Einführungsvortrag - Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen

Klassische Serologie in der modernen Labordiagnostik
• Klassische serologische Untersuchungen: Definition und Bedeutung
• Serologische Untersuchungsmethoden: Übersicht und Anwendung
(SSA/RBT, SLA, HAH, IDT, MAR, KBR, SNT….)
Joachim Borgwardt
Einführungs-Vortrag,
Fortbildungsveranstaltung der Länder Mai 2014
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt
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Rechtsgrundlagen zur Anwendung serologischer Testmethoden
● Diagnose-Handbuch, Entscheidung der Komm. 2003/422/EG vom 26.05.2003
● Gesetz zur Vorbeugung vor und Bekämpfung von Tierseuchen (TierGesG) vom
22.05.2013 (BGBl. I S. 1324, 3942) in Kraft ab 1. Mai 2014 (§ 45, TierGesG)
● Methodensammlung des Friedrich-Löffler-Institutes (FLI), auf der Grundlage von § 27
des TierGesG (ehem. § 4 TierSG), Stand Januar 2014
● VO über anzeigepflichtigen Tierseuchen (TierSeuchAnzV) i. d. Fassg. der Bekanntm.
vom 19. Juli 2011 (BGBl. I S. 1404)
● VO über meldepflichtige Tierkrankheiten (TKrMeldpflV) i. d. Fassg. der Bekanntm.
vom 11. Februar 2011 (BGBl. I S. 252)
● Liste der zugelassenen Mittel nach § 11 TierGesG (ehem. § 17 c TierSG)
● Bundesmaßnahmekatalog-Tierseuchen
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Serologische Untersuchung
Die serologische Untersuchung ist eine zielgerichtete
labordiagnostische Tätigkeit zur qualitativen und
quantitativen Bestimmung von definierten
immunologischen Reaktionspartnern in flüssigen
biologischen Systemen.
zielgerichtet:
zielorientiert, selektiv, ich muss vorher festlegen welche Methode ich nutze.
labordiagnostisch:
Invitro-Immuntest, Tätigkeit unter standardisierten Bedingungen, Qualitätsmanagement.
definiert:
konkret, Art des Suchziels, ich muss vorher entscheiden nach was ich suche.
immunologische Reaktionspartner (Ag, Ab):
Ag: Krankheitserreger und immunogene körperfremde Stoffe mit der Fähigkeit der
Auslösung einer Immunanreaktion (Antigene, Antikörper, Proteine, Moleküle, u.a.).
Ab: Humorale und zelluläre körpereigene, spezifische Abwehrsysteme mit der
Fähigkeit der Erkennung, Markierung und Inaktivierung von Krankheitserregern und
immunogenen körperfremden Stoffen.
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in vivo Reaktionen
Diese
Reaktionen
sind in vitro
möglich und
somit als
serologische
Testsysteme
diagnostisch
nutzbar.
Testbasis
Spezifischer
Antigen –
Antikörper –
Kontakt
Quelle: www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)
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Die Kinetik, Quantität und Wirkung der Ig-Klassen sind bei einer Infektion
tierartlich, erregerspezifisch und individuell sehr verschieden, allgemein kann aber
folgendes gelten:
lg M:
Ist bei einer Infektion zuerst nachweisbar, ist auch an unspezifischen und
paraspezifischen Reaktionen beteiligt, Ig M persistiert länger als lg G1.
Ig D:
Bestandteil der B-Lymphozytenmembran, bindet und aktiviert Basophile und
Mastzellen, sehr kurzlebig.
lg G1:
Sind die häufigsten lg nach einer Infektion, Ig G1 treten etwas später als Ig M
in Erscheinung, persistieren meist während einer Infektion, sind bei Rindern
Haupt-lg in der Milch und im Serum, können die SLA blockieren und
verursachen im MRT oft statt einer Ringbildung eine Agglutination.
lg G 2:
Tritt zusammen mit lg G1 oder etwas später auf, kann konzentrationsabhängig Prozonen verursachen.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
lg A:
Ist als letzte lg-Klasse im spezifischen Infektionsverlauf nachweisbar,
permanent präsent als lokaler Schutz auf Schleimhäuten und im Eutergewebe.
