Zur Bedeutung von somatischen Mutationen und - E

Zur Bedeutung von
somatischen Mutationen und
Keimbahnmutationen des HMGA2 Gens bei
Tumorerkrankungen
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
-DR. RER. NAT.-
DEM
PROMOTIONSAUSSCHUß DR. RER. NAT.
IM
FACHBEREICH BIOLOGIE / CHEMIE DER UNIVERSITÄT BREMEN
VORGELEGT VON
INGA VON AHSEN
BREMEN, DEZEMBER 2005
1. GUTACHTER: PROF. DR. J. BULLERDIEK
2. GUTACHTER: PROF. DR. H. WENK
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS………………………………………………………............III
1
EINLEITUNG……………………………………………………………………………. 1
2
MATERIAL UND METHODEN………………………………………………………...6
2.1
2.2
ZELLMATERIAL……………………………………………………………………………….…6
2.1.1
GENOMISCHE KLONE……………………………………………………………………………...6
2.1.2
PRIMÄRES ZELLMATERIAL…………………………………………..…………………………...6
2.1.3
ZELLLINIEN………………………………………………………………………..………………..10
ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN……………………..……………………………….10
2.2.1
PAC-, COSMID- UND PLASMID-DNA ISOLIERUNG…………………..………………………10
2.2.2
DNA-ISOLIERUNG………………………………………………………………………………....11
2.2.3
RNA-ISOLIERUNG…………………………….........................................…………………...…11
2.3
cDNA-ERST-STRANG-SYNTHESE…………………............…………………………........11
2.4
PCR…………………………………………………………...............…………………………12
2.5
RT-PCR……………………………………………………….........……………………………12
2.6
3’RACE-PCR…………………………………………………............…………………………12
2.7
GELELEKTROPHORESE………………………………………………..........………………13
2.8
HERSTELLUNG VON DNA-SONDEN....................………………………....………..........13
2.9
SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG……………………………………………….......…13
2.10 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA…………………..................…………………………14
2.11 HERSTELLUNG VON KLONIERUNGSVEKTOREN….........………………………………15
2.12 LIGATIONEN………………………………………........…………………………....…………15
2.13 TRANSFORMATIONEN………………………….............……………………………………15
2.13.1
HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN….......................15
2.13.2
TRANSFORMATION VON E. coli...…………………......................…………………………16
2.14 ZELLKULTUREN…………….........……………………………………………………………16
2.14.1
KULTIVIERUNG VON ZELLEN……….....................…………………………………………16
2.14.2
KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN………………………........................……………16
2.14.3
AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN……………………………………......................16
2.15 ZYTOGENETISCHE PRÄPARATION………………………………………………….........17
2.15.1
CHROMOSOMENPRÄPARATION……………………………………......................………17
2.15.2
G-BANDING ALS VORBEREITUNG ZUR FISH………………………………....................17
2.16 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH)…………………………………......17
2.16.1
MARKIERUNG DER SONDEN-DNA DURCH NICK TRANSLATION…....................……17
I
INHALTSVERZEICHNIS
2.16.2
FLUORESZENZ IN-SITU-HYBRIDISIERUNG…………………….……...................……...18
2.17 SEQUENZIERUNGEN......................................................................................................18
2.18 IN SILICO-ANLYSEN…………………......……………………………………………………18
3 ERGEBNISSE..............................................................................................................19
3.1
IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER CHROMOSOMALEN
ABERRATION IN DER REGION 12q13-15 UND 13q12-14 KONNTE KEIN HMGA2LHFP FUSIONSGEN DETEKTIERT WERDEN............…………………………………….19
3.2
IN ALLEN UNTERSUCHTEN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT
EINER t(3;12)(q27-28;q14-15) WIRD EIN IDENTISCHES HMGIC-LPP TRANSKRIPT
EXPREMIERT..………………………………..........................………………………………20
3.3
EXPRESSIONSMUSTER VOM HMGA2-LPP FUSIONSTRANSKRIPT IN
CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER
t(3;12)(q27-28;q14-15).…….............................................................................................21
3.4
EIN TEIL DES HMGA2-LOKUS IST IN EINEM LIPOM MIT DER t(3;12)(q27-28;q14-15)
VON EINER DELETION BETROFFEN………………………………………....…..............22
3.5
EIN NEUES LPP-FUSIONSGEN WEIST AUF DIE ENTSCHEIDENDE ROLLE VON
TRUNKIERTEN LPP PROTEINEN IN LIPOMEN UND CHONDROIDEN
LUNGENHAMARTOMEN HIN……...........………………………..………………...............22
3.6
IN NUR EINEM VON 61 CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINEM
NORMALEN KARYOTYP WIRD DAS HMGA2-LPP FUSIONSTRANSKRIPT
EXPREMIERT……………………………………………………………................…………23
3.7
FÜR DIE MEHRHEIT DER LEIOMYOME DES UTERUS SIND KEINE
KEIMBAHNMUTATIONEN DES HMGA2-GENS VERANTWORTLICH……………........24
4 DISKUSSION……………………………….………………….………….………….……26
5 ZUSAMMENFASSUNG………………………………………………………………......34
6 SUMMARY………………………………………………………………………………....36
7 LITERATUR……………………………………………………………………………......38
DANKSAGUNG………………………………………………………………………….........51
PUBLIKATIONSÜBERSICHT….………………………………………………………........52
II
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
µg, µl, µm
Mikrogramm, -liter, -meter
AS
Aminosäure
bp
Basenpaare
C
Celsius
cDNA
komplementäre DNA
C-terminal
Carboxyterminal
dATP
Desoxy-Adenosin-5’-Triphosphate
dCTP
Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphate
dGTP
Desoxy-Guanosin-5’-Triphosphate
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxy-Nukleosid-5’-Triphosphate
DTT
Dithiotreithol
dTTP
Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphate
dUTP
Desoxy-Uracil-5’-Triphosphate
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ERG
Eppendorf-Reaktionsgefäß
EtOH
Ethanol
FISH
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
FCS
Fötales Kälberserum
g
Gravitationsbeschleunigung
GAPDH
Glyceraldehyde-3-Phosphat Dehydrogenase
GTG
G Bänderung mit Trypsin und Giemsa
h
Stunde
HMG
High Mobility Group
HMGA1
HMGA1-Gen (ehemals HMGIY)
HMGA1
Protein des HMGA1-Gen (HMGA1a und HMGA1b)
HMGA2
HMGA2-Gen (ehemals HMGIC)
HMGA2
Protein des HMGA2-Gen
kb
Kilo-Basenpaare
M
Molar
Mb
Mega-Basenpaare
mg, ml, mM Milligramm, -liter, -molar
III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
min
Minute
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
ng, nm, nM
Nanogramm, -meter, -molar
ORF
Offenes Leseraster
OT
Objektträger
PAC
P1 abgeleitetes, artifizielles Chromosom
PCH
chondroides Lungenhamartom
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
RACE
Rapid Amplification of cDNA Ends
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse-Transkription-PCR
sec
Sekunde
UTR
Untranslatierte Region
UV
ultraviolett
v
Volumen
w
Gewicht
IV
EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Viele Erkrankungen beruhen auf Mutationen, die die funktionellen Interaktionen der
Transkriptionsregulation und vorangehende oder nachfolgende Signalwege
beeinflussen. Eine Gruppe von Transkriptionsregulatoren sind die High Mobility
Group (HMG) Proteine, die in den 70er Jahren von Goodwin und seinen Mitarbeitern
(Goodwin et al.,1973) entdeckt wurden und in den letzten Jahren mehr und mehr
durch die Entdeckung ihrer kausalen Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen an
Bedeutung gewonnen haben.
Die Mitglieder der Familie der HMG-Proteine kodieren für nukleare Nicht-HistonProteine, welche mit geringer Spezifität DNA binden, die als so genannte
architektonische Transkriptionsfaktoren die Chromatin-Struktur verändern und DNAabhängige Prozesse wie Transkription, Replikation, Rekombination und DNAReparatur beeinflussen. (Bustin und Reeves, 1996; Bustin 1999). Funktionell lassen
sich die HMG-Proteine durch ihre DNA-bindenden Domänen in drei Subfamilien, die
HMG Nukleosom bindenden Proteine (HMGN), die HMG Box bindenden Proteine
(HMGB) und die HMG AT-Hook bindenden Proteine (HMGA), unterteilen.
Die HMGN-Familie besteht aus Proteinen, die an die Innenseite nukleosomaler DNA
binden und damit die Interaktion zwischen DNA und dem Histon Oktamer
beeinflussen (Shick et al., 1985; Bustin und Reeves, 1996). Durch Interaktionen der
C-terminalen Domäne der HMGN-Proteine mit den Histonen H1 und H3 können sie
die Chromatinstruktur modifizieren, um dadurch die Transkription zu erleichtern, ohne
dabei selbst ein Bestandteil des Transkriptionskomplexes zu sein (Trieschmann et
al., 1995; Bustin, 1999).
Zur Familie der HMGB-Proteine gehören die drei Mitglieder HMGB1, HMGB2 und
HMGB3. Die HMGB-Proteine bestehen aus zwei homologen DNA-bindenden
Domänen (A- und B-Box) und einer sauren C-terminalen Domäne (Reeck et al.
1982). Mit Hilfe dieser HMG-Boxen erfolgt das strukturspezifische Binden der DNA.
HMGA Proteine sind architektonische Transkriptionsfaktoren (Thanos und Maniatis,
1992), die auf die Organisation des Chromatins bzw. der Chromosomen einwirken.
Die HMGA-Subfamilie setzt sich aus sechs Mitgliedern zusammen: Aus dem auf
Chromosom 6p21.3 lokalisiertem HMGA1 Gen mit seinen sich unterscheidenden
1
EINLEITUNG
Splicevarianten HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c (Friedmann et al., 1993) und dem
in der chromosomalen Region 12q14-15 gelegenen HMGA2-Gen (Schoenmakers et
al., 1995) mit seinen Splicevarianten HMGA2a und HMGA2b (Chau et al., 1995;
Hauke et al., 2002). Die HMGA-Proteine bestehen aus drei stark konservierten DNAbindenden Domänen, den sogenannten AT-Hooks, mit denen sie mit hoher Affinität
an die kleine Furche AT-reicher B-Form DNA binden (Solomon et al., 1986; Elton et
al.,1987; Reeves und Nissen, 1990) und einer sauren C-terminalen Domäne. Die
HMGA-Proteine erkennen mehr die DNA-Struktur als die Nukleotid-Sequenz (Reeves
und Nissen, 1990; Reeves und Wolffe, 1996), wodurch sie bevorzugt an irreguläre
Strukturen wie for-way-junction DNA (Hill und Reeves, 1997), supercoiled-DNA
(Nissen und Reeves, 1995) und an nukleosomale Kern-Partikel (Reeves und Nissen,
1993) binden und dadurch die DNA biegen, strecken, entwickeln und supercoils in
sie einfügen (Bustin und Reeves, 1996).
Die HMGA-Proteine können allein keine Transkription auslösen, sondern
ermöglichen durch eine Konfirmationsänderung der DNA definierte Protein-DNA und
Protein-Protein-Wechselwirkungen (Wolffe, 1994). Die Bildung von Enhanceosomen
in der Promotorregion von regulierten Zielgenen, werden durch HMGA-Proteine
unterstützt, indem sie zwischen den beteiligten Transkriptionsfaktoren kooperative
Bindungen vermitteln. Dadurch nehmen sie regulatorisch auf die Expression vieler
Gene Einfluss, wodurch es zur Aktivierung oder Inhibierung der Genexpression
kommen kann (Thanos und Maniatis, 1995; John et al., 1995). Bisher konnte gezeigt
werden, dass mindestens 18 verschiedene Transkriptionsfaktoren reguliert und
dadurch mehr als 40 verschiedene virale und eukaryotische Gene in ihrer Expression
durch HMGA-Proteine kontrolliert werden (Reeves und Beckerbauer, 2001).
HMGA-Proteine sind hauptsächlich in proliferierenden, undifferenzierten Zellen aktiv.
Dementsprechend ist eine starke Expression dieser Gene während der
Embryogenese zu finden. Im adulten, differenzierten Gewebe ist HMGA2 gar nicht
und HMGA1 nur noch in sehr geringen Konzentrationen detektierbar. Lediglich in der
Retina ist HMGA1 stark exprimiert (Bussemarkers et al., 1991; Chiapetta et al., 1996;
Rogalla et al., 1996; Zhou et al., 1996; Chau et al., 2000).
Expressionsuntersuchungen von HMGA-Proteinen in verschiedenen embryonalen
Entwicklungsstadien der Maus zeigten, dass HMGA1 und HMGA2 in allen Geweben
in früher Phase exprimiert wurden. In der zweiten Hälfte der Embryonalentwicklung
2
EINLEITUNG
zeigte sich eine eingeschränkte Expression von HMGA2 im mesenchymalen
Gewebe, das sich zu Knorpel und Muskel differenziert sowie in einigen epithelialen
Zellschichten und Teilen des zentralen Nervensystems (Hirning-Folz et al., 1998).
HMGA1 hingegen wurde in allen, aber nur in einigen Geweben stark exprimiert
(Chiappetta et al., 1996).
Neben dem bedeutenden Einfluss der HMGA-Proteine in der Tumorgenese durch
eine Reaktivierung ihrer Expression, spielen die HMGA-Proteine eine weitere Rolle in
der Proliferation von Fettgewebe, sowie nach Verletzungen von Blutgefäßen in
glatten Muskelzellen (Chau et al., 1995; Chin et al., 1999; Foster et al., 1998; Anand
und Chada, 2000; Melillo et al., 2001) und sind in apoptotische Prozesse involviert
(Diana et al., 2001; Sgarra et al., 2003).
In vielen verschiedenen malignen Tumoren wie die der Schilddrüse (Chiapetta et al.
1995), des Colons (Fedele et al. 1996; Abe et al., 1999), der Brust (Ram et al., 1993;
Rogalla et al., 1997), der Lunge (Rogalla et al., 1998a), der Bauchspeicheldrüse
(Abe et al., 2000; Abe et al., 2003), der Prostata (Bussemakers et al., 1991; Tamimi
et al., 1993), der Cervix (Bandiera et al., 1998), sowie bei Lymphomen, Leukämien
und Liposarkomen (Wood et al., 2000; Rommel et al. 1997; Berner et al., 1997)
wurde eine Überexpression der HMGA-Proteine gefunden, so dass die HMGA1
Expression als Indikator für neoplastische Transformation (Goodwin et al. 1985;
Giancotti et al., 1987, 1989; Chiapetta et al., 1998) und für die Progression maligner
Tumoren diskutiert wird (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Chiapetta et
al., 1995).
Die Expression des HMGA2-Gens soll hingegen in Brust- und Lungenkarzinomen mit
dem Tumorgrading korrelieren.
Benigne mesenchymale Tumoren stellen die größte Gruppe gutartiger Neoplasien
des Menschen dar. Zu den häufigsten chromosomalen Veränderungen bei diesen
Tumoren gehören Aberrationen des Chromosoms 12, insbesondere in dem Bereich
12q14-15. Schoenmakers et al. (1995) konnten mit Hilfe der Bruchpunktklonierung
herausfinden, dass in der betroffenen Region das HMGA2-Gen lokalisiert ist und das
Zielgen der chromosomalen Aberration darstellt.
Die häufigsten von dieser Aberration betroffenen mesenchymalen Tumoren beim
Menschen sind die Lipome (Heim et al., 1986; Turc-Carel et al., 1986; Mandahl et al.,
1987; Sreekantaiah et al., 1991; Belge et al., 1992). Sie bestehen aus subkutanen
3
EINLEITUNG
und intramuskulären Fettgewebe. Die Leiomyome des Uterus (Heim et al., 1988;
Turc-Carel et al., 1988; Vanni und Lecca, 1988), mesenchymale Muskeltumoren,
gehören mit einer Inzidenz von etwa 30% bei Frauen über 30 Jahren zu den
häufigsten Tumoren der Frau überhaupt (Norris und Zaloudek, 1982).
