumor- wie auch in Lymphknotengewebe verglichen mit dem Normalgewebe vor. Bei p53 war diese nachgewiesen Überexpression in Tumorgewebe signifikant höher als im korrespondierenden Lymphknoten. Im Vergleich zum Normalgewebe war p-p42/44MAPK und PTEN in Tumor und Lymphknoten deutlich vermindert exprimiert. Jedoch zeigte sich bei der Untersuchung des p-p42/44MAPK-Status im Vergleich Tumorgewebe mit Lymphknotengewebe eine signifikant vermehrt Expression im Tumorgewebe. In beiden Geweben lag der Expressionsstatus jedoch deutlich unter dem des Normalgewebes. 77 Marker Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin-D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 p-p42/44MAPK pAKT PTEN Mediane des Expressions-Score Tumor Normalgewebe 3,72 5,13 2,95 3,76 6,36 6,00 1,16 1,18 4,00 1,29 3,71 1,95 5,87 4,97 5,50 2,71 0,00 0,00 2,44 6,28 2,95 1,36 3,47 6,11 p-Wert 0,006 0,146 0,359 0,863 0,000 0,002 0,000 0,000 1,000 0,000 0,003 0,000 Tabelle 18: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Tumor- und Normalgewebe Marker Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin-D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 p-p42/44MAPK pAKT PTEN Mediane des Expressions-Score Lymphknoten Normalgewebe 0,55 5,73 2,92 3,00 5,82 5,82 0,69 1,38 3,73 1,20 2,45 1,23 5,85 4,69 5,82 1,45 0,00 0,00 0,21 5,71 3,85 0,92 0,90 6,40 p-Wert 0,020 0,018 1,000 0,359 0,003 0,115 0,004 0,006 1,000 0,001 0,045 0,007 Tabelle 19: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Lymphknoten- und Normalgewebe 78 Marker Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin-D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 p-p42/44MAPK pAKT PTEN Mediane des ExpressionsScore Tumor Lymphknoten 2,16 0,56 1,89 1,89 6,26 5,35 1,19 0,46 4,57 3,73 3,72 2,76 6,12 6,00 5,50 5,45 0,00 0,00 2,62 0,19 2,30 3,36 2,25 1,21 p-Wert 0,020 0,970 0,067 0,101 0,110 0,032 0,471 0,732 1,000 0,002 0,160 0,092 Tabelle 20: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Tumor- und Lymphknotengewebe Eine graphische Darstellung der Verteilung des Expressionsscores der jeweiligen Marker in Tumor- und Normalgewebe mit zugehörigen Medianen ist in den Abbildungen 1 bis 11 im Anhang dargestellt. 4.3.2 Korrelationsanalyse Des Weiteren wurde mit Hilfe der Spearman-Correlations-Analyse für alle Marker die jeweiligen Expressionsprofile bivariant miteinander korreliert. Dabei zeigten sich für etliche Marker Korrelationen innerhalb des eigenen Funktionsbereiches, aber auch mit Markern des jeweils anderen Funktionsbereiches. In fast allen Fällen zeigte sich ein eher schwacher, jedoch statistisch signifikanter Korrelationskoeffizient. Der am stärksten ausgeprägte Koeffizient lag für PLK-1/ Survivin bei 0,531. Bis auf die Korrelation zwischen p53 und Survivin, welche negativ ausfiel, zeigten sich ausschließlich positive Korrelationskoeffizienten. Die meisten Korrelationen ergaben sich für die Marker; PLK-1, Bub1B und pAKT, mit jeweils 7 Korrelationen mit unterschiedlichen Markern. Dies war gefolgt von PTEN und Survivin, für die jeweils 6 Korrelationen mit anderen Markern 79 nachgewiesen werden konnten. Lediglich für STK15 lag keine Korrelation mit einem anderen Marker vor. ERBB2 konnte auf Grund der fehlenden Proteinexpression nicht mit anderen Markern korreliert werden. Survivin PLK-1 Bub1B cyclinD1 STK15 Survivin Survivin PLK-1 Bub1B PLK-1 Bub1B p53 ki67 EGFR ERBB2 Survivin pAKT PTEN Survivin Survivin Survivin PLK-1 PLK-1 Bub1B pMAPK Bub1B PLK-1 Bub1B cyclinD1 cyclinD1 PLK-1 PLK-1 Bub1B Bub1B cyclinD1 cyclinD1 p53 ki67 pAKT pAKT pMAPK pMAPK PTEN 6 pAkT ki67 pAKT pAKT pAKT pAKT pMAPK PTEN PTEN EGFR EGFR 7 7 PTEN 4 0 1 2 2 PTEN PTEN 4 7 Tabelle 21: Übersicht der jeweiligen Marker-Korrelationen (Korrelations-Analyse nach Spearman) Eine Übersicht der jeweiligen Markerkorrelationen gibt die Tabelle 21. Eine detaillierte Ansicht inklusive Korrelationskoeffizienten gibt die Tabelle 3 im Anhang (KorrelationsAnalyse nach Spearman). Eine graphische Darstellung aller Markerkombinationen mit einer Signifikanz (p-Wert < 0,05) zeigen die dreidimensionale Streudiagramme in Abbildung 12 im Anhang. Des Weiteren wurden jeweils das Raucherverhalten sowie der Alkoholkonsum mit dem jeweiligen Expressionsstatus der unterschiedlichen Marker im Tumorgewebe korreliert. Dabei ergab sich für den EGFR, als einzigen Marker eine statistisch signifikante Korrelation für beide klinischen Variablen. Bezüglich des Alkoholkonsumes zeigte sich eine positive Korrelation, bezüglich des Rauchstatus eine negative Korrelation. D.h. unter den Patienten mit einem deutlich erhöhten EGFR-Score fanden sich statistisch relevant mehr Patienten, die einen regelmäßigen Alkoholkonsum angaben, welcher jedoch nicht genauer spezifiziert wurde. Zusätzlich konnten bei ansteigendem EGFR-Score eine zunehmende Anzahl an Nichtraucher nachgewiesen werden. 80 pMAPK 6 Survivin PLK-1 Bub1B cyclin D1 STK15 p53 ki67 pAKT p-p42/44MAPK pTEN EGFR ERBB2 Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Korrelationskoeffizient Sig. (2-seitig) N Alkoholkonsum Raucherstatus ,038 ,087 ,729 ,386 86 101 ,037 -,105 ,735 ,292 87 103 -,056 -,047 ,613 ,641 85 101 ,078 -,124 ,481 ,219 84 100 -,019 -,100 ,847 ,269 108 125 -,107 ,034 ,329 ,732 85 101 ,205 ,039 ,063 ,700 83 99 -,008 ,043 ,941 ,668 88 103 ,132 ,005 ,234 ,963 83 99 ,171 ,025 ,104 ,800 91 107 ,257* -,206* ,014 ,035 90 105 . . . . 88 98 Tabelle 22: Spearman-Korrelation zwischen Alkoholkonsum/ Raucherverhalten und allen untersuchten Marker. * Die Korrelation ist auf dem 0,05 Niveau signifikant (zweiseitig) ** Die Korrelation ist auf dem 0,01 Niveau signifikant (zweiseitig) 81 Abbildung 23: Korrelation: EGFR-Status in Tumorgewebe mit Alkoholkonsum Abbildung 24: Korrelation: EGFR-Status in Tumorgewebe mit Raucherstatus 82 4.3.3 Vier-Felder-Tafeln Weitere Zusammenhänge zwischen Markerexpression und klinischen Daten wurden durch Vier-Felder-Tafeln mittels Chi-Quadrat-Test, sowie bei geringerer Fallzahl mittels exaktem Test nach Fisher ermittelt. Dabei wurde das Markerexpressionsprofil in HNSCCs mit den klinischen Daten aus unserem Patientenkollektiv verglichen. Das mediane Follow-up für die Erhebung der Daten betrug ca. 13,3 Jahre. Als klinische Kategorien wurden die TKlassifikation, die Lymphknotenmetastasierung (N-Klassifikation bei Erstdiagnose), die Fernmetastasierung im Krankheitsverlauf, die Rezidivrate, sowie die Rate an Zweitkarzinomen gewählt. Zusätzlich wurde der Expressionsstatus der Marker in Lymphknotengewebe mit der N-Klassifikation bei Erstdiagnose verglichen. Dafür wurden die Gewebe (Tumor oder Lymphknoten) jeweils in 2 Kategorien unterteilt; „positiv“ und „negativ“. Der cut-off Wert für diese Einteilung wurde, wie oben beschrieben bei 2 gewählt. Eine Übersicht über die statistisch signifikanten Ergebnisse gibt die Tabelle 23. Insgesamt ergaben sich für Survivin und PLK-1 die meisten Korrelationen mit klinischen Daten, jeweils für 3 Kategorien (T-Klassifikation, N-Klassifikation und Fernmetastasierung). Gefolgt wurde das Ergebnis von cyclin D1 welches eine signifikante Korrelation mit 2 klinischen Kategorien zeigte, der Rezidivrate sowie der Rate an Zweitkarzinomen. Die pAKT-Expression korrelierte signifikante mit der Rate an Fernmetastasen, während die p-p42/44MAPK-Expression mit der N-Klassifikation korrelierte. Bezüglich des Expressions-Status in Lymphknoten und der N-Klassifikation konnte kein Marker eine statistisch signifikante Aussage machen. Jedoch zeigte sich ein positiver Trend für den Marker PLK-1. 83 Marker in HNSCCs Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 pMAPK pAKT PTEN Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markern und klinischen Daten FernRezidiv ZweitT-Klassifi- Lymphknotenkarzinome kation metastasierung metastasierung p-Werte 0,006 0,033 1 0,845 0,511 0,13 1 0,375 cq cq ef cq cq cq ef ef 0,239 cq 0,394 cq 0,616 cq p-Werte 0,012 0,056 1 0,711 0,117 0,75 0,62 0,366 p-Werte 0,005 0,016 1 0,279 0,711 0,196 0,456 1 cq cq ef cq cq cq ef ef 0,001 cq 0,934 cq 1 ef cq cq ef cq ef cq ef ef p-Werte 0,961 0,455 1 0,025 1 0,863 1 1 0,313 cq 0,022 cq 0,46 cq cq cq ef cq ef cq ef ef p-Werte 0,766 0,772 0,382 0,001 0,565 0,453 0,226 1 0,875 cq 0,871 cq 0,256 cq Tabelle 23: Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markerexpression in HNSCCs und klinischen Daten mittels ChiQuadrat-Test oder exaktem Test nach Fisher (cq: Chi-Quadrat-Test; ef: exakter Test nach Fisher) Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markern und klinischen Daten Marker in Lymphknoten Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 pMAPK pAKT PTEN Lymphknotenmetastasierung p-Werte 0,542 0,068 1 0,603 0,302 0,188 1 1 1 0,47 0,29 0,559 ef ef ef ef ef ef ef ef ef ef cq ef Tabelle 24: Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markerexpression in Lymphknoten und klinischen Daten mittels Chi-Quadrat-Test oder exaktem Test nach Fisher (cq: ChiQuadrat-Test; ef: exakter Test nach Fisher) 84 Cq Cq Ef Cq Ef Cq Ef Ef 0,433 Cq 0,192 Cq 0,969 Cq T-Klassifikation Für die Betrachtung der klinischen Variable „T-Klassifikation“ wurde diese in der Vier-FelderTafel vereinfacht dargestellt und in 2 Kategorien aufgeteilt. Eine Kategorie beinhaltete die niedrigen T-Klassifikationen T1 und T2 (25 + 66 Fälle¸ insgesamt 51%) die andere die höheren T-Klassifikationen T3 und T4 (48 + 41 Fälle, insgesamt 49%). Die Marker Survivin und PLK-1 zeigten einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen Expressions-Status und TKlassifikation. Unter den HNSCCs mit niedriger T-Klassifikation zeigten signifikant mehr Tumoren eine Survivin oder PLK-1 Expression. Während unter den HNSCCs mit fehlender Survivin- oder PLK-1 Expression statistisch signifikant mehr Tumoren eine fortgeschrittenes T-Klassifikation aufwiesen. Tabelle 25: Kreuztabellen: Survivin Expression vs. T-Klassifikation. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. T-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,006 85 Tabelle 26: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. T-Klassifikation Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. TKlassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,033 N-Klassifikation Auch hier wurde zur genaueren Beurteilung des Zusammenhanges zwischen Lymphknotenmetastasierung bei Erstdiagnose (N-Klassifikation) und Proteinexpression die klinische Variable „N-Klassifikation“ vereinfacht. Die N-Klassifikation wurde in N+ und N0 unterteilt. Dabei wurde ein positiver Nachweis von Tumorzellen im Lymphknotengewebe, egal welche N-Klassifikation (N1, 2, 3) als N+ gewertet und ein fehlenden Nachweis von Tumorzellen im Lymphknoten als N0 gewertet. In unserem Kollektiv wurden bei Diagnosestellung insgesamt 86 Patienten als N+ (47%) und 94 Patienten als N0 (55%) eingestuft. Bezüglich dieses klinischen Merkmales konnten mit Expressionsprofilen von 2 Markern, Survivin und p-p42/44MAPK, ein signifikanter Zusammenhang hergestellt werden. Bei PLK-1 86 lässt sich eine Assoziation, wenn auch knapp keine statistisch signifikante Korrelation (pWert 0,056) nachweisen. Ein inverser Zusammenhang besteht für alle 3 Marker, sowohl für Survivin und pp42/44MAPK, wie auch für PLK-1. Unter den HNSCC mit einem Expressionsnachweis von Survivin oder p-p42/44MAPK finden sich signifikant mehr Patienten ohne lymphatische Metastasierung. Während HNSCCs ohne Expressionsnachweis eines der beiden Proteine signifikant häufiger Lymphknotenmetastasen bei Erstdiagnose aufwiesen. Für PLK-1 konnten die gleiche Beobachtung gemacht werden, im Chi-Quadrat-Test war dies jedoch gerade nicht mehr im Signifikanzniveau (p-Wert: 0,056). Tabelle 27: Kreuztabellen: Survivin-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,012 87 Tabelle 28: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Stadium der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,056 88 Tabelle 29: Kreuztabellen: p-p42/44MAPK-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,001 Fernmetastasierung Auch war eine signifikante Aussage bezüglich des Zusammenhanges zwischen der Fernmetastasierungsrate und dem Expressionsprofil der beiden zellzyklusregulierenden Marker Survivin und PLK-1 möglich. Aus dem Bereich der Signaltransduktionsmarker zeigte das Expressionsverhalten von pAKT in HNSCCs einen signifikanten Zusammenhang mit der Rate an Fernmetastasen. Zum Zeitpunkt der Erstellung des Patientenkollektives wurden alle Patienten bezüglich der Fernmetastasierung als cM0 klassifiziert, da cM1 als Ausschlusskriterium für die Studie gesehen wurde. Während des Follow-ups von 13,3 Jahren entwickelten 27 Patienten (15%) Fernmetastasen. 