Ig E:
An Mastzellen und Granulozyten gebundene, IG mit Hauptbedeutung für die
spezifische parasitäre Abwehr und für allergische Reaktionen, sehr langlebig.
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In der serologischen Brucellose-Diagnostik hauptsächlich erfasste
Immunglobulin-Klassen (nach: W.J.B. Morgan, 1982)
SSA/RBT
KBR
SLA
MRT/ABR
(+)
+
+
+
lg G 1
+
(+)
(+)
(+)
lg G 2
-
-
+
-
lg A
-
-
+
-
lg M
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Möglichkeiten von Antikörpereinteilungen
Antikörper nach Wirkung (???)
- agglutinierende
- präzipitierende
- opsonierende
- komplementaktivierende
- sezernierende
- neutralisierende
-.
-..
-…
Antikörper nach
Wirksamwerden (???)
- Ig M
- Ig G1
- Ig G2
- Ig A
- Ig E
- Ig D
Antikörper nach Herstellung (???)
- monoklonale
- rekombinante
- polyklonale
Antikörper nach Bauart (???)
- Monomer (IgD, IgE, IgG)
- Dimer (IgA)
- Pentamer (IgM)
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Auszug aus: Amtliche Methodensammlung des FLI, Stand Januar 2014
Nr.
AMS
Name der Krankheit
HAD
IDT
DIFT
IIFT
NT
SNT
2
Afrik. Pferdepest
x
3
Afrik. Schweinepest
5
Anst. Blutarmut d. Pferde
6
Anst. Blutarmut d. Lachse
8
Aujeszky KH
9
Aviäre Influenza
12
Beschälseuche d. Pferde
14
BHV-1
15
BSE
16
BVD
17
Brucellose
19
Chlamydiose
21
Bovine Leukose
23
Epiz. Hämorrh. D. Hirsche
x
24
Equine Virus Arteritis
x
x
30
IHN, VHS
x
x
x
31
Koi-Herpes-Inf-
x
KBR
IBlot
x
x
x
IPox
x
HA
HAH
x
x
SLA
RBT
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Anzahl der aufgeführten klassischen serologischen Methoden = 37
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Auszug aus: Amtliche Methodensammlung des FLI, Stand Januar 2014
Nr.
AMS
Name der Krankheit
HAD
IDT
DIFT
33
Lungenseuche d. Rd.
34
MKS
36
Newcastle Krankheit
40
Pferdeencephalomyelitis
41
Pockenseuche der Sf+Zg
42
Q-Fieber
44
Rifttal-Fieber
45
Rotz
46
Orthopox-Infektion
48
Schweinepest (KSP)
49
Stomat. Vesicularis
50
Taura-Syndrom
51
Tollwut
x
52
Toxoplasmose
x
56
Tularämie
58
Vesicul. Schw.-KH (SVD)
61
West-Nil-Virus
62
Yellowhead Disease
63
Zecken-übertragb. KH
IIFT
NT
SNT
x
KBR
IBlot
IPox
HA
HAH
x
x
SLA
RBT
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Anzahl der aufgeführten klassischen serologischen Methoden = 30
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Begriffe der klassischen mikrobiologischen Testheorie (KTT)
als Grundlage von Testbewertungen
-
Sensitivität und Spezifität
Objektivität und Robustheit
Validität und Reliabilität
Positive und negative Prädiktion
Prävalenz und Inzidens
Affinität und Avidität
Korrelationskoeffizient
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Krankheit /
Goldstandard
Möglichkeit von
Testvergleichen
Testpositiv
ergebnis
negativ
ja
nein
a
b
a+b
c
d
c+d
a+c
b+d
Sensitivität = a/(a+c)
Spezifität = d/(d+b)
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Einsatzmöglichkeiten sensitiver und spezifischer Tests in der Serologie
Anwendung sensitiver Tests, falls
