und seine Rolle in alternativen Wnt
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin IV (Nephrologie) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Das Nephronophthise Typ 2 Protein Inversin (NPHP2) und seine Rolle in alternativen Wnt-Signalübertragungswegen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2006 von Corinna Krönig geboren in Gütersloh Dekan: Professor Dr. C. Peters Erster Gutachter: Professor Dr. J. Gloy Zweiter Gutachter: Professor Dr. H. Omran Jahr der Promotion: 2008 Theories come and theories go. The frog remains. Jean Rostand (1960) I Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung.........................................................................................................................1 1.1. Polyzystische Nierenerkrankungen.....................................................................1 1.1.1. Die Einführung in das Krankheitsbild der Nephronophthise ..................1 1.1.2. Eine Mutation des Gens invs, das für Inversin kodiert, ist für das Krankheitsbild der infantilen Nephronophthise Typ 2 (NPH2) verantwortlich..............................................................................................2 1.2. Wnt-Signaltransduktion…………………………………………………………...…..3 1.2.1. Wnt-Signale in der Entwicklungsbiologie……………………………..……3 1.2.2. Wnt-Signal ist nicht gleich Wnt-Signal!...…………………………………...3 1.3. Xenopus laevis als Modellorganismus für das Studium von alternativen Wnt-Signalübertragungswegen ......................................................5 1.4. 2. Hintergrund und Ziel dieser Arbeit ......................................................................7 Material & Methoden .......................................................................................................8 2.1. 2.1.1. In vivo Methoden ...................................................................................................8 Xenopus laevis als funktionelles Modell zum Studium der WntSignalübertragung .......................................................................................8 2.1.2. Gewinnung und Behandlung der Embryonen ...........................................9 2.1.3. Mikroinjektionstechniken ..........................................................................11 2.1.4. Mikrodissektionstechniken .......................................................................12 Der Animalkappen-Assay (animal cap assay) .........................................12 2.1.5. Analyse der phänotypischen Veränderungen von Embryonen und animalen Kappen ................................................................................14 2.1.6. 2.2. Fotografische Dokumentation ..................................................................15 Molekularbiologische und biochemische Methoden .......................................15 2.2.1. Subklonierung, DNA-Amplifizierung und DNA-Extraktion ......................15 2.2.2. In vitro RNA-Synthese ................................................................................17 2.2.3. Gelelektrophorese.......................................................................................17 2.2.4. Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA ......................................18 2.2.5. Morpholino-Antisense-Oligonukleotide (MO) ...........................................18 2.2.6. Verwendete Konstrukte ..............................................................................19 2.2.7. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketternreaktion (rt-PCR)................19 2.2.8. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ..............................21 Inhaltsverzeichnis II 3. Ergebnisse.....................................................................................................................22 3.1. Inversin beeinflusst die frühe Nephrogenese von Xenopus laevis................22 3.2. Inversin spielt eine Rolle in alternativen Wnt-Signalwegen............................23 3.3. Die Depletion von Inversin durch Inversin-MO inhibiert sowohl die endogene Achsenelongation als auch die Elongation von Aktivin-induzierten animalen Kappen.................................................................................................24 3.4. Inversin-MO beeinflussen nicht die Spezifizierung dorsalen Gewebes.........26 3.5. Inversin wird während der Gastrulation vor allem im Ektoderm und ventro-marginalem Mesoderm exprimiert.........................................................28 3.6. Die Funktion von Inversin in alternativen Wnt/PCP-Signalwegen..................30 3.6.1. Durch DN-Wnt-11 induzierte Defekte können nicht signifikant von Inversin reduziert werden ..................................................................30 3.6.2. Eine Störung der Achsenstreckung durch ECD8 kann durch Koinjektion von Inversin reduziert werden..............................................32 3.6.3. Koinjektion von Cdc42 und Inversin zeigen eine synergistische Verstärkung der Achsenstreckungsdefekte ............................................33 4. 4.1. Diskussion .....................................................................................................................36 Die regelrechte Nierenentwicklung erfordert eine intakte Funktion von Inversin.................................................................................................................36 4.2. Inversin reguliert morphogenetische Zellbewegungen ...................................36 4.3. Funktion von Inversin in alternativen Wnt-Signalwegen.................................38 4.4. Ausblick ...............................................................................................................43 5. Zusammenfassung .......................................................................................................44 6. Literaturverzeichnis ......................................................................................................45 7. Anhang...........................................................................................................................49 7.1. Abbildungsverzeichnis .......................................................................................49 7.2. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................50 7.3. Verwendete Geräte und Materialien ..................................................................52 7.4. Publikation ...........................................................................................................53 7.5. Curriculum vitae .................................................................................................54 7.6. Danksagung.........................................................................................................55 Inhaltsverzeichnis 1 1. Einleitung 1.1. Polyzystische Nierenerkrankungen 1.1.1. Die Einführung in das Krankheitsbild der Nephronophthise Die autosomal-rezessiv vererbte Nephronophthise (NPH) bildet zusammen mit den medullären Zystennieren (MDCK) eine Gruppe von renalen Zystenerkrankungen, die in unterschiedlichen Altersstufen zum terminalen Nierenversagen führen [18]. NPH manifestiert sich im frühen Kindes- und Jugendalter und stellt dabei mit 6-10% die häufigste genetische Ursache für ein terminales Nierenversagen in dieser Altersgruppe dar. Mit medullären Zystennieren (MDCK) verbindet man eine Krankheit, die im Erwachsenenalter auftritt. Auf MDCK soll hier jedoch nicht weiter eingegangen werden [17]. Symptomatisch macht sich die NPH zunächst mit Polyurie und Polydipsie bemerkbar. Im weiteren Verlauf treten Anämie, Wachstumsretardierung und terminales Nierenversagen auf. Die einzige Therapiemöglichkeit besteht in einer Nierentransplantation. Ein gemeinsames Merkmal der verschiedenen Formen der NPH ist das Entstehen von Zysten am kortikomedullären Übergang des Nierenparenchyms [17]. Trotz Zystenbildung bleibt die Größe der Nieren normal. Mikroskopisch werden hingegen Veränderungen sichtbar, die durch eine typische histologische Trias gekennzeichnet sind: (1) Irreguläre Verdickung und Rückbildung bzw. Spaltung der tubulären Basalmembran (Basalmembrandesintegration), (2) Atrophie und Ektasie mit Zystenbildung vor allem in den distalen Tubuli und (3) periglomeruläre und interstitielle Fibrose [16, 17, 19, 36, 43]. Bei den rezessiven Formen wurden bislang 5 Gene identifiziert. Mutationen in NPHP1 (kodiert für Nephrocystin) sind verantwortlich für die juvenile, in NPHP2 (kodiert für Inversin) für die infantile und in NPHP3 (Genprodukt: Nephrocystin-3) und NPHP4 (Genprodukt: Nephroretinin) für die adoleszente Nephronophthise [19]. Durch Mutationen in NPHP5 (kodiert für Nephrocytin-5) resultiert das Senior Loken Syndrom. Die verschiedenen Formen unterscheiden sich vor allem in dem Alter, in dem das terminale Nierenversagen eintritt: Während die juvenile Form im Durchschnittsalter von 13 Jahren zur dialysepflichtigen Niereninsuffizienz führt und das Manifestationsalter der adulten NPH3 und NPH4 bei durchschnittlich 19 Jahren Einleitung 2 liegt, ist die infantile NPH2 durch ein Eintreten der Dialysepflichtigkeit während der ersten 3 Lebensjahre gekennzeichnet. 1.1.2. Eine Mutation des Gens invs, das für Inversin kodiert, ist für das Krankheitsbild der infantilen Nephronophthise Typ 2 (NPH2) verantwortlich Interessanterweise unterscheidet sich die NPH2 von den anderen Formen der NPH sowohl klinisch als auch morphologisch, da der Phänotyp dieser Erkrankung Charakteristika der Nephronophthise mit denen der autosomal-dominanten polyzystischen Nierenerkrankungen (ADPKD) verbindet: Mit Hilfe bildgebender Verfahren wie Ultraschall oder Computertomographie lassen sich vergrößerte Nieren und Zysten im gesamten Nierenparenchym diagnostizieren [14, 44]. Zudem zeigt die NPH2 extrarenale Zystenentstehung und kann mit einem situs inversus einhergehen [36]. Das Krankheitsbild ist durch Symptome wie Anämie, hyperkalämische metabolische Azidose und Hypertonie gekennzeichnet, während Polyurie und Polydipsie nicht auftreten [14]. Die infantile Nephronophthise (NPH2) wird durch Mutation eines Gens auf Chromosom 9q22-31 [14] verursacht. Dieses Gen, invs, kodiert für das Protein Inversin [44], welches beim Menschen aus 1065 Aminosäuren besteht [69]. Die Proteinsequenz enthält eine Reihe charakteristischer Domänen und Proteinbindungsmotive: 16 N-terminale Ankyrin-repeats, zwei IQ-Domänen, zwei DBox-Motive sowie drei nukleäre Lokalisationssignale (NLS) (Übersicht in Abb.1). Der N-terminale Teil des Proteins zeigt einen hohen Prozentsatz an Homologie zwischen unterschiedlichen Spezies. 96% der Sequenz des Menschen sind mit der der Maus und 80% mit der des Zebrafisches identisch. Diese hochgradige Konservierung von Inversin weist auf eine grundsätzliche funktionelle Bedeutung hin. Abbildung 1: Domänenstruktur von Inversin (NPHP2) aus Eley et al. [12]. Am N-Terminus befinden sich die Ankyrin-repeats. In blau sind die IQ-Domänen, in violett die D-Box-Motive und in grün die nukleären Lokalisationssignale dargestellt. Einleitung 3 Es existieren drei Isoformen, die durch alternatives Spleißen entstehen [42]. Diese weisen verschiedene subzelluläre Lokalisationen auf. Inversin befindet sich als 125 kD-Isoform membran-assoziiert an den Zell-Zell-Kontakten [23] und als 90 bzw. 140 kD-Isoform im Nukleus und im perinukleären Kompartiment [42]. In Experimenten unserer Arbeitsgruppe wurde Inversin mit dem sogenannten klassischen Wnt-Signalweg (siehe 1.2.4.) in Verbindung gebracht [51], welcher unter anderem eine entscheidende Rolle während der Nephrogenese spielt. 1.2. Wnt-Signaltransduktion 1.2.1. Wnt-Signale in der Entwicklungsbiologie Wnt-Moleküle sind eine entwicklungsgeschichtlich hochgradig konservierte Gruppe von Cystein-reichen, sezernierten Glykoproteinen. Ihre zeitlich und räumlich distinkte Expression ist entwicklungsbiologisch essentiell für eine Reihe grundlegender zellulärer Prozesse wie Differenzierung, Proliferation, Polarisierung, Adhäsion und morphogenetische Zellbewegungen [70]. Zudem spielen sie eine wichtige Rolle während der frühen Embryonalentwicklung und der Gewebe- und Organentstehung. Während der Nephrogenese sind klassische Wnt-Signale beispielsweise wichtig für die Induktion des metanephrogenen Mesenchyms und für das Aufzweigen der Ureterknospe [60]. Über- oder unterexprimierte Wnt-Signalmoleküle oder eine Fehlregulation der Signaltransduktion führen zu einer gestörten Nephrogenese: Knock-out-Mäuse ohne Wnt-4-Funktion weisen einen starken Defekt bei der Tubulogenese im zukünftigen Nierenparenchym auf, da sie keine prätubulären Zellaggregate bilden können [60, 61]. Sie entwickeln keine regelrechte Niere und versterben aufgrund von Nierenversagen kurz nach der Geburt [48]. Auch die Überexpression von ß-Catenin (siehe 1.2.4.) in transgenen Mäusen führt schon kurz nach der Geburt zu polyzystischen Läsionen sowohl im Bereich der proximalen und distalen Tubuli als auch im Sammelrohr [46]. 