89 So zeigten die verwendeten Testverfahren für alle drei Marker, dass unter den wenigen Patienten unseres Kollektives, die während des Follow-ups an einer Fernmetastase erkrankten signifikant mehr Patienten keinen Nachweis für einen der drei immunhistochemischen Marker hatten. Patienten ohne Fernmetastasen waren in der ICH häufiger signifikant positiv für Survivin und PLK-1. Für den pAKT-Expressions-Status ergab sich innerhalb der Gruppe von Patienten mit einer weiterhin bestehenden M0-Klassifkation keine eindeutige Differenzierung. Tabelle 30: Kreuztabellen: Survivin-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf ExpressionsStatus bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,005 90 Tabelle 31: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,016 91 Tabelle 32: Kreuztabellen: pAKT-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,022 Rezidivrate Bei der Analyse des Zusammenhanges zwischen Rezidivrate und Markerprofil konnte cyclin D1 sein Potenzial als Prognosemarker beweisen. Während unserer Beobachtungszeit von 13,3 Jahren erkrankten 31 Patienten (17,4%) an einem Tumorrezidiv. Unter diesen Patienten wurden signifikant mehr Patienten/HNSCCs gefunden, welche eine Proteinexpression für cyclin D1 aufwiesen. Unter den Patienten, die während des Follow-ups kein Rezidiv erlitten, waren signifikant mehr Tumorproben ohne immunhistochemischen Proteinnachweis. 92 Tabelle 33: Kreuztabellen: cyclin D1-Expression vs. Rezidivrate. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Rezidiv-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,025 Rate an Zweitkarzinomen Zuletzt wurde noch überprüft, ob es einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der Rate an Zweitkarzinomen im Bereich des Aerodigestivtraktes und einer Markerexpression geben könnte. In unserem Kollektiv erkrankten 40 Patienten (22,5%) an solch einem Zweitkarzinom. Es zeigte sich, dass in dieser Gruppe von Patienten signifikant seltener ein positiver Expressionsnachweis für cyclin D1 gefunden werden konnte. Ein umgekehrter Schluss, nämlich dass Patienten mit fehlender cyclin D1 Expression signifikant häufiger an einem Zweitkarzinom erkranken, war nicht möglich. 93 Tabelle 34: Kreuztabellen: cyclin D1-Expression vs. Zweitkarzinomrate im Aerodigestivtrakt. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Zweitkarzinom-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,001 4.3.4 Überlebenskurven Kaplan-Meier-Analysen Um die einzelnen Marker bezüglich ihres prognostischen Wertes bezogen auf das Gesamtüberleben zu überprüfen führten wir Kaplan-Meier-Analysen und Log Rank Tests durch. Dazu verwendeten wir ebenfalls innerhalb des Expressions-Scores einen cut-off Wert von 2. Alle Fälle die einen Score ≥ 2 hatten, wurden einheitlich als positiv gewertet, dabei erfolgte keine genauere Differenzierung zwischen stark und schwach positiv. Der Expressionsstatus wurde im Tumorgewebe erhoben. 94 Unter den Markern der Zellzyklusregulation konnte sich Survivin als Prognosemarker beweisen. Für die Patienten/ HNSCCs mit einer nachgewiesen Survivin-Überexpression ergab sich ein statistisch signifikant besseres Gesamtüberleben, im Vergleich zu denjenigen mit fehlendem Expressionsnachweis. Für cyclin D1 (p-Wert: 0,065) sowie für p53 (p-Wert: 0,079) zeichnete sich ein positiver Trend ab. Dabei zeigten jeweils die Patienten mit einer nachgewiesenen Expression des jeweiligen Proteins ein tendenziell besseres Gesamtüberleben, wenn auch nicht statistisch signifikant. Aus dem Bereich der Marker für Signaltransduktion zeigte sich pAKT als signifikanter Prognosemarker. Auch hier ergab sich für Patienten mit einer Überexpression des Proteins ein signifikant besseres Überleben, als für Patienten ohne Expressionsnachweis. Für ERBB2 konnte erneut auf Grund der fehlenden Expression keine Analyse durchgeführt werden. Marker Survivin PLK-1 Bub-1B cyclin-D1 STK15 p53 ki67 EGFR ERBB2 p-p42/44MAPK pAKT PTEN Log-Rank Test p-Wert 0,025 0,183 0,618 0,065 0,301 0,079 0,526 0,43 0,259 0,023 0,272 Tabelle 35: p-Werte des Log-Rank Test, Überlebensanalysen der einzelnen Marker 95 Abbildung 25: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der Survivin-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,025 Abbildung 26: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der pAKT-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,023 96 Abbildung 27: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der cyclin D1-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,065 Abbildung 28: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der p53-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,079 97 Cox-Regressions-Modell Desweiteren führten wir zur Verifizierung der Ergebnisse der Kaplan-Meier-Analysen und zur weiteren Beurteilung Multivariant-Analysen in Form von Cox-Regressions-Modellen (vorwärts WALD) durch. Eine wichtige Fragestellung war, ob ggf. Markerkombinationen ein gleich gutes oder sogar besseres Prognosepotenzial haben als Einzelmarker. Dabei wurden die Marker erneut innerhalb ihrer Funktionsbereiche getestet. Lediglich STK15 wurde zusätzlich auch in die Analyse der Signaltransduktionsmarker aufgenommen, da in der Literatur Hinweise für eine EGFR vermittelte STK15 Aktivierung beschrieben sind (Hung, Tseng et al. 2008) (Lai, Tseng et al. 2010) und man sich somit eine Kopplung der Expressionsprofile von STK15 und EGFR oder dessen nachgeschalteten Signaltransduktionsproteine vorstellen könnte. Survivin, der einzige signifikante Überlebens-Prognosemarker aus dem Bereich der Zellzyklusregulation konnte sich in der Multivariant-Analyse nicht durchsetzten. Jedoch zeichnete sich die Markerkombination von cyclinD1 und p53 als signifikante Prognosemarker bezüglich des Gesamtüberlebens ab. In den Kaplan-Meier-Analysen lag für diese beiden Einzelmarker hingegen lediglich ein positiver Trend jedoch keine Signifikanz bezüglich ihres Prognosepotenziales vor. Die Patienten mit einer cyclin D1 oder einer p53 Überexpression hatten tendenziell ein besseres Gesamtüberleben, wie die Patienten ohne Expressionsnachweis. pAKT, als einziger Marker unter den Signaltransduktionsproteinen, der in der Überlebensanalyse der Einzelmarker ein signifikantes Ergebnis erbrachte, konnte sich auch im Cox-Regressions-Modell beweisen. Es ergaben sich keine Hinweise für weitere Marker oder Markerkombinationen, die ein positives Gesamtüberlebens hatten. 98 Prognosepotenzial bezüglich des Auswertung der Fallverarbeitung des Modells der zellzyklusregulierenden Marker N Für Analyse verfügbare Fälle Nicht verwendete Fälle Ereignis 50 Prozent 27,8% Zensiert 42 23,3% Insgesamt 92 51,1% Fälle mit fehlenden Werten 88 48,9% Fälle mit negativer Zeit 0 ,0% Zensierte Fälle vor dem frühesten Ereignis in einer Schicht 0 ,0% 88 48,9% 180 100,0% a Insgesamt Insgesamt a. Abhängige Variable: Überlebenszeit Anfangsblock; Variablen nicht in der Gleichunga STK15 Score ,264 df 1 Signifikanz ,608 Survivin ,949 1 ,330 plk-1 2,463 1 ,117 cyclin D1 3,238 1 ,072 ,215 1 ,643 p53 3,943 1 ,047 ki67 ,179 1 ,672 Bub1B a. Chi-Quadrat-Residuen= 12,074 bei 7 df Sig. = ,098 Block 1: Methode = Vorwärts schrittweise (Wald) Omnibus-Tests der Modellkoeffizientenc Schritt Änderung aus Änderung aus vorangegangenem vorangegangenem Schritt Block ChiChiSignifikanz Quadrat df Signifikanz Quadrat df Signifikanz ,047 3,742 1 ,053 3,742 1 ,053 Gesamt (Wert) a 1 b 2 -2 LogLikelihood 413,034 Chi-Quadrat 3,943 df 1 408,704 8,024 2 ,018 4,331 1 ,037 a. Variable(n) eingegeben in Schritt Nr. 1: p53 b. Variable(n) eingegeben in Schritt Nr. 2: cyclin D1 c. Beginnen mit Block-Nr. 1. Methode = Vorwärts schrittweise (Wald) Variablen in der Gleichung Schritt 1 p53 B -,558 SE ,285 Wald 3,844 df 1 Signifikanz ,050 Exp(B) ,572 Schritt 2 cyclin D1 -,676 ,343 3,871 1 ,049 ,509 p53 -,622 ,286 4,730 1 ,030 ,537 99 8,073 2 ,018 Variablen nicht in der Gleichunga,b Schritt 1 Schritt 2 Score ,105 df 1 Signifikanz ,745 Survivin 1,692 1 ,193 plk-1 3,169 1 ,075 cyclin D1 STK15 4,016 1 ,045 Bub1B ,059 1 ,807 ki67 STK15 ,000 ,335 1 1 ,985 ,563 Survivin 1,637 1 ,201 plk-1 1,617 1 ,204 Bub1B ,176 1 ,675 ki67 ,068 1 ,795 a. Chi-Quadrat-Residuen= 8,390 bei 6 df Sig. = ,211 b. Chi-Quadrat-Residuen= 4,102 bei 5 df Sig. = ,535 Tabelle 36: COX-Regressionsmodel; Methode vorwärts schrittweise (WALD) der zellzyklusregulierenden Marker Auswertung der Fallverarbeitung des Modelles der Signaltrasduktionsmarker plus STK15 N Für Analyse verfügbare Fälle Ereignis 57 Prozent 31,7% Zensiert 48 26,7% 105 58,3% 75 41,7% Fälle mit negativer Zeit 0 ,0% Zensierte Fälle vor dem frühesten Ereignis in einer Schicht Insgesamt 0 ,0% a Insgesamt Nicht verwendete Fälle Fälle mit fehlenden Werten Insgesamt 75 41,7% 180 100,0% a. Abhängige Variable: Überlebenszeit Anfangsblock: Variablen nicht in der Gleichunga STK15 Score ,696 1 Signifikanz 0,404 pAKT 4,352 1 0,037 pMAPK df ,483 1 0,487 pTEN 1,839 1 0,175 EGFR 1,269 1 0,260 a. Chi-Quadrat-Residuen= 8,625 bei 5 df Sig. =0 ,125 100 Block 1: Methode = Vorwärts schrittweise (Wald); Omnibus-Tests der Modellkoeffizientenb Schritt Änderung aus Änderung aus vorangegangenem Schritt vorangegangenem Block ChiChiSignifikanz Quadrat df Signifikanz Quadrat df Signifikanz 0,037 4,428 1 0,035 4,428 1 0,035 Gesamt (Wert) pAKT* -2 LogLikelihood 487,448 Chi-Quadrat 4,352 df 1 * Variable(n) eingegeben in Schritt Nr. 1: pAKT b. Beginnen mit Block-Nr. 1. Methode = Vorwärts schrittweise (Wald) Variablen in der Gleichung Schritt 1 pAKT B SE -,572 ,278 Wald 4,237 df 1 Signifikanz 0,040 Exp(B) ,564 Variablen nicht in der Gleichunga Score 1,318 df 1 Signifikanz 0,251 pMAPK ,082 1 0,775 pTEN ,305 1 0,581 EGFR 1,617 1 0,204 Schritt 1 STK15 a. Chi-Quadrat-Residuen= 3,981 bei 4 df Sig. = 0,409 Tabelle 37: COX-Regressionsmodel; Methode vorwärts schrittweise (WALD) der Signaltransduktionsmarker + STK15 5 Diskussion 5.1 Einleitung Trotz der starken Bemühungen in Forschung und Klinik hat sich die Prognose des HNSCC in den letzten Jahren nur wenig geändert (Boehm, Wichmann et al. 2010). Weiterhin scheinen die wichtigsten Faktoren zur Prognoseeinschätzung bis auf wenige Ausnahmen (z.B. HPVStatus bei Oropharynxtumoren (Hennessey PT, Westra WH et al. 2009) (Rischin D, Young RJ et al. 2010)) die TNM-Klassifikation und die histologische Differenzierung des Tumors zu sein (Lehnerdt G, Hoffmann TK et al. 2010). Auch konnte im Voraus bisher nur wenig Aussage über das Therapieansprechen von RCTX gemacht werden. Somit profitiert nur ein bestimmter Anteil von Patienten von dieser Behandlung, während aber alle Patienten den unerwünschten Nebenwirkungen und ggf. Komplikationen ausgesetzt sind. 101 Die letzten Jahre der Forschung zeigten, dass vor allem die Verschiedenartigkeit von Patient und Tumor eine wichtige Rolle bei der Prognoseeinschätzung und Therapiewahl spielen könnte. In der Therapie unterschiedlicher Tumorentitäten ist versucht worden, an Hand von erweiterten Kriterien wie Alter, Vorhandensein von Biomarkern etc. den individuellen Therapieerfolg vorauszusagen (Le Tourneau and Siu 2008). Bei Magen- und kolorektalen Karzinomen wird dies schon im klinischen Alltag umgesetzt. Der Mutationsstatus des KRAS-Gens (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Gen) wird vor Beginn der Therapie mit monoklonalen Antikörpern (z.B. Cetuximab) überprüft, nur bei Vorliegen des KRAS-Wildtyps kann von einem Nutzen der CetuximabTherapie ausgegangen werden (Saridaki, Georgoulias et al. 2010). Ähnliches gilt für den Rezeptorstatus bei Brustkrebs: Immunhistochemisch wird die Expression der Östrogen-, Progesteron- und ERBB2-Rezeptoren überprüft. Bei einer nachgewiesenen Überexpression wird mit Antikörpern therapiert, die gegen diese Rezeptoren gerichtet sind, wie z.B. Trastuzumab gegen den ERBB2 (Paik S, Kim C et al. 2008). Weitere Beispiele sind c-Kit Mutationen bei gastrointestinalen Stroma Tumoren (GIST) und die BCR-ABL-Translokation bei der chronisch myeloischen Leukämie (CML), die prädiktiv für den Therapieerfolg mit Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib sind (Ganjoo KN and S. 2011) (Pavlovsky C, Kantarjian H et al. 2009). Für HNSCC Patienten ist bisher der EGFR-Antikörper Cetuximab im Sinne einer „targeted therapy“ zugelassen. Die Forschung ist weiterhin sehr bemüht in diesem, wie auch in anderen Bereichen Biomarker zu finden und zu entwickeln, die bei HNSCC Patienten eine bessere Prognoseeinschätzung des Krankheitsverlaufes und damit ggf. eine Therapieindiviualisierung zulassen. 5.2 Stand der wissenschaftlichen Forschung Es gibt zahlreiche Publikationen zu einzelnen Biomarkern (siehe Einleitung), die zeigen konnten, dass es durchaus sinnvoll ist, weitere Bemühungen in die Suche nach 102 Prognosemarkern bei HNSCCs zu stecken. Sowohl Marker aus dem Bereich des Zellzyklus, des Wachstumssignalweges, sowie Matrix Metalloproteinasen und Marker für LOH (loss of heterocygosity), wie z.B fragil histidine triad gen (FHIT) konnten in unterschiedlichen Arbeiten ihr Potenzial als prognostische Biomarker zeigen (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Bisher wurde nach unserem Stand des Wissens jedoch weder auf DNA noch auf Proteinebene ein Prognosefaktor identifiziert, der in Studien mit großen Patientenkollektiven ein eindeutig signifikantes reproduzierbares Ergebnis zeigte, so dass dies im klinischen Alltag umgesetzt werden könnte. 5.2.1 Micro-Array-Technologie Mit der Entwicklung der Micro-Array-Technologie ist es möglich, mit nur sehr geringer Materialmenge viele Einzelnachweise zu erhalten. Somit ist es deutlich einfacher mehrere Marker parallel an den geforderten großen Patientenkollektiven zu untersuchen. Mittels dieser „Gen-/ Biochips“ (Micro-Arrays) können Breitspektrum-Genexpressionsmuster oder Proteinmuster untersucht werden, um einen genaueren Einblick in die Tumorgenese zu bekommen (Lehnerdt G, Hoffmann TK et al. 2010). Damit können tumorrelevante Gene bzw. Proteine identifiziert werden. 