Weitere Tumoren mit Veränderungen der Region 12q14-15 sind chondroide
Hamartome der Lunge (Fletcher et al., 1991; Dal Cin et al., 1993), die neben
Knorpel-, Muskel-, Fett- und undifferenzierten mesenchymalen Zellen auch Epithel
des respiratorischen Traktes umfassen, chondromatöse Tumoren (Bridge et al.,
1992; Mandahl et al., 1989), pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen (Mark et
al., 1980; Mark und Dahlenfors, 1986; Bullerdiek et al., 1987), benigne Tumoren der
Brust (Birdsal et al., 1992; Rohen et al., 1995; Staats et al.,1996),
Endometriumpolypen (Walter et al., 1989; Vanni et al., 1993; Dal Cin et al., 1995),
Hämangiopericytome (Mandahl et al., 1993), diffuse Astrocytome (Jenkins et al.,
1989), aggressive Angiomyxome (Kazmierczak et al., 1995), und Osteoclastome
(Noguera et al., 1989).
Auf molekulargenetischer Ebene besteht das HMGA2-Gen strukturell aus 5 Exons
und 4 Introns und überspannt eine genomische Distanz von ca. 142 kb (Chau et al.
1995; Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1996). Die ersten drei Exons, die
jeweils einen AT-Hook kodieren, werden durch ein ca. 112 kb langes Intron 3 vom
Exon 4 und Exon 5, die die carboxyterminale Protein-bindende Domäne kodieren,
getrennt (Chau et al., 1995; Hauke et al., 2002). Der häufigste Bruchpunkt
chromosomaler Aberrationen in menschlichen Tumoren befindet sich im Intron 3 des
HMGA2-Gens (Kazmierczak et al., 1996a). Durch dieses Bruchereignis ersetzen
ektopische Sequenzen die carboxyterminale Protein-bindende Domäne (Gattas et al.
1999; Rogalla et al., 1997), als auch die AT-Hooks des HMGA2-Gens (Petit et al.,
1996; Schoenmakers et al.,1999). Derartige chromosomale Bruchereignisse konnten
bisher in Lipomen (Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1995; Petit et al.,1996),
chondroiden Hamartomen der Lunge (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et
al., 1995, 1996a), Uterus Leiomyomen (Schoenmakers et al.,1995),
Endometriumpolypen (Schoenmakers et al., 1995; Bol et al., 1996), pleomorphen
Adenomen der Kopfspeicheldrüse (Schoenmakers et al., 1995), sowie für
Fribroadenome (Schoenmakers et al., 1995) und Angiomyxome (Schoenmakers et
al., 1995) gefunden werden. Zum einen kommt es in den verschiedenen
Tumorentitäten zur Entstehung trunkierter Transkripte, die Resultat von aberrantem
4
EINLEITUNG
Splicen mit Sequenzen aus dem Intron 3 oder Intron 4 von HMGA2 sind (Hauke et
al., 2001, 2002). Zum anderen findet eine Überexpression von nativem HMGA2 oder
chimärem HMGA2 statt.
Bei den chimären Formen von HMGA2 stellt die reziproke Fusion zwischen dem
HMGA2- und dem LPP-Gen (lipoma preferred partner) das am häufigsten zu
beobachtende Fusionsprodukt dar, welches bisher sowohl in Lipomen als auch in
Lungenhamartomen mit einer t(3;12)(q27;q14-15) gefunden wurde (Petit et al., 1996;
Rogalla et al., 1998b). Weitere Fusionspartner für das HMGA2 sind beispielsweise
LHFP (lipoma HMGIC fusion partner) (Petit et al., 1999), RAD51L1 (Schoenmakers
et al., 1999), ALDH2 (mitochondriale Aldehyd-Dehydrogenase 2 ) (Kazmierczak et
al., 1995) und FHIT (fragile histidine triad) (Geurts et al., 1997).
Eine spezifische Expression von Fusionstranskripten in einzelnen Tumorentitäten
konnte bisher nicht nachgewiesen werden. So wird das HMGA2/LPPFusionstranskript sowohl in Lipomen (Schoenmakers et al., 1995; Petit et al., 1996)
als auch in chondroiden Lungenhamartomen exprimiert (Rogalla et al., 1998b).
Vergleichende Untersuchungen von einer 3’ trunkierten HMGA2-Variante, einem
HMGA2/LPP-Fusionstranskript und dem nativen HMGA2 zeigten, das der Verlust der
carboxyterminalen Domäne und nicht die Fusion mit neuen funktionellen Domänen
für eine neoplastische Zelltransformation verantwortlich ist (Fedele et al., 1998).
Transgene Mäuse mit einer hohen Expression einer 3’ trunkierten HMGA2-Variante,
wiesen einen „giant“ Phänotyp mit Fettleibigkeit und einem hohen Vorkommen an
Lipomen auf (Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Knock-out-Mäuse, mit einer
homozygoten Deletion des HMGA2-Gens, weisen hingegen Zwergwuchs und eine
starke Reduktion ihres Körperfettgehaltes auf (Zhou et al., 1995; Anand und Chada,
2000).
Ziel dieser Arbeit war es die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens bei somatischen
Mutationen der zytogenetischen Subgruppe benigner mesenchymaler Tumoren mit
einer Veränderung in der Region 12q14-15, insbesondere bei Lipomen und
chondroiden Hamartomen der Lunge zu analysieren und die Relevanz und Rolle des
HMGA2-Gens bei Keimbahnmutationen mit einer sich daraus resultierenden
möglichen individuellen genetischen Variabilität assoziiert mit einer Prädisposition in
der Tumorgenese zu detektieren.
5
MATERIAL UND METHODEN
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 ZELLMATERIAL
2.1.1 GENOMISCHE KLONE
Die PAC-Klone 12/1, 12/2 und 20422 wurden mit Hilfe spezifischer Primerpaare für
das HMGA2-Gen mittels PCR in einer humanen genomischen PAC-Libary (Genome
Systems, St. Louis, USA) identifiziert (Dr. V. Rippe, Universität Bremen; Hauke et al.
2002).
Zwei PAC-Klone wurden mittels PCR mit Hilfe spezifischer Primerpaare für das Exon
6 des LPP-Gens und das Intron 10/Exon 11 des LPP-Gens in einer humanen
genomischen PAC-Libary (Genome Systems, St. Louis, USA) gescreent (Rogalla et
al. 1998b).
Die Cosmide 202A1, 27E12 und 142/H1 sind der Region multipler Aberrationen auf
Chromosom 12q13-15 zugeordnet und stammen aus der LL12NC01-Cosmidbank
des humanen Chromosoms 12 (Schoenmakers et al. 1995).
2.1.2 PRIMÄRES ZELLMATERIAL
Tabelle 1: Für molekulargenetische Untersuchungen verwendete primäre chondroide
Lungenhamartome (F: weiblich, M: männlich).
Chondroide
Lungen-
Alter/
Karyotyp
Publikation
Geschlecht
hamartome
6
18/F
46,XX[12]
Kazmierczak et al. (1996b)
12
58/M
46,XY[10]
Kazmierczak et al. (1996b)
14
53/F
46,XX[9]
Kazmierczak et al. (1996b)
16
53/M
46,XY[3]
Kazmierczak et al. (1996b)
17
66/M
46,XY[13]
Kazmierczak et al. (1996b)
21
49/M
46,XY[11]
Kazmierczak et al. (1996b)
6
MATERIAL UND METHODEN
Chondroide
Lungen-
Alter/
Karyotyp
Publikation
Geschlecht
hamartome
35
50/M
46,XY[20]
Kazmierczak et al. (1996b)
40
40/M
46,XY,t(3;12)(q27;q15),der(10)add(10)(p15)
Kazmierczak et al. (1999a)
t(10;21)(q21;q21),der(21)t(10;21)(q21;q21)[20]
49
74/M
46,XY[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
53
48/F
46,XX[14]
Kazmierczak et al. (1999a)
58
61/M
46,XY[16]
Kazmierczak et al. (1999a)
60
62/M
46,XY[14]
Kazmierczak et al. (1999a)
64
61/M
46,XY[13]
Kazmierczak et al. (1999a)
69
55/F
46,XX,t(3;12)(q28;q15)[16] / 46,idem,del(1)(q2?),
Rogalla et al. (1998b)
der(3)add(3)(p21)dup(3)(q23q29)[2]
70
43/M
46,XY[19]
Kazmierczak et al. (1999a)
71
55/F
46,XX[13]
Kazmierczak et al. (1999a)
74
63/M
46,XY[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
75
46/M
46,XY[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
79
39/F
46,XX,del(6)(p21.1),der(12)t(12;13)(p12 or p13;q12)
t(12;17)(q15;p13),der(13)t(12;13)(q15;q12),
der(17)t(6;17)(p21.1;p13)[18]
Kazmierczak et al. (1999a)
80
34/M
46,XY[21]
Kazmierczak et al. (1999a)
85
52/F
46,XX,t(3;12)(q28;q15)[12] / 47,idem,+mar[2]
112
65/F
46,XX[6]
115
25/F
46,XX,t(3;12)(q27;q15)[14]
120
58/M
46,XY[17]
Kazmierczak et al. (1999a)
128
59/M
46,XY[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
129
60/M
46,XY,t(3;12)(q27;q15)[10]
132
44/F
46,XX[18]
Kazmierczak et al. (1999a)
142
56/M
46,XY[17]
Kazmierczak et al. (1999a)
145
68/F
46,XX[15]
Kazmierczak et al. (1999a)
Rogalla et al. (1998b)
Kazmierczak et al. (1999a)
Rogalla et al. (1998b)
Rogalla et al. (1998b)
7
MATERIAL UND METHODEN
Chondroide
Lungen-
Alter/
Karyotyp
Publikation
Geschlecht
hamartome
147
49/M
46,XY,del(6)(q24),t(12;13)(q15;q13)[22]
Kazmierczak et al. (1999a)
150
59/F
46,XX[9]
Kazmierczak et al. (1999a)
153
48/F
46,XX,t(3;12)(q27 or q28;q15)[12]
155
44/F
46,XX[20]
Kazmierczak et al. (1999a)
157
71/M
46,XY[22]
Kazmierczak et al. (1999a)
158
58/M
46,XY[10]
Kazmierczak et al. (1999a)
172
42/F
46,XX[18]
Kazmierczak et al. (1999a)
174
71/M
46,XY[14]
Kazmierczak et al. (1999a)
175
33/M
46,XY[15]
Kazmierczak et al. (1999a)
181
53/F
45,XX,-12,der(13)t(12;13)(q13;q12),
del(14)(q22q24),der(18)t(12;18)(p11.2;p11.1)[9]
Kazmierczak et al. (1999a)
184
56/F
46,XX,t(3;12)(q27;q15)[15]
Kazmierczak et al. (1998)
190
60/M
46,XY[17]
Kazmierczak et al. (1999a)
194
56/F
46,XX[18]
Kazmierczak et al. (1999a)
197
47/F
46,XX[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
202
58/M
46,XY[16]
Kazmierczak et al. (1999a)
203
69/M
46,XY[9]
Kazmierczak et al. (1999a)
204
50/M
46,XY[17]
Kazmierczak et al. (1999a)
206
50/M
46,XY[12]
Kazmierczak et al. (1999a)
218
66/F
46,XX[9]
Kazmierczak et al. (1999b)
222
60/M
46,XY[15]
Kazmierczak et al. (1999b)
227
37/M
46,XY[17]
Kazmierczak et al. (1999b)
228
69/F
46,XX,der(13),t(13;14)(q14;q24),der(14),
t(12;14)(q15;q24)[19]
Kazmierczak et al. (1999b)
244
35/M
46,XY[16]
Kazmierczak et al. (1999b)
245
67/F
46,XX[17]
Kazmierczak et al. (1999b)
269
64/F
46,XX,t(3;12)(q27;q14 or q15)[12]/
46,XX,idem,der(15;18)(p10;p10)[3]
Kazmierczak et al. (1999b)
275
39/M
46,XY[20]
Kazmierczak et al. (1999b)
Rogalla et al. (1998b)
8
MATERIAL UND METHODEN
Chondroide
Lungen-
Alter/
Karyotyp
Publikation
Geschlecht
hamartome
276
67/F
46,XX[19]
Kazmierczak et al. (1999b)
283
51/F
46,XX,t(3;12)(q27;q15)[16]
Kazmierczak et al. (1999b)
296
64/F
46,XX[18]
Kazmierczak et al. (1999b)
300
60/F
46,XX,t(3;12)(q27;q14 or q15)[20]
Kazmierczak et al. (1999b)
309
23/F
46,XX[16]
Kazmierczak et al. (1999b)
318
83/F
46,XX[15]
Kazmierczak et al. (1999b)
321
61/M
46,XY[16]
Lemke et al. (2002)
322
65/F
46,XX[18]
Lemke et al. (2002)
323
39/M
46,XY[28]
Lemke et al. (2002)
324
58/M
46,XY[20]
Lemke et al. (2002)
329
70/M
46,XY[26]
Lemke et al. (2002)
330
58/F
46,XX[13]
Lemke et al. (2002)
333
57/F
46,XX[16]
Lemke et al. (2002)
340
64/M
46,XY[21]
Lemke et al. (2002)
343
65/F
46,XX[18]
Lemke et al. (2002)
345
52/M
46,XY[16]
Lemke et al. (2002)
350
66/M
46,XY[14]
Lemke et al. (2002)
360
34/F
46,XX[17]
Lemke et al. (2002)
361
60/F
46,XX[23]
Lemke et al. (2002)
379
61/F
46,XX[29]
Lemke et al. (2002)
Darüber hinaus wurde primäres normales Fetalgewebe, Embryonalgewebe, Testis,
Gewebe der Haut, Glandula Parotis, Schilddrüse, Pleura, Lunge, Mamma,
Myometrium, Colon sowie Fibroblasten und Lymphozyten verwendet.
9
MATERIAL UND METHODEN
2.1.3 Zelllinien
Die folgenden Zelllinien wurden vom Zentrum für Humangenetik der Universität
Bremen bereitgestellt und für Untersuchungen verwendet.
EFM19
immortale Mammakarzinom-Zelllinie
HeLa
immortale Zervixkarzinom-Zelllinie
L1236
immortale Leukämie-Zelllinie
Li-14
SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie
Li-167
SV40 transfizierte immortale Lipom-Zelllinie
MCF7
immortale Mammakarzinom-Zelllinie
MRIH186
immortale Zervixkarzinom-Zelllinie
S40
SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie
S121
SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie
S216
SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie
S270
SV40 transfizierte immortale Schilddrüsen-Adenom-Zelllinie
2.2
ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN
2.2.1 PAC-, COSMID- UND PLASMID-DNA ISOLIERUNG
Die Isolierung der PAC-, Cosmid- und Plasmid-DNA erfolgte nach dem Prinzip der
alkalischen Lyse mit nachfolgender Aufreinigung über Anionen-Austauscher-Säulen.
Hierfür wurden die kommerziellen DNA-Isolierungs-Kits „QIAGEN Plasmid Midi Kit“,
„QIAGEN Maxi Plasmid/Cosmid Purification-Kit“ und „QIAprep Spin Miniprep Kit“
(Qiagen, Hilden) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet
(QIAGEN Plasmid Purification Handbook, QIAprep Miniprep Handbook).
10
MATERIAL UND METHODEN
2.2.2 DNA-ISOLIERUNG
Die DNA-Isolierung wurde mit Hilfe der Salzextraktion nach Lahiri &Nurnberger
(1991) durchgeführt. 5ml Vollblut mit 100µl 15 %iger EDTA wurde mit 5 ml TKM1Puffer versetzt und vermischt. Zur Lyse der Zellen erfolgte die Zugabe von 150 µl
IGEPAL mit anschließendem mehrmaligen vortexen. Es folgte das Abzentrifugieren
bei 2.500 rpm für 10 min bei RT, der Überstand wurde vorsichtig dekantiert. Das
erhaltene Pellet wurde zweimal mit 5 ml TKM1-Puffer gewaschen und erneut bei
2.500 rpm für 10 min bei RT zentrifugiert.
