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I Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Abteilung Innere Medizin IV der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. HÄMANGIOBLASTOME DES ZENTRALEN NERVENSYSTEMS UND DIE VON HIPPEL-LINDAU KRANKHEIT INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2001 von Sven Gläsker geboren in Bünde II Dekan Prof. Dr. M. Berger 1. Gutachter Prof. Dr. H.P.H Neumann 2. Gutachter Prof. Dr. J. Zentner Promotionsjahr 2002 III Meinen Eltern Wolfgang und Angela Gläsker IV INHALT 1 EINLEITUNG 1 1.1 Das Hämangioblastom des ZNS 1 1.1.1 Klinik und Einteilung 1 1.1.2 Diagnostik und Therapie 3 1.2 Die von Hippel-Lindau Krankheit 5 1.2.1 Klinik und Einteilung 5 1.2.2 Diagnose der von Hippel-Lindau Krankheit 7 1.3 Genetische Grundlagen 8 1.3.1 Mechanismen der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen 10 1.3.2 Das VHL-Gen 11 1.4 Fragestellung 13 1.4.1 Genetische und klinische Diagnostik bei patienten mit Hämangioblastom 13 1.4.2 Molekulare Pathogenese des Hämangioblastoms 13 2 MATERIAL UND METHODEN 15 2.1 Material 15 2.1.1 Geräte 15 2.1.2 Enzyme 16 2.1.3 Nukleotide und Nukleinsäuren 16 2.1.4 Chemikalien 17 2.1.5 Lösungen 18 2.2 Methoden 23 2.2.1 Register 23 2.2.2 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut 24 2.2.3 DNA-Extraktion aus Tumorgewebe 25 2.2.4 Polymerasekettenreaktion 26 2.2.5 Agarosegel-Elektrophorese 28 2.2.6 Acrylamidgel-Elektrophorese 28 2.2.7 Single-Stranded Conformational Polymorphism (SSCP) Analyse 29 2.2.8 Sequenzierung 31 2.2.9 Southern Blotting 31 2.2.10 Verlust der Heterozygotie (LOH) 35 V 2.2.11 Untersuchung der Hypermethylierung 39 2.2.11 Statistik 41 3 ERGEBNISSE 42 3.1 Register 42 3.2 Untersuchung der Blutproben 44 3.2.1 Genetisches VHL-Screening 44 3.2.2 Genotypen 46 3.2.3 Asymptomatische Hämangioblastome 49 3.2.5 Sensitivität 50 3.2.5 Genotyp-Phänotyp Korrelationen 50 3.1.6 Kosten 52 3.3 Analyse der Tumorproben 52 3.3.1 Ergebnisse der SSCP-Analyse 53 3.3.2 Verlust der Heterozygotie (LOH) 54 3.3.3 DNA Methylierung 56 3.3.4 Synopsis 57 4 DISKUSSION 59 4.1 Molekulargenetische Diagnostik 59 4.1.1 Primär symptomatische Hämangioblastome 59 4.1.2 Asymptomatische Hämangioblastome 62 4.1.3 Genotyp-Phänotyp Korrelationen 62 4.1.4 Bedeutung der molekulargenetischen Diagnostik 63 4.2 Die molekulare Pathogenese des Hämangioblastoms 66 4.2.1 Intragenische Mutationen des VHL-Gens 66 4.2.2 Allelverluste 68 4.2.3 DNA Methylierung 69 4.2.4 Die Pathogenese VHL-assoziierter und sporadischer Hämangioblastome 70 5 Zusammenfassung 73 6 Literatur 74 7 Danksagung 87 8 Lebenslauf 88 VI Abkürzungen APS Ammoniumpersulfat ASCO American Society of Clinical Oncology ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare c Nukleotid CpG Dinukleotid aus Cytosin und Guanosin CTP Cytosintriphosphat DIG Digoxigenin DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat Fab Antigenbindendes Fragment GTP Guanosintriphosphat LOH Loss of Heterozygosity MDE Mutation Detection Enhancement MIBG Metaiodobenzylguanidin NTP Nukleotidtriphosphat PCR Polymerasekettenreaktion RNA Ribonukleinsäure SD Standardabweichung SDS Natriumlaurylsulfat SSC Salz aus Natriumchlorid und Natriumzitrat SSCP Single-Stranded Conformational Polymorphism TE Tris-EDTA TBE Tris-Borsäure-EDTA TEMED N, N, N´, N´-Tetramethylmethylendiamin TNE Tris-Natrium-EDTA TTP Thymidintriphosphat UTP Uridintriphosphat UV ultraviolett VHL von Hippel-Lindau WHO World Health Organization w/v Gewicht pro Volumen ZNS Zentrales Nervensystem 1 1 Einleitung 1 Einleitung Hämangioblastome des Zentralen Nervensystems (ZNS) sind histologisch gutartige Tumore, die bevorzugt in der hinteren Schädelgrube auftreten. Der schwedische Pathologe Arvid Lindau erkannte im Jahre 1927 einen Zusammenhang zwischen dem Hämangioblastom und einem Netzhauttumor, dem retinalen Angiom (Lindau 1927), für das der deutsche Ophthalmologe Eugen von Hippel die klassische Beschreibung publizierte (von Hippel 1904). Harvey Cushing wurde auf Lindaus Erkenntnisse aufmerksam und stufte sie als wichtige neue Krankheitsentität ein. Er gab ihr den Namen Lindau´sche Krankheit (Fulton 1946). Im Laufe der Jahre erweiterte sich die Nosologie des später als von Hippel-Lindau Krankheit bezeichneten Tumorsyndroms, und es wurde die Beteiligung von Niere, Nebenniere und Pankreas erkannt. Weitere Läsionen folgten. Die Beteiligung der verschiedenen Organsysteme bei dieser Phakomatose hat immer eine Herausforderung für die Medizin dargestellt. Insbesondere seit der Entdeckung des VHL-Tumorsuppressorgens im Jahre 1993 (Latif et al. 1993) hält diese Krankheit sowohl die klinische als auch die Grundlagenforschung in Atem, und nimmt durch ihren paradigmatischen Charakter einen zentralen Stellenwert in der Krebsforschung ein. Im Folgenden werden die klinischen und molekulargenetischen Grundlagen dieser Krankheit erläutert. 1.1 Das Hämangioblastom des ZNS 1.1.1 Klinik und Einteilung Hämangioblastome des ZNS sind histologisch gutartige Tumore (Bohling et al. 2000), die zumeist in der hinteren Schädelgrube oder im Rückenmarks lokalisiert sind. Sie können sporadisch oder familiär als Manifestation der später näher beschriebenen von Hippel-Lindau Krankheit auftreten. In histologischer Hinsicht bestehen Hämangioblastome aus zwei verschiedenen Komponenten: Zwischen gut abgrenzbaren, manchmal teleangiektatisch erweiterten Kapillaren befinden sich Trabekel großer Stromazellen, die durch ihre Lipidbeladung schaumig imponieren (siehe Abb. 1A). Obwohl es inzwischen klare Hinweise darauf gibt, dass nicht die 2 1 Einleitung Kapillarendothelien, sondern die interstitiellen Zellen entartet sind (Lee et al. 1998), ist die Herkunft des Hämangioblastoms ist noch nicht vollständig geklärt. Die Inzidenz des Tumors beträgt 1 bis 2,5 % aller intrakraniellen Neoplasien (Ferrante et al. 1984) und 7 - 12 % aller Tumore der hinteren Schädelgrube (Palmer 1972). Typischerweise wachsen die Tumore mit einer großen Zyste, die wandständig einen kleinen soliden Anteil, den eigentlichen Tumor, enthält (siehe Abb. 1A). Die Zysten enthalten eine bernsteinfarbene Flüssigkeit und formieren sich im Bereich des Rückenmarks zu Syringen. Als paraneoplastische Erscheinung enthält diese Flüssigkeit in hohem Maße Erythropoietin (Neumann 1995), welches jedoch im Serum normale Werte aufweist und meist nicht mit einer Polyglobulie einhergeht (Neumann et al. 1991). 1A A B Abbildung 1A und B: Typischer radiologischer und histologischer Befund eines Hämangioblastoms. A) T2 gewichtetes Kernspintomogramm in sagittaler Schichtung mit Gadolinium als Kontrastmittel. Typischer Befund in der hinteren Schädelgrube mit großem zystischen Anteil und einem kleinen, randständigen und soliden Tumoranteil (schwarzer Pfeil). B) Hämatoxylin-Eosin Färbung eines soliden Tumorteils. Neben Kopfschmerzen stehen bei den infratentoriellen Tumoren Übelkeit, Ataxie, Nystagmus, Vertigo und Dysmetrie im Vordergrund, während die spinalen Tumore fokale neurologische Defizite auf und unterhalb Läsionshöhe aufweisen (Jones et al. 1992). Trotz ihres histologisch gutartigen Erscheinens und des langsamen Wachstums haben Hämangioblastome eine hohe Mortalität (Lamiell et al. 1989; Maher et al. 1990; Neumann 1987) und stellen die häufigste Todesursache bei VHL-Patienten dar (Maher et 3 1 Einleitung al. 1997). Verantwortlich dafür sind expandierende Tumorzysten, die zu einer akuten Beeinträchtigung der Liquorzirkulation führen können. Weiterhin bereitet das multiple Auftreten der Tumore bei VHL-Patienten häufig Schwierigkeiten. 