Proteindesign zur Veränderung der - Ti
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Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover Proteindesign zur Veränderung der Sequenzspezifität der Restriktionsendonuklease EcoRI INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Daniela Gerschon aus Hannover Hannover 2000 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. E. Töpfer-Petersen Prof. Dr. J. Alves 1. Gutacher: Prof. Dr. E. Töpfer-Petersen 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Otto Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2000 Inhaltsverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1 2 5 6 1.6 1.7 RESTRIKTIONSENZYME DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASE ECORI UNSPEZIFISCHE DNA-BINDUNG UND LINEARE DIFFUSION ERKENNUNG DER SPEZIFISCHEN DNA-SEQUENZ UND KOPPLUNG ZUR KATALYSE STRUKTUR DER RESTRIKTIONSENDONUKLEASE ECORI IM VERGLEICH MIT ANDEREN RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN KATALYSE ZIEL DER ARBEIT 9 16 18 2 Material und Methoden 20 2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 2.1.1 Bakterienstämme 2.1.2 Verwendete Vektoren 2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen 2.1.4 Transformation von Bakterienzellen 2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA 2.2.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA 2.2.3 Ligation 2.2.4 Elektrophoretische Trennung von DNA 2.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese 2.2.4.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese 2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) 2.2.6 Mutagenesestrategien Gapped duplex-Mutagenese 2.2.6.1 2.2.6.2 PCR-Mutagenese 2.2.6.3 Mutageneseprimer 2.2.6.4 Klonierung der Mutanten mit StrepTag II 2.2.7 DNA-Sequenzierung 2.2.7.1 DNA-Vorbereitung und Annealingreaktion 2.2.7.2 Markierungsreaktion 2.2.7.3 Terminationsreaktion 2.2.7.4 Sequenziergel 2.3 PROTEINCHEMISCHES ARBEITEN 2.3.1 Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli 2.3.2 Expressionstest 2.3.3 Fermentation 2.3.4 Ultraschallzellaufschluß 2.3.5 Chromatographische Verfahren 2.3.5.1 Affinitätschromatographie mit Hexahistidintag 2.3.5.2 Affinitätschromatographie mit StrepTag II 2.3.5.3 Ionenaustauschchromatographie 2.3.6 Dialyse 2.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ECORI-MUTANTEN 2.4.1 UV-Spektroskopie λ-DNA-Kinetiken 2.4.2 2.4.3 Gelretardationsexperimente (Mobility-Shift-Assays) 2.4.3.1 Bindung an ein 174Bp-Fragment Mobility-Shift-Assay mit modifizierten Oligonukleotiden 2.4.3.2 2+ Mobility-Shift-Assay unter Ca -Zusatz 2.4.3.3 20 20 21 22 23 24 24 24 25 25 25 26 27 28 28 31 34 34 35 36 36 37 37 38 38 40 41 42 42 42 43 44 45 46 46 46 47 47 49 50 II 2.4.4 2.4.5 2.4.6 Inhaltsverzeichnis Spaltung von Oligonukleotiden Gelfiltration (HPLC) Circulardichroismus (CD) 51 52 52 3 Ergebnisse 53 3.1 3.1.1 53 3.1.3 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.3.1 3.4.3.2 3.4.4 3.4.4.1 3.4.4.2 DARSTELLUNG DER MUTANTEN PCR-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140A/N141AHis6 und G140A/N141SHis6 Gapped duplex-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 Klonierung des StrepTag II AUFREINIGUNG DER MUTANTEN Aufreinigung der Mutanten mit Hexahistidintag Aufreinigung der Mutanten mit StrepTag II CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN MIT HEXAHISTIDINTAG DNA-Bindung der Mutanten mit Hexahistidintag Kinetische Charakterisierung der Mutanten mit Hexahistidintag Spaltverhalten auf λ-DNA Spaltkinetiken mit λ(dam , dcm )-DNA CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN MIT STREPTAG II Gelfiltration Circulardichroismus Bestimmung der DNA-Bindung der Mutanten mit StrepTag II DNA-Bindung an das 174Bp-Fragment DNA-Bindung an modifizierte Oligonukleotide Charakterisierung der Spaltaktivität der Mutanten mit StrepTag II Spaltaktivität auf λ(dam , dcm )-DNA Spaltaktivität auf modifizierten Oligonukleotiden 4 5 6 7 Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis 3.1.2 53 55 57 57 57 63 65 65 66 66 69 71 71 73 74 74 75 79 79 82 91 106 107 108 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A AA AAP ad Amp APS ATP Bis Bp BSA c CCD Chl dd ddH2O DMS DNA dNTP DTB DTT E.coli EDTA εxxxnm EtBr g GTP Gua/HCl h HPLC k kDa Konz. l LB M m min µ MOPS n NNTA NTP ODxxxnm Oligonukleotid p Ampère Acrylamid Agarose-Auftragspuffer auffüllen auf Ampicillin Ammoniumperoxodisulfat Adenin-5‘-triphosphat N,N-Methylen-bisacrylamid Basenpaar(e) Bovines Serumalbumin Konzentration CarboxylCirculardichroismus Chloramphenicol didesoxy bidestilliertes Wasser Dimethylsuberimidat Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat Desthiobiotin 1,4-Dithiothreitol Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz Extinktionskoeffizient bei xxx nm Ethidiumbromid Gramm oder Erdbeschleunigung Guanosin-5´-triphosphat Guanidiniumhydrochlorid Stunde(n) High pressure liquid chromatography kilo Kilo-Dalton Konzentration Liter Luria Bertani molar milli oder Meter Minute(n) mikro 3-Morpholinopropansulfonsäure nano AminoNitrilotriessigsäure Ribonukleosid-5´-triphosphat optische Dichte bei xxxnm oligomeres Desoxyribonukleotid pico oder Plasmid III IV PCR Pi T4-PNK r RNA rpm RT SDS s ST Taq TBS TCA TE TEMED TPE Tris TTE TTP U ÜN UV V % (v/v) % (w/v) wt Abkürzungsverzeichnis Polymerase chain reaction anorganisches Phosphat T4-Polynukleotidkinase ribo Ribonukleinsäure Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Natriumdodecylphosphat Sekunde(n) Saline tris buffer Thermus aquaticus Tris buffered saline Trichloressigsäure Tris-EDTA-Puffer N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tris-Posphat-EDTA-Puffer Tris(hydroxymethyl)aminoethan Tris-Taurin-EDTA-Puffer Thymidin-5´-triphosphat Unit (Einheit) über Nacht Ultraviolett Volt Volumenprozent pro Volumen Gewichtsprozent pro Volumen Wildtyp Aminosäuren werden nach dem internationalen Ein- oder Drei-Buchstabencode abgekürzt. Eine Zahl hinter der Bezeichnung kennzeichnet die Position der Aminosäure innerhalb des Proteins. Mutanten werden benannt, indem an die auszutauschende Aminosäure mit anschließender Positionsnummer das Kürzel der eingeführten Aminosäure angehängt wird. Einleitung 1 EINLEITUNG 1.1 Restriktionsenzyme 1 Restriktionsenzyme sind ubiquitär in Prokaryonten vorkommende Endonukleasen, welche spezifisch kurze DNA Sequenzen erkennen und in beiden Strängen spalten [Luria & Human, 1952]. Als Bestandteil von sogenannten Restriktions/Modifikationssystemen (R/M-System) stellen sie einen Abwehrmechanismus gegen das Etablieren von Fremd-DNA in der Bakterienzelle dar, indem sie dieser durch Spaltung in Teilstücke die Infektiosität nehmen. Die zelleigene DNA muß durch Methylierung in der Erkennungssequenz geschützt werden, die durch ein korrespondierendes Modifikationsenzym erfolgt. Dabei ist sowohl die Methylierung einer hemimethylierten Erkennungssequenz als auch eine de novo-Methylierung möglich. Das Enzym führt eine Methylgruppe in die DNA ein, wobei die Methylasen danach unterschieden werden, ob eine Methylierung des Ringkohlenstoffatoms zum C5-Methylcytosin oder eines exocyclischen Stickstoffatoms zum N4-Methylcytosin beziehungsweise N6-Methyladenin stattfindet [Cheng, 1995]. Für Restriktionsenzym und Methylase ist eine hohe Spezifität unabdingbar, da ein Schutz des Bakteriengenoms sonst nicht möglich ist. R/M-Systeme lassen sich in vier Klassen einteilen, die sich aufgrund der Zusammensetzung ihrer Untereinheiten sowie der verwendeten Kofaktoren unterscheiden [Heitmann, 1993; Pingoud & Jeltsch, 1997]. Weiterhin bestehen Unterschiede in der Erkennung der spezifischen Sequenz und nachfolgender Spaltung der DNA. Allen gemeinsam ist die notwendige Anwesenheit divalenter Kationen (Mg2+), die eine katalytische Aktivität ermöglichen. Bei den R/M-Systemen vom Typ I handelt es sich um einen aus drei Untereinheiten (R, M, S) bestehenden Komplex [Murray, 2000]. Dabei steht R für Restriktion, M für Modifikation und S für Spezifität des Enzymkomplexes. Als Kofaktoren werden ATP, S-Adenosylmethionin (AdoMet) und Magnesiumionen benötigt. Die Spaltung der DNA erfolgt in großer Entfernung zur sieben Basenpaare (Bp) umfassenden, unterbrochenen Erkennungssequenz. R/M-Systeme des Typs II beinhalten zwei voneinander unabhängige Enzyme: Einerseits die Restriktionsendonuklease, welche als Homodimer auftritt und DNA in Anwe- 2 Einleitung senheit von Mg2+ spaltet, andererseits die monomere Methyltransferase, die AdoMet als Kofaktor braucht. Die Spaltung erfolgt innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der vier bis acht Basenpaare langen palindromen Erkennungssequenz, wobei entweder glatte (blunt ends) oder überhängende (sticky ends) DNA-Enden entstehen. Innerhalb des Typ II R/M-Systems wurden aufgrund ungewöhnlicher Eigenschaften einiger dort klassifizierter Enzyme Untergruppen eingeführt. Bei den Restriktionsenzymen der Klasse IIe erfolgt eine allosterische Aktivierung durch Bindung einer zweiten als Effektor wirkenden Erkennungssequenz [Krüger et al., 1995]. Enzyme des Typs IIs erkennen vier bis sieben Basenpaare lange Erkennungssequenzen, die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand außerhalb derselben. Typ III-Systeme bestehen aus zwei Untereinheiten (R und M). Während die Methyltransferase allein in Anwesenheit von AdoMet katalytisch aktiv ist, erfordert die Restriktion ein Zusammenwirken beider Untereinheiten sowie ATP [Meisel et al., 1995]. Erkennungssequenzen der Typ III-Systeme bestehen aus einem Enzymkomplex mit jeweils einer Untereinheit für Restriktion und Modifikation. Die Erkennungssequenz ist asymmetrisch und die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand von etwa 25 Basenpaaren [Bickle, 1993]. Bei den Typ IV-R/M-Systemen treten Restriktionsendonukleasen auf, deren Spaltung einerseits durch AdoMet stimuliert wird, andererseits jedoch ATP unabhängig ist. Die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand außerhalb der asymmetrischen sechs Basenpaare langen Erkennungssequenz [Janulaitis et al., 1992]. Restriktionsenzyme, die unterbrochene Sequenzen erkennen und DNA in definiertem Abstand auf beiden Seiten außerhalb dieser Sequenz spalten, werden dem Typ BcgI zugeordnet [Kong et al., 1993]. 1.2 Die Restriktionsendonuklease EcoRI Die zuerst aus dem Bakterium Escherischia coli isolierte Restriktionsendonuklease EcoRI gehört neben EcoRV zu den am besten untersuchten Typ II-Endonukleasen. Sie besteht aus 276 Aminosäuren bekannter Sequenz [Greene et al., 1981; Newman et al., 1981]. Das Enzym zeigt seine katalytische Aktivität im Homodimer [Alves et al., Einleitung 3 1982]. Weiterhin können in höheren Konzentrationen spaltaktive Tetramere gebildet werden [Modrich & Zabel, 1976], darüber hinaus entstehen unlösliche Komplexe [Luke & Halford, 1985]. Die EcoRI-Methylase zeigt keine Homologie zur Endonuklease. Beide Enzyme erkennen jedoch spezifisch die palindrome Sequenz GAATTC, welche von der Endonuklease zwischen G und A gespalten und von der Methylase an der N6-Aminogruppe der zentralen Adenine methyliert wird (Me; siehe Abbildung 1.1). Me G A AT T C C T T AAG Me Abb. 1.1: Spaltung und Methylierung an der EcoRI-Erkennungssequenz Durch die Methylierung der Erkennungssequenz wird eine vollständige Spaltung des DNA-Doppelstrangs verhindert [Jost & Saluz, 1993; McClelland et al., 1994]. Eine sehr langsame Spaltung unspezifischer oder methylierter Sequenzen ist möglich, wobei es vorwiegend zu Einzelstrangbrüchen in der DNA kommt [Jen-Jacobson et al., 1996]. Diese können durch die zelleigene Ligase repariert werden und stellen so keine Gefahr für die Zelle dar [Taylor et al., 1990]. In Gegenwart von Magnesiumionen werden kognate Sequenzen erkannt und gespalten. Sequenzen, die in einem Basenpaar davon abweichen, werden Starsequenzen genannt. Ihre Spaltung erfolgt um den Faktor 103 bis 106 langsamer [Lesser et al., 1990; Thielking et al., 1990]. Unter bestimmten Pufferbedingungen relaxiert die hohe Genauigkeit des Enzyms. Dazu zählen erhöhter pH-Wert (pH8,8) bei erniedrigter Salzkonzentration [Polisky et al., 1975], Verwendung von Manganionen anstelle des Magnesiums [Hsu & Berg, 1978] oder der Zusatz organischer Lösungsmittel [Goodman et al., 1978]. Unter diesen Bedingungen steigt die Spaltaktivität für Starsequenzen um den Faktor 103, während die Spaltgeschwindigkeit für die kanonischen Sequenzen bis auf den Level der Staraktivität absinkt. 4 Einleitung Vier Jahre nach Veröffentlichung der ersten Röntgenstruktur der Restriktionsendonuklease EcoRI im Komplex mit dem Oligonukleotid d(TCGCGAATTCGCG) [McClarin et al., 1986] folgte 1990 nach Analyse weiterer EcoRI-Schwermetall-Derivate eine Korrektur dieses Strukturmodells [Kim et al., 1990]. Die beiden EcoRI-Untereinheiten bilden im Dimer eine nahezu globuläre Struktur aus, welche die DNA umschließt. Dabei umgreift jede Untereinheit die DNA mit armähnlichen Gebilden, den so genannten Inner arms und Outer arms (siehe Abbildung 1.2). Inner arm Outer arm Extended chain ß3 (Katalyse) α4 α5 Abb. 1.2: Schleifenmodell der dimeren EcoRI im Komplex mit DNA Bei Bindung des Enzyms an die spezifische DNA-Sequenz kommt es zu ausgeprägten Konformationsänderungen, wobei die große Furche der DNA um 28° entwunden [Rosenberg, 1991] und ein Knick von etwa 30° induziert wird [McClarin, 1986]. Einleitung 5 Daraus ergibt sich eine Aufweitung der großen Furche um etwa 0,35nm, was die Einlagerung von je zwei α-Helices (α4 und α5) und einem ausgestreckten Abschnitt der Polypeptidkette (Extended chain) pro Untereinheit der Restriktionsendonuklease in die große Furche für die Erkennung der Basensequenz ermöglicht. Die kleine Furche der DNA bleibt dem Lösungsmittel zugewandt. Das zentrale Strukturmotiv jeder Untereinheit wird gebildet durch ein fünfsträngiges β-Faltblatt sowie vier α-Helices, wobei die Faltblätter β1 und β3 eine antiparallele Ausrichtung erfahren und die katalytisch bedeutungsvollen Aminosäurereste Asp91, Glu111 und Lys113 enthalten. Durch die Faltblätter β3 und β5 sowie den Helices α4 und 5 entsteht ein α/β-Bindungsmotiv. Dieses weist Ähnlichkeiten zu der in zahlreichen Dehydrogenasen vorkommenden nukleotidbindenden Rossman-Falte auf [Rossman et al., 1975]. Durch die innere (α4) und die äußere (α5) Erkennungshelix wird im Homodimer ein Vier-Helix-Bündel gebildet, welches zur DNA hin ausgerichtet ist. 1.3 Unspezifische DNA-Bindung und lineare Diffusion Um ihrer Funktion als Abwehrenzym gegen Fremd-DNA gerecht werden zu können, muß EcoRI ihr Substrat zunächst erkennen und binden, bevor es zur Spaltung kommen kann. Die Bindung kann sowohl an spezifischen als auch an unspezifischen Sequenzen erfolgen [Langowski et al., 1980; Woodhead & Malcolm, 1980]. Bedingt dadurch, daß die spezifischen Bindungsstellen deutlich unterrepräsentiert sind, bindet das Enzym in der überwiegenden Zahl der Fälle sein Substrat zunächst an unspezifischen Bindungsstellen. Anschließend erfolgt eine eindimensionale Diffusion auf die Erkennungssequenz mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 × 106 Basenpaaren pro Sekunde [Ehbrecht et al., 1985]. Bei Bindung der DNA durch EcoRI wird diese dann von den Strukturen des Inner arm (Aminosäuren 124-136) und Outer arm (Aminosäuren 176-193) umschlossen. Unspezifische Bindung in Anwesenheit von Magnesium ist möglich (Kass≅105 [Langowski et al., 1980; Terry et al., 1985]), wobei jedoch die Bindung spezifischer Sequenzen deutlich stärker erfolgt (Kass>108, [Grabowski et al., 1995]). Dabei liegen 6 Einleitung der unspezifischen Bindung elektrostatische Wechselwirkungen zugrunde. Diese sind sowohl anziehender als auch abstoßender Natur und müssen in einem Gleichgewicht miteinander stehen, um eine optimale lineare Diffusion zu ermöglichen. Diese stellt keine gleichmäßige Bewegung dar, vielmehr ist sie abhängig von Sequenz und Struktur der DNA. Sie folgt den Windungen der großen Furche in der DNA [Jeltsch et al., 1994]. Starsequenzen können vom Enzym wesentlich besser gebunden werden als unspezifische DNA [Lesser et al.,1990; Thielking et al., 1990]. Dieses führt zu längeren Pausen (bis zu 20 Sekunden) während der linearen Diffusion, ohne daß es zur Spaltung kommt [Jeltsch et al., 1994]. Die Bedeutung einer optimalen linearen Diffusion liegt in der schnellen Spaltung der Fremd-DNA durch die Restriktionsendonuklease, was für die Zelle von entscheidender Bedeutung ist, da eine schnellere Methylierung der kognaten Sequenzen zu einem Schutz der Fremd-DNA führt. 1.4 Erkennung der spezifischen DNA-Sequenz und Kopplung zur Katalyse Zu den herausragendsten Eigenschaften der Restriktionsendonukleasen gehört ihre hohe Präzision in der Substraterkennung und Katalyse, welche sich aus einer Vielzahl von Wechselwirkungen des Enzyms mit der zu spaltenden DNA-Sequenz ergibt. Es handelt sich dabei um van der Waals-Kontakte, ionische Kontakte und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Protein und DNA. Als Erkennung bezeichnet man die Summe dieser bevorzugten Wechselwirkungen; sie beginnt mit dem Übergang vom unspezifischen in den spezifischen Komplex und schließt mit der Aktivierung des katalytischen Zentrums ab. Die spezifische Bindung durch die Restriktionsendonuklease EcoRI führt zu einer Entwindung der DNA um 28° in der großen Furche. So entsteht Platz, um die Einlagerung der Erkennungshelices α4 und α5 und der Extended chain (Aminosäuren 137-142) zu ermöglichen. Das Extended chain-Motiv bildet eine Vielzahl spezifischer Kontakte zu den Basen aus. Es wird durch das Vier-Helix-Bündel α4/α5 und das antiparallele Faltblatt (β1/β3) ausgerichtet. Ein Peptid der Sequenz des Extended chain- Einleitung 7 Motivs ist in der Lage, an die spezifische Erkennungssequenz zu binden [Jeltsch et al., 1995; Vennekohl 1999]. Für diese Arbeit von besonderer Wichtigkeit sind die Kontakte zum äußeren AT-Basenpaar, in dem sich die Erkennungssequenz von EcoRI von der von BamHI (GGATCC) unterscheidet. Dabei wird das äußere Thymin durch einen van der Waals-Kontakt durch Gly140 kontaktiert. Diese Aminosäure bildet einen vergleichbaren Kontakt zum inneren Thymin [Küster, 1998]. Das äußere Adenin wird durch eine Wasserstoffbrückenbindung vom Arg145 kontaktiert. Diese Aminosäure bildet gleichzeitig einen Kontakt zum inneren Adenin aus und einen ionischen Kontakt zu Glu144 der anderen Untereinheit. Gleichzeitig besteht eine doppelseitige Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn141 und dem äußeren Adenin [Fritz et al., 1998]. Die katalytischen Aminosäuren Glu111 und Lys113 sind im Faltblatt β3 lokalisiert. Es enthält ebenso die zur Kopplung wichtigen Aminosäuren Gln115 und Lys117. Als Kopplung wird die Kommunikation zwischen einzelnen Proteinteilen bezeichnet, die dafür sorgt, daß nach Bindung der spezifischen DNA-Sequenz die Spaltung erfolgt. Gln115 bildet neben einem Kontakt zur DNA ebenfalls Kontakte zum Extended chain aus (vergleiche auch Abbildung 1.3) [Jeltsch et al., 1993a]. Durch die Lage im β3Faltblatt ist eine Kommunikation mit dem katalytischen Zentrum wahrscheinlich. Weiterhin wichtig für die Kopplung von Erkennungssequenz und Spaltung ist die Aminosäure Glu144, die durch Kontakte zur eigenen Untereinheit (Asn141 und Arg203) und zur anderen Untereinheit (Arg145 und Lys148) für eine effektive Vernetzung sorgt. So führt auch ein Austausch von Aminosäuren, die nicht direkt an der Katalyse beteiligt sind, durch Störung dieses Netzwerkes zu einer unter Umständen gravierenden Einbuße in der Spaltaktivität [Jeltsch et al., 1993a]. Insgesamt bildet die Restriktionsendonuklease EcoRI sowohl mit Purin- als auch mit Pyrimidinbasen in der GAATTC-Sequenz spezifische Wechselwirkungen aus. Dabei entstehen 18 Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Protein und DNA, 14 davon sind Protein-Purin, vier sind Protein-Pyrimidin Wechselwirkungen. Weiterhin bestehen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Guaninbase, einem Wassermolekül und den zwei Aminosäureseitenketten Arg200 und Arg203 sowie eine Vielzahl von van der Waals-Wechselwirkungen zwischen Protein und DNA [Rosenberg, 1991] (siehe Abbildung 1.3). 8 Einleitung α5 Asn85 HN87 α4 Asn149 HN89 Asp91 β3 Lys148 Arg145 Glu144 HN142 Ala142 Mg Glu111 Lys113 Gln115 Lys117 Asn141 Gly140 Extended chain CO138 Met137 p p Lys130 H2O C A T p Ile197 Met137 CO138 Extended chain Gly140 Lys117 A p Tp T A T Ap Mg Gln115 Lys113 Asn141 Ala142 HN142 Glu144 Arg145 Glu111 Lys148 β3 Asp91 Asn149 C Gp H2O p HN87 p Asn85 Lys130 Arg203 Arg200 p G p Ile197 Arg200 Arg203 p HN89 α4 α5 H-Brücke Ionenkontakt van der Waals-Kontakt Abb. 1.3: Schematische Darstellung aller Kontakte der dimeren EcoRI zur kognaten Sequenz GAATTC Zur Ausbildung der Kontakte ist eine strukturelle Adaption von DNA und Enzym nötig (Induced fit), da erst durch die konformationellen Änderungen optimale Abstände entstehen. Für die DNA sind diese Strukturänderungen leicht aus einem Vergleich mit der Struktur des freien Oligodesoxynukleotids [Drew et al., 1981; Rinkel et al., 1987] zu ersehen. Für das freie Enzym ist bisher keine Strukturuntersuchung im molekularen Detail gelungen. Allerdings zeigen Experimente zur schnellen Reaktionskinetik einen Einfluß zweiwertiger Kationen auf die Geschwindigkeit des Überganges in den aktiven Zustand [Alves et al., 1989b] und es sind Mutanten generiert worden, die sogar zweiwertige Kationen wie zum Beispiel Ca2+-Ionen benötigen, um an die DNA Einleitung 9 binden zu können [Windolph et al., 1997]. Beides spricht eindeutig für verschiedene Konformationen, die das Enzym einnehmen kann. Nach Betrachtung aller Wechselwirkungen ergibt sich die Schlußfolgerung, daß es sich bei dem Erkennungsprozeß der Restriktionsendonuklease EcoRI um ein redundantes System handelt. So kommt es bei Verlust einzelner Wechselwirkungen zwar zu einer spezifischen Substraterkennung durch die verbleibenden Kontakte, jedoch resultiert häufig auch eine verminderte Spaltaktivität [Wolfes et al., 1986; Yanofsky et al., 1987; Geiger et al., 1989; Alves et al., 1989a; Needles et al., 1989; King et al., 1989; Wright et al., 1989; Osuna et al., 1991; Selent et al., 1992; Jeltsch et al., 1993a; Flores et al., 1995; Fritz et al., 1998]. 