Das Pellet wurde anschließend vollständig in 800 µl TKM2-Puffer resuspendiert und
in ein 2.0 ml Eppendorfcup überführen. Nach der Zugabe von 50 µl 10%iger SDS
wurde die Suspension gut vermischt und für 10 min bei 55°C im Wasserbad
inkubiert. Anschließend wurden dem Ansatz 300 µl 6 M NaCl (gesättigte Lösung)
zugegeben und bei 12.800 x g für 5 min zentrifugiert.
Dem Überstand, welcher die DNA enthält wurde gleiches Volumen Isopropanol
zugeführt. Das Cup wurde vorsichtig geschwenkt, bis die DNA präzipitiert war.
Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 12.800 x g für weitere 10 min bei 4°C.
Zum Abschluss wurde das Pellet mit 1 ml eiskaltem Ethanol (70%) gewaschen und
für 5 min erneut bei 12.800 x g bei 4°C zentrifugiert.
Das Pellet wurde bei RT getrocknet und in 200 µl TE-Puffer (pH 8.0) bei 65°C für 15
min resuspendiert.
2.2.3 RNA- ISOLIERUNG
RNA aus Geweben oder kultivierten Zelllinien wurde mit Hilfe des TRIzol-Reagenzes
(Invitrogen,Karlsruhe) nach Herstellerangaben auf der Basis des Einzelschritt SäurePhenol-Isolierungsprinzips für RNA isoliert.
2.3
cDNA-ERST-STRANG-SYNTHESE
Die cDNA-Erst-Strang-Sythese erfolgte standardmäßig an 5µg totaler RNA in einem
Volumen von 20 µl mit Hilfe von 200U M-MLV Reverser Transkriptase
(Invitrogen,Karlsruhe), 0,5 mM dNTPs, 1µM Poly(A)-Adapter-Primer
11
MATERIAL UND METHODEN
(AP1)(5’AAGGATCCGTCGACATCT(17)-3’), 1xReaktionspuffer (50mM TrisHCl/75mMKCl/3mM MgCl2;pH 8,3) und 0,01M 1,4-Dithiotreitol für 45 min bei 42°C.
Die Inaktivierung des Synthese-Ansatzes erfolgte durch eine 5-minütige Inkubation
bei 65°C.
2.4
PCR
Die Amplifikation von DNA Fragmenten mittels PCR erfolgte nach
Standardmethoden. Dazu wurden je nach Ansatz 0,5 U Taq-Polymease
verschiedener Hersteller mit dem jeweils zugehörigen 10x Puffer mit 50mM MgCl2,
100µM eines jeden dNTPs und je 200nM Sense- und Antisense-Primer in einem
Volumen von 50-100 µl in 0,5 ml PCR-Reaktiongefäßen eingesetzt. Die Reaktion
erfolgte im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg). Spezifische Angaben zu
Primern, eingesetzten Proben und Amplifikationsprofilen sind in den einzelnen
Publikationen in der Publikationsübersicht beschrieben. Die direkte Aufreinigung von
PCR-Ansätzen erfolgte mit Hilfe des QIAquick PCR purification Kits (Qiagen,Hilden)
entsprechend der Herstellerangaben.
2.5
RT-PCR
RT-PCRs wurden standardmäßig mit 2-7 µl cDNA, 0,5 U Taq-Polymerase (Qiagen,
Hilden), dem zugehörigen PCR-Reaktionspuffer mit 1,5 mM MgCl2, 1x Q-Solution
(Qiagen,Hilden), 100 µM eines dNTPs und je 200 nM Sense und Antisense-Primer in
einem Volumen von 20 µl angesetzt. Die Reaktion erfolgte im Mastercycler Gradient
(Eppendorf, Hamburg) mit Amplifikationsprofilen, die in den einzelnen Publikationen
beschrieben sind.
2.6
3’RACE-PCR
3’-RACE-PCRs wurden semi-nested durchgeführt. Für die erste und zweite PCRReaktion wurden als Antisense-Primer der universal-Adapter-Primer (UAP2) 5’-CUA
CUA CUA CUA CUA AAG GAT CCG TGG ACA TC-3’ und als Sense-Primer
12
MATERIAL UND METHODEN
genspezifische nested-Primer eingesetzt. Die PCR-Reaktionen erfolgten nach
standard PCR-Methoden, bei denen 5µl cDNA als Template für die erste PCR und
1 µl der ersten PCR als Template für die zweite PCR eingesetzt wurden. Spezifische
Angaben zu Sense-Primern und Amplifikationsprofilen sind in den jeweiligen
Publikationen beschrieben.
2.7
GELELEKTROPHORESE
Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA wurde je nach Fragmentgröße in 0,8
- 2%igen (w/v) Agarosegelen in 1x TAE-Puffer (0.04M Tris-Base; 1mM EDTA (pH
8,0); 20 mM Eisessig) durchgeführt. Die Proben sowie die Molekulargewichtsmarker
wurden mit 1/6 Volumen Gelbeladungspuffer (15% (w/v) Ficoll 400, 0,25% Xylen
Cyanol FF, 0,25% Bromphenolblau) versetzt. Die Elektrophorese wurde bei 80-100 V
durchgeführt,bis die Fragmente genügend aufgetrennt waren. Durch die Zugabe von
Ethidiumbromid wurden die aufgetrennten Nukleinsäuren im UV-Durchlicht bei 254
nm Wellenlänge nachgewiesen. Die Dokumentation erfolgte durch Fotographie (MP4 Kamerasystem, Polaroid). Mit Hilfe und nach den Protokollen des QIAExII Gel
Isolation Kits (Qiagen, Hilden) wurden die DNA-Fragmente aus Agarosegelen isoliert.
2.8
HERSTELLUNG VON DNA-SONDEN
Die Herstellung Digoxigenin-markierter DNA-Sonden für nicht radioaktive Southern
Blot-Hybridisierungen erfolgte mittels PCR unter Zusatz von 0,3 nM DIG-11-dUTP an
Plasmid-DNA oder PCR-Produkten. Das PCR-Produkt wurde im Agarosegel
aufgetrennt und die entsprechende Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die
Extraktion der DNA aus dem Gelfragment erfolgte nach Herstellerangaben mit dem
„QIAquick PCR Purification KIT“ (Qiagen, Hilden).
2.9
SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG
Die Methode des Southern Blots erfolgte nach einem modifizierten „HybondTM-N+“Protokoll (Amersham Biosciences, Freiburg). Zur Denaturierung der zuvor
13
MATERIAL UND METHODEN
aufgetrennten DNA wurde das Gel zweimal für je 15 min in 0,5 M NaOH inkubiert.
Nach Neutralisation für 30 min in 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl/1mM EDTA (pH 7,2)
erfolgte der Transfer auf eine positiv geladene Nylonmembran für 45 min bei 7 inch
Hg Unterdruck. Eine kovalente Bindung der DNA an die Nylonmembran erfolgte
anschließend durch UV-Crosslinking (0,4 J/cm2). Die Hybridisierung wurde nach
einem modifizierten „ExpressHyb Hybridization Solution“-Protokoll (BD Biosciences
Clontech, Palo Alto, USA) durchgeführt. Die Membran wurde für 30 min bei 60°C mit
5 ml vorgewärmter ExpressHyb-Lösung (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA)
pro 100 cm2 Membran prähybridisiert und anschließend 1 h bei 60°C mit 5ml/1mm
cm2 vorgewärmter Express-Hyb-Lösung mit ca. 5 ng/ml denaturierter Sonde
hybridisiert. Das Waschen der Membran erfolgte für zweimal 15 min mit
2xSSC/0,1%SDS bei RT, anschließend zweimal 15 min mit 0,1xSSC/0,1%SDS bei
60°C, dann 5 min mit 0,1 M Maleinsäure/ 0,15 M NaCl/0,3% Tween 20 (pH 7,5) bei
RT. Die Detektion der Digoxigenin-markierten DNA-Sonde erfolgte nach einem
modifizierten „DIG Application Manual for Filter Hybridization“ Protokoll (Roche
Diagnostics, Mannheim). Die Membran wurde für 30 min mit 0,1 M
Maleinsäure/0,15M NaCl/1% Blocking-Reagenz (pH 7,5) bei RT inkubiert. Im
Anschluss erfolgte eine Inkubation für 30 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl/1%
Blocking-Reagenz (pH 7,5) mit 75 mU/ml Anti-Digoxigenin-Antikörper bei RT. Die
Membran wurde dann zweimal 15 min mit 0,1 M Maleinsäure/0,15M NaCl/0,3%
Tween 20 (pH 7,5) bei RT gewaschen. Nach Inkubation für 5 min mit 0,1 M TrisHCl/0,1 M NaCl/50mM MgCl2 (pH 9,5) bei RT, erfolgte die Nachweisreaktion mittels
12,5 mM CDP-Star Substrat auf einem Film (Hyperfilm ECL; Amersham Biosciences,
Buckinghamshire, UK) nach Angaben des Herstellers.
2.10 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA
Für den enzymatischen Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen wurden die
spezifischen 10x Restriktionspuffer des Herstellers verwendet und auf 1x
Konzentration verdünnt. Die Aufreinigung geschnittener DNA erfolgte wahlweise über
die Ethanol-Fällung oder mit Hilfe des „QIAquick PCR Purification Kits“ (Qiagen,
Hilden) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
14
MATERIAL UND METHODEN
2.11 HERSTELLUNG VON KLONIERUNGSVEKTOREN
Zur Herstellung von Klonierungsvektoren wurde Vektor-DNA mit singulär
schneidenden Restriktionsendonukleasen über Nacht enzymatisch verdaut und
anschließend mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend
den Herstellerangaben aufgereinigt. Die Entfernung überstehender Phosphatreste an
den Restriktionschnittstellen erfolgte nach der Sambrook et al. (1989) beschriebenen
Methode. Dabei wurden je 100 pmol 5’-überstehende Enden mit 1 U CIP-Enzym in
einem Ansatz mit 1/10 Vol 10x CIP-Reaktionspuffer für 30min bei 37°C
dephosphoryliert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1/9Vol 10x CIP-Stop-Puffer
und Inkubation für 30 min bei 56°C gestoppt und mit dem „QIAquick PCR Purification
Kit“ aufgereinigt.
2.12 LIGATIONEN
Die Ligationen wurden in einem Gesamtvolumen von 10-20 µl durchgeführt. Das
Verhältnis von Vektor- zu Fragment-DNA betrug 1:1-1:5. Die Ligation von PCRProdukten erfolgte standardmäßig mit Hilfe des Vektor-Systems pGem-T Easy
(Promega, Mannheim) nach den Vorgaben des Herstellers. Die Ligation von
geschnittenen DNA-Fragmenten erfolgte mittels T4-DNA-Ligase (Promega,
Mannheim) in den Vektor pGem11zf+ (Promega, Mannheim). Die Ligation von 3’RACE-PCR-Produkten erfolgte standardmäßig in pGem-T Easy-Vektor (Promega,
Mannheim). Alternativ wurde das pAMP1-Vektor-System (Gibco BRL, Eggenstein)
entsprechend den Herstellerangaben verwendet.
2.13 TRANSFORMATIONEN
2.13.1 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN
Die Herstellung transformationskompetenter Bakterien aus Escherichia coli K12Sicherheitsstämmen wurde entsprechend dem „Standard Protokoll für die SEM
Präparation kompetenter Zellen“ (Inoue et al., 1990) durchgeführt.
15
MATERIAL UND METHODEN
2.13.2 TRANSFORMATION VON E. coli
Die Thermo-Transformation von Ligationsprodukten erfolgte nach dem Protokoll von
Inoue et al. (1990) in kompetente DH5α E. coli-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA).
2.14 ZELLKULTUREN
2.14.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN
Zellkulturen wurden in Medium TC 199 (20% fetales Kälberserum; 200 lU/ml
Penicillin; 200 mg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit
kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgte alle 2 bis 3 Tage. Bei einer konfluent
gewachsenen Zellschicht wurde die Zellkultur trypsiniert (0,05% Trypsin; 0,02%
EDTA) und auf neue Kulturflaschen passagiert.
2.14.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN
Zur Konservierung kultivierter Zellen wurden diese in Stickstoff eingefroren. Dazu
wurden die Zellen nach Ausbildung eines geschlossenen Monolayers trypsiniert, in 2
ml eiskaltem Medium TC199 mit 10% DMSO aufgenommen und in ein Kryoröhrchen
überführt. Das Einfrieren erfolgte stufenweise in folgenden Temperaturschritten:
0,7°C/min auf -13°C; 0,3°C/min auf -15°C und 1°C/min auf -120°C mit einem
Einfriergerät (CTE 880, Cryotechnik, Erlangen). Nach Beendigung des Vorganges
wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
2.14.3 AUFTAUEN EINGEFRORENER ZELLEN
In Stickstoff gelagerte Zellen wurden in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut.
Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Sarstedt-Röhrchen mit 8 ml
MediumTC199 überführt und 10 min bei 120 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen, das Pellet resuspendiert und mit 5 ml Medium TC199 in eine
Zellkulturflasche überführt.
16
MATERIAL UND METHODEN
2.15 ZYTOGENETISCHE PRÄPARATION
2.15.1 CHROMOSOMENPRÄPARATION
Die Präparation von Metaphase-Chromosomen wurde nach einer Methode von
Bullerdiek et al. (1987) durchgeführt. Waren mit dem Phasenkontrastmikroskop eine
ausreichende Anzahl proliferierender Zellen im Mitose-Stadium sichtbar, wurden die
Zellen mit Colcemid (0,004 mg/ml Medium) in der Metaphase arretiert. Nach einer
Inkubation von 4-6 h (Primärkulturen) bzw. 30 min (Zelllinien) wurden die Zellen
durch Trypsinierung (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) geerntet. Nach einer 20
minütigen hypotonen Behandlung in 1:6 verdünnter Medium/aqua bidest Lösung
wurden die Zellen in 3:1 Methanol/Eisessig-Gemisch über Nacht bei 4°C fixiert. Zur
Erlangung gespreizter Metaphase-Chromsomen wurde die fixierte Zellsuspension auf
eiskalte Objektträger getropft.
2.15.2 G-BANDING ALS VORBEREITUNG ZUR FISH
Die präparierten Metaphasen von Lymphozyten- bzw. Tumorzellkulturen wurden
einer GTG-Banding modifiziert nach Seabright (1971) zum Zwecke einer
Karyotypanalyse unterzogen. Die Präparate wurden mit einem Durchlichtmikroskop
(Axiophot, Zeiss) nach geeigneten, gespreizten Metaphase-Chromosomen
abgesucht. Die Dokumentation der Metaphasen erfolgte mit Hilfe einer
Bildverarbeitung mit dem Karyotypisierungs-Programm Mac-Type von Perceptive
Scientific International.
2.16 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH)
2.16.1 MARKIERUNG DER SONDEN-DNA DURCH NICK TRANSLATION
In die Sonden-DNA wurden mittels Nick Translation Biotin-markierte Nukleotide
(Biotin-16-dUTPs) oder Digoxigenin-markierte Nukleotide (DIG-11-dUTPs) eingebaut.
Das Labelling wurde nach dem Protokoll des Biotin-/DIG-Nick Translationsmix im
17
MATERIAL UND METHODEN
Handbuch „Nonradioactive in situ hybridization application manual“ von Roche
diagnostics durchgeführt.
2.16.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurde nach dem Protokoll von Kievits et al.
(1990) modifiziert durchgeführt. Die Auswertung der FISH-Versuche erfolgte an den
zuvor ausgesuchten Metaphasen: An einem UV-Durchlichtmikroskop, mit digitaler
Aufsatzkamera und mit dem Macintosh Programm MacProbe (Perspective Scientific
Instruments, England).
2.17 SEQUENZIERUNGEN
Sequenzierungen wurden von kommerziellen Anbietern (MWG-Biotech, München;
GAG, Bremen; Institut für Rechtsmedizin, ZKH St.-Jürgen-Str., Bremen)
durchgeführt. Für die Sequenzierung klonierter Fragmente wurden zumeist die
Standardprimer M13 uni (5’-TGTAAAACGACGGCC-AGT-3’) und M13 rev (5’CAGGAAACAGCTATGACC-3’) verwendet. Die Sequenzierung von PCR-Produkten
erfolgte jeweils mit den Primern, mit denen diese Produkte generiert worden waren.
