Doktorarbeit_Hella_Pfeiffer_Opus

Bestimmung der Oberflächenmarker und des Aktivierungsgrades von
CD14+ Zellen aus humanem Blut nach Stimulation und Reifung mit
IL-4/GM-CSF oder IL-15/GM-CSF
Aus der Medizinischen Klinik I mit Poliklinik
Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Hella Andrea Pfeiffer
aus Stuttgart
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
PD Dr. W. Dieterich
Gutachter:
Prof. Dr. M. Neurath
Tag der mündlichen Prüfung:
23.02.2015
Für Hanke
und
für Gerhard.
ii
INHALTSVERZEICHNIS
iii
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung
1
1.1
Hintergrund und Ziele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2
Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.3
Ergebnisse und Beobachtungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.4
Praktische Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
2 Englische Zusammenfassung
3
2.1
Background and objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.2
Material and methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.3
Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
2.4
Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
3 Einleitung und Fragestellung
3.1
3.2
3.3
5
Zöliakie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
3.1.1
Klinik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
3.1.2
Pathologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.1.3
Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.1.4
Therapeutische Möglichkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Zelluläre Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.2.1
HLA-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.2.2
Dendritische Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2.3
Oberflächenmerkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2.4
Intraepitheliale Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.5
Interleukine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
iv
INHALTSVERZEICHNIS
4 Durchführung
27
4.1
Probanden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2
Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2.1
Blutgewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.2.2
Isolierung von CD14 positiven Zellen . . . . . . . . . . . . . . 28
4.2.3
Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.2.4
Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.2.5
Lymphozytenproliferationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.6
Antikörpernachweis mittels ELISA . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2.7
HLA-Klasse-II Typisierung auf HLA-DQ2/8-Status . . . . . . 41
4.3
Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4
Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.4.1
Laborgeräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.4.2
Gefäße . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4.3
Laborzubehör . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4.4
Reagentien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.4.5
Kommerzielle Reaktionssysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.4.6
Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5 Ergebnisse
5.1
51
Durchflusszytometrische Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.1
CD14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.2
CD25 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.3
CD83 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.4
CD86 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.1.5
HLA-DR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.1.6
CD89 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.1.7
CD209 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.1.8
CD71 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.1.9
TG2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.1.10 CD103 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.2
Lymphozytenproliferationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
INHALTSVERZEICHNIS
v
5.2.1
HLA-DQ2/8-negative Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . 70
5.2.2
HLA-DQ2/8-positive Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
5.2.3
Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät . . . . . . . . . . . . 75
5.2.4
Aktive‘ Zöliakiepatienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
’
6 Diskussion
79
7 Literaturverzeichnis
87
8 Abkürzungsverzeichnis
97
9 Abbildungsverzeichnis
101
10 Tabellenverzeichnis
103
11 Danksagung
105
vi
INHALTSVERZEICHNIS
1
Kapitel 1
Zusammenfassung
1.1
Hintergrund und Ziele
Die Zöliakie ist eine Autoimmunerkrankung, welche sich vorwiegend in einer
lokalen Entzündungsreaktion der Dünndarmschleimhaut zeigt. Das auslösende Agens
(Gluten) ist bekannt und kann nach Belieben der Ernährung hinzugefügt oder weggelassen werden. In dieser Arbeit wurde die Oberflächenexpression von dendritischen
Zellen und Makrophagen in Abhängigkeit vom Stimulans untersucht, wobei die Zellen
von Zöliakiepatienten und gesunden Kontrollpersonen verglichen wurden.
1.2
Methoden
Ausgewertet wurde das Blut von 20 Probanden: zehn Kontrollen (jeweils fünf
HLA-DQ2/8-negative und fünf HLA-DQ2/8-positive), fünf Zöliakiepatienten unter
glutenfreier Diät und fünf aktive‘ Zöliakiepatienten, die sich glutenhaltig ernährten.
’
Aus dem Blut der Probanden wurden mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten
die peripheren mononukleären Zellen isoliert. Diese wurden über magnetmarkierte
Partikel weiter aufgetrennt; die CD14+ Zellen wurden in einer Zellkultur ausgesät und
nach einer Woche per Durchflusszytometrie vermessen. Die CD14− Zellen wurden
tiefgefroren und später als Effektorzellen im Lymphozytenproliferationstest eingesetzt.
Bei allen Probanden wurden der HLA-DQ2/8-Trägerstatus sowie eventuell vorhandene anti-Transglutaminase-Antikörper (IgA/IgG) bestimmt.
2
KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
1.3
Ergebnisse und Beobachtungen
Der HLA-DQ2/8-Trägerstatus hatte nur geringe Bedeutung bezüglich der Stimulierbarkeit von IL-4- oder IL-15-gereiften Zellen und deren weitere Stimulation
durch TG2 oder T-Gliadin. Auch der Aktivitätsgrad der Zöliakieerkrankung hatte
nur einen geringen Einfluss auf die Stimulierbarkeit der eingesetzten Zellen. Von
größerer Bedeutung schien eher das Zytokinmilieu zu sein. Eine Stimulation mit TG2
wirkte sich auf die Moleküle CD25 und CD89 positiv, auf CD209 negativ aus. Die
Inkubation mit T-Gliadin führte vor allem bei den IL-15-gereiften Makrophagen zu
einer ausgeprägten Hochregulation, besonders bei CD25, CD71, CD89, CD103 und
TG2. Die Kombination aus erhöhter IL-15-Konzentration im intestinalen Gewebe von
Zöliakiepatienten mit einer erhöhten CD25-Expression scheint zu einer vermehrten
Immunstimulation zu führen.
1.4
Praktische Schlussfolgerungen
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in einem Zytokinmilieu, wie es
bei Zöliakiepatienten auftritt (erhöhte IL-15-Konzentration), Gliadinfragmente eine deutliche Immunstimulation bewirken. Neben der vermehrten Expression des
Aktivitätsmarkers CD25 wurde auch eine deutlich höhere Expression der Oberflächentransglutaminase 2 gefunden, was zu einer effizienteren Phagozytose bzw.
Bereitstellung von deamidierten, immunstimulatorischen Gliadinpeptiden führen
könnte. Erhöhte CD71-Werte können einen vermehrten Durchtritt von Gliadinfragmenten durch das Epithel fördern, CD89 eine effizientere Antigenpräsentation. Hohe
CD103-Marker erleichtern die migratorische Rückkehr der Immunzellen in das Darmepithel. Gemeinsam führen diese Moleküle zu einer stärkeren Immunmodulation.
Möglicherweise stellt die Blockade von IL-15 einen therapeutischen Ansatzpunkt bei
Zöliakie dar.
3
Kapitel 2
Englische Zusammenfassung
2.1
Background and objectives
Coeliac disease is an autoimmune disorder which manifests itself in a localized
inflammatory process of the mucosa in the small intestine. A characteristic feature
is the known trigger (gluten), which can be added to or eliminated from the diet.
In this thesis the expressions of certain surface molecules on dendritic cells and
macrophages were studied. The cells of coeliac disease patients and healthy controls
were compared.
2.2
Material and methods
The blood samples of 20 probands were evaluated: ten healthy controls (five
HLA-DQ2/8-negative and five HLA-DQ2/8-positive), five coeliac disease patients
on a gluten-free diet and five active‘ coeliac disease patients on a gluten-containing
’
diet.
From the probands blood the peripheral mononuclear cells were isolated through
a Ficoll density gradient. These were further separated by magnetic cell sorting; the
CD14+ cells were planted in cell cultures and measured by fluorescence associated
cell sorting after one week. The CD14− cells were frozen and later used as effector
cells in a lymphocyte reaction.
All probands were typed for HLA-DQ2/8 and checked for anti-transglutaminase-
4
KAPITEL 2. ENGLISCHE ZUSAMMENFASSUNG
antibodies (IgA/IgG).
2.3
Results
The presence of HLA-DQ2/8 only had a minor effect on the stimulation of cells
with IL-4 or IL-15 as well as on the further stimulation with tTG or T-gliadin.
The degree of activity of the coeliac disease also had only a small impact on the
stimulated cells. In contrast, the cytokine environment seemed to have a pronounced
effect.The stimulation with tTG had a positive effect on CD25 and CD89 and a
negative effect on CD209. The incubation with T-gliadin, especially in IL-15-derived
macrophages, lead to a marked rise in the expression of CD25, CD71, CD89, CD103
as well as tTG. High levels of IL-15 (as shown in the intestinal mucosa of coeliac
disease patients) combined with an elevated expression of CD25 seem to favor the
heightened stimulation of the immune system.
2.4
Conclusions
This thesis showed that in a special cytokine environment as seen in coeliac
disease patients (high levels of IL-15) gliadin fragments cause a distinct stimulation
of the immune system. An elevated expression of both the activation marker CD25
as well as surface tissue transglutaminase was found, which could lead to a more
efficient phagocytosis and, respectively, to a preferred presentation of deamidated,
immunostimulatory gliadin fragments. Elevated levels of CD71 facilitate the passage
of gliadin fragments through the epithelium. High levels of CD89 lead to a more
efficient presentation of antigens. High levels of CD103 enable the immune cells to
return to the intestinal epithelium. Taken together, these changes in the expression
of CD-molecules lead to a marked modulation of the immune system. The inhibition
of IL-15 could prove to be a therapeutic target in coeliac disease.
5
Kapitel 3
Einleitung und Fragestellung
Die Zöliakie ist eine Erkrankung, welche seit langem bekannt ist, aber erst in
den letzen Jahren in das Bewusstsein der breiteren Bevölkerung gedrungen ist. Die
wohl erste Beschreibung sowie die Bezeichnung Zöliakie stammen von Aretaeus
dem Kappadokier aus dem ersten oder zweiten Jahrhundert [2]. Samuel Gee (18391911) beschrieb die Erkrankung im Jahre 1888 als erster eindeutig als chronische
Verdauungsstörung [17]. Willem Karel Dicke (1905-1962) zeigte 1950, dass eine
weizen-, roggen- und haferfreie Diät zu einer deutlichen Besserung der Beschwerden
führte und identifizierte 1953 Gluten als auslösendes Element [17, 35, 69].
Der Begriff Zöliakie“ wurde von Aretaeus verwendet und von Gee aufgegrif”
fen [17]. Er stammt von dem griechischen Wort koiliakos“ ab, was abdominell
”
bedeutet bzw. von koila“, der bauchigen Krankheit‘ [21, 74]. Im Laufe der Ge”
’
schichte erhielt die Krankheit viele andere Namen wie idiopathische Steatorrhoe,
glutensensitive Enteropathie, nicht-tropische Sprue, einheimische Sprue oder intestinaler Infantilismus [21].
Die Zöliakie kann sich in jedem Lebensalter manifestieren [15]. Während die
Erkrankung lange Zeit vor allem im Kleinkindesalter auftrat, zeigt sich heute die
höchste Prävalenz im Alter [15, 17]. Trotz der klassischen Verdauungsbeschwerden,
die bereits Aretaeus benannte, handelt es sich bei der Zöliakie um eine lebenslange,
systemische Erkankung, die nahezu alle Organsysteme betreffen kann [2, 53].
Mit der Nahrung aufgenommene Proteine bestimmter Getreidearten, Glutene
genannt, sind das kritische Agens sowohl in der Auslösung als auch in der Aufrecht-
6
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
erhaltung einer Zöliakie [74]. Unter strikter glutenfreier Diät werden die Patienten1
in der Regel beschwerdefrei und auffällige klinische Befunde normalisieren sich [57].
Die Zöliakie weist eine ausgeprägte HLA-Assoziation auf: Nahezu alle Patienten
tragen die HLA-Moleküle DQ2 und/oder DQ8 [36]. Diese Gene sind bei etwa 20
bis 40% der europäischen Allgemeinbevölkerung vorhanden, aber nur zwei bis fünf
Prozent der Genträger erkranken an einer Zöliakie [15, 28, 58].
Um den Effekt von Gluten auf die Entwicklung bestimmter Zellpopulationen des
Immunsystems zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit periphere mononukleäre
Zellen aus venösem Blut isoliert, die in Zellkulturen zu dendritischen Zellen und zu
makrophagenähnlichen Zellen heranwuchsen. Die reifen Zellen wurden mit verschiedenen Antigenen stimuliert. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Veränderungen in
der Expression bestimmter Oberflächenmoleküle in Abhängigkeit vom Stimulans untersucht. Außerdem wurde im Lymphozytenproliferationstest überprüft, in welchem
Ausmaß diese gereiften Zellen in der Lage sind, naive Immunzellen zur Proliferation
zu bewegen.
Besonders interessierte in diesem Hinblick die Frage, ob sich Zellen von Zöliakiepatienten, verglichen mit Zellen von gesunden Kontrollpersonen, bei der Reifung
unterschiedlich verhalten und ob der HLA-Status einen Einfluss darauf hat.
Kapitel 3.1 gibt einen Überblick über die Erkrankung Zöliakie, ihre Klinik, Pathologie, Diagnostik sowie therapeutische Möglichkeiten. Kapitel 3.2 befasst sich mit
zellulären Eigenschaften, welche im Rahmen der Zöliakie von besonderer Bedeutung
sind. Eine detaillierte Beschreibung der Fragestellung findet sich in Kapitel 3.3.
3.1
Zöliakie
In Westeuropa sind ein bis zwei Prozent der Bevölkerung an Zöliakie erkrankt,
wobei die Gesamtprävalenz in den letzten Jahren einen starken Anstieg aufwies [15,53].
Die meisten dieser Patienten haben klinisch nur wenig ausgeprägte Symptome und
1
Zur besseren Lesbarkeit der Arbeit werden Personengruppen (Probanden, Patienten, Kontrollen)
in einer neutralen Form angesprochen, wobei, soweit nicht explizit beschrieben, immer Menschen
aller Geschlechter gemeint sind.
3.1. ZÖLIAKIE
7
werden erst im Erwachsenenalter diagnostiziert [15, 28]. Es wird vermutet, dass
nur einer von sieben Patienten auch korrekt diagnostiziert wird [68]. Warum sich
die Zöliakie in verschiedenen Lebensaltern manifestieren kann, ist nicht bekannt
[28]. Ein erhöhtes Erkrankungsrisiko findet sich bei Verwandten ersten Grades von
Zöliakiepatienten sowie bei Patienten mit weiteren Autoimmunerkrankungen [55].
Die Zöliakie ist eine systemische Erkrankung, manifestiert sich aber klassischerweise als entzündliche Erkrankung des Dünndarmes bei genetisch prädisponierten
Personen [53, 58]. Die krankheitsfördernden Proteine aus Weizen sind die Gliadine,
aus Roggen die Secaline und aus Gerste die Hordeine [58]. Für die Manifestation einer
Zöliakie ist ein Kontakt mit dem auslösenden Protein, dem Gluten, unerlässlich [15].
Hafer enthält die Avenine, welche nach heutigem Wissen von Zöliakiepatienten
toleriert werden [23]. Allerdings besteht beim Hafer eine hohe Gefahr durch Kontamination mit Gluten im Rahmen des Herstellungs- und Verarbeitungsprozesses, so
dass eine glutenfreie Diät momentan noch weitgehend auf Hafer verzichtet [18, 54].
Die HLA-Merkmale DQ2 (DQA1*05, DQB1*02) und DQ8 (DQA1*03, DQB1*0302) sind notwendige Faktoren für die Entstehung einer Zöliakie, aber da längst
nicht alle Genträger erkranken, muss es weitere Risikofaktoren geben [55]. Kontrovers
diskutiert werden momentan eine beginnende Glutenzufuhr vor dem vierten oder
nach dem siebten Lebensmonat, genauso wie wiederholte Rotavirus-Infektionen im
Kleinkindalter [66].
Die Symptome und mögliche Manifestationen der Zöliakie werden in Kapitel
3.1.1 geschildert, die pathologischen Mechanismen in Kapitel 3.1.2, die Diagnostik in
Kapitel 3.1.3 und die therapeutischen Möglichkeiten in Kapitel 3.1.4.
3.1.1
Klinik
Klassischerweise sind die Symptome der Zöliakie gastrointestinaler Natur: vor
allem Diarrhoe, zum Teil Steatorrhoe, Krämpfe und Blähungen, seltener Obstipation [15, 55]. Kleinkinder leiden oft an Gewichtsabnahme und Gedeihstörungen [15].
Häufig fallen die Patienten durch die Folgen der Malabsorption sowie die extraintestinalen Symptome auf: Abgeschlagenheit, Anämie, Appetitlosigkeit, Gewichts-
8
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
verlust, Müdigkeit, Muskelschmerzen oder Übelkeit, seltener Infertilität, neurologische
oder psychiatrische Auffälligkeiten, unklare Transaminasenerhöhungen oder Zahnschmelzdefekte (siehe Tabelle 3.1 auf S.8) [15, 23]. Die meisten klinischen Symptome
lassen sich auf die Malabsorption zurückführen [28].
Tabelle 3.1: Klinische Symptome einer Zöliakie, modifiziert nach [15, 23], ergänzt
durch [55, 75].
klassische Symptome
atypische Symptome
ausladendes Abdomen
abdominelle Schmerzen
Durchfall, Steatorrhoe
Anämie durch Eisenmangel
Gedeihstörungen
Appetitlosigkeit
Krämpfe, Blähungen
Dermatitis herpetiformis
Müdigkeit, Abgeschlagenheit
erhöhte Abortrate
Rachitis
erhöhte Transaminasen
schneller Gewichtsverlust
Folsäuremangel
Übelkeit, Erbrechen
Haarausfall
Untergewicht
Infertilität
Osteoporose durch Vitamin-D-Mangel
periphere Neuropathie
psychiatrische Auffälligkeiten
Zahnschmelzdefekte
Die meisten dieser Krankheitssymptome, vor allem die gastrointestinalen Beschwerden sowie die Müdigkeit und Abgeschlagenheit, sind unter glutenfreier Diät
innerhalb kurzer Zeit rückläufig [4, 69].
Damit es bei einem an Zöliakie Erkrankten zu Symptomen kommt, muss eine
glutenhaltige Ernährung vorliegen und zusätzlich die Krankheit über einen Trigger
aktiviert werden [4]. Als Auslöser sind gastrointestinale Infekte, Mangelernährung,
Stresssituationen oder Malignome in der Diskussion [4].
Nicht bei allen Patienten liegen die typischen Zöliakiesymptome vor [75]. Es gibt
noch die monosymptomatische, stumme, atypische, latente und refraktäre Zölia-
3.1. ZÖLIAKIE
9
kie [29, 75]. Die monosymptomatische Zöliakie ist durch lediglich diskrete Verdauungsbeschwerden gekennzeichnet, allerdings sind sowohl Antikörper als auch die
Duodenalschleimhaut pathologisch verändert [29]. Bei Patienten mit stummer Zöliake
finden sich nur geringfügig ausgeprägte Symptome, bei zöliakietypisch auffälliger Serologie sowie Histologie [75]. Bei der atypischen Zöliakie finden sich klinisch relevante
extraintestinale Sympome bei fehlenden Verdauungsbeschwerden; diese Patienten
zeigen erhöhte Antikörper sowie die typischen Veränderungen der duodenalen Mukosa [55, 75]. Die latente Zöliakie, welche nur bei Patienten mit eindeutiger Zöliakiedagnostik in der Vorgeschichte festgestellt werden darf, zeichnet sich durch serologische
und bioptische Befunde aus, die trotz glutenhaltiger Ernährung unauffällig sind [29].
Die refraktäre Zöliakie findet sich bei Patienten mit gesicherter Erkrankung, die auf
eine glutenfreie Diät nur unzureichend ansprechen (ca. 5% aller Patienten) [55, 68].
Diese Patienten haben ein hohes Komplikationsrisiko, therapeutisch werden die Gabe
von Immunsuppressiva und Glucocorticoiden versucht [55].
Mittlerweile liegt das klassische Vollbild nur noch bei 10 bis 20% der Patienten
vor, die häufigste Form ist die atypische Zöliakie [29, 55].
Unter Zöliakiepatienten finden sich gehäuft weitere Autoimmunerkrankungen wie
Diabetes mellitus Typ I, Schilddrüsenfunktionsstörungen oder Leberfunktionsstörungen [72]. Diese treten deutlich häufiger bei Patienten auf, deren Zöliakie erst im
Erwachsenenalter diagnostiziert wurde [56]. Die Zöliakie findet sich häufiger bei
Patienten, die ein Down-, Sjögren- oder Turner-Syndrom haben [74].
Komplikationen scheinen gehäuft vor allem bei langjährig untherapierten Patienten aufzutreten [27]. Jene umfassen ulzerierende Entzündungen des Dünndarmes
oder Infertilität und erhöhte Abortneigung bei mangelhaft therapierten Patientinnen [53, 74]. Am gefürchtesten sind Non-Hodgkin-Lymphome des Gastrointestinaltraktes, genannt MALT-Lymphome [74]. Bei Glutenzufuhr ist das Riskio hierfür bis
40fach erhöht; nach fnf Jahren strikt glutenfreier Therapie sinkt es auf das Risiko
der Allgemeinbevölkerung ab [74, 75].