1.5 Struktur der Restriktionsendonuklease EcoRI im Vergleich mit anderen Restriktionsendonukleasen Ein Vergleich der bis heute sequenzierten und biochemisch charakterisierten 50 Typ II-Restriktionsendonukleasen zeigt keine, beziehungsweise nur geringe Homologien in den Gesamtsequenzen mit Ausnahme einiger Iso- und Neoschizomere. Klassische DNA–Bindungsmotive wie Helix-turn-helix oder basische Helix-loop-helix Strukuren, Zinkfinger oder basische Zipper sind nicht ersichtlich [Pingoud & Jeltsch, 1997]. Bestimmte Teilbereiche enthalten jedoch Übereinstimmungen in Struktur und Funktion [Siksnys et al.,1995]. Von neun Restriktionsendonukleasen sind die Kristallstrukturen bekannt. Ihre Eigenschaften zeigt die nachfolgende Tabelle: Tab. 1.1: Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannter Struktur Restriktionsendonuklease Autoren der Röntgenstruktur Anzahl Aminosäuren Erkennungssequenz EcoRI Kim et al., 1990 276 G↓AATTC EcoRV Winkler et al., 1993 245 GAT↓ATC BamHI Newman et al., 1995 213 G↓GATCC 10 Einleitung PvuII Athanasiadis et al., 1994 157 CAG↓CTG Cfr10l Bozic et al., 1996 285 Pu↓CCGGPy FokI Wah et al., 1997 583 GGATGN9/N14 BglI Newman et al., 1998 299 GCCNNNN↓NGG C MunI Deibert et al., 1999 203 C↓AATTG NaeI Huai et al., 2000 162* GCC↓CGG * den Restriktionsenzymen verwandte Domäne des Enzyms Die Abbildung 1.4 zeigt den strukturellen Aufbau der Restriktionsendonukleasen im Komplex mit DNA beziehungsweise ohne (Cfr10I und NaeI). EcoRI BamHI MunI Cfr10I EcoRV PvuII BglI NaeI Abb. 1.4: Vergleich der Strukturen von Restriktionsendonukleasen im Komplex mit und ohne DNA (Cfr10I, NaeI). Die Komplexe sind so angeordnet, daß die große Furche am Mittelpunkt der Erkennungssequenz nach oben weist. Obwohl es an Sequenzhomologien mangelt, weisen die Enzyme Strukturhomologien auf. Allen acht Enzymen gemeinsam ist das zentrale Strukturmotiv, bestehend aus einem fünfsträngigen ß-Faltblatt, welches die für die Katalyse wichtigen Aminosäuren Einleitung 11 enthält. Hinsichtlich des Spaltverhaltens lassen sich die Enzyme in zwei Gruppen einteilen. Während sich die Enzyme, die einen 5´-Überhang erzeugen, der DNA von der großen Furche her nähern (obere Reihe der Abbildung 1.4), befindet sich bei den blunt end-Schneidern und Enzymen, die einen 3´-Überhang erzeugen, die größte Masse des Enzyms im Bereich der kleinen Furche (untere Reihe der Abbildung 1.4). Dieses liegt begründet in den unterschiedlichen relativen Positionen der zu spaltenden Phosphodiesterbindungen. Während die Spaltung von DNA zu glatten Enden (EcoRV und PvuII) aus der kleinen Furche geschehen kann, ist die kognate Sequenz bei der Erzeugung eines 5´-Überhanges nur von der großen Furche zugänglich [Anderson, 1993]. Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Gruppen werden im Vergleich der Topologien der Enzyme deutlich. In Abbildung 1.5 sind die Sekundärstrukturelemente der Enzymgruppe dargestellt, die sich von der großen Grube her nähert. EcoRI BamHI D91 E111 E111 D94 K113 E113 MunI E98 D83 K100 Cfr10I E204 S188 D134 K190 Abb.1.5: Vergleich der Topologien der Sekundärstrukturelemente von EcoRI, BamHI, MunI und Cfr10I, die sich der DNA von der großen Furche her nähern 12 Einleitung Das fünfsträngige β-Faltblatt durchzieht die Strukturen (blau markiert). Die vier Enzyme verwenden ein gemeinsames Dimerisierungsmotiv, das durch zwei Helices gebildet wird (rot markiert in Abb. 1.5). Nach diesen Strukturen erscheint es wahrscheinlich, daß die Ausrichtung des Enzyms zur DNA durch die Dimerisierungsfläche bestimmt wird. BamHI, EcoRI und MunI enthalten dabei einen Loop in der Dimerisierungsfläche, der die gleiche Ausrichtung zum Faltblatt aufweist. In Abbildung 1.6 sind die Sekundärstrukturelemente derjenigen Enzyme dargestellt, die sich von der kleinen Furche her ihrer DNA Sequenz nähern. EcoRV PvuII BglI NaeI Abb. 1.6: Vergleich der Topologien der Sekundärstrukturelemente von EcoRV, PvuII, BglI und NaeI, die sich der DNA von der kleinen Furche her nähern Einleitung 13 Alle Strukturen zeigen das fünfsträngige β-Faltblattmotiv. Die Enzyme PvuII und die Endonukleasendomäne der NaeI weisen dabei große Ähnlichkeiten untereinander auf. Sie zeichnen sich beide durch eine geringe Größe aus. Die Erkennungssequenzen von EcoRI und MunI unterscheiden sich lediglich im äußeren Basenpaar (EcoRI: G↓AATTC; MunI: C↓AATTG), wobei die zu spaltende Bindung neben dem zentralen AATT-Motiv gleich positioniert ist. So ergeben sich viele Gemeinsamkeiten zwischen den Enzymen. Neben dem schon erwähnten ähnlichen Dimerisierungsmotiv zeigt der strukturelle Vergleich der DNA-Strukturen der spezifischen Sequenzen von MunI und EcoRI ebenfalls eine große Ähnlichkeit: beide DNA-Sequenzen tragen zentral die Sequenz AATT, die bei der spezifischen Bindung in gleicher Weise geknickt wird. EcoRI verwendet für die Erkennung zwei armähnliche Strukturen (Inner arm, Outer arm). Der Outer arm ist bei MunI nicht vorhanden, der Inner arm ist verkürzt und in einer anderen Konformation. Während die Erkennung des äußeren Basenpaars von MunI durch eine einzelne Aminosäure (Arg115) erreicht wird, kontaktiert EcoRI die DNA an dieser Stelle durch ein gebundenes Wassermolekül an den Aminosäuren Arg200 und Arg203, das Cytosin direkt durch Met137 und das Peptid-NH von Ala138. Aufgrund der Ähnlichkeit der Dimerisierung wurde für EcoRI und BamHI ein gemeinsamer evolutionärer Ursprung postuliert [Newman et al., 1994], der nun auf MunI ausgedehnt werden kann. Unterschiede zwischen EcoRI und BamHI zeigen sich in der DNA-Struktur und DNA-Erkennung. Während bei EcoRI eine Verzerrung der DNA eintritt, ersichtlich durch einen Knick von 28° im zentralen AATT-Motiv, fehlt diese Erscheinung bei BamHI bei der spezifischen DNA-Bindung. BamHI zeigt keine vergleichbaren Strukturen zu Inner und Outer arm sowie zum Extended chain-Motiv. Jedoch wird hier eine zusätzliche C-terminal angeordnete α-Helix nur einer Untereinheit in die kleine Furche der DNA eingelagert. Auf diese Weise kontaktiert BamHI die Basen eines Stranges und das Phosphatrückrat des jeweils anderen Stranges (überKreuz-Kontakt). Im Vergleich zu EcoRI nähert sich EcoRV ihrer Erkennungssequenz von der kleinen Furche her. Sie entwindet die DNA in der Mitte der Erkennungssequenz, wobei ein Knick von 50° entsteht. Dadurch folgt eine Erweiterung der kleinen Furche sowie eine Verengung der großen Furche, so daß dem Enzym ein besserer Zugriff auf die 14 Einleitung zu spaltenden Phosphodiesterbindungen möglich wird. Der größte Teil des Erkennungsmotives von EcoRV wird als Erkennungsschleife bezeichnet (R-loop), die um die DNA herum in die große Furche gelegt wird. Einen kleineren Anteil an der DNAErkennung trägt die glutaminhaltige Schleife (Q-loop) bei. Der R-loop bildet zwölf der 18 direkten Wasserstoffbrückenbindungen, zwei van der Waals-Kontakte sowie zwölf wasservermittelte Wasserstoffbrückenbindungen zum Phosphatrückrat. Beim Q-loop sind es vier Wasserstoffbrückenbindungen zu den Basen der kleinen Grube. Bei der Restriktionsendonuklease PvuII ist zwar große Ähnlichkeit zu EcoRV vorhanden, es tritt jedoch hier keine Verzerrung der DNA in der spezifischen Bindung auf. Ein zweisträngiges, antiparalleles Faltblatt mit zwölf direkten Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals-Kontakten zu Basen und Phosphatrückrat dient als Erkennungsmotiv. Obwohl die einzelnen Restriktionsendonukleasen unterschiedliche Strategien zur DNA-Bindung und -Erkennung anwenden, gibt es bei der Anordnung der katalytischen Aminosäuren große Ähnlichkeiten, die in der Superposition eine hohe Übereinstimmung aufweisen (siehe Abbildung 1.7). Dies impliziert eine Ähnlichkeit im Katalysemechanismus. Eine vergleichbare Organisation der aktiven Aminosäuren ist auch bei anderen DNA-modifizierten Enzymen zu finden, zum Beispiel bei der λ-Exonuklease oder dem Reparaturenzym MutH. Einleitung 15 BamHI EcoRI Asp91 Asp91 Glu111 EcoRV Glu98 Glu113 Asp56 Asp90 Glu68 Lys92 Ser188 Lys100 BglI PvuII Asp74 Asp134 Asp83 Glu111 Lys113 Cfr10I MunI NaeI Asp116 Asp86 Asp142 FokI Lys190 Lys70 Lys144 MutH λ-Exo Asp95 Lys97 Glu56 Asp450 Asp119 Asp467 Lys469 Glu77 Glu129 Lys79 Lys131 Abb. 1.7: Superposition der katalytischen Zentren der Restriktionsendonukleasen bekannter Kristallstruktur und anderer DNA-modifizierter Enzyme Das katalytische Zentrum ist auf einem β-Faltblatt lokalisiert. Im überwiegenden Fall werden zwei saure und eine basische Aminosäure verwendet. Dabei gibt es folgende Ausnahmen: BamHI verfügt über drei saure Aminosäuren (Asp91; Glu111; Glu113). Bei Cfr10I dagegen steht zwar ein Serin anstelle einer der sauren Aminosäuren (Asp134; Ser188; Lys190), dafür wird aber von einem anderen Strukturteil ein Glutamat ins aktive Zentrum rekrutiert. Für die aktiven Zentren von Restriktionsendonukleasen wurde ein allgemein gültiges Sequenzmotiv entwickelt, das die Zusammensetzung PDX9-18(E/D)ZK aufweist [Selent et al., 1992]. Dabei ist X eine beliebige Aminosäure, während Z eine hydrophobe Aminosäure darstellt. Das Auftreten des Motivs ist jedoch zu unbestimmt, um definitiv sein zu können. So weist EcoRI zwei solcher Strukturmotive pro Untereinheit auf, aber nur ein aktives Zentrum. 16 1.6 Einleitung Katalyse Im Vergleich der Kristallstrukturen (siehe Kapitel 1.5 und Abbildung 1.6) wird die räumliche Anordnung der für die Katalyse entscheidenden Aminosäuren zu den zu spaltenden Phosphodiesterbindungen deutlich. Die Spaltung der Phosphordiesterbindung entspricht einem Angriff eines Wassermoleküls in Form einer SN2-Reaktion [Connolly et al., 1984]. Dabei sind folgende Elemente nötig: 1. Erhöhung der Elektrophilie des Phosphoratoms durch eine Lewissäure 2. Aktivierung des Wassers durch eine Base 3. Stabilisierung der negativen Ladung im Übergangszustand durch eine Lewissäure 4. Protonierung der Fluchtgruppe Ein 1992 entwickeltes Modell der substratunterstützten Katalyse für EcoRI und EcoRV als möglicher Mechanismus der DNA-Spaltung erfüllt die genannten Forderungen [Jeltsch et al., 1992] (siehe Abbildung 1.8, nächste Seite). Im Fall der substratunterstützten Katalyse wird das Wasser durch den pro-RpPhosphorylsauerstoff der Phosphatgruppe am 3‘-Ende der zu spaltenden Bindung aktiviert. Die negative Ladung dieses Sauerstoffatomes ist für die Katalyse bedeutungsvoll, da durch die Aktivierung des Wassermoleküles dessen Nukleophilie erhöht wird [Jeltsch et al., 1993b]. Spaltexperimente mit sogenannten Missing phosphateSubstraten belegen die Aktivierung des Wassers auf die beschriebene Weise [Jeltsch et al., 1993b]. Bei Verwendung von H-Phosphonaten tritt demnach eine Verlangsamung der Spaltgeschwindigkeit um den Faktor 104 ein. Die Phosphatgruppe kann von dem aktivierten Wasser in Richtung der aufzulösenden Phosphatbindung angegriffen werden, wobei die Hydrolyse unter Inversion der Konfiguration der reaktiven Phosphatgruppe erfolgt [Connolly et al., 1984]. Eine Erhöhung der Elektrophilie des Phosphoratoms erfolgt dadurch, daß die Aminosäuren Asp91 und Glu111 das Magnesiumion gegenüber der zu spaltenden Bindung positionieren [Jeltsch et al., 1992], was wiederum eine Polarisierung der nicht zum DNA-Rückgrat gehörenden P-O-Bindung des Phosphates bewirkt. Ein Sauerstoffatom der Phos- Einleitung 17 Modell der substratunterstützten Katalyse O P A # O P O :O H O .. H Lys113 O H A O H O Lys113 Glu111 O O P O O: P O H O Mg Asp91 O H H O: G H O Glu111 O O P A H Lys113 P Mg Asp91 :O H H Glu111 O O O Mg Asp91 H O G G Modell der Zwei-Metallionen-Katalyse # A H O .. O P Glu45 Lys92 Mg Asp74 O O T H O P O O Asp90 O O: A O Mg Glu45 Lys92 Mg Asp74 H H Mg T H A P O Asp90 O O: H Glu45 Lys92 Mg Asp74 O O O H H O :O Mg Asp90 H T Abb. 1.8: Modell der substratunterstützten Katalyse [Jeltsch et al., 1992] und der Zwei-MetallionenKatalyse [Kostrewa & Winkler, 1995] phatgruppe wird beim Übergang der tetragonalen Geometrie des Phosphatesters in den trigonal bipyramidalen Übergangszustand Teil der Koordinationssphäre des Magnesiumatoms [Heitman, 1992]. Bei diesem Übergangszustand tritt zusätzliche negative Ladung auf, welche durch die basische Aminosäure Lys113 neutralisiert wird. Die Protonierung der Fluchtgruppe erfolgt mit Hilfe eines Wassermoleküls aus der Koordinationssphäre des Mg2+-Ions. Für die Restriktionsendonuklease EcoRV existiert, anders als bei EcoRI, ein Protein/DNA-Kokristall mit den zweiwertigen Kationen Mg2+, Mn2+ und/oder Ca2+. Es konnten in diesen DNA-Kokristallen zwei Metallbindungsstellen lokalisiert werden. Dabei sind die Aminosäuren Asp74/Asp90 an den Wechselwirkungen zum Kation beteiligt und weisen eine hohe Elektronendichte auf, während Asp74/Asp45 eine ge- 18 Einleitung ringe Elektronendichte aufweist und nicht immer alle Kriterien für eine Magnesiumsbindungsstelle erfüllt. Es konnte jedoch eine zweite Bindungsstelle experimentell nachgewiesen werden: Nach Zugabe von Kalziumionen trat bei Vorhandensein von Manganionen eine Erhöhung der Spaltgeschwindigkeit ein, auch wenn dieses Resultat durch Kalzium allein nicht erzielt werden konnte [Vipond et al., 1995]. Diese Ergebnisse führten zur Einführung der Zwei-Metallionen-Katalyse als Alternative zur substratunterstützten Katalyse [Kostrewa & Winkler, 1995; Vipond et al., 1995] (siehe Abbildung 1.7). Bei diesem Mechanismus entstammt das angreifende Wasser der Hydrathülle des einen Metallions, es wird durch dieses aktiviert, während das zweite Metallion eine PO-Bindung im Phosphat polarisiert. Bei den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PvuII trifft die Zwei-Metallionen-Katalyse nicht zu, weil sich die potentiellen Bindungspartner für ein zweites Metallion (EcoRI: Asp59; PvuII: Glu55) als katalytisch unbedeutend erwiesen haben [Grabowski et al., 1996; Nastri et al., 1997]. 1.7 Ziel der Arbeit Die Restriktionsendonuklease EcoRI entwickelt zu ihrer Erkennungssequenz GAATTC eine hohe Anzahl von Wechselwirkungen, wodurch die hohe Spezifität vermittelt wird. Hauptverantwortlich für diese spezifischen Interaktionen mit der DNA sind die Aminosäuren Met137 bis Arg145, die man auch als Extended chain-Motiv bezeichnet. Diese Aminosäurereste bilden eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen Interaktionen zu den Basen und Phosphatresten der DNA. Die Aminosäure Glycin 140 dieses Extended chain-Motivs bildet eine hydrophobe Wechselwirkung zum Thymin der Erkennungssequenz [Rosenberg 1991]. Für einen Aminosäureaustausch des Glycins an der Position 140 zu Alanin konnte gezeigt werden, daß diese Mutante eine erhöhte Spaltgeschwindigkeit auf einem Oligonukleotid zeigt, dessen äußeres Thymin durch ein Uracil ersetzt wurde [Küster, 1998]. Einleitung 19 Basierend auf diesen Erkenntnissen sollen in dieser Arbeit Mehrfachmutanten hergestellt werden, die in Kombination mit der Mutation an Position 140 eine relaxierte Spezifität für das dem Thymin komplementäre Adenin zeigen. Hierbei handelt es sich um die Aminosäuren Asn141 und Arg145. Diese Aminosäuren wurden in Kombination mit der Aminosäure Glycin 140 ausgewählt, da durch die Röntgenstruktur [Rosenberg, 1991] sowie Mutageneseexperimente [Geiger et al., 1989; Alves et al., 1989b; Fritz et al., 1998] sowohl die Wasserstoffbrückenbindung von Arg145 als auch von Asn141 zu dem äußeren Adenin der Erkennungssequenz belegt werden konnte. Mit Hilfe der in dieser Arbeit hergestellten Mehrfachmutanten soll eine Änderung der Spezifität erzielt werden, die eine Erkennung von GGATCC ermöglichen würde (BamHI). 20 Material und Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Mikrobiologische Methoden 2.1.1 Bakterienstämme Bei den unterschiedlichen Arbeitsschritten im Verlauf dieser Arbeit werden die nachfolgend aufgeführten Bakterienstämme (Abkömmlinge des Stammes K12) verwendet: LK111(λ) Genotyp: (rK- mK+), thi-1, thr-1, leuB6, tonA21, supE44, lacIqYZ ∆M15, Hfr, λ+ Es handelt sich um einen λ-lysogenen Stamm, welcher den λ-Repressor cI konstitutiv exprimiert. Dadurch werden Proteine, die unter der Kontrolle des PL-Promoters stehen, reprimiert. Verwendung findet er in der Vermehrung von Plasmid-DNA. TGE900(pEcoR4) Genotyp: (rK- mK+), F-, su-1, ilv-1, bio[λcI857 ∆Bam ∆H1] Dieser λ-lysogene Stamm dient der Expression von Mutanten der Restriktionsendonuklease EcoRI, er exprimiert eine thermosensitive Mutante des λ-Repressors (cl857). Oberhalb einer Temperatur von 42°C liegt dieser Repressor als bindungsinaktives Monomer vor, dadurch kann eine Expression eines plasmidkodierten Gens unter Kontrolle des PL-Promoters durch Temperaturerhöhung induziert werden [Bottermann & Zabeau, 1985]. Zusätzlich enthält dieser Stamm das Plasmid pEcoR4, welches die zu EcoRI korrespondierende Methylase kodiert. Auf diesem Weg wird die toxische Wirkung des exprimierten Genproduktes EcoRI minimiert. WK6mutS(λ) Genotyp: (rK- mK+), ∆[lac proAB], galE, strA, mutS215: Tn 10 [F´, proAB, lacIq Z∆M15], λ+ Hierbei handelt es sich auch um einen λ-lysogenen Stamm, welcher in der Vermehrung von Mismatch-Plasmiden aus der Gapped duplex-Mutagenese eingesetzt wird. Material und Methoden 21 Es ist ein reparaturdefizienter Stamm, bei dem das für die Mismatch-Reparatur verantwortliche mutS-Gen durch Tn10 zerstört wurde. 2.1.2 Verwendete Vektoren pRIF309+(His6) (5068Bp) [Wolfes et al., 1986; Rotzal, 1992] Es handelt sich um ein pBR322-Derivat, welches für die Replikation den CoIE1-Replikationsursprung (Ori) besitzt. Für die Herstellung des einzelsträngigen Plasmids liegt der Replikationsursprung des filamentösen Phagen f1 vor. pRIF309+ trägt das βLactamasegen. Dieses wird durch den Tn903-TetR-Promotor konstitutiv exprimiert, wodurch die plasmidhaltigen Zellen über eine Ampicillin-Resistenz verfügen. Auf dem Plasmid liegt das ecoRI-Gen. Es wird durch den PL-Promotor und den fdTerminator kontrolliert. Dieses System ermöglicht die Haltung des toxischen Gens in E.coli-Zellen, die den λ-Repressor cl produzieren. Am C-Terminus der codierenden Sequenz des ecoRI-Gens sind sechs Histidinreste angefügt (Hexahistidintag), um das Genprodukt (EcoRIHis6) über eine Ni2+-NTA-Affinitätsmatrix aufreinigen zu können. Das Plasmid dient der Mutagenese und der Expression von EcoRI-Mutanten. pRIF309+ findet Verwendung als Template während der PCR-Mutagenese. pEcoR4 (5929Bp) Bei dem Plasmid pEcoR4 handelt es sich um einen Abkömmling des Vektors pACYC184. Es trägt das ecoRI-Methylasegen, welches konstitutiv exprimiert wird und eine Chloramphenicol-Resistenz. Durch die EcoRI-Methylase wird die zelleigene DNA vor dem toxischen Genprodukt EcoRI geschützt, eine Überproduktion wird so ermöglicht. Das Plasmid enthält den Replikationsursprung p15A und ist dadurch zu pRIF309+(CH6) kompatibel, welches das ecoRI-Gen trägt. pRIStrep (5074Bp) [Vennekohl, 1999] Ausgehend vom Vektor pRIF309+(CH6) erfolgte ein Austausch des C-terminalen Hexahistidintags durch einen Affinitätstag nach Vorlage des StrepTag II, welcher acht Aminosäuren enthält. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Basenpaare auf 5074Bp. Man bezeichnet das EcoRI-Fusionsprotein mit diesem Affinitätstag als EcoRIStrepII. 22 Material und Methoden pUC8 (2665Bp) [Viera & Messing, 1982; Pouwels et al., 1985] pUC8 ist ein käuflicher Klonierungsvektor mit CoIE1-Replikationsursprung. Das Plasmid trägt ein Ampicillin-Resistenzgen. Es enthält in der Multiple cloning site eine singuläre EcoRI-Erkennungssequenz und wird hier für kinetische Spaltexperimente verwendet. 2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen Die in dieser Arbeit verwendeten chemisch kompetenten Zellen werden nach der Rubidiumchlorid-Methode hergestellt, einem modifizierten Verfahren nach Hanahan (1993). Bei dieser Methode können Kompetenzen von >107 cfu/µg eingesetzter DNA erreicht werden. Die Zellen sind dann bis zu einem Jahr bei -70°C stabil. Aus einer Übernachtkultur in Luria-Bertani-Medium (LB-Medium) wird eine 100ml Kultur des betreffenden E.coli-Stammes angeimpft. Bei OD600nm=0,40,6 werden die Zellen sedimentiert (1300g, 10min, 4°C), in 100ml eiskalter TFB1-Lösung aufgenommen und 5min auf Eis inkubiert. Die folgenden Arbeitsschritte müssen auf Eis und mit gekühlten Gefäßen ausgeführt werden. Nach einer erneuten Sedimentation erfolgt eine Resuspension in 10ml eiskalter TBF2-Lösung und anschließender 15-60 minütiger Aufbewahrung auf Eis. 100µl Aliquots werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert. LB-Medium: 10g Caseinhydrolysat (Gibco-BRL) 10g Hefeextrakt (Gibco-BRL) 5g NaCl ad 1l ddH2O; pH7,5 einstellen Material und Methoden 23 TBF1: 30mM K-Acetat 100mM RbCl 10mM CaCl2 50mM MnCl2 15% Glycerin pH8,5; einstellen mit 0,1M Essigsäure, sterilfiltrieren TBF2: 10mM Mops oder Pipes 75mM CaCl2 10mM RbCl 15% Glycerin pH6,5; einstellen mit 0,1M KOH, steril filtrieren 2.1.4 Transformation von Bakterienzellen Da Bakterienzellen normalerweise keine DNA aus dem umgebenden Medium aufnehmen, müssen sie speziell darauf vorbereitet werden (siehe 2.1.3). Die kompetenten Zellen können dann mit dem Zielplasmid transformiert werden. Ein 100µl-Aliquot der kompetenten Zellen wird in einem Eisbad aufgetaut. Nach Zugabe von etwa 100ng der zu überführenden Plasmid-DNA wird der Ansatz für 45min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgt ein 2minütiger Hitzeschock, welcher die Aufnahme von DNA in die Zellen fördern soll. Die Temperatur ist abhängig vom verwendeten Zelltypus, sie liegt 5-7°C über der optimalen Bebrütungstemperatur. Nach einer kurzen Abschreckphase auf Eis werden die Zellen mit 900µl LBMedium versetzt und 1h bei optimaler Wachstumstemperatur inkubiert. Nach schonender Zentrifugation (4°C, 1000g, 5min) werden die Zellen auf festem Selektivmedium ausplattiert und über Nacht bei optimaler Temperatur bebrütet. Tabelle 2.1 gibt die Temperaturen für die verwendeten Stämme wider. 24 Material und Methoden Tab. 2.1: Bebrütungs- und Hitzeschocktemperatur in Abhängigkeit des Bakterienstammes Stamm Hitzeschocktemperatur Bebrütungstemperatur LK111(λ λ) 42°C 37°C TGE900(pEcoR4) 37°C 30°C WK6mutS(λ λ) 42°C 37°C 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus E.coli erfolgt mit den Produkten der Firma Qiagen. Mit dem QIAprep Spin Miniprep System werden bis zu 10µg DNA erhalten (aus 3ml LB-Kulturen). Eine größere Ausbeute an DNA gewinnt man mit QIAGEN-tip 20 (20ml Kulturvolumen) beziehungsweise QIAGEN-tip 100 (100ml Kulturvolumen). Die Ausbeute beträgt dann 20µg beziehungsweise 100µg. Zur Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wird mit dem QIAquick Gel Extraction Kit durchgeführt. Die Durchführungen richten sich nach den jeweiligen Protokollen des Herstellers. 2.2.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA Enzymatische Plasmidspaltungen werden auf verschiedenen Stufen des Klonierungsprozesses durchgeführt. Sie dienen einerseits der Überprüfung des Klonierungserfolges (analytische Spaltung) andererseits der Gewinnung von DNA für die Klonierung (präparative Spaltung). Die Trennung erfolgt durch Agarosegelelektrophorese (siehe 2.2.4.1), wobei eine Längenabschätzung der gewonnenen Fragmente anhand eines Standards vorgenommen wird. Material und Methoden 25 Analytische Spaltung: 1-2µg Plasmid-DNA werden mit 10U einer Restriktionsendonuklease für eine Stunde bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert. Präparative Spaltung: 8-10µg Plasmid-DNA werden mit 20U einer Restriktionsendonuklease für mehrere Stunden oder auch über Nacht bei optimaler Temperatur inkubiert. 