Alle Sequenzdaten wurden manuell durch Überprüfung der Chromatogramme
verifiziert.
2.18 IN SILICO-ANALYSEN
Die Sequenzanalysen erfolgten mit Hilfe des Lasergene Software Paket (DNAstar,
Madison, USA). Für in silico Analysen von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen
wurden Online-Programme des National Center for Biotechnology Information
(Bethesda, USA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) genutzt.
18
ERGEBNISSE
3 ERGEBNISSE
3.1 IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER
CHROMOSOMALEN ABERRATION IN DER REGION 12q13-15 UND
13q12-14 KONNTE KEIN HMGA2-LHFP FUSIONSGEN DETEKTIERT
WERDEN.
I: Rogalla et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 133: 2002
Neben den beiden predominanten chromosomalen Veränderungen t(3;12)(q2728;q14-15) und t (12;14)(q14-q15;q23-q24) in Hamartomen der Lunge, Lipomen und
uterinen Leiomyomen, bei denen jeweils das HMGA2-Gen betroffen ist, wurde eine
weitere häufig auftretende Aberration t(12;13)(q14-q15;q12-q14) in Lipomen und
Hamartomen der Lunge beschrieben (Mandahl et al.,1994; Kazmierczak et al., 1995;
1999b). Auf molekulargenetischer Ebene wurde das Fusionsgen HMGA2-LHFP
(LHFP=lipom HMGA2 fusion partner) in einem Lipom mit einer t(12;13)(q14-q15;q12q14) identifiziert (Petit et al., 1999). Es stellt sich die Frage, ob das Fusionsgen
HMGA2-LHFP auch in anderen Tumorentitäten zu finden ist, wie z.B. das
Fusionsgen HMGA2-LPP, das sowohl in Lipomen als auch in Hamartomen der
Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) zu finden ist.
Aus diesem Grund wurden mittels RT-PCR und Southern blot Analysen drei
Lungenhamartome mit komplexen Aberrationen in den chromosomalen Regionen
12q14-15 und 13q12-14 sowie ein Lungenhamartom mit einer einfachen t(12;13) auf
das Vorkommen des HMGA2-LHFP Transkripts untersucht. Es zeigte sich, dass das
Fusionsgen HMGA2-LHFP nicht konstant in mesenchymalen Tumoren mit klonalen
Aberrationen in den chromosomalen Regionen 12q13-15 und 13q12-14 zu finden ist.
19
ERGEBNISSE
3.2 IN CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER
t(3;12)(q27-28;q14-15) WIRD EIN IDENTISCHES HMGA2-LPP
TRANSKRIPT EXPRIMIERT.
II: Rogalla et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 29: 2000
Bei Betrachtung der chimären Formen des HMGA2-Gens stellt das HMGA2-LPP
Fusionsgen das am häufigsten zu beobachtende Fusionsprodukt in Tumoren dar, das
bisher sowohl in Lipomen als auch in chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer
t(3;12)(q27-28;q14-15) gefunden wurde. Eine mögliche molekulare Variabilität des
HMGA2-LPP Fusionsgens könnte zu einem besseren Verständnis von der sich
unterscheidenden Histologie zwischen Lipomen, die homogen aus reifen Adipozyten
bestehen und Hamartomen der Lunge, die sich aus Chondrozyten, Adipozyten,
Muskelzellen, undifferenzierten Mesenchymalzellen und Epithel des respiratorischen
Traktes zusammensetzen, beitragen. Auch in anderen Neoplasien kommt es zur
Fusion identischer Gene in verschiedenen Tumorentitäten. Daher wurde
angenommen, dass der Phänotyp des Tumors sich durch variierende Bruchpunkte in
beiden Genen und sich damit verschiedene Varianten von Fusionsgenen ergeben
(Melo, 1996). Im HMGA2-LPP Fusionsgen konnten in neun Lipomen Variationen
identifiziert werden (Petit et al., 1996). So hatten acht Lipome ein identisches
Fusionstranskript, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des
LPP-Gens. In einem weiteren Lipom fusionierten jedoch Exon 1-3 vom HMGA2 mit
Exon 7-11 vom LPP.
Aus einer Serie von 364 chondroiden Hamartomen der Lunge wurden 13 Hamartome
mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) ausgewählt. Mittels RT-PCR, Southern blot und
Restriktionsenzymverdau wurde das HMGA2-LPP Fusionstranskript charakterisiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass alle PCR-Fragmente die gleiche Struktur aufwiesen,
Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPP-Gens. Ein entsprechendes
Fusionsprotein bestehend aus drei AT-Hooks und zwei LIM-Domänen.
20
ERGEBNISSE
3.3 EXPRESSIONSMUSTER VOM LPP-HMGA2 FUSIONSTRANSKRIPT IN
CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE MIT EINER t(3;12)
(q27-28;q14-15).
III: von Ahsen et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 163:
2005a
Da sich die unterschiedliche Histologie zwischen Lipomen und chondroiden
Hamartomen der Lunge und dessen histologische Heterogenität nicht durch ein
variierendes HMGA2-LPP Fusionstranskript erklären lässt, wurden in einem
nächsten Schritt Expressionsstudien vom LPP-HMGA2-Fusionsgen an chondroiden
Hamartomen der Lunge durchgeführt, um dort eine eventuelle molekulare Variabilität
des Fusionsgens zu detektieren und somit eine Erklärung für die unterschiedlichen
Phänotypen von Lipomen und Hamartomen der Lunge zu finden. Das reziproke
Fusionstranskript, bestehend aus Exon 1-8 des LPP-Gens und Exon 4-5 des
HMGA2-Gens wurde nur in einem von neun untersuchten Lipomen exprimiert (Petit
et al., 1996). Eine große Deletion des LPP-Lokus, hervorgerufen durch die
Translokation, scheint für das Fehlen des LPP-HMGA2 Transkripts in Lipomen
verantwortlich zu sein (Lemke et al., 2001).
Mit Hilfe von RT-PCR und Southern blot Analysen wurde die mögliche Expression
des LPP-HMGA2 Transkripts in elf Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q2728;q14-15) untersucht. In einer vorherigen Studie wurde gezeigt, dass alle elf
Hamartome der Lunge das gleiche HMGA2-LPP-Fusionsgen exprimierten (Rogalla et
al., 2000).
Das LPP-HMGA2-Fusionstranskript konnte in acht von elf Hamartomen der Lunge
mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) nachgewiesen werden. Klonierungs- und
Sequenzierungsanalysen zeigten, dass sich alle Fusionstranskripte aus Exon 1-8 des
LPP-Gens und Exon 4-5 des HMGA2-Gens zusammensetzen. Ein Protein
zusammengesetzt aus der prolinreichen Region und der ersten LIM-Domäne des
LPP-Gens und dem sauren Teil des HMGA2-Gens. Somit ist anzunehmen, dass in
chondroiden Hamartomen der Lunge neben dem HMGA2-LPP-Fusionsgen, dem
reziproken Fusionsgen eine pathologische Signifikanz zukommt.
21
ERGEBNISSE
3.4 EIN TEIL DES HMGA2-LOKUS IST IN EINEM LIPOM MIT DER
t(3;12)(q27-28;q14-15) VON EINER DELETION BETROFFEN.
IV: Lemke et al., Cancer Genetics and Cytogenetics, 129:
2001a
Auf Grund der Beobachtung, dass in Lipomen mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) das
reziproke Fusionstranskript LPP-HMGA2 häufig nicht zu detektieren ist (Petit et al.
1996) und die Hypothese aufgestellt wurde, dass durch die Translokation im
Bruchpunktbereich Chromosomenmaterial deletiert und somit das reziproke
Transkript nicht entstehen kann, wurde mittels FISH-Experimenten mit Proben vom
HMGA2- und LPP-Lokus ein Lipom mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) untersucht, bei
dem mit Hilfe von RT-PCR und Southern blot Analysen das HMGA2-LPP
Fusionstranskript nachgewiesen werden konnte, jedoch nicht das LPP-HMGA2
Fusionstranskript.
Die Ergebnisse der FISH-Analysen mit den Cosmid-Klonen 27E12, 142H1 und
202A1 sowie den PAC-Klonen 12/1, 12/2 und aus der chromosomalen Region 3q2728 zeigten Signale auf dem normalen Chromosom 12, auf dem derivativen
Chromosom 12, jedoch keine Signale auf dem derivativen Chromosom 3. Das
bedeutet, dass die t(3;12)(q27-28;q14-15) von einer großen Deletion begleitet wird.
Der Vergleich mit der genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus
(Schoenmakers et al. 1995) ergab, dass ca. 170 kb vom Chromosom 12 deletiert
sind. Somit kann das Fehlen des LPP-HMGA2 Fusionsgens in Lipomen mit einer
t(3;12)(q27-28;q14-15) durch eine Deletion erklärt werden.
3.5 EIN NEUES LPP-FUSIONSGEN WEIST AUF DIE ENTSCHEIDENDE
ROLLE VON TRUNKIERTEN LPP PROTEINEN IN LIPOMEN UND
CHONDROIDEN LUNGENHAMARTOMEN HIN.
V: Lemke et al., Cytogenetics and Cell Genetics, 95: 2001b
Vorangegangene Studien zeigten das Vorkommen einer Deletion, ausgelöst durch
die t(3;12)(q27-28;q14-15) in einem Lipom (Lemke et al., 2001). Die Expression des
22
ERGEBNISSE
HMGA2-LPP-Fusionstranskript in allen Tumoren mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15)
und das Fehlen des LPP-HMGA2-Fusionstranskript führte zu der Schlussfolgerung,
dass nur das HMGA2-LPP Fusionsgen von funktioneller Signifikanz in der
molekularen Pathogenese von Lipomen ist (Petit et al., 1996). Die Überlegung, dass
das Fehlen des LPP-HMGA2-Fusionsgens die Fusion mit Sequenzen 3’ vom HMGA2
mit dem 5’-Part des LPP-Gens nicht ausschließt, sind bisher als nicht relevant in der
Tumorentstehung betrachtet worden. Aus diesem Grund wurde ein Lipom mit einer
170 kb großen Deletion, mittels 3’ RACE analysiert.
In einem mesenchymalen Tumor konnte erstmals ein neues LPP-Fusionstranskript
detektiert werden, bestehend aus den Exons 1-6 des LPP-Gens und zwei terminalen
Exons eines bisher unbekannten Gens (Gen Bank Accession Number: AF 393503).
Das neue Gen, genannt C12orf9 (chromosome 12 open reading frame 9) ist
approximal 200 kb 3’ vom HMGA2-Gen lokalisiert. Das LPP-C12orf9 Fusionsprotein
besteht aus der Prolinreichen-Region des LPP-Gens und 28 Aminosäuren vom
C12orf9-Gen. Des weiteren wurde die genomische Struktur des C12orf9-Gens (Gen
Bank Accession Number: AF 393634) mit Hilfe von in silico Analysen durchgeführt,
bei denen keine positiven cDNAs oder ESTs in der NCBI Datenbank gefunden
wurden.
Bei zusätzlichen RT-PCR Experimenten mit C12orf9 spezifischen Primern konnte die
Expression in zehn verschiedenen Normalgeweben, zehn Hamartomen der Lunge,
acht verschiedenen Tumorzelllinien und einem weiteren Lipom nicht nachgewiesen
werden. Somit ist das C12orf9-Gen kein „echtes“ Gen, sondern wurde nur durch die
Deletion und Zusammenführung mit LPP, exprimiert. Ein trunkiertes LPP-Protein
oder LPP in Fusion mit anderen Genen außer HMGA2 weist demnach ein onkogenes
Potential auf.
3.6 IN NUR EINEM VON 61 CHONDROIDEN HAMARTOMEN DER LUNGE
MIT EINEM NORMALEN KARYOTYP WIRD DAS HMGA2-LPP
FUSIONSTRANSKRIPT EXPRIMIERT.
VI: Lemke et al., Cancer Genetic and Cytogenetics, 138: 2002
Auf zytogenetischer Ebene ist eine Erkennung von Mikro-Aberrationen nicht möglich.
23
ERGEBNISSE
So stellt sich die Frage, ob nicht doch kleine Subpopulationen von Tumorzellen mit
HMGA2 Rearrangierungen in einigen Tumoren aufzufinden sind. Die Existenz dieser
Populationen würde nahe legen, dass es sich bei der chromosomalen Aberration um
ein sekundäres Ereignis handelt.
Auf diesen Hintergrund Bezug nehmend, wurden 61 Hamartome der Lunge mit
einem scheinbar normalen Karyotypen mittels RT-PCR auf das Fusionsgen HMGA2LPP untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass in einem von 61 Hamartomen der Lunge das HMGA2LPP Transkript, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des LPPGens, exprimiert wurde. Zusätzlich wurde der positive Tumor auf das reziproke
Fusionstranskript untersucht. Mit Hilfe einer Semi-nested RT-PCR konnte keine
Expression des LPP-HMGA2 Fusionsgens nachgewiesen werden. Weitere dual-color
FISH-Analysen an dem positiven Hamartom wurden mit einem PAC-Klon, der das
vollständige Intron 3 des HMGA2-Gens beinhaltet und einem PAC-Klon, aus der
chromosomalen Region 3q27-28 durchgeführt.
Es zeigten sich Hybridisierungs-Signale von beiden Sonden auf einem anscheinend
normalen Chromosom 4, in 6 von 20 Metaphasen. Neben dieser Anordnung waren
LPP-spezifische Signale auf beiden normalen Chromosomen 3, jedoch zeigte nur ein
Chromosom 12 Signale der HMGA2-spezifischen Probe. Die Ergebnisse zeigen,
dass das HMGA2-LPP Fusionstranskript in kleinen Populationen von karyotypisch
normalen Hamartomen der Lunge nicht exprimiert wird und legt nahe, das
chromosomale Aberrationen primäre Ereignisse in gutartigen mesenchymalen
Tumoren darstellen.
3.7 FÜR DIE MEHRHEIT DER LEIOMYOME DES UTERUS SIND KEINE
KEIMBAHNMUTATIONEN DES HMGA2-GENS VERANTWORTLICH.
VII: von Ahsen et al., Molecular Human Reproduction
(Eingereicht) 2005b
Leiomyome des Uterus gehören zu den häufigsten Tumoren der Frau und treten bei
mehr als 30% aller Frauen über 30 Jahren auf (Norris und Zaloudek, 1982). Weil der
24
ERGEBNISSE
Ursprung dieser häufig auftretenden Neoplasie unbekannt ist, wurde eine genetische
Prädisposition, basierend auf Zwillingsstudien (Snieder et al., 1998) und familiären
Auffälligkeiten für diesen Tumor in betracht gezogen (Vikhlyaeva et al., 1995). Ein
Gen, das mit der Entstehung von Leiomyomen des Uterus assoziiert wird, ist HMGA2
(Schoenmakers et al., 1995; Ashar et al., 1995), welches durch Aberrationen in der
chromosomalen Region 12q14-15 in den meisten Fällen rearrangiert vorliegt. Obwohl
die Existenz einer genetischen Prädisposition in diesem häufig auftretenden Tumor
angenommen wird, wurden noch keine Untersuchungen zu Sequenzvariationen im
HMGA2-Gen unternommen. Ebenso sollten die Untersuchungen Aufschluss über
mögliche Sequenzvarianten in Bezug auf die Problematik der unterschiedlichen
Histologien von Lipomen und chondroiden Hamartomen der Lunge, sowie dessen
histologische Heterogenität geben.
Es wurde die kodierende Region des HMGA2-Gens von 87 gesunden
Kontrollpersonen sequenziert, um individuelle Unterschiede in der NukleotidSequenz zu detektieren, die mit einer genetischen Prädisposition assoziiert werden
können. Alle fünf Exons des HMGA2-Gens wurden mit spezifischen Primern mittels
PCR von 87 Individuen amplifiziert. Eine anschließende Sequenzierung jedes PCRFragments ergab eine G -> A Punktmutation an Position 26 im Exon 1, mit einem
Aminosäureaustausch im Codon 9 von Glycin zu Glutaminsäure.