1.1.2 Diagnostik und Therapie Für die primäre Diagnostik und Verlaufsbeobachtung der Tumore ist die Kernspintomographie mit Gadolinium als Kontrastmittel das Verfahren der Wahl (Filling-Katz et al. 1991; Resche et al. 1993). Dabei müssen differentialdiagnostisch die zystische Form des Astrozytoms, das Medulloblastom und das Ependymom abgegrenzt werden (Naidich et al. 1977). Ebenso kommen Metastasen, so insbesondere Absiedlungen des klarzelligen Nierenkarzinoms in Betracht (Resche et al. 1993). Liegen entsprechende OP-Indikationen vor, besteht die Therapie klassischerweise in einer mikrochirurgischen Exzision des Tumors. Weiterhin wird derzeit am Stanford University Medical Center eine weniger invasive radiochirurgische Technologie mit guten vorläufigen Ergebnissen bei VHL-Patienten getestet (Chang et al. 1998). Die Gruppe setzt für einige der Tumore ein neu entwickeltes radiochirurgisches Instrument namens „Cyberknife“ ein, welches einen von einem Roboterarm gesteuerten Linearbeschleuniger verwendet. Eine für den Patienten unangenehme Fixierung des Schädels in einem Rahmen ist hierbei nicht nötig (s. Abb. 2c) (Adler et al. 1997). In der Studie wurden bei 13 VHL-Patienten insgesamt 29 Tumore mit durchschnittlich 23,2 Gy behandelt. Nur einer der Tumore setzte sein Wachstum fort, die restlichen wurden im Wachstum aufgehalten, wurden kleiner oder verschwanden. Abbildung 2 A und B zeigen ein Beispiel für ein Hämangioblastom, das mit dem Cyberknife behandelt wurde. 4 A 1 Einleitung B C Abbildung 2: Hämangioblastom (Pfeil) im Zervikalmark vor (A) und 7 Monate nach (B) Behandlung mit dem Cyberknife (C). Einzelheiten im Text. Mit freundlicher Genehmigung von John R. Adler, M.D., Stanford University Medical Center. Beim rechtzeitigen Erkennen der von Hippel-Lindau Krankheit und adäquater Behandlung des Tumors ist die Prognose des Hämangioblastoms per se aufgrund der modernen mikrochirurgischen Behandlungsmöglichkeiten sehr gut. 5 1 Einleitung 1.2 Die von Hippel-Lindau Krankheit 1.2.1 Klinik und Einteilung Die von Hippel-Lindau Krankheit ist eine hereditäre Multisystemerkrankung. Sie wird autosomal dominant vererbt und besitzt eine bemerkenswerte phänotypische Variabilität. Im Folgenden werden die wesentlichen Läsionen im Einzelnen besprochen (s. Tab.1 und Abb. 3): RETINALE ANGIOME HÄMANGIOBLASTOME DES ZNS PANKREASZYSTEN PHÄOCHROMOZYTOME NIERENZYSTEN UND KARZINOME Abbildung 3: Häufige Manifestationen der von Hippel-Lindau Krankheit. Hämangioblastome des zentralen Nervensystems einschließlich der Retina sind bei den meisten Patienten die erste Manifestation der von Hippel-Lindau Krankheit (Maddock et al. 1996). Retinale Angiome treten häufig multipel auf und werden dann als Angiomatosis retinae bezeichnet. Unbehandelt führen sie oft ohne Prodromi zur Ablatio retinae und damit zur Erblindung. Werden sie aber rechtzeitig entdeckt, können sie meist gut mit einer Lasertherapie behandelt werden (Schmidt et al. 2000). Als Nierenveränderungen im Rahmen der von Hippel-Lindau Krankheit kommen Nierenzysten und klarzellige Nierenzellkarzinome vor. Nierenzysten sind dabei häufig, verursachen aber selten Beschwerden (Maher et al. 1990; Richard et al. 1994). Im Gegenteil dazu sind die Nierenkarzinome bei VHL-Patienten ein zentrales und für die Behandlung schwieriges Problem. Sie treten häufig multizentrisch und bilateral auf, 6 1 Einleitung wobei ein Teil der Tumore makroskopisch nicht zu identifizieren ist. Mehrfache Operationen wegen neuer Primärtumore sind daher meist unumgänglich. Um eine bilaterale Nephrektomie mit daraus resultierender terminaler Niereninsuffizienz zu vermeiden, werden die Patienten in Freiburg seit 1991, sofern möglich, organerhaltend operiert. Grundlage hierfür ist, dass Nierenkarzinome bei VHL-Patienten im Gegensatz zu sporadischen Nierenkarzinomen erst relativ spät metastasieren. So zeigte eine Studie von Neumann und Mitarbeitern, dass Nierenkarzinome bei VHL-Patienten im allgemeinen erst ab einer Größe von sieben Zentimetern metastasieren (Neumann et al. 1998). Die Tumore werden daher überwacht und bei einer Größe von etwa fünf Zentimetern organerhaltend entfernt (Neumann et al. 1997). Dadurch ergibt sich für VHL-assoziierte Nierenkarzinome im Vergleich zu sporadischen eine verbesserte Prognose. Voraussetzung dafür ist allerdings ein rechtzeitiges Erkennen der Hippel-Lindau Krankheit. Läsion Häufigkeit Manifestationsalter Retinales Angiom 57% 25,4 a Hämangioblastom des ZNS 61% 29,0 a Nierenkarzinom 22% 44,0 a Nierenzysten 33% Phäochromozytom 19% Pankreaszysten 14% Nebenhodenzystadenome 17% 20,2 a Tabelle 1: Wahrscheinlichkeit des Auftretens der häufigsten Läsionen bei unselektierten VHL-Patienten (Lamiell et al. 1989) und durchschnittliches Manifestationsalter (Maher et al. 1990). Phäochromozytome sind eine weitere Manifestation der Erkrankung. Aufgrund der meist verspätet gestellten Diagnose sind diese zumeist gutartigen, endokrin aktiven Tumore des Nebennierenmarks und Sympathikusgrenzstranges problematisch. Grund dafür sind die missverständlichen Symptome der Phäochromozytome wie Kopfschmerzen, Herzklopfen und Schweißausbrüche, sowie das junge Alter der Patienten bei VHL-assoziierter Manifestation. Durch Freisetzung von Adrenalin und Noradrenalin verursachen diese Neoplasien eine arterielle Hypertonie. Diagnostiziert werden die Tumore mittels Kernspintomographie, Metaiodobenzylguanidin (MIBG)Szintigraphie und Katecholaminbestimmung im 24h Sammelurin. Bemerkenswert ist die große Variabilität im Auftreten des Phäochromozytoms bei VHL-Patienten. Bei bestimmten konstitutionellen Mutationen, den unten näher besprochenen Missense- 7 1 Einleitung Mutationen, kommt der Tumor häufig vor, während er sich bei anderen Mutationen mit umfangreicheren Alterationen des resultierenden VHL-Proteins kaum findet (Neumann et al. 1998). Auch beim Phäochromozytom ist die Diagnose der Hippel-Lindau Krankheit von laparoskopischen entscheidender Bedeutung, nebennierenerhaltenden da VHL-Patienten mit Phäochromozytom-Chirurgie der eine weniger invasive Therapie zur Verfügung steht (Neumann et al. 1999) und ein chirurgisch induziertes Addison-Syndrom vermieden werden kann. Als Pankreasveränderungen treten bei VHL-Patienten Pankreaszysten und in seltenen Fällen Inselzelltumore auf. Einen Beteiligung des Pankreas ist bei der Hippel-Lindau Krankheit nicht selten, beschränkt sich aber meistens auf multiple Pankreaszysten. Die endokrin meist inaktiven Inselzelltumore treten seltener, sind dann allerdings häufig maligne. Weitere seltenere Manifestationen der Hippel-Lindau Krankheit sind Innenohrtumore (Kempermann et al. 1996), Nebenhodenzystadenome (de Souza Andrade et al. 1985) und sehr selten finden sich Astrozytome (Ng et al. 1999). Die Lebenserwartung der betroffenen Patienten ist bei unselektierten VHL-Patienten um etwa 15 bis 20 Jahre vermindert (Maher et al. 1990). 1.2.2 Diagnose der von Hippel-Lindau Krankheit Die große Vielfalt und Variabilität der genannten Läsionen hat zur Folge, dass die Diagnose meist Jahre zu spät gestellt wird (Maddock et al. 1996). Die Kriterien zur Diagnosestellung wurden erstmals 1964 von Melmon und Rosen definiert (Melmon et al. 1964), und von Neumann, Maher und Choyke entsprechend der genotypischen Daten modifiziert (Neumann 1987; Maher et al. 1990; Choyke et al. 1995) und lauten heute unter Einbeziehung der Gendiagnostik wie folgt: Die Diagnose der von Hippel-Lindau Krankheit wird dann gestellt, wenn ein Patient ein retinales oder zentralnervöses Hämangioblastom hat und zusätzlich (I) eine weitere Läsion aus Tabelle 1 oder (II) einen Verwandten mit einer Läsion aus Tabelle 1 oder (III) einen positiven molekulargenetischen Test aufweist. Die betroffenen Personen sowie auch deren asymptomatische mutationstragende Verwandte benötigen eine lebenslange intensive Betreuung und müssen etwa jährlich einem aufwendigem klinischen Screeningprogramm unterzogen werden. 