2.2.3 Ligation Zur Verknüpfung von DNA-Fragmenten wurde in dieser Arbeit T4-DNA-Ligase verwendet. Das Enzym ist in der Lage, alle Brüche zu reparieren, die in einer doppelsträngigen DNA vorkommen können. Die Ligation erfolgt bei einzelsträngigen Überhängen (sticky ends) bei 37°C, da die DNA-Fragmente schon durch Basenpaarung der Überhänge in Verbindung treten können. Eine Verknüpfung von glatten DNA-Fragmenten (blunt ends) wird bei niedrigerer Temperatur durchgeführt (etwa 16°C). Für den Ansatz setzt man äquimolare Mengen der DNA-Fragmente ein. Weiterhin gibt man den vom Hersteller empfohlenen Puffer und ATP dazu (um das durch die Knüpfung von Phosphodiesterbindungen verbrauchte ATP zu ersetzen). Nach Zugabe von 1,5U T4-DNA-Ligase wird der Reaktionsansatz eine halbe Stunde inkubiert. Nachfolgend muß die Ligase durch 10minütige Erhitzung des Ansatzes auf 65°C inaktiviert werden. Nun können mit dem Ligationsprodukt Zellen transformiert werden (siehe 2.1.4). 2.2.4 Elektrophoretische Trennung von DNA 2.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese Agarose, ein Polysaccharid aus roten Meeresalgen, ist ein lineares Polymer aus alternierend 1,3-verknüpften ß-D-Galactopyranose- und 1,4-verknüpften 3,6-Anhydro- 26 Material und Methoden α-L-Galactopyranose-Resten. Es löst sich beim Erhitzen in Wasser. Beim Abkühlen bildet sich ein Netzwerk, welches die Wanderung der zu trennenden DNAFragmente herabsetzt. Zum Beispiel ist ein 1%iges Gel durch Poren mit einem mittleren Durchmesser von 150nm gekennzeichnet. Die herzustellende Konzentration richtet sich nach der Anzahl der Basenpaare der zu trennenden DNA-Fragmente: je kleiner das Fragment, desto höher die Gelkonzentration. Agarosegele werden in einer die Dimension des Gels festlegenden Wanne gegossen. Für ein 1%iges Gel löst man 1g Agarose in 100ml TPE-Laufpuffer unter Erhitzen auf. Anschließend gießt man die Lösung in die vorbereitete Gelkassette. Nach Erstarren der Masse wird diese mit Laufpuffer überschichtet. Nun können die mit Agaroseauftragspuffer versetzten Proben aufgetragen werden. Die Elektrophorese läuft etwa zwei Stunden bei 60V und 100mA. Zur Dokumentation wird das Gel mit Ethidiumbromid (etwa 10µl auf 100ml warmes Wasser) gefärbt. Die Banden werden auf einem UV-Leuchttisch (312nm, UV-Transilluminator Chema 4) sichtbar gemacht. Die Dokumentation erfolgt mit E.A.S.Y RH-3 (Enhanced Analysis System, Herolab), die Bilder werden über einen Drucker (Mitsubishi Video copy processor) erhalten. TPE-Puffer: (10fach) 900mM 20mM Agaroseauftragspuffer: 0,25M (5fach) 1,2% 25% 0,1% 0,1% 2.2.4.2 Tris EDTA, pH8,8 EDTA SDS Saccharose Bromphenolblau Xylen Cyanol FF Polyacrylamidgel-Elektrophorese Diese Form der Elektrophorese dient der Trennung doppelsträngiger DNA-Fragmente in einem Bereich von 5-1000Bp, wie man sie beispielsweise aus Restriktionsspaltungen oder PCR erhält. Als Gel- und Laufpuffer benutzt man TTE. Stammlösung ist eine 30%ige Acrylamid/Bisacrylamidlösung der Firma AGS. Material und Methoden 27 Man gießt die vorbereitete Gellösung zwischen zwei Glasplatten und wartet die durch TEMED und APS eingeleitete Polymerisation ab. Anschließend kann das Gel in die Elektrophoresekammer eingespannt und die Proben aufgetragen werden. Die Elektrophorese läuft bei 30mA. Angefärbt wird das Gel auf einer Glasplatte haftend in Ethidiumbromidlösung. Die Dokumentation der Banden wird wie beim Agarosegel beschrieben durchgeführt (siehe 2.2.4.1). TTE: (20fach) 1,8M 575mM 2,7mM PAA-Auftragspuffer: (5fach) 10mM 1mM 50% (v/v) 0,2% (w/v) 0,2% (w/v) 0,2% (w/v) Tris (nicht eingestellt) Taurin EDTA Tris/HCl, pH8,8 EDTA Glyzerin Azorubin Bromphenolblau Xylen Cyanol FF 2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) beruht auf der zyklischen Amplifikation von DNA-Sequenzen durch eine thermostabile Polymerase. Dazu sind mehrere Faktoren wichtig. Man benötigt zwei synthetisch hergestellte Oligodesoxynucleotid-Primer mit einer Länge von 15-30 Nukleotiden. Die Sequenzen der Primer müssen komplementär zu den Anfangs- und Endsequenzen der beiden Stränge der zu amplifizierenden DNA sein. Weiterhin wird ein Gemisch von Desoxynukleotidtriphosphaten und eine hitzestabile DNA-Polymerase, zum Beispiel aus Thermus aquaticus [Mullis & Falcona, 1987], benötigt. Die PCR-Reaktion läuft in drei sich wiederholenden Reaktionsschritten ab. Zunächst erfolgt eine Denaturierung der Doppelstrang-DNA (Template) der gewünschten Sequenz durch Erhitzen auf 95°C. Dieses bewirkt eine Auftrennung in Einzelstränge. In der nun folgenden Abkühlphase hybridisieren die Primer auf die Einzelstrang-DNA (Annealing). Durch die thermostabile DNA-Polymerase werden die neuen Stränge 28 Material und Methoden bei einer Temperatur von 72°C synthetisiert (Extension). Es sind nun zwei Moleküle doppelsträngiger DNA entstanden. Diese werden wieder denaturiert, es entstehen erneut Einzelstränge, die nach dem Abkühlen mit den Primern hybridisieren und dann wieder von der Polymerase verlängert werden. Da bei jedem Einzelschritt eine Verdopplung der DNA-Menge erreicht werden sollte, tritt nach 20 Zyklen theoretisch ein Vermehrungsfaktor von etwa 106 auf. 2.2.6 Mutagenesestrategien Für die zielgerichtete Herstellung der EcoRI-Mutanten wurden die Gapped duplexMethode [Kramer et al.,1984] und die PCR-Mutagenese [Barettino et al. 1994] verwendet. 2.2.6.1 Gapped duplex-Mutagenese Die Gapped duplex-Methode ist eine gezielte Mutagenesestrategie. Um die gewünschte Mutation einführen zu können, wird zunächst ein Oligonukleotid (Primer) synthetisiert, welches neben der Aminosäuremutation eine stille Mutation enthält. Diese beinhaltet die Basensequenz zur Erzeugung oder Zerstörung einer Restriktionsspaltstelle, verändert jedoch nicht die Aminosäuresequenzen der Position. Die stille Mutation dient später der Überprüfung des Mutageneseerfolges und wird als Screeningsite bezeichnet. Abbildung 2.1 zeigt eine schematisierte Darstellung der Mutagenese. Material und Methoden 29 + Transformation von WK6mutS ss-pRIF309+ wt-Plasmid mutiertes Plasmid Screening: Schneiden mit BglII mismatch-Plasmid Rahmen: SpeI/HindIII MutageneseOligonukleotid + linearisiertes wt-Plasmid mutiertes Plasmid Transformation in LK111 Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Gapped duplex-Mutagenese Aus einer mit f1-Phagen superinfizierten Bakterienkultur, welche das zu mutierende Plasmid mit f1-Replikon (pRIF309+(CH6)) enthält, wird einzelsträngige Plasmid-DNA aufgereinigt [Vennekohl,1996]. Dann erfolgt auf dieser Matrize die Hybridisierung des Mutageneseprimers sowie eines Mutageneserahmens, welcher die Bereiche, die in der Auffüllreaktion (Fill in) neusynthetisiert werden müssen, möglichst klein hält. Diesen Rahmen erhält man durch Spaltung aus dem zu mutierenden doppelsträngigem pRIF309+(CH6) mit zwei Restriktionsendonukleasen. Der Mutageneseprimer enthält nach der Synthese kein endständiges Phosphat, so daß eine Phosphorylierung erforderlich wird (siehe unten). Zur Hybridisierung folgt eine Inkubation von 5min bei 95°C mit anschließender langsamer Abkühlungsphase des Hybridisierungsansatzes auf Raumtemperatur. Einzelsträngige Bereiche werden mit Hilfe von T7-DNA-Polymerase aufgefüllt und dann durch T4DNA-Ligase geschlossen (siehe unten). Mit dem entstandenen Mismatch-Plasmid werden Zellen des reparaturdefizienten Stammes WK6mutS(λ) transformiert (siehe 2.1.4). Nach der in vivo- 30 Material und Methoden Amplifikation besitzen höchstens 50% der Tochterplasmide die gewünschte Mutation, da nur ein Strang des Plasmids die durch den Mutageneseprimer eingeführte Mutation trägt. Über die stille Mutation ist dann eine Selektion der positiven Klone möglich, indem bei Einführung einer Restriktionsspaltstelle die isolierte DNA mit dem entsprechenden Enzym gespalten wird (siehe 2.2.2). Nach Religation (siehe 2.2.3) erfolgt die Transformation von LK111(λ)-Zellen. Wurde eine Restriktionsspaltstelle vernichtet, können nach der Spaltung durch das ScreeningEnzym direkt LK111(λ) transformiert werden. Anschließend werden einzelne Klone erneut mit dem Screening-Enzym gespalten. Die daraus hervorgehenden positiven Klone müssen in ihrer Basensequenz verifiziert werden (siehe 2.2.7). Phosphorylierungsansatz: 2µl 2µl 1µl 1µl 13µl 1µl 10x EcoRI-Puffer (Standardbedingungen) 0,1M DTT 10mM rATP (20pmol) Primer ddH20 PNK (1U/µl) Hybridisierungsansatz: 4µl 10µl 3µl Hybridisierungspuffer (10fach) (10pmol) phosphoryliertes Oligonukleotid (1pmol) einzelsträngige pRif309+(His6)Matrize 10µl (0,5pmol) verkürzter Doppelstrang (Rahmen) ad 40ml ddH2O Auffüllreaktion (Fill in): und Ligation 40µl Hybridisierungsansatz 7,5U T7-DNA-Polymerase 7,5U T4-Ligase Fill in-Puffer (10fach) 8µl ad 80µl ddH2O Material und Methoden 2.2.6.2 31 Hybridisierungspuffer: 10mM Tris/HCl, pH7,5 150mM KCl Fill in-Puffer: 27,5mM 67,5mM 15mM 2mM 50µM je 25µM Tris/HCl, pH7,5 KCl MgCl2 DTE ATP dATP, dGTP, dTTP, dCTP PCR-Mutagenese Die in vitro-Amplifikationsmethode der Polymerase chain reaction (PCR) [Mullis & Falcona, 1989] ermöglicht die gezielte Veränderung eines Gens, in das durch die Verlängerung der eingesetzten mutagenen Primer gleichzeitig eine Mutation auf beiden Strängen des Gens eingebracht wird [Barettino et al., 1993]. Dazu sind zwei Teilschritte notwendig, welche auf der Abbildung 2.2 deutlich gemacht werden. Abb. 2.2: Schematische Darstellung der PCR-Mutagenese 32 Material und Methoden In diesem Fall erfolgt im ersten Schritt die Amplifikation eines verkürzten Fragments des ecoRI-Gens. Der Reaktionsansatz beinhaltet den Mutageneseprimer M, der sowohl die gewünschte als auch eine stille Mutation enthält sowie den Primer A, der auf dem Hexahistidintag des ecoRI-Gens und angrenzenden Bereichen hybridisiert. Als Template wird hier pRIF309+(CH6) eingesetzt (Ansatz siehe unten). Das Produkt dieser 1. PCR-Reaktion dient in der anschließenden 2. PCR-Reaktion als Megaprimer. Dort werden gleichzeitig die Primer A und B sowie pRIF309+(ohne Hexahistidintag) als Template eingesetzt (Ansatz siehe unten). Der PCR-Ansatz wird nach folgenden Angaben zusammengestellt (siehe unten) und einer PCR unterzogen. Tabelle 2.2 gibt das Standardprogramm für die PCR-Mutagenese wider. Erste PCR: 5µl 5µl 1µl 1µl 1µl 1µl 35µl 10xHigh-Fidelity-Puffer 2mM dNTPs 50µM Primer A 50µM Mutageneseprimer pRIF309+(His6) (100ng/µl, lin. XmnI) High Fidelity-DNA-Polymerase (nativ, 2,5U/µl, Firma Boehringer Mannheim) ddH2O Tab. 2.2: Standardprogramm für die PCR-Mutagenese Wiederholungen Denaturierung Annealing Extension 1x 91°C 91°C 45°C 72°C 60s 90s 60s 91°C 45°C 72°C 60s 90s 300s 300s 30x 1x Material und Methoden 33 Der entstandene Megaprimer wird mit dem PCR Purification Kit der Firma Qiagen aufgereinigt, in 50µl TE aufgenommen. Das PCR-Produkt wird auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (siehe 2.2.4.2) analysiert. Das erste PCR-Produkt wird in die zweite PCR eingesetzt (Ansatz siehe unten). Es wird das gleiche Programm wie für die erste PCR (siehe Tabelle 2.2) verwendet. Zweite PCR: 5µl 5µl 1µl 1µl 5µl 1µl 1µl 31µl 10xReaktionspuffer 2mM dNTPs 50µM Primer A 50µM Primer B Megaprimer pRIF309+(ohne His6) (100ng/µl, lin. PvuI) High Fidelity-DNA-Polymerase (nativ, 2,5U/µl, Firma Boehringer Mannheim) ddH2O Das zweite PCR Produkt wird ebenfalls auf einem Polyacrylamidgel (siehe 2.2.4.2) analysiert und mit dem PCR Purification Kit der Firma Qiagen aufgereinigt. Anschließend erfolgt eine Restriktionsspaltung des zweiten PCR-Produktes, welches durch Ligation (siehe 2.2.3) in den vorbereiteten Rahmen des Plasmids pRIF309+(CH6) überführt wird. Der Ligationsansatz wird in LK111(λ) transformiert und die Klone auf das Vorhandensein der eingeführten Screeningsite geprüft. Vergleicht man die Gapped duplex-Mutagenese mit der PCR-Mutagenese, liegt der Vorteil letzterer in einem deutlich geringerem Zeitaufwand sowie der Möglichkeit der Herstellung von Mehrfachmutanten, deren Mutationen in der Primärsequenz dicht aufeinander folgen. Dieses ist mit der Gapped duplex- Mutagenese schwierig, da der Mutageneseprimer mit jedem zusätzlichen Mismatch schlechter auf dem Template hybridisiert. 34 Material und Methoden 2.2.6.3 Mutageneseprimer Die Primersequenzen sind in 5‘→3‘-Richtung angegeben. Die in der DNA vorgenommenen Basenaustausche sind fett gedruckt. Die neu eingefügten Aminosäurecodons sind kursiv gedruckt. Mit den Primern wurde jeweils die BglII-Spaltstelle (unterstrichen) entfernt. Wildtypsequenz TTA ATG GCT GCT GGT AAT GCT ATC GAA AGA TCT CAT AAG AAT G140A/N141A (-BglII) TTA ATG GCT GCT GCT GCT GCT ATC GAA AGG TCT CAT AAG AAT Ala Ala G140A/N141S (-BglII) TTA ATG GCT GCT GCT AGT GCT ATC GAA AGG TCT CAT AAG AAT Ala Ser G140S/R145K (-BglII) TTA ATG GCT GCT AGT AAT GCT ATC GAA AAA TCT CAT AAG AAT Ser Lys G140S/N141S/R145K (-Bglll) TTA ATG GCT GCT AGT AGT GCT ATC GAA AAA TCT CAT AAG AAT Ser Ser Lys Die Mutanten G140A/N141A und G140A/N141S wurden mit Hilfe der PCR- Mutagenese hergestellt, G140S/R145K und G140S/N141S/R145K mittels der Gapped duplex-Mutagenese. 2.2.6.4 Klonierung der Mutanten mit StrepTag II Aufgrund der schlechten Aufreinigungserfolge der Mutanten mit dem Hexahistidintag erfolgte eine Umklonierung zum StrepTag II. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Ba- Material und Methoden 35 senpaare von sechs (His6) auf acht (StrepTag II). Es handelt sich dabei um die Aminosäuresequenz Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys. In dieser Arbeit wurde durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen SpeI und HindIII ein 620Bp großes Insert, welches die Mutation trägt herausgeschnitten und den 4451Bp großen pRSN-Rahmen ligiert (siehe 2.2.3). Anschließend erfolgte die Transformation von LK111(λ) mit dem Ligationsansatz. Eine Überprüfung des Klonierungserfolges fand auf einem Agarosegel statt. Die positiven Klone konnten nach Transformation in TGE900(pEcoR4) der Aufreinigung mit dem StrepTag II-System zugeführt werden (siehe 2.2.6.4). 2.2.7 DNA-Sequenzierung Zur Bestätigung der Mutationen wird das betreffende Plasmid einer DNA-Sequenzierung unterzogen. Um Sekundärmutationen auszuschließen, muß das gesamte ecoRI-Gen kontrolliert werden. Hierzu wurde die Didesoxy-Methode nach Sanger [Sanger et al., 1977] verwendet. Auf die zu sequenzierende DNA (Template) wird ein kurzes Oligonukleotid (Primer) hybridisiert (Annealing), welches durch die Polymerase verlängert wird. Zusätzlich zu den Desoxynukleotidtriphosphaten wird in vier Parallelreaktionen je eine der vier Basen als Didesoxynukleotidtriphosphat für die Polymerisation eingesetzt (Termination). Zu einem Kettenabbruch kommt es, wenn ein Didesoxynukleotid durch die Polymerase in die Nukleotidkette eingebaut wird, so daß die für die Synthese der nächsten Phosphordiesterbindung benötigte 3‘OHGruppe fehlt. Auf diese Weise entstehen statistisch unterschiedlich lange DNAFragmente, die durch eine denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (6%iges Gel) aufgrund ihrer Länge aufgetrennt werden können. Anschließend kann die Basensequenz der DNA von einem Autoradiogramm abgelesen werden. Folgende Primer wurden zur Sequenzierung verwendet (siehe Tabelle 2.3): 36 Material und Methoden Tab. 2.3: Primersequenzen für die Sequenzierung des ecoRI-Gens nach Sanger Primer Sequenz Position im Gen (Bp des Plasmids) lesbarer Bereich (Aminosäureposition) H239 TTCAAAGCAGAAGGC 239-253 1-90 H1 GATCTTGGCGGTA 541-528 90-160 M2 TCGAAAGATCTCATAA 729-744 160-240 H955 TGTATTAACAAATTT 953-966 240-284 2.2.7.1 DNA-Vorbereitung und Annealingreaktion 1,5-2µg doppelsträngige Template-DNA wird durch Zugabe von 2µl 2M NaOH 10min bei Raumtemperatur denaturiert. Zur Neutralisation werden 3µl Na-Acetat (pH4,5) und 7µl ddH2O zugegeben. Anschließend gibt man 60µl 100% Ethanol dazu, um die DNA zu fällen (-70°C für 15min oder 20°C für 30min). Nach 10min Zentrifugation bei 12000rpm wird der Überstand verworfen, das Pellet in 70% Ethanol (eiskalt) resuspendiert und erneut zentrifugiert (10min, 12000rpm, 4°C). Der Überstand wird entfernt, das DNA-Pellet an der Luft getrocknet und dann in 10µl ddH2O aufgenommen. Diese Lösung wird nach Zugabe von 2µl Annealingpuffer und 2µl Primer (710ng) 20min bei 37°C inkubiert. Dann läßt man den Ansatz 10min bei Raumtemperatur stehen. Die Annealingansätze können sofort benutzt oder bei -20°C aufbewahrt werden. Annealingpuffer: 0,28M 0,1M 0,35M Tris/HCl, pH7,5 MgCl2 NaCl 2.2.7.2 Markierungsreaktion Zum Annealingansatz werden 2µl Labellingmix, 1µl 0,3M DDT und 1µl [α35 S]dATP gegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2µl verdünnter T7- Material und Methoden 37 DNA-Polymerase (1,5U/µl) gestartet. Dann mischt man die Lösung vorsichtig mit der Pipettenspitze, zentrifugiert kurz an und inkubiert 5min bei Raumtemperatur. Labellingmix: 2µM dTTP, dGTP und dCTP 2.2.7.3 Terminationsreaktion Je 2,5µl der vier Terminationsmixe werden bei 37°C vorgewärmt. Nach Beenden der Labellingreaktion werden 4,5µl der Ansätze zu den Terminationsansätzen pipettiert. Die Reaktion wird nach genau 5min durch Zugabe von 5µl Sequenzierauftragspuffer (SAP, Stopplösung) beendet. Vor Auftrag auf das Sequenziergel müssen die Proben noch 2min bei 95°C denaturiert und auf Eis abgeschreckt werden. Pro Probentasche setzt man 2,5µl ein. Terminationsmixe: 15µM 150µM 40mM 10mM 50mM ddATP bzw. ddTTP, ddGTP oder ddCTP dATP, dTTP, dGTP und dCTP Tris/HCl, pH7,5 MgCl2 NaCl 2.2.7.4 Sequenziergel Zunächst werden die mit Ethanol gereinigten Glasplatten mit Haftsilan beziehungsweise Repellsilan beschichtet. Die Polymerisation der vorbereiteten Gellösung wird durch Zugabe von 27µl TEMED und 270µl APS (40%) gestartet. Nach etwa einer Stunde kann das Gel verwendet werden. Es wird dafür zunächst in eine beheizbare, vertikale Elektrophoresekammer (Temperatur etwa 55°C) eingespannt und die Pufferbehälter mit 1xTTE gefüllt. Für den Vorlauf werden die Taschen mit 2µl SAP beschickt. Der Vorlauf dauert etwa 30min und wird bei 1500V (maximal 50mA) durchgeführt. Anschließend werden 2µl der Proben in die gesäuberten Geltaschen pipettiert. Die Trennung der DNA-Fragmente erfolgt bei 1500V für 2-3 Stunden (bis das zugesetzte Bromphenolblau das Gelende erreicht hat). 38 Material und Methoden Um den Harnstoff zu entfernen, wird das Gel 1-2 Stunden in 10%ige Essigsäure gelegt und anschließend bei 65°C getrocknet. Die radioaktiv markierten Banden werden durch Auflegen eines Röntgenfilmes (Firma: Kodak; Kodak BioMax) sichtbar gemacht. Repellsilan: 10% (v/v) Dichlordimethylsilan in Toluol Haftsilan: 40µl SilanA-174 (=τ-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, BDH „Electran“) 200µl 10%ige Essigsäure ad 10ml Ethanol Die Lösung muß frisch angesetzt werden. Gellösung (6%): 18,7g 12, 5ml 2,5ml ad 50ml Harnstoff 25% Sequenziergel-Fertiglösung w/w; AGS) 20fach TTE ddH2O Auftrags- und Stoppuffer: 95% (v/v) 20mM 0,05%(w/v) 0,05% (w/v) 2.3 (19:1; deionisiertes Formamid EDTA, pH7,5 Xylen Cyanol FF Bromphenolblau Proteinchemisches Arbeiten 2.3.1 Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli Diese denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese mit Zusatz von Sodiumdodecylsulfat (SDS) und ß-Mercaptoethanol in einem diskontinuierlichen Puffersystem [Laemmli, 1970] dient der Überprüfung der Reinheit einer Präparation oder der Identifizierung eines Proteins innerhalb eines Gemisches. Material und Methoden 39 Die meisten Proteine binden die Seife (SDS) zu negativ geladenen SDS-Komplexen mit konstantem Ladungs- zu Masse-Verhältnis. Durch SDS erfolgt eine Denaturierung der Proteine, insbesondere wenn eine vorherige Reduktion mit Mercaptoethanol oder DDT stattgefunden hat. Der gebildete SDS-Protein-Komplex wandert bei der Elektrophorese im elektrischen Feld zum Plus-Pol. Durch den Molekularsiebeffekt einer porösen Polyacrylamidmatrix kommt es dabei zur Auftrennung der SDS-Protein-Komplexe nach ihrem Molekulargewicht. Bei der Analyse des Genproduktes EcoRI aus einem Proteingemisch des Zellaufschlusses verwendet man 17,5%ige Gele zur Trennung. Dieses wird mit einem 6%igen Sammelgel überschichtet, welches die Auflösung der Proteinbanden erhöht. Nach Gießen des Trenngels zwischen zwei vorbereitete Glasplatten, wird es sofort mit Ethanol überschichtet, um einen waagerechten Abschluß zu erhalten. Ist die Polymerisation erfolgt, wird der Alkohol vorsichtig abgegossen und das Sammelgel über das Trenngel geschichtet. Die Elektrophorese erfolgt bei konstant 30mA, bis das Bromphenolblau die untere Glasplattenkante verlassen hat. Die zu untersuchenden Proben werden zur Konzentrierung mit dem gleichen Volumen 20%iger TCA (w/v) versetzt. Nach einer 15minütigen Fällungsphase erfolgt eine 15minütige Zentrifugation (13000rpm, 4°C). Der Überstand wird verworfen und das Präzipitat in 20µl Laemmli-Auftragspuffer aufgenommen. Um die Proben zu neutralisieren, wird ihnen 1-2µl 2M Tris-Lösung hinzugefügt. Proben mit geringem Volumen werden direkt mit Auftragspuffer versetzt. Vor dem Auftrag erhitzt man die Proben für 2min auf 95°C und kühlt sie kurz auf Eis ab. Stammlösung 17,5%: 58ml 28ml 10ml 4ml 30% AA (w/v), 0,8% BisAA (w/v) 1,5M Tris/HCl, pH8,8 1% (w/v) SDS ddH2O 40 Material und Methoden Stammlösung 6%: 20ml 12,5ml 10ml 47,5ml 30% AA (w/v), 0,8% BisAA (w/v) 1M Tris/HCl, pH6,8 1% (w/v) SDS ddH2O Laemmli-Auftragspuffer: 50mM (2fach) 100mM 2% 0,1% 10% (v/v) Laemmli-Laufpuffer: (10fach) 0,25M 1% 1,9M Tris/HCl, pH6,8 DTT SDS Bromphenolblau Glycerin Tris (pH8,3, nicht eingestellt) SDS Glycin Laemmli-Färbelösung: 0,2% (w/v) Coomassie Blue R 250 0,05% (w/v)Coomassie Blue G 250 42,5% (v/v) Ethanol 5% (v/v) Methanol 10 % (v/v) 100%ige Essigsäure 2.3.2 Expressionstest Ein Expressionstest wird durchgeführt, um die Funktionalität des mutierten Genproduktes zu überprüfen bevor dieses der Proteinfermentation im großen Maßstab zugeführt wird. Zellen des Stammes TGE900(pEcoR4) werden mit den im Verlauf der Arbeit erhaltenen mutierten pRIF309+-Plasmiden transformiert. Mit einem der gewonnenen Klone wird eine 5ml Kultur angeimpft. Als Selektionsmarker gibt man dem Nährmedium sowohl Ampicillin (pRIF309+) als auch Chloramphenicol (auf pEcoR4) dazu. Nach Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase wird eine Probe von 500µl entnommen. Dann wird zur Wachstumssteigerung 200µl 20%ige Glukose beigefügt und die Temperatur zur Induk- Material und Methoden 41 tion auf 42°C erhöht. Nach etwa 2 Stunden Wachstumszeit wird erneut ein Probenvolumen von 500µl abgenommen. Die Proben vor und nach der Induktion werden zusammen sedimentiert (13000rpm, 5min), das Zellpellet in 50µl LAP aufgenommen und anschließend auf einem Laemmligel analysiert (siehe 2.3.1). 