5.2.2 Genexpressionsprofil Affymetrix GeneChip arrays In mehreren Studien wurde das Genexpressionsprofil von HNSCC mit Normalgewebe mittels Affymetrix GeneChip Arrays verglichen. So konnte z.B. die Arbeitsgruppe um Kronberg mehr als 400 Gene identifizieren, die bei allen untersuchten Tumoren (8 Tumorproben) ein verändertes Genexpressionsprofil aufwiesen, jedoch in den jeweiligen Kontrollgeweben (Plattenepithel) nicht (Kornberg, Villaret et al. 2005). Die Arbeitsgruppe um Ginos identifizierte sogar 2890 Gene, deren Expressionsmuster sich deutlich von dem des Normalgewebes unterschied. Viele der Gene sind an der Regulation von entzündlichen und immunologischen Prozessen, an epithelialer Differenzierung, an Zelladhäsion und extrazellulärer Matrixfunktion beteiligt (Ginos, Page et al. 2004). 103 Dieses Verfahren kann jedoch als Screeningverfahren nur einer ersten Einschätzung dienen. Es erlaubt keine Aussage über die oben schon erwähnte so wichtige individuelle Einschätzung des Patienten- und Tumorprofiles. Dazu werden weitere Studien benötigt, die Tumoren untereinander vergleichen, wie dies z.B. die Arbeitsgruppe um Chang versuchte. An einem Kollektiv von 60 Patienten ist es ihnen gelungen HNSCCs in 4 Subtypen mit unterschiedlichem Genprofil einzuteilen. Unter all den Tumoren mit einem immunhistochemischen Nachweis für EGFR, gelang eine Differenzierung bezüglich des Aktivierungsstatus des EGFR auf DNA-Ebene. Diese 4 Subtypen unterschieden sich bezüglich dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Rezidivfreiheit (Chung, Parker et al. 2004). 5.2.3 Proteinexpressionsprofil MALDI-TOF-MS/ SELDI-TOF-MS Durch die Entwicklung der matrix assisted LASER desorption ionisation time of flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und die weiter entwickelte surface-enhanced-laserdesorption/ionisation-time-of-flight-Massenspektrometrie (SELDI-TOF-MS) scheint auch auf Proteinebene eine Breitspektrum-Analyse möglich (Lehnerdt G, Hoffmann TK et al. 2010). Das zweitgenannte Verfahren ist vor allem auch im Bereich von kleinen Molekülen anwendbar und damit ein großer Zugewinn. Da lediglich kleine Probenmengen (Gewebe oder Serum) nötig sind, erscheint dies ein hocheffizientes Verfahren. Mehrere Arbeitsgruppen haben damit vergleichende Untersuchungen zwischen HNSCC und Normalgewebe (Wadsworth, Somers et al. 2004) (Gourin, Xia et al. 2006) (Roesch-Ely, Nees et al. 2007), wie auch zwischen HNSCCs untereinander (Gourin, Moretz et al. 2007) (Freed, Cazares et al. 2008) durchgeführt. Dabei wurden unterschiedliche anatomische Tumorlokalisationen, Tumorstadien und unterschiedlichen Therapiestadien der HNSCCPatienten untersucht. Mittels dieser Methoden konnte mit einer Sensitivität von 82% und einer Spezifität von 76% zwischen Tumor und Nichttumor differenziert und die Lokalisation (oral, oropharyngeal und laryngeal) zugeordnet werden (Gourin, Xia et al. 2006). Des Weiteren konnte für fortgeschrittene Tumoren ein anderes Proteinprofil detektiert werden als für weniger fortgeschrittene Tumore, ebenfalls konnte recht zuverlässig zwischen präund posttherapeutischen Stadium unterschieden werden (Gourin, Moretz et al. 2007). 104 Somit könnte eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens einerseits als Screening-Methode eingesetzt werden, um in einem Frühstadium ohne klinische Symptome bereits HNSCCs zu erkennen. Andererseits könnte es dazu dienen an großen Patientenkollektiven Biomarkern zu entwickeln, die der individuellen Risiko- und Prognoseeinschätzung der Patienten dienen. Sicherlich sind diesbezüglich noch weitere Studien nötig, um die ersten sehr erfolgsversprechenden Ansatzpunkte weiter zu entwickeln. Immunhistochemie Eine schon deutlich länger bestehende Methode auf Proteinebene ist die Immunhistochemie. Auf diesem Gebiet wurden schon viele Versuche unternommen, wie nach dem Vorbild des Mammakarzinomes neue Biomarker für Prognose und Therapieansprechen zu finden. Mit der Entwicklung der Tissue-Micro-Array-Technologie ist es auch mit diesem Verfahren möglich größere Patientenkollektive zu untersuchen. Da es sich um eine eher einfache und kostengünstige Methode handelt, ist sie nach wie vor für den klinischen Alltag sehr gut geeignet (Lehnerdt G, Hoffmann TK et al. 2010). Bisher wurden meistens einzelne Proteine herausgegriffen und auf ihr Expressionsmuster hin untersucht. Dabei sind die Marker p53 und ki67, sowie der EGFR, die am meisten untersuchtesten Proteine in HNSCCs. Gerade der EGFR, der vor allem in Hinblick auf Therapiemöglichkeiten detailliert untersucht wurde, scheint zu den vielversprechendsten Markern zu gehören. Auch zu den in unserer Arbeit untersuchten Proteinen aus Zellzykluskontrolle und EGFRvermittelte Signaltrasduktion gab es einige vielversprechende Arbeiten, die zum Teil schon in der Einleitung erwähnt wurden. Jedoch konnte sich nach unserem Stand des Wissens keines der einzelnen Proteine allein als Biomarker in großen randomisierten Studien beweisen. Daher wurde begonnen, ähnlich wie in den beiden oben erwähnten Verfahren nach Markerkombinationen zu suchen, wobei in der Immunhistochemie gezielte Markerkombinationen abgefragt werden müssen. Die Arbeitsgruppe um van den Broek untersucht an einer Gruppe von HNSCC Patienten mit primärer RCTX 18 Biomarker aus den Bereichen Zellzyklusregulation (cyclin D1, cortactin, RB, p27, p21, p16), Apoptosesteuerung (p53, Transformation related protein 73 (p73), 105 MDM2), Hypoxie (Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1α), carbonic anhydrase 9 (CA9)) und Sensibilität für CTX (Xeroderma pigmentosum group A-complementing protein (XPA), multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2), multidrug resistance protein 1 (MDR1)). Dabei wurden die einzelnen Proteine untersucht und zusätzlich nach signifikanten Korrelationen zwischen allen Markern untereinander und in den jeweiligen funktionsspezifischen Bereichen gesucht. Keine Gruppe von Markern, im Vergleich zu den jeweiligen Einzelmarkern konnte eine signifikante Korrelation bezüglich des Gesamtüberlebens liefern. Lediglich die Profil-Gruppe aus p16, p21, und p27 konnte eine signifikante Assoziation mit einer besseren Ansprechrate auf RCTX in Form von einer besseren lokalen Tumorkontrolle zeigen (van den Broek, Wildeman et al. 2009). Dahingegen konnte die Arbeitsgruppe um Buffa das durchaus positive Potenzial von Markerprofilen zur Einschätzung des individuellen Risikoprofils der HNSCC Patienten zeigen. Im Speziellen konnte hier eine Korrelation zwischen Markern und der Ansprechrate auf RTX gezeigt werden. An einem Patientenkollektiv von 402 Patienten, die mit kontinuierlicher hyperfraktionierter akzellerierter Radiotherapie (CHART) oder konventioneller fraktionierter RTX behandelt wurden, untersuchte die Arbeitsgruppe mittels Immunhistochemie unterschiedliche Marker. Es wurden die einzelnen Expressionsprofile von ki67, p53, cyclin D1, Bcl-2, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM-1/ CD31) ermittelt und am Computer mit Hilfe eines hierarchischen Cluster-Algorhythmus acht unterschiedliche Cluster-Gruppen gefunden. Dabei konnten 3 unterschiedliche Expressionsmuster von Markerkombinationen (3 Cluster) bestimmten klinischen Phänotypen zugeordnet werden. Diese Phänotypen unterschieden sich in der Ansprechrate auf RTX. Die erste Markerkombination ist durch eine verminderte Expression von p53 und Bcl-2, jedoch eine hohe und inhomogene Expression von ki67 charakterisiert. Sie korreliert mit einem schlechteren Ansprechen auf CHART. Die zweite Subgruppe zeichnet sich ebenfalls durch eine verminderte Expression von p53 und Bcl-2 aus, zeigt jedoch ein deutlich geordneteres jedoch sehr wenig ausgeprägtes Färbemuster von ki67. Sie ist mit einem guten Ansprechen auf CHART assoziiert. Das Charakteristikum der dritten Gruppe ist eine hohe Expression von Bcl-2. Tumoren dieser Gruppe scheinen sowohl ein besseres Ansprechen auf CHART und konventionelle fraktionierte RTX zu haben. cyclin D1 und CD 31 zeigten keine signifikanten 106 Unterschiede zwischen den acht unterschiedlichen Clustern und konnten damit als profilgebende Marker nicht verwendet werden. (Buffa, Bentzen et al. 2004) Diese Ergebnisse müssen sicherlich noch weiter überprüft und eventuell mit genetischen Profilen kombiniert werden. Aber insgesamt lässt dies hoffen, dass solche Ergebnisse irgendwann auch auf Untersuchungen anderer klinischer Variablen in HNSCCs übertragbar sind und damit eine individuellere Einstufung der HNSCC Patienten und deren Prognose und somit eine individuellere Wahl des Therapieverfahren möglich wäre. Weitere immunhistochemische Markeranalysen bei HNSCC in ähnlichem Umfang sind uns nicht bekannt. Ein Zusammenhang zwischen zwei Markern konnte aber für Marker mehrerer Bereiche gezeigt werden (Khan, Tiwari et al. 2009) (Yang, Xiong et al. 2009) (Fischer CA, Jung M et al. 2011) (Masuda M, Suzui M et al. 2002) (O-charoenrat, Rhys-Evans et al. 2002). Jedoch fehlt häufig ein eindeutiger Nachweis, dass die Markerkombinationen eine höhere Korrelation zu klinischen Daten zeigen und damit eine bessere Prognoseeinschätzung erlauben, als ein Einzelnachweis, wie dies die Arbeitsgruppe um Fabi bei metastasiertem Mammakarzinom unter Trastuzumab Therapie umsetzen und zeigen konnte: Eine Überexpression von PTEN korreliert positiv mit einem längeren progressionsfreien Überleben. Darüber hinaus geht eine Co-Expression von PTEN und pAKT mit einem signifikant längeren progressionsfreien Überleben einher verglichen mit dem Rest aller Patienten und damit auch verglichen mit denjenigen Patienten, die nur für ein Protein eine Überexpression aufweisen (Fabi, Metro et al. 2010). 5.3 Einordnung der eigenen Arbeit Wie bereits erwähnt gelangen schon etliche Publikationen bei denen das durchaus positive Potenzial von einzelnen Proteinen als Biomarker gezeigt werden konnte. Am meisten wurde der EGFR, sowie p53 und ki67 beforscht. Jedoch konnte sich keiner dieser Marker bisher in großen prospektiven Studien als eindeutig signifikanter Prognosemarker behaupten. Daher untersuchten wir in unserer Arbeit jeweils erneut einzelne Proteine auf ihre Eigenschaft als Prognosemarker. Desweiteren korrelierten wir diese mit unterschiedlichen klinischen Variablen, um ggf. mehr über das Risikoprofil dieser HNSCC Patienten sagen zu können. Wir 107 legten aber auch großen Wert auf die Untersuchung von Korrelationen der einzelnen Marker untereinander. Dabei war für uns die Fragestellung besonders wichtig, ob Markerkombinationen vielleicht einen besseren prognostischen Wert haben als Einzelmarker. Insgesamt wurden in unserer Arbeit 12 Proteine gewählt, die nach der aktuellen Literatur als für die Karzinogenese relevant eingeschätzt wurden. Es handelte sich um 7 Proteine aus dem Bereich des Zellzyklus, und 5 Proteine aus dem Bereich der Signaltrasduktion des EGFR und dessen nachfolgenden Elementen. Dabei war uns wichtig Proteine zu wählen, die an unterschiedlichen Checkpoints des Zellzyklus agieren. Besonders erschien uns STK15 als vielversprechend, da wissenschaftliche Arbeiten für STK15 alleine eine Korrelation mit Tumorprogression, Lymphknotenmetastasen und kürzerem Überleben zeigen konnten (Reiter, Gais et al. 2006). Des Weiteren konnte eine gehäufte CoExpression zwischen STK15 und EGFR in kolorektalen Tumoren nachgewiesen werden (Lai, Tseng et al. 2010). Damit könnte eine mögliche Verbindung zu dem zweiten von uns gewählten Funktionsbereich, der Signaltrasduktion bestehen. Hier wurde der EGFR selbst, wie auch Proteine aus zwei seiner wichtigsten nachfolgenden Signalkaskaden gewählt (pp42/44MAPK und pAKT, sowie PTEN als negativer Regulator des Signalweges). Durch den großen Pool an Markern konnten diese bezüglich Korrelationen mit klinischen Daten und Prognosewerten einzeln betrachtet werden, aber auch innerhalb ihres Funktionsbereiches (Zellzyklus oder Signaltrasduktion) und darüber hinaus, auf eine mögliche Verbindung zwischen den beiden Bereichen untersucht werden. Als qualitatives Verfahren wurde die Immunhistochemie an Micro-Arrays durchgeführt, wohl mit dem Bewusstsein, dass dieses Verfahren einige Einschränkungen hat und keine quantitativen Aussagen machen kann. Des Weiteren wird es häufig als subjektives Verfahren eingeschätzt, welches bis zu einem gewissen Teil befunderabhängig ist. Dem versuchten wir jedoch zu entgegnen, indem die Färbungen von 2 unabhängigen Untersuchern bewertet wurden. Zusätzlich wurde bei der statistischen Auswertung die mittels Score - fein differenzierte immunhistochemische Auswertung zum Teil nicht direkt 108 berücksichtigt. Vielmehr wurde ein cut-off Wert gewählt, welcher die Färbung in „nicht positiv“ und „positiv“ einteilte. Mit Hilfe der Tissue-Micro-Array-Technologie war es möglich ein großes Kollektiv (180 Patienten) an relativ wenig Material zu untersuchen. Pro Markerfärbung konnten alle 180 Fälle parallel bearbeitet werden. Somit war es möglich die gleichen IHC-Färbebedingungen für alle Fälle zu schaffen. Durch die Möglichkeit eines direkten Vergleiches der einzelnen Fälle auf einem Objektträger verbesserte dies die Auswertbedingungen. 