10
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
3.1.2
Pathologie
An Zöliakie erkrankte Patienten können bestimmte Getreideproteine, die sogenannten Glutene, zwar verstoffwechseln, reagieren darauf aber mit (typischen)
Beschwerden [15, 69]. Die zöliakiefördernden Glutene kommen in den phylogenetisch
nahe verwandten Arten Weizen, Roggen und Gerste vor, nicht jedoch in reinem
Hafer [63]. Gliadin, der alkohollösliche Anteil des Weizenglutens, ist reich an den
Aminosäuren Glutamin und Prolin [56, 75]. Prolinreiche Peptide sind resistenter
gegenüber Proteolyse durch Verdauungsenzyme und erreichen den Dünndarm daher
als große, immunogene Moleküle [41, 63]. Das Gluten durchquert das Darmepithel,
wird von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und über die
Oberflächenmoleküle HLA-DQ2/8 den T-Lymphozyten dargeboten [11, 47].
1997 konnten Dieterich et al zeigen, dass das ubiquitär vorkommende Enzym
Transglutaminase 2 (TG2; engl. tissue transglutaminase, tTG) das dominierende
Autoantigen der zöliakiespezifischen Autoantikörper ist [13, 55]. Die TG2 befindet
sich im Endomysium2 , liegt primär intrazellulär vor und wird bei Entzündungen,
mechanischer Belastung oder Apoptose vermehrt freigesetzt [15, 56]. Fibroblasten,
mononukleäre Zellen und aktivierte Endothelien sind besonders reich an TG2 [56].
Die Aminosäuresequenz von Gluten besteht zu 15% aus Prolin und zu 30 bis 50%
aus Glutamin, was die Glutene zu einem idealen Substrat der Transglutaminase machen [56, 57]. Die TG2 ist ein Kalzium-abhängiges Enzym und führt zu einer Quervernetzung von Proteinen durch die Ausbildung einer Glutamyl-LysylIsopeptidbindung [15,55]. Durch Autokatalyse kann die TG2 auch eine kovalente Bindung mit Glutenfragmenten, die nur unzureichend verdaut wurden, eingehen [15, 55].
Die TG2 ist aber auch in der Lage, bestimmte Glutaminreste direkt nach der
Durchquerung des Darmepithels zu Glutamat zu deamidieren, was zu einer negativen Ladung der Peptide führt [11, 15]. Diese veränderten Glutenpeptide weisen
eine erhöhte Affinität zu den HLA-DQ2/8-Molekülen auf, woraus eine verstärkte
Immunreaktion resultiert [15].
Somit ist Gluten, gemeinsam mit TG2, für die Aufrechterhaltung einer chronischen
2
Das Endomysium ist ein retikuläres Bindegewebe, welches bspw. glatte Muskelfasern umgibt.
3.1. ZÖLIAKIE
11
Immunantwort im Dünndarm von Zöliakiepatienten verantwortlich; für die Initiierung
des inflammatorischen Prozesses scheint Gluten alleine zu genügen [55]. Hierbei
werden sowohl die adaptive als auch die native Immunantwort aktiviert [55].
Die adaptive Immunantwort beruht auf CD4+ CD8+ glutenreaktiven T-Lymphozyten in der Lamina propria des Dünndarms [55]. Diese werden bei der Präsentation
von Glutenpeptiden über HLA-DQ2/8-Moleküle zur Proliferation angeregt und sezernieren proinflammatorische Zytokine [41,55]. Im Rahmen dieses proinflammatorischen
Prozesses, vor allem durch das Zytokin Interleukin-γ, kommt es zur Hyperplasie der
Krypten und zur Atrophie der Dünndarmzotten [55, 68].
Die native Immunantwort ist durch eine vermehrte Sekretion von Interleukin15 (IL-15) der duodenalen Epithelzellen gekennzeichnet [37, 55]. IL-15 aktiviert
intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und verlängert deren Überlebenszeit [55]. Diese
IEL sind nach ihrer Aktivierung in der Lage, Enterozyten, welche Stresssignale
exprimieren, zu erkennen und abzutöten [55, 63]. Zusätzlich werden dendritische
Zellen aktiviert, die in die spezifische Immunantwort eingreifen [55].
3.1.3
Diagnostik
Die Prävalenz symptomatischer Zöliakiepatienten liegt bei 1:2000; sie steigt unter
Einbeziehung atypischer Krankheitsverläufe auf 1:100 [63, 75]. Die Ausprägung der
duodenalen Veränderungen und die Antikörpernachweise korrelieren kaum mit der
klinischen Symptomatik oder dem Schweregrad der Erkrankung [75].
Der Goldstandard zur Diagnose einer Zöliakie ist die duodenale Biopsie [15].
Bei Verdachtsfällen sind Antikörpernachweise ein wichtiger, nichtinvasiver Schritt,
wobei die IgA-Transglutaminase-Antikörper ein zuverlässigeres Ergebnis liefern als
IgG-Antikörper [15]. IgA-Transglutaminase-Antikörper sind geeignet um bei Patienten mit niedrigem Risiko eine Zöliakie auszuschließen; bei Kindern mit hohem
Erkrankungsrisiko werden sie als Screeninginstrument verwendet [4].
2012 wurden die 1990 erstellten ESPGHAN-Kriterien für die Diagnose der Zöliakie,
aufgestellt von der European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology
and Nutrition, überarbeitet [30]. Sie umfassen die Symptomatik, das histologische
12
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
Ergebnis und die Antikörperbefunde sowie die Tatsache, dass sich diese unter glutenfreier Diät zurückbilden [30, 75].
Bei Zöliakieverdacht sollten zuerst die Antikörper untersucht und je nach Ergebnis direkt im Anschluss eine duodenale Biopsie durchgeführt werden [55]. Es gibt
Risikopersonengruppen, bei denen eine Antikörpersuche als Screeningtest indiziiert
sein kann: bei erstgradigen Verwandten von Zöliakiepatienten (Risiko 10%), bei
gleichzeitigem Vorliegen eines Turner- (8 bis 10%) oder Downsyndromes (7%), bei
schwer beherrschbarem Diabetes Typ I (2 bis 4%), bei unklarer Eisenmangelanämie
(5%), Kleinwuchs (8%), Infertilität (3%) sowie bei unklaren neurologischen oder
psychiatrischen Erkankungen (35%) [29, 55].
Antikörper
Durch die Antikörperdiagnostik, welche sich in den letzten Jahrzehnten stetig verbessert hat, werden zunehmend atypische und oligosymptomatische Zöliakieverläufe
diagnostiziert [23]. Im Rahmen der Zöliakie treten verschiedene (Auto-)Antikörper
auf [56]. Der Grund für diese Antikörperproduktion ist bislang unklar [63].
Für die Diagnostik sind die Antikörper der Klasse IgA aufgrund der hohen
Sensitivität und Spezifität zuverlässiger als IgG-Antikörper [13, 14]. Zu beachten
ist jedoch die IgA-Defizienz, die bei 2% aller Zöliakiepatienten vorkommt und bei
negativen IgA-Antikörpern und dringendem klinischen Verdacht auf eine Zöliakie
ausgeschlossen werden muss [74].
IgA-Antikörper werden im gesamten Gastrointestinaltrakt epithelial produziert
und sezerniert [68]. Ihre Produktion wird durch verschiedene Zytokine, bspw. IL-4,
IL-5, IL-6 und IL-10, gefördert [68]. Sezernierte IgA-Antikörper binden dietätische
oder mikrobielle Antigene und tragen so zu ihrer Neutralisierung bei [68].
Das gewebsständige Enzym TG2 findet sich in hoher Konzentration in den
Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes, wo es als inaktive Vorstufe intrazellulär
gespeichert wird [57]. Es wird durch mechanische oder inflammatorische Stresssignale
freigesetzt und benötigt zu seiner Aktivierung hohe Kalziumkonzentrationen, wie
sie extrazellulär vorliegen [57]. Dieses Enzym ist das Autoantigen, gegen welches
sich die Anti-Endomysium-Antikörper richten [67]. Sie weisen eine hohe Spezifität
3.1. ZÖLIAKIE
13
sowie Sensitivität auf und sind deutlich sensitiver und spezifischer als Anti-GliadinAntikörper [14, 23]. Diese finden heute nur in der Diagnostik von Kleinkindern
routinemäßige Anwendung, da diese häufig noch über keine Anti-TransglutaminaseAntikörper verfügen [15].
Anti-Endomysium-Antikörper (EmA) erhielten im Laufe der Geschichte verschiedene Namen: Anti-Reticulin-Antikörper, antijejunale Antikörper, antiumbilicale
Antikörper und antiendomysiale Antikörper [56]. EmA werden mittels Immunfluoreszenz an Gewebeproben aus Affenösophagus oder humaner Nabelschnur nachgewiesen
und unter dem Mikroskop ausgewertet [55]. Die Sensitivität liegt für beide Gewebe bei
mehr als 90%, die Spezifität bei knapp 100% [55]. Allerdings ist dieser Nachweis deutlich aufwendiger als die Bestimmung der Anti-Transglutaminase-Antikörper [14, 28].
Antikörper gegen TG2 werden über einen enzymgekoppelten Immunoassay (ELISA) nachgewiesen und quantifiziert [14]. Die Sensitivität dieser Methode liegt für
IgA-Antikörper bei 90 bis 95%, die Spezifität bei mehr als 95% [55]. Der Nachweis
von IgG-Antikörpern ist unspezifischer, außer bei Zöliakiepatienten mit IgA-Defizienz,
welche meist auffallend hohe IgG-Anti-Transglutaminase-Antikörper aufweisen [15].
Anti-Transglutaminase-Antikörper eignen sich auch zur Verlaufskontrolle bei Patienten unter glutenfreier Diät [28].
Antikörper gegen Gliadin werden ebenfalls mittels ELISA nachgewiesen, allerdings
weisen sie nur einen sehr geringen positiv-prädikitiven Wert auf [55]. 2010 wurde der
Nachweis erbracht, dass IgG-Antikörper gegen deamidierte Gliadinpeptide ebenfalls
eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität aufweisen [3,73]. Das momentan treffendste
Screeningverfahren scheint aus der Kombination von IgA-Anti-TransglutaminaseAntikörpern mit IgG-Antikörpern gegen deamidierte Gliadinpeptide zu bestehen [73].
Unter einer strikten glutenfreien Diät normalisieren sich die Antikörpertiter, was
bedeutet, dass bei korrekt therapierten Patienten nur sehr geringe Titer zöliakietypischer Antikörper nachweisbar sind [14, 67].
14
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
Duodenale Biopsie
Die duodenale Biopsie wurde mit den Entwicklungen von Shiner (1956) und
Crosby/ Kugler (1957) an lebenden Patienten möglich [9, 61]. Sie ist auch heute noch
der Goldstandard der Zöliakiediagnostik, wobei die Entnahme von mindestens vier
Gewebeproben aus unterschiedlichen Teilen des Duodenums empfohlen wird, um
unvollständig ausgeprägte Befunde nicht zu übersehen [29, 30]. Sobald der Verdacht
auf eine Zöliakie besteht und Antikörper nachweisbar sind, sollte eine Biopsie durchgeführt werden [55]. Die histologischen Veränderungen beinhalten die Infiltration
von Lymphozyten in das Epithel (sog. intraepitheliale Lymphozyten, IEL; auffällig
sind mehr als 30 bis 40 IEL pro 100 Enterozyten), eine Kryptenhyperplasie, eine
Zottenatrophie sowie den Zellgehalt der Lamina propria [38, 74]. Im Folgenden sind
die Stadien nach Marsh aufgeführt3 (siehe Abbildung 3.1 auf S.15) [45]:
Stadium 0 (präinfiltrativ): Hierbei ist die Schleimhaut vollkommen unauffällig.
Stadium I (infiltrativ): Es finden sich mehr als 40 IEL pro 100 Enterozyten; gastrointestinale Beschwerden treten nur selten auf.
Stadium II (hyperplastisch): Die Anzahl an IEL ist vermehrt auf mehr als 40 pro
100 Enterozyten und die Krypten sind hypertrophiert.
Stadium III (destruktiv): Die Anzahl an IEL beträgt mehr als 40 pro 100 Enterozyten, die Krypten sind hypertroph, die Zotten atroph und die Anzahl an
Entzündungszellen in der Lamina propria ist erhöht; die Zottenatrophie hat
eine deutliche Reduktion der resorptiven Oberfläche zur Folge. Dieses Stadium
wird weiter unterteilt in Marsh IIIa (milde Zottenatrophie), IIIb (hochgradige
Zottenatrophie) und IIIc (totale Zottenatrophie).
Stadium IV (hypoplastisch): Hierbei sind alle Zotten atroph, es finden sich keine
hypertrophen Krypten oder vermehrte IEL; es handelt sich wohl um ein irreversibles Endstadium bei therapierefraktären Patienten oder bei Lymphomen.
3
Die Marsh-Einteilung gilt definitionsgemäß nur für Zöliakiepatienten. Dementsprechend gilt
das Stadium 0 auch nicht als pathologisch, so dass in der Literatur in der Regel nur vier Stadien
angegeben werden [38, 45].
3.1. ZÖLIAKIE
15
Abbildung 3.1: Klassifikation der Duodenalhistologie nach Marsh, Abbildung aus [45].
Eine Übersicht der Einteilung findet sich in Tabelle 3.2 auf S.16. Die Stadien stellen
keine starren Entitäten dar, vielmehr gibt es zwischen ihnen fließende Übergänge [38].
Die Stadien Marsh I und II erlauben keine sichere Diagnose einer Zöliakie, sondern
müssen in Zusammenschau mit klinischen Beschwerden, Antikörpernachweisen und
eventuell vorhandenen Differentialdiagnosen beurteilt werden [45]. Die histologisch
nachgewiesene Mukosaschädigung korreliert hinsichtlich ihrer Ausprägung nicht
zwingend mit dem Schweregrad der klinischen Erkrankung, allerdings hängt sie
vermutlich mit der Menge des eingenommenen Glutens zusammen [15, 38, 56]. Auch
die Anzahl an IEL scheint mit der Glutenzufuhr anzusteigen [38].
Unter einer strikt glutenfreien Diät normalisiert sich die duodenale Histologie;
optimal therapierte Patienten befinden sich nach geraumer Zeit im Stadium Marsh 0
oder I [45].
Verlaufskontrolle
Unter einer strikt glutenfreien Diät nehmen die IgA-Anti-Transglutaminase-Antikörper schon nach kurzer Zeit bis unter die Nachweisgrenze ab, die Regeneration der
Mukosa dauert allerdings bis zu einem Jahr [13].
16
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
Tabelle 3.2: Einteilung der duodenalen Histologie anhand der modifizierten Kriterien
nach Marsh, modifiziert nach Oberhuber [45].
Marsh-Einteilung
IEL
Krypten
L. propria
Zotten
Marsh 0
unauffällig
unauffällig
unauffällig
unauffällig
Marsh I
>40
unauffällig
unauffällig
unauffällig
Marsh II
>40
hypertroph
unauffällig
unauffällig
Marsh III
>40
hypertroph
Zellzahl↑
plump
Marsh IIIa
milde Atrophie
Marsh IIIb
subtotale Atrophie
Marhs IIIc
totale Atrophie
Marsh IV
unauffällig
unauffällig
unauffällig
totale Atrophie
IEL = intraepitheliale Lymphozyten, angegeben als IEL pro 100 Enterozyten;
Zellzahl↑ bedeutet eine gesteigerte Anzahl an Entzündungszellen in der Lamina
propria.
3.1.4
Therapeutische Möglichkeiten
Bereits Aretaeus beschrieb, dass eine ausschließlich auf Brot basierende Diät
keine Steigerung der körperlichen Leistungsfähigkeit bringe und Gee postulierte, dass
die einzige Heilung in einer Diät bestünde [2, 17]. Die strikt glutenfreie Diät, welche
heutzutage noch immer die einzige therapeutische Möglichkeit darstellt, basiert
auf der Arbeit von Dicke [12]. Sie schließt sämtliche Nahrungsmittel mit Weizen,
Gerste oder Roggen sowie damit verwandte Getreidearten wie Grünkern, Dinkel,
Einkorn oder Emmer aus [15]. Unter einer strikt glutenfreien Diät verschwinden
zöliakiebedingte Symptome innerhalb eines Jahres meist vollständig [75].
Hafer ist prinzipiell glutenfrei [18]. Allerdings ist er, bedingt durch den Herstellungsprozess, meist mit Gerste, Roggen oder Weizen verunreinigt [18]. Daher wird
empfohlen, zu Beginn einer glutenfreien Diät auf Haferprodukte zu verzichten [18].
Nach ausreichender Stabilisierung kann gegebenenfalls, unter strenger klinischer
Kontrolle, ein Versuch mit haferhaltiger Diät erfolgen [18].
An alternativen Behandlungsmöglichkeiten wird geforscht [63]. Orale Peptidase--
3.1. ZÖLIAKIE
17
Ersatzstoffe aus Bakterien sollen die langen Glutenpeptide im Magen und Darm
in kleinere Moleküle spalten [57, 63]. Drei dieser Proteasen, ALV003, AN-PEP und
STAN1, befinden sich bereits in der zweiten Phase klinischer Studien [63].
Der Zonulin-Antikörper AT1001 befindet sich ebenfalls in der zweiten Phase
klinischer Testung [15]. Zonulin wird bei Zöliakiepatienten vermehrt exprimiert
und verursacht eine erhöhte Epithelpermeabilität, die durch den Antikörper wieder
normalisiert werden soll [4, 15, 63].
Mehrere verschiedene Inhibitoren der TG2 befinden sich noch in der präklinischen
Testung [63]. Hemmstoffe, welche die Antigenpräsentation durch die HLA-DQ2/8Moleküle verhindern sollen, werden untersucht [4, 63].
Der Impfstoff Nexvax2 soll eine orale Toleranz gegenüber Gluten herstellen und
befindet sich in der ersten Phase klinischer Testung [63]. Es gibt auch Versuche, mit
Hilfe von dendritischen Zellen einen Impfstoff herzustellen [11].
Ein nichtmedikamentöses Behandlungskonzept, das sich bereits in der zweiten
klinischen Testphase befindet, beruht auf dem Einsatz von Necator americanus,
einem Hakenwurm [63]. Dieser soll die Immunreaktion modulieren, indem die bei
Zöliakiepatienten typische TH 1-Reaktion zugunsten einer TH 2-Reaktion verändert
wird. [8].
Untersucht werden auch Anti-IL-15-Antikörper, welche die vorzeitige Apoptose
von Enterozyten verhindern sollen, und diverse T-Zell-Antikörper, welche die glutenreaktiven T-Lymphozyten unterdrücken sollen [11].
Der orale Chemokin-Rezeptor-9-Antagonist CCX282-B soll die Migration von
T-Lymphozyten in das Darmepithel verhindern und dadurch die lokale Immunantwort
gegen Gluten minimieren [60]. Eine Phase zwei-Studie läuft bereits, allerdings ist der
Wirkmechanismus nicht zöliakiespezifisch und birgt das Risiko intestinaler Infektionen
[60].
Bei allen Forschungsansätzen lässt sich nicht sagen, ob sie später eine glutenfreie
Diät ergänzen werden oder ob es möglich sein wird, diese vollständig zu ersetzen [4].
Momentan bestehen Sicherheitsbedenken bezüglich auftretender Nebenwirkungen, so
dass diese neuen Therapeutika möglicherweise nur intermittierend nach Diagnosestellung oder bei therapieresistenter Zöliakie einsetzt werden [11].
18
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
3.2
Zelluläre Eigenschaften
Bei fast allen Zöliakiepatienten lassen sich die zellulären Oberflächenmerkmale
HLA-DQ2 und/oder HLA-DQ8 nachweisen [42]. HLA-Moleküle dienen der Antigenpräsentation von Peptiden, unter anderem auf dendritischen Zellen, und lassen auch
einen Rückschluss auf die Aktivierung und Differenzierung von Zellen zu [15, 34].
Kapitel 3.2.1 befasst sich mit dem HLA-System, Kapitel 3.2.2 mit dendritischen
Zellen, Kapitel 3.2.3 mit den untersuchten zellulären Oberflächenmarkern, Kapitel 3.2.4 mit intraepithelialen Lymphozyten und Kapitel 3.2.5 mit Interleukinen,
interzellulären Botenstoffen.