• kein spezifisch Antikörper-positiver Fall übersehen werden soll
• spezifisch Antikörper-positive Fälle ausgeschlossen werden sollen
• Ausschluss-Tests „negatives Ergebnis gesucht, Rule-Out“
• Screening-Tests, Überwachungsuntersuchungen
• Testsituation mit mehrheitlich geringer spezifischer Seroprävalenz
Anwendung spezifischer Tests, falls
• kein spezifisch Antikörper-negativer Fall übersehen werden soll
• positive und verdächtige Fälle bestätigt / überprüft werden sollen
• Such-Tests „positives Ergebnis gesucht, Rule-In“
• Bestätigungs-Tests, Verlaufsuntersuchungen, Impfkontrollen
• Testsituation mit mehrheitlich hoher spezifischer Seroprävalenz
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Serologische Testmethoden
-IDT / AGPT / AGID
-SNT
-SLA / MAR
-SSA / RBT
-HA / HAH
-KBR
-HAD
-DIFT / IIFT
-ã-IFT
-ELISA
-IPoxT
-IBlot
-u.a.
Brauchen wir denn überhaupt noch die
klassische Virologie/Serologie ?
(DIFT, IDT, SNT, SLA, SSA, HAH, KBR, usw.)
Ja
• Untersuchungen mit reduziertem Labor
• Referenzmethode – Goldstandard
• Impf- und Infektiositätsnachweise
• Differenzierung von Biotypen/Phänotypen
• Basisdiagnostik bei neuen Erkrankungen
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Methode: Immundiffusionstest oder Agargelpräzipitationstest (IDT/AGPT/AGID)
• Antigen und Antikörper diffundieren dreidimensional in einem Agarmedium,
Möglichkeit der qualitativen und semiquantitativen Testinterpretation.
• Lineare Immundiffusion (n. Oudin), radiale Immundiffusion (n. Mancini) und
Doppelimmundiffusion (n. Ochterlony).
• In der Aquivalenzzone bilden sich lichtstreuende Präzipitationsringe oder -linien
aus Antigen-Antikörper-Komplexen.
• Die Präzipitationsreaktion ist steuerbar und wird beeinflußt von der Konzentration
und dem Volumen der Reaktionspartner sowie durch die Dichte des zu
durchdringenden Agarmediums.
• Der Ouchterlony-Assay ist eine wechselseitig nutzbare Diffusionsmethode, bei der
beispielsweise Antikörper in ein Loch in der Mitte eines Agarose-Gels
pipettiert werden und verschiedene Löcher mit Antigen-Lösungen kreisförmig
herum angeordnet sind (Rosette). Mit diesem Test lässt sich anhand der
Präzipitationslinien zeigen, ob ein Antikörper verschiedene Antigene erkennt
bzw. ob verschiedene Antigene ganz oder teilweise identisch sind.
• AGID-Anwendungsbeispiele in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen Celo, IBD, Marek, EIA, BLV, CAE/MV, Riftal-Fieber.
(n. Mancini)
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n. Mancini
Quelle: http://Laborwissen.de/wiki (2014)
n. Ochterlony
Quelle: Dr. Hänel, CVUA Stuttgart (2010)
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Methode: Serumneutralisationstest (SNT)
• Die Neutralisation von Viren wird in der Serologie zur Bestimmung neutralisierender
Antikörper verwendet. Es werden Virusstämme mit typischen zytopathischen
Effekten verwendet, sodass die positiven und negativen Reaktionen an den
Zellkulturen mikroskopisch direkt ablesbar sind.
