Gastroenteritis - Medizinische Mikrobiologie

Mikrobiologisches Praktikum für
Humanmediziner
Vorbereitung zu Kurs 5:
Infektionen des Gastrointestinaltrakts
Dr. med. Matthias Karrasch
Institut für Medizinische Mikrobiologie
Universitätsklinikum Jena
Die humane physiologische Darmflora
• entfaltet verschiedene wichtige Effekte zum Nutzen des Menschen
• besteht aus > 400 verschiedenen Bakterienspezies und Subspezies,
insgesamt etwa 1012–1013 Bakterien (Mensch besteht aus 1013 Zellen),
z.B.:
• Anaerobier (Bacteroides, Eubacterium, Bifobacterium,…..)
• fakultativ pathogene Mikroorganismen (Clostridium difficile,
C. perfringens,……)
• Sowohl Pilze als auch Protozoen können Bestandteile der normalen
Darmflora sein (geringe Keimzahl)
• Wechselwirkung zwischen verschiedenen Bakterienspezies und
zwischen Bakterien und Wirtszellen sind von großer Bedeutung
• Veränderungen der bakteriellen Flora können unter Umständen zu
schweren Erkrankungen beim Menschen führen
Gastrointestinale Infektionen: Übersicht
Ösophagitis
Gastritis
Enteritis
Colitis
Gastritis
Gastritis
Magen
Beispiel für einen wichtigen Erreger: Helicobacter pylori
• spiralig gekrümmtes, Gram-negatives Stäbchen mit lophotricher Begeißelung
• fäkal-oral übertragen und kolonisiert oberste Schicht der Magenmukosa; tiefere
Schichten  Infektion
Diagnostik
•
sehr schwierige Kultur
•
Indirekte od. kulturunabhängige Verfahren notwendig (PCR, Urease-Test,
Histologie, Atemtest, Stuhl-Antigen ELISA)
Enteritis versus Kolitis
Enteritis
Kolitis
Entzündung des
Dünndarms; meist
Störung des
Elektrolytflusses und
der Resorption
Entzündung des
Dickdarms; meist
invasiv und Zerstörung
der Epithelschicht
Enteritis versus Kolitis
Enteritis
Kolitis
Dünndarm
Dickdarm
Enterotoxin
Zytotoxin
Erbrechen/Durchfall
Durchfall
Stuhl:
Stuhl:
wässrig
blutig/schleimig
kaum Entzündung
viel Entzündung
Enteritis versus Kolitis
Enteritis
Vibrio cholerae
Enteritis-Salmonellen
ETEC
Campylobacter sp.
…….
Kolitis
Clostridium difficile
Shigella
EIEC, (EHEC)
Campylobacter sp.
……
Beispiele für Enteritis:
Vibrio cholerae
• Gram-negative, leicht gekrümmte Stäbchen
• Humanpathogen: V. cholerae, Serovar O1, O139
• Mensch ist einzige Infektionsquelle, Übertragung
direkt oder über Wasser, Nahrungsmittel
• Pathogenese: orale Aufnahme, IKZ 2-5 Tage, massive wässrige
Diarrhoe durch Choleratoxin; durch Alkalitoleranz Vermehrung der
Keime im Duodenum
• Toxin-regulierte Pili (TCP): Adhärenz an Darmzellen,
keine Invasion und Zerstörung der Mukosa
• Choleratoxin (CT); AB-Toxin: Aktivierung der Adenlytacyclase cAMP
 vermehrte Sekretion von Cl- und Wasser
Cholera: Klinik
•
Massive Ausscheidung von Elektrolyten und Wasser (bis zu
20l/Tag)
•
Breiig, immer wässriger werdender Stuhl („Reiswasserstuhl“),
Erbrechen
•
Großer Flüssigkeitsverlust:  Krämpfe, Heißerkeit,
Blutdruckabfall, bis Anurie, Kreislaufkollaps
•
Häufig sind auch leichte Verlaufsformen
Cholera:
Diagnose
• Mikroskopische Schnelldiagnostik: aus Reiswasserstuhl;
Nativpräparat, um die Beweglichkeit der Vibrionen zu
sehen
• Kultureller Erregernachweis: Empfindliche Erreger,
schneller Transport, Anreicherung in alkalischen
Peptonwasser, TCBS-Agar
Therapie
• Ausgleich des Wasser- und Elektrolytverlustes
• Evtl. Antibiotika (Tetrazycline): vermindern die Erregerausscheidung