3.2.1
HLA-System
HLA steht für human leucocyte antigen“ und bezeichnet bei Menschen vor”
kommende zelluläre Oberflächenmoleküle, die Haupthistokompatibilitätskomplexe
(MHC, engl. major histocompatibility complex), welche der Unterscheidung zwischen
körpereigen‘ und körperfremd‘ dienen und aus Glykoproteinen bestehen [34]. Es
’
’
gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: Die MHC der Klasse I kommen auf allen
kernhaltigen Zellen vor, Klasse-II-Moleküle nur auf antigenpräsentierenden Zellen,
bspw. dendritische Zellen, T-Lymphozyten oder Makrophagen [5].
Die HLA-Gene liegen auf dem Chromosom 6p21.3 [44]. Die Klasse I-Gene werden
in die drei Untergruppen HLA-A, HLA-B und HLA-C unterteilt, die Klasse II-Gene
in die Untergruppen HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DM und HLA-DP, wobei diese jeweils
aus einer α- und einer β-Kette bestehen [34].
MHC-Moleküle dienen der Antigenpräsentation: Die Klasse I präsentiert intrazellulär synthetisierte Antigene (körpereigene oder intrazelluläre Fragmente von
Krankheitserregern), die von zytotoxischen CD8+ T-Zellen erkannt werden [5, 34].
Die Klasse-II-MHC präsentieren Antigene von zuvor phagozytierten (extrazellulären)
Partikeln, welche von CD4+ T-Helferzellen (TH ) erkannt werden [5, 34].
Die CD4+ T-Helferzellen koordinieren die spezifische Immunantwort durch die
Sekretion bestimmter Zytokine [68]. Sie lassen sich noch weiter differenzieren in TH 1und TH 2-Zellen, wobei TH 1-Zellen hauptsächlich für die zelluläre Immunantwort,
3.2. ZELLULÄRE EIGENSCHAFTEN
19
TH 2-Zellen für die Antikörperproduktion wichtig sind [5]. IL-4 verschiebt eine TH 1Reaktion zugunsten einer TH 2-Reaktion [56].
Die Zöliakie weist eine starke HLA-Assoziation auf: Nahezu 95% aller Zöliakiepatienten sind Träger des HLA-DQ2-Moleküls (genauer: der Variante HLA-DQ2.5), die
verbleibenden vier bis fünf Prozent tragen meist das HLA-DQ8-Molekül [15,63]. Interessanterweise sind 20 bis 40% der europäischen Bevölkerung HLA-DQ2/8-positiv, aber
nur zwei bis fünf Prozent dieser Personen erkranken tatsächlich an Zöliakie [15,28,58].
Diese Verteilung lässt sich als Ausschlusskriterium bei vermuteter Zöliakie nutzen:
der negativ-prädiktive Wert des Fehlens der Gene für HLA-DQ2/8 beträgt nahezu
100% [11, 55].
Die HLA-DQ-Moleküle bestehten aus je 2 Untereinheiten, wobei die α-Kette
von HLA-DQ2 durch DQA1*05 kodiert wird und die β-Kette durch DQB1*02
(entweder DQB1*0201 oder *0202), bei HLA-DQ8 erfolgt dies durch DQA1*03
und DQB1*0302 [64, 65]. 2013 wurde von Vazquez-Roque et al. nachgewiesen, dass
bereits das Vorhandensein von HLA-DQ2/8 zu einer erhöhten Durchlässigkeit des
Dünndarmepithels führt [71].
Die antigenpräsentierenden Zellen nehmen Glutenfragmente auf, verarbeiten
diese und präsentieren sie über HLA-DQ2/8-Moleküle an ihrer Oberfläche, wo sie
von den entsprechenden T-Lymphozyten erkannt werden und zu einer gesteigerten
Proliferation, Zytokinsekretion sowie Antikörperproduktion führen [15].
Die Erkrankungsrate bei einem an Zöliakie erkrankten Angehörigen liegt für
eineiige Zwillinge bei circa 75%; bei zweieiigen Zwillingen liegt sie, genauso wie bei
Geschwistern, bei 11% [20]. Daher wird spekuliert, dass es weitere, HLA-unabhängige
Gene gibt, die bei der Entstehung einer Zöliakie eine Rolle spielen [56]. Bislang
wurden 26 sicher mit Zöliakie assoziierte nicht-HLA-Gene und 13 möglicherweise
assoziierte Gene identifiziert [41,68]. Allerdings sind diese Gene häufige Allelvarianten,
welche jeweils nur einen geringen Beitrag zum Zöliakierisiko leisten (alle gemeinsam
ca. 5%); interessanterweise kommen viele dieser Gene auch bei anderen Autoimmunkrankheiten gehäuft vor [41, 68].
20
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
3.2.2
Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (engl. dendritic cells, DC) gehören zu den antigenpräsentierenden Zellen [5]. Sie liegen als unreife Vorstufen vor und reifen durch Stimulation, was
zu einer effizienteren Aufnahme und Verarbeitung von Proteinen sowie zu einer vermehrten Antigenpräsentation für T-Lymphozyten führt [47]. Die Reifung wird über
Chemokine und Zytokine vermittelt und beinhaltet morphologische, phänotypische
und funktionelle Veränderungen [47].
DC präsentieren Antigene von zuvor phagozytierten Molekülen mit Hilfe der
MHC-Klasse-II-Moleküle, die von CD4+ T-Helferzellen erkannt werden [5, 34]. Durch
die Anwesenheit weiterer Oberflächenmoleküle wird diese Interaktion verstärkt [60].
Reife DC können letztendlich T-Lymphozyten zur Proliferation anregen und ihnen
das Ziel ihrer Gewebemigration vorgeben [60].
3.2.3
Oberflächenmerkmale
CD ist die Abkürzung für cluster of differentiation“ und bezeichnet eine hetero”
gene Gruppe von Oberflächenmolekülen auf Zellen, vor allem auf Leukozyten [34].
Sie sind international standardisiert und werden mit spezifischen monoklonalen Antikörpern nachgewiesen [34]. Zurzeit sind mehr als 200 CD-Antigene definiert [1, 34].
Diese Antigene ermöglichen die Unterscheidung von Leukozyten in verschiedenen
aktiven Zuständen oder Differenzierungen (siehe Tabelle 3.3 auf S.21) [34].
In dieser Arbeit wurde die Expression folgender Oberflächenantigene untersucht:
CD14 ist ein Marker für Makrophagen und Monozyten im peripheren Blut und wird
auch Lipopolysaccharidrezeptor genannt [59]. Bei der Reifung von dendritischen
Zellen wird die CD14-Expression deutlich reduziert [22].
CD25 ist ein Aktivierungsmarker auf T-Lymphozyten und dendritischen Zellen und
bildet zusammen mit p75 den Rezeptor für IL-2 [59].
CD71 ist ein Transferrinrezeptor, der auf allen proliferierenden Zellen exprimiert
und bei Zöliakiepatienten vermehrt im intestinalen Gewebe gefunden wird
[1, 39]. Es wird spekuliert, dass Gliadin mit Hilfe von CD71 durch das Epithel
3.2. ZELLULÄRE EIGENSCHAFTEN
21
Tabelle 3.3: Charakteristische CD-Antigene von Leukozyten, aus [34]
CD-Antigen
Zelltyp
CD3
T-Lymphozyt
CD4
T-Helferzelle
CD8
zytotoxische T-Zelle
CD14
Monozyt
CD19
B-Lymphozyt
CD34
Stammzelle
CD56
natürliche Killerzelle
geschleust wird [39]. Als wichtiger Teil der Immunreaktion auf Antigene wird
er auf Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und sich teilenden Zellen
hochreguliert [39].
CD83 ist ein sehr spezifischer Aktivierungs- und Reifemarker für dendritische Zellen
[33]. CD83 kann in einer membrangebundenen Form vorliegen, welche in dieser
Arbeit untersucht wurde [50]. Eine der Hauptfunktionen von CD83 ist die
Aktivierung von (zytotoxischen) T-Zellen, die auch zur Proliferation angeregt
werden [33, 50]. Außerdem scheint CD83 CD8+ T-Zellen zur Teilung anzuregen
und eine begrenzte Tumorimmunität zu induzieren [50]. Die lösliche Form
von CD83 führt zu einer verminderten Reifung von dendritischen Zellen und
beeinflußt die Aktivierung von (zytotoxischen) T-Zellen [32, 50].
CD86 (umfasst auch B70 und B7-2) regt T-Lymphozyten zur Teilung an und ist
ein Aktivierungsmarker auf Monozyten und B-Zellen [34, 59]. CD86 wird zur
Aktivierung und Proliferation von T-Zellen benötigt [70].
CD89 ist ein IgA-Rezeptor (FcαR) auf Zellen der myeloischen Zellreihe, unter
anderem auch auf Monozyten und Makrophagen [1, 43]. CD89 ist an vielen
biologischen Abwehrprozessen beteiligt, außerdem übt dieses Molekül möglicherweise regulatorische Funktionen im Rahmen der Antigenprozessierung
aus [43]. Zusätzlich ist CD89 an der Phagozytose IgA-markierter Bakterien
22
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
und Hefepartikel beteiligt [43].
CD103 ist auch als αE-Integrin bekannt, findet sich hauptsächlich auf IEL und spielt
eine Rolle bei Adhäsionsprozessen [1, 6]. In Kombination mit B7 ermöglicht
CD103 den Immunzellen die Rückkehr ins Darmepithel [31].
CD209 (DC-Sign) ist auf dendritischen Zellen in mukosalen Geweben zu finden
und stabilisiert die Kontaktzone zwischen dendritischen Zellen und T-ZellRezeptoren [1]. Durch die Interaktion mit ICAM2, welches auf vaskulärem
Endothel exprimiert wird, befähigt CD209 die dendritischen Zellen zum Durchtritt durch das Endothel [19].
HLA-DR ist ein Aktivierungsmarker von Monozyten und wird bei der Reifung von
dendritischen Zellen vermehrt exprimiert [5, 46]. HLA-DR-Moleküle spielen
eine wesentliche Rolle bei der Interaktion von antigenpräsentierenden Zellen
und T-Zellen [5].
TG2 wird an der Oberfläche aller Zellen exprimiert und dient vermutlich einer
effizienten Phagozytose [52].
3.2.4
Intraepitheliale Lymphozyten
Intraepitheliale Lymphozyten (IEL), welche sich zwischen intestinalen Epithelzellen finden und eine Schutz- und Wächterfunktion ausüben, lassen sich bei allen
Menschen nachweisen [28, 60]. Es handelt sich meist um T-Lymphozyten [6]. Ihre Aktivierung und Differenzierung wird durch zelluläre Interaktion mit Epithelzellen und
Chemokinen beeinflusst und ist abhängig von der Ernährung und der Bakterienflora
im Darm [6].
Die sehr heterogenen IEL unterteilen sich in die üblicherweise vorherrschenden
α/β-Lymphozyten (90%, CD4+ und/oder CD8+ ) und die selteneren γ/δ-Lymphozyten (10%, CD4− CD8− ) [6, 28, 34, 60]. Letztere sind bei Zöliakiepatienten überproportional vermehrt, allerdings sind sie nicht spezifisch für eine Zöliakie, da sie auch
bei allergischen oder Entzündungsreaktionen vermehrt vorhanden sind [28, 36, 60].
γ/δ-Lymphozyten erkennen gewebsspezifische Stresssignale und können betroffene Zellen gezielt abtöten [41]. Dadurch tragen sie zum Schutz des Epithels bei
3.2. ZELLULÄRE EIGENSCHAFTEN
23
und minimieren lokale Entzündungsreaktionen [6]. Außerdem verhindern sie das
Eindringen von Pathogenen in das Epithel [6]. Sie können durch die Sekretion von
Interferon-γ (INF-γ) proinflammatorische Prozesse fördern, auf der anderen Seite
können sie die INF-γ-Produktion anderer Zellen kontrollieren [6]. Es wird spekuliert,
dass sie an der zöliakietypischen Epithelschädigung beteiligt sind [28, 60].
Auch α/β-Lymphozyten können Zellen, welche Stresssignale exprimieren, gezielt
abtöten [41]. Sie fördern die protektive mukosale Integrität gegenüber Krankheitserregern und tragen möglicherweise zu regulatorischen Mechanismen bei, die pathologische Immunantworten unterdrücken [6]. Sie werden zum Teil für den Schaden des
Dünndarmgewebes verantwortlich gemacht [41].
Durch die Sekretion von IL-15 oder INF-γ wirken IEL proinflammatorisch und
zytotoxisch, durch die Sekretion von IL-10 können sie auch antiinflammatorisch
wirken [60]. Darüber hinaus können sie auch IL-2, IL-4 und IL-17 sezernieren [6].
Durch Glutenzufuhr werden IEL aktiviert und exprimieren vermehrt CD25 [36].
Im aktivierten Zustand sezernieren sie Chemokine, welche die Zellen der unspezifischen Immunantwort (Monozyten/Makrophagen, eosinophile und neutrophile
Granulozyten) anlocken und stimulieren [56]. Damit greifen sie in den Entzündungsprozess ein, stören die Integrität des Epithels und schädigen es [41, 60]. In seltenen
Fällen wird so der Weg für ein T-Zell-Lymphom bereitet [41].
Enterozyten sezernieren IL-15, das IEL aktiviert und deren Überlebenszeit durch
die Induktion von antiapoptotischen Molekülen verlängert [41, 55, 60]. Außerdem
werden die Lymphozyten zur Proliferation angeregt [6, 60]. Durch die Sekretion von
IL-4 modifizieren IEL die antigenspezifische Immunantwort, da die TH 1-Reaktion zugunsten der TH 2-Reaktion vermindert wird [56]. Durch diesen Mechanismus scheinen
sie die Mukosa vor chronischer Exposition mit schädigenden Stoffen zu schützen [56].
Bei einer Zöliakie reagieren aktivierte IEL autoreaktiv [6]. Sie sezernieren Chemokine und wirken zytotoxisch auf Enterozyten, welche Stresssignale exprimieren und
fördern so die Entzündungsreaktion im Dünndarm [6]. In proinflammatorischer
Umgebung wird die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf Enterozyten
stimuliert, was eine vermehrte Aufnahme von Glutenpeptiden zur Folge hat [6]. Diese
werden von glutenspezifischen T-Lymphozyten erkannt, die unter anderem INF-γ
24
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
sezernieren und damit die Entzündungsreaktion aufrecht erhalten [6].
3.2.5
Interleukine
Interleukine (IL), eine Untergruppe der Zytokine, sind Signalstoffe, welche von
diversen Zellen synthetisiert und sezerniert werden [34]. Durch Stimulation werden
sie vermehrt freigesetzt [34]. Sie wirken, im Gegensatz zu Hormonen, meist nur in
der unmittelbaren Umgebung, in die sie sezerniert wurden [34]. Interleukine dienen
der Immunabwehr, fördern die Hämatopoese und regulieren entzündliche Prozesse
und die Apoptose [34].
Im Dünndarmepithel untherapierter Zöliakiepatienten finden sich deutlich erhöhte
Werte an IL-15, wobei die Höhe mit der Dünndarmschädigung korreliert [10, 40].
Die Inkubation von CD14+ Monozyten mit GM-CSF und IL-4 bewirkt die Reifung
dieser Zellen zu semimaturen dendritischen Zellen [22]. Durch die Stimulation von
CD14+ Monozyten mit GM-CSF und IL-15 reifen die Zellen zu makrophagenähnlichen
Zellen heran [22]. Dieser Ansatz wurde gewählt, da IL-15 im intestinalen Gewebe
von Zöliakiepatienten überexprimiert wird und der Einfluss von IL-15 auf Monozyten
und die T-Zell-Proliferation bestimmt werden sollte [37].
3.3
Fragestellung
In dieser Arbeit wurden die Oberflächenmarker von Monozyten, welche aus peripheren mononukleären Zellen gewonnen wurden, charakterisiert. Dazu reiften die
Monozyten mit GM-CSF und entweder mit IL-4 oder mit IL-15. Anschließend wurden
sie mit verschiedenen Antigenen stimuliert. Hierbei wurden T-Gliadin und Transglutaminase 2 eingesetzt. Ein Ansatz mit Reifungscocktail diente als Positivkontrolle,
ein Ansatz ausschließlich mit Zellkulturmedium als Negativkontrolle.
Die Reifungsmarker für dendritische Zellen (bei Reifung mit IL-4) bzw. für
Makrophagen (bei Reifung mit IL-15) - CD14, CD25, CD83, CD86, CD89, CD103,
CD209, HLA-DR - wurden analysiert, um Aufschluss über den Reifungsgrad der
antigenpräsentierenden Zellen zu geben. Zusätzlich wurden die Oberflächenmarker
CD71 und TG2 bestimmt.
3.3. FRAGESTELLUNG
25
Besonders interessierte in diesem Zusammenhang, ob sich Zellen von Zöliakiepatienten von denen gesunder Kontrollpersonen unterschieden und ob der HLATrägerstatus (HLA-DQ2/8-positiv oder -negativ) eine Auswirkung auf die Zellreifung
hatte.
Anschließend wurde überprüft, inwieweit die gereiften Zellen in der Lage waren,
autologe Lymphozyten zur Proliferation anzuregen. Auch hier war von Interesse, ob
sich die Zellen von gesunden Personen in Abhängigkeit vom HLA-DQ-Status von
denen von Zöliakiepatienten unterschieden.
26
KAPITEL 3. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG
27
Kapitel 4
Durchführung
4.1
Probanden
Diese Arbeit beruht auf der Auswertung von Blutproben von 20 Probanden: Zehn
Kontrollen (jeweils fünf HLA-DQ2/8-negative und fünf HLA-DQ2/8-positive), fünf
Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät und fünf aktive‘ Zöliakiepatienten, die sich
’
glutenhaltig ernährten.
Die Kontrollpersonen stammen aus dem eigenen Labor der Medizinischen Klinik
I in Erlangen. Das Blut der Zöliakiepatienten erhielten wir durch Kooperation mit
einer internistischen Praxis sowie über die Patientendatenbank der Arbeitsgruppe.
Alle Probanden wurden über den Versuchsaufbau aufgeklärt und unterzeichneten eine Einverständniserklärung zur Abnahme von 54ml venösem Blut und zur
Durchführung der im Folgenden beschriebenen Versuche.
Die Geschlechts- und Altersverteilung der Probanden sind in Tabelle 4.1 auf S.
28 aufgeführt.
4.2
Methoden
Aus dem Blut der Probanden wurden mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten
die peripheren mononukleären Zellen (PBMC, engl. peripheral blood mononuclear
cells) isoliert (Kapitel 4.2.2). Diese wurden über MACS (engl. magnetic cell sorting) mit Hilfe magnetmarkierter Partikel weiter aufgetrennt (Kapitel 4.2.2). Die
28
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Tabelle 4.1: Probanden (∗ Bei einem Probanden handelte es sich um einen
Buffycoat, so dass Alter und Geschlecht nicht bekannt sind.)
Gruppe
n
m:w durchschnittliches Alter
Kontrollen, HLA-DQ2/8-negativ
5
1:4
34,60 Jahre
Kontrollen, HLA-DQ2/8-positiv
5
0:4∗
34,25 Jahre∗
Zöliakiepatienten unter Diät
5
1:4
43,60 Jahre
aktive Zöliakiepatienten
5
3:2
39,80 Jahre
CD14+ Zellen wurden in einer Zellkultur mit verschiedenen Zytokinen kultiviert
und mit verschiedenen Antigenen stimuliert (Kapitel 4.2.3). Im Anschluss wurden
die Oberflächenmoleküle mittels Durchflusszytometrie (genannt FACS, engl. fluorescence associated cell sorting) gemessen (Kapitel 4.2.4). Die CD14− Zellen wurden
tiefgefroren und später als Effektorzellen im Lymphozytenproliferationstest (LR,
engl. lymphocyte reaction) eingesetzt (Kapitel 4.2.5). Bei allen Probanden wurden
der HLA-DQ2/8-Trägerstatus sowie eventuell vorhandene Anti-TransglutaminaseAntikörper (IgA/IgG) bestimmt (Kapitel 4.2.7 bzw. 4.2.6). Einen Überblick über die
verwendeten Methoden sowie den zeitlichen Ablauf bietet Abbildung 4.1 auf S.29.
Soweit nicht anders gekennzeichnet, erfolgten alle Schritte unter einer sterilen
Arbeitsbank.
4.2.1
Blutgewinnung
Bei allen Probanden wurden über eine Butterfly-Nadel sechs Zitratröhrchen
venöses Blut entnommen. Dies ergab bei 9ml Röhrchenvolumen 54ml Blut je Proband.
