Charakterisierung der Pathogenität und Transmissibilität von 2009

Charakterisierung der Pathogenität und
Transmissibilität von 2009 pandemischen H1N1
Influenza A Viren in Kleintiermodellen
Dissertation
Anna Otte
Hamburg 2013
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) am
Fachbereich Biologie in der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften an
der Universität Hamburg
Korrigierte Fassung
Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Juli 2009 bis Oktober 2013 am
Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie, Direktor: Prof. Dr.
Thomas Dobner, Fachbereich Biologie der Universität Hamburg, unter der Leitung von PD
Dr. Gülsah Gabriel durchgeführt.
Angenommen vom Fachbereich Biologie der Universität Hamburg am: 28.11.2013
Erstgutachter: PD. Dr. Gülsah Gabriel
Zweitgutachter: Prof. Dr. Thomas Dobner
Tag der mündlichen Prüfung am: 13.12.2013
Mitglieder der Prüfungskommission: Prof. Dr. Jörg Ganzhorn
Prof. Dr. Wolfram Brune
PD. Dr. Gülsah Gabriel
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ............................................................................................................. 1
1.1
Influenza A Viren ........................................................................................................ 1
1.1.1
Taxonomie ....................................................................................................................... 1
1.1.2
Virionstruktur.................................................................................................................... 2
1.1.3
Genomaufbau .................................................................................................................. 3
1.1.4
Replikationszyklus ........................................................................................................... 5
1.1.5
Wirtsspektrum und Evolution ........................................................................................... 8
1.1.6
Epidemiologie im Menschen.......................................................................................... 11
1.1.6.1
Influenza-Epidemien .................................................................................................. 11
1.1.6.2
Influenza-Pandemien ................................................................................................. 12
1.1.6.3
Influenza-Zoonosen ................................................................................................... 14
1.1.7
Pathogenese im Menschen ........................................................................................... 15
1.1.8
Adaptive Mutationen und Pathogenitätsdeterminanten im Säuger ............................... 17
1.2
2009 pandemische H1N1 Influenza (2009 pH1N1) ................................................. 21
1.2.1
1.2.1.1
Ursprung der 2009 pH1N1 Influenzaviren ................................................................. 23
1.2.2
Pathogenese der 2009 pH1N1 Influenza ...................................................................... 25
1.2.3
Pathogenitätsdeterminanten der 2009 pH1N1 Influenza .............................................. 26
1.3
Tiermodelle in der Influenzaforschung ..................................................................... 27
1.3.1
Mäuse ............................................................................................................................ 28
1.3.2
Meerschweinchen .......................................................................................................... 30
1.3.3
Frettchen........................................................................................................................ 31
1.3.4
Weitere Tiermodelle ...................................................................................................... 33
1.4
2
Epidemiologie der 2009 pH1N1 Influenza ..................................................................... 21
Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................... 34
Material .............................................................................................................. 35
2.1
Chemikalien, Lösungen und Puffer ......................................................................... 35
2.2
Kulturmedien und -zusätze ...................................................................................... 36
2.3
Enzyme, Reaktionssysteme und Zusätze ................................................................ 38
2.4
Primer ...................................................................................................................... 39
2.5
Plasmide und Vektoren ............................................................................................ 39
2.6
Virusstämme ............................................................................................................ 39
2.7
Bakterienstämme ..................................................................................................... 40
2.8
Eukaryotische Zelllinien ........................................................................................... 40
2.9
Versuchstiere ........................................................................................................... 40
2.10
Antikörper................................................................................................................. 41
2.11
Narkotika, Analgetika und Zusätze .......................................................................... 41
2.12
Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 41
I
2.13
3
Geräte ...................................................................................................................... 42
Methoden ........................................................................................................... 44
3.1
Molekularbiologische Methoden .............................................................................. 44
3.1.1
Isolierung von viraler RNA ............................................................................................. 44
3.1.2
Design von PCR-Primern .............................................................................................. 44
3.1.3
Sequenzierung viraler RNA ........................................................................................... 44
3.1.4
Klonierung viraler DNA .................................................................................................. 45
3.1.4.1
Zweistufige RT-PCR .................................................................................................. 45
3.1.4.2
DNA-Gelelektrophorese ............................................................................................ 46
3.1.4.3
Ligation ...................................................................................................................... 47
3.1.4.4
Restriktionsverdau ..................................................................................................... 47
3.1.4.5
Transformation kompetenter E. coli-Bakterien .......................................................... 47
3.1.5
Zielgerichtete PCR-Mutagenese ................................................................................... 48
3.1.6
Plasmidamplifikation in E. coli Bakterien ....................................................................... 49
3.1.7
Plasmidpräparation ........................................................................................................ 49
3.1.8
Archivierung plasmidtragender E-coli Bakterien ........................................................... 49
3.1.9
Bestimmung Polymeraseaktivität .................................................................................. 49
3.1.9.1
Transfektion von HEK293T-Zellen ............................................................................ 50
3.1.9.2
Messung der relativen Polymeraseaktivität ............................................................... 50
3.1.10
3.2
Zytokinbestimmung mittels enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) ......... 50
Zellkultur .................................................................................................................. 51
3.2.1
Kultivierung .................................................................................................................... 51
3.2.2
Archivierung ................................................................................................................... 51
3.3
Virologische Methoden ............................................................................................ 52
3.3.1
Virusanzucht .................................................................................................................. 52
3.3.1.1
Anzucht im Hühnerei ................................................................................................. 52
3.3.1.2
Anzucht in MDCK-Zellen ........................................................................................... 52
3.3.2
3.3.2.1
Reverse Genetik ............................................................................................................ 53
Generierung rekombinanter pH1N1 Viren ................................................................. 53
3.3.3
Virusgenotypisierung ..................................................................................................... 54
3.3.4
Hämagglutinationstest ................................................................................................... 55
3.3.5
Hämagglutinationsinhibitionstest ................................................................................... 55
3.3.6
Titerbestimmung mittels Plaquetest .............................................................................. 56
3.3.7
Wachstumskurven von Viren ......................................................................................... 57
3.4
Tierexperimentelle Methoden .................................................................................. 57
3.4.1
Narkose und Tötungsmethoden .................................................................................... 58
3.4.2
Infektion und Überlebensversuch (MLD50 -Bestimmung) .............................................. 58
3.4.3
Blutentnahme, Organentnahme und Nasenspülung ..................................................... 59
3.4.4
Herstellung von Organhomogenaten............................................................................. 60
3.4.5
Zellzahlbestimmung in Vollblut mittels Hämatologiegerät ............................................. 60
II
3.4.6
3.5
4
Transmissionsversuche ................................................................................................. 61
Histologische Methoden ........................................................................................... 63
3.5.1
Präparation von Gewebeschnitten ................................................................................ 63
3.5.2
Entparaffinierung und Rehydrierung von Gewebeschnitten .......................................... 63
3.5.3
in situ-Hybridisierung ..................................................................................................... 64
3.5.3.1
Herstellung der in situ-Sonde .................................................................................... 64
3.5.3.2
Permeabilisierung der Gewebeschnitte ..................................................................... 66
3.5.3.3
Hybridisierung der Gewebeschnitte........................................................................... 66
3.5.3.4
Posthybridisierung ..................................................................................................... 67
3.5.3.5
Autoradiographie und Entwicklung ............................................................................ 67
3.5.4
Hämatoxylin-Eosin Färbung .......................................................................................... 67
3.5.5
Immunhistochemische Färbung .................................................................................... 68
Ergebnisse ......................................................................................................... 69
4.1
Klinische Isolate der 2009 pandemischen H1N1 Influenza (2009 pH1N1) .............. 69
4.2
Sequenzanalyse der 2009 pH1N1 Virusisolate ....................................................... 70
4.3
Wachstumsverhalten der 2009 pH1N1 Influenzaviren in humanen Lungenzellen .. 71
4.4
Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Mausmodell ......................... 72
4.4.1
Pathogenität und Virulenz der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler H1N1
und humaner H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen ................................. 73
4.4.2
Organtropismus der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler H1N1 und
humaner H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen ........................................ 75
4.4.3
Virustropismus der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler H1N1 und
humaner H5N1 Influenza in der Lunge von BALB/c und C57BL/6J Mäusen ................ 77
4.4.4
Blutbild nach Infektion mit 2009 pH1N1, alt-saisonaler H1N1 und humaner H5N1
Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen ................................................................. 79
4.4.5
Th1/Th2-Immunantwort nach Infektion mit pH1N1, alt-saisonaler H1N1 und humaner
H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen ....................................................... 81
4.5
Rekombinante 2009 pH1N1 Influenzaviren (2009 pH1N1rek) ................................. 84
4.5.1
Generierung von 2009 pH1N1rek Influenzaviren .......................................................... 84
4.5.2
Charakterisierung der 2009 pH1N1rek Influenzaviren im C57BL/6J Mausmodell ........ 85
4.5.2.1
Pathogenität der 2009 pH1N1rek Influenzaviren in C57BL/6J Mäusen .................... 85
4.5.2.2
Tropismus der 2009 pH1N1rek Influenzaviren in der Lunge von C57BL/6J Mäusen 87
4.5.2.3
Lymphozytenwerte nach Infektion mit 2009 pH1N1rek Influenzaviren in C57BL/6J
Mäusen ...................................................................................................................... 89
4.6
Analyse der Mutationen im Hämagglutinin und Nukleoprotein ................................ 90
4.6.1
Rezeptorbindungseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren ................................ 92
4.6.2
Polymeraseaktivität der RNP-Komplexe der 2009 pH1N1 Influenzaviren in humanen
Zellen ............................................................................................................................. 93
4.7
Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Meerschweinchenmodell..... 95
III
4.7.1
Virustropismus der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Respirationstrakt von
Meerschweinchen .......................................................................................................... 95
4.7.2
4.8
5
Transmissionseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Meerschweinchen ... 99
Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Frettchenmodell ................ 103
4.8.1
Virustropismus der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Respirationstrakt von Frettchen.. 103
4.8.2
Transmissionseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Frettchen ............... 107
Diskussion........................................................................................................ 110
5.1
Charakterisierung von 2009 pH1N1 Influenzaviren ............................................... 110
5.2
Unterschiedliche Pathogenitätsdeterminanten für 2009 pH1N1 und humane H5N1
Influenzaviren im Mausmodell ............................................................................... 112
5.3
Differenzielle Pathogenität von 2009 pH1N1 Influenzaviren im C57BL/6J Modell 116
5.4
Einzelne Mutationen in NP und HA sind für die differenzielle Pathogenität im
C57BL/6J Modell verantwortlich ............................................................................ 118
5.5
Pathogenität und Replikationseigenschaften von 2009 pH1N1 Influenzaviren in
Meerschweinchen und Frettchen ........................................................................... 121
5.6
Differenzielle Transmissionseigenschaften von 2009 pH1N1 Influenzaviren in
Meerschweinchen und Frettchen ........................................................................... 124
5.7
Eine höhere Pathogenität von HH15 im Vergleich zu HH05 .................................. 128
6
Zusammenfassung........................................................................................... 131
7
Summary.......................................................................................................... 133
8
Literaturverzeichnis .......................................................................................... 135
9
Anhang............................................................................................................. 145
9.1
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... 145
9.2
Tabellenverzeichnis ............................................................................................... 148
9.3
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... 149
9.4
Primerlisten ............................................................................................................ 151
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen ........................................ 154
Wissenschaftlicher Werdegang .............................................................................. 158
Danksagung ........................................................................................................... 159
Eidesstattliche Erklärung ........................................................................................ 160
IV
Einleitung
1 Einleitung
In dieser Arbeit wurden zwei klinische Isolate der 2009 pandemischen H1N1 Influenza in
vitro und in vivo in verschiedenen Tiermodellen charakterisiert. Da bisher bekannte
Signaturen der Pathogenität und der Anpassung von Influenzaviren im Menschen in den
2009 pandemischen H1N1 Influenza A Viren nicht gefunden wurden, war das Ziel dieser
Arbeit neue Determinanten zu identifizieren. Daher werden im Folgenden zuerst die Biologie
und Epidemiologie von Influenza A Viren zusammengefasst, sowie die molekularen
Grundlagen der Adaptation und der Pathogenität im Menschen beschrieben. Darauf folgt
eine detailliertere Ausführung zu den bisher bekannten Charakteristika der 2009
pandemischen H1N1 Influenza. Im letzten Teil der Einleitung werden Tiermodelle, die in
dieser Arbeit verwendet wurden, vorgestellt.
1.1 Influenza A Viren
1.1.1 Taxonomie
Influenza A Viren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae und besitzen ein segmentiertes
und negativ-orientiertes einzelsträngiges RNA-Genom (Palese und Shaw, 2007). Die
Virionen sind von einer Lipid-Doppelschicht umgeben und somit zählen die Orthomyxoviridae
zu den behüllten Viren. Eine weitere Besonderheit von Influenza A Viren, im Vergleich zu
den meisten anderen RNA-Viren, ist, dass sie im Zellkern des Wirtsorganismus
transkribieren und replizieren. Deshalb sind sie auf den effizienten Import ihrer
Viruspolymerase in den Zellkern sowie die Interaktion mit weiteren zellulären Faktoren
angewiesen (1.1.4). Neben den Influenzaviren A, B und C gehören die Gattungen
Thogotovirus, Quarjavirus und Isavirus zu den Orthomyxoviridae (Presti et al., 2009). Einige
der Thogotoviren und der kürzlich neu klassifizierten Quarjaviren wurden bisher in erster
Linie aus Vögeln und Zecken isoliert, können jedoch auf Säugetiere, darunter auch den
Menschen, übertragen werden (Butenko et al., 1987; Presti et al., 2009; Davies et al., 1986).
Der Gattung der Isaviren ist das Virus der infektiösen Lachsanämie (Infectious Salmon
Anemia Virus) untergeordnet, das eine Erkrankung bei Lachsen auslöst (Mjaaland et al.,
1997). Die verschiedenen Influenzaviren werden nach der Antigenität des viralen
Nukleoproteins und des viralen Matrixproteins unterschieden und sind in Influenza A, B
und C Viren gegliedert. Die drei Arten unterscheiden sich in der Anzahl der Genomsegmente
sowie in ihrem Wirtsspektrum (Palese und Shaw, 2007). Influenza A Viren können eine
Vielzahl unterschiedlicher Spezies infizieren (1.1.5), während Influenza B Viren bisher nur in
Seehunden und Menschen nachgewiesen wurden. Das Genom beider Virusarten ist in acht
1
Einleitung
Segmente unterteilt. Influenza C Viren haben hingegen sieben Genomsegmente. Die
Funktionen der viralen Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)
sind im Hämagglutinin-Esterase-Fusionsprotein (HEF-Protein) von Influenza C Viren
kombiniert (Palese und Shaw, 2007). Eine Infektion mit Influenza C Viren konnte bisher nur
für Schweine und Menschen gezeigt werden (Guo et al., 1983). Die Nomenklatur der
einzelnen Influenza A Virusstämme setzt sich aus der jeweiligen Art der Wirtsspezies, aus
der es isoliert wurde, dem Isolationsort, der Laufnummer der Probe und dem Jahr der
Virusisolierung
zusammen.
Influenza
A
Viren
werden
zusätzlich
nach
ihren
Oberflächenproteinen HA und NA in Subtypen klassifiziert, da diese im Gegensatz zu den
viralen Kernproteinen größeren genetischen Veränderungen unterliegen. Derzeit sind
17 verschiedene HA-Subtypen bekannt und neun verschiedene NA-Subtypen, welche
jeweils nach ihrer Identifizierung nummeriert werden (Wright et al., 2007; Tong et al., 2012).
1.1.2 Virionstruktur
Die behüllten infektiösen Viruspartikel von Influenza A Viren haben meist eine sphärische
Form mit einer Größe von 80-120 nm im Durchmesser (Webster et al., 1992; Nayak et al.,
2009). Viruspartikel konnten jedoch besonders in klinischen Isolaten auch in filamentöser
Form nachgewiesen werden. Die Morphologie der Virionen wird Studien zufolge von
verschiedenen viralen und auch zellulären Determinanten bestimmt, wobei die Funktion
unterschiedlich geformter Viruspartikel bisher noch nicht geklärt werden konnte (Rossman
und Lamb, 2011).
Die Oberfläche der Virionen besteht aus einer Lipiddoppelschicht, welche sich aus der
Zellmembran der Wirtszelle ableitet (1.1.4; Rossman und Lamb, 2011). In die äußere Hülle
sind drei verschiedene virale Transmembranproteine integriert, das Hämagglutintin (HA), die
Neuraminidase (NA) und das Ionenkanalprotein M2 (Abb. 1B). Die extramembranen Anteile
der Glykoproteine HA und NA sind in elektronenmikroskopischen Abbildungen als
sogenannte Spikes auf der Oberfläche der Virionen auszumachen (Abb. 1A; Nayak et al.,
2009). Das virale HA-Protein kommt dabei im vierfachen Verhältnis zu NA vor (Palese und
Shaw, 2007). An der Innenseite der Lipidhülle befindet sich eine weitere Hülle des Virions,
das aus dem Matrixprotein M1 gebildet wird. Die M1-Matrix umgibt das in acht Segmente
unterteilte virale Genom im Inneren, welche als Ribonukleoprotein-Komplexe vorliegen
(Palese
und
Shaw,
2007).
In
diesen
Komplexen
wird
die
virale
RNA
von
Nukleoproteinmonomeren enkapsidiert und ist an beiden Enden mit der viralen Polymerase
assoziiert (Abb. 1B; 1.1.3; Boivin et al., 2010; Resa-Infante und Gabriel, 2013). Des Weiteren
ist noch das Kernexportprotein (NEP oder NS2) im Viruspartikel nachzuweisen, welches im
2
Einleitung
Replikationszyklus den Export von neu synthetisierten RNP-Komplexen aus dem Zellkern
reguliert (Palese und Shaw, 2007).
Abb. 1: Morphologie von Influenza A Virionen. A) Kolorierte elektronenmikroskopische Aufnahme von
Influenzaviruspartikeln der 2009 pandemischen H1N1 Influenza. Die sphärischen Virionen haben einen
durchschnittlichen Durchmesser von ca. 100 nm. Die Oberflächenglykoproteine Hämagglutinin (HA) und
Neuraminidase (NA) sind in der äußeren Hülle als Spikes sichtbar (Abteilung Elektronenmikroskopie, HeinrichPette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie). B) Schematische Darstellung eines
Influenzaviruspartikels (modifiziert nach Karlsson Hedestam et al., 2008). Die Glykoproteine HA und NA sowie
das Ionenkanalprotein M2 sind in die Virushülle, die von der Doppellipidmembran der Wirtszelle abgeleitet ist,
eingebettet. Der Viruskern enthält die Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP) der acht Gensegmente. In diesen
Komplexen wird die virale RNA von Nukleoproteinmonomeren enkapsidiert und ist an beiden Enden mit der
viralen Polymerase bestehend aus PB1, PB2 und PA, assoziiert.
1.1.3 Genomaufbau
Das Genom von Influenzaviren besteht aus acht unterschiedlich großen Segmenten negativorientierter, einzelsträngiger RNA. Zusammen ergeben die Segmente eine Genomgröße von
13,6 kb und kodieren nach heutigem Wissensstand für bis zu 13 virale Proteine (Jagger et
al., 2012). Die Genomsegmente haben an ihren 3'- sowie 5'-Enden jeweils eine für
Influenzaviren hochkonservierte, nichtkodierende Region, welche die regulatorischen
Sequenzen für die Transkriptions- und Replikationspromotoren, für das Verpackungssignal
sowie für die mRNA-Prozessierung enthält (Naffakh et al., 2008). Für die Transkription und
Replikation der viralen RNA benötigt das Virus eine RNA-abhängige RNA-Polymerase.
Diese
liegt
im
Viruspartikel
bereits
in
Assoziation
mit
der
RNA
im
viralen
Ribonukleoprotein (vRNA)-Komplex vor.
3
Einleitung
Tab. 1: Die Genomsegmente und die jeweiligen Genprodukte von Influenzaviren.
Segment
Länge
Protein
Proteinfunktion
PB2
2341 bp
PB2
Basisches Polymeraseprotein 2, Untereinheit des RNPund Polymerasekomplexes, Erkennung der Cap-Struktur
zellulärer mRNA
PB1
2341 bp
PB1
Basisches Polymeraseprotein 1, Untereinheit des RNPund Polymerasekomplexes, RNA-abhängige RNAPolymerase
PB1-F2
Regulation von Apoptose und viraler Polymeraseaktivität
(Chen et al., 2001; Knipe und Howley, 2006)
PA
2233 bp
PB1-N40
Unbekannte Funktion (Wise et al., 2009)
PA
Saures Polymeraseprotein: Untereinheit des RNP- und
Polymerasekomplexes, Proteaseaktivität
HA
1778 bp
PA-X
Modulierung Immunantwort des Wirtes (Jagger et al., 2012)
HA
Hämagglutinin, Oberflächenglykoprotein, stärkstes Antigen,
Rezeptorbindung, Fusion
NP
1565 bp
NP
Nukleoprotein, Komponente des RNP-Komplexes, RNASynthese, Kernimport
NA
1413 bp
NA
Neuraminidase, Oberflächenglykoprotein, Sialidaseaktivität,
Antigen
M
1027 bp
M1
Matrixprotein 1, Interaktion mit vRNP-Komplexen und
Oberflächenglykoproteinen, Kernexport, Virusfreisetzung
NS
890 bp
M2
Matrixprotein 2, Membranprotein, Ionenkanalaktivität
NS1
Nichtstrukturprotein 1, multifunktionales Protein,
Interferonantagonist, Regulierung der zellulären
Genexpression
NS2 (NEP)
Nichtstrukturprotein 2/Kernexportprotein, Regulatorisches
Protein, vRNP-Export
Die Genomsegmente PB2, PA, HA, NP und NA kodieren jeweils für das gleichnamige Protein. M und NS
hingegen kodieren mittels alternativen Spleißens für jeweils zwei Proteine (M1 und M2 bzw. NS1 und NS2). Die
Proteine PB1-N40 und PA-X werden über alternative Leserahmen kodiert. Die Länge der Genomsegmente ist in
Basenpaaren (bp) angegeben. Den Angaben nach modifiziert nach Palese und Shaw, 2007.
4
Einleitung
Die virale Polymerase ist ein heterotrimärer Proteinkomplex, bestehend aus den basischen
Polymeraseproteinen PB1 und PB2 sowie dem sauren Polymeraseprotein PA. Die 3'- und
5'-Enden der viralen RNA sind teilweise komplementär zueinander und bilden einen kurzen
Duplexbereich aus, welcher mit der RNA-Polymerase assoziiert ist (Klumpp et al., 1997;
Resa-Infante und Gabriel, 2013). Dadurch ist jedes Genomsegment in eine doppelhelikale
Haarnadelstruktur gewunden, in der die RNA mit zahlreichen Nukleoproteinen (NP)
enkapsidiert vorliegt. Die Segmente für PB2, NP, HA und NA kodieren jeweils für ein
Genprodukt, dagegen können die Segmente PB1, PA, M und NS für zwei oder wie im Fall
von PB1 für drei Genprodukte kodieren (Tab. 1). Dies geschieht beispielsweise im Fall von
M1 und M2 durch alternatives Spleißen oder wie im Fall von PB1-F2 durch einen
überlappenden Leserahmen in der PB1-mRNA (Lamb und Choppin, 1981; Chen et al.,
2001). Alle bisher beschriebenen viralen Proteine und deren Funktionen sind in Tab. 1
aufgeführt.
1.1.4 Replikationszyklus
Der Replikationszyklus von Influenzaviren lässt sich in Adsorption und rezeptorvermittelte
Endozytose, in Membranfusion und Freisetzung der viralen RNA (vRNA), in Transkription
und Replikation sowie in Zusammenlagerung und Freisetzung neuer Viruspartikel unterteilen
(Abb. 2, Wilschut et al., 2006; Palese und Shaw, 2007). Eine Vielzahl dieser Prozesse ist
dabei abhängig von der Interaktion viraler und zellulärer Faktoren. Das Zusammenspiel mit
den Wirtsfaktoren übt demnach einen hohen Selektionsdruck auf Influenzaviren aus und
bietet Angriffspunkte für die Entwicklung von antiviralen Medikamenten.
Adsorption und rezeptorvermittelte Endozytose
Die Kopfdomäne des heterotrimären HA befindet sich auf der Oberfläche der Viruspartikel
und bindet als Rezeptor glykosidisch gebundene Sialinsäuren. Diese kommen vor allem auf
Epithelzellen in großer Anzahl vor. Eine Besonderheit von aviären Influenzaviren ist die
Präferenz, α2,3-glykosidisch gebundene Sialinsäuren zu binden (Connor et al., 1994).
Humane Influenzaviren hingegen binden präferenziell α2,6-gebundene Sialinsäuren. Die
effiziente Rezeptorbindung wird jedoch auch von weiteren Oberflächenmolekülen der
Wirtszelle beeinflusst (de Vries et al., 2012; Nicholls et al., 2012). Nach Bindung kommt es
durch rezeptorvermittelte Endozytose zur Aufnahme des Viruspartikels in die Wirtszelle. Bei
der Endozytose umschließt die Zellmembran das eindringende Molekül und schnürt sich ins
Zellinnere als Endosom ab.
Membranfusion und Freisetzung der vRNPs
Das Endosom wird im Zytoplasma durch Protonenpumpen in der zellulären Membran
angesäuert, um eine Lyse des Vesikels herbeizuführen. Der saure pH-Wert im Endosom hat
5
Einleitung
eine Konformationsänderung des membranständigen HA-Proteins zur Folge. Durch Fusion
des nun freiliegenden C-terminalen Endes von HA mit der endosomalen Zellmembran
entstehen Poren im Endosom (Cross et al., 2001). Das HA-Protein muss dafür bereits durch
Spaltung des inaktiven HA0 durch zelluläre Proteasen zu den funktionellen Untereinheiten
HA1 und HA2 aktiviert worden sein (Klenk et al., 1975). Das Innere des Viruspartikels wird
durch den viralen M2 Ionenkanal ebenfalls angesäuert (Helenius, 1992). Dadurch wird die
Interaktion der vRNP-Komplexe mit der M1-Matrix geschwächt und eine Freisetzung der
vRNPs durch die entstandenen Fusionsporen in der Endosommembran in das Zytoplasma
ermöglicht.
Transkription und Replikation
Für die Initiation der Transkription und Replikation ist die virale Polymerase auf zelluläre
Kernprozesse angewiesen. Daher müssen die vRNPs zunächst in den Zellkern transportiert
werden. Dies geschieht durch aktive Kernimportprozesse der Wirtszelle und wird vorrangig
über die Kernlokalisationssignale (NLS) im NP-Protein vermittelt (Cros et al., 2005; ResaInfante und Gabriel, 2013). Im Zellkern wird die virale mRNA-Synthese durch den
Mechanismus des cap-snatching des viralen Polymerasekomplexes initiiert. Dabei bindet die
PB2-Untereinheit die 5‘-Cap-Strukturen von zellulären prä-mRNAs. Diese werden durch die
Endonukleaseaktivität von PA von den zellulären mRNA-Produkten abgeschnitten und als
Primer für die virale mRNA-Synthese verwendet (Krug, 1981; Boivin et al., 2010). Das hat
zusätzlich eine Inhibierung der zellulären Replikation zur Folge. Die virale mRNA wird ins
Zytoplasma transportiert, wo an den Ribosomen die Translation der viralen Proteine
stattfindet. Die Polymeraseproteine werden für die weitere Transkription und die Replikation
in den Zellkern transportiert. Nach Transkription großer Mengen viraler mRNA findet die
Replikation viraler RNA (vRNA) in virale positivorientierte komplementäre RNA (cRNA) statt.
Diese dient in einer späteren Phase des Replikationszyklus als Matrize neuer vRNAProdukte (Palese und Shaw, 2007). Die Replikation der cRNA und vRNA wird von der viralen
Polymerase über die Promotoren in den nichtkodierenden Bereichen der Genomsegmente
Primer-unabhängig durchgeführt (Neumann et al., 2004). Das Nichtstrukturprotein NS1,
welches im Viruspartikel nicht nachzuweisen ist, wird während der frühen Phase der
Replikation synthetisiert, um die virale Replikation durch Manipulation zellulärer Signalwege
zu begünstigen (Kochs et al., 2007; Marazzi et al., 2012).
Zusammenlagerung und Freisetzung neuer Viruspartikel
Während die viralen Kernproteine PB1, PB2, PA, NP, NS1, NS2 und M1 im Zytoplasma an
freien Ribosomen translatiert werden, geschieht dies für die Oberflächenproteine HA, NA
und M2 an den Ribosomen des rauen endoplasmatischen Retikulums. Noch während der
Proteinsynthese werden diese Proteine zu Polymeren zusammengelagert, anschließend
6
Einleitung
über den Golgi-Apparat posttranslational modifiziert und zur Zellmembran transportiert
(Palese und Shaw, 2007). Die neu synthetisierte vRNA wird noch während der Synthese im
Zellkern in vRNP-Komplexe enkapsidiert und der Export ins Zytoplasma über das NS2
Protein vermittelt (Hay et al., 1977; Cros und Palese, 2003). Durch Assoziation mit dem M1
Protein wird in der späten Phase der Replikation ein Wiedereintritt der vRNPs in den Zellkern
verhindert (Whittaker et al., 1995). M1 interagiert im Zytoplasma ebenfalls mit den bereits in
der Membran eingelagerten Oberflächenproteinen HA, NA und M2 (Palese und Shaw, 2007).
Es kommt zu einer Zusammenlagerung der vRNP-Komplexe an der Zellmembran mit einer
hohen
Dichte
an
viralen
Oberflächenproteinen.
Dies
führt
zur
Ausbildung
einer
Membranausstülpung, was im Weiteren zu einer Abschnürung eines neuen Viruspartikels
führt (Rossman und Lamb, 2011). Zur endgültigen Freisetzung des neuen Virions spaltet das
NA die am HA gebundenen Sialinsäuren ab. Ebenso werden die zellulär gebundenen
Sialinsäuren abgespalten, wodurch eine erneute Rezeptorbindung verhindert wird und das
Viruspartikel neue Wirtszellen infizieren kann (Palese und Compans, 1976; Luo et al., 1999).
Abb. 2: Replikationszyklus von Influenzaviren. Nach rezeptorvermittelter Endozytose werden die viralen
Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP) durch Membranfusion in das Zytoplasma freigesetzt und zur Transkription
und Replikation in den Zellkern transportiert. Die mRNA wird im Zytoplasma translatiert und teilweise für die
weitere Replikation wieder in den Zellkern importiert. Neue vRNPs werden im Zellkern gebildet und anschließend
exportiert. Es kommt zu einer Zusammenlagerung der vRNPs an der Zellmembran, in die bereits die viralen
Oberflächenproteine integriert sind. Nach Membranausstülpung werden neue Virionen durch
Neuraminidaseaktivität freigesetzt. Modifiziert nach Neumann et al., 2009.
7
Einleitung
Die viralen nicht-Struktur Proteine PB1-F2, NS1 und PA-X sind nur indirekt am
Replikationszyklus von Influenzaviren beteiligt. Sie ermöglichen eine effiziente Replikation
des Virus durch die Inhibierung oder Modulation der Immunantwort des infizierten Wirts
(Jagger et al., 2012; Knipe und Howley, 2006). Besonders NS1 spielt dabei eine wichtige
Rolle als Interferonantagonist (Geiss et al., 2002). Für das Protein PB1-N40, welches durch
alternatives Spleißen transkribiert wird, konnte bisher keine Funktion beschrieben werden
(Wise et al., 2009).
1.1.5 Wirtsspektrum und Evolution
Als natürliches Reservoir von Influenzaviren sind wildlebende Wasservögel identifiziert
worden. Vor allem in Vögeln der Ordnung Anseriformes und Charadriiformes zirkulieren fast
alle bisher bekannten Influenzavirussubtypen (Webster et al., 1992). Nur das erst kürzlich
identifizierte H17 konnte bisher nur aus Fledermäusen isoliert werden (Tong et al., 2012).
Ausschlaggebend für ein solches Reservoir ist die optimale Anpassung des Virus an den
Wirt. In den infizierten Wasservögeln wird keine Erkrankung durch eine Infektion ausgelöst
und die Viren können ohne Selektionsdruck stabil zirkulieren. Gelegentlich kommt es jedoch
zu einer Übertragung auf andere Spezies (Abb. 3). Ist diese immunologisch naiv, kann es zu
Erkrankungen
unterschiedlichen
Ausmaßes
kommen.
Die
hohe
Diversität
der
in
Wasservögeln zirkulierenden Influenzaviren begünstigt diesen Vorgang. Durch den
Selektionsdruck in einem neuen Wirt kommt es zu einer Anhäufung adaptiver Mutationen
(Webster et al., 1992). Die virale Polymerase ist ein hochprozessiver Enzymkomplex, der
eine hohe Generationsfolge an Virusnachkommen ermöglicht und dadurch eine schnelle
Anpassung an einen neuen Wirt oder andere Umweltfaktoren begünstigt (1.1.3). Hinzu
kommt, dass die Polymerase über keine Korrekturleseaktivität verfügt und damit die hohe
Mutationsrate mit etwa einem Fehler pro repliziertem Genom begünstigt (Drake, 1993). Die
stark antigenen Oberflächenproteine sind dabei dem höchsten Selektionsdruck unterworfen
(Webster et al., 1992). Neben der hohen Mutationsrate von Influenzaviren ermöglicht die
Segmentierung
des
Genoms
eine
genetische
Vermischung
zwei
verschiedener
Influenzavirussubtypen bei Koinfektion des gleichen Wirts. Die Virusnachkommen können
dabei eine beliebige Kombination der acht Genomsegmente der zwei Parentalviren
beinhalten (Wright et al., 2007). Kommt es durch Mutationen oder Reassortierung zu einer
Veränderung der Wirtsspezifität kann sich eine neue artspezifische Viruslinie etablieren
(Webster et al., 1992; Wright et al., 2007; 1.1.8).
Influenzaviren konnten bereits in diversen Land- und Wassersäugern, aber auch in anderen
Vogelordnungen und in domestiziertem Geflügel nachgewiesen werden (Abb. 3). Dabei
handelt es sich bei einer Vielzahl der Fälle um gelegentliche Transmissionen ohne die
8
Einleitung
Etablierung neuer stabiler Viruslinien. Ausbrüche von Influenzaerkrankungen mit großem
Ausmaß sind wiederkehrend in Vögeln zu beobachten. Hier unterscheidet man für Hühner
zwischen niedrigpathogenen aviären oder hochpathogenen aviären Influenzaviren (Webster
et al., 1992). Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (LPAIV), die nahezu alle bekannten
HA-Subtypen enthalten können, lösen im Huhn und auch anderen Vögeln nur milde oder
asymptotische Erkrankungen aus (Webster et al., 1992; Wright et al., 2007). Eine Infektion
mit LPAIVs im Menschen wurde für die Subtypen H6N1, H7N2, H7N3, H7N9 und H9N2
nachgewiesen, wobei es sich bisher meist um Einzelfälle mit mildem Krankheitsverlauf
handelte
(www.who.int
/influenza/
human_animal_interface/
Influenza_Summary_
IRA_HA_interface_03July13.pdf; Guo et al., 1999; Belser et al., 2009a). Jüngste Berichte
über eine steigende Anzahl schwerwiegender Erkrankungen nach Infektion mit dem H7N9
Influenzasubtyp zeigen jedoch, dass von LPAIV auch eine Gefahr für den Menschen ausgeht
(Yu et al., 2013). Die hochpathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) sind bisher alle vom
H5- oder H7-Subtyp und auch als Vogelgrippe oder Geflügelpest bekannt. Sie lösen eine
systemische Erkrankung von Hühnern aus, die innerhalb weniger Tage zum Tod führt
(Webster et al., 1992; Jeong et al., 2009). Da neben anderen Vögeln hauptsächlich
domestiziertes Geflügel betroffen ist und sich die Viren sowohl über die Ausscheidungen als
auch über Aerosole in einer gesamten Vogelpopulation ausbreiten ist dies von erheblichen
wirtschaftlichen Schäden begleitet (Wright et al., 2007). HPAIVs können auch auf den
Menschen übertragen werden. Seit den Neunzigern wurden immer wieder Übertragungen
von H5N1 und H7N7 Influenzaviren auf den Menschen beobachtet (Subbarao et al., 1998;
Horimoto, 2001; Fouchier et al., 2004; Belser et al., 2009a). Früher datierte Fälle von H7N7
Infektionen erfolgten nur in Einzelfällen nach direktem Kontakt mit infektiösem Material
(Belser et al., 2009a). Besonders HPAIV des H5N1 Subtyps führen zu schweren
Erkrankungen im Menschen nicht selten mit tödlichem Ausgang (1.1.7) und sind daher auch
von großer gesellschaftlicher Bedeutung. Ein befürchtetes Szenario sind adaptive
Veränderungen die zu einer Übertragbarkeit von Mensch zu Mensch führen und so eine
Pandemie auslösen können (Horimoto und Kawaoka, 2005). Unter 1.1.6.3 wird näher auf die
Übertragung von aviären Influenzaviren auf den Menschen eingegangen.
Im Jahre 1933 gelang es erstmals ein Influenzavirus aus dem Menschen zu isolieren (Smith
et al., 1933). Eine Übertragung von Influenzaviren aus dem aviären Reservoir auf den
Menschen geschieht meist über Zwischenwirte wie beispielsweise andere infizierte Vögel,
oder findet über das Schwein als intermediären Wirt statt (Scholtissek, 1990; Subbarao und
Katz, 2000; Ma et al., 2008). Schweine können sowohl von aviären als auch von humanen
Influenzaviren infiziert werden. Sie werden daher als sogenanntes Mischgefäß für humanpathogene Influenzaviren bezeichnet, da es im Schwein nach einer Koinfektion mit zu einer
Reassortierung aviärer und humaner Influenzaviren kommen kann. Da Influenzaviren vom
9
Einleitung
Menschen auch wieder auf Tier übertragen werden können, wie im Fall des Schweins,
handelt es sich um eine Zoonose. Viruslinien, die sich bisher im Menschen etablieren
konnten, zählen zu den H1-, H2- und H3-Subtypen (Wright et al., 2007). Einzelne
Punktmutationen, besonders in den stark antigenen Oberflächenproteinen, können dazu
führen, dass die Influenzaviren von neutralisierenden Antikörpern nicht mehr erkannt
werden. Es kommt zu einem sogenannten Antigendrift, welcher in der Bevölkerung eine
neue Influenza-Epidemie auslösen kann (Wright et al., 2007; 1.1.6). Bei Reassortierung von
Genomsegmenten zweier Parentalviren hingegen kann es vorkommen, dass in einer
Bevölkerung keine Immunität gegen die Nachkommenviren vorhanden ist. Zu einer solchen
Verschiebung der Antigenität haben in einigen Fällen auch Mutationen, ohne eine
Neuverteilung der Genomsegmente, geführt. Diese Vorkommnisse nennt man Antigenshift.
Ein solcher Antigenshift von Influenzaviren ist mit oder ohne Reassortierung für den
Ausbruch von Influenza-Pandemien in der Vergangenheit verantwortlich gewesen (Webster
et al., 1992; 1.1.6).
Abb. 3: Wirtsspektrum von Influenzaviren. Schematische Darstellung des Wirtsspektrums von Influenzaviren
und deren HA-Subtypen und dem Reservoir in wilden Wasservögeln (modifiziert nach Manz et al., 2013, erweitert
nach Webster et al., 1992 und Wright et al., 2007). Für die Subtypen H5, H6, H7 und H9 konnte bisher keine
Übertragung von Mensch zu Mensch beobachtet werden. Pfeile stellen die wahrscheinlichen Übertragungswege
dar.
10
Einleitung
1.1.6 Epidemiologie im Menschen
1.1.6.1 Influenza-Epidemien
Influenzaviren führen im Menschen zur klassischen Virusgrippe oder Influenza. Dabei
handelt es sich um fiebrige Atemwegserkrankungen dessen Pathogenese unter 1.1.7
beschrieben wird.
Durch die Mutationsrate von humanen Influenzaviren treten durch Antigendrift jährlich
Epidemien in der Bevölkerung auf. Laut Weltgesundheitsorganisation kommt es weltweit
jährlich zu etwa 3 bis 5 Millionen schweren Fällen von denen etwa 250 000 bis 500 000
einen letalen Ausgang zur Folge haben (http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs211/
en/index.html; 10.08.13). Epidemien treten meist im Winter auf. Die Ursachen hierfür
konnten noch nicht abschließend geklärt werden. Zum einen sind Influenzaviruspartikel bei
niedrigeren Temperaturen und trockener Luft stabiler, zum anderen begünstigt das Aufhalten
in geschlossenen Räumen mit anderen Menschen die Ansteckung (Cauchemez et al., 2008;
Shaman und Kohn, 2009). So konnte im Meerschweinchenmodell gezeigt werden, dass die
Aerosol-Transmission von saisonalen Influenzaviren bei niedriger Luftfeuchtigkeit und
niedriger Umgebungstemperatur am effizientesten ist (Lowen et al., 2007). Auch ist das
Immunsystem im Winter anfälliger, wenn die primäre Eintrittspforte der Viren, die
Nasenschleimhäute, durch Heizungsluft bereits gereizt ist (Salah et al., 1988; Dowell, 2001).
In tropischen Regionen treten Influenza-Epidemien zu keiner definierten Jahreszeit auf.
Abgesehen von der gesellschaftlichen Auswirkung führen die vielen Krankheitsfälle, bedingt
durch die jährlichen Influenza-Epidemien, zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen.
Aufgrund der meist geringen Unterschiede im Virusgenom humaner Influenzaviren zwischen
zwei Epidemiewellen und der zeitlichen Verzögerung vom Auftreten einzelner Virusstämme
bis zum Ausbruch einer Epidemie bieten jährlich angepasste Influenzaimpfstoffe eine gute
Prävention. Die größtenteils in Hühnereiern generierten Impfstoffe bestehen meist aus
inaktivierten Virusbestandteilen verschiedener zirkulierender Influenzaviren (Neumann et al.,
2009). Besonders betroffen sind junge Menschen unter zwei Jahren, bei denen sich vor
allem die adaptive Immunabwehr noch im Reifungsprozess befindet, ebenso gefährdet sind
ältere Menschen ab einem Alter von 65 Jahren, da bei ihnen das Immunsystem dem
Alterungsprozesse unterliegt (Wilschut et al., 2006). Weitere Risikogruppen sind Menschen
mit Vorerkrankungen oder supprimiertem Immunsystem (1.1.7). Derzeit zirkulieren in der
menschlichen Bevölkerung neben Influenza B Viren der Yamagatalinie, Influenzaviren des
saisonalen H3N2-Subtyps oder einer Variante und Viren des 2009 pandemischen H1N1Subtyps
(http://www.who.int/
influenza/gisrs
laboratory/updates/
summaryreport/en
/index.html; 05.08.13). Um möglichst schnell auf neu auftretende oder veränderte
Influenzastämme in der Bevölkerung zu reagieren, werden Probenanalysen, gemeldete
11
Einleitung
Krankenhausaufnahmen und Todesfälle, die mit Influenzaviren in Verbindung stehen
weltweit
von
Referenzzentren
registriert.
Diese
Datenerhebungen
laufen
bei
der
Weltgesundheitsorganisation zusammen und ermöglichen aktualisierte Impfempfehlungen
sowie eine schnellstmögliche Reaktion auf Epidemien und Pandemien. Dabei ist die
Erforschung von sogenannten adaptiven Mutationen und Pathogenitätsdeterminanten für
eine Risikoabschätzung von großer Bedeutung (1.1.8).
1.1.6.2 Influenza-Pandemien
Gelegentlich kommt es durch einen Antigenshift (1.1.5) in einer immunologisch naiven
Bevölkerung zum Ausbruch einer Pandemie. Dabei breitet sich ein Influenzavirusstamm
weltweit in der Bevölkerung aus und führt durch das Fehlen jeglicher Immunität der
Menschen gegen dieses Virus zu hohen Morbiditäten und Mortalitäten (Webster et al., 1992).
In vielen Teilen der Welt kommt es dabei zu mehreren Wellen von Infektionen. Ob die
Gründe dafür in einer veränderten Pathogenität der Viren, in der Immunantwort der
Bevölkerung
oder
anderer
epidemiologischer
Faktoren
liegt,
konnte
bisher
nicht
abschließend geklärt werden (Mummert et al., 2013). Die ersten belegten Berichte einer
Influenza-Pandemie gehen auf das Jahr 1918 mit der sogenannten „Spanischen Grippe"
zurück. Es folgten zwei weitere Pandemieausbrüche im 20. Jahrhundert, die „Asiatische
Grippe" und die „Hongkong Grippe". Ein weiterer unnatürlich herbeigeführter und häufig als
Pseudopandemie bezeichneter Influenzaausbruch trat 1977 auf und wurde als „Russische
Grippe" bezeichnet. Zuletzt kam es 2009 zu einer weltweiten Influenza-Pandemie (Abb. 4).
Diese 2009 pandemische H1N1 Influenza, die häufig auch als „Schweinegrippe“ oder „Neue
Grippe“ bezeichnet wurde, wird ausführlich unter 1.2 behandelt.
Die erste Pandemie des 20. Jahrhunderts, die „Spanische Grippe“ (H1N1), hatte 1918
vermutlich ihren Ursprung in den USA und nicht wie der Name vermuten lässt, in Spanien.
Nach heutigen Erkenntnissen mit Hilfe der reversen Genetik von Influenzaviren ist die
Pandemie vom H1-Subtyp durch Mutationen direkt vom Vogel auf den Menschen übertragen
worden (Reid et al., 2004; Taubenberger und Morens, 2006; Neumann et al., 2009).
Demnach hat also ein Antigenshift ohne vorherige Reassortierung stattgefunden. Nach einer
ersten Welle im Frühjahr 1918 kam es zu einer zweiten weltweit stärkeren Pandemie-Welle
im Herbst, gefolgt von einer dritten im darauffolgenden Jahr 1919 (Neumann et al., 2009).
Nach heutigen Schätzungen sind bis zu 50 Millionen Menschen an den Folgen der
„Spanischen Grippe“ verstorben (Johnson und Mueller, 2002). Ungewöhnlicherweise traten
etwa 50 % der Todesfälle unter jungen Erwachsenen zwischen 20 und 40 Jahren auf
(Simonsen et al., 1998). Der Grund dafür konnte bis heute nicht geklärt werden. Die
Erkrankungen beschränkten sich überwiegend auf den Respirationstrakt und hatten in vielen
Fällen schwerwiegende Pneumonien zur Folge (Reid et al., 2004; Kobasa et al., 2007). Die
12
Einleitung
hohe Sterberate der Spanischen Pandemie wird jedoch auch zum Großteil auf
Sekundärerkrankungen zurückgeführt. Bakterielle Pneumonien, vor allem durch den Erreger
Hemophilus influenzae, waren vermutlich die häufigste Todesursache da zu der Zeit noch
keine Behandlung mit Antibiotika statt fand (Morens et al., 2008).
Der Auslöser der 1957 ursprünglich in China ausgebrochenen „Asiatischen Grippe“ (H2N2)
war eine Reassortante aus den zu der Zeit zirkulierenden Influenzaviren mit aviären
Influenzaviren. Dabei wurden neben der Polymeraseuntereinheit PB1 das H2 und das N2
aus aviären Viren in die im Menschen zirkulierenden Influenzaviren eingeführt (Scholtissek et
al., 1978; Kawaoka et al., 1989). Da es sich dabei um die stark immunogenen
Oberflächenproteine handelte, lag keine Immunität gegen das neu reassortierte Virus im
Menschen vor. Die Opfer waren meist sehr jung oder bereits im höheren Alter. Weltweit
erlagen mehr als eine Million Menschen dieser Pandemie sowie einer zweiten Welle 1958
(Wilschut et al., 2006; Wright et al., 2007).
Abb. 4: Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts. Anhand von Virusgenomanalysen wurde
nachgewiesen, dass die Spanische Grippe (H1N1) 1918 durch adaptive Mutationen direkt vom Vogel auf den
Menschen übertragen wurde. Die Asiatische (H2N2) und die Hongkong (H3N2) Pandemie wurden 1957 bzw.
1968 durch Reassotierung von aviären Influenzaviren mit bereits in der Bevölkerung zirkulierenden Influenzaviren
ausgelöst. Dabei wurden jeweils neue HA-Subtypen auf den Menschen übertragen, welche den bereits
zirkulierenden HA-Subtyp verdrängten. Der Ursprung der Russischen Pseudopandemie (H1N1) 1977 waren
vermutlich archivierte Laborviren, da starke Ähnlichkeit mit Influenzaviren aus den Fünfzigerjahren bestand. Der
H1N1-Subtyp der Russischen Pseudopandemie zirkulierte anschließend parallel zum H2N3-Subtyp der
Hongkong Grippe. Modifiziert nach Horimoto und Kawaoka, 2005.
13
Einleitung
Bereits zehn Jahre später, im Jahr 1968, kam es zu einer erneuten weltweiten InfluenzaPandemie, der „Hongkong Grippe“. Das erste Isolat wurde in Hongkong isoliert und gehörte
dem H3N2-Subtyp an. Wie bei der „Asiatischen Grippe“ stammte das PB1 und das
Hämagglutinin aus Vögeln, wohingegen das NA und die übrigen Genomsegmente aus
bereits zirkulierenden humanen Influenzaviren stammten (Scholtissek et al., 1978; Kawaoka
et al., 1989). Die Letalitätsrate dieser Pandemie lag mit geschätzten 500 000 bis einer Million
Toten unter der vorangegangenen Pandemie von 1957 (Wilschut et al., 2006). Es wird
vermutet, dass dies an einer Teilimmunität gegen das N2 aus bereits zirkulierenden Viren lag
(Wright et al., 2007). Die Hongkong Pandemie grassierte mit zwei großen Infektionswellen
um die Jahreswechsel 1968/69 und 1969/70 unter den Menschen (Neumann et al., 2009).
Die „Russische Grippe“, welche 1977 zuerst in China gemeldet wurde, war wie die
„Spanische Grippe“ vom H1N1-Subtyp. Das Genom der Influenzaviren wies eine starke
Ähnlichkeit mit H1N1 Influenzaviren auf, die um 1950 in der Bevölkerung zirkulierten
(Nakajima et al., 1978). Daher wird davon ausgegangen, dass diese Pseudopandemie durch
archivierte Laborviren ausgelöst wurde. Der milde Verlauf der Russischen Grippe wird darauf
zurückgeführt, dass Menschen über 27 Jahre bereits in den Fünfzigern mit diesem
Virusstamm in Kontakt gekommen waren und damit über Antikörper gegen das Virus
verfügten (Wilschut et al., 2006). Im Gegensatz zu den vorherigen Pandemien H2N2 und
H3N2 ersetze das H1N1 Virus von 1977 nicht den zirkulierenden Subtyp, sondern verblieb
parallel zum H3N2-Subtyp in der Bevölkerung (Wright et al., 2007; Neumann et al., 2009).
1.1.6.3 Influenza-Zoonosen
Eine Übertragung von HPAIV des H5N1-Subtyps löst im Menschen eine schwere
Virusgrippe (1.1.7) mit einer derzeitigen Letalitätsrate von etwa 60 % aus (WHO;
http://www.who.int/influenza/human
animal
interface/H5N1
cumulative
table
archives/en/index.html; 05.08.13). Seit 2003 wurden 633 Fälle gemeldet, von denen der
Großteil im asiatischen und nordafrikanischen Raum auftritt, wo es zu häufigen und engen
Kontakten von Mensch und Geflügel kommt. Aber auch in Europa wurde bei einem
Geflügelpestausbruch 2003 in den Niederlanden HPAIVs des H7N7-Subtyps aus Menschen
isoliert (Koopmans et al., 2004). Die Infektion beschränkte sich jedoch meist auf eine
Konjunktivitis mit milder Grippesymptomatik (Fouchier et al., 2004). Mensch zu Mensch
Übertragungen wurden bisher nur in einzelnen Fällen diskutiert (Kandun et al., 2006; Wang
et al., 2008). Das Auftreten von adaptiven Mutationen kann jedoch in infizierten Patienten zur
Entstehung von übertragbaren H5N1 Influenzaviren führen und eine Pandemie in der
Bevölkerung auslösen (Horimoto und Kawaoka, 2005). 2012 wurden zwei Studien
veröffentlicht, in denen Influenzaviren des H5N1-Subtyps experimentell an Frettchen
adaptiert wurden (Herfst et al., 2012; Imai et al., 2012). Das Frettchen wird aufgrund einer
14
Einleitung
dem Menschen ähnlichen Virusrezeptorverteilung in den Atemwegen sowie einer ähnlichen
Grippesymptomatik als Modellorganismus für human relevante Influenzaviren verwendet
(1.3.3; Belser et al., 2011b). Besorgniserregend war dabei, dass für eine Übertragung der
Viren in diesem Säugermodell nur einige wenige Mutationen im Rezeptorbindeprotein HA
nötig waren. Diese Viren waren zwar niedriger pathogen als die Parentalviren, unterstreichen
jedoch, dass H5N1 Influenzaviren zumindest tierexperimentell die Fähigkeit besitzen können,
Pandemien auszulösen.