1.2.2. Wnt-Signal ist nicht gleich Wnt-Signal! Verschiedene Wnts aktivieren unterschiedliche Signalwege, wobei man 2 Klassen von Wnt-Proteinen funktionell grob unterscheiden kann [11]: Xenopus Wnt-1, Wnt3a, Wnt-8 und Wnt-8b beispielsweise werden dem sogenannten klassischen Signalweg zugeordnet und können eine zweite, ektope Körperachse mit Kopf-, Rumpf- und Schwanzstrukturen induzieren, wenn sie in der ventro-marginalen Einleitung 4 Region des sich teilenden frühen Embryos exprimiert werden. Der zweiten Klasse werden Wnt-5a, Wnt-4 und Wnt-11 zugeordnet, welche alternative Signalwege aktivieren. Diese Wnts haben keine „achseninduzierende“ Eigenschaft, können jedoch bei dorso-marginaler Überexpression zur gravierenden Beeinflussung der Morphogenese während Gastrulation und Neurulation führen [7]. Während der klassische Wnt-Signalweg, bei dem es durch eine Stabilisierung und Akkumulation von ß-Catenin zur Transkription von Zielgenen kommt [35], relativ gut beschrieben ist, ist die Funktion alternativer, ß-Catenin-unabhängiger Signalwege im Vertebraten noch weitgehend unbekannt. Bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster wird die planare Zellpolarität (PCP) in Epithelien von Flügel und Auge durch Signale des Wnt-Homologs wingless bestimmt, die an der Regulation des Zytoskeletts beteiligt sind [1, 2, 23, 34, 37, 53, 56, 65, 67]. Neuere Forschungsergebnisse geben Hinweise, dass dieser sogenannte PCPSignalübertragungsweg auch in Vertebraten konserviert ist und hier an der Regulation von Zellbewegungen und –polarität bei der Morphogenese während der Gastrulation und Neurulation beteiligt ist [3, 10, 15, 23, 41, 59, 62, 67]. Was passiert in Gegenwart eines Wnt-Signals? Wie zu Beginn des klassischen Signalwegs binden Wnts (z.B. Wnt-11, Wnt-5a) an Frizzled-Rezeptoren (z.B. Fz-7, Fz-8). Über einen noch unbekannten Mechanismus führt diese Bindung von Wnt an Fz zur Aktivierung des zytosolischen Multidomänprotein Dishevelled (Dsh). Dann divergieren die Signalwege: Der PCP-ähnliche Signalweg bei Vertebraten setzt sich durch die Interaktion von Dsh mit Daam1 (Dsh-associated activator of morphogenesis) [13] über Rho A fort, das zu den kleinen GTPasen zählt. Parallel und unabhängig davon wird, ebenfalls von Dsh ausgehend, über die kleine GTPase Rac die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK-) Kinase aktiviert [29, 37]. Beide Wege führen zu der Regulation eines bestimmten Musters von Zellwanderungs- und Adhäsionsprozessen, die zur konvergenten Ausdehnung (siehe 1.3) während der Gastrulation beitragen [15, 59, 67]. Ein anderer alternativer Weg, der ebenfalls die Morphogenese bei der Gastrulation reguliert, ist der Wnt/Ca2+ Signalweg. Durch Bindung der gleichen Liganden des PCP-ähnlichen Wnt-Signalweges (Wnt-5a und Wnt-11) an einen Fz-Rezeptor kommt es, möglicherweise unter Beteiligung eines Fz-interagierenden G-Proteins, zu einem Ca2+-Anstieg, der zur Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) und der Ca2+/ Calmodulin-abhängigen Kinase II (CamKII) führt [7, 25-27, 34, 50, 62, 66]. Ob dieser Einleitung 5 Signalweg ebenfalls über Dsh vermittelt wird oder mit der PCP-Signalkaskade interagiert, ist jedoch noch nicht definitiv geklärt. Abbildung 2: Übersicht über die alternativen Wnt-Signalwege; Erläuterungen siehe Text 1.3. Xenopus laevis als Modellorganismus für das Studium von alternativen Wnt-Signalübertragungswegen Der Krallenfrosch Xenopus laevis eignet sich gut zum Studium der Induktionsfunktion des Wnt-Signalweges bei der Gewebeentwicklung und -differenzierung mittels standardisierter genotypischer und phänotypischer Assays. Die Gastrulation, bei der alternative Wnt-Signalübertragungswege morphogenetische Zellbewegungen beeinflussen [10, 15, 53, 58, 62], kann mit Hilfe des convergent extension assays (siehe Methodenteil) untersucht werden und soll im Folgenden ausführlicher beschrieben werden: Während der Gastrulation kommt es zu dramatischen Veränderungen in der Gesamtstruktur des Embryos, durch die er eine komplexe dreidimensionale Struktur erhält: Endo- und mesodermale Zellen beginnen in der dorso-marginalen Region durch den Urmund ins Innere des Embryos seitlich und Einleitung 6 nach vegetal einzuwandern (Involution). Das animale Ektoderm dehnt sich währenddessen in den vegetalen Bereich aus (Epibolie), indem sich die Zellen senkrecht zur Oberfläche ineinander schieben (radiäre Interkalation). Mesenchymale Zellen hingegen beginnen sich bipolar zu polarisieren und mit benachbarten Zellen zu interkalieren (medio-laterale Interkalation). Hierbei wandern entfernte dorso-laterale Strukturen zur Mittellinie (Konvergenz), wodurch das gesamte mesenchymale Gewebe schmaler wird und als Resultat der Embryo in der anterio-posterioren Achse elongiert (Extension/Achsenstreckung). Abbildung 3: Radiäre und medio-laterale Interkalation. Bei der radiären Interkalation schieben sich ektodermale Zellen senkrecht zur Oberfläche ineinander; dadurch vergrößert sich die Oberfläche des Ektoderms. Bei der medio-lateralen Interkalation konvergieren benachbarte mesodermale Zellen zur Mittellinie des Gewebes, wodurch das Mesoderm entlang der Achse schmaler wird und sich in anterioposteriorer Richtung ausdehnt. Die konvergente Ausdehnung wird auch nach Ende der Gastrulation in der sich anschließenden Neurulation in mesenchymalem und neuroektodermalem Gewebe fortgesetzt und spielt zudem eine Rolle bei der Organogenese. Einleitung 7 1.4. Hintergrund und Ziel dieser Arbeit Die zystische Nierenerkrankung Nephronophthise Typ 2 wird durch eine Mutation des Gens invs, welches für Inversin kodiert, verursacht. Gegenstand aktueller Forschungen zum Pathomechanismus von Zystennieren ist die Suche nach Signalübertragungswegen der Zystenproteine. In Experimenten unserer Arbeitsgruppe, die vor dieser Arbeit durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass Inversin mit dem für die Nierenentwicklung wichtigen Wnt-Signalweg interagiert: Dishevelled und Inversin kopräzipitieren sowohl endogen als auch in Überexpressionsstudien. Um die Interaktion von Inversin mit Dishevelled funktionell zu analysieren, wurde die Fähigkeit von Dishevelled herangezogen, bei Überexpression nach ventro-marginaler Injektion im 4-Zellstadium eine zweite ektope Körperachse mit Schwanz, Rumpf und Kopfstrukturen hervorzurufen [54, 55]. Es wurde gezeigt, dass sich bei Koinjektion von Dishevelled mit Inversin eine dosisabhängige Inhibition der durch Dishevelled induzierten ektopen Körperachse beobachten ließ. Dieses Experiment wies darauf hin, dass Inversin den klassischen Wnt-Signalweg inhibiert [51]. Die jüngsten Ergebnisse geben zudem Hinweise, dass Inversin auch in alternativen Wnt-Signalwegen eine Rolle spielt. Diese Erkenntnisse sind von großem Interesse, da Wnt-Signale eine regulierende Funktion bei der Nephrogenese haben. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es, den Einfluss von Inversin in alternativen Signalwegen auf morphogenetische Zellbewegungen während der Gastrulation und Neurulation zu untersuchen und Inversin durch Epistase-Experimente einem der alternativen Wnt-Signalkaskaden zuzuordnen. Einleitung 8 2. Material & Methoden 2.1. In vivo Methoden 2.1.1. Xenopus laevis als funktionelles Modell zum Studium der WntSignalübertragung Amphibien repräsentieren den Archetyp der Wirbeltierentwicklung, auf die sich die abgewandte Entwicklung der Reptilien, Vögel und Säuger zurückführen lässt. Als Versuchstier zum Studium von Signaltransduktionswegen in der frühen Embryogenese eignet sich der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis aus mehreren Gründen besonders gut: Sowohl die Haltung der Frösche in Leitungswasser als auch das Gewinnen befruchteter Eier ist recht einfach. Durch die hohe Widerstandsfähigkeit der Xenopus-Eier lassen sich diese leicht kultivieren und eignen sich mit einem Durchmesser von 1-2 mm gut für mikrochirurgische Manipulationen. Anhand von Abbildung 4 lässt sich schematisch die Entwicklung von Xenopus laevis nachvollziehen. Gastrula Blastula Neurula 5h 16h 9h 24h 2h RT (23°C) 2d 6h Fertilisation 1 cm Kaulquappe 1-2 Jahre Abbildung 4: Entwicklungszyklus des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Stadieneinteilung nach Nieuwkoop und Faber (1967), Zeitangaben entsprechend einer Entwicklung auf Raumtemperatur (23°C). Material & Methoden 9 Zudem ist der Krallenfrosch eines der am intensivsten erforschten Wirbeltiere, und umfangreiche prospektive Untersuchungen in der Vergangenheit (fate maps) trugen dazu bei, dass die komplexen zellulären Vorgänge der Embryonalentwicklung heute gut dokumentiert sind. Schließlich dient Xenopus laevis, wie schon erwähnt, dem Studium der Induktionsfunktion des Wnt-Signalweges bei der Gewebeentwicklung und -differenzierung mittels standardisierten genotypischen und phänotypischen Assays. 2.1.2. Gewinnung und Behandlung der Embryonen Weibliche Krallenfrösche2 können zu jeder Jahreszeit durch Injektion von 500-800 Einheiten (IU) humanem Choriongonadotropin1 in den dorsalen Lymphsack zur Oozytenreifung und Ovulation stimuliert werden. Je nach Wassertemperatur (zwischen 18 und 22°C) vergehen 10-14 Stunden bis es zur spontanen Eiablage aus der dann rötlich imponierenden, geschwollenen Kloake kommt. Durch einen, den natürlichen Klammergriff des Männchens (Amplexus) imitierenden Griff und mit Hilfe manueller Stimulation von Bauch und Flanken kann der natürliche Eiablagereflex des Weibchens ausgelöst und mehrere hundert bis tausend Eier gewonnen werden. Die synchron erfolgende Fertilisation wird mit einem kleinen Stück Testis durch Überstreichen der Eier in 1x MMR (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES3 [39]) durchgeführt. Einige Min. später werden die befruchteten Eier in 0,1x MMR überführt und können dann beliebig lange kultiviert werden. Die befruchteten Eier lassen sich nach 15-30 Min. von unbefruchteten nach der sogenannten kortikalen Rotation unterscheiden; die animale, pigmentierte Hemisphere zeigt bei diesen Eiern nach oben. Die gesamte Prozedur der Eiergewinnung kann mehrfach am selben Tag mit mindestens einstündigem Abstand wiederholt werden. Nach einer dreimonatigen Ruhepause können die weiblichen Frösche erneut hormonell zur Ovulation stimuliert werden. Für die Isolierung des Testis wird ein männlicher Krallenfrosch2 mit 0,2-0,3 ml 20%igem MS 222 (3-Aminobenzoesäureethylester)1 tief narkotisiert. Nach konsekutiver Durchtrennung der Haut- und Muskelschicht können beide Testes möglichst sauber präpariert und in 1x MMR mit 50 µg/ml Gentamicin1 überführt werden, in der sich die Testes bei 4°C einige Wochen lagern lassen. Material & Methoden 10 Um die nun folgende Mikromanipulation der Xenopus-Embryonen überhaupt durchführen zu können, ist es notwendig die dicke, schützende Gallertkapsel (jelly coat) zu entfernen, welche die Oozyten auf dem Weg durch den Ductus ovaricus erhalten und die notwendig für die Fertilisation ist. Hierzu werden die befruchteten Eier vorsichtig für drei bis vier Min. in 3% Cystein4 (pH 7,5-7,8) inkubiert und anschließend mehrmals mit 0,1x MMR gespült. Absterbende Eier sollten während der Entwicklung bis zum 4-Zellstadium und auch danach sofort entfernt und das Lösungsvolumen ausreichend groß gehalten werden. Wenn man über einen längeren Zeitraum Embryonen des gleichen Entwicklungsstadiums injizieren oder Teile von Embryonen explantieren möchte, besteht die Möglichkeit, die starke Temperaturabhängigkeit der Entwicklung von Xenopus-Embryonen zu nutzen. So können die Eier problemlos auf Raumtemperatur oder auf 13°C gehalten werden, wobei die Entwicklungsgeschwindigkeit bei 13°C auf ein Drittel reduziert wird. Lässt man die Embryonen nach der Fertilisation auf Raumtemperatur, erreichen diese nach etwa 2 Stunden das 4-Zellstadium, in welchem die meisten Injektionen durchgeführt werden. Die ventralen und dorsalen Blastomere sind nun durch Pigmentierungsunterschiede des animalen Pols gekennzeichnet, wobei die beiden ventralen deutlich dunkler pigmentiert sind. Dies ermöglicht die gezielte Mikroinjektion in bestimmte Regionen des frühen Embryos. Um ein Platzen der Eier bei der Manipulation zu verhindern, werden diese in ein hyperosmolares Medium (3% Ficoll5 in 0,5x MMR) transferiert und dann unter dem Injektionsmikroskop6 platziert. Nach der Injektion werden die Embryonen für 12-16 Stunden auf 13°C kultiviert und anschließend in 0,1x MMR mit Gentamicin1 50 µg/ml überführt. Hierin können sie sich nun auf Raumtemperatur bis zum gewünschten Stadium entwickeln. Je nach Ziel des Experiments werden die Embryonen im Blastula-Stadium für Mikrodissektionen verwendet, im Gastrula-Stadium (Stadium 10,5-11) lysiert und für Expressionsstudien tiefgefroren, oder aber zu Analyse des Phänotypes bis zum Kaulquappenstadium kultiviert und gegebenenfalls fixiert und sogar histologisch aufgearbeitet. Material & Methoden 11 2.1.3. Mikroinjektionstechniken Das Schicksal von Organen und Gewebeanlagen ist bereits im frühen Mehrzellstadium in bestimmten Blastomeren des Embryos festgelegt. Dies kann man sich bei der Analyse phänotypischer Effekte nach Mikroinjektion von RNA oder DNA zunutze machen. Eine gezielte Injektion kann sehr charakteristische Veränderungen bestimmter Organe hervorrufen. Injiziert man beispielsweise in beide dorso-animalen Blastomere, wird hauptsächlich die Augen- und Gehirnentwicklung beeinflusst. Um