5.4 Erwartungen an die Ergebnisse Die Erwartungen an unsere Untersuchung waren folgende: • An Hand eines großen Patientenkollektives sollten Markerkorrelationen zwischen Einzelmarkern in HNSCC untersucht werden, um eine Co-Expression von Proteinen erkennen zu können. • Des Weiteren sollten die einzelnen Proteine in Bezug auf eine Korrelation mit klinischen Daten und Überlebensdaten untersucht werden. Dadurch sollte ggf. ein spezifisches Risikoprofil einzelnen Biomarkern und damit einzelnen Subgruppen von HNSCC zugeordnet werden können. Zusätzlich sollten diejenigen Marker identifiziert werden, welche ein Prognosepotenzial bezüglich des Gesamtüberlebens in HNSCC haben. • Dies sollte die Grundlage für die Untersuchung von Markerkombinationen bilden. Idealerweise zeigen sich dabei Markerkombinationen, die eine bessere Prognoseeinschätzung im Vergleich zu den jeweiligen Einzelmarker zulassen. 5.5 Vergleich der Erwartungen mit den Ergebnissen Um einen Überblick über die Expressionsprofile der einzelnen Proteine und deren Verbindung untereinander zu erhalten, führten wir einen Wilcoxon-Mann-Whitney-Test und eine Spearman-Correlations-Analyse durch. In der Correlations-Analyse zeichneten sich für etliche Marker sowohl signifikante Korrelationen mit Markern innerhalb des eigenen 109 Funktionsbereiches, wie auch mit Markern aus dem jeweils anderen Bereich ab. Insgesamt fielen diese Korrelationen (siehe Tabelle 3 im Anhang) zwar signifikant, aber bezüglich ihres Korrelationskoeffizienten eher schwach aus. Bis auf die negative Korrelation zwischen p53 und Survivin waren alle übrigen signifikanten Korrelationskoeffizienten positiv. In einer Studie an Prostatakarzinomen konnte ebenfalls eine inverse Korrelation der Proteinexpression von Survivin und p53 nachgewiesen werden. Allerdings handelte es sich dabei um den p53 Wildtyp (Shao, Liu et al. 2010). Ein immunhistochemischer Nachweis dieser negativen Korrelation gelang ebenfalls einer Arbeitsgruppe an Basalzellkarzinomen der Haut (Adamkov, Halasova et al. 2011). Weitere Studien konnten die These, dass Survivin negativ von p53 (Wildtyp) reguliert wird, bekräftigen. In unterschiedlichen Arbeiten zeigte sich eine vermehrte Survivin-Expression bei gleichzeitigem Vorliegen einer p53-Mutation und eine verminderte Expression bei Vorliegen des Wildtypes (Nakano, Huang et al. 2005) (Hoffman, Biade et al. 2002) (Yang, Xiong et al. 2009). In unserer Arbeit, die rein immunhistochemisch ausgerichtet ist, wurden keine genaueren Untersuchungen bezüglich des Mutationsstatus von p53 durchgeführt. Lediglich für STK15 als einzigen Marker ergab sich bezüglich keines anderen Markers eine nachweisbare signifikante Korrelation. Speziell die in der Literatur beschriebenen CoExpression zwischen STK15 und EGFR konnten nicht bestätigt werden (Lai, Tseng et al. 2010). In der Beurteilung der jeweiligen Einzelmarker bezüglich Prognoserelevanz und Zuordnung zu klinischen Charakteristika konnte Folgendes gezeigt werden. Unsere Ergebnisse sollen hier den Ergebnissen der uns bekannten aktuellen wissenschaftlichen Forschung gegenübergestellt werden. 5.5.1 Survivin Insgesamt konnte im Vergleich zu Normalgewebe keine vermehrte Expression von Survivin im Tumorgewebe oder Lymphknotengewebe nachgewiesen werden. Ein Vergleich zwischen Tumorgewebe und korrespondierendem Lymphknotengewebe zeigte eine höhere Detektierbarkeit von Survivin im Tumor. 110 Jedoch zeigte sich in unserer Arbeit eine positive Korrelation zwischen Survivin und Gesamtüberleben. Wobei eine positive immunhistochemische Färbung im Tumorgewebe mit einem besseren Gesamtüberleben einhergeht. Des Weiteren konnte eine Reihe von Assoziationen zu klinischen Daten nachgewiesen werden. Unter den T1/T2 Tumoren waren signifikant mehr HNSCCs mit einer positiven Survivin-Expression. Unter den T3/T4 Tumoren waren signifikant mehr HNSCCs mit fehlender Survivin-Expression. In dieser Gruppe von HNSCCs mit fehlender SurvivinExpression konnte weiterhin eine statistisch signifikante Assoziation mit einer fortgeschrittenen Tumorerkrankung, in Form von Lymphknoten- sowie Fernmetastasen nachgewiesen werden. Diese Korrelationen untermauern das Ergebnis der Kaplan-MeierAnalyse, welches eine kürzere Gesamtüberlebenszeit für Patienten mit HNSCCs ohne immunhistochemischen Survivin-Nachweis besagt. Die für uns in sich schlüssigen Ergebnisse konnten in der Literatur nicht bestätigt werden. In einer Arbeit an Larynxkarzinomen konnte zum einen eine signifikante Überexpression von Survivin in Tumoren im Vergleich zu Normalgewebe nachgewiesen werden. Zum anderen zeigte sich eine positive Korrelation bezüglich Überexpression und kürzerem Gesamtüberleben. Die positiv detektierten Tumoren zeigten des Weiteren eine Assoziation zu vermehrten Lymphknotenmetastasen und höheren T-Stadien (Kim, Kim et al. 2010). Lediglich eine Überexpression von Survivin in oralen Plattenepithelkarzinomen (OSCC) im Vergleich zu Normalgewebe, jedoch keine Assoziation zu klinisch-pathologischen Patientendaten konnte die Arbeitsgruppe um Khan nachweisen (Khan, Tiwari et al. 2009). Allgemein anerkannt ist die anti-apoptotische Funktion von Survivin. Aus diesem Grund werden Tumoren mit einer Survivin-Überexpression ein aggressiveres Wachstum und ein schlechtes Ansprechen auf RCTX zugesprochen. Diese Beobachtung wird von den oben genannten Studien aus der aktuellen Literatur bestätigt. Des Weiteren konnte in der Literatur gezeigt werden, dass eine Überexpression von Survivin signifikant häufiger in Tumoren mit gleichzeitig nachgewiesener p53-Mutation vorkommt (Nakano, Huang et al. 2005) (Yang, Xiong et al. 2009), während Tumore mit Wildtyp-p53 eine verminderte Expression von Survivin zeigen. Auf Grund der aktuellen Forschung geht 111 man von einer negativen Regulierung von Survivin durch p53 aus. Survivin wird als einer der wenigen identifizierten Apoptose-Effektoren von p53 gesehen (Shao, Liu et al. 2010) (Nakano, Huang et al. 2005) (Hoffman, Biade et al. 2002) (Yang, Xiong et al. 2009). In unserer Arbeit besteht, wie oben bereits erwähnt eine inverse Korrelation zwischen den beiden Proteinen in Form von einer verminderten Survivin- bei gleichzeitig gesteigerten p53 Expression. Zudem hat Survivin als Teil des CPC weitere Aufgaben innerhalb der Zellzykluskontrolle. Das Wegfallen dieser Aufgaben, als Kontrollpunkt für eine korrekte Kern- bzw. Zellteilung könnte zu einem gesteigerten fehlerhaften Durchlauf des Zellzyklus und damit zur gesteigerten Tumorprogression führen. Dies könnte ein mögliches Erklärungsmodell für die Ergebnisse unserer Arbeit sein, da diejenigen Tumoren ohne Survivin-Nachweis mit einer schlechteren Prognose und einer zunehmenden Tumorprogression assoziiert sind, als die mit einem Survivin-Nachweis. 5.5.2 PLK-1 PLK-1, welches ebenfalls zu den zellzyklusregulierenden Proteinen gehört, zeigt in unsere Arbeit kein eindeutiges Potenzial als Prognosemarker. Insgesamt lässt sich das Protein sehr stark und v.a. in allen drei untersuchten Geweben sehr gleichmäßig verteilt nachweisen. Es besteht kein Hinweis für eine Überexpression in Tumoren im Vergleich zu normalen Plattenepithel. Zwar ergaben sich Assoziationen zwischen dem Expressionsmuster und klinischen Daten (TKlassifikation und Metastasierung), jedoch zeigt sich kein signifikanter Zusammenhang bezüglich des Gesamtüberlebens. Auch bleibt die Bedeutung der vorhandenen Korrelationen mit klinischen Daten in Kenntnis der aktuellen Literatur unklar. In unserer Arbeit zeigt sich eine positive Korrelation zwischen fortgeschrittener TKlassifikation (T3, T4) und fehlendem PLK-1-Expressionsnachweis. Dagegen war unter all den HNSCCs die als T1 oder T2 Tumor klassifiziert wurden eine PLK-1-Überexpression statistisch signifikant häufiger nachzuweisen. Ebenso zeigt sich für die lymphatische Metastasierungsrate ein positiver Trend, wenn auch statistisch nicht signifikant (p-Wert: 0,056) und für die Rate an Fernmetastasen ein signifikanter Zusammenhang bezüglich der 112 Proteinexpression. Auch hier scheint unter den HNSCCs, die als N0 oder M0 klassifizert wurden, häufiger eine PLK-1-Expression nachweisbar zu sein. Die wenigen Patienten mit einer Fernmetastase sind signifikant häufiger in der Gruppe ohne immunhistochemische Proteinfärbung zu finden, während unter den HNSCCs mit nachgewiesen Proteinexpression mehr Patienten als N0 (p-Wert: 0,056), bzw. mehr Patienten als M0 (p-Wert: 0,016) klassifiziert wurden. Alle Ergebnisse sprechen für eine fortgeschrittene Tumorprogression bei Patienten mit negativem PLK-1 Status. Andere Arbeiten konnten allgemein in HNSCCs (Knecht, Oberhauser et al. 2000) und speziell in Nasopharynxkarzinomen, wie auch in anderen soliden Tumoren eine Überexpression des Proteins im Vergleich zu Normalgewebe nachweisen. Im Widerspruch zu unseren Ergebnissen zeigen Arbeiten aus dem HNO-Bereich einen signifikanten Zusammenhang zwischen PLK-1-Überexpression und schlechterer Prognose (kürzerem Gesamtüberleben und kürzerer rezidivfreier Zeit) (Shi, Alajez et al. 2010) (Takai, Hamanaka et al. 2005). Diese Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen sprechen eher für die Hypothese, welche PLK-1 als wichtiges potenzielles Protooncogen sieht, das im Rahmen der Tumorgenese zu einem aggressiven und schnellen Tumorwachstum führen könnte. Wobei noch nicht eindeutig geklärt ist, ob eine Überexpression von PLK-1 ursächlich für die Tumorgenese und nicht als Folge derer zu bewerten ist (Eckerdt, Yuan et al. 2005). 5.5.3 Bub1B Bub1B, welches in seiner Aufgabe innerhalb des Spindelcheckpoints als Art Gegenspieler von PLK-1 aufgefasst werden kann, konnte sich in unsere Arbeit nicht als Prognosemarker beweisen. In diesem Studienkollektiv wurde keine Assoziation zwischen Bub1B-Expression und klinisch-/pathologischen Charakteristika gefunden. Insgesamt konnte Bub1B immunhistochemisch in ausgeprägter Intensität in allen drei untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Die in der Literatur beschriebene Überexpression von Bub1B in OSCC und dysplastischen oralen Läsionen verglichen mit Normalgewebe war in unsere Arbeit an HNSCCs nicht nachweisbar (Lira, Miranda et al. 2010) (Hsieh, Chen et al. 2010). In der Literatur sind die Ergebnisse bezüglich HNSCCs widersprüchlich: Es wurde eine signifikante Korrelation von Bub1B-Überexpression sowohl 113 mit längerem als auch kürzerem Gesamtüberleben beschrieben (Hannisdal, Burum-Auensen et al. 2010) (Lira, Miranda et al. 2010). Insgesamt gibt es nach unserem Kenntnisstand wenige Arbeiten, die sich mit dem Expressionsstatus von Bub1B in Tumoren des Kopf-/ Halsbereiches beschäftigen, jedoch gibt es durchaus eine Reihe von Arbeiten im Bereich anderer Tumorentitäten, wie z.B. Urothelkarzinom, Mammakarzinom, Pankreaskarzinom, Magenkarzinom (Yamamoto, Matsuyama et al. 2007) (Yuan, Xu et al. 2006) (Gladhaug, Westgaard et al. 2010). Auch hier konnte jedoch kein homogenes Ergebnis bezüglich Korrelationen zwischen Expressionsmuster und klinischen Daten gezeigt werden. Ausgehend von der Funktion von Bub1B als Teil des Spindelcheckpointes müsste man eigentlich im Rahmen der Tumorgenese einen Verlust seiner Kontrollfunktion und damit ein uneingeschränktes Fortschreiten im Zellzyklus erwarten. Dies würde zu ungehinderter Zellproliferation und damit zu Tumorprogression führen. Dieser Verlust der Kontrollfunktion könnte entweder mit einem Untergang des Proteins (Expressionsverlust) oder eben mit einer Akkumulation einer mutierten und damit fehlerhaften Form von Bub1B einhergehen (Überexpression). 5.5.4 STK15 Wir konnten, wie in der Literatur für HNSCCs und diverse andere solide Tumoren beschrieben, eine Überexpression von STK15 in Tumorgewebe im Vergleich zu Normalgewebe nachweisen (Mazumdar, Henderson et al. 2009) (Tanaka, Hashimoto et al. 2005) (Zhang, Wang et al. 2009) (Ogawa, Takenaka et al. 2008). Es zeigten sich jedoch keinerlei Korrelationen zu klinischen Daten des Patietenkollektives. Auch konnte eine positive Assoziation zwischen Proteinüberexpression und schlechterem Gesamtüberleben in unserer Arbeit nicht bestätigt werden. Dies steht im Widerspruch zu den Daten der Arbeitsgruppe um Reiter, die als erste mit zwei unterschiedlichen Nachweisverfahren (PCR und IHC) eine signifikante Korrelation zwischen STK15Überexpression und einem kürzeren rezidivfreien sowie Gesamtüberleben in ihrer Arbeit zeigen konnten. Zusätzlich bestand eine Assoziation zu einer gesteigerten Metastasierungsrate (Lymphknotenmetastasen sowie Fernmetastasen). Für die anderen klinischen Daten ergaben sich keine signifikanten Korrelationen (Reiter, Gais et al. 2006). 114 Auch zeigte sich in unserer Arbeit keine Korrelation zwischen STK15 und EGFR, wie dies in kolorektalen Karzinomen beschrieben wurde (Lai, Tseng et al. 2010). Die Erforschung von STK15 als möglichen Prognosemarker ist noch sehr jung. Es gibt im Vergleich zu anderen, mittlerweile sehr genau untersuchten Markern wie z.B. EGFR, ki67 und p53 noch zu wenig Arbeiten, um sich eine eindeutige Meinung bilden zu können. Aus diesem Grund sind sicherlich noch weitere Untersuchungen nötig um das Prognosepotenzial dieses Markers genauer einschätzen zu können. 