Die jüngsten Vorkommnisse von Übertragungen des LPAIV-Subtyps H7N9 auf den
Menschen lassen nun neben HPAIV auch LPAIV mehr in den Fokus der Forschung und der
Gesundheitsüberwachung rücken. Im Gegensatz zu einigen wenigen Übertragungen von
LPAIV vom H6N1-, H7N2-, H7N3- und H9N2-Subtyp (Guo et al., 1999; Belser et al., 2009a;
www.who.int/ influenza/human_animal_interface/ Influenza_Summary_ IRA_HA_interface_
03July13.pdf), werden seit März 2013 vermehrt Fälle von H7N9-Infektionen in Menschen
gemeldet.
Besorgniserregend
ist
hierbei
die
steigende
Anzahl
an
schweren
Krankheitsverläufen und Todesfällen (Yu et al., 2013).
1.1.7 Pathogenese im Menschen
Eine Influenzavirusinfektion verursacht im Menschen die klassische Virusgrippe. Diese ist in
der Regel hochansteckend und wird meist über eine Tröpfchen-, Kontakt- oder
Schmierinfektion übertragen. Dabei können die infektiösen Virionen, meist aus Nasensekret
von Erkrankten, auf glatten Oberflächen bis zu mehreren Tagen infektiös sein (Bean et al.,
1982). Die Eintrittspforte der Viren sind die Schleimhäute der oberen Atemwege oder in
einigen Fällen auch die Bindehaut des Menschen. Gelangen durch Kontakt oder Aerosole in
der Luft ausreichend Viruspartikel an die Schleimhäute, kommt es zu einer Infektion über die
Epithelzellen (1.1.4). Die Inkubationszeit liegt zwischen 24 Stunden und vier Tagen (Wilschut
et al., 2006). Im Gegensatz zu anderen respiratorischen Infektionskrankheiten zeichnet sich
eine Influenzavirusinfektion durch einen plötzlichen Krankheitsbeginn mit hohem Fieber aus.
In den ersten Tagen dominieren durch proinflammatorische Zytokine ausgelöste systemische
Symptome, dazu zählen Fieber, Schüttelfrost, Glieder-, Muskel- und Kopfschmerzen. In
einigen Fällen kann es auch zu Magen-Darm-Symptomen wie Erbrechen und Durchfällen
kommen.
Die
lokalen
Symptome
unterscheiden
sich
kaum
von
denen
anderer
respiratorischer Erkrankungen (Loeb et al., 2000). Durch die Entzündungsreaktion und die
Lyse der infizierten Epithelzellen in den oberen Atemwegen bis hin zu Trachea kommt es zu
Schleimbildung und Flüssigkeitsansammlungen, begleitet von Halsschmerzen und einem
charakteristischen trockenen Husten (Wilschut et al., 2006). Bei Kindern führt eine
Influenzavirusinfektion häufig auch zu einer begleitenden Mittelohrentzündung (Vesa et al.,
15
Einleitung
2001). Influenzavirusinfektionen sind im Menschen meist auf den Respirationstrakt
beschränkt und klingen in der Regel nach etwa sieben bis zehn Tagen wieder ab
(Taubenberger und Morens, 2008). Eine allgemeine Abgeschlagenheit kann bei Erkrankten
jedoch weitere zwei Wochen andauern. Liegen keine zusätzlichen Vorerkrankungen oder
Komplikationen
vor,
Krankheitsverläufen
kommt
durch
es
zu
einer
vorliegende
vollständigen
Vorerkrankungen,
Heilung.
einem
Bei
schweren
geschwächten
Immunsystem, einer Pandemie oder auch einer Infektion mit HPAIV kann der untere
Respirationstrakt infiziert werden und zur Ausbildung einer primär viralen Pneumonie führen
(Wilschut et al., 2006; Wright et al., 2007). Die Kapillarpermeabilität erhöht sich durch die
Zerstörung der Epithelschicht in den Lungen wodurch es zu Hämorrhagien und Ödemen in
den Kapillarzwischenräumen kommt (Wilschut et al., 2006; Taubenberger und Morens,
2008). Dies hat meist eine Hypoxie des Patienten zur Folge, die oft schon nach wenigen
Tagen zum Tod führen kann. Des Weiteren wird ein sogenannter Zytokinsturm mit dem
tödlichen Verlauf von pandemischen und H5N1 Influenzavirusinfektionen in Verbindung
gebracht (de Jong et al., 2006; Neumann et al., 2009). Dabei kommt es durch das Fehlen
jeglicher Immunität zu einer massiven Entzündungsreaktion des betroffenen Gewebes, die
vom Immunsystem nicht mehr kontrolliert werden kann. Bei einem bedeutenden Anteil der
Pneumonien in Verbindung mit einer Virusgrippe handelt es sich jedoch um eine bakterielle
Koinfektion. Die Schwächung des Immunsystems und die Reizung der Schleimhäute
begünstigen eine Infektion mit Bakterien der Arten Streptococcus pneumoniae und
Staphylococcus aureus, seltener auch Haemophylus influenzae (Wright et al., 2007;
Metersky et al., 2012). Auch wenn eine Virusgrippe meist auf den Respirationstrakt
beschränkt ist, wurden Influenzaviren ebenfalls in extrapulmonären Organen detektiert
(Wright et al., 2007). Dabei handelte es sich meist um eine Infektion mit HPAIV. Eine
Infektion des zentralen Nervensystems hat oft schwere Enzephalopathien zur Folge (Wang
et al., 2010; Tsai und Baker, 2013). Gelangen die Viren in die Blutbahn, kommt es zu einer
Virämie (Beigel et al., 2005; Dawood et al., 2009). Darüber hinaus führen schwerwiegende
Influenzaviruserkrankungen oftmals zu weiteren extrapulmonären Komplikationen. Dazu
zählen Konjunktivitis, Myositis, Myokarditis oder das Reye Syndrom (Wilschut et al., 2006;
Wright et al., 2007). Komplikationen treten häufig auch bei Menschen mit entsprechenden
Vorerkrankungen auf. Chronische Lungenerkrankungen wie Asthma oder chronische
Herzerkrankungen so wie eine vorliegende Diabetes erhöhen das Risiko einer Infektion.
Auch schwangere Frauen waren bisher öfter von Komplikationen in Verbindung mit einer
Influenzavirusinfektion betroffen und werden besonders seit der 2009 pandemischen H1N1
Influenza von der Weltgesundheitsorganisation als höchste Risikogruppe eingestuft (WHO,
2009).
16
Einleitung
Die Diagnose einer Influenzavirusinfektion lässt sich aufgrund der Ähnlichkeiten zu anderen
respiratorischen Infektionen nur mittels Laboranalyse stellen, meist durch Detektion von
Antigenen oder viraler RNA. Da eine effektive Behandlung jedoch von einer schnellen
Diagnose abhängig ist, werden oftmals sowohl zeitliche Kriterien als auch eine festgelegte
Kombination von Symptomen zu Hilfe genommen. Diese Kombination zur Feststellung einer
sogenannten Influenza-ähnlichen Erkrankung, kurz ILI (influenza like illness), setzt sich aus
dem
Vorliegen
einer
akuten
respiratorischen
Erkrankung
mit
mindestens
38 °C
Körpertemperatur und Husten über sieben Tage zusammen (WHO, 2011). Zusätzlich ist das
zeitliche
Auftreten
einer
Atemwegserkrankung
entscheidend.
Eine
Infektion
mit
Influenzaviren ist während einer Grippesaison wahrscheinlicher.
Neben einer symptomatischen Behandlung, welche bei schwerwiegenden Fällen eine
künstliche Beatmung einschließt, sind derzeit verschiedene antivirale Medikamente
erhältlich. Eine medikamentöse Therapie kann durch die Gabe von M2-Ionenkanalinhibitoren
(Amantadin, Rimantadin) oder Neuraminidasehemmern (Zanamivir, Oseltamivir) erfolgen.
Erstere hemmen die Freisetzung des viralen Genoms in einer infizierten Zelle und zweite
verhindern das Freisetzen von neuen Virusnachkommen (Hay et al., 1985; Moscona, 2005).
Da jedoch durch beide Therapieansätze die Infektion nicht verhindert sondern nur im
weiteren
Verlauf
geschwächt
wird,
ist
der
Erfolg
von
einem
möglichst
frühen
Behandlungsbeginn abhängig. Durch die hohe Mutationsfrequenz von Influenzaviren treten
immer häufiger Resistenzen gegen die vorhandenen antiviralen Medikamente auf. Daher ist
die Entwicklung neuer Therapieansätze von großer Bedeutung.
1.1.8 Adaptive Mutationen und Pathogenitätsdeterminanten im Säuger
Influenzaviren sind an ihren ursprünglichen Wirt, die Wasservögel, optimal angepasst (1.1.5).
Findet eine Übertragung auf eine andere Spezies statt, haben in der Regel Veränderungen
im Virusgenom, sogenannte adaptive Mutationen, stattgefunden und eine Infektion des
neuen Wirts ermöglicht. Der Selektionsdruck in einem neuen Wirt führt zu weiteren adaptiven
Mutationen, die zur Etablierung des Virusstamms in diesem Wirt führen können (1.1.5;
Webster et al., 1992). Veränderungen im Virusgenom, die eine Erkrankung in einem Wirt
auslösen, werden als Pathogenitätsdeterminanten bezeichnet. Dies beinhaltet auch
genetische
Veränderungen,
schwerwiegenderen
die
zu
Krankheitsverlauf
einer
führen.
erhöhten
Neben
Letalität
adaptiven
oder
zu
einem
Mutationen
können
Zwischenwirte eine Anpassung an einen neuen Wirt ermöglichen (Subbarao und Katz, 2000;
Ma et al., 2008). Ein Beispiel für einen solchen Zwischenwirt ist das Schwein (Scholtissek,
1990). Die Verteilung der viralen Rezeptoren im Respirationstrakt von Schweinen ermöglicht
eine Infektion mit aviären wie auch humanen Influenzaviren (s.u.). Eine Koinfektion mit Viren
17
Einleitung
beider Ursprünge kann zur Reassortierung führen. Dabei können Virusnachkommen
entstehen, die aufgrund der human adaptierten Genomsegmente für den Menschen infektiös
sind oder aber zusätzlich von Mensch zu Mensch weiter übertragen werden können.
Gegenüber Genomsegmenten aviären Ursprungs ist dann jedoch keine Immunität
vorhanden und die Pathogenität im Menschen erhöht. Ein Beispiel für einen solchen
Vorgang ist die Entstehung des 2009 pandemischen H1N1 Influenzavirus, welches unter 1.2
ausführlicher behandelt wird.
Durch den Vergleich von aviären und humanen Influenzaviren konnten viele Determinanten
identifiziert werden, die die Gefahr einer Anpassung an den Menschen, einer erhöhten
Pathogenität oder der Fähigkeit von Mensch zu Mensch zu transmittieren bergen. Es folgt
eine Übersicht über einige der wichtigsten bisher beschriebenen Determinanten der
Pathogenität und des Wirtsspektrums.
Um einen neuen Wirt zu infizieren, ist die erste zelluläre Barriere, die eine Anpassung
erfordert, die Bindung des viralen Hämagglutinins (HA) an seinen Rezeptor, die Sialinsäure
(1.1.4). Dabei unterscheidet sich die Spezifität von aviären und humanen Influenzaviren
(Connor et al., 1994). Aviäre Viren binden präferenziell α2,3-konjugierte Sialinsäuren, die im
Intestinaltrakt von Vögeln vorkommen, und ermöglichen so eine eine Infektion in diesen
Bereichen. Die Epithelzellen im oberen Respirationstrakt des Menschen weisen hingegen
überwiegend
α2,6-konjugierte
Sialinsäuren
auf
(Couceiro
et
al.,
1993).
Humane
Influenzaviren haben durch adaptive Mutationen in der Rezeptorbindungsstelle des
Hämagglutinins die Fähigkeit erworben, präferenziell an diesen Sialinsäuretyp zu binden
(Neumann et al., 2009). Eine Infektion mit humanen Influenzaviren ist im Menschen daher
meist auf die oberen Atemwege beschränkt (1.1.7). Der untere Respirationstrakt von
Menschen enthält im Gegensatz dazu eine hohe Anzahl an α2,3-konjugierte Sialinsäuren.
Eine Infektion mit aviären Viren ist über die Eintrittspforte des oberen Respirationstrakts von
Menschen
zwar
vergleichsweise
ineffizient,
kann
sich
dann
jedoch
über
die
Rezeptorspezifität effizient in der Lunge ausbreiten und zu schweren Pneumonien führen
(1.1.7; Bouvier und Palese, 2008).
Eine weitere wichtige Pathogenitätsdeterminante ist die proteolytische Spaltstelle im viralen
HA-Protein. Für die fusogene Aktivität des HAs bei der Freisetzung der viralen RNPs im
Replikationszyklus (1.1.4) muss diese durch zelluläre Proteasen aktiviert werden
(Steinhauer,
1999;
Palese
und
Shaw,
2007).
Niedrigpathogene
und
nicht-aviäre
Influenzaviren besitzen an dieser Stelle ein einzelnes Arginin. Die Spaltung erfolgt durch
zelluläre Proteasen, welche im Respirationstrakt, bei Vögeln auch im Intestinaltrakt,
exprimiert werden (Webster et al., 1992). Neben trypsinähnlichen Proteasen wurden kürzlich
18
Einleitung
weitere zelluläre und auch bakterielle Faktoren identifiziert die eine Aktivierung des HA
Proteins herbeiführen (Bottcher-Friebertshauser et al., 2013). Durch die Verteilung dieser
Proteasen ist die Infektion mit Influenzaviren mit monobasischer Spaltstelle meist auf den
Respirationstrakt limitiert, wie auch schon durch die Rezeptorspezifität. HPAIV des H5- und
H7-Subtyps verfügen über eine multibasische Spaltstelle im HA und eine Aktivierung erfolgt
durch ubiquitär vorkommende Proteasen wie Furin oder PC6 (Kawaoka und Webster, 1988;
Stieneke-Grober et al., 1992). Dadurch können systemische Infektionen ausgelöst werden,
wobei auch extrapulmonale Organe betroffen sind. Die erhöhte Pathogenität von HPAIV in
Vögeln und auch im Menschen wird zum Großteil auf diese Pathogenitätsdeterminante
zurückgeführt (Horimoto und Kawaoka, 2005).
Eine weitere zelluläre Barriere im Infektionszyklus von Influenzaviren stellt die Kernmembran
dar. Für die Replikation und Transkription der vRNP-Komplexe im Zellkern ist das
Influenzavirus auf die Kernimportmaschinerie der Zelle angewiesen (1.1.4; Resa-Infante und
Gabriel, 2013). Dabei vermitteln in erster Linie Importin-α Isoformen als Adapterproteine der
zellulären Importmaschinerie die Bindung der zu transportierenden Proteine (Chook und
Blobel, 2001). Eine Anpassung an diese Importin-α Isoformen als Kernimportkomponenten
des Wirts wird durch Mutationen in der viralen Polymerase und dem NP-Protein erreicht
(Gabriel et al., 2005; Naffakh et al., 2008; Resa-Infante und Gabriel, 2013). Es wurde
gezeigt, dass aviäre und humane Influenzaviren an unterschiedliche Isoformen angepasst
sind (Gabriel et al., 2011; Hudjetz und Gabriel, 2012).
Des Weiteren wurden in der PB2 Untereinheit der viralen Polymerase entscheidende
Signaturen des Wirtsspektrums und der Pathogenität identifiziert (Gabriel et al., 2007;
Naffakh et al., 2008; Mehle und Doudna, 2009). An der Aminosäureposition 627 von PB2
dominiert bei aviären Viren ein Glutamat, wo hingegen humane Viren meist ein Lysin
besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass ein Lysin an dieser Stelle eine effizientere
Replikation im oberen Respirationstrakt von Säugern zur Folge hat (Hatta et al., 2007). Dies
führt, wie experimentelle Versuche in Meerschweinchen gezeigt haben, auch zu einer
erhöhten Transmission von Influenzaviren mit dieser Signatur (Steel et al., 2009). Im
Menschen wurde diese Pathogenitätsdeterminante erstmals in einem H3N2 Virus mit
erhöhter Replikationseffizienz beschrieben (Subbarao et al., 1993). Im Umkehrschluss führt
die Aminosäure Glutamat an der Position 627 zu einer weniger effizienten Replikation und
niedrigeren Pathogenität im Säuger, was den wirtsadaptiven Charakter dieser Signatur
unterstreicht (Clements et al., 1992; Mehle und Doudna, 2008). Eine weitere wichtige
Pathogenitätsdeterminante im PB2 ist eine Mutation an Position 701. Es wurde gezeigt, dass
ein Asparagin an dieser Aminosäureposition im Säuger mit einer erhöhten Virusreplikation
und Pathogenität einen vergleichbaren Effekt hat wie die 627 Signatur (Gabriel et al., 2005;
19
Einleitung
de Jong et al., 2006). Beide Signaturen kommen jedoch in natürlichen Isolaten nicht
gleichzeitig vor, was darauf schließen lässt, dass sie sich durch eine ähnliche Funktion
ersetzen. Weitere wirtsadaptive Signaturen wurden für die Polymeraseuntereinheit PB1 und
das NP Protein beschrieben (Gabriel et al., 2007; Watanabe et al., 2009; Xu et al., 2012a;
Gabriel et al., 2013).
Das Nichtstrukurprotein NS1 stellt eine zusätzliche Pathogenitätsdeterminante dar. NS1
inhibiert unter anderem zelluläre Signalwege, wie die Aktivierung von Replikationsfaktoren,
sowie die antivirale Immunantwort der Wirtszelle und wird daher als Interferonantagonist
bezeichnet (Wang et al., 2000; Hale et al., 2008). Unterschiedliche Mutationen wurden mit
einer erhöhten Pathogenität unterschiedlicher Virusstämme in Verbindung gebracht (Wright
et al., 2007; Jiao et al., 2008). Daher scheinen Pathogenitätsdeterminanten in NS1 abhängig
vom jeweiligen Virusstamm zu sein. Eine Glutaminsäure an Position 92 von NS1 in HPAIV
vermittelt beispielsweise eine Resistenz gegenüber der Interferonantwort des Wirts (Seo et
al., 2002). Dies führt zu einer überschießenden Zytokinantwort, welches im Menschen als
einer der Faktoren für die hohe Mortalität von H5N1-Infektionen gilt (Yuen et al., 1998; Peiris
et al., 2004). Reassortanten von humanen Influenzaviren mit dem NS1 der „Spanischen
Grippe“ von 1918 verursachen in experimentellen Versuchen eine erhöhte Virulenz in
Mäusen (Jackson et al., 2008). Hier wurden insgesamt vier Aminosäurereste am C-Terminus
des Proteins als verantwortliche Determinanten beschrieben.
Das durch einen offenen Leserahmen im PB1-Segment exprimierte virale Protein PB1-F2
kommt im Viruspartikel nicht vor sondern spielt eine Rolle bei der Regulation der
Polymeraseaktivität im Replikationszyklus und induziert die Apoptoseantwort der Wirtszellen
(1.1.4; Palese und Shaw, 2007). Daher kann dieses Protein ebenfalls einen wichtigen
Pathogenitätsfaktor von Influenzaviren darstellen, abhängig vom jeweiligen Influenzastamm
(Zamarin et al., 2006; Neumann et al., 2009; Krumbholz et al., 2011). Ein Serin an der
Position 66 im PB1-F2 von H5N1 Influenzaviren erhöht beispielsweise die Pathogenität von
humanen Viren in der Maus (Conenello et al., 2007). Das Influenzavirus der 1918 Pandemie
enthielt ebenfalls ein Serin an Position 66 (Krumbholz et al., 2011). Klassische
Schweineviren vom H1N1-Subtyp und humane H1N1 Influenzaviren seit 1950 kodieren
hingegen für eine verkürzte Version dieses Proteins ohne bekannte Funktion (Zell et al.,
2007).
20
Einleitung
1.2 2009 pandemische H1N1 Influenza (2009 pH1N1)
1.2.1 Epidemiologie der 2009 pH1N1 Influenza
Die ersten Fälle der 2009 pH1N1 Influenza traten Mitte Februar 2009 in Mexiko auf (Fraser
et al., 2009). Bereits einen Monat später, im März 2009, stieg die Anzahl von Influenza
ähnlichen Erkrankungen, bei denen es zur Aufnahme ins Krankenhaus und oftmals auch zu
Todesfällen kam. Ende April wurden die ersten Fälle des inzwischen identifizierten H1N1
Influenzastamms in den USA gemeldet (http://www.who.int/ csr/don/ 2009_04_24/
en/index.html). Die Weltgesundheitsorganisation meldete am 25. April 2009, dass es sich bei
dem Influenza Ausbruch um eine Situation von globalem Interesse handelt. Bereits zwei
Tage später wurde die Pandemiestufe fünf ausgerufen. Diese besagt, dass es vermehrt zu
Mensch zu Mensch Übertragungen in mindestens zwei verschiedenen Staaten kommt
(Dawood et al., 2009). Der neue H1N1-Subtyp hatte sich bis Anfang Mai 2009 über elf
Länder ausgebreitet. Die WHO gab ab August weltweit einen Rückgang der neu gemeldeten
Fälle bekannt und setzte die Pandemiewarnstufe herab (http://www.who.int/ csr/don/
2009_08_28/ en/index.html). Dadurch zeichnete sich auch der erste Höhepunkt von
Infektionsfällen der 2009 Pandemie aus. Ende September 2009 konnten die ersten
flächendeckenden Impfaktionen in China initiiert werden. Kurz darauf folgten Australien,
Schweden, Japan und Großbritannien. In Deutschland war der erste Impfstoff gegen das
2009 pH1N1 Influenzavirus Ende Oktober 2009 verfügbar (Wichmann et al., 2010). Bis
Oktober waren mindestens 80 Länder von der Pandemie betroffen und etwa 5000 Todesfälle
bestätigt
worden
(http://www.who.int/
csr/disease/
swineflu/laboratory
16_10_2009/
en/index.html). In der nördlichen Hemisphäre stieg die Anzahl der Influenza Fälle im Winter
2009 wieder an und ließ die jährliche Influenza Saison ungewöhnlich früh anfangen. Die
höchste Anzahl der Infektionen mit 2009 pH1N1 Influenza wurde weltweit im Dezember
gemeldet. Eineinhalb Jahre nach Ausbruch der Pandemie waren die neu auftretenden
Infektionen vergleichbar zum saisonalen Auftreten von Influenza-Epidemien und die WHO
deklarierte
am
10.
August
2010
das
Ende
der
Pandemie
(http://www.who.int/
mediacentre/news/ statements/2010/ h1n1_vpc_20100810/ en/index.html). Die 2009 pH1N1
Influenzaviren haben seitdem den bisherigen H1N1 Influenzastamm abgelöst und zirkulieren
weltweit parallel zu Influenzaviren des H3N2-Subtyps.
Auch wenn die Höhepunkte weltweit gemeldeter Fälle der 2009 Pandemie im August und
Dezember 2009 auftraten, kam es in verschiedenen Regionen der Erde zu unterschiedlichen
Infektionswellen. Länder wie die USA, Kanada, Neuseeland und viele weitere meldeten zwei
Wellen an Infektionen (Helferty et al., 2010; Bandaranayake et al., 2011; Mummert et al.,
2013). In den USA kam es Anfang Juni und Mitte Oktober jeweils zu Höchstständen der
gemeldeten Fälle (Abb. 5A). Dies war früher als die zwei weltweit gemeldeten Höchststände
21
Einleitung
im August und Dezember und lag vermutlich an der geographischen Nähe zum
Ausbruchsort. Andere Länder meldeten nur eine Pandemie-Welle. In Deutschland wurden
die ersten Fälle Ende April aus Hamburg und Bayern gemeldet und anschließend vom
Robert-Koch-Institut
bestätigt
(http://www.rki.de/
DE/Content/Service/Presse/
Pressemitteilungen/ 2009/08_2009.html). Deutschland meldete vergleichsweise wenige Fälle
der 2009 Pandemie im Frühjahr und Sommer 2009, wobei es sich zum Großteil um
importierte
Infektionen
handelte
und
die
jährlich
auftretenden
saisonalen
Influenzameldungen nicht signifikant überstieg (Robert-Koch-Institut, 2010). Die ersten
Todesfälle hingegen traten im September auf (Poggensee et al., 2010; Wilking et al., 2010)
und im November kam es in Deutschland zu einer ausgeprägten Pandemie-Welle, in der die
meisten Influenza-assoziierten Todesfälle auftraten (Abb. 5B; Robert-Koch-Institut, 2010).
Auch in China kam es nur zu einer Pandemie-Welle (Mummert et al., 2013). Es wird
spekuliert, ob dies an den zuvor implementierten strengen Grenzkontrollen möglicher
infizierter Einreisender lag. In Deutschland ist das Auftreten von nur einer Pandemie-Welle
damit nicht zu erklären. Das Ende der Sommerferien, neu auftretende Mutation in den
zirkulierenden pandemischen Influenzaviren (1.2.3) und die Jahreszeit werden hier als
mögliche Ursachen diskutiert (Poggensee et al., 2010; Mummert et al., 2013). Die
Schwierigkeit, allgemein gültige Ursachen für das Auftreten von Wellen während einer
Pandemie festzustellen, verdeutlicht sich weiter durch die Meldung von beispielsweise drei
Pandemie-Wellen in Dänemark oder in Großbritannien (Dorigatti et al., 2013; Orsted et al.,
2013).
Abb. 5: Anzahl gemeldeter Fälle der 2009 pH1N1 Influenza in den USA und Deutschland in 2009. A)
Gemeldete Fälle der 2009 pH1N1 Influenza in den USA vom Ausbruch im April bis zum November 2009
(modifiziert nach Mummert et al., 2013). B) Anzahl der gemeldeten Fälle vom Robert-Koch-Institut für
Deutschland für das ganze Jahr 2009 (modifiziert nach Robert-Koch-Institut, 2010).
Bis zum Ende der Pandemie im August 2010 wurden der WHO etwa 18 500 Todesfälle mit
bestätigter 2009 pH1N1 Influenza gemeldet (http://www.who.int/ csr/don/ 2010_08_06/
en/index.html). In Deutschland waren es bis zum Frühjahr 2010 etwa 250 Erkrankungen mit
22
Einleitung
Todesfolge (Wilking et al., 2010). Damit ist Deutschland eines der Länder mit der niedrigsten
Mortalität der 2009 pH1N1 Influenza. Die Anzahl der Infektionen wurde seit Dezember 2009
nicht mehr von der WHO erhoben, da milde Fälle der 2009 Pandemie nicht mehr erfasst
oder die Patienten gar nicht mehr vorstellig wurden. Da es im Vergleich zu vorherigen
Pandemien im Schnitt zu mehr milden Erkrankungsfällen kam (1.2.2) und die etwa 18 500
Todesfälle im Vergleich zur saisonalen Influenza mit jährlich bis zu 500 000 InfluenzaEpidemieopfern weltweit viel weniger waren, kam die Frage auf, ob die 2009 Pandemie
überschätzt wurde. Um die Mortalität dieser Pandemie im Nachhinein einzuschätzen, wurde
die Anzahl der verlorenen Lebensjahre der Opfer berechnet (Miller et al., 2010; Dawood et
al., 2012). Im Vergleich zu saisonalen Influenza-Epidemien trat bei der 2009 Pandemie die
größte Anzahl der Erkrankungen mit Todesfolge unter Kindern und jungen Erwachsenen auf,
welche nach statistischer Lebenserwartung noch mehr Lebensjahre vor sich hatten als ältere
Menschen (1.2.2; Vaillant et al., 2009; Karageorgopoulos et al., 2011). Des Weiteren wurde
bei Erhebung der Daten viele Todesfälle von Menschen mit vorliegenden Vorerkrankungen
oder anderen Komplikationen nicht erfasst. Ebenfalls nicht in die Mortalität einbezogen sind
Fälle von Patienten, bei denen zum Zeitpunkt des Todes keine Viren mehr nachgewiesen
wurden. Bei Schätzungen der Mortalität vergangener Pandemien wurde oftmals nur die
statistische Sterberate als Referenz genommen (Serfling, 1963; Miller et al., 2010). Ein
weiterer Nachteil der von der WHO veröffentlichten Mortalitätsrate ist die Verlässlichkeit und
die Flächenabdeckung der einzelnen Referenzzentren weltweit (Viboud und Simonsen,
2012). Schätzungen der zusammengefassten Todesrate der 2009 pH1N1 Influenza sind
oftmals nur für einzelne Länder, meist Industrienationen mit guter medizinischer Infrastruktur,
erhältlich (Wilking et al., 2010; Lemaitre et al., 2012). Aktuelle anerkannte Schätzungen der
2009 Pandemie-assoziierten Todesfälle liegen bei 152 000 bis 575 000 Menschen, also
15-fach höher als die von der WHO gemeldeten Zahlen (Dawood et al., 2012).
1.2.1.1 Ursprung der 2009 pH1N1 Influenzaviren
Die morphologische Charakterisierung der neuen 2009 pH1N1 Influenzaviren zeigte
sphärische und filamentöse Viruspartikel, wobei die filamentöse Form in erster Linie in
klinischen Isolaten zu finden war (Itoh et al., 2009; Neumann et al., 2009; Goldsmith et al.,
2011) Nach Sequenzierung der ersten Isolate der 2009 pH1N1 Influenza wurde die
genetische Zusammenstellung des Virusstamms entschlüsselt. Es konnte gezeigt werden,
dass die neuen Influenzaviren Reassortanten aus vier verschiedenen Ursprungsstämmen
sind (Abb. 6). Die Segmente der Polymeraseproteine PB2 und PA stammen aus einer
nordamerikanischen aviären Influenzalinie, die des Polymeraseproteins PB1, aus einer im
Menschen zirkulierende saisonale H3N2 Influenza. Die Genomsegmente HA, NP und NS
hingegen kommen aus klassischen Schweineinfluenzastämmen. NA und M stammen aus
eurasischen Vogelinfluenza-ähnlichen Schweineviren (Dawood et al., 2009; Garten et al.,
23
Einleitung
2009; Neumann et al., 2009). Vor der direkten Übertragung auf den Menschen kam es bei
der Entstehung der 2009 pH1N1 Influenzaviren in zwei Stufen zur Reassortierung im
Schwein. Wie unter 1.1.8 beschrieben, ist das Schwein ein bekanntes Mischgefäß für Viren
aviären und humanen Ursprungs (Scholtissek, 1990). Dreifach-Reassortanten von denen
das 2009 pH1N1 Virus abstammt, zirkulierten bereits seit 1997/98 in Schweinen (Dawood et
al., 2009; Neumann et al., 2009).
Abb. 6: Ursprung und genetische Zusammensetzung der 2009 pH1N1 Influenzaviren. Die vierfache
Reassortante entstand vermutlich im Schwein und wurde von diesem auf den Menschen übertragen. Die
Gensegmente PB2 und PA stammen aus einer nordamerikanischen Vogelinfluenzalinie, PB1 aus humanen H3N2
Influenzaviren, HA, NP und NS hingegen aus klassischen Schweineinfluenzaviren, NA und M stammen aus
eurasischen Vogelinfluenza-ähnlichen Schweineviren (Neumann et al., 2009).
Es gibt Berichte, dass kurz vor Ausbruch der 2009 Pandemie Schweineviren eine ähnliche
Dreifach-Reassortante in den USA bereits auf den Menschen übertragen wurde und einen
ungewöhnlich schweren Krankheitsverlauf zur Folge hatten (Shinde et al., 2009). Dies
könnte eine Zwischenstufe in der Entstehung gewesen sein, die durch weitere
Reassortierung auf den Menschen übertragen wurde. Bisher bekannte Determinanten, die
die Pathogenität von Influenzaviren im Menschen erhöhen oder deren Anpassung an den
Menschen ermöglichen, wurden nicht identifiziert (Chen und Shih, 2009; Dawood et al.,
2009; Garten et al., 2009). Eine detailliertere Analyse der genetischen Determinanten ist
24
Einleitung
unter 1.2.3 zu finden. Die genetische Ähnlichkeit der ersten Fälle der 2009 Pandemie
sprechen für einen Ausbruch durch nur wenige direkte Übertragungen vom Schwein auf den
Menschen (Garten et al., 2009). Mit fortschreitender Ausbreitung traten immer mehr
Mutationen auf, bei denen sich die Viren in verschiedene monophyletische Gruppen aufteilen
ließen (Fereidouni et al., 2009; Nelson et al., 2009). Als Ursache für das Auftreten dieser
Gruppen werden statt eines Selektionsdrucks in der Bevölkerung in erster Linie
Flaschenhalseffekte verantwortlich gemacht. Für einen Vergleich der genetischen Varianten
wird
hierfür
meist
eines
der
ersten
sequenzierten
Isolate
aus
Kalifornien,
A/California/04/2009 (H1N1) (Cal/04) oder A/California/07/2009 (H1N1) (Cal/07), verwendet.
1.2.2 Pathogenese der 2009 pH1N1 Influenza
Die Krankheitsfälle während der Pandemie verliefen überwiegend mild mit einer auf den
Respirationstrakt beschränkten Virusgrippe, wie ausführlicher unter 1.1.7 beschrieben
(Dawood et al., 2009). Die 2009 pH1N1 Influenza transmittierte effizient von Mensch zu
Mensch. Die schnelle Ausbreitung der Pandemie wird auf die effiziente Übertragung und auf
die oftmals unerkannten milden Krankheitsfälle und eine längere Viruslast der Patienten
zurückgeführt. Ein Unterschied zu den jährlich auftretenden Influenzavirusinfektionen war
das häufigere Auftreten der begleitenden Symptome, wie Erbrechen und Diarrhö (Dawood et
al.,
2009).
Dazu
kam,
dass
eine
ungewöhnlich
hohe
Anzahl
an
schweren
Krankheitsverläufen bei Kindern und jungen Erwachsenen auftrat. Es gab eine starke
Verschiebung der Altersverteilung im Vergleich zu saisonaler Influenza, bei welcher meist
Kleinstkinder und Menschen über 65 Jahre betroffen waren. Während der 2009 Pandemie
zeigte sich für Menschen über 65 hingegen kein erhöhtes Infektionsrisiko. Die größte Anzahl
an gemeldeten Krankenhausaufnahmen mit 2009 pandemischer H1N1 Influenza trat unter
Kindern und Jugendlichen bis 18 Jahre auf (Dawood et al., 2009, Poggensee et al., 2010;
Karageorgopoulos et al., 2011). Die meisten Todesfälle ereigneten sich unter Jugendlichen
und jungen Erwachsenen, auch ohne vorliegende Vorerkrankungen (Vaillant et al., 2009;
Karageorgopoulos et al., 2011; Dawood et al., 2012). Es wird spekuliert, dass ältere
Menschen eine gewisse Teilimmunität gegen die 2009 Pandemie besitzen (Dawood et al.,
2009). So konnte gezeigt werden, dass Menschen, geboren vor 1930, durch den Kontakt zu
früher zirkulierenden H1N1 Viren tatsächlich über eine Kreuzimmunität verfügten (Hancock
et al., 2009; Itoh et al., 2009; Verma et al., 2012). Dies reicht jedoch nicht für eine Erklärung
der hohen Anzahl an Todesfällen unter jungen, gesunden Menschen. Neben der
ungewöhnlichen Altersverteilung waren Risikogruppen für schwere Infektionsverläufe
vergleichbar mit denen einer epidemischen Influenza. Dazu zählten Menschen mit
chronischen Lungen- und Herzerkrankungen, Diabetes oder supprimiertem Immunsystem.
Insbesondere Kinder unter zwei Jahren hatten ebenfalls ein erhöhtes Risiko, an der 2009
25
Einleitung
pandemischen
H1N1
Influenza
schwer
zu
erkranken
(http://www.who.int
/csr/disease/swineflu/ frequently_asked_questions/ risk/en/index.html). Im Unterschied zu
vorherigen Pandemien waren schwangere Frauen und Menschen mit metabolischen
Einschränkungen,
wie
Fettleibigkeit,
ebenfalls
Risikogruppen
und
wurden
in
den
Impfempfehlungen besonders berücksichtigt (Robert-Koch-Institut, 2009; Vaillant et al.,
2009). Die schweren Verläufe der 2009 pH1N1 Influenza wiesen Pneumonien auf, welche
häufig eine künstliche Beatmung notwendig machten. Die Pathologie der viralen
Pneumonien war vergleichbar mit der vergangener Pandemien, mit diffus zerstörter
Alveolarstruktur und Ödemen (1.1.7; Gill et al., 2010). Virustiter wurden vorrangig im
Respirationstrakt, insbesondere in den Epithelzellen der oberen Atemwege, der Trachea und
der Bronchien sowie in alveolaren Epithelzellen Typ 1 und 2 aber auch in alveolaren
Makrophagen der Patienten detektiert. (Gill et al., 2010; Peiris et al., 2010; Shieh et al.,
2010). Es gibt jedoch auch Berichte über schwere Erkrankungsfälle mit Auftreten einer
Virämie (Oughton et al., 2011). Schwere Fälle der 2009 Pandemie waren oftmals mit einer
bakteriellen Koinfektion der Lunge assoziiert, welche im Gegensatz zu anderen Pandemien
jedoch nicht zu den häufigsten Todesursachen gehörte (Perez-Padilla et al., 2009). Auffällig
war zudem, dass in den Patienten länger Virus nachzuweisen war als bei schweren Fällen
epidemischer Influenzavirusinfektionen. Auch proinflammatorische Zytokine waren im
Krankheitsverlauf länger erhöht (Peiris et al., 2010; To et al., 2010). Bei rechtzeitiger
Applikation führte eine Medikation mit den Neuraminidasehemmern Oseltamivir oder
Zanamivir zu einem Behandlungserfolg. Gegen die zweite große Gruppe verfügbarer
Antiviralia, der Ionenkanalinhibitoren, wies die 2009 pH1N1 Influenza Resistenzen auf
(Dawood et al., 2009; Neumann et al., 2009). Warum neben den Risikogruppen mit
vorliegenden medizinischen Einschränkungen ein Großteil der schweren Infektionsverläufe
unter jungen, gesunden Erwachsenen auftraten, konnte bisher noch nicht abschließend
geklärt werden.
1.2.3 Pathogenitätsdeterminanten der 2009 pH1N1 Influenza
Kurz nach Ausbruch der 2009 pH1N1 Influenza wurde die genetische Zusammensetzung der
Reassortante entschlüsselt (1.2.1.1; Neumann et al., 2009). Bisher bekannte Signaturen, die
die Anpassung und Pathogenität von Influenzaviren im Menschen beeinflussen, wie auch
unter 1.1.8 beschrieben, wurden allerdings kaum gefunden (Dawood et al., 2009; Garten et
al., 2009; Neumann et al., 2009). Das Hämagglutinin der 2009 Pandemie enthält eine
monobasische Spaltstelle für die Aktivierung wie sie bei niedrigpathogenen Influenzaviren
vorkommt. Für eine effiziente Infektion des oberen Respirationstraktes im Menschen müssen
die aus Vögeln stammenden Influenzaviren an die dort vorkommenden Rezeptoren binden
können. Es wurde gezeigt, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren sowohl die sogenannten
26
Einleitung
aviären α2,3-ständigen als auch die humanen α2,6-ständigen Sialinsäuren binden (Childs et
al., 2009). Wie auch schon bei der Spanischen Pandemie 1918 wird dies durch die
Mutationen E190D und G225D in der Rezeptorbindedomäne des HAs vermittelt (Yang et al.,
2010; Xu et al., 2012b). Die Anpassung an humane Rezeptoren ging bisher jedoch mit dem
Verlust der α2,3-ständigen Sialinsäure-Bindung einher. Die breite Rezeptorspezifität der
2009 pH1N1 Viren ermöglicht daher nicht nur die Replikation der Viren in den oberen
Atemwegen sondern auch die effiziente Infektion des unteren Respirationstrakts, wodurch es
zu schweren Pneumonien kommen kann. Daher wird das Hämagglutinin für die gesteigerte
Pathogenität der 2009 Pandemie im Vergleich zu saisonaler Influenza verantwortlich
gemacht (Childs et al., 2009).
Signaturen in der viralen Polymerase, die mit einer gesteigerten Pathogenität für Säuger
einhergehen, wie beispielsweise E627K und D701N in PB2, sind im Genom der 2009
Pandemie nicht enthalten (Garten et al., 2009; Neumann et al., 2009). Selbst eine
experimentelle Einführung dieser Mutationen zeigte im Mausmodell keinen pathogenitätssteigernden Effekt (Herfst et al., 2010). Ein weiterer bekannter viraler Pathogenitätsfaktor ist
das über einen offenen Leserahmen exprimierte PB1-F2 (1.1.8; Krumbholz et al., 2011). Das
PB1 Gensegment von 2009 pH1N1 Viren kodiert jedoch nur für eine verkürzte Version des
Proteins, das bisher mit einer niedrigeren Pathogenität in Verbindung gebracht wurde
(Garten et al., 2009; Trifonov et al., 2009). Auch das virale Nichtstrukturprotein NS1, welches
als Pathogenitätsfaktor beschrieben wurde, wird in 2009 pH1N1 Influenzaviren mit einer
Deletion am C-Terminus kodiert. Daher fehlt die funktionelle Domäne, die mit einer erhöhten
Pathogenität von anderen Influenzaviren in Verbindung gebracht werden konnte (Jackson et
al., 2008).
Das Fehlen bisher beschriebener Pathogenitätsdeterminanten in den 2009 pH1N1
Influenzaviren wird für die große Anzahl an milden Krankheitsfällen verantwortlich gemacht.
Auf der anderen Seite wird seit Ausbruch der Pandemie nach bisher unbekannten
Pathogenitätsdeterminanten
geforscht,
welche
für
die
schweren
Erkrankungsfälle
verantwortlich waren. Des Weiteren werden neu auftretende Mutationen in den noch immer
zirkulierenden 2009 pH1N1 Viren auf ihr pathogenes und adaptives Potenzial für den
Menschen untersucht. Neben in vitro Experimenten sind Tiermodelle, wie sie unter 1.3
beschrieben werden, ein wichtiges Hilfsmittel für die Untersuchung von Pathogenitäts- und
Transmissionsdeterminanten von Influenzaviren.
1.3 Tiermodelle in der Influenzaforschung
Tiermodelle spielen in der biomedizinischen Forschung eine wichtige Rolle, um Krankheiten
zu verstehen und zu kontrollieren. In der Virusforschung wurden bereits Anfang des
27
Einleitung
20. Jahrhunderts kleine Säugetiere für die Charakterisierung und Anzucht von Viren
verwendet (Bryant, 2008). Auch heute stellt die Versuchstierkunde eine nur begrenzt zu
ersetzende Methode in diesem Gebiet dar. Die Komplexität der viralen Faktoren und der
Wirtsfaktoren sowie deren Zusammenspiel kann ausschließlich im kompletten Organismus
untersucht werden (Bryant, 2008; Bouvier und Lowen, 2010). Des Weiteren müssen
antivirale Medikamente aus ökonomischen und ethischen Gründen vor der Anwendung im
Menschen in Tiermodellen optimiert und deren Wirksamkeit und Sicherheit getestet werden
(Beigel und Bray, 2008; Barnard, 2009). Dies gilt auch für die Entwicklung von neuen
Impfstoffen. Die Entwicklung von gentechnisch veränderten Nagetieren, in erster Linie
Mäusen, bietet die Möglichkeit, die Rolle einzelner Gene oder Signalwege während einer
Infektion gezielt zu untersuchen (Bryant, 2008). Immunsupprimierte Kleinsäuger ermöglichen
darüber hinaus die Charakterisierung einer Infektion ohne die Bekämpfung durch die
Immunabwehr (Mastino et al., 1991).
Für
eine
Charakterisierung
der
Pathogenität
oder
der
Immunantwort
einer
Influenzavirusinfektion ist die Wahl des Tiermodells entscheidend. Viele etablierte
Versuchstiermodelle sind kein natürlicher Wirt für Influenzaviren und können meist nur durch
künstliche Adaptation des Virus infiziert werden (Barnard, 2009; Bouvier und Lowen, 2010).
Ebenfalls muss der Fokus der Studie, also die zu untersuchenden klinischen Ausprägungen,
in dem entsprechenden Tiermodell reflektiert werden. Im Folgenden wird auf die wichtigsten
Tiermodelle und deren Anwendung in der Influenzaforschung eingegangen.
1.3.1 Mäuse
Die Labormaus (Mus musculus) ist aufgrund ihrer Größe und des vergleichsweise niedrigen
Kostenaufwands ein beliebtes Säugermodell in der biomedizinischen Forschung. Die
Genetik der verwendeten Mäusestämme ist umfassend beschrieben und es steht ein
umfangreiches
Spektrum
an
Technologien
zur
genetischen
Modifikation
und
Charakterisierung zur Verfügung. Durch Inzucht der Labormausstämme sind Versuche gut
reproduzierbar, wobei die Vielzahl der verschiedenen Zuchtstämme bis zu einem gewissen
Grad die genetische Vielfalt in der Bevölkerung reflektiert (Trammell und Toth, 2008; Kroeze
et al., 2012).
Da Mäuse kein natürlicher Wirt von Influenzaviren sind, ist eine Infektion mit natürlichen
Virusisolaten nur begrenzt möglich. Humane Influenzaviren binden präferenziell an
Rezeptoren mit α2,6-gebundenen Sialinsäuren auf der Zelloberfläche (Connor et al., 1994).
Mäuse besitzen hingegen vorwiegend α2,3-gebundene Sialinsäuren im Respirationstrakt
(Ibricevic et al., 2006; van Riel et al., 2007), weshalb dort humane Influenzaviren nur
begrenzt replizieren. Um dennoch Infektionsversuche durchführen zu können, werden die
28
Einleitung
Viren künstlich an die Maus adaptiert. Dies geschieht meist durch serielle Passagen von
Lungenhomogenaten in Mäusen (Hirst, 1947; Brown, 1990; Gabriel et al., 2005). Eine
Infektion mit Labor-adaptierten Influenzaviren wie PR8 oder WSN, benötigen keine vorherige
Adaptation an Labormäuse (Bouvier und Lowen, 2010). Aufgrund der Rezeptorspezifität von
aviären Influenzaviren für α2,3-gebundene Sialinsäuren ist eine Infektion mit humanen
HPAIV Isolaten ebenfalls möglich (Tumpey et al., 2005; Boon et al., 2009). Es gibt auch
einige Mausstämme, wie DBA/2J und A/J, die für eine Infektion mit humanen Influenzaviren
generell empfänglicher sind. Die genetische Variabilität der Mäuse hinsichtlich ihrer
Immunantwort auf eine Infektion wird teilweise dafür verantwortlich gemacht (Srivastava et
al., 2009; Alberts et al., 2010). Die Mausstämme BALB/c und C57BL/6 werden in der
Influenzaforschung am häufigsten verwendet.
Die Pathogenese und die Virulenz eines Influenzavirus in der Maus sind neben dem
Virusstamm abhängig von der Infektionsdosis (Barnard, 2009; Bouvier und Lowen, 2010).
Die Virulenz wird mittels serieller Infektionsdosen bestimmt (3.4.2; Reed und Muench, 1938).
Je nach Versuchsfokus wird jedoch meist eine letale Dosis gewählt, um den vollen Umfang
einer Influenzaerkrankung zu untersuchen (Bouvier und Lowen, 2010). Etwa 24 Stunden
nach Infektion kann es zu den ersten Krankheitsanzeichen kommen, darunter Lethargie,
struppiges Fell und verminderte Nahrungs- und Wasseraufnahme, die zu einem
Gewichtsverlust der Tiere führen (Lu et al., 1999; Trammell und Toth, 2008). Der
Gewichtsverlust, bezogen auf das Körpergewicht bei der Infektion, wird als wichtiger
Parameter für den Infektionsverlauf und zur Endpunktbestimmung verwendet (Barnard,
2009). Durch die Replikation im gesamten Respirationstrakt kommt es bei hohen
Infektionsdosen oder einer Infektion mit HPAIV und 1918 pandemischen Viren zu viralen
Pneumonien (Kobasa et al., 2004; Bouvier und Lowen, 2010). Diese sind mit
charakteristischen Lungenläsionen und -ödemen sowie Immunzellinfiltraten mit schweren
Pneumonien im Menschen zu vergleichen (1.1.7; Perrone et al., 2008; Kroeze et al., 2012).
HPAIV und Maus-adaptierte Influenzaviren können in Mäusen eine systemische Infektion zur
Folge haben (Belser et al., 2009b; Bouvier und Lowen, 2010; Gabriel et al., 2009). So
wurden unter anderem Viren in extrapulmonalen Organen wie Gehirn, Leber oder Herz,
detektiert.
Andere
klinische
Zeichen
einer
Virusgrippe,
wie
Fieber,
Husten
und
Schleimbildung in den oberen Atemwegen, fehlen im Mausmodell (Barnard, 2009; Bouvier
und Lowen, 2010). Darüber hinaus kommt es in Mäusen häufiger zu einer systemischen
Ausbreitung und zu höheren Virustitern (Bouvier und Lowen, 2010). Jedoch kann die
Transmission von Influenzaviren in der Maus nicht untersucht werden, da für die meisten
Virusstämme eine Übertragung von Maus zu Maus weder durch Kontakt noch durch
Aerosolbildung nachweisbar war (Lowen et al., 2006; Bouvier und Lowen, 2010). Berichte
29
Einleitung
über eine Transmission von H2N2 Influenzaviren in Mäusen konnte für andere Subtypen
nicht gezeigt werden oder war nicht reproduzierbar (Schulman und Kilbourne, 1963).
1.3.2 Meerschweinchen
Domestizierte Meerschweinchen (Cavia porcellus) werden aufgrund der einfachen Zucht, der
genügsamen Haltungsansprüche und dem sanftmütigen Wesen vielfach in der Forschung
eingesetzt. Berichte über die Verwendung von Meerschweinchen in der Forschung gehen
auf Lavoisier im späten 18. Jahrhundert zurück (Terril und Clemons, 1998). Spätere Studien
konnten zeigen, dass es viele Ähnlichkeiten zwischen dem Immunsystem von Menschen und
Meerschweinchen gibt (Terril und Clemons, 1998; Padilla-Carlin et al., 2008). Daher sind die
Tiere heute noch ein beliebtes Modell in der biomedizinischen Forschung und werden auch
in immunologischen Studien respiratorischer Infektionskrankheiten wie Influenza verwendet
(Wetherbee, 1973; Kauffman et al., 1978; Phair et al., 1979). Meerschweinchen sind ohne
vorherige Adaptation empfänglich für eine Infektion mit saisonalen humanen und 1918
pandemischen Influenzaviren (Lowen et al., 2006; Tang und Chong, 2009; Van Hoeven et
al., 2009). Die Viren replizieren effizient im oberen Respirationstrakt der Tiere, da dort α2,6glykosidisch
gebundene
Sialinsäuren
vorkommen.
Da
neben
den
α2,6-ständigen
Sialinsäuren auch α2,3-gebundene im oberen Respirationstrakt der Tiere vorkommen (Sun
et al., 2010), konnte ebenfalls eine Infektion von Meerschweinchen mit verschiedenen
Schweine- und Vogelinfluenzaviren, unter anderem auch dem HPAIV-Stamm H5N1, gezeigt
werden (Van Hoeven et al., 2009; Steel et al., 2010; Sun et al., 2010). Nachdem Lowen und
Kollegen
2006
auf
Berichte
einer
Ausbreitung
von
Influenzaviren
unter
Labor-
Meerschweinchen aufmerksam wurden, zeigten sie den Nutzen der Tiere für reproduzierbare
Transmissionsversuche (Lowen et al., 2006). Die Transmission von Influenzaviren ist ein
wichtiger epidemiologischer Faktor und kann in Labormäusen nicht untersucht werden
(Bouvier und Lowen, 2010). Humane Influenzaviren und HPAIV transmittieren effizient von
Meerschweinchen zu Meerschweinchen bei direktem Kontakt der Tiere (Lowen et al., 2006;
Mubareka et al., 2009; Steel et al., 2009). Eine Übertragung von Tier zu Tier in getrennten
Käfigen über eine Aerosolbildung konnte ebenfalls für humane Influenzaviren gezeigt werden
(Bouvier und Lowen, 2010; Sun et al., 2010). Die Viren transmittieren effizient über kurze
Distanzen. Jedoch wurden auch einzelne Übertragungen über eine Entfernung von etwa
einem Meter beschrieben (Lowen et al., 2006; Mubareka et al., 2009). Die Transmission von
HPAIV konnte bisher für Viren des H5N1-Subtyps nur durch direkten Kontakt der Tiere
gezeigt werden (Gao et al., 2009). Auch ein humanes H5N1 Isolat transmittierte in
Meerschweinchen mit einer Effizienz von 75 % (Steel et al., 2009). Schweine- und LPAIV
Vogelinfluenzaviren sind nur begrenzt über Kontakt übertragbar (Gao et al., 2009; Sun et al.,
2010). Die effiziente Replikation von Influenzaviren und deren Transmission wurde bisher für
30
Einleitung
die Zuchtstämme 2 und 13 und den Hartley Stamm gezeigt (Lowen et al., 2006; Bouvier und
Lowen, 2010). Da bisher nur in einem Fall Unterschiede in der Empfänglichkeit und der
Pathogenese zwischen den Stämmen gezeigt wurden, werden überwiegend Hartley
Meerschweinchen in der Influenzaforschung verwendet, die auch kommerziell verfügbar sind
(Lowen et al., 2006; Bouvier und Lowen, 2010). Zu beachten ist, dass Meerschweinchen
nicht wie Labormäuse durch Inzucht gezüchtet werden und daher auch innerhalb eines
Stammes genetische Unterschiede aufweisen.