8 1 Einleitung Hier eröffnet die molekulargenetische Diagnostik neue Perspektiven, die es ermöglichen, die Erkrankung bei asymptomatischen Familienmitgliedern festzustellen oder auszuschließen und damit ein gezieltes Familienscreening durchzuführen. Das klinische Screeningprogramm ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Klinisches VHL Screening-Programm Kernspintomographie des Gehirns mit Kontrastmittel Kernspintomographie des Rückenmarks mit Kontrastmittel Kernspintomographie oder Computertomographie des Abdomens Augenärztliche Untersuchung (Retinoskopie) Katecholaminbestimmung im 24 h Urin Tabelle 2: Klinisches Screeningprogramm für potentielle VHL-Patienten (Neumann 1987). Die Untersuchungen sollten jährlich durchgeführt werden. Der großen phänotypischen Variabilität der Hippel-Lindau Krankheit, die mit Genotypen korreliert, ist man mit einer Einteilung in Untergruppen nachgekommen (Neumann und Bender 1998). Die Familien mit VHL Typ 1 können sämtliche Manifestationen der Krankheit außer dem Phäochromozytom bekommen. Bei den Familien mit Phäochromozytom (VHL Typ 2) unterscheidet man drei Subgruppen. Typ 2A ohne Nierenzellkarzinom, Typ 2B mit Nierenzellkarzinom und Typ 2C, bei denen das Phäochromozytom als einzige Manifestation der Hippel-Lindau Krankheit vorkommt. Neuste Genotyp-Phänotyp Studien der Freiburger Gruppe zeigen allerdings, dass die Typisierung lediglich ein Dominieren der Tumortypen kennzeichnet. So kommen beim Typ 2A sehr selten auch Nierenkarzinome, beim Typ 2C sehr selten auch retinale Angiome vor. Es fällt auf, dass sich bei VHL Typ 2 zu 96 % Missense-Mutationen finden. Ursache der Hippel-Lindau Krankheit ist eine konstitutionelle Mutation des VHL Tumorsuppressorgens. Im nächsten Abschnitt werden die Grundlagen der Tumorsuppressorgene und insbesondere des VHL-Gens beleuchtet. 1.3 Genetische Grundlagen Es gilt als erwiesen, dass Tumore durch Veränderungen in der DNA entstehen. Dabei spielt die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen sowie die Aktivierung von 9 1 Einleitung Protoonkogenen eine entscheidende Rolle. Alfred Knudson stellte dazu schon im Jahre 1971, lange vor der Entdeckung der genannten Krebsgene, anhand statistischer Berechnungen ein Postulat auf, das als "two hit"- Theorie bekannt wurde und auch heute noch für die Pathogenese vieler Tumore als zentrales Dogma angesehen wird. Er postulierte, dass das Retinoblastom, ein seltener kindlicher Augentumor, durch zwei sukzessive Läsionen im Genom ausgelöst wird (Knudson 1971). Diese beiden Läsionen seien aufgrund der Diploidie des menschlichen Genoms vonnöten. Dabei sollte der Mechanismus bei der erblichen und bei der sporadischen Form des Tumors derselbe sein. Bei der erblichen Form läge nach Knudson die erste Läsion bereits in der konstitutionellen DNA vor und die zweite erfolge somatisch. Bei der sporadischen Form hingegen seien beide Mutationen somatisch (siehe Abb. 4). Familiäre Tumorentstehung ↓ Sporadische Tumorentstehung ↓ Konstitutionelle Mutation Keimzelle Somatische Mutation 1. Somatische Mutation Somat. Zelle 2. Somatische Mutation Tumoretstehung Tumoretstehung Abbildung 4: Die klassische "two hit"-Theorie basierend auf statistischen Analysen von Alfred Knudson. Vergleich zeitlicher Mutationsabfolge bei familiären und sporadischen Tumore. Beim familiären Tumor ist die erste Mutation bereits in der Keimzelle vorhanden. Die Existenz von Genen, die die Entstehung von Tumoren unterdrücken, wurde erstmals 1914 von Theodor Boveri postuliert (Boveri 1914). Inzwischen wurden mehrere solcher Tumorsuppressorgene und die entsprechenden erblichen 10 1 Einleitung Tumorsyndrome entdeckt. Bekannte Beispiele sind neben dem VHL-Gen das p53 Gen (Vogelstein et al. 1989) beim Li-Fraumeni-Karzinomsyndrom, das Retinoblastomgen (Friend et al. 1986), die Wilms-Tumor-Gene (Francke et al. 1979), das Neurofibromatose Typ-1-Gen (Wallace et al. 1990) und das Adenomatöse Polyposis-coli-Gen (Forrester et al. 1987). Diese klassische „two hit“-Theorie wird auch als Mechanismus für die molekulare Pathogenese des Hämangioblastoms postuliert (Kanno et al. 1994; Lee et al. 1998; Oberstrass et al. 1996). 1.3.1 Mechanismen der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen Wie beschrieben führt die Inaktivierung beider Allele eines Tumorsuppressorgens zur Tumorentstehung. Dabei werden unterschiedliche Mechanismen der Inaktivierung diskutiert. Das erste Allel wird typischerweise durch eine innerhalb des Gens gelegene (intragenische) Mutation inaktiviert, welche durch die Single Stranded Conformational Polymorphism (SSCP)-Analyse oder durch einen Southern Blot nachgewiesen werden kann. Hierbei finden sich Punktmutationen, Mikrodeletionen, Mikroinsertionen und auch größere Deletionen. Die Inaktivierung des zweiten Allels geschieht charakteristischerweise durch einen Rekombinationsfehler, wobei größere Chromosomenabschnitte verloren gehen, die das entsprechende Wildtyp Allel enthalten. Diese lassen sich durch den Verlust der Heterozygotie (LOH) für polymorphe DNA Marker innerhalb oder nahe am Tumorsuppressorgen nachweisen (Marshall 1991). Seit einiger Zeit wird ein weiterer Mechanismus diskutiert: Die Inaktivierung eines Tumorsuppressorgens durch Hypermethylierung von Sequenzen seines Promoters, die reich an 5´-CG-3´ Dinukleotiden sind, sogenannter „CpG-islands“. Schon länger bekannt ist die Tatsache, dass Tumor-DNA ein verändertes Methylierungsmuster aufweist. Nicht in Inseln gelegene CpGs werden hypomethyliert, während die in CpG-Inseln dicht hypermethyliert werden (Antequera et al. 1990; Baylin et al. 1998; Jones 1996). Weiterhin weiß man, dass Gene durch Hypermethylierung ihres Promoters inaktiviert werden können. Dies ist beispielsweise bei der Inaktivierung des XChromosoms und beim genomic imprinting hinlänglich bekannt (Baylin et al. 1998). Schließlich wurde dieser Mechanismus auch für VHL-assoziierte klarzellige Nierenkarzinome nachgewiesen (Herman et al. 1994). Bisher ist allerdings noch unklar, welche Rolle die Hypermethylierung spielt und ob sie überhaupt das primär inaktivierende Ereignis ist oder eine Folge anderer 11 inaktivierender Mechanismen. Bewiesen 1 Einleitung ist bisher lediglich, dass ein Zusammenhang zwischen Methylierung und Expressionsregulation besteht (Li et al. 1993). 1.3.2 Das VHL-Gen Das VHL-Gen ist eines der erläuterten Tumorsuppressorgene. Ein defektes VHLGen wird für die von Hippel-Lindau Krankheit verantwortlich gemacht. Seizinger und Mitarbeiter haben den Ort des VHL-Gens 1988 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 3 (3p25,26) durch genomic mapping lokalisiert (Seizinger et al. 1988). Im Jahre 1993 gelang es dann Latif und Mitarbeitern, das VHL-Gen durch positional cloning zu isolieren (Latif et al. 1993). Drei Exons beinhalten eine codierende Sequenz von 852 Nukleotiden und erstrecken sich über eine Region von 20 Kilobasen. Dem Ende des dritten Exons schließt sich eine lange 3´ untranslatierte Region an (siehe Abb. 5). Abbildung 5: Das VHL-Gen und seine Domänen (utr= nicht translatierte Bereiche). Es befinden sich zwei Startcodons im ersten Exon, von denen das erste bei Nukleotid 213 und das zweite bei Nukleotid 373 liegt. Das größere VHL-Protein misst 213 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 28-30 kDa. Die ersten 54 Aminosäuren bis zum zweiten Startcodon bestehen aus Wiederholungen von GxEEx-Sequenzen (G=Glycin, E=Glutamin, x=beliebige Aminosäure) und scheinen bei der Tumorsuppression keine Relevanz zu haben (Iliopoulos et al. 1998; Schoenfeld et al. 1998). 