2.3.3 Fermentation Die Fermentation dient der Gewinnung größerer Proteinmengen. Sie wird im 10lMaßstab durchgeführt, die Expression der EcoRI-Mutanten erfolgt in TGE900(pEcoR4)-Zellen (siehe 2.1.3). Zunächst wird die Fermentationsapparatur zusammengebaut, mit 8l entionisiertem Wasser befüllt und für mindestens 14 Stunden bei 120°C sterilisiert. Nach Zugabe von 1l sterilisiertem 10xLB-Medium, 1g Ampicillin, 0,3g Chloramphenicol sowie 3ml Entschäumer wird das Medium durch Hinzufügen von 1l Vorkultur angeimpft. Nun folgt die Anzucht der Zellen, unter ständiger Kontrolle des pH-Wertes (pH7,5) bei 30°C bis zu OD600nm von etwa 1,5-2 (etwa 2-3 Stunden). Ist die gewünschte Zelldichte erreicht, werden 500ml sterile Glukoselösung (200g/l) sowie 500ml sterile Caseinlösung (200g/l) dazugegeben und die Temperatur auf 42°C erhöht. Nach 2stündiger Expression werden die Zellen abzentrifugiert (5000rpm, 10min), mit ST-Puffer gewaschen und anschließend in 100ml PDL/0,5M NaCl resuspendiert. Die Zellösung kann nun weiterverwendet oder bei –20°C eingefroren werden. ST-Puffer: 10mM 100mM Tris/HCl, pH8,0 NaCl PDL: 30mM KPi, pH7,2 0,1mM DTT 0,01% (v/v) Lubrol 42 Material und Methoden 2.3.4 Ultraschallzellaufschluß E.coli-Zellen können in unterschiedlichen Verfahren aufgeschlossen werden. Für größere Mengen eignet sich Ultraschall. Für den Ultraschallzellaufschluß werden die Zellen in einem Becherglas auf Eis kühl gestellt und 25min mit Ultraschall behandelt (Duty Cycle: 60%; Output Control: Stufe 6, Branson Sonifier 250, Ultrasonics). Jeweils nach einer halben Minute Beschallung erfolgt eine halbe Minute Pause, um die Zellösung nicht zu sehr zu erhitzen. Um Zelltrümmer und unversehrte Zellen zu trennen wird im Anschluß eine 1stündige Ultrazentrifugation durchgeführt (10000g, 4°C) nach welcher das klare Lysat weiterverwendet werden kann. 2.3.5 Chromatographische Verfahren 2.3.5.1 Affinitätschromatographie mit Hexahistidintag Affinitätschromatographie nutzt die hohe Affinität bestimmter biologischer Komponenten aus, um eine Aufreinigung eines Zielproteines mit hoher Selektivität zu erreichen. In diesem Fall wurde Metallchelatchromatographie eingesetzt [Hochuli, 1990]. Als Trägermaterial steht Ni2+-NTA-Agarose (Firma Qiagen) zur Verfügung, um Proteine mit Hexahistidintag zu binden. Das Material enthält als funktionelle Gruppe Ni2+-Ionen, die mit aufeinanderfolgenden Histidinen einen Komplex bilden können. Daher werden Proteine, die einen Hexahistidintag (His6) enthalten, selektiv gebunden. Die Elution erfolgt mit Imidazol, das mit den Histidinen um die Bindungsplätze konkurriert. Alle im Rahmen dieser Arbeit hergestellten EcoRI-Mutanten wurden unter anderem als C-terminale His6-Fusionsproteine kloniert, und können dadurch über Ni2+-NTA-Agarose aufgereinigt werden. Um eine Stabilisierung des Proteins zu erreichen wurde in einem zweiten Aufreinigungsverfahren 1mM CaCl2 hinzugefügt. Für die Aufarbeitung eines 10l-Fermenters werden 1ml Ni2+-NTA-Agarose mit 100ml Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Um die Viskosität zu senken, verdünnt man das klare Zellysat mit dem Äquilibrierungspuffer 1:5 und stellt den Material und Methoden 43 pH-Wert der Lösung mit Ammoniaklösung (100mM) auf pH7,5 ein. Dann erfolgt der Auftrag auf die vorbereitete Säule. Anschließend wird mit 100ml Äquilibrierungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgt mit einem linearen Imidazolgradienten von 10-200mM Imidazol in PDL-Puffer/0,5M NaCl. Das Eluat fängt man in einzelnen Fraktionen zu 200 Tropfen (10ml) auf und trägt es zusammen mit Aliquots von Durchlauf, Waschschritt und Säulenmaterial nach TCA-Fällung von je 100µl der Fraktionen auf ein Laemmli-Gel auf (siehe 2.3.1). Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden vereinigt und der Ionenaustauschchromatographie zugeführt (siehe 2.3.5.3). 2.3.5.2 PDL: 30mM KPi, pH7,5 0,1mM DTE 0,01% (v/v) Lubrol Äquilibrierungspuffer: PDL, pH7,5 500mM NaCl 10mM Imidazol (1mM CaCl2) Elutionspuffer: PDL, pH7,5 500mM NaCl 150mM Imidazol (1mM CaCl2) Affinitätschromatographie mit StrepTag II Das hier verwendete StrepTag II-System wurde eingesetzt, um eine effektivere Aufreinigung von Fusionsproteinen mit dem StrepTag II-Peptid [Schmidt et al., 1996] über eine Affinitätsmatrix mit immobilisiertem StrepTactin zu erreichen. Die Dissoziationskonstante des StrepTag II-Peptids von StrepTactin beträgt 1µM [Voss & Skerra, 1997]. Der Affinitätstag kann C- oder N-terminal oder zwischen zwei Domänen kloniert werden. 44 Material und Methoden Durch die Kompetition mit Desthiobiotin (DTB) wird eine schonende Elution des gereinigten rekombinanten Proteins von der Affinitätsmatrix gewährleistet. Zusätzlich wurde bei dieser Arbeit 1mM CaCl2 eingesetzt, um das Protein zu stabilisieren. Zunächst erfolgte die Äquilibrierung der Säule mit 0,5ml StrepTactin, 1ml Sephadex G-25 Medium mit Äquilibrierungspuffer. Das Zellysat wurde1:5 verdünnt, um die Viskosität herabzusetzen. Anschließend wurde die vorbereitete Säule damit befüllt. Es folgte ein Waschschritt mit fünf Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer, anschließend mit desthiobiotinhaltigem Waschpuffer. Die Elution erfolgte mit einem Säulenvolumen des Elutionspuffers. Waschfraktionen, Säulenmaterial und Eluat wurden auf einem Laemmligel auf ihren Proteingehalt überprüft (siehe 2.3.1). Das Eluat wurde der Dialyse zugeführt. Äquilibrierungspuffer: 500mM 1mM PDL, pH7,5 NaCl CaCl2 500mM 1mM 0,1mM PDL, pH7,5 NaCl CaCl2 Desthiobiotin 500mM 1mM 5mM PDL, pH7,5 NaCl CaCl2 Desthiobiotin Waschpuffer: Elutionspuffer: 2.3.5.3 Ionenaustauschchromatographie Im Anschluß an die Affinitätschromatographie mit Hexahistidintag (siehe 2.3.5.1) erfolgt die weitere Aufreinigung und Konzentrierung der vereinigten Proteinfraktionen aus der Affinitätschromatographie mittels der hier beschriebenen Ionenaustauschchromatographie (P-Cell, Whatman). Bei EcoRI handelt es sich um ein DNAbindendes Protein, das heißt, es geht wesentlich stärkere Bindungen zu den Phos- Material und Methoden 45 phatgruppen des Austauschermaterials ein als andere Proteine. DNA wird durch ihre negative Ladung nicht gebunden, so daß eine quantitative Abtrennung möglich wird. Ein Säulenvolumen von 5ml Phosphozellulose wird mit 100ml Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Um die NaCl-Konzentration der vereinigten Fraktionen der Affinitätschromatographie zu senken, verdünnt man sie 1:5 mit PEDL-Puffer. Nach Auftrag auf die Säule wird diese mit 50ml Äquilibrierungspuffer (PEDL/0,1M NaCl) gewaschen. Die Elution erfolgt im Batchverfahren mit je 5ml PEDL/0,5M, 0,75M, 1M, 1,5M beziehungsweise 2M NaCl, die Eluate werden aufgefangen und rezyklisiert. Die Fraktionen werden auf einem Laemmli-Gel auf ihren Proteingehalt untersucht (siehe 2.3.1). Positive Fraktionen werden vereinigt und der Dialyse zugeführt (siehe 2.3.6). PEDL: 30mM 0,1mM 0,01% 0,5mM KPi, pH7,2 DTT Lubrol EDTA 0,1M PEDL NaCl Äquilibrierungspuffer: 2.3.6 Dialyse Die Dialyse der aufgereinigten Proteine dient der Stabilisierung von Enzymlösungen sowie ihrer Konzentrierung. Das Eluat wird über Nacht gegen den Dialysepuffer dialysiert (Dialyseschläuche: VISKING, molekulare Ausschlußgrenze 12000-14000 Da) und kann anschließend bei –20°C gelagert werden. Dialysepuffer: PDL, pH7,5 300mM NaCl 70% (v/v) Glycerin (87%ig) 46 2.4 Material und Methoden Biochemische Charakterisierung der EcoRI-Mutanten 2.4.1 UV-Spektroskopie UV-Spektren werden verwendet, um die Konzentration von Proteinlösungen zu ermitteln und Proteinpräparationen auf DNA-Verunreinigen zu untersuchen. Um eine Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen zu ermöglichen, wird ein Spektrum im Bereich 220-320nm aufgenommen (Spektralphotometer Hitachi U 3210). Es wird bei Raumtemperatur in einer Quarzküvette gemessen (Schichtdicke 1cm). Die Konzentrationsbestimmung erfolgt nach dem Lambert-Beerschen Gesetz mit einem Extinktionskoeffizienten von ε278=52985 M-1 cm-1 für das EcoRI Wildtypenzym [Modrich & Zabel, 1976]. 2.4.2 λ-DNA-Kinetiken Die Spaltung des makromolekularen Substrates λ-DNA (48502Bp) hat sich als Standardtest für die Bestimmung der spezifischen Aktivität der EcoRI-Mutanten etabliert. Dabei ist 1U/mg Protein Ausdruck der spezifischen Aktivität und beschreibt die Menge Protein (EcoRI), die 1µg λ-DNA unter Standardpufferbedingungen innerhalb 1h in einem Reaktionsvolumen von 60µl bei 37°C zu spalten vermag. Die Restriktionsendonuklease spaltet λ-DNA unter Standardbedingungen spezifisch an fünf Stellen, dadurch entsteht ein charakteristisches Bandenmuster. Das kanonische Spaltmuster enthält Fragmente der Länge: 21226Bp, 7421Bp, 5804Bp, 5643Bp, 4878Bp und 3530Bp. Die spezifische Aktivität wird anhand des Zeitwertes berechnet, zu dem das vollständige Spaltmuster entstanden ist. Die Trennung der Fragmente erfolgt durch ein 0,8%iges Agarosegel. Zur Charakterisierung der Mutanten wird die Spaltung unter verschiedenen Pufferbedingungen ausgeführt. So genannte Starspaltstellen werden gespalten, wenn man Mangan statt Magnesium oder pH8,8 in Verbindung mit niedriger Ionenstärke oder Zugabe organischer Lösungsmittel, wie zum Beispiel Glycerin einsetzt. Dieses Spaltstellen weichen in einem Basenpaar von der spezifischen Erkennungssequenz ab. Material und Methoden 47 In einem 15µl-Ansatz werden zu 1µl λ-DNA (250ng/µl) 1,5µl des entsprechenden Spaltpuffers (10fach) zugesetzt, mit der gewünschten Enzymverdünnung gestartet und bei 37°C inkubiert. Nach definiertem Zeitwert wird die Reaktion durch Zugabe von 5µl AAP gestoppt. Nach Erhitzen auf 65°C für 5min werden die Proben auf Eis abgeschreckt und auf einem Agarosegel (siehe 2.2.4.1) elektrophoretisch getrennt. EcoRI-Standardspaltpuffer: 20mM 10mM 50mM Tris/HCl, pH7,5 MgCl2 NaCl Mn-Starspaltpuffer: 20mM Tris/HCl, pH7,5 1mM 50mM MnCl2 NaCl pH8,8-Staraspaltpuffer: 20mM 1mM 5mM Tris/HCl, pH8,8 MgCl2 NaCl pH8,8-Normalsalzpuffer: 20mM 10mM 50mM Tris/HCl, pH8,8 MgCl2 NaCl 2.4.3 Gelretardationsexperimente (Mobility-Shift-Assays) 2.4.3.1 Bindung an ein 174Bp-Fragment Grundlage dieser Methode ist die Tatsache, daß proteingebundene DNA im nativen Polyacrylamidgel ein verändertes Laufverhalten im Vergleich zur freien DNA zeigt. Dieser Unterschied läßt sich schon bei einer 20cm langen Laufstrecke in einem 6%igen Polyacrylamidgel feststellen. Ein 174Bp langes PCR-Produkt dient als Shiftsubstrat, das in der Mitte die EcoRI-Erkennungssequenz trägt und durch Zugabe von 32 P [αdATP] radioaktiv markiert ist. Als Template für die PCR dient pBR322. Tabelle 2.4 zeigt die Sequenzen des Primerpaares. 48 Material und Methoden Tab. 2.4: Sequenz der PCR-Primer zur Erzeugung des 174er Shift–Substrates Primer Sequenz Shift hin GTGCCACCTGACGTCTAAGA Shift her ATACACGGTGCCTGACTGCG Die PCR wird nach dem folgenden Ansatz zusammengestellt und einer PCR unterzogen (Bedingungen, siehe Tabelle 2.5). PCR-Ansatz: 10µl 10µl 2µl 2µl 1µl 10x Polymerase-Puffer 2mM dNTP-Lösung Primer Shift hin (50µM) Primer Shift her (50µM) pBR322 (linearisiert;100ng) 32 1µl P[αdATP] (10µCi, Amersham) Taq-Polymerase (Firma Qiagen) 1µl ad 100µl dd H2O Tab. 2.5: Standardprogramm für die Erzeugung des 174Bp-Fragments Wiederholungen Denaturierung Annealing Extension 1x 91°C 91°C 63°C 72°C 60s 90s 60s 91°C 63°C 72°C 60s 90s 400s 300s 30x 1x Das PCR Produkt wird mit dem Aufreinigungssystem der Firma Qiagen aufgereinigt. Um die Bindungskonstanten zu bestimmen wird eine feste Shiftsubstratkonzentration von 1nM mit verschiedenen Enzymkonzentrationen im Bereich Material und Methoden 49 0,1nM bis 20nM im Standardshiftpuffer für 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem 30minütigen Vorlauf bei 20mA des nativen Polyacrylamidgels werden die Ansätze direkt aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt bei 150V, etwa drei Stunden lang bei Raumtemperatur bis der Azorubinpuffer das Ende des Gels erreicht. Anschließend wird das Gel im Vakuum getrocknet und über Nacht auf eine Phosphoimagerplatte aufgelegt. Diese kann dann in einem Gerät der Firma Fuji (BAS 1000 bioimager) ausgewertet und mit dem Programm MacBAS2,0 quantifiziert werden. Man erhält eine Bindungskurve, welche zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten herangezogen wird. Dazu ist die folgende Formel nötig: K ass = F ( E − F ×O ) ( 1 − F ) 0 0 F= Anteil der gebundenen DNA E0=Gesamtkonzentration Enzym O0=Gesamtkonzentration Oligonukleotid Standardshiftpuffer: 20mM 50mM 10mM Tris/HCl, pH7,5 NaCl EDTA TTE: (20fach) 1,8M 0,6M 12mM Tris Taurin EDTA 6%ige Gellösung: 8ml 30% AA (w/v), 0,8% BisAA (w/v) 1ml 20xTTE ad 40ml ddH2O 2.4.3.2 Mobility-Shift-Assay mit modifizierten Oligonukleotiden Eine Analyse des Bindungsverhaltens der Mutanten ist auch mit Oligonukleotiden möglich. Sie bieten gleichzeitig die Möglichkeit, modifizierte DNA-Sequenzen anzubieten. Zur Detektion der Oligonukleotide müssen diese radioaktiv markiert werden. 50 Material und Methoden Markierung von Oligonukleotiden kann am 3´-Ende erfolgen (Terminale Transferase; αddATP) oder am 5´-Ende (Polynukleotidkinase; γdATP). Markierungsansatz der 5‘-Phosphorylierung: 1µl Oligonukleotid [etwa 1mM] 1µl 10fach PNK-Puffer A 1µl 1µl 6µl 32 P[γdATP] (10µCi/µl, Amersham) PNK (10U/µl, Fermentas) ddH2O Der Reaktionsansatz wird etwa 5h bei 37°C inkubiert. Dann erfolgt eine Aufreinigung der Oligonukleotide mit dem Nukleotide Removal Kit der Firma Qiagen. Bei konstanter Oligonukleotidkonzentration werden dem Bindungsansatz verschiedene Enzymkonzentrationen hinzugefügt und in Shiftbindungspuffer bei Raumtemperatur 30min inkubiert. Nach dem Vorlauf des Gels (etwa 2h bei 20mA) werden die Proben direkt aufgetragen. Die Elektrophorese (6% Polyacrylamidgel) läuft bei 200V in 0,5xTTE-Puffer für 1-1,5h. Gelbehandlung und Detektion der Banden wird wie bei den Mobility-ShiftAssays mit dem 174Bp-Fragment durchgeführt (siehe 2.4.3.1). Eine Aufstellung über die Oligonukleotidsequenzen findet sich in Tabelle 3.7. 2.4.3.3 Mobility-Shift-Assay unter Ca2+-Zusatz Um Mutanten, die unter Standardbedingungen keine Assoziation an spezifische Substrate zeigten die Möglichkeit einer Bindung zu geben, wurden in Anlehnung an EcoRV-Bindungsexperimente Ca2+-Bindungsansätze verwendet [Vipond et al., 1995; Windolph, 1996]. Dazu wurden dem Bindungspuffer (Ca-Shiftpuffer), dem Gelsystem sowie dem Laufpuffer 1mM CaCl2 hinzugefügt und das EDTA weggelassen. Die Einstellung des pH-Wertes erfolgte auf pH7,5. Der Vorlauf des Gels wurde bei 200V für etwa 2h durchgeführt. Nach Beenden des Vorlaufs wurde der Puffer ausgewechselt. Material und Methoden 51 Diese Experimente wurden sowohl mit dem 174Bp-Substrat als auch mit den modifizierten Oligonukleotiden durchgeführt (vergleiche 2.4.4). Ca-Shiftpuffer: 20mM 50mM 1mM Tris/HCl, pH7,5 NaCl CaCl2 2.4.4 Spaltung von Oligonukleotiden Zur Bestimmung der katalytischen Aktivität wurden Kinetiken mit unterschiedlichen Oligonukleotiden durchgeführt. Eingesetzt wurde die kanonische EcoRI-DNA-Sequenz, modifizierte Oligonukleotide dieser Sequenz, sowie die kanonische Erkennungssequenz von BamHI (vergleiche Tabelle 2.6). Dabei wurden verschiedene Zeitwerte und Pufferbedingungen verwendet analog zu den Spaltkinetiken auf λ-DNA (siehe 2.4.2). Zunächst fand eine radioaktive Markierung der Oligonukleotide durch 5‘-Phosphorylierung mit 32P [γdATP] mit T4-Polynukleotidkinase statt (siehe 2.4.3.2). Anschließend erfolgte die Aufreinigung nach dem Nukleotide Removal Protokoll der Firma Qiagen. In einem 50µl Ansatz wurden alle Mutanten mit StrepTag II mit jeweils dem entsprechenden Oligonukleotid (siehe Tabelle) und Puffer versetzt. Nach verschiedenen Zeitwerten erfolgte die Abnahme von jeweils 10µl des Inkubationsansatzes und stoppen der Reaktion durch Zugabe von Stoppuffer. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach einem 30minütigen Vorlauf wurden 5µl der Proben auf das Gel aufgetragen werden. Die Trennung von Substrat und Produkt erfolgte durch Gelelektrophorese in einem denaturierenden 18%igen Polyacrylamidgel (6M Harnstoff). Die Auswertung der Kinetik fand mit dem Phosphoimager der Firma Fuji (BAS 1000 bioimager) statt. 52 Material und Methoden 2.4.5 Gelfiltration (HPLC) Die High performance liquid chromatography (HPLC) liefert Messungen, deren Signale vom Molekulargewicht des zu messenden Stoffes abhängig sind. Auf diese Weise kann bei einem Enzym eine Bestimmung seines Aggregationszustandes erfolgen. Die hohe Trennleistung bei HPLC beruht auf der Verwendung kleiner Partikel definierter Größe und hoher Rigidität. Die verwendeten HPLC-Säulen zeichnen sich durch eine hohe Kapazität aus und erlauben hohe Durchflußgeschwindigkeiten, welche nur bei hohem Druck erreicht werden können und abhängig von Säulenfüllmaterial und vom Laufmittel sind. Die HPLC-Messungen wurden nach der von Geiger et al. (1989) beschriebenen Methode durchgeführt. Als Stammpuffer wurde ein 800mM NaCl-Puffer verwendet, welcher Anteile monomeren Enzyms zurückdrängen soll. Standardsubstanzen waren BSA (MR=68kDa), Ovalbumin (MR=43kDa) und Lysozym (MR=14,4kDa). Die Messungen wurden mit den Präparationen der Mutanten mit StrepTag ausgeführt. 2.4.6 Circulardichroismus (CD) Die Circulardichroismus(CD)-Spektroskopie ist eine spezielle Art der Absorptionsspektroskopie im UV/VIS-Bereich des Spektrums, welche sich aus der Wechselwirkung polarisierten Lichts mit optisch aktiven Substanzen ergibt. Ein wichtiges Anwendungsgebiet der CD-Spektroskopie liegt in der Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen. Bekannt sind die Spektren der Haupttypen der Sekundärstrukturen der Proteine (α, β und Random coil). Diese unterscheiden sich deutlich voneinander. Die Spektren wurden mit einem Jobin-Yvon Dichrographen R.J.Mark III zwischen 190 bis 250nm aufgenommen. Die Auswertung erfolgte mit einem Programm von J. Greipel (CIRC 42) [Peters & Greipel, 1993], welches unter Berücksichtigung von Standardspektren den prozentualen Anteil an α-Helix und β-Faltblatt ermittelt [Chen et al., 1972]. Eine Messung der aufgereinigten Proteine erfolgte in 0,05cm starken Quarzküvetten. Anschließend wurden die Spektren mit einem Kurvenanpassungsprogramm ausgewertet. Ergebnisse 53 3 ERGEBNISSE 3.1 Darstellung der Mutanten 3.1.1 PCR-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140A/N141AHis6 und G140A/N141SHis6 Die Mutanten G140A/N141AHis6 und G140S/N141SHis6 wurden mit der in Kapitel 2.2.6.2 beschriebenen PCR-Mutagenese hergestellt. Neben der Aminosäuremutation wurde eine stille Mutation zur späteren Identifikation der positiven Klone eingeführt, indem die BglII-Spaltstelle entfernt wurde. Bis zur endgültigen Fertigstellung von Megaprimer und zweitem PCR-Produkt mußten, ausgehend von den Standardbedingungen (siehe Tabelle 2.2), verschiedene PCR-Bedingungen ausprobiert werden. Positive Ergebnisse wurden schließlich unter Verwendung des Expand High FidelitySystems (High Fidelity-Polymerase), einer Annealingtemperatur von 50°C sowie einer Anzahl von 50 Zyklen erzielt. In einem 50µl PCR-Ansatz wurden etwa 100ng Template (pRIF309+(CH6), linearisiert mit XmnI), 1µl Primer A (50µM), 1µl Mutageneseprimer (50µM) mit 10U High Fidelity-Polymerase versetzt und nach dem folgenden Programm (Tabelle 3.1) einer PCR unterzogen: Tab. 3.1: Modifiziertes PCR-Programm zur Erzeugung des Megaprimers Wiederholungen Denaturierung Annealing Extension 1x 91°C 91°C 50°C 72°C 60 sec 90 sec 60 sec 91°C 50°C 72°C 60 sec 90 sec 300 sec 300 sec 50x 1x Die Abbildung 3.1 zeigt das Resultat der ersten PCR zur Erzeugung des Mega- 54 Ergebnisse primers auf einem 10%igen Polyacrylamidgel. (1) (2) (3) (4) (5) 500Bp 443Bp PCR-Produkte zur Herstellung des Megaprimers (1) 100Bp, Gene Ruler (Fa. Qiagen) (2) Standard-PCR-Programm, G140A/N141AHis6 (3) modifiziertes-PCR-Programm, G140A/N141AHis6 (4) Standard-PCR-Programm, G140A/N141SHis6 (5) modifiziertes-PCR-Programm, G140A/N141SHis6 Abb. 3.1: PCR zur Darstellung des Megaprimers Als Vergleich wurde eine 100Bp Leiter (Firma Quiagen) aufgetragen. Die 500BpBande ist durch eine größere DNA-Menge hervorgehoben (Pfeil in der Abbildung 3.1). Mit einer Länge von 443Bp liegt das PCR-Produkt in der erwarteten Größe vor. Die Spuren 2 und 4 zeigen das PCR-Produkt mit dem Standard-PCR-Mutageneseprogramm (siehe Tabelle 2.2), das für diese Mutanten modifiziert wurde. Um den entstandenen Megaprimer vom Template abtrennen zu können, ist eine Aufreinigung mit dem Qiaquick-Gel-Extraction-Kit der Firma Qiagen erforderlich. Das zweite PCR-Produkt wird mit den Primern A und B erhalten, die das ecoRI-Gen umschließen. Somit ergibt sich eine Produktlänge des zweiten PCR-Produktes von 1165Bp. Die Herstellung des zweiten PCR-Produktes erfolgte ebenfalls in einem 50µl Ansatz, in welchem 0,5µl Template (pRIF309+, ohne Hexahistidintag), 1µl Primer A (50µM), 1µl Primer B (50µM) und 5µl Megaprimer mit 1µl High Fidelity-Polymerase (10U/µl) versetzt wurden. Zur Durchführung der PCR wurde das modifizierte Standardprogramm verwendet (Tabelle 3.1). Abbildung 3.2 zeigt die Produkte der PCR auf einem 10%igen Polyacrylamidgel. Ergebnisse 55 (1) (2) (3) (4) 1200Bp (5) 1165Bp PCR-Produkte zur Herstellung des mutierten ecoRI-Gens (1) 100Bp, Gene Ruler (Fa. Qiagen) (2) Standard-PCR-Programm, G140A/N141AHis6 (3) modifiziertes-PCR-Programm, G140A/N141AHis6 (4) Standard-PCR-Programm, G140A/N141SHis6 (5) modifiziertes-PCR-Programm, G140A/N141SHis6 Abb. 3.2: PCR-Produkte nach der zweiten PCR in der Mutagenese Bei der zweiten PCR-Reaktion wurde mit dem modifizierten PCR-Programm ebenfalls mehr Produkt gebildet. Trotz der Nebenprodukte wurde das PCR-Produkt für die weitere Mutagenese eingesetzt, da nur DNA-Stücke, welche die passenden Schnittstellen enthalten, in den Rahmen ligiert werden können. Der Rahmen wurde aus pRIF309+(CH6) mit den Enzymen SpeI und HindIII hergestellt. Nach Spaltung des PCR-Produktes mit entsprechenden Enzymen wurden jeweils 150ng PCR-Produkt und 90ng Rahmen ligiert (siehe 2.2.3). Die Transformation des Ligationsansatzes erfolgte in den Stamm LK111(λ) (siehe 2.1.4). Nach Vereinzelung auf Selektivmedien wurden die screening-positiven Klone (keine Spaltung mit BglII) zur Bestätigung des Mutageneseerfolges sequenziert (siehe 2.2.7). Um Sekundärmutationen ausschließen zu können, wurde nicht nur die mutierte Region, sondern das gesamte Gen sequenziert und verifiziert. Die Plasmide, welche die erwünschte Veränderung des ecoRI-Gens trugen, wurden in den Expressionstamm TGE900(pEcoR4) überführt (siehe 2.1.4). 