Obwohl Meerschweinchen empfänglich für eine Reihe von Influenzaviren sind, fehlen meist
klinische Zeichen einer Erkrankung (Bouvier und Lowen, 2010). Bei einer Infektion mit
humanen Influenzaviren kommt es zu Virustitern im Respirationstrakt, begleitet von der
Bildung von Mucus (Tang und Chong, 2009). Die Virustiter in den oberen Atemwegen sind
dabei deutlich höher als in Trachea oder Lunge (Lowen et al., 2006; Tang und Chong, 2009;
Sun et al., 2010). Hohe Dosen von H5N1 Influenzaviren führten in infizierten
Meerschweinchen zu Anzeichen von Teilnahmslosigkeit und zu leichtem Gewichtsverlust
(Kwon et al., 2009; Van Hoeven et al., 2009). Die Replikation von Influenzaviren in
extrapulmonalen Organen wurde bisher nicht nachgewiesen (Gao et al., 2009). Auftretende
Pneumonien werden aufgrund der niedrigen Virusreplikation im Vergleich zum oberen
Respirationstrakt auf die starke Immuninfiltration der Lunge zurückgeführt (Kwon et al., 2009;
Tang und Chong, 2009; Van Hoeven et al., 2009).
Eine Charakterisierung der Pathogenität von Influenzaviren ist wegen Fehlens klinischer
Zeichen und Unterschiede in der Pathologie schlecht auf den Menschen übertragbar. Daher
beschränken
sich
Studien
in
diesem
Tiermodell
meist
auf
Untersuchungen
zu
immunologischen Fragestellungen, die Transmission und Studien zur Replikation. Die
Effekte von antiviralen Medikamenten und Impfstoffen oder auch Mutationen auf die
Virusreplikation und Transmission können im Meerschweinchen untersucht werden (Gao et
al., 2009; Lowen et al., 2009; Steel et al., 2009; Van Hoeven et al., 2009). Im Gegensatz zur
Transmissionseffizienz von Influenzaviren ist die Untersuchung der Übertragungswege der
Viren jedoch schwierig, da bei infizierten Meerschweinchen weder Husten noch Niesen
beobachtet wurde (Mubareka et al., 2009).
1.3.3 Frettchen
Das Frettchen (Mustela putorius furo) ist eine domestizierte Form des Iltis und gilt als
„Goldstandard“ unter den kleinen Säugermodellen in der Influenzaforschung. Eine Reihe von
respiratorischen Infektionskrankheiten, insbesondere Influenzaviren, führen in Frettchen zu
einer Erkrankung, die der im Menschen ähnlich ist (Maher und DeStefano, 2004; Barnard,
2009; Bouvier und Lowen, 2010; Belser et al., 2011b). Anfang der Dreißiger wurden
31
Einleitung
erstmalig Frettchen experimentell mit humanen Influenzaviren infiziert, wobei ebenfalls die
Transmission zu nicht-infizierten Tieren nachgewiesen wurde (Smith et al., 1933; Francis
und Magill, 1935; Smith und Sweet, 1988). Eine Infektion von Frettchen wurde für ein Reihe
von humanen sowie H5N1 Influenzaviren gezeigt (Bouvier und Lowen, 2010). Ähnlich wie
beim Menschen kommen im oberen Respirationstrakt von Frettchen vorherrschend
α2,6-gebundene Sialinsäuren auf den Epithelzellen vor und ermöglichen so die effiziente
Infektion durch humane Influenzaviren (Leigh et al., 1995). Eine Adaptation der Viren wie bei
Mäusen ist daher nicht nötig. Darüber hinaus sind Frettchen ebenfalls empfänglich für eine
Infektion mit Schweine- und Vogelinfluenzaviren (Shope, 1934; Wan et al., 2008).
Humane Influenzaviren transmittieren effizient von Frettchen zu Frettchen sowohl durch
direkten Kontakt als auch über Aerosole (Bouvier und Lowen, 2010; Belser et al., 2011b;
Kroeze et al., 2012). Eine weitere Parallele zum Menschen ist, dass humane H5N1
Influenzaviren nur eingeschränkt auf nicht-infizierte Frettchen übertragen werden (Maines et
al., 2006). Die potenzielle Gefahr von adaptiven Mutationen in HPAIV, die eine Transmission
von Mensch zu Mensch ermöglichen, kann so mit Hilfe des Frettchenmodells evaluiert
werden. Erst kürzlich wurden zwei Studien veröffentlicht, in denen durch experimentelle
Adaptation an Frettchen gezeigt wurde, dass nur wenige Mutationen in humanen H5N1
Isolaten für eine effiziente Transmission von Frettchen zu Frettchen nötig sind (Herfst et al.,
2012; Imai et al., 2012). Die Pathogenität der adaptierten H5N1 Influenzaviren war jedoch
niedriger als die der Parentalviren. Da eine Tröpfcheninfektion von Frettchen vergleichbar zu
der im Menschen ist, wurden Frettchen zur Infektion zerstäubten Virusproben ausgesetzt.
Dadurch soll die Vergleichbarkeit mit natürlichen Bedingungen einer Infektion optimiert
werden (Gustin et al., 2011; MacInnes et al., 2011).
Die infizierten Tiere haben oftmals bereits einen Tag nach Infektion eine erhöhte
Körpertemperatur (Sweet et al., 1979). Es kommt zur Mucusbildung in den oberen
Atemwegen und einer Abgeschlagenheit der Tiere, die von Gewichtsverlust begleitet sein
kann (Maher und DeStefano, 2004; Belser et al., 2011b). Saisonale humane Influenzaviren
replizieren zu hohen Titern in den oberen Atemwegen von Frettchen (Maher und DeStefano,
2004; Bouvier und Lowen, 2010). Im Gegensatz zur Virusgrippe im Menschen ist Niesen
eines der häufigsten klinischen Symptome von infizierten Frettchen (Matsuoka et al., 2009).
Eine Infektion mit humanen H5N1 Isolaten oder 1918 pandemischen Influenzaviren führt
hingegen,
wie
im
Menschen,
zu
einer
verstärkten
Virusreplikation
im
unteren
Respirationstrakt (Zitzow et al., 2002; Maines et al., 2005; Tumpey et al., 2007). Es kommt
zu schweren Krankheitsverläufen mit viraler Pneumonie, die auch den Tod der Tiere zur
Folge haben kann. Humane H5N1 Viren wurden in infizierten Frettchen auch aus
extrapulmonalen Organen isoliert (Zitzow et al., 2002; Belser et al., 2011b). Kürzlich wurde
32
Einleitung
die Replikation von humanen H5N1 Influenzaviren in mehreren Regionen des zentralen
Nervensystems von Frettchen gezeigt (Schrauwen et al., 2012).
Trotz der guten Übertragbarkeit von Transmission und Pathogenität hat das Frettchenmodell
jedoch auch Grenzen. Da es keine durch Inzucht gezüchteten Frettchen gibt, stellt die
genetische Vielfalt der Tiere, wie auch im Meerschweinchen, einen weiteren Nachteil dar
(Kroeze et al., 2012). Das Spektrum an immunologischen Reagenzien ist zudem begrenzt.
Darüber hinaus wurden in pharmakologischen Studien Unterschiede in der Toxizität und der
Bioverfügbarkeit von Reagenzien im Vergleich zum Menschen festgestellt (Cochran et al.,
1965; Bouvier und Lowen, 2010). Zudem ist die Haltung aufwändiger und mit weit höheren
Kosten als bei Mäusen und Meerschweinchen verbunden.
1.3.4 Weitere Tiermodelle
Auch wenn viele Fragestellungen in der Influenzaforschung mit Hilfe von Labormäusen,
Meerschweinchen und Frettchen untersucht werden können, bieten Halbaffen, aufgrund des
engen Verwandtschaftsgrades, den bestmöglichen Vergleich zu Influenzavirusinfektionen im
Menschen (Barnard, 2009; Bouvier und Lowen, 2010; Kroeze et al., 2012). In der
Influenzaforschung werden verschiedene Makakenarten verwendet. Eine Infektion in
Halbaffen wurde mit verschiedenen humanen Influenzaviren gezeigt, darunter auch 1918
pandemische sowie H5N1 Influenza (Bouvier und Lowen, 2010). Die Pathogenese ist der im
Menschen sehr ähnlich. Aufgrund der guten Übertragbarkeit werden neben therapeutischen
Studien auch Fragestellungen zur Zytokin- und Genexpression in Halbaffen untersucht (Baas
et al., 2006; Kobasa et al., 2007; Stittelaar et al., 2008). Die Verwendung von Halbaffen in
der Forschung ist jedoch nicht nur aus ethischen Gründen sondern auch aufgrund der hohen
Kosten und der Verfügbarkeit der Tiere begrenzt.
Baumwollratten
und
Goldhamster
können
ebenfalls
experimentell
mit
humanen
Influenzaviren infiziert werden (Barnard, 2009; Bouvier und Lowen, 2010). Empfänglichkeit
und Pathogenese infizierter Tiere weisen viele Parallelen zum Meerschweinchenmodell auf
(Bouvier und Lowen, 2010). Da Meerschweinchen sich zusätzlich als Transmissionsmodell
in der Influenzaforschung etabliert haben, werden Ratten und Hamster nur in wenigen
Studien verwendet. Des Weiteren gibt es auch Studien zu Influenzavirusinfektionen in vielen
weiteren Säugetieren, wie Katzen und Hunden mit HPAIV des H5N1-Subtyps (Rimmelzwaan
et al., 2006; Giese et al., 2008). Für Fragestellungen, die den natürlichen oder intermediären
Wirt
von
Influenzaviren
betreffen,
werden
Schweine-
und
Vogelinfluenzaviren
in
Hausschweinen bzw. in Hühnern und Enten untersucht (Kroeze et al., 2012). Die Einteilung
von aviären Influenzaviren hinsichtlich ihrer Virulenz in LPAIV und HPAIV erfolgt anhand des
intravenösen Pathogenitätsindex in Hühnern (Wright et al., 2007).
33
Einleitung
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Die 2009 pandemische H1N1 Influenza stellte die erste Pandemie des 21. Jahrhunderts dar.
Dieses Ereignis verdeutlichte erneut, dass Influenzaviren neben den jährlichen Epidemien
auch stetig wiederkehrende Pandemien auslösen können. Frühere Arbeiten, vor allem mit
aviären Influenzaviren, haben bereits mehrere Pathogenitäts- und Adaptationsdeterminanten
beschrieben. Diese Erkenntnis ist für eine Gefahrenabschätzung, die von neuen
Influenzaviren ausgehen könnte sowie für die Entwicklung von präventiven und
therapeutischen Maßnahmen von hoher Bedeutung. In den 2009 pandemischen H1N1
(pH1N1)
Influenzaviren
hingegen
sind
diese
früher
beschriebenen
Pathogenitätsdeterminanten nicht vorhanden. Dies sprach dafür, dass weitere bislang nicht
identifizierte Determinanten in den 2009 pH1N1 Influenzaviren vorhanden sein müssen, die
zu deren erhöhter Pathogenität und Transmissibilität im Menschen beigetragen haben.
Daher sollten in dieser Arbeit klinische Isolate der 2009 pH1N1 Influenza in vitro und in vivo
hinsichtlich ihrer Pathogenität im Mausmodell sowie hinsichtlich ihrer Transmissibilität im
Meerschweinchen- und Frettchenmodell untersucht werden.
Folgende Kernfragen sollten dabei beantwortet werden:
•
Wie unterscheiden sich die 2009 pH1N1 Influenzaviren bezüglich ihrer Pathogenität
von alt-saisonalen Influenzaviren und hochpathogenen aviären Influenzaviren des
Menschen?
•
Was sind die Transmissionseigenschaften von 2009 pH1N1 Influenzaviren?
•
Welche viralen Determinanten sind für potenzielle Unterschiede in der Pathogenese
von 2009 pH1N1 Influenzaviren verantwortlich?
34
Material
2 Material
2.1 Chemikalien, Lösungen und Puffer
Bezeichnung
Zusammensetzung/ Hersteller
Agarose
Serva
ß-Mercaptoethanol
Fluka
Citratpuffer (10x)
DCS
Dextransulfat
Sigma-Aldrich
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Sigma-Aldrich
Dithiothreitol (DTT)
Sigma-Aldrich
DNA-Ladepuffer (6X MassRuler DNA
Loading Dye)
Fermentas / Thermo Scientific
DNA-Leiterstandart (MassRuler
Ladder Mix, 80-10 000 bp)
Fermentas / Thermo Scientific
DNA
Eosin G
Sigma-Aldrich
Entwicklerlösung D19
Kodak
Ethidiumbromid (EtBr)
Fluka
Ethanol (EtOH)
Merck
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Merck
Ficol
Sigma-Aldrich
Fixierlösung
Kodak
Formamid
Merck
Gewebeinfiltrationsautomat ASP 3000
Leica
Glycerol
Invitrogen
Glykogen (Mytilus edulis)
Sigma-Aldrich
Hämatoxylin
Shandon
Hühnervollblut mit Citrat
Lohmann Tierzucht
Isopropanol (2-Propanol)
Fluka
Jodlösung
volumetrisch, 0,5 M I2 (1,0 N) (Fluka)
Kristallviolettlösung
37 % Formaldehyd (Merck) in ddH2O
1 g Kristallviolett (Merck) auf 1 L
Lipofectamin®2000
LifeTechnologies
Natriumchlorid (NaCl)
Merck
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Sigma-Aldrich
Paraffin
DCS
Paraformaldehyd (PFA)
4 % PFA (AppliChem) in 1x PBS
PBS (10x)
26,8 mM KCl (Carl Roth)
17,6 mM KH2PO4 (Merck)
35
Material
1,37 M NaCl (Merck)
51,3 mM Na2HPO4 · 2H2O (Merck)
ad. 1 L ddH2O
pH 7,4
PBS-Tween (0.05 %)
0,05 % Tween-20 (Serva) in 1x PBS
PEI
1 mg/ml Polyethylenamin (Polysciences)
pH 7,2
Polyvinylpyrrolidin
Sigma-Aldrich
Proteinase K Puffer
20 mM Tris/HCl, pH 7,4 (Merck)
2 mM CaCl2 (Merck)
Salzsäure (HCL)
Merck
Sephadex G50
Roche
SSC (20x)
3 M NaCl
0,35 M tri-Natriumcitrat (Merck)
SuperBlock T20 (TBS)
Pierce / Thermo Scientific
Transkriptionslösung
40 mM Tris/HCl, pH 8,0
(Sonden-Markierung
10 mM DTT
in situ-Hybridisierung)
6 mM MgCl2 (Merck)
2 mM Spermidin
100 mg/ml BSA (RNase- und DNase frei)
500 μM ATP
500 μM CTP
500 μM GTP
25 μM 35S-UTP
1 U RNAse Inhibitor
TBE (10x)
108 g TRIS
55 g Borsäure
9,3 g EDTA
ad 100 ml ddH2O
pH 8,3
Triton-X-100
Merck
TrueBlue™ Peroxidase Substrat
KPL
Vollblut, human, EDTA-Zusatz
Transfusionsmedizin Universitätsklinikum Eppendorf
Xylol
Merck
2.2 Kulturmedien und -zusätze
Bezeichnung
Zusammensetzung/ Hersteller
Albumin Lösung (BSA; 35 % in DPBS)
Sigma-Aldrich
36
Material
Ampicillin (100 mg/ml)
Serva
Avicel (mikrokristalline Cellulose)
FMC BioPolymer
Avicel-Overlay-Medium
50 % Overlay-Medium
50 % Avicel-Lösung (2,5% Avicel in 1xPBS)
Bakterieneinfriermedium
50 % LB-Amp-Medium
50 % Glycerol
Dulbecco’s
(DMEM)
Modified
Eagle
Medium
PAA
Dulbecco’s PBS (1x)
PAA
Fötales Kälberserum (FCS)
PAA
Infektionsmedium MDCK
MEM
0,2 % BSA
1 % L-Glutamin
1 % Penicillin und Streptomycin
LB-Amp100-Agar
LB-Amp100-Medium
1,5 % Bakto-Agar (BD Biosciences)
LB-Amp100-Medium
10 g/L Pepton
5 g/L Hefeextrakt
10 g/L NaCl
pH 7,5
0,1 mg/ml Ampicillin
Minimal Essential Medium (MEM)
PAA
Modified Eagle Medium 2x (2x MEM)
PAA
Overlay-Medium für Plaquetest
2x MEM
0,4 % BSA
2 % L-Glutamin
2 % Penicillin und Streptomycin
Penicillin und Streptomycin (P/S, 100x)
PAA
Reduced Serum Medium (OPTI-MEM I)
GIBCO
Transfektionsmedium
DMEM
HEK 293T
10 % FCS
1 % L-Glutamin
Trypsin-EDTA (1x)
PAA
Wachstumsmedium MDCK
MEM
10 % FCS
1 % L-Glutamin
1 % Penicillin und Streptomycin
Wachstumsmedium HEK 293T
DMEM
10 % FCS
37
Material
1 % L-Glutamin
1 % Penicillin und Streptomycin
Zelleinfriermedium
FCS
10 % DMSO
2.3 Enzyme, Reaktionssysteme und Zusätze
Bezeichnung
Hersteller
DNA (Salmon Sperm)
Sigma-Aldrich
DNA-Polymerase Phusion
NEB
DNA-Polymerase Pfu Turbo
Stratagene
DNAse I, RNase frei
Roche
Dual-Luciferase® Reporter Assay System
Promega
LEGEND MAX™ Mouse IFN-γ ELISA Kit
Biolegend
LEGEND MAX™ Mouse IL-4 ELISA Kit
Biolegend
LEGEND MAX™ Mouse TNF-α ELISA Kit
Biolegend
Mouse/Rat CCL2/JE/MCP-1 Quantikine
ELISA Kit
R&D Systems
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit
R&D Systems
Mouse IL-10 Quantikine ELISA Kit
R&D Systems
Omniscript RT Kit
QIAGEN
peqGOLD dNTP-Mix (10 mM each)
Peqlab
Proteinase K
Roche
QIAamp Viral RNA Mini Kit
QIAGEN
QIAfilter Plasmid Maxi Kit
QIAGEN
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit
QIAGEN
QIAprep Spin Miniprep Kit
QIAGEN
QIAquick Gel Extraction Kit
QIAGEN
QIAquick PCR Purification Kit
QIAGEN
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit
Stratagene
Restriktionsenzym DpnI (10 U/µl)
Fermentas/ Thermo Scientific
Restriktionsenzym EcoRI (20 U/µl)
NEB
Restriktionsenzym KpnI (20 U/µl)
NEB
Ribonukleotide (ATP,CPT,GTP)
Roche
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)
Fermentas / Thermo Scientific
35
Perkin Elmer
T4-Ligase (4 U/µl)
Statagene
T7-Polymerase
Roche
t-RNA (Kaninchen Leber)
Sigma-Aldrich
S-UTP
38
Material
Trypsin-TPCK
Sigma
Zytochem-Plus HRP Kit
Zytomed
2.4 Primer
Die Oligonukleotide für die Sequenzierung und Genotypisierung von Virus-DNA sowie zur
Mutagenese und Klonierung von Plasmid-DNA wurden wie unter 3.1.2 beschrieben
entworfen und vom Dienstleister Eurofins MWG Operon synthetisiert. Die Bezeichnung der
Primer und die jeweiligen DNA-Sequenzen sind im Anhang unter 9.4 zu finden.
2.5 Plasmide und Vektoren
Bezeichnung
Beschreibung/ Hersteller
pHW2000
Leervektor für Reverse Genetik
(Hoffmann et al., 2000b)
pHWSccdB
Klonierungsvektor
(Stech et al., 2008)
pRL-TK
Luciferase-Reporter (Renilla reniformis)
(Promega)
pPol-I-NP-Luc-human
Luciferase-Reporter (Photinus Pyralis) mit Luciferase-Gen (GenBank:
AF053462), das unter der Kontrolle des humanen Polymerase I-Promotors
steht und von den 3’- und 5’-Enden der nicht-kodierenden Regionen des
A/WSN/33 (H1N1) Virus (GenBank: M30746) flankiert wird.
(T. Wolff, Robert Koch-Institut, Berlin, Deutschland)
pBluescript II KS+
Stratagene
2.6 Virusstämme
Bezeichnung
Herkunft
A/Hamburg/05/09 (pH1N1) → HH05
Sigrid Baumgarte, Institut für Hygiene und Umwelt,
Hamburg, Deutschland (Otte et al., 2011)
A/Hamburg/NY1580/09 (pH1N1) → HH15
Sigrid Baumgarte, Institut für Hygiene und Umwelt,
Hamburg, Deutschland (Gabriel et al., 2011)
SC35M (H7N7)
Rekombinantes, mausadaptiertes SC35M
Influenzavirus (H7N7) (Scheiblauer et al., 1995)
A/Solomon Islands/3/06-like (H1N1)
Armin Balliot, Niedersächsisches
Landesgesundheitsamt, Hannover, Deutschland
A/Thailand/KAN-1/04 (H5N1)
Hans-Dieter Klenk, Institut für Virologie, Philipps
Universität Marburg, Deutschland (Puthavathana et al.,
2005)
39
Material
2.7 Bakterienstämme
Bezeichnung
Beschreibung/ Hersteller
Escherichia coli SURE-2
Genotyp: e14-(McrA-) ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171 endA1
gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5
(Kanr) uvrC [F’ proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
Stratagene
Escherichia coli XL1-Blue
Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac
[F’proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr)])
Stratagene
2.8 Eukaryotische Zelllinien
Bezeichnung
Beschreibung
A549 (Human Lung Adenocarcinoma Cells)
humane Lungenepithelzelllinie
HEK293T (Human Embryonic Kidney Cells)
humane Nierenepithelzelllinie
MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cells)
canine Nierenepithelzelllinie
2.9 Versuchstiere
Mäuse:
Für die tierexperimentellen Versuche dieser Arbeit wurden weibliche C57BL/6J Mäuse bzw.
BALB/c Mäuse im Alter von fünf bis acht Wochen verwendet. Mäuse des C57BL/6J Stamms
wurden von Charles River bzw. Harlan Laboratories bezogen. Die verwendeten BALB/c
Mäuse entstammten der hauseigenen SPF-Zucht des Heinrich-Pette-Instituts, Leibniz-Institut
für Experimentelle Virologie.
Die Mäuse wurden während der Versuche zu maximal fünf Tieren in einzeln belüfteten
Typ II L Käfigen eines IVC-Systems (Tecniplast) unter konstanten Außenbedingungen (12 h
Tag-Nacht-Zyklus, Temperatur) gehalten. Futter und Wasser waren ad-libitum vorhanden.
Meerschweinchen:
Für weitere tierexperimentelle Versuche mit Meerschweinchen wurden 300-400 Gramm
schwere weibliche Tiere des Hartley-Zuchtstammes von Charles River Laboratories
bezogen.
Die Meerschweinchen wurden während der Versuche zu maximal zwei Tieren in Typ IV
Käfigen in einem UNI-PROTECT-Laminar-Luftstromschrank (Ehret) unter konstanten
Außenbedingungen (12 h Tag-Nacht-Zyklus, Temperatur, Luftstrom) gehalten. Futter und
Wasser waren ad-libitum vorhanden.
40
Material
Frettchen:
Die tierexperimentellen Versuche mit Frettchen wurden in der Biological Investigations
Group, Public Health England in Porton Down, Großbritannien durchgeführt. Es wurden
sechs bis zwölf Monate alte weiblich Frettchen verwendet, welche von der Public Health
England eigenen Zucht Highgate Farm bezogen wurden.
Die Frettchen wurden während der Versuche jeweils in Gruppen von mindestens zwei Tieren
unter konstanten Außenbedingungen (12 h Tag-Nacht-Zyklus, Temperatur, Luftstrom)
gehalten. Futter und Wasser waren ad-libitum vorhanden.
Embryonierte Hühnereier:
Für die Virusanzucht wurden frische SPF-Hühnereier von Lohmann Tierzucht bezogen und
in einem Eierinkubator in der Versuchstierhaltung des Universitätskrankenhauses Eppendorf
bebrütet.
2.10 Antikörper
Bezeichnung
Ursprung
Hersteller
Verwendung
Anti-NP
Frettchen polyklonal
WHO
1:500 Histologie
Anti-NP
Maus monoklonal
Abcam (ab43821)
1:1000 Plaquetest
Anti-Maus IgG-HRP
Kaninchen polyklonal
SouthernBiotech (6170-05)
1:1000 Plaquetest
Anti-Frettchen-Biotin
Ziege polyklonal
Rockland
1:200 Histologie
2.11 Narkotika, Analgetika und Zusätze
Bezeichnung
Hersteller
Bepantene Augensalbe
Bayer Vital GmbH
Forene (Isofluran 100 %)
Abbott
Ketamin Gräub (100 mg/ml)
Albrecht
Natriumchlorid (0,9 % Lösung)
B. Braun Melsungen AG
Pentobarbital-Natrium-Salz
Sigma Aldrich
Sedaxylan (Xylazin-Hydrochlorid, 20 mg/ml)
WDT
T61 Injektionlösung
Intervet
2.12 Verbrauchsmaterialien
Wenn im Folgenden nicht weiter vermerkt, wurden Einwegartikel von folgenden Firmen
bezogen: Falcon, Sarstedt, Biozym, Nunc.
Bezeichnung
Hersteller
Applikatoren, steril, Holz
Böttger
41
Material
Bastelkleber ohne Lösungsmittel
UHU
Einmal-Injektionskanüle Microlance™ 3
BD
(26G 3/8“, 0,45 x 10 mm)
Einmal-Injektionskanüle Microlance™ 3
BD
(25G 1“, 0,5 x 25 mm)
Einmal-Injektionskanüle
BD
(20G 1“, 0,9 x 25 mm)
Einmalskalpell (Surgical Disposable Scalpels)
B. Braun Melsungen AG
Einmalspritzen Omnifix® (3 ml / Luer Lock Solo)
B. Braun Melsungen AG
Einmalspritzen Omnifix® (10 ml / Luer Solo)
B. Braun Melsungen AG
Einmalspritzen TERUMO® U-100 Insulin (1 ml /
6 % Luer)
TERUMO Corporation
Einmalspritzen Soft Ject (1 ml)
Henke Sass Wolf
EDTA-Kapillarblutentnahme-Röhrchen (200 µl)
KABE Labortechnik
Lanzetten, steril, ACCU-CHEK Softclix XL (21G
0,8 mm)
Roche
Mahlkugeln (Glasperlen: Ø 0,50-0,75 mm)
Retsch
SuperFrost/Plus Objektträger
Menzel-Gläser
96-Vertiefungen-MTP MicroAmp® Optical 96-Well
Reaction Plate with Barcode
Invitrogen / Life Technologies
2.13 Geräte
Bezeichnung
Hersteller
Badumwälz-Thermostat Precitherm PFV
Labora Mannheim
Chirurgische Feinschere
Fine Science Tools
Chirurgische Standard-Pinzette
Fine Science Tools
CO2-Inkubator BBD6220
Thermo Scientific
CO2-Inkubator HERACELL 150
Thermo Scientific
Digitalkamera SZ-10
Olympus
Durchlichtmikroskop Axioskop 2
Zeiss
Durchlichtmikroskop IM
Zeiss
Eierprüflampe
Fritz Gössner
Feinwaage Extend
Sartorius
Flüssigszintillationszähler Tri-Carb 1600TR
Packard
Gefriercontainer Mr. Frosty
Nalgene
Geldokumentationssystem Gel Doc XR
Bio-Rad
Gelelektrophoresesystem Sub-Cell GT
Bio-Rad
Hämatologie-Analysegerät pocH-100i
Sysmex
Magnetrührer MR3001
Heidolph
42
Material
Magnetrührer MR80
Heidolph
Mikrotiterplatten Lesegerät Safire2
Tecan
Magellan™ - Data Analysis Software
Magellan Software
Mikrotiterplatten Lesegerät Tristar LB 941
Berthold Technologies,
Mikrowin2000-Software v.4.41
Software von Mikrotek Laborsysteme GmbH
Mikrotom HM325
Microm
Mikrowellenofen R-647
Sharp
PCR-Gerät GeneAmp® PCR System 9700
Applied Biosystems
pH-Messgerät 766 Calimatic
Knick
Pipetten Eppendorf Reference
Eppendorf
Pipettierhilfe Pipetus
Hirschmann Laborgeräte
Präzisionswaage ED224S
Sartorius
Reinstwassersystem Milli Q Aca
Millipore
Schüttler Digital MaxQ 6000
Thermo Scientific
Schüttelwasserbad SW-22
Julabo
Schwingmühle MM400
Retsch
Spannungsquelle Powerpac Basic
Bio-Rad
Spektralphotometer Nanodrop 1000
Peqlab
Sterile Werkbank Herasafe KS 12
Thermo Scientific
Sterile Werkbank Herasafe KS 18
Thermo Scientific
Sterile Werkbank SG400E
Baker Company
Taumel-Wipptisch WT12
Biometra
Thermomixer Comfort
Analytik Jena
Trockenschrank 6120
Heraeus
Vortex-Mixer 7-2020
neoLab
Wasserbad H15-2
Kunz Instruments
Zentrifuge Multifuge 3S-R
Heraeus
Zentrifuge Varifuge 3.0R
Heraeus
Zentrifuge 5417R
Eppendorf
Zentrifuge Biofuge Pico
Heraeus
Zentrifuge Avanti J-E
Beckham Coulter
43
Methoden
3
Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Isolierung von viraler RNA
Die virale RNA (vRNA) wurde mit Hilfe des QIAamp Viral RNA Mini Kits (QIAGEN) nach
Herstellerangaben isoliert. Dafür wurden 900 µl des jeweiligen Virus-Arbeitsstocks (3.3.1)
eingesetzt und mit 30 µl ddH2O eluiert, anschließend aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
3.1.2 Design von PCR-Primern
Das Design der Primer für die Sequenzierung (3.1.3), die Klonierung (3.1.4), die
zielgerichtete Mutagenese (3.1.5) und die Herstellung der in situ-Sonden erfolgte nach
Standardkriterien (Lottspeich und Zorbas, 1998). Für die Herstellung der Mutageneseprimer
wurde nach den Kriterien des Reaktionssystems QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit
(Stratagene) vorgegangen. Die Sequenzen der Oligonukleotide wurden mit Hilfe der
Software Clone Manager 9 Professional (Sci-Ed Software) erstellt und anschließend
zusätzlich mit Hilfe eines Online-Programms überprüft (http://depts.washington.edu/
bakerpg/primertemp/primertemp.html).
Um
weitere
Sequenzhomologien
der
Primer
auszuschließen, wurden diese abschließend mittels NCBI-Onlinetools Basic Local Alignment
Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.) überprüft. Die Synthese der Primer
erfolgte durch den Dienstleister Eurofins MWG Operon. Die Bezeichnung der Primer und die
jeweiligen DNA-Sequenzen sind im Anhang unter 9.4 zu finden.
3.1.3 Sequenzierung viraler RNA
Da die Nukleotidsequenz der hier charakterisierten 2009 pandemischen H1N1 (pH1N1)Isolate noch unbekannt war, wurde das Genom dieser Viren aus zwei unabhängigen RNAIsolierungen (3.1.1) nach Umschreiben in DNA mittels RT-PCR (3.1.4.1) vom Dienstleister
Seqlab vollständig sequenziert. Die Sequenzen wurden anschließend in die InfluenzavirusDatenbank
vom
NCBI
(Influenza
Virus
Resource;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
genomes/FLU/FLU.html) unter folgenden Zugriffsschlüsseln eingepflegt:
HH05 (pH1N1): HQ111361 (PB2), HQ111362 (PB1), HQ111363 (PA), HQ111365 (NP),
HQ111364 (HA), HQ111366 (NA), HQ111367 (M) and HQ111368 (NS).
HH15 (pH1N1): GU480807 (PB2), HQ104924 (PB1), HQ104925 (PA), HM598305 (NP),
HQ104926 (HA), HQ104927 (NA), HQ104928 (M) and HQ104929 (NS).
44
Methoden
3.1.4 Klonierung viraler DNA
Für die Charakterisierung des Influenzavirus Genoms in einem Vektor wurde für diese Arbeit,
wie unter 3.1.1 und 3.1.3 beschrieben, virale RNA isoliert und sequenziert. Anschließend
wurde die RNA in vitro wie folgt zu DNA umgeschrieben. Die amplifizierte DNA wurde in den
Plasmid-Vektor pHWSccdB (Stech et al., 2008) ligiert und konnte so in kompetente XL1-Blue
oder SURE-2 Bakterien (Stratagene) transformiert werden.
3.1.4.1 Zweistufige RT-PCR
Zur DNA-Synthese wurde die unter 3.1.1 isolierte vRNA einer zweistufigen Reversen
Transkriptase-Polymerase
Kettenreaktion
(RT-PCR)
unterzogen.
Dabei
transkribierte
zunächst eine Reverse Transkriptase unspezifisch die RNA in einzelsträngige cDNA. Für die
reverse Transkription wurde ein Omniscript RT Kit (QIAGEN) den Herstellerangaben
entsprechend und ein Uni12 Primer verwendet, welcher an die hochkonservierte
Promotorregion aller viralen Gensegmente bindet (Hoffmann et al., 2001). In einem zweiten
Reaktionsansatz wurde mittels DNA-abhängiger-DNA-Polymerase mit Virusgen-spezifischen
Primern die cDNA zu doppelsträngiger DNA amplifiziert. Für jedes virale Gen wurde
demnach ein Reaktionsansatz benötigt. Die hierfür verwendete Phusion Polymerase (NEB)
verfügt über eine hohe "proofreading"-Aktivität.
RT-Ansatz:
10x Omniscript Puffer 2 µl
dNTP 5 mM 2 µl
RNAse Inhibitor 0,25 µl
Uni12-Primer 10 µM 2 µl
Omniscript 1 µl
RNA Template 4 µl
ad 20 µl ddH2O
→1 h 37 °C
PCR-Ansatz: 5x Puffer 10 μl
dNTPs 5 mM 2 μl
Primer fw 10 μM 2,5 μl
Primer rv 10 μM 2,5 μl
Phusion Polymerase 1 μl
cDNA Template 2 μl
ad 50 μl dH2O
PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 98 °C 30 s
35 mal 3-Schritt Zyklen mit:
Denaturierung 98 °C 10 s
45
Methoden
Primerhybridisierung 60 °C 30 s
Elongation 72 °C 6 min
Finale Elongation 72 °C 5 min
3.1.4.2 DNA-Gelelektrophorese
Um die amplifizierten viralen DNA-Segmente auf ihre zu erwartende Molekülmasse zu
überprüfen und aufzureinigen, wurde zur Größenauftrennung eine Geleletktrophorese
durchgeführt. Dafür wurde durch Erhitzen
1 % Agarose in 1x TBE-Puffer gelöst, mit
Ethidiumbromid versetzt und in eine entsprechende Laufkammer gegossen. Die Proben
wurden
vor
dem
Auftragen
mit
6x
Probenpuffer
versetzt
und
zur
späteren
Größenbestimmung der MassRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific) zusammen mit den
Proben auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 100-120 V. Die
Visualisierung der DNA-Banden fand anschließend unter UV-Licht statt (Bsp.: Abb. 7). Zur
Extraktion der überprüften DNA-Banden wurden diese unter UV-Licht ausgeschnitten und
einer DNA-Aufreinigung mittels QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN) nach Angaben des
Herstellers unterzogen. Die aufgereinigte DNA konnte nun zur weiteren Kontrolle sequenziert
(3.1.3) und für die Ligation (3.1.4.3) in einen Vektor verwendet werden.
Abb. 7: Darstellung der zu erwartenden Bandengrößen der viralen Gensegmente auf einem Agarosegel.
Die jeweils angegebenen Banden wurden für die Aufreinigung nach der elektrophoretischen Auftrennung
ausgeschnitten. (aus Stech et al., 2008)
46
Methoden
3.1.4.3 Ligation
Die überprüften und aufgereinigten DNA-Segmente aus 3.1.4.2 wurden in einer PCR in den
Plasmid-Vektor pHWSccdB (Stech et al., 2008) eingeführt. Aufgrund der Amplifikation der
DNA-Segmente mit Gen- und Vektorspezifischen Primern binden diese am 5' Ende
komplementär an das hier verwendete Plasmid. Die Genspezifische Sequenz ist zum einen
komplementär zu der konservierten nicht-kodierenden Region, die Influenzavirus Gene
flankieren, zum anderen komplimentär zu einer für jedes Gen spezifischen Anfangssequenz.
In diesem Fall wurde Primer spezifisch gegen die viralen Gene eines 1918 pandemischen
Influenzavirusstamms (H1N1) verwendet, da eine hohe Übereinstimmung mit den 2009
pandemischen Influenzaviren (pH1N1) zu erwarten war. Die PCR wurde mit der bereits unter
3.1.4.1 beschriebenen Phusion Polymerase (NEB) in mehreren Ansätzen mit jeweils
verschiedenen Mengen DNA durchgeführt, um ein optimales Verhältnis von Vektor zu Insert
zu erreichen.
Ligations-PCR-Ansatz:
5x Puffer 10 μl
dNTP 10mM 1 μl
Phusion Polymerase 1 μl
pHWSccdB Plasmid (1:100) 10 µl
DNA Insert 1/3/7 µl
ad 50 μl ddH2O
PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 98 °C 30 s
35 mal 3-Schritt Zyklen mit
Denaturierung 98 °C 10 s
Primerhybridisierung 48 °C 1 min
Elongation 72 °C 5:30 min
3.1.4.4 Restriktionsverdau
Nach der Ligations-PCR wurde dem Ansatz jeweils 1 µl des Restriktionsenzyms DpnI
(10 U/µl) zugegeben und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Da die, in ihrer ursprünglichen Form aus
E. coli-Bakterien stammende, DNA methyliert vorliegt, werden Plasmide die noch methylierte
DNA oder hemimethylierte DNA beinhalten vom DpnI-Enzym erkannt und durch Verdau
ausselektiert. Die Plasmide konnten dann für eine anschließende Amplifikation in
kompetente XL1-Blue oder SURE-2 Bakterien (Stratagene) transformiert werden.
3.1.4.5 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien
Zur Transformation wurden kompetente Bakterien des E. coli Stammes XL1-Blue oder
SURE-2 (Stratagene) verwendet, dabei wurde die sogenannte Hitzeschock-Methode
angewandt.
Dafür
wurden
jeweils
50 µl
der
fertigen
Bakterien-Suspension
mit
47
Methoden
ß-Mercaptoethanol versetzt und auf Eis vorinkubiert und nach Zugabe von 10 µl des
Ligationsansatzes (3.1.4.3) wurde 30 min lang auf Eis inkubiert. Darauf folgte die Inkubation
von 45 s bei 42 °C in einem Wasserbad. Nach weiteren 2 min auf Eis wurden jedem Ansatz
450 µl vorgewärmtes (42 °C) TB-Kulturmedium hinzugegeben und für eine weitere Stunde
bei 37 °C in einem Schüttler inkubiert. Durch anschließende Zentrifugation wurde das
Reaktions-Medium entfernt. 100 µl vom Zellpellet wurden auf
Ampicillin-Agarplatten
ausplattiert und die Bakterien über Nacht bei 37 °C angezogen. Aufgrund des Ampicillins
erfolgte eine Negativselektion der Bakterien ohne Plasmide.
3.1.5 Zielgerichtete PCR-Mutagenese
Bei einer zielgerichteten Mutagenese können Nukleotidaustausche, -insertionen oder
-deletionen mit Hilfe des QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kits (Stratagene) in
doppelsträngige Plasmid-DNA eingeführt werden. Hierzu werden zwei gegenläufige
komplementäre Primer mit der gewünschten Mutation in einer PCR verwendet. Die
Amplifikation erfolgt mittels hochprozessiver PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene),
welche über eine Korrekturlese-Aktivität verfügt. Der als anfängliche Vorlage dienende
Parentalstrang, der nicht über die gewünschte Mutation verfügt, ist methyliert bzw.
hemimetyliert,
so
wie
meist
aus
E. coli
stammende
Plasmid-DNA.
Die
DpnI-
Restriktionsendonuklease erkennt methylierte DNA und verdaut diese. Dadurch kann
unmethylierte, methylierte bzw. eingeführte DNA spezifisch selektiert werden (3.1.4.4). Zur
anschließenden Ligation der entstandenen Einzelstrang-Brüche wurden die Plasmide in
kompetente XL1-Blue oder SURE-2 Bakterien (Stratagene) transformiert (3.1.4.5).
PCR-Ansatz: 10x Pfu Puffer 5 μl
dNTP-Mix 10 mM 1 μl
Primer fw 10 μM 2 μl
Primer rv 10 μM 2 μl
PfuTurbo Polymerase (2,5 U/μl) 1 μl
Plasmid pHW2000 50 ng/μl 1 μl
ad 50 μl ddH2O
PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 95 °C 1 min
20 mal 3-Schritt Zyklen mit
Denaturierung 95 °C 30 s
Primerhybridisierung 48 °C 1 min
Elongation 68 °C 10 min
48
Methoden
3.1.6 Plasmidamplifikation in E. coli Bakterien
Die Vervielfältigung viraler Plasmid-DNA (3.1.4, 3.1.5) erfolgte in E. coli-Bakterien des
Stammes XL1-Blue oder SURE-2 (Stratagene). Dafür wurden einzelne Klone nach der
Anzucht auf Agarplatten gepickt und in eine LB-Amp-Flüssignährlösung mit 100 µg/ml des
Antibiotikums Ampicillin überführt. Für kleine Mengen wurden ca. 5 ml, für größere Mengen
ca. 250 ml Nährlösung verwendet. Die angeimpften Nährlösungen wurden für 18-24 h bei
37 °C im Schüttelinkubator bis zur gewünschten Zelldichte inkubiert.
3.1.7 Plasmidpräparation
Nach Vervielfältigung der viralen Plasmid-DNA in Bakterien (3.1.6) wurde diese mit Hilfe
fertiger
Reaktionssysteme
gewonnen.
Für
kleine
Mengen
wurde
dies
mit
dem
Reaktionssystem QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) und für größere Mengen mit dem
QIAfilter Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) durchgeführt. Zusätzlich zu den Standardangaben des
Herstellers wurden für die Isopropanol-Fällung 6 µg/ml Glycogen verwendet, um die DNAAusbeute zu erhöhen.
3.1.8 Archivierung plasmidtragender E-coli Bakterien
Für die Archivierung plasmidtragender E. coli-Bakterien wurde 1 ml einer Bakterienkultur in
Nährlösung mit 1ml Glycerol versetzt und bei -80 °C gelagert. Diese sogenannten
Kryostocks
können
zum
Animpfen
von
Nährlösungen
zur
Vervielfältigung
der
entsprechenden Plasmid-DNA verwendet werden.
3.1.9 Bestimmung Polymeraseaktivität
Um die Aktivität eines viralen Polymerasekomplexes in vitro zu messen, werden die
Untereinheiten des viralen Polymerasekomplexes PB1, PB2, PA und NP zusammen mit
einem Reportergenplasmid (pPol-I-NP-Luc-human) in eukaryotische Zellen transfiziert. Die
entsprechenden viralen Gene wurden hierfür in ein Expressionsplasmid kloniert (3.1.4). Das
Reportergen kodiert für die Luciferase des Leuchtkäfers Photinus pyralis und steht unter der
Kontrolle eines Pol-I Promotors. Es wird daher von der zellulären DNA-abhängigen RNAPolymerase erkannt, was zu einer schwachen Expression der Reportergen-Luciferase führt.
Dies ist ebenso der Fall für die RNP-Untereinheiten, welche sich nach Transkription und
Translation
in
den
Zellen
zu
einem
viralen
Ribonukleoprotein
(vRNP)-Komplex
zusammenlagern. Da das Reportergen von virusspezifischen, nicht-kodierenden Regionen
flankiert wird, entsteht bei dessen Transkription negativ orientierte virale RNA, welche von
den neu entstandenen viralen Polymerasekomplexen ebenfalls erkannt und nun verstärkt
prozessiert wird. Die relative Aktivität der viralen Polymerase kann demnach an der
49
Methoden
Expression des Reportergens gemessen werden. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz
wird ein zweites Reportergenplasmid transfiziert. Dieses kodiert für eine weitere Luciferase
(Renilla reniformis) steht allerdings unter der Kontrolle eines anderen Promotors (HSVThymidinkinase) und wird daher ausschließlich von den eukaryotischen Zellen prozessiert
und nicht vom viralen Polymerasekomplex.
3.1.9.1 Transfektion von HEK293T-Zellen
Die Untereinheiten der viralen RNPs wurden jeweils in den Expressionvektor kloniert
pHW2000
und
anschließend
amplifiziert
(3.1.4,
3.1.6).
Je
1 µg
der
viralen
Polymeraseunteinheiten und des Nukleoproteins wurden zusammen mit den beiden
Reporter Plasmiden in HEK293T-Zellen transfiziert. Pro Plasmidansatz wurde dafür 1 ml
Optimem mit 12 µl des komplexbildenden Transfektionsreagenz PEI für 5 min vorinkubiert.
Diese Mischung wurde anschließend zum Plasmidansatz hinzugegeben und für 20 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Für einen Transfektionsansatz in einer 60 mm Zellkulturschale
wurden ca. 2*106 HEK293T-Zellen in 2 ml Transfektionsmedium suspendiert und die
Plasmidmischung langsam hinzugefügt. Es folgte eine Inkubation von 24 Stunden bei 37 °C
in einem CO2-Inkubator, bevor die transfizierten Zellen geerntet und für die Messung lysiert
wurden.
3.1.9.2 Messung der relativen Polymeraseaktivität
Detektiert wurde die relative Polymeraseaktivität mit Hilfe eines Dual-Luciferase Reporter
Assays (Promega). Hierbei wird Luciferin, das Substrat der Luciferase, zu den nach
Herstellerangaben lysierten transfizierten Zellen hinzugegeben (3.1.9.1). Die Spaltung des
Luciferins durch die Luciferase führt zu einer detektierbaren Biolumineszenz . Diese wurde in
Relativen Lichteinheiten (Relativ Light Units, RLU) in Mikrotiterplatten in einem Tristar LB
941 Luminometer (Berthold Technologies) gemessen und mit Hilfe der Software MikroWin
2000 ausgewertet.
3.1.10 Zytokinbestimmung mittels enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA)
Um Unterschiede in der Expression einzelner Zytokine während der Immunantwort auf eine
Influenzavirus Infektion zu untersuchen, wurden deren absolute Mengen in der Lunge und im
Serum von infizierten und nicht-infizierten Mäusen bestimmt (3.4).
Bei einem enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) wird das nachzuweisende
Antigen, in diesem Fall ein Zytokin, an einen spezifischen Erstantikörper gebunden, wobei
dieser wiederum mit einem enzymgekoppelten Zweitantikörper detektiert werden kann. Bei
der hier verwendeten Sandwich-Methode werden zwei Erstantikörper verwendet, wovon
einer bereits an eine Mikrotiterplatte gebunden ist. Die Antigen enthaltende Probe konnte
50
Methoden
nun auf der Mikrotiterplatte angereichert werden, um dann mit Hilfe eines weiteren
Erstantikörpers nachgewiesen zu werden.
Für
diese Arbeit
wurden
die
Zytokine
IL-4,
TNF-α
und
IFN-γ
in
Serum
und
Lungenhomogenaten von Mäusen (3.4.3) mit Hilfe des jeweiligen LEGEND MAX™ Mouse
ELISA Kits (Biolegend) detektiert. Für MCP-1, IL-6 und IL-10 hingegen wurden die jeweiligen
Mouse Quantikine ELISA Kits (R&D Systems), den Herstellerangaben entsprechend,
verwendet. Die absolute Mengenbestimmung erfolgte mit Hilfe einer Verdünnungsreihe des
aufgereinigten Antigens. Der Farbumschlag der verschiedenen Ansätze, durch enzymatische
Reaktion einer Meerrettichperoxidase, wurde bei 450 nm in einem Mikrotiterplatten
Lesegerät Safire2 (Tecan) gemessen.
3.2 Zellkultur
3.2.1 Kultivierung
Die Kultivierung der hier verwendeten eukaryotischen Zelllinien erfolgte in einem CO2Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 %. Als
Wachstumsmedium wurde für HEK293T- und A549-Zellen DMEM-Zellkulturmedium und für
MDCK-Zellen MEM-Zellkulturmedium mit jeweils 10 % FCS, 1 % Penicillin und Streptomycin
und 1 % L-Glutamin verwendet. Wenn die Zellen 90-100 % Konfluenz im Kulturgefäß
erreichten, wurde je nach Verwendung ein Teil der Zellen passagiert. Hierfür wurden die
Zellen mit PBS gewaschen (MDCK alternativ mit Trypsin-EDTA) und mit Trypsin-EDTA bei
37 °C inkubiert, bis alle Zellen vom Boden abgelöst waren. Die Inaktivierung des Trypsins
erfolgte durch anschließendes Hinzugeben von FCS-haltigem Medium. Eine entsprechende
Verdünnung der Zellen wurde dann in ein neues Kulturgefäß transferiert.
3.2.2 Archivierung
Für die Archivierung der verwendeten Zellen wurden diese vom Kulturgefäß abgelöst (3.2.1)
und abzentrifugiert (5 min, 1000 xg). Die Zellen wurden in einem Milliliter Zelleinfriermedium
resuspendiert und in Kryoröhrchen mittels Gefriercontainer (runterkühlen von -1 °C/min) bei
-80 °C eingefroren. Für die Archivierung von mehr als einigen Wochen sollte ein
Flüssigstickstoffkontainer verwendet werden.
Um eingefrorene Zellen wieder in Kultur zu nehmen, wurden diese bei 37 °C im Wasserbad
aufgetaut und anschließend langsam Kulturmedium zu den Zellen hinzugegeben. Reste des
Einfriermediums wurden mittels Zentrifugation entfernt und die Zellen in frischem
Kulturmedium resuspendiert. Die erste Passage oder ggf. ein Mediumwechsel sollte bereits
am nächsten Tag stattfinden.
51
Methoden
3.3 Virologische Methoden
Alle
Arbeiten
mit
infektiösem
Material
wurden
für
diese
Arbeit,
je
nach
Risikogruppeneinstufung des jeweiligen Virusstamms von der Gentechnikbehörde der Stadt
Hamburg, unter Schutzstufe-2 oder -3 Bedingungen durchgeführt.
3.3.1 Virusanzucht
Um Virusisolate, die direkt von einem infizierten Wirt entnommen wurden, untersuchen zu
können, wurden diese zu einem Arbeitsstock hochgezogen. Zur Minimierung adaptiver
Mutation sollte dies im jeweils ursprünglichen Wirtsorganismus geschehen. So wurden
Influenzavirusisolate aviären Ursprungs in embryonierten Hühnereiern hochgezogen Isolate
aus Säugetieren hingegen in Säugerzellen hochgezogen. Um die Anhäufung von
zufallsbedingen Mutationen der viralen Polymerase, welche über keine KorrekturleseAktivität verfügt (Drake, 1993), zu minimieren, wird die Anzahl der Passagen so gering wie
möglich gehalten. Für die vorliegende Arbeit wurden Arbeitsstocks mit maximal zwei
Passagen verwendet. Die Lagerung der Arbeitsstocks erfolgte in 100 µl bis 1 ml Aliquots
(meist 300 µl) bei -80 °C.