25
DISKUSSION
4 Diskussion
Benigne mesenchymale Tumoren stellen die größte Gruppe gutartiger Neoplasien
des Menschen dar. Dabei ist das häufigste Ziel chromosomaler Rearrangierungen
die chromosomale Region 12q14-15. Mit Hilfe von Bruchpunktklonierungen konnten
Schoenmakers et al. (1995) in der betroffenen Region das HMGA2-Gen lokalisieren.
Die am häufigsten von einer Rearrangierung der chromosomalen Region 12q14-15
betroffenen mesenchymalen Tumoren sind u. a. Lipome (Heim et al., 1986; TurcCarel et al., 1986; Mandahl et al., 1987; Sreekantaiah et al., 1991; Belge et al.,
1992), die homogen aus reifen Adipozyten bestehen und zu den häufigsten
mesenchymalen Tumoren des Menschen gehören, chondroide Hamartome der
Lunge (Fletcher et al., 1991; Dal Cin et al., 1993), die zu den häufigsten benignen
Tumoren der Lunge zählen und sich aus Chondrozyten, Adipozyten, Muskelzellen,
undifferenzierten Mesenchymzellen und Epithel des respiratorischen Traktes
zusammen setzen, sowie Leiomyome des Uterus (Heim et al., 1988; Turc-Carel et
al., 1988; Vanni und Lecca, 1988), mesenchymale Muskeltumoren, die zu den
häufigsten Tumoren der Frau gehören und in mehr als 30% aller Frauen über 30
Jahren auftreten (Norris und Zaloudek, 1992).
Diese chromosomalen Rearrangierungen führen häufig zu Fusionsgenen. Die am
häufigsten zu beobachtenden Fusionsprodukte stellen die reziproken Fusionen
zwischen dem HMGA2- und LPP-Gen dar. Diese Fusion wurde sowohl in Lipomen
als auch in chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15)
gefunden (Petit et al., 1996; Rogalla et al., 1998), sowie die Fusion zwischen dem
HMGA2- und RAD51L1-Gen in uterinen Leiomyomen mit einer t(12;14)(q14-15;q2324) (Schoenmakers et al., 1995).
Neben diesen beiden prominenten Translokationen, wurde eine weitere
Translokation t(12;13)(q14-15;q12-14) in einem Lipom detektiert, bei dem das
Fusionsgen HMGA2-LHFP entsteht (Petit et al., 1999). Der Frage nachgehend ob ein
weiteres gemeinsames Fusionsgen in Lipomen und Hamartomen besteht, wurden in
der vorliegenden Arbeit vier Hamartome mit einer t(12;13)(q14-15;q12-14)
untersucht, bei denen HMGA2-LHFP nicht nachgewiesen werden konnte.
26
DISKUSSION
Frühere Studien korrelierten die Genese verschiedener Tumorentitäten mit der
Expression spezifischer HMGA2-Fusionsgene, bei denen die DNA-bindendenDomänen (DBD’s) des HMGA2 mit funktionellen Domänen anderer Gene
fusionierten. So wurde die Entstehung von Lipomen mit der Fusion der DBD’s mit
den proteinbindenden LIM-Domänen des LPP korreliert (Ashar et al., 1995; LovellBadge 1995). Um die unterschiedliche Histologie zwischen Lipomen und
chondroiden Hamartomen der Lunge sowie deren histologische Heterogenität trotz
gleicher zytogenetischer Veränderung, der t(3;12)(q27-28;q14-15) aufzuklären,
wurden im ersten Schritt mögliche molekulare Variabilitäten des Fusionsgens
HMGA2-LPP untersucht. Auch in anderen Neoplasien fusionieren identische Gene in
verschiedenen Tumorentitäten. Demnach wurde angenommen, dass variierende
Bruchpunkte in beiden Genen und somit verschiedene Fusionsproteine den
Phänotyp des Tumors bestimmen. So konnte Melo (1996) postulieren, dass bei der
Translokation t(9;22) der Bruchpunkt in den Fusionsgenen BCR und ABL mit den
genauen klinischen und morphologischen Formen der chronischen myeloischen
Leukämie (Ph+ CML) oder der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) assoziiert
werden kann.
Beim HMGA2-LPP Fusionsgen konnten Petit et al. (1996) bei der Analyse von neun
Lipomen zeigen, dass das Fusionsgen nicht konstant identisch ist. So zeigten acht
Lipome ein identisches Fusionsgen (Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des
LPP-Gens), ein Lipom zeigte jedoch ein Fusionstranskript bestehend aus den Exons
1-3 vom HMGA2- und Exon 7-11 vom LPP-Gen.
In der vorliegenden Arbeit wurden 13 chondroide Hamartome der Lunge mit einer
t(3;12)(q27-28;14-15) untersucht. Eine molekulargenetische Variabilität der
Fusionsgene konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigten sich bei allen 13
untersuchten chondroiden Hamartomen der Lunge die gleichen HMGA2-LPP
Fusionstranskripte, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2-Gens und Exon 9-11 des
LPP-Gens, woraus sich folgern lässt, dass andere Faktoren für die histologischen
Unterschiede verantwortlich sind.
In vitro und in vivo-Studien belegen, dass das tumorigene Potential der HMGA2Transkripte eher auf die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen als auf die
Entstehung funktionell neuartiger Transkripte zurückzuführen ist. Versuche mit
murinen NIH3T3-Zellen ergaben sowohl für eine 3’trunkierte HMGA2-Variante, die
27
DISKUSSION
nur die DNA-bindenden-Domänen kodiert, als auch für das HMGA2-LPP
Fusionstranskript das gleiche neoplastische Transformationspotential (Fedele et al.,
1998). Darüber hinaus entwickelten transgene Mäuse, die die trunkierte HMGA2Variante exprimierten, einen ‚giant’ Phänotyp mit stark ausgeprägter abdominaler
Lipomatose, einhergehend mit einer außergewöhnlich hohen Prävalenz für Lipome
(Battista et al., 1999; Arlotta et al., 2000). Dies weist darauf hin, dass für die
Adipogenese die Reexpression der DNA-bindenden-Domänen des HMGA2-Gens
wesentlich ist, nicht aber die Expression von HMGA2-LPP Fusionstranskripten
(Fedele et al., 2001). Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen
Expressionsmuster von HMGA2-LPP würden zwar die Genese der Lipome erklären,
nicht aber die Heterogenität der chondroiden Hamartome, die lediglich aus 10% reifer
Adipozyten bestehen.
In einem zweiten Schritt wurden Untersuchungen durchgeführt, die Aufschluss über
die Relevanz des reziproken Fusionsgens LPP-HMGA2 in der histologischen
Variabilität von chondroiden Hamartomen der Lunge geben sollten.
Die LPP-HMGA2 Expressionsstudien zeigten in 8 von 11 chondroiden Hamartomen
der Lunge mit einer t(3;12), die alle das HMGA2-LPP Fusionstranskript aufweisen,
dass Fusionsgen LPP-HMGA2, bestehend aus Exon 1-8 vom LPP- und Exon 4-5
vom HMGA2-Gen. In einer Arbeit von Petit et al., (1996) wurde nur in einem von
neun Lipomen mit einer t(3;12) das LPP-HMGA2 Fusionsgen nachgewiesen. Die
Expression des HMGA2-LPP Transkripts in allen Lipomen und die Abwesenheit des
LPP-HMGA2 Fusionsgens hatte zu der Annahme geführt, dass nur die HMGA2-LPP
Fusion bzw. die DNA-bindenden-Domänen der trunkierten Form von HMGA2 von
funktioneller Signifikanz sind. So kann dieses für Lipome angenommen werden,
jedoch nicht für chondroide Hamartome der Lunge mit einer t(3;12).
Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlossen werden,
dass neben der HMGA2-LPP Fusion das reziproke Fusionsgen LPP-HMGA2 bzw.
ein trunkiertes LPP-Gen in der Pathogenese von chondroiden Hamartomen
signifikant ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bei uterinen Leiomyomen mit einer
t(12;14) von Schoenmakers et al. (1999) beschrieben. Neben der Dysregulation von
HMGA2 führt auch die Expression trunkierter oder aberranter RAD51L1 Proteine zu
einem tumorspezifischen Merkmal.
28
DISKUSSION
Um den molekularen Hintergrund bzw. das Fehlen des LPP-HMGA2 Fusionsgens in
Lipomen aufzuklären, wurde ein Lipom mit einer t(3;12)(q28-27;q14-15) näher
untersucht. Mittels RT-PCR konnte das HMGA2-LPP Fusionsgen, bestehend aus
Exon 1-3 vom HMGA2 und Exon 9-11 vom LPP detektiert werden, welches klar
einen Bruch im Intron 3 des HMGA2-Gens belegt, jedoch nicht das reziproke LPPHMGA2. Basierend auf der Hypothese, dass das Fehlen von LPP-HMGA2 durch
eine Deletion ausgelöst durch die Translokation erklärt werden könnte, wurden FISHAnalysen mit einer Vielzahl von Proben 3’ des HMGA2 Bruches durchgeführt.
Fehlende Signale auf dem (der) 3 Chromosom und der Vergleich mit der
genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus (Schoenmakers et al., 1995) ergaben
eine 170 kb große Deletion des Chromosoms 12.
Mit diesen Ergebnissen lässt sich auch das Fehlen des LPP-HMGA2 Transkripts in 8
von 9 Lipomen erklären (Petit et al., 1996).
Vergleichend wurden einfache Deletionen, die eine reziproke Translokation begleiten
z.B. auch in chronischen myeloischen Leukämien mit einer t(9;22)(q34;q11)
(Popenoe et al., 1986) oder in follikulären Lymphomen mit einer t(14;18)(q32;q21)
gefunden (Zelnetz et al., 1993).
Die Abwesenheit des Fusionsgens LPP-HMGA2 (Lemke et al., 2001) schließt nicht
aus, dass Fusionstranskripte bestehend aus dem 5’ Part von LPP und anderen
Sequenzen 3’ vom HMGA2 existieren und eine Rolle in der Tumorentstehung
spielen. Die Hypothese, dass LPP in Fusion mit anderen Genen außer mit HMGA2
eine Rolle in der Tumorentstehung spielt wurde von Daheron et al. (2001) postuliert.
Hier wurde eine klonale t(3;11)(q28;q23) mit einer Fusion des LPP- und dem MLLGen in einer sekundären akuten Leukämie beschrieben. Ebenso konnten
Schoenmakers et al. (1999) nachweisen, dass neben der Dysregulation von HMGA2
ein knock out von Splicevarianten des RAD51L1-Gens in uterinen Leiomyomen mit
einer t(12;14) ein tumorspezifisches Merkmal aufweisen. Auf diesen Hintergrund
bezogen wurden 3’RACE-Experimente an dem Lipom mit einer 170 kb großen
Deletion auf Chromosom 12 3’ des HMGA2-Gens durchgeführt (Lemke et al., 2001).
Das LPP-C12orf9 Fusionsgens, das dabei detektiert wurde codiert ein Protein
bestehend aus der aminoterminalen Prolin-reichen Region von LPP und 28 AS vom
C12orf9-Gen. Es stellt sich die Frage ob ein LPP-Fusionsgen oder ein trunkiertes
LPP-Protein eine Rolle in der Tumorgenese spielt. Da das putative C12orf9-Gen
29
DISKUSSION
nicht in verschiedenen normalen Geweben exprimiert wird und nur aus 28 AS
besteht, handelt es sich wahrscheinlich nicht um ein „echtes“ Gen, sondern wird nur
als Resultat einer Deletion exprimiert und nur durch die Vereinigung mit LPP zu
einem echten Gen. Es wird in der vorliegenden Arbeit die Hypothese aufgestellt,
dass die mögliche Rolle von LPP-Fusionsproteinen aus der aberranten Expression
der Prolin-reichen-Region resultiert. Ähnliches zeigte sich bei dem Fusionsgen MLLAF3p21 (Sano et al., 2000). So konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein
anderes LPP Fusionsgen außer das LPP-HMGA2 in einem mesenchymalen Tumor
und das onkogene Potential von einem trunkierten LPP-Gen aufgeführt werden.
Da HMGA2-Mutationen eine verstärkte Proliferation mesenchymaler Zellen auslösen
und ihren Differenzierungsgrad beeinflussen (Ashar et al., 1995), ist es vorstellbar,
das die pathologische Heterogenität von chondroiden Hamartomen der Lunge sich
durch eine Translokation t(3;12) in einer Stammzelle erklären lassen könnte.
Gewebespezifische Stammzellen kommen in allen adulten Organen vor. Sie besitzen
das Potential zu proliferieren und sich in unterschiedlichste terminal differenzierte
Zellen zu entwickeln (Zvaifler et al., 2000; Zuk et al., 2001). Sie sind daher
Ausgangspunkt von Geweberegeneration in den Geweben und Organen. Nach
bisheriger Meinung haben sie je nach Lokalisation eine Entwicklung durchgemacht,
die sie prädestiniert, einen gewebespezifischen Differenzierungsweg einzuschlagen.
So können mesenchymale Stammzellen (MSC) zu Chondrozyten, Adiopozyten,
Osteoblasten, Fibroblasten und Myozyten werden. Diese Prägung - das so genannte
Committment - determiniert die Zellen möglicherweise nicht unwiderruflich, so dass
sie prinzipiell auch in Zellen differenzieren können, die nicht spezifisch dem
jeweiligen Gewebe zugeordnet werden können. In vitro können beispielsweise MSC
auch in Zellen differenziert werden, die neuronale Charakteristika aufweisen. Derzeit
wird zudem das Potential vieler unterschiedlich ausgereifter Zellen untersucht, trotz
eines bereits deutlichen Phänotyps doch noch in eine Zellart anderer Provenienz
umzudifferenzieren. Ebenfalls könnte angenommen werden, dass die Translokation
eine Dedifferenzierung der bereits differenzierten Zellen bewirkt.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war, versteckte HMGA2- Aberrationen in
zytogenetisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge zu detektieren.
Zytogenetische Analysen von Kurzzeit-Kulturen einer großen Serie benigner
mesenchymaler Tumoren zeigten, dass in einer beträchtlichen Anzahl in Tumoren
mit klonalen Veränderungen, zytogenetisch normale Zellen vorhanden sind (Mark et
30
DISKUSSION
al., 1990; Skreekantaiah et al., 1991; Kazmierczak et al., 1999). Basierend auf
diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich chromosomale
Rearrangierungen in der Folge von unbekannten primären submikroskopischen
Veränderungen ereignen können. Augenscheinlich wurde diese Hypothese von
Klonalitäts-Assays unterstrichen, durchgeführt mit DNA von Zellkulturen uteriner
Leiomyome (Marshal et al., 1994; Xing et al., 1997). Als Resultat von Fällen mit
Mosaiken, charakterisiert in Zellen mit klonalen karyotypischen Veränderungen und
karyotypisch normalen Zellen, zeigte sich ein monoklonales Muster von Chromosom
X Inaktivität. Diese Ergebnisse gelten für uterine Leiomyome, müssen aber nicht für
andere Tumorentitäten wie z.B. für chondroide Hamartome der Lunge und Lipome
gelten. Um die Rolle von Aberrationen mit der Involvierung von HMGA2 zu
verstehen, wurden Expressions- und FISH-Studien durchgeführt, um das Fusionsgen
HMGA2-LPP in kleinen Populationen karyotypisch normaler Zellen zu detektieren.
Nur in 1 von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge konnte das Fusionsgen
HMGA2-LPP detektiert werden. In diesem Tumor zeigte sich eine versteckte
Aberration, die mit zytogenetischen Methoden nicht detektierbar war.
Somit konnte in einer Serie von 61 chondroiden Hamartomen der Lunge mit
normalem Karyotyp kein Beweis für die Existenz kleiner Subpopulationen von Zellen
mit einer HMGA2-LPP-Fusion gefunden werden. Vorausgesetzt, dass es sich um ein
Ereignis sekundärer Natur handelt, würde das Vorkommen dieses Fusionsgens in
einer Subpopulation in einer beträchtlichen Anzahl von Tumoren erwartet werden.