12 1 Einleitung Die Struktur des VHL-Proteins besteht aus sieben β-Faltblatt Domänen und einer kurzen α-helikalen Domäne, die mehr als die Hälfte der Mutationen enthält. Diese ist für die Bindung an Elongin C maßgeblich. Die Struktur des VHL - Elongin C - Elongin B - Komplexes wurde kürzlich aufgeklärt. Abbildung 6: Die Struktur des VHL - Elongin C - Elongin B - Komplexes (Stebbins et al. 1999). Mit freundlicher Genehmigung von „Science“ (Journal of the American Association for the Advancement of Science). Die Sequenz des VHL Proteins hat keine Homologien zu anderen bekannten Proteinen. Seine Bindungspartner aber teilen Homologien mit Komponenten des SCF (Skp1-Cul1-F-box) Proteinkomplexes, der viele Zellzyklus-Regulatoren zur Ubiquitin-vermittelten Proteolyse führt (Kipreos et al. 1996). Zu den Funktionen des VHL-Gens zählt die negative Regulation hypoxieinduzierbarer mRNAs (Maxwell et al. 1999). Dies erfolgt durch Zerstörung des Transkriptionsfaktors HIF (hypoxia-inducible factor) durch einen Komplex aus einer E3 Ubiquitin-Ligase und dem VHL-Protein bei Anwesenheit von Sauerstoff. Weiterhin zählen zu den Funktionen des VHL-Gens das korrekte Zusammenfügen der extrazellulären Fibronektinmatrix (Ohh et al. 1998), die Regulation des Austritts aus dem Zellteilungszyklus (Pause et al. 1998) und die Expressionsregulation der Carboanhydrasen neun und zwölf (Ivanov et al. 1998). 13 1 Einleitung 1.4 Fragestellung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich zum einen mit der molekulargenetischen und klinischen Diagnostik der von Hippel-Lindau Krankheit und zum anderen mit der molekularen Pathogenese von sporadischen und VHL-assoziierten Hämangioblastomen des Zentralen Nervensystems. 1.4.1 Genetische und klinische Diagnostik bei Patienten mit Hämangioblastomen Es soll die Frage geklärt werden, welche Bedeutung die molekulargenetische Diagnostik für Patienten mit primär symptomatischem Hämangioblastom hat. Dabei interessieren folgende Punkte: a) Welche Sensitivität erreicht die genetische, welche die klinische Diagnostik? b) Wie häufig sind Mutationen des VHL-Gens bei Patienten mit primär symptomatischen Hämangioblastomen? Wie viele der primär symptomatischen Hämangioblastom-Patienten ohne klinischen Hinweis auf die von Hippel-Lindau Krankheit haben eine Mutation des VHL-Gens? c) Welche Konsequenzen und welchen Nutzen hat die Gendiagnostik für Patienten mit Hämangioblastomen und ihre Familienmitglieder? 1.4.2 Molekulare Pathogenese sporadischer und VHL-assoziierter Hämangioblastome Bisherige genetische Studien, die sich mit Hämangioblastomen befasst haben, basierten auf kleinen Fallzahlen und haben nicht alle Mechanismen der Inaktivierung untersucht. Diese Studien haben sehr unterschiedliche Ergebnisse erzielt (Crossey et al. 1994; Kanno et al. 1994; Lee et al. 1998; Oberstrass et al. 1996; Prowse et al. 1997; Tse et al. 1997; Vortmeyer et al. 1997). Um die Bedeutung der einzelnen Inaktivierungsmechanismen des VHLGens bei Hämangioblastomen des ZNS zu klären, sollten folgende Fragen beantwortet werden: a) Wie häufig sind intragenische Mutationen, LOH von 3p und Hypermethylierung bei einer großen Stichprobe dieser Tumore? Wie sind diese Mechanismen miteinander kombiniert? 14 b) 1 Einleitung Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Mutation des ersten und zweiten Allels des VHL-Gens bei zentralnervösen Hämangioblastomen? c) Welche molekulargenetischen Mechanismen liegen der Entstehung von sporadischen Hämangioblastomen zu Grunde? 15 2 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Geräte Agarosegel-Elektrophoresekammer Agagel Standard Typ G 45/1, Biometra, Göttingen Geltrockner SE 1160, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA Heizblock DB 3 A, Techne, Cambridge, UK Membran-Vakuumpumpe MZ2C/1,7m3/h, Vacuubrand, Wertheim Polaroid-Kamera PHC 34, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA Polyacrylamidgel- SE 1600, Hoefer Scientific Instruments, Elektrophoresekammer San Francisco, USA Spannungsgeräte Power-All 3000 V/ 200mA, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA Thermocycler 60/2, Biomed, Theres UV-Transilluminator UVTM-25, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA Zentrifuge a) bis 2 ml Reaktionsgefäße Biofuge 13, Heraeus, Osterode b) bis 50 ml Reaktionsgefäße Hettich Rotixa/RP, Tuttlingen 16 2 Material und Methoden 2.1.2 Enzyme Taq-DNA-Polymerase Gibco BRC, Eggenstein Proteinase K Boehringer Mannheim Restriktionsendonukleasen: Acc I New England Biolabs, Beverly, MA/USA Eco RI Boehringer Mannheim Ehe I New England Biolabs, Beverly, MA/USA Hae III Boehringer Mannheim Die zu den Restriktionsenzymen gehörenden 10 x Puffer wurden in verwendungsfertiger Form von denselben Herstellern bezogen. Anti-Digoxygenin-AP, Boehringer Mannheim Fab-Fragmente 2.1.3 Nukleotide und Nukleinsäuren dATP, dGTP, dTTP, dCTP Sigma Chemical Co., St Louis, USA DIG-11-UTP (Digoxygenin-11-2´- Boehringer Mannheim desoxy-uridin-5´-triphosphat, Alkali-labil) DNA-Längenstandard II, Boehringer Mannheim Digoxigenin-markiert DNA-Längenstandard X Boehringer Mannheim (0,07-12,2kbp) Primer-Oligonukleotide Birsner & Grob-Biotech GmbH, Denzlingen 17 2 Material und Methoden 2.1.4 Chemikalien Agarose Sigma Chemical Co., St Louis, USA Ammoniumpersulfat Sigma Chemical Co., St Louis, USA Borsäure Merck, Darmstadt Bromphenolblau Merck, Darmstadt Chloroform Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Holland Ethidiumbromid Sigma Chemical Co., St Louis, USA Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma Chemical Co., St Louis, USA Ficoll© 400 Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden GENECLEAN© II DNA Purification Kit BIO 101, Vista, CA, USA Hybridisierungspuffer DIG Easy Hyb, Boehringer Mannheim Hydroxychiolin Merck, Darmstadt Igepal CA-630 Sigma Chemical Co., St Louis, USA Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt Mineralöl Sigma Chemical Co., St Louis, USA MDE-Gel Lösung (2x) FMC Bioproducts Europe 18 2 Material und Methoden NBT/BCIP-Stammlösung Boehringer Mannheim Natriumcarbonat (wasserfrei, reinst) Merck, Darmstadt Phenol (kristallin, reinst) Merck, Darmstadt SDS (Natriumdodecylsulfat) Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe Silikonpaste Baysilone (mittelviskos), Bayer AG, Leverkusen TEMED (N, N, N´, N´-Tetramethyl- Sigma Chemical Co., St Louis, USA methylendiamin) Tris[hydroxymethyl]aminomethan Amersham Life Science, Cleveland, USA Triton-X-100 (t-Ocytylphenoxypoly- Sigma Chemical Co., St Louis, USA ethoxyethanol) Xylencyanol Merck, Darmstadt Alle weiteren Chemikalien wurden in analysereiner Form von der Firma Merck bezogen. 