5.5.5 ki67 ki67 als bereits ausgiebig beforschter Marker für Zelllproliferation wurde in unserer Arbeit ebenfalls untersucht. Dabei zeigte sich eine signifikant vermehrte ki67-Expression in Tumoren im Vergleich zum jeweiligen Normalgewebe. Diese Überexpression war auch in den korrespondierenden Lymphknoten vorhanden. Im normalen Plattenepithel hingegen war die Expression weniger ausgeprägt und zeigte sich hier vor allem in den basalen Zellreihen. Dies entspricht der aktuellen Literatur (Liu and Klein-Szanto 2000) (Hong, Laskin et al. 1995). Wobei in OSCC eine zunehmende Expression von ki67 mit zunehmender Tumortransformation von normaler Mucosa über dyplastische Veränderungen bis hin zu OSCC gezeigt werden konnte (Torres-Rendon, Roy et al. 2009) (Iamaroon, Khemaleelakul et al. 2004) (Montebugnoli, Felicetti et al. 2008). Weitere Assoziationen zu klinischpathologischen Daten und Überlebensdaten ergaben sich in unserer Arbeit nicht. In der Literatur wird die Frage, ob ki67 oder andere Proliferationsmarker in HNSCCs eine prognostische Relevanz haben können, kontrovers diskutiert (Homma, Furuta et al. 2001) (Lavertu, Adelstein et al. 2001) (Ashraf, Maghbul et al. 2010) (Sittel, Ruiz et al. 1999) (Roland, Caslin et al. 1994) (Spafford, Koeppe et al. 1996). Die Bewertung der Daten ist erschwert durch die mangelnde Vergleichbarkeit der Studien auf Grund der unterschiedlichen Patientenkollektive bezüglich Lokalisation, Therapie, Therapiestadium usw. 115 5.5.6 cyclin D1 In dieser Arbeit konnte im Gegensatz zu unseren Erwartungen keine Überexpression von cyclin D1 im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Es zeigte sich eine homogene Verteilung der positiv gefärbten Zellen in allen drei untersuchten Geweben. Ein positiver Trend, wenn auch keine statistische Signifikanz (p-Wert: 0,065) zeigte sich bezüglich des Gesamtüberlebens. Bei Patienten/ HNSCCs mit einer positiven Proteinexpression zeigte sich ein Trend zu einem insgesamt besseren Gesamtüberleben, als bei denjenigen Patienten ohne nachweisbare Proteinexpression. Dem gegenüber steht jedoch eine statistisch signifikante Assoziation zwischen cyclin D1-Überexpression und gesteigerter Rate von Tumorrezidiven. Unter den Patienten mit Tumorrezidiv ist eine cyclin D1-Überexpression statistisch signifikant häufiger. Dazu passend haben Patienten ohne Rezidiv auch signifikant häufiger keinen cyclin D1-Proteinnachweis. Dieses Ergebnis passt nicht zu dem in der Kaplan-Meier-Analyse beschriebenen positiven Trend eines besseren Gesamtüberlebens bei positivem Proteinnachweis. Nur schwerlich ist sich vorzustellen, dass HNSCC-Patienten mit Tumorrezidiv auch gleichzeitig ein besseres Gesamtüberleben haben. Abseits dessen konnte für Patienten mit Zweitkarzinomen signifikant häufiger ein Fehlen einer cyclin D1-Expression nachgewiesen werden. Vergleicht man nun unsere Ergebnisse mit denen der aktuellen Literatur, so wird der Zusammenhang zwischen Rezidivrate und cyclin D1-Expressionsnachweis bestätigt. Allgemein wird eine Überexpression von cyclin D1 in HNSCC im Vergleich zu normalem Plattenepithel beschrieben. Zusätzlich scheint diese mit einer schlechteren Prognose assoziiert zu sein. Die Arbeitsgruppe um Higuchi untersuchte mittels IHC ebenfalls cyclin D1 und p16 in HNSCCs, welche mit RCTX behandelt wurden. In dieser Arbeit zeigte sich ein Zusammenhang zwischen Proteinüberexpression und schlechterer Prognose (Higuchi, Oridate et al. 2007). Eine Überexpression von cyclin D1 war in einer anderen Studie an OSCC, welche mit konventioneller oder hyperfraktionierter RTX behandelt wurden, mit einer stärkeren Tumorprogression unter hyperfraktionierter RTX und einem schlechteren Gesamtüberleben assoziiert (Jayasurya, Francis et al. 2004). Auch für chirurgisch behandelte Patienten mit einem Zungenkarzinom beschrieb die Arbeitsgruppe um Bova eine Assoziation zwischen Überexpression von cyclin D1 und Tumorprogression in Form von einem kürzeren 116 rezidivfreien- und Gesamtüberleben (Bova, Quinn et al. 1999). Ein ähnliches Ergebnis konnte 1997 die Arbeitsgruppe um Michalides zeigen. An einem Kollektiv von 115 HNSCCs zeigten diejenigen Tumoren mit einer nachweisbaren Überexpression eine schlechtere Prognose (früheres Tumorrezidiv) als die ohne (Michalides, van Veelen et al. 1997). Diese Ergebnisse sind gut vereinbar mit der Theorie, dass durch eine Überexpression von cyclin D1 eine Checkpoint-Funktion im Zellzyklus wegfällt und dies somit die Tumorprogression begünstigt. Diese Theorie wird durch Ergebnisse weiterer Studien gestützt welche z.B. an Hand eines großen Patientenkollektivs (547 Patienten) eine Assoziation zwischen cyclin D1-Überexpression und fortgeschrittenem Tumorstadium (UICC IV) in HNSCCs zeigen konnten (Freier, Bosch et al. 2003). Des Weiteren konnte auch eine signifikante Assoziation zu einer fortgeschrittenen T-Klassifikation und vermehrtem Auftreten von Lymphknotenmetastasen gezeigt werden (Krecicki, Smigiel et al. 2004) (Fu, Ma et al. 2008). Bei all den Arbeiten, die das Potenzial von cyclin D1 als Prognosemarker bestärken, sollen hier noch die Studien erwähnt werden, die keinen Nachweis für cyclin D1 als Prognosefaktor liefern konnten (Vielba, Bilbao et al. 2003) (Kunz, Bosch et al. 2003). In Anbetracht der sehr unterschiedlichen Ergebnisse bleibt die Forschung um cyclin D1 weiterhin ein sehr heterogenes Feld, welches wohl noch weitere Bemühungen benötigt, um einen eindeutigen Trend zu erkennen. 5.5.7 p53 Einer der meist untersuchtesten Marker ist p53. Im Rahmen einer Vielzahl an wissenschaftlichen Arbeiten konnte in diversen Tumorentitäten unterschiedliche Mutationen von TP53, sowie eine Überexpression von p53 nachgewiesen werden. Auch in unserer Arbeit konnte für HNSCCs und entsprechende Lymphknoten eine vermehrte Expression dieses Proteins im Vergleich zu normalen Plattenepithel nachgewiesen werden. Für das in der Literatur oft so kontrovers diskutierte Potenzial von p53 als Prognosemarker konnten auch hier keine eindeutigen Hinweise gefunden werden. In der Betrachtung von p53 als Einzelmarker zeigt sich in der Überlebensanalyse lediglich ein positiver Trend. Demnach scheinen Patienten mit p53-Überexpression ein besseres Gesamtüberleben zu 117 haben. In der Kombination mit cyclin D1 hingegen zeigt sich p53 im Cox-Regressions-Model als signifikanter Prognosemarker. Bezüglich anderen klinisch-pathologischen Daten der Patienten ergaben sich keine signifikanten Assoziationen. Kämpft man sich durch all die Arbeiten, die sich auf genetischer oder Protein-Ebene mit p53 und dessen Potenzial als Biomarker beschäftigen, so kann aktuell noch keine klare Aussage getroffen werden (Thomas, Nadiminti et al. 2005) (Nylander, Dabelsteen et al. 2000). Nach vielen Jahren wissenschaftlicher Arbeit und Fortschritt ist das Feld weiterhin sehr heterogen und weitläufig. Selbst wenn man es auf bestimmte Tumorlokalisationen, Therapieverfahren oder Nachweisverfahren eingrenzt, erhält man kontroverse Ergebnisse. Das erfolgversprechendste Potenzial von p53 als Prognosemarker konnte in HNSCCs im Bereich des Larynx nachgewiesen werden. Eine Überexpression des Proteins war dort signifikant mit einem schlechteren Überleben assoziiert (Nylander, Dabelsteen et al. 2000). Des Weiteren konnte durch eine genaue örtliche Differenzierung der p53 positiv gefärbten Zellen (basal, suprabasal) ein erster Ansatzpunkt für eine Unterscheidung zwischen milden und schweren dysplastischen Veränderung im Kopf-Halsbereich gemacht werden (Nylander, Dabelsteen et al. 2000). Natürlich wurde die Frage nach der Ursache für dieses kaum fassbare Feld an uneinheitlichen Ergebnissen schon viele Male gestellt. Die Arbeitgruppe um Thomas beschreibt in ihrer Publikation v.a. Laborfehler und ihre falsche Interpretation als mögliche Ursache. So scheint eine Fehlerquelle zu sein, dass in vielen immunhistochemischen Arbeiten mit Antikörpern gearbeitet wird, die den p53 Wildtyp, sowie mutierte Formen färben. An sich wurde lange Zeit davon ausgegangen, dass auf Grund der kurzen Halbwertszeit von p53 die Wildtyp-Form immunhistochemisch nicht detektierbar ist. Tatsächlich scheint es aber abgesehen von einer Mutation auch andere Gründe, zu geben, die für eine längere Halbwertszeit von p53 verantwortlich sind. Das Prinzip immunhistochemisch sichtbares „p53“ ist gleich „TP53-Mutation“ scheint damit nicht eindeutig zu gelten (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Und noch viel weniger lässt sich dem zufolge von einer Überexpression auf eine exakte TP53 Mutation schließen, da es auch Mutationen gibt, die zu keiner Aktivierung und damit 118 Überexpression von p53 führen (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Sicherlich werden noch weiter Untersuchungen zur Identifikation der einzelnen Mutationen und deren Relevanz in der Tumorgenese und in der Proteinexpression nötig sein. Damit bleibt die Frage nach dem Potenzial von p53 als prognostischer Biomarker weiterhin offen (Thomas, Nadiminti et al. 2005) (Homma, Furuta et al. 2001) (Nylander, Dabelsteen et al. 2000). 5.5.8 EGFR Der EGFR zählt zu den sehr gut erforschten Proteinen. Er gilt sowohl als einer der erfolgversprechendsten Biomarker auf Proteinebene, wie auch als das erfolgversprechendste Ziel der „targeted therapy“ in HNSCCs. Die in der Literatur fast einheitlich beschriebene EGFR-Überexpression in HNSCCs (38%92%) im Vergleich zu normalem Plattenepithel konnte auch in dieser Arbeit bestätigt werden. Des Weiteren zeigt sich auch eine vermehrte Detektierbarkeit des EGFR in den korrespondierenden Lymphknoten. Jedoch ergaben sich im Gegensatz zu unseren Erwartungen und den Ergebnissen der aktuellen Literatur keine signifikanten Korrelationen mit Überlebensdaten. Bezüglich einer Korrelation zwischen EGRF-Expressionstatus und weiteren klinischpathologischen Daten, zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen Rauchverhalten bzw. Alkoholkonsum und EGFR-Expression. Beides zählt zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung von HNSCCs. Während sich unter den Patienten mit zunehmendem EGFRExpressionsscore signifikant häufiger Patienten fanden, die einen regelmäßigen Alkoholkonsum angaben, zeigte sich eine negative Korrelation bezüglich des Rauchverhaltens. Unter den Patienten mit einer deutlichen Überexpression von EGFR waren signifikant häufiger Nichtraucher zu finden. Insgesamt muss aber berücksichtigt werden, dass in dem untersuchten Patientenkollektiv mehr als die Hälfte aller Patienten Raucher bzw. regelmäßige „Trinker“ (60% bzw. 50%) sind. In der Literatur ist eine durch kanzerogene Stoffe des Tabaks ausgelöste Beeinflussung unterschiedlicher Gene/Proteine (z.B. p53, p16, Cyclooxigenase 2 (Cox-2) und Prostaglandin2 (PEG2)) beschrieben (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Eine durch Rauchen 119 ausgelöste mögliche Beeinflussung des EGFR wurde wohl bisher am ausgedehntesten an Lungenkarzinomen untersucht. Dabei scheinen Bestandteile des Tabakrauches zu einer Aktivierung des EGFR mit anschließendem perinukleärem Nachweis zu führen (Khan, Lanir et al. 2008). Studien konnten in NSCLC einen Zusammenhang zwischen EGFR-Mutationsrate und klinisch-pathologischen Daten belegen. Bei Nicht-Rauchern, Frauen und in Adenokarzinomen der Lunge war die Mutationsrate im Vergleich zum untersuchten Gesamtkollektiv (NSCLC) signifikant höher. Zusätzlich ist dies mit einer besseren Ansprechrate auf Tyrosinkinase-Inhibitoren assoziiert. Diese Aktivierungs-Mutationen wurden in HNSCCs jedoch deutlich seltener gefunden (Wu, Zhong et al. 2007) (Hirsch, Varella-Garcia et al. 2005). Des Weiteren sei hier eine Studie von 1998 erwähnt, die in HNSCC keinen Zusammenhang zwischen Alkohol-/ Tabakkonsum und EGFR-Überexpression darstellen konnte (van Oijen, Rijksen et al. 1998). In Anbetracht der uns bekannten Literatur sind aus den vorliegenden Ergebnissen noch keine konkreten Folgerungen zu schließen. Sieht man die Beobachtungen dieser Arbeit als Ansatzpunkt für weitere kombinierte Untersuchung auf Gen- und Proteinebene, könnte man ähnlich wie bei NSCLC eine HNSCCPatientengruppe definieren, die ggf. mehr von einer Tyrosinkinase-Inhibitor-Therapie profitieren würde als andere. Bezüglich der anderen klinischen Merkmale wie T-Klassifkation, Rezidivraten und Metastasierungsrate bestand kein Zusammenhang. Auch wenn es einige Studien gibt (Frank JL, Garb JL et al. 1993) (Ulanovski D, Stern Y et al. 2004), die mittels IHC oder Westernblot unser Ergebnis unterstützen, so zeigt sich im überwiegenden Teil der Literatur eine signifikante Assoziation zwischen EGFR-Überexpression und schlechterer Prognose, in Form von einem gehäuften Auftreten von Lymphknotenmetastasen und einem kürzeren rezidivfreien- sowie kürzerem Gesamtüberleben (Maurizi, Almadori et al. 1996) (Putti TC, To KF et al. 2002) (Temam S, Kawaguchi H et al. 2007). Des Weiteren konnte eine Korrelation zwischen Überexpression und vermindertem Therapieansprechen auf RCTX beschrieben werden (Milas L 2004). Dies könnte eine Möglichkeit sein, um das Ansprechen auf Therapie z.B. mit Tyrosinkinaseinhibitoren vorherzusagen und Therapieversager von vorneherein auszufiltern (Thomas, Nadiminti et al. 2005). 