gezielt die Nephrogenese zu untersuchen, wird bei Eieren im 4-Zellstadium in die zukünftige Nierenregion ventro-marginal-lateral injiziert. Durch dorso-marginale Injektion von positiven oder negativen Regulatoren der alternativen Wnt-Signalwege kann man hingegen die Elongation der physiologischen Körperachse beeinflussen. Dies lässt sich dadurch erklären, dass von dieser Region die Regulierung der morphogenetischen Veränderungen bei der Körperstreckung (convergent extension) ausgeht. Das beidseitige Injizieren dorsomarginaler Blastomere kann als Assay der konvergenten Extension (convergent extension assay) bezeichnet werden und wird zur funktionellen Analyse der alternativen Wnt-Signalwege genutzt. Der Anlageplan (fate map) zeigt beispielhaft das Zellschicksal verschiedener Blastomere im 32-Zellstadium von Xenopus laevis Embryonen (Abb.5). Neuralleiste Herz Pronephros Abbildung 5: Der Anlageplan eines frühen Xenopus-Embryos (Fate map) nach Moody (www.xenbase.com). Oben entspricht animal, unten vegetal, links entspricht ventral und rechts dorsal. Rot gekennzeichnete Zellen spielen eine bedeutende, grüne eine geringe und gelbe kaum eine Rolle bei der Entstehung der oben dargestellten Organe. Für die Injektion bedient man sich eines Mikroinjektors7 mit kalibrierbarer, zeit- und druckgesteuerter Injektion im Nanoliter-Bereich. Mittels eines Mikromanipulators8 kann man die Injektionsnadeln (Borosilikatkapillaren9), die in einem selbstgebauten Pipettenziehgerät10 unter Hitze ausgezogenen werden, stufenlos für die Injektion Material & Methoden 12 positionieren. Zur Bewegung der Embryonen unter dem Mikroskop6 (16fache Vergrößerung) eignen sich feine Pinzetten4 sowie Haarschleifen (hair loops), die mittels Siegelwachs/-lack1 in abgebrochenen Pasteurpipetten4 fixiert sind. Nach der gewünschten Injektion mehrerer Gruppen mit je 10 nl RNA Lösung pro Injektion kultiviert man die Eier wie oben beschrieben. Es werden pro Versuch immer nur Eier des selben Laiches verwendet. 2.1.4. Mikrodissektionstechniken Der Animalkappen-Assay (animal cap assay) In diesem in vitro-Assay ist es möglich, mit Hilfe eines Mesoderm stimulierenden Faktors zu untersuchen, welche Proteine eine regulierende Rolle bei morphogenetischen Zellbewegungen während der Gastrulation einnehmen. Zunächst wird im 4-8-Zellstadium mRNA in alle vier animalen Blastomere injiziert. Nach ungefähr 12 Teilungszyklen besteht der Embryo – nun Blastula genannt – aus vielen kleinen Zellen, die einen flüssigkeitsgefüllten Hohlraum (das Blastocoel) umschließen, der sich über den größeren vegetalen Dotterzellen befindet. Kultiviert man Explantate des animalen Pols oder vegetative Zellen aus einer Blastula in einem Medium mit allen für das Ionengleichgewicht erforderlichen Salzen (z.B. 0,6X MMR), dann bilden sie alleine nur Ektoderm bzw. Entoderm. Zellen der marginalen Zone dagegen, in der animale und vegetative Bereiche nebeneinander liegen, bilden später mesodermales Gewebe (Mesenchym, Blutzellen, Chorda und Muskel). Dieses beginnt sich mit der Gastrulation um den Urmund herum in das Innere der Blastula einzurollen und auszudehnen (Involution). Es ist daher wichtig, Mikrodissektionen wie den Animalkappen-Assay in den Blastula-Stadien 8-9,5 (early-/ mid- & late blastula) vor Beginn der Gastrulation durchzuführen, um induktive Einflüsse von vegetalen und marginalen Zellen auf die Animalkappe auszuschalten. Vor der Abtrennung der Animalkappe muss die den Embryo umgebende Vitellinmembran entfernt werden. Hierfür werden die Eier in ein isotones Medium (0,6X MMR) auf mit 1% Agarose1 beschichtete Petrischalen transferiert. Die isotone Lösung ist erforderlich, da die Zellen dazu neigen, nach dem Entfernen der protektiven Vitellinmembran, aus dem Gewebsverband zu dissoziieren. Beim Abpräparieren der Membran gilt es darauf zu achten, die Blastocoele nicht zu punktieren, da sonst die Gefahr besteht, dass die flüssigkeitsgefüllte Höhle kollabiert. Material & Methoden 13 Dies würde ein Berühren der animalen Kappe mit dem vegetalen Pol erlauben, welche mit einer unerwünschten vegetalen Induktion der Kappe einher ginge. Zudem sollte vermieden werden den animalen Zellpol zu beschädigen. Am besten bedient man sich zweier scharfer Pinzetten11, mit denen man mit dem Entfernen der Vitellinmembran in der marginalen Zone beginnt. Im Anschluss „schneidet“ man mit Hilfe einer an einer abgebrochenen PasteurPipette4 befestigten, Wachs1-beschichteten Augenbraue („Augenbrauenmesser = eyebrow knife“) den animalen pigmentierten Pol oberhalb des Blastocoels ab. Um ein möglichst homogenes Gewebestück zu gewinnen, das in der Größe auch mit den anderen explantierten Animalkappen übereinstimmt, schneidet man nun ein kleines Quadrat aus der vorher entfernten animalen Hälfte. Es ist erforderlich, vegetale und marginale Zellen sofort zu entfernen, da diese Zellen Mesoderm induzieren können. Als Resultat hat man schließlich ein quadratisches Gewebestück vorliegen. Dieses besteht aus einer äußeren, pigmentierten Epithelschicht und einer inneren, nichtpigmentierten Schicht. Gemeinsam umfassen sie etwa fünf gleichmäßig dicke Zellschichten aus denen normalerweise nur Ektoderm entsteht. Da die explantierte animale Kappe die Tendenz hat, sich innerhalb von Min. abzurunden und zu verheilen, sollte sie möglichst schnell zur Kultivierung bis zum Neurula-Stadium (Stadium 18) in 0,6X MMR mit und ohne Aktivin A1 überführt werden. Abbildung 6: Mikrodissektion: Nach erfolgter animaler Injektion im 4-Zellstadium werden die im Blastula-Stadium (Stadium 8-9,5) explantierte Animalkappen mit oder ohne Aktivin bis zum NeurulaStadium (Stadium 18) kultiviert. Danach folgt die Auswertung der Elongation. In 0,6X MMR kugelt sich die Animalkappe innerhalb einiger Min. ab und heilt in wenigen Stunden zu einem Ektodermballen, da ihr induktive Signale des übrigen Embryonen bzw. der marginalen Zone und des Organisators fehlen. In MMR und 7,5-10 ng/ml humanem rekombinanten Aktivin A1 verhält sich die Animalkappe jedoch anders. Da es sich bei Aktivin A1 um ein Mitglied der TGF-ß Familie handelt, das die Fähigkeit hat, die Formation und Differenzierung von dorsalem Mesoderm zu Material & Methoden 14 stimulieren, kommt es zu einer Elongation durch die Ausbildung axialer Strukturen [54]. Dieses erfolgt vermutlich über die Induktion eines dorsalisierenden WntSignales durch Aktivin A1. Diese Explantate können gegebenenfalls direkt lysiert und für Expressionsstudien verwendet werden (siehe 3.3). Mittels der Mikrodissektionstechnik lassen sich auch Explantate aus ventromarginalen, dorso-marginalen und vegetalen Teilen des Embryos im Stadium 10 (frühe Gastrula) gewinnen. 2.1.5. Analyse der phänotypischen Veränderungen von Embryonen und animalen Kappen Für die Analyse der phänotypischen Veränderungen wird die Klassifikation der Entwicklungsstadien nach Nieuwkoop und Faber [40] zu Hilfe genommen. Zur besten Beurteilung des „convergent extension assays“ fixiert man die Embryonen im Kaulquappenstadium (Stadium 37/38). Die Fixation erfolgt in 1x MEMFA (0,1 M MOPS1, pH 7,4, 1 mM EGTA1, 2 mM MgSO4, 3,7% Formaldehyd1) für 1 Stunde auf Raumtemperatur oder über Nacht auf 4°C. Um die Kaulquappen beliebig lange lagern zu können, werden sie nach dem Fixieren in Methanol12 überführt, wobei es bei einer geplanten histologischen Aufarbeitung wichtig ist, dies schrittweise mit Verdünnungsreihen zu tun, um eine Präzipitation des Formaldehyds zu vermeiden. Da die dorso-marginal injizierten Embryonen unterschiedlich starke Defekte wie Achsenverkürzung und dorsale Krümmungen zeigen, wird der convergent extension assay mit Hilfe des CEI-Index (convergent extension impairment-index) ausgewertet. Abbildung 7: Die dorso-marginale Injektion beeinflusst die Achsenstreckung. Die resultierenden Defekte können mit Hilfe des CEI-Index (convergent extension impairment-index) ausgewertet. Erläuterungen siehe Text. Ein normaler Embryo entspricht einem Score von CEI 0. CEI 1 repräsentiert einen milden Defekt mit einer Achsenverkürzung von bis zu 25% der normalen Körperlänge und einer leichten Dorsalflexur, während CEI 2, als mäßig starker Defekt, eine Verkürzung um 25-50% zeigt. Erhält ein Embryo den Score CEI 3, so ist seine Material & Methoden 15 Körperlänge nicht nur auf weniger als 50% reduziert, sondern es lassen sich zudem auch Defekte wie ein nicht vollständig geschlossenes Neuralrohr oder eine Fusion von Kopf und Schwanz des Embryonen beobachten. Für die Beurteilung des Animalkappen-Assays werden die Kontroll-Embryonen und die abgerundeten oder auch elongierten animalen Explantate im Neurulastadium 18 fixiert. In diesem Fall wird bei Elongation der animalen Kappen zwischen voll elongiert, partiell elongiert (nur Ausknospung) und ausbleibender Elongation unterschieden. 2.1.6. Fotografische Dokumentation Zur Dokumentation der phänotypischen Veränderungen werden die Kaulquappen in 1x Phosphate Buffer Saline (PBS) überführt, unter einem Mikroskop13 platziert und auf Agarose1 (verhindert Schattengebung) unter Auflicht fotografiert. Anschließend werden die Bilder am Computer bearbeitet14, um charakteristische Veränderungen besser herauszustellen. 2.2. Molekularbiologische und biochemische Methoden 2.2.1. Subklonierung, DNA-Amplifizierung und DNA-Extraktion Bei der Ligationsreaktion wird ein mit Restriktionsendonukleasen15 verdauter DNAAbschnitt als so genanntes Insert mit Hilfe einer DNA-Ligase15 in einen an entsprechenden Stellen geschnittenen Plasmidvektor eingebaut. Die Auftrennung der DNA-Abschnitte und der geschnittenen Vektoren erfolgt mittels Gelelektrophorese (2.2.3.) auf einem Nusieve-Gel (1,5% Nusieve Agarose1). Die gewünschten DNA-Abschnitte und geschnittenen Vektoren werden aus dem Gel gestanzt und durch einen Schmelzvorgang bei 70°C gewonnen. 1 µl des gewonnenen Vektoransatzes und 4 µl des Inserts zusammen mit 2,5 µl 10x Ligationspuffer16, 22,5 µl H2O sowie 0,25 µl T4-DNA-Ligase ergeben den Reaktionsansatz. Dieser wird für 1,5 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Kompetente Bakterienstämme werden mit rekombinanten DNA-Plasmiden transformiert, die von den Bakterien aufgenommen werden. Als kompetente Bakterienstämme mit selektiver Antibiotika-Resistenz stehen E. coli für Ampicillin (DH10B-T117) sowie für Ampicillin und Tetracyclin (E. coli DH10-P317) zur Verfügung. 5 µl 1:1000 verdünntes Plasmid wird zu 50 µl Bakteriensuspension gegeben und für Material & Methoden 16 mindestens 30 Min. auf Eis gelagert. Der Transformationsansatz wird dann 45 Sek. bei 42°C inkubiert. Eine Stunde nach Zugabe von 200 µl Nährmedium (Soc-Medium) werden die Bakterien auf einer mit dem entsprechenden Antibiotikum behandelten Agarplatte ausgestrichen. Die Platte wird über Nacht bei 37°C aufbewahrt, so dass bei erfolgreicher Transformation am folgenden Morgen Bakterienkulturen auf dem Nährboden gewachsen sind. Bei der Minipräparation werden Bakterienkolonien mit sterilen Pipettenspitzen aufgenommen, jeweils 3 ml mit Antibiotikum versetztes LB-Medium (20 g LB-Broth1 auf 1000 ml H2O; 100 µg/ml Ampicillin18; 0,25 µg/ml Tetracyclin18) beimpft und über Nacht auf einem Rotor* bei 37°C inkubiert. Aus einem Teil der Bakteriensuspension wird durch ein Verfahren, das aus Zentrifugations-, Wasch- und Fällungsschritten ähnlich der Maxipräparation (siehe unten) besteht, DNA gewonnen, die durch einen Restriktionsverdau und eine Auftrennung auf einem Agarosegel (siehe unten) Auskunft über den Erfolg der Amplifikation oder Subklonierung gibt. Die Maxi-Präparation dient der weiteren Vervielfachung eines DNA-Konstruktes in Bakterienzellen. 3 ml Bakterienkultur, die das zu vermehrende DNA Konstrukt enthalten (s. 2.4), werden in einem mit Selektionsantibiotikum versetzten Ansatz (1000 ml H2O; 20g LB Broth1, 10 ml Ampiciliin18 oder 7,5 ml Tetracyclin18 plus 2,5 ml Ampicillin18) für 16-20 Stunden bei 37°C unter stetigem Schütteln vermehrt. Anschließend werden die Bakteriensuspension zentrifugiert (4500 UpM., 15 Min., 4°C) und der Überstand verworfen. Der Bodensatz, der die Bakterien enthält, wird in 40 ml Lösung 1 (10 mM EDTA; pH 8,0) gelöst und dann mit 80 ml Lösung 2 (0,2 M NaOH/ 1% SDS1) versetzt, einem Detergens, das die Bakterienwände zerstört und so die DNA freisetzt. 40 ml der Lösung 3 (5 M Kaliumazetat) führen zu einer Neutralisation des vorherigen Schrittes. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (4200 UpM., 15 Min., 4°C) werden bakterielle Zellbestandteile herausfiltriert, die Suspension zur Fällung der DNA mit 100% Isopropanol im Verhältnis 1:1 versetzt und erneut zentrifugiert (4200 UpM., 5 Min., 4°C). Danach wird das Isopropanol abgegossen. Der Bodensatz wird mit 70% Ethanol gespült, um Salze von der DNA abzulösen, und anschließend getrocknet. Als Nächstes wird er mit 10 mM Tris HCl Puffer (pH 7,5) gelöst und mit 5 g Cäsiumchlorid (CsCl2 ) und 500 µl Ethidiumbromid1 versetzt. Es folgt ein Zentrifugationsschritt mit 80.000 UpM. für 4 Stunden oder alternativ mit 60.000 UpM. über Nacht bei 25°C. In der weitgehend durchsichtigen Lösung zeichnet sich eine rote Bande ab, die mit Hilfe einer Kanüle entnommen wird. Material & Methoden 17 Um das CsCl2 zu entfernen muss eine Butanolextraktion mit 5-10 ml gesättigtem 1 M NaCl Butanol* durchgeführt werden. Die DNA wird nun mit 95% Ethanol ausgefällt und mit einem Zentrifugationsschritt (13.500 UpM., 15 Min., 25°C) vom Überstand getrennt. Nach Waschschritten mit 70% Ethanol kann die DNA schließlich in 1 ml H2O gelöst werden. Im Anschluss wird die Reinheit der DNA überprüft und deren Konzentration bestimmt (siehe 2.2.3. und 2.2.4.). 