3.3.1.1 Anzucht im Hühnerei
Für die Anzucht im embryonierten Hühnerei wurden elf Tage lang bebrütete Hühnereier mit
Virus infiziert. Zunächst wurde mittels Eierprüflampe kontrolliert, ob das Ei befruchtet und der
Embryo lebendig ist. Die stumpfe Seite des Eis wurde mit Jodlösung desinfiziert und mit
einem Handbohrer vorsichtig ein kleines Loch in die Schale gebohrt. Pro Ei wurden hier
200 µl Virusverdünnung (10-3 oder 10-4) mittels Kanüle (0,5 x 25 mm) in die Allantoishöhle
injiziert. Um diese zu erreichen und dabei den Embryo nicht zu verletzen wurde die Kanüle
senkrecht in die Öffnung der Schale vollständig eingeführt. Anschließend wurde die Öffnung
mit Lösungsmittel freiem Klebstoff verschlossen und die Eier für weitere 48 Stunden bei
37 °C inkubiert. Die infizierten Hühnereier wurden anschließend über Nacht bei 4 °C gelagert
um durch Vasokonstriktion eine blutfreie Entnahme der Allantoisflüssigkeit zu erleichtern. Die
Eier wurden hierfür am stumpfen Ende über der Luftkammer geöffnet und die
Allantoisflüssigkeit mittels Einweg-Plastikpipette entnommen, dazu wurde der Dottersack mit
einem stumpfen Werkzeug zur Seite gedrückt. Die Allantoisflüssigkeit verschiedender Eier
konnten nun mittels Hämagglutinationstest (3.3.4) auf Viruspartikel überprüft und Chargen
mit ähnlichen Werten zusammengeführt werden, um mit Hilfe eines Plaquetests den Titer an
infektiösen Viruspartikeln zu bestimmen (3.3.6).
3.3.1.2 Anzucht in MDCK-Zellen
Für die Virusanzucht in Säugerzellen wurden MDCK-Zellen verwendet die am vorherigen
Tag in 75 cm2 Kulturflaschen ausgesät wurden. Die Zellen sollten eine Konfluenz von
52
Methoden
80-90 % aufweisen und wurden vor Infektion mit ca. 5 ml Infektionsmedium gewaschen.
Anschließend wurde 2 ml Virusverdünnung in Infektionsmedium auf die Zellen gegeben und
für 30 min bei 37°C im CO2-Inkubator inokuliert. Danach wurde das Inokulum entfernt und
ca. 6 ml Infektionsmedium auf die Zellen gegeben. Bei der Anzucht von Viren mit
monobasischer Spaltstelle im HA wurde dem Infektionsmedium 1 µg/ml TPCK-Trypsin
hinzugegeben. Es folgte eine Inkubation der infizierten Zellen bis zu einem Zytopathischen
Effekt (CPE) von mehr als 50 % und/oder der Detektion einer Hämagglutination von
Hühnerblut (3.3.4) (ca. 24-48 h). Der Zellkulturüberstand wurde daraufhin abgenommen und
Zelltrümmer bei 1000 xg für 5 min abzentrifugiert. Für die Verwendung als Arbeitsstock
wurde der Überstand aliquotiert und der Titer an infektiösen Viruspartikeln mittels Plaquetest
bestimmt (3.3.6).
3.3.2 Reverse Genetik
Für die Herstellung rekombinanter Influenzaviren wurde für diese Arbeit die Reverse Genetik
nach der Methode von Hoffmann et al. angewandt (Hoffmann et al., 2000a). Bei der
Reversen Genetik von Influenza Viren werden die acht viralen Gensegmente, wie unter 3.1.4
beschrieben, in den Expressions-Vektor pHW2000 kloniert. In diesem werden die jeweiligen
Inserts von eukaryotischen Promotoren flankiert, welche eine Expression des genetischen
Materials in eukaryotischen Zellen ermöglichen. Zusätzlich können z.B. mittels zielgerichteter
Mutagenese (3.1.5) künstlich Veränderungen im viralen Genom eingeführt werden. Alle acht
Plasmide werden in HEK293T-Zellen transfiziert, wo virale RNA und die viralen Proteine
synthetisiert werden. Analog zu einer Infektion der Zelle werden nun Viruspartikel
zusammengelagert und freigelassen. Zur effizienten Vermehrung der Viren fand mit dem
Zellüberstand
anschließend
eine
Infektion
von
MDCK-Zellen
statt.
Die
genaue
Vorgehensweise zur Erlangung eines Arbeitsstocks rekombinanter Viren ist im folgenden
Abschnitt 3.3.2.1 beschrieben.
3.3.2.1 Generierung rekombinanter pH1N1 Viren
Rekombinante 2009 pandemische H1N1 (pH1N1) Viren, deren Reassortanten und
Punktmutanten wurden nach der unter 3.3.2 beschriebenen Methode hergestellt. Für einen
Transfektionsansatz wurden die Vektoren mit allen acht Gensegmenten zusammenpipettiert
und mit 250 µl Optimem versetzt. Dabei wurden für das HH05 Virus (pH1N1) jeweils 1 µg
und für Segmente des HH15 Virus (pH1N1) jeweils 2 µg eingesetzt. Pro Plasmidansatz
wurden weitere 250 µl Optimem mit dem Transfektionsreagenz Lipofectamin®2000 im
Verhältnis Plasmid [µg] : LF 2000 [µl] ≙ 1:2 für 5 min vorinkubiert. Diese Mischung wurde
anschließend zum Plasmidansatz hinzugegeben und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Für einen Transfektionsansatz in einer 6 cm Zellkulturschale wurden ca. 3*106 HEK293T-
53
Methoden
Zellen in 3 ml Transfektionsmedium suspendiert und die Plasmidmischung langsam
hinzugegeben. Es folgte eine Inkubation von 48 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator. Für eine
effiziente
Vermehrung
Zellkulturüberstands
der
nach
neu
entstandenen
Transfektion
auf
Viruspartikel
konfluente
wurden
MDCK-Zellen
500 µl
des
(mit
1 ml
Infektionsmedium) in einer 35 mm Zellkulturschale gegeben. Nach weiteren 72 h Inkubation
wurde eine erneute Virusanzucht in MDCK-Zellen, wie unter 3.3.1.2, durchgeführt
(Abänderungen:
25 cm2
Zellkulturflasche,
1 ml
Überstand
als
Inokulum,
4 ml
Infektionsmedium).
3.3.3 Virusgenotypisierung
Um nach Generierung rekombinanter Viren (3.3.2.1) zu überprüfen, ob an den definierten
Stellen des Virusgenoms die erwarteten Nukleinsäuren vorhanden sind, wurden mit
spezifischen Primern einzelne Bereiche des viralen Genoms sequenziert. Dafür wurden die
entsprechenden Genomabschnitte mittels einstufiger PCR revers transkribiert und
amplifiziert. Die Gewinnung viraler DNA über eine zweistufige PCR, wie für die Klonierung
beschrieben (3.1.4), ist hochspezifisch mit maximaler Genauigkeit der Polymerase, wird aber
für eine partielle Überprüfung, wie hier bei der Genotypisierung, nicht zwangläufig benötigt.
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des QIAamp Viral RNA Mini Kits (QIAGEN), virale RNA
isoliert, wie unter 3.1.1 beschrieben. Die entsprechenden DNA-Abschnitte wurden mit genund abschnittsspezifischen Primern (3.1.2) mittels eines QIAGEN OneStep RT-PCR Kits
(QIAGEN) in einem Reaktionsansatz transkribiert und amplifiziert. Nach der PCR wurde die
virale DNA mit Hilfe eines PCR Purification Kits (QIAGEN) aufgereinigt und anschließend
sequenziert (3.1.3).
RT-PCR-Ansatz:
5 x OneStep Puffer 10 µl
dNTP 10 mM 2 µl
OneStep Enzyme Mix 2 µl
RNasin (40 U/µl) 1 µl
Primer fw 10 µM 3 µl
Primer rv 10 µM 3 µl
Template 1,0 µl
ad 50 µl ddH2O
PCR-Programm:
Reverse Transkription 50 °C 30 min
Initiale Denaturierung 95 °C 15 min
35 mal 3-Schritt Zyklen mit
Denaturierung 94 °C 1 min
Primerhybridisierung 52 °C 30 s
54
Methoden
Elongation 72 °C 3 min
Finale Elongation 72 °C 10 min
3.3.4 Hämagglutinationstest
Das Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) von Influenzaviren bindet zelluläre Sialinsäuren
als Rezeptor. Inkubiert man eine Suspension welche das virale HA Protein enthält mit
Erythrozyten, werden letztere durch Rezeptorbindung des viralen Proteins quervernetzt. Es
kommt zu einer sogenannten Hämagglutination. Ist kein HA in der Suspension enthalten
sedimentieren die Erythrozyten. Demnach kann mit diesem Test nicht festgestellt werden, ob
es sich bei den quervernetzenden HA-Partikeln um infektiöse Viruspartikeln handelt.
Der Hämagglutinationstest (HA-Test) wurde in 96-Loch-Titerplatten mit einem v-förmigen
Boden durchgeführt. Aus 100 µl der unverdünnten Probe in der jeweils ersten Vertiefung
wurde eine zweifach-Verdünnungsreihe erstellt. Hierfür wurden 50 µl PBS in den
Vertiefungen vorgelegt und jeweils 50 µl in die nächste Vertiefung weitergetragen. Nach
Zugabe von jeweils 50 µl einer 1 %igen Erythrozytensuspension folgte eine Inkubation bei
4 °C für ca. 30 min. Das virale Oberflächenprotein NA, welches eine Spaltung der HARezeptorbindung katalysieren würde, ist bei 4 °C nicht aktiv. Zur Auswertung wird jeweils der
reziproke Wert der Verdünnungsstufe als Hämagglutinationseinheit (haemagglutination units,
HAU) angegeben, bei der gerade noch eine Agglutinierung der Erythrozyten stattfindet.
In der vorliegenden Arbeit wurde humanes Blut oder Hühnervollblut für die Herstellung einer
1 %igen Erythrozytensuspension in 0,9 %iger NaCl-Lösung verwendet.
3.3.5 Hämagglutinationsinhibitionstest
Die Eigenschaft des Oberflächenproteins, HA Erythrozyten zu agglutinieren kann auch für
einen Serum-Antikörpertest genutzt werden. Die Kopfdomäne des viralen HAs ist das
stärkste Antigen von Influenzaviren und induziert bei einem infizierten Wirt die Bildung von
spezifischen Antikörpern. Inkubiert man eine Virussuspension mit diesen Antikörpern,
erkennen und binden diese das HA-Protein. Eine Hämagglutination wird dadurch, abhängig
von der Antikörperkonzentration, inhibiert.
Für die Bestimmung der Antikörperkonzentration gegen einen bestimmten Influenzavirus
Subtyp im Serum, wurde dieses zunächst für 30 min bei 56 °C im Wasserbad inaktiviert.
Ausgehend von einer 1:5 Vorverdünnung wurde eine 2-fach Verdünnungsreihe in 96-LochTiterplatten mit einem v-förmigen Boden erstellt. Dafür wurden jeweils 25 µl aus der
vorangehenden Vertiefung zu 25 µl vorgelegten PBS in die nächste gegeben. Mittels HATest (3.3.4) wurde vom Virus, gegen das getestet werden sollte, die Verdünnung bestimmt
55
Methoden
bei der ein HAU von 4 vorlagt. Jeweils 25 µl einer Virussuspension mit von 4 HAU wurden zu
den Serumverdünnungen gegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde 50 µl einer 1 %igen Erythrozytensuspension in jede Vertiefung gegeben
und für eine Stunde bei 4 °C inkubiert. Der Hämagglutinationsinhibitions (HAI)-Titer in einem
untersuchten Serum ist der reziproke Wert der Verdünnung bei der gerade noch eine
Inhibition der Hämagglutination stattfindet. Ein Wert von ≥ 1:40 wird definiert als ein HAI-Titer
mit ausreichender Menge an Antikörpern im Serum, um vor einer erneuten Infektion mit dem
getesteten Influenzavirus Subtyp zu schützen.
Für diese Arbeit wurden für Hämagglutinationsinhibitionstests stets Hühnererythrozyten in
0,9 %igen NaCl-Lösung verwendet.
3.3.6 Titerbestimmung mittels Plaquetest
Zur Titerbestimmung infektiöser Viruspartikel in einer Virussuspension wird ein Plaquetest
mit semi-viskosen Overlay verwendet (modifiziert nach Matrosovich et al., 2006). MDCKZellen wurden am Vortag in 6-Loch-Zellkulturplatten ausgesät und mit einer Konfluenz von
70-80 % verwendet. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit jeweils 333 µl der zu
bestimmenden Virussuspension inokuliert. Für eine Titerbestimmung wurde hierzu eine 10fach Verdünnungsreihe der Probe in PBS verwendet. Es folgte eine Inkubation von 30 min
bei 37 °C im CO2-Inkubator.Dabei wurde durch gelegentliches Schwenken ein Austrocknen
der
Zellen
verhindert.
Anschließend
wurden
3 ml
Avicel-Overlay-Medium
in
jede
Plattenvertiefung gegeben, wobei für Viren mit monobasischer Spaltstelle im HA 1 µg/ml
TPCK-Trypsin hinzugefügt wird. Die Kulturplatten wurden für 72 h bei 37 °C im CO2Inkubator inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und zur Fixierung für 30 min bei
4 °C mit 4 %igem PFA überschichtet. Detektiert werden sogenannte Plaques im Zellrasen,
diese gehen von infizierten Zellen während der Inokulation aus. Zur Berechnung des Titers in
plaque forming units pro Milliliter (p.f.u./ml) werden die Plaques ausgezählt und die
jeweiligen Verdünnungen einberechnet.
Für die vorliegende Arbeit wurden die Virustiter mittels Immunfärbung des viralen NPProteins bestimmt. Dazu wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für 30 min mit 0,3 %
Triton-X auf einem Taumelwipptisch permeabilisiert. Anschließend folgte eine Inkubation mit
500 µl Erstantikörper, ein Anti-NP Antikörper (Abcam), pro Vertiefung für ca. 1 h bei
Raumtemperatur. Nach drei Waschschritten mit PBS-Tween (0,05 %) wurde für eine weitere
Stunde mit 500 µl Zweitantikörper, ein Anti-Maus-IgG HRP-gekoppelter Antikörper
(SouthernBiotech), inkubiert. Beide Antikörper wurden für diese Arbeit mit einer Verdünnung
von 1:1000 in Superblock-Puffer eingesetzt. Die Detektion erfolgte nach zwei Waschschritten
56
Methoden
mit dem HRP-Substrat enthaltenden True-Blue (KPL). Dabei wurde jeweils die letzte
Vertiefung der Zellkulturplatte ausgewertet, in der noch Plaques zu detektieren waren.
Alternativ kann für die Titerbestimmung auch eine indirekte Detektion mittels Kristallviolett
verwendet werden. Dafür werden die infizierten Zellkulturplatten nach 72 h Inkubation
gewaschen und fixiert (s.o.) und mit Kristallviolett überschichtet. Nach ca. 5 min wird die
Kristallviolett-Lösung wieder abgenommen und die Zellen gewaschen. Intakte Zellen weisen
anschließend eine violette Färbung auf, durch Virusinfektion lysierte Zellen oder Löcher im
Zellrasen bleiben farblos.
3.3.7 Wachstumskurven von Viren
Das Wachstumsverhalten der hier verwendeten Viren in humanen Lungenzellen, wurde
anhand einer Titer-Kinetik bestimmt. Humane A549-Zellen wurden hierfür bei einer
Konfluenz
von
80-90 %
in
35 mm-Durchmesser
Zellkulturschalen
mit
dem
zu
untersuchenden Virus infiziert und 24, 48, 72 und 96 h danach 100 µl vom Überstand
abgenommen. Die jeweiligen Virustiter wurden zu den verschiedenen Zeitpunkten nach
Infektion (p.i.) mittels Plaquetest (3.3.6) bestimmt. Infiziert wurde mit einer Multiplizität der
Infektion (MOI) von 0,01 der 2009 pandemischen H1N1 Influenzaviren und des saisonalen
H1N1 und mit MOI=0,001 des humanen H5N1 Isolats. Die Verdünnungen wurden in PBS
angesetzt, das Inokulationsvolumen betrug 500 µl. Nach 30 min Inkubation bei 37 °C wurde
das Inokulum entfernt und mit 2 ml Infektionsmedium ersetzt. Zur anschließenden
Titerbestimmung mittels Plaquetest (3.3.6) wurde zu den entsprechenden Zeitpunkten 100 µl
Kulturüberstand abgenommen und bei -20 °C gelagert.
3.4 Tierexperimentelle Methoden
Untersuchungen zur Letalität, Organtropismus, Immunreaktion und Transmission der in
dieser Arbeit untersuchten Influenzaviren wurden in Mäusen und Meerschweinchen am
Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie in Hamburg durchgeführt
(2.9). Alle Tierversuche wurden nach Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes
durchgeführt
und
von
der
Behörde
Veterinärwesen/Lebensmittelsicherheit
-
für
Gesundheit
Hamburg
und
geprüft
Verbraucherschutz
und
genehmigt.
Die
experimentellen Versuche mit Frettchen wurden in der Biological Investigation Group, Public
Health England in Porton Down, Großbritannien genehmigt und durchgeführt.
57
Methoden
3.4.1 Narkose und Tötungsmethoden
Mäuse:
Für die Infektion (3.4.2) von Mäusen wurde eine Anästhesie-Mischung mit 100 mg/kg
Ketamin und 10 mg/kg Xylazin in 200 µl 0,9 %iger NaCl-Lösung mittels einer 26G Kanüle
intraperitoneal injiziert. Zur kurzen Sedierung für die Blutentnahme (3.4.3) wurde eine
Inhalationsnarkose mit Isofluran verabreicht. Die Entnahme von Organen erfolgte erst nach
Tötung der Versuchstiere (3.4.3). Das Töten der Mäuse wurde mittels zervikaler Dislokation
(Strecken) durchgeführt, diesem ging zusätzlich eine Inhalationsnarkose mit Isofluran
voraus.
Meerschweinchen:
Für die Narkose während der Infektion und der Nasenspülung von Meerschweinchen (3.4.2,
3.4.3) wurde eine 30 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Xylazin-Mischung verwendet und in einer
0,9 %igen NaCl-Lösung von 200 µl intramuskulär in den Oberschenkel injiziert (26G-Kanüle).
Um das Austrocknen der Hornhaut während der Narkose zu verhindern, wurde Augensalbe
auf die Augen der Meerschweinchen gegeben. Die finale Blut- und Organentnahme (3.4.3)
fand unter einer überdosierten Barbiturat-Narkose statt. Hierfür wurden 100 mg/kg
Pentobarbital-Natriumsalz zu 50 mg/ml in ddH2O gelöst und intraperitoneal mit einer 26G
Kanüle injiziert. Fand keine Probenentnahme nach Ende des Tierversuchs statt, wurde das
Embutramid T61 zur Tötung eingesetzt. Hierfür wurde mittels 25 G Kanüle 2 ml der
Injektionslösung intrakardial verabreicht.
Frettchen:
Für die Narkose während der Infektion und der Nasenspülung von Frettchen (3.4.2, 3.4.3)
wurde jeweils 0,25 ml/kg einer 1 ml Ketamin/0,4 ml Xylazin Injektionslösung intramuskulär in
den Oberschenkel injiziert. Bei der finalen Blut- oder Organentnahme aller infizierten Tiere
(3.4.3) wurden diese unter Narkose ausgeblutet.
3.4.2 Infektion und Überlebensversuch (MLD50-Bestimmung)
Mäuse:
Für die Infektion von Mäusen mit Influenzavirusisolaten wurde nach erfolgter Narkose die
entsprechende Viruskonzentration in 50 µl PBS verdünnt und dem narkotisierten Tier durch
langsames Pipettieren in die Nasenlöcher verabreicht. Kontrolltieren wurde intranasal die
entsprechende Menge PBS verabreicht. Danach wurden die Versuchstiere über 14 Tage
hinweg täglich kontrolliert und regelmäßig gewogen. Der humane Endpunkt wurde bei einem
Gewichtsverlust von mehr als 25 % des Ausgangsgewichts oder wenn ein Tier
offensichtliche Schmerzen und/oder nicht mehr selbstständig fressen/trinken konnte erreicht.
Das Tier wurde dann vorzeitig getötet. Die Letalität der hier untersuchten Virusisolate in
58
Methoden
Mäusen wurde mit der MLD50 Methode nach Reed und Muench, 1938 bestimmt. Dabei wird
mit seriellen 10-fachen Virusverdünnungen infiziert und die Dosis bei der 50 % der
Versuchstiere überleben, berechnet.
Meerschweinchen:
Für die Infektion von Meerschweinchen wurde nach erfolgter Narkose die Virusverdünnung
in 300 µl PBS angesetzt und je Nasenloch 150 µl appliziert. Kontrolltieren wurde
ausschließlich die entsprechende Menge PBS verabreicht. Anschließend wurden die
Versuchstiere über 14 Tage hinweg täglich kontrolliert und regelmäßig gewogen. Bei einem
Gewichtsverlust von mehr als 15 % des Ausgangsgewichts oder wenn ein Tier
offensichtliche Schmerzen und/oder nicht mehr selbstständig fressen/trinken konnte war der
humane Endpunkt erreicht und das Tier wurde vorzeitig getötet. Für die Pathogenitäts- und
Transmissionsstudien in Meerschweinchen wurde eine Virusdosis von 105 p.f.u. verwendet.
Frettchen:
Für die Infektion von Frettchen wurde nach erfolgter Narkose eine Virusverdünnung in 200 µl
PBS angesetzt und je Nasenloch 100 µl appliziert. Kontroll-Tieren wurde ebenfalls intranasal
die entsprechende Menge PBS verabreicht. Im Anschluss wurden die Versuchstiere über
14 Tage
hinweg
täglich
kontrolliert
und
gewogen.
Für
die
Pathogenitäts-
und
5
Transmissionsstudien wurde eine Virusdosis von 10 p.f.u. verwendet.
3.4.3 Blutentnahme, Organentnahme und Nasenspülung
Mäuse:
Vollblut wurde bei Mäusen durch Punktion der submandibulären Gesichtsvene (Vena
facialis) mit Hilfe einer Lanzette entnommen und in EDTA-Röhrchen aufgefangen. Das
Vollblut wurde nach Analyse im Hämatologiegerät 10 min bei 1000 xg zentrifugiert und das
Serum für die Untersuchung von Zytokinmengen (3.1.10) abgenommen und bei -80 °C
gelagert. Nach Töten der Mäuse wurde longitudinal die Bauch- und Brusthöhle eröffnet und
Lunge und Darm entnommen. Zur Entnahme des Gehirns wurde ausgehend vom Foramen
magnum der Schädel mit einer chirurgischen Schere eröffnet. Jeweils die Hälfte eines
Organs wurde für histologische Untersuchungen (3.5) mit 4 %igem PFA über Nacht fixiert
und anschließend in PBS gelagert. Die andere Hälfte wurde für die Virustiter-Bestimmung
homogenisiert (3.4.4).
Meerschweinchen:
Die finale Blutentnahme bei Meerschweinchen erfolgte unter Pentobarbital-Narkose über
direkte Punktion des Herzens. Hierfür wurde eine 25 mm lange 20 G Kanüle von der
ventralen Seite des Brustkorbes senkrecht in das Herz eingeführt. Für die Entnahme von
59
Methoden
Lunge und Trachea, die ebenfalls unter Pentobarbital-Narkose stattfand, wurde das Tier
longitudinal vom Brustkorb bis zum Unterkiefer geöffnet und die Trachea direkt unterhalb des
Kehlkopfes durchtrennt. Für eine vergleichende Pathologie wurden die Lungen vor der
weiteren Prozessierung photographisch dokumentiert. Jeweils die Hälfte eines Organs wurde
anschließend für histologische Untersuchungen (3.5) in 4 % PFA fixiert, in PBS gelagert und
die andere Hälfte für die Virustiter-Bestimmung homogenisiert (3.4.4). Zur Analyse der
replizierenden Viren im oberen Respirationstrakt der Meerschweinchen wurde eine Spülung
der Nasenhöhle vorgenommen. Dabei wurden dem narkotisierten Tier 700 µl PBS
(+ 0,2 %BSA; + 1 % Pen/Strep) zügig in jedes Nasenloch gegeben und wieder in einer
Petrischale aufgefangen. Die Nasenspülung wurde durch kurze Zentrifugation (5 min,
2000 xg) von Nasenepithelzellen u.ä. getrennt und der Virustiter mittels Plaquetest (3.3.6)
bestimmt. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C.
Frettchen:
Die finale Blutentnahme bei Frettchen erfolgte bei der Entblutung der Tiere unter
Ketamin/Xylazin-Narkose. Die Entnahme von Lunge, Trachea und Nasennebenhöhlen fand
nach Entbluten der Tiere statt. Die Organe wurden für histologische Untersuchungen (3.5) in
10 % Formalin fixiert und anschließend in PBS gelagert. Ein Teil der Organe wurde für die
Virustiter-Bestimmung homogenisiert (3.4.4). Zur Analyse der replizierenden Viren im oberen
Respirationstrakt der Frettchen wurde eine Spülung der Nasenhöhle vorgenommen. Dabei
wurden dem narkotisierten Tier 1 ml PBS langsam in beiden Nasenlöcher verabreicht und
die sogleich ausgenieste Flüssigkeit in einem Becher aufgefangen. Der Virustiter der
Nasenspülung wurde danach mittels Plaquetest (3.3.6) bestimmt. Die Lagerung erfolgte bei
-80 °C.
3.4.4 Herstellung von Organhomogenaten
Für die Bestimmung der Viruslast in einem Organ wurde das entsprechende Gewebe
gewogen und anschließend mit Glaskügelchen in 1 ml PBS 20 min lang in einer
Schwingmühle bei 30 Hz zerkleinert. Größere Gewebetrümmer wurden anschließend
runterzentrifugiert (5 min, 5000 rpm). Der Überstand wurde bei -80 °C gelagert und der
Virustiter mittels Plaquetest (3.3.6) bestimmt.
3.4.5 Zellzahlbestimmung in Vollblut mittels Hämatologiegerät
Ein Blutbild, insbesondere zur Analyse der Immunzellen im Blut der Versuchstiere während
des Infektionsverlaufs, wurde mit frischem Vollblut in einem pocH-100i Hämatologiegerät
erstellt. Eine Zellzahlbestimmung wurde hier mittels Impedanz-Messung durchgeführt, wobei
15 µl Vollblut über eine Kapillare angesogen wurden.
60
Methoden
3.4.6 Transmissionsversuche
Meerschweinchen:
Im Gegensatz zu Mäusen können Meerschweinchen Influenzaviren übertragen (1.3.2;
Lowen et al., 2006). Deshalb wurde die Transmissionsfähigkeit der 2009 pandemischen
H1N1 Influenzaviren in dieser Arbeit unter anderem in diesem Tiermodell untersucht. Es
sollte zum einen die Übertragbarkeit durch direkten Kontakt von infizierten zu naiven Tieren
untersucht werden zum anderen die Übertragbarkeit ausschließlich über die Luft mittels
Aerosolbildung. Die Versuche fanden unter BSL-3 Bedingungen statt, wobei die
Transmissions-Käfige in einem isolierten Luftstromschrank mit vertikalem Luftaustausch
(Ehret) untergebracht waren.
Abb. 8: Aufbau zur Evaluierung der Kontakt-Transmission bei Meerschweinchen. Jeweils ein naives Tier
wird zusammen mit einem infizierten Tier über die Dauer des Versuchs in einem Käfig, bei ca. 22 °C und ca.
45 % Luftfeuchtigkeit, gehalten.
Für die Evaluierung der Kontakt-Transmission wurde jeweils ein infiziertes Meerschweinchen
zusammen mit einem naiven Tier über die Versuchsdauer von 14 Tagen in einem Käfig
gehalten (Abb. 8.) Dabei wurde jeweils nach 1, 3, 6 und 9 Tagen nach Infektion (d p.i.) eine
Nasenspülung zur Virustiter-Bestimmung im oberen Respirationstrakt von beiden Tieren
durchgeführt (3.4.3).
Abb. 9: Aufbau zur Evaluierung der Aerosol-Transmission bei Meerschweinchen. Zwei naive Tiere werden
in einem Käfig in 10 cm Entfernung im Luftstrom eines zweiten Käfigs mit zwei infizierten Tieren, bei ca. 22 °C
und ca. 45 % Luftfeuchtigkeit, gehalten. Beide Käfige sind an den Seiten perforiert, so dass der Luftstrom frei
passieren kann.
Für die Evaluierung der Aerosol-Transmission wurden jeweils zwei Tiere aus einem Käfig mit
einem der 2009 pandemischen H1N1 Influenzaviren infiziert. Zwei naive nicht-infizierte Tiere
wurden dann über die Versuchsdauer von 14 Tagen in einem zweiten Käfig in 10 cm
61
Methoden
Entfernung im Luftstrom des ersten platziert (Abb. 9). Beide Käfige haben mit Drahtgitter
perforierte Seitenwände, so dass der Luftstrom erst den Käfig mit den infizierten Tieren und
dann ungehindert den Käfig mit den naiven Tieren passieren konnte. Der Abstand von 10 cm
verhinderte jeglichen Kontakt der Tiere sowie eine Übertragung von Einstreu o.ä. von einem
Käfig in den anderen. Es wurden jeweils 1, 3, 6 und 9 d p.i. eine Nasenspülung zur VirustiterBestimmung im oberen Respirationstrakt von allen Tieren durchgeführt (3.4.3).
Frettchen:
Frettchen wurden als gutes Tiermodell zur Charakterisierung sowohl der Pathogenität als
auch der Transmission von
Influenzaviren beschrieben (1.3.3; Belser et al., 2011b). In
dieser Arbeit wurde die Transmissionsfähigkeit der untersuchten 2009 pandemischen Isolate
über die Luft mittels Aerosolbildung neben Meerschweinchen auch in Frettchen untersucht.
Die Versuche dafür fanden unter BSL-3 Bedingungen statt, wobei die Tiere in isolierten
Transmissions-Käfigen untergebracht waren. Jeweils zwei Tiere wurden mit einem der 2009
pH1N1 Influenzaviren infiziert und in einem Käfig untergebracht. Einen Tag später wurden
jeweils zwei naive nicht-infizierte Tiere in einem Käfig untergebracht, der mit dem Käfig der
infizierten Tieren verbunden war (Abb. 10). Dadurch konnte ausgeschlossen werden, dass
bei einer Transmission das für die Infektion verwendete Inokulum beteiligt ist. Da dies zum
Zeitpunkt der Versuchsdurchführung mit Meerschweinchen nicht bekannt war, wurde es erst
hier berücksichtigt. Die Luft wurde in den Käfig der infizierten Tiere eingeleitet und nach
Passieren der Verbindung am Ende des Käfigs mit den nicht-infizierten Tieren wieder heraus
geleitet. Ein Abstand von 10 cm und ein Drahtgitter in der Verbindung verhinderte dabei
Kontakt der Tiere sowie eine Übertragung von Einstreu o.ä. von einem Käfig in den anderen.
Es wurden jeweils 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11 und 13 d p.i. eine Nasenspülung zur VirustiterBestimmung im oberen Respirationstrakt von allen Tieren durchgeführt (3.4.3).
Abb. 10: Aufbau zur Evaluierung der Aerosol-Transmission bei Frettchen. Zwei naive Tiere werden in einem
Käfig in 10 cm Entfernung im Luftstrom eines zweiten Käfigs mit zwei infizierten Tieren, bei ca. 20 °C und ca.
55 % Luftfeuchtigkeit, gehalten.
62
Methoden
3.5 Histologische Methoden
3.5.1 Präparation von Gewebeschnitten
Aus den PFA-fixierten Organen von Mäusen, Meerschweinchen und Frettchen (3.4.3)
wurden für histologische Untersuchungen Paraffinschnitte hergestellt. Dafür wurden die
Proben in einem Gewebeinfiltrationsautomat sequenziell in einer aufsteigenden EthanolReihe inkubiert, mit Xylol entwässert und anschließend mit Paraffin infiltriert. Für die
Herstellung von Schnitten wurden die Organe nach Infiltration in Paraffinblöcke eingebettet
und auf einer Kühlplatte ca. 30 min lang auf -12 °C vorgekühlt. Danach wurden in einem
HM325
Microtom
20 µm
dicke
Gewebeschnitte
angefertigt.
Diese
wurden
auf
SuperFrost/Plus Objektträger aufgebracht und über Nacht bei 37 °C im Wärmeschrank
getrocknet. Die Paraffinblöcke können für weitere Verwendung bei Raumtemperatur im
Dunkeln gelagert werden.
Infiltrations-Programm:
Ethanol 70 % 1 h
Ethanol 80 % 1 h
Ethanol 90 % 1 h
Ethanol 95 % 1 h
Ethanol 100 % 1 h
Ethanol 100 % 1,5 h
Xylol I 1 h
Xylol II 1 h
Paraffin Typ 3 58 °C 1 h
Paraffin Typ 3 58 °C 1 h
Paraffin Typ 3 58 °C 1 h
3.5.2 Entparaffinierung und Rehydrierung von Gewebeschnitten
Vor der in situ-Hybridisierung oder einer Färbung der Paraffinschnitte wurden diese
unmittelbar vor Verwendung entparaffiniert und rehydriert. Für die Gewebeschnitte dies am
Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Tübingen nach folgender Reihenfolge
durchgeführt:
Xylol 3 x 5 min
Ethanol 100 % 5 min
Ethanol 70 % 5 min
Ethanol 40 % 1 min
63
Methoden
3.5.3 in situ-Hybridisierung
Bei der in situ-Hybridisierung (ISH) können Nukleinsäuren direkt auf Gewebeschnitten mittels
einer komplementären radioaktiv markierten Sonde detektiert werden. Diese hybridisiert mit
großer Stabilität mit der Zielsequenz und die RNA-Hybride können anschließend
autoradiographisch visualisiert werden. Für diese Arbeit wurde virale RNA in Gewebeschnitte
von Mäusen und Meerschweinchen mit einer
35
S-markierten RNA-Sonde hybridisiert und
visualisiert. Die radioaktive Markierung der Sonde sowie die Durchführung der Hybridisierung
bis zur Visualisierung wurden am Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Tübingen
durchgeführt.
3.5.3.1 Herstellung der in situ-Sonde
Für die Herstellung einer RNA-Sonde wird die sogenannte „run-off“-Methode verwendet.
Dabei wird ein Fragment, komplementär zur Zielsequenz und von einem T7- bzw. T3Promotor flankiert, in einen Transkriptionsvektor kloniert. Zusätzlich werden an beiden Seiten
des klonierten Fragments Schnittstellen eingefügt, damit die transkribierten Inserts nach
Linearisierung mit den entsprechenden Restriktionsenzymen eine definierte Länge haben.
Da für die ISH in dieser Arbeit RNA der 2009 pH1N1 Influnenzaviren in Gewebeschnitten
detektiert werden sollte, wurde ein 374 bp langes Fragment des NP-Gens von
A/Hamburg/NY1580/09 (pH1N1) in den Expressionsvektor pBluescript II KS+ (Stratagene)
kloniert.
Für das Insert wurde, wie unter 3.1.4.1 beschrieben, mittels zweistufiger RT-PCR die DNA
des NP-Gens spezifisch amplifiziert. Schnittstellen für einen Restriktionsverdau mit EcoRI
und/oder KpnI (NEB) wurden mit Hilfe spezifischer Primer (3.1.2) in einem weiteren PCRAnsatz eingeführt.
Schnittstellen-PCR: 5x Puffer 10 µl
dNTPs 10 mM 1 µl
Primer fw 10 mM 2,5 µl
Primer rv 10 mM 2,5 µl
Phusion Polymerase 1 µl
DNA Template 1 µl
ad 50 µl ddH2O
Nach Aufreinigung mittels QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) wurde mit dem PCRProdukt
anhand
der
eingefügten
Schnittstellen
ein
doppelter
Restriktionsverdau
durchgeführt. Ebenso wurde mit dem Transkriptionsvektor pBluescript II KS+ (Stratagene)
verfahren, in den das Insert anschließend über die Schnittstellen ligiert werden konnte.
64
Methoden
Doppelverdau-Ansatz:
NEB Puffer 15 µl
10x BSA 5 µl
EcoRI (20 U/µl) 1µl
NotI (20 U/µl) 2µl
DNA 2 µg oder Plasmid 2 µl
ad 50 µl H2O
Nach Doppelverdau wurde das Verhältnis von Vektor zu Plasmid mittels eines analytischen
Agarosegels bestimmt (3.1.4.2). In der anschließenden Ligation wurde jeweils ein Ansatz mit
einem Vektor:Insert-Verhältnis von 1:2, 1:5 und 1:10 eingesetzt.
Ligations-Ansatz:
10x Ligationspuffer 1 µl
ATP 10 mM 1 µl
T4-Ligase (4 U/µl) 0,5 µl
ddH2O 2,5 µl
Vektor und Insert 1:2/ 1:5/ 1:10
→ 4 °C über Nacht
Für die Amplifikation wurden die Plasmide in E. coli-Bakterien transformiert (3.1.4.5). Nach
anschließender Präparation der Plasmide (3.1.7) wurden diese mittels Restriktionsenzym
KpnI linearisiert, um bei der folgenden in vitro-Transkription mit einer T7-RNA-Polymerase
eine antisense-RNA-Sonde zu erhalten. Diese hybridisiert mit mRNA und cRNA des viralen
NP-Proteins und ermöglicht dadurch den Nachweis von replizierenden 2009 pH1N1
Influenzaviren in den Gewebeschnitten.
Für die radioaktive Markierung der RNA-Sonde wurden 25 µCi
35
S-UTP mit einer Aktivität
von 1300 Ci/mmol eingedampft und das Pellet in 10 µl Transkriptionslösung aufgenommen.
Von der linearisierten Plasmid-DNA wurden 1 µg zusammen mit 20 U T7-RNA Polymerase
hinzugegeben und der Ansatz für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der
Ansatz mit 20 Einheiten DNase I in 50 µl DEPC-H2O bei 37 °C 20 min verdaut und die nicht
eingebauten Nukleotide durch eine Säulenzentrifugation (Sephadex G50) abgetrennt. Nach
Aufreinigung der RNA wurde das Pellet 2x mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet
und die RNA in DEPC-Wasser gelöst. Diesem wurden 10 mM Dithiotreitol (DTT) als
Oxidationsschutz
zugegeben.
Die
Aktivität
der
Proben
wurde
in
einem
Flüssigszintillationszähler (Packard) bestimmt. Die Länge der RNA-Fragmente wurde durch
Agarosegelelektrophorese und anschließende Autoradiographie bestimmt (3.5.3.5).
65
Methoden
3.5.3.2 Permeabilisierung der Gewebeschnitte
Vor der Hybridisierung wurden die Gefrierschnitte permaebilisiert um den Eintritt der RNASonde in das Gewebe zu erleichtern. Dafür wurde folgendes Protokoll einer enzymatischen
und chemischen Denaturierung durchgeführt. Im Anschluss wurden die Gewebeschnitte bei
37 °C ca. 30 Minuten lang getrocknet.
ddH2O 20 s
HCL 0,2 N 20 min
ddH2O 20 s
2x SSC bei 70 °C 30 min
ddH2O 20 s
Puffer für den Proteinase K Verdau mit 1 µg Proteinase K/ml bei 37 °C 15 min
2x ddH2O 20 s
2x Ethanol 70 % 3 min
Ethanol 100 % 5 min
3.5.3.3 Hybridisierung der Gewebeschnitte
Für
die
Hybridisierung
der
Proben
wurden
14 µl
Hybridisierungslösung
auf
die
permeabilisierten, getrockneten Gewebeschnitte aufgetragen und diese anschließend mit
einem silikonisierten Deckgläschen abgedeckt. Nach Abdichten wurden die Objektträger
18 h lang bei 42 °C im Dunkeln inkubiert.
Die Hybridisierungslösung wurde wie folgt zusammengesetzt:
3x105 cpm/Gewebeschnitt in vitro transkribierte, hydrolysierte 35S-H1N1-RNA-Sonde
50 % deionisiertes Formamid
Tris/HCl 10 mM pH 7,4
EDTA 1 mM pH 7,2
sonifizierte Salmon Sperm DNA/ml 200 µg
t-RNA (Kaninchenleber)/ml 100 µg
Die Komponenten wurden gut vermischt. Zur Denaturierung der Nukleinsäuren wurde die
Mischung 5 min auf 100 °C erhitzt und für 10 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden
folgende Chemikalien zugegeben und erneut gemischt.
NaCl 600 mM
Dextransulfat 10 %
BSA, RNase-und DNase-frei 0,05 %
Ficoll 0,02 %
Polyvinylpyrrolidon 0,02 %
Dithiotreitol (DTT) 0,02 %
Natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1 %
66
Methoden
3.5.3.4 Posthybridisierung
Nach Inkubation mit der Hybridisierungslösung wurden die Deckgläschen vorsichtig
abgenommen und gewaschen. Dafür wurden mit den Gewebeschnitten folgende
Waschschritte durchgeführt und anschließend bei 37°C getrocknet.
2x SSC 2x 10 min
SSC 2x /50 % Formamid bei 42 °C 30 min
Puffer für RNase A Verdau mit 20 μg /ml RNase A bei 37 °C 30 min
Puffer für RNase A Verdau (ohne RNase A) bei 37 °C 30 min
SSC 2x /50 % Formamid bei 50 °C 30 min
SSC 2x bei 55 °C 60 min
Ethanol 70 % 3 min
Ethanol 100 % 3 min
3.5.3.5 Autoradiographie und Entwicklung
Die Visualisierung der hybridisierten RNA Sonde auf den Gewebeschnitten erfolgte mittels
Autoradiographie und anschließender Entwicklung in der Dunkelkammer. Zum Befilmen der
Objektträger wurden diese einzeln in, bei 43 °C verflüssigter, Filmemulsion getaucht und in
einem
Objektträgerkasten
lichtdicht
verpackt.
Die
anschließende
Exponierung
bei
Raumtemperatur dauerte routinemäßig ca. 4 Wochen. Zur Entwicklung wurden die befilmten
Objektträger in Entwicklerlösung (Kodak D19, 8 g/100 ml) 4 min bei 18 °C inkubiert und 2
mal 20 s lang mit dH2O gewaschen. Dann folgte 8 min Inkubation in Fixierlösung (Kodak
Fixer, 18 g/100 ml) und ein finaler Waschschritt für 5 min. Die hybridisierte Sonde war nun
als bestrahlte schwarze Granula sichtbar, die nach zusätzlicher Hämatoxylin-Eosin Färbung
(3.5.4) der Schnitte lichtmikroskopisch ausgewertet wurden.
3.5.4 Hämatoxylin-Eosin Färbung
Eine Hämatoxylin-Eosin (HE-) Färbung erleichtert die lichtmikroskopische Unterscheidung
von Zellkernen und Zytoplasma in Gewebeschnitte. Der natürliche Farbstoff Hämatoxylin
färbt dabei die basophilen Zellkerne blau/violett an und der synthetische Farbstoff Eosin färbt
das eosinophile Zytoplasma rötlich. Die Färbung wurde nach folgender Reihenfolge vor
Einbetten der Gewebeschnitte durchgeführt.
dH2O 2 min
Hämatoxylinlösung 4 min
dH2O 10 s
67
Methoden
fließendes Leitungswasser 4 min
Eosin G-Lösung, wässrig, 1 % 30 s
3x dH2O 15 s
2x Ethanol 70 % 15 s
2x Ethanol 90 % 15 s
2x Ethanol 100 % 15 s
3x Xylol 5 min
3.5.5 Immunhistochemische Färbung
Alternativ zur Virus-Detektion in Gewebeschnitten mittels in situ-Hybridisierung (3.5.3)
wurden
für
diese
Arbeit
Viruspartikel
in
den
Organen
infizierter
Mäuse
durch
immunhistochemischer Färbung nachgewiesen. Dabei wurde ein gegen das virale NPProtein gerichteter Erstantikörper verwendet, der wiederum mittels Biotin-gekoppelten
Zweitantikörpers detektiert werden konnte. Die Färbung wurde am Institut für Pathologie des
Universitätsklinikums Tübingen durchgeführt. Aus den Organen wurden, wie unter 3.5.1
beschrieben, Gefrierschnitte angefertigt und vor der Färbung entparaffiniert (3.5.2). Die
Gewebeschnitte wurden mit 0.1 M Citratpuffer (pH 6.0) renaturiert und anschließend mit dem
Erstantikörper in einer 1:500 Verdünnung inkubiert. Dieser polyklonale Frettchen Antikörper
(freundlicher Weise von der WHO zur Verfügung gestellt) ist gegen das A/Vic/3/75 (H3N2)
Influenzavirus gerichtet und kreuzreagiert mit dem NP-Protein diverser Influenzavirus
Subtypen (Gabriel et al., 2011). Der biotinylierte Anti-Frettchen Zweitantikörper wurde mit
einer Verdünnung von 1:200 verwendet (Rockland) und mit Hilfe des Zytochem-Plus HRP
Kits (Zytomed) nach Herstellerangaben detektiert. Vor der lichtmikroskopischen Auswertung
wurde eine HE-Gegenfärbung durchgeführt (3.5.4).
68
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Klinische Isolate der 2009 pandemischen H1N1 Influenza (2009
pH1N1)
Nach Ausbruch der 2009 pandemischen H1N1 (pH1N1) Influenza in Mexiko im März 2009
traten kurz darauf die ersten Fälle dieser Pandemie in Deutschland auf (1.2.1). Im April und
Juni 2009 wurde von zwei Patienten, die im Universitätskrankenhaus Eppendorf sowie in der
Asklepios Klinik Hamburg stationär aufgenommen worden waren, ein Rachenabstrich
genommen. Das erste Isolat mit der Kennung A/Hamburg/05/09 wird in dieser Arbeit HH05
abgekürzt,
das
zweite
A/Hamburg/NY1580/09
wird
hier
als
HH15
bezeichnet.
Rachenabstriche von Patienten wurden vor Medikation mit Oseltamivir gewonnen und mittels
PCR die Anwesenheit von 2009 pH1N1 Influenza positiv diagnostiziert und die potenzielle
Anwesenheit von häufigen Infektionen bzw. Ko-Infektionen ausgeschlossen (Herpes-Simplex
Virus Typ 1 und Typ 2, Varicella-Zoster Virus, Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus,
humanes Enterovirus, Influenza B Virus und humanes Parechovirus). Vor nachfolgender
Oseltamivir-Behandlung der Patienten, fand eine Anzucht dieser Isolate statt, welche in
dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Pathogenität und Transmission untersucht werden sollten.
Die 22-jährige Patientin, von welcher das HH05 Isolat stammt, erkrankte nach einem
Aufenthalt in Mexiko und wurde nach Aufnahme ins Krankenhaus mit dem NeuraminidaseHemmer Oseltamivir behandelt (Tab. 2). Der Krankheitsverlauf wurde als mild mit erhöhter
Körpertemperatur sowie erhöhten Werten des C-reaktiven Proteins (CRP) und der
Leukozyten (WBC), welche beide auf eine entzündliche Erkrankung hindeuten, beschrieben.
Der 29-jährige Patient, von dem das HH15 Isolat stammt, kam vor seiner Aufnahme ins
Krankenhaus aus New York. Er wurde ebenfalls direkt nach Aufnahme mit Oseltamivir
behandelt, erhielt aber zusätzlich intravenös Flüssigkeit und eine symptomatische
Behandlung (Tab. 2). Der Krankheitsverlauf dieses Patienten war ebenfalls mild mit erhöhter
Körpertemperatur, vergleichbar erhöhtem CRP-Wert und erhöhter Leukozytenzahl wie bei
der HH05-Patientin.
Demnach gibt es keinen klinischen Unterschied im Infektionsverlauf der zwei hier
untersuchten Fälle der 2009 pandemischen H1N1 Influenza. Man kann jedoch nicht sagen,
wie der, hier als mild beschriebene, Krankheitsverlauf abgelaufen wäre ohne rechtzeitige
Medikation mit antiviralen Medikamenten. Festzuhalten ist, dass es sich bei den Patienten
um junge Erwachsene ohne bekannte Vorerkrankungen handelte.
69
Ergebnisse
Tab. 2: Daten beider Patienten und deren Krankheitsverlauf der 2009 pandemischen H1N1 Influenza.
A/Hamburg/05/09
A/Hamburg/NY1580/09
→ HH05 (pH1N1)
→ HH15 (pH1N1)
Geschlecht
Weiblich
Männlich
Geburtsjahr
1987
1980
Erstes Auftreten von Symptomen
25.04.09
05.06.09
Krankenhausaufnahme
28.04.09
07.06.09
Krankenhausaufenthalt
6 Tage
5 Tage
Aufenthaltsort vor Erkrankung
Mexiko
USA (New York)
Bekannte Vorerkrankungen
Nein
Nein
Medikation
Oseltamivir
Oseltamivir
Acetylcytein
Metamizol
Krankheitsverlauf
Mild, typische Symptome einer
Mild, typische Symptome einer
Influenzavirusinfektion
Influenzavirusinfektion
Max. Körpertemperatur
39 °C
39,8 °C
CRP [<0,5 mg/dl]
25
23,6
WBC [3,8-11,9 Mrd/l]
3,7
3,2
Aufgeführt sind alle vergleichbaren, übermittelten Daten der beiden 2009 pH1N1 Patienten, welche im
Universitätskrankenhaus Eppendorf bzw. der Asklepios Klinik Hamburg stationiert waren. Die Virusproben
wurden vor antiviraler Behandlung mittels Rachenabstrich isoliert. Der Blutwert für das C-reaktive Protein (CRP)
und die Leukozyten (WBC) sind für Tag 4 nach Auftreten der Symptome angegeben.
4.2 Sequenzanalyse der 2009 pH1N1 Virusisolate
Um die 2009 pandemischen H1N1 Isolate auf molekularer Ebene zu charakterisieren, wurde
deren Genom sequenziert (3.1.3) und alle viralen Gensegmente mittels Sequenzalignment
verglichen.
Das HH15 Isolat unterscheidet sich in 12 Aminosäuren von HH05 (Tab. 3). Im viralen
Ribonukleoproteinkomplex
(vRNP)
sind
jeweils
zwei
Punktmutationen
in
den
Polymeraseuntereinheiten PB2 und PA und drei Austausche im Polymerase-assoziierten
Nukleoprotein (NP) aufgetreten (Tab. 3). In den Oberflächenglykoproteinen, welche eine
wichtige
Rolle
bei
der
Erkennung
von
Antikörpern
spielen,
gibt
es
einen
Aminosäureaustausch im HA und drei im NA (Tab. 3). Der Interferon Antagonist NS1 von
70
Ergebnisse
HH15 unterscheidet sich in einer Aminosäure von HH05 (Tab. 3). Die viralen Proteine PB1
und M wiesen keine Unterschiede in der Aminosäuresequenz auf.
Tab. 3: Aminosäuresequenz-Unterschiede im Genotyp von HH05 und HH15 (pH1N1).
Genotyp
PB2
PA
NP
100 133
373
HA
NA
NS1
202
32 106 248
123
340
526
118
581
HH05
K
R
I
L
V
I
I
S
T
V
N
I
HH15
N
K
V
M
I
L
T
T
I
I
D
V
Die Nukleotidsequenz beider 2009 pH1N1 Isolate wurde nach zwei unabhängigen Sequenzierungen (3.1.3) in
einem Alignment verglichen. Die Unterschiede im Genotyp der beiden Isolate sind hier gezeigt. Dabei
unterscheidet sich das Genom der beiden Isolate in der Polymeraseuntereinheit PB2 und PA, dem Nukleoprotein
(NP), den Oberflächenproteinen Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) und dem Nichtstrukturprotein 1
(NS1). Die Nummerierung der Aminosäuren im HA entsprechen der H1- und im NA der N1-Nummerierung.
4.3 Wachstumsverhalten der 2009 pH1N1 Influenzaviren in humanen
Lungenzellen
Für die Charakterisierung der beiden klinischen 2009 pH1N1 Isolate HH05 und HH15 (4.1)
wurde
jeweils
ein
Arbeitsstock
angelegt
(3.3.1).
Anschließend
wurde
deren
Wachstumsverhalten in humanen Zellen charakterisiert, wobei zusätzlich ein alt-saisonales
H1N1 Isolat aus 2006 (A/Solomon Islands/3/06-like) sowie ein humanes HPAIV-Isolat
(A/Thailand/KAN-1/04 (H5N1)) als Referenz verwendet wurden. Hierfür wurde eine
Viruskinetik in der humanen Lungenepithelzelllinie A549 erstellt (Abb. 11). Die Zellen wurden
infiziert und der Virustiter 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion im Kulturüberstand
bestimmt (3.3.6).
Das alt-saisonale H1N1 Virus replizierte effizient in humanen Lungenzellen mit dem
höchsten Titer von ca. 4 log p.f.u./ml 48 Stunden nach Infektion (Abb. 11). Die 2009
pandemischen H1N1 Isolate replizierten zu vergleichbaren Virustitern wie das alt-saisonale
H1N1, wobei HH15 (pH1N1) über den untersuchten Zeitraum von 96 Stunden im Mittel
zehnfach höhere Titer erreichte als HH05 (pH1N1) (Abb. 11). Das humane H5N1 replizierte
trotz
niedrigerer
Infektionsdosis
mit
einer
um
vier
bis
fünf
Logstufen
höheren
Replikationseffizienz im Vergleich zum alt-saisonalen H1N1 und den 2009 pH1N1 Isolaten
und erreichte Virustiter von bis zu 8 log p.f.u./ml (Abb. 11).