120 In Phase II und III Studien konnte eine Kombination von Anti-EGFR-Therapie plus RCTX oder plus CTX alleine erste vielversprechende Ergebnisse bei Patienten mit fortgeschrittenem HNSCC zeigen (Bonner, Harari et al. 2010) (Greenhalgh, Bagust et al. 2009). Die Arbeitsgruppe um Bonner konnte z.B. eine Verdopplung der medianen Überlebenszeit bei Patienten mit erweiterter Therapie (RTX + Anti-EGFR-AK) im Gegensatz zu alleiniger RTX zeigen (Bonner, Harari et al. 2006) (Bonner, Harari et al. 2010), so dass Cetuximab als Monotherapie bei metastasiertem fortgeschrittenem HNSCC und als adjuvante Therapie bei lokal fortgeschrittenem HNSCC zugelassen wurde. In einer Metaanalyse von 15 Studien, die das Therapieansprechen von HNSCC Patienten auf Cetuximab + CTX versus CTX allein verglich, konnte jedoch die ersten positiven Ergebnisse nicht bestätigt werden. Zwar konnte eine verbesserte Ansprechrate, jedoch kein signifikant verbessertes Gesamtüberleben durch die Kombinationstherapie gezeigt werden (Reeves, Hill et al. 2011). Ein vergleichbares Ergebnis veröffentlichte die Arbeitsgruppe um Burtness (Burtness B, Goldwasser MA et al. 2005). Der erste große Enthusiasmus bezüglich des bahnbrechenden Therapieerfolges der spezifischen EGRF-Immuntherapie in diversen Tumorentitäten scheint bereits etwas gebremst worden zu sein. Zunehmend stellt sich eine Resistenz gegen diese Art der Immuntherapie dar, die genauen Mechanismen sind jedoch nur teilweise verstanden (Kruser and Wheeler 2010) (Brand, Iida et al. 2011). Auch scheint noch nicht klar zu sein, in wie weit der EGFR-Status mit einem Therapieansprechen korreliert (Yamatodani T, Ekblad L et al. 2009) (Burtness B, Goldwasser MA et al. 2005) (Niu G, Sun X et al. 2010). Es werden sicherlich noch weitere Studien benötigt, um diesen Therapieansatz noch effizienter klinisch umsetzen zu können. Aber nicht nur die Ausbildung von Resistenz sondern auch das Zusammenspiel der unterschiedlichen Komponenten der Signaltransduktion scheint für den noch nicht völlig zufriedenstellenden Erfolg der Therapieoption mitverantwortlich zu sein. Da der EGFR in ein großes Netzwerk an unterschiedlichen Pfaden eingebettet ist, kann man sich nur schwer vorstellen, dass die Blockierung einer einzelnen Substanz zum gewünschten Erfolg führt. Die aktuelle Forschung 121 beschäftigt sich vor allem mit den unterschiedlichen Komponenten, deren Interaktion und Rolle in der Tumorgenese. 5.5.9 ERBB2 In dieser Arbeit wurde der ERBB2 Rezeptor als weiterer Vertreter der EGFR-Familie und als favorisierter Dimerisierungspartner des EGFR untersucht. Jedoch konnten im Gegensatz zur aktuellen Literatur keine ERBB2 positiven Zellen in dem von uns untersuchen Tumorgewebe nachgewiesen werden. Lediglich 1,70% der Gewebestanzen aus dem untersuchten Lymphknotengewebe wurden als positiv gewertet. Dafür zeigte sich hier eine eindeutige membranständige Färbung. Auch nach mehrmaligen Veränderungen des Vorbereitungsprozesses der IHC-Schnitte vor der Färbung blieb das Ergebnis negativ. Ein deutlich positiver Nachweis der Positiv-Kontrolle (Mammakarzinom) ließ keinen Zweifel an der Funktionsfähigkeit des verwendeten Antikörpers. Dementsprechend war in unserer Arbeit eine Korrelation mit klinischen Daten nicht möglich. So eindeutige Ergebnisse wie in der Brustkrebsforschung gibt es bisher in HNSCCs bezüglich ERBB2 nicht. In der Literatur wird eine Überexpression von ERBB2 in 3-29% und damit deutlich seltener als eine EGFR-Überexpression beschrieben (Schartinger, Kacani et al. 2004) (Scheer, Prange et al. 2003) (Bei, Budillon et al. 2004). Auch wurde ERBB2, wie sein großer Bruder der EGFR in Hinblick auf sein Potenzial als Biomarker ausgiebig überprüft. In einigen Studien konnten Korrelationen zu klinischen Daten wie fortgeschrittenem Tumorstadium, invasivem Wachstum, dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen gezeigt werden. Zum Teil war ein vermehrter Nachweis des Rezeptors auch mit einem kürzeren Gesamtüberleben assoziiert (Ocharoenrat, Rhys-Evans et al. 2002) (Cavalot, Martone et al. 2007) (Xia, Lau et al. 1999). Andere Studien konnten lediglich eine mäßig ausgeprägte Überexpression, aber keine Assoziation zu klinischen Daten zeigen (Khademi, Shirazi et al. 2002) (Khan, King et al. 2002) (Chen, Chang et al. 2003) (Ali, Gunduz et al. 2010). Auch in einer großen Studie an Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre konnte zwar eine Überexpression, aber keine signifikante Assoziation zu klinischen Daten belegt werden (Sato-Kuwabara, Neves et al. 2009). 122 Insgesamt bleibt das Forschungsfeld weiterhin sehr inhomogen. Auch hier ist man erneut mit dem Problem der geringen Vergleichbarkeit der Studien konfrontiert, da die Patientenkollektive oft unterschiedlich gewählt sind. Daher wurde vermehrt eine mögliche Co-Expression von unterschiedlichen Mitgliedern der ERBB-Rezeptorfamilie in HNSCCs untersucht (Bei, Pompa et al. 2001). Die Arbeitsgruppe um Xia konnte dabei ein vielversprechendes Ergebnis veröffentlichen. In ihrer Arbeit wurden der EGFR sowie ERBB2 bis 4 untersucht. Eine Korrelation zu einer positiven N- bzw. M-Klassifkation bestand für eine Überexpression aller Mitglieder bis auf ERBB4. Des Weiteren konnte für alle Mitglieder eine Assoziation zu einem kürzeren Gesamtüberleben bei positivem Rezeptorstatus nachgewiesen werden, wobei die Assoziation für ERBB2 am meisten ausgeprägt war. Das vielleicht wichtigste Ergebnis dieser Studie war jedoch, dass eine Kombination von positivem Rezeptorstatus für EGFR, ERBB2 und ERBB3 den prognostischen Wert der Markerkombination im Gegensatz zu einer Einzeluntersuchung eindeutig verbesserte (Xia, Lau et al. 1999). Auch in NSCLC war eine Kombination aus positivem Rezeptorstatus für EGFR und ERBB2 mit einem signifikant besseren Therapieansprechen auf TyrosinkinaseInhibitoren assoziiert im Vergleich zu NSCLC, die lediglich einen positiven EGFR-Status hatten (Hirsch, Varella-Garcia et al. 2009). In einer methodisch nicht vergleichbaren Studie konnten diese Ergebnisse nicht bestätigt werden. Die Arbeitsgruppe um Chen untersuchte mittels Immunassay (Elisa) ebenfalls den Expressions-Status von EGFR und ERBB2 in OSCCs. Dabei konnte keine signifikante CoExpression der beiden Rezeptoren in den Tumorproben nachgewiesen werden. Lediglich für den EGFR alleine zeigten sich signifikante Assoziationen zu klinisch-pathologischen Daten (Chen, Chang et al. 2003). Obwohl die Datenlage auch bezüglich einer Co-Expression weiterhin sehr heterogen bleibt, werden erste Versuche einer kombinierten Immuntherapie gegen EGFR und ERBB2 in HNSCCs unternommen (Kondo, Tsukuda et al. 2010). 5.5.10 p-p42/44MAPK Der Marker p-p42/44MAPK konnte nicht vermehrt in HNSCCs im Vergleich zu Normalgewebe nachgewiesen werden. Des Weiteren ergaben sich keine statistisch 123 signifikanten Zusammenhänge bezüglich des Gesamtüberlebens. Jedoch konnte eine signifikante Assoziation zwischen p-p42/44MAPK-Status und N-Klassifikation gezeigt werden. Unter den Patienten mit Lymphknotenmetastasen (N+) konnten wir signifikant weniger häufig eine p-p42/44MAPK-Expression nachweisen, während die Patienten mit N0 Stadium signifikant häufiger eine p-p42/44MAPK-Expression zeigten. Es gibt insgesamt nur sehr wenige veröffentlichte Arbeiten, die sich mit einem immunhistochemischen Nachweis von p-p42/44MAPK in Tumoren bzw. HNSCC beschäftigen. Dies ist erstaunlich angesichts der Tatsache, dass bereits anti-MAPK-Agenzien im Sinne einer „targeted therapy“ entwickelt und getestet werden. In den meisten Arbeiten werden die dem EGFR nachgeschalteten Proteine mittels Westernblot untersucht. Die Arbeitsgruppe um Mukohara konnte in NSCLC zwar eine Korrelation zwischen der Expression von EGFR und seinen nachgeschalteten Proteinen (pMAPK und pAKT) zeigen. Es gelang jedoch nicht, eine Assoziation zu klinisch-pathologischen Daten nachzuweisen (Mukohara, Kudoh et al. 2003). In kolorektalen Karzinomen und Hormonrezeptor-negativen Mammakarzinomen konnte hingegen eine signifikante Assoziation zwischen Gesamtüberleben bzw. rezidivfreien Überleben und Expressionsstatus dieser Proteine gezeigt werden. Eine Überexpression war signifikant mit einem längeren Gesamtüberleben bzw. längeren rezidivfreien Überleben assoziiert (Yu, Yu et al. 2011) (Eralp, Derin et al. 2008). Diese Ergebnisse passen insoweit zu unserem Ergebnis, da in dieser Arbeit eine Überexpression signifikant seltener mit einer Lymphknotenmetastasierung einhergeht. Eine positive N-Klassifikation wird allgemein als Tumorprogression gewertet und als prognostisch negativ eingeschätzt (Shingaki, Takada et al. 2003). An einem kleinen und sehr speziell gewählten Kollektiv von T4 Mammakarzinomen konnte eine mittels IHC dargestellte signifikante Co-Expression von p-p42/44MAPK und Survivin sowie p-42/44MAPK und ki67 gezeigt werden. Des Weiteren war ein positiver Nachweis von p-p42/44MAPK mit einem schlechteren Gesamtüberleben assoziiert (Massidda, Sini et al. 2010). In unserer Arbeit konnte auch eine positive Korrelation für die Expressionsprofile von Survivin und p-p42/44MAKP, jedoch nicht für ki67 und p-p42/44MAPK gezeigt werden. 124 Sicherlich sind auch hier noch weitere Arbeiten an Tumoren allgemein und speziell an HNSCCs nötig, um eindeutigerer Aussagen bezüglich der Relevanz von p-p42/44MAPK als Prognose- bzw. Risikomarker machen zu können. 5.5.11 PTEN In der Literatur konnte bisher gezeigt werden, dass PTEN in unterschiedlichen Tumorentitäten eine verminderte Expression aufweist. Dies kann auch in unsere Arbeit für das HNSCC bestätigt werden. Jedoch lagen hier keine weiteren Korrelationen bezüglich klinisch-pathologischen Charakteristika der Tumoren oder bezüglich des Gesamtüberlebens vor. Dies entspricht den Ergebnissen anderer Publikationen über PTEN-Expressionsprofile von OSCCs (Kurasawa, Shiiba et al. 2008) (Squarize, Castilho et al. 2002). In der zweiten genannten Studie konnte jedoch zusätzlich ein Zusammenhang zwischen dem Verlust der PTEN-Expression und einem zunehmenden Grading hergestellt werden. In einer weiteren Studie an Zungenkarzinomen konnte ebenfalls z.T. eine verminderte Expression von PTEN beobachtet werden. Hier ist besonders hervorzuheben, dass die Patienten ohne PTENNachweis in der Studie ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben und kürzeres progressionsfreies Überleben hatten (Lee, Soria et al. 2001). Man geht davon aus, dass ein Herunterregulieren von PTEN zu einer Akkumulation von PIP3 und damit zu einer vermehrten Aktivierung von PI3K und pAKT führt. Würde man dies eindimensional betrachten, so müsste diese Konstellation auch im Tumorgewebe nachweisbar sein. In dem von uns untersuchten Tumorgewebe war eine verminderte Expression von PTEN und eine vermehrte Expression von pAKT zu beobachten. Jedoch ergab sich für beide Expressionsprofile keine inverse Korrelation in der bivarianten SpearmanKorrelationsanalyse. So bleibt offen, in wie weit sich die beiden Proteine gegenseitig bedingen und in wie weit dies für die Tumorgenese eine Rolle spielt. In der Literatur sind z.B. auch ein PTEN vermittelter, jedoch PI3K/AKT unabhängiger Signaltransduktionswege beschrieben, welcher für die Tumorgenese eine Rolle spielen könnte (Blanco-Aparicio, Renner et al. 2007). 125 5.5.12 pAKT Der Marker pAKT, der in unserer Arbeit für den zweiten nachgeschalteten Signaltransduktionsweg steht, zeigte erwartungsgemäß eine signifikante Überexpression in Tumorgwebe im Vergleich zum Normalgewebe. Zusätzlich war pAKT der einzige unter den ausgewählten Markern der Signaltransduktion, der eine signifikante Aussage bezüglich Gesamtüberlebens zuließ. Dabei zeigten Patienten mit einer vermehrt detektierbaren pAKT-Expression ein signifikant längeres Gesamtüberleben als Patienten mit negativen pAKT-Status. Dieses Ergebnis wird auch durch eine zweite signifikante Beobachtung gestützt: Demnach gehören Patienten mit Fernmetastasen signifikant häufiger der Gruppe von Patienten mit fehlender pAKTExpression an, welche in der Kaplan-Meier-Analyse ein signifikant schlechteres Gesamtüberleben haben. Damit könnte pAKT als Biomarker ein guter Ansatz für eine Prognoseeinschätzung der HNSCC Patienten sein. Des Weiteren könnte dies einer Vorselektionierung dienen, um Patienten mit einem hohem Metastasierungsrisiko frühzeitig zu erkennen, diese adäquat zu therapieren und engmaschig zu überwachen. Vergleicht man unsere Ergebnisse mit denen der aktuellen Literatur, so zeigt sich ein sehr unterschiedliches Feld. Einerseits konnte in Studien eine positive Korrelation zwischen pAKT-Überexpression und Tumorprogression gezeigt werden. Das Gesamtüberleben war signifikant kürzer bei Patienten mit einer pAKT-Überexpression als bei Patienten, ohne (Massarelli, Liu et al. 2005), andererseits konnte in einigen Studien auch keine Assoziation zwischen pAKT-Überexpression und Überlebensdaten gezeigt werden (Ongkeko, Altuna et al. 2005) (Zhang, Pellitteri et al. 2005) (Gupta, McKenna et al. 2002). Insgesamt haben all diese Studien ein eher kleines und sehr spezifisches Patientenkollektiv (Oropharynxkarzinome, Tonsillenkarzinome, Zungenkarzinome) und sind damit nicht direkt vergleichbar. Nach unserem Wissenstand fehlen größer angelegte Studien, die nicht nur eine fragliche Überexpression von pAKT, sondern auch dessen Prognoserelevanz genauer untersuchen. Denn wie in der Einleitung bereits erwähnt, scheint pAKT auf unterschiedlichsten Wegen eine anti-apoptotische Wirkung und somit eine indirekte und direkte zellproliferative Wirkung zu haben. Daraus entwickelt sich eine für die Kanzerogenese nicht uninteressante Theorie, dass eine vermehrt pAKT-Expression mit 126 einem schnell und aggressiv wachsendem sowie wenig RCTX sensiblen Tumor einhergehen könnte. 