2.2.2. In vitro RNA-Synthese Mit einem Restriktionsenzym7, für das das Konstrukt nur eine Schnittstelle aufweist, wird der Reaktionsansatz, bestehend aus Enzym-spezifischem Puffer7, Bovine Serum Albumin (BSA)1 und Konstrukt, für 6-8 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wird das Ergebnis mittels eines 1%igen Agarose-Gels in der Gelelektrophorese (30 Min. bei 80 V) überprüft. Die Aufreinigung des linearisierten Konstrukts erfolgt mit einem Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25 Teile Phenol1, 24 Teile Chloroform12, 1 Teil Isoamylakohol12). Nach Präzipitation der DNA mit einem Gemisch aus 100% Ethanol und 3 M Natriumacetat auf -20°C wird diese abschließend in 80% Ethanol gewaschen und steht nun für die RNA-Synthese zur Verfügung. Die in vitro RNA Synthese [24] wird mit dem kommerziell erhältlichen Transkriptionskit19 nach Herstellerangaben durchgeführt. Der Transkriptionsansatz besteht dabei immer aus dem linearisierten Konstrukt, einer RNA-Polymerase (T7 oder SP6, je nach Promoter), einem CAP-Analogon zum Schutz vor endogenem Abbau der RNA, Nukleosidtriphosphaten (NTP) und Reaktionspuffer. Die Inkubation erfolgt für 2 Stunden auf 37°C. Zur Entfernung der linearisierten DNA wird dem Ansatz DNase zugegeben und für weitere 15 Min. auf 37°C inkubiert. Die Aufreinigung erfolgt mit dem RNeasy Kit20 nach Herstellerprotokoll. Anschließend wird die Konzentration mittels Photometer bestimmt (siehe 2.2.4.) und zur Kontrolle eine Gelektrophorese durchgeführt (2.2.3.). Bei erfolgreicher RNA-Synthese kann die RNA auf -80°C tiefgefroren werden, um diese bis zu ihrem Einsatz möglichst stabil zu halten. 2.2.3. Gelelektrophorese Zur Auftrennung einer DNA-Probe werden 15 µl der Probe auf ein 1%iges Agarosegel* aufgetragen. Als Größenmarker dient eine Lösung von verschiedenen Material & Methoden 18 DNA-Fragmenten definierter Länge (Lambda DNA-BstE II Digest)7. Die Nukleinsäuren werden für 30 Min. bei 80 mV aufgetrennt und unter UV-Licht mit Hilfe von Ethidiumbromid fluoreszenzoptisch sichtbar gemacht und fotografisch dokumentiert. Zur Überprüfung einer gelungenen RNA-Synthese werden die RNA-Proben sowie eine Referenz-RNA auf ein RNA-Gel aufgetragen (Gel: 1% Agarose1 mit 1x MOPS1 und 17,75 % Formaldehyd1; Ladepuffer: 50 % Formamid1, 15 % Formaldehyd1, 1x MOPS1, EtBr1 5 µl/ml Puffer, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau; Laufpuffer: 1x MOPS1). Nach 30 Min. bei 80 V wird mit den Proben zur Dokumentation wie oben beschrieben fortgefahren. 2.2.4. Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA Nukleinsäuren in Lösung weisen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm Wellenlänge auf. Dies wird zur photometrischen Konzentrationsbestimmung21 ausgenutzt. Die Konzentration C ergibt sich dabei gemäß dem Lambert-Beerschen-Gesetz: (1) C = A 260 ⋅ V ⋅ 40 [µg/ml]; A= Absorption; V = Verdünnungsfaktor Der Faktor 50 µg/ml gilt für doppelsträngige DNA, für RNA beträgt er 40 µg/ml. Der Quotient A260/A280 ist ein Maß für die Reinheit der DNA bzw. RNA, wobei Quotienten zwischen 1,8 und 2 für hochreine Nukleinsäuren sprechen. 2.2.5. Morpholino-Antisense-Oligonukleotide (MO) Klassische Antisense-Oligonukleotide blocken die mRNA, rekrutieren endogene RNAsen und verhindern so die Translation des Zielproteins. Sie bestehen aus 18-25 Nukleotiden, die komplementär zur Zielsequenz sind. Bei Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (MO) ist gegenüber den klassischen Antisense-Ansätzen, wie z.B. Phosphorothioat-gekoppelten Nukleotiden, das Ribosidgerüst durch ein Morpholino-Gerüst ersetzt [57]. Dadurch ergeben sich zahlreiche Vorteile, namentlich hohe Substratspezifität bei geringer Toxizität und Resistenz gegenüber Nukleasen. Der Hauptmechanismus der Morpholinos besteht in der Blockade der Translation durch Interaktion mit der mRNA des Zielproteins. So kann man im Falle einer Mikroinjektion von Inversin-Morpholino (Inversin-MO) eine gezielte, regionsspezifische Depletion des Inversin Proteins erreichen. Ein Inversin-MO wurde hergestellt, das komplementär zum 5’-Ende der kodierenden Material & Methoden 19 Inversinsequenz war und das Startkodon überlappte (Inversin-MO: 5’-GGCTACTCATACTAGAACTGGGACA-3’)22. Zur Kontrolle der Spezifität des beobachteten Inversin-MO Effektes wurde ein Kontroll-Morpholino ähnlicher Länge und Basenzusammensetzung injiziert. (Kontroll-MO: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACA ATTT ATA-3’) Der erworbene Inversin-MO wurde in RNAse-freiem Wasser als 1 und 2 mM Stocklösung aufgelöst und fortan auf -20°C gelagert. Für die Injektion wurden Dosen von 0,2 mM (16 ng) bis 0,4 mM (32 ng) pro Blastomer eingesetzt. 2.2.6. Verwendete Konstrukte Folgende Konstrukte wurden im Rahmen dieser Arbeit als RNA in Oozyten mikroinjiziert: - Inversin (Inv) in PXT7-HA - Dishevelled (Dsh), Vektor pCS2 myc - Inversin-Morpholino (siehe 2.2.5.) - Kontroll-Morpholino (siehe 2.2.5.) - Extrazelluläre Cysteine-reiche Domaine von Xenopus Frizzled-8 (ECD8) in pXT7 - Xenopus Frizzled-8 (XFz-8) in pCS2+ und in pXT7 - Xenopus Frizzled-7 (XFz-7) in pCS2+ - Dominant-negative Form von Xenopus Wnt-11 (DN-Wnt-11) in pSP64T - Cyclin-abhängige (Cyclin-dependent) Kinase (Cdc42) N17 in myc - Cyclin-abhängige (Cyclin-dependent) Kinase (Cdc42) L61 in Cmyc 2.2.7. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketternreaktion (rt-PCR) Die rt-PCR ist eine sensitive Technik um endogene messenger-Ribonukleinsäuren (mRNA) zu detektieren. Zellen oder Embryonen bzw. Explantate werden mit dem RNeasy Kit20 nach Herstellerangaben23 lysiert und die RNA anschließend extrahiert. Die Konzentrationsmessung der endogenen, aufgereinigten RNA findet bei OD 260 nm wie oben beschrieben statt. Anschließend werden in der reverse Transkription, in der die extrahierte RNA in eine komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben wird, gleiche Mengen der einzelnen Embryo- und Explantatlysate eingesetzt. Der Reaktionsansatz besteht aus RNA, dNTP Mix23, RNase freiem Wasser23, DTT23, Reaktionspuffer23, RNase out23, reverser Transkriptase23 und Oligo dT23, einem kurzen Oligonucleotid (Primer), das Material & Methoden 20 durch Bindung an den Poly-A-Schwanz dafür sorgt, dass alle in der Probe vorhandene mRNA in cDNA umgeschrieben wird. Die darauf folgende Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ermöglicht eine zyklische, enzymatische und exponentielle Vervielfältigung der nun vorliegenden cDNAFragmente. Ein typischer Reaktionsansatz von 50 µl enthält neben H2O die zu amplifizierende DNA-Sequenz, entsprechende vorwärts- und rückwärts-Primer26, Taq-Polymerase25 sowie PCR Puffer* mit Nukleotidbausteinen und wird in ca. 30 Zyklen in so genannten Thermocyclern24 durchgeführt. Bei 95°C lösen sich Sekundärstrukturen und es kommt zur Linearisierung und Vereinzelung der DNAStränge (Melting). Bei 58-60°C hybridisieren Primer, die die Ziel-DNA-Sequenz von beiden Seiten her begrenzen, mit den jeweils komplementären Basensträngen der cDNA (Annealing). Durch die Wahl der Primer kann man exakt bestimmen, welcher Bereich der DNA amplifiziert werden soll. Eine thermostabile Taq-Ploymerase25 ergänzt bei 72°C die fehlenden Stücke komplementär zur Vorlage, wobei diese in 5’Æ3’-Richtung verläuft (Elongation). Ergebnis sind 2 identische DNA-Doppelstränge, die durch Wiederholungen des Zyklus exponentiell amplifiziert werden können. Zur Qualitätssicherung werden immer sowohl eine Positivkontrolle (ODC = Ornityldecarboxylase) als auch eine Negativkontrolle (nicht transkribierte RNA) eingesetzt. Die amplifizierte DNA wird im Anschluss an die PCR mit 10 µl DNALadepuffer vermischt und 30 µl dieses Gemisches auf ein 1,5%iges Agarosegel geladen. Nach einstündiger Elektrophorese bei 100 V können die aufgetrennten Proben wie oben beschrieben unter UV-Licht fotografisch dokumentiert werden. Folgende Primer wurden im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt: Inversin-Primer: vorwärts: 5’-GTGCAAAGGTGCACCTTGTAGAC-3’ rückwärts: 5’-GAGGCTGCAATGTCCTGAATGGC-3’ ODC-Primer: vorwärts: 5’-AATGGATTTCAGAGACCA-3’ rückwärts: 5’-CCAAGGCTAAAGTTGCAG-3’ Chordin-Primer: vorwärts: 5’-GCTCCAGACTATGACAGGA-3’ rückwärts: 5-GCACAGTTGGATGCCAACGC-3’ VegT-Primer vorwärts: 5’-AGAAACTGCTGCTGTCGGGAA-3’ rückwärts: 5’-CGGATCTTACACTGAGGA-3’ Vg-1-Primer vorwärts: 5’ -GACCGCTAACGATGAGTG-3‘ rückwärts: 5’- AGGAATGTCTTCTGGCTC-3’ Xbra-Primer vorwärts: 5’-GGATCGTTATCACCTCTG-3‘ rückwärts: 5’-GTGTAGTCTGTAGCAGCA-3‘ Material & Methoden 21 2.2.8. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) In der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Proteine auf Grund ihres Molekulargewichtes elektrophoretisch in Anwesenheit des denaturierenden, anionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS)1 in Richtung Anode in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt, wobei große Proteine langsamer durch die Gelporen wandern als kleine. Durch Variation des Vernetzungsgrades kann die Porengröße des Gels so variiert werden, dass sich eine optimale Auftrennung der Eiweiße ergibt. Das negativ geladene Detergens SDS1, ein Sulfatester des Dodekanols, bindet an hydrophobe Proteinbezirke, wodurch es zum Entfalten der Eiweiße und zur Aufhebung der Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Lipiden kommt. Mit Hilfe der reduzierenden Wirkung von Dithiotreitol (DTT)1 werden vorhandene Disulfidbrücken der Proteine aufgespalten. Die aufgetrennten Eiweiße können anschließend mittels Western-Blot-Technik detektiert werden. Um eine Gelektrophorese von Lysaten injizierter Embryonen mit anschließendem Western Blot durchzuführen, werden 25 Embryonen aus jeder Gruppe in der frühen Gastrula mit 500 µl Lyse-Puffer (1% Triton X1001, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) für 10 bis 15 Min. auf Eis lysiert. Nach Zentrifugation der Suspension des Gemisches für 20 Min. in der Ultrazentrifuge bei 45000 rpm, werden 200 µl des klaren Lysates mit gleichen Mengen 2x Laemmli-Puffer* bei 95°C für 5 Min. denaturiert. Anschließend werden je 25 µl in die Taschen des vorbereiteten Polyacrylamidgels (siehe Tab. 1) aufgetragen. Trenngelpuffer (180 ml Tris HCl 2M, 570 ml Tris-Base 2M, 20 ml SDS 20%, 230 ml H2O) Sammelgelpuffer (242 ml Tris HCl 2M, 8 ml Tris-Base 2M, 20 ml SDS 20%, 730 ml H2O) Acrylamid (30%) H2O Ammoniumperoxidisulfat (10%) TEMED Trenngel 10 ml Sammelgel 0 ml 0 ml 5 ml 4 ml 6 ml 240 µl 30 µl 1 ml 4 ml 100 µl 15 µl Tabelle 1: Zusammensetzung des Polyacrylamidgels (8%) Zur späteren Molekulargewichtsbestimmung werden 15 µl eines kommerziell erhältlichen Proteinmarkers(P7708S)7 aufgetragen. Die Gele bestehen aus zwei Phasen. Zunächst wandern die Proteine in der Sammelphase bei 70 Volt für 30 Min.. Danach werden die Eiweiße in der Trennphase für 2,5 Stunden bei 20 mA aufgetrennt (Laufpuffer: 14,4 g Glycin; 1 g SDS; 3 g Tris Base pro Liter H2O ). Material & Methoden 22 3. Ergebnisse 3.1. Inversin beeinflusst die frühe Nierenentwicklung von Xenopus laevis Wie in der Einleitung beschrieben, spielen Wnt-Signale bei der Induktion und Differenzierung der Niere eine wichtige Rolle (siehe 1.2.1). Um gezielt den Einfluss von Inversin in Wnt-Signalwegen auf die Nephrogenese im Krallenfrosch zu untersuchen, wurden Eier im 4-Zellstadium im Bereich der zukünftigen Nierenregion [5, 22, 63] rechtsseitig ventro-marginal-lateral mit 32 ng Inversin-MorpholinoAntisense-Oligonukleotiden (Inversin-MO, siehe 2.2.5.) injiziert (n=80). Bis etwa zum Stadium 42 unterschieden sich die injizierten Kaulquappen makroskopisch nicht von der Kontrollgruppe. Im Laufe der nächsten drei Stadien entwickelten die injizierten Kaulquappen vor allem im Bereich der Bauchhöhle, z.T. aber auch im Kopfbereich, starke Flüssigkeitsansammlungen. Abbildung 8: Ödemphänotyp im Stadium 45: Injektion von Inversin-Morpholino (MO) rechtseitig in ein ventro-marginal-laterales Blastomer führte ab dem Stadium 42 zu einer Ödembildung im Bereich der Bauchhöhle. Die uninjizierte Kontrollgruppe entwickelte sich normal. Die phänotypische Veränderung der injizierten Kaulquappen ab dem Stadium 42 deutete darauf hin, dass die Depletion von Inversin in der prospektiven region (Pronephros) des 4-Zellstadiums möglicherweise eine Nieren- Störung der Nephrogenese hervorgerufen hatte. Das Ausbleiben von Ödemen bei Injektion eines funktionslosen Kontroll-MO (n=20) zeigte, dass Inversin notwendig für eine regelrechte Nierenentwicklung zu sein scheint. Die Tatsache, dass bei den ödematösen Embryonen das Herz angelegt war und regelrecht schlug, macht eine kardiale Insuffizienz als Ursache für die Ödeme unwahrscheinlich. Hinweise, dass Inversin tatsächlich in die für die Nierenentwicklung wichtige Wnt/Fz/Dsh-Kaskade eingreift, liefern zudem Vorarbeiten aus unserem Labor [73]. Welche Wnt-Signale