• Expositionsprophylaxe
Exkurs: Cholera-Ausbruch Haiti
• Beginn nach dach dem starken Erdbeben 2010
• katastrophale hygienische Bedingungen
„650,000 cases reported by the Ministry of Public Health February 15, 2013), Médecins Sans
Frontières treated nearly 200,000 for a total cost of approximately $60 million and with a
mortality rate of less than 1%“ (London School of Hygiene & Tropical Medicine)
Exkurs: Cholera-Ausbruch Haiti
“Cholera still issue despite Haiti's public
health progress. Cholera cases have
dropped from more than 352,000 in 2011
to just over 15,000 in 2014”
Feb 19, 2015
Beispiele für Kolitis:
Clostridium difficile
• Virulenzmerkmale: Toxin A (Enterotoxin), Toxin B (Cytotoxin)
• Antibiotika-induzierte pseudomembranöse Enterokolitis
Keime überwachsen und
produzieren Toxine
• häufig nach:
• auch nach:
Clindamycin, Ampicillin, Tetracyclinen
Penicillinen, Cephalosporinen, Carbapenemen, Makroliden, CoTrimoxazol und einigen Zytostatika
• Diagnose:
Toxin-Nachweis, [evtl. Koloskopie]
• Therapie:
Vancomycin per os (0,125 g alle 6h, 10 Tage)
Metronidazol per os (0,25 g alle 6h, 10 Tage)
Beispiele für Enteritis & Kolitis:
Campylobacter jejuni:
Campylobacter coli:
C. fetus / C. laridis:
häufig bei
Haustieren und
Schlachtgeflügel
Virulenzfaktoren: Enterotoxin (LT), Zytotoxin (ähnlich dem Shigatoxin)
Klinik: ulzerierende Colitis, Kryptenabszesse (oft selbstlimitierend)
Beispiele für Enteritis & Kolitis:
Fallbericht Campylobacter jejuni:
• Philadelphia-chromosom- & BCR-ABL-positive chronische myeloische Leukämia (CML).
•
25 Jahre, akuter Beginn von blutiger Diarrhoe, Bauch-/Kopfschmerzen, Fieber (39.9°C),
Abgeschlagenheit
Fig.2: Wachstum auf Butzleragar
Fig. 1: Campylobacter (gram-negative- spiral, corkscrew-formed rods) in stool culture (left panel;
1000x magnification; virtual enlargement) and blood culture (right panel; 1000x magnification; virtual
enlargement). Gram’s Saffranin solution staining, dark light: Zeiss Axio® microscope (Zeiss, Jena,
Butzler Agar
Germany),
Campylobacter jejuni ssp. jejuni Bacteremia in a Patient with Philadelphia- and BCR-ABLPositive Chronic Myelogenous Leukemia (CML) in Cytogenetic and Molecular Remission after
2nd generation tyrosine kinase inhibitor therapy. M. Karrasch, W. Pfister, B. Edel, A. Stallmach,
S. Hagel, A. Hochhaus, J. Rödel . JMM Case Reports 2015, DOI: 10.1099/jmmcr.0.000083
Fig.3: Etest Ciprofloxacin
Darmpathogene Protozoen (1)
„Amöbenruhr“
Entamoeba histolytica:
Tropen, weltweit
Zyklus: Zyste (vierkenig) Minutaform: E. dispar
Zyste
Magnaform: E. histolytica
invasiv:
Komplikationen: Amöbom, Leberabszess, Abszesse in anderen Organen
Entamoeba histolytica
Darmpathogene Protozoen (2)
Giardia lamblia:
weltweit, Infektion durch Zysten,
nicht invasiv, wässr. Durchfälle,
Resorptionshindernis
Cryptosporidien:
weltweit, Infektionen meist latent, bei
Immunsuppression schwere, chronische Durchfälle
(AIDS)
Infektion durch Zysten, Internalisierung in
Epithelzellen
Mikrosporidien:
Infektion durch Zysten, Erkrankung bei AIDS
Isospora belli:
Infektion durch Oozysten, Kokzidiose (hartnäckige,
therapieresistente Durchfälle)
Häufiger bei Reiserückkehrern
und Immunsupprimierten
virale Gastroenteritiden
 Rotaviren: 6 Gruppen bei Mensch und Tier, befallen wird nur der
Dünndarm!