3.1.2 Gapped duplex-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 Die Herstellung der Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 erfolgte mittels der unter 2.2.6.1 beschriebenen Gapped duplex-Mutagenese nachdem 56 Ergebnisse der gewünschte Mutageneseerfolg mit Hilfe der PCR-Mutagenese nicht erzielt werden konnte. Zur Einführung der Mutation wurde jeweils ein 42Bp langer Primer synthetisiert, welcher einerseits die Mutationen an den gewünschten Codons und andererseits eine stille Mutation zur Zerstörung der Spaltstelle von BglII trägt, um eine Selektion positiv mutierter Klone zu erreichen. Als Matrize dient das einzelsträngige Plasmid pRIF309+(CH6). Darauf wurden das Oligonukleotid und der Rahmen hybridisiert. Mit den entstandenen mismatch-Plasmiden wurden Zellen des reparaturdefizienten Stammes WK6mutS(λ) transformiert. Der Transformationsansatz wurde zur Hälfte auf einer LBAmp-Platte ausplattiert, um die Klonausbeute abzuschätzen. Die andere Hälfte wurde in eine 100ml-LBAmp-Flüssigkultur überführt. Aus den Zellen der Flüssigkulturen erfolgte die Isolierung der Plasmid-DNA (siehe 2.2.1) mit anschließender Restriktionsspaltung mit dem Screeningenzym BglII (siehe 2.2.2). Mit der daraus hervorgehenden ungespaltenen Plasmid-DNA wurde der Stamm LK111(λ) transformiert. Nach Vereinzelung der Klone und Isolierung der PlasmidDNA wurden die Klone erneut auf die Spaltung durch BglII getestet. Abbildung 3.3 zeigt exemplarisch die Spaltungen für die Mutante G140S/R145KHis6 auf einem 1%ige Agarosegel. Positive Klone erscheinen ungespalten, da die BglII-Spaltstelle mutiert wurde. (1) (2) (4) (6) (8) (10) Restriktionsspaltung mit BglII für unterschiedliche Klone der Mutante G140S/R145KHis6 (1) Standard: pRIF309+, nativ (2, 3) Klon 1, nativ; Spaltung BglII (4, 5) Klon 2, nativ; Spaltung BglII (6, 7) Klon 3, nativ; Spaltung BglII (8, 9) Klon 4, nativ; Spaltung BglII (10, 11) Klon 5, nativ; Spaltung BglII Abb. 3.3: Screening mit BglII von Klonen aus LK111(λ) der Mutante G140S/R145KHis6 Von jeder Mutante wurde eine 100ml LBAmp-Kultur angeimpft, um dann die PlasmidDNA zu isolieren. Es folgte die Sequenzierung mit der Kettenabbruchmethode nach Sanger (siehe 2.2.7), wodurch die Mutationen und die Basensequenz des Gens veri- Ergebnisse 57 fiziert werden konnte. Mit den modifizierten Plasmiden wurde der Expressionsstamm TGE900(pEcoR4) transformiert (siehe 2.1.4). 3.1.3 Klonierung des StrepTag II Da sich die Aufreinigung der Mutanten mit dem Hexahistidintag als unerwartet schwierig herausstellte, wurde er durch einen C-terminalen StrepTag II ersetzt. Dieser wurde in dem Plasmid pRSN [Vennekohl, 1999] im direkten Anschluß an das ecoRI-Gen kloniert. Dieser Tag beinhaltet acht Aminosäuren und ist daher um 6Bp länger als der Hexahistidintag. Durch Spaltung mit den Enzymen SpeI und HindIII wurde jeweils ein 620Bp großes Fragment (Insert) aus den Plasmiden herausgeschnitten, welches die entsprechende Mutation trägt. In einer analogen Spaltung wurde aus dem Plasmid pRSN ein Rahmen erzeugt und aufgereinigt. Zur Ligation (siehe 2.2.3) wurden äquimolare Verhältnisse eingesetzt und damit anschließend LK111(λ) transformiert (siehe 2.1.4). Die erhaltenen Klone wurden auf ihre Größe untersucht. Alle Plasmide richtiger Größe (5074Bp) enthielten das Insert und erschienen daher bei der Spaltung durch BglII ungespalten. Auf eine weitere Sequenzierung wurde verzichtet. Mit jeweils einem positiven Klon wurden Zellen des Expressionsstammes TGE900(pEcoR4) transformiert (siehe 2.1.4). 3.2 Aufreinigung der Mutanten 3.2.1 Aufreinigung der Mutanten mit Hexahistidintag Um die Proteinexpression zu überprüfen, wurde mit allen vier Mutanten ein Expressionstest (siehe 2.3.2) durchgeführt, welcher jedoch zu keinem eindeutigen Ergebnis führte. Alle dargestellten Mutanten enthalten den Hexahistidintag am C-Terminus. So ist eine Bindung an Nickelionen möglich, was bei der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie ausgenutzt wird [Rotzal, 1992]. 58 Ergebnisse In einem Induktionstest in 3ml Kulturen aus transformierten TGE900(pEcoR4)-Zellen (siehe 2.3.2) konnte keine eindeutige Expression der Mutanten festgestellt werden. Aus diesem Grund wurden induzierte Zellen (3ml) sedimentiert und mit Ultraschall aufgeschlossen. Nach erneutem Sedimentieren der Zelltrümmer wurde der Überstand mit equilibrierter Ni2+-NTA-Agarose versetzt, um durch eine Bindung an das Affinitätsmaterial das Zielprotein nachzuweisen (siehe 2.3.5.1). Das Säulenmaterial wurde auf einem 17,5%igen Laemmli-Gel analysiert. Abbildung 3.4 zeigt exemplarisch die Ergebnisse mit den Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Bindung der Proteine G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 aus einem Expressionstest (3ml) an Ni-NTA-Agarose (1) G140S/R145KHis6, Klon 1 (2) G140S/R145KHis6, Klon 2 (3) G140S/R145KHis6, Klon 3 (4) G140S/N141S/R145KHis6, Klon 1 (5) G140S/N141S/R145KHis6, Klon 2 (6) Standard: wtEcoRIHis6, BSA (7) G140S/N141S/R145KHis6, Klon 3 EcoRI Abb. 3.4: Expressionstest mit den Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 Obwohl durch den Expressionstest keine eindeutige Aussage über die Produktion der Mutanten erzielt werden konnte, ist nach der Abreicherung anderer E.coli-Proteine durch die Bindung der Mutanten an das Affinitätsmaterial eine eindeutige Bande im Bereich des Standards (wtEcoRI, Spur 6) zu erkennen. Dabei zeigten alle Klone eine vergleichbare Expression. Für die Fermentation (siehe 2.3.3) wurden der erste Klon der Mutante G140S/R145KHis6 sowie der dritte Klon der Mutante G140S/N141S/R145KHis6 ausgewählt. Bei den Mutanten G140A/N141AHis6 und G140A/N141SHis6 wurde für die Reindarstellung jeweils der dritte Klon herangezogen. Die Aufreinigung der Mutanten erfolgte mit Hilfe der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie. Sie wurde nach dem Protokoll ausgeführt, das seit Jahren im Labor etabliert Ergebnisse 59 ist (siehe 2.3.5.1). Allerdings konnte keine angemessene Aufreinigung erzielt werden. Abbildung 3.5 zeigt exemplarisch den Verlauf einer Affinitätschromatographie mit der Mutante G140A/N141AHis6. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) Elutionsprofil (Ni-NTA-Agarose) der Mutante G140A/N141AHis6 (1) Standard: wtEcoRI (2-9) Fraktionen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 und 16 (jeweils 100µl) (10) Durchlauf Abb. 3.5: Verlauf G140A/N141AHis6 der Affinitätschromatographie mit 2+ Ni -NTA-Agarose für die Mutante Es findet eine Bindung des Zielproteines an das Affinitätsmaterial statt, da im Durchlauf keine prominenten Bande mehr im Bereich der EcoRI zu sehen ist. Allerdings zeigt das Elutionsprofil, daß eine Vielzahl von Proteinen zusammen mit der Mutante eluiert werden. Die Fraktionen mit der geringsten Verunreinigung wurden vereinigt und der Ionenaustauschchromatographie zugeführt (siehe 2.3.5.3). Die Ionenaustauschchromatographie nutzt aus, daß EcoRI als DNA-bindendes Protein an die negativ geladene Phosphozellulose bindet. Dadurch werden normalerweise weitere Verunreinigungen abgetrennt. Die Proteine, die nach der Affinitätschromatographie als Verunreinigungen auftraten, konnten aber auch mit der Ionenaustauschchromatographie nicht abgetrennt werden. Die Elution der Mutanten erfolgte in Vergesellschaftung anderer Proteine, so daß keine weitere Aufreinigung des Zielproteines erfolgte. Um die Aufreinigung zu verbessern, wurde eine Umkehrung der Reihenfolge der Säulen vorgenommen, sowie eine Gradientenelution für die Ionenaustauschsäule versucht. Leider konnte keine verbesserte Aufreinigung erzielt werden. Konnten nach einer Ionenaustauschchromatographie Fraktionen gewonnen werden, in denen EcoRI den größten Anteil ausmachte, wurden diese vereinigt und in die 60 Ergebnisse Dialyse eingesetzt (siehe Tabelle 3.2, Kapitelende). Die Elution von Proteinen in so enger Vergesellschaftung mit dem Zielprotein legt die Vermutung nahe, daß es sich dabei um Chaperone handelt, die an strukturell beeinträchtigte Mutanten gebunden haben. Daher wurde eine Affinitätschromatographie in Anwesenheit von 100µM rATP versucht. Durch Zusatz des rATPs sollten die Chaperone befähigt werden, ihren Faltungszyklus zu beenden und das Protein zu entlassen. Leider konnte durch den Zusatz des rATP keine Verbesserung der Aufreinigung erzielt werden. In einem vergleichenden Laemmligel konnte zusätzlich gezeigt werden, daß es sich bei den Verunreinigungen in den Mutanten zumindest nicht um die gängigen Chaperone handelt (siehe Abbildung 3.6). (1) 78kDa 66kDa 42kDa 30kDa (2) (3) (4) (5) Vergleich der Molekulargewichte der gängigen Chaperone mit wtEcoRI (1) Merck IV Protein-Standard (2) wtEcoRI (3) GroES (4) GroEL (5) DnaK 17kDa 12,3kDa Abb. 3.6 : Vergleich der Molekulargewichte gängiger Chaperone mit EcoRI Der Vergleich zeigt deutlich, daß die Verunreinigungen, die nahe der EcoRI laufen (vergleiche Abbildung 3.5) nicht zu den hier getesteten Chaperonen gehören. Es ist jedoch möglich, daß es sich um andere Helferproteine handelt. Die Ergebnisse der Aufreinigungen sprechen für eine Destabilisierung der Mutanten durch die eingeführten Aminosäuren. Auch die insgesamt geringe Menge an EcoRI, die aus den Zellen (jeweils 10l Zellen, OD600nm=3-4) gewonnen werden konnte spricht für eine strukturelle Instabilität. Bei anderen Mutanten (zum Beispiel K130E Ergebnisse 61 [Windolph et al., 1997] konnte durch Zusatz von Kalzium eine Stabilisierung der Mutanten bei der DNA-Bindung festgestellt werden. Daher wurde die Aufreinigung der Mutanten G140A/N141AHis6 und G140A/N141SHis6 in Anwesenheit von Kalziumionen (1mM CaCl2) versucht. Die Affinitätschromatographie wurde in gleicher Weise wie zuvor ausgeführt. Abbildung 3.7 zeigt exemplarisch das Elutionsprofil einer Ni2+-NTAAgarosesäule in Anwesenheit von Ca2+-Ionen der Mutante G140A/N141AHis6. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) Elutionsprofil (Ni-NTA-Agarose in Gegenwart von Ca-Ionen) der Mutante G140A/N141AHis6,Ca (1) Standard: wtEcoRI (2-9) Fraktionen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 und 16 (jeweils 100µl) (10) Durchlauf der Säule (5µl) (11) Waschfraktion (100µl) 2+ Abb. 3.7: Elutionsprofil (Ni -NTA-Agarose) der Mutante G140A/N141AHis6,Ca in Anwesenheit von 1mM CaCl2 Dabei konnte mit dem Zusatz von Ca2+-Ionen eine höhere Ausbeute an Protein erzielt werden, wobei auch hier eine starke Vergesellschaftung mit anderen Proteinen zu erkennen ist (Spuren 3 bis 5). Eine Reduktion der Verunreinigungen konnte mit der nachfolgenden Phophocellulosesäule erreicht werden (siehe Abbildung 3.8), die ebenfalls in Anwesenheit von Ca2+-Ionen ausgeführt wurde. Gegenüber der Aufreinigung unter Standardbedingungen ist eine deutliche Verbesserung der Proteinreinheit zu verzeichnen. Diese Proteine werden im folgenden mit dem Index „His6,Ca“ gekennzeichnet. Nach der Dialyse jedoch, die ebenfalls 1mM CaCl2 im Puffer aufwies, erschien das Dialysat trübe, so daß von einer Aggregation der Mutanten ausgegangen werden mußte. Daher wurde auf eine Präparation der Mutanten G140S/R145KHis6,Ca und G140S/N141S/R145KHis6,Ca verzichtet. 62 Ergebnisse (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) Elutionsprofil (Phosphozellulose in Gegenwart von Ca-Ionen) der Mutante G140A/N141AHis6,Ca (1) Standard: wtEcoRI (2-8) Elutionspuffer mit steigender NaClKonzentration (0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,5M; 2M; jeweils 100µl) Abb. 3.8: Elutionsprofil (Phosphozellulose) der Mutante G140A/N141AHis6,Ca unter Zusatz von 1mM CaCl2 Die Konzentrationsbestimmung aller Dialysate erfolgte im UV-Spektrum (siehe 2.4.1), allerdings ergaben sich hier Probleme, da die gemessene Absorption aus allen Proteinen (EcoRI und Verunreinigungen) resultiert. Daher erfolgte eine Bestimmung mittels Laemmligel (siehe 2.3.1), auf das eine Konzentrationsreihe des wtEcoRIHis6 (4,4µM) aufgetragen wurde. Tabelle 3.2 gibt die ermittelten Konzentrationen wider. Tab. 3.2: Konzentrationen der Mutanten mit Hexahistidintag Mutante Proteinkonzentration Reinheit G140A/N141AHis6 1µM 30% G140A/N141SHis6 1µM 40% G145S/R145KHis6 2,8µM 50% G140S/N141S/R145KHis6 1µM 55% G140A/N141AHis6,Ca ausgefallen 65% G140A/N141SHis6,Ca ausgefallen 65% Ergebnisse 63 3.2.2 Aufreinigung der Mutanten mit StrepTag II Die Anwesenheit von Kalziumionen hat die Aufreinigung der Mutanten mit Hexahistidintag entscheidend verbessert. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß EcoRI mit Hexahistidintag eine erhöhte Aggregationsneigung aufweist [Küster, 1998; Vennekohl, 1999], die unter Verwendung des StrepTag II-Systemes minimiert werden konnte. Nach der Umklonierung der mutierten ecoRI-Gene in den StrepTag II wurde eine Aufreinigung mit diesem System unter 1mM Ca2+-Ionen durchgeführt (siehe 2.3.5.2). Diese Proteine erhalten den Index „StrepII“. Abbildung 3.9 zeigt exemplarisch die Aufreinigung der Mutante G140A/N141AStrepII. (1) (2) (3) (4) (5) Elutionsprofil (StrepTactin in Gegenwart von Ca-Ionen) der Mutante G140A/N141AStrepII (1) Durchlauf (2) Waschfraktion (3) Waschfraktion (0,1mM DTB) (4) Elution (5mM DTB) (5) Standard: wtEcoRI Abb. 3.9: Aufreinigung der Mutante G140A/N141AStrepII mit dem Affinitätsmaterial StrepTactin Der Durchlauf erscheint frei vom Zielprotein EcoRI. Im ersten Waschschritt können schon wesentliche Verunreinigungen entfernt werden, da der Desthiobiotin-haltige zweite Waschschritt schon kein Protein mehr eluiert. Das Eluat der Mutante zeichnet sich durch eine gute Reinheit aus, obwohl einige Proteine nicht abgereinigt werden können. Als Verunreinigung tritt meistens ein Biotincarboxyl-Carrierprotein aus E.coli auf, das ebenfalls an die StrepTactin-Matrix bindet. Eine Bestimmung der Konzentration durch UV-Spektroskopie war bei diesen Mutanten ebenfalls nicht möglich, da das Eluat eine starke Absorption bei 260nm aufwies. Dies weist auf eine Verunreinigung durch nukleotidisches Material hin, nicht unge- 64 Ergebnisse wöhnlich für ein DNA-bindendes Protein. Daher wurde in einem erneuten Ansatz eine DE59-Säule vorgeschaltet. Dieses Material bindet negativ geladene Proteine. Unter geeigneten Pufferbedingungen (PDL, 0,1M NaCl) passiert EcoRI das Säulenmaterial, während DNA gebunden bleibt. Allerdings zeigte sich auch hier im Eluat des StrepTactins eine Absorption von 260nm. Es muß daher davon ausgegangen werden, daß es sich nicht um DNA handelt. Die Konzentrationsbestimmung der Proteine erfolgte also auch in diesem Fall durch eine vergleichende Konzentrationsreihe auf dem Laemmligel (siehe 2.3.1). Abbildung 3.10 zeigt dieses Vorgehen exemplarisch für die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII aus den ersten Präparationen. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) Vergleichende Konzentrationsreihe mit wtEcoRIHis6 für die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII (1-8) Konzentrationsreihe wt EcoRIHis6 (0,377µM) mit absteigenden Volumina (10µl; 3µl; 2,5µl; 1,5µl; 1µl; 0,5µl; 0,25µl) (9) G140A/N141AStrepII (10) G140A/N141SStrepII Abb. 3.10: Vergleichende Konzentrationsreihe mit wtEcoRIHis6 für die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII Die Bandenstärke der Konzentrationsreihe mit wtEcoRIHis6 und der Proben wurde mithilfe des Geldokumentationssystemes E.A.S.Y der Firma Herolab ausgewertet. Durch lineare Regression ergab sich eine Geradengleichung, mit der die Konzentration der Mutanten bestimmt werden konnte (vergleiche Tabelle 3.2). Insgesamt ergibt jedoch auch die Aufreinigung mit dem StrepTag II eine nur geringe Proteinausbeute. Daher wurden die Aufarbeitungen mehrfach ausgeführt. Sie sind in Tabelle 3.3 zusammengestellt. Ergebnisse 65 Tab. 3.3: Konzentrationen der Mutanten mit StrepTag II Mutante Proteinkonzentration Reinheit G140A/N141AStrepII 1µM (zweifach präpariert) >90% G140A/N141SStrepII 1µM (zweifach präpariert) >90% G140S/R145KStrepII 0,270µM; 1,5µM >90% G140S/N141S/R145KStrepII 0,213µM; 2µM >90% 3.3 Charakterisierung der Mutanten mit Hexahistidintag 3.3.1 DNA-Bindung der Mutanten mit Hexahistidintag Die Ermittlung der DNA-Bindung wurde nach dem Standardprotokoll für EcoRIMutanten (siehe 2.4.3) ausgeführt. Als Substrat dient ein 174Bp großes PCRProdukt, das mittig eine EcoRI-Spaltstelle trägt. Durch die Bindung des Proteins ergibt sich ein langsamerer Lauf des Fragmentes im nativen Polyacylamidgel (Shift). Bei konstanter DNA-Konzentration (1nM) wurde eine jeweils unterschiedliche Menge Protein zugegeben. Sie variiert vom 50fachen Überschuß (50nM Protein) bis zum 10fachen Unterschuß (0,1nM Protein). Abbildung 3.11 zeigt den Gelshift für die Mutanten mit Hexahistidintag. Unter diesen Bedingungen zeigte sich ausschließlich bei der Mutante G140S/R145KHis6 eine eindeutige Bindung. Hier ist allerdings eine Berechnung der spezifischen Bindungskonstante nicht sinnvoll, da es sich um eine unspezifische Bindung handelt (Leiterbildung wie bei wtEcoRI). 66 Ergebnisse (1) (4) (7) (10) (13)(14) 3. Shift 2. Shift 1. Shift ungebunden Gelshift mit dem 174Bp-Fragment für die Mutanten mit Hexahistidintag (1-3) G140A/N141AHis6 (4-6) G140A/N141SHis6 (7-9) G140S/R145KHis6 (10-12) G140S/N141S/R145KHis6 (13) 174Bp-Fragment, nativ (14, 15) wtEcoRI Verhältnis Mutante zu DNA jeweils 50:1, 10:1 und 2:1, für wtEcoRI 20:1 und 10:1 Abb. 3.11: Gelshift mit dem 174Bp-Fragment für die Mutanten mit Hexahistidintag Durch die Detektion des DNA-Fragments mit dem empfindlichen PhosphoImagerSystem können Shifts ab 10% Bindung detektiert werden. Dies entpricht einer Bindungsstärke von 2x106M-1 (bei 50fachem Überschuß), so daß die Bindung der Mutanten als kleiner eingestuft werden muß. Eine unspezifische Bindung an das DNA-Fragment ist mit 105M-1 nicht meßbar. 3.3.2 Kinetische Charakterisierung der Mutanten mit Hexahistidintag Die kinetische Charakterisierung dient der Untersuchung biochemischer Eigenschaften der Mutanten hinsichtlich ihrer Sequenzspezifität sowie ihrer katalytischen Aktivität im Vergleich zur wtEcoRI unter verschiedenen Bedingungen. Mit den in dieser Arbeit angefertigten Mutanten wurden kinetische Untersuchungen mit unterschiedlichen Substraten unter verschiedenen Pufferbedingungen und Zeitwerten durchgeführt. 3.3.2.1 Spaltverhalten auf λ-DNA Das Spaltverhalten aller vier Mutanten wurde bei 37°C in einem Zeitraum von 1min bis 18h (über Nacht) unter Standardbedingungen getestet. Als Substrat diente λ-DNA (48502Bp). Die Spaltung erfolgte unter Standardbedingungen sowie den Starbedin- Ergebnisse 67 gungen pH8,8 (Niedrigsalz) und Mangan. Zusätzlich erfolgten Spaltungen mit pH8,8 unter Normalsalzbedingungen. Die Vorgehensweise ist unter 2.4.2 beschrieben. Die Kinetiken zeigten durchgehend einen unspezifischen Abbau von DNA. Die Abbildung 3.12 zeigt exemplarisch eine λ-DNA Kinetik der Mutante G140S/R145KHis6 unter Standardbedingungen. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Spaltung von λ-DNA durch die Mutante G140S/R145KHis6 (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140S/R145KHis6 Zeitwerte: 2,5min, 7min,15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min Abb. 3.12: λ-Kinetik mit der Mutante G140S/R145KHis6 unter Standardbedingungen Der unspezifische Abbau der DNA kann durch eine Nuklease erfolgen, die aus den Zellen mit aufgereinigt wurde. Aber eine sequenzunabhängige Nukleaseaktivität, die zu unspezifischem DNA-Abbau führt, ist für Mutanten, die monomer vorliegen auch möglich [Vennekohl, 1996] und kann in diesem Fall nicht ausgeschlossen werden. Durch die geringen Konzentrationen der Mutanten mußte eine große Menge der Präparation eingesetzt werden, so daß auch eventuell vorhandene Verunreinigungen in erhöhter Konzentration eingeschleppt wurden. Der unspezifische Abbau der DNA stellt ein weiteres Problem dar, eine eventuell auftretende spezifische Restriktionsaktivität der Mutanten zu detektieren. So ist es unter Umständen nicht möglich, Reaktionsbedingungen zu finden, welche die Detektion spezifischer Spaltung erlauben. Um einen qualitativen Vergleich zwischen den Mutanten möglich zu machen wurde jeweils der Zeitwert bestimmt, für den eine diskrete Bande für die zu spaltende λDNA nicht mehr erkennbar war (zum Beispiel 15min in Abbildung 3.12). Tabelle 3.4 stellt die ermittelten Werte gegenüber. 68 Ergebnisse Tab. 3.4: Bestimmung des Zeitwertes, für den durch unspezifische Nukleaseaktivität keine diskrete λDNA Bande mehr detektiert werden konnte. Verwendet wurde λ-DNA und Mutanten mit Hexahistidintag. G140A/ N141AHis6 G140A/ N141SHis6 G140S/ R145KHis6 G140S/N141S/ R145KHis6 Standardbedingungen >2h >2h 15min 1,5h Manganbedingungen 18h 5h 30min 3h pH 8,8 (Niedrigsalz) >4h >7h 2h 3h pH 8,8 (Normalsalz) 2h 18h 30min 18h Eingesetzt wurden die maximal möglichen Enzymmengen, die durch die Salzkonzentration im Test bestimmt werden, da der Dialysepuffer zur Stabilisierung 300mM NaCl enthält. Die Salzkonzentration bei den Standardbedingungen sowie für Mangan und pH8,8 (Normalsalz) beträgt 50mM, für pH8,8 (Niedrigsalz) 5mM. Daher ergeben sich folgende maximale Enzymkonzentrationen (Tabelle 3.5): Tab. 3.5: Maximale Enzymkonzentrationen bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen für die Mutanten mit Hexahistidintag 50mM NaCl 5mM NaCl G140A/N141AHis6 167nM 16,7nM G140A/N141SHis6 167nM 16,7nM G140S/R145KHis6 467nM 46,7nM G140S/N141S/R145KHis6 167nM 16,7nM Die Degradation der DNA ist sowohl von der eingesetzten Mutante als auch von den Bedingungen des Spaltansatzes abhängig. Die Nukleaseaktivität der Mutante G140S/R145KHis6 erscheint ausgeprägter als bei den anderen Mutanten. Bei den Mutanten läßt sich keine Korrelation zwischen Pufferbedingungen und Stärke der Ergebnisse 69 Nukleaseaktivität feststellen. Nach der erneuten Präparation der Mutanten unter Ca-Zusatz wurden keine λ-Kinetiken ausgeführt, da eine Konzentrationsbestimmung nicht möglich war. Außerdem kann es durch die Aggregation der Mutanten zu einer Einbuße ihrer Funktionsfähigkeit gekommen sein. 3.3.2.2 Spaltkinetiken mit λ(dam-, dcm-)-DNA Die aus E.coli-Bakterien gewonnene, zuvor eingesetzte λ-DNA ist methyliert durch die dam- und die dcm-Methylase. Die dam-Methylase methyliert die N6-Position des Adenins in GATC, die dcm-Methylase die C5-Position im inneren Cytosin von CCWGG (mit W=A oder T). Die dam-Methylierung blockiert dabei die Restriktionsspaltstelle von BamHI. Die Mutationen in der EcoRI sind geeignet, einen Austausch in der Erkennungssequenz am äußeren A/T-Basenpaar zu erlauben. Die Zielsequenz ist dabei GGATCC, die Restriktionsspaltstelle, die von BamHI gespalten wird. Daher ist es möglich, daß die Mutanten eine veränderte Spezifität aufweisen und eine Spaltung der neuen Zielsequenz (GGATCC) wie bei BamHI durch die Methylierung verhindert wird. Aus diesem Grund wurden die Spaltungen mit unmethylierter λ-DNA ausgeführt (λ(dam-, dcm-)-DNA). Dabei wurden die gleichen Reaktionsbedingungen verwendet wie zuvor. Abbildung 3.13 zeigt exemplarisch die Kinetiken bei pH8,8 unter Normalsalzbedingungen. Bei allen vier Mutanten ist das Fortschreiten der unspezifischen Degradation über den Verlauf der Kinetik gut zu erkennen. Die Mutante G140A/N141AHis6 erscheint hier mit der höchsten Nukleaseaktivität. 