werden durch die Depletion von Inversin beeinflusst, sodass eine Störung der Nephrogenese resultiert? Ergebnisse 23 3.2. Inversin spielt eine Rolle in alternativen Wnt-Signalwegen In Experimenten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Inversin an Dsh zu einer Hemmung des klassischen Wnt/ß-Catenin Signalweges führte [51]. Da Inversin als ein mit Dsh interagierendes Protein am Kreuzungsweg verschiedener Signalkaskaden liegt (siehe Abschnitt 1.2.2.), stellt sich die Frage, ob Inversin auch eine mögliche Funktion in alternativen Wnt-Signalwegen hat. Alternative Wnt-Signalübertragungswege beeinflussen Zellpolarität und Zellmigration während der anterior-posterioren Achsenelongation im Rahmen der späten Gastrulaund Neurulastadien von Xenopus laevis (siehe Abschnitt 1.2.2.). Mittels gezielter dorso-marginaler Injektion von RNA im 4-Zellstadium kann die Regulation der morphogenetischen Veränderungen bei der Körperstreckung beeinflusst werden. Sowohl die Überexpression positiver Regulatoren der alternativen Signal- übertragungswege wie Dishevelled [54], Fz-7 [10, 31, 32], Fz-8 [9] und Wnt-11 [59] als auch die Überexpression dominant-negativer Konstrukte wie ECD8 (extracellular cystine-rich domain of frizzled-8) [21] und dominant-negatives Wnt-11 (DN-Wnt-11) [52] im dorsalen Embryo führen zu einem ähnlichen Phänotyp: Die Embryonen zeigen eine charakteristische Verkürzung und Dorsalkrümmung ihrer Körperachse und weisen unter anderem Störungen der Augenentwicklung und des Neuralrohrschlusses auf. Diese sogenannten convergent extension Defekte können unterschiedlich stark ausfallen und werden anhand eines CEI-Scores im Stadium 37/38 ausgewertet (siehe 2.1.5.). Abbildung 9: Die dorso-marginale Überexpression von Inversin hemmt die Elongation der Körperachse in Xenopus laevis. Mit Inversin-RNA (Inv) injizierte Embryonen wiesen eine charakteristische Verkürzung und Dorsalkrümmung ihrer Körperachse auf. Dies zeigte, dass Inversin eine Rolle in alternativen Wnt-Signalwegen spielt. Ergebnisse 24 In der Tat führten Überexpressions- (gain of function) und Depletions-Experimente (loss of function) von Inversin-RNA zu charakteristischen, dosisabhängigen Defekten der Achsenstreckung von Embryonen und wiesen darauf hin, dass Inversin eine Rolle als Kofaktor in alternativen Wnt-Signalwegen spielt. Dieses schon von Simons et al. beschriebene Ergebnis konnte hier nochmals bestätigt werden [51, 73]. Abbildung 10: Statistische Auswertung der phänotypischen Effekte nach dorso-marginaler Injektion von Inversin im 4-Zellstadium. Embryonen wurden nach dem CEI-Score beurteilt: milde (CEI 1), moderate (CEI 2) und schwere Achsenstreckungsdefekte (CEI 3) (siehe 2.1.5.) Dosisabhängig ließen sich die Defekte steigern. Die Anzahl der verwendeten Embryonen ist in Klammern angegeben. 3.3. Die Depletion von Inversin durch Inv-MO inhibiert sowohl die endogene Achsenelongation als auch die Elongation von Aktivin-induzierten animalen Kappen Um die Effekte in einem weniger störanfälligen in vitro-Assay zu untersuchen, wurde der sogenannte Animalkappen-Assay (animal cap assay) durchgeführt. In diesem Assay können induktive Einflüsse auf Zellbewegungen und Zellmigration während der anterio-posterioren Achsenelongation gut studiert werden. Animale Explantate wurden während der Blastulastadien 8-9,5 disseziert und in 0,6X MMR mit oder ohne 7,5 ng/ml Aktivin, einem starken Stimulanz für die Formation und Differenzierung von Mesoderm, kultiviert. In 0,6X MMR kultiviert, kugelten sich die animalen Kappen nach einigen Min. ab und heilten innerhalb weniger Stunden zu einem Ektodermballen, da ihnen induktive Signale des übrigen Embryos bzw. der marginalen Zone und des Organisatiors fehlten (n=103, siehe Abb. 10 und 11). Bei der Kultivierung in MMR und 7,5 ng/ml humanem rekombinanten Aktivin kam es hingegen zu einer Elongation der animalen Explantate durch die Ausbildung axialer Strukturen (n=96, siehe Abb. 10 und 11). Dieses erfolgte vermutlich über die Induktion eines dorsalisierenden Wnt-Signales durch Aktivin. Wurde jedoch im 4Zellstadium eine animale Injektion mit 32 ng Inversin-MO (siehe 2.2.5.), welches die Ergebnisse 25 Translation endogener Inversin-mRNA blockiert, durchgeführt, war die durch Aktivin induzierte Elongation der Explantate in 86% der Fälle (n= 81, siehe Abb. 10 und 11) gehemmt, analog der Wirkung von Inversin-MO auf die Achsenextension in vivo [51]. Abbildung 11: Einfluss von Inversin-Morpholino auf die Elongation von Aktivin-induzierten Explantaten. A) Im animal cap assay wurden animale Kappen im Blastula-Stadium (Stadium 8-9,5) explantiert und mit oder ohne Aktivin bis zum Neurula-Stadium (Stadium 18) kultiviert. B) Ohne Aktivin kultivierte Kontrollexplantate bildeten runde Ektodermballen, während der Zusatz von Aktivin bei uninjizierten animalen Kappen eine Elongation bewirkte. Explantate, die im 4-Zellstadium animal mit 32 ng Inversin-MO injiziert und nach erfolgter Mikrodissektion in Aktivin kultiviert wurden, zeigten entweder keine oder nur eine partielle Elongation. Koinjektion von aus Mäusen gewonnener Inversin-RNA (mInversin) reduzierte die hemmende Wirkung von Inversin-MO partiell und komplett. Ergebnisse 26 Die Injektion einer äquimolaren Menge an Kontroll-MO hingegen hatte keinerlei Einfluss auf die Streckung der animalen Kappen (n=28). Um zu zeigen, dass es sich bei dem Ausbleiben der Elongation um einen spezifischen Effekt der Depletion Inversins handelte, wurde Inversin koexprimiert, dessen mRNA nicht von InversinMO blockiert werden konnte. Der hemmende Effekt von Inversin-MO konnte durch Koinjektion von 1 ng Inversin-RNA von 86% auf 36% reduziert werden (rescue). Abbildung 12: Statistische Auswertung des animal cap assays: Inversin-MO blockte die Elongation von im Blastula-Stadium explantierten animalen Kappen, die in Aktivin kultiviert wurden. Durch Koinjektion von Inversin-RNA konnte die Elongation entweder partiell oder komplett wiederhergestellt werden. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass Inversin für die Elongation essentiell ist und bestätigt die in vivo Experimente [51]. Somit ist belegt, dass Inversin eine entscheidende Rolle bei der Achsenstreckung während der Gastrulation spielt. Nun stellte sich die Frage, welcher Mechanismus die Elongation der animalen Kappen verhinderte. Wurde die durch Aktivin gesteuerte Induktion von Mesoderm durch die Depletion von Inversin gestört, oder lag das Ausbleiben der Elongation an einer Hemmung der morphogenetischen Zellbewegung/planaren Zellpolarität während Gastrulation und Neurulation begründet? 3.4. Inversin-MO beeinflussen nicht die Spezifizierung dorsalen Gewebes Um herauszufinden, ob die gestörte Elongation der animalen Kappen durch einen Defekt in der mesodermalen Zelldifferenzierung bedingt war, wurde die Expression verschiedener Marker mit Hilfe einer rt-PCR überprüft. Mit 32 ng Inversin-MO injizierte animale Kappen wurden im Blastulastadium geschnitten und in Aktivin kultiviert, bis die Kontrollgruppe Neurula-Stadium 18 Ergebnisse 27 erreicht hatte. Anschließend wurden die verschiedenen Gruppen für die rt-PCR lysiert. Als Positivkontrolle dienten mit Aktivin behandelte elongierte animale Kappen. Die Negativkontrolle stellte abgerundete ektodermale Explantate dar, die nicht in Aktivin kultiviert wurden. Zudem wurden ganze Embryonen zur Stadienbestimmung und Expressionskontrolle verwendet. Zur selektiven Amplifikation der Marker wurden spezifische Primer für Inversin (XInv), Chordin (Chd), Xbra, Vg-1, Veg-T und die Ornityldecarboxylase (ODC) eingesetzt. Chordin wurde dabei als dorsaler Mesodermmarker, Xbra als panmesodermaler Marker, Vg-1 und VegT als vegetale Marker verwendet. Die Ornityldecarboxylase ODC, welche in allen Zellen des Embryos gleich stark exprimiert wird, diente als Ladungskontrolle. Abbildung 13: Die Depletion von Inversin hat keinen Effekt auf die Expression mesodermaler Marker. A) Inversin-Morpholino-injizierte und uninjizierte animale Kappen wurden in Aktivin A bis zum Neurula-Stadium kultiviert, um dann in einer rt-PCR verwendet zu werden. B) Die rt-PCR-Analyse zeigte, dass Inversin-Transkripte in ganzen Embryonen (WE) sowie in Animalkappen (AC) nachweisbar sind. Die Injektion von Inversin-Morpholino beeinflusste nicht das Expressionsmuster von Inversin (XInv) oder der mesodermalen Marker Chordin (Chd) und Xbra. ODC+ und VegT dienten als Ladungs- bzw. Qualitätskontrollen. Das Ergebnis der Gelelektrophorese zeigte, dass Inversin sowohl im Ektoderm, d.h. in Aktivin-unbehandelten animalen Kappen, als auch in elongierten mesodermalen Explantaten exprimiert wird. Bei den mit Inversin-MO injizierten, in der Elongation gehemmten animalen Kappen wies das gleiche Expressionsmuster auf. Auch die Expression der mesodermalen Marker Chordin und Xbra wurde durch die Injektion Ergebnisse 28 von Inversin-MO nicht verändert. Die Ladungskontrolle zeigte eine gleichmäßige Verteilung von ODC in allen Proben. Die beiden vegetalen Marker VegT und Vg-1 (in der Abbildung nicht gezeigt) wiesen nur im ganzen Embryo eine Bande auf, was eine saubere Dissektion bestätigt. Die Negativkontrolle, für die nichttranskribierte RNA verwendet wurde, zeigte keine Bande. Diese Ergebnisse machten ein verändertes Zellschicksal mesodermaler Zellverbände als Ursache des Inversin-MO Phänotyps unwahrscheinlich. Es ist daher anzunehmen, dass die inhibierte Elongation der animalen Kappen nicht durch fehlende Geninduktion sondern durch gestörte morphogenetische Zellbewegungen zustande kommt. Inversin ist demnach für die Regulation von Zellbewegung polarisierter Zellen (convergent extension movements) notwendig, damit eine Elongation der Explantate stattfinden kann, nicht jedoch für die Mesoderminduktion bzw. –differenzierung. 3.5. Inversin wird während der Gastrulation vor allem im Ektoderm und ventromarginalem Mesoderm exprimiert Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass Inversin während der gesamten frühen Embryogenese von Xenopus laevis exprimiert wird [51]. Um näheres über die Verteilung von Inversin während der frühen Gastrulation zu erfahren, wurden Embryonen im frühen Gastrula-Stadium (Stadium 10) in animale, vegetale, dorsomarginale und ventro-marginale Teile disseziert. Mit den Lysaten der Explantate wurde eine rt-PCR durchgeführt. Als Expressionskontrolle wurden ganze Embryonen verwendet. Neben dem Primer für Inversin (XInv) wurden Primer für die Marker Chordin (ein dorso-marginaler Marker) und VegT (ein vegetaler Marker) eingesetzt, um eine saubere Dissektion zu bestätigen. Als Ladungskontrolle diente die Ornityldecarboxylase (ODC). Die rt-PCR-Analyse zeigte eine gleichmäßige ODC-Expression. VegT war als vegetaler Marker in ganzen Embryonen und stark in vegetalen Explantaten nachweisbar. Zudem ist eine schwache Bande ventro-marginal zu erkennen. mRNATranskripte des dorso-marginalen Markers Chordin ließen sich in ganzen Embryonen und in dorso-marginalen Explantaten nachweisen. Das Expressionsmuster von VegT und Chordin bestätigt somit eine saubere, qualitativ gute Dissektion. Ergebnisse 29 Abbildung 14: rt-PCR-Analysen zeigen den Nachweis von Inversin-Transkripten in der frühen Gastrula. A) Embryonen im frühen Gastrula-Stadium (Stadium 10) wurden in animale (An), vegetale (Veg), ventro-marginale (VM) und dorso-marginale (DM) Explantate disseziert. WE = ganze Embryonen. B) Inversin-Transkripte sind in allen Explantaten nachweisbar innerhalb des Embryonen mit Schwerpunkt des Nachweises animal (An) und ventro-marginal (VM). ODC, chordin (Chd) und VegT sind Ladungs- bzw. Qualitätskontrollen. Inversin-Transkripte waren sowohl in ganzen Embryonen als auch in allen Explantaten nachweisbar, jedoch in unterschiedlich starkem Ausmaß: InversinmRNA war animal am stärksten transkribiert, aber auch in ventro-marginalen Explantaten zeigte sich eine recht starke Bande. In dorso-marginalen und vegetalen Teilen wurden Inversin-Transkripte nur schwach nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden mehrfach reproduziert (n=3 Experimente). Der Nachweis von Inversin-Transkripten in Mesoderm und Ektoderm, die an der anterio-posterioren Achsenelongation beteiligt sind, unterstützt die Vermutung, dass Inversin an der Regulation der konvergenten Extension/planare Polarität beteiligt ist. Ergebnisse 30 3.6. Die Funktion von Inversin in alternativen Wnt/PCP-Signalwegen Wie auch schon mit Epistase-Experimenten ermittelt wurde, dass Inversin an der Regulation morphogenetischer Zellbewegungen beteiligt ist, sollte nun mit Hilfe gezielter Mikroinjektion untersucht werden mit welchen Komponenten alternativer Wnt-Signalwege Inversin möglicherweise in Zusammenhang gebracht werden kann. Koinjektionen auf Signalmolekülebende mit Wnt-11, auf Rezeptorebene mit dem dominant-negativen Fz-8 (ECD8) und zytosolisch mit Cdc42 sollten zeigen, über welchen Signalweg Inversin wirkt. 