4.2.2
Isolierung von CD14 positiven Zellen
Nachfolgend wird beschrieben, wie das Blut zuerst in Plasma und Blutzellen
aufgetrennt wurde und die Blutzellen anschließend über einen Ficoll-Dichtegradienten
weiter unterteilt wurden, um periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) zu erhalten. Danach wurden die Zellen mit Hilfe von magnetmarkierten Partikeln (magnet associated cell sorting, MACS) in CD14+ und CD14−
4.2. METHODEN
29
Blutentnahme
1ml Plasma einfrieren
Antikörpernachweis
1ml Blutzellen einfrieren
HLA-DQ2/8-Typisierung
Isolation der PBMC mittels Ficoll
Isolation der CD14+ und CD14− Zellen mittels MACS
(Tag 1)
Isolation der CD14+ Zellen
Zentrifugation
CD14− Zellen einfrieren
Anlage der Zellkultur mit CD14+ Zellen
an Tag 2 und 4: Mediumwechsel mit Zytokinzugabe
(Tag 1-7)
Zellkultur
an Tag 6: Stimulation
Zellaufbereitung
FACS
(Tag 7)
LR
(Tag 9)
50.000 Zellen/Ansatz
Zellen färben
durchflusszytometrische Messung
LR ansetzen
CD14− Zellen auftauen
LR auswerten
später
Antikörpernachweis mittels ELISA
HLA-DQ2/8-Typisierung
Abbildung 4.1: Zeitliche Abfolge der verschiedenen Arbeitsschritte.
FACS – fluorescence associated cell sorting, LR – Lymphozytenproliferationstest,
PBMC – peripheral blood mononucelar cells.
30
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Zellen getrennt.
Gewinnung von PBMC
Nach der Blutentnahme wurden die Röhrchen für 20 Minuten auf dem Rollenschüttler in Bewegung gehalten, um eine Agglutination zu verhindern und eine
optimale Durchmischung von Blut und Zitrat zu erreichen. Alle Blutröhrchen wurden
bei 1000g und 21°C 20 Minuten zentrifugiert.
In der Zwischenzeit wurde in drei Leucosep-Röhrchen je 15ml Ficoll pipettiert
und bei 300g und 21°C eine Minute zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation der Blutröhrchen wurde das Serum vorsichtig abgenommen, wobei möglichst keine Erythrozyten übertragen wurden sollten. Etwa 1ml Serum
wurde für die spätere Bestimmung der Anti-Transglutaminase-Antikörper bei -20°C
tiefgefroren. Jedes Blutröhrchen wurde mit 2ml PBS (engl. phosphate buffered saline;
Raumtemperatur) versetzt und die Blutzellen wurden durch auf- und abpipettieren
resuspendiert. Etwa 1ml der Zellsuspension wurde bei -20°C tiefgefroren, um später
daraus den HLA-DQ2/8-Trägerstatus des Probanden bestimmen zu können. Die
resuspendierten Zellen wurden in die Leucosep-Röhrchen überführt, wobei der Inhalt
von zwei Blutröhrchen auf ein Leucosep-Röhrchen vereint wurde. Die Blutröhrchen
wurden mit PBS nachgewaschen und bis zu einem Volumen von 45ml in die jeweiligen
Leucosep-Röhrchen überführt.
Die Zellen wurden mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten aufgetrennt: Die Leucosep-Röhrchen wurden bei 750g und 21°C 15 Minuten zentrifugiert; die Bremse wurde
auf 1 heruntergestellt.
Nach der Zentrifugation befanden sich die Erythrozyten im Pellet unterhalb
des Filters der Leucosep-Röhrchen, die PBMC erschienen als weißlicher Ring einige
Millimeter oberhalb des Filters. Die Flüssigkeit oberhalb des PBMC-Ringes wurde
vorsichtig abpipettiert und verworfen; die PBMC-Zellen wurden in ein neues FalconRöhrchen mit 20ml kaltem PBS (4°C) gegeben. Bei diesem Schritt wurden die Zellen
aus allen drei Leucosep-Röhrchen auf ein Falcon-Röhrchen vereint und dann bei 370g
und 8°C 10 Minuten zentrifugiert.
Zum Waschen der Zellen wurde der Überstand vorsichtig abgenommen, das
4.2. METHODEN
31
Zellpellet wurde in 30ml kaltem PBS mit 1mM EDTA resuspendiert und bei 370g
und 8°C 10 Minuten zentrifugiert.
Sofern das nach dieser Zentrifugation sichtbare Zellpellet zu viele Erythrozyten
enthielt (erkennbar an einer rosa Verfärbung des Pellets), wurden diese lysiert. War
das Zellpellet weiß, konnte dieser Schritt übersprungen werden. Zur Lyse wurde
der Überstand vorsichtig abpipettiert und die Zellen in 4ml ACK-Lyse-Puffer (für
die genaue Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4) resuspendiert. Die Lyse erfolgte
(abhängig von dem Grad der Rosafärbung) vier bis zehn Minuten und wurde durch
Zugabe von 25ml PBS abgestoppt, danach wurde das Falcon-Röhrchen zentrifugiert
(370g und 8°C, 10 Minuten). Bei Bedarf wurde noch einmal lysiert.
Der resultierende Überstand wurde abgenommen und das Zellpellet in 30ml
kaltem RPMI (4°C) resuspendiert.
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 10µl Trypanblau mit 10µl der Zellsuspension
vermischt und hiervon 10µl auf die Neubauer-Zählkammer übertragen. Ausgezählt
wurden die Zellen zweier schräg gegenüber liegender Großquadrate. Das gezählte
Ergebnis wurde mit 104 /ml multipliziert1 und auf das gesamte Zellsuspensionsvolumen hochgerechnet. Zellzahlen werden in Millionen Zellen pro Milliliter (106 /ml)
angegeben.
Die gewonnenen Zellzahlen lagen bei 63 bis 133 Millionen PBMC je Probenansatz
aus 54ml venösem Blut.
MACS
Die über den Ficoll-Dichtegradienten isolierten PBMC wurden erneut zentrifugiert
(370g und 8°C, 10 Minuten).
Nach der Zentrifugation wurde der Überstand sorgfältig und möglichst vollständig
abgenommen. Die Zellen wurden in 80µl MACS-Puffer je 107 Zellen resuspendiert
(für die genaue Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4). Zu dem Puffer wurden 20µl
der magnetischen Anti-CD14-Beads je 107 Zellen gegeben. Die Zellsuspension wurde
1
Ein Großquadrat hat ein Volumen von 0,1µl (bei einer Fläche von 1mm2 und einer Tiefe von
0,1mm). Dieses Volumen wurde durch Multiplikation mit 104 auf einen Milliliter hochgerechnet.
Die Verdünnung von 1:1 wurde berücksichtigt.
32
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
für eine Dauer von 15 Minuten in den Kühlschrank gestellt, wo sie durch vorsichtiges
Schütteln alle fünf Minuten gemischt wurde.
Im Anschluss wurde das zehn- bis zwanzigfache Volumen an vorher zugegebenem MACS-Puffer in das Falcon-Röhrchen pipettiert und die Zellen wurden erneut
zentrifugiert (370g und 8°C, 10 Minuten).
Während der Zentrifugation wurde das MACS-Gestell unter der sterilen Arbeitsbank aufgebaut, die bei 4°C vorgekühlte Säule (Größe LS/VS für 10 bis 100 Millionen
Zellen) wurde in das Magnetfeld eingeklickt und mit 3ml MACS-Puffer vorgewaschen.
Nach der Zentrifugation der PBMC wurde der Überstand möglichst vollständig
abgenommen, das Zellpellet wurde in 50µl MACS-Puffer je 107 Millionen Zellen
resuspendiert und auf die Säule aufgetragen. Durch die magnetischen Antikörper
wurden die CD14+ Zellen in der Säule zurückgehalten, die CD14− Zellen wurden
ausgewaschen und in einem 15ml Falcon-Röhrchen aufgefangen. Die Säule wurde
insgesamt drei Mal mit je 3ml MACS-Puffer gespült, sobald der vorher zugegebene
Puffer durchgelaufen war.
Die Säule wurde aus dem Magnetfeld entfernt und auf ein frisches 15ml FalconRöhrchen gesteckt. Nach Zugabe von 5ml MACS-Puffer wurde der mitgelieferte
Stempel auf die Säule aufgesetzt und mit Druck heruntergedrückt, so dass die CD14+
Zellen ausgespült wurden.
Die Zellzahl der CD14+ Zellen wurde bestimmt und auf das gesamte Zellsuspensionsvolumen hochgerechnet; die erhaltenen Zellzahlen lagen zwischen 6 und 15
Millionen CD14+ Zellen, entsprechend 10 bis 20% der Gesamtzahl der PBMC.
Die CD14+ und die CD14− Zellen wurden bei 370g und 8°C 10 Minuten zentrifugiert.
Die CD14− Zellen wurden bei -80°C tiefgefroren. Hierzu wurde das Zellpellet
in 4,5ml Einfriermedium I resuspendiert. Langsam und unter ständigem Mischen
wurden 4,5ml Einfriermedium II zugegeben (für die genaue Zusammensetzung siehe
jeweils Kapitel 4.4.4). Die resultierenden 9ml Zellsuspension wurden in Aliquots
à 1,8ml in Einfrierröhrchen pipettiert, in ein bei 4°C vorgekühltes Alkoholrondell
gesteckt und in den -80°C Schrank gestellt. Der Alkohol gewährleistet ein schonendes
Einfrieren, wobei eine Temperatur von -80°C nach ca. zwölf Stunden erreicht wurde.
4.2. METHODEN
4.2.3
33
Zellkultur
Nach der Zentrifugation der CD14+ Zellen wurde der Überstand abgenommen
und das Falcon-Röhrchen mit dem Pellet wurde zur Resuspension der Zellen über das
Gitter der sterilen Arbeitsbank gezogen. Das Zellpellet wurde in einer Konzentration
von einer Million Zellen pro Milliliter in der entsprechenden Menge Zellkulturmedium
(für die genaue Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4) gelöst. Die Zellen wurden auf
eine 12-Well-Platte mit maximal 1,5ml je Well ausgesät und bei 37°C, 5% CO2 im
Brutschrank kultiviert.
Am nächsten Tag ( Tag 2“ der Zellen) wurden Zytokine zum Medium hinzu”
gegeben. In alle Wells wurden 20µl/ml GM-CSF (granulocyte macrophage colonystimulating factor; Stocklösung 40.000u/ml GM-CSF in destilliertem Wasser) gegeben,
die Endkonzentration betrug 800u/ml GM-CSF (1:50). In die Hälfte der Wells wurde
2µl/ml Interleukin 4 (IL-4; Stocklösung 125.000u/ml IL-4 in destilliertem Wasser)
gegeben - Endkonzentration war 250u IL-4 je Milliliter Medium (1:500). Die andere
Hälfte der Wells wurde mit 1µl/ml Interleukin 15 (IL-15; Stocklösung 100µg/ml
IL-15 in destilliertem Wasser) versetzt, so ergab sich eine Endkonzentration von
100ng/ml Medium (1:1.000).
Am Tag 4“ erfolgte ein Mediumwechsel, wobei vorsichtig ein Drittel der Medium”
menge je Well entnommen und durch die äquivalente Menge an frischem Medium
ersetzt wurde. In alle Wells wurden 10µl GM-CSF je Milliliter Medium gegeben. In
die IL-4-Wells wurden 2µl/ml IL-4 und in die IL-15-Wells 1µl/ml IL-15 gegeben.
Am Tag 6“ der Zellen erfolgte die Stimulation der dendritischen Zellen mit
”
Antigenen. Auf den Abbildungen 4.2a und 4.2b auf S.34 sind die Zellen vor Antigenstimulation abgebildet. Zur Stimulation wurden die dendritischen Zellen resuspendiert
und die auf der Zellkulturplatte verbleibenden Zellen vorsichtig abgelöst, entweder
durch vorsichtiges Kratzen mit der Pipettenspitze oder mit Hilfe eines Cell Scra’
pers‘. Die Suspensionen der IL-4- und IL-15-Zellen wurden jeweils in einem 15ml
Falcon-Röhrchen gesammelt, gezählt und zentrifugiert (370g und 21°C, 10 Minuten).
Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen, die Zellen wurden
mit Hilfe von Zellkulturmedium auf eine Konzentration von 1 Million/ml eingestellt
34
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
(a) IL-4-gereifte Zellen
(b) IL-15-gereifte Zellen
Abbildung 4.2: Zellkulturen am Tag 6“, eigene Photographien. a) Dendritische Zellen
”
in Zellkultur nach Stimulation mit IL-4 und GM-CSF, b) Makrophagenähnliche
Zellen in Zellkultur nach Stimulation mit IL-15 und GM-CSF.
und auf eine 48-Well-Platte ausgesät, wobei je 0,5ml in ein Well pipettiert wurden
(entsprechend 0,5 Milllionen Zellen je Well). Zu allen Wells wurde GM-CSF in einer
Konzentration von 800u/ml gegeben. Zu den IL-4-stimulierten Zellen wurde IL-4 in
einer Konzentration von 250u/ml gegeben, zu den IL-15-stimulierten Zellen wurde
IL-15 in einer Konzentration von 100ng/ml gegeben. In die leeren Wells wurde je
0,5ml destiliertes Wasser als Verdunstungsschutz pipettiert.
Sowohl bei den IL-4- als auch bei den IL-15-gereiften Zellen wurde jeweils eine
Negativkontrolle (nur mit Zellkulturmedium) sowie eine Positivkontrolle (mit 10µl/ml
Reifungscocktail, für die genaue Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4) angesetzt. Die
anderen Wells erhielten je zur Hälte T-Gliadin2 in einer Konzentration von 0,5mg/ml
bzw. Transglutaminase 2 (TG2) in einer Konzentration von 5µg/ml.
Am Tag 7“ erfolgte die Messung der Zellen am Durchflusszytometer.
”
4.2.4
Durchflusszytometrie
Zur durchflusszytometrischen Messung wurde die Zellkulturplatte zentrifugiert
(300g und 21°C, 10 Minuten). Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen, die
Zellen wurden mit 550µl FACS-Puffer (für die genaue Zusammensetzung siehe Kapitel
2
T-Gliadin entsteht durch Enzymverdau mit Trypsin aus Gliadin.
4.2. METHODEN
35
4.4.4) resuspendiert. Für die mit Reifungscocktail stimulierten Zellen mussten 750µl
FACS-Puffer zum Resuspendieren verwendet wurden, da mit diesen Zellen die Isotypkontrollen und die Kalibrierung des FACS vorgenommen wurden. Insgesamt waren
je FACS-Ansatz etwa 50.000 Zellen nötig. In jedes FACS-Röhrchen wurden je 90µl
der Zellsuspension gegeben.
Als Farbstoffe wurden PE (R-Phycoerythrin), FITC (Fluorescein Isothiocyanat)
und APC (Allophycocyanin) verwendet.
Für jeden Probanden waren drei Kompensationskontrollen nötig; hierfür wurden IL-4-Reifungscocktail-stimulierte Zellen verwendet. Zur Kompensationskontrolle
wurden ein PE-markierter Antikörper gegen das Merkmal DR, ein FITC-markierter
Antikörper gegen das Merkmal CD71 und ein APC-markierter Antikörper gegen das
Merkmal CD83 verwendet.
Bei IL-4- und bei IL-15-Reifungscocktail-stimulierten Zellen wurden jeweils ein
ungefärbter Messansatz sowie ein Messansatz mit einem PE-markierten Antikörper
gegen das Merkmal CD14 vorbereitet.
Für jeden Interleukin- und Antigenansatz wurden drei Messansätze vorbereitet:
Im ersten waren ein PE-gefärbter Antikörper für das Merkmal DR, ein APC-gefärbter
Antikörper für CD83 und ein FITC-gefärbter Antikörper für CD71 enthalten, im
zweiten Ansatz waren ein PE-gefärbter Antikörper für CD86, ein APC-gefärbter
Antikörper für CD25 und ein FITC-gefärbter Antikörper für TG2, im dritten Ansatz
schließlich ein PE-gefärbter Antikörper für CD89, ein APC-gefärbter Antikörper für
CD209 und ein FITC-gefärbter Antikörper für CD103. Tabelle 4.2 auf S.36 zeigt
eine Zusammenfassung der Messansätze und der darin enthaltenen Antikörper.
Die Zellen wurden 15 bis 20 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. Die
Ansätze wurden mit FACS-Puffer auf 500µl aufgefüllt und im FACS-Gerät gemessen.
36
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Tabelle 4.2: FACS-Antikörperfärbung der dendritischen Zellen (RC – Reifungscocktail,
Med – Medium, Tgl – T-Gliadin, TG2 – Transglutaminase 2)
gereift mit
Stimulans Antikörper
IL-4
RC
ungefärbt
RC
CD14
RC
DR PE (Kompensationskontrolle)
RC
CD83 APC (Kompensationskontrolle)
RC
CD71 FITC (Kompensationskontrolle)
RC
DR, CD83, CD71
RC
CD86, CD25, TG2
RC
CD89, CD209, CD103
Med
DR, CD83, CD71
Med
CD86, CD25, TG2
Med
CD89, CD209, CD103
Tgl
DR, CD83, CD71
Tgl
CD86, CD25, TG2
Tgl
CD89, CD209, CD103
TG-2
DR, CD83, CD71
TG-2
CD86, CD25, TG2
TG-2
CD89, CD209, CD103
RC
ungefärbt
RC
CD14
RC
DR, CD83, CD71
RC
CD86, CD25, TG2
RC
CD89, CD209, CD103
Med
DR, CD83, CD71
Med
CD86, CD25, TG2
Med
CD89, CD209, CD103
IL-15
4.2. METHODEN
IL-15
4.2.5
37
Tgl
DR, CD83, CD71
Tgl
CD86, CD25, TG2
Tgl
CD89, CD209, CD103
TG-2
DR, CD83, CD71
TG-2
CD86, CD25, TG2
TG-2
CD89, CD209, CD103
Lymphozytenproliferationstest
Im Rahmen des Lymphozytenproliferationstestes (LR) wurden die in der Zellkultur stimulierten DC eingesetzt, um ihre Aktivität sowie ihre Kapazität, die
Proliferation von autologen CD14− Zellen zu fördern, zu bestimmen. Zur Überprüfung der Stimulierbarkeit der CD14− Zellen wurden diese zusätzlich mit IL-2 bzw.
ConA (Concanavalin) kultiviert. Als Negativkontrollen wurden die CD14+ sowie die
CD14− Zellen ausschließlich mit Zellkulturmedium angesetzt.
Der LR wurde mit den IL-4-gereiften DC und mit den IL-15-gereiften makrophagenähnlichen Zellen angesetzt, wobei die verschieden stimulierten Untergruppen
(Medium, Reifungscocktail, T-Gliadin, TG2) getrennt behandelt wurden.
Im Rahmen der Zellvorbereitung für die Messung am FACS wurden Zellen für
den LR abgenommen, gezählt und mit M-plus-Zellkulturmedium (für die genaue
Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4) auf eine Konzentration von 600.000 Zellen je
Milliliter eingestellt; für den LR wurden mindestens 100.000 Zellen benötigt.
In eine 96-Well-Platte wurden in jedes Well 50µl von M-plus vorgelegt. In die
ersten beiden Wells wurden 25µl der Zellsuspension pipettiert. Aus dem ersten
Duplikat3 wurden je 25µl ins zweite Duplikat überführt; im ersten Duplikat verblieben
10.000 Zellen in 50µl je Well. Vom zweiten Duplikat wurden erneut je 25µl ins dritte
Duplikate überführt, ebenso vom dritten ins vierte und vom vierten ins fünfte Duplikat.
Aus dem fünften (und letzten) Duplikat wurden ebenfalls je 25µl entnommen und
verworfen.
3
Duplikat bezeichnet hier je zwei Wells mit identischem Inhalt innerhalb einer Verdünnungsreihe.
38
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Der Inhalt der Duplikate stellte sich folgendermaßen dar:
ˆ Erstes Duplikat je Well 10.000 Zellen in 50µl
ˆ Zweites Duplikat je Well 3333 Zellen in 50µl
ˆ Drittes Duplikat je Well 1111 Zellen in 50µl
ˆ Viertes Duplikat je Well 370 Zellen in 50µl
ˆ Fünftes Duplikat je Well 123 Zellen in 50µl
Die Platte mit den DC wurde in den Brutschrank gestellt, bis die CD14− Zellen
vorbereitet waren. Als Negativkontrolle wurde jeweils ein Well mit DC ohne CD14−
Zellen kultiviert. War die gewonnene Zellzahl zu niedrig, um alle Verdünnungen
durchführen zu können, wurde auf das erste Duplikat verzichtet.
Die CD14− Zellen, welche nach der MACS-Isolierung bei -80°C eingefroren wurden,
wurden vorbereitet. Pro Platte wurden mindestens 10 Millionen CD14− benötigt.
Die Zellen wurden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, in einem 15ml Falcon-Röhrchen
vereint, zentrifugiert (370g und 8°C, 10 Minuten), in 20ml RPMI + 10% FCS
resuspendiert und erneut zentrifugiert (370g und 8°C, 10 Minuten).