Die Ergebnisse erlauben aber den Schluss, dass die t(3;12)(q27-28;q14-15) in
chondroiden Hamartomen der Lunge ein primäres Ereignis ist. So konnte zum ersten
Mal gezeigt werden, das das HMGA2-LPP-Fusionsgen nicht in kleinen Populationen
von karyotypisch normalen chondroiden Hamartomen der Lunge exprimiert wird und
stark auf einen primären Vorgang chromosomaler Aberrationen hinweist. Ebenso
schließt das primäre Vorkommen der t(3;12) nicht aus, dass diese Translokation per
se nicht ausreichend ist, um ein chondroides Hamartom der Lunge zu induzieren,
sobald es in einer einzigen Zelle vorkommt.
Trotz der entscheidenden Rolle von HMG-Proteinen in der Pathogenese von
mesenchymalen Tumoren wie Lipomen, Hamartomen der Lunge und uterinen
Leiomyomen sowie anderen Erkrankungen wie z.B. Lipomatose oder Adipositas,
wurden bisher keine Analysen im Hinblick auf individuelle genetische Variabilitäten
durchgeführt, die genetische Dispositionen erkennen lassen.
31
DISKUSSION
Keimbahnmutationen des HMGA2-Gens zeigten im Phänotyp eine Disposition zum
Groß- oder Kleinwuchs und zur Lipomatose (Zhou et al., 1995, Battista et al., 1999;
Arlotta et al., 2000).
Der Phänotyp eines 8 Jahre alten Jungen mit einer perizentrischen Inversion auf
Chromosom 12, inv(12)(p11.22;q14.3), zeigt ein übermäßiges Wachstum und
Lipomatose (Ligon et al., 2005).
Ein Dinukleotid-Repeat im HMGA2 Promoter wurde von Ishwad et al. (1997)
identifiziert. Dieser Polymorphismus besteht aus 18-37 Kopien eines (CT)-Repeats
mit einer beobachteten Heterogenität in 82-83% bei Afroamerikanern und
Kaukasiern. Das dieses polymorphe Dinukleotid Repeat im HMGA2 Promoter einen
entscheidenden Einfluss auf dessen Expressionsaktivität ausübt, wobei die
Promoteraktivität von der Länge des Repeats abhängig ist, konnte von Borrmann et
al. (2003) nachgewiesen werden. Durch die in dieser Arbeit durchgeführte
Sequenzierung des ORF vom HMGA2-Gen, konnte in 174 Allelen nur eine
Sequenzveränderung mit einem Aminosäure-Austausch detektiert werden. Dieses
Ergebnis lässt zum einen den Schluss zu, das Sequenzvariationen des HMGA2Gens bei der Tumorgenese insbesondere bei der Genese von uterinen Leiomyomen
sich auf Grund eines bisher unbekannten Ereignisses, beispielsweise einer
Virusinfektion (Bullerdiek, 1999) vollzieht.
Zum anderen wird dadurch verdeutlicht, dass es sich um ein hoch konserviertes Gen
handelt was durch die Untersuchungen von Manfioletti et al. (1991); Zhou et al.
(1996) und Kazmierzcak et al. (1998b) unterstützt wird. Um eine individuelle
genetische Disposition z.B. in der familiären Lipomatose oder Adipositas
auszuschließen oder ob erkrankte Gewebe durch spezifische
Sequenzveränderungen zu charakterisieren sind, bedarf es weiterer Analysen.
Die Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens sowie dessen Fusionspartner in der
Tumorgenese wurden in den vorliegenden Untersuchungen verdeutlicht. Es konnte
gezeigt werden, dass bei somatischen Mutationen dem reziproken LPP-HMGA2
neben dem HMGA2-LPP Fusionsgen in chondroiden Hamartomen der Lunge eine
pathologische Signifikanz zukommt. Veränderungen des HMGA2-Gens konnten als
primäres Ereignis in der Tumorgenese von chondroiden Hamartomen der Lunge
nachgewiesen werden. Erstmals konnte ein neues LPP-Fusionsgen in einem
mesenchymalen Tumor und das onkogene Potential von einem trunkierten LPP-Gen
32
DISKUSSION
aufgeführt werden. Keimbahnmutationen, die das HMGA2-Gen betreffen und eine
sich daraus resultierende individuelle genetische Prädisposition in der Tumorgenese
benigner Neoplasien konnten in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden.
Weiterführende Studien zur Relevanz und Rolle des HMGA2-Gens als
pathogenetische Ursache für die Genese von Neoplasien beständen in zyto- und
molekulargenetischen Untersuchungen, wie z.B. Bruchpunktklonierungen,
Expressionsstudien bei Tumoren mit Veränderungen in der chromosomalen Region
12q14-15 und weitere Sequenzanalysen.
33
ZUSAMMENFASSUNG
5. ZUSAMMENFASSUNG
Bei der zytogenetischen Subgruppe benigner mesenchymaler Tumoren mit
Rearrangierungen in der chromosomalen Region 12q14-15, kommt es zu
Veränderungen des HMGA2-Gens. In der vorliegenden Dissertation sollte die Rolle
und Relevanz der Fusionspartner und die aberranten HMGA2-Transkripte in Bezug
auf die Tumorentstehung analysiert werden. In diesem Zusammenhang wurde auch
eine Erklärung für die unterschiedliche Histologie trotz gleicher Translokation
t(3;12)(q27-28;q14-15) in Lipomen und chondroiden Hamartomen der Lunge sowie
deren histologische Heterogenität gesucht. Ferner wurden Untersuchungen zu
Sequenzvariationen im HMGA2-Gen unternommen im Hinblick auf genetische
Prädispositionen.
-
Das in Lipomen gefundene Fusionstranskript HMGA2-LHFP konnte in drei
chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer t(12;13)(q14-15;q12-14) nicht
detektiert werden.
-
Expressionsanalysen an 13 chondroiden Hamartomen der Lunge mit einer
t(3;12)(q27-28;q14-15) zeigten die gleiche Struktur des Fusionsgens wie in
Lipomen, bestehend aus Exon 1-3 des HMGA2- und Exon 9-11 des LPPGens. Somit kann die unterschiedliche Histologie von Lipomen und
chondroiden Hamartomen der Lunge nicht durch ein variierendes
Fusionstranskript erklärt werden.
-
Nachfolgend wurde das reziproke Fusionsgen LPP-HMGA2, welches in
Lipomen nicht exprimiert wird, in acht von elf Hamartomen mit einer
t(3;12)(q27-28;q14-15) detektiert. Alle Fusionstranskripte setzten sich aus den
Exons 1-8 des LPP- und Exon 4-5 des HMGA2-Gens zusammen. Es kann
angenommen werden, dass in chondroiden Hamartomen der Lunge neben
dem HMGA2-LPP Fusionsgen dem reziproken Fusionsgen eine pathologische
Signifikanz zukommt.
-
Ferner wurde ein Lipom mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15) untersucht, dass das
Fusionsgen HMGA2-LPP, jedoch nicht das reziproke Fusionsgen LPPHMGA2 exprimiert. Durch FISH-Analysen und dem Vergleich mit der
genomischen Organisation vom HMGA2-Lokus konnte eine 170kb große
Deletion vom Chromosom 12 nachgewiesen werden. Somit konnte das Fehlen
34
ZUSAMMENFASSUNG
des reziproken Fusionsgens in Lipomen mit einer t(3;12)(q27-28;q14-15)
durch eine Deletion erklärt werden. Ebenfalls wird die funktionelle Signifikanz
des HMGA2-LPP Fusionsgens, jedoch nicht die des Reversen in der
Tumorentstehung von Lipomen unterstrichen.
-
Das C12orf9-Gen, das erstmalig in einem Lipom beschrieben werden konnte,
ist approximal 200 kb 3’ vom HMGA2-Gen lokalisiert. Das LPP-C12orf9
besteht aus der prolinreichen-Region des LPP-Gens und 28 Aminosäuren
vom C12orf9-Gen. Bei dem C12orf9-Gen handelt es sich um kein „echtes“
Gen, sondern wurde nur durch eine Deletion und Zusammenführung mit LPP
exprimiert. Jedoch konnte erstmals ein anderes LPP Fusionsgen außer das
LPP-HMGA2 in einem mesenchymalen Tumor und das onkogene Potential
von einem trunkierten LPP-Gen aufgeführt werden.
-
In einem von 62 chondroiden Hamartomen der Lunge mit normalen Karyotyp
konnte das HMGA2-LPP Fusionstranskript in kleinen Subpopulationen von
Tumorzellen nachgewiesen werden und legt nahe, dass HMGA2
Veränderungen sich als primäre Ereignisse in der Tumorgenese von
Hamartomen der Lunge darstellen.
-
Individuelle Variationen des HMGA2-Gens und eine damit verbundene
Disposition für z.B. mesenchymale Tumoren, Lipomatose oder Adipositas
konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Lediglich eine
G->A Punktmutation an Position 26 im Exon 1 mit einem
Aminosäureaustausch im Codon 9 von Glycin zu Glutaminsäure konnte in 174
Allelen detektiert werden.
35
SUMMARY
6. SUMMARY
As to the cytogenetic subgroup of benign mesenchymal tumors with rearrangements
of the chromosomal region 12q14-15, the chromosomal alterations lead to
rearrangements of the HMGA2 gene. The present thesis aims at the elucidation of
the role of fusion partners of HMGA2 in tumor development and in particular refers to
a molecular explanation of the same translocation t(3;12)(q27~28;q14~15) in two
histologically different tumor entities, i.e. lipomas and chondroid hamartomas of the
lung. Furthermore, blood samples of normal healthy donors have been screened for
possible germ line mutations leading to sequence variations of HMGA2. The latter
may be associated with genetic predispositions for certain diseases known often to
be characterized with somatic mutations of that gene.
In detail the following results have been obtained:
-
The fusion transcript HMGA2-LHFP found in lipomas has been detected in
three chondroid hamartomas of the lung showing a t(12;13)(q14~15;q12~14).
-
Expression analyses of 13 chondroid hamartomas of the lung showing
t(3;12)(q27~28;q14~15) detected the same fusion transcript that was
described in lipomas, consisting of exon 1-3 of the HMGA2 gene and exon 911 of the LPP gene. These data indicate that the different histology seen in
lipomas and chondroid hamartomas cannot be explained by the existence of
different fusion transcripts of that type.
-
A fusion gene LPP-HMGA2 which has been detected in lipomas was detected
in eight of eleven chondroid hamartomas showing a t(3;12)(q27~28;q14~15).
All fusion transcripts consist of exon 1-8 of the LPP and exon 4-5 of HMGA2.
This indicates that in chondroid hamartomas of the lung the detected LPPHMGA2 fusion transcript may have a significant role in pathogenesis in
addition to the HMGA2-LPP fusion transcript.
-
One lipoma with a t(3;12)(q27-28;q14-15) showing only the HMGA2-LPP
transcript was analysed by FISH. The FISH analyses showed that a 170kb
deletion affecting the HMGA2 gene locus was accompanying the
translocation. The absence of the LPP-HMGA2 transcript can be explained by
the observed deletion.
36
SUMMARY
-
In one lipoma a new sequence named C12orf9 could be identified localized
200kb upstream of HMGA2. The resulting transcript itself consists of the prolin
rich region of LPP and 28 amino acids of C12orf9. The gene itself can be
expressed by deletion and fusion to LPP. This describes the first LPP fusion
transcript besides the LPP-HMGA2 with oncogenic potential in a
mesenchymal tumor.
-
The HMGA2-LPP transcript could be identified only in a small tumor area in
one of sixty-two screened chondroid hamartomas of the lung with normal
karyotype. This finding suggests that HMGA2 aberration may be a primary
event in tumorgeneses of chondroid lung hamartomas.
-
A screening for novel HMGA2 gene variants possibly associated with
mesenchymal tumors, lipomatosis or adipositas revealed that only one of 174
analysed alleles showed a single nucleotide polymorphism i.e. a G->A
exchange in position 26 of exon 1 of HMGA2. This mutation leads to an amino
acid exchange in codon 9 from glycine to glutamic acid.
37
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50
DANKSAGUNG
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. J. Bullerdiek für die wissenschaftliche
Betreuung meiner Arbeit und für die Übernahme des Referates.
Herrn Prof. Dr. H. Wenk danke ich herzlich für die Übernahme des Koreferates.
Für seinen wissenschaftlichen und technischen Rat und seiner ständigen
Diskussionsbereitschaft danke ich Herrn Dr. Piere Rogalla.
Darüber hinaus danke ich allen Mitarbeitern des Zentrums für Humangenetik.
Besonders danke ich Herrn Dr. Gazanfer Belge, Frau Dr. Cornelia Blank, Herrn Dr.
Lars Borrmann, Herrn Norbert Drieschner, Herrn Dr. Sven Hauke, Frau Dr. Maren
Meiboom, Frau Heike Munzinger, Herrn Dr. Hugo Murua Escobar, Herrn Dr. Volkard
Rippe und Frau Dr. Corina Rohen-Bullerdiek für ihre freundschaftliche und
technische Hilfe.
Abschließend gilt mein besonderer Dank meinem Mann und meinen Eltern für die
moralische Unterstützung während meiner Dissertation.
Meinem Sohn Luca Johannes danke ich dafür, dass er mir Zeit gegeben hat diese
Dissertationsschrift zu beenden.
51
PUBLIKATIONSÜBERSICHT
PUBLIKATIONSÜBERSICHT
In der folgenden Übersicht sind die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden
Publikationen in der Reihenfolge, in der sie im Ergebnissteil erscheinen, aufgeführt.
I.
Rogalla, P., Lemke, I., Bullerdiek, J. (2002). Absence of HMGIC-LHFP
fusion in pulmonary chondroid hamartomas with aberrations involving
chromosomal regions 12q13-q15 and 13q12-q14. Cancer Genetics and
Cytogenetics 133: 90-93.
II.
Rogalla, P., Lemke, I., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J. (2000). An identical
HMGIC-LPP fusion transcript is consistently expressed in pulmonary
chondroid hamartomas with t(3;12)(q27-28;q14-15). Genes, Chromosomes &
Cancer 29: 363-366.
III.
von Ahsen, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2005a). Expression pattern of the
LPP-HMGA2 fusion transcript in pulmonary chondroid hamartomas with
t(3;12)(q27-28;q14-15). Cancer Genetics and Cytogenetics 163: 68-70.
IV.
Lemke, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2001a). Large deletion of part of the
HMGIC locus accompanying a t(3;12)(q27-28;q14-15) in a lipoma. Cancer
Genetics and Cytogenetics 129: 161-164.
V.
Lemke, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2001b). A novel LPP fusion gene
indicates the crucial role of truncated LPP proteins in lipomas and pulmonary
chondroid hamartomas. Cytogenetics and Cell Genetics 95: 153-156.
VI.
Lemke, I., Rogalla, P., Grundmann, F., Kunze, W.-P., Haupt, R., Bullerdiek,
J. (2002). Expression of the HMGA2-LPP fusion transcript in only 1 of 61
52
PUBLIKATIONSÜBERSICHT
karyotypically normal pulmonary chondroid hamartomas. Cancer Genetic and
Cytogenetics 138: 160-164.
VII.
von Ahsen, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2005b). Mutations of the human
high mobility group protein gene HMGA2 do not account for a majority of
uterine leiomyomas. Molecular Human Reproduction (Eingereicht).
53
I.
Rogalla, P., Lemke, I., Bullerdiek, J. (2002).
Absence of HMGIC-LHFP fusion in pulmonary chondroid hamartomas
with aberrations involving chromosomal regions 12q13-q15 and 13q12q14. Cancer Genetics and Cytogenetics 133: 90-93.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
Cancer Genetics and Cytogenetics 133 (2002) 90–93
Short communication
Absence of HMGIC-LHFP fusion in pulmonary chondroid hamartomas
with aberrations involving chromosomal regions
12q13q15 and 13q12q14
Piere Rogalla, Inga Lemke, Jörn Bullerdiek*
Center of Human Genetics, University of Bremen, Leobenerstr. ZGH, D-28359, Breman, Germany
Received 3 August 2000; received in revised form 5 July 2001; accepted 6 July 2001
Abstract
In a variety of benign solid human tumors the high mobility group protein gene HMGIC is affected by aberrations involving the chromosomal region 12q14q15. Beside the two predominant alterations t(3;12)
(q2728;q14q15) and t(12;14)(q14q15;q23q24), the t(12;13)(q14q15;q12q14) is another aberration observed recurrently in these tumors. Very recently, an HMGIC-LHFP (lipoma HMGIC fusion
partner) fusion gene has been detected in a lipoma with a t(12;13). The results of the present study demonstrated the absence of the HMGIC-LHFP fusion in three pulmonary chondroid hamartomas (PCH) with
complex aberrations involving chromosomal regions 12q13q15 and 13q12qq14 and one PCH with a
simple t(12;13)(q1415;q13) by reverse transcription–polymerase chain reaction. Thus, intragenic rearrangements within the LHFP gene leading to its fusion to HMGIC are not a consistent finding in mesenchymal tumors with clonal aberrations of both chromosomal regions 12q13q15 and 13q12q14. © 2002
Elsevier Science Inc. All rights reserved.