3.6.1. Durch DN-Wnt-11 induzierte Defekte können nicht signifikant von Inversin reduziert werden Es ist bekannt, dass ein Wnt-11-Signal bei morphogenetischen Zellbewegungen in alternativen Wnt-Signalwegen eine Rolle spielt, dessen Wirkung zumindest teilweise über Dsh vermittelt wird [10]. Da Inversin mit Dishevelled interagiert [51], ist anzunehmen, dass Inversin unterhalb (downstream) von Wnt-11 wirken könnte. Um dies herauszufinden, wurden dominant-negatives Wnt-11 (DN-Wnt-11) und Inversin in den dorsalen Embryo koinjiziert. Injizierte man DN-Wnt-11-RNA in die dorso-marginale Region des 4-Zell-Embryos und fixierte die Embryos im Kaulquappenstadium, so konnte man charakteristische Achsenstreckungsdefekte beobachten. Eine Dosis von 500 pg bewirkte in 72% der injizierten Embryonen CEI Defekte, die mit einem CEI-Score 3 bewertet wurden (n=237), 250 pg in 60% (n=133). Die Koinjektion von Inversin-RNA bewirkte keine Reduktion der Defekte mit dem CEIScore 3. Die Koinjektion von 2 ng Inversin führte sogar zu einer deutlichen Verstärkung der Defekte (n=34). Die Koinjektion von 250 pg mit Inversin zeigte eine geringe, jedoch nicht signifikante Reduktion der schweren Achsenstreckungsdefekte: Mit 0,5 ng Inversin erfolgte eine partielle Verminderung der CEI-3-Defekte von 60% auf 43% (n=110) und mit 1 ng Inversin konnten die Defekte von 60% auf 35% reduziert werden (n=65). 2 ng Inversin wirkte wiederum verstärkend auf die Hemmung der Achsenstreckung von 60% auf 81% (n=31). Ergebnisse 31 Abbildung 15: Koinjektion von mInversin hat keinen eindeutigen Effekt auf DN-Wnt-11 injizierte defekte Embryonen. A) Die Injektion der Embryonen erfolgte dorso-marginal wie dargestellt. Nach Injektion von Inversin sowie von dominant-negativem Wnt-11 (DN-Wnt-11) kam es zu dramatischen Veränderungen der Embryonen mit verkürzter und verkrümmter Körperachse. Die Injektion von DNWnt-11 ging zudem teilweise mit Störungen der Neuralentwicklung einher. Die Koinjektion von Inversin konnte die durch DN-Wnt-11 induzierten schweren Defekte nur leicht reduzieren. Die Gesamtzahl der Defekte blieb unverändert. B und C) Statistische Auswertung. Embryonen wurden nach dem CEI-Score beurteilt: milde (CEI 1), moderate (CEI 2) und schwere Achsenstreckungsdefekte (CEI 3) (siehe 2.1.5.); Gesamtzahl n in Klammern; weitere Erläuterung, siehe Text; Ergebnisse 32 Während sich die schweren, durch DN-Wnt-11 induzierten CEI 3 Defekte mit Inversin leicht reduzieren ließen, nahmen jedoch die leichten bis mittelschweren Defekte zu, sodass die Gesamtzahl an defekten Embryonen gleich blieb. Diese Ergebnisse machen es unwahrscheinlich, dass Inversin in einem Wnt-11induzieten Wnt/PCP-Signalweg positioniert ist. 3.6.2. Eine Störung der Achsenstreckung durch EDC8 kann durch Koinjektion von Inversin reduziert werden Bei ECD8 handelt es sich um die extrazelluläre Cystein-reiche Domäne von Frizzled-8, welche zwar ein Wnt-Molekül bindet, deren Signal jedoch nicht weiterleiten kann, da der dafür erforderliche transmembranäre und zytoplasmatische Teil des Rezeptors fehlt. ECD8 wirkt somit als potenter Wnt-Antagonist. Bei Injektionsmengen von 250 pg zeigten bereits ca. 70% der Embryonen massive Störungen der Achsenstreckung, die auch mit Neuralrohrdefekten einhergingen und so einen Score von CEI 3 erhielten (n=151). Diese starken convergent extension Defekte waren durch Koinjektion von Inversin partiellen reversibel (rescue). Abbildung 16: Eine Störung der Achsenstreckung durch den Wnt-Antagonist ECD8 kann durch Koinjektion von Inversin reduziert werden. Dorso-marginale Injektion von ECD8 verursachte, ähnlich wie dominant-negatives Wnt-11, ebenfalls dorsalflexierte Embryonen. Diese Effekte konnten durch Koinjektion von Inversin partiell reduziert werden. Dosisabhängig ließen sich die Defekte abschwächen: Bei 0,5 ng koinjizierter Inversin-RNA erfolgte ein Reduktion der schweren Missbildungen von 78% auf 50% (n=137). Bei der Koinjektion von 1 ng Inversin-RNA lag der Anteil der CEI 3 Defekte Ergebnisse 33 sogar nur noch bei 33% (n=126). Ebenso ließ sich die Prozentzahl der stark dorsalflexierten Embryonen bei Injektion von 125 pg ECD8 (n=91) mit 0,5 ng Inversin-RNA von 26% auf 4% reduzieren (n=76). Die Koinjektion von 1 ng Inversin zeigte ebenfalls eine Abschwächung der CEI 3 Defekte, die jedoch geringer als bei Koinjektion mit 0,5 ng Inversin ausfiel: Noch 10% der Embryonen zeigten eine starke Hemmung der Achsenstreckung. Dies könnte darauf hindeuten, dass 1 ng Inversin bei Koinjektion mit 125 pg ECD8 eine schon zu hoch eingesetzte Dosis war, um die ECD8-Defekte signifikant zu reduzieren. Abbildung 17: ECD8 führt als Wnt-Antagonist zu Veränderungen, welche durch gleichzeitige Injektion mit Inversin vermindert werden können. Embryonen wurden nach dem CEI-Score beurteilt: milde (CEI 1), moderate (CEI 2) und schwere Achsenstreckungsdefekte (CEI 3) (siehe 2.1.5.); Gesamtzahl n in Klammern; Erläuterung, siehe Text; Dieser partielle Rescue liefert einen ersten Hinweis, dass Inversin möglicherweise downstream (unterhalb) von Fz-8 in einem weitgehend unbekannten alternativen Wnt/PCP-Signalweg an der Regulation von morphogenetischen Zellbewegungen und –polarität während der Achsenelongation beteiligt ist. 3.6.3. Koinjektion von Cdc42 und Inversin zeigen eine synergistische Verstärkung der Achsenstreckungsdefekte Die Cyclin-abhängige Kinase 42 (Cdc42) gehört zu der Rho-Familie kleiner GTPasen (Rho, Rac, Cdc42) und wird ebenfalls mit der Regulation morphogenetischer Zellbewegungen bzw. des Zytoskeletts während der Gastrulation in Verbindung gebracht. Cdc42 wird als mögliche Effektorkinase der Wnt/PCP-Signalkaskade zugeordnet [10]. Ob Cdc42 zudem downstream der Proteinkinase C (PKC) im Wnt/Ca2+-Signalweg liegt [7], ist noch unklar. Ergebnisse 34 Sollte Inversin oberhalb (upstream) von Cdc42 lokalisiert sein, sollte es gelingen, Defekte der Achsenstreckung, die durch Inversin bzw. Inversin-MO induziert wurden, mit Hilfe von dominant-negativem bzw. konstitutiv aktivem Cdc42 teilweise zu reduzieren. Bei dorso-marginaler Injektion von 2 ng Inversin lag der Anteil der Achsenstreckungsdefekte bei 79% (n=91). Die Injektion von 100 pg der dominantnegativen Cdc42 Form N17 rief nur in 27% der Fälle dorsalflexierte Embryonen hervor (n=91). Die Koinjektion von Inversin und Cdc42 N17 zeigte keine Abschwächung sondern eine synergistische Verstärkung der Defekte: 95% der Embryonen waren durch eine Hemmung der Achsenstreckung gekennzeichnet (n=145). Abbildung 18: Inversin und die dominant-negative Form von Cdc42 (N17) hemmen die Achsenextension in Xenopus-Embryonen. Bei Koinjektion zeigt sich eine synergistische Verstärkung der Defekte. Embryonen wurden nach dem CEI-Score beurteilt: milde (CEI 1), moderate (CEI 2) und schwere Achsenstreckungsdefekte (CEI 3) (siehe 2.1.5.); Gesamtzahl n in Klammern; Auch die Koinjektion von Inversin-MO und 15-25 pg der konstitutiv aktiven Cdc42 Form L61 resultierte in einer Verstärkung der CEI Defekte. Während bei einer Injektion von 32 ng Inversin-MO in 63% der Fälle die Embryonen rückseitig gekrümmt waren (n=76), bewirkte eine Dosis von 15 pg Cdc42 N17 in ca. 28% (n=25) und 25 pg Cdc42 N17 in 87% der injizierten Embryos eine Inhibition der Achsenstreckung (n=46). Diese Prozentzahlen der CEI Defekte ließen sich bei der Koinjektion von 32 ng Inversin-MO mit 15 pg Cdc42 von 63% auf 78% (n=44) und mit 25 pg Cdc42 auf 97% dosisabhängig steigern (n=62). Ergebnisse 35 Abbildung 19: Inversin-Morpholino (Inv-MO) und die aktive Form von Cdc42 (L61) hemmen die Achsenextension in Xenopus-Embryonen. Bei Koinjektion zeigt sich eine synergistische Verstärkung der Defekte. Weitere Erläuterungen, siehe Text; Dieser synergistische Effekt ließ vermuten, dass Inversin und Cdc42 in unterschiedlichen Wnt-Signalkaskaden an der Regulation von morphogenetischen Zellbewegungen beteiligt sind. Ergebnisse 36 4. Diskussion 4.1. Die regelrechte Nierenentwicklung erfordert eine intakte Funktion von Inversin Die Mutation des Gens invs, das für Inversin kodiert, ist verantwortlich für die Erkrankung des Menschen an der infantilen Nephronophthise (NPH2). Auch bei Xenopus laevis ist Inversin für eine regelrechte Nierenentwicklung erforderlich: Xenopus-Embryonen, die mit Inversin-Morpholino in die prospektive Nierenregion injiziert wurden, entwickelten ab dem Kaulquappenstadium 43-45 Ödeme im Bauchbereicht (siehe 3.1.). Da die Injektion von Inversin-MO in Zebrafischembryonen in deren Vornieren eine Zystenformation induzierte [51], lässt sich der ÖdemPhänotyp in Xenopus laevis möglicherweise als Resultat einer gestörten Nierenbildung und –funktion infolge der Depletion von Inversin erklären. Welche Signalwege beeinflussen die Nierenentwicklung? 4.2. Inversin reguliert morphogenetische Zellbewegungen Eine entscheidende regulative Rolle während der Nephrogenese spielen WntSignale. In Experimenten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass Inversin den klassischen Wnt/ß-Catenin-Signalweg inhibiert. Zudem hat Inversin möglicherweise eine positive Funktion in alternativen Wnt/PCP-Signalwegen an morphogenetischen Regulationsprozessen während der Achsenentwicklung bei der Gastrulation und Neurulation [51]. Simons et al. konnten zeigen, dass sowohl durch Überexpression als auch durch Depletion von Inversin eine Störung der Achsenstreckung in Xenopus laevis induziert wurde. In dieser Arbeit stellte sich heraus, dass analog der Wirkung von Inversin-MO auf die Achsenextension in vivo, auch die animale Injektion von Inversin-MO die durch Aktivin hervorgerufene Elongation animaler Kappen in vitro hemmte (siehe 3.3.). Eine äquimolare Menge an Kontroll-MO zeigte hingegen keinerlei Einfluss auf die Streckung der Explantate. Durch Koinjektion von Inversin-RNA konnte die hemmende Wirkung von Inversin-MO reduziert werden, so dass die Explantate in Aktivin wieder normal elongierten. Dies bewies, dass die durch Inversin-MO induzierten Defekte spezifisch waren. Mit Hilfe einer rt-PCR ergab die Analyse mesodermaler Marker, dass das Ausbleiben der Elongation durch Inversin-MO nicht Diskussion 37 einer gestörten Mesoderminduktion durch veränderte Genexpression, sondern einer gestörten Konvergenz und Extension neuroektodermaler und mesodermaler Zellen zugeschrieben werden konnte (siehe 3.4.). Die Veränderungen sind demnach nicht Folge einer Beeinflussung des Zellschicksals sondern der Zellpolarität. Die Tatsache, dass die mesodermale Induktion und Zelldifferenzierung nicht beeinflusst waren, macht eine maßgebliche Beteiligung des klassischen Wnt-Signalweges an der Elongation des Mesoderms unwahrscheinlich. Dies bedeutet, dass sowohl die Defekte in vivo als auch in vitro nach Depletion von Inversin Folge einer gestörten Regulation von morphogenetischen Zellbewegungen und Zellpolarität während Gastrulation und Neurulation waren. Wie kommt es zu einer Störung der Morphogenese? Bevor morphogenetische Zellbewegungen wie die medio-laterale Interkalation zu einer konvergenten Ausdehnung führen, verändern die betroffenen mesodermalen Zellen ihre Form: Sie entwickeln kleine Zellausläufer, Lamellipodien, die ganz zufällig orientiert sind. Mit Beginn der Gastrulation verlängern sich die Zellen in mediolateraler Richtung, wodurch die Lamellipodien an den medialen und lateralen Enden der Zelle stabilisiert werden [28, 64]. Diese Formveränderungen werden vom Zytoskelett vorgenommen, einem intrazellulären Gerüst, das die Zellform kontrolliert und auch an der Zellbewegung beteiligt ist. Zellen mit dieser charakteristischen Form interkalieren nun mit benachbarten Zellen in der Mittellinie (Konvergenz), wodurch das gesamte Gewebe schmaler wird und sich in anterio-posteriorer Richtung ausdehnt (Extension der Körperachse, siehe 1.3.). Die aktive Bewegung, durch die es zur konvergenten Extension kommt, beschränkt sich auf die Enden dieser elongierten bipolaren Zellen, die aktive Lamellipodien besitzen. Demnach kann eine fehlregulierte Polarisierung, in diesem Fall durch Depletion von endogenem Inversin, morphogenetische Zellbewegungen während der Achsenentwicklung unterschiedlich beeinflussen: Entweder kann die Polarität der Zellen oder aber die Stabilisierung der Lamellipodien und damit die aktive Migration der Zellen gestört werden. Eine weitere Möglichkeit wäre eine Beeinflussung der Morphogenese über Cadherine, welche in Anwesenheit von Ca2+ Zell-Zell-Adhäsion kontrollieren und auch an Zellmigration beteiligt sind [38]. Diese Membranproteine interagieren mit dem Zytoskelett der Zelle über die Verbindung ihrer zytoplasmatischen Schwänze mit den intrazellulären ß-Cateninen und können so an der Übertragung von Signalen in das Zellinnere Teil haben. Nürnberger et al. konnten nachweisen, dass Inversin Diskussion 38 einen Komplex mit ß-Catenin und N-Cadherin an der Zellmembran konfluierender Zellen bildet [42]. Während der medio-lateralen Interkalation ist es notwendig, dass die Ca2+-abhängige Zell-Zell-Adhäsion herunterreguliert wird, damit morphogenetische Zellbewegungen stattfinden können. Dies wird durch die Reduktion von C-Cadherin bewirkt [6]. Während die Zellen jedoch zur Mittellinie konvergieren und sich in anterio-posteriorer Richtung ausdehnen, müssen die migrierenden Zellen auf darunter liegende Zellen Zug ausüben, um sich immer entlang der medio-lateralen Achse zwischen Zellen zu schieben. Vielleicht könnte Inversin zusammen mit N-Cadherin und ß-Catenin als Adhäsions-Komplex fungieren, mit dem die migrierende Zelle den notwendigen Zug ausüben kann. Die Depletion von Inversin würde so zu einer gestörten Adhäsion zwischen den Zellschichten führen und folglich eine Störung der konvergenten Extension bewirken. Zusammenfassend lassen die gain of function und loss of function Experimente die Vermutung zu, dass Inversin bei der Regulation morphogenetischer Zellbewegungen während der Achsenstreckung des Vertebraten eine wichtige Rolle spielt. Eine Möglichkeit, die Funktion von Inversin in diesen Mechanismen zu verstehen, ist die Untersuchung der Signalwege, über die Inversin seine Wirkung vermitteln könnte. 