2.1.5 Lösungen 6 x Agarosegel-Ladepuffer 12,5 mg Bromphenolblau 12,5 mg Xylencyanol 7,5 g Ficoll (Typ 400) ddH2O ad 50 ml, bei 4 °C lagern 20 % APS (Ammoniumpersulfat) 0,2 g APS 19 2 Material und Methoden 1,0 ml ddH2O bei 4 °C aufbewahren 1x Blockierungslösung 10x Blocking buffer 1: 10 in 1x Maleinsäurepuffer 1x Detektionspuffer 100 mM Tris-HCl (pH 9,5) 100 mM NaCl 1x DIG-Waschpuffer 0,3 % (w/v) Tween 20 in 1x Maleinsäure-Puffer 10x Maleinsäurepuffer 116,1 g Maleinsäure 87,66 g NaCl in 500 ml dH2O lösen, pH ad 7,5 mit 5 N NaOH dH2O ad 1000 ml 0,5 x Mutation Detection Enhancement (MDE)-Acrylamid-Gel a) ohne Glycerol 15 ml MDE-Gellösung (2 x) 3,6 ml 10 x TBE 41,4 ml ddH2O versetzt mit 120 µl APS und 24 µl TEMED b) mit Glycerol 15 ml MDE-Gellösung (2 x) 3,6 ml 10 x TBE 3 ml Glycerol 38,4 ml ddH2O versetzt mit 120 µl APS und 24 µl TEMED 20 Natriumacetat pH 5,3 2 Material und Methoden 12,3 g in 40 ml ddH2O 5 ml 99,8 % Essigsäure ddH2O ad 50 ml 10 x dNTP-Lösung 2 mM je dNTP in ddH2O 10 x PCR-Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 8,3) 500 mM KCl 10-25 mM MgCl2 0,1 % Gelatine in ddH2O, aliquotiert bei -20 °C aufbewahren Phenol-Hydroxychinolin-Lösung 1,0 kg Phenol (kristallines Phenol bei 65 °C im Wasserbad schmelzen) 1,0 g Hydroxychinolin mit Tris-HCl pH 8 (0,5 M und 100 mM) äquilibrieren bis pH > 7,8 bei 4 °C lagern Reduktionslösung (Silberfärbung) 60 g Na2CO3 1,0 ml Formaldehyd (37 %) dH2O ad 2 l 2 x Saccharoselösung 218 g Saccharose 2,4 g Tris 2,03 g MgCl2 x 6 H2O 20 ml Triton X-100 ddH2O ad 1 l, mit HCl auf pH 7,6 einstellen, bei 4 °C lagern Salz-EDTA 2,19 g NaCl 4,46 g EDTA mit 1 M NaOH auf pH 8 einstellen, ddH2O ad 500 ml, bei 4 °C aufbewahren 21 12 mM Silbernitratlösung 2 Material und Methoden 2 g AgNO3 dH2O ad 1000 ml maximal zwei Wochen bei Raumtemperatur lagern 20 x SSC 175,3 g NaCl 88,2 g Na-Citrat Dihydrat dH2O ad 1000 ml SSCP-Ladepuffer 47,5 ml Formamid 100 µl 5 N NaOH 0,125 g Bromphenolblau 0,125 g Xylencyanol 10 x TBE 108 g Tris 55 g Borsäure 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) ddH2O ad 1 l TE-Puffer pH 8,0 500 µl 1 M Tris-HCl (mit 37 % HCl auf pH 8,0) 100 µl 0,5 M EDTA (mit 37 % HCl auf pH 8,0) ddH2O ad 50 ml TNE 5,0 ml 1 M Tris-HCl pH (8,0) 10 ml 5 M NaCl 2,1 g EDTA mit 5 M NaOH auf pH 7,5 titrieren, ddH2O ad 500 ml, bei 4 °C lagern TNE/SDS/Proteinase K-Lösung 2,7 ml TNE (5 ml für eine Probe) 0,6 ml 10 % SDS 0,2 ml Proteinase K (10 mg/ml) 22 10 x Warner´s Lösung 2 Material und Methoden 81,1 g NaCl 3,7 g KCl 0,3 g MgCl2 ddH2O ad 1 l, Lagerung bei 4 °C 23 2 Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 Register Zunächst wurde ein Register aller „primär symptomatischen“ HämangioblastomPatienten aufgestellt, die im Zeitraum von 1983 bis 1998 in der Neurochirurgischen Universitätsklinik Freiburg operiert wurden („primär symptomatisch“ soll hierbei bedeuten, dass diejenigen ausgeschlossen sind, die im Familien-Screening entdeckt wurden und erst sekundär symptomatisch wurden). Außerdem wurden weitere primär symptomatische Patienten aus anderen Zentren in das Register aufgenommen, die zum genetischen Test an die Freiburger Universitätsklinik überwiesen wurden. Es wurden von jedem Patienten die folgenden Daten systematisch erfasst: Persönliche Daten: Name, Geschlecht, Geburtsdatum, Operationsdatum, Alter bei der ersten Operation, Wohnort des Patienten, Ort der Operation. Klinische Daten: Erhoben wurden Daten zur neurologischen Symptomatik, dem Auftreten anderer Manifestationen der von Hippel-Lindau Erkrankung inklusive Zeitpunkt der Feststellung beziehungsweise des Ausschlusses retinaler Angiome, klarzelliger Nierenkarzinome, Phäochromozytome, Pankreaszysten und einer Nebenhodenbeteiligung. Außerdem wurden radiologische Daten zur Lokalisation der einzelnen Tumore sowie zu deren Größe (jeweils solider und zystischer Anteil) zu Beginn und im Verlauf der Krankheit festgehalten. Des weiteren wurden eingehend familienanamnestische Daten erhoben, wobei das Vorkommen von Hirntumoren sowie anderer Manifestationen der von Hippel-Lindau Erkrankung evaluiert wurden. Es wurden diejenigen Patienten als Hippel-Lindau Patienten klassifiziert, die neben dem Hämangioblastom außerdem (1) retinale Angiome, klarzellige Nierenkarzinome, Phäochromozytome, Pankreaszysten oder Zystadenome des Nebenhodens oder (2) einen Verwandten ersten Grades mit mindestens einer der genannten Läsionen oder (3) beim genetischen Test ein positives Ergebnis hatten. Weiterhin wurden den Patienten 10 ml EDTA-antikoaguliertes Blut zur molekulargenetischen Analyse abgenommen. Bei denjenigen Patienten, bei denen eine Mutationsträgerschaft nachgewiesen wurde, wurden auch primär nicht symptomatische Familienmitglieder genetisch untersucht. Im Falle eines positiven 24 2 Material und Methoden Befundes wurden auch sie dem klinischen Screeningprogramm nach Tabelle 1 (Seite 6) unterzogen. Soweit verfügbar wurden außerdem Gewebsproben der Tumore gewonnen. Diese wurden innerhalb einer halben Stunde nach Tumorexzision in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei -80 °C bis zur DNA-Extraktion gelagert. Die Blutproben wurden bei -20 °C tiefgefroren und bis zur DNA-Extraktion gelagert. 2.2.2 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut Die konstitutionelle DNA wird aus peripheren Blutleukozyten durch eine PhenolChloroformextraktion (Sambrook et al. 1989) gewonnen: 1) Man gibt 10 ml mit EDTA-antikoaguliertes Vollblut eines Patienten in ein steriles 50 ml Röhrchen. Dazu füllt man 20 ml einer 2 x Saccharose-Lösung, 500 µl einer 10 % Igepal CA-630-Lösung. Schließlich füllt man das Röhrchen mit 1 x Warner´s ad 40 ml, mischt gut und inkubiert 20 min bei Raumtemperatur. Dabei wird die Plasmamembran lysiert. 2) Das Gemisch wird für 20 min bei 3500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert. 3) Das Pellet wird mit 1 x Warner´s Lösung gewaschen und nochmals 10 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert, die Waschlösung sollte gut auslaufen. 4) Man gibt nun zu dem Pellet 3,5 ml TNE/SDS/Proteinase K-Lösung und 2,5 ml Salz-EDTA-Lösung und zerkleinert das Pellet vorsichtig mit einer Pasteurpipette. In der darauf folgenden Inkubation bei 55 °C über Nacht werden die Kernmembranen aufgelöst (SDS), sowie darin enthaltene Proteine hydrolysiert (Proteinase K). 5) Das Lysat wird in ein phenolresistentes 15 ml Röhrchen überführt und ein äquivalentes Volumen (etwa 6 ml) Phenol-Hydroxychinolin-Lösung hinzugefügt. Man lässt das Röhrchen dann 15 min auf einem Rotator schwenken, wodurch die Proteine in die organische Phenolphase übergehen, während die DNA in der wässrigen Phase verbleibt. 25 6) 2 Material und Methoden Es folgt eine zehnminütige Zentrifugation bei 2000 rpm und Raumtemperatur, der wässrige Überstand wird mit einer Transferpipette in ein weiteres 15 ml Röhrchen gegeben. Dieser Vorgang wird ab Punkt 5 insgesamt zweimal mit Phenol-Hydroxychinolin, einmal mit einem Phenol-Chloroform- Isoamylalkoholgemisch (25:24:1) und schließlich mit reinem Chloroform durchgeführt. 7) Zuletzt wird die gereinigte DNA mit 60 µl 1 M Kaliumchlorid und zwei Volumenteilen absolutem Alkohol (-20 °C) gefällt. Die präzipitierte DNA wird dann mit einer ausgezogenen Pasteurpipette entnommen und je nach Menge in 200 bis 1500 ml TE-Puffer resuspendiert und bei 4 °C aufbewahrt. Falls die DNA nicht ausfällt, wird die Lösung über Nacht bei -20 °C gelagert, bei 4°C 10 min mit 3500 rpm zentrifugiert, dekantiert und das luftgetrocknete Pellet in 200 µl TE-Puffer gelöst. 8) Für die PCR erweisen sich Verdünnungen von 1:10 bis 1:100 in ddH2O als günstig. 2.2.3 DNA-Extraktion aus Tumorgewebe Die DNA-Extraktion erfolgte aus Tumorgewebe, welches postoperativ unverzüglich in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde und bei -80 °C gelagert wurde. 1) Ein 5 x 5 mm großes Stück des aufgetauten Tumors wird in eine sterile Wägschale gegeben und mit einem sterilen Skalpell zerkleinert. 2) Das zerkleinerte Gewebe wird in ein steriles 50 ml Röhrchen gegeben und mit 3,5 ml TNE/SDS/Proteinase K-Lösung sowie 2,5 ml Salz-EDTA-Lösung versetzt. Bei sehr kleinen Tumoren sollten entsprechend geringere Mengen an Lösungen eingesetzt werden. In der darauf folgenden Inkubation bei 55 °C über Nacht werden die Zellmembranen und Kernmembranen aufgelöst (SDS), sowie darin enthaltene Proteine hydrolysiert (Proteinase K). 3) Sofern die Lyse vollständig ist, kann mit der Phenol-Extraktion wie in Punkt 5 unter 2.2.2 beschrieben fortgefahren werden. Sollte die Lyse unvollständig sein, kann man nochmals 200 µl Proteinase K hinzufügen und neu inkubieren. 4) Die Tumor-DNA für die PCR höher verdünnen (1:100). 