70 Ergebnisse (1) (2) (6) Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140A/N141AHis6 und G140A/N141SHis6 (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140A/N141AHis6 (6-10) Zeitwerte G140A/N141SHis6 Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140S/R145KHis6 und G140S/N141S/R145KHis6 (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140S/R145KHis6 (6-10) Zeitwerte G140S/N141S/R145KHis6 Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h - - Abb. 3.13: Spaltung unmethylierter λ-DNA (dam , dcm ) bei pH8,8 unter Normalsalzbedingungen für alle Mutanten mit Hexahistidintag Tabelle 3.6 stellt die Nukleaseaktivitäten gegenüber, die analog zur Tabelle 3.4 ermittelt wurden. Eingesetzt wurden die Enzymkonzentrationen aus Tabelle 3.5. Tab. 3.6: Bestimmung des Zeitwertes, für den durch unspezifische Nukleaseaktivität keine diskrete λDNA-Bande mehr detektiert werden konnte. Verwendet wurden λ(dam , dcm )-DNA und Mutanten mit Hexahistidintag. G140A/ N141AHis6 G140A/ N141SHis6 G140S/ R145KHis6 G140S/N141S/ R145KHis6 Standardbedingungen 2h 18h 1h 1,5h Manganbedingungen >6h >18h >90min 1,5h pH8,8 (Niedrigsalz) 6h 6h 6h 18h pH8,8 (Normalsalz) 2h 18h 3h 6h Ergebnisse 71 Im Vergleich zur korrespondierenden Tabelle 3.4 ergibt sich keine Änderung im Spaltverhalten der Mutanten. Daher ist auszuschließen, daß es sich um eine BamHISpaltaktivität handelt, die durch die Methylierung blockiert wurde. Unspezifische Nukleaseaktivität der Mutanten sollte unabhängig von der Methylierung sein. 3.4 Charakterisierung der Mutanten mit StrepTag II Durch die erfolgreiche Reindarstellung der Mutanten konnten zusätzliche biophysikalische Untersuchungen (Gelfiltration (siehe 2.4.5), CD-Spektroskopie (siehe 2.4.6)) ausgeführt werden, die mit den Hexahistidinmutanten aufgrund ihrer geringen Reinheit nicht möglich waren. Allerdings mußten durch die geringe Proteinkonzentration mehrere Aufarbeitungen durchgeführt werden. 3.4.1 Gelfiltration Nach der Klonierung des Hexahistidintags an das ecoRI-Gen wurde festgestellt, daß der Affinitätstag eine Trennung durch die Gelfiltration nicht länger möglich macht [Vennekohl, 1996]. Es erscheint wahrscheinlich, daß die Histidine dabei eine Interaktion mit dem Gelmaterial eingehen, die eine Trennung verhindert. Das Protein EcoRI selbst interagiert auch mit dem Säulenmaterial (Sepharose), so daß monomere und dimere Anteile des Proteins retardiert bei ungefähr dem halben tatsächlichen Molekulargewicht erscheinen. Die Gelfiltration wurde deshalb mit den Mutanten des StrepTag II-Systems ausgeführt. Als Vergleich dienten wtEcoRIStrepII und L158DStrepII. Letzteres Vergleichsprotein liegt nahezu zu 100% als monomeres Protein vor. Abbildung 3.14 stellt die Gelfiltrationen gegenüber. Ergebnisse M on Di om m er er M on Di om m er er 72 G140A/N141A G140A/N141S G140S/R145K G140S/N141S/ R145K wtEcoRI L158D 60 40 20 60 40 20 min Abb. 3.14: Vergleich der Gelfiltrationsläufe der Mutanten mit StrepTag II mit wtEcoRIStrepII und L158DStrepII Die Gelläufe von G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII gleichen dem Spektrum von wtEcoRIStrepII. Sie enthalten etwa 95% dimeres Protein. Dagegen weisen die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII einen im Vergleich zum wt-Enzym erhöhten monomeren Proteinanteil auf (beide Mutanten etwa 75% mono- Ergebnisse 73 mer). Der Puffer des Gelfiltrationslaufs enthält Magnesiumchlorid, so daß eine Denaturierung der Proteine aufgrund eines fehlenden zweiwertigen Kations, das zuvor zur Stabilisierung benötigt wurde, nicht wahrscheinlich ist. Es muß jedoch berücksichtigt werden, daß vor dem Einspritzen in die Gelfiltrationssäule eine Verdünnung stattgefunden hat, um den Glyzerinanteil herabzusetzen. Durch die Verdünnung wird die Dissoziation des Proteins begünstigt [Vennekohl, 1996]. Es ist daher anzunehmen, daß die Proteine G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII in ihrer Dimerisierungsfläche durch die Mutationen destabilisiert sind. Die Messungen wurden bei 230nm vorgenommen. Diese erhöhte Empfindlichkeit war nötig, da die Proteinlösungen nur eine geringe Konzentration an EcoRI aufwiesen. Dadurch erscheinen in den Spektren mehr Nebenbanden, welche jedoch aufgrund des geringen Materials hingenommen werden mußten. Diese Verunreinigungen sind auf einem Laemmligel nicht so prominent zu sehen, da die Auflösung eines solchen Gels im Bereich von unterhalb 14kDa nicht gut genug ist. 3.4.2 Circulardichroismus Eine Messung der Mutanten war erst durch die größere Reinheit der StrepTag IIPräparation sinnvoll, da auch Verunreinigungen in den Präparationen zum Spektrum beitragen. Abbildung 3.15 stellt die Spektren gegenüber. Die Spektren der Mutanten stimmen bei G140A/N141SStrepII, G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII gut überein. Die Konzentration der Mutante G140A/N141AStrepII ist zu gering, um ein rauschfreies Spektrum zu erzeugen. Es widerspricht jedoch nicht dem Spektrum des wt-Proteins. Im Vergleich zur Gelfiltration erscheinen die Proteine G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII in ihrer Struktur nicht beeinträchtigt, da sie unverdünnt in der glyzerinhaltigen Lösung gemessen werden konnten. 74 Ergebnisse Θ [Grad 1/Mm] 0 -4000 -8000 -12000 wtEcoRI 200 220 G140A/N141A 240 200 220 G140A/N141S 240 200 220 240 G140S/R145K 200 220 240 G140S/N141S/R145K 200 220 240 nm Abb. 3.15: Gegenüberstellung der CD-Spektren der Mutanten mit StrepTag II zu wtEcoRIHis6 3.4.3 Bestimmung der DNA-Bindung der Mutanten mit StrepTag II 3.4.3.1 DNA-Bindung an das 174Bp-Fragment Analog zu den Bindungsexperimenten mit dem Hexahistidinmutanten wurde die Bestimmung der DNA-Bindung mit den Mutanten mit StrepTag II ausgeführt. Die Mutanten wurden dabei in einem Überschuß von 50:1, 20:1 und 10:1 zum 174BpDNA-Fragment eingesetzt. Abbildung 3.16 zeigt die Gelshifts für die Mutanten. Die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII zeigen unter den Bedingungen keinen Shift. Die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII zeigen eine eindeutige DNA-Bindung, die sich jedoch nicht in einer diskreten Bande äußert, sondern eine Verschmierung des 174BpFragmentes bewirkt. Es ist eine Steigerung in der Retardierung der DNA zu erkennen, welche mit steigender Proteinkonzentration auftritt. Dies spricht für eine unspezifische Bindung der Enzyme, die allerdings nicht stark genug ist, um die DNA über die Dauer des Gellaufes (etwa 2,5h) festzuhalten. Ergebnisse (1) 75 (4) (7) (10) (13)(14) Gelshift mit dem 174Bp-Fragment für die Mutanten mit StrepTag II (1-3) G140A/N141AStrepII (4-6) G140A/N141SStrepII (7-9) G140S/R145KStrepII (10-12) G140S/N141S/R145KStrepII (13) 174Bp-Fragment, nativ (14, 15) wtEcoRI 1. Shift ungebunden Verhältnis Mutante zu DNA jeweils 50:1, 20:1 und 10:1, für wtEcoRI 10:1 und 2:1 Abb. 3.16: Gelshift mit 174Bp-Fragment für die Mutanten mit StrepTag II 3.4.3.2 DNA-Bindung an modifizierte Oligonukleotide Die Aminosäurenaustausche in den Mutanten zielen auf eine veränderte Erkennung einer DNA-Sequenz, die von der kanonischen Sequenz GAATTC abweicht. Zu diesem Zweck wurden modifizierte Oligonukleotide hergestellt, welche jene veränderten Kontaktverhältnisse berücksichtigen. Es wurden am äußeren A/T-Basenpaar ein Austausch des A zum I vorgenommen, vom T zum U und beides. Diese Sequenzen leiten hin zur BamHI-Erkennungssequenz, die an dieser Stelle ein G/C-Basenpaar trägt. Eine genauere Beschreibung der Kontakte befindet sich in der Diskussion. Tabelle 3.7 stellt hier die Sequenzen der Oligonukleotide vor. Dabei ist die EcoRI-Erkennungssequenz fett gedruckt, Modifikationen zu dieser Sequenz sind unterstrichen. Die Oligonukleotide sind selbstkomplementär, so daß sie ohne zusätzliches Annealing für Bindung (siehe unten) oder Spaltung (siehe 3.4.4.2) eingesetzt werden können, da sie doppelsträngig vorliegen. 76 Ergebnisse Tab. 3.7: Sequenzen der Oligonukleotide, die für die DNA-Bindung eingesetzt wurden Oligonukleotid Sequenz Dick AT 5‘-TATA GAATTC TAT-3‘ Dick I AT 5‘-TATA GIATTC TAT-3‘ Dick U AT 5‘-TATA GAATUC TAT-3‘ Dick IU AT 5‘-TATA GIATUC TAT-3‘ BamHI AT 5‘-TATA GGATCC TAT-3‘ Die DNA-Bindung wurde mit allen Mutanten (StrepTag II) und dem wt-Enzym für alle fünf Oligonukleotide getestet. Es wurden 100nM Enzym und 20nM Oligonukleotid eingesetzt. Die Abbildung 3.17 stellt die Gelshifts der Mutanten gegenüber. (1) (7) Dick AT (13) BamHI AT (19) Dick I AT (25) Dick U AT Dick IU AT Shift nativ Gelshift mit den modifizierten Oligonukleotiden für die Mutanten mit StrepTag II BamHI AT (1-6) Dick AT (7-12) (13-18) Dick I AT (19-24) Dick U AT (25-30) Dick IU AT Reihenfolge jeweils von links nach rechts: ohne Enzym, G140A/N141AStrepII, G140A/N141SStrepII, G140S/R145KStrepII, G140S/N141S/R145KStrepII, wtEcoRI Abb. 3.17: Gelshift der modifizierten Oligonukleotide mit allen Mutanten mit StrepTag II und dem wtEnzym Ergebnisse 77 Eine Shift-Bande ist nur für das wt-Enzym mit Dick AT zu detektieren, welches die kanonische Sequenz trägt. Auffällig ist, daß bei den Oligonukleotiden, die mit den Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII inkubiert wurden, eine Bande unterhalb des eigentlichen Oligonukleotids auftritt. Es ist möglich, daß sie durch Degradation von einer Nuklease hervorgerufen wurden. Um einen solchen Nukleaseabbau nachzuweisen, wurde eine Kinetik unter gleichen Bedingungen ausgeführt. Die Inkubationszeiten für die Bindung wurden von 30min auf 10min, 20min, 30min und 60min varriert. Eingesetzt wurde das Oligonukleotid Dick AT für alle Enzyme. Abbildung 3.18 zeigt den Gelshift. (1) (7) Dick AT (13) BamHI AT (19) Dick I AT (25) Dick U AT Dick IU AT Shift nativ Gelshift mit den modifizierten Oligonukleotiden für die Mutanten mit StrepTag II BamHI AT (1-6) Dick AT (7-12) (13-18) Dick I AT (19-24) Dick U AT (25-30) Dick IU AT Reihenfolge jeweils von links nach rechts: ohne Enzym, G140A/N141AStrepII, G140A/N141SStrepII, G140S/R145KStrepII, G140S/N141S/R145KStrepII, wtEcoRI Abb. 3.18: Gelshift für die Mutanten und das wt-Enzym mit Dick AT nach Inkubation für unterschiedliche Zeitwerte Für die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII ist deutlich eine Kinetik zu erkennen, die die Ergebnisse der anderen Gelshiftexperimente erhärtet. Im Verlauf der Inkubation ist eine Zunahme der verkürzten Bande erkennbar (Spuren 2 bis 5 für G140A/N141SStrepII und Spuren 6 bis 8 für G140A/N141SStrepII). Auch bei G140S/R145KStrepII und in geringem Maße auch bei G140S/N141S/R145KStrepII sind 78 Ergebnisse Banden in der gleichen Höhe detektierbar, die sich jedoch erst nach einer Inkubation von einer Stunde zeigen (Spur 13 beziehungsweise Spur 17). Für das wt-Enzym ergibt sich in den Zeiten von 10min bis 30min eine Zunahme des Shiftproduktes (Spuren 18 bis 20), wobei eine Degradation des Oligonukleotids nicht erkennbar wird. Bei der Degradation des Oligonukleotids Dick AT kann es sich nicht um eine Aktivität der Mutanten handeln. Es ist gezeigt worden, daß EcoRI mit Ca2+-Ionen allein nicht in der Lage ist, eine Spaltung auszuführen [Woodhead et al., 1981]. Dies muß ebenso für die Mutanten gelten, die unter verschiedensten Bedingungen auf Spaltaktivität getestet wurden. Es ist daher anzunehmen, daß es sich bei dieser DNA-Degradation um eine Verunreinigung in den Enzympräparationen handelt, die durch die Aufreinigung mit dem StrepTag II-System nicht abgetrennt werden konnte. Diese Verunreinigung tritt stärker bei G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII in Erscheinung, sie ist jedoch auch bei G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII vorhanden. Die Reaktion wurden unter 10mM EDTA ausgeführt, welches eine Bindungskonstante von 4x1010M-1 für Ca2+-Ionen aufweist. Bei einer eingesetzten Enzymkonzentration von 100nM im Test, die 1mM CaCl2 enthält, ergibt sich somit eine Konzentration von freiem Ca2+-Ionen von 0,25pM im Reaktionsansatz. Diese geringe Konzentration reicht dem Enzym, um diese Degradation hervorzurufen. In dem nativen Gelsystem ist eine Abschätzung der Länge der degradierten Banden schwer möglich. Es ist jedoch anzunehmen, daß weder das Enzym, welches den Abbau hervorruft noch die Mutante gebunden sind, da die Bande unterhalb des nativen Oligonukleotids läuft. Analoge Ansätze wurden ebenfalls auf einem 18% denaturierenden Gel analysiert. Die Ergebnisse entsprechen denen des nativen Gels. Insgesamt konnte für die Mutanten mit StrepTag II unter den Shift-Bedingungen mit keinem der Oligonukleotide eine Bindung festgestellt werden. Ergebnisse 79 3.4.4 Charakterisierung der Spaltaktivität der Mutanten mit StrepTag II 3.4.4.1 Spaltaktivität auf λ(dam-, dcm-)-DNA Die Charakterisierung des Spaltverhaltens auf λ-DNA wurde mit den Mutanten mit StrepTag II ausschließlich auf unmethylierter λ-DNA (λ(dam-, dcm-)) ausgeführt, da durch die Tests mit der methylierten DNA keine zusätzliche Information zu erwarten war. Die Reaktionsbedingungen sind analog zu den vorherigen Experimenten (3.3.2) gewählt worden. Eine Wiederholung der Experimente mit diesen Präparationen erschien sinnvoll, da sie eine höhere Reinheit als die korrespondierenden Enzyme mit Hexahistidintag aufwiesen. Abbildung 3.19 zeigt die Spaltungen von λ(dam-, dcm-)DNA bei pH 8,8 (Normalsalz)-Bedingungen. (1) (2) (6) Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140A/N141AStrepII (6-10) Zeitwerte G140A/N141SStrepII Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h Spaltung unmethlierter λ-DNA durch die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140S/R145KStrepII (6-10) Zeitwerte G140S/N141S/R145KStrepII Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h - - Abb. 3.19: Spaltung unmethylierter λ-DNA (dam , dcm ) durch die Mutanten mit StrepTag II bei pH8,8 (Normalsalz)-Bedingungen 80 Ergebnisse Für die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII ergibt sich ein unspezifischer Abbau der DNA. Bei G140A/N141AStrepII ist nach 3h keine vollständige λ-DNA mehr detektierbar, während bei G140A/N141SStrepII ein vergleichbarer Abbau schon bei 90min auftritt. Bei den Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII sind deutlich Bandenmuster zu erkennen, die unter der unspezifischen Nukleaseaktivität liegen. Eine genaue Bestimmung dieser Spaltaktivität erwies sich aufgrund der unspezifischen Degradation als sehr schwierig. Spaltaktivität konnte bei G140S/R145KStrepII unter keinen anderen Bedingungen detektiert werden, bei G140S/N141S/R145KStrepII jedoch zusätzlich unter Standardbedingungen (siehe Abbildung 3.20). Dabei erscheint das gebildete Bandenmuster weder EcoRI noch BamHI ähnlich. (1) (2) (6) (14) Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140A/N141AStrepII (6-10) Zeitwerte G140A/N141SStrepII Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (2-9) Zeitwerte G140S/R145KStrepII (6-10) Zeitwerte G140S/N141S/R145KStrepII (14) Standard-Spaltmuster wtEcoRI Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h - - Abb. 3.20: Spaltung unmethylierter λ-DNA (dam , dcm ) durch die Mutanten mit StrepTag II unter Standardbedingungen Für die Mutante G140S/N141S/R145SStrepII ist deutlich in den ersten Zeitwerten (bis 3h) ein Bandenmuster zu erkennen, das im Laufe der weiteren Kinetik durch unspezifische Nuklease abgebaut wird. Um eine genauere Abschätzung der Bandengröße Ergebnisse 81 vorzunehmen, wurden Hilfslinien in eingefügt, die korrespondierende Banden in beiden Standardspaltmustern verbinden. Auf diese Weise kann ein ungleichmäßiges Laufverhalten über die Breite des Agarosegels ausgeglichen werden. (1) (14) (6) Spaltung unmethylierter λ-DNA durch die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII (1) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI (6-10) Zeitwerte G140S/N141S/R145KStrepII (14) Standard-Spaltmuster: wtEcoRI Zeitwerte: 45min, 90min, 3h, 6h, 18h - - Abb. 3.21: Spaltung unmethylierter λ-DNA (dam , dcm ) durch die Mutante G140S/N141S/R145KStrepII und Standardspaltbedingungen (Abbildung 3.20) mit Hilfslinien zur Abschätzung der Bandengröße Obwohl es sich um ein ähnliches Bandenmuster handelt, ist deutlich zu erkennen, daß die DNA-Fragmente, die durch die Mutante erzeugt werden, nicht der Größe der Fragmente der wtEcoRI-Spaltung entsprechen. Allerdings erscheinen die Banden auch nicht im BamHI-Spaltmuster dieses Substrates, da die Fragmente für eine BamHI-Spaltung (16841BP, 7233Bp, 6771Bp, 6527Bp, 5626Bp, 5505Bp) einen zu großen Längenunterschied aufweisen. Daher muß angenommen werden, daß die Dreifachmutante eine gänzlich andere DNA-Sequenz erkennt und spaltet. Für die weiteren Mutanten wurde die Aktivität wie zuvor daran gemessen, wie schnell λ-DNA degradiert wurde. Tabelle 3.8 stellt dabei die zugrundeliegenden Enzymkonzentrationen zusammen, die für die unterschiedlichen Bedingungen in Tabelle 3.9 gelten (5mM NaCl für pH 8,8 Niedrigsalz, 50mM für alle anderen Bedingungen). 82 Ergebnisse Tab. 3.8: Maximale Enzymkonzentrationen der StrepTag II- Mutanten unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen 50mM NaCl 5mM NaCl G140A/N141AStrepII 167nM 16,7nM G140A/N141SStrepII 167nM 16,7nM G140S/R145KStrepII 45nM; 250nM 4,5nM; 25nM G140S/N141S/R145KStrepII 36nM; 333nM 3,6nM; 33,3nM Tab. 3.9: Bestimmung des Zeitwertes, für den durch unspezifische Nukleaseaktivität keine diskrete λDNA-Bande mehr detektiert werden konnte. Verwendet wurden λ(dam , dcm )-DNA und StrepTagIIMutanten. G140A/ N141AStrepII G140A/ N141SStrepII G140S/ R145KStrepII G140S/N141S/ R145KStrepII Standardbedingungen 1,5h 1,5h 6h 6h Manganbedingungen 3h 1,5h 6h 18h pH8,8 (Niedrigsalz) 1,5h 1,5h 3h 3h pH8,8 (Normalsalz) 3h 1,5h 6h 6h Die Spaltaktivität für die Mutante G140S/N141S/R145KStrepII konnte auf λ-DNA nicht weiter charakterisiert werden, daher wurden für die folgenden Experimente Oligonukleotide eingesetzt (siehe 3.4.4.2). Bei den anderen Mutanten kann keine Korrelation zwischen Nukleaseaktivität und Pufferbedingungen festgestellt werden. 3.4.4.2 Spaltaktivität auf modifizierten Oligonukleotiden Um auf λ-DNA Spaltaktivität mit einem Agarosegel zu detektieren, müssen viele Spaltereignisse an der gleichen Spaltstelle zusammenkommen, so daß eine diskrete Bande entsteht. Für Mutanten mit geringer Spaltaktivität ist dies unter Umständen Ergebnisse 83 nicht erreichbar, ohne daß eine unspezifische Degradation des Substrats auftritt. Wird die Spaltung auf einem Oligonukleotid verfolgt, führt schon eine geringe Anzahl von Spaltereignisse zu einer sichtbaren Bande, wenn das Oligonukleotid radioaktiv markiert wurde. Daher kann eine schwächere Spaltaktivität mit diesem System detektiert werden. Außerdem wird das Enzym auf die Oligonukleotidsequenz konzentriert und kann sich nicht in einer Bindung an viele andere Sequenzen verlieren. Da mit den Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII auf λ-DNA unter keiner der Versuchsbedingungen eine Spaltaktivität nachgewiesen werden konnte und für G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII nur partielle Spaltmuster, wurden als Substrate verschiedene Oligonukleotide verwendet. Hierbei handelt es sich um modifizierte Oligonukleotide des Typs Dick AT. Dabei sind ausgehend von der EcoRI-Erkennungssequenz (GAATTC) Basenaustausche am äußeren A/T-Basenpaar vorgenommen worden zu Dick I AT Dick U AT und Dick IU AT (Sequenzen siehe Tabelle 3.7). Zusätzlich wurde das Basenpaar durch G/C ausgetauscht, so daß die BamHI-Erkennungssequenz entsteht (GGATCC). Die Oligonukleotide sind selbstkomplementär und bilden einen 12Bp langen Doppelstrang mit einem 5‘-überhängenden Thymidin zur leichteren radioaktiven Markierung mit der Polynukleotidkinase. Bevor das Spaltverhalten der hier hergestellten Mutanten mit den Oligonukleotiden getestet wurde, erfolgte eine Testspaltung mit wtEcoRI. Das Verhältnis Oligonukleotid zu Enzym betrug bei Dick AT 50nM zu 60nM, bei den anderen Oligonukleotiden 500nM zu 600nM. Durch die Erhöhung der absoluten Menge bei gleichem Verhältnis ist eine Bindung des Oligonukleotids begünstigt. Diese Bedingungen wurden für die modifizierten Oligonukleotide gewählt, da hier mit einer sehr langsamen Spaltung zu rechnen ist. Die Reaktionen wurden wegen besserer Handhabung bei Raumtemperatur vorgenommen. Für die Sequenz mit Uracil (Dick U AT) ist bekannt, daß eine Spaltung möglich ist [Jeltsch et al., 1993a; Küster, 1998]. Abbildung 3.22 zeigt die Spaltungen der fünf Oligonukleotide für wtEcoRI. 84 Ergebnisse (1) (2) (5) (8) (11) (16) 13Bp 5Bp Spaltung modifizierter Oligonukleotide durch wtEcoRI (1) Positivkontrolle (2-4) (5-7) Zeitwerte Dick IU AT (8-10) (11-15) Zeitwerter Dick U AT (16-20) Zeitwerte Dick I AT Zeitwerte BamHI AT Zeitwerte Dick AT Zeitwerte für Dick I AT, Dick IU AT und BamHI AT: Nullwert, 10min, 3h Zeitwerte für Dick U AT und Dick AT: Nullwert, 15s, 30s, 1min, 5min Abb. 3.22: Spaltung der modifizierten Oligonukleotide durch wtEcoRI Für die Oligonukleotide Dick I AT, Dick IU AT und BamHI AT konnte selbst für einen Zeitwert von 3h keine Spaltung erreicht werden. Auffällig ist hier, daß selbst für das wt-Enzym, das in hoher Reinheit vorliegt, bereits eine leichte Leiterbildung bei den 3h-Inkubationen zu erkennen ist (Spuren 4, 7 und 10). Daher sind Inkubationen über längere Zeitwerte nicht sinnvoll. Für das Oligonukleotid Dick U AT ergibt sich schon ab 15s eine Spaltung, die bis zum Zeitwert von 5min deutlich zunimmt. Ebenso verhält es sich beim Oligonukleotid Dick AT, das die kanonische Sequenz trägt. Auch hier nimmt die Spaltung deutlich von 15s fortschreitend bis 5min zu. Die Spaltung dieses Oligonukleotids wurde für alle folgenden Spaltanalysen als Positivkontrolle (Spur 1) eingesetzt, um die Laufstrecke der zu erwartenden Spaltung abschätzen zu können. Für die Mutanten konnte ein vergleichbares Verhältnis von Enzym zu Oligonukleotid nicht eingesetzt werden, da die Präparationen geringere Proteinkonzentrationen enthielten. Eingesetzt wurden daher die höchstmöglichen Konzentrationen der Enzyme Ergebnisse 85 (vergleiche Tabellen 3.10 bis 3.13). Die Kinetiken wurden zunächst unter Standardspaltbedingungen ausgeführt. Dabei wurden mehrere Zeitwerte genommen, um eine Entwicklung der Spaltung zu detektieren. Analog zum Experiment mit dem wt-Enzym wurden zunächst Inkubationszeiten von 3h gewählt. Dabei konnte für keine der Mutanten bei irgendeinem der Oligonukleotide eine Spaltung detektiert werden. Daher wurden im Folgenden Zeitwerte bis zu 18h genommen (über Nacht). Abbildung 3.23 zeigt exemplarisch die Spaltung der modifizierten Oligonukleotide mit den Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII unter Standardspaltbedingungen. (1) (2) (5) (8) 13Bp 5Bp (11) Spaltung modifizierter Oligonukleotide durch G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII, jeweils 18h (1) Positivkontrolle (2-4) Dick I AT (5-7) Dick U AT (8-10) Dick IU AT (11-13) Dick AT Reihefolge jeweils: Nullwert, G140A/N141AStrepII, G140A/N141SStrepII Abb. 3.23: Oligonukleotidspaltung durch die Mutanten G140A/N141AStrepII und G140A/N141SStrepII unter Standardbedingungen Spur 1 zeigt die Positivkontrolle, die Spaltung von Dick AT durch das wt-Enzym. Für alle vier Oligonukleotide ist ein Abbau detektierbar, der nukleotidweise erfolgt. Somit ergibt sich eine Leiter von 13Bp bis 7Bp. Eine Spaltung des Oligonukleotids zum 5Bp großen Produkt, das von einer Restriktionsaktivität erwartet wird, tritt nicht auf. Es ist unwahrscheinlich, daß eine solche Aktivität von den Mutanten ausgeht, da es sich hier um eine Exonukleaseaktivität handelt. Abbildung 3.24 zeigt die Sequenzen in doppelsträngigen Oligonukleotiden. 