5.5.13 Verbindungen zwischen den Marker Zusätzlich zu den Untersuchungen der einzelnen Marker wurden in dieser Arbeit auch möglichen Markerkombinationen untersucht. Um einen Überblick zu erhalten wurde die Spearmann-Korrelationsanalyse verwendet. Mit Hilfe eines Cox-Regressions-Modelles sollte die Prognoserelevanz von Markerkombinationen im Vergleich zu den jeweiligen Einzelmarkern überprüft werden. In der Multivariant-Analyse der zellzyklusregulierenden Marker konnte sich dann Survivin, welcher in der Kaplan-Meier-Analyse als signifikanter Prognosemarker eingeschätzt wurde, nicht mehr behaupten. Die Kombination aus p53 und cyclin D1 stellte sich als signifikant prognostischer Prädiktor für das Gesamtüberleben heraus. In der Einzelanalyse zeigte sich mit einem p-Wert von 0,079 (p53) bzw. 0,065 (cyclin D1) für beide Marker ein positiver Trend. Eine wahrscheinlich Erklärung für den Unterschied zwischen Kombination und Einzelmarkern liegt in den aus statistischen Gründen unterschiedlichen Fallzahlen. Diejenigen Patienten mit einem positiven p53- oder cyclin D1- Nachweis hatten ein insgesamt besseres Überleben, als diejenigen mit fehlendem Proteinnachweis. In das Cox-Regressions-Modell der EGFR nachgeschaltenen Signaltransuktionsmarker wurde zusätzlich noch STK15 aufgenommen, da in der Literatur Hinweise für eine EGFR vermittelte STK15-Aktivierung beschrieben sind, die genaue Verbindung ist noch unklar (Hung, Tseng et al. 2008). Jedoch konnte z.B. in Kolonkarzinomen eine Co-Überexpression von EGFR und STK15 nachgewiesen werden, welche mit einer schlechteren Prognose assoziiert war (Lai, Tseng et al. 2010). Diese Kombination von Markern sollte auch an HNSCCs in dieser Arbeit überprüft werden. Jedoch konnte lediglich für AKT ein Prognosepotenzial, sowohl in der Kaplan-Meier-Analyse wie auch im Cox-Regressions-Modell gezeigt werden. Es ergaben sich keine weiteren signifikanten Markerkombinationen, weder innerhalb der Marker aus dem Bereich des EGFR nachgeschaltenem Signalweges noch mit STK15. 127 Abgesehen von p53 und cyclin D1 gelang es nicht, eine Markerkombination zu finden, die als Kombination ein besseres Prognosepotenzial aufweist, als die jeweiligen Einzelmarker. Insgesamt gibt es wenige vergleichbare Studien, die einen so großen Markerumfang geprüft haben. In den zu Beginn der Diskussion erwähnten Studien von Buffa und van den Broek wurden ebenfalls p53 und cyclin D1 in die Reihe der untersuchten Biomarker aufgenommen, jedoch konnte sich cyclin D1 in keiner der beiden Studien als Teil einer Markerkombination beweisen. In den Ergebnissen von Buffa wurde p53 zwar in die Gruppe von Markern aufgenommen, deren Kombination eine Prognoseaussage zuließ, jedoch stellte speziell das Expressionsmuster von p53 nicht den entscheidenden Unterschied dar, durch den die einzelnen Subgruppen charakterisiert wurden (Buffa, Bentzen et al. 2004). In der anderen Arbeit konnte p53 auch keinen Platz in der Kombination der prognoserelevanten Marker finden (van den Broek, Wildeman et al. 2009). 5.5.14 Probleme Ein Problem bei der Untersuchung von großen Mengen an Markern ist, dass auf Grund der Vielzahl an Variablen in den statistischen Test eine sehr hohe Fallzahl benötigt wird. Gleichzeitig dezimiert sich die Fallzahl durch die Anzahl an Fällen, die auf Grund eines fehlenden Ergebnisses aus dem Testverfahren ausgeschlossen werden müssen. Dabei ist klar, dass umso mehr Biomarker untersucht werden, die Wahrscheinlichkeit für das Fehlen eines Ergebnisses steigt. Damit kann es notwendig sein, dass ein kompletter Fall somit auf Grund einer nicht beurteilbaren Gewebeprobe bzw. fehlenden Gewebeprobe auf dem entsprechenden Tissue Micro Array für alle Marker aus der Testung genommen werden muss. Möchte man diesem Problem entgehen, muss man die nicht beurteilbaren bzw. fehlenden Stanzen des TMA nacharbeiten und nachfärben. Dabei begegnet man jedoch einem weiteren Problem der IHC, nämlich dem nicht hundertprozentig standardisierbaren Vorbereitungs-, Färbe- und Nachbereitungsprozess. Dadurch entstehen für die unterschiedlichen Markerfärbungen und die Färbungen innerhalb eines Biomarkers unterschiedliche Bedingungen. Dies kann ihre Vergleichbarkeit und damit die Beurteilbarkeit beeinflussen, ein Problem dass gerade durch die Verwendung der TMA verringert werden kann (Nylander, Dabelsteen et al. 2000), (Thomas, Nadiminti et al. 2005). 128 Gerade wenn man zur Objektivierung der immunhistochemischen Färbung einen Score anwendet, der nicht nur aus der Anzahl der gefärbten Zellen, sondern auch aus deren Färbeintensität besteht, sind vergleichbare Färbebedingen sehr wichtig, wobei ein Auswertungs-Score nicht nur auf immunhistochemischer Ebene einen kritischen Punkt darstellt, sondern auch auf Ebene der Beurteilung und Auswertung. Denn bei vielen statistischen Tests benötigt man einen cut-off Wert, der zum einen vor der Subjektivität schützt, welche der IHC oft vorgeworfen wird. Zum anderen geht dadurch aber unbemerkt Information in seiner Varianz und Ausprägung verloren. Des Weiteren gibt es keinen allgemein gültigen wissenschaftlichen Score oder cut-off Wert der von allen Arbeitsgruppen angewandt wird. Dadurch wird zusätzlich die Vergleichbarkeit von unterschiedlichen Studien erschwert (Nylander, Dabelsteen et al. 2000). Abgesehen von den technischen Problemen, die zum einen im Labor, aber auch bei der statistischen Auswertung auftreten, scheint es noch mehr Gründe zu geben, warum bisher nach unserem Kenntnisstand noch keine bahnbrechenden und mehrheitlich anerkannten Ergebnisse im Bereich der Biomarker bei HNSCCs publiziert wurden. Vielmehr stellt man im Rahmen der Recherche fest, dass immer neue Studien veröffentlicht werden, die zum Teil sehr gute aber meist sehr heterogene Ergebnisse präsentieren. Diese Studien weisen häufig ein sehr unterschiedliches Patientenkollektiv auf, welches sich zu mindestens in einem nicht unerheblichen Detail, wie z.B. Tumorlokalisation, Ort der Probeentnahme, Art der Therapie und Zeitpunkt im Therapieverlauf unterscheiden (Thomas, Nadiminti et al. 2005). So kann die Suche nach vergleichbaren Studien bzw. vergleichbaren Ergebnissen erfolglos sein. Eine Standardisierung auf unterschiedlichen Ebenen, wie z.B. standardisierte Therapieprotokolle, standardisierte Probeentnahmen und natürlich standardisierte Vorbereitungs- und Färbeprotokolle der IHC könnten dieses Problem zwar nicht lösen, aber zu mindestens um einen Hauptkritikpunkt dezimieren (Thomas, Nadiminti et al. 2005). Solche Vereinheitlichungen gelingen häufig in prospektiven Studien besser. Diese werden sicherlich in Zukunft benötigt werden, da die meisten Studien, inklusive unserer Arbeit retrospektiv erstellt wurden. 129 Insgesamt lässt sich ein Teil unserer Ergebnisse harmonisch in die veröffentlichten Ergebnisse der aktuellen Literatur einordnen. Der andere Teil unserer Ergebnisse ist nicht in den wissenschaftlichen Beobachtungen anderer Forschungsgruppen zu finden. Diese Beobachtung wiederum bestätigt das insgesamt sehr heterogene Feld an veröffentlichten Arbeiten im Bereich von Biomarkern auf Proteinebene in Tumoren des Kopf- Halsbereiches. Eine Standardisierung auf mehreren Ebenen könnte vielleicht das Problem der mangelnden Vergleichbarkeit der Studien mildern. Damit wären die sehr variablen Ergebnisse eventuell leichter einzuordnen. In den letzten Jahren der wissenschaftlichen Forschung zeichnete sich bereits ab, dass die Wahrscheinlichkeit einen einzelnen guten Prognosemarker zu finden sehr gering ist. Aber auch die Suche nach einer Markerkombination gestaltet sich trotz erweiterter Methodik nicht einfacher. Jedoch wurden durchaus erfolgsversprechende Ansatzpunkte veröffentlicht. Aus unserer Sicht sind auch in dieser Arbeit einige vielversprechende Anknüpfungspunkte dabei. So zeigte sich Survivin und vor allem pAKT als prognoserelevante Biomarker. Des Weiteren hat die Markerkombination aus p53 und cyclin D1 ein positives Potenzial als Prognoseprädiktor. Zusätzlich zeigte sich eine Vielzahl von Zusammenhängen zwischen Expressionsmuster einzelner Biomarker (Survivin, PLK-1, cyclin D1, p42/44MAPK, pAKT) und klinischen Charakteristika, die zur Einordnung der HNSCC in spezielle Subgruppen mit unterschiedlichem Risikoprofil genutzt werden können. Sieht man diese immunhistrochemische Arbeit, mit seiner Fülle an Markern als erstes Screening, so müssen sicherlich noch weitere Arbeiten folgen, um die vielen Teilergebnissen zu verifizieren. Dabei ist eine Erweiterung der Methodik sinnvoll. Jedoch bleibt die IHC ein einfaches und gutes Verfahren, welches als Screeningverfahren in der Forschung dient, aber auch nach Verifizierung der Ergebnisse durch unterschiedliche Methoden als spezielles Nachweisverfahren für tumorrelevante Proteine im klinischen Alltag genutzt werden kann. 130 6 Zusammenfassung Weltweit haben Karzinome des Kopf-Hals-Bereiches eine Inzidenz von 500.000 Fällen pro Jahr und stehen damit an sechster (deutschlandweit an siebter) Stelle aller Tumorentitäten bei Männern. Trotz Verbesserung der Diagnose- und Therapieverfahren hat sich die 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit in den letzten 30 Jahren nicht wesentlich verbessert, jedoch variiert die Prognose stark je nach Tumorstadium. Bisher ist die TNM-Klassifikation bei Erstdiagnose der beste Anhaltspunkt für eine Prognoseeinschätzung. Allerdings lässt sich diese Prognose nicht immer auf den individuellen Patienten übertragen. Daher werden weitere Prognosemarker benötigt, die individuelle Risikovorhersagen ermöglichen und ggf. eine individuelle Therapieentscheidung zulassen. Mit einem zunehmenden Verständnis für die molekulare Onkogenese in HNSCCs sind einzelne Gene bzw. Proteine der Zellzyklusregulation und Signalvermittlung ins Zentrum der Forschung gerückt. Ziel dieser Arbeit soll es sein, Proteine zu identifizieren, deren Expressionsmuster mit dem Gesamtüberleben signifikant assoziiert sind. Zusätzlich sollen Assoziationen zwischen klinischen Variablen einerseits und Proteinexpressionsmustern andererseits gefunden werden. Dafür untersuchten wir an einem Patientenkollektiv von 180 HNSCC Patienten das Expressionsmuster von 12 Proteinen, 7 aus dem Bereich der Zellzykluskontrolle (Survivin, PLK-1, Bub1B, cyclin D1, STK15, p53 und ki67) und 5 aus dem Bereich der EGFR vermittelten Signaltransduktion (EGFR, ERBB2, p-p42/44MAPK, pAKT und PTEN). Der Nachweis wurde immunhistochemisch an Tissue Micro Arrays von Tumor- und Lymphknoten- und Normalgewebe von HNSCCs durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels eines Scores für Intensität und Anzahl an positiven Zellen. Anschließend wurden die Ergebnisse mit den erhobenen klinischen Charakteristika verglichen und statistisch ausgewertet. Dabei ergab sich für die Marker STK15, p53, ki67, EGFR und pAKT eine signifikante Überexpression im Tumorgewebe. Eine verminderte Expression hingegen lag für die Marker 131 Survivin, p-p42/44MAPK und PTEN vor. Zusätzlich ließen sich für etliche Marker signifikante Korrelationen mit anderen Markern nachweisen, insbesondere bei Survivin, PLK-1, Bub1B, pAKT und PTEN. Des Weiteren konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen EGFR-Expression und Rauch- bzw. Trinkverhalten gezeigt werden. Auch lag für die Marker Survivin und PLK-1 eine signifikante Assoziation zur T-Klassifkation vor und für Survivin und p-p42/44MAPK eine signifikante Assoziation bzgl. der lymphatischen Metastasierung. Der Expressionsstatus von Survivin, PLK-1 und pAKT war signifikant mit der Rate an Fernmetastasen assoziiert. Für die Rate an Rezidiven und Zweitkarzinomen lag eine signifikante Assoziation mit dem Expressionsstatus von cyclin D1 vor. In der Kaplan-Meier-Analyse war die Survivin-Überexpression signifikant mit einem längeren Gesamtüberleben verknüpft. pAKT war der einzige Marker der Signaltransduktion, der sowohl in der Kaplan-Meier-Analyse als auch im Cox-Regressionsmodell eine statistisch signifikante Aussage bezüglich des Gesamtüberlebens erlaubte. Die Markerkombination von p53 und cyclin D1 zeigte im Cox-Regressionsmodel eine signifikante Aussage bezüglich des Gesamtüberlebens. Insgesamt lag für die signifikanten Marker bei positivem Expressionsnachweis ein besseres Gesamtüberleben vor. Diese Arbeit zeigt das Prognosepotential der oben erwähnten Marker(-Kombinationen). Des Weiteren konnte eine Vielzahl von Assoziationen zwischen Expressionsmuster einzelner Biomarker (Survivin, PLK-1, cyclin D1, p-p42/44MAPK, pAKT und EGFR) und klinischen Charakteristika gezeigt werden. Diese können zur Einordnung der HNSCC in spezielle Subgruppen mit unterschiedlichem Risikoprofil und ggf. unterschiedlichen Therapieoptionen genutzt werden. Zur weiteren Evaluierung der klinischen Anwendbarkeit sollten die gewonnenen Ergebnisse in prospektiven Studien unter standardisierten Bedingungen weiter geprüft werden. 132 7 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Hypothetisches Modell der Karzinogenese in HNSCCs modifiziert nach (Perez-Ordonez, Beauchemin et al. 2006)........................................................ 19 Abbildung 2: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2004; Schätzung der Dokumentation Krebs des RKI (Robert-Koch-Institut 2008). ........................... 