26 2 Material und Methoden 2.2.4 Polymerasekettenreaktion (nach Saiki et al. 1985) Die Polymerasekettenreaktion chromosomaler Abschnitte. Das (PCR) dient der Amplifikation spezifischer Verfahren basiert auf der Replikation von Einzelstrang-DNA mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase in mehreren Zyklen, die jeweils aus drei Teilschritten bestehen. Im ersten Schritt wird das Reaktionsgemisch auf 95 °C erhitzt, so dass sich Strang und Gegenstrang der DNA voneinander trennen. Im zweiten Schritt (Primer-Annealing) wird die Temperatur auf einen Wert gesenkt, der den Primer-Oligonukleotiden eine Hybridisierung mit den DNA-Einzelsträngen ermöglicht. Zur Replikation eines bestimmten chromosomalen Abschnitts werden zwei unterschiedliche Primer verwendet, deren Sequenz jeweils komplementär zu flankierenden Regionen am 3´-Ende von Strang und Gegenstrang ist. In dieser Weise determinieren die Sequenzen des Primerpaares den chromosomalen Abschnitt, der während der Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird. Ausgehend von den Primer-Oligonukleotiden werden im letzten Teilschritt des Zyklus nach der Primeranlagerung Strang und Gegenstrang als komplementäre DNA-Moleküle synthetisiert. Dies geschieht bei 72 °C, da bei dieser Temperatur die Taq-Polymerase ihre optimale Aktivität besitzt. Im nächsten Zyklus stehen neben den ursprünglichen Strängen auch die neu synthetisierten Moleküle für das PrimerAnnealing zur Verfügung. Die Polymerasekettenreaktion wurde in 0,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäßen durchgeführt. Die Ansätze variieren je nach Versuchsanordnung und sind in den entsprechenden Abschnitten aufgeführt. Um ein Verdampfen der im Allgemeinen kleinen Ansatzvolumina zu vermeiden, wird jeder Ansatz mit 4 µl Paraffinöl überschichtet. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt neun verschiedene Fragmente des VHLGens oder seiner nächsten Umgebung amplifiziert. Die Angaben über die zugehörigen Primer sind Tabelle 3 zu entnehmen. Die Angaben über die PCR-Bedingungen bezüglich der Annealing-Temperatur und MgCl2-Konzentration wurden experimentell ermittelt. 27 Primer Primersequenz ( 5´ 3´) 2 Material und Methoden [MgCl2] TA Referenz 1,5 62 Gnarra et al., 1994 1,0 62 Gnarra et al., 1994 1,5 60 Gnarra et al., 1994 1,5 60 Gnarra et al., 1994 1,5 55 Payne et al., 1994 1,0 50 1,0 50 1,5 61 [mM] 1 F: GAGGCAGGCGTCGAAGAGTACGGC 2 R: GACTGCGATTGCAGAAGATGACCT 3 F: GGCCCGTGCTGCGCTCGGTGAACT 4 R: GACCGTGCTATCGTCCCTGC 5 F: CTTTAACAACCTTTGCTTGTCCCG 6 R: GTCTATCCTGTACTTACCACAACA 7 F: CTGAGACCCTAGTCTGCCACTGAG 8 R: CAAAAGCTGAGATGAAACAGTGTA 9 F: CTGCCCATTAGAGAAGTATTT 10 R: AATTCCCACTGAATTACGTATA 11 F: CCTCGCCTCCGTTACAACAGCCTA 4 R: GACCGTGCTATCGTCCCTGC 12 F: AGGCATTGTGATGTTTAGGGGCA 13 R: CTCGTATTTTCTGTGCGGATGG 14 F: ACAGTAACGAGTTGGCCTAG 15 R: CTGCGTGCGCGCTCCCGAGT 16 F: AAAGGGGTTCAGGAAACCTG 17 R: TCCAGTAAGAGGCTTCCTAG Sekido et al., 1994 1,0 50 Jones et al., 1992 Tabelle 3: Eingesetzte Primer mit Referenzen und PCR-Bedingungen. (F: Forward-Primer; R: Revers-Primer (jeweils in 5´→3´Richtung); [MgCl2]: Magnesiumchloridkonzentration; TA: Annealing-Temperatur) Die Polymerasekettenreaktion läuft für 30 bis 35 Zyklen mit 1) 30 s 94 °C Denaturierung 2) 40 s TA 3) 30 s 72 °C DNA-Synthese Primer-Annealing Vor dem ersten Schritt wird einmalig für 5 min bei 96 °C denaturiert. Nach dem letzten Schritt wird zusätzlich für 10 min bei 72 °C elongiert, um unvollständige Amplifikationsprodukte zu vermeiden. 28 2 Material und Methoden 2.2.5 Agarosegel-Elektrophorese Die Agarosegelelektrophorese kam beim Southern Blotting und bei der Untersuchung auf Hypermethylierung zum Einsatz. Außerdem wurden sie zur Kontrolle einiger Amplifikationsprodukte einer Polymerasekettenreaktion verwendet. Zunächst wird das UV-transparente Geltablett gereinigt und an den Seiten abgeklebt. Daraufhin wird die jeweils prozentual angegebene Menge Agarose (w/v) in 80 ml 1x TBE gelöst und kurz aufgekocht. Nachdem sie leicht abgekühlt aber noch nicht erstarrt ist, werden 20 µl Ethidiumbromid-Stammlösung (10 mg/ml dH2O) hinzugefügt, die Kämme eingesetzt und das Gel gegossen. Das Gel wird in eine horizontale Kammer gelegt und in 1x TBE gebettet. Die DNA-Proben werden vor dem Auftrag auf das Gel mit 6x Agarosegel-Ladepuffer versetzt. Um die Länge und Konzentration der Nukleinsäuren im Gel abschätzen zu können, wird auch ein DNA-Längenstandard aufgetragen. Die Auftrennungszeit beträgt 30 min bei 100 Volt, beziehungsweise 4 h und 80 Volt beim Southern Blot. Bei der Bewegung durch das Agarose-Gel werden die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Länge aufgetrennt. Im Unterschied zum Acrylamid-Gel treten hierbei Veränderungen aufgrund von Punktmutationen nicht zu Tage. Die Banden im Gel können dann ohne weitere Maßnahmen unter UV-Licht der Wellenlänge 366 nm sichtbar gemacht und mit einer Polaroid-Kamera fotografiert und dokumentiert werden. 2.2.6 Acrylamidgel-Elektrophorese Die Acrylamid-Gelelektrophorese wurde bei den SSCP- und LOH-Untersuchungen verwendet. 2.2.6.1 Herstellung eines Acrylamid-Gels Hierzu werden zwei Glasplatten gründlich mit Wasser und anschließend mit 70 prozentigem Ethanol gereinigt. Die Platte, von der sich das Gel nachher zuerst lösen soll, wird mit Acrylease behandelt. Danach werden die Platten waagerecht aufeinander gelegt und an den Längsseiten Spacer (0,35 mm) eingesetzt. Die Unterseite wird abgeklebt. Als nächstes werden die MDE-Lösungen wie unter 1.1.5 29 2 Material und Methoden beschrieben zusammengefügt und die Polymerisation mit Ammoniumpersulfat (APS) und N,N,N´,N´-Tetramethylmethylendiamin (TEMED) gestartet. Das Gel wird nun luftblasenfrei gegossen und ein Taschenkamm wird eingesetzt. Bevor das Gel in die Elektrophoresekammer eingesetzt wird, sollte es mindestens eine Stunde lang auspolymerisieren. Sobald der Taschenkamm entfernt wurde, müssen die Taschen unverzüglich durchgespült werden. Bevor die DNA-Proben geladen werden, legt man für eine halbe Stunde eine Spannung von 250 Volt an das Gel. 2.2.6.2 Silberfärbung eines Acrylamid-Gels (nach Budowle et al. 1991) Nach beendeter Elektrophorese wird die mit Acrylease behandelte Glasplatte abgelöst. Das Gel verbleibt auf der anderen Platte und wird in einen Färberahmen eingespannt (Bender et al. 1994). Dieser ist so konstruiert, dass alle Seiten des nun frei liegenden Gels durch den darauf liegenden Rahmen abgedichtet sind. Die Entwicklung beginnt mit der Applikation von einprozentiger Salpetersäure auf das Gel. Nach drei Minuten wird diese abgegossen und dreimal mit dH2O gespült. Daraufhin wird das Gel für 20 min mit Silbernitrat (12 mM) inkubiert. Dabei wird es mit einer Platte abgedunkelt. Im Anschluss wird wiederum dreimal mit dH2O gespült. Jetzt wird die Reduktionslösung zugegeben und nach kurzem Schwänken gleich wieder abgeschüttet. Frische Reduktionslösung wird hinzugegeben und verbleibt so lange bis die Banden die gewünschte Intensität erreichen. Dabei werden die von der DNA gebundenen Silberionen durch das Formaldehyd in der Reduktionslösung reduziert und sichtbar gemacht. Mehrfaches Wechseln der Reduktionslösung verhindert eine starke Anfärbung des Hintergrundes. Zuletzt wird die Färbereaktion mit 10 prozentiger Essigsäure gestoppt. Nachdem der Rahmen entfernt wurde wird das Gel mit Filterpapier (Schleicher und Schuell, Nr. 2316) von der Glasplatte abgelöst und mit einem Geltrockner für eine Stunde bei 80 °C getrocknet. 2.2.7 Single-Stranded Conformational Polymorphism (SSCP)-Analyse Die Single-Stranded Conformational Poymorphism (SSCP) Analyse ist ein molekulargenetisches Screeningverfahren, welches dazu in der Lage ist, Allelspezifische Sequenzunterschiede bis hin zu einem einzelnen Nukleotid zu detektieren. 