86 Ergebnisse 5´ *T A T A G A A T T C T A T T A T C T T A A G A T A T* 5´ Abb. 3.24: Darstellung des 5‘-markierten selbstkomplementären Oligonukleotids Dick AT Möglicherweise handelt es sich bei der Nukleaseaktivität in diesen Proben um eine Polymerase mit Proofreading-Aktivität. Sie würde in Ermangelung von Nukleotiden zur Vervollständigung des einzelsträngigen Überhanges vom 3‘-Ende her das doppelsträngige Oligonukleotid abbauen. In Abbildung 3.24 sind die möglichen Abbauprodukte durch Pfeile gekennzeichnet. Dieser Abbau schreitet fort, bis die Stränge des Oligonukleotids nicht länger hybridisieren können, so daß das 7Bp-Fragment das kürzeste Produkt darstellt. Für ein schnelles Restriktionsenzym stellt diese Art der Verunreinigung einer Präparation keine Komplikation dar. Bei Enzymen so geringer Aktivität jedoch, wie sie hier vorliegen, kann diese Nebenaktivität detektiert werden. Die Endonukleaseaktivität der Enzyme sollte in jedem Fall ein kürzeres Produkt hervorbringen, so daß hier keine Spaltung durch die Mutanten vorliegt. Die Spaltungen aller Oligonukleotide wurden mit den vier Mutanten mit StrepTag II mit maximalem Enzymeinsatz durchgeführt. Tabelle 3.10 stellt die Ergebnisse für die Mutanten und das wt-Enzym zusammen. Für keine der Mutanten konnte die Bildung des 5Bp-Produktes unter Standardbedingungen beobachtet werden. Die maximalen Konzentrationen der Enzyme ergeben sich aus den Präparationen der Mutanten. Aufgrund des hohen Verbrauchs der Enzyme bei den Messungen konnten die Spaltungen nicht mit allen Präparationen ausgeführt werden, so daß bei den Enzymen G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII nicht die letzten Präparationen berücksichtigt werden konnten, welche eine höhere Konzentration aufwiesen (vergleiche Tabelle 3.3). Ergebnisse 87 Tab. 3.10: Oligonukleotidspaltungen durch die Mutanten und das wt-Enzym unter Standardbedingungen. Die Konzentrationsverhältnisse geben Enzym zu Oligonukleotid in nM an. Mutante Enzym/Oligonukleotid [nM] Zeitwerte Spaltung Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT wtEcoRIHis6 60/50 15s bis 5min 600/500 10min bis 3h 600/500 15s bis 5min 600/500 10min bis 3h 600/500 10min bis 3h Spaltung zum 5Bp kein Produkt Spaltung zum 5Bp kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141AStrepII 284/500 2min bis 18h 284/500 2min bis 18h 284/500 2min bis 18h 284/500 2min bis 18h 284/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141SStrepII 64/500 2min bis 18h 64/500 2min bis 18h 64/500 2min bis 18h 64/500 2min bis 18h 64/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/R145KStrepII 191/500 10min bis 18h 191/500 10min bis 18h 191/500 10min bis 18h 191/500 10min bis 18h 191/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/N141S/R145KStrepII 151/500 10min bis 18h 151/500 10min bis 18h 151/500 10min bis 18h 151/500 10min bis 18h 151/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt 88 Ergebnisse Von einigen Mutanten ist bekannt, daß eine langsame oder nicht vorhandene Spaltaktivität durch Starspaltbedingungen verbessert wird. Daher wurden für die Mutanten die klassischen Starspaltbedingungen Manganzusatz und pH8,8 (Niedrigsalz) getestet. Um einen möglichst geringen Enzymverbrauch zu erreichen, wurden einzelne lange Zeitwerte (über Nacht, also etwa 18h) verwendet. Im Fall einer Spaltung sollte eine ausführliche Kinetik angeschlossen werden. Tabelle 3.11 zeigt die Ergebnisse für die Spaltungen unter Mangan-Starbedingungen. Tab. 3.11: Oligonukleotidspaltungen durch die Mutanten unter Mangan-Starbedingungen. Die Konzentrationsverhältnisse geben Enzym zu Oligonukleotid in nM an. Mutante Enzym/Oligonukleotid [nM] Zeitwerte Spaltung Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141AStrepII 284/500 5h bis 18h 284/500 5h bis 18h 284/500 5h bis 18h 284/500 5h bis 18h 284/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141SStrepII 64/500 5h bis 18h 64/500 5h bis 18h 64/500 5h bis 18h 64/500 5h bis 18h 64/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/R145KStrepII 191/500 5h bis 18h 191/500 5h bis 18h 191/500 5h bis 18h 191/500 5h bis 18h 191/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/N141S/R145KStrepII 151/500 5h bis 18h 151/500 5h bis 18h 151/500 5h bis 18h 151/500 5h bis 18h 151/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Ergebnisse 89 Unter Mangan-Starbedingungen konnte kein unspezifischer Abbau der Oligonukleotide zu einer Leiter festgestellt werden. Allerdings zeigte sich auch keine Spaltung zum 5Bp-Produkt nach einer Spaltung bei Raumtemperatur über Nacht (etwa 18h). Für den Test der pH8,8-Starbedingungen unter Niedrigsalz muß das Enzym zuvor in pH8,8-Puffer äquillibriert werden. Die Bedingungen fordern nicht mehr als 5mM NaCl, so daß sich insgesamt eine geringere Enzymkonzentration ergibt (vergleiche Tabelle 3.8). Tabelle 3.12 gibt die Spaltungen unter diesen Bedingungen wider. Tab. 3.12: Oligonukleotidspaltungen durch die Mutanten unter pH8,8-Starbedingungen (Niedrigsalz). Die Konzentrationsverhältnisse geben Enzym zu Oligonukleotid in nM an. Mutante Enzym/Oligonukleotid [nM] Zeitwerte Spaltung Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141AStrepII 28,4/500 5h bis 18h 28,4/500 5h bis 18h 28,4/500 5h bis 18h 28,4/500 5h bis 18h 28,4/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140A/N141SStrepII 6,4/500 5h bis 18h 6,4/500 5h bis 18h 6,4/500 5h bis 18h 6,4/500 5h bis 18h 6,4/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/R145KStrepII 19/500 5h bis 18h 19/500 5h bis 18h 19/500 5h bis 18h 19/500 5h bis 18h 19/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt Dick AT Dick I AT Dick U AT Dick IU AT BamHI AT G140S/N141S/R145KStrepII 15/500 5h bis 18h 15/500 5h bis 18h 15/500 5h bis 18h 15/500 5h bis 18h 15/500 18h kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt kein Produkt 90 Ergebnisse Wie unter Mangan-Starbedingungen wurde für pH8,8-Starbedingungen keine Spaltung zum 5Bp-Produkt beobachtet. Eine Leiterbildung wurde ebenfalls nicht detektiert. Durch die größere Verdünnung des Enzyms wurden auch Verunreinigungen, die mit eingeschleppt wurden, weiter verringert. Allerdings beträgt der Konzentrationsunterschied zu den Standardbedingungen den Faktor 10. Bei einer so langen Inkubationszeit von etwa 18h sollte dies unerheblich sein. Daher ist es wahrscheinlicher, daß die Standardpufferbedingungen für die abbauende Verunreinigung günstiger sind als die EcoRI-Starbedingungen. Insgesamt konnte unter keiner der getesteten Bedingungen eine Spaltung des unmodifizierten Oligonukleotids Dick AT oder der modifizierten Sequenzen von Dick I AT, Dick U AT oder Dick IU AT, sowie BamHI AT gespalten werden. Zwar entzieht der unspezifische Abbau dem Enzym immer mehr Substrat, aber da nach 18h auch immer noch Oligonukleotid der Ausgangslänge vorhanden war, sollte eine spezifische Spaltung zum 5Bp-Produkt detektiert worden sein. Diskussion 4 91 DISKUSSION In der vorliegenden Arbeit wurden Mutationen an der Restriktionsendonuklease EcoRI durchgeführt, die sowohl zum erweiterten Verständnis der Struktur dieses Enzyms und seiner Wechselwirkung mit der DNA, als auch zur Grundlage der Erweiterung der Sequenzspezifität dienen sollen. Auswahl geeigneter Mutanten Nach der Röntgenstrukturanalyse werden die nebeneinanderliegenden AT-Basenpaare von Gly140 und Asn141 der einen Untereinheit sowie Arg145 der anderen Untereinheit erkannt [Rosenberg, 1991]. Für Gly140 ist dabei eine hydrophobe Wechselwirkung zum äußeren Thymin der Erkennungssequenz beschrieben worden. Dieser Kontakt konnte durch zielgerichtete Mutageneseexperimente bestätigt werden [Küster, 1998]. In diesem Fall wurden Aminosäureaustausche an Position 140 von Glycin zu Alanin beziehungsweise Serin durchgeführt. Die Mutanten sind deutlich in ihrer katalytischen Aktivität beeinträchtigt (G140A 1000fach, G140S inaktiv). Allerdings war die Aktivität der G140A-Mutante auf Oligonukleotiden mit Uracil anstelle je eines Thymins deutlich erhöht. Daraus folgt, daß die Reduktion der Aktivität der G140A-Mutante vor allem auf einer sterischen Behinderung durch die zusätzliche Methylgruppe beruht und daß ein Kontakt zu beiden Thyminbasen gleichzeitig erfolgt. Die Aminosäureposition 141 bildet Wasserstoffbrückenbindungen zu den Adeninen der Erkennungssequenz aus. Dieser Kontakt wurde auch bereits charakterisiert [Fritz et al., 1998]. Während die N141A-Mutante nur unter Starbedingungen aktiv ist, konnte für die Einzelmutante N141S eine spezifische Aktivität bestimmt werden, die um den Faktor 100 unter der des Wildtypenzyms liegt. Arg145 nimmt neben der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zu zumindest einem der beiden Adenine der Erkennungssequenz eine zentrale Stellung in der Wechselwirkung der Untereinheiten ein, indem es über einen Ionenkontakt mit Glu144 der gegenüberliegenden Untereinheit die Dimerbildung der Restriktionsendonuklease EcoRI stabilisiert. Außerdem ist die Seitenkette von Arg145 im Wasserstoffbrückenbindungsabstand zu dem gegenüberliegenden Asn141 und dem zu 92 Diskussion spaltenden Phosphat, so daß ein Beitrag zur Kopplung von Erkennung und Katalyse wahrscheinlich ist. Für die R145K-Mutante ist aber nur eine Reduktion der spezifischen Aktivität um den Faktor 50 beschrieben worden [Wolfes et al., 1986]. Die folgenden Abbildungen illustrieren als Stereobilder die Abstände und Ausrichtungen der interessierenden Bereiche. Dabei kennzeichnen a und b die beiden Untereinheiten des Enzyms. A B G140(a) N141(a) G140(a) N141(a) R145(b) R145(b) G140(a) N141(a) G140(a) N141(a) R145(b) R145(b) Abb. 4.1: Stereobild der Kontakte des wt-Enzyms zur kanonischen EcoRI-Sequenz (A) und zur BamHI-Sequenz (B) Wie oben bereits beschrieben und in Abbildung 4.1/A dargestellt, tragen die hier zur zielgerichteten Mutagenese ausgewählten Aminosäurereste wie folgt bei: Gly140 bildet sowohl zur Methylgruppe des inneren als auch des äußeren Thymins van der Waals-Wechselwirkungen aus. Asn141 erkennt die beiden Adenine der Erkennungssequenz über insgesamt drei Wasserstoffbrückenbindungen. Darüber hinaus bildet Arg145 der anderen Untereinheit zwei Wasserstoffbrückenbindungen zum äußeren Adenin der Erkennungssequenz aus. Bei der Bindung des Wildtypenzyms zu seiner spezifischen Erkennungssequenz wird von diesen drei Aminosäuren also insgesamt ein „Netzwerk“ von fünf Wasserstoffbrückenbindungen und zwei van der Waals Wechselwirkungen gebildet. Ein mögliches Ziel der Spezifitätsänderung von EcoRI Diskussion 93 ist die Erkennung der Sequenz GGATCC, die einer BamHI-Spezifität entspricht. Dies wurde durch die verbesserte Aktivität von der G140A-Mutante auf einem GAATUCSubstrat nahegelegt [Küster, 1998]. Deshalb wird in Abbildung 4.1/B die Wechselwirkung mit dem analogen Ausschnitt aus der BamHI-Sequenz gezeigt. Für das wt-Enzym ergibt sich neben dem Verlust einer hydrophoben Wechselwirkungen (das Cytosin hat keine 5‘-Methylgruppe) auch der Austausch einer Wasserstoffbrückenbindung gegen eine elektronische Abstoßung (Guanin hat an Position 6 eine Carbonyl- statt einer Aminogruppe). Aus diesem Unterschied zwischen den Interaktionen mit den Sequenzen GAATTC und GGATCC sowie den Eigenschaften der Einzelmutanten an den Positionen 140 und 141 erschienen die Doppelmutanten G140A/N141A und G140A/N141S als vielversprechende Kandidaten für eine Spezifitätsänderung. A A140(a) A141(a) A140(a) A141(a) B R145(b) R145(b) A140(a) A141(a) A140(a) A141(a) R145(b) R145(b) Abb. 4.2: Stereobild der Kontakte der Mutante G140A/N141A zur kanonischen EcoRISequenz (A) und zur BamHI-Sequenz (B) Wie auf Abbildung 4.2/A zu erkennen ist, kommt es durch die Einführungen der Aminosäure Alanin an den Positionen 140 und 141 zu Destabilisierungen des ProteinDNA Netzwerkes auf einer GAATTC-Sequenz. Aus sterischen Gründen kann die Aminosäure Alanin 140 keine van der Waals-Wechselwirkungen mehr zu den Me- 94 Diskussion thylgruppen der Thymine ausbilden. Es kommt dagegen aufgrund der räumlichen Lage zu sterischen Behinderungen. Ferner ist der Alaninrest an Position 141 nicht in der Lage, Wechselwirkungen zur DNA zu bilden. Diese Mutationen haben jedoch keinen Einfluß auf die beiden Wasserstoffbrückenbindungen des Arginins. Der Verlust dreier Wasserstoffbrückenbindungen und eine sterische Behinderung lassen sicherlich keine Wechselwirkung mit der GAATTC-Sequenz mehr zu. Schon die Einzelmutante N141A war ja unter kanonischen Pufferbedingungen inaktiv [Fritz et al., 1998]. Bei einer GGATCC-Sequenz ist die sterische Behinderung aufgehoben und durch einen hydrophoben Kontakt ersetzt (siehe Abb. 4.2/B). Allerdings trägt Ala141 nicht zur Wechselwirkung bei. Immerhin könnte man sich eine Spaltung von GGATCC unter Starbedingungen vorstellen, so wie die Einzelmutante N141A auf der Sequenz GAATTC unter diesen Bedingungen aktiv war. A A140(a) S141(a) A140(a) S141(a) B R145(b) A140(a) S141(a) A140(a) S141(a) R145(b) R145(b) R145(b) Abb. 4.3: Stereobild der Kontakte der Mutante G140A/N141S zur kanonischen EcoRISequenz (A) und zur BamHI-Sequenz(B) In Abbildung 4.3/A ist die Situation, wie sie in der Doppelmutante G140A/N141S vorliegen sollte, zu erkennen. Hier kommt es ebenfalls aufgrund der räumlichen Lage des Alaninrestes an Position 140 zu den Methylgruppen der Thymine zu Destabilisierungen in der Protein/DNA-Wechselwirkung. Durch das Serin an Position 141 ent- Diskussion 95 stehen zwei Möglichkeiten zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen, wobei es fraglich bleibt, ob die Entfernungen von Donor und Akzeptor ausreichen, eine Bindung zu generieren. Die erhöhte Aktivität der Einzelmutante N141S gegenüber N141A spricht sehr dafür [Fritz et al., 1998]. Diese Mutationen haben auch hier keinen Einfluß auf die Wasserstoffbrückenbindungen des Arginin 145. Auf der BamHISequenz sieht die Situation noch besser aus (siehe Abb. 4.3/B). Vom Alanin an Position 140 sollte jetzt zumindest ein hydrophober Kontakt ohne sterische Behinderungen beigetragen werden, so daß insgesamt nur eine Wasserstoffbrückenbindung weniger als bei der Erkennung der GAATTC-Sequenz durch das wt-Enzym resultiert. Die beiden beschriebenen Doppelmutanten fassen jeweils zwei Mutationen zusammen, die schon als Einzelmutanten charakterisiert wurden. Um auch die dritte, die AT-Basenpaare kontaktierende Aminosäure Arg145 mit einzubeziehen, wurde die Tripelmutante G140S/N141S/R145K gewählt. Außerdem sollte die Doppelmutante G140S/R145K mit in die Untersuchungen einbezogen werden, um den Beitrag der drei Einzelmutationen etwas besser abschätzen zu können. A B S140(a) N141(a) S140(a) N141(a) K145(b) S140(a) N141(a) S140(a) N141(a) K145(b) K145(b) K145(b) Abb. 4.4: Stereobild der Kontakte der Mutante G140S/R145K zur kanonischen EcoRISequenz (A) und zur BamHI-Sequenz (B) Bei der Generierung der Doppelmutante G140S/R145K ist die Situation wie folgt (siehe Abb. 4.4/A): Neben der sterischen Behinderung durch die Hydroxymethyl- 96 Diskussion gruppe des Serinrestes, liegt hier auch eine starke elektronische Abstoßung zwischen der Alkoholgruppe des Serins und zumindest einer Carbonylgruppe des Thymins vor. Zusätzlich zu den drei Wasserstoffbrückenbindungen des Asn141 ist das Lysin an Position 145 in der Lage, drei weitere Wasserstoffbrückenbindungen zu beiden Adeninen der Erkennungssequenz auszubilden, wobei den starken Behinderungen durch das Serin insgesamt sechs Wasserstoffbrückenbindungen gegenüberstehen. Wie stark sich allerdings der Verlust der Kontakte von Arg145 zu Glu144 der anderen Untereinheit und zum zu spaltenden Phosphat auswirken, ist schwer einzuschätzen. Immerhin ist die Einzelmutante R145K nur um den Faktor 50 langsamer [Wolfes et al., 1986]. Das Serin an Position 140 hat auf einer BamHI-Sequenz die Möglichkeit, sowohl einen hydrophoben Kontakt als auch eine Wasserstoffbrücke zum Cytosin auszubilden (siehe Abb. 4.4/B). Es muß sich dazu aber leicht umorientieren. Das Asparagin an Position 141 trägt nur zwei Wasserstoffbrücken bei und interferiert mit der Carbonylgruppe am Guanin, während das Lysin an Position 145 keinen Unterschied zwischen einem Guanin und einem Adenin an dieser Nukleotidposition macht. Im günstigsten Fall würde also die Interferenz des Carbonylsauerstoffs von Guanin und Asparagin durch eine zusätzliche Wasserstoffbrücke ausgeglichen. Allerdings kann man die Konsequenzen der notwendigen Umorientierungen einzelner Aminosäuren in einem verzahnten Wasserstoffbrückennetzwerk, wie wir es in der Interaktionsfläche der EcoRI mit der DNA vorliegen haben, in keiner Weise vorhersagen. In der Mutante G140S/N141S/R145K kommt es neben den oben bereits erwähnten Abstoßungen durch G140S und Wasserstoffbrückenbindungen durch R145K zum Verlust von mindestens einer Wasserstoffbrückenbindung aufgrund der Substitution von Asn141 durch Serin (siehe Abb. 4.5/A). In dieser Tripelmutante sind nun gegenüber einem GC-Basenpaar einer BamHI-Sequenz keine sterischen oder elektronischen Behinderungen sichtbar (siehe Abb. 4.5/B). Alle drei neuen Seitenketten sollten positive Wechselwirkungen mit dem Basenpaar ausbilden können, so daß eine Situation resultiert, die der Erkennung der kanonischen Sequenz durch die wtEcoRI entspricht. Diskussion A B 97 S140(a) S141(a) S140(a) S141(a) K145(b) S140(a) K145(b) S140(a) S141(a) S141(a) K145(b) K145(b) Abb. 4.5: Stereobild der Kontakte der Mutante G140S/N141S/R145K zur kanonischen EcoRI-Sequenz (A) und zur BamHI-Sequenz (B) Alle diese Bedingungen beruhen auf einer einzelnen Röntgenstruktur, die die notwendige Dynamik eines Enzyms bei dem Übergang vom freien Zustand über einen erst unspezifisch und dann spezifisch gebundenen Zustand zur Spaltung außer Acht lassen muß. Erst die Generierung und Untersuchung der entsprechenden Mutanten kann zeigen, inwieweit diese der Modellvorstellung nahekommen. Zu diesem Zweck wurden folgende Mehrfachmutanten hergestellt: G140A/N141A, G140A/N141S, G140S/R145K und G140S/N141S/R145K. Expression und Aufreinigung der Mutanten Die Aufreinigung der Mutanten mit Hexahistidintag erfolgte zunächst nach dem Standardprotokoll. Dabei konnte keine saubere Aufreinigung erzielt werden. Es wurden größere Mengen an Fremdprotein mitgeschleppt, welche sich auch durch die Ionenaustauschchromatographie nicht abtrennen ließen. Diverse Veränderungen wie Vertauschen der Säulenreihenfolge brachten nicht den erwünschten Erfolg. Da zunächst vermutet wurde, daß es sich bei den mitgeschleppten Verunreinigungen um Chaperone handele, wurde ATP zugesetzt, welches ein Freisetzen des Proteins durch die Chaperone bewirken sollte. Da das ATP jedoch keinen Einfluß auf die 98 Diskussion Proteinreinheit nehmen konnte und die drei hauptsächlichen Chaperone der E.coliZelle auf anderer Höhe als die Verunreinigungen laufen, handelt es sich bei diesen vermutlich nicht um Chaperone, vergleiche Abbildung 3.6. Trotzdem könnte bei den hier vorgestellten Mutanten eine Beeinträchtigung ihrer strukturellen Stabilität und/oder Konformation zur schlechten Aufreinigung beitragen. Im Gegensatz zur wtEcoRI ist aus dem Rohextrakt keine Spaltaktivität erkennbar. Vermutlich erfolgt keine so starke Produktion in den Zellen wie es beim Wildtyp der Fall ist. Die Transkription der Mutanten sollte unbeeinflußt sein, da der Promotor unverändert ist. Es wird jedoch entweder weniger Protein hergestellt oder dieses in den Zellen sofort wieder abgebaut. Durch den Zusatz von zweiwertigen Kationen wurden schon in früheren Experimenten positive Auswirkungen auf die Stabilität und Bindungsfähigkeit [Windolph et al., 1997] sowie auf eine schnellere Katalyse [Alves et al., 1989] von Restriktionsendonukleasen beschrieben. Aus diesem Grund wurde dem Aufreinigungsprozeß der Mutanten Ca2+ zugefügt. Daraus resultierte eine deutlich verbesserte Aufreinigung, eine fast saubere Präparation wurde erhalten. Die Bindungsstelle für ein stabilisierendes Ca2+-Ion ist nicht bekannt. Es ist sicherlich nicht die Bindungsposition des katalytisch essentiellen Mg2+-Ions, da Ca2+ eine DNASpaltung nicht ermöglicht [Woodhead et al., 1981], bei der Mutante K130E aber in geringen Konzentrationen die Mg2+-induzierte Spaltung stimulierte [Windolph et al., 1997]. Die dort vermutete Bindungsstelle an den sauren Aminosäuren Asp133/Asp135 konnte inzwischen ausgeschlossen werden [Rosati, 1999]. Die strukturelle Stabilisierung dieser Mutanten durch Ca2+ ist für sich allein schon ein sehr wichtiges Ergebnis dieser Arbeit. Sie konnte in der Arbeitsgruppe auch bereits auf weitere Mutanten erfolgreich übertragen werden. Nach der abschließenden Dialyse, die zum Umpuffern auf einen glycerinhaltigen Aufbewahrungspuffer dient und mit einer Konzentrierung der Enzymlösung einhergeht, kam es aber zum Ausfallen der in Gegenwart von Ca2+ aufgereinigten Mutanten. Diese verstärkte Aggregationneigung der EcoRI-Mutanten mit Hexahistidintag wurde schon in anderen Arbeiten beobachtet [Vennekohl, 1999]. In diesem Fall könnte es auch ein weiteres Indiz auf eine strukturelle Beeinträchtigung der Mutanten sein. Die durch den Hexahistidintag bedingte Aggregationsneigung wird demnach durch die Mutationen noch verstärkt. Diskussion 99 Auf der Grundlage dieses Ergebnisses erfolgte eine Umklonierung der Mutanten mit anschließender Aufreinigung mit dem StrepTag II-System. Nach den positiven Erfahrungen bei der Hexahistidintagaufreinigung erfolgte gleich ein Zusatz von Kalzium. Das Ergebnis war eine saubere Präparation der Mutanten (Reinheitsgrad etwa 80 bis 90%) mit allerdings geringer Enzymmenge, die auch nach mehreren Aufreinigungen nicht verstärkt werden konnte. Biophysikalisch chemische und biochemische Charakterisierung der Mutanten Durch den Reinheitsgrad der StrepTag-Mutanten wurden biophysikalische Untersuchungen erst möglich. Der Hauptteil der Charakterisierungen wurde aus diesem Grund auch mit diesen Mutanten durchgeführt. Beim Circulardichroismus wiesen die Enzyme keine Besonderheiten auf. Die Spektren sind durch die nur gering einsetzbare Konzentration zum Teil verrauscht. Ein Widerspruch zum Wildtypenzym tritt aber in der Sekundärstruktur nicht auf. Die weiterhin durchgeführte Gelfiltration zeigte eindeutig, daß die Mutanten G140A/N141A und G140A/N141S in ihrem Monomer-Dimer-Gleichgewicht in Richtung des Monomers verschoben sind. Beide Enzyme sind zu 50 bis 75% monomer. Diese Instabilität des nativen Dimerstatus kann sehr einfach die erhöhte Aggregationsneigung erklären, die auch schon für andere Mutanten beobachtet wurde [Vennekohl, 1999]. Sie könnte auch der Grund für die geringere Expressionsausbeute sein, da Aggregate zumindest dem löslichen Teil des Zytosols entzogen sind. Die Mutanten G140S/R145K und G140S/N141S/R145K dagegen erscheinen analog zum Wildtypenzym als Dimere, also nicht in ihrem Gleichgewicht gestört. Interessanterweise sind die Mutanten mit einer Mutation von Arg145, welches in der Röntgenstruktur über eine Wasserstoffbrücke mit Glu144 der anderen Untereinheit verknüpft ist, weniger beeinträchtigt als diejenigen, die nur an den Positionen 140 und 141 mutiert sind. Allerdings kennen wir die Struktur des freien Enzyms nicht in einem ähnlichen Detail. Es ist sehr wohl möglich, daß ohne eine Stabilisierung durch die gebundene Erkennungssequenz verschiedene Konformationen möglich sind, bei denen auch die nicht mehr Basen-gebundenen Aminosäuren für einen Monomer-MonomerKontakt wichtig sind. Der Monomer-Dimer-Status ist weiterhin wichtig für die DNA-Bindungsfähigkeit und 100 Diskussion die katalytische Aktivität der Mutanten. Mutanten mit größeren Anteilen an Monomeren zeigten nur das Ausmaß an spezifischer Doppelstrangspaltung, das dem Anteil an Enzymdimeren entsprach [Vennekohl, 1996]. Die DNA-Bindungsfähigkeit war gleichermaßen an den dimeren Zustand geknüpft, so daß zum Beispiel für die Mutante L158D, die in dieser Arbeit als Vergleich in der Gelfiltration eingesetzt wurde, keine DNA-Bindung detektierbar war. Für die Messung der Affinität der Mutanten für DNA wurde hier der Gelretardationsassay eingesetzt, weil darin im Gegensatz zur Nitrozellulosefilterbindung als zusätzliche Information die Art des Komplexes an den Laufeigenschaften zu erkennen ist. So führt eine sequenzspezifische Bindung zu einem definierten Komplex, während sequenzunspezifische Bindung in der Regel zu verschiedenen Komplexen mit 1, 2, 3... gebundenen Enzymdimeren führt, die im Gel unterschieden werden können. Das Standardsubstrat für diesen Assay in der Arbeitsgruppe ist ein 174Bp PCR-Produkt mit einer zentralen GAATTCSequenz. Man kann nicht unbedingt erwarten, daß es auch für die untersuchten Mutanten eine spezifische Sequenz bereithält. So ist zum Beispiel keine GGATCCSequenz vorhanden. Demgemäß wurde auch für die G140A/N141S-Mutante der Ansatz einer Leiter von Banden und damit eine unspezifische Bindung gefunden. Für die G140A/N141A-Mutante reichten die eingebrachten Konzentrationen nicht für die Detektion einer Bindung aus. Das Verhalten der G140S/R145K und der G140S/N141S/R145K-Mutanten ist noch schwerer zu deuten, weil sie zwar eine Retardation des Shiftsubstrates verursachen, aber nicht zu definierten Banden führten. Eine mögliche Erklärung ist, daß diese Enzyme zwar an die DNA binden, diese Komplexe aber während der Elektrophorese nicht stabil sind, sondern das Shiftsubstrat sukzessive verlieren. So kommt es zu einem Schmier zwischen der Wanderungsposition der freien DNA und der Position des Komplexes mit dem höchsten Molekulargewicht, der nach den Gelen bei etwa sechs Enzymdimeren auf einem DNA-Substrat liegt. Die als Shiftsubstrate getesteten Oligonukleotide, mit denen aufgrund ihrer geringen Größe nur ein Bindungskomplex gebildet werden kann, zeigen, daß weder die GAATTC- noch die GGATCC-Sequenz gebunden werden. Daß mit diesen Substraten, die ja in 10fach höherer molarer Konzentration eingesetzt wurden, im Gegensatz zum längeren 174Bp-Shiftsubstrat keine Bindung zu sehen war, ist nicht verwunderlich, da letzteres für eine unspezifische Diskussion 101 Bindung bei einer Bedeckungslänge von gut 10Bp etwa 160 unspezifische Bindungsstellen und damit dann doch wieder eine höhere Konzentration von ihnen bereitstellt. Allerdings gab es die Möglichkeit, daß die modifizierten Oligonukleotide eine sequenzspezifische Bindung ermöglichen würden. Eine solche Bindung war aber nicht detektierbar. Als typischer Test hinsichtlich der katalytischen Aktivität wurde den Enzymen λ-DNA (48,5kBp) als Substrat zur Verfügung gestellt, auf welcher nur wenige Restriktionsenzyme ihre spezifische Sequenz nicht finden. Weiterhin wurden Kinetiken mit nicht methylierter λ-DNA (dam-, dcm-) durchgeführt. Die dam-Methylierung dient in E.coliZellen der gerichteten Mismatch-Reparatur nach der Replikation und auch der Kontrolle des Replikationsstartes. Bei der palindromen Sequenz GATC erfolgt die Methylierung am Adenin. Diese Sequenz entspricht dem Zentrum der BamHI-Erkennungssequenz, so daß die Methylierung vor einer BamHI-Spaltung schützt. Bei beiden DNA-Typen als Substrat kam es bei den Mutanten mit dem Hexahistidintag zu einem unspezifischen Abbau der DNA, ohne daß ein spezifisches Bandenmuster erkennbar gewesen wäre. Das kann unter anderem in der unsauberen Qualität dieser Enzyme begründet liegen. Spaltaktivitäten der StrepTag II-Mutanten wurden nur mit unmethylierter λ-DNA als Substrat getestet. Auch hier wurde ein unspezifischer Abbau beobachtet, wenn auch nicht in so starkem Ausmaß wie bei den Hexahistidin-Mutanten. Bei den Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII trat zum ersten Mal ein transientes Bandenmuster auf, welches allerdings durch den unspezifischen Abbau überlagert wurde. Verunreinigungen mit unspezifischer Nuklease sind zwar nicht ungewöhnlich, stören normalerweise aber nicht, da die spezifische Spaltaktivität früher einsetzen sollte als ein unspezifischer Abbau durch Nukleasen. Bei den hier vorgestellten Enzymen kommt es aufgrund ihrer stark eingeschränkten Spaltaktivität zu einer sehr starken Konkurrenzsituation zwischen unspezifischer und spezifischer Spaltung. Bei den Mutanten G140A/N141A und G140A/N141S liegt ein erhöhter Monomeranteil vor, was sich in einem unspezifischen DNA-Abbau durch die Enzyme selbst äußern könnte. Für Mutanten mit stark beeinträchtigter Dimerisierungsfähigkeit wurde nachgewiesen, daß sie selber Einzelstrangspaltungen mit nicht detektierbarer 102 Diskussion Sequenzspezifität durchführen [Vennekohl, 1999]. Sie verhalten sich also so, als ob ihr katalytisches Zentrum ohne eine Kopplung an eine Sequenzerkennung aktiv würde. Diese „Nicking“-Aktivität wird nur durch die geringe Affinität für DNA gezügelt. Es ist also nicht auszuschließen, daß ein Teil des unspezifischen Abbaus der DNA auf den Mutanten selbst beruht. G140S/R145K und G140S/N141S/R145K zeigen zwar ein vor dem Hintergrund des unspezifischen Abbaus kurzzeitig auftretendes Bandenmuster, dieses ist jedoch nicht analog zu dem des Wildtypenzyms und läßt sich nicht definierten Bandengrößen zuordnen. Es ist auch nicht klar, ob dieses Muster der vollständigen Spaltung oder nur einer Partialspaltung zuzuordnen ist. Immerhin ist das Angebot an unspezifischen Sequenzen in einem so langen Substrat so groß, daß ein derart inaktives Enzym wie diese Mutanten Schwierigkeiten hat, eine spezifische Sequenz zu finden. Aus diesem Grund wurden Spaltungen mit kürzeren DNA-Sequenzen durchgeführt (Oligonukleotide). Die Spaltaktivität wurde mit den verschiedenen Oligonukleotiden (siehe Tabelle 3.7) und allen Mutanten getestet. Bei den modifizierten Oligonukleotiden wurde Thymin durch Uracil und/oder Adenin durch Inosin substituiert. Die Erwartungen an eine Uracilsubstitution bestand darin, bei einem Aminosäureaustausch an Position 140 mehr Raum zu schaffen für längere Seitenketten. Im Fall des Inosins besteht ein potentieller Kontaktpunkt an Position 141 für das Serin, welches Wasserstoffbrückenbindung sowohl geben als auch empfangen kann. Die Kombination beider Austausche beeinhaltet beide Effekte. Als weiteres Substrat wurde die BamHISequenz angeboten. Keines der getesteten Oligonukleotide wurde von den Mutanten gespalten. Beim Wildtypenzym trat eine residuelle Aktivität auf dem Uracil-substituierten Oligonukleotid auf, beschrieben wurde dieses schon früher [Jeltsch et al., 1993]. Zusammenfassend sprechen die hier angeführten Ergebnisse hinsichtlich der katalytischen Aktivität der Mutanten dafür, daß es sich bei dem Bandenmuster der Mutanten G140S/R145K und G140S/N141S/R145K auf λ-DNA weder um ein EcoRI-spezifisches noch um ein BamHI-spezifisches Spaltmuster handeln kann. Es muß eine neue Spaltaktivität entstanden sein, die von unspezifischer Spaltung maskiert wird und nur geringe Aktivität besitzt, so daß mit den bis jetzt getesteten Bedingungen keine eindeutige Aussage gemacht werden kann, an welcher Position diese Katalyse Diskussion 103 stattfindet. Dieses Ergebnis mag auf den ersten Blick enttäuschend erscheinen. Es ist aber tatsächlich ein großer Schritt vorwärts, da es bisher nicht gelungen ist, irgendein Restriktionsenzym in seiner Sequenzspezifität so zu verändern, daß eine veränderte natürliche DNA-Sequenz gespalten wurde. Die meisten Mutanten spalten mit zum Teil drastisch verringerter Aktivität die kanonische Sequenz. So konnte von der PvuII eine Mutante generiert werden, die eine starke Bindung zu der degenerierten Sequenz CANNTG zeigte, aber auch nur in der spezifischen Erkennungssequenz CAGCTG spalten konnte [Nastri et al., 1997]. Eine bevorzugte Spaltung synthetischer DNA-Sequenzen mit unnatürlichen Basen wie zum Beispiel Uracil [Lanio et al., 1996; Küster, 1998] war das bisher beste Ergebnis einer Spezifitätsänderung. Dies zeigt, daß neben der direkten Basenerkennung noch weitere Faktoren eine Rolle für die Sequenzspezifität der Restriktionsenzyme spielen. Bei der EcoRI sind das im Wesentlichen vier Faktoren, die bei der Planung der hier vorgestellten Mutanten erst einmal bewußt außer Acht gelassen wurden. 1. Die Erkennungssequenz wird von dem Enzym so deformiert, daß die große Furche für die Kontaktaufnahme mit den Basen aufgeweitet wird. Dazu sind Phosphatkontakte direkt neben und genau in der Mitte der Erkennungssequenz wichtig [Kurpiewski et al, 1996]. Dabei wird die Stapelwechselwirkung zwischen den zentralen AT-Basenpaaren teilweise aufgehoben und diese erscheinen zum nächstäußeren AT-Basenpaar gekippt. Diese Stellung wird durch eine Dreizentren-Wasserstoffbrücke stabilisiert, die so nur in der Sequenz AATT möglich erscheint. Der Beitrag der DNA-Feinstruktur und ihrer Flexibilität auf eine so intensive Interaktion mit einem Protein ist noch weitgehend unerforscht. So kann nicht vorhergesagt werden, ob zum Beispiel die in dieser Arbeit angestrebte innere Erkennungssequenz GATC den Anforderungen der Deformierbarkeit durch eine EcoRI-Mutante genügen kann. 2. Die Bedeutung der Phosphatkontakte für die Sequenzerkennung und ihre Wechselwirkung mit den Basenkontakten ist auch noch wenig untersucht. Immerhin sind die Phosphodiesterbindungen des äußeren AT-Basenpaares, dessen Kontakte in dieser Arbeit verändert wurden, direkt (GpA wird gespalten) oder indirekt 104 Diskussion (ApA aktiviert das angreifende Nukleophil) in die Katalyse involviert. Die R145KMutation betrifft auch den Kontakt zum zu spaltenden Phosphat, allerdings ohne daß diese Einzelmutation die Katalyse zu stark beeinträchtigen würde (die R145K-Mutante hat eine nur 50fach verringerte Aktivität [Wolfes et al., 1986]). Die Lysinreste 117 und 130, die den Phosphodiesterbindungen zwischen den Pyrimidinen der Erkennungssequenz nahe kommen, konnten beide mit nur geringem Aktivitätsverlust gegen Glutamatreste ausgetauscht werden [Windolph et al., 1997; Rosati, 1999]. So scheint dieser Beitrag nicht so kritisch für den Kontakt des Enzyms zur DNA zu sein. 3. Aufgrund der Kürze der Erkennungsequenz sind die Basenkontakte alle auf engem Raum lokalisiert und durch direkte oder Wasser-vermittelte Kontakte untereinander verzahnt. Eine gegenseitige Beeinflussung ist deshalb zu erwarten. Allerdings darf die Möglichkeit einer Adaption an die geänderte Struktur nicht außer Acht gelassen werden. 4. Die Kopplung der Spaltung an die Bindung einer DNA-Sequenz stellt die größte Hürde für die Generierung einer neuen Spezifität eines Restriktionsenzyms dar. Sie ist der wichtigste Faktor für ihre hohe Genauigkeit. So werden abweichende Sequenzen zum Teil gebunden aber nur sehr langsam oder gar nicht gespalten [Thielking et al., 1990; Lesser et al., 1990]. Die Spaltung ist dann auch nicht mehr konzertiert in beiden Einzelsträngen, sondern ein Einzelstrang wird deutlich vor dem anderen gespalten, so daß eine Dissoziation des Enzyms von dieser Sequenz vor der Spaltung des zweiten Stranges wahrscheinlich ist. In vivo gibt das Anlaß für eine einfache Reparatur solch fehlerhafter Ereignisse durch die DNALigase [Taylor et al., 1990]. Diese strikte Kopplung ist molekular noch wenig verstanden. Gln115, das im gleichen Faltblattstrang neben den Aminosäuren des katalytischen Zentrums steht (Glu111, Lys113), spielt dadurch eine wichtige Rolle, daß es Wasserstoffbrückenbindungen zu Peptidbindungen in der Extended chain ausbildet [Jeltsch et al., 1993]. Gleichzeitig macht es aber auch einen hydrophoben Kontakt zum inneren Thymin. Weitere Faktoren müssen für die Kopplung eine Rolle spielen, da in den asymetrischen Starsequenzen das katalytische Zentrum der Untereinheit zuerst spaltet, die weniger Kontakte zu dieser Sequenz ausbilden kann [Thielking et al., 1990]. Das setzt eine Kopplung zwischen den Diskussion 105 beiden Untereinheiten voraus, die unabhängig von Gln115 sein sollte. Außerdem waren in einem heterodimeren Enzym aus einer Wildtypuntereinheit und einer im katalytischen Zentrum inaktivierten Mutante beide Untereinheiten katalytisch inaktiv [Vennekohl, 1999]. Wie stark sich die Beeinträchtigung von Basenkontakten auf die Kopplung an die DNA-Spaltung auswirkt, ist deshalb nur schwer vorherzusagen. Allerdings kann man erwarten, daß kürzere Aminosäureseitenketten eher die Möglichkeit haben, sich strukturellen Anforderungen anzupassen, vor allem wenn so wie bei den hier untersuchten Mutanten mehrere Austausche nebeneinander durchgeführt werden. Insofern ist es sehr positiv, daß für die G140S/N141S/R145K-Mutante eine, wenn auch sehr schwache Spaltaktivität detektierbar war. Sie zeigt, daß eine Spezifitätsänderung der EcoRI überhaupt möglich ist. Hauptteil anschließender Experimente muß sein, die Spaltaktivität zu steigern. So wurden EcoRI-Mutanten beschrieben, welche die Stringenz der Kopplung mindern und so zu einer Aktivierung des Enzyms führen [Heitman et al., 1990]. Solche Mutationen führen auch im Kontext mit Mutationen von Basenkontakten zu einer Steigerung der Spaltaktivität [Küster, 1998]. Außerdem ist es möglich, die hier beschriebenen Kombinationen von Mutationen in den Kontext eines heterodimeren Enzyms so zu überführen, daß nur eine Halbseite der Erkennungssequenz betroffen ist. Das wäre zum Beispiel die Kombination einer Untereinheit einer G140S/N141S-Doppelmutante mit einer Untereinheit einer R145KEinzelmutante [Vennekohl, 1999]. Das könnte die Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität mildern, da dann nur die Hälfte der Kontakte verändert wären. So wurde mit den in dieser Arbeit untersuchten Mutanten die Grundlage geschaffen, die Veränderbarkeit der DNA-Erkennung durch die Restriktionsendonuklease EcoRI weiter zu untersuchen und zu Enzymen zu kommen, die auch im Routinelaborbetrieb einsetzbar sind. 106 5 Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Die Restriktionsendonuklease EcoRI erkennt spezifisch die DNA Sequenz GAATTC über ein sehr komplexes und redundantes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, ionischen und van der Waals-Kontakten. Innerhalb dieses Netzwerkes bilden Gly140, Asn141 und Arg145 Kontakte zum äußeren A/T Basenpaar. Um eine Spezifitätsänderung des Enzyms in Richtung eines G/C Basenpaars herbeizuführen, was in der Erkennung der BamHI Sequenz GGATCC resultieren würde, wurden vier Mutanten erzeugt: die Doppelmutanten G140A/N141A, G140A/N141S und G140S/R145K sowie die Tripelmutante G140S/N141S/R145K. Diese Aminosäureaustausche erscheinen geeignet, ein G/C-Basenpaar gegenüber einem A/T-Basenpaar zu bevorzugen. Nach zielgerichteter Mutagenese wurden die beschriebenen Mutanten mit einem Hexahistidintag für die Affinitätschromatographie aufgereinigt. Es konnte jedoch keine saubere Aufreinigung erzielt werden, was in einer strukturellen Instabilität der Mutanten begründet liegt. Durch die Zugabe von Kalzium während des Aufreinigungsverfahren konnte zwar eine verbesserte Stabilität der Mutanten beobachtet werden, es kam jedoch zur Aggregation der aufgereinigten Enzyme. Aus diesem Grund erfolgte eine Umklonierung in das StrepTag II-System, das eine nahezu homogene Aufreinigung ermöglichte. Die Stabilisierung strukturell beeinträchtigter Mutanten durch Kalzium-Zugabe während des Aufreinigungsprozesses kann als wichtige Errungenschaft dieser Arbeit angesehen werden. Die aufgereinigten Proteine zeigten nur eine sehr geringe, unspezifische Bindung auf den bis jetzt getesteten Substraten. Sequenzspezifische DNA-Spaltung konnte nur für die Mutanten G140S/R145KStrepII und G140S/N141S/R145KStrepII detektiert werden. Die Dreifachmutante zeigt auf unmethylierter λ-DNA ein Bandenmuster, welches weder dem normalen oder dem relaxierten Muster der EcoRI noch dem BamHI-Muster zugeordnet werden kann. Durch die sehr geringe Spaltaktivität verbunden mit einer Kontamination mit unspezifischer Nuklease, läßt sich keine eindeutige Aussage über die gespaltene Sequenz machen. Um eine Restspaltaktivität der Mutanten zu finden, wurden kurze Oligonukleotide mit der EcoRI-Sequenz und Modifikationen davon (am äußeren A/T Basenpaar zu Inosin, Uracil sowie zu beiden) als Substrat eingesetzt. Weiterhin wurde die BamHI-Erkennungssequenz getestet. Auch unter verschiedenen Pufferbedingungen konnte bei keinem der Oligonukleotidsubstrate eine Spaltung durch die Mutanten beobachtet werden. Daraus folgt, daß die Mutante G140S/N141S/R145K eine andere, bis jetzt noch nicht identifizierte DNA Sequenz erkennt und spaltet, was als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft angesehen werden kann. Summary 6 107 SUMMARY Daniela Gerschon Proteindesign in order to change the sequence specifity of the restriction endonuclease EcoRI The restriction endonuclease EcoRI recognizes very specifically the DNA sequence GAATTC via a highly complex and redundant network of hydrogen bonds, ionic and van der Waals contacts. Within this network Gly140, Asn141 and Arg145 contact the outer A/T basepair. To change the specifity of the enzyme towards a G/C basepair resulting in the recognition of a BamHI canonical sequence GGATCC, four mutants were created: the double mutants G140A/N141A, G140A/N141S and G140S/R145K as well as the triple mutant G140S/N141S/R145K. These amino acid exchanges are likely to favour a G/C basepair above an A/T basepair. After site directed mutagenesis the described mutants have been expressed with a hexahistidine tag to perform affinity chromatography. Unfortunately structural instability led to a poor yield of mutant proteins that could not be purified without contamination. Addition of calcium ions to purification buffers increased their stability but the purified proteins tended to aggregate. Therefore the StrepTag II has been cloned to the mutants allowing an effective purification almost to homogeneity. Stabilisation of structurally impaired mutants by calcium ions in the stage of purification is a major achievement of this work. The purified proteins showed only a weak DNA binding ability which appear to be without sequence preference on the substrates used so far. Sequence specific DNA cleavage could only be detected for the mutants G140S/R145KStrepII and G140S/N141S/R145KStrepII. The triple mutant cuts unmethylated λ DNA with a unique cleavage pattern that resembles neither an EcoRI canonical or star pattern nor a BamHI pattern. The very low cleavage activity together with a contamination by an unspecific nuclease prevents the identification of the sequences cleaved. In order to detect a residual cleavage activity, short oligonucleotides comprising the EcoRI recognition site and sequences modified at the outer A/T basepair to inosine, uracil or both were used as a substrate. In addition the BamHI canonical site was tested. None of the oligonucleotide substrates has been cleaved by the mutants under varied buffer conditions. Therefore the triple mutant G140S/N141S/R145K have to recognize and cut an entirely different DNA sequence, which has not been identified yet. It is a very promising starting point for further investigations. 108 7 Literaturverzeichnis LITERATURVERZEICHNIS Alves, J., Pingoud, A., Langowski, J., Urbanke, C., and Maass, G. (1982) Two identical subunits of the EcoRI restriction endonuclease co-operate in the binding and cleavage of the palindromic substrate Eur. J. Biochem. 124, 139-142 Alves, J., Rüter, T., Fliess, A., Maass, G., and Pingoud, A. (1989a) Changing the hydrogen bonding potential in the DNA binding site of EcoRI by site directed mutagenesis drastically reduces the enzymatic activity, not however, the preference of this restriction endonuclease for cleavage within the site -GAATTCBiochemistry 28, 2678-2684 Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., and Pingoud, A. 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Herrn Rolf Mull-Grotefend für die technische Assistenz „in letzter Minute“ und die „netten Pausen“ Herrn Dr. Olaf Rosati für seine Hilfsbereitschaft und Geduld allen nicht erwähnten Mitgliedern der Abteilungen Biophysikalische Chemie und Biochemisch-Biophysikalische Verfahren, die durch ein seeeeehr nettes Arbeitsklima zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben den Mitgliedern des Chemikaliencenters für das „Einspringen in der Not“ und die große Zuneigung, die sie Lisa entgegengebracht haben meiner Familie und meinen Freunden für ihre Unterstützung in allen Lebenslagen