1. Introduction
2. Materials and methods
In a variety of benign solid human tumors, aberrations
involving chromosomal region 12q1415 have been shown
to affect the high mobility group protein gene HMGIC.
Beside the two predominant alterations affecting HMGIC,
that is, t(3;12)(q27q28;q14q15) and t(12;14)(q14q15;
q23q24), the t(12;13)(q14q15;q12q14) is another aberration that has been observed recurrently. Very recently,
an HMGIC-LHFP fusion gene has been shown in a lipoma
with that translocation [1]. In that fusion, the 5 part of
HMGIC encoding three AT hooks was fused to the 3 part
of LHFP (lipoma HMGIC fusion partner) encoding a protein belonging to a new protein family that as yet has not
been further analyzed [1]. The question arises whether in
other cases with t(12;13)(q14q15;q12q14) the HMGICLHFP can be found as well. To address to this question, we
have analyzed cell cultures from four pulmonary chondroid
hamartomas (PCH) by reverse transcription–polymerase
chain reaction (RT-PCR) for the existence of the HMGICLHFP fusion gene.
The cases were selected from a series of 317 PCH recently described [2,3]. Whereas three PCH showed complex
aberrations involving the chromosomal regions 12q13q15
and 13q12q14, the remaining case had a simple t(12;
13)(q14q15;q13; Table 1). The cervical cancer cell lines
HeLa and MRIH-186 served as negative controls for the
molecular studies. As a positive control, a plasmid containing an HMGIC-LHFP fusion fragment was used. To generate this fusion fragment, we amplified an HMGIC and an
LHFP fragment, respectively, by PCR and cloned into the
pGem-Teasy vector (Promega, Mannheim, Germany). For
cloning additional EcoRI restriction sites were introduced.
For amplification, the following primers were used:
HMGIC specific primers (forward: 5-CTT CAG CCC
AGG GAC AAC-3; reverse: 5-CCG GAA TTC ATT TCC
TAG GTC TGC CTC TTG-3) and LHFP specific primers
(forward: 5-CCG GAA TTC GTG AAA TCG GCT GGG
CCT ACT A-3; reverse: LHFP1596do [see Table 2]).
The forward HMGIC specific primers for the RT-PCR
experiments have been used in several RT-PCR and 3 rapid
amplification of cDNA ends experiments [4–7]. The corresponding LHFP specific reverse primers were selected from
primer sets (Fig. 1; Table 2), allowing for the amplification
of the normal LHFP transcript based on the cDNA of LHFP
* Corresponding author. Tel.: 49-421-218-3589; fax: 49-421218-4239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
0165-4608/02/$ – see front matter © 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved.
PII: S0165-4608(01)00 5 5 3 - 2
P. Rogalla et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 133 (2002) 90–93
91
Table 1
Karyotypes of pulmonary chondroid hamartomas investigated in the
present study
Table 2
LHFP specific primers used in the present study for RT-PCR analyses
Name
Sequence
Case no.
Karyotype
Ha79
46,XX,del(6)(p21.1),der(12)t(12;13)(p12 or p13;q12)
t(12;17)(q15;p13),der(13)t(12;13)(q15;q12),
der(17)t(6;17)(p21.1;p13)[18]
46,XY,del(6)(q24),t(12;13)(q15;q13)[22]
45,XX,12,der(13)t(12;13)(q13;q12),del(14)(q22q24),
der(18)t(12;18)p11.2;p11.1)[9]
46;XX,der(13)t(13;14)(q14;q24),der(14)
t(12;14)(q15;q24)[19]
LHFP261 up
LHFP360 up
LHFP746 up
LHFP775 up
LHFP846 up
LHFP886 do
LHFP923 low
LHFP1079 low
LHFP1163 do
LHFP1596 do
5-GGATTATCTGTGGGTCCCTGGTGATT-3
5-GCATCCAGCCTGACTTGTACTGG-3
5-GTTGATTGGTGCTGGCTGTG-3
5-CCTTGGGCTGGGACAGTGA-3
5-GTGAAATCGGCTGGGCCTACTA-3
5-AGCAGCATGGCGGCAGTG-3
5-GCTTCTGTTTCTTGCCCGAAAAG-3
5-TGATTTTATCGGGTTTCATT-3
5-GCCTTTGGTCCATTTTTCTCCATCAT-3
5-TTGGCTTATTGGTCCATTTATTAGG-3
Ha147
Ha181
Ha228
(Genbank accession number AF098807). RNA was isolated
using the trizol reagent (GIBCO BRL, Eggenstein, Germany). cDNA was synthesized using a poly(A)-oligo (dt)
17 primer and M-MLV reverse transcriptase (GIBCOBRL). We performed RT-PCR in a 100-l volume containing 10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2,
100 M dATP, 100 M dTTP, 100 M dGTP, 100 M
dCTP, 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, 1
unit/100 l DNA Taq polymerase (Sigma, Deisenhofen,
Germany), and cDNA derived from 250 ng RNA. Amplifications were performed for 35 cycles (1 minute 94C, 1
minute 55C to 60C, 1 minute 72C). All PCR experiments
were performed in a nested or heminested manner (Fig. 2).
3. Results
All PCR products were separated on 1.5% agarose gels
resulting in several fragments of varying sizes and intensities in all PCH used, but all PCR experiments failed to am-
Positions of primers are given by the first nucletide position matching
within the sense sequence of the cDNA of LHFP (Genbank accession number AF098807).
plify fragments of the expected sizes. As one example, the
results of a nested PCR experiment are shown in Fig. 2a. In
all PCR experiments Southern blotting and hybridization
using an HMGIC specific probe (Fig. 2b) and rehybridization using a LHFP specific probe (data not shown) confirmed the lack of HMGIC-LHFP fusion transcripts. In contrast, the HMGIC-LHFP fusion fragment was detectable in
all positive controls. Probes were generated and digoxigenin-labeled by PCR using HMGIC specific primers (forward: 5-GTG AGG GCG CGG GGC AGC CGT CCA CTT
C-3; reverse: 5-CCT CTT CGG CAG ACT CTT GTG
AGG ATG TCT-3) and the LHFP primers LHFP846up and
LHFP1163do (see Table 2). For hybridization, the ExpressHyb hybridization solution (Clontech, Heidelberg,
Germany) was used and detection was performed as de-
Fig. 1. Schematic presentation of the cDNA structure of HMGIC and LHFP and PCR experiments used for the detection of the expected fusion transcript
HMGIC-LHFP in PCH with aberrations involving the chromosomal regions 12q13q15 and 13q12q14. The 3 untranslated region (UTR) of HMGIC is not
completely shown. ORF, open reading frame.
92
P. Rogalla et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 133 (2002) 90–93
genetically analyzed. Similarily, at the molecular level the
identification of the HMGIC-LHFP fusion gene in a lipoma
with t(12;13) makes it a possible candidate for a frequent
fusion gene in these tumors. A comparable situation recently has been described for the t(3;12)(q27q28;
q14q15) where the underlying HMGIC-LPP fusion gene
can be detected in both lipomas and PCH with that translocation [10,11]. In contrast, the results of the present study
show that the HMGIC-LHFP fusion is not a consistent finding
in tumors with aberrations of 12q13q15 and 13q12q14.
Thus, the molecular basis may be rather similar to that of
the t(12;14)(q14q15;q23q24) frequently found in uterine fibroids and PCH. In this translocation, intragenic
breakpoints and breakpoints in the vincinity of HMGIC
have been found [2,12–14].
References
Fig. 2. Results of a RT-PCR experiment excluding the fusion gene HMGICLHFP in four pulmonary chondroid hamartomas (PCH) with aberrations
involving the chromosomal regions 12q13q15 and 13q12q14. Whereas
three PCH showed complex aberrations involving 12q13q15 and
3q12q14 (Ha 79, Ha 181, and Ha 228), the remaining case had a simple
t(12;13)(q14q15;q13) (Ha 147). For PCR, the HMGIC specific forward
primers Se1 and P1 and the LHFP specific reverse primers LHFP1596do
and LHFP1163do were used. The cell line HeLa served as negative control. As a positive control a plasmid containing an HMGIC-LHFP fusion
fragment was used. (a) RT-PCR products after electrophoresis and ethidium bromide staining. (b) RT-PCR products after electrophoresis followed
by Southern blot hybridization using a 312-bp HMGIC cDNA probe. (c)
RT-PCR products of GAPDH after electrophoresis and ethidium bromide
staining.
scribed by Rogalla et al. [8]. As control for intact RNA and
cDNA, respectively, routine RNA agarose gels were run
and checked using standard methods, and a RT-PCR for the
housekeeping gene of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase was performed as described previously [6]
(Fig. 2c).
4. Discussion
The translocation t(12;13)(q13q15;q12q14) has been
described recurrently in lipomas [9] and PCH [2,3]. Kazmierczak et al. [2] found three cases with a t(12;13)
(q13q15;q12q14) in a series of 191 PCH whereas Mandahl et al. [8] described two such cases in 188 lipomas cyto-
[1] Petit MMR, Schoenmakers EFPM, Huysmans C, Geurts JMW, Mandahl N, Van de Ven WJM. LHFP, a novel translocation partner gene
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93
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II.
Rogalla, P., Lemke, I., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J. (2000).
An identical HMGIC-LPP fusion transcript is consistently expressed in
pulmonary chondroid hamartomas with t(3;12)(q27-28;q14-15). Genes,
Chromosomes & Cancer 29: 363-366.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
III.
von Ahsen, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2005a). Expression pattern
of the LPP-HMGA2 fusion transcript in pulmonary chondroid
hamartomas with t(3;12)(q27-28;q14-15). Cancer Genetics and
Cytogenetics 163: 68-70.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
IV.
Lemke, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2001a). Large deletion of part of
the HMGIC locus accompanying a t(3;12)(q27-28;q14-15) in a lipoma.
Cancer Genetics and Cytogenetics 129:161-164.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
Cancer Genetics and Cytogenetics 129 (2001) 161–164
Short communication
Large deletion of part of the HMGIC locus accompanying a
t(3;12)(q27q28;q14q15) in a lipoma
Inga Lemke, Piere Rogalla, Jörn Bullerdiek*
Center of Human Genetics, University of Bremen, Leobenerstr. ZHG, D-28359 Bremen, Germany
Received 25 August 2000; received in revised form 1 February 2001; accepted 5 February 2001
Abstract
The high mobility group protein gene HMGIC has been found to be rearranged in a variety of human benign solid tumors. Often, these rearrangements lead to fusion genes of which that between
HMGIC and LPP underlying t(3;12)(q27q28;q14q15) is by far the most common. Herein, we
analysed a lipoma with a t(3;12)(q27q28;q14q15). RT-PCR revealed the presence of a HMGICLPP fusion transcript composed of exons 1–3 of HMGIC and exons 9–11 of LPP, but the absence of
the reverse LPP-HMGIC fusion transcript. Fluorescence in situ hybridization experiments using different probes derived from the HMGIC gene and its 3 vicinity showed the absence of FISH signals
on the derivative chromosome 3. Thus, in the present tumor the t(3;12)(q27q28;q14q15) was accompanied by a large genomic deletion. Roughly, it can be estimated that at least 170 kb of chromosome 12 material were deleted. To the best of our knowledge, this is the first report showing that
the “simple” t(3;12)(q27q28;q14q15) results in a large deletion of DNA. © 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved.
1. Introduction
2. Materials and Methods
HMGIC encodes for one member of high mobility group
proteins and is rearranged in a variety of human benign solid
tumors [1,2]. Often, these rearrangements lead to fusion
genes encoding the three AT-hooks of HMGIC and a carboxyterminal part of other genes. Of these fusion genes that
between HMGIC and LPP underlying t(3;12)(q27q28;
q14q15) is by far the most common [1,2]. These latter rearrangements have been found only in lipomas and pulmonary
chondroid hamartomas (PCHs) [3]. When expressed in
NIH3T3 murine fibroblasts, the fusion protein has been
shown to induce transformation as shown by Fedele et al. [4].
In contrast to that fusion transcript composed of exons 1–3
of HMGIC and exons 9–11 of LPP [5,6], the reverse transcript is often not detectable in the corresponding tumors
even by RT-PCR [5]. Because one might hypothesize that
this lack of the reverse transcript is due to deletions surrounding the breakpoint on the “non-functional” derivative
chromosome, we performed a fluorescence in situ hybridization (FISH) study on a lipoma lacking that transcript using a variety of probes from the HMGIC region 3 of the
breakpoint.
The lipoma used for the present study showed a t(3;
12)(q27–q28;q14–q15). Cells from this lipoma were immortalized by the large T-antigen of SV40 leading to metaphases
characterized by either a diploid or tetraploid karyotype.
After isolation of RNA using the trizol reagent (GIBCO
BRL, Eggenstein, Germany) containing phenol and isothiocyanate cDNA was synthesized using a poly(A)-oligo(dt)17
primer and M-MLV reverse transcriptase (GIBCO BRL,
Eggenstein, Germany). RT-PCR for the detection of the
HMGIC-LPP fusion transcript was done as recently described [6]. RT-PCR analysis aimed at the detection of the
LPP-HMGIC fusion transcript has been performed in a
nested manner using the primer pair 5-CTG GAC GCT
GAG ATT GAC-3 and 5-GTG AAA GTA GAC CCC
ACC-3 in the first round and the primer pair 5-ACA GCC
TCT CCT CCA GTT-3 and 5-GTT CTC AGA CGG CTT
CTC CTG ATC-3 in the second round. As a positive control, a pulmonary chondroid hamartoma with a t(3;12)(q27
q28;q14q15) known to express both fusion transcripts
was used. PCR products were separated on a 1.5% agarose
gel and fusion transcripts were clearly detected by Southern
blotting and hybridization using a HMGIC cDNA specific
probe and as control for intact cDNA an RT-PCR for the
housekeeping gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was performed as recently described [6].
* Corresponding author. Tel.: 49-421-218-3589; fax: 49-421-2184239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
0165-4608/01/$ – see front matter © 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved.
PII: S0165-4608(01)00 4 4 1 - 1
162
I. Lemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 129 (2001) 161–164
for the FISH studies a pool of the cosmid clones 27E12 and
142H1, known to flank the 3 and 5 ends, respectively, of
the third intron of HMGIC [2], PAC clone 12/2 containing
the entire intron 3 of HMGIC, cosmid clone 202A1 derived
from the 3 vicinity of HMGIC [2], PAC clone 12/1 containing part of intron 3 of HMGIC and its 3 vicinity, and a
pool of two PAC clones obtained by screening of a human
PAC library using primer sets specific for exon 6 and
intron10/exon11, respectively, of the LPP gene [8] were
used. The localization of clones within the HMGIC locus is
shown in Fig. 1. Metaphases were GTG-banded prior to
FISH and for each probe at least 10 metaphases have been
evaluated.
Fig. 1. Map of the HMGIC locus and localization of cosmid and PAC
clones used in the present study as probes for FISH analyses. For orientation of cosmid clones see [2].