30 2 Material und Methoden Die Methode weist mit hoher Sensitivität Polymorphismen sowie krankheitsverursachende Mutationen nach (Ainsworth et al. 1991). Es wurden insgesamt vier Polymerasekettenreaktion Fragmente amplifiziert und des VHL-Gens untersucht. Dabei mittels wurden einer die Primeroligonukleotide so gewählt, dass die untersuchten Fragmente die meisten Mutationen abdeckten. Für das Exon 1 wurden die Primerpaare 1/2 und 3/4 verwendet (siehe 2.2.4). Das Exon 2 wurde mit den beiden intronischen Primern 5 und 6 komplett amplifiziert, während mit dem Primerpaar 7/8 der translatierte Abschnitt des Exons 3 untersucht wurde. Die Polymerasekettenreaktion wurde unter den in 2.2.3 beschriebenen Bedingungen über 30 Zyklen durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug 10 µl, worin enthalten waren: • 4,9 µl ddH2O • 1 µl 10x PCR-Puffer (Mg-Konzentration ist Tabelle 3 zu entnehmen) • 1 µl 10x dNTP-Lösung • 1 µl Primer A (20 pmol/ml) • 1 µl Primer B (20 pmol/ml) • 1 µl extrahierte DNA (1:10 verdünnt) • 0,1 µl Taq-Polymerase 4 µl des amplifizierten Fragments wurden dann mit 6 µl SSCP-Ladepuffer versehen und 3 min bei 95 °C durch die Hitze und das im Puffer enthaltene Formamid denaturiert. Damit die Einzelstränge nicht rehybridisieren, muss die Probe danach unverzüglich auf Eis gebettet werden. Die Proben wurden dann auf ein in 2.2.6 beschriebenes Acrylamid-Gel geladen. Die Fragmente aus den Primerpaaren 1/2 und 7/8 wurden ohne Glycerol über Nacht bei 3 Watt aufgetrennt. Für das Primerpaar 5/6 wurde ein Acrylamid-Gel mit Glycerol verwendet. Dieses wurde bei 5 Watt über Nacht aufgetrennt. Die Sequenz aus den Primern 3 und 4 wurde wegen der Unschärfe ihrer Banden sowohl mit als auch ohne Glycerol untersucht. Bei der Auftrennung in dem nicht denaturierenden Gel werden Strang und Gegenstrang, sowie eventuell mutierte Allele aufgetrennt, obgleich sie primär eine identische Länge haben. Dies ist folgendermaßen zu erklären: Die Einzelstrang-DNA liegt unter nicht denaturierenden Bedingungen in einer gefalteten Konformation vor, die von ihrer Primärsequenz abhängt und durch intramolekulare Interaktionen stabilisiert wird. Punktmutationen verändern die Primärsequenz und somit auch die dreidimensionale Struktur des Einzelstranges. Die Geschwindigkeit der 31 2 Material und Methoden Einzelstrangmoleküle im Gel hängt somit von ihrer Konformation ab. Liegt eine Punktmutation also heterozygot vor, so entstehen zwei zusätzlich mögliche Konformationen. Diese werden dann im Gel als zusätzliche Banden neben den beiden korrespondierenden Einzelsträngen ohne Punktmutation sichtbar. Zuletzt wurden die Gele gefärbt und getrocknet wie beschrieben. 2.2.8 Sequenzierung Bei denjenigen Proben, die im SSCP auffällig waren, wurden aberrierende Banden nach dem Trocknen aus dem Gel ausgeschnitten. Nach Lagerung über 16 h in TEPuffer diffundiert ein Großteil der DNA in den Puffer und kann wie unter 2.2.4 beschrieben nochmals mit den gleichen Primern in einem Gesamtvolumen von 100 µl reamplifiziert werden. Die Ausbeute wird durch Auftragen von 5 µl in einem dreiprozentigem Agarose-Gel kontrolliert und die Probe wurde an ein auf Sequenzierung spezialisiertes Labor geschickt. Die Sequenzierung erfolgte mit fluoreszenz-markierten Primern nach der Dideoxymethode in einem halbautomatischen Sequenzierer. 2.2.9 Southern Blot Diese Methode wurde eingesetzt, um Deletionen im VHL-Gen nachzuweisen. Hierbei wurde mit Eco RI verdaute genomische DNA in einem Agarose-Gel aufgetrennt und durch einen kapillären Blot auf eine Nylonmembran übertragen. Hier wurde sie dann mit zwei selbst hergestellten, Digoxigenin-markierten Sonden am Anfang und am Ende des VHL-Gens hybridisiert. Diese wurden dann durch einen Antikörper enzymatisch detektiert. 2.2.9.1 Eco RI-Verdau genomischer DNA und Auftrennung in einem Agarose-Gel Es werden 7,5 µg DNA mit 40 U Eco RI, sowie dazugehörigem Inkubationspuffer und ddH2O zu einem Gesamtvolumen von 100 µl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Die Spaltung der DNA erfolgt bei 37 °C über Nacht. Am nächsten Tag wird zuerst das Enzym durch zwanzigminütiges Erhitzen auf 65 °C inaktiviert. Danach werden 10 µl 3 32 2 Material und Methoden M Natriumacetat (pH 5,3) und 275 µl absoluter Ethanol dazugegeben. Bei -20 °C wird in vier Stunden die verdaute DNA durch das Salz und den Alkohol gefällt. Es erfolgt eine 25minütige Zentrifugation bei 13000 rpm. Der Überstand wird vorsichtig dekantiert und verworfen. Das Pellet wird in 70 prozentigem Ethanol gewaschen, nochmals zehn Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, dekantiert und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wird es in 10 µl ddH2O aufgenommen und zusammen mit 3 µl Ladepuffer in ein 0,6 % Agarose-Gel wie unter 2.2.5 beschrieben geladen und aufgetrennt. Zusätzlich zu den Proben wird noch ein Digoxigeninmarkierter λ Hind III Längenstandard (DNA-Längenstandard II) aufgetragen. Vor dem Auftragen auf das Gel werden 2 µl Längenmarker mit 8 µl TE und 3 µl Ladepuffer drei Minuten lang bei 60 °C erhitzt. 2.2.9.2 Kapillärer Transfer (nach Southern 1975) Bei dieser Methode werden DNA-Fragmente mit einer hochkonzentrierten Salzlösung durch kapilläre Kräfte auf eine positiv geladene Nylonmembran transferiert. Die Ausbeute hängt dabei stark von der Größe der Fragmente ab. Um diese zu optimieren, wird das Phosphodiestergerüst der DNA stellenweise hydrolysiert. Dazu wird das Gel zunächst maximal zehn Minuten in 0,25 N Salzsäure schüttelnd bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei wird die DNA partiell depuriniert. Nach Waschen mit dH2O wird das Gel zweimal 15 Minuten lang einer 0,5 N NaOH/ 1,5 M NaCl-Lösung exponiert. Die DNA bricht an den depurinierten Stellen in Fragmente von ungefähr 1 kb Länge. Zuletzt wird das Gel in 0,5 M Tris/ 2,5 M NaCl (pH 7,5) zweimal 15 Minuten lang neutralisiert. Nun erfolgt der Blot nach unten stehender Abbildung (siehe Abb. 7) über Nacht in 20 x SSC. Dabei entsteht ein Flüssigkeitsstrom durch das Gel, der die DNA mitzieht. Selbige bleibt dann mit ihrem negativ geladenen Phosphodiestergerüst an der positiv geladenen Nylonmembran hängen. 33 2 Material und Methoden Abbildung 7: Aufbau des Southern Blot. Der 20 x SSC-Puffer wird durch die kapillären Kräfte des Filterpapiers durch das Gel und die Membran gezogen. Dabei werden die DNA-Fragmente mitgerissen und bleiben mit ihrem negativ geladenen Phosphatrückgrat an der positiv geladenen Nylonmembran hängen. Bevor mit der Hybridisierung begonnen werden kann, müssen die DNA-Bruchstücke kovalent an die Membran gebunden werden. Dies erfolgt durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht einer Wellenlänge von 254 nm für zehn Minuten (Khandjian et al. 1986). Danach wird das Gel zwei Minuten lang in 2 x SSC gespült. 2.2.9.3 Hybridisierung Zunächst müssen die Digoxigenin-markierten Sonden für das VHL-Gen hergestellt werden. Dies erfolgt durch Polymerasekettenreaktion (siehe 2.2.4). Dabei werden zwei Fragmente amplifiziert, wobei mit dem ersten Primerpaar (11/4) das gesamte erste Exon vervielfältigt wird und mit dem zweiten Primerpaar (12/13) ein Fragment im untranslatierten Bereich des Exons 3. Es werden dazu für jedes Fragment drei Ansätze mit jeweils 100 µl gemacht. Diese enthalten: • 49 µl ddH2O • 10 µl PCR-Puffer • 10 µl Primer 11 beziehungsweise 12 • 10 µl Primer 4 beziehungsweise 13 • 10 µl dNTP-Mix • 10 µl genomische DNA (1:10 verdünnt) • 1 µl Taq-Polymerase Die Polymerasekettenreaktion wird dann unter den in 2.2.4 angegebenen Bedingungen für 30 Zyklen durchgeführt. Die Produkte (603 und 641 bp) werden mit dem GeneClean DNA Purification Kit entsprechend den Angaben des Herstellers gereinigt. 