70nm , doppelsträngig RNA (segmentiert)  Reassortment
keine Hülle, inneres und äußeres Kapsid (Rad)
 Adenoviren: Typen 40, 41, vorwiegend Kinder betroffen,
80 nm., doppelstr. DNA, Spikes, keine Hülle
 Caliciviren: Brechdurchfälle, (HEV gehört zu den Caliciviren)
40 nm, einstr. RNA, keine Hülle
Norovirus, Norwalk-Agens: Gastroenteritiden bei Kindern
und Senioren
Norovirus
Explosiv-Epidemien
Diagnostisches / therapeutisches Vorgehen
abhängig von:
Stuhlbeschaffenheit:
- geformt, fest
- breiig, flüssig, schleimige oder blutige Bestandteile
- wässrig, mit Schleimflocken und /oder Blut
Status:
- Fieber
- Durchfälle / Tag
- Arthritis, Erythema nodosum, Appendizitis o. ä.
Anamnese:
- Alter
- ambulant oder stationär
- Klinik: Onkologie, Immunsuppression (z.B.
Transplantation, HIV), Intensivstation, etc.
- Reiseanamnese / Lebensmittelanamnese
- operative Eingriffe
- laufende Antibiotikatherapie
Diarrhoe (Durchfall)
Definition: mindestens drei ungeformte Stühle in 24h
Enteritis: Durchfall ohne Begleitsymptomatik
Dysenterie: Durchfall mit Begleitsymptomatik
(z.B. Fieber, Bauchkrämpfe, Stuhlentleerung mit Blutbeimengungen
akute Diarrhoe:
- Hauptursache: Erreger (Bakterien, Viren, Pilze)
- unterschiedliche Angriffspunkte der Erreger z. B. im Dünn- oder Dickdarm,
verschiedene klinische Symptomatik
chronische Diarrhoe:
- > 21 Tage anhaltend, häufig mit Allgemeinsymptomen z.B. Arthritis, Fieber,
Gewichtsverlust, Flush, Hyperpigmentation
- Genese eher parasitär, falls erregerbedingt
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Differential- und Selektivmedien für Gram-negative
Yersinien-Agar
CIN (Cefsulodin, Irgasan, Novobiocin)
Mannit
MacConkey-Agar Leifson-Agar
+
E. coli
Salm.
Abbau von
Laktose
Salmonella
Bildung von
H2S
Na-Selenit-Bouillon zur
Anreicherung von Salmonellen und
Shigellen
Fleischpepton + Natriumselenit pH 7,0
Campylobacter-Agar
(Columbia-Agar + Aktivkohle,
Hämatin, Cephalosporine,
Polymxin B, Vancomycin)
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Bunte Reihe: Differenzierung mittels biochemischer Reaktionen
gram-negative
Stäbe
Endo-Agar +
Glukoseverwertung
oxidativ / fermentativ
Wachstum
aerob / anaerob
Glukoseverwertung
Glukoseverwertung
oxidativ + fermentativ
negativ (oxidativ)
Wachstum
Wachstum
aerob + anaerob
nur aerob
E.coli
Klebsiella
Enterobacter
Proteus
Laktose +
Indol +
Citrat +
Harnstoff +
Citrat +
Harnstoff +
H2S +
Pseudomonas Acinetobacter
Oxidase +
Oxidase -
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Bunte Reihe api 20 E: Differenzierung mittels biochemischer Reaktionen
Prinzip der Bunten Reihe:
• bakteriologisches Verfahren zur Bestimmung/Differenzierung von Bakterien
aufgrund ihrer stoffwechselphysiologischen Leistungen.