For molecular cytogenetic studies cell cultures from the
lipoma were prepared following routine protocols. Slides
were used for FISH studies using a modification of the
method described by Kievits et al. [7]. As molecular probes
3. Results
RT-PCR analysis followed by gel electrophoresis and
Southern blot hybridization using a HMGIC cDNA specific
probe revealed the presence of a HMGIC-LPP fusion transcript but the absence of the reverse LPP-HMGIC fusion
transcript in the lipoma with t(3;12)(q27q28;q14q15)
Fig. 2. Results of RT-PCR experiments followed by gel electrophoresis and Southern blot hybridization using a HMGIC specific cDNA probe showing the
absence of the LPP-HMGIC fusion transcript (a) but the presence of the HMGIC-LPP fusion transcript (b) in the lipoma with a t(3;12)(q27q28;q14q15).
RT-PCR experiment of the positive control, a pulmonary chondroid hamartoma with a t(3;12)(q27q28;q14q15), revealed both fusion transcripts. (A) RTPCR products of LPP-HMGIC after gel electrophoresis followed by Southern blot hybridization using a HMGIC cDNA probe. (b) RT-PCR products of
HMGIC-LPP after gel electrophoresis followed by Southern blot hybridization using a HMGIC cDNA probe. (c) RT-PCR products of GAPDH after gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
I. Lemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 129 (2001) 161–164
163
Fig. 3. Results of FISH analyses of the lipoma with a t(3;12)(q27q28;q14q15) using probes derived from the HMGIC locus and its 3 site (Fig. 1). Normal
chromosomes 12 indicated by green arrows, derivative chromosomes 12 by yellow arrows, and derivative chromosomes 3 by white arrows. Chromosomes
were identified by G-banding prior to FISH. (a) FISH analysis using the PAC clone 12/1 containing part of intron 3 of HMGIC and its 3 vicinity. (b) FISH
analysis using the cosmid clone 202A1 derived from the 3 vicinity of HMGIC. (c) FISH analysis using the PAC clone 12/2 containing the entire intron 3 of
HMGIC (tetraploid metaphase). (d) FISH analysis using a pool of the cosmid clones 27E12 and 142H1, known to flank the 3 and 5 ends, respectively, of the
third intron of HMGIC (part of a tetraploid metaphase).
(Figs. 2a–c). PCR fragment length indicates that the
HMGIC-LPP fusion transcript is composed of exons 1–3 of
HMGIC and exons 9–11 of LPP.
FISH analyses using different probes from the HMGIC
locus (Fig. 1) were performed to analyse whether or not a genomic deletion is responsible for the absence of the reverse
fusion transcript LPP-HMGIC. FISH experiments with
probes exclusively derived from the 3 part of HMGIC or its
3 vicinity revealed signals on the normal chromosome 12
but not on either of the derivative chromosomes (Figs. 3a, b).
In addition, FISH experiments using either a PAC clone
which contains the entire intron 3 of HMGIC or a pool of
cosmids known to flank the 3 and 5 ends, respectively, of
the third intron of HMGIC resulted in signals on the normal
chromosome 12 and the derivative chromosome 12, but
not on the derivative chromosome 3 (Figs. 3c, d). Most
metaphases revealed apparently weaker FISH signals on the
derivative chromosome 12 than those on the normal chromosome 12. In addition, FISH experiments using a pool of two
PAC clones derived from the LPP gene revealed signals on
the normal chromosome 3, the derivative chromosome 3,
and the derivative chromosome 12 (data not shown).
4. Discussion
The frequency of t(3;12)(q27q28;q14q15) in lipomas
[9,10] and PCHs [11] makes it one of the most frequent alterations in human tumors. Despite the high frequency of
the t(3;12), little is known about the molecular changes accompanying the underlying fusion of both chromosomes.
FISH, using different probes derived from the HMGIC
gene and its 3 vicinity, revealed the absence of signals on
the derivative chromosome 3. However, RT-PCR showed
the characteristic HMGIC-LPP fusion transcript composed
of exons 1–3 of HMGIC and exons 9–11 of LPP [5,6],
164
I. Lemke et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 129 (2001) 161–164
clearly indicating a break within the third intron of HMGIC.
From these results it can be concluded that the t(3;12)(q27
q28;q14q15) found in the lipoma was accompanied by a
large genomic deletion. Based on the contig presented by
Schoenmakers et al. [2], the deletion of chromosome 12 material has an estimated size of at least 170 kb.
In summary, our findings underline the functional significance of the HMGIC-LPP fusion whereas the reverse fusion seems to be of no relevance in terms of tumor development. Furthermore, a frequent deletion accompanying that
translocation can also explain the lack of LPP-HMGIC fusion transcripts in four of five lipomas with a t(3;12) described by Petit et al. [5]. In contrast, another possible explanation may be the additional deletion of the promoter of
LPP or of other 5 regulatory elements.
Nevertheless, similar deletions accompanying apparently
balanced translocations have also been found, for example
in chronic myelogeneous leukemias with t(9;22)(q34;q11)
[12] or in follicular lymphomas with t(14;18)(q32;q21)
[13]. To the best of our knowledge, this is the first report
showing that the “simple” t(3;12)(q27q28;q14q15) results in a large genomic deletion.
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V.
Lemke, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2001b). A novel LPP fusion gene
indicates the crucial role of truncated LPP proteins in lipomas and
pulmonary chondroid hamartomas. Cytogenetics and Cell Genetics 95:
153-156.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
VI.
Lemke, I., Rogalla, P., Grundmann, F., Kunze, W.-P., Haupt, R.,
Bullerdiek, J. (2002). Expression of the HMGA2-LPP fusion transcript in
only 1 of 61 karyotypically normal pulmonary chondroid hamartomas.
Cancer Genetic and Cytogenetics 138: 160-164.
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. P. Rogalla
VII.
von Ahsen, I., Rogalla, P., Bullerdiek, J. (2005b). Mutations of the
human high mobility group protein gene HMGA2 do not account for a
majority of uterine leiomyomas. Molecular Human Reproduction
(Eingereicht).
Eigenanteil an dieser Publikation:
- Planung und Durchführung aller Arbeiten
- Verfassen der Publikation
von Ahsen et al. 1
Mutations of the human high mobility group protein
gene HMGA2 do not account for a majority of uterine
leiomyomas
Inga von Ahsen, Piere Rogalla, and Jörn Bullerdiek*
Center of Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, D-28359
Bremen, Germany
*Correspondence to: J. Bullerdiek, Center of Human Genetics, University of Bremen,
Leobenerstr. ZHG, D-28359 Bremen, Germany, Phone: 49-421-218-4239; Fax: 49421-218-4239; e-mail: [email protected].
Running title: Mutation Analysis of the HMGA2 Gene
von Ahsen et al. 2
Abstract
The close association of proteins of the high mobility group family HMGA in a number
of diseases has emerged clearly during the past years. As to benign tumors targeting
genes by chromosomal alterations has been well documented for e.g. lipomas,
pulmonary chondroid hamartomas and uterine leiomyomas. HMGA proteins act as
architectural transcription factors regulating a high number of target genes by
modulating chromatin structure. However, very little is known about variation of the
HMGA genes within human populations which could account for the high prevalence
e.g. of uterine fibroids. Therefore we have sequenced the coding region of HMGA2 of
87 of healthy volunteers aimed at the detection of single nucleotide polymorphism
(SNP’s) which may be associated with a genetic predisposition. As a result we were
able to show only one sequence divergence leading to an amino acid change in
coding regions of HMGA2 in all 174 alleles analysed. This, indicates that sequence
variations of HMGA2 do not account for the high frequency of uterine leiomyomas.
Key words: high mobility group proteins, single nucleotide polymorphism, uterine
leiomyomas
Introduction
The gene encoding the high mobility group protein HMGA2 is the most frequent
target of specific chromosomal translocations in human tumors known far.
Cytogenetic rearrangements affecting 12q14-15 i.e. the genomic region harboring
HMGA2 are a frequent finding in benign tumors mostly of mesenchymal origin as e.g.
lipomas and uterine leiomyomas.
von Ahsen et al. 3
As a molecular consequence of there translocations, either fusion transcripts
involving HMGA2 are expressed in case of intragenic rearrangements or a simple
transcriptional up-regulation of that gene occurs which is mainly expressed almost
during embryonic and fetal development (Rogalla et al., 1996; Hirning-Folz et al.,
1998). Uterine leiomyome are the most common female genital tumors affecting at
least one third of all women over 30 years old and their actual frequency may be
even much higher (Norris and Zaloudek, 1982). While the etiology of these frequent
neoplasms is still unknown, a genetic predisposition often has been considered e.g.
based on classical twin studies (Snieder et al., 1998) and an apparent predisposition
to these tumors in some families (Vikhlyaeva et al., 1995). One of the few genes that
have been associated so far with the development of uterine leiomyomas is HMGA2
(syn.: HMGIC) (Schoenmakers et al. 1995). HMGA2 encodes for a so-called high
mobility group protein acting as an architectural transcription factor. By binding to
DNA it can modulate the access of specific transcription factors. By chromosomal
rearrangements the expression of HMGA2 that in most normal tissues is expressed
at very low levels except for embryonic and fetal development (Rogalla et al., 1996)
becames transcriptionally up-regulated or becomes involved in the formation of
fusion genes. There rearrangements are their considered being causually involved in
the development of e.g. uterine leiomyomas carrying 12q14-15 aberrations. Although
the existence of a genetic predisposition for these highly frequent tumors is widely
accepted, surprisingly almost nothing is known about sequence variations of HMGA2
among the population. To determine if non-synonymous single nucleotide
polymorphisms (SNP’s) are frequent and thus may account for this predisposition, we
have sequenced that gene based on DNA samples obtained from 87 healthy
Caucasian European individuals.
von Ahsen et al. 4
Materials and methods
Blood samples taken from 87 healthy volunteers were included in the present study.
Genomic DNA was isolated from 5 ml peripheral blood by the salt-extraction
procedure described by Lahiri and Nurnberger (1991).
Specific oligonucleotide primers were designed according to the genomic HMGA2
DNA sequence (Schoenmakers et al., 1995) (GenBank accession number
AH003120). Primer sets were designed for PCR to amplify each of the 5 exons of the
HMGA2 gene (see table I).
PCR was performed in a reaction volume of 50 µl containing 500 ng of genomic DNA
template, 10 mM Tris/HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 100µM dATP, 100µM
dTTP, 100µM dGTP, 100µM dCTP, 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, 1
unit/100 µl DNA Taq polymerase (Sigma, Deisenhofen, Germany). For the fragment
containing exon 5 a nested PCR was performed by addition of 0.5 µl of the primary
PCR product to a second PCR mix. PCR experiments were performed for 35 cycles
(1 min denaturation at 94°C, 1 min annealing at 57-66°C for a single primer pair see
table 1, and 1 min extension at 72°C). The cycles were proceeded by an initial
denaturation step of 4 min at 94°C and were followed by a final extension step of 10
min. The amplification products were separated on 1.5 % agarose gels.
Each PCR fragment was sequenced on both strands using the primers shown in
table 1 on an automated ABI 377 sequencer according to the protocol by the
manufacturer (PE-Applied Biosystem, Connecticut, USA ). The resulting sequences
were aligned for the presence of mutations (nonsense, insertion, or deletion
mutations) with the DNASTAR's SeqMan II program.
von Ahsen et al. 5
Results
All five exons of HMGA2 containing the complete ORF were amplified by PCR.
Using the DNA of 87 individuals all PCR experiments resulted in fragments of the
expected sizes (table II). Direct sequencing revealed only one GÆA point mutation at
position 26 with the consequent substitution of an glycine to glutamic acid at codon 9
in exon 1 of HMGA2 in all 87 individuals.
Discussion
The prominent role of HMGA proteins explains their involvement in a number of
diseases including various malignancies and also several benign tumors. Based on
the idea that frequent single nucleotide polymorphisms of that gene may be
associated with genetic predisposition to leiomyomas, herein, we analysed 174
alleles of the HMGA2 gene. Surprisingly, there was only one sequence divergence
leading to an amino acid change in the complete ORF of HMGA2 detectable. Most
likely, the high interindividual conservation of the protein is due to the fact that most
base pair substitutions leading to an amino acid exchanges lead to proteins which
are not able to act like the wilde-type protein. This hypothesis is also supported by
comparative genomics. The coding region of the murine HMGA2 shows an identity of
92% in comparison to its human counterpart allowing for the expression of a protein
which differs in only 5 of 110 amino acids (96% identity) (Zhou et al. 1996, Manfioletti
et al. 1991). However, this is the first paper reporting on the sequence analysis of the
HMGA2 gene in a larger number of individuals. From the results it can be deduced
clearly that sequence variations of HMGA2 do not account for the frequent
occurrence of uterine fibroids.
von Ahsen et al. 6
ACKNOWLEDGEMENT
This work was supported by a grant from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Bu
592/4-3).
REFERENCES
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pattern of the Hmgic gene during development. Genes Chromosomes Cancer
23, 350-357.
Lahiri DK and Nurnberger JIJr (1991) A rapid non-enzymatic method for the
preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucleic Acids Res 19,
5444.
Manfioletti G, Giancotti V, Bandiera A, Buratti E, Sautiere P, Cary P, Crane-Robinson
C, Coles B, Goodwin GH (1991) cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein,
a nuclear protein associated with neoplastic and undifferentiated phenotypes
Nucleic Acids Res 19, 6793-6797.
Norris HJ, Zaloudek CJ (1982) Mesenchymal tumor of the uterus. In: Pathology of
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frequent mesenchymal tumors. Am J Pathol 149, 775-779.
Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de
Ven WJ (1995) Recurrent rearrangements in the high mobility group protein
gene, HMGI- C, in benign mesenchymal tumours. Nat Genet 10, 436-444.
Snieder H, MacGregor AJ, Spector TD (1998) Genes control the cessation of a
woman's reproductive life: a twin study of hysterectomy and age at
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von Ahsen et al. 7
Vikhlyaeva EM, Khodzhaeva ZS, Fantschenko ND (1995) Familial predisposition to
uterine leiomyomas. Int J Gynaecol Obstet 51, 127-131.
Zhou X, Benson KF, Przybysz K, Liu J, Hou Y, Cherath L, Chada K (1996) Genomic
structure and expression of the murine Hmgi-c gene. Nucleic Acids Res 24,
4071-4077.
von Ahsen et al. 8
Table I
Primer sequences and conditions for PCR amplification of HMGA2
Exon
1
Primer Sequencesa
(F) ACCTCATCTCCCGAAAGGTGCTG
Annealing
Sice of
Temperature Product
(°C)
(bp)
66
290
(R) ACTGGGCTCCCGCACTCCG
2
(F) CCACCTTTTCAATATGGAAGATTGTTG
57
816
57
553
60
420
60
532
60
426
(R) TTCCTCACTTCTACCCGTTTTAAGGTT
3
(F) TCTTTTAGGGCGAGGGGTTGCATAGAT
(R) GAAGAGTGGAGCCTCTTTTGATGTTGA
4
(F) AGCTGGTCTACAACTCCTGGGCTCAAG
(R) GGCTACAACACATTTTCAGAATACTGC
5
(F1) TGCCCTGACATTCTCTGGACAGC
(R1) TCCCTGTGTTACAGCAGTTTT
(F2) CCTCAATTACGGTTTAAGAAG
(R2) AGGGATTACAAAGAAGGTGATTA
a
F = forward, and R = reverse
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Table II
Primer sequences for sequencing of HMGA2
Exon
1
Primer Sequencesa
(F) ACCTCATCTCCCGAAAGGT
(R) ACTGGGCTCCCGCACTC
2
(F) TGAACGTGTTCCAACAGCTC
(R) GAAATGAGTCTTGTGTTACCCAG
3
(F) CGATACGTCATCTGCAAAGC
(R) CTGGATGGAGCCTAGTGGTA
4
(F) CTCAAGCCATCCGTCCGC
(R) TTCAGAATACTGCAGGACGA
5
(F) GCTGTGGAAACAGGTTACCT
(R) CCATGGCAATACAGAATAAGTGG
a
F = forward, and R = reverse
„Hiermit erkläre ich, Inga von Ahsen, geb. am 26. März 1968 in Bremen, dass ich die
vorliegende Dissertation „Zur Bedeutung von somatischen Mutationen und
Keimbahnmutationen des HMGA2 Gens bei Tumorerkrankungen“ selbstständig
verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet
habe.“
Bremen, Dezember 2005
(Inga von Ahsen)