34 2 Material und Methoden Jetzt erfolgt die Herstellung der Digoxigenin-markierten Sonden. Dazu wird eine zweite Polymerasekettenreaktion durchgeführt, wobei an Stelle des gewöhnlichen dNTP-Mixes Dig-11-dUTP und dTTP im Verhältnis 1:2 zugegeben werden. Die anderen Desoxynukleotide werden in den üblichen Konzentrationen zugeführt. In den 100 µl Reaktionsvolumen sind enthalten: • 10 µl PCR-Puffer • 10 µl Primer 11 beziehungsweise 12 • 10 µl Primer 4 beziehungsweise 13 • 10 µl dATP/dCTP/dGTP-Mix (2 mM Stocklösung) • 7 µl Dig-11-dUTP (1 mM Stocklösung) • 10 µl dTTP (1,3 mM Stocklösung) • 10 µl genomische DNA (1:10 verdünnt) • 1 µl Taq-Polymerase • 20 ng aufgereinigtes Template • ddH2O ad 100 µl Die PCR wird für 35 Zyklen mit den unter 2.2.4 an gegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Ausbeute wird auf einem Agarose-Gel kontrolliert. Nun wird zunächst noch die Nylonmembran zwei Stunden in 20 ml reinem Hybridisierungspuffer unter leichter Rotation bei 50 °C für zwei Studen prähybridisiert. Damit blockiert man unspezifische Bindungsstellen für Nukleinsäuren auf der Membran. Daraufhin werden die selbst hergestellten Sonden zehn Minuten bei 95 °C denaturiert und danach auf Eis gekühlt. Nach abgelaufener Prähybridisierung werden diese direkt in den Hybridisierungspuffer gegeben. Es sollten 25 ng Sonde pro ml Puffer eingesetzt werden. Hybridisiert wird bei 50 °C über Nacht unter leichter Rotation. Dabei lagern sich die Sonden an diejenigen Eco RI-Fragmente an, die ihre komplementäre wiederverwendet Sequenz werden. enthalten. Sie Die werden Sonden hierzu können nach bis zu Gebrauch fünfmal mitsamt Hybridisierungspuffer bei -20 °C gelagert. Vor erneuter Verwendung müssen sie dann allerdings zehn Minuten bei 68 °C denaturiert werden. 2.2.9.4 Immunologische Detektion Zuerst muss man ungebundenes, überschüssiges Sondenmaterial entfernen. Dies geschieht durch folgenden Waschvorgang: Zunächst wird fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation mit 2x SSC/ 0,1 % SDS gewaschen. Die Lösung wird abgekippt und der Vorgang wird einmal wiederholt. Danach wird zweimal bei 50 °C für 35 2 Material und Methoden 15 min ebenfalls unter Rotation mit 0,5x SSC/ 0,1 % SDS gewaschen. Die nun folgenden Schritte erfolgen alle bei Raumtemperatur unter Rotation. 1) Dreiminütige Äquilibrierung in DIG-Waschpuffer. 2) Blockierung freier Bindungsstellen auf der Membran durch Inkubation in 100 ml frisch angesetzter Blockierungslösung für 30 min. 3) Bindung des Antikörpers: Anti-Digoxigenin-Alkalische Phosphatase-Konjugat wird in 30 ml Blockierungslösung auf 150 mU/ml verdünnt (1: 5000). Die Membran wird darin 30 min luftblasenfrei inkubiert. Dabei binden die FabFragmente an das Digoxigenin in den Sonden. 4) Zweimal 15 min mit je 100 ml DIG-Waschpuffer waschen. 5) Äquilibrierung mit 20 ml Detektionspuffer für zwei Minuten. 6) Detektion: 400 µl NBT/BCIP-Stammlösung werden in 20 ml Detektionspuffer auf 1:5000 verdünnt. Die nun folgende Inkubation muss unter Ausschuss von Licht und ohne Rotation stattfinden. Die Alkalische Phosphatase setzt NBT/BCIP zu einem grauviolettem Farbstoff um. Die Banden werden nach fünf Minuten bis 24 Stunden sichtbar. 7) Ist die gewünschte Farbintensität erreicht, wird die Färbereaktion in dH2O abgestoppt. Die Membran kann, falls gewünscht, für weitere Hybridisierungen in TE-Puffer gelagert werden. 8) Die Resultate können entweder durch Fotokopieren der nassen Membran, durch Fotografie oder durch Einscannen in einen Computer dokumentiert werden. Die Farbe auf der Membran verblasst mit der Zeit. 2.2.10 Verlust der Heterozygotie (LOH) Hier kamen drei verschiedene Methoden zum Einsatz. Die erste beruht auf einem Polymorphismus am Nukleotid 1149, die zweite beruht auf einem Polymorphismus am Nukleotid 19 und die dritte auf einem Dinucleotide-repeat-polymorphism. 36 2 Material und Methoden 2.2.10.1 Verlust der Heterozygotie (LOH) am Nukleotid 1149 (Nach Payne et al. 1994) Dieser Nachweis des Verlustes eines gesamten Allels des VHL-Gens basiert auf einem Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus im untranslatierten Bereich des dritten Exons. Es wird ein Verlust des heterozygoten Vorliegens dieses Polymorphismus im Tumor nachgewiesen. Dieser Polymorphismus betrifft das Nukleotid 1149. Hier enthält die DNA entweder ein A oder G (Latif et al. 1993). Dazu wird zuerst ein Fragment, welches dieses Nukleotid enthält mittels einer PCR amplifiziert (Primerpaar 9/10). Die Restriktionsfragmentanalyse wird erst dadurch ermöglicht, dass durch einen speziell gewählten reversen Primer an Position 1154 ein C an Stelle eines A eingefügt wird. Dadurch entsteht eine Acc I-Schnittstelle (GTATAC) im Falle des G-Allels bei Nukleotid 1149 (siehe Abb. 8). Polymorphismus Nukleotid 1149 A/G A Genomische DNA: 5´-----GGAGGTTT GTATAAGTAATTCAGTGGGAATTGCAGCA-----3´ Reverser Primer 10 (siehe 2.2.4): 5´ ATATGCATTAAGTCACCCTTAA 3´ Austausch A/C am Nukleotid 1154 3´-Ende des PCR-ampliA fizierten Fragments: 5´-----GGAGGTTT GTATACGTAATTCAGTGGGAATT 3´ Acc I-Schnittstelle: GTATAC Abbildung 8: Generierung einer Acc I-Schnittstelle im untranslatierten Bereich des Exons 3 durch Austausch eines Nukleotides mittels eines speziell gewählten reversen Primers. Ist am Nukleotid 1149 ein G vorhanden (32 %), kann das Restriktionsenzym Acc I das amplifizierte 110 bp-Fragment in ein 89 bp- und ein 21 bp-Fragment zerschneiden. Ist das Nukleotid 1149 ein A (68 %), schneidet Acc I nicht. Beim Auftrennen der verdauten Fragmente in einem Acrylamid-Gel erscheint dann entweder nur die 110 bp Bande (homozygot A, 46 % nach Payne et al.) oder die 89 bp und die 21 bp-Bande sichtbar (homozygot G, 10 %) oder aber alle drei Banden (heterozygot, 44 %). Einen eventuellen Verlust der Heterozygotie im Tumorgewebe kann man somit nur bei den 44 % der Patienten untersuchen, bei denen die Blut-DNA für diesen Polymorphismus heterozygot ist. Die 56 % Homozygoten sind bei dieser Methode nicht informativ. 37 2 Material und Methoden Es folgen die genauen Reaktionsbedingungen: 1) Zunächst wird das genannte Fragment aus genomischer DNA von je Blut und Tumor durch eine Polymerasekettenreaktion amplifiziert (siehe 2.2.4). In den je 10 µl PCR-Volumen sind enthalten: • 4,9 µl ddH2O • 1 µl 10x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) • 1 µl 10x dNTP-Lösung • 1 µl Primer 9 (20 pmol/ml) • 1 µl Primer 10 (20 pmol/ml) • 1 µl extrahierte DNA (1:10 verdünnt) • 0,1 µl Taq-Polymerase Die Polymerasekettenreaktion läuft 30 Zyklen wie unter 2.2.4 beschrieben. 2) Nach abgelaufener PCR wird in jedes Reaktionsgefäß 5 µl Acc IRestriktionsgemisch pipettiert. Darin sind enthalten: 3) • 0,1 µl Acc I (10 U/µl) • 1,5 µl Acc I-Inkubationspuffer (10x) • 3,4 µl ddH2O Die Inkubation erfolgt 90 Minuten bei 37 °C und danach weitere 90 Minuten bei 55°C. 4) Die Proben werden dann mit 5 µl Agarosegel-Ladepuffer versehen und in einem 0,5x MDE/ 1x TBE-Gel bei 35 Watt in einer dreiviertel Stunde aufgetrennt (siehe 2.2.6). 5) Darauf werden sie mit Silberbromid gefärbt wie unter 2.2.6.2 beschrieben. 2.2.10.2 Verlust der Heterozygotie (LOH) am Nukleotid 19 (nach Sekido et al. 1994) Diese Methode läuft prinzipiell gleich ab wie die vorherige. Ein Fragment im Bereich des Nukleotid 19 im ersten Exon des VHL-Gens wird mittels PCR amplifiziert (Primerpaar 14/15) und daraufhin mit dem Restriktionsenzym Hae III geschnitten (Erkennungssequenz GGCC). Der Unterschied besteht darin, dass das Fragment schon von vornherein zwei konstitutive Hae III-Schnittstellen aufweist. Das 167 bp Produkt wird dadurch in drei Fragmente mit 82 bp, 70 bp und 15 bp zerschnitten. Ist dann am Nukleotid 19 ein G anstelle eines A vorhanden, so entsteht eine