20 Abbildung 3: Inzidenzrate von Karzinomen in Mundhöhle und Pharynx in ausgewählten Ländern 2002; Globocan-Schätzung , RKI Schätzung für Deutschland 2002, 2004 (Robert-Koch-Institut 2008)..................................................................... 21 Abbildung 4: Prozentualer Anteil ausgewählter Tumorlokalisationen an allen Krebssterbefällen in Deutschland 2004; Amtliche Todesursachenstatistik, Statistisches Bundesamt, Wiesbaden (Robert-Koch-Institut 2008). ................ 21 Abbildung 5: Anatomische Regionen von Halslymphknoten: Level IA/B submental/submandibuläre Lymphknoten (LK), Level II A/B obere juguläre LK-Gruppe, Level III mittlere juguläre LK-Gruppe, Level IV untere juguläre LK-Gruppe, VA/B hinteres Halsdreieck, VI anteriore zentrale Gruppe , VII superior mediastinale Gruppe. Modifiziert nach (Robbins, Shaha et al. 2008) (Gray 1918). ............................................................................................ 27 Abbildung 6: Regulation den Anaphase pormoting complex C durch PLK-1 modifiziert nach (Eckerdt and Strebhardt 2006) ................................................................ 37 Abbildung 7: p53 im Zellzyklus modifiziert nach (Levine 1997)............................................. 45 Abbildung 8: EGFR mit nachgeschalteten Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) ........................................................................................................ 47 Abbildung 9: EGFR nachgeschalteter MAPK Signalweg Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) ............................................................................. 54 133 Abbildung 10: EGFR nachgeschalteter AKT Signalweg Signalwegen modifiziert nach (Marmor, Skaria et al. 2004) ............................................................................. 59 Abbildung 11: Beispiel eines Blockes mit TMA- Stanzen; Ο = Tumorgewebe, Lymphknotengewebe oder Plattenepithel; • = Lebergewebe (Markierung) ... 67 Abbildung 12: Immunhistochemische Darstellung von Survivin. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe ........................................................ 73 Abbildung 13: Immunhistochemische Darstellung von PLK-1. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe ........................................................ 73 Abbildung 14: Immunhistochemische Darstellung von Bub1B. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe ........................................................ 73 Abbildung 15: Immunhistochemische Darstellung von STK15. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 74 Abbildung 16: Immunhistochemische Darstellung von cyclin D1. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 74 Abbildung 17: Immunhistochemische Darstellung von p53. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 74 Abbildung 18: Immunhistochemische Darstellung von Ki67. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 75 Abbildung 19: Immunhistochemische Darstellung von EGFR. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 75 Abbildung 20: Immunhistochemische Darstellung von pAKT. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe .................................................................... 75 Abbildung 21: Immunhistochemische Darstellung von p-p42/44MAPK. A: Tumorgewebe; B: Tumorgewebe; C: Normalgewebe................................................................ 76 134 Abbildung 22: Immunhistochemische Darstellung von PTEN. A: Tumorgewebe; B: Lymphknotengewebe; C: Normalgewebe ........................................................ 76 Abbildung 23: Korrelation: EGFR-Status in Tumorgewebe mit Alkoholkonsum ..................... 82 Abbildung 24: Korrelation: EGFR-Status in Tumorgewebe mit Raucherstatus ....................... 82 Abbildung 25: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der Survivin-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,025 ............................................................ 96 Abbildung 26: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der pAKT-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,023 .................................................................... 96 Abbildung 27: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der cyclin D1-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,065 ............................................................ 97 Abbildung 28: Kaplan-Meier-Analyse: prognostische Relevanz der p53-Expression bzgl. Gesamtüberleben; p-Wert: 0,079 .................................................................... 97 135 8 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle, Lippen und Oropharynx ............................................................................................................ 14 Tabelle 2: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome des Larynx ...................................... 14 Tabelle 3: T-Klassifikation für Plattenepithelkarzinome des Hypopharynx ........................... 15 Tabelle 4: N-Klassifikation für HNSCC .................................................................................... 16 Tabelle 5: M-Klassifikation für HNSCC ................................................................................... 16 Tabelle 6: R-Klassifikation für HNSCC..................................................................................... 16 Tabelle 7: Differenzierung von HNSCC ................................................................................... 16 Tabelle 8: Stadieneinteilung nach UICC ................................................................................. 17 Tabelle 9: verwendete Geräte ............................................................................................... 63 Tabelle 10: verwendete Chemikalien....................................................................................... 64 Tabelle 11: verwendete Pufferlösungen .................................................................................. 65 Tabelle 12: verwendetes Verbrauchsmaterial ......................................................................... 65 Tabelle 13: verwendete Antikörper mit positiver Kontrolle .................................................... 66 Tabelle 14: Immunreaktiver Score (IRS = PP x SI) nach (Remmele and Schicketanz 1993) (Schauer, Rothe et al. 1988) .................................................................................. 69 Tabelle 15: verwendeter Score (SI + PP = Score) ..................................................................... 69 Tabelle 16: Charakterisierung des Patientenkollektives zum Zeitpunkt der Erstellung des Kollektives *nach alter WHO-Klassifikation 1997 ................................................. 72 Tabelle 17: Lokalisation der Markerdedetion; * die für die Auswertung gültige Färbung. ..... 72 136 Tabelle 18: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Tumor- und Normalgewebe .................................................................................. 78 Tabelle 19: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Lymphknoten- und Normalgewebe ...................................................................... 78 Tabelle 20: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test: Vergleich des Expressionsprofiles zwischen Tumor- und Lymphknotengewebe ........................................................................ 79 Tabelle 21: Übersicht der jeweiligen Marker-Korrelationen (Korrelations-Analyse nach Spearman) ............................................................................................................. 80 Tabelle 22: Spearman-Korrelation zwischen Alkoholkonsum/ Raucherverhalten und allen untersuchten Marker.* Die Korrelation ist auf dem 0,05 Niveau signifikant (zweiseitig) ** Die Korrelation ist auf dem 0,01 Niveau signifikant (zweiseitig) .. 81 Tabelle 23: Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markerexpression in HNSCCs und klinischen Daten mittels Chi-Quadrat-Test oder exaktem Test nach Fisher (cq: Chi-Quadrat-Test; ef: exakter Test nach Fisher) ................................................... 84 Tabelle 24: Vier-Felder-Tafel: Korrelation zwischen Markerexpression in Lymphknoten und klinischen Daten mittels Chi-Quadrat-Test oder exaktem Test nach Fisher (cq: Chi-Quadrat-Test; ef: exakter Test nach Fisher) ............................................ 84 Tabelle 25: Kreuztabellen: Survivin Expression vs. T-Klassifikation. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. T-Klassifikation der HNSCCs. ChiQuadrat-Test: p-Wert: 0,006 ................................................................................. 85 Tabelle 26: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. T-Klassifikation Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. T-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: pWert: 0,033 ............................................................................................................ 86 Tabelle 27: Kreuztabellen: Survivin-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,012 ............................................................ 87 137 Tabelle 28: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Stadium der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,056 .......................................................................... 88 Tabelle 29: Kreuztabellen: p-p42/44MAPK-Expression vs. Rate an Lymphknotenmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. N-Klassifikation der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,001 ................... 89 Tabelle 30: Kreuztabellen: Survivin-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,005 ..................................................... 90 Tabelle 31: Kreuztabellen: PLK-1-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. ChiQuadrat-Test: p-Wert: 0,016 ................................................................................. 91 Tabelle 32: Kreuztabellen: pAKT-Expression vs. Rate an Fernmetastasen. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Fernmetastasen-Status der HNSCCs. ChiQuadrat-Test: p-Wert: 0,022 ................................................................................. 92 Tabelle 33: Kreuztabellen: cyclin D1-Expression vs. Rezidivrate. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Rezidiv-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: pWert: 0,025 ............................................................................................................ 93 Tabelle 34: Kreuztabellen: cyclin D1-Expression vs. Zweitkarzinomrate im Aerodigestivtrakt. Prozentangaben bezogen auf Expressions-Status bzw. Zweitkarzinom-Status der HNSCCs. Chi-Quadrat-Test: p-Wert: 0,001 ................. 94 Tabelle 35: p-Werte des Log-Rank Test, Überlebensanalysen der einzelnen Marker............. 95 Tabelle 36: COX-Regressionsmodel; Methode vorwärts schrittweise (WALD) der zellzyklusregulierenden Marker .......................................................................... 100 Tabelle 37: COX-Regressionsmodel; Methode vorwärts schrittweise (WALD) der Signaltransduktionsmarker + STK15.................................................................... 101 138 9 Literaturverzeichnis Abal, M., A. Obrador-Hevia, K. P. Janssen, L. Casadome, M. Menendez, S. Carpentier, E. Barillot, M. Wagner, W. Ansorge, G. Moeslein, H. Fsihi, V. Bezrookove, J. Reventos, D. Louvard, G. Capella and S. Robine (2007). "APC inactivation associates with abnormal mitosis completion and concomitant BUB1B/MAD2L1 up-regulation." Gastroenterology 132(7): 2448-58. Abou-Elhamd, K. E. and T. N. Habib (2008). 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Henning Bier bedanken, der mir die Gelegenheit zur Promotion in seiner Klinik gegeben hat, sowie bei der verstorbenen Prof. Dr. med. Miriam Steuer-Vogt, unter deren Leitung ich meine Doktorarbeit begonnen habe. Mein ganz besonderer Dank geht an Fr. Dr. med. Anja Pickhard für die exzellente Betreuung und ständige Hilfestellung bei der Planung, Durchführung, Auswertung und Korrektur der Arbeit. Auch möchte ich mich ganz herzlich bei Ingrid Hoepner und Guido Piontek für die immer freundliche und kompetente Hilfe bei allen praktischen Fragen und für die vielen fruchtbaren Diskussionen bedanken. An dieser Stelle sei Fr. Dr. med. Frauke Neff erwähnt, die mir von Seiten der Pathologie wertvolle Hilfe gab, sowie Fr. Dr. Victoria Kehl, die mir bei der statitischen Auswertung sehr freundlich geholfen hat. Ebenfalls möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Jürgen Schlegel, dem Leiter der Neuropathologie danken, der es mir ermöglichte in seiner Arbeitsgruppe den experimentellen Teil der Arbeit umzusetzen. Den Mitgliedern dieser Arbeitsgruppe, insbesondere Johanna Margraf und Maxmilian Huhn, möchte ich für die schöne Arbeitsatmosphäre und für die gute Zeit miteinander danken. Zuletzt möchte ich mich von tiefsten Herzen bei meinem Freund Sebastian Schmid bedanken, der mich durch alle Hochs und Tiefs der Entstehungsphase dieser Arbeit begleitet hat. Auch möchte ich mich hier bei meiner Familie bedanken, für all ihre Unterstützung durch die diese Arbeit möglich war. 185