71
Ergebnisse
Abb. 11: Wachstumsverhalten von alt-saisonalen H1N1, HH05 und HH15 (pH1N1) und humanen H5N1
Influenzaviren in humanen Lungenzellen. Humane Lungenepithelzellen (A549) wurden mit einer MOI von 0,01
des alt-saisonalen H1N1, des HH05 (pH1N1), des HH15 (pH1N1) und MOI=0,001 des humanen H5N1
Influenzavirus infiziert. Jeweils 24, 48, 72 und 96 Stunden nach Infektion (h p.i.) wurde Überstand abgenommen
und der Titer mittels Plaquetest (3.3.6) bestimmt. Dargestellt ist jeweils der Virustiter mit der Standardabweichung
zweier unabhängiger Experimente.
Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass sich die Replikation der 2009 pH1N1
Influenzaviren in humanen Lungenepithelzellen nicht von der eines alt-saisonalen H1N1
unterscheidet. Das HH15 Virusisolat führt dabei tendenziell zu höheren Virustitern als das
HH05 Virusisolat.
4.4 Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Mausmodell
Durch Inzucht gezüchtete Mausstämme sind ein gutes Modell für eine in vivoCharakterisierung von Influenzaviren in einem Säugerorganismus (1.3.1). Zwar sind Mäuse
nicht der natürliche Wirt für Influenzaviren und eine Infektion ist erst nach künstlicher
Adaptation der Viren möglich. Allerdings kommt es in infizierten Mäusen zu Gewichtsverlust,
viralen Pneumonien und auch zu letalen Verläufen (Bouvier und Lowen, 2010). HPAIV wie
beispielsweise H5N1 führen bereits bei geringen Dosen zu einem letalen Infektionsverlauf in
der Maus (Maines et al., 2005). Um humane Influenzaviren im Mausmodell zu
charakterisieren, werden die Virusisolate meist durch serielle Passagen an die Maus
adaptiert (Hirst, 1947; Brown, 1990; Gabriel et al., 2005), oder es werden immunsupprimierte
Mausstämme verwendet (Mastino et al., 1991). Für die vorliegende Arbeit wurden zum einen
BALB/c Mäuse verwendet, welche häufig für in vivo Versuche mit Influenzaviren eingesetzt
werden. Zum anderen wurden Mäuse des C57BL/6J-Stamms verwendet, welche häufig als
genetischer Hintergrund für gentechnisch veränderte Kreuzungen Anwendung finden. Für
einen Vergleich des Infektionsverlaufs wurden Mäuse beider Stämme ebenfalls mit einem
72
Ergebnisse
alt-saisonalen H1N1 Isolat A/Solomon Islands/3/06-like und dem humanen HPAIV-Isolat
A/Thailand/KAN-1/04 (H5N1) infiziert. Das humane H5N1 Virus stammt von einem
fünfjährigen Jungen, der an den Folgen der Infektion verstarb (Puthavathana et al., 2005).
4.4.1 Pathogenität und Virulenz der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler
H1N1 und humaner H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen
BALB/c und C57BL/6J Mäuse wurden mit beiden klinischen 2009 pH1N1 Isolaten sowie dem
alt-saisonalen H1N1 Influenzavirus als Referenz mit einer Dosis von 105 p.f.u. intranasal
infiziert. Für das humane H5N1 Virus hingegen wurde eine Dosis von 102 p.f.u. für die
Infektion eingesetzt, da dieses Virus als hochvirulent für Mäuse beschrieben wurde (Gabriel
et al., 2011).
Wie erwartet führte die Infektion mit dem alt-saisonalen H1N1 in BALB/c Mäusen nur zu
einem marginalen Gewichtsverlust und alle Mäuse überlebten den Infektionsversuch (Abb.
12A,B). Die Infektion mit den beiden 2009 pH1N1 Isolaten führte zu einem Gewichtsverlust
von 10-15 % des Ausgangsgewichts der BALB/c Mäuse und einer Überlebensrate von 93 %
(Abb. 12A,B). Das humane H5N1 Influenzavirus führte hingegen zu einem 100 %ig letalen
Infektionsverlauf, begleitet von einem starken Gewichtsverlust der Tiere bereits ab Tag drei
nach Infektion (Abb. 12A,B).
In C57BL/6J Mäusen führte die Infektion mit alt-saisonalem H1N1 erwartungsgemäß, wie
auch bei BALB/c Mäusen, nur zu einem geringen Gewichtsverlust mit einer Überlebensrate
von 100 % (Abb. 12C,D). Die Infektion mit dem 2009 pH1N1 Isolat HH05 hingegen hatte in
C57BL/6J Mäusen im Mittel einen Verlust von ca. 20 % des Ausgangsgewichts zur Folge
und nur 66 % der Tiere überlebten (Abb. 12C,D). C57BL/6J Mäuse infiziert mit dem 2009
pH1N1 Isolat HH15 erlagen dagegen vollständig der Infektion bei gleicher Dosis mit einer
Letalität von 100 % (Abb. 12C). Wie erwartet führte das humane H5N1 Influenzavirus, wie
auch in BALB/c Mäusen, zu einer Letalität von 100 % (Abb. 12C).
Für einen Vergleich der Virulenz des alt-saisonalen H1N1, der 2009 pH1N1 Isolate und des
humanen H5N1 in beiden Mäusestämmen wurden, wie unter 3.4.2 beschrieben, die
entsprechenden MLD50 Werte bestimmt, also die Dosis eines Virus bei der 50 % der
jeweiligen Mäuse nach Infektion versterben.
73
Ergebnisse
Abb. 12: Überlebensrate und Gewichtsverlust von alt-saisonalen H1N1-, HH05- (pH1N1), HH15- (pH1N1)
und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. BALB/c (A,B) oder C57BL/6J Mäuse (C,D)
wurden mit 105 p.f.u. des alt-saisonalen H1N1 (n=14), HH05 (pH1N1) (n=21) und HH15 (pH1N1) (n=21), sowie
mit 102 p.f.u. des humanen H5N1 (n=20) infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht.
Anschließend wurden die Tiere 14 Tage lang auf Gewichtsverlust (B,D) und Überleben (A,C) überprüft (d p.i.
Tage nach Infektion).
Die MLD50 Werte aus Tab. 4 zeigten, dass im BALB/c Modell das alt-saisonale H1N1 sowie
beide 2009 pH1N1 Influenzaviren mit einer MLD50 von >6 log p.f.u. niedrigpathogen waren.
Das humane H5N1 Influenzavirus hingegen hatte einen MLD50 Wert von 0,3 und war damit
hochpathogen für BALB/c Mäuse. Im C57BL/6J Mausmodell war das alt-saisonale H1N1 mit
einer MLD50 von >6 log p.f.u. ebenso wenig letal wie im BALB/c-Modell (Tab. 4). Korrelierend
mit dem Überlebensversuch in Abb. 12 zeigten die 2009 pH1N1 Isolate jedoch eine erhöhte
Virulenz in C57BL/6J Mäusen, welche sich auch untereinander unterschied. Das HH15 Virus
war in diesem Mausmodell mit einer MLD50 von 3,5 log p.f.u., etwa 50-fach letaler als das
HH05 Virus, für welches eine MLD50 von 5,2 log p.f.u. bestimmt wurde (Tab. 4). Das humane
H5N1 war mit einem Wert von 1,8 log p.f.u. auch in C57BL/6J Mäusen hochpathogen, wobei
in BALB/c Mäusen die Virulenz sogar noch höher war (Tab. 4).
Zusammenfassend
niedrigpathogen
bestätigen
und
das
diese
humane
Ergebnisse,
H5N1
dass
Influenzavirus
das
alt-saisonale
hochpathogen
in
H1N1
beiden
Mausmodellen ist. Beide 2009 pandemische H1N1 Influenzaviren sind niedrigpathogen in
BALB/c Mäusen mit einer vergleichbar niedrigen Virulenz ähnlich der des alt-saisonalen
H1N1 Influenzavirus. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die C57BL/6J Mäuse
74
Ergebnisse
empfänglicher für die 2009 pH1N1 Viren sind, allerdings mit unterschiedlich hoher Virulenz.
Diese Unterschiede zwischen den zwei Isolaten des 2009 pH1N1-Subtyps sind im BALB/c
Modell
nicht
zu
sehen.
Daraus
lässt
sich
schließen,
dass
wirtsspezifische
Pathogenitätsdeterminanten bei der Infektion der unterschiedlichen Mausstämme mit 2009
pH1N1 eine Rolle spielen. Diese Determinanten scheinen sich von denen des humanen
H5N1 zu unterschieden, da dieses Virus hochpathogen in beiden Mausmodellen ist. Die
Empfänglichkeit der C57BL/6J Mäuse für 2009 pH1N1 Isolate ermöglicht es, Isolate dieses
Virusstamms ohne vorherige Adaptation weitergehend nach wirtsspezifischen sowie auch
viralen Pathogenitätsdeterminanten in vivo zu untersuchen.
Tab. 4: MLD50 Werte von alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1), HH15 (pH1N1) und humanen H5N1
Influenzaviren in BALB/c und C57BL/6J Mäusen.
MLD50
saisonales H1N1
HH05 (pH1N1)
HH15 (pH1N1)
humanes H5N1
BALB/c
>6
>6
>6
0,3
C57BL/6J
>6
5,2
3,5
1,8
[log p.f.u.]
BALB/c und C57BL/6J Mäuse wurden mit seriellen zehnfach-Verdünnungen (106 p.f.u. - 100p.f.u.) des altsaisonalen H1N1, der beiden 2009 pandemischen H1N1-Viren und des humanen H5N1 infiziert. Die
Überlebensraten wurden über einen Verlauf von 14 Tagen dokumentiert und die MLD50 mittels der von Reed und
Muench beschriebenen Methode berechnet (Reed und Muench, 1938).
4.4.2 Organtropismus der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler H1N1 und
humaner H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen
Die Ausbreitung von alt-saisonalen H1N1, 2009 pH1N1 und humanen H5N1 Influenzaviren
im Mäuseorganismus wurde durch eine Virustiter-Bestimmung in Lunge, Gehirn und Darm
der infizierten Tiere untersucht (3.3.6).
In BALB/c Mäusen wurden 3 d p.i. vergleichbar hohe Titer in der Lunge für das alt-saisonale
H1N1, HH05, HH15 sowie das humane H5N1 Influenzavirus detektiert (Abb. 13A). Nach
sechs Tagen hingegen unterschieden sich die Virustiter in der Lunge für die 2009 pH1N1
Isolate und H5N1 signifikant von denen des alt-saisonalen H1N1 Virus. Die höchsten Titer
wurden in der Lunge von H5N1-infizierten BALB/c Mäusen nachgewiesen (Abb. 13A). In den
extrapulmonalen Organen Gehirn und Darm wurden nach Infektion mit alt-saisonalen H1N1
und 2009 pH1N1 Influenzaviren keine signifikanten Titer detektiert. Eine Infektion mit dem
humanen H5N1 Virus hingegen führte zu hohen Virustitern im Gehirn der BALB/c Mäuse
(Abb. 13A).
75
Ergebnisse
Auch im C57BL/6J Mausmodell unterschieden sich die Virustiter in der Lunge 3 d p.i. nicht
innerhalb der verschiedenen Influenzaviren (Abb. 13B). Dies war, im Gegensatz zu den
BALB/c Mäusen, auch 6 d p.i. der Fall. Signifikante extrapulmonale Virustiter wurden in
C57BL/6J Mäusen nur im Darm von HH15-infizierten Tieren nachgewiesen (Abb. 13B).
.
Abb. 13: Virustiter in Lunge, Gehirn und Darm von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. BALB/c (A) oder C57BL/6J Mäuse (B) wurden
5
2
mit 10 p.f.u. des alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) sowie mit 10 p.f.u. des humanen
H5N1 infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag drei und sechs nach Infektion (3 &
6 d p.i.) wurden jeweils von drei Tieren die Lunge, das Gehirn und der Darm entnommen (3.4.3). Der Virustiter
wurde mittels Plaquetest bestimmt und ist hier mit entsprechender Standardabweichung logarithmisch in p.f.u. pro
Gramm Organ angegeben. Die Detektionsgrenze für die Virustiter in Lunge und Gehirn lag bei 0,5 log p.f.u./ml
bzw. im Darm bei 1,5 log p.f.u./m Organhomogenat. Die statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-t-Test
ermittelt (* entspricht p≤0,05; ** entspricht p≤0,01).
Die Virustiter in der Lunge von BALB/c Mäusen korrelieren demnach 6 d p.i. mit der
Pathogenität
des
jeweiligen
Influenzavirus
mit
den
niedrigsten
Virustitern
des
niedrigpathogenen alt-saisonalen H1N1 und den höchsten Titern nach Infektion mit dem
hochpathogenen humanen H5N1. Im Gegensatz dazu spiegeln die Virustiter in den Lungen
der infizierten C57BL/6J Mäuse auch nach sechs Tagen die differenzielle Virulenz
verschiedener Virusisolate, wie unter 4.4.1 gezeigt, nicht wider. Demzufolge lässt die
76
Ergebnisse
Viruslast in der Lunge von infizierten C57BL/6J Mäusen, im Gegensatz zu der in BALB/c
Mäusen, keinen Rückschluss auf Pathogenität und Virulenz von Influenzaviren in diesem
Mausmodell zu.
Der Organtropismus des alt-saisonalen H1N1 und der des 2009 pH1N1 Isolats HH05
beschränkt sich in beiden Mausmodellen auf die Lunge. Das HH15 Isolat hingegen, welches
in C57BL/6J Mäusen hochvirulent ist, scheint sich nach Infektion auch auf den Darm von
Tieren dieses Mäusestamms auszubreiten. Ein extrapulmonaler Organtropismus wurde
bereits mehrfach für H5N1-infizierte Mäuse beschrieben (Maines et al., 2005) und ist auch
hier für das BALB/c Mausmodell im Gehirn der Fall.
4.4.3 Virustropismus der 2009 pH1N1 Viren im Vergleich zu alt-saisonaler H1N1 und
humaner H5N1 Influenza in der Lunge von BALB/c und C57BL/6J Mäusen
Für die Analyse der pathologischen Veränderungen in den Lungen infizierter Mäuse sowie
des Virustropismus in diesem Organ wurden histologische Schnitte angefertigt und eine
Immunfärbung gegen das kreuzreaktive NP Protein von Influenzaviren durchgeführt (3.5.5).
Dafür wurden BALB/c und C57BL/6J Mäuse mit dem alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1),
HH15 (pH1N1) oder dem humanen H5N1 Influenzavirus infiziert und nach sechs Tagen die
Lungen entnommen (3.4.3).
Die Lungenschnitte von alt-saisonalen H1N1-infizierten BALB/c Mäusen wiesen im Vergleich
zur Negativkontrolle einige mononukleäre Infiltratzellen im Interstitium auf, wobei nur
einzelne Zellen infiziert waren (Abb. 14B). In BALB/c Mäusen, die mit dem 2009
pandemischen H1N1 Isolat HH05 infiziert wurden, waren hingegen mehr infizierte Zellen,
assoziiert mit der Einwanderung von Immunzellen ins Alveolarepithel, zu sehen (Abb. 14C).
HH15-Infektion führte im Vergleich zu HH05 zu einer höhergradigen interstitiellen
Entzündung der Lunge mit einer hohen Anzahl Virus-infizierter Zellen und eingewanderten
Entzündungszellen sowie dilatierten Blutgefäßen (Abb. 14D). Die Lungenschnitte von H5N1infizierten BALB/c Mäusen wiesen die größte Anzahl infizierter Zellen im Alveolar- und
Bronchialepithel auf, wobei die pathologischen Veränderungen vergleichbar zu denen von
HH15-infizierten Tieren waren (Abb. 14E).
Auch in den Lungenschnitten alt-saisonaler H1N1-infizierter C57BL/6J Mäuse zeigten sich
mononukleäre
Infiltrationen
des
Interstitiums
mit
einigen
infizierten
Alveolar-
und
Bronchialzellen (Abb. 14G). Die Lungen von HH05-infizierten C57BL/6J Mäuse waren
wiederum höhergradig entzündet als die der alt-saisonalen H1N1-infizierten und wiesen
dilatierte Kapillaren und eine vergleichsweise größere Anzahl infizierter Zellen auf (Abb.
14H). Das 2009 pandemische H1N1 Isolat HH15 verursachte in den Lungen der C57BL/6J
77
Ergebnisse
Mäuse
hochgradige
Veränderungen
mit
sichtbaren
Alveolar-
und
Bronchialepithelzellnekrosen (Abb. 14I). Im Vergleich zu HH05 waren hier mehr Zellen
positiv für das Virusantigen. Das humane H5N1 zeigte im C57BL/6J-Mausmodell, im
Vergleich zu den anderen Influenzaviren, eine höchstgradige Zerstörung der Lungenstruktur
mit diversen Virus-infizierten Lungenepithelzellen und Hämorrhagien (Abb. 14J).
Abb. 14: Immunhistologische Färbung von Lungenschnitten von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-,
HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. BALB/c (obere Reihe) und
C57BL/6J Mäuse (untere Reihe) wurden mit 105 p.f.u. des alt-saisonalen H1N1 (B,G), HH05 (pH1N1) (C,H) und
HH15 (pH1N1) (D,I), sowie mit 102 p.f.u. des humanen H5N1 (E,J) infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich
PBS verabreicht (A,F). An Tag sechs nach Infektion (6 d p.i.) wurden jeweils drei Tiere getötet und die Lungen
entnommen (3.4.3). Die Schnitte wurden immunhistologisch gegen das Influenzaantigen und anschließend mit
H&E gefärbt (3.5.4; 3.5.5). Antigen-positive Zellen haben eine rot-braune Färbung und sind zum Teil mit Pfeilen
markiert (←). Auffällig stark infiltrierte Gewebebereiche sind durch einen Stern markiert (*). Die
lichtmikroskopischen Bilder wurden in einer 400fachen-Vergrößerung aufgenommen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass das alt-saisonale H1N1 zu einer geringen
Entzündungsreaktion des Lungengewebes in beiden Mausstämmen führt. Das pandemische
HH05 Isolat verursacht im Vergleich hierzu eine stärkere Entzündungsreaktion, wobei auch
allgemein eine größere Anzahl an Zellen infiziert wird. Das HH15 Isolat hingegen führt in
beiden Mausmodellen bereits zu einer Pneumonie mit annähernd massiven pathologischen
Befunden
wie
eine
H5N1-Infektion.
Letztere
führt
zu
höchstgradig
entzündetem
Lungengewebe in beiden Mausstämmen. Zwischen BALB/c und C57BL/6J Mäusen sind
keine Unterschiede in der Pathologie und dem Virustropismus in der Lunge für die jeweiligen
Virusstämme festzustellen. Dies spricht dafür, dass der pathologische Befund allein nicht
ausreicht die Virulenz komplett widerzuspiegeln, allerdings einen guten Eindruck bezüglich
des Potenzials dieser Viren, pathologische Veränderungen in der Lunge auszulösen,
wiedergibt.
78
Ergebnisse
4.4.4 Blutbild nach Infektion mit 2009 pH1N1, alt-saisonaler H1N1 und humaner H5N1
Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen
Die Bestimmung von Parametern im Blut kann wichtige Hinweise bezüglich der
Immunbeteiligung einer Erkrankung liefern. Ein Blutbild kann einfach und minimalinvasiv
mittels eines Hämatologiegerätes erstellt werden (3.4.5). BALB/c und C57BL/6J Mäuse
wurden mit alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1), HH15 (pH1N1) oder humanen H5N1
Influenzaviren infiziert und jeweils nach drei und sechs Tagen eine Blutprobe entnommen
(3.4.3). Es wurden die absoluten Zellzahlen von Leukozyten (WBC), Erythrozyten (RBC),
Thrombozyten
(PTL),
Lymphozyten
(LYM)
und
Granulozyten
(GRA),
sowie
der
Hämoglobingehalt (HGB) und der Hämatokritanteil (HCT) im Blut von BALB/c (Tab. 5) und
C57BL/6J Mäusen (Tab. 6) bestimmt.
Tab. 5: Blutparameter von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1infizierten BALB/c Mäusen.
saisonales H1N1
HH05 (pH1N1)
HH15 (pH1N1)
humanes H5N1
Kontrolle
WBC
3
3
[10 /mm ]
RBC
[103/mm3]
HGB
[g/dl]
HCT
[%]
PLT
[103/mm3]
LYM
3
3
[10 /mm ]
GRA
[103/mm3]
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
7,3 ± 1,8
5,3 ± 1,1
7,3 ± 1,3
5,0 ± 1,4
7,4 ± 1,3
4,8 ± 0,4
7,8 ± 0,7
6,7 ± 1,0
2,5 ± 0,6
10,7 ± 0,7
9,4 ± 0,4
9,9 ± 0,1
10,4 ± 1,6
11,3 ± 0,8
10,8 ± 0,6
11,1 ± 0,3
11,4 ± 0,4
11,5 ± 0,7
19,0 ± 1,2
17,3 ± 1,0
17,4 ± 0,4
18,7 ± 2,4
19,9 ± 1,2
19,2 ± 1,0
19,8 ± 0,3
20,0 ± 0,7
20,0 ± 1,6
49,6 ±1,7
46,4 ± 3,0
49,8 ± 0,3
48,0 ± 7,2
52,1 ± 3,9
49,7 ± 3,7
50,8 ± 1,6
52,9 ± 0,3
54,8 ± 2,1
823 ± 227
1007 ± 218
967 ± 101
620 ± 410
778 ± 484
591 ± 180
598 ± 251
870 ± 308
1005 ± 25
5,4 ± 1,1
3,6 ± 0,7
4,8 ± 1,0
3,5 ± 1,2
4,1 ± 1,2
3,2 ± 0,4
4,3 ± 0,8
4,0 ± 0,3
0,7 ± 0,0
1,9 ± 0,9
1,7 ± 0,5
2,5 ± 0,4
1,5 ± 0,3
3,3 ± 0,2
1,6 ± 0,0
3,5 ± 0,6
2,7 ± 0,7
1,8 ± 0,6
Jeweils 3 - 5 BALB/c Mäuse wurden mit 105 p.f.u. des alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1),
sowie 102 p.f.u. des humanen H5N1 Virus infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag
drei und sechs nach Infektion (3 und 6 d p.i.) wurden je Tier ca. 50 µl Vollblut entnommen und die Parameter
mittels eines Hämatologiegerätes bestimmt (3.4.3; 3.4.5). Dargestellt sind die Parameter mit Standardabweichung
(±) für Leukozyten (WBC), Erythrozyten (RBC), Thrombozyten (PTL), Lymphozyten (LYM) und Granulozyten
(GRA) sowie der Hämoglobingehalt (HGB) und der Hämatokritanteil (HCT). Die statistische Signifikanz (p≤0,05)
der Parameter wurde durch einen Sudent’s-t-Test, im Vergleich zu alt-saisonalen H1N1-infizierten Tieren ermittelt
(unterstrichen).
An 3 d p.i. waren die Leukozyten, im Vergleich mit den Kontrolltieren, bei allen infizierten
BALB/c Mäusen erniedrigt (Tab. 5). Dies ist eine zu erwartende Reaktion der angeborenen
Immunabwehr auf eine Virusinfektion. An 6 d p.i. hatten sich die Leukozyten von BALB/c
79
Ergebnisse
Mäusen, welche mit dem alt-saisonalen H1N1 bzw. den 2009 pH1N1 Isolaten infiziert
wurden, wieder vergleichbar zur nicht-infizierten Kontrollgruppe normalisiert (Tab. 5). Die
H5N1-Infektion in diesem Mausmodell führte hingegen 6 d p.i. im Vergleich zu alt-saisonaler
H1N1-Infektion zu stark verringerten Leukozytenwerten, die mit einer signifikanten
Lymphopenie einhergingen (Tab. 5). Eine signifikante Veränderung im Blutbild war auch ein
erhöhter Hämatokritwert in H5N1-infizierten BALB/c Mäusen (Tab. 5). Dieser lässt eine
gesteigerte Hämoglobinfreisetzung aufgrund eines hämorrhagischen Krankheitsverlaufs
vermuten.
Tab. 6: Blutparameter von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1infizierten C57BL/6J Mäusen.
saisonales H1N1
HH05 (pH1N1)
HH15 (pH1N1)
humanes H5N1
Kontrolle
WBC
[103/mm3]
RBC
3
3
[10 /mm ]
HGB
[g/dl]
HCT
[%]
PLT
[103/mm3]
LYM
[103/mm3]
GRA
3
3
[10 /mm ]
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
3 d p.i.
6 d p.i.
9,4 ± 2,8
10,3 ± 1,2
9,8 ± 1,0
5,5 ± 1,4
10,2 ± 0,5
5,9 ± 0,8
5,8 ± 0,8
10,3 ± 0,5
5,8 ± 1,1
9,8 ± 1,3
10,9 ± 0,3
9,3 ± 6,0
11,3 ± 0,8
9,9 ± 0,7
11,7 ± 1,0
11,,3 ± 0,6
10,4 ± 0,1
10,4 ± 0,4
15,1 ± 2,0
16,8 ± 0,4
14,6 ± 0,7
17,7 ± 1,4
15,4 ± 0,8
18,5 ± 1,3
16,9 ± 0,6
16,2 ± 0,1
16,6 ± 0,6
48,1 ±6,9
47,6 ± 1,5
40,7 ± 2,0
48,6 ± 3,9
41,7 ± 2,9
50,9 ± 4,1
47,9 ± 2,0
45,3 ± 0,2
45,2 ± 1,3
1051 ± 303
779 ± 260
1248 ± 76
1541 ± 172 1417 ± 289
1479 ± 85
1334 ± 223 1137 ± 105 1332 ± 262
7,9 ± 2,3
8,2 ± 1,0
8,0 ± 0,8
3,8 ± 1,3
6,1 ± 0,8
3,7 ± 0,7
3,5 ± 0,7
7,9 ± 1,1
3,6 ± 0,7
1,6 ± 0,6
2,1 ± 0,4
1,8 ± 0,2
1,6 ± 0,2
4,1 ± 0,8
2,2 ± 0,3
2,3 ± 0,6
2,3 ± 0,9
2,2 ± 0,4
5
Jeweils 3 - 5 C57BL/6J Mäuse wurden mit 10 p.f.u. des alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1)
sowie 102 p.f.u. des humanen H5N1 Virus infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag
drei und sechs nach Infektion (3 und 6 d p.i.) wurden je Tier ca. 50 µl Vollblut entnommen und die Parameter
mittels eines Hämatologiegerätes bestimmt (3.4.3; 3.4.5). Dargestellt sind die Parameter mit Standardabweichung
(±) für Leukozyten (WBC), Erythrozyten (RBC), Thrombozyten (PTL), Lymphozyten (LYM) und Granulozyten
(GRA) sowie der Hämoglobingehalt (HGB) und der Hämatokritanteil (HCT). Die statistische Signifikanz (p≤0,05)
der Parameter wurde durch einen Sudent’s-t-Test, im Vergleich zu alt-saisonalen H1N1-infizierten Tieren ermittelt
(unterstrichen).
Im C57BL/6J Mausmodell waren 3 d p.i. nach 2009 pH1N1-Infektion im Vergleich zu altsaisonaler H1N1-Infektion die Leukozyten- sowie die Lymphozytenwerte signifikant erniedrigt
(Tab. 6). 6 d p.i. hatten die Leukozyten und Lymphozyten bei der HH05-Infektion der
C57BL/6J Mäuse, im Gegensatz zur HH15-Infektion, wieder Normalwerte erreicht (Tab. 6).
Ebenso wie bei den HH15-infizierten Tieren kam es 6 d p.i. auch bei den H5N1-infizierten
C57BL/6J Mäusen zu einer Lymphopenie mit signifikant erniedrigten Leukozytenwerten
(Tab. 6). Andere Blutparameter während der Infektion mit den 2009 pH1N1 Isolaten oder
80
Ergebnisse
H5N1 unterschieden sich in diesem Mausmodell weder von denen der alt-saisonalen H1N1Infektion, noch von denen der nicht-infizierten Kontrolltiere.
Zusammenfassend unterschieden sich die Blutwerte von alt-saisonalen H1N1-infizierten
BALB/c und C57BL/6J Mäusen kaum von denen der nicht-infizierten Kontrolltiere. Eine
H5N1-Infektion scheint hingegen in beiden Mausstämmen zu einer schweren und
irreversiblen Lymphopenie zu führen. Ein schwerer Grad einer Lymphozytendepletion gilt als
ein wichtiger Marker für eine hohe Virulenz in der Maus nach einer HPAIV-Infektion (Tumpey
et al., 2000; Vogel et al., 2010; Gabriel et al., 2009). Das 2009 pandemische H1N1 Virus
hatte im BALB/c Mausmodell keine signifikanten Veränderungen der Blutwerte zufolge, im
Gegensatz dazu kam es im C57BL/6J Mausmodell zu einer signifikanten Leukozyten- sowie
Lymphozytendepletion. Während sich die Zellzahlen von HH05-infizierten C57BL/6J Mäusen
im Infektionsverlauf wieder zu normalisieren scheinen, führt eine HH15-Infektion zu einer
progressiven und irreversiblen Lymphopenie. Daraus lässt sich folgern, dass eine
anhaltenden Lymphopenie nach einer Influenza-Infektion generell mit einem letalen Ausgang
im Mausmodel einhergeht.
4.4.5 Th1/Th2-Immunantwort nach Infektion mit pH1N1, alt-saisonaler H1N1 und
humaner H5N1 Influenza in BALB/c und C57BL/6J Mäusen
Einer der am besten untersuchten Unterschiede zwischen den BALB/c und C57BL/6J
Inzucht-Mausstämmen ist die Polarisierung der Immunantwort von T-Helferzellen (Th)
(Heinzel et al., 1989). C57BL/6J Mäuse bilden eine stärkere Th1-Antwort aus, wobei die
aktivierten T-Lymphozyten Zytokine ausschütten, die an der zellulären Immunabwehr
beteiligt sind. In BALB/c Mäusen hingegen kommt es zur Aktivierung einer größeren Anzahl
an Typ 2 T-Helferzellen, welche in der humoralen Immunantwort eine maßgebliche Rolle
spielen. Für einen optimalen Schutz gegen Krankheitserreger sollten sich beide ThAntworten in einem ausbalancierten Verhältnis befinden.
Die Aktivierung des Immunsystems während der Infektion beider Mausstämme wurde für
diese Arbeit durch die Analyse der Proteinlevel von Th-Zellen ausgeschütteter Zytokine
untersucht. Die Zytokinmengen der Typ1-Zytokine TNF-α, IFN-γ und MCP-1 und der Th2Zytokine IL-4, IL-6 und IL-10 (Heinzel et al., 1989; Kidd, 2003) wurden zum einen direkt in
der Lunge der infizierten Mäuse untersucht und zum anderen für eine systemische
Bestimmung im Serum (Abb. 15). Hierfür wurden BALB/c und C57BL/6J Mäuse mit altsaisonalen H1N1, HH05 (pH1N1), HH15 (pH1N1) oder humanen H5N1 Influenzaviren
infiziert und nach sechs Tagen die Lungen sowie Blutproben entnommen (3.4.3).
81
Ergebnisse
Abb. 15: Lokale und systemische Level von Th1- (TNF-α, IFN-γ, MCP-1) und Th2- Zytokinen (IL-4, IL-6,
IL-10) in alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1-infizierten BALB/c und
C57BL/6J Mäusen. BALB/c (graue Balken) oder C57BL/6J Mäuse (schwarze Balken) wurden mit 105 p.f.u. des
alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) sowie mit 102 p.f.u. des humanen H5N1 infiziert.
Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag 6 nach Infektion wurden jeweils die vereinigten
Lungenhomogenate von drei Tieren (A,B) und die vereinigten Serumproben von 4 – 6 Tieren (C,D) im Duplett
einem enzymgekoppelten Immunoabsorptions-Assay (ELISA; 3.1.10) unterzogen. Dabei wurden in zwei
unabhängigen Durchläufen die Proteinlevel von Typ1-Zytokinen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interferon-γ
(IFN-γ) und monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) (A,C) und Th2-Zytokinen Interleukin-4 ( IL-4), Interleukin-6
(IL-6) und Interleukin-10 (IL-10) (B,D) bestimmt. Werte unter dem Detektionslimit des Assays wurden als „nicht
detektiert“ (n.d.) gekennzeichnet. Die statistische Relevanz wurde durch einen Student’s-t-Test ermittelt
(* entspricht p≤0,05; ** entspricht p≤0,01).
82
Ergebnisse
In der Lunge, dem primären Zielorgan der viralen Replikation, waren für infizierte BALB/c
Mäuse generell höhere Zytokin-Expressionslevel zu detektieren als für C57BL/6J Mäuse
(Abb. 15A,B). Das alt-saisonale H1N1 Influenzavirus führte zu einer höheren IFN-γExpression im BALB/c Mausmodell im Vergleich zu C57BL/6J (Abb. 15A). TNF-α, IFN-γ und
IL-10 wurden zu signifikant höherem Level in 2009 pH1N1-infizierten BALB/c Mäusen
gemessen als in C57BL/6J Mäusen, wobei das HH05-Isolat zu einer stärkeren Expression
von IFN-γ und IL-10 führte als HH15 (Abb. 15A,B). Auch für IL-4 war in BALB/c Mäusen nach
Infektion mit dem HH05 Isolat eine stärkere Expression als mit HH15 zu beobachten (Abb.
15B). Dies war nicht der Fall in C57BL/6J Mäusen. H5N1-infizierte BALB/c Mäuse wiesen im
Vergleich zu C57BL/6J Mäusen eine signifikant erhöhte Expression der inflammatorischen
Zytokine TNF-α, IFN-γ, MCP-1 und IL-6 auf (Abb. 15A,B).
Die systemischen Zytokinlevel im Serum der infizierten Mäuse waren wesentlich niedriger als
in der Lunge und, mit Ausnahme von IL-4, nach alt-saisonaler H1N1-Infektion nur knapp
über dem Detektionslimit oder gar nicht detektierbar (Abb. 15C,D). IL-4 konnte nach Infektion
mit allen Viren, im Gegensatz zu den Lungenmessungen, nur in infizierten C57BL/6J
Mäusen nachgewiesen werden (Abb. 15D). Eine 2009 pH1N1-Infektion führte in BALB/c
Mäusen, wie auch schon in den Lungenhomogenaten gezeigt, zu signifikant höherer IFN-γExpression (Abb. 15C). Die höchsten Expressionslevel wurden nach H5N1-Infektion für
IFN-γ und IL-10 in BALB/c Mäusen und für MCP-1 in C57BL/6J Mäusen nachgewiesen (Abb.
15C,D).
Zusammenfassend kommt es nach alt-saisonaler H1N1-Infektion in beiden Mausmodellen
nur zu einer geringen Erhöhung der untersuchten Zytokine in der Lunge. Das humane H5N1
hingegen führt generell zu einer gesteigerten Zytokinexpression. Ein sogenannter
„Zytokinsturm“ wurde für H5N1-Virusinfektionen und für die 1918 spanische Pandemie in der
Literatur beschrieben und gilt als wichtiges Korrelat für erhöhte Pathogenität (Kobasa et al.,
2004; de Jong et al., 2006; Szretter et al., 2007). Eine 2009 pH1N1-Infektion scheint, im
Vergleich zu alt-saisonaler H1N1-Infektion eine erhöhte Zytokinexpression in der Lunge von
Mäusen zur Folge zu haben. In BALB/c Mäusen führt eine 2009 pH1N1-Infektion dabei
jedoch zu signifikant höheren Expressionsleveln der untersuchten Zytokine. Dies lässt darauf
schließen, dass im Gegensatz zu den negativen Auswirkung eines Zytokinsturms nach
H5N1-Infektion, eine erhöhte Expression von Th1- und Th2-Zytokine im BALB/c Modell mit
einer niedrigen Pathogenität einer 2009 pH1N1-Infektion einhergeht. Spekulativ ist demnach
die Zytokinexpression nach einer 2009 pH1N1-Infektion in C57BL/6J Mäusen unzureichend
und korreliert mit einer höheren Pathogenität. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass
unterschiedliche Wirtsdeterminanten bei 2009 pH1N1 Influenzaviren eine Rolle spielen als
bei H5N1 Influenzaviren.
83
Ergebnisse
4.5 Rekombinante 2009 pH1N1 Influenzaviren (2009 pH1N1rek)
Genetisch bedingte Charakteristika von Influenzaviren lassen sich durch die Generierung
von rekombinanten Influenzaviren ermöglichen. Wildtypisolate, die direkt aus einem
infizierten Wirt isoliert wurden, enthalten meist eine Mischung aus dem vorherrschenden
Genotyp und sogenannten Quasispezies-Varianten. Letztere entstehen durch Mutationen
während der viralen Replikation im Wirt und durch die Selektion des Immunsystems.
Experimentelle Untersuchungen eines bestimmten viralen Genotyps sind demnach mit
rekombinanten Viren besser zu reproduzieren. Der größte Vorteil von rekombinant
hergestellten Influenzaviren ist, dass Unterschiede in der Pathogeniät durch die Herstellung
von Reassortanten und Mutanten auf einzelne virale Faktoren zurückgeführt werden können.
Diese Pathogenitätsdeterminanten können so auch weitergehend im viralen Kontext
charakterisiert werden.
4.5.1 Generierung von 2009 pH1N1rek Influenzaviren
Für eine Analyse der viralen Determinanten von HH05 und HH15 (pH1N1), die im C57BL/6J
Mausmodell zu einer differenziellen Pahtogenität geführt haben (4.4), wurden rekombinante
2009 pH1N1 Influenzaviren (2009 pH1N1rek) generiert. Dafür wurden, wie unter 3.3.2
beschrieben, die viralen Gensegmente in Expressionsvektoren integriert und anschließend
für die Rekonstruktion von Viruspartikeln in Zellen transfiziert. Neben den rekombinanten
2009 pH1N1 Viren der parentalen Wildtypisolate (wt) HH05wt und HH15wt wurden auch
Reassortanten beider Isolate hergestellt, zum einen 7+1 Einzelgenreassortanten, wobei
jeweils ein Genomsegment des höher pathogenen HH15 Virusisolats mit den übrigen
Genomsegmenten des HH05 Influenzavirus kombiniert wurde. Dies wurde jedoch nur mit
HH15-Segmenten durchgeführt, die sich von HH05 unterscheiden (PB2, PA, HA, NP, NA,
NS).
Zum
anderen
wurden
auch
eine
6+2-Reassortante,
mit
den
beiden
Oberflächenproteinen HA und NA von HH15, sowie eine 5+3-Reassortante, mit den vRNP
Segmenten PB2, PA und NP von HH15 im Hintergrund von HH05, hergestellt. Anhand
dieser Reassortanten sollte des Weiteren untersucht werden, welche Genomsegmente von
HH15 maßgeblich zur erhöhten Pathogenität, im Vergleich zu HH05, in C57BL/6J Mäusen
beitragen (4.5.2.1). Mit den 6+2- und 5+3-Reassortanten sollten auch Unterschiede des
Phänotyps untersucht werden können, die durch eine Wechselwirkung von funktionell
interagierenden viralen Faktoren vermittelt werden. Für die Bestimmung einzelner
Aminosäuren als Pathogenitätsdeterminanten, wurde für Genomsegmente von HH15, die
sich an mehreren Sequenzpositionen von HH05 unterschieden, Punktmutanten hergestellt.
Dafür wurden mittels zielgerichteter Mutagenese (3.1.5) die einzelnen HH15-spezifischen
Aminosäureaustausche in das entsprechende Gen von HH05 eingeführt. Die so generierten
84
Ergebnisse
Reassortanten und Punktmutanten können nun in vivo und in vitro zur Untersuchung von
HH15-spezifischen Pathogenitätsdeterminanten verwendet werden.
4.5.2 Charakterisierung der 2009 pH1N1rek Influenzaviren im C57BL/6J Mausmodell
Die rekombinanten 2009 pH1N1 Viren wurden im Folgenden hinsichtlich der Pathogenität
und Virulenz im C57BL/6J Modell charakterisiert. Analog zu den Infektions-Experimenten mit
den klinischen 2009 pH1N1 Virusisolaten sollte für einen Vergleich auch der Virustiter in der
Lunge bestimmt werden. Anschließend wurden in der Histologie der Lunge die dortige
Viruslast sowie eventuelle pathologische Veränderungen untersucht.
4.5.2.1 Pathogenität der 2009 pH1N1rek Influenzaviren in C57BL/6J Mäusen
Zur Kontrolle des Phänotyps der 2009 pH1N1rek Viren im Vergleich zu den parentalen
Virusisolaten, wurden C57BL/6J Mäuse infiziert und die MLD50 bestimmt (3.4.2; Abb. 16). Die
Virulenz des rekombinanten HH05 (HH05rek) entsprach dabei dem des parentalen HH05Isolats (HH05wt). Beide sind im C57BL/6J Mausmodell niedrigpathogen mit von >5 log p.f.u.
(Abb. 16). Auch die Virulenz des rekombinanten HH15 (HH15rek) war vergleichbar mit der
des parentalen Virusisolats HH15wt mit einer MDL50 3,2 log p.f.u. (Abb. 16; 4.4.1). Somit
entspricht der Phänotyp der 2009 pH1N1rek Influenzaviren dem der klinischen 2009 pH1N1
Virusisolate in C57BL/6J Mäusen und können für die weitere Charakterisierung und
Identifikation der HH15-spezifischen Pathogenitätsdeterminanten verwendet werden.
Einzelgenreassortanten mit HH15-spezifischen PB2 (HH05-PB2HH15) oder NS (HH05-NSHH15)
im genetischen Hintergrund von HH05 entsprachen mit einer MLD50 >5 log p.f.u. dem des
parentalen sowie des rekombinanten HH05 im C57BL/6J Mausmodell (Abb. 16). Auch die
HH15-spezifischen Genomsegmente PA (HH05-PAHH15) und NA (HH05-NAHH15) führten im
Hintergrund von HH05, mit MDL50 Werten von 4,5 bzw. 4,4 log p.f.u., zu keiner signifikanten
Erhöhung der Virulenz im Vergleich zu HH05 (Abb. 16). Im Gegensatz dazu, wiesen die
Reassortanten mit HH15-spezifischem NP (HH05-NPHH15) oder NA (HH05-HAHH15) hingegen
eine MDL50 von 3,2 bzw. 3,6 log p.f.u. auf und waren mit der hohen Virulenz von HH15
vergleichbar (Abb. 16). Die 5+3-Reassortante mit HH15-spezifischem PB2, PA und NP im
HH05-Hintergrund (HH05-PB2/PA/NPHH15) war, ebenso wie die 6+2-Reassortante mit den
beiden Oberflächenproteinen von HH15 (HH05-HA/NAHH15) virulenter als das HH05
Virusisolat. Die MDL50 dieser rekombinanten Influenzaviren entsprach mit 3,5 bzw.
3,8 log p.f.u. der von HH15 in C57BL/6J Mäusen (Abb. 16). Demnach führen Reassortanten,
die das HH15-spezifische NP oder HA Genomsegment im genetischen Hintergrund von
HH05 enthalten, zu einer erhöhten Pathogenität in C57BL/6J Mäusen.
85
Ergebnisse
Abb. 16: Genotyp, MLD50 und Virustiter in der Lunge von 2009 pH1N1rek-infizierten C57BL/6J Mäusen. Der
Genotyp der generierten rekombinanten Influenzaviren ist dem Farbcode der Abbildung zu entnehmen, wobei
graue Kästchen für ein Genomsegment des HH05 Isolats und schwarze Kästchen für ein Genomsegment des
HH15 Isolats stehen. HH05rek bzw. HH15rek steht für die rekombinanten Isolate, HH05wt bzw. HH15wt für die
parentalen Virusisolate. Für Punktmutanten ist die Mutation im Kästchen des entsprechenden Genomsegments
angegeben. Da sich PB1 und M von HH05 und HH15 nicht unterscheiden gibt es für diese viralen Proteine keine
Angabe. Für die Maus-letale-Dosis 50 (MLD50) wurden jeweils fünf C57BL/6J Mäuse intranasal mit seriellen
5
0
zehnfach-Verdünnungen (10 p.f.u. - 10 p.f.u.) der 2009 pH1N1rek Influenzaviren infiziert. Die Überlebensraten
wurden über einen Verlauf von 14 Tagen dokumentiert und die MLD50 mittels der von Reed und Muench
beschriebenen Methode berechnet (3.4.2). MLD50-Werte von Reassortanten und Punktmutanten, die denen des
HH15 Virus (rek & wt) mehr entsprechen als der MDL50 von HH05 sind fett hervorgehoben. Für die Analyse der
5
Virustiter in der Lunge wurden C57BL/6J Mäuse intranasal mit 10 p.f.u. der 2009 pH1N1 Influnezaviren infiziert.
An Tag drei und sechs nach Infektion (3 und 6 d p.i.) wurden jeweils von drei Tieren die Lungen entnommen und
der Virustiter mittels Plaquetest bestimmt (3.4.3; 3.3.6) Die Titer sind hier logarithmisch in p.f.u. pro Gramm Organ
mit der jeweiligen Standardabweichung (±) angegeben. Die Detektionsgrenze für die Virustiter lag bei
0,5 log p.f.u./ml Organhomogenat. Eine statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-t-Test überprüft.
Da sich im Gegensatz zum HH15-spezifischen HA, das NP-Protein in mehr als einer
Aminosäure vom HH05 Virusisolat unterscheidet, wurden dafür Punktmutanten generiert
(4.5.1). Diese enthalten jeweils nur einen HH15-spezifischen Aminosäureaustausch im NP
Protein im genetischen Hintergrund von HH05. So konnte die Rolle aller drei Mutationen für
die erhöhte Pathogenität von HH15 bzw. HH05-NPHH15 untersucht werden. Die drei
Punktmutanten, HH05-NPV100I, HH05-NPI133L und HH05-NPI373T, waren mit MDL50 Werten von
3,4, 2,9 bzw. 3,6 log p.f.u. alle hochpathogen im C57BL/6J Mausmodell mit einer
vergleichbaren Virulenz wie die des HH15 Influenzavirus (Abb. 16).
Die Virustiter in der Lunge 2009 pH1N1rek-infizierter C57BL/6J Mäusen wiesen, trotz
beobachteter Unterschiede in der Virulenz, weder 3 d p.i. noch 6 d p.i. Unterschiede auf
86
Ergebnisse
(Abb. 16). Für alle rekombinanten Influenzaviren wurden vergleichbar hohe Titer wie für die
parentalen 2009 pH1N1 Virusisolate detektiert (Abb. 16; 4.4.2).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die HH15-spezifischen Mutation im HA
(S202T) und die drei Mutationen im NP (V100I, I133L, I373T) einzeln sowie in Kombination
maßgeblich zu einer erhöhten Pathogenität im C57BL/6J Mausmodell führen. Demnach
tragen diese Determinanten maßgeblich zu der, im Vergleich zu HH05, erhöhten
Pathogenität von HH15 bei. Die Bestimmung von infektiösen Viruspartikeln in der Lunge
mittels Plaquetest lässt hingegen keine Rückschlüsse auf die Pathogeniät der 2009 pH1N1
Influenzaviren zu. Dies wurde bereits für die klinischen 2009 pH1N1 Virusisolate unter 4.4.2
postuliert.
4.5.2.2 Tropismus der 2009 pH1N1rek Influenzaviren in der Lunge von C57BL/6J
Mäusen
Wie unter 4.4.2 bereits für die 2009 pH1N1 Influenzaviren beobachtet und 4.5.2.1 auch für
die 2009 pH1N1rek Viren gezeigt, ist in C57BL/6J Mäusen die Bestimmung der Viruslast in
der Lunge mittels Plaquetest kein Korrelat für die Pathogenität von Influenzaviren. Eine
immunhistologische
Detektion
von
Viruspartikeln
in
der
Lungen
zeigte
hingegen
Unterschiede in Pathologie und Viruslast HH05- und HH15-infizierter C57BL/6J Mäuse
(4.4.3). Demnach wurden auch von den Lungen 2009 pH1N1rek-infizierter C57BL/6J Mäuse
histologische Schnitte für eine Analyse des Virustropismus durchgeführt. Dabei sollte die
Viruslast auf RNA-Ebene mittels in situ-Hybridisierung untersucht werden (3.5.3). Die
Detektion von viraler RNA (vRNA) lässt dabei auf aktiv replizierende Influenzaviren
schließen. Es sollten in erster Linie die Viruslast und Pathologie von 2009 pH1N1rek
Influenzaviren, im Vergleich zu HH05, untersucht werden die zu einer erhöhten Pathogenität
im C57BL/6J Modell führen. Dafür wurden die Lungenschnitte von HH05rek- und HH15rek-,
HH05-HAHH15- und HH05-NPHH15- sowie HH05-NPV100I-, HH05-NPI133L- und HH05-NPI373Tinfizierten C57BL/6J Mäusen untersucht (Abb. 17).
HH05rek verursachte in der Lunge von infizierten C57BL/6J Mäusen, im Vergleich zu den
Kontrollschnitten (Abb. 17A) eine Infiltration des Lungengewebes mit einigen vRNA-positiven
Zellen (Abb. 17B). Auch HH15rek-infizierte Lungen wiesen Infiltrate und vRNA-positive
Zellen auf, die Alveolarstruktur war jedoch zu einem höheren Grad zerstört als nach
HH05rek-Infektion
(Abb.
17C).
Infektion
der
C57BL/6J
Mäuse
mit
den
Einzelgenreassortanten HH05-HAHH15 und HH05-NPHH15 hatte eine hochgradig zerstörte
Alveolarstruktur in den Lungen zur Folge (Abb. 17D,E), vergleichbar mit HH15rek-infizierten
C57BL/6J Mäusen. Hierbei wurde, im Vergleich zu HH05rek, eine größere Anzahl vRNApositiver Zellen detektiert. Die Punktmutante HH05-NPV100I führte zu einer Gewebeinfiltration,
87
Ergebnisse
die vergleichbar zu der einer HH05rek-Infektion war, jedoch wurde hier eine größere Anzahl
vRNA-positiver Zellen detektiert. Die beiden Punktmutanten HH05-NPI133L und HH05-NPI373T
führten in der C57BL/6J Maus zu zahlreichen mononukleären Infiltraten, einhergehend mit
zerstörten Alveolarstrukturen, vergleichbar zur HH15rek-Infektion. Die vRNA dieser beiden
Punktmutanten wurde jedoch nur zu einer geringen Menge detektiert.
Abb. 17: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Lungenschnitten von 2009 pH1N1rek-infizierten C57BL/6J
Mäusen. C57BL/6J Mäuse wurden intranasal mit 105 p.f.u. der rekombinanten 2009 pH1N1 Virusisolate
(HH05rek & HH15rek) (B,C), der Einzelgenreassortanten mit HH15-spezifischem HA und NP im genetischen
Hintergrund von HH05 (HH05-HAHH15 & HH05-NPHH15) (D,E) und HH15-spezifischen Punktmutanten des NP
(HH05-NPV100I, HH05-NPI133L, HH05-NPI373T) (F,G,H) infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht
(A). An Tag sechs nach Infektion wurden jeweils drei Tiere getötet und die Lungen entnommen (3.4.3). Die RNA
des viralen NP-Proteins von 2009 pH1N1 wurde mittels einer radioaktiv markierten in situ-Sonde detektiert
(3.5.3). Anschließend wurde eine H&E-Gegenfärbung der Schnitte durchgeführt (3.5.4). Virus RNA-positive Zellen
haben eine schwarze Färbung. Die lichtmikroskopischen Bilder wurden in einer 100facher-Vergrößerung
aufgenommen.
Die erhöhte Pathogenität der verschiedenen 2009 pH1N1rek Influenzaviren korreliert
demnach mit einer unterschiedlich hohen Viruslast und einer unterschiedlich starken
Entzündungsreaktion in der Lunge von C57BL/6J Mäusen. Während vor allem bei
HH05-NPHH15 und HH05-NPV100I eine erhöhte Virusreplikation eine Rolle spielt, führt eine
Infektion mit HH05-HAHH15, HH05-NPI133L und HH05-NPI373T zu einer starken Infiltration mit
hochgradiger Zerstörung der Alveolarstruktur. Diese deutet auf unterschiedliche virale
88
Ergebnisse
Mechanismen der einzelnen HH15-spezifischen Mutationen hin, die zu einer erhöhten
Pathogenität führen.