• Bakteriensuspension wird in api 20 E eingeimpft
• unterschiedliche Nährlösungen enthalten Indikatoren, die durch eine pHabhängige Farbveränderung die Verwertung der Substrate oder durch andere
Farbreaktionen die Bildung bestimmter Substanzen durch Bakterien anzeigen.
Vorbereitung der api20E Bunten Reihe:
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Bunte Reihe api 20 E: Differenzierung mittels biochemischer Reaktionen
api 20 E vor Inkubation
api 20 E nach Inkubation
 Der differenzierte Keim ist E. coli.
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Agglutination: Differenzierung mittels Agglutination
von Oberflächenantigenen
Beispiel Salmonellen
Einteilung nach Antigenen der Zellwand (O), der Kapsel (K) und der Geisel (H)
Einteilung durch Agglutination
 Kauffmann-White-Schema : (Antigen-Formel) SEROVAR
Bakteriologische Stuhldiagnostik
Vitek: Differenzierung mittels
biochemischer Reaktionen
MALDI-TOF: Differenzierung
mittels Massensprektrometrie
Keimdifferenzierung und
Resistenztestung
Sehr schnelle
Keimdifferenzierung
Vitek-2
MALDI-TOF
Aufgaben heute im Kurs
- Bearbeitung eines Rektalabstrichs
- Vorbereitung Kurstag 6: Atemwegsinfektionen
- Demonstrationen
Bearbeitung eines Rektalabstrichs (1)
Klinischer Fall: Patient mit Durchfall ohne Reiseanamnese, vor 2 Tagen vom
„Mitbringbuffett“ beim Sommerfest des Kleingartenvereins verschiedene Salate
gegessen
Material:
• je 2er Gruppe Stuhlsuspension, Drigalski- , S-S- Agar, Impfösen
• Reinkulturen von E. coli, Proteus, Salmonellen auf Columbiaschafblut- bzw.
Drigalskiagar, Oxidaseplättchen,
• api20 E Kit
• NaCl Röhrchen
• Pasteurpipetten
Bearbeitung eines Rektalabstrichs (2)
Durchführung:
• Anlegen einer Bakterienkultur mit fraktioniertem Verdünnungsausstrich auf
Festmedien und Inkubation.
• Keimidentifizierung aus Reinkultur mittels Bunter Reihe (api20E)
(siehe Skript Methodenteil).
Auswertung: (an Kurstag 6):
• Testung verdächtiger Kolonien auf Agglutination mit den polyspezifischen
Seren gegen verschiedene EPEC/EHEC/ETEC oder Salmonellen (Coli I
und III, Salmonella I).
• Eine halbe Kolonie mit der Impföse auf einem Glasobjektträger in einem
Tropfen Kochsalzlösung verreiben und die andere halbe Kolonie mit einem
Tropfen Testserum behandeln.
• Beobachtung und Dokumentation von entstehenden Agglutinaten.
Vorbereitung Kurstag 6: Atemwegsinfektionen
Normale Rachenflora:
Material:
• 1 Abstrichtupfer pro Person
• Kulturplatten (Kochblut-, Blut-, Drigalskiagar)
• Objektträger, Stifte für Beschriftung
Durchführung:
• Abnahmen eines Rachenabstrichs durch Ihre(n)
Nachbarin/Nachbarn im Kurs
• Anlegen des Rachenabstrichs auf Kulturplatten als
Verdünnungsausstrich auf Blutagar und
Kochblutagar
Demonstrationen:
Selektivnährmedien, Gram-Präparate, biochemische Differenzierungen von:
• Salmonellen
• Shigellen
• Campylobacter
• E. coli
• Yersinia
• C. difficile
• H. pylori
Viel Erfolg im Kurs !