Die Zellen wurden in kaltem PBS resuspendiert, wobei auf 10 Millionen Zellen
975µl PBS und danach 25µl Natriumperjodat (20mM) gegeben4 wurden, was einer
Endkonzentration von 0,5mM Natriumperjodat entsprach. Im Anschluß daran wurden
die Zellen 20 Minuten auf Eis inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 5ml FCS für jeden Milliliter Zelllösung hinzugegeben
und vorsichtig und gründlich vermischt. Die Zellen wurden zwei Mal in 20ml PBS
gewaschen, erneut in 20ml M-plus resuspendiert und zentrifugiert (370g und 8°C, 10
Minuten). Zuletzt wurden die Zellen mit Hilfe von M-plus auf eine Konzentration
von 2 Millionen Zellen je Milliliter (entsprechend 100.000 Zellen je 50µl) eingestellt.
Die CD14− Zellen wurden auf die vorbereitete Platte pipettiert, wobei je 50µl
in ein Well gegeben wurden. Dadurch ergaben sich Verdünnungen mit den DC von
4
Für die Stocklösung wurden 4,28mg Natriumperjodat in einem Milliliter destilliertem Wasser
gelöst und bei -20°C aufbewahrt. Natriumperjodat führt zu einem Einbau von Aldehyd-Grupen auf
T-Zellen, was zur Bildung zusätzlicher Schiff’scher Basen zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen führt [51]. Diese reversible Verbindung ermöglicht eine T-Zell-Rezeptor-unabhängige
Antigenerkennung [51].
4.2. METHODEN
39
Tabelle 4.3: Pipettierschema für LR
Verhältnis DC zu CD14−
1:10
1:30
nur
1:90
1:270
1:810 DC
nur
CD14−
RC
CD14−
Med
CD14−
Tgl
+IL-2
TG-2
+IL-2
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
+ConA
CD14−
+DC
+IL-2 RC RC Med Med Tgl Tgl TG2 TG2 / /
/ +ConA
−
DC – dendritische Zellen, CD14 – CD14-negative Zellen. RC– Reifungscocktail,
Med – Medium, Tgl – T-Gliadin, TG2 – Transglutaminase 2, IL-2 – Interleukin 2,
ConA – Concanavalin. / – leeres Well.
1:10, 1:30, 1:90, 1:270 und 1:180. Zur Kontrolle ihrer Stimulierbarkeit wurden CD14−
Zellen alleine, mit IL-2 (100u/ml) bzw. Concanavalin A (1µg/ml) oder mit IL-2
(100u/ml) und DC inkubiert.
Für eine Zusammenfassung des Pipettierschemas siehe Tabelle 4.3 auf S.39.
Die Kulturplatten wurden für 48 Stunden bei 37°C, 5% CO2 im Brutschrank
inkubiert. Die Proliferation wurde mittels BrDU5 überprüft, wobei der Einbau
von BrDU anstelle von Thymidin in die DNA bei der Zellteilung im Anschluss
photometrisch nachgewiesen wurde. Hierzu wurden die Zellen mit je 10µl BrDULösung inkubiert (Endkonzentration 10µM BrDU), vorsichtig geschüttelt und für
weitere 18 Stunden bei 37°C, 5% CO2 kultiviert.
Zum Abstoppen des BrDU-Einbaus wurde die Zellkulturplatte bei 300g und 21°C
10 Minuten zentrifugiert. Die Platte wurde vorsichtig ausgeklopft und getrocknet
(eine Stunde bei 60°C oder ca. 5 Minuten föhnen).
Für die Auswertung wurden je Well 200µl FixDenat“ zu den Zellen gegeben und
”
5
Hierfür wurde ein kommerzieller BrDU-Kit der Firma Roche verwendet, welcher bei 4°C
aufbewahrt wurde. Die Arbeitsschritte entsprachen den Herstellerangaben.
40
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellkulturplatte wurde auf Zellstoff
vorsichtig ausgeschlagen, in jedes Well wurden 100µl Anti-BrDU-POD-Lösung“ (Peri”
oxidase-gekoppelter Antikörper gegen BrDU) pipettiert und bei Raumtemperatur
90 Minuten inkubiert. Die Zellkulturplatte wurde dreimal mit je 200-300µl/Well
Washing Solution“‘ nachgewaschen. Nach Entfernen der Waschlösung wurden je
”
Well 100µl TMB (Tetramethylbenzidin) zugegeben und bei Raumtemperatur 5 bis
30 Minuten lang inkubiert, bis eine ausreichende Färbung sichtbar wurde.
Je Well wurden 25µl 1M Schwefelsäure als Stopplösung zugegeben und bei
Raumtemperatur für eine Minute auf dem Schüttler inkubiert. Der LR wurde im
ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450nm ausgewertet.
4.2.6
Antikörpernachweis mittels ELISA
Die Antikörperbestimmung diente der Identifizierung aktiver‘ Zöliakiepatienten.
’
Für die Bestimmung von Anti-Transglutaminase-Antikörpern (IgA, IgG) wurde ein
kommerzieller Kit der Firma Eurospital verwendet, der bei 4°C aufbewahrt wurde.
Vor Beginn mussten alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Die
Arbeitsschritte entsprachen den Herstellerangaben.
Das tiefgefrorene Probandenserum wurde aufgetaut und 1:101 verdünnt (10µl Serum auf 1ml Probenverdünnungslösung), die benötigte Anzahl an Mikrotiterküvetten
wurde in die Mikrotiterplatte eingefügt. Tabelle 4.4 auf S.41 zeigt ein Pipettierschema.
In jede Mikrotiterküvette wurden 100µl Kalibrator in den verschiedenen Verdünnungen pipettiert; es wurden jeweils 100µl vorverdünntes Patientenserum bzw. 100µl
Negativkontrolle oder 100µl Positivkontrolle hinzugefügt. Die Mikrotiterküvetten
wurden zum Schutz gegen Verdunstung mit Klebefolie abgedeckt und bei 21°C 45
Minuten inkubiert.
Im Anschluss wurde die Mikrotiterplatte mit jeweils 300µl Waschlösung je
Küvette insgesamt drei Mal gewaschen. In alle IgA-Küvetten wurden je 100µl AntiIgA-Konjugat und in alle IgG-Küvetten je 100µl Anti-IgG-Konjugat (Peroxidasegekoppelt) pipettiert, die Mikrotiterküvetten wurden mit Klebefolie abgedeckt und
bei 21°C 30 Minuten inkubiert.
4.2. METHODEN
41
Tabelle 4.4: Pipettierschema für ELISA
Position
IgA
IgG
A
10u
2u
B
20u
10u
C
50u
50u
D
100u
100u
E
IgA-Positivkontrolle
IgG-Positivkontrolle
F
IgA-Negativkontrolle
IgG-Negativkontrolle
G
Proband 1
Proband 1
H
Proband 2
Proband 2
Die Mikrotiterplatte wurde mit jeweils 300µl Waschlösung je Küvette insgesamt
drei Mal gewaschen. In alle Küvetten wurden je 100µl Substrat (TMB) pipettiert,
die Mikrotiterküvetten wurden mit Klebefolie abgedeckt und bei 21°C 15 Minuten
inkubiert.
Die Reaktion wurde mit 100µl Stopplösung je Küvette gestoppt. Das Ergebnis
wurde photometrisch bei 450nm bestimmt.
Interpretation der Ergebnisse:
positive Serologie für Zöliakie: IgA ≥ 16 / IgG ≥ 20
negative Serologie für Zöliakie: IgA < 9 / IgG < 20
9 ≤ IgA < 16: diagnostischer Graubereich
Bei IgA-Serum-Defizienz gilt ein IgG-Wert größer 9 als positiv.
4.2.7
HLA-Klasse-II Typisierung auf HLA-DQ2/8-Status
Bei allen Probanden wurde der HLA-DQ2/8-Trägerstatus festgestellt. Hierzu
wurde aus der Blutprobe zuerst DNA isoliert, diese mit Hilfe der PCR (PolymeraseKetten-Reaktion, engl. polymerase chain reaction) vervielfältigt und das Ergebnis
über eine Gelelektrophorese sichtbar gemacht.
42
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
DNA-Extraktion
Für die Extraktion der DNA aus der Blutprobe wurde ein kommerzieller Kit
der Firma Qiagen verwendet, welcher bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde. Die
Arbeitsschritte entsprachen den Herstellerangaben.
Die tiefgefrorene Zellsuspension wurde aufgetaut und 200µl davon wurden in
einem Eppendorfcup mit 20µl Protease gemischt. Dann wurden 200µl AL-Puffer
dazugegeben, mit dem Vortexer gemischt und bei 56°C 10 Minuten inkubiert. In
der Tischzentrifuge wurde einige Sekunden zentrifugiert, 200µl Ethanol wurden
dazugeben, mit dem Vortexer gemischt und erneut in der Tischzentrifuge zentrifugiert.
Der Inhalt des Eppendorfcups wurde auf eine Säule übertragen und bei 6010g und
21°C eine Minute zentrifugiert; das Filtrat wurde verworfen. Zur Säule wurden
500µl AW1-Lösung“ zugegeben und bei 6010g und 21°C eine Minute zentrifugiert;
”
das Filtrat wurde verworfen. Dann wurden 500µl AW2-Lösung“ dazugeben und
”
bei 20230g und 21°C drei Minuten zentrifugiert. Die Säule wurde auf ein neues
Eppendorfcup gesetzt und das Filtrat verworfen. Zuletzt wurden 200µl AC-Puffer“
”
dazugeben, um die DNA von der Säule zu lösen, fünf Minuten bei 21°C inkubiert
und bei 6010g und 21°C eine Minute zentrifugiert.
Falls die PCR am nächsten Tag durchgeführt wurde, konnte die DNA bei 4°C
aufbewahrt wurden; längere Aufbewahrung erfolgte bei -20°C.
PCR
Für die PCR wurde der kommerzielle Kit MutaGEL der Firma Immundiagostik verwendet, der bei 4°C gelagert wurde. Die Arbeitsschritte entsprachen den
Herstellerangaben, sämtliche Arbeitsschritte der PCR wurden auf Eis durchgeführt.
Pro Proband wurden zwei PCR-Probenröhrchen mit jeweils 20µl PCR-Mix A“
”
bzw. PCR-Mix B“ befüllt, dazu wurden jeweils 5µl der zuvor isolierten DNA gegeben.
”
Für die Positivkontrolle wurden 5µl Positivkontroll-DNA (im Kit enthalten) einmal
mit PCR-Mix A“ sowie einmal mit PCR-Mix B“ angesetzt; für die Negativkontrolle
”
”
wurden je 5µl destilliertes Wasser eingesetzt.
Die Probenröhrchen wurden in den Thermocycler gestellt. Folgende Einstellungen
4.3. STATISTISCHE AUSWERTUNG
43
wurden gewählt:
ˆ Anfangsphase: 95°C für 12 Minuten
ˆ 5 Zyklen 95°C für 30 Sekunden – 70°C für 30 Sekunden – 72°C für eine Minute
ˆ 5 Zyklen 95°C für 30 Sekunden – 65°C für 30 Sekunden – 72°C für eine Minute
ˆ 30 Zyklen 95°C für 30 Sekunden – 59°C für 30 Sekunden – 72°C für eine Minute
ˆ Strangverlängerung: 74°C für 10 Minuten
ˆ Endphase: 10°C
Gelelektrophorese
In der Gelelektrophorese wurden die durch PCR amplifizierten DNA-Sequenzen
nach ihrer Größe aufgetrennt und im UV-Transilluminator sichtbar gemacht.
Das Gel bestand aus 3% Agarose in einfachkonzentriertem TAE-Puffer (siehe
Kapitel 4.4.4) und wurde in der Mikrowelle schonend und unter gelegentlichem
Schwenken erhitzt, bis die Agarose vollständig gelöst war. Das Gel wurde blasenfrei
gegossen, die Kämme wurden eingesetzt und das Gel kühlte bei Raumtemperatur ca.
30 Minuten ab.
Für die Auftrennung wurden jeweils 10µl der amplifizierten Probe mit 2µl Bromphenolblau und Glycerin gemischt und auf das Gel aufgetragen. Zusätzlich musste
ein 100-Basenpaarstandard aufgetragen wurden.
Die DNA wurde bei 60V, 200mA und einer Laufzeit von 1,6 Stunden in TAEPuffer aufgetrennt und nach Inkubation in konzentrierter Sybrgreen-Lösung am
UV-Transilluminator ausgewertet.
4.3
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung und graphische Darstellung der Ergebnisse der FACSMessung wurden mit Hilfe des Programmes GraphPad Prism durchgeführt. Die
Signifikanzberechnung erfolgte mit 2-way ANOVA und dem Bonferroni post-Test.
Hierbei wurden sämtliche Ansätze eines Probanden miteinander und die Gruppen
untereinander verglichen. Hochsignifikante (p<0,0001), signifikante (p<0,001) und
44
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
niedrig-signifikante (p<0,01) Ergebnisse wurden im Kapitel 5 (S.51ff) in den Legenden
beschrieben. Die Ergebnisse des LR wurden mit Hilfe von Excel graphisch dargestellt.
4.4. MATERIAL
4.4
4.4.1
45
Material
Laborgeräte
Gerät
Hersteller
Brutschrank
HERAcell 240i
Durchflusszytometer
BD LSR Fortessa
Eismaschine
Scotsman
ELISA-Reader
Tecan
Gefrierschrank, -20°C
Liebherr
Gelelektrophoresekammer
Hoefer
Kühlschrank, 4°C
Liebherr
Mikroskop
Zeiss Axiovert 25
Mikrowelle
Severin
Parafilm
American National Can
PCR-Gerät
MJ Research PTC-100
Rollenschüttler
Assistent RM5
Schüttler
Scientific Industries
Spannungsgerät
Amersham Pharmacia Biotech
Thermocycler
Eppendorf Thermomixer Comfort
Tiefkühltruhe, -80°C
Hera Freeze
Tischzentrifuge
Qualitron
UV-Transilluminator
Peqlab
Vortexer
Heidolph Reax 2000
Wasserbad
Julabo
Zentrifuge
Eppendorf Centrifuge 5424
Heraeus instruments Biofuge Stratos
Heraeus multifuge X1R
46
4.4.2
4.4.3
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Gefäße
Gefäß
Hersteller
Zitrat-Röhrchen, 9ml
Sarstedt
Eppendorfcup
Eppendorf
Falcon-Röhrchen, 25ml
Sarstedt
Falcon-Röhrchen, 50ml
Sarstedt
Gefriertübchen, 2ml
Greiner Bio-one
Leucosep-Röhrchen, 50ml
Greiner Bio-one
MACS-Säule, LS/VS
Miltenyi
Tübchen
Sarstedt
Zellkulturplatte, 12 Well
Greiner Bio-one
Zellkulturplatte, 48 Well
Greiner Bio-one
Zellkulturplatte, 96 Well
Greiner Bio-one
Laborzubehör
Zubehör
Hersteller
Alkoholrondell
Quali-lab
Autopipette
Drumond
Autopipettenspitzen
Sarstedt
Cell Scraper
Corning Incorporated
Dialysemembran 1000Da
Serva
MACS-Gerüst
Miltenyi
Mikrotiterplatte
Greiner Bio-one
Multipette
Eppendorf
Multipettenspitzen
Eppendorf
Neubauer-Zählkammer
Marienfeld
Pipetten
Eppendorf
Pipettenspitzen
Starlab
Sterilfilter 0,22µm
BD
4.4. MATERIAL
4.4.4
47
Reagentien
Reagens
Hersteller
2-Merkaptoethanol
Gibco
AB-Serum
Invitrogen
Agarose
Peqlab
Ammoniumchlorid
Merck
Ammoniumbicarbonat
Merck
Aqua dest.
Basenstandard (bp100)
Gibco
Bromphenol blau
Invitrogen
BSA
Sigma
Concanavalin
Sigma
DMSO
Sigma
EDTA
Merck
Essigsäure
Merck
FCS
PAA
Ficoll
PAA
Gliadin
Sigma
GM-CSF
Miltenyi
Harnstoff
Merck
IL-2
Seromed
IL-4
Miltenyi
IL-15
Miltenyi
Kaliumdihydrocarbonat
Merck
MACS-Beads, CD14
Miltenyi
PBS
Gibco
Penicillin/Streptomycin
Biochrom
Reifungscocktail
Dermatologie Erlangen
RPMI
Gibco
Salzsäure
Merck
48
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
Sybrgreen
BioRad
Transglutaminase
Herstellung im eigenen Labor
Tris-Base
Sigma
Trypanblau
Biochrom
Trypsin
Merck
X-Vivo 15
Lonza
Antikörper
Zielstruktur
Farbstoff
Klon
Isotyp
Herkunft
Hersteller
CD14
PE
M5E2
IgG2a,κ
Maus
BD Bioscience
CD25
APC
M-A251
IgG1,κ
Maus
BD Bioscience
CD71
FITC
M-A712
IgG2a,κ
Maus
BD Bioscience
CD83
APC
HB15e
IgG1,κ
Maus
BD Bioscience
CD86
PE
2331(FUN-1)
IgG1,κ
Maus
BD Bioscience
CD89
PE
A59
IgG1,κ
Maus
BD Bioscience
CD103
FITC
EPR4166
IgG
Hase
Epitomics
CD209
APC
DCN46
IgG2b,κ
Maus
BD Bioscience
DR
PE
G46-6
IgG2a,κ
Maus
BD Bioscience
TG2
FITC
polyklonal
gesamt-IgG Hase
Zedira
Isotypkontrollen
IgG1
APC
X40
IgG
Maus
BD Bioscience
IgG1,κ
PE
MOPC-21
IgG1,κ
Maus
BD Bioscience
IgG2a,κ
FITC
G155-178
IgG2a,κ
Maus
BD Bioscience
Lösungen und Puffer
Für den ACK-Lyse-Puffer wurden 8,29g Ammoniumchlorid (0,15M), 1g Kaliumdihydrocarbonat (1mM) und 37,2mg Binatrium-EDTA (0,1mM) abgewogen und in
800ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH wurde mittels Salzsäure (1N) auf den
Bereich 7,2 bis 7,4 eingestellt. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf
1000ml aufgefüllt. Die Lösung wurde durch einen 0,22µm Filter steril filtriert und
bei Raumtemperatur gelagert.
4.4. MATERIAL
49
MACS-Puffer wurde aus PBS mit 0,5% BSA und 2mM EDTA hergestellt und
steril filtriert. Er konnte bei 4°C bis zu vier Wochen aufbewahrt werden.
Einfriermedium I bestand zu 50% aus RPMI und zu 50% aus FCS und wurde
bei 4°C aufbewahrt. Einfriermedium II wurde aus 60% RPMI, 20% DMSO und 20%
FCS hergestellt und ebenfalls bei 4°C aufbewahrt.
Das Zellkulturmedium bestand aus X-Vivo 15, versetzt mit 2% AB-Serum und
Penicillin/Streptomycin (Konzentration von Penicillin 100u/ml, von Streptomycin
100µg/ml).
Der Reifungscocktail wurde von der Dermatologischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen zur Verfügung gestellt. Er bestand aus 800u/ml GM-CSF, 250u/ml
IL-4, 2ng/ml IL-1β, 1000u/ml IL-6, 10ng/ml TNF-α, 10ng/ml IL-15 und 1µg/ml
PGE2 in PBS. Nach der Zubereitung wurde er aliquotiert bei -20°C aufbewahrt und
in einer Konzentration von 10µl je Milliliter Zellkulturmedium eingesetzt.
FACS-Puffer bestand aus PBS mit 2% FCS und wurde bei 4°C gelagert.
M-plus-Medium bestand aus X-Vivo 15 mit 2% AB-Serum, 1,5mM CaCl2 und
5µl 2-Mercaptoethanol (50mM).
TAE-Puffer wurde als Stocklösung (fünfzigfach) aus 121g Tris-Base, 28,55ml
Essigsäure und 50mL 0,5M EDTA hergestellt und mit destilliertem Wasser auf 500ml
aufgefüllt. Für die Gelelektrophorese wurde der Puffer mit destilliertem Wasser auf
einfache Konzentration verdünnt.
T-Gliadin
T-Gliadin wurde durch tryptischen Verdau aus Gliadin gewonnen.
1g Gliadin wurde in 7,5ml Ammoniumbicarbonatlösung (10mM), pH 7,5 mit 2M
Harnstoff bei 37°C in einem Schüttler für zwei Stunden gelöst.