4.5.2.3 Lymphozytenwerte nach Infektion mit 2009 pH1N1rek Influenzaviren in
C57BL/6J Mäusen
Unter 4.4.4 konnte gezeigt werden, dass die Virulenz von Influenzaviren in Mäusen mit einer
Lymphozytendepletion korreliert. Daher sollte analysiert werden, ob die Mutationen, die zur
erhöhten Pathogenität von HH15 im C57BL/6J Mausmodell beitragen, auch zu einer
Lymphopenie führen (4.5.2.1). Dafür wurden die Lymphozytenwerte im Blut von HH05rekund HH15rek-, HH05-HAHH15- und HH05-NPHH15- sowie HH05-NPV100I-, HH05-NPI133L-,
HH05-NPI373T-infizierten C57BL/6J Mäusen bestimmt (Abb. 18). Um auch geringe
Unterschiede zwischen den verschiedenen 2009 pH1N1rek Influenzaviren detektieren zu
können, wurden die C57BL/6J Mäuse mit einer niedrigeren Dosis als für die Blutbild-Analyse
der klinischen 2009 pH1N1 Virusisolate, unter 4.4.4, infiziert.
Abb. 18: Lymphozytenwerte im Blut von 2009 pH1N1rek-infizierten C57BL/6J Mäusen. C57BL/6J Mäuse
wurden intranasal mit 104 p.f.u. der rekombinanten 2009 pH1N1 Virusisolate (HH05rek & HH15rek), der
Einzelgenreassortanten mit HA und NP von HH15 im genetischen Hintergrund von HH05 (HH05-HAHH15 & HH05NPHH15) und den HH15-spezifischen Punktmutanten von NP (HH05-NPV100I, HH05-NPI133L, HH05-NPI373T) infiziert.
Kontrolltiere bekamen ausschließlich PBS verabreicht. An Tag drei nach Infektion wurden Blutproben entnommen
und die Lmphozytenwerte von mindestens vier Tieren mittels eines Hämatologiegerätes bestimmt (3.4.5). Die
Werte der nicht-infizierten Kontrolltiere wurden auf 100 % gesetzt. HH05rek infizierte Tiere dienten als Referenz,
wobei die statistische Relevanz durch einen Sudent’s-t-Test ermittelt wurde (* entspricht p≤0,05; *** entspricht
p≤0,001).
Im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrolltieren waren die Lymphozyten im Blut aller
infizierten C57BL/6J Mäuse bereits 3 d p.i. um mindestens 50 % erniedrigt (Abb. 18). Die
Lymphozytenwerte in HH15rek-infizierten Tieren waren nochmals signifikant geringer, bei ca.
25 % des Normalwertes, als in HH05rek-infizierten C57BL/6J Mäusen (Abb. 18). Die
Einzelgenreassortanten
HH05-HAHH15
und
HH05-NPHH15
verursachten
eine
Lymphozytendepletion vergleichbar zu HH05rek (Abb. 18). Eine Infektion mit HH05-NPV100I
und HH05-NPI133L hatte hingegen eine vergleichbar starke Lymphopenie, wie nach HH15wt-
89
Ergebnisse
Infektion, zur Folge (Abb. 18). HH05-NPI373T-infizierte C57BL/6J Mäuse wiesen ebenfalls
eine, im Vergleich zu HH05rek, stärkere Lymphozytendepletion auf, jedoch geringer als die
zwei Punktmutanten HH05-NPV100I und HH05-NPI133L.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass alle hier untersuchten 2009 pH1N1rek
Influenzaviren 3 d p.i. zu einer Lymphozytendepletion in C57BL/6J Mäusen führen. Den
höchsten Grad einer Lymphopenie wird von den höher pathogenen HH15rek Influenzaviren
sowie den NP-Punktmutanten ausgelöst. Demnach kann die Hypothese aufgestellt werden,
dass die HH15-spezifischen Punktmutationen im NP Protein für einen höheren Grad einer
Lymphopenie verantwortlich sind und so zur Letalität im C57BL/6J Mausmodell beitragen.
4.6 Analyse der Mutationen im Hämagglutinin und Nukleoprotein
Die Charakterisierung der Reassortanten unter 4.5.2 zeigte, dass neben einer Mutation im
Hämagglutinin (HA) drei verschiedene Aminosäureaustausche im Nukleoprotein (NP)
maßgeblich an der differenziellen Pathogenität von HH05 und HH15 im C57BL/6J
Mausmodell beteiligt sind.
Abb. 19: Strukturelle Lokalisierung der HH15 (pH1N1)-spezifischen HA Mutation. Die Position der S202TMutation ist in rot in der Tertiärstruktur eines H1 HA Proteins markiert (nach Zhang et al., 2010, mittels PyMOL
3D-Grafiksoftware, Schödinger LCC). Die Antigenbindungsstellen sowie die Rezeptorbindungsstelle sind in der
globulären Kopfdomäne mit schwarzen Kreisen gekennzeichnet (nach Bouvier und Palese, 2008). Die
funktionellen Domänen HA1 und HA2 sowie die Position der Rezeptorbindungsstellen (RBS) werden ebenfalls in
der ungefalteten Proteinstruktur gezeigt (nach Sriwilaijaroen und Suzuki, 2012).
90
Ergebnisse
In der Tertiärstruktur des ungespaltenen HA befindet sich die S202T-Mutation in der
globulären
Kopfdomäne
des
Proteins
(Abb.
19).
Diese
beinhaltet
die
Rezeptorbindungstasche und alle für H1 beschriebenen Antigenbindungsstellen (Bouvier
und Palese, 2008). Die Mutation von HH15 ist in einer der Antigenbindungsstellen lokalisiert
(Abb. 19). Eine strukturelle oder eine Ladungs-Änderung dieser Stellen durch eine Mutation
kann Einfluss auf die Erkennung von Antikörpern in einem infizierten Wirt haben. Die
Aminosäure Threonin ist polar und ungeladen ebenso wie Serin. Es könnte jedoch eine
sterische Änderung im Protein bei diesem Aminosäureaustausch auftreten. In der
Tertiärstruktur
von
HA
ist
keine
räumliche
Assoziation
der
Mutation
mit
der
Rezeptorbindetasche erkennbar. Im ungefalteten Protein ist jedoch zu sehen, dass die
Position 202 zwischen zwei Rezeptorbindestellen lokalisiert ist (Abb. 19). Diese Mutation
könnte demnach dennoch die Rezeptorbindeeigenschaft von 2009 pH1N1 Influenzaviren
beeinflussen.
Abb. 20: Strukturelle Lokalisierung der HH15 (pH1N1)-spezifischen NP Mutationen V100I, I133L und I373T.
Die Positionen der NP Mutation V100I, I133L und I373T sind in rot in der Tertiärstruktur eines Influenzavirus NPProteins markiert (nach Ye et al., 2006, mittels PyMOL 3D-Grafiksoftware, Schödinger LCC). Die Mutationen sind
alle innerhalb der Körperdomäne lokalisiert (nach Boulo et al., 2011). Die funktionellen Domänen der RNABindung und einer PB2-Interaktion des Proteins, sowie die Position der Kernlokalisationssignale (NLS) werden
ebenfalls in der ungefalteten Proteinstruktur gezeigt (nach Naffakh et al., 2008).
91
Ergebnisse
Die Mutationen V100I, I133L und I373T im NP Protein des 2009 pH1N1 Virusisolats HH15
sind alle in Regionen lokalisiert die mit dem viralen PB2 interagieren (Abb. 20). Daher
könnten Mutationen an diesen Stellen einen Einfluss auf die Funktion der Polymerase der
2009 pH1N1 Influenzaviren haben. Darüber hinaus ist die Sequenz des viralen NP bei
Influenzaviren hochkonserviert und spielt eine entscheidende Rolle in der Immunerkennung
durch T-Zellen (Webster et al., 1992). Die HH15-spezifische I373T Mutation liegt in einem
Bereich in dem schon mehrfach die Bindung von verschiedenen HL-Antigenen beschrieben
wurde (Immue Epitope Database, www.iedb.org). Vor allem diese Mutation könnte daher zu
einer Restriktion der adaptiven Immunantwort in infizierten Wirten führen. Zudem liegen die
Mutationen alle auf der Oberfläche des Proteins. Eine durch diese Mutationen ausgelöste
Veränderung in der Tertiärstruktur des Proteins könnte daher eine direkte Auswirkung auf die
Interaktion mit viralen Proteinen, der RNA-Bindung oder Wirtsfaktoren haben.
4.6.1 Rezeptorbindungseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren
Aviäre Influenzaviren binden präferenziell an α2,3-glykosidisch gebundene Sialinsäuren, die
zu einem größeren Anteil auf der Oberfläche von Hühnererythrozyten vorkommen. Humane
Influenzaviren hingegen binden in erster Linie α2,6-glykosidisch gebundene Sialinsäuren (Ito
et al., 1997; Nobusawa et al., 2000). Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, dass die
2009 pH1N1 Influenzaviren beide Rezeptoren binden können, allerdings mit einer Präferenz
für α2,6-gebundene Sialinsäuren (Yang et al., 2010; Childs et al., 2009). Um einen
möglichen Einfluss der HA-Mutation S202T auf die Rezeptorbindungseigenschaft zu
untersuchen, wurde die Bindungspräferenz des HA-Proteins der rekombinanten und
parentalen 2009 pH1N1 Influenzaviren mittels Hämagglutinationstests mit humanen und
Hühnererythrozyten untersucht (3.3.4; Abb. 21). Zur Kontrolle wurde das aviäre SC35M
(H7N7) und das humane A/Solomon Islands/3/06-like (Solomon) (H1N1) ebenfalls mit
Erythrozyten beider Spezies inkubiert (Abb. 21).
Die 2009 pH1N1rek Influenzaviren sowie die parentalen 2009 pH1N1 Virusisolate (HH05wt,
HH15wt) hämagglutinierten stärker mit humanen Erythrozyten als mit Hühnererythrozyten
(Abb. 21A,B). Ein signifikanter Unterschied zwischen HH05 und HH15 konnte nicht
festgestellt werden. Die Hämagglutination durch die Einzelgenreassortante HH05-HAHH15 mit
der
HH15-spezifischen
HA-Mutation
war
ebenfalls
stärker
mit
humanen
als
mit
Hühnererythrozyten (Abb. 21A,B). Das aviäre Virus SC35M hämagglutinierte wie erwartet
die Hühnererythrozyten zu höheren Hämagglutinationseinheiten (HAU) als die humanen
Erythrozyten (Abb. 21A,B), was besonders in der prozentualen Darstellung sichtbar wird
(Abb.
21A).
Im
Gegensatz
dazu
hämagglutinierte
das
humane
Solomon
Virus
92
Ergebnisse
erwartungsgemäß die humanen Erythrozyten stärker als die Hühnererythrozyten (Abb.
21A,B).
Abb. 21: Hämagglutination von humanen und Hühnererythrozyten durch rekombinante und parentale
2009 pH1N1 Influenzaviren. Das klinische Virusisolat und das rekombinante Virus von HH05 und HH15, sowie
die HA-Reassortante HH05-HAHH15 wurden in einem Hämagglutinationstest (3.3.4) mit humanen (weiße Balken)
oder Hühnernerythrozyten (schwarze Balken) inkubiert. Zur Kontrolle wurde das aviäre SC35M (H7N7) und das
humane A/Solomon Islands/3/06-like (Solomon) (H1N1) verwendet. Die Hämagglutinationseinheiten (HAU) mit
Standardabweichung aus zwei unabhängigen Tests wurden zum einen in Prozent angegeben, wobei der mittlere
Wert für humane Erythrozyten auf 100 % gesetzt wurde (A). Zum anderen wurden die absoluten HAU-Titer
angegeben (B). Eine statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-t-Test überprüft.
Die Ergebnisse zeigen, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren generell humane Erythrozyten
stärker binden als Hühnererythrozyten. Dies spricht für eine stärkere Bindungspräferenz von
humanen Virusrezeptoren. Unterschiede in der Bindungspräferenz von HH05 und HH15 sind
nicht festzustellen.
4.6.2 Polymeraseaktivität der RNP-Komplexe der 2009 pH1N1 Influenzaviren in
humanen Zellen
Das NP-Protein von Influenzaviren enkapsidiert im Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex die
virale RNA und trägt maßgeblich zu dessen Replikation bei (Portela und Digard, 2002).
93
Ergebnisse
Dementsprechend können Mutationen im NP die Prozessivität des ganzen RNP-Komplexes
beeinflussen. Es wurde zusätzlich gezeigt, dass Mutationen in der Polymerase und dem NP
von aviären Influenzaviren die Adaptation an den Säuger vermitteln können (Gabriel et al.,
2005; Resa-Infante und Gabriel, 2013). Um einen möglichen Einfluss der Mutationen V100I,
I133L und I373T im NP-Protein von HH15 auf die Polymeraseaktivität zu untersuchen,
wurden Reporterassays (3.1.9) mit unterschiedlicher Kombination der RNP-Untereinheiten
durchgeführt (Abb. 22). Dafür wurden die jeweiligen Polymeraseuntereinheiten (PB1, PB2,
PA) und das Nukleoprotein (NP) in Expressionsvektoren in HEK293T-Zellen transfiziert. In
diesen Zellen wurden die viralen RNP-Komplexe rekonstruiert und deren replikative Aktivität
mittels eines Reportergens gemessen.
Abb. 22: Polymeraseaktivität der RNP-Komplexe von HH05, HH15 und deren Kombination in humanen
Zellen. Die relative Aktivität des viralen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes wurde mit Hilfe eines
Reporterassays ermittelt (3.1.9). Expressionsplasmide mit den jeweiligen Polymeraseuntereinheiten (PB1, PB2,
PA) und dem Nukleoprotein (NP) wurden zusammen mit dem humanen Reportergenplasmid pPol-I, wie in der
Tabelle angegeben, in humane HEK293T-Zellen transfiziert. Die Polymeraseaktivität ist in Prozent mit der
jeweiligen Standardabweichung aus mindestens sechs unabhängigen Experimenten gezeigt, wobei die Aktivität
des vollständigen RNP-Komplexes von HH05 auf 100 % gesetzt wurde. Als Negativkontrolle wurden Plasmide
des RNP-Komplexes ohne PB2-Untereinheit verwendet. Die statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-tTest ermittelt (*** entspricht p≤0,001).
Die Polymeraseaktivität des RNP-Komplexes von HH15 (Abb. 22, 3. Balken) war im
Vergleich zur Negativkontrolle (Abb. 22, 1. Balken) nur schwach zu detektieren und
signifikant niedriger als die des vollständigen HH05-RNP-Komplexes (Abb. 22, 2. Balken).
Durch das Einbringen des PB2 von HH15 in den Hintergrund des HH05 RNP-Komplex
wurde die Polymeraseaktivität ebenfalls signifikant reduziert (Abb. 22, 4. Balken). Die
prozentualen Werte der Aktivität waren vergleichbar mit denen des HH15-RNP-Komplexes.
Wurden die viralen Proteine PA oder NP von HH05 gegen die von HH15 ausgetauscht,
unterschied sich die Aktivität der Polymerase nicht signifikant von der des HH05-RNP-
94
Ergebnisse
Komplexes. Ein Austausch der Polymereaseuntereinheit PB1 wurde nicht untersucht, da in
diesem Protein keine Aminosäureunterschiede zwischen HH05 und HH15 vorliegen (Tab. 3).
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass der Polymerasekomplex von HH15
in humanen Zellen generell eine niedrige Aktivität aufweist, welche von der PB2-Untereinheit
vermittelt wird. Die Mutationen im NP, die zur erhöhten Pathogenität von HH15 im C57BL/6JModell beitragen, haben keine Änderung der Polymeraseaktivität im Vergleich zum HH05RNP-Komplex zur Folge. Demzufolge ist die erhöhte Pathogenität von HH15 sowie die
erhöhte Viruslast in C57BL/6J Mäusen, wie unter 4.4.3 und 4.5.2.2 gezeigt, nicht auf eine
erhöhte Aktivität der viralen Polymerase zurückzuführen.
4.7 Charakterisierung
der
2009
pH1N1
Influenzaviren
im
Meerschweinchenmodell
Charakteristikum einer Pandemie ist eine effiziente Mensch zu Mensch Transmission, wie
sie auch für die 2009 pandemische H1N1 Influenza beobachtet wurde (Neumann et al.,
2009). Mäuse eignen sich als kleines Säugermodell zwar gut für die Charakterisierung der
Pathogenität und des Tropismus von Influenzaviren, lassen jedoch keinen Rückschluss auf
die Übertragbarkeit im Säuger zu (Bouvier und Lowen, 2010). Hierfür wurde das
Meerschweinchen als Transmissionsmodell beschrieben (Lowen et al., 2006). Es sind zwar
keinerlei
klinische
Symptome
einer
Influenzaerkrankung
im
Meerschweinchen
nachzuweisen, jedoch können humane Influenzaviren aufgrund der Rezeptorverteilung im
Respirationstrakt der Tiere effizient replizieren. Eine Übertragung der Viren von infizierten zu
nicht-infizierten Sentineltieren über direkten Kontakt konnte daher mehrfach gezeigt werden
(Lowen et al., 2006; Bouvier und Lowen, 2010). Darüber hinaus wurde für einige
Influenzavirusisolate ebenfalls eine Transmission über Aerosole, ohne direkten Kontakt der
Tiere, nachgewiesen (Lowen et al., 2006; Gao et al., 2009; Mubareka et al., 2009; Sun et al.,
2010). Im Folgenden sollte zunächst die Replikationseigenschaft sowie der Tropismus der
hier charakterisierten 2009 pH1N1 Isolate im Respirationstrakt von Meerschweinchen
analysiert (4.7.1) werden. Für die Analyse der Transmissionseigenschaften dieser Viren
wurde zum einen die Übertragung über direkten Kontakt von Tieren untersucht, zum anderen
die Übertragung über Aerosole, indem nicht-infizierte Tiere der Umgebungsluft von infizierten
Tieren ausgesetzt wurden (4.7.2).
4.7.1 Virustropismus der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Respirationstrakt von
Meerschweinchen
Im oberen Respirationstrakt (ORT) von Meerschweinchen liegen α-2,6-glykosidisch
gebundene Sialinsäuren auf der Oberfläche von Epithelzellen vor (Sun et al., 2010). Diese
95
Ergebnisse
werden von humanen Influenzaviren als Rezeptor gebunden und ermöglichen die Infektion
dieser Zellen. In dieser Arbeit wurde die Replikation und der Virustropismus der 2009 pH1N1
Influenzaisolate im Respirationstrakt von Meerschweinchen untersucht (Abb. 24). Dafür
wurden Tiere des Hartley Meerschweinchenstamms intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 bzw.
des HH15 Isolats infiziert (3.4.2). Zur Bestimmung der Virustiter im ORT wurden 1, 3, 6 und
9 d p.i. Nasenspülungen der Tiere durchgeführt und anschließend der Virustiter bestimmt
(3.4.2; 3.4.3; 3.3.6). Für eine Analyse des unteren Respirationstraktes (URT) wurden die
Trachea und die Lunge der Tiere jeweils 3 und 6 d p.i. entnommen und anschließend die
Virustiter bestimmt sowie histologische Schnitte angefertigt (3.4.3; 3.5.1). Während des
Versuchs über einen Zeitraum von 14 Tagen wurden die Meerschweinchen zur Kontrolle
regelmäßig gewogen. Wie erwartet zeigten die Tiere keinerlei Gewichtsverlust oder weitere
klinische Symptome (Abb. 23).
Abb. 23: Gewichtsverlust von HH05 (pH1N1)- oder HH15 (pH1N1)-infizierten Meerschweinchen. Hartley
Meerschweinchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus
infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. Das Gewicht aller Tiere wurde über 14 Tage nach
Infektion (1-14 d p.i.) dokumentiert und ist hier mit entsprechender Standardabweichung in Prozent zum
jeweiligen Ausgangsgewicht angegeben.
Bereits 1 d p.i. waren im ORT von Meerschweinchen, infiziert mit HH05 oder HH15,
vergleichbar hohe Virustiter von durchschnittlich 6 log p.f.u./ml nachzuweisen (Abb. 24A).
3 d p.i. sanken die Titer von beiden 2009 pH1N1 Viren im ORT bereits wieder um ein Drittel
(Abb. 24A). Das HH05 Isolat wurde nur noch in zwei von zehn Meerschweinchen zu
geringen Titern detektiert. In der Nasenspülung HH15-infizierter Tiere hingegen war 6 d p.i.
kein Virustiter mehr nachzuweisen (Abb. 24A).
An 9 d p.i. wurde in allen infizierten
Meerschweinchen kein Virus mehr detektiert (Abb. 24A).
Im URT von HH05-infizierten Meerschweinchen konnte weder 3 d p.i. noch 6 d p.i. Virus in
den Trachea- und Lungenhomogenaten nachgewiesen werden (Abb. 24B,C). In HH15infizierten Tieren hingegen wurde 3 d p.i. in der Trachea von drei aus vier Tieren Virus
96
Ergebnisse
detektiert. Hierbei wurde eine im Vergleich zum
ORT niedrigere Viruslast von
1,3 - 2,8 log p.f.u. pro Gramm Organ gemessen (Abb. 24B). Auch in den Lungen der HH15infizierten Meerschweinchen wurde 3 d p.i. in zwei von vier Tieren das HH15 Virus zu
geringen Titern detektiert (Abb. 24C). Keines der beiden 2009 pH1N1 Influenzaviren wurde
6 d p.i. im URT von infizierten Meerschweinchen detektiert (Abb. 24B,C).
Abb. 24: Virustiter in der Nasenspülung der Trachea und der Lunge von HH05 (pH1N1)- und HH15
(pH1N1)-infizierten Meerschweinchen. Hartley Meerschweinchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05
(pH1N1) oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An
Tag eins, drei, sechs und neun nach Infektion (1,3,6,9 d p.i.) wurden mit mindestens acht Tieren eine
Nasenspülung durchgeführt (3.4.3). An Tag drei und sechs nach Infektion (3 und 6 d p.i.) wurden von mindestens
zwei Tieren die Lunge und die Trachea entnommen (3.4.3). Die Virustiter wurden mittels Plaquetest (3.3.6) in der
Nasenspülung und den Organhomogenaten bestimmt. (ORT = oberer Respirationstrakt; URT = unterer
Respirationstrakt). Die Detektionsgrenze für die Virustiter lag bei 0,5 log p.f.u./ml Nasenspülung bzw.
Organhomogenat. Eine statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-t-Test überprüft.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass beide 2009 pH1N1 Viren mit vergleichbarer
Effizienz im ORT von Meerschweinchen replizieren. Eine Eliminierung der Viren aus dem
ORT findet etwa sechs Tage nach Infektion statt. Im URT hingegen scheint im Gegensatz zu
97
Ergebnisse
HH05 das HH15 Influenzavirus sowohl in der Trachea wie auch in der Lunge infizierter Tiere
replizieren zu können. Diese Daten weisen darauf hin, dass HH15 im Vergleich zu HH05
effizienter im URT von Meerschweinchen repliziert.
Aufgrund der beobachteten Replikationsunterschiede von HH05 und HH15 im URT von
Meerschweinchen (Abb. 24) wurde im Vergleich die Histologie von Trachea und Lunge der
infizierten Tiere untersucht. Dabei sollte der Virustropismus der 2009 pH1N1 Isolate auf
RNA-Ebene mittels in situ-Hybridisierung und die pathologischen Folgen einer 2009 pH1N1Infektion in diesen Organen genauer untersucht werden.
Für einen ersten Vergleich der Pathologie der ganzen Lungen wurden diese direkt nach der
Entnahme 3 d p.i. fotografiert. In Abb. 25 war ein deutlicher Unterschied von Lungen nichtinfizierter und 2009 pH1N1-infizierter Meerschweinchen zu sehen, wobei große Bereiche der
Lunge HH05- sowie HH15-infizierter Meerschweinchen Hämorrhagien aufwiesen.
Abb. 25: Pathologie der Lunge von HH05 (pH1N1)- und HH15 (pH1N1)-infizierten Meerschweinchen.
Hartley Meerschweinchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1)
Influenzavirus infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag drei nach Infektion wurde von
jeweils drei Tieren die Lunge entnommen (3.4.3). Die Bilder wurden mit einer digitalen Kompaktkamera
aufgenommen.
In der Trachea konnten weder in HH05- noch in HH15-infizierten Meerschweinchen virale
RNA (vRNA) nachgewiesen werden (Abb. 26). Auch waren hier keine pathologischen
Veränderungen im Vergleich zu nicht-infiziertern Tieren zu erkennen. Im Gegensatz dazu
konnte die vRNA beider 2009 pH1N1 Influenzaisolate in den Lungen infizierter
Meerschweinchen
detektiert
werden.
Das
Lungengewebe
der
HH05-infizierten
Meerschweinchen wies einzelne vRNA-positive Zellen auf mit einem geringen Grad an
alveolaren Infiltraten (Abb. 26). In den Lungen von HH15-infizierten Meerschweinchen
wurden hingegen zahlreiche vRNA-positive Alveolarzellen, mit zahlreichen mononukleären
Infiltraten, einhergehend mit zerstörten Alveolarstrukturen, detektiert (Abb. 26).
98
Ergebnisse
Abb. 26: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Trachea und Lunge von HH05 (pH1N1)- und HH15 (pH1N1)infizierten Meerschweinchen. Hartley Meerschweinchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1)
oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag drei
nach Infektion wurden von jeweils drei Tieren die Lunge und die Trachea entnommen (3.4.3). Die RNA des
viralen NP-Proteins von 2009 pH1N1 wurden mittels einer radioaktiv markierten in situ-Sonde auf den
Gewebeschnitten detektiert (3.5.3) Anschließend wurde eine H&E-Gegenfärbung der Schnitte durchgeführt
(3.5.4). Influenza RNA-positive Zellen haben eine schwarze Färbung, einige sind repräsentativ mit einem Pfeil
markiert (←). Die lichtmikroskopischen Bilder wurden in einer 100fach-Vergrößerung aufgenommen. (URT =
unterer Respirationstrakt).
Die Virustiter-Bestimmung mittels Plaquetest zeigte, dass im ORT von Meerschweinchen
beide 2009 pH1N1 Influenzaviren effizient replizieren können im URT hingegen nur das
HH15 Virusisolat. Virale RNA des HH15 Virus konnte mittels in situ-Hybridisierung jedoch
nicht detektiert werden. Dies lässt darauf schließen, dass zwar infektiöse Viruspartikel in der
Trachea infizierter Tiere vorkommen, das HH15 Virus jedoch nicht aktiv in den Zellen der
Trachea repliziert. Dagegen konnte sowohl in den Lungen HH05- sowie HH15-infizierter
Meerschweinchen vRNA detektiert werden. Dies spricht für eine aktive Replikation beider
2009 pH1N1 Influenzaviren im Lungengewebe. Da jedoch die vRNA des HH15 Virus in
größeren Mengen detektiert wurde, bestätigt dies auch die Annahme, dass das HH15
Influenzavirusisolat, im Vergleich zu HH05, effizienter im URT von Meerschweinchen
repliziert. Darüberhinaus scheint eine HH15-Infektion im Meerschweinchen eine stärkere
Entzündungsreaktion in der Lunge zur Folge zu haben als eine HH05-Infektion.
4.7.2 Transmissionseigenschaften
der
2009
pH1N1
Influenzaviren
im
Untersuchung
der
Meerschweinchen
Meerschweinchen
dienen
als
Modellsysteme
zur
Transmissionseigenschaften von Influenzaviren beschrieben (Lowen et al., 2006). Dabei wird
zwischen einer Kontakt- und einer Aerosol-Transmission unterschieden. Bei der Kontakt-
99
Ergebnisse
Transmission wird die Übertragung von Viren durch einen direkten Kontakt von infizierten zu
nicht-infizierten Tieren untersucht. Bei der Aerosol-Transmission hingegen findet eine
Übertragung über die Luft durch Viruspartikel in größeren Respirationströpfchen (> 5 µm)
oder in kleineren Aerosolen (< 5 µm) des infizierten Organismus statt (Cowling et al., 2013).
In
dieser
Arbeit
wurden
die
Transmissionseigenschaften
der
2009
pH1N1
Influenzavirusisolate im Meerschweinchen charakterisiert. Zur Untersuchung der KontaktTransmission wurden HH05- bzw. HH15-infizierte Tiere insgesamt 14 Tage lang mit einem
Sentineltier im gleichen Käfig gehalten. Für die Analyse einer möglichen Übertragung der
Viren über die Luft wurden jeweils zwei Sentineltiere insgesamt 14 Tage lang in einem Käfig
in 10 cm Entfernung im Luftstrom des Käfigs mit infizierten Tieren gehalten. Die genaue
Größe der Flüssigkeitspartikel konnte dabei nicht bestimmt werden. Durch den Abstand der
Käfige zueinander kann jedoch eine Übertragung von großen Respirationströpfchen
eingegrenzt werden, da diese nicht über größere Strecken in der Luft verbleiben. Jeweils
1, 3, 6 und 9 d p.i. wurden die Virustiter in der Nasenspülung aller Versuchstiere bestimmt
(3.3.6), da vorrangig Viruspartikel aus dem ORT für eine mögliche Transmission
verantwortlich sind. 28 Tage nach Infektion wurden zusätzlich von allen Tieren Blutproben
genommen und das Serum auf Antikörper gegen die 2009 pH1N1 Isolate untersucht (3.4.3;
3.3.5). So sollte festgestellt werden, welche der Sentineltiere durch den Kontakt zum Aerosol
infizierter Tiere serokonvertieren.
Die Virustiter im ORT der HH05- und HH15-infizierten Meerschweinchen für die KontaktTransmission entsprachen den bereits beobachteten Ergebnissen bei der VirustiterBestimmung unter 4.7.1. Beide 2009 pH1N1 Influenzaviren wiesen 1 d p.i. Titer von
durchschnittlich 6 log p.f.u./ml sowie 3 d p.i. Titer um 4 log p.f.u./ml auf (Abb. 27A,B). An Tag
sechs wurde kein Virus mehr im ORT infizierter Tiere nachgewiesen (Abb. 27A,B). In den
Sentineltieren konnte bereits einen Tag nach Kontakt mit infizierten Tieren ebenfalls Virus im
oberen Respirationstrakt nachgewiesen werden (Abb. 27A,B). Die Titer waren allerdings
durchschnittlich etwa 1 - 2 log p.f.u./ml niedriger als bei infizierten Tieren.
Die höchsten Titer im ORT der Sentineltiere waren mit etwa 4 log p.f.u./ml drei Tage nach
Kontakt zu 2009 pH1N1-infizierten Meerschweinchen festzustellen (Abb. 27A,B). Nach sechs
Tagen sanken die Virustiter in der Nasenspülung der Sentineltiere ab und neun Tage nach
Kontakt zu den HH05- und HH15-infizierten Meerschweinchen war kein Virus mehr
nachzuweisen. Die Virustiter der Sentineltiere aus der Kontakt-Transmissionsstudie
unterschieden sich nicht zwischen HH05 und HH15 (Abb. 27A,B).
100
Ergebnisse
Abb. 27: Transmission von HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) im Meerschweinchen. Hartley
Meerschweinchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus
infiziert. Sentineltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht (gestrichelte Linien). A) Zur Untersuchung der
Kontakt-Transmission wurden jeweils eins von zwei infizierte Tieren mit einem von zwei nicht-infizierten Tieren
über den Versuchsverlauf von 14 Tagen in einem Käfig gehalten (3.4.6.) B) Zur Untersuchung der AerosolTransmission wurden jeweils vier Tiere infiziert. Vier nicht infizerte Tiere wurden, während der Versuchsdauer von
14 Tagen in Käfigen in 10 cm Entfernung im Luftstrom der Käfige mit infizierten Tieren gehalten (3.4.6). An Tag
eins, drei, sechs und neun nach Infektion (1,3,6,9 d p.i.) wurde mit mindestens zwei Tieren eine Nasenspülung
durchgeführt (3.4.3). Die Virustiter wurden mittels Plaquetest in der Nasenspülung bestimmt (3.3.6). Die
Detektionsgrenze für die Virustiter lag bei 1,5 log p.f.u./ml Nasenspülung.
Im Aerosol-Transmissionsversuch waren die Virustiter in der Nasenspülung der HH05- oder
HH15-infizierten
Meerschweinchen
ebenfalls
vergleichbar
mit
denen
vorheriger
Infektionsversuche (Abb. 24; Abb. 27). Das HH05 Virus konnte auch im ORT von zwei aus
vier Sentineltieren nachgewiesen werden. Bei einem Tier wurde 6 d p.i. ein Virustiter von
4,8 log p.f.u./ml, bei einem anderen Tier 9 d p.i. mit 2,7 log p.f.u./ml Virus in der
Nasenspülung nachgewiesen (Abb. 27C). Im Gegensatz dazu wurde in Sentineltieren, die im
101
Ergebnisse
Luftstrom von HH15-infizierten Meerschweinchen gehalten wurden, zu keinem der
untersuchten Zeitpunkte Virus im ORT nachgewiesen (Abb. 27D).
Im Serum der HH05- und HH05-infizierten Meerschweinchen konnten 28 Tage nach
Infektion Antikörper gegen das jeweilige Influenzavirus nachgewiesen werden (Abb. 28). Drei
von vier Sentineltiere, die im Luftstrom der HH05-infizierten Meerschweinchen gehalten
wurden, waren 28 Tage nach Versuchsbeginn serokonvertiert. In den Sentineltieren des
Aerosol-Transmissionsversuchs mit dem HH15 Virusisolat konnten hingegen keine
virusspezifischen Antikörper detektiert werden (Abb. 28).
Abb. 28: HAI-Titer im Serum von Meerschweinchen 28 Tage nach HH05 (pH1N1)- und HH15 (pH1N1)Infektion, sowie im Serum von Sentineltieren des Aerosol-Transmissionsversuchs. Hartley
5
Meerschweinchen wurden intranasal mit 10 p.f.u. des HH05 (pH1N1) (A) oder des HH15 (pH1N1) (B)
Influenzavirus infiziert. Zur Untersuchung der Aerosol-Transmission wurden jeweils vier Tiere infiziert. Vier nicht
infizierte Tiere wurden in einem Käfig in 10 cm Entfernung im Luftstrom der Käfige mit infizierten Tieren gehalten
(Abb. 27, 3.4.6). 28 Tage nach Infektion wurden von den infizierten (schwarze Balken) sowie von den
Sentineltieren (weiße Balken) Blutproben entnommen und der HAI-Titer mittels Hämagglutinationsinhibitionstest
mit Hühnererythrozyten im Duplett bestimmt (3.3.5: 3.4.3). Zur Kontrolle wurde jeweils das Serum zweier nicht
infizerter Tiere verwendet und als Schwellenwert für den Graphen genommen.
Die Ergebnisse der Transmissionsversuche lassen darauf schließen, dass die 2009 pH1N1
Influenzaviren in Meerschweinchen effizient über den direkten Kontakt von Tier zu Tier
übertragen werden können. Eine Transmission dieser Influenzaviren über Aerosole hingegen
konnte, im Gegensatz zu HH15, nur für das HH05 Virusisolat mit einer Effizienz von 75 %
mittels Serokonversion gezeigt werden. Die Replikation des HH05 Virus nach Transmission
ist in zwei von drei serokonvertierten Tieren zu detektieren. Die Tiere im Aerosol-Versuch
wurden allerdings in Zweiergruppen gehalten, wodurch das zeitversetzte Auftreten der
HH05-Virustiter in den Sentineltieren auf eine mögliche zusätzliche Kontakt-Transmission
hindeuten könnte. Dies lässt dennoch auf eine hohe Transmissionseffizienz von HH05 über
Aerosole schließen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass HH05 effizient, HH15
dagegen gar nicht, über ein Aerosolbildung infizierter Tiere im Meerschweinchen
transmittieren kann.
102
Ergebnisse
4.8 Charakterisierung
der
2009
pH1N1
Influenzaviren
im
Frettchenmodell
Das Frettchen wird in der Influenzaforschung unter den kleinen Säugermodellen häufig als
„Goldstandard“ verwendet, da sowohl die Pathogenität als auch die Transmission von
humanen Influenzaviren untersucht werden kann (1.3.3; Bouvier und Lowen, 2010). Im
Gegensatz zu Meerschweinchen weisen Frettchen klinische Symptome auf, die denen einer
Influenzaerkrankung im Menschen ähneln. Es können in infizierten Frettchen beispielsweise
Fieber, Rhinitis oder Gewichtsverlust auftreten. Darüber hinaus ähnelt auch die
Rezeptorverteilung im ORT von Frettchen der Rezeptorverteilung im ORT des Menschen. Es
kommen dort überwiegend α-2,6-glykosidisch gebundene Sialinsäuren vor, welche von
humanen Influenzaviren präferenziell als Rezeptor gebunden werden (Connor et al., 1994;
Leigh et al., 1995). Im Meerschweinchen kommen hingegen humane sowie aviäre
Rezeptoren im ORT vor (Sun et al., 2010; Gao et al., 2009). Humane Influenzaviren können
demnach ohne vorherige Adaptation effizient im ORT von Frettchen replizieren und
transmittieren von Tier zu Tier, sowohl über direkten Kontakt als auch über respiratorische
Aerosole (Belser et al., 2011b). Für die weitere Charakterisierung der 2009 pH1N1
Influenzaviren wurden die Replikationseigenschaften, der Tropismus sowie die Transmission
im Frettchen untersucht (4.8.1). Dabei sollte vor allem die Vergleichbarkeit zu
Transmissionsstudien im Meerschweinchenmodell evaluiert werden (4.8.2).
4.8.1 Virustropismus der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Respirationstrakt von
Frettchen
In dieser Arbeit wurde der Virustropismus der 2009 pH1N1 Virusisolate im gesamten
Respirationstrakt untersucht (Abb. 31). Dafür wurden Frettchen intranasal mit 105 p.f.u. von
HH05 oder HH15 infiziert (3.4.2). Zur Bestimmung der Virustiter im ORT wurde an
verschiedenen Tagen nach Infektion (1 - 9 d p.i.) eine Nasenspülung aller Tiere durchgeführt
(3.4.2; 3.4.3; 3.3.6). Im URT, der Trachea und der Lunge wurden die Virustiter nach
Entnahme der Organe jeweils 3 d p.i. und 6 d p.i. bestimmt sowie histologische Schnitte
angefertigt (3.4.3; 3.5.1). Während des Versuchs über den Zeitraum von 14 Tagen wurden
die Versuchstiere zur Kontrolle täglich gewogen und die Körpertemperatur mittels eines,
zuvor in der Zucht subkutan transplantierten, Identifikations-Chips überprüft.
In keinem der 2009 pH1N1-infizierten Frettchen kam es im Versuchsverlauf zu einem
signifikanten Gewichtsverlust (Abb. 29). Anzeichen einer Infektion zeigten die infizierten
Frettchen mit vereinzelt beobachtetem Niesen ab dem dritten Tag und dem Auftreten von
Nasensekret. Ein signifikanter Unterschied zwischen den HH05- und HH15-infizierten
Tiergruppen sowie der Kontrollgruppe konnte jedoch nicht festgestellt werden. Eine erhöhte
103
Ergebnisse
Körpertemperatur aufgrund der 2009 pH1N1-Infektion wurde ebenfalls nicht beobachtet
(Abb. 30). Daraus lässt sich schließen, dass aus klinischer Sicht eine Infektion mit HH05
oder HH15 zu einer milden Erkrankung führt.
Abb. 29: Gewichtsverlust von HH05 (pH1N1)- oder HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen. Frettchen wurden
intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus infiziert. Kontrolltieren wurde
ausschließlich PBS verabreicht. Das Gewicht aller Tiere wurde über 14 Tage nach Infektion (1-14 d p.i.)
dokumentiert und ist hier mit entsprechender Standardabweichung in Prozent zum jeweiligen Ausgangsgewicht
angegeben.
Abb. 30: Körpertemperatur von HH05 (pH1N1)- oder HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen. Frettchen wurden
intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1) Influenzavirus infiziert. Kontrolltieren wurde
ausschließlich PBS verabreicht. Die Körpertemperatur aller Tiere wurde über 14 Tage nach Infektion (1-14 d p.i.)
jeweils morgens und abends dokumentiert. Die Mittelwerte sind hier mit entsprechender Standardabweichung
angegeben.
Die 2009 pH1N1 Isolate replizierten jedoch effizient im oberen Respirationstrakt der
infizierten Frettchen. Einen Tag nach Infektion waren sowohl für HH05-infizierte als auch für
HH15-infizierte Frettchen hohe Virustiter von durchschnittlich 7 log p.f.u./ml im ORT zu
detektieren (Abb. 31A). Nach 3 d p.i. sanken die Titer beider Virusisolate in den
Nasenspülungen um mehr als eine Log-Stufe (Abb. 31A). 6 d p.i. waren die Virustiter im
104
Ergebnisse
ORT der HH15-infizierten Frettchen auf durchschnittlich 3,6 log p.f.u./ml gesunken. Das
HH05 Virusisolat war hingegen nur noch zu signifikant niedrigeren Titern von durchschnittlich
1,8 log p.f.u./ml detektiert (Abb. 31A). Beide 2009 pH1N1 Virusisolate waren 9 d p.i. aus dem
ORT der infizierten Frettchen eliminiert.
Abb. 31: Virustiter in der Nasenspülung, der Trachea und der Lunge von HH05 (pH1N1)- oder HH15
(pH1N1)-infizierten Frettchen. Die Frettchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15
(pH1N1) Wildtypisolats infiziert. Kontrolltieren wurde ausschließlich PBS verabreicht. An Tag eins, drei, vier, fünf,
sechs und neun nach Infektion (1,3,6,9 d p.i.) wurden eine Nasenspülung mit mindestens vier Tieren durchgeführt
(3.4.3). An Tag drei und sechs nach Infektion (3 und 6 d p.i.) wurden die Lunge und die Trachea von jeweils drei
Tieren entnommen (3.4.3). Die Virustiter wurden mittels Plaquetest (3.3.6) in der Nasenspülung und den
Organhomogenaten bestimmt. (ORT = oberer Respirationstrakt; URT = unterer Respirationstrakt). Die
Detektionsgrenze für die Virustiter lag bei 0,5 log p.f.u./ml Nasenspülung bzw. Organhomogenat. Eine
statistische Relevanz wurde durch einen Sudent’s-t-Test ermittelt (* entspricht p≤0,05).
Im URT, der Trachea und der Lunge der 2009 pH1N1-infizierten Frettchen konnte nur 3 d p.i.
Virus detektiert werden (Abb. 31B,C). In der Trachea replizierte HH05 durchschnittlich zu
einem Titer von 5,4 log p.f.u./ml (Abb. 31B), wo hingegen das HH15 Virusisolat zu signifikant
höheren Titern von durchschnittlich 6,0 log p.f.u./ml nachgewiesen wurde. In der Lunge
replizierte das HH15 Virusisolat in zwei von drei Tieren mit 5,5 log p.f.u./ml und
105
Ergebnisse
5,7 log p.f.u./ml ebenfalls zu höheren Titern als HH05, welches durchschnittlich zu einem
Tier von 4,1 log p.f.u./ml replizierte (Abb. 31C). Ein signifikanter Unterschied der Virustiter
von HH15 im Vergleich zu HH05 ergab sich in der Lunge jedoch nicht.
Diese Ergebnisse deuten auf eine effizientere Replikation von HH15 im Vergleich zu HH05,
vor allem im ORT von Frettchen hin, wobei auch im URT tendeziell höhere Virustiter zu
beobachten sind.
Abb. 32: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Trachea und Lunge von HH05 (pH1N1)- und HH15 (pH1N1)infizierten Frettchen. Die Frettchen wurden intranasal mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) oder des HH15 (pH1N1)
Influenzavirus infiziert. Kontrolltiere bekamen ausschließlich PBS verabreicht. An Tag drei nach Infektion wurden
von jeweils drei Tieren die Lunge und die Trachea entnommen (3.4.3). Die RNA des viralen NP-Proteins von
2009 pH1N1 wurde mittels einer radioaktiv markierten in situ-Sonde auf den Gewebeschnitten detektiert (3.5.3)
Anschließend wurde eine H&E-Gegenfärbung der Schnitte durchgeführt (3.5.4). Influenza RNA-positive Zellen
haben eine schwarze Färbung. Die lichtmikroskopischen Bilder wurden in einer 100fach-Vergrößerung
aufgenommen. (ORT = oberer Respirationstrakt; URT = unterer Respirationstrakt).
Für eine weitere Analyse der unterschiedlichen Virustiter im Respirationstrakt der 2009
pH1N1-infizierten Frettchen wurden Viruslast und -tropismus in den Nasennebenhöhlen, der
Trachea und der Lunge auf RNA-Ebene mittels in situ-Hybridisierung von histologischen
Schnitten untersucht (3.5.3).
106
Ergebnisse
Im ORT, in Gewebeschnitten der Nasennebenhöhlen, wurde 3 d p.i. sowohl in HH05- als
auch in HH15-infizierten Frettchen zahlreiche vRNA-positive Zellen nachgewiesen (Abb.
32B,C). Signifikante Unterschiede in der Viruslast zwischen den beiden 2009 pH1N1 Isolaten
wurden nicht festgestellt. In der Trachea wurde die RNA des HH05 Virusisolats nur vereinzelt
detektiert (Abb. 32E). Im Gegensatz dazu wurden vRNA-positive Zellen in der Trachea von
HH15-infizierten
Frettchen
mehrfach,
zum
Teil
in
Ansammlungen
vorkommend,
nachgewiesen (Abb. 32F). Im Lungengewebe von HH05-infizierten Frettchen wies nur eines
von drei Tieren einen Bereich vRNA-positiver Zellen in einem peribronchialen Bereich auf. In
den anderen HH05-infizierten Tieren konnte keine vRNA nachgewiesen werden (Abb. 32H).
Pathologische Veränderungen waren hier, im Vergleich zu den Kontrolltieren, kaum
festzustellen. In den Lungen von HH15-infizierten Frettchen wurden hingegen zahlreiche
vRNA-positive Zellen des Bronchialepithels sowie der Alveolen, einhergehend mit zerstörten
Alveolarstrukturen, detektiert (Abb. 32I).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die 2009 pH1N1 Virusisolate einen milden
Krankheitsverlauf im Frettchen zur Folge haben und sowohl im ORT wie auch im URT
replizieren können. Dabei scheint das HH15 Virusisolat nach einer Infektion zu höheren
Titern im ORT replizieren zu können als HH05. Darüber hinaus kann HH15, im Gegensatz zu
HH05, effizienter in der Trachea replizieren. Dies spricht für einen Replikationsvorteil von
HH15 gegenüber HH05 im ORT und URT von Frettchen.
4.8.2 Transmissionseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Frettchen
Das Frettchenmodell ist nicht nur für eine Charakterisierung der Pathogenität von
Influenzaviren geeignet sondern auch für die Untersuchung der Transmission (Belser et al.,
2011b). Da im Meerschweinchenmodell unter 4.7.2 Unterschiede zwischen beiden 2009
pH1N1 Virusisolaten in der Aerosol-Transmission gezeigt wurden, wurde für einen Vergleich
die Übertragung von Frettchen zu Frettchen speziell mittels Aerosolbildung analysiert. Dabei
wird in dieser Arbeit die Größe der Aerosole nicht definiert. Durch eine Entfernung von 10 cm
der Sentineltiere zu den infizierten Tieren wird jedoch eine mögliche Transmission durch
große Respirationströpfchen (> 5 µm) weitestgehend ausgeschlossen (Cowling et al., 2013).
Nicht-infizierte Sentineltiere wurden einen Tag nach HH05- bzw. HH15-Infektion von
Überträgertieren 14 Tage lang in 10 cm Entfernung im Luftstrom der infizierten Frettchen
gehalten (3.4.6). An mehreren Tagen nach Infektion (1 - 14 d p.i.) wurden die Virustiter im
ORT in Nasenspülungen von jeweils drei Tieren bestimmt (3.3.6). Im Anschluss an den
Versuch wurde das Serum aller Frettchen auf Antikörper gegen die 2009 pH1N1 Isolate
untersucht (3.3.5). Dabei sollte festgestellt werden, welche der Sentineltiere durch den
Kontakt zum Aerosol der infizierten Tiere serokonvertiert sind.
107
Ergebnisse
Abb. 33: Transmission von HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) im Frettchen. Die Frettchen wurden intranasal
mit 105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) (A) oder des HH15 (pH1N1) (B) Wildtypisolats infiziert. Sentineltiere bekamen
ausschließlich PBS verabreicht (gestrichelte Linien). Zur Untersuchung der Aerosol-Transmission wurden die
Sentineltiere einen Tag nach Infektion für die Versuchsdauer von 14 Tagen in Käfigen in 10 cm Entfernung im
Luftstrom der infizierten Tieren gehalten (3.4.6). An mehreren Tagen nach Infektion (1,3, 5, 6, 7, 8, 9 und
14 d p.i.) wurde mit jeweils drei Tieren eine Nasenspülung durchgeführt (3.4.3). Die Virustiter in der
Nasenspülung wurden mittels Plaquetest bestimmt (3.3.6). Die Detektionsgrenze für die Virustiter lag bei 2 log
p.f.u./ml Nasenspülung.
Bei der Virustiter-Bestimmung im ORT der infizierten Tiere wurden beide 2009 pH1N1 Viren
bereits 1 d p.i. zu hohen Titern gemessen (Abb. 33A,B), analog zu den unter 4.8.1.infizierten
Frettchen. 6 d p.i. waren HH05 sowie HH15 aus den ORT der infizierten Frettchen eliminiert.
Das HH05 Influenzavirus wurde ebenfalls bei allen untersuchten Sentineltieren, über einen
Verlauf von vier Tagen, im ORT detektiert (Abb. 33A). Dabei konnten die ersten Virustiter
jeweils 5, 6 und 8 d p.i. mit den höchsten Titern von durchschnittlich 6,7 log p.f.u./ml
nachgewiesen werden. Auch das HH15 Virusisolat wurde im ORT aller untersuchten
Sentineltiere nachgewiesen (Abb. 33B). In zwei von drei Tieren war das HH15 Virusisolat
bereits 3 d p.i. und über eine Dauer von fünf Tagen nachzuweisen, im dritten der
untersuchten
Sentineltiere
war
erstmals
5 d p.i.
Virus
zu
detektieren
mit
einer
anschließenden Dauer von vier Tagen. Dabei waren die maximalen Virustiter des HH15
Virusisolats in den Sentineltieren mit durchschnittlich 5,5 log p.f.u./ml eine Log-Stufe
niedriger als die in den HH05-Sentineltieren (Abb. 33A,B).
Im Anschluss an den Aerosol-Tranmissionsversuch konnten im Serum der HH05- und HH15
infizierten Frettchen erwartungsgemäß Antikörper gegen die 2009 pH1N1 Influenzaviren
nachgewiesen werden (Abb. 34). Auch die Sentineltiere waren nach dem Kontakt zu
möglichen Aerosolen der infizierten Tiere zu 100 % serokonvertiert. In allen Sentineltieren
konnten Antikörper gegen 2009 Influenzaviren zu vergleichbar hohen Titern wie in
experimentell infizierten Frettchen detektiert werden (Abb. 34).
108
Ergebnisse
Abb. 34: HAI-Titer im Serum von Frettchen nach der Infektion mit HH05 (pH1N1) oder HH15 (pH1N1) sowie
im Serum von Sentineltieren im Aerosol-Transmissionsversuch. Die Frettchen wurden intranasal mit
105 p.f.u. des HH05 (pH1N1) (A) oder des HH15 (pH1N1) (B) Influenzavirus infiziert. Zur Untersuchung der
Aerosol-Transmission wurden jeweils drei Tiere infiziert. Nicht-infizierte Sentineltiere wurden in einem Käfig in
10 cm Entfernung im Luftstrom der infizierten Tieren gehalten (Abb. 10; 3.4.6). Nach 14 bzw. 21 Tagen wurden
von den infizierten (schwarze Balken) bzw. von den Sentineltieren (weiße Balken) Blutproben entnommen und
HAI-Titer mittels Hämagglutinationinhibitionstest mit Hühnererythrozyten bestimmt (3.3.5; 3.4.3). Zur Kontrolle
wurden Blutproben vor Versuchsbeginn entnommen und als Schwellenwert für den jeweiligen Graphen
genommen.
Die Ergebnisse des Transmissionsversuches in Frettchen lassen auf eine zu 100 %
effiziente Übertragung beider 2009 pH1N1 Virusisolate durch die Aerosole infizierter Tiere
schließen. Dabei scheint das HH15 Virusisolat jedoch mindestens zwei Tage eher auf die
Sentineltieren zu transmittieren als HH05. Da die Frettchen jeweils zu zweit in Käfigen
gehalten wurden, kann jedoch vermutet werden, dass die Tiere mit zeitversetzten Virustitern
des HH05 Virusisolats durch Kontakt-Transmission infiziert wurden. Darüber hinaus scheint
HH15 nach einer Übertragung zu einer, nach initialer Detektion, länger andauernden
Viruslast in den Sentineltieren zu führen. Demnach kann spekuliert werden, dass HH15
effizienter im Frettchen transmittiert als HH05.