4.3. Funktion von Inversin in alternativen Wnt-Signalwegen Der oben beschriebene Prozess spiegelt Merkmale der planaren Zellpolarität (PCP) wider, die zuerst bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster in Epithelien von Flügel und Auge untersucht wurde (siehe 1.2.4.). Viele Gene werden mit der Regulation der konvergenten Extension in Verbindung gebracht. Ein großer Anteil davon ist den Drosophila PCP-Genen homolog, was dafür spricht, dass der PCPSignalübertragungsweg ebenfalls in Vertebraten konserviert ist. Es verdichten sich jedoch Hinweise, dass es darüber hinaus weitere alternative Wnt-Signalwege gibt, deren Mechanismen und Funktion in komplexeren Geschehen der Achsenstreckung weitgehend ungeklärt sind. Als Beispiel sei hier der Wnt/Ca2+-Signalweg genannt, bei dem es zu klären gilt, ob eine Abhängigkeit der Signalkaskade von Dishevelled (Dsh) besteht oder nicht. Weiterhin ist auch unklar, ob Cdc42 als Effektorkinase im PCP/Wnt-Signalweg oder auch in der Wnt/Ca2+-Signalkaskade eine Rolle spielt. Komplizierend kommt hinzu, dass es zur gegenseitigen Wechselwirkung von Molekülen und damit zu einer Interaktion der verschiedenen Signalkaskaden kommen kann: So können zum Beispiel PKC und CamKII, die während des Diskussion 39 Wnt/Ca2+-Signalweges aktiviert sind, den klassischen Signalweg auf unterschiedlichen Levels hemmen [25]. Wie ist der Signalweg von Dishevelled? Das Multidomänprotein Dsh, welches Inversin bindet [51], nimmt eine wichtige Funktion in Wnt-Signalwegen ein, da es am Kreuzungsweg des klassischen und der alternativen Signalkaskaden liegt (siehe 1.2.2. und [4]). Da wenig über die Signalübertragung von Fz zu Dsh und über die Weiterleitung des Signals bekannt ist, versucht man durch Identifizierung neuer Bindungspartner von Dsh dessen Regulationsmechanismen und Funktion besser zu verstehen. Einige mit Dsh-interagierende Proteine können regulierend in die Weiterleitung der Dsh-Signale eingreifen und die Funktion eines „molekularen Schalters“ (switch) zwischen verschiedenen Wnt/Fz/Dsh-Signalübertragungswegen einnehmen: Die Casein-kinase 1 (CK1) wirkt als Stimulator des klassischen WntSignalweges, hemmt aber die Aktivierung von JNK und folglich die Zellpolarisierung und Morphogenese bei der Gastrulation [45]. Im Gegensatz dazu inhibiert Naked cuticle (Nkd), bei gleichzeitiger Bindung einer regulatorischen Untereinheit der Protein-Phosphatase Typ 2A (PR72), die Dsh-Funktion im klassischen WntSignalweg, während Nkd und PR72 zusammen an der Regulation des PCP/WntSignalweges in Drosophila und Vertebraten beteiligt sind [8, 71]. Simons et al. konnten zeigen, dass Inversin Dsh über seinen C-Terminus bindet und damit wie Dsh am Kreuzungsweg mehrerer Signalkaskaden liegt. Da Inversin den klassischen Wnt-Signalweg hemmt, aber eine wichtige Rolle bei der Kontrolle morphogenetischer Zellbewegungen spielt, könnte Inversin ebenfalls die Funktion eines „molekularen Schalters“ (switch) einnehmen. Dies würde bedeuten, dass bei Depletion von Inversin zum einen die Hemmung des klassischen Wnt-Signalweges, zum anderen aber auch die positive Regulation alternativer Wnt-Signalwege wegfallen würde. Auch in der Nierenentwicklung spielen der switch zwischen klassischem und alternativen Wnt-Signalwegen und damit auch Inversin als Schaltmolekül eine entscheidende Rolle: Wie in der Einleitung schon beschrieben, sind klassische WntSignale in der frühen Nierenentwicklung essentiell für die Induktion des metanephrogenen Mesenchyms und für das Aufzweigen der Ureterknospe [60]. In späteren Stadien führt eine persistierende Aktivierung von Wnt-ß-Catenin-Signalen bei Mäusen jedoch zu Zystennieren [46]. Diversin weist wie Inversin AnkyrinWiederholungen (Ankyrin-repeats) am N-Terminus des Proteins auf. Es ähnelt damit Diskussion 40 Inversin jedoch nicht nur strukturell sondern auch funktionell, da es als Schaltmolekül wie Inversin den klassischen Wnt-Signalweg hemmt, während es gleichzeitig alternative Wnt-Signalwege positiv beeinflusst. Durch Koinjektion von Diversin kann die durch Inversin-MO induzierte Zystenbildung im Zebrafisch verhindert werden [51]. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gestörte Nierenentwicklung durch Depletion von Inversin-RNA Folge einer fehlerhaften Inhibition des klassischen WntSignalweges während bestimmter Entwicklungsphasen ist. Die zudem resultierende gestörte positive Regulation alternativer Wnt-Signalwege scheint mitverantwortlich für die defektive Entwicklung und Elongation des Tubulusapparates, sodass sich Zystennieren bilden. Bezüglich des Bindungsverhaltens von Inversin und Dishevelled ist es interessant, das Expressionsmuster von endogenem Inversin hinzuzuziehen (siehe 3.5). Die rtPCR von Inversin-RNA zeigte einen Nachweis von Inversin-Transkripten zu Beginn der Gastrulation vor allem in ventro-marginalen und animalen Explantaten. Dorsomarginale und vegetale Teile lassen eine nur schwache Expression erkennen. Dsh und andere Komponenten der Wnt-Signalwege sind hingegen vor allem dorsomarginal konzentriert [33]. Die ungleiche Verteilung von Inversin-RNA im Embryo könnte darauf hinweisen, dass Inversin als Antagonist des klassischen WntSignalweges dazu beiträgt auf der ventralen Seite des Embryos dorsalisierende Wnt/Dsh/ß-Catenin Signale zu antagonisieren. Für die Regulation von morphogenetischen Zellbewegungen im dorsalen Mesoderm scheint jedoch, dem Expressionsmuster nach zu urteilen, nur wenig Inversin erforderlich zu sein. Die starke Expression in animalen Explantaten lässt vermuten, dass Inversin an der Konvergenz und Extension neuroektodermalen Gewebes beteiligt sein könnte oder auch eine Rolle bei der Differenzierung des Ektoderms spielt. Zusätzliche Untersuchungen müssen die Frage klären, welche Funktionen Inversin in den unterschiedlichen Regionen des Embryos hat und wie diese zeitlich reguliert werden. Die Komplexität und die noch unzureichenden Kenntnisse über die alternativen WntSignalwege machen es schwierig, Inversin einer bestimmten Signalkaskade zuzuordnen und genauer zu platzieren. Epistase-Experimente im Frosch sollten zeigen, mit welchen Komponenten alternativer Wnt-SignaleInversin möglicherweise in Zusammenhang gebracht werden kann (siehe 3.6.). Ist Inversin unterhalb von Wnt-11 an der Regulation alternativer Wnt-Signalwege beteiligt? Starke Defekte der Achsenstreckung mit einem CEI Score Diskussion 41 3, die durch Injektion von DN-Wnt-11 induziert wurden, konnten durch Koinjektion von Inversin nur geringfügig vermindert werden. Zudem blieb die Gesamtzahl der defekten Embryonen gleich (siehe 3.6.1.). Wie ist das zu erklären? Wnt-11 wirkt als Ligand in 2 Signalwegen. Zum einen stimuliert Wnt-11 die Wnt/PCP-Signalkaskade, zum anderen wird Wnt-11 als Ligand der Wnt/Ca2+-Signalkaskade zugeschrieben. Die dosisabhängige, jedoch nur geringe und damit wenig aussagekräftige Reduktion der CEI-3-Defekte durch Inversin könnte darauf hinweisen, dass Inversin vielleicht in einem der beiden Wege unterhalb von Wnt-11 liegt. Inversin würde so einen der beiden Wege partiell wieder herstellen, während der zweite Weg durch DN-Wnt-11 inhibiert und damit defekt bleiben würde. Dies würde erklären, warum zwar die schweren Defekte leicht abgeschwächt werden konnten, die Gesamtzahl an defekten Embryonen jedoch gleich bliebt. Da eine Interaktion von Inversin mit dem CalciumSensor-Protein Calmodulin nachgewiesen wurde [72], wäre es denkbar, dass Inversin eine Rolle in der Wnt/Ca2+-Signalkaskade unterhalb von Wnt-11 spielt. Der schwache Effekt von Inversin auf den Phänotyp von DN-Wnt-11 injizierten Embryonen könnte jedoch auch damit erklärt werden, dass eventuell zu hohe Dosen DN-Wnt-11-RNA bei der Injektion eingesetzt wurden, sodass die resultierenden Defekte zu stark waren, um durch Inversin signifikant reduziert zu werden. Eine Beteiligung von Inversin an Wnt-11 vermittelten Signalwegen bleibt eine offene Frage. Es wäre diesbezüglich wichtig die Wirkung von Inversin auf Effektoren des Wnt/Ca2+Signalweges zu analysieren, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erzielen. Während die Koinjektion von DN-Wnt-11 mit Inversin in zwei dorsale Blastomere im 4-Zell-Embryo keine eindeutigen Effekte zeigte, konnten Störungen der Achsenstreckung nach Injektion von ECD8 (extracellular cystine-rich domain of frizzled-8) durch Koinjektion von Inversin-RNA dosisabhängig partiell reduziert werden (siehe 3.6.2.). Dieses Ergebnis gibt einen ersten Hinweis auf eine mögliche Funktion von Inversin über Xfz-8 in einem weitgehend unbekannten alternativen WntSignalweg, der essentiell für die Zellpolarisierung und Morphogenese bei der Gastrulation ist. Es ist zwar beschrieben, dass Xfz-8 sowohl eine Rolle im klassischen als auch in alternativen Wnt-Signalwegen spielt, aber auch Xfz-8 wurde bisher keine der alternativen Wnt-Signalkaskaden zugeordnet [9, 20, 47, 68]. Zudem gibt es Hinweise auf einen weiteren, noch wenig beschriebenen Signalweg, der von Xfz-8 stimuliert über die Aktivierung von SAPK/ERK Kinase-1 (SEK-1) und JNK zu Apoptose in Krallenfrosch-Embryonen im Gastrula-Stadium führt [30]. Über die Diskussion 42 Regulation und Rolle der Apoptoseinduktion durch Wnts in der Embryonalentwicklung und Pathophysiologie ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Ob Inversin im Zusammenhang mit Xfz-8 eine mögliche Funktion in diesem sehr fraglichen, nur von Lisovsky et al. beschriebenen Wnt/Apoptoseweges innehat, müsste geklärt werden. Weitere Untersuchungen müssen den Fragen nachgehen, welche weiteren Komponenten unterhalb von Xfz-8 und Inversin eine Rolle spielen, welcher Ligand oder welche Liganden an Xfz-8 binden, ob möglicherweise Inversin direkt Xfz-8 bindet und es somit Interaktionen mit anderen alternativen WntSignalwegen gibt und zu welcher Zeit und in welchen Gewebetypen dieser Signalweg über Xfz-8 und Inversin aktiviert wird. Weitere im Frosch durchgeführte Epistase-Experimente weisen darauf hin, dass Cdc42, welches zu den kleinen GTPasen zählt und dem PCP/Wnt-Signalweg zugeordnet wird, nicht als Effektorkinase von Inversin zu fungieren scheint (siehe 3.6.3.): Die Koinjektion von Inversin verstärkte die durch dominant-negatives Cdc42 induzierten Defekte anstatt sie zu reduzieren. Umgekehrt konnten mit Inversin-MO induzierte Defekte nicht durch konsekutiv aktives Cdc42 reduziert werden. Diese Daten weisen darauf hin, dass Inversin und Cdc42 in verschiedenen Signalwegen regulativ auf die Morphogenese wirken. In Zellkultur wurde zudem in weiteren Experimenten unserer Arbeitsgruppe untersucht, ob die Überexperession von Inversin die Aktivierung der c-Jun-Nterminalen Kinase (JNK) im PCP/Wnt-Signalweg induzieren kann. Auch dieser Versuch zeigte kein eindeutiges Ergebnis. Zusammenfassend sprechen die experimentellen Daten gegen eine Beteiligung von Inversin an Wnt-11-, Fz-7-, Cdc42- und JNK-vermittelten PCP-Signalen und für einen möglicherweise neuen Fz-8/Dsh/Inversin-Signalweg. Diskussion 43 4.4. Ausblick Da Inversin und Fz-8, wie oben diskutiert, möglicherweise zusammen in einem bisher nicht beschriebenen alternativen Wnt-Signalweg an der Regulation von morphogenetischen Zellbewegungen und –polarität beteiligt sind, ist es von besonderem Interesse, dass Xfz-8 wie Inversin eine Rolle bei der Nephrogenese spielt. Bei der Injektion von Xfz-8-Morpholino in die zukünftige Nierenregion von wurde von Satow et al. ein Ödem-Phänotyp beschrieben, der einer Inversin-MO injizierten Kaulquappe sehr ähnelt [47]. In der Immunhistochemie-Analyse zeigten die Kaulquappen Veränderungen sowohl im Bereich des Ductus als auch des Tubulusapparates der Vorniere. Histologische Schnitte ließen dilatierte Tubulusstrukturen erkennen, wobei die Tubulusepithelzellen irregulär angeordnet und rund statt kubisch geformt waren. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Depletion von Xfz-8 die zelluläre Morphogenese negativ beeinflusst und dadurch die regelrechte Formation der Epithelzellen des Tubulusapparates und des Ductus der Vorniere gestört hat. Sowohl eine immunhistochemische als auch eine sich anschließende histologische Untersuchung sollten klären, ob Inversin-MO wie Xfz-8MO die Nephrogenese beeinflusst. Diskussion 44 5. Zusammenfassung Die infantile Nephronophthise (NPH2) ist eine autosomal-rezessiv vererbte, zystische Nierenerkrankung, die schon zwischen dem ersten und dritten Lebensjahr zum terminalen Nierenversagen führt. Zudem kann NPH2 mit einem situs inversus einhergehen. Das verantwortliche mutierte Gen invs kodiert für Inversin, ein Protein, das Dishevelled bindet und Einfluss auf die Wnt-Signaltransduktion nimmt. Auch in Xenopus laevis spielt Inversin eine entscheidende Rolle bei der Nephrogenese. Die Depletion von Inversin in der prospektiven Nierenregion von Xenopus-Embryonen führte zu generalisierten Ödemen, die möglicherweise auf eine gestörte Nierenentwicklung zurückzuführen sind. Diese Arbeit untersucht die Funktion von Inversin in alternativen Wnt/PCPSignalübertragungswegen. Es konnte nachgewiesen werden, dass Inversin an der Regulation von Zellbewegung und –polarität bei der Morphogenese während und nach der Gastrulation beteiligt ist, die durch alternative Wnt-Signalwege beeinflusst werden. Im Animalkappen-Assay hemmte Inversin-MO die Elongation animaler Explantate, welche durch Koinjektion von Inversin-RNA reversibel war. rt-PCRAnalysen zeigten, dass durch Inversin-MO nicht die Genexpression bzw. das Zellschicksal verändert wurde, sondern das Ausbleiben der Elongation Folge einer gestörten Konvergenz und Extension neuroektodermaler und mesodermer Zellen war. Das dominant-negative Frizzled-8 (ECD8) induzierte Defekte der Achsenstreckung, die durch Koinjektion mit Inversin reduziert werden konnten. Diese EpistaseExperimente legen die Vermutung nahe, dass Inversin an einem Fz-8-abhängigen, bisher nicht beschriebenen alternativen Wnt-Signalweg funktionell beteiligt ist. Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen die Theorie von der Funktion von Inversin als Schaltermolekül des Wnt-Signalweges [51]. Danach ist die Hemmung von Wnt/ßCatenin und die Aktivierung von alternativen Wnt-Signalen zu einem bestimmten Zeitpunkt der Nierenentwicklung für die korrekte Entwicklung und Elongation des Tubulusapparates notwendig. Zukünftige Studien sollten sich mit der Frage befassen, ob Xfz-8 und Inversin zusammen in einem gemeinsamen Signalweg Einfluss auf die Nierenentwicklung in Xenopus laevis nehmen. Zusammenfassung 45 6. Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Adler, P.N.. 2002. 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Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Domänenstruktur von Inversin (NPHP2) aus Eley et al. [12]. …………..2 Abbildung 2: Übersicht über die alternativen Wnt-Signalwege; .................................. 5 Abbildung 3: Radiäre und medio-laterale Interkalation. .............................................. 6 Abbildung 4: Entwicklungszyklus des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Stadieneinteilung nach Nieuwkoop und Faber (1967), Zeitangaben entsprechend einer Entwicklung auf Raumtemperatur (23°C)............................. 8 Abbildung 5: Der Anlageplan eines frühen Xenopus-Embryos (Fate map) nach Moody (www.xenbase.com). ............................................................................ .11 Abbildung 6: Mikrodissektion: Nach erfolgter animaler Injektion im 4-Zellstadium werden die im Blastula-Stadium (Stadium 8-9,5) explantierte Animalkappen mit oder ohne Aktivin bis zum Neurula-Stadium (Stadium 18) kultiviert. …………..13 Abbildung 7: Die dorso-marginale Injektion beeinflusst die Achsenstreckung. ……..14 Abbildung 8: Ödemphänotyp im Stadium 45: Injektion von Inversin-Morpholino (MO) rechtseitig in ein ventro-marginal-laterales Blastomer führte ab dem Stadium 42 zu einer Ödembildung im Bereich der Bauchhöhle. .......................................... 22 Abbildung 9: Die dorso-marginale Überexpression von Inversin hemmt die Elongation der Körperachse in Xenopus laevis. .................................................................. 23 Abbildung 10: Statistische Auswertung der phänotypischen Effekte nach dorsomarginaler Injektion von Inversin im 4-Zellstadium. ………………………………24 Abbildung 11: Einfluss von Inversin-Morpholino auf die Elongation von Aktivininduzierten Explantaten. .................................................................................... 25 Abbildung 12: Statistische Auswertung des animal cap assays: Inversin-MO blockte die Elongation von im Blastula-Stadium explantierten animalen Kappen, die in Aktivin kultiviert wurden… ................................................................................. 26 Abbildung 13: Die Depletion von Inversin hat keinen Effekt auf die Expression mesodermaler Marker. ……………………………………………………………….27 Abbildung 14: rt-PCR-Analysen zeigen den Nachweis von Inversin-Transkripten in der frühen Gastrula............................................................................................ 29 Abbildung 15: Koinjektion von mInversin hat keinen eindeutigen Effekt auf DN-Wnt11 injizierte defekte Embryonen ........................................................................ 31 Abbildung 16: Eine Störung der Achsenstreckung durch den Wnt-Antagonist ECD8 kann durch Koinjektion von Inversin reduziert werden. …………………………..32 Abbildung 17: ECD8 führt als Wnt-Antagonist zu Veränderungen, welche durch gleichzeitige Injektion mit Inversin vermindert werden können…………………. 33 Abbildung 18: Inversin und die dominant-negative Form von Cdc42 (N17) hemmen die Achsenextension in Xenopus-Embryonen..……………………………………34 Abbildung 19: Inversin-Morpholino (Inv-MO) und die aktive Form von Cdc42 (L61) hemmen die Achsenextension in Xenopus-Embryonen. ................................... 35 Anhang 50 7.2. Abkürzungsverzeichnis AC ADPKD BSA cDNA CamKII CEI Cdc42 Chd CK1 C-Terminus Daam DNA DN-Wnt-11 Dsh DTT ECD8 E.coli EDTA EGTA Fz GTPase HEPES Inv INVS IU JNK MDCK MDCK MEMFA mInv MMR MO MOPS mRNA MS 222 NBT NLS Nkd NPH/NPH2 NPHP (1-4) N-Terminus ODC PBS PCP PKC PMSF animal cap/ animale Kappe Autosomal-dominate polyzystische Nierenerkrankung Bovines Serum Albumin copy Desoxy-Ribonukleinsäure Calcium/Calmodulin-abhängige Kinase II Convergent extension impairment, Index zur Bewertung der Hemmung der Achsenstreckung in Xenopus Cyclin-dependent Kinase 42 chordin Caseinkinase1 Carboxyl-Terminus Dsh-associated activator of morphogenesis Desoxy-Ribonukleinsäure dominant-negatives Wnt-11 Dishvelled Dithiotreitol extracellular cystine-rich domain of frizzled-8 Escherichia coli Ethylendiamin-tetraessigsäure Ethylen-Glykol-Tetraessigsäure Frizzled-Rezeptor Guanosine-Triphosphatase (RhoA und Rac) 4-2(Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat Inversin Inversin-Gen international units c-Jun-N-terminale Kinase Medulläre Zystennieren Madin-Darby canine kidney cell line Fixierungslösung bestehend aus MOPS, EGTA, MgSO4 und Formaldehyd mouseInversin Mark’s Modified Ringer Morpholino-Antisense-Oligonukleotid 3-[N-morpholino] propanesulphonic acid messenger Ribonukleinsäure Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Nitrotetrazolium-Blau-Chlorid nukleäres Lokalisationssignal Naked cuticle Nephronophthise/infantile Nephronophthise Nephronophthise Protein (Typ 1-4) Amino-Terminus Ornityldecarboxylase Phosphate Buffered Saline Planar-Cell-Polarity Proteinkinase C Phenylmethylsulfonylfluorid Anhang 51 PTW RNA RNAse rt-PCR SDS SEK-1 Taq TEMED UpM. Vg-1 und VegT WE Wnt XInv Xbra PBS-Tween Ribonukleinsäure Ribonuklease reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Sodium dodecyl sulphate SAPK/ERK Kinase-1 Thermus aquaticus N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Umdrehungen pro Minute Mitglieder der Familie des Transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGF-ß) whole embryos/ ganze Embryonen Die Wnt-Proteinfamilie der Wirbeltiere ist mit einem Protein aus Drosophila verwandt und wird auch nach ihm benannt; dieses Protein wird von dem Gen wingless (flügellos) codiert. Xenopus Inversin Xenopus brachyury Anhang 52 7.3. Verwendete Geräte und Materialien 1. Sigma-Aldrich; Steinheim; Deutschland 2. Horst Kähler; Bedarf für Forschung und Lehre; Hamburg; Deutschland; Xenopus Express; Le Bourg, Frankreich 3. Gerbu; Gaiberg; Deutschland 4. Roth; Karlsruhe; Deutschland 5. Amersham Biosciences; Uppsala; Schweden 6. Stemi 2000; Zeiss, Göttingen; Deutschland 7. IM 300 Microinjector; Narishige; Tokyo; Japan 8. Oxford Manipulator; Micro Instruments; Oxford; UK 9. Glass Thinw W/Fil 1.OMM; World Precision Instruments; Sarasota; USA 10. Werkstatt des Physiologischen Instituts; Freiburg; Deutschland 11. Pinzetten Inox Nr.5, neoLab Migge, Heidelberg 12. Merck, Darmstadt, Deutschland 13. MZ95, KL1500 LCD; Leica; Wetzlar; Deutschland 14. Adobe Photoshop; Adobe Systems Inc., San Jose; USA 15. New England BioLabs; Frankfurt am Main; Deutschland 16. MBI; Fermentas; St. Leon-Rot; Deutschland 17. Invitrogen; Karslruhe, Deutschland 18. Roche Diagnostics GmbH; Mannheim; Deutschland 19. mMESSAGE mMACHINE SP6, T7 (High Yield Capped) RNA Transcripion Kit; Ambion Inc.; Austin; USA 20. RNeasy Mini Kit (250); Qiagen; Hilden; Deutschland 21. Spectrophotometer DU 640; Beckman; Fullerton; USA 22. Gene Tools; Philomath; USA 23. SuperScript First-Strand Synthesis System; Invitrogen; Karlsruhe; Deutschland 24. PTC-200 Peltier Thermal Cycler; MJ Research; Watertown; USA 25. Taq200TM DNA Polymerase; Stratagene; Amsterdam; Niederlande 26. Hermann GbR Synthetische Biomoleküle; Freiburg; Deutschland 27. PolyScreen PVDF Transfer Membrane; NEN Life Science Products; Frankfurt; Deutschland 28. Fuji Medical X-Ray Film 100 NIF; FUJI Photo Film (Europe); Düsseldorf; Deutschland Alle weiteren nicht gekennzeichneten Lösungen von den Firmen Roth, Sigma und Merck bezogen. Anhang 53 7.4. Publikation Simons, M., J. Gloy, A. Ganner, A. Bullerkotte, M. Bashkurov, C. Krönig, B. Schermer, T. Benzing, O. A. Cabello, A. Jenny, M. Mlodzik, B. Polok, W. Driever, T. Obara, and G. Walz. 2005. Inversin, the gene product mutated in nephronophthisis type II, functions as a molecular switch between Wnt signaling pathways. Nat Genet 37:537-43. Anhang 54 7.5. Curriculum vitae Name Corinna Krönig Geburtsdatum 19.08.1982 Geburtsort Gütersloh Schulausbildung 1988 – 1992 Grundschule Blücherschule, Gütersloh 1992 – 2001 Evangelisch Stiftisches Gymnasium, Gütersloh 09/98-04/99 Wells Cathedral-School, England 2001 Abitur Studium Seit WS 2001 Studium der Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität 09/2003 Physikum 09/04-04/05 Experimentelle Doktorarbeit in der Nephrologie (Innere Medizin) Famulaturen 03/04 – 04/04 Famulatur: Innere Medizin, Kaiser-Franz-Joseph-Spital, Wien 08/05 – 09/05 Famulatur: Innere Medizin, St. Michael’s Hospital, Dun Laoghaire, Irland Freizeitengagement Musik: 1987-2002 privater Querflötenunterricht diesbezüglich: Absolvierung verschiedener aus London geführter Prüfungen der „Associated Board of the Royal School of Music” von Grad 1-8 mit Auszeichnungen, mehrfache Teilnahme (1991, 1993, 1995, 1997, 1998 und 2000) an „Jugend musiziert“ mit ersten und zweiten Preisen sowie Förderpreisen auf Regional- und Landeswettbewerb 2000 Teilnahme mit gutem Erfolg am Bundeswettbewerb seit WS 2001 Mitglied im Studentenorchester der katholischen Hochschulgemeinde Anhang 55 7.6. Danksagung Ein herzliches Dankeschön an alle, die mich beim Zustandekommen dieser Doktorarbeit unterstützt haben! Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer und Doktorvater PD Dr. Joachim Gloy bedanken, der mir neben dem Thema für diese Arbeit auch einen ausgezeichneten Arbeitsplatz in einer unglaublich netten Arbeitsgruppe überließ. Unter diesen Voraussetzungen konnte ich lernen im Team wissenschaftlich zu arbeiten, wobei sein Rat und die kritische Begleitung der Arbeit, aber auch die Tipps meiner Arbeitskollegen, ganz entscheidend für das Gelingen des Projektes waren. Meinem Postdoc Manuela Horndasch möchte ich herzlichst für ihre einzigartige Hilfsbereitschaft, ihre fachliche Zusammenarbeit danken. Mit Kompetenz Manuelas Hilfe und ihre freundschaftliche und Simone Diederichsens ausgezeichneter technischer Assistenz während der Laborphase sowie den vielen Aufmunterungen ihrerseits entstand eine Arbeitsatmosphäre, in der das Experimentieren Spaß gemacht hat. Vielen Dank! Ganz entscheidend trugen auch meine „Vordoktoranden“ zum Gelingen dieser Arbeit bei. Mein Dank gilt allen voran Axel Bullerkotte und Benjamin Goebel, den „Komikern“, die mich bei meinen ersten wissenschaftlichen Gehversuchen (die Kunst einen Frosch zu „quetschen“/Mikroinjektion und vieles mehr) hervorragend eingelernt und betreut haben und es verstanden, mich an frustrierenden Experimentiertagen in der Anfangsphase humorvoll zu motivieren. Weiterhin danke ich Soeren Lienkamp und meinem Nachdoktoranden Christian Mattonet für ihre Disskusionsbereitschaft und Soeren zudem für seinen mitreißenden forscherischen Enthusiasmus. Zahlreiche Helferinnen und Helfer aus dem Walz-Labor standen mir mit Tipps und Tricks zur Seite. Stellvertretend möchte ich Daniel Romaker, Matias Simons, Athina Ganner, Albrecht Kramer-Zucker und Alexandra Schmitt danken. Nicht zuletzt gilt mein Dank meinen Freunden und Bekannten, zum einen für die kritische Korrektur der Dissertationsschrift zum anderen für ihre freundschaftliche Unterstützung. In diesem Sinne danke ich ganz besonders meinem Freund Malte Schwardt. Schließlich möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir ein Medizinstudium ohne Zeitdruck und Sorge ermöglichen, mit Interesse meine Fortschritte begleiten und mich dabei zu jeder Zeit und auf jede erdenkliche Art unterstützen. Danksagung