50mg Trypsin wurden in 500µl Salzsäure (1mM) gelöst und zu der Gliadinlösung
gegeben. Der enzymatische Verdau wurde über vier Stunden bei 37°C in einem
Schüttler durchgeführt. Das Enzym Trypsin wurde bei 80°C für 30 Minute inaktiviert. Die Lösung wurde zentrifugiert (6010g und 21°C, 15 Minuten) und gegen
1,5l Ammoniumbicarbonat (10mM) bei 4°C über Nacht dialysiert (Ausschlussgröße
der Dialysemembran 1000Da). Der Dialysepuffer wurde gegen 1,5l neuen Puffer
50
KAPITEL 4. DURCHFÜHRUNG
ausgewechselt und die Dialyse für weitere vier bis fünf Stunden durchgeführt.
Das gewonnene T-Gliadin wurde bei -80°C eingefroren und lyophilisiert.
Transglutaminase
Die Herstellung der TG2 erfolgte wie in [16] und [49] beschrieben im E. coliSystem.
4.4.5
4.4.6
Kommerzielle Reaktionssysteme
Reaktionssystem
Hersteller
BrDU-Kit
Roche
DNA Blood Kit
Qiagen
Eu-TG IgG
Eurospital
Eu-TG IgA
Eurospital
HLA-DQ2+8-Kit
Immundiagnostik GmbH
Software
Excel
Microsoft Corporation
FACS-Diva
BD Biosciences
Flow Jo
Tree Star, Inc.
GIMP
freie Software (GNU)
GraphPad Prism
GraphPad Software, Inc.
Inkscape
freie Software (GNU)
MikTeX
Open Source
51
Kapitel 5
Ergebnisse
Die Inkubation von CD14+ Monozyten mit GM-CSF und IL-4 bewirkt die Reifung
dieser Zellen zu semimaturen dendritischen Zellen; durch die Stimulation von CD14+
Monozyten mit GM-CSF und IL-15 reifen die Zellen zu makrophagenähnlichen Zellen
heran [22]. In der FACS-Messung wurde die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle bestimmt (Kapitel 5.1 auf S.51); die biologische Aktivität der gereiften Zellen
wurde mittels des Lymphozytenreaktionstestes (Kapitel 5.2 auf S.69) untersucht.
5.1
Durchflusszytometrische Messungen
Die Oberflächenmoleküle der Zellen wurden im Durchflusszytometer gemessen
und graphisch, aufgeschlüsselt nach Stimulation mit IL-4 oder IL-15, ausgewertet.
Der Ansatz mit Reifungscocktail (nicht dargestellt) diente als Positivkontrolle der
Stimulierbarkeit der gewonnenen Zellen, der Ansatz mit Zellkulturmedium diente
als Negativkontrolle. Dabei wurden die prozentualen Veränderungen der Marker im
Vergleich zur Negativkontrolle betrachtet sowie die Dichte der Oberflächenmarker
bestimmt.
Bei den nachfolgenden graphischen Abbildungen der FACS-Messergebnisse ist
in der ersten Graphik die Veränderung der Expression eines Oberflächenmarkers in
Prozent (im Vergleich zur Mediumkontrolle) angegeben, die zweite Graphik zeigt die
absolute Dichte der Zelloberflächenparameter (genannt mean“, angegeben wird die
”
mittlere Fluoreszenzintensität, engl. mean fluorescence intensity (MFI), in relativen
’
52
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
Einheiten‘, wobei es sich um eine logarithmische Skalierung handelt). Es wurden alle
Versuchsgruppen ( DQ2/8 neg Ko“ bezeichnet die HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen,
”
DQ2/8 pos Ko“ die HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen, gfd“ die Zöliakiepatienten
”
”
unter glutenfreier Diät, cd“ aktive‘ Zöliakiepatienten) sowie jeweils beide Zellpopu”
’
lationen (IL-4- und IL-15-gereifte Zellen) dargestellt. Sofern die statistische Analyse
signifikante Ergebnisse erbrachte, sind diese in die Bildunterschriften eingefügt. Dabei
ist benannt, um welche Probandengruppe, IL-4- oder IL-15-gereifte Zellen und um
welches Stimulans (T-Gliadin oder TG2) es sich handelt.
5.1.1
CD14
CD14 ist ein Marker für Makrophagen und Monozyten im peripheren Blut und
wird auch Lipopolysaccharidrezeptor genannt [59]. Es ist bekannt, dass die CD14Expression bei der Reifung von dendritischen Zellen deutlich reduziert wird [22].
CD14 diente in dieser Arbeit der Überprüfung der Zellreifung zu dendritischen
Zellen nach Stimulation mit IL-4 und GM-CSF und wurde erwartungsgemäß nur
noch gering exprimiert (siehe Abbildung 5.1 auf S.53). Die Inkubation mit IL-15
hingegegen führte zur Prägung der Monozyten zu makrophagenähnlichen Zellen,
wobei die Expression von CD14 weiterhin hoch blieb. Dieser Effekt war besonders
bei Zöliakiepatienten mit oder ohne glutenfreie Diät zu erkennen.
5.1.2
CD25
CD25 ist ein Aktivierungsmarker auf T-Lymphozyten und dendritischen Zellen und bildet zusammen mit p75 den Rezeptor für IL-2 [59]. Für die graphische
Darstellung der Ergebnisse siehe Abbildung 5.2 auf S.54.
Die prozentuale Veränderung der CD25-Moleküle auf der Zelloberfläche war bei IL15-gereiften Zellen deutlich stärker ausgeprägt und zeigte in allen vier Gruppen eine
Signifikanz (mindestens p<0,01), verglichen mit IL-4-gereiften Zellen. Die Stimulation
mit TG2 oder T-Gliadin bewirkte bei beiden Zelltypen eine weitere deutliche Zunahme
der CD25-Expression, wobei bei den HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen TG2 eine
stärkere Zunahme hervorrief als T-Gliadin. Der Vergleich zwischen IL-4-gereiften
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
53
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.1: CD14: FACS-Daten, jeweils nur Reifungscocktail in allen Versuchsgruppen. a) prozentuale Veränderung von CD14, b) Dichte von CD14 in relativen
’
Einheiten‘.
54
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.2: CD25: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD25. (∗ )p<0,01
bei IL-4, HLA-DQ2/8-negative Kontrollen vs. aktive‘ Patienten (TG2). (◦ )p<0,01
’
bei IL-4 vs. IL-15, aktive‘ Zöliakiepatienten (T-Gliadin und TG2), b) Dichte von
’
CD25 in relativen Einheiten‘. (+ )p<0,001 bzw p<0,0001 bei IL-15, DQ2/8-positive
’
Kontrollen (T-Gliadin bzw. TG2).
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
55
Zellen der HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen mit den aktiven‘ Zöliakiepatienten
’
erbrachte ein niedrig-signifikantes Ergebnis (p<0,01). Innerhalb der Gruppe der
aktiven‘ Zöliakiepatienten war der Unterschied zwischen IL-4- und IL-15-gereiften
’
Zellen im T-Gliadin-Ansatz ebenfalls niedrig-signifikant (p<0,01).
Auch bei der CD25-Dichte zeigten IL-15-gereifte Zellen deutlich höhere Werte als
IL-4-gereifte Zellen. Die IL-15-gereiften Zellen zeigten besonders nach Stimulation
mit TG2 bzw. T-Gliadin höhere Werte als in der reinen Mediumkontrolle, wobei der
stärkste Effekt in der Gruppe der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen zu finden war.
Hier fand sich auch eine eindeutige Signifikanz der Dichteveränderung (p<0,001 bei
T-Gliadin, p<0,0001 bei TG2). Die Zellen der Zöliakiepatienten wiesen sowohl nach
IL-4- als auch nach IL-15-Stimulation die geringste CD25-Dichte auf, zeigten aber
ebenfalls eine deutliche Stimulation nach IL-15-Gabe und besonders nach Inkubation
mit TG2 und T-Gliadin.
Ein Effekt von Lipopolysaccharidspuren in der Gliadin- und TG2-Präparation konnte ausgeschlossen werden, da die IL-4-stimulierten Zellen nicht mit einer
vermehrten CD25-Expression reagierten.
5.1.3
CD83
CD83 ist ein sehr spezifischer Aktivierungs- und Reifemarker für dendritische
Zellen und kann in einer membrangebundenen Form vorliegen, welche in dieser Arbeit
untersucht wurde [33, 50].
Bereits in der Mediumkontrolle zeigte sich eine hohe Oberflächenexpression
von CD83, bei IL-4-gereiften Zellen lagen diese Werte leicht unterhalb der von
IL-15-gereiften Zellen (siehe Abbildung 5.3 auf S.56). In der Gruppe der aktiven‘
’
Zöliakiepatienten zeigte sich eine insgesamt geringere Oberflächenexpression von
CD83. Bei Zellen, die mit IL-4 reiften, führte die Stimulation mit T-Gliadin und
TG2 zu einer leicht erhöhten CD83-Expression, dies war bei IL-15-gereiften Zellen
nicht zu verzeichnen. Hier zeigte sich kein Unterschied zwischen der Stimulation mit
TG2 und T-Gliadin.
Bei der Dichte zeigten sich in den Kontrollgruppen bei den IL-4-gereiften Zellen
56
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.3: CD83: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD83, b) Dichte
von CD83 in relativen Einheiten‘.
’
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
57
geringfügig höhere Werte als bei den IL-15-gereiften Zellen. Bei den Zöliakiepatienten
unter glutenfreier Diät war dieser Effekt umgekehrt: Hier waren die Werte bei IL-15gereiften Zellen etwas höher als bei IL-4-gereiften Zellen. Bei den Zellen der aktiven‘
’
Zöliakiepatienten zeigte sich kaum eine vermehrte CD83-Expression. Bezüglich der
Stimulation mit TG2 oder T-Gliadin ließ sich kein Unterschied erkennen.
5.1.4
CD86
CD86 (umfasst auch B7-2) bewirkt als kostimulatorisches Signal die Aktivierung
von T-Lymphozyten zur Teilung und stellt somit einen Aktivierungsmarker auf
Monozyten und B-Zellen dar [34, 59, 70]. Abbildung 5.4 auf S.58 zeigt die graphische
Darstellung der Ergebnisse.
Bei Reifung mit IL-4 fand sich bei allen Probandengruppen eine deutlich stärkere
Expression des Oberflächenmoleküls CD86 als nach Inkubation mit IL-15. TG2 und
T-Gliadin bewirkten bei IL-4-gereiften Zellen in allen Gruppen eine verminderte
Expression von CD86, verglichen mit der Mediumkontrolle. Im Gegensatz dazu
bewirkte die Stimulation mit T-Gliadin bei IL-15-gereiften Zellen in allen Kollektiven
eine vermehrte Expression von CD86, während TG2-stimulierte Zellen nur eine
geringe CD86-Expression aufwiesen. Die Zellen aktiver‘ Zöliakiepatienten wiesen
’
sowohl nach IL-4- als auch nach IL-15-Reifung die geringste CD86-Expression auf.
IL-4-gereifte Zellen zeigten ebenfalls eine deutlich höhere Dichte an CD86 als IL15-gereifte Zellen und in Analogie zu den prozentualen Werten konnte auch hier durch
die Zugabe von TG2 bzw. T-Gliadin eine dezente Herunterregulation verzeichnet
werden. Die niedrigsten Werte bei den IL-4-gereiften Zellen fanden sich wiederum bei
den aktiven‘ Zöliakiepatienten. IL-15-gereifte Zellen zeigten auf die verschiedenen
’
Antigene keine Veränderung, auch fand sich kein relevanter Unterschied zwischen
den verschiedenen Versuchsgruppen. Bei den Patienten unter glutenfreier Diät war
der Vergleich von IL-4- und IL-15-gereiften Zellen niedrig-signifikant (p<0,01 sowohl
bei T-Gliadin als auch bei TG2).
58
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.4: CD86: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD86, b) Dichte
von CD86 in relativen Einheiten‘. (∗ )p<0,01 bei IL-4 vs. IL-15, Patienten unter
’
glutenfreier Diät (T-Gliadin und TG2).
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
5.1.5
59
HLA-DR
HLA-DR wird bei der Reifung von dendritischen Zellen vermehrt exprimiert und
diente in dieser Arbeit als Aktivierungsmarker [5, 46]. HLA-DR-Moleküle spielen
eine wesentliche Rolle bei der Interaktion von antigenpräsentierenden Zellen und
T-Zellen [5].
Die Oberflächenexpression von HLA-DR war in allen Versuchsgruppen bei IL-15gereiften Zellen höher als bei IL-4-gereiften Zellen (siehe Abbildung 5.5 auf S.60).
Der höchste Wert fand sich in der Gruppe der HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen,
der niedrigste Wert fand sich bei den Zellen der aktiven‘ Zöliakiepatienten. In der
’
Gruppe der aktiven‘ Zöliakiepatienten führte die Stimulation mit T-Gliadin zu
’
höheren Werten als die TG2-Stimulation. Bei den IL-4-gereiften Zellen der Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät zeigte sich eine leicht verminderte Expression
nach Stimulation mit T-Gliadin, TG2 führte zu einer ähnlich hohen Expression wie
in der Mediumkontrolle. Bei den IL-15-gereiften Zellen der HLA-DQ2/8-positiven
Kontrollen sowie der Patienten unter glutenfreier Diät zeigte sich kein Untersuchied
zwischen der Stimulation mit TG2 oder T-Gliadin, jedoch führten beide Ansätze zu
einer höheren Expression als in der Mediumkontrolle. Bei allen anderen Ansätzen
zeigte sich kein Unterschied zwischen der Mediumkontrolle und der Stimulation mit
T-Gliadin oder TG2.
Bei der Dichte zeigte sich ebenfalls bei den IL-15-gereiften Zellen der HLA-DQ2/8negativen Kontrollen der höchste HLA-DR-Wert; auch war nur in dieser Gruppe
ein deutlicher Unterschied zwischen den IL-4- (niedrig) und den IL-15-gereiften
Zellen (hoch) zu verzeichnen. Bei allen anderen Gruppen fanden sich für beide
Ansätze ähnliche, eher niedrige Werte; in der Gruppe der aktiven‘ Zöliakiepatienten
’
fanden sich besonders niedrige Werte. In allen Versuchsgruppen zeigte sich kein
nennenswerter Unterschied zwischen TG2 und T-Gliadin.
5.1.6
CD89
CD89 ist ein IgA-Rezeptor (FcαR) auf Zellen der myeloischen Zellreihe, unter
anderem auch auf Monozyten und Makrophagen [1, 43].
60
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.5: HLA-DR: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von HLA-DR,
b) Dichte von HLA-DR in relativen Einheiten‘.
’
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
61
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.6: CD89: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD89, b) Dichte
von CD89 in relativen Einheiten‘. (∗ )p<0,01 bei IL-4 vs. IL-15, Patienten unter
’
glutenfreier Diät (T-Gliadin und TG2).
62
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
Die Stimulation mit IL-15 führte in allen Gruppen zu einer deutlichen prozentualen
Erhöhung von CD89, welche im Vergleich mit den IL-4-gereiften Zellen ebenfalls
in allen vier Gruppen statistisch signifikant war (p<0,001) (siehe Abbildung 5.6
auf S.61). Bei IL-4-gereiften Zellen zeigte sich bei den aktiven‘ Zöliakiepatienten
’
eine leichte Erhöhung, bei den anderen Gruppen fanden sich nur minimal erhöhte
Werte. Die Stimulation mit T-Gliadin führte in allen Gruppen zu der stärksten
Oberflächenexpression von CD89.
Auch bei der Dichte zeigte sich nach Stimulation mit IL-15 ein deutlicher, statistisch signifikanter Anstieg in allen vier Gruppen (p<0,01), wobei die Zellen der
HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen den geringsten Anstieg aufwiesen. Die Stimulation
mit TG2 bzw. T-Gliadin erbrachte auch hier das höchste Ergebnis, besonders in der
Gruppe der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen, wobei sich kein Unterschied zwischen
TG2 und T-Gliadin fand. Bei den IL-4-gereiften Zellen fanden sich nur sehr geringe
Unterschiede zwischen den verschiedenen Stimulantien. Der Vergleich der IL-4- und
der IL-15-gereiften Zellen war in der Gruppe der Patienten unter glutenfreier Diät
niedrig-signifikant (p<0,01 sowohl für T-Gliadin als auch für TG2).
5.1.7
CD209
CD209 (DC-Sign) ist auf dendritischen Zellen in mukosalen Geweben zu finden und
stabilisiert die Kontaktzone zwischen dendritischen Zellen und T-Zell-Rezeptoren [1].
Durch die Interaktion mit ICAM2, das auf vaskulärem Endothel exprimiert wird,
befähigt CD209 die dendritischen Zellen zum Durchtritt durch das Endothel [19].
Die Ergebnisse sind in Abbildung 5.7 auf S.63 graphisch dargestellt.
IL-4-gereifte Zellen exprimierten CD209 unabhängig vom Stimulus zu nahezu
100% auf ihrer Zelloberfläche. Die Inkubation von Monozyten mit IL-15 bewirkte
jedoch eine statistisch signifikant verringerte Expression von CD209 (p<0,01), wobei
die Stimulation mit TG2 eine besonders niedrige Oberflächenexpression hervorrief.
Betrachtet man die Dichte der IL-15-gereiften Zellen, so fällt eine sehr geringe
Menge an CD209-Molekülen auf, unabhängig vom eingesetzten Stimulans. Bei den
IL-4-gereiften Zellen zeigte sich dagegen eine deutliche Steigerung der Dichte, wobei
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
63
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.7: CD209: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD209, b)
Dichte von CD209 in relativen Einheiten‘.
’
64
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
die Stimulation mit TG2 zu etwas niedrigeren Werten führte, verglichen mit dem
Einsatz von T-Gliadin und der Mediumkontrolle.
5.1.8
CD71
CD71 ist ein Transferrinrezeptor, der sich auf allen proliferierenden Zellen findet
und bei Zöliakiepatienten vermehrt im intestinalen Gewebe exprimiert wird [1, 39].
Es wird spekuliert, dass Gliadin mit Hilfe von CD71 durch Retrotranszytose durch
das Epithel geschleust wird [39].
IL-15 bewirkte im Reifungsprozess der Monozyten eine vermehrte prozentuale
Expression von CD71 im Vergleich zu IL-4 (siehe Abbildung 5.8 auf S.65). TGliadin bewirkte in allen Gruppen, unabhängig von IL-4- oder IL-15-Reifung, eine
zusätzliche starke Expression von CD71. Die Inkubation mit TG2 führte nur in
HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen zu einer vermehrten CD71-Expression. Bei den
HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen sowie bei Zöliakiepatienten (mit und ohne Diät)
wurde nach TG2-Stimulation eine verminderte CD71-Expression festgestellt.
Die Dichte an CD71 ergab ebenfalls bei den IL-15-gereiften Zellen deutlich höhere
Werte als bei IL-4-gereiften Zellen. Hierbei ließen sich in allen Versuchsgruppen keine
Unterschiede bezüglich des eingesetzten Stimulans feststellen. Die Zellen aktiver‘
’
Zöliakiepatienten wiesen die geringste Stimulierbarkeit auf.
Sowohl bei der Oberflächenexpression als auch bei der Dichte war innerhalb der
Gruppe der Patienten unter glutenfreier Diät der Vergleich der T-Gliadin- mit der
TG2-Stimulation statistisch signifikant.
5.1.9
TG2
TG2 wird an der Oberfläche vieler Zellen exprimiert, auf dendritischen Zellen
bewirkt die TG2 möglicherweise eine effiziente Phagozytose [52]. Eine graphische
Darstellung der Ergebnisse bietet Abbildung 5.9 auf S.66.
IL-15 bewirkte im Vergleich zu IL-4 eine deutliche Steigerung der Oberflächenexpression von TG2. Die verminderte TG2-Expression bei IL-4- im Vergleich zu
IL-15-gereiften Zellen war in allen Versuchsgruppen statistisch signifikant. Mit Aus-
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
65
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.8: CD71: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD71. (∗ )p<0,01
bei IL-4 bzw. (◦ )p<0,05 bei IL-15, Patienten unter glutenfreier Diät (T-Gliadin vs.
TG2), b) Dichte von CD71 in relativen Einheiten‘. (+ )p<0,05 bei IL-4, Patienten
’
unter glutenfreier Diät (T-Gliadin vs. TG2).
66
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.9: TG2: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von TG2. (∗ )p<0,001
bei IL-4 bzw. (◦ )p<0,01 bei IL-15, HLA-DQ2/8-positive Kontrollen (T-Gliadin vs.
TG2), (+ )p<0,05 bei IL-4, Patienten unter glutenfreier Diät (T-Gliadin vs. TG2),
(∧ )p<0,01 bei IL-4 und IL-15, aktive‘ Zöliakiepatienten (T-Gliadin vs. TG2), b)
’
Dichte von TG2 in relativen Einheiten‘.