109
Diskussion
5 Diskussion
5.1 Charakterisierung von 2009 pH1N1 Influenzaviren
Die 2009 pH1N1 Influenza verdeutlichte erneut das wiederkehrende Potenzial von
Influenzaviren, Pandemien auszulösen. Die hohe Mutationsrate von Influenzaviren und ihre
Fähigkeit
zu
reassortieren,
bergen
die
Gefahr
der
Interspeziestransmission
und
anschließende Anpassung an den neuen Wirt (Webster et al., 1992).
Durch den Vergleich von aviären und humanen Influenzaviren konnten bereits genetische
Determinanten identifiziert werden, die eine Anpassung an den Menschen mit erhöhter
Pathogenität oder der Fähigkeit von Mensch zu Mensch zu transmittieren ermöglichen. Jene
säugeradaptiven Determinanten, die vor allem in humanen HPAIV Isolaten identifiziert
wurden, kamen jedoch nicht in den 2009 pH1N1 Influenzaviren vor (Neumann et al., 2009;
Garten et al., 2009; Itoh et al., 2009). Die 2009 pH1N1 Influenzaviren besitzen
Genomsegmente aviärer sowie porciner Influenzastämme. Demnach musste angenommen
werden, dass bisher unbekannte Determinanten für die humane Adaptation und Pathogenität
verantwortlich sein müssen. Die ersten sequenzierten 2009 pH1N1 Virusisolate aus
Patienten zeigten, dass diese Viren noch viele typische aviäre Signaturen beinhalten (Garten
et al., 2009; Dawood et al., 2009; Neumann et al., 2009; Chen und Shih, 2009). Daher wurde
eine noch weitergehende Anpassung an den Menschen erwartet, bei der in den bereits
zirkulierenden 2009 pH1N1 Influenzaviren Mutationen auftreten, die die Pathogenität
erhöhen oder eine bereits vorhandene Immunität umgehen können.
Um die 2009 pH1N1 Influenzaviren in dieser Arbeit zu charakterisieren, wurden Virusisolate
von zwei Patienten miteinander sowie mit anderen bereits charakterisierten Influenzaviren
anderer Stämme verglichen. Das erste Isolat HH05 wurde zwei Monate nach Ausbruch der
Pandemie von einer Patientin entnommen, die aus Mexiko kam, wo die Pandemie
höchstwahrscheinlich ihren Ursprung hatte (Fraser et al., 2009). Das zweite Isolat HH15
wurde über einen Monat später von einem Besucher aus New York isoliert. Die Patienten
hatten beide einen milden Krankheitsverlauf, erhielten jedoch bereits wenige Tage nach
Auftreten der Symptome eine antivirale Medikation mit Oseltamivir (4.1). Eine Spekulation
über den Krankheitsverlauf der beiden Patienten ohne Behandlung ist daher nicht möglich,
da die zeitnahe Behandlung mit Oseltamivir oder Zanamivir in vielen 2009 pH1N1-infizierten
Patienten
ohne
zusätzliche
Risikofaktoren
oder
Vorerkrankungen
einen
schnellen
Genesungsprozess zeigte (Smith et al., 2010).
Sequenzanalysen von HH05 und HH15 wiesen zwölf verschiedene Aminosäureaustausche
zwischen beiden Isolaten auf (4.2). Der Genotyp des HH05 Virusisolats weist eine höhere
110
Diskussion
Homologie zu den Sequenzen auf, welche sehr früh in der Pandemie isoliert und sequenziert
wurden, wie z.B. das Referenzisolat A/California/04/2009 (Zhang und Chen, 2009). Vier von
zwölf Mutationen im etwa einen Monat später isolierten HH15 (HA S202T, NA N248D, NP
V100I, NS I123V) traten hingegen verstärkt ab Juni 2009 in 2009 pH1N1 Viren auf (Pan et
al., 2010). Vor allem HA S202T, NP V100I sowie zwei weitere HH15-spezifische Mutationen
im NP (I133L, I373T) sind noch heute vorrangig in den 2009 pH1N1 Influenzaviren enthalten
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ sutils/blast_table.cgi?taxid= 11308&selectall). Dies deutet auf
einen Selektionsvorteil gegenüber den vorherigen Aminosäureresubstitutionen hin, die in
HH05 enthalten sind. Weitere Veröffentlichungen zeigten, dass diese sowie weitere HH15spezifische Positionen (NA 106, NP 373, PB2 340, PA 581) als Marker für eine Aufteilung
der 2009 pH1N1 Viren in monophyletische Gruppen dienten (Pan et al., 2010; Lee et al.,
2010; Nelson et al., 2009; Fereidouni et al., 2009). Eine weitere Evaluation von zwei dieser
Mutationen im HA, K340N und S202T, ergaben jedoch keinen signifikanten Zusammenhang
zu schwerwiegenderen Krankheits- oder häufigeren Todesfällen (Lee et al., 2010; WHO,
2010; Ding et al., 2010). Diese Analysen basierten allerdings lediglich auf statistischen
Berechnungen gemeldeter Fälle und nicht auf experimentellen Untersuchungen einzelner
Mutationen wie in der vorliegenden Arbeit.
Es wurde zunächst das Wachstumsverhalten der zwei klinischen Isolate (HH05 und HH15)
auf humanen Lungenepithelzellen untersucht (4.3), wobei die Replikationseigenschaften der
2009 pH1N1 Viren denen von alt-saisonalen H1N1 Influenzaviren entsprachen, die 2006
zirkulierten. Das HH15 Virusisolat replizierte jedoch zu etwa einer Log-Stufe höheren Titern
als HH05. Dies spricht dafür, dass HH15 durch Mutationen eine höhere Replikationseffizienz
in humanen Zellen erworben haben könnte. Ob dieser Replikationsvorteil auch im
Säugerorganismus zu beobachten ist und möglicherweise zu einer erhöhten Pathogenität
oder Transmissibilität beiträgt, wurde weitergehend in dieser Arbeit untersucht. Eine
vergleichbare Replikationseffizienz der 2009 pH1N1 zu alt-saisonalen Influenzaviren wurde
bereits in der Literatur beschrieben (Itoh et al., 2009; Chan et al., 2010; Octaviani et al.,
2011). In einer erst kürzlich veröffentlichten Studie replizierte ein 2009 pH1N1 Influenzavirus
eines letalen Falls zu signifikant höheren Titern als das Virus eines milden Krankheitsfalls
(Rodriguez
et
al.,
2013).
Eine
Korrelation
der
in
dieser
Arbeit
beschriebenen
Replikationsunterschiede zum Krankheitsverlauf konnte aufgrund einer Medikation der
Patienten, wie oben diskutiert, nicht untersucht werden.
Insgesamt bieten die beiden in dieser Arbeit verwendeten klinischen 2009 pH1N1
Virusisolate zwei Modellsysteme, um Pathogenitätsdeterminanten der 2009 pH1N1
Influenzaviren zu identifizieren und charakterisieren: HH05 als frühes 2009 pH1N1 Isolat mit
einer hohen Homologie zu den ersten identifizierten 2009 pH1N1 Influenzaviren und HH15
111
Diskussion
mit genetischen Signaturen, die sich später in der Pandemie durchgesetzt haben und auf
einen Selektionsvorteil hindeuten. Die Relevanz der genetischen Unterschiede im Phänotyp
der beiden Isolate wird in dieser Arbeit eingehend evaluiert.
5.2 Unterschiedliche Pathogenitätsdeterminanten für 2009 pH1N1 und
humane H5N1 Influenzaviren im Mausmodell
Für eine Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren wurden in dieser Arbeit zwei
klinische Virusisolate mit einem alt-saisonalen H1N1 aus 2006 sowie einem humanen HPAIV
H5N1 von einem tödlichem Krankheitsverlauf (Puthavathana et al., 2005) in zwei
verschiedenen Mäusestämmen (BALB/c und C57BL/6J) verglichen. Beide Mausmodelle
werden häufig in der Influenzaforschung verwendet. Das alt-saisonale H1N1 Influenzavirus
war, wie bereits in der Literatur beschrieben, niedrigpathogen mit einer Überlebensrate von
100 % in beiden Mäusestämmen (4.4.1; Tumpey et al., 2005; Glaser et al., 2007). Das
humane H5N1 Isolat hingegen zeigte in beiden Mausmodellen eine hohe Pathogenität mit
100 % Letalität (4.4.1) trotz niedrigerer Infektionsdosis. Eine hohe Virulenz von humanen
H5N1 Influenzaviren in BALB/c Mäusen wurde ebenfalls in früheren Publikationen gezeigt
(Prabhu et al., 2009; Lu et al., 1999). Im Respirationstrakt von Mäusen herrschen in erster
Linie Rezeptoren aviärer Influenzaviren vor. Demnach ist die Replikation aviärer Viren dort
hocheffizient und führt zu einer hohen Virulenz (Ibricevic et al., 2006). Im Kontrast zu dem
alt-saisonalen H1N1 und den humanen H5N1 Influenzaviren wiesen die zwei 2009 pH1N1
Viren eine differenzielle Pathogenität in den zwei Maustämmen auf (4.4.1). In BALB/c
Mäusen
waren
die
2009
H1N1
Influenzaviren
mit
Überlebensraten
von
100 %
niedrigpathogen, vergleichbar zum alt-saisonalen H1N1 Virus. C57BL/6J Mäuse waren
hingegen empfänglicher für die 2009 pH1N1 Influenzaviren. Im diesem Mausstamm führten
beide Virusisolate zu einer erhöhten Pathogenität. HH05 führte zu einer Letalität von 34 %.
HH15 war im Vergleich dazu 50-fach virulenter mit einer Letalität von 100 %. Demnach sind
die 2009 pH1N1 Influenzaviren pathogen für C57BL/6J jedoch nicht für BALB/c Mäuse.
Mäuse des BALB/c Stammes wurden bereits mehrfach für die Charakterisierung von pH1N1
Isolaten verwendet (Itoh et al., 2009; Maines et al., 2009; Belser et al., 2010). In den
Veröffentlichungen dazu wird die 2009 pH1N1 Influenza überwiegend als niedrigpathogen für
BALB/c Mäuse beschrieben, vergleichbar zu der von alt-saisonalen Influenzaviren. Eine
erhöhte Pathogenität wurde nur in einzelnen Fällen mit höheren Infektionsdosen in BALB/c
Mäusen beobachtet (Rodriguez et al., 2013). Dies korreliert mit der in dieser Arbeit
beobachteten niedrigen Pathogenität der 2009 pH1N1 Isolate in BALB/c Mäusen (4.4). Das
C57BL/6J Mausmodell wurde anfangs nur in einzelnen Fällen für die Charakterisierung der
2009 pH1N1 Influenza verwendet, wobei nur für ein Isolat eine erhöhte Pathogenität gezeigt
112
Diskussion
wurde (Manicassamy et al., 2010). Um humane Influenzaviren im Mausmodell zu
charakterisieren,
werden
diese
aufgrund
der
meist
niedrigen
Pathogenität
und
Empfänglichkeit in der Maus meist durch serielle Passagen an den Wirt adaptiert (Hirst,
1947; Brown, 1990; Gabriel et al., 2005). Dabei akkumulieren adaptive Mutationen der Maus,
die eine Untersuchung des ursprünglichen Genotyps erschweren. Die in der vorliegenden
Arbeit beobachtete Empfänglichkeit und Pathogenität der beiden klinischen 2009 pH1N1
Influenzaviren in der C57BL/6J Maus ermöglicht eine weitergehende Charakterisierung
dieser Viren ohne eine vorherige Adaptation zum Tiermodell. Die erhöhte Pathogenität der
2009 pH1N1 Influenzaviren im Vergleich zu alt-saisonalen, konnte auch in weiteren
etablierten Pathogenitätsmodellen für Influenzaviren wie Frettchen, Schweinen und Makaken
beobachtet werden (Itoh et al., 2009; Maines et al., 2009; Munster et al., 2009). Im Vergleich
zu alt-saisonalen Influenzaviren korreliert die erhöhte Pathogenität der 2009 pH1N1 Viren in
Säugermodellen, wie hier in C57BL/6J Mäusen, mit der höheren Mortalität und mitunter
schweren Krankheitsverläufen der 2009 pH1N1 Influenza (1.2.2).
Bereits bekannte virale Determinanten von HPAIV, die die Pathogenität und Empfänglichkeit
von Influenzaviren für den Säuger beeinflussen, wie beispielsweise die PB2 Mutation E627K,
sind nicht in den 2006 pH1N1 Isolaten präsent. Eine artifizielle Einführung dieser Marker in
2009 pH1N1 Influenzaviren führte zu keiner gesteigerten Pathogenität in BALB/c Mäusen
(Garten et al., 2009; Itoh et al., 2009; Herfst et al., 2010). Da in dieser Arbeit jedoch gezeigt
wurde, dass die 2009 pH1N1 Virusisolate nur in C57BL/6J und nicht in BALB/c Mäusen eine
erhöhte Pathogenität und Virulenz aufweisen, kann davon ausgegangen werden, dass ein
möglicher Einfluss dieser Pathogenitätsdeterminanten erst im C57BL/6J Modell sichtbar
werden
würde.
Deshalb
sollte
eine
artifizielle
Einführung
dieser
bekannten
Pathogenitätsdeterminanten sowie die Identifikation von neuen Determinanten zukünftig in
den hier verwendeten C57BL/6J Mäusen untersucht werden.
Nach einer Influenzavirusinfektion sind der Virustiter im primären Zielorgan der Lunge sowie
deren Pathologie wichtige Hinweise auf die vom Virus dort verursachte Viruslast und
Entzündungsreaktion. Die Virustiter sowie der Grad der Entzündungsreaktion in der Lunge
von infizierten BALB/c Mäusen spiegelte sich in der niedrigen bzw. hohen Pathogenität von
alt-saisonalen H1N1 bzw. humanen H5N1 Influenzaviren wider (4.4). Die im Vergleich zu altsaisonaler H1N1 Influenza höheren Virustiter und eine stärkere Entzündungsreaktion in der
Lunge nach 2009 pH1N1-Infektion korrelierte im BALB/c Mausmodell jedoch nicht mit der
dort beobachteten niedrigen Pathogenität. Die Viruslast und der Entzündungsgrad der Lunge
von infizierten C57BL/6J Mäusen korrelierten dagegen mit der Pathogenität und Virulenz von
allen
hier
untersuchten
Influenzaviren.
Die
niedrigsten
Titer
und
der
geringste
Entzündungsgrad waren nach alt-saisonaler H1N1-Infektion zu beobachten und die höchsten
113
Diskussion
Virustiter und die am stärksten beeinträchtigte Lungenpathologie nach H5N1-Infektion (4.4.2;
4.4.3). Dies war jedoch nur bei einer Detektion der Viruspartikel in der Lungenhistologie,
nicht aber in einer Titerbestimmung in Lungenhomogenaten sichtbar. Demzufolge ist die
Viruslast in den Lungen infizierter BALB/c Mäuse kein Korrelat für die Pathogenität
verschiedener Influenzaviren. Dass in der Titerbestimmung von infektiösen Partikeln
Lungenhomogenaten der infizierten C57BL/6J Mäuse kein Unterschied für die verschieden
pathogenen Influenzaviren zu sehen ist, könnte an der Viruselimination des Wirts liegen.
Freie Viruspartikel, nach Freisetzung oder der Lyse von Zellen, werden vom Immunsystem
detektiert und eliminiert. Geschieht dies aufgrund von Wirtsfaktoren für verschiedene
Influenzaviren unterschiedlich schnell oder effizient, könnten einzelne Zeitpunkte im
Infektionsverlauf einen Vergleich der tatsächlichen Viruslast erschweren. Bei einer direkten
Immunfärbung oder RNA-Hybridisierung werden hingegen aktiv replizierende Viren
detektiert.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren andere
Pathogenitätsdeterminanten besitzen als humane H5N1 Influenzaviren, da eine erhöhte
Viruslast und eine stärkere Entzündungsreaktion im Gegensatz zu humanen H5N1
Influenzaviren in 2009 pH1N1-infizierten BALB/c Mäusen keinen Einfluss auf die Virulenz
haben.
Humane H5N1 Influenzaviren können, wie im Menschen beschrieben, auch in der Maus eine
extrapulmonale Virusausbreitung zur Folge haben (Wright et al., 2007; Gabriel et al., 2009).
Dies konnte in der vorliegenden Arbeit im BALB/c Mausmodell ebenfalls gezeigt werden
(4.4.2). Darüber hinaus wurden hohe Titer des höher pathogenen 2009 pH1N1 Virus HH15
im Darm von infizierten C57BL/6J Mäusen detektiert. In immunhistologischen Färbungen von
Darmschnitten der infizierten Mäuse konnten jedoch keine aktiv replizierenden Viren
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Der Virusnachweis im Darm lässt daher auf
eine vorausgegangene Virämie schließen. Bisher wurde eine virale Ausbreitung über den
Blutkreislauf experimentell meist nur für HPAIV gezeigt (Rimmelzwaan et al., 2006; Gabriel
et al., 2009; Gao et al., 1999), auch gibt es vereinzelt klinische Berichte, in denen eine
Virämie bei humanen H5N1 Influenzavirusinfektionen nachgewiesen wurde (Beigel et al.,
2005; Likos et al., 2007). Während der 2009 Pandemie waren gastrointestinale Beschwerden
ein häufiges Symptom bei 2009 pH1N1-Erkrankten, was auf eine extrapulmonale
Virusausbreitung hindeuten könnte (Dawood et al., 2009; Riquelme et al., 2009).
Dementsprechend
wurden
auch
bei
2009
pH1N1-Patienten
mit
schweren
Krankheitsverläufen Virustiter im Blut nachgewiesen (To et al., 2010; Oughton et al., 2011).
Eine weitere Untersuchung einer Virämie sowie von weiteren Organen nach HH15-Infektion
114
Diskussion
ist demnach von großem Interesse, da eine extrapulmonale Virusausbreitung, wie hier mit
HH15 vermutet wird, zu hoher Morbidität und Mortalitäten führen kann.
Ein signifikantes Korrelat der Pathogenität und Virulenz von alt-saisonalen H1N1, 2009
pH1N1 und humanen H5N1 Influenzaviren in beiden Mausstämmen zeigte sich in der
Analyse des Blutbildes infizierter Tiere (4.4.4). In beiden Mausstämmen, infiziert mit
humanen H5N1 Viren, sowie in 2009 pH1N1-infizierten C57BL/6J Mäusen, konnte eine
Lymphozytendepletion im Blut nachgewiesen werden. Dies korrelierte mit einer erhöhten
Pathogenität sowie Letalität im jeweiligen Mausstamm. Eine Lymphopenie wurde bereits für
Infektionen mit HPAIV im Säuger einhergehend mit hoher Letalität beobachtet (Gabriel et al.,
2009; Maines et al., 2008). Nach Ausbruch der 2009 Pandemie gab es vereinzelte Berichte
von verringerten Lymphozytenwerten mit steigender Viruslast (To et al., 2010). Auch in den
Patienten, von denen die in dieser Arbeit untersuchten 2009 pH1N1 Isolate isoliert wurden,
war die Gesamtzahl der Leukozyten verringert (4.1). Das Auftreten einer Lymphopenie ist
demnach, wie hier gezeigt, ein Indikator für erhöhte Virulenz zum einen für unterschiedliche
Influenzaviren, zum anderen auch in Mausstämmen mit unterschiedlichem genetischem
Hintergrund.
Die Mausstämme BALB/c und C57BL/6J unterschieden sich nicht nur phäno- sondern auch
genotypisch voneinander (The Jackson Laboratories: www.jax.org). Einer der am besten
untersuchten genetischen Unterschiede ist eine Polarisierung der adaptiven Immunantwort
(Heinzel et al., 1989; Liblau et al., 1995). Während C57BL/6J Mäuse eine stärkere zelluläre
Immunantwort ausbilden, vermittelt über Typ 1 T-Helferzellen (Th1), reagiert das
Immunsystem von BALB/c Mäusen mit stärkerer Gewichtung einer humoralen Typ 2 ThAntwort (Kidd, 2003). So wurden in dieser Arbeit einige wesentliche Th1- und Th2-Zytokine
nach einer Influenzainfektion in beiden Mausmodellen, evaluiert (4.4.5). Es wurden generell
hohe Expressionslevel der Zytokine in H5N1-infizierten Tieren beider Mausstämme
beobachtet. Eine stark erhöhte Zytokinantwort kann im Organismus oft nicht mehr
rückkoppelnd reguliert werden und daher eine Verschlechterung des Krankheitsverlaufs zur
Folge haben. Dies zeigte sich in einer Letalität von 100 % in den H5N1-infizierten Mäusen. In
der Literatur ist dies als „Zytokinsturm“ bekannt und wurde zuvor in H5N1- oder H7N7infizierten Mäusen beobachtet (Szretter et al., 2007;Gabriel et al., 2009). Ein Zytokinsturm
wurde auch mit letalen H5N1-Infektionen im Menschen in Verbindung gebracht (de Jong et
al., 2006). Eine Infektion mit den 2009 pH1N1 Influenzaviren hatte in dieser Arbeit in BALB/c
Mäusen eine höhere Zytokinexpression zur Folge als im C57BL/6J Modell (4.4.5). Besonders
das Th1-Zytokin IFN-γ und die Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 wurden in BALB/c Mäusen in
großen Mengen detektiert. Im Gegensatz dazu waren IL-4 und IL-10 in den 2009 pH1N1infizierten C57BL/6J Mäusen, einhergehend mit erhöhter Pathogenität und Virulenz, gar nicht
115
Diskussion
zu detektieren. Es existiert ein Bericht in dem IL-10 auch in pH1N1-infizierten Patienten
herabreguliert war (Liu et al., 2012). Das führt zu der Vermutung, dass die Th2-Zytokine IL-4
und IL-10 im Krankheitsverlauf der 2009 pH1N1-infizierten BALB/c Mäuse eine vorteilhafte
Rolle spielen könnten. Dies bedarf jedoch genauerer Untersuchungen, die sich neben den
sezernierten Zytokinen auch auf die T-Helferzellen direkt beziehen. In der Literatur konnte
bereits gezeigt werden, dass zelluläre Modulatoren, die eine IL-4 Expression in
Influenzavirus-infizierten Mäusen erhöhen, die Letalität reduzieren können (Aldridge et al.,
2009). Die Rolle von IL-10 im Infektionsverlauf von Influenzaviren wurde ebenfalls bereits
untersucht, wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert, da ein Fehlen dieses Zytokins
zum einen mit vorteilhaften zum anderen mit negativen Auswirkungen auf den
Infektionsverlauf infizierter Mäuse beschrieben worden ist (McKinstry et al., 2009; Sun et al.,
2009). Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten allerdings darauf hin, dass eine 2009 pH1N1Infektion in BALB/c Mäusen eine andere Immunantwort als in C57BL/6 Mäusen auslöst, sich
jedoch
die
wirtsspezifische
Immunantwort
nach
einer
H5N1-Infektion
in
beiden
Mausmodellen ähnelt.
Pathogenitätsdeterminanten der 2009 pH1N1 Influenza scheinen im BALB/c Mäusestamm
im Gegensatz zu C57BL/6J Mäusen maskiert zu sein. Dies ist nur für die 2009 pH1N1
Influenzaviren der Fall und verdeutlicht, dass für diese Influenzaviren andere, vor allem
wirtsspezifische Determinanten, eine entscheidende Rolle für die Pathogenität spielen als für
humane H5N1 Influenzaviren. Vor allem die Immunantwort des jeweiligen Wirts scheint
ausschlaggebend zu sein, da eine erhöhte Virusreplikation allein nicht für die erhöhte
Pathogenität verantwortlich ist. Für die Charakterisierung von 2009 pH1N1 Influenzaviren
sollte demnach künftig das C57BL/6J Mausmodell verwendet werden. Wie im nächsten
Punkt diskutiert, kann es dazu dienen, neue noch unbekannte Pathogenitätsdeterminanten
der 2009 pandemischen H1N1 Influenza zu identifizieren.
5.3 Differenzielle Pathogenität von 2009 pH1N1 Influenzaviren im
C57BL/6J Modell
Wie unter 5.2 diskutiert, wiesen die zwei klinischen 2009 pH1N1 Virusisolate im Vergleich zu
alt-saisonalen Influenzaviren eine erhöhte Pathogenität im C57BL/6J Modell auf. In diesem
Mausmodell waren auch zwischen den zwei untersuchten Isolaten Unterschiede in
Pathogenität und Virulenz zu beobachten (4.4). Das 2009 pH1N1 Influenazavirus HH15 war
im C57BL/6J Mausmodell 50-fach virulenter als das HH05 Virusisolat. Die Unterschiede in
der Pathogenität der 2009 pH1N1 Viren spiegeln sich auch in der Pathologie der Lunge
infizierter C57BL/6J Mäuse wider. Diese zeigten eine stärkere Infiltration und Destruktion in
HH15-infizierten Mäusen im Vergleich zu HH05-infizierten (4.4.3). Des Weiteren war eine
116
Diskussion
höhere Viruslast in der Lunge der HH15-infizierten C57BL/6J Mäuse als in HH05-infizierten
zu detektieren. Hinweise auf eine Virämie wurden ebenfalls nur nach Infektion mit dem höher
pathogenen HH15 Virus in den C57BL/6J Mäusen festgestellt. Die ebenfalls unter 5.2
diskutierte auftretende Lymphopenie als Korrelat von Pathogenität und Virulenz für
Influenzaviren in beiden Mäusestämmen zeigt ebenfalls Unterschiede zwischen den beiden
pH1N1 Isolaten in der C57BL/6J Maus (4.4.4). Drei Tage nach Infektion mit beiden 2009
pH1N1 Influenzaviren sind die Lymphozyten im Blut der Mäuse depletiert, nach sechs Tagen
hingegen nur noch in HH15-infizierten Mäusen. Demzufolge korreliert auch der Grad einer
Lymphopenie mit einer höheren Pathogenität und Virulenz im C57BL/6J Mausmodell.
Differenzielle Pathogenität für verschiedene 2009 pH1N1 Influenzaviren wurde auch in
anderen etablierten Säugermodellen wie Frettchen und Makaken gezeigt (Safronetz et al.,
2011; Maines et al., 2009). Diese Unterschiede in Pathogenität für verschiedene 2009
pH1N1 Virusisolate korrelieren mit der Beobachtung, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren
während der Pandemiephase sehr unterschiedliche Krankheitsverläufe zur Folge hatten. Die
Mehrzahl der Betroffenen wies eine milde Influenzaerkrankung auf. Andere, darunter
auffallend viele junge immunkompetente Erwachsene, erlitten schwere Krankheitsverläufe,
mitunter mit Todesfolge (Karageorgopoulos et al., 2011; Dawood et al., 2009; Dawood et al.,
2012). Dabei benötigten Patienten mit schweren 2009 pH1N1-Erkrankungen oftmals
künstliche Beatmung aufgrund einer viralen Pneumonie (Gill et al., 2010). Die in dieser Arbeit
beobachtete stärkere Entzündungsreaktion und Viruslast in der Lunge von HH15-infizierten
C57BL/6J Mäusen könnte daher für eine höhere Pathogenität sprechen. Zumal allein eine
höhere Viruslast, wie sie für HH15 auch in humanen Zellen gezeigt wurde, zu einem
schwereren Krankheitsverlauf führen könnte. Hohe Mortalitätsraten, assoziiert mit der 2009
pH1N1 Pandemie, traten vor allem bei Menschen mit vorliegenden Vorerkrankungen auf
(Dawood et al., 2012). Liegt bereits eine immunschwächende Erkrankung vor, können
bereits geringe Unterschiede, wie beispielsweise ein höherer Virustiter, zu einer erheblich
schwereren Erkrankung führen. Die Patienten, von denen die beiden in dieser Arbeit
charakterisierten 2009 pH1N1 Influenzaviren isoliert wurden, wiesen keine signifikanten
Unterschiede im Krankheitsverlauf auf, was wahrscheinlich auf die zeitnahe Behandlung mit
antiviralen Medikamente zurück zu führen ist. Auch waren in beiden Patienten keine
Ko-Morbiditäten bekannt, die den Grad der Erkrankung hätten zusätzlich beeinflussen
können (4.1).
Die differenzielle Pathogenität von HH05 und HH15 in C57BL/6J Mäusen kann aufgrund der
unter 5.1 diskutierten Sequenzunterschiede der beiden Virusisolate die Identifizierung und
Charakterisierung von adaptiven Pathogenitätsdeterminanten, die während der Pandemie
auftraten, ermöglichen.
117
Diskussion
5.4 Einzelne Mutationen in NP und HA sind für die differenzielle
Pathogenität im C57BL/6J Modell verantwortlich
In C57BL/6J Mäusen zeigten die in dieser Arbeit charakterisierten klinischen 2009 pH1N1
Influenzaviren eine differenzielle Pathogenität und Virulenz, welche mit dem Grad der
Entzündungsreaktion in der Lunge sowie dem Grad einer Lymphopenie korrelierten (5.3). Da
sich die beiden Influenzavirusisolate nur in zwölf Aminosäuresubstitutionen unterscheiden,
müssen unter diesen auch virale Determinanten zu identifizieren sein, die zu der
differenziellen Pathogenität beitragen. Um diese festzustellen, wurden mittels reverser
Genetik rekombinante 2009 pH1N1 Viren generiert (4.5.1). Ein großer Vorteil der reversen
Genetik ist es, gezielt einzelne Mutationen in rekombinante Viren einzuführen, um deren
Rolle hinsichtlich der Pathogenität zu untersuchen (Stech et al., 2008). Die rekombinanten
Viren wurden anschließend hinsichtlich Pathogenität und Virulenz im C57BL/6J Modell im
Vergleich zu den parentalen Viren der klinischen 2009 pH1N1 Influenzaisolate untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass rekombinante 2009 pH1N1 Viren, welche die HH15-spezifische
HA Mutation S202T oder die HH15-spezifischen NP Mutationen V100I, I133L und I373T im
genetischen Hintergrund von HH05 enthielten, eine vergleichbar hohe Pathogenität und
Virulenz im C57BL/6J Modell haben wie das klinische HH15 Isolat (4.5.2). Diese Mutationen
führten dabei nicht nur in Kombination sondern auch einzeln zu einer erhöhten Virulenz im
Vergleich zu HH05 und einer stärkeren Infiltration oder Viruslast in der Lunge der infizierten
Mäuse. Die beobachteten Unterschiede in der Lungenpathologie könnten darauf hindeuten,
dass die einzelnen Mutationen mit unterschiedlichen Mechanismen zu der erhöhten
Pathogenität in der Lunge von C57BL6/J Mäusen beitragen. Eine höhere Viruslast kann
beispielsweise
zu
einer
ähnlich
schweren
Erkrankung
führen
wie
eine
stärkere
Immunsuppression. Um das in dieser Arbeit beschriebene Virulenz-Korrelat einer länger
andauernden Lymphopenie zu untersuchen, wurden ebenfalls die Blutbilder der infizierten
Mäuse analysiert (4.5.2.3). Auch hier wiesen die rekombinanten Viren mit den HH15spezifischen Mutationen im HA und NP eine signifikant stärkere Lymphozytendepletion auf
als das HH05 Virusisolat. Demnach sind einzelne HH15-spezifische Mutationen im HA und
NP für die hier beobachtete differenzielle Pathogenität der 2009 pH1N1 Viren im C57BL/6J
Modell verantwortlich.
Die HH15-spezifische HA Mutation S202T, die zu einer erhöhten Pathogenität beiträgt, liegt
in einer Antigenbindestelle des Oberflächenproteins (4.6; Bouvier und Palese, 2008). Ein
Einfluss auf Unterschiede in der Antigenität von HH15 im Vergleich zu HH05 wäre daher ein
denkbarer Mechanismus, der zu der erhöhten Pathogenität beitragen könnte. Daher sollten
weiterführende Studien zur Antigenität von HH05 und HH15 für verschiedene Antikörper
durchgeführt werden. Es wurde beschrieben, dass im Serum von Erwachsenen Antikörper
118
Diskussion
identifiziert wurden, die zwar mit den 2009 pH1N1 Viren kreuzreagieren, aber keine
schützende Immunantwort gegen das Virus vermitteln (Monsalvo et al., 2011). Sollte die
S202T Mutation einen solchen Effekt auf die Antigenität haben, würde dies die hohe Virulenz
in Verbindung mit wirtspezifischen Determinanten erklären. Des Weiteren ist die S202T
Mutation in der Domäne lokalisiert, welche die Rezeptorbindung während einer
Influenzainfektion vermittelt. Die Position 202 liegt nicht direkt in der Rezeptorbindetasche
des Proteins. Dennoch ist ein indirekter Einfluss auf die Rezeptorbindeeigenschaften
denkbar. Die Rezeptorbindeeigenschaften von HH15 im Vergleich zu HH05 sowie dem
rekombinanten Virus mit der HH15-spezifischen HA Mutation S202T wurden hier anhand der
Hämagglutination von Erythrozyten untersucht. Hierbei zeigten alle 2009 pH1N1 Viren eine
vergleichbare Bindungspräferenz von humanen Virusrezeptoren (4.6.1). In der Literatur
wurde beschrieben, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren humane α2,6-ständige Sialinsäuren
stärker binden als aviäre α2,3-ständige (Yang et al., 2010; Childs et al., 2009). Um eine Rolle
der
HH15-spezifischen
HA
Mutation
für
die
erhöhte
Pathogenität
aufgrund
von
verschiedenen Rezeptorbindeeigenschaften auszuschließen, sollte jedoch die spezifische
Bindungspräferenz an α2,3- und α2,6-ständige Sialinsäuren untersucht werden. Dabei
sollten ebenfalls die seltener untersuchten α2,8-ständigen Sialinsäuren mit einbezogen
werden, da Influenzaviren auch diese binden können (Wu und Air, 2004). Eine stärkere
Bindung des HH15 im Vergleich zu HH05 von solchen zusätzlichen Rezeptoren könnte zu
einer erhöhten Infektionseffizienz führen. Es wurde bereits eine andere HA Position in 2009
pH1N1 Viren identifiziert, an der eine Mutation die Rezeptorbindeeigenschaft der 2009
pH1N1 Influenzaviren verändert (Chutinimitkul et al., 2010; Liu et al., 2010). Die D222G
Mutation tritt vermehrt im HA Protein von 2009 pH1N1 Influenzaviren auf und wurde mit
schweren
Krankheitsverläufen
assoziiert.
Diese
Mutation
führt
zu
einer
breiteren
Rezeptorspezifität der 2009 pH1N1 Viren mit einer erhöhten Präferenz für aviäre
Virusrezeptoren (WHO, 2010; Chen et al., 2010; Chutinimitkul et al., 2010; Liu et al., 2010).
Eine erhöhte Pathogenität in der Maus von 2009 pH1N1 Viren mit dieser Mutation konnte
ebenfalls gezeigt werden (Zheng et al., 2010; Belser et al., 2011a). Die in dieser Arbeit
charakterisierten 2009 pH1N1 Isolate enthielten beide die ursprüngliche 222D Signatur im
HA Protein.
Die drei Mutationen von HH15 in NP, V100I, I133L und I373T, trugen ebenfalls zu einer
erhöhten Pathogenität in C57BL/6J Mäusen bei (4.5.2). Da alle drei der NP Mutationen in
Bereichen des Proteins liegen, die im viralen RNP-Komplex mit dem Polymereaseprotein
PB2 interagieren, wurde ein möglicher Einfluss auf die Polymeraseaktivität mittels eines
in vitro Reporter-assays analysiert (4.6.2). Der Polymerasekomplex des HH15 Virus zeigte
im Vergleich zu dem des HH05 Virus eine deutlich reduzierte Aktivität. Dies ist ein
unerwartetes Ergebnis, da das HH15 Virus in humanen Lungenzellen sowie in der Lunge
119
Diskussion
von C57BL/6J Mäusen einen Replikationsvorteil im Vergleich zu HH05 aufwies. Eine erhöhte
Pathogenität geht in der Regel mit einer effizienten Aktivität der viralen Polymerase in
Säugerzellen einher (Gabriel et al., 2005; Hudjetz und Gabriel, 2012). Die effizientere
Replikation von HH15 scheint daher nur im Kontext des vollständigen Virus aufzutreten. Die
niedrige Polymeraseaktivität könnte jedoch auch dafür sprechen, dass für die beobachtete
höhere Virusreplikation von HH15 nicht die intrinsische Aktivität der Polymerase, sondern
andere virale oder zelluläre Faktoren beitragen. So würde eine effizientere, vom Virus
vermittelte, Immunsuppression des Wirts auch zu einer effizienteren Virusreplikation führen.
Die Untersuchung der Polymeraseaktivität der 2009 pH1N1 Viren ergab weiter, dass eine
oder beide HH15-spezifischen Mutationen im PB2 Protein für die niedrigere in vitro-Aktivität
der HH15 Polymerase verantwortlich sind. Da diese jedoch nicht zu der differenziellen
Pathogenität in C57BL/6J Mäusen beitrug, wurde dies in der vorliegenden Arbeit nicht weiter
untersucht.
Eine Evaluierung des Virulenz-Korrelats einer Lymphopenie in rekombinanten 2009 pH1N1infizierten C57BL/6J Mäusen zeigte, dass die HH15-spezifischen Mutationen im NP zu der
unter 5.2 und 5.3 diskutierten höhergradigen Lymphozytendepletion von HH15 führen
(4.5.2.3). Die HH15-spezifischen Mutationen an Position 100 und 133 wiesen dabei einen
stärkeren Einfluss auf als die Mutation an Position 373. Die ersten beiden NP Mutationen
sind auf der Proteinoberfläche lokalisiert. Dort haben Mutationen häufiger die Veränderungen
von molekularen Mechanismen zur Folge. Für eine weitere Analyse der auftretenden
Lymphopenie müsste der Einfluss der 2009 pH1N1 Isolate auf die Lymphopoese untersucht
werden. Die nach HH15-Infektion beobachtete Lymphopenie könnte eine entscheidende
Rolle bei der erhöhten Replikation von HH15 im Vergleich zu HH05 spielen. Die von HH15
verursachte Lymphopenie und damit Immunsuppression könnte das Replikationsverhalten
von HH15, trotz niedriger Polymeraseaktivität entscheidend vorangetrieben haben.
Eine weitere Möglichkeit für eine Rolle der auf der Proteinoberfläche lokalisierten HH15spezifischen NP Mutationen in der differenziellen Pathogenität in C57BL/6J Mäusen könnte
eine Veränderung von T-Zell- oder Antikörperepitopen sein. Die Aminosäuresequenz des
viralen NP ist hochkonserviert und spielt daher eine entscheidende Rolle in der
Immunerkennung vor allem von CD8+ T-Zellen (Webster et al., 1992; Bui et al., 2007). Eine
Mutation in einem solchen Epitop kann daher zur Restriktion der adaptiven Immunantwort
gegen Influenzaviren führen (Price et al., 2000). Zhou et al. publizierte, dass besonders in
HA, NA und NP der 2009 pH1N1 Influenza die Epitope zytotoxischer T-Zellen im Vergleich
mit alt-saisonalen H1N1 Influenzaviren hochkonserviert sind (Zhou et al., 2011). Alle
Bereiche des NP Proteins von Influenzaviren, in denen die HH15-spezifischen Mutationen
liegen, wurden bereits in verschiedenen Immunepitopen beschrieben (Immune Epitope
120
Diskussion
Database, www.iedb.org) Die Evaluierung, besonders von T-Zellepitopen, basiert jedoch auf
komplizierten Algoryhtmen und Peptid-Vorhersage Programmen jeweils für bestimmte HLA
Allele (Assarsson et al., 2008; Grant et al., 2013). Eine Untersuchung der Immundominanz
für einzelne Mutationen ist daher erschwert (Varich et al., 2009). Es ist jedoch nicht
auszuschließen, dass adaptive Mutationen, wie hier in HH15 beobachtet, zu einer
Umgehung der Immunabwehr gegen die bereits vorhandenen 2009 pH1N1 Influenzaviren in
der Bevölkerung führen.
Die HH15-spezifische Mutation S202T im HA Protein sowie V100I, I133L und I373T im NP
Protein sind maßgeblich an einer erhöhten Pathogenität im C57BL/6J Modell im Vergleich zu
HH05 beteiligt. Dabei erhöht jede der genannten Mutationen die Pathogenität im gleichen
Maß wie in Kombination. Es tritt kein additiver Effekt dieser Pathogenitätsdeterminanten auf,
wie in der Literatur für andere virale Determinanten beschrieben (Gabriel et al., 2008). Das
könnte auf eine vom Immunsystem des Wirtes vermittelte Begrenzung einer noch höheren
Pathogenität hindeuten. Da diese Mutationen in den zirkulierenden 2009 pH1N1
Influenzaviren immer noch prevalent sind, spricht dies für eine Selektion zugunsten einer
erhöhten Pathogenität, welche vor allem in Menschen mit Ko-Morbiditäten zum Vorschein
kommen könnte. Der molekulare Mechanismus der einzelnen Mutationen ist von hohem
Interesse und soll in Zukunft detailliert in vitro untersucht werden.
5.5 Pathogenität und Replikationseigenschaften von 2009 pH1N1
Influenzaviren in Meerschweinchen und Frettchen
Um die Transmissionseigenschaften von 2009 pH1N1 Influenzaviren zu untersuchen,
wurden die bereits in der Literatur beschriebenen Kleinsäugermodelle Meerschweinchen und
Frettchen verwendet (1.3; Bouvier und Lowen, 2010). Humane Influenzaviren replizieren
effizient im ORT von Meerschweinchen, ohne dass eine vorherige Adaptation notwendig ist.
Diese Eigenschaft resultiert in einer hohen Übertragbarkeit von Influenzaviren zwischen den
Tieren (Lowen et al., 2006). Allerdings kommt es in Meerschweinchen zu keinem Ausbruch
einer klinischen Symptomatik (Bouvier und Lowen, 2010). Frettchen hingegen eignen sich
aufgrund vieler Parallelen zum Krankheitsverlauf einer Influenzaviruserkrankung im
Menschen. In Frettchen kann sowohl die Transmission von Influenzaviren als auch deren
Pathogenität untersucht werden (Barnard, 2009; Maher und DeStefano, 2004; Belser et al.,
2011b). In dieser Arbeit wurde zunächst die Pathogenität und der Tropismus der 2009
pH1N1 Influenzaviren in beiden Modellen verglichen (4.5; 4.8).
In 2009 pH1N1-infizierten Meerschweinchen waren, wie erwartet keine klinischen Anzeichen
einer Erkrankung wie erhöhte Temperatur, Gewichtsverlust oder Lethargie zu beobachten.
121
Diskussion
Beide 2009 pH1N1 Isolate replizierten effizient im ORT der Tiere und waren mit hohen Titern
zu detektieren (4.7.1). Die effiziente Replikation ist auf das Vorkommen der humanen
Virusrezeptoren, der α2,6-verknüpften Sialinsäuren, im ORT von Meerschweinchen
zurückzuführen (Sun et al., 2010; Gao et al., 2009). Dies wurde auch von anderen Gruppen
in Infektionsexperimenten mit 2009 pH1N1 Influenzaviren in Meerschweinchen beobachtet
(Sun et al., 2010; Steel et al., 2010). Im URT der 2009 pH1N1-infizierten Meerschweinchen
wurde nur für das HH15 Virusisolat eine Replikation nachgewiesen, jedoch zu niedrigen
Titern. HH05 scheint demnach gar nicht im URT von Meerschweinchen replizieren zu
können. In der Lunge von Meerschweinchen kommen vermehrt die aviären Virusrezeptoren,
α2,3-verknüpfte Sialinsäuren, vor (Gao et al., 2009). Eine Replikation von HH15 im URT von
Meerschweinchen, vor allem in der Lunge, könnte entweder auf eine allgemein erhöhte
Replikationeffizienz oder auf eine stärkere Bindung von aviären Rezeptoren zurückzuführen
sein. Wie unter 5.4 diskutiert, konnte letzteres für HH15 mittels Hämagglutination von
humanen und aviären Erythrozyten nicht gezeigt werden. Um den Einfluss der Rezeptoren
auszuschließen, müsste jedoch eine detaillierte Analyse der Sialinbindung durchgeführt
werden. Eine breitere Rezeptorspezifität kann zu einer erhöhten Pathogenität des Virus
führen (Zheng et al., 2010; Belser et al., 2011a). Die Replikation von 2009 pH1N1
Influenzaviren im URT von Meerschweinchen wurde ebenfalls von Zhang et al. gezeigt
(Zhang et al., 2012). Dort wird jedoch eine effiziente Replikation unabhängig von der
Rezeptorspezifität postuliert. Dabei beziehen sich Zhang et al. jedoch nur auf eine Änderung
der Rezeptorspezifität durch eine HA-Mutation, welche sich von der HH15-spezifischen
unterscheidet (5.4). Eine histologische Auswertung des URT der 2009 pH1N1-infizierten
Meerschweinchen reflektierte die Ergebnisse der Virustiter-Bestimmung, da eine signifikant
größere Anzahl replizierender HH15 Viren in den Lungen nachzuweisen war als HH05 Viren
(4.7.1). Dieses Ergebnis stützt die Annahme, dass HH15 im Vergleich zu HH05 im URT von
Meerschweinchen einen Replikationsvorteil hat. Hätte HH15 durch spezifische Mutationen,
wie beispielsweise die im HA vorkommende, eine höhere Bindungsaffinität zu aviären
Rezeptoren erlangt, würde das hypothetisch zu einer effizienteren Replikation in den Lungen
vieler Säuger und demnach einer schwereren Erkrankung führen. Auch die Pathologie wies
nach HH15-Infektion im Vergleich zu HH05 in den Lungen der Meerschweinchen einen
höheren Entzündungsgrad mit deutlich zerstörter Alveolarstruktur auf. Diese Ergebnisse
sprechen
dafür,
dass
HH15
insgesamt
zu
einer
schwereren
Erkrankung
im
Meerschweinchen führt als HH05.
Auch im Frettchenmodell wurden keine signifikanten Unterschiede von Körpertemperatur,
-gewicht oder Virulenz der 2009 pH1N1-infizierten Tiere im Vergleich zu nicht-infizierten
beobachtet (4.8). Beide 2009 pH1N1 Influenzaviren replizieren effizient im ORT, wobei HH15
im Vergleich zu HH05 länger zu höheren Titern nachgewiesen wurde (4.8.1). Die effiziente
122
Diskussion
Replikation kann ebenfalls mit dem vermehrten Vorkommen von humanen Virusrezeptoren
im ORT von Frettchen erklärt werden (Leigh et al., 1995; Belser et al., 2011b). Die 2009
pH1N1 Viren wiesen ebenfalls im URT, der Trachea und der Lunge infizierter Frettchen eine
effiziente Replikation mit hohen Virustitern auf. Dabei replizierte HH15 in der Trachea
signifikant und in der Lunge tendenziell zu höheren Titern als das HH05 Virusisolat. Da in der
Lunge von Frettchen ein höherer Anteil aviärer Virusrezeptoren als im ORT vorhanden ist
(Leigh et al., 1995; Thongratsakul et al., 2010), könnte ein Replikationsvorteil von HH15
analog zum Meerschweinchen auf eine breitere Rezeptorspezifität hindeuten. Für humane
Influenzaviren ist in der Literatur die effiziente Replikation hauptsächlich im ORT
beschrieben. Eine Replikation im URT, wie auch bei humanen H5N1 Influenzaviren, wird auf
die dort vorkommenden aviären Virusrezeptoren zurückgeführt (Maher und DeStefano, 2004;
Bouvier und Lowen, 2010; Belser et al., 2011b). Die erhöhte Replikation von HH15 im URT
wurde in der Histologie von Trachea und Lunge der infizierten Frettchen bestätigt (4.8.1). Ein
genereller
Replikationsvorteil
von
HH15
könnte
jedoch
neben
einer
veränderten
Rezeptorbindung auch zu der effizienteren Replikation im URT im Vergleich zu HH05 führen.
Die Pathologie der Frettchenlungen weist nach HH15-Infektion eine Entzündungsreaktion
einhergehend mit zerstörter Alveolarstruktur auf. Dies trägt zu der Annahme bei, dass HH15
im Frettchen pathogener ist als HH05. Von anderen Gruppen durchgeführte 2009 pH1N1Infektionsversuche im Frettchen wiesen zum Teil unterschiedlich schwere Krankheitsverläufe
für verschiedene Isolate auf, von milden bis zu letalen Fällen mit Virusreplikation in ORT und
URT (Huang et al., 2011; Maines et al., 2009; Itoh et al., 2009; Munster et al., 2009). Die in
dieser Arbeit untersuchten 2009 pH1N1 Virusisolate sind im Frettchen nicht letal und zeigen
keine klinische Symptomatik. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass HH15 durch seinen
Replikationsvorteil zu einer schwereren Erkrankung im Frettchen führt als HH05. Des
Weiteren gibt es einen Bericht über die Detektion von Virustitern im Darm von 2009 pH1N1infizierten Frettchen (Maines et al., 2009). Da dies hier für das HH15 Isolat auch in C57BL/6J
Mäusen beobachtet wurde und gastrointestinale Beschwerden auffallend häufig in 2009
pH1N1 Patienten vorkamen, sollte der Darm zukünftig auch in Meerschweinchen und
Frettchen in weiterführenden Studien untersucht werden.
Die Ergebnisse zur Virusreplikation lassen darauf schließen, dass aufgrund des
Vorkommens humaner Virusrezeptoren die 2009 pH1N1 Influenzaviren effizient im ORT von
Meerschweinchen und Frettchen replizieren können. Im URT zeigte das HH15 Virusisolat in
beiden Modellen einen Replikationsvorteil gegenüber HH05. Im Meerschweinchen sowie im
Frettchen kommen dort aviäre Rezeptoren vor. Es ist bekannt, dass 2009 pH1N1 Viren zwar
verstärkt die humanen Rezeptoren, aber im Gegensatz zu alt-saisonalen Influenzaviren,
auch noch signifikant aviäre Rezeptoren binden können (Childs et al., 2009; Yang et al.,
2010; Xu et al., 2012b). Dies deutet darauf hin, dass HH15 durch Mutationen entweder eine
123
Diskussion
breitere Bindungspräferenz oder eine allgemein höhere Replikationseffizienz als HH05
erworben hat. Darüber hinaus hat HH15 in beiden Säugermodellen eine stärkere Erkrankung
zur Folge. Auch wenn dies keine direkte Letalität oder klinische Symptomatik nach sich zieht,
kann die höhere Viruslast, vor allem in der Lunge (URT) oder bei Vorerkrankungen, zu einer
schwereren Erkrankung führen. Das zeigt sich auch in der Pathologie der Lunge beider
Säugermodelle. Welche der HH15-spezifischen Mutationen zu diesen Beobachtungen
beitragen, soll in Zukunft geklärt werden.
Im Vergleich der drei Säugermodelle hinsichtlich Pathogenität und Virusreplikation lässt sich
zusammenfassen, dass die Ergebnisse für die 2009 H1N1 Influenzaviren vergleichbar sind.
Die Virustiter im Respirationstrakt von Meerschweinchen, vor allem im URT, sind allerdings
insgesamt niedriger als in Frettchen. Dies könnte teilweise durch geringe Unterschiede in der
Rezeptorverteilung im Respirationstrakt der beiden Säugermodelle erklärt werden.
Meerschweinchen haben im ORT humane sowie aviäre Virusrezeptoren, im URT dagegen
vermehrt aviäre. Frettchen hingegen haben im ORT mehr humane, im URT jedoch beide
Virusrezeptoren (Sun et al., 2010; Gao et al., 2009; Leigh et al., 1995; Thongratsakul et al.,
2010). Dadurch könnte eine breitere aviäre und humane Rezeptorbindepräferenz von
Influenzaviren, wie hier für HH15 vermutet, im Meerschweinchenmodell zu deutlicheren
Unterschieden führen. Darüber hinaus korreliert der Befund der erhöhten Replikation und
Pathogenität von HH15 im Vergleich zu HH05 in allen drei Säugermodellen. Bezüglich der
Transmissibilität dagegen scheinen beide Modelle, Meerschweinchen und Frettchen,
unterschiedliche Ergebnisse zu liefern, die in der unterschiedlichen Verteilung der
Virusrezeptoren oder aber unterschiedlichen Immunantworten in diesen liegen könnten.
Daher gilt es Aussagen zur Transmissionseffizienz von Influenzaviren vorsichtig im
untersuchten Hintergrund des Tiermodells zu evaluieren.
5.6 Differenzielle
Transmissionseigenschaften
von
2009
pH1N1
Influenzaviren in Meerschweinchen und Frettchen
Die 2009 pH1N1 Influenza zeichnete sich unter anderem durch eine effiziente Übertragung
von Mensch zu Mensch aus, was für eine schnelle Ausbreitung der Pandemie sorgte (1.2.1).