• Bei Viren ohne ablesbaren CpE kann eine Virusvermehrung oder -neutralisation
mittels anschließender Immunfluoreszenz nachgewiesen werden.
• Zur Bestimmung des Antikörpertiters wird das zu testende Serum titriert bis keine
Neutralisationswirkung des Testvirus auf den Zellkulturen feststellbar ist.
• Der Serumneutralisationstest ist ein apparativ, organisatorisch und vom know how
ein sehr aufwändiges Testverfahren.
• Die Zellkulturen erfordern für die tägliche Laborarbeit ein viel höheres Maß an
Arbeitsaufwand und Erfahrung als die Nutzung vorgefertigter Test-Kits.
• Die Spezifität der SNT-Reaktion wird jedoch von keinem anderen automatisierten
Immunassay (z.B. Ab-ELISA) erreicht, der SNT wird oft als Referenztest oder
„Goldstandard“ für die Diagnostik und für Qualitätskontrolle verwendet.
• SNT-Anwendung in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen BHV-1, BVD, PI-3, KSP, AK, SVD, EAV, EHV-1, EHV-4,
Tollwut, IBD, ILT, IHN, VHS.
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Quelle: Dr. Schirrmeier, FLI Insel Riems (2012), SNT von BHK 21-ct Zelle mit SBV BH80
Quelle: Dr. Schirrmeier, FLI Insel Riems (2012), IIFT von BHK 21-BRS5 Zelle mit SBV BH80
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Methode: Serumlangsamagglutination (SLA) und Mikroagglutination (MAR)
• Die SLA/MAR werden in der Serologie zur Bestimmung agglutinierender, polymerer,
bakterielle und parasitäre Antikörper verwendet. Zur Anwendung kommen
attenuierte Mikrobensuspensionen bzw. genormte, lebende Stämme.
• Zur Bestimmung des Antikörpertiters wird das zu testende Serum titriert bis keine
spezifische Agglutinationswirkung der Reaktionspartner nachweisbar ist, die
Tests sind visuell (direkt, mikroskopisch, optisch/digital) ablesbar.
• Bei Testmethoden mit schwer- oder nicht ablesbarer Agglutination wird die
Testreaktion mittels Anfärbung (Safranin, Neutralrot) sichtbar gemacht.
• Die SLA wird zusammen mit KBR und RBT hauptsächlich bei der BrucelloseDiagnostik angewandt, sie ist mittels Automatisierung massentauglich.
• Die MAR ist Standardmethode bei der serologischen Leptospirose-Diagnostik, diese
Methode erfordert ein erhöhtes Maß an Arbeitsorganisation, Labortechnik
und Erfahrung (Stammhaltung, Dunkelfeldmikroskopie).
• SNT/MAR-Anwendungsbeispiele in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen Brucella ssp., Tularämie, Rotz, BHV-1, Leptospira ssp.
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Quelle: LAVES, Niedersachsen (2014)
Quelle: www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)
Dunkelfeldmikroskopie
1:360
1:500
1:100
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Serumlangsamagglutination (SLA, Brucellose)
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Literaturhinweise zur klassischen Serologie
• Mayr, A. et al, Virologische Arbeitsmethoden, Band 2, Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, New York, 1977
• Jawetz E., Melnick J.L. & Adelberg E.A.. (1973). Medizinische Mikrobiologie.
Berlin: Springer Verlag.
• Thomas, L. (1992). Labor und Diagnose. Hamburg: Medizinische
Verlagsgesellschaft.
• Deutsche Norm: Serodiagnostik von Infektionskrankheiten. DIN 58 969, Teil 10,
Ausgabe Juli 1989; Beuth Verlag GmbH, Burggrafenstraße 6, Berlin
• Laborheft Serologie im Bayerischen Landesamt für Gesundheit und
Lebensmittelsicherheit
• www.infektionsnetz.at (2914)
• www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)
• www.Laborwissen.de/wiki (2014)
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