’
5.1. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNGEN
67
nahme der IL-15-gereiften Zellen von diäthaltenden Zöliakiepatienten bewirkte eine
Stimulation mit T-Gliadin die stärkste Expressionssteigerung. Der Effekt der TG2Stimulation auf die TG2-Expression war mit der Mediumkontrolle vergleichbar. Der
Expressionsunterschied zwischen der Stimulation mit T-Gliadin und mit TG2 war bei
beiden Patientengruppen sowie bei den HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen statistisch
signifikant (bei IL-4-gereiften Zellen in allen drei Gruppen, bei IL-15-gereiften Zellen
bei den HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen sowie den aktiven‘ Zöliakiepatienten).
’
Bei den Kontrollgruppen sowie bei den diäthaltenden Patienten fand sich bei den
IL-15-gereiften Zellen eine deutlich höhere Dichte als bei den IL-4-gereiften Zellen.
Die Dichte zeigte in der Gruppe der aktiven‘ Patienten sowohl hinsichtlich Reifung
’
als auch Stimulation wenig Unterschied. In den meisten Fällen ergab eine Stimulation
mit T-Gliadin die höchsten Werte, mit Ausnahme der IL-4-gereiften Zellen der HLADQ2/8-negativen Kontrollen, wo sich die höchsten Werte nach Stimulation mit TG2
fanden. Die andere Ausnahme bilden wiederum die IL-15-Zellen der diäthaltenden
Patienen, bei denen sich die höchsten Werte in der Mediumkontrolle bei nur sehr
geringer Streubreite aller Stimulationsansätze fanden.
5.1.10
CD103
CD103, auch als αE-Integrin bekannt, findet sich hauptsächlich auf IEL und spielt
eine Rolle bei Adhäsionsprozessen [1, 6]. CD103 konnte in dieser Arbeit jedoch auch
auf Monozyten nachgewiesen werden. In Kombination mit B7 ermöglicht CD103 den
Immunzellen die Rückkehr ins Darmepithel [31]. Abbildung 5.10 auf S.68 stellt die
Ergebnisse graphisch dar.
In drei Gruppen (beide Kontrollgruppen sowie Zöliakiepatienten unter glutenfreier
Diät) fand sich in der Gruppe der IL-15-gereiften Zellen eine größere, statistisch
signifikante Oberflächenexpression von CD103 als nach Inkubation mit IL-4 (p<0,01).
In der Gruppe der aktiven‘ Zöliakiepatienten fand sich kein Unterschied zwischen
’
der Reifung mit IL-4 oder IL-15. Die Stimulation mit T-Gliadin führte in allen
vier Probandengruppen und unabhängig von der Reifung mit IL-4 oder IL-15 zu
den jeweils höchsten, statistisch ebenfalls signifikanten Oberflächenexpressionen
68
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) prozentuale Veränderung
(b) Dichte
Abbildung 5.10: CD103: FACS-Daten. a) prozentuale Veränderung von CD103.
(∗ )p<0,01 bei IL-15, HLA-DQ2/8-negative Kontrollen (T-Gliadin). (◦ )p<0,01 bei IL-4,
HLA-DQ2/8-positive Kontrollen, Patienten unter glutenfreier Diät und aktive‘ Zölia’
kiepatienten (T-Gliadin). (+ )p<0,001 bei IL-15, HLA-DQ2/8-positive Kontrollen,
Patienten unter glutenfreier Diät und aktive‘ Zöliakiepatienten (T-Gliadin), b) Dich’
te von CD103 in relativen Einheiten‘. (∧ )p<0,0001 bei IL-15, HLA-DQ2/8-positive
’
Kontrollen vs. Patienten unter glutenfreier Diät und bei IL-15, HLA-DQ2/8-positive
Kontrollen vs. aktive‘ Zöliakiepatienten (T-Gliadin).
’
5.2. LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST
69
(mindestens p<0,01). Bei Stimulation mit TG2 zeigte sich lediglich bei den IL-15gereiften-Zellen der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen ein minimal erhöhter Wert; in
dieser Gruppe fand sich auch der absolut höchste Wert aller Stimulansansätze. In
allen anderen Zellgruppen zeigten sich keine relevanten Unterschiede zwischen der
Stimulation mit TG2 und der Mediumkontrolle.
Auch bei der Dichte der CD103-Merkmale zeigte sich bei den IL-15-gereiften
Zellen in allen vier Gruppen ein höherer Wert als bei IL-4-gereiften Zellen, welcher bei
den HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen sowie bei beiden Patientengruppen statistisch
signifikant war (p<0,05 in beiden Patientengruppen, p<0,0001 bei den HLA-DQ2/8positiven Kontrollen). Dieser Unterschied war bei den aktiven‘ Zöliakiepatienten nur
’
sehr gering ausgeprägt, bei insgesamt sehr niedriger Variabilität auch bezüglich des
eingesetzten Stimulans in dieser Probandengruppe. Die Stimulation mit T-Gliadin
zeigte auch hier deutlich höhere Werte als die Stimulation mit TG2, die in allen
vier Probandengruppen statistisch signifikant war (mindestens p<0,05); der absolut
höchste Wert fand sich wiederum in der Gruppe der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen
bei den IL-15-gereiften Zellen. Die Stimulation mit TG2 sowie die Mediumkontrolle
erbrachten in allen Probandengruppen keine relevant unterschiedlichen Werte. Die
Ergebnisse der IL-15-gereiften Zellen der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen waren
nach T-Gliadin-Stimulation sowohl gegenüber denen der Patienten unter glutenfreier
Diät als auch gegenüber den aktiven‘ Zöliakiepatienten hoch signifikant.
’
5.2
Lymphozytenproliferationstest
Im Lymphozytenproliferationstest (LR) wurden die in der Zellkultur stimulierten
dendritischen Zellen eingesetzt, um ihre Aktivität sowie ihre Kapazität, die Proliferation von autologen CD14− Zellen zu fördern, zu bestimmen. Der LR wurde
mit den IL-4- und den IL-15-gereiften Zellen durchgeführt, wobei die verschieden
stimulierten Untergruppen (Medium, Reifungscocktail, T-Gliadin, TG2) getrennt behandelt wurden. Der Ansatz mit Reifungscocktail diente hierbei als Positivkontrolle,
ob die CD14− Zellen von autologen dendritischen Zellen überhaupt zur Proliferation
angeregt werden können.
70
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
Es wurden Verdünnungsreihen mit dem Verhältnis dendritischer Zellen zu CD14−
Zellen von 1:10, 1:30, 1:90, 1:270 und 1:810 angelegt. Bei nicht ausreichender Anzahl
an dendritischen Zellen wurde die 1:10-Verdünnung gestrichen. Außerdem gab es als
Negativkontrolle einen Ansatz, in dem dendritische Zellen alleine kultiviert wurden.
Dieser ist aus Gründen der Übersichtlichkeit im Folgenden nicht graphisch dargestellt.
Bei allen Versuchen, unabhängig von Gruppenzugehörigkeit oder Reifung mit
IL-4 oder IL-15, führte der Einsatz von höheren Mengen an dendritischen Zellen im
Verhältnis zu CD14− Zellen zu ausgeprägteren Reaktionen.
Bei den Graphen ist, jeweils separat für IL-4- und IL-15-gereifte Zellen eines
Probanden, auf der X-Achse das Verhältnis dendritischer Zellen zu autologen CD14−
Zellen dargestellt. Die Y-Achse zeigt die optische Dichte nach Einbau und Detektion
von BrDU (bei 450 nm) und ist somit ein Maß für die Proliferation der Lymphozyten
(siehe S.37ff).
5.2.1
HLA-DQ2/8-negative Kontrollen
Die Graphen aller Probanden dieser Versuchsgruppe sind als Abbildung 5.11 auf
S.72 dargestellt.
Sowohl die IL-4- als auch die IL-15-gereiften dendritischen Zellen waren nach Stimulation mit Reifungscocktail in der Lage, die CD14− Zellen deutlich zu stimulieren.
Je mehr DC im Verhältnis zu CD14− Zellen eingesetzt wurden, umso stärker war die
Proliferation.
Die Oberflächenmarker der dendritischen Zellen (z.B. besonders CD25 nach
TG2-Stimulation, siehe S.51ff) waren bei den IL-4- und besonders bei den IL-15gereiften Zellen nach Stimulation mit den verschiedenen Antigenen erhöht. Dennoch
zeigten diese Zellen im Vergleich zur Mediumkontrolle nur geringfügig vermehrte
T-Zell-proliferative Eigenschaften.
Ein Vergleich der stimulatorischen Fähigkeiten von T-Gliadin- und TG2-behandelten Zellen zeigte, dass (mit Ausnahme von Proband 2) IL-4-gereifte dendritische
Zellen durch Behandlung mit T-Gliadin im Vergleich zur Inkubation mit TG2 eine
vermehrte Stimulationskapazität für CD14− autologe Zellen aufwiesen.
5.2. LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST
(a) Proband 1
(b) Proband 2
(c) Proband 3
(d) Proband 4
71
72
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(e) Proband 5
Abbildung 5.11: Lymphozytenproliferationstest in der Gruppe der HLA-DQ2/8negativen gesunden Kontrollen. In der linken Spalte ist die Stimulation der Zellen mit
GM-CSF und IL-4 dargestellt, in der rechten Spalte die Stimulation mit GM-CSF
und IL-15. a) Proband 1, b) Proband 2, c) Proband 3, d) Proband 4, e) Proband 5.
Im Gegensatz hierzu führte eine Stimulation der IL-15-gereiften Zellen mit TG2
zu einer deutlich gesteigerten Aktivität dieser Zellen, verglichen mit der Behandlung
mit T-Gliadin. Bei Proband 2 fand sich hierbei bei den T-Gliadin-stimulierten Zellen
eine stärkere Proliferation, bei Proband 5 zeigte sich kein Unterschied zwischen den
beiden Stimulationsansätzen.
5.2.2
HLA-DQ2/8-positive Kontrollen
Auch die dendritischen Zellen der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollpersonen zeigten
nach Stimulation mit Reifungscocktail eine ausgeprägte Kapazität, die autologen
CD14− Lymphozyten zu stimulieren (siehe Abbildung 5.12 auf S.74).
Ähnlich wie bei den HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen zeigte eine Stimulation mit
T-Gliadin beziehungsweise TG2 im Vergleich zur Mediumkontrolle wenig Unterschied.
Der Trend, dass IL-4-gereifte dendritische Zellen durch T-Gliadin eine vermehrte
Aktivität auf Lymphozyten aufweisen, ist bei dieser Kontrollgruppe nur bei Proband
4 zu erkennen. Bei Proband 3 zeigte sich die stärkste proliferative Antwort erst in
der 1:30-Verdünnung.
Ebenso wie bei den HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen erscheinen IL-15-gereifte
Zellen nach Stimulation mit TG2 eine leicht gesteigerte lymphozytenaktivierende
5.2. LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST
(a) Proband 1
(b) Proband 2
(c) Proband 3
(d) Proband 4
73
74
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(e) Proband 5
Abbildung 5.12: Lymphozytenproliferationstest in der Gruppe der HLA-DQ2/8positiven gesunden Kontrollen. In der linken Spalte ist die Stimulation der Zellen mit
GM-CSF und IL-4 dargestellt, in der rechten Spalte die Stimulation mit GM-CSF
und IL-15. a) Proband 1, b) Proband 2, c) Proband 3, d) Proband 4, e) Proband 5.
Fähigkeit zu erlangen (erkennbar bei den Probanden 1 und 4).
5.2. LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST
5.2.3
75
Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät
Auf S.77 zeigt Abbildung 5.13 sämtliche Graphen dieser Versuchsgruppe.
Bei der Stimulation mit Reifungscocktail zeigte sich auch in der Gruppe der
Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät eine ausreichende Fähigkeit zur Stimulation
der CD14− autologen Zellen.
Bei den IL-4-gereiften dendritischen Zellen zeigten sich unterschiedliche Ergebnisse.
Nach Stimulation mit T-Gliadin fand sich bei Proband 3 eine leicht verstärkte
Proliferation im Vergleich zu TG2, bei den Probanden 2 und 4 war die stärkste
Proliferation nach TG2-Stimulation zu verzeichnen, bei den Probanden 1 und 5
zeigte sich kein Unterschied zwischen diesen beiden Stimulantien.
Die IL-15-gereiften Zellen zeigten bei Proband 1 eine stärkere Proliferation nach
Inkubation mit T-Gliadin. Eine leicht verstärkte Proliferation nach Stimulation mit
TG2 fand sich bei Proband 3. Die Probanden 4 und 5 zeigte keinen Unterschied
zwischen TG2- und T-Gliadin-Stimulation. Bei Proband 2 konnte aufgrund zu
geringer Zellzahlen kein Ansatz mit IL-15 durchgeführt werden.
76
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) Proband 1
(b) Proband 2
(c) Proband 3
(d) Proband 4
5.2. LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST
77
(e) Proband 5
Abbildung 5.13: Lymphozytenproliferationstest in der Gruppe der Zöliakiepatienten
unter glutenfreier Diät. In der linken Spalte ist die Stimulation der Zellen mit GMCSF und IL-4 dargestellt, in der rechten Spalte die Stimulation mit GM-CSF und
IL-15. a) Proband 1, b) Proband 2, c) Proband 3, d) Proband 4, e) Proband 5.
5.2.4
Aktive‘ Zöliakiepatienten
’
Für eine Darstellung aller Versuchsergebnisse dieser Probandengruppe siehe
Abbildung 5.14 auf S.78.
Bei den aktiven‘ Zöliakiepatienten ließen sich die CD14− Zellen nach Stimulation
’
mit Reifungscocktail sowohl von den IL-4- als auch von den IL-15-gereiften dendritischen Zellen stimulieren. Zellzahlbedingt konnte nur bei vier Probanden ein LR
durchgeführt werden.
Bei den IL-4-gereiften dendritischen Zellen des Probanden 4 zeigte sich eine
verstärkte Proliferation der T-Zellen nach Stimulation mit T-Gliadin. Bei den Probanden 1 und 2 führte eine Stimulation der Zellen mit TG2 oder T-Gliadin zu
höheren Aktivitäten als in der Mediumkontrolle, die Antigene im Vergleich bewirkten
jedoch keinen Unterschied.
Die IL-15-gereiften Zellen der Probanden 3 und 4 zeigten eine deutlich stärkere
Proliferation nach Stimulation mit T-Gliadin im Vergleich zu TG2, während die
Probanden 1 und 2 hierbei keinen Unterschied hinsichtlich der Stimulationsfähigkeit
zeigten.
78
KAPITEL 5. ERGEBNISSE
(a) Proband 1
(b) Proband 2
(c) Proband 3
(d) Proband 4
Abbildung 5.14: Lymphozytenproliferationstest in der Gruppe der aktiven‘ Zölia’
kiepatienten. In der linken Spalte ist die Stimulation der Zellen mit GM-CSF und
IL-4 dargestellt, in der rechten Spalte die Stimulation mit GM-CSF und IL-15. a)
Proband 1, b) Proband 2, c) Proband 3, d) Proband 4.
79
Kapitel 6
Diskussion
Die Zöliakie ist eine mittlerweile äußerst gut verstandene Autoimmunerkrankung
[15]. Als diätetisches Agens konnten die Glutene aus Weizen, Roggen und Gerste
ermittelt werden, zudem besteht eine genetische Prädisposition durch die MHCKlasse-II-Oberflächenmarker HLA-DQ2 und -DQ8 [55, 58]. Aktive Zöliakiepatienten
weisen zu nahezu 100% Autoantikörper auf, welche gegen das ubiquitär vorhandene
Enzym Transglutaminase 2 (abgekürzt TG2) gerichtet sind [14]. Eine Beteiligung des
nativen Immunsystems in Form einer erhöhten IL-15-Sekretion und einer vermehrten
Anreicherung von γ/δ-T-Zellrezeptor-tragenden intraepithelialen Lymphozyten im
intestinalen Epithel konnte nachgewiesen werden [37, 55, 60]. Für die Aufrechterhaltung der inflammatorischen Immunantwort, die letztendlich die klinische Zöliakie
auslöst, werden glutenreaktive T-Zellen verantwortlich gemacht [36, 41]. Daher ist
die glutenfreie Diät die Therapie der Wahl [57]. Dennoch ist immer noch unklar,
weshalb der Großteil der HLA-DQ2/8-tragenden Bevölkerung trotz glutenhaltiger
Ernährung keine Zöliakie entwickelt [15, 36].
Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Untersuchung, inwiefern sich Monozyten von gesunden Kontrollpersonen im Vergleich zu Monozyten von Zöliakiepatienten
unter Einfluss von IL-4 bzw. IL-15 unterschiedlich entwickeln. Ferner war von Interesse, ob die unterschiedlich gereiften dendritischen Zellen bzw. Makrophagen der
Kontroll- und Patientengruppen Unterschiede hinsichtlich ihrer Aktivität oder ihrer
Fähigkeit, autologe Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, aufwiesen.
CD14 diente in dieser Arbeit der Überprüfung der Zelldifferenzierung, da CD14
80
KAPITEL 6. DISKUSSION
nach Reifung der PBMC zu dendritischen Zellen nur noch vermindert exprimiert wird
[22]. Dies trat nach Reifung der Monozyten mit IL-4 und GM-CSF zu dendritischen
Zellen auch ein. Bei Inkubation der Monozyten mit IL-15 und GM-CSF blieb die
CD14-Expression erwartungsgemäß hoch und die Monozyten differenzierten sich zu
Makrophagen.
Die Untersuchung von CD25 war von Bedeutung, da dies einen Aktivierungsmarker auf Lymphozyten darstellt [59]. Aus der Literatur ist bereits bekannt, dass
eine Stimulation mit bestimmten Gliadinfragmenten eine Hochregulation von CD25
auf dendritischen Zellen bewirkt [36, 51, 62]. Dies konnte auch in der vorliegenden
Arbeit bestätigt werden. Ebenfalls führte die Stimulation mit TG2 zu einer sehr
hohen Expression von CD25, ein Effekt, der bei den HLA-DQ2/8-positiven und
-negativen gesunden Kontrollpersonen besonders ausgeprägt war. Im Rahmen dieser Arbeit war vor allem die Expression auf IL-15-gereiften Zellen, welche sich zu
makrophagenähnlichen Zellen differenzierten, erhöht. Die Veränderung der prozentualen Oberflächenexpression war in allen Probandengruppen bei IL-15-gereiften
Zellen sowohl nach Stimulation mit T-Gliadin als auch mit TG2 hochsignifikant.
Da die Zöliakiepatienten eine erhöhte intestinale IL-15-Konzentration aufweisen
sowie vermehrt Transglutaminase 2 exprimieren, wäre es denkbar, dass eine Stimulation mit TG2 zu einer starken Aktivierung der Makrophagen und damit des
nativen Immunsystems im Allgemeinen führt. IL-15-gereifte Monozyten von gesunden
Personen zeigten zwar auch eine stärkere Aktivierung durch TG2, durch die nur
geringfügig vorhandenen intestinalen IL-15-Konzentrationen ist bei Gesunden jedoch
keine wesentliche Stimulation des nativen Immunsystems zu erwarten.
CD83 ist ein sehr spezifischer Aktivierungs- und Reifemarker für dendritische
Zellen, der bei der Aktivierung von T-Zellen sowie zytotoxischen T-Zellen eine
zentrale Rolle spielt [33, 50]. Eine Stimulation mit T-Gliadin und TG2 bei IL-15gereiften Zellen zeigte in allen Gruppen keinen Effekt auf die bereits sehr hohe
Expression von CD83. Bei den IL-4-gereiften Zellen zeigte sich durch TG2 und durch
T-Gliadin eine Hochregulation; lediglich in der Gruppe der aktiven‘ Zöliakiepatienten
’
ließ sich, wie auch von Ciccocioppo et al. [7] beschrieben, nur eine sehr geringe
Veränderung nachweisen. Dies könnte bedeuten, dass bei aktiven‘ Zöliakiepatienten
’
81
die dendritischen Zellen im Vergleich zu Gesunden weniger stimulierbar sind. Ob
dies darauf beruht, dass deren Immunsystem durch den ständigen Kontakt mit dem
auslösenden Agens Gluten bereits grenzwertig hochreguliert ist, bleibt offen.
CD86 ist ein Aktivierungsmarker auf Monozyten und wird zusätzlich zur Aktivierung und Proliferation von T-Zellen benötigt [34, 59, 70]. Erwartungsgemäß zeigten
Zellen, die mittels IL-4 zu dendritischen Zellen reiften, eine höhere Expression an
CD86 als IL-15-gereifte Zellen. Bei den aktiven‘ Zöliakiepatienten fanden sich die
’
niedrigsten Werte. Nach Stimulation mit T-Gliadin bzw. TG2 fand sich bei den
IL-4-gereiften Zellen bei drei von vier Probandengruppen (HLA-DQ2/8-positive
Kontrollen, Patienten unter glutenfreier Diät, aktive‘ Zöliakiepatienten) eine deut’
lich verminderte CD86-Expressionen. Dagegen zeigten die HLA-DQ2/8-negativen
Kontrollpersonen auf dendritischen Zellen eine dezente Hochregulation von CD86,
wodurch eine Immunantwort initiiert werden kann. Die beiden Moleküle T-Gliadin
und TG2, die an der Entstehung und Aufrechterhaltung der Zöliakie beteiligt sind,
scheinen somit zu bewirken, dass bei HLA-DQ2/8-positivem Trägerstatus diese
Immunreaktion vermindert ausfällt. Dies steht jedoch in Widerspruch zu einer anderen Arbeit aus dem eigenen Labor [51], in der durch peptisch-tryptischen Verdau
gewonnenes Gliadin bei Zöliakiepatienten zu einer vermehrten CD86-Expression
führte. Dieser Unterschied lässt sich zum einen auf die Verwendung von längeren
Gliadinfragmenten in dieser Arbeit (Gliadin wurde nur tryptisch verdaut) sowie auf
die jeweils relativ kleinen Fallzahlen in beiden Arbeiten zurückführen.
HLA-DR ist ebenfalls ein Aktivierungsmarker auf Monozyten und spielt eine
wesentliche Rolle bei der Interaktion von antigenpräsentierenden Zellen und TZellen [5, 46]. Aus der Literatur [46, 47] ist eine vermehrte Expression von HLADR nach Stimulation mit Gliadinen, sowohl bei gesunden Kontrollen als auch bei
Zöliakiepatienten mit oder ohne Diät, bekannt. In dieser Arbeit führte die Stimulation
mit T-Gliadin nur bei Zöliakiepatienten (sowohl aktiv‘ als auch unter glutenfreier
’
Diät) zu einer leichten Hochregulation von HLA-DR. TG2 bewirkte ebenfalls nur
eine mäßige Hochregulation von HLA-DR, ein Effekt, der besonders bei den IL-15gereiften Zellen zu erkennen war. Dies spricht dafür, dass T-Gliadin und TG2 sowohl
auf IL-4- als auch auf IL-15-gereiften Zellen, wie auch in der Arbeit von Harris et
82
KAPITEL 6. DISKUSSION
al. [22], einen aktivierenden Effekt ausüben, selbst wenn in dieser Arbeit die Zellen
aktiver‘ Zöliakiepatienten relativ geringe HLA-DR-Werte aufwiesen.
’
CD89 ist ein IgA-Rezeptor auf Monozyten und Makrophagen, dendritische Zellen
verlieren diesen Marker im Laufe ihres Reifungsprozesses [1, 43]. Wie auch von Harris
et al. [22] beschrieben, ließ sich in der vorliegenden Arbeit bei den IL-15-gereiften
Makrophagen in allen Gruppen eine deutlich gesteigerte CD89-Expression nachweisen.
Dieses Reaktionsmuster zeigte noch einmal sehr klar, dass die Differenzierung der
Monozyten zu Makrophagen (IL-15 und GM-CSF) bzw. dendritischen Zellen (IL-4
und GM-CSF) eindeutig stattfand. Während T-Gliadin bei den IL-4-gereiften Zellen
kaum Einfluss hatte, führte die Stimulation mit T-Gliadin bei IL-15-gereiften Zellen zu
einer stärkeren CD89-Expression. Dies ist besonders interessant, da CD89 wohl auch
an der intestinalen Barrierefunktion beteiligt ist [43]. So kann spekuliert werden, dass
Gliadinpeptide im Darmlumen von IgA-Anti-Gliadin-Antikörpern gebunden und über
den CD89-Rezeptor, ähnlich wie über CD71, durch das Epithel geschleust werden.
Ferner ist es denkbar, dass CD89 durch IL-15 und Gliadin auch auf Epithelzellen
hochreguliert wird. Durch die erhöhten intestinalen Konzentrationen an IL-15 bei
aktiven‘ Zöliakiepatienten sowie die Anwesenheit von Gliadinfragmenten könnte die
’
vermehrte Expression von CD89 den Transport der schädlichen Gliadinfragmente vom
Darmlumen in die Lamina propria begünstigen. Auf diesem Weg könnten anschließend
die weiteren immunologischen Prozesse wie die Deamidierung von Gliadinen durch die
Transglutaminase 2, die Präsentation über HLA-DQ2/8 oder die T-Zellaktivierung
gefördert werden.
CD209 dient einerseits der Stabilisierung der Kontaktzone zwischen dendritischen
Zellen und T-Zell-Rezeptoren, andererseits befähigt es die dendritischen Zellen zum
Durchtritt durch das Endothel [1,19]. CD209 fand sich in allen vier Probandengruppen
auf den IL-4-gereiften, dendritischen Zellen. Auf den IL-15-gereiften Zellen war CD209
statistisch signifikant geringer exprimiert. Dies entspricht den Daten von Harris et
al. [22], welche auch eine geringe Expression auf IL-15-gereiften Zellen, verglichen
mit IL-4-gereiften Zellen, nachwiesen. Interessanterweise zeigte TG2 einen stark
inhibitorischen Effekt auf die CD209-Expression, der sowohl bei den dendritischen
Zellen als auch bei den Makrophagen nachweisbar war. Daher kann spekuliert werden,
83
dass CD209 bei Zöliakiepatienten durch die gehäuft auftretende Transglutaminase
2 herunterreguliert wird. Hesse et al. konnten im Mausmodell zeigen, dass antiCD209-Antikörper in der Lage sind, Zielantigene mit hoher Effizienz über CD209
in die dendritischen Zellen zu transportieren, woraufhin eine starke CD4+ CD8+ -TZellantwort ausgelöst wird [24]. Die verminderte CD209-Expression könnte somit
einen negativen Effekt auf die Interaktion der dendritischen Zellen mit T-Zellen
ausüben.
CD71 ist ein Transferrinrezeptor, der bei Zöliakiepatienten vermehrt im intestinalen Gewebe gefunden wird [1, 39]. Es wird vermutet, dass Gliadin über sekretorisches
IgA durch Transzytose mit Hilfe von CD71 durch das Epithel transportiert wird [1,39].
Dieser Prozess wird möglicherweise durch TG2 gefördert [25]. Als wichtiger Teil der
Immunreaktion auf Antigene wird CD71 aber auch auf Lymphozyten, Monozyten
und Makrophagen hochreguliert [39], was sich auch in den Versuchen dieser Arbeit
bestätigen ließ. Eine Stimulation mit T-Gliadin führte in dieser Arbeit bei allen
Probandengruppen zu einer deutlich vermehrten Oberflächenexpression von CD71,
analog zu der Arbeit von Papista et al. [48] und passend zu der zellulären Differenzierung zu makrophagenähnlichen Zellen. Die Arbeit von Matysiak et al. [39] deutet
darauf hin, dass Gliadinpeptide im Darmlumen von IgA-Anti-Gliadin-Antikörpern
gebunden und über den CD71-Rezeptor durch das Epithel in die Lamina propria
geschleust werden. Dadurch könnte Gliadin die Expression von CD71 induzieren
und somit letztendlich eine positive Rückkopplung auf den eigenen intestinalen
Membrantransport ausüben. Interessanterweise wiesen die dendritischen Zellen von
aktiven Zöliakiepatienten die geringste CD71-Expression auf. Unter Einfluss von
IL-15 fand jedoch eine ausgeprägte CD71-Expression statt, die durch T-Gliadin
zusätzlich gefördert wurde.
TG2 ist ein ubiquitär vorhandenes zytosolisches Protein und wird auch an der
Oberfläche aller Zellen exprimiert; auf dendritischen Zellen dient es vermutlich einer
effizienten Phagozytose [52]. TG2 wird durch Lipopolysaccharide hochreguliert [26].
In dieser Arbeit konnte eine Lipopolysaccharidverunreinigung im Rahmen der TGliadin- und TG2-Herstellung jedoch ausgeschlossen werden, da die eingesetzten
Antigene zum Beispiel keine erhöhte CD25-Expression induzierten. Die Reifung der
84
KAPITEL 6. DISKUSSION
Monozyten mit IL-15 führte in allen Versuchsgruppen zu einer deutlich stärkeren
TG2-Oberflächenexpression als die Reifung mit IL-4. Zudem erwies sich T-Gliadin,
verglichen mit TG2, als deutlich stärkeres Stimulans; bei beiden Patientengruppen
sowie bei den HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen war dieser Unterschied statistisch
signifikant. Dies entspricht auch den Daten von Papista et al. [48], die zeigten,
dass eine Glutenexposition zu einer vermehrten Expression von TG2 führt. Da
dieser T-Gliadin-Effekt besonders stark bei IL-15-gereiften Zellen auftritt, könnte
die vermehrte TG2-Oberflächenexpression somit zu einer effizienteren Phagozytose
von Antigenen führen. Ferner könnte eine aktive Oberflächen-TG 2 zu einer weiteren
Deamidierung von Gliadinpeptiden führen. Dies wiederum ist eine Voraussetzung für
eine verbesserte Bindung der Gliadinpeptide an HLA-DQ2/8-Moleküle, wodurch eine
gesteigerte T-Zell-Stimulation erreicht wird. Ob die Oberflächen-TG2 auf Makrophagen aktiv ist, müssen weitere Versuche klären.
CD103 findet sich hauptsächlich auf IEL, spielt eine Rolle bei Adhäsionsprozessen
und ermöglicht in Kombination mit B7 den Immunzellen die Rückkehr ins Darmepithel [1, 6, 31]. In dieser Arbeit zeigte sich eine deutlich vermehrte Expression von
CD103 besonders auf IL-15-gereiften Makrophagen, verglichen mit IL-4-gereiften dendritischen Zellen. Die erhöhte CD103-Expression könnte für Makrophagen bezüglich
ihrer Chemotaxis bzw. ihrer Zellmigration eine wichtige Rolle spielen. Besonders
interessant war die auffällig starke Hochregulation von CD103 nach Stimulation
mit T-Gliadin, die sich in dieser Arbeit in allen Probandengruppen nachweisen
ließ und die für die zellmigratorische Rückkehr der Makrophagen ins Darmepithel,
beispielsweise im Rahmen entzündlicher Prozesse, von großer Bedeutung sein könnte.
Sowohl dendritische Zellen als auch makrophagenähnliche Zellen sind, nach TG2oder T-Gliadin-Stimulation, im Lymphozytenproliferationstest in der Lage, autologe
CD14− Zellen zur Proliferation anzuregen. Dies führt, unabhängig vom Krankheitsund HLA-DQ-Trägerstatus, zu einer Immunreaktion. IL-4-gereifte Zellen zeigten
hierbei eine tendenziell stärkere Reaktion als IL-15-gereifte Zellen, wobei die Stimulation mit T-Gliadin meist zu etwas höheren Werten führte als der Einsatz von TG2.
Bei den IL-15-gereiften Zellen fand sich bei den diäthaltenden sowie den aktiven‘
’
Zöliakiepatienten eine eher verstärkte Reaktion auf T-Gliadin-Stimulation, während
85
sich bei den gesunden Kontrollen nur eine geringere Stimulation und vor allem
nach TG2-Einsatz nachweisen ließ. Da bei der Zöliakie eine pathologisch-verstärkte
Immunreaktion durch Gliadine ausgelöst wird, könnte die verstärkte Reaktion im
Lymphozytenreaktionstest auf ebendiese immunologische Übererregbarkeit zurückzuführen sein.
Zusammenfassend scheint der HLA-DQ2/8-Trägerstatus eher von geringerer
Bedeutung bezüglich der Stimulierbarkeit von IL-4- oder IL-15-gereiften Zellen
und unabhängig von einer Stimulation mit TG2 oder T-Gliadin zu sein. Auch
der Aktivitätsgrad der Zöliakieerkrankung (‘aktive‘ Patienten versus Patienten in
Remission unter glutenfreier Diät) wies in dieser Arbeit keine große Bedeutung auf.
Allerdings legen die Versuche von Vazquez-Roque et al. [71] nahe, dass der HLADQ2/8-positive Trägerstatus per se zu einer erhöhten Darmepithelpermeabilität
führt, was ein wichtiger Faktor bei der Entstehung und Aufrechterhaltung einer
Zöliakie ist.
Von größerer Bedeutung scheint das Zytokinmilieu zu sein. Während IL-4 zusammen mit GM-CSF die Differenzierung der Monozyten zu reifen dendritischen
Zellen bewirkt, förderte der Einsatz von IL-15 die Differenzierung zu Makrophagen.
Mention et al. [40] zeigten, dass Zöliakiepatienten über erhöhte intestinale IL-15Spiegel verfügen, so dass im aktiven‘ Krankheitsgeschehen einer untherapierten
’
Zöliakie von einer vermehrten Reifung von Makrophagen ausgangen werden muss.
Die Stimulation mit T-Gliadin führte vor allem bei den IL-15-gereiften Makrophagen zu einer ausgeprägten Hochregulation, besonders bei CD25, CD71, CD89,
CD103 und TG2. Eine Stimulation mit TG2 wirkte sich auf die Moleküle CD25 und
CD89 positiv, auf CD209 negativ aus.
Die erhöhte IL-15-Konzentration im intestinalen Gewebe von Zöliakiepatienten
könnte vor allem in Kombination mit einer erhöhten CD25-Expression zu einer vermehrten Immunstimulation führen. Durch die vermehrte CD71- und CD89-Expression
ist es zudem sehr wahrscheinlich, dass Gliadinfragmente leichter durch das Epithel
transportiert werden. Dies führt zu einer erhöhten Konzentration an Gliadinfragmenten in der Lamina propria, wodurch die CD71- und CD89-Expression wiederum noch
weiter erhöht wird (entsprechend einer positiven Rückkopplungsschleife). Die hohe
86
KAPITEL 6. DISKUSSION
CD103-Expression fördert zudem die migratorische Rückkehr der Immunzellen ins
Darmepithel.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in einem Zytokinmilieu, wie es
bei Zöliakiepatienten auftritt (erhöhte IL-15-Konzentration), Gliadinfragmente eine
Immunstimulation bewirken. Neben der vermehrten Expression des Aktivitätsmarkers
CD25 wurde auch eine deutlich höhere Expression der Oberflächentransglutaminase 2
gefunden, was zu einer effizienteren Phagozytose bzw. Bereitstellung von deamidierten,
immunstimulatorischen Gliadinpeptiden führen könnte.
Ob sich die Verhinderung oder Reduzierung der IL-15-Freisetzung als therapeutischer Ansatzpunkt bei Zöliakiepatienten eignet, muss in einem Folgeprojekt und mit
einer größeren Anzahl an Probanden weiter untersucht werden.
87
Kapitel 7
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[70] van Gool, S., P. Vandenberghe, M. de Boer und J. Ceuppens, CD80, CD86
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LITERATURVERZEICHNIS
95
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Arztebl, 2001; 98(49): S. A3285–A3292.
96
LITERATURVERZEICHNIS
97
Kapitel 8
Abkürzungsverzeichnis
°C
Grad Celsius
AB-Serum
gepooltes Serum von männlichen Spendern mit der Blutgruppe AB
ACK-Lyse-Puffer
Ammoniumchlorid-Kaliumhydrogencarbonat-Lyse-Puffer
APC
Allophycocyanin
bp
Basenpaar
BrDU
5’-Brom-2’-Desoxyuridin
BSA
Albumin aus bovinem Serum
CD
zelluläre Oberflächenmerkmale, engl. cluster of differentiation
cm
Zentimeter
ConA
Concanavalin
DC
dendritische Zelle(n), engl. dendritic cells
DMSO
Dimethylsulfoxid
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzym-Immunoassay, engl. enzyme linked immunosorbent
assay
EmA
antiendomysiale Antikörper, Anti-Endomysium-Antikörper
engl.
aus dem Englischen
98
FACS
KAPITEL 8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Durchflusszytometrie, engl. fluorescence associated cell sorting
FCS
fötales Kälberserum, engl. fetal calf serum
FITC
Fluorescein Isothiocyanat
g
Schwerebeschleunigung (9,81m/s2 )
g
Gramm
GM-CSF
spezieller Wachstumsfaktor, engl. granulocyte macrophage
colony-stimulating factor
HLA
humane Leukozytenantigene, engl. human leucocyte antigen
ICAM2
zelluläres Adhäsionsmolekül, engl. intercellular adhesion
molecule 2
IEL
intraepitheliale Lymphozyten
IL
Interleukin
INF-γ
Interferon-γ
l
Liter
LR
Lymphozytentoxizitätstest, engl. lymphocyte reaction
LS/VS
Größenangabe bei MACS-Säulen
m
molar, Konzentrationsangabe in mol/l
MACS
Zellsortierung mit Hilfe von Magneten, engl. magnetic cell
sorting
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität, engl. mean fluorescence
intensity
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex, engl. major histocompatibility complex
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
min
Minute
mg
Milligramm
ml
Milliliter
N
normal, Äquivalentkonzentration
99
PBMC
mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, engl. peripheral blood mononuclear cells
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung, engl. phosphate buffered
saline
PCR
Polymerase-Kettenreaktion, engl. polymerase chain reaction
PE
R-Phycoerythrin
PenStrep
Penicillin/Streptomycin
PGE
Prostaglandin E
pH
potentia hydrogenii, Angabe über den sauren oder basischen
Charakter einer Flüssigkeit
RPMI
= RPMI-1640, ein Zellkulturmedium, benannt nach dem
Ort seiner Entwicklung (Roswell Park Memorial Institute)
TAE-Puffer
Puffer aus Tris-Base (Trishydroxymethylaminomethan), Essigsäure (engl.: acetic acid) und EDTA
TG2
Transglutaminase 2
TH
T-Helferzelle
TMB
Tetramethylbenzidin
TNF
Tumor Nekrose Faktor
tTG
tissue transglutaminase, deutsch: Transglutaminase 2
u
atomare Masseneinheit (unit), 1u=1,660538921(73)·10−27 kg
100
KAPITEL 8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
101
Kapitel 9
Abbildungsverzeichnis
3.1
Klassifikation der Duodenalhistologie nach Marsh . . . . . . . . . . . 15
4.1
Übersicht aller Arbeitsschritte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2
Photographien der Zellkultur
5.1
CD14: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2
CD25: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.3
CD83: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.4
CD86: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.5
HLA-DR: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.6
CD89: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.7
CD209: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.8
CD71: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.9
TG2: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5.10 CD103: Statistik der FACS-Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
5.11 LR der HLA-DQ2/8-negativen Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . 72
5.12 LR der HLA-DQ2/8-positiven Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . 74
5.13 LR der Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät . . . . . . . . . . . . 77
5.14 LR der aktiven‘ Zöliakiepatienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
’
102
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
103
Kapitel 10
Tabellenverzeichnis
3.1
Klinische Symptome einer Zöliakie
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
Einteilung der duodenalen Histologie anhand der modifizierten Krite-
8
rien nach Marsh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.3
Charakteristische CD-Antigene von Leukozyten . . . . . . . . . . . . 21
4.1
Probanden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.2
FACS-Antikörperfärbung der dendritischen Zellen . . . . . . . . . . . 36
4.3
Pipettierschema für LR
4.4
Pipettierschema für ELISA
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
104
TABELLENVERZEICHNIS
105
Kapitel 11
Danksagung
Ich möchte mich herzlichst bei allen Personen bedanken, die zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen und sie so erst ermöglicht haben.
Bei meiner Betreuerin Frau PD Dr. Walburga Dieterich bedanke ich mich ganz
herzlich für die ständige Erreichbarkeit, die enge und exzellente Betreuung und die
tatkräftige Unterstützung bei Bedarf.
Ohne die medizinisch-technische Mitarbeiterin Marina Rakhimova wäre diese
Arbeit vermutlich nie fertig geworden, auch an sie geht ein herzliches Dankeschön
für Rat und Tat, Vor- und Nachbereitung meiner Versuche und für das geduldige
Beantworten endloser technischer Fragen.
Außerdem gebührt mein Dank allen Probanden, sowohl den Patienten als auch
den Kontrollpersonen. Durch sie ist diese Arbeit möglich gewesen!
Meiner Kollegin Stefanie Zenker danke ich für die Anleitung für den ACK-LysePuffer.
Ein großes Dankeschön geht auch an alle Korrekturleser und -leserinnen, die
geduldig Fehler gesucht und logische Löcher gefunden haben.
Für geduldige und kompetente Unterstützung bei der Verwendung von TeX sowie
für die seelisch-moralische Unterstützung danke ich meinem Mann.
Zu guter Letzt geht ein großes Dankeschön an meine Familie, ohne die mein
Studium und diese Arbeit nicht möglich gewesen wären.