Zur Charakterisierung der Transmissionseigenschaften der beiden hier untersuchten 2009
pH1N1 Influenzaviren wurden Meerschweinchen und Frettchen verwendet. Beide gelten als
etablierte Kleinsäugermodelle für die Transmission von Influenzaviren (Maher und
DeStefano, 2004; Lowen et al., 2006). Im Frettchen ähnelt eine Influenzavirusinfektion, vor
allem
aufgrund
der
Rezeptorverteilung
im
Respirationstrakt
und
des
klinischen
Krankheitsverlaufs der des Menschen (Belser et al., 2011b; Bouvier und Lowen, 2010).
Frettchen gelten daher neben Halbaffen als „Goldstandard“ für die Untersuchung der
124
Diskussion
Pathogenität und Transmission von Influenzaviren. Da in Meerschweinchen ebenfalls
humane
Influenzavirusrezeptoren
vergleichsweise
kosten-
und
im
ORT
vorkommen,
aufwandgünstigeres
werden
Modell
diese
verwendet,
häufig
sind
als
aber
weitestgehend auf die Transmission beschränkt (Lowen et al., 2006). Voraussetzung für eine
Übertragung von Tier zu Tier in diesen beiden Modellen ist, dass das entsprechende Virus
zu ausreichend hohen Titern in den oberen Atemwegen repliziert. Da gezeigt werden konnte,
dass beide hier untersuchten 2009 pH1N1 Virusisolate, wie unter 5.5 diskutiert, ähnlich
effizient
im
ORT
von
Meerschweinchen
und
Frettchen
replizieren,
wurden
Transmissionsstudien mit Sentineltieren durchgeführt (4.7.2; 4.8.2.).
Kontakt-Transmission
Die Übertragung von 2009 pH1N1 Influenzaviren durch direkten Kontakt war im
Meerschweinchenmodell, gemessen an Virustitern im ORT der Sentineltiere, zu 100 %
effizient. Dies galt für das HH05 Virusisolat ebenso wie für HH15. Die sequenziellen
Unterschiede zwischen HH05 und HH15 scheinen dementsprechend keinen Einfluss auf die
effiziente Kontakt-Transmission im Meerschweinchen zu haben. Eine effiziente KontaktTransmission der 2009 pH1N1 Influenzaviren konnte bereits in zwei weiteren Publikationen
gezeigt werden (Steel et al., 2010; Sun et al., 2010; Kaminski et al., 2013). Kaminski et al.
untersuchten die Kontakt-Transmission des hier ebenfalls verwendeten HH05 Isolats und
bestätigten die effiziente Transmission auf Sentineltiere. Im Gegensatz dazu werden für altsaisonale Influenzaviren unterschiedliche Transmissionseffizienzen für den direkten Kontakt
von Meerschweinchen gezeigt. Mit Ausnahme eines alt-saisonalen H1N1 Influenzavirus,
welches ebenfalls zu 100 % übertragen wurde, wiesen ein anderes alt-saisonales H1N1 und
ein H3N2 Influenzavirus lediglich Übertragungsraten zwischen 25 % und 66 % auf
(Mubareka et al., 2009; Sun et al., 2010; Lowen et al., 2006). Dies könnte auf eine höhere
Effizienz der Kontakt-Transmission der 2009 pH1N1 Influenza im Gegensatz zu altsaisonalen Influenzaviren hindeuten und zur schnellen Ausbreitung der Pandemie in 2009
beigetragen haben.
Die Kontakt-Transmission im Frettchenmodell wird in der Literatur als hoch effizient für
humane Influenzaviren verschiedener Subtypen beschrieben (Bouvier und Lowen, 2010).
Ebenso zeigten Maines et al., dass auch 2009 pH1N1 Influenzaviren zu 100 % über direkten
Kontakt von Frettchen zu Frettchen transmittieren (Maines et al., 2009). Die KontaktTransmission im Frettchen wurde in dieser Arbeit nicht untersucht.
Aerosol-Transmission
Für die Untersuchung einer Übertragung von Tier zu Tier durch Aerosolbildung wurden
jeweils nicht-infizierte Meerschweinchen bzw. Frettchen im Luftstrom von infizierten Tieren
125
Diskussion
gehalten (3.4.6). Durch einen Abstand von etwa 10 cm der Käfige voneinander wurde
sichergestellt,
dass
keine
Übertragung
durch
direkten
Kontakt
oder
große
Respirationströpfchen erfolgte.
In Meerschweinchen konnte eine Transmission über Aerosole nur für das HH05 Isolat
nachgewiesen werden. In zwei von vier Sentineltieren konnte während des Versuchs Virus
im ORT nachgewiesen werden (4.7.2). In einem Sentineltier war nach sechs Tagen Virus zu
detektieren und im anderen zeitversetzt nach neun Tagen. Da die Tiere jeweils in
Zweiergruppen gehalten wurden und eine effiziente Kontakt-Transmission für das HH05
Isolat bereits gezeigt wurde, ist hier eine direkte Übertragung vom ersten Sentineltier auf das
zweite wahrscheinlich. Ein Antikörpernachweis der Sentineltiere zeigte eine Serokonversion
von drei aus vier Sentineltieren (4.7.2). Die Virustiter im ORT des dritten Tieres lagen
demnach voraussichtlich unter der Detektionsgrenze. Daraus ergibt sich für die AerosolTransmission von HH05 eine Effizienz von 75 %. Der Antikörpernachweis bestätigte
weitergehend, dass für HH15 keine Aerosol-Transmission in Meerschweinchen stattfindet.
Die beobachtete Replikation von HH15 im Gegensatz zu HH05 im URT von
Meerschweinchen scheint demnach mit dem Verlust der Transmissibilität über Aerosole zu
korrelieren. Es ist bekannt, dass HPAIV, die tiefer in der Lunge von Menschen replizieren,
auch schlechter von Mensch zu Mensch transmittieren, was meistens aber mit einer
ineffizienteren Replikation im ORT einhergeht (Shinya et al., 2006). Dies war im Fall von
HH15 nicht zu beobachten, da es ebenso effizient im ORT replizierte wie das HH05 Isolat.
Es wurde jedoch in der Literatur beschrieben, dass ein humanes H5N1 Influenzavirus,
welches auch zu hohen Titern im ORT replizierte und über Kontakt transmittierte, nicht über
Aerosol-Transmission auf naive Meerschweinchen übertragen wurde (Bouvier und Lowen,
2010; Steel et al., 2009). Eine Erklärung dafür liefert unter anderem eine Veröffentlichung
von Zhang et al. (Zhang et al., 2012). Dort wird gezeigt, dass eine stärkere Affinität von 2009
pH1N1
Influenzaviren
zu
aviären
Virusrezeptoren
eine
Aerosol-Transmission
im
Meerschweinchen trotz effizienter Replikation im ORT unterbindet. Dies stützt die Hypothese
unter 5.5, nach der HH15 aviäre Virusrezeptoren stärker binden könnte als HH05. Dadurch
könnte die Effizienz der Aerosol-Transmission eingebüßt worden sein. Steel et al.
untersuchten ebenfalls die Aerosol-Transmission von 2009 pH1N1 Influenzaviren im
Meerschweinchen (Steel et al., 2010). Dort transmittierten zwei verschiedene 2009 pH1N1
Influenzaviren mit einer Effizienz von 100 %. Das eine Influenzavirus wurde jedoch mit als
erstes in 2009 sequenziert und weist zu HH05 eine höhere Sequenzhomologie auf als zu
HH15, was darauf hindeutet , dass die HH15-spezifischen Mutationen zu den Unterschieden
in der Aerosol-Transmission im Meerschweinchen beitragen.
126
Diskussion
Eine Aerosol-Transmission von Frettchen zu Frettchen fand mit beiden 2009 pH1N1
Influenzaviren statt (4.8.2). Das HH05 Virus wurde initial jeweils zeitversetzt im ORT der
Sentineltiere detektiert, in einem der Tiere erst 8 d p.i.. Das HH15 Virus hingegen wurde
bereits früh im Verlauf des Versuchs in allen Sentineltieren detektiert und über einen
längeren Zeitraum im ORT der einzelnen Tiere nachgewiesen als beim HH05 der Fall. Eine
effiziente Aerosol-Transmission von 100 % wurde mittels Antikörpertest für HH05- sowie
HH15-Sentineltiere bestätigt. Da die Frettchen jeweils zu zweit im Käfig gehalten wurden,
liegt die Vermutung auch hier nahe, dass die Tiere mit Virustitern zu späteren Zeitpunkten,
besonders bei HH05, durch eine Kontakt-Transmission infiziert wurden. Demzufolge könnte
vermutet werden, dass das HH15 Virus tendenziell effizienter über Aerosole transmittiert als
HH05, denn obwohl HH05 nach einer Übertragung auf die Sentineltiere zu höheren Titern im
ORT repliziert, führt HH15 zu einer länger andauernden Viruslast. Dies würde bestätigen,
dass eine effiziente Virusreplikation im ORT zu einer effizienten Aerosol-Transmission
beiträgt. Zusammen mit dem für HH15 beobachteten Replikationsvorteil im URT der
Frettchen, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HH15 tendenziell zu einer effizienteren
Infektion im Frettchen führt als HH05.
In Studien anderer Gruppen zur Aerosol-Transmission von 2009 pH1N1 Influenzaviren im
Frettchenmodell wurde ebenfalls eine Effizienz von 100 % beschrieben (Itoh et al., 2009;
Zhang et al., 2012; Munster et al., 2009). Zhang et al. zeigten dabei jedoch eine zeitversetze
Infektion der Sentineltiere, vergleichbar zu HH05, was ebenfalls auf eine KontaktTransmission der Sentineltiere untereinander vermuten lässt. In einer weiteren Publikation
transmittierten drei verschiedene 2009 pH1N1 Isolate jeweils nur mit einer Effizienz von
66 %, gemessen an Virustitern im ORT der Frettchen (Maines et al., 2009). Die
unterschiedliche Effizienz in der Aerosol-Transmission von 2009 pH1N1 Influenzaviren
wurde bisher nicht untersucht. Human-adaptierte, alt-saisonale oder pandemische 1918
Influenzaviren transmittieren effizient im Frettchen, aviäre Influenzaviren, unter anderem
auch humane H5N1 Isolate, hingegen nicht (Bouvier und Lowen, 2010; Maines et al., 2009;
Maines et al., 2006). In zwei parallel veröffentlichten Studien wurde gezeigt, dass humanadaptive Mutationen von aviären H5N1 Viren eine Transmission im Frettchen ermöglichen,
was jedoch mit einer niedrigeren Replikation und Pathogenität einhergeht (Imai et al., 2012;
Herfst et al., 2012). Sollte HH15 eine höhere Affinität zu aviären Virusrezeptoren erworben
haben als HH05, würde die effizientere Replikation im URT mit diesen Ergebnissen zwar
korrelieren, nicht aber die tendenziell effizientere Aerosol-Transmission erklären. Demnach
könnte auch eine generell höhere Replikationseffizienz von HH15 für den tendenziellen
Transmissionsvorteil verantwortlich sein. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse zur
Replikation und Transmission in 2009 pH1N1-infizierten Frettchen dafür, dass HH15 durch
adaptive Mutationen zum einen pathogener und zum anderen auch transmissiver geworden
127
Diskussion
sein könnte als HH05. Dies würde zusätzlich unterstreichen, dass bei den 2009 pH1N1
andere Pathogenitätsdeterminanten eine Rolle spielen als bei HPAIV.
Im Vergleich von Meerschweinchen und Frettchen sind demnach Unterschiede in der
Aerosol-Transmission zu beobachten. Die vermutete effizientere Transmission von HH15 im
Frettchen konnte im Meerschweinchen nicht gezeigt werden. Obwohl die Stichprobe für die
Aerosol-Transmission im Frettchen zu klein ist, um HH15 generell transmissiver als HH05 zu
bezeichnen, scheint HH15 im Meerschweinchen hingegen zu gar keiner Übertragung durch
Aerosole zu führen. Hier gilt es allerdings hervorzuheben, dass die Virustiter im
Respirationstrakt von Meerschweinchen nach 2009 pH1N1-Infektion generell niedriger waren
als in Frettchen. Diese generell reduzierte Virusreplikation im Meerschweinchen könnte ein
wichtiger
Punkt
bei
der
Restriktion
einer
Virustransmission
im
Gegensatz
zum
Frettchenmodell darstellen.
Die Rezeptorverteilung im Respirationstrakt und die Pathogenese von Frettchen ähnelt im
Vergleich zu Meerschweinchen eher der im Menschen. Daher stellt sich die Frage, ob die
Aerosol-Transmission
widerspiegelt.
im
Frettchen
Unterschiede
in
eher
die
Replikation
Gegebenheiten
und
in
der
Rezeptorbindung
Bevölkerung
könnten
im
Meerschweinchen hingegen deutlicher zum Vorschein kommen. Zhang et al. zeigten, dass
Unterschiede in der Rezeptorbindung von Influenzaviren im Meerschweinchen deutlicher zu
beobachten waren als im Frettchen (Zhang et al., 2012). Weitere Untersuchungen dazu,
welche Rolle die Sequenzunterschiede von HH05 und HH15 bei der differenziellen
Transmission im Meerschweinchen und Frettchen spielen, sollte in Zukunft weiter untersucht
werden. Die Größe der Aerosolpartikel ist entscheidend für die Persistenz in der Luft und die
Menge an transportierten Viruspartikeln wichtig für das Eindringen in die Atemwege (Tellier,
2009; Gustin et al., 2011). Daher wäre es von Interesse zu untersuchen, ob sich Größe und
Menge der Aerosolpartikel von HH05 und HH15 voneinander unterschieden und somit einen
Einfluss auf deren Transmissionseffizienz haben könnten.
5.7 Eine höhere Pathogenität von HH15 im Vergleich zu HH05
Die Ergebnisse zur Charakterisierung der 2009 pH1N1 Influenzaviren in dieser Arbeit lassen
deutlich auf eine höhere Pathogenität des HH15 Virusisolats im Vergleich zu HH05
schließen. Wie in Tab. 7 schematisch zusammengefasst, repliziert HH15 in humanen
Lungenzellen zu höheren Titern als HH05. In vivo ist HH15 im C57BL/6J Mausmodell
50-fach virulenter und führt zu einer schwereren Erkrankung mit andauernder Lymphopenie
im Vergleich zu HH05. Darüber hinaus scheint HH15 im Gegensatz zu HH05 in C57BL/6J
Mäusen auch zu einer Viräme zu führen. Dementsprechend kommt es auch im
Meerschweinchen und Frettchenmodell zu einer schwereren Erkrankung nach HH15-
128
Diskussion
Infektion im Vergleich zur HH05-Infektion, vor allem gemessen an der Viruslast im
Respirationstrakt.
Vier
der
zwölf
HH15-spezifischen
Mutationen
konnten
als
Pathogenitätsdeterminanten in C57BL/6J Mäusen identifiziert werden. Aufgrund der
Ergebnisse zur Replikation in den verschiedenen Säugermodellen könnte eine veränderte
Rezeptorspezifität oder Antigenität von HA eine wichtige Rolle bei der beobachteten
erhöhten Pathogenität spielen. Darüber hinaus tragen HH15-spezifische Mutationen im NP
Protein zur einer andauernden Lymphopenie in HH15-infizierten C57BL/6J Mäusen bei. Die
in vitro Polymeraseaktivität von HH15 ist trotz des Replikationsvorteils von HH15 im Säuger
niedriger als die von HH05 (Tab. 7). Da eine erhöhte Pathogenität in der Regel mit einer
effizienteren Polymeraseaktivität einhergeht, spricht dieses Ergebnis dafür, dass für die
beobachtete höhere Virusreplikation von HH15 im Tiermodell sowie in humanen Zellen nicht
die intrinsische Funktion der Polymerase sondern andere virale oder zelluläre Faktoren
zusätzlich eine Rolle spielen. Dies deutet ebenfalls darauf hin, dass auch die Immunantwort
des Wirts eine entscheidende Rolle in der gesteigerten Pathogenität von HH15 spielt. Die
durch Lymphozytendepletion hervorgerufene Immunsuppression könnte zur erhöhten
Replikation von HH15 im Tiermodell beigetragen haben.
Die Aerosol-Transmission zeigt erhebliche Unterschiede zwischen den beiden verwendeten
Säugermodellen (Tab. 7). HH15 zeigt im Meerschweinchen eine höhere Replikation als
HH05, welche in keiner Aerosol-Transmission resultiert. Basierend auf der Literatur wäre mit
eine erhöhten Replikation im URT, wie für HH15, eine erniedrigere Transmissionseffizienz
auch zu erwarten. Da sich die 2009 pH1N1 Influenza bereits kurz nach ihrem Auftreten
weltweit ausbreiten konnte, könnten später erworbene Mutationen wie hier im HH15, nur
nach Pathogenität oder nach einer damit einhergehenden Veränderung der Antigenität
selektiert worden sein. Rezeptorbindung sowie Antigenität von HH05 und HH15 sollten daher
in Zukunft weitergehend untersucht werden. Im Gegensatz zum Meerschweinchen scheint
HH05 im Frettchenmodell hingegen sogar tendenziell effizienter über Aerosole zu
transmittieren als HH05. Sollte sich dieses Ergebnis mit einer höheren Stichprobe
bestätigen, könnte es darauf hindeuten, dass die 2009 pH1N1 Influenzaviren durch adaptive
Mutationen, wie hier in HH15, pathogener und zusätzlich transmissiver geworden sind.
Abschließend ist festzustellen, dass diese Arbeit deutliche Hinweise auf die Selektion von
adaptiven Pathogenitätsdeterminanten im Verlauf der 2009 Pandemie zeigt. Das HA und NP
Protein wurde in der Maus als wichtige Pathogenitätsdeterminante identifiziert. Diese Daten
sprechen eindeutig dafür, dass 2009 pH1N1 Influenzaviren kurz nach Ausbruch der
Pandemie ihr Replikationspotenzial erhöht haben. Dies könnte einen wichtigen Einfluss auf
die erhöhte Pathogenität vor allem bei den am schwersten betroffenen Patienten mit
vorhandenen Ko-Morbiditäten gehabt haben. Hervorzuheben ist dabei, dass die als
129
Diskussion
Pathogenitätsdeterminanten identifizierten Mutationen noch heute in zirkulierenden 2009
pH1N1 Influenzaviren prevalent sind.
Bezüglich der Transmissibilität lässt sich keine allgemein gültige Aussage treffen. Diese
scheint vor allem vom verwendeten Tiermodell abzuhängen. Allerdings führen diese
Ergebnisse vor Augen, wie wichtig eine Evaluierung von Transmissionseigenschaften in
verschiedenen Tiermodellen ist. Anatomische Unterschiede wie z.B. die differenzielle
Rezeptorverteilung im Respirationstrakt oder Unterschiede in der Immunantwort können
verschiedene Ergebnisse liefern, die vorsichtig im jeweiligen Hintergrund des verwendeten
Tiermodels diskutiert werden müssen.
Tab. 7: Schematische Darstellung der in vitro und in vivo Unterschiede von HH15 (pH1N1) im Vergleich zu
HH05 (pH1N1)
Dargestellt sind untersuchte in vitro und in vivo Parameter zur Pathogenität und Transmission der 2009 pH1N1
Influenzaviren in humanen Zellen, C57BL/6J Mäusen, Meerschweinchen oder Frettchen. Es wird jeweils eine
Erhöhung (↑), eine Erniedrigung (↓) oder kein Unterschied (↔) des jeweiligen Parameters von HH15 im Vergleich
zu HH05 gezeigt (ORT = oberer Respirationstrakt, URT = unterer Respirationstrakt).
130
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Die 2009 pandemische H1N1 Influenza stellte die erste Pandemie des 21. Jahrhunderts dar.
Hierbei handelte es sich um ein Influenzavirus mit Gensegmenten aus Influenzaviren der
Vögel und der Schweine, von dem vermutet wird, dass es vom Schwein auf den Menschen
übergegangen ist. Deshalb war es besonders erstaunlich, dass säugeradaptive Mutationen,
welche vor allem in Arbeiten mit aviären Influenzaviren beschrieben wurden, nicht im
Virusgenom der 2009 pandemischen H1N1 Influenzaviren (2009 pH1N1) vorkommen.
Demnach musste angenommen werden, dass bisher unbekannte Determinanten für die
Adaptation und die erhöhte Pathogenität der 2009 pH1N1 Influenzaviren im Menschen
verantwortlich sein müssen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, Influenzaviren, die während der
2009 Pandemie isoliert wurden, hinsichtlich ihrer Pathogenität und Transmissibilität in
verschiedenen Kleintiermodellen (Maus, Meerschweinchen und Frettchen) zu untersuchen.
Es wurden zwei klinische 2009 pH1N1 Isolate verwendet, die früh (HH05) bzw. später
(HH15) im Verlauf der Pandemie isoliert wurden. Der Vergleich von 2009 pH1N1
Influenzaviren in Mäusen bestätigte, dass für deren Pathogenese im Säuger im Gegensatz
zu hochpathogen aviären Influenzaviren andere Determinanten verantwortlich sind. Während
HH15 in C57BL/6J Mäusen etwa 50-fach virulenter ist als HH05, sind beide Isolate in BALB/c
Mäusen niedrig pathogen. Intrinsische Pathogenitätsdeterminanten von HH15, die in
C57BL/6J Mäusen zu einer letalen Infektion führen, scheinen daher in BALB/c Mäusen
maskiert zu sein. Für die hohe Pathogenität von HH15 in C57BL/6J Mäusen konnten
Mutationen im viralen HA (S202T) und NP Protein (V100I, I133L, I373T) als Determinanten
identifiziert werden. Die in C57BL/6J Mäusen beobachtete erhöhte Replikation und Virulenz
von HH15 korrelierte mit der Lymphopenie in diesen Tieren, welche von Mutationen im NP
ausgelöst wurden. Diese Daten sprechen dafür, dass der Replikationsvorteil von HH15 durch
die Immunsuppression (Lymphopenie und reduzierte Zytokinexpression) in C57BL/6J
Mäusen bedingt wird. Der Replikationsvorteil von HH15 im Vergleich zu HH05 konnte auch
im Respirationstrakt von Meerschweinchen und Frettchen bestätigt werden.
Die Transmissionseigenschaften der 2009 pH1N1 Influenzaviren sind im Meerschweinchenund Frettchenmodell jedoch unterschiedlich. Im Meerschweinchen findet mit HH15 im
Gegensatz zu HH05 keine Aerosol-Transmission statt. Demnach hätte eine höhere
Replikationseffizienz der 2009 pH1N1 Viren zu Einbußen in der Transmission geführt. Im
Frettchenmodell hingegen scheint HH15 sogar tendenziell effizienter über Aerosole zu
transmittieren als HH05. Dieses würde darauf schließen lassen, dass die 2009 pH1N1
Influenzaviren durch adaptive Mutationen nicht nur einen Replikationsvorteil erworben
haben, sondern auch zusätzlich transmissiver geworden sind. Diese Ergebnisse zeigen,
131
Zusammenfassung
dass die Transmissionseffizienz vom verwendeten Tiermodell abhängt und jeweils im
Hintergrund des verwendeten Tiermodells diskutiert werden müssen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die HH15-spezifische Mutationen im
Verlauf der Pandemie durchgesetzt haben, da sie noch heute in zirkulierenden 2009 pH1N1
Influenzaviren prävalent sind. Dadurch könnte vermutet werden, dass die 2009 pH1N1
Influenzaviren sehr früh nach Ausbruch der Pandemie erste Mutationen erworben haben, die
zu einer erhöhten Virusreplikation im Säuger führen. Dies könnte vor allem bei Menschen mit
Ko-Morbiditäten, die während der Pandemie am schwersten betroffen waren, zu einem
schweren Infektionsverlauf geführt haben.
132
Summary
7 Summary
2009 pandemic H1N1 influenza viruses were the causative agents of the first pandemic of
the 20th century. These viruses contained gene segments from avian and swine influenza
viruses and are believed to have transmitted from swine to humans. Previously described
determinants of mammalian adaptation and pathogenicity of influenza viruses were mostly
identified in studies with avian influenza viruses. Surprisingly, they were not present in the
2009 pandemic H1N1 influenza viruses (pH1N1). Thus, novel determinants seem to be
responsible for the adaptation and enhanced pathogenicity of the 2009 pH1N1 viruses in
humans and need to be identified. The aim of this study was to analyze the pathogenicity
and transmissibility of 2009 pH1N1 influenza viruses in small animal models (mice, guinea
pigs and ferrets).
Therefore, two clinical 2009 pH1N1 isolates, obtained early (HH05) and later (HH15) during
the pandemic, were used in this study. Comparison of the 2009 pH1N1 viruses in mice
confirmed that determinants involved in the pathogenesis of 2009 pH1N1 influenza viruses
differ from those of highly pathogenic avian influenza viruses. Moreover, HH15 was
approximately 50 times more virulent in C57BL/6J mice compared to HH05. In contrast, both
virus isolates are low pathogenic in BALB/c mice. Hence, intrinsic pathogenicity determinants
leading to lethal infection in C57BL/6J mice seem to be masked in the BALB/c mouse model.
Mutations in HA (S202T) and NP (V100I, I133L, I373T) could be identified as viral
determinants mediating enhanced pathogenicity in C57BL/6J mice. Further lymphopenia,
caused by mutations in NP, correlated with enhanced replication and virulence of HH15 in
C57BL/6J mice. This leads to the conclusion that immunosuppression (lymphopenia and
reduced cytokine expression) leads to the enhanced replication in C57BL/6J mice. The
replicative advantage of HH15 compared to HH05 could be confirmed in the respiratory tract
of guinea pig and ferrets.
Transmission properties of 2009 pH1N1 influenza viruses differed in the guinea pig and the
ferret model. In guinea pigs, HH15 did not transmit via aerosols in contrast to HH05. This
would suggest that enhanced replication of HH15 correlates with a loss of aerosol
transmission. In the ferret model, HH15 seemed to transmit even more efficiently than HH05.
This would suggest that HH15 acquired higher replication properties as well as higher
transmission efficiencies by acquisition of adaptive mutations. Overall, these data show that
transmission properties are dependent on the animal model used and therefore need to be
carefully discussed in this respect.
133
Summary
In summary, these data suggest that adaptive mutations in 2009 pH1N1 influenza viruses
have occurred very early after the pandemic outbreak. HH15-specific signatures are still
prevalent in currently circulating influenza virus strains suggesting that they might have
contributed to the replicative fitness of pandemic strains. Furthermore, the enhanced
replication properties of 2009 pH1N1 influenza viruses which emerged very early during the
pandemic might have contributed to severe disease outcome, especially in humans with
underlying co-morbidities that accounted for the highest morbidities during the pandemic.
134
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144
Anhang
9 Anhang
9.1 Abkürzungsverzeichnis
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
aa
Aminosäure
Abb.
Abbildung
ad
an/zu
AK
Antikörper
Amp
Ampicillin
ATP
Adenosintryphosphat
bp
Basenpaar
BSA
bovines Serumalbumin
C-
Carboxyterminal / Carboxy-Terminus
CaCl2
Kalziumchlorid
Ci
Curie
CO2
Kohlenstoffdioxid
cpm
counts per minute (Zählimpulse pro Minute)
cRNA
copy RNA
d
Tag (day)
Da
Dalton
ddH2O
Doppelt destilliertes Wasser
DECP
Diethylpyrocarbonat
dl
Deziliter
DMEM
Dulbecco’s modified Eagles medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
desoxy-NPT
DTT
Dithiotreitol
E.coli
Escherichia coli
E.coli
Escherichia coli Bakterien
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
FCS
fötales Kälber Serum
g
Gramm
GRA
Ganulozyten
h
Stunde
H2
Wasserstoff
H2O
Wasser
HA
Hämagglutinin
HAI
Hämagglutinantionsinhibitions-Titer
145
Anhang
HAU
Hämagglutinantionstiter (hemagglutination units)
HCL
Salzsäure
HCT
Hämatokrit
HE
Hämatoxylin-Eosin
HGB
Hämoglobin
HPAIV
hochpathogenes aviäres Influenzavirus (high pathogenic avian influenza virus)
HRP
Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
HSV
Herpes-Simplex Virus
Hz
Hertz
IFN-γ
Interferon-γ
IL-10
Interleukin-10
IL-4
Interleukin-4
IL-6
Interleukin-6
ISH
in situ-Hybridisierung
kDA
Kilodalton
kg
Kilogramm
L
Liter
LB
Luria-Bertani-Medium
log
Logarithmus
LPAIV
niedrigpathogenes aviäres Influenzavirus (low pathogenic avian influenza virus)
LYM
Lymphozyten
M
Molar
M1/2
Matrixprotein-1/-2
MCP-1
monocyte chemotactic protein-1
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minute
Mio.
Millionen
ml
Milliliter
MLD50
Maus-letale-Dosis-50
mM
Millimolar
MOI
Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection)
mol
Stoffmenge
mRNA
messenger RNA
N-
Aminoterminal/ Amino-Terminus
N
Stickstoff
Na
Natrium
NA
Neuraminidase
NaCl
Natriumchlorid
NEP
nuclear export protein
NLS
Kernlokalisierungssignal
146
Anhang
nm
Nanometer
NP
Nukleoprotein
NS
Nichtstrukturprotein
ORT
oberer Respirationstrakt
p.f.u.
plaque forming units (Virustiter Angabe)
p.i.
nach Infektion (post infection)
PA
polymerase acidic protein
PB1
polymerase basic protein 1
PB2
polymerase basic protein 2
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR
Polymerasekettenreaktion
PEI
Polyethylenimin
PFA
Parafomaldehyd
pH
negativ dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
pH1N1
pandemische H1N1
PTL
Thrombozyten (platelets)
RBC
Erythrozyten (red blood cells)
rek
rekombinant
RLU
Relative Lichteinheiten (relative light units)
RNA
Ribonukleinsäure
RNP
Ribonukleoprotein
rpm
Umdrehungen pro Minute
s
Sekunde
SSC
Natriumdodecylsulfat
Tab.
Tabelle
TBE
TRIS-Borat-EDTA-Puffer
TNF-α
Tumornekrosefaktor α
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
t-RNA
transfer-RNA
U
Unit, Einheit der Enzymaktivität
URT
unterer Respirationstrakt
UTP
Uridistriphosphat
UV
Ultraviolett
V
Volt
vRNA
virale RNA
WBC
Leukozyten (white blood cells)
wt
Wildtyp
xg
Erdbeschleunigung (Angabe zur Zentrifugationsstärke)
147
Anhang
9.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Die Genomsegmente und die jeweiligen Genprodukte von Influenzaviren. ................. 4
Tab. 2: Daten beider Patienten und deren Krankheitsverlauf der 2009 pandemischen H1N1
Influenza. ................................................................................................................................ 70
Tab. 3: Aminosäuresequenz-Unterschiede im Genotyp von HH05 und HH15 (pH1N1). ....... 71
Tab. 4: MLD50 Werte von alt-saisonalen H1N1, HH05 (pH1N1), HH15 (pH1N1) und humanen
H5N1 Influenzaviren in BALB/c und C57BL/6J Mäusen. ....................................................... 75
Tab. 5: Blutparameter von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und
humanen H5N1-infizierten BALB/c Mäusen. .......................................................................... 79
Tab. 6: Blutparameter von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und
humanen H5N1-infizierten C57BL/6J Mäusen. ...................................................................... 80
Tab. 7: Schematische Darstellung der in vitro und in vivo Unterschiede von HH15 (pH1N1)
im Vergleich zu HH05 (pH1N1) ............................................................................................ 130
148
Anhang
9.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Morphologie von Influenza A Virionen. ........................................................................ 3
Abb. 2: Replikationszyklus von Influenzaviren. ........................................................................ 7
Abb. 3: Wirtsspektrum von Influenzaviren .............................................................................. 10
Abb. 4: Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts ......................................................... 13
Abb. 5: Anzahl gemeldeter Fälle der 2009 pH1N1 Influenza in den USA und Deutschland in
2009. ...................................................................................................................................... 22
Abb. 6: Ursprung und genetische Zusammensetzung der 2009 pH1N1 Influenzaviren. ....... 24
Abb. 7: Darstellung der zu erwartenden Bandengrößen der viralen Gensegmente auf einem
Agarosegel. ............................................................................................................................ 46
Abb. 8: Aufbau zur Evaluierung der Kontakt-Transmission bei Meerschweinchen. ............... 61
Abb. 9: Aufbau zur Evaluierung der Aerosol-Transmission bei Meerschweinchen. ............... 61
Abb. 10: Aufbau zur Evaluierung der Aerosol-Transmission bei Frettchen. ........................... 62
Abb. 11: Wachstumsverhalten von alt-saisonalen H1N1, HH05 und HH15 (pH1N1) und
humanen H5N1 Influenzaviren in humanen Lungenzellen..................................................... 72
Abb. 12: Überlebensrate und Gewichtsverlust von alt-saisonalen H1N1-, HH05- (pH1N1),
HH15- (pH1N1) und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. ................. 74
Abb. 13: Virustiter in Lunge, Gehirn und Darm von alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-,
HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. ................. 76
Abb. 14: Immunhistologische Färbung von Lungenschnitten von alt-saisonalen H1N1-, HH05
(pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und humanen H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. 78
Abb. 15: Lokale und systemische Level von Th1- (TNF-α, IFN-γ, MCP-1) und Th2- Zytokinen
(IL-4, IL-6, IL-10) in alt-saisonalen H1N1-, HH05 (pH1N1)-, HH15 (pH1N1)- und humanen
H5N1-infizierten BALB/c und C57BL/6J Mäusen. .................................................................. 82
Abb. 16: Genotyp, MLD50 und Virustiter in der Lunge von 2009 pH1N1rek-infizierten
C57BL/6J Mäusen. ................................................................................................................. 86
Abb. 17: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Lungenschnitten von 2009 pH1N1rekinfizierten C57BL/6J Mäusen. ................................................................................................ 88
149
Anhang
Abb. 18: Lymphozytenwerte im Blut von 2009 pH1N1rek-infizierten C57BL/6J Mäusen. ...... 89
Abb. 19: Strukturelle Lokalisierung der HH15 (pH1N1)-spezifischen HA Mutation. ............... 90
Abb. 20: Strukturelle Lokalisierung der HH15 (pH1N1)-spezifischen NP Mutationen V100I,
I133L und I373T. .................................................................................................................... 91
Abb. 21: Hämagglutination von humanen und Hühnererythrozyten durch rekombinante und
parentale 2009 pH1N1 Influenzaviren. ................................................................................... 93
Abb. 22: Polymeraseaktivität der RNP-Komplexe von HH05, HH15 und deren Kombination in
humanen Zellen...................................................................................................................... 94
Abb.
23:
Gewichtsverlust
von
HH05
(pH1N1)-
oder
HH15
(pH1N1)-infizierten
Meerschweinchen. ................................................................................................................. 96
Abb. 24: Virustiter in der Nasenspülung der Trachea und der Lunge von HH05 (pH1N1)- und
HH15 (pH1N1)-infizierten Meerschweinchen. ........................................................................ 97
Abb. 25: Pathologie der Lunge von HH05 (pH1N1)- und HH15 (pH1N1)-infizierten
Meerschweinchen. ................................................................................................................. 98
Abb. 26: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Trachea und Lunge von HH05 (pH1N1)- und
HH15 (pH1N1)-infizierten Meerschweinchen. ........................................................................ 99
Abb. 27: Transmission von HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) im Meerschweinchen........ 101
Abb. 28: HAI-Titer im Serum von Meerschweinchen 28 Tage nach HH05 (pH1N1)- und HH15
(pH1N1)-Infektion, sowie im Serum von Sentineltieren des Aerosol-Transmissionsversuchs.
............................................................................................................................................. 102
Abb. 29: Gewichtsverlust von HH05 (pH1N1)- oder HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen. .. 104
Abb. 30: Körpertemperatur von HH05 (pH1N1)- oder HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen.104
Abb. 31: Virustiter in der Nasenspülung, der Trachea und der Lunge von HH05 (pH1N1)oder HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen. ............................................................................ 105
Abb. 32: In situ-Hybridisierung viraler RNA in Trachea und Lunge von HH05 (pH1N1)- und
HH15 (pH1N1)-infizierten Frettchen. .................................................................................... 106
Abb. 33: Transmission von HH05 (pH1N1) und HH15 (pH1N1) im Frettchen. .................... 108
Abb. 34: HAI-Titer im Serum von Frettchen nach der Infektion mit HH05 (pH1N1) oder HH15
(pH1N1) sowie im Serum von Sentineltieren im Aerosol-Transmissionsversuch. ............... 109
150
Anhang
9.4 Primerlisten
Die Oligonukleotide für die Sequenzierung und Genotypisierung von Virus-DNA sowie für die
Mutagenese und die Klonierung von Plasmid-DNA wurden wie unter 3.1.2 beschrieben
entworfen und vom Dienstleister Eurofins MWG Operon synthetisiert. F oder fw steht für
Vorwärtsprimer und RV oder rv steht für Rückwärtsprimer.
Sequenzierung-/Genotypisierungsprimer
Bezeichnung
Sequenz (5‘3‘)
1918-PB2-501F
GGCACAGGATGTAATCATGG
1918-PB2-1025F
CAAGTGGCTCATCAGTCAAG
1918-PB2-1505F
GGGTGGTGGTGAGCATTGAC
1918-PB2-2019F
ACTCACAGTTCTCGGAAAGG
PB2_299_FW1
ACATGGTGGAATAGGAATGG
PB2_1003_FW2
AAGGACAAGCGGATCATCAG
PB2_1701_FW3
GGTCACAAGATCCCACAATG
PB2_2265_RV4
TTGGTCGCTGTCTGGCTGTC
PB2_1684_RV3
TTCCCAGTTCCTGATTATCC
PB2_1024_RV2
GACTGATGATCCGCTTGTCC
PB2_496_RV1
CACATCCTGTGCCTCCTTG
1918-PB1-484F
GGCCTCACGGCCAATGAATC
1918-PB1-1000F
ACCAGAAATCAGCCCGAATG
1918-PB1-1542F
CATGGAGCTTCCCAGCTTTG
1918-PB1-1901F
ACCCACTGAACCCATTTGTC
PB1_396fw
CGCCAGACTTATGATTGGAC
PB1_1062fw
ATGGCAAGACTAGGGAAAGG
PB1_1764fw
CAAACCCAATCAAAGGTAGG
PB1_873rv
CATTTGCCAGTTTGGCCTTC
PB1_1642rv
GGTCCAAGGTCATTGTTTATC
1918-PA-491F
CCACAAAGGCCGACTACACT
1918-PA-1038F
GAAGCAAGTACTGGCAGAAC
1918-PA-1498F
AAGGAGGGAAGACGAAAGAC
1918-PA-2025F
TATCGTTCAGGCTCTTAGGG
PA_257fw
TTGAAGGAAGAGACCGAATC
PA_965fw
TTGGCTGGAAAGAGCCTAAC
PA_1666fw
CTCTTGAGGACTGCGATAGG
151
Anhang
PA_815rv
GGTGTCGTCCTCAAGAATGG
PA_1502rv
CCTTCTTTGGTCCTACATTTG
1918-HA-531F
TGGCTGACAAAGAAGGGAAG
1918-HA-1020F
AGGATGGCTACAGGACTAAG
1918-HA-1381F
GAACCCTGGATTTCCATGAC
HA_601fw
ACTAGTGCTGACCAACAAAG
1918-NP-503F
CTCTTGTTCGCACCGGAATG
1918-NP-940F
GTCGGAATAGACCCTTTCAG
1918-NP-1255F
GGCCAAATCAGCGTGCAACC
NP_744fw
CTTGTTCGCACCGGAATG
NP_977fw
AAACCCAGCTCACAAGAGTC
NP_781rv
TCTTCAATCTCAGCGTTTCC
NP_1297rv
GCCATAACGGTTGCTCTTTC
1918-NA-490F
CTTAATGAGCTGCCCTGTTG
1918-NA-997F
GCGTCCCAATGATGGAACAG
NA_510fw
GTGAAGTTCCCTCTCCATAC
1918-M-506F
TCTCACAGGCAAATGGTGAC
1918-NS-516F
CCTTCTCTTCCAGGACATAC
CMV_F
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
BGH_R
TAGAAGGCACAGTCGAGG
Mutageneseprimer
Bezeichnung
Sequenz (5‘3‘)
PB2_Mut_1020fw
GCGGATCATCAGTCAAGAAAGAAGAAGAAGTGCTAACGG
PB2_Mut_1020rv
CCGTTAGCACTTCTTCTTCTTTCTTGACTGATGATCCGC
PB2_Mut_1577fw
TGAAACGCAAGGAACTGAGAGGTTGACAATAACTTATTCGTCATC
PB2_Mut_1577rv
GATGACGAATAAGTTATTGTCAACCTCTCAGTTCCTTGCGTTTCA
PA_Mut_1741fw
CAAGATGAAATGGGGCATGGAACTGAGGCGCTGCCTTCTTCAG
PA_Mut_1741rv
CTGAAGAAGGCAGCGCCTCAGTTCCATGCCCCATTTCATCTTG
NP_Mut_298fw
GGAGGACCCATATATAGAAGAGTAGACGGAAAGTGGATGAGAG
NP_Mut_298rv
CTCTCATCCACTTTCCGTCTACTCTTCTATATATGGGTCCTCC
NP_Mut_397fw
GGCGAAGATGCAACAGCAGGTATTACTCATATCATGATTTGG
NP_Mut_397rv
CCAAATCATGATATGAGTAATACCTGCTGTTGCATCTTCGCC
NP_Mut_1118fw
CTTCAAATGAGAATGTGGAAATCATGGACTCCAATACCCTGGAAC
152
Anhang
NP_Mut_1118rv
GTTCCAGGGTATTGGAGTCCATGATTTCCACATTCTCATTTGAAG
NA_Mut_95fw
AAATTGGAAACATAATCTCAACATGGATTAGCCACTCAATTCAAC
NA_Mut_95rv
GTTGAATTGAGTGGCTAATCCATGTTGAGATTATGTTTCCAATTT
NA_Mut_316fw
GGCTATATACAGTAAAGACAACAGTGTAAGAATCGGTTCCAAGG
NA_Mut_316rv
CCTTGGAACCGATTCTTACACTGTTGTCTTTACTGTATATAGCC
NA_Mut_742fw
TAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAG
NA_Mut742rv
CTTGTATGAGGCCTGTCCATTACTTGGTCCATCGGTCATTA
Klonierungsprimer
Bezeichnung
Sequenz (5‘3‘)
PHW-1918-PB2f
gaagttggggggg AGCGAAAGCAGG TC
PHW-1918-PB2r
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG TCGTTT
PHW-1918-PB1f
gaagttggggggg AGCGAAAGCAGG CAAAC
PHW-1918-PB1r
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG CATTT
PHW-1918-PAf
gaagttggggggg AGCGAAAGCAGG TAC
PHW-1918-PAr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG TACTT
PHW-1918-HAf
gaagttggggggg AGCAAAAGCAGG GG
PHW-1918-HAr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG GTG
PHW-1918-NPf
gaagttggggggg AGCAAAAGCAGG GTA
PHW-1918-NPr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG GTATTTTT
PHW-1918-NAf
gaagttggggggg AGCGAAAGCAGG AGT
PHW-1918-NAr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG AGT
PHW-1918-Mf
gaagttggggggg AGCAAAAGCAGG TAG
PHW-1918-Mr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG TAG
PHW-1918-NSf
gaagttggggggg AGCAAAAGCAGG GTG
PHW-1918-NSr
ccgccgggttatt AGTAGAAACAAGG GTG
Uni12
AGCGAAAGCAGG
Schnittstellenprimer
Bezeichnung
Sequenz (5‘3‘)
NP-Sonde_fw
GAGATCT GAATTC GAACTGAGAAGCAGATACT
NP-Sonde_rv
CGATGA GGTACC ACTCCTCTGCATTGTC
153
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
Publikationen
Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden zum Teil in den folgenden Publikationen veröffentlicht:
Otte A., Dove B., Marriott A., Sauter M., Klingel K., Carroll M., Gabriel G. (2013)
Single Mutations in HA and NP Mediate Differential Pathogenicity and Transmission of 2009
Pandemic H1N1 Influenza Virus in Small Animal Models.
Manuskript in Vorbereitung.
Otte A. and Gabriel G. (2011)
2009 Pandemic H1N1 Influenza A Virus Strains Display Differential Pathogenicity in
C57BL/6J but not BALB/c Mice.
Virulence. 2:6.
Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2011)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models.
Am J Pathol. 179:1
Weitere Publikationen während der Promotion
Czudai-Matwich V., Gabriel G., Otte A., Klenk H-D. (2013)
Pathogenicity of Influenza A Virus of Subtype H5N1 to Mice is Increased by Mutation PB2
S714R of the Polymerase.
Manuskript in Vorbereitung.
Schwalm F., Otte A., Gabriel G., Klenk H-D. (2011)
Adaptive Mutations in the PB2-subunit of Pandemic A/Hamburg/05/2009 (H1N1) Increase
the in vitro Polymerase Activity and in vivo Pathogenicity in the C57BL/6 Mouse Model.
Manuskript in Vorbereitung.
154
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
Gabriel G., Klingel K., Otte A., Thiele S., Hudjetz B., Arman-Kalcek G., Sauter M., Shmidt T.,
Rother F., Baumgarte S., Keiner B., Hartmann E., Bader M., Brownlee GG., Fodor E., Klenk
H-D. (2011)
Differential Use of Importin-α Isoforms Governs Cell Tropism and Host Adaptation of
Influenza Virus.
Nat Commun. 2:156.
Vorträge auf Fachtagungen
(*präsentierender Autor)
*Otte A., Gabriel G. (2012)
Molecular Determinants of 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus Pathogenicity and
Transmission in Experimental Animal Models
HPI Joint Scientific Retreat, Hamburg, Deutschland
*Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2012)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models.
P³AGI Summer School 2012 - Imaging Innovations of the Lung, Göttingen, Deutschland
Resa Infante P., Otte A., *Gabriel G. (2012)
Molecular Determinants of 2009 pandemic H1N1 pathogenicity: Virus-Host Interactions.
1st Flupharm Annual Meeting, Paris, Frankreich
*Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2011)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models
Flupharm Kickoff Meeting 2011, Grenoble, Frankreich
*Gabriel G., Klingel K., Otte A., Thiele S., Arman-Kalcek G., Sauter M., Shmidt T., Rother F.,
Baumgarte S., Keiner B., Hartmann E., Bader M., Brownlee GG., Fodor E., Klenk HD.
(2011).
Interspecies Transmission and Pathogenesis of Influenza A Viruses.
LCI Symposium Co-Infection 2011, Hamburg, Deutschland
155
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
*Otte A., Gabriel G. (2010)
Differential Pathogenicity of Pandemic 2009 (H1N1v) Influenza A Virus Strains in Mice.
HPI Scientific Retreat, Hamburg, Deutschland
*Gabriel G., Klingel K., Otte A., Thiele S., Arman-Kalcek G., Sauter M., Shmidt T., Rother F.,
Baumgarte S., Keiner B., Hartmann E., Bader M., Brownlee GG., Fodor E., Klenk HD.
(2010).
Differential use of importin-α isoforms governs cell tropism and host adaptation of influenza
virus.
14th International Conference on Negative Strand Viruses (2010), Brügge, Belgien
Posterpräsentationen auf Fachtagungen
(*präsentierender Autor)
*Otte A. and Gabriel G. (2013)
Single mutations in HA and NP mediate enhanced pathogenicity of 2009 H1N1 pandemic
influenza virus in mice.
8th International Conference on Options for the Control of Influenza, Cape Town, South Africa
*Otte A. and Gabriel G. (2013)
Single mutations in HA and NP mediate enhanced pathogenicity of 2009 H1N1 pandemic
influenza virus in mice.
15th International Conference on Negative Strand Viruses, Granada, Spanien
*Otte A. and Gabriel G. (2012)
Single mutations in HA and NP mediate enhanced pathogenicity of 2009 H1N1 pandemic
influenza virus in mice.
3rd International Influenza Meeting, Münster, Deutschland
*Otte A. and Gabriel G. (2012)
Single mutations in HA and NP mediate enhanced pathogenicity of 2009 H1N1 pandemic
influenza virus in mice.
22nd Annual Meeting of the German Society for Virology, Essen, Deutschland
156
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
*Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2011)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models.
HPI Joint Scientific Retreat, Hamburg, Deutschland
*Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2011)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models.
4th ESWI Influenza Conference, Malta
*Otte A., Sauter M., Alleva L., Baumgarte S., Klingel K., Gabriel G. (2011)
Differential Host Determinants Contribute to the Pathogenesis of 2009 Pandemic H1N1 and
Human H5N1 Influenza A Viruses in Experimental Mouse Models.
21st Annual Meeting of the German Society for Virology, Freiburg, Deutschland
Stolter C., Averdung M., Billerbeck S., Deventer S., Kleinschmidt B., Kremers D., Ostwald A.,
*Otte A., Waldmann M., Yousef S. (2008)
The influence of secondary plant metabolites of coniferous trees on bank voles.
101st Annual Conference of the German Society for Zoology, Jena, Deutschland
157
Wissenschaftlicher Werdegang
Wissenschaftlicher Werdegang
2003 - 2008
Studium der Biologie, Universität Hamburg,
Hauptfächer: Zoologie, Biochemie
2008 – 2009
Diplomarbeit am Zoologischen Institut der Universität Hamburg,
Abteilung Tierphysiologie bei Prof. Dr. Thorsten Burmester
Thema: „Differenzielle Genexpression während der Ästivation
des Kleinen Igeltenrek Echinops telfairi“
2009 – 2013
Promotion
am
Heinrich-Pette-Institut,
Leibniz-Institut
für
Experimentelle Virologie, Abteilung Influenza Pathogenese bei
PD Dr. Gülsah Gabriel
Thema:
“Charakterisierung
der
Pathogenität
und
Transmissibilität von 2009 pandemischen H1N1 Influenza A
Viren in Kleintiermodellen”
Stipendien
Reisekostenförderung durch die GlaxoSmithKline Stiftung für die Teilnahme an der „8th
International Conference on Options for the Control of Influenza, Cape Town, South Africa“.
(2013)
Reisekostenförderung durch die Universität Hamburg, Abteilung für Forschung und
Wissenschaftsförderung zur Teilnahme an „22nd Annual Meeting of the German Society for
Virology, Essen, Deutschland“. (2012)
Mobilitätsstipendium vom Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie
für Forschungsarbeiten an der Health Protection Agency, Porton Down, Großbritannien.
(2012)
European Young Scientist Fund Stipendium vom Young Scientist Fund zur Teinahme an der
4th ESWI Influenza Conference, Malta. (2011)
Danksagung
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei PD Dr. Gülsah Gabriel bedanken, vor allem für die
Möglichkeit meine Doktorarbeit über ein so spannendes und gesellschaftsrelevantes Thema
anzufertigen, für die gute Betreuung und Unterstützung während der Promotion sowie die
Breitschaft zur Begutachtung dieser Arbeit.
Prof. Dr. Thomas Dobner möchte ich für sein Einverständnis zur schriftlichen Begutachtung
dieser Arbeit danken.
Prof. Dr. Jörg Ganzhorn und Prof. Dr. Wolfram Brune danke ich für Ihre Bereitschaft als
Prüfungskommission, zusammen mit PD Dr. Gülsah Gabriel, meine Disputation zu leiten
bzw. zu begutachten.
Bei Prof. Dr. Karin Klingel und Dr. Martina Sauter möchte ich mich für die Durchführung
sowie
für
die
Hilfe
bei
der
Auswertung
der
in
situ-Hybridisierung
und
der
immunhistologischen Färbung der Gewebeschnitte bedanken.
Unseren Kollaborationpartnern von Public Health England, Porton Down, Großbritannien, vor
allem Dr. Brian Dove, Dr. Anthony Marriott und Irene Taylor möchte ich für die
experimentelle Unterstützung in der Durchführung der Infektionsversuche im Frettchen
danken.
Dr. Bastian Tiemann und Bianca Ziesch danke ich für die Hilfe bei der Etablierung des
Meerschweinchenmodells.
Dorothee Kampmann danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei den Experimenten zu
dieser Arbeit.
Bei meinen jetzigen und früheren Kollegen aus der Arbeitsgruppe von PD Dr. Gülsah Gabriel
möchte ich mich herzlich für jegliche fachliche und nicht-fachliche Unterstützung sowie die
außergewöhnlich tolle Atmosphäre bedanken; besonders bei Julia Hoffmann und Patricia
Resa Infante die zu jeder Tag- und Nachtzeit für mich da waren.
Mein größter Dank gilt natürlich meinen Eltern sowie meinem Lebenspartner Oliver für die
unendliche, liebevolle und geduldige Unterstützung.
Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift selbst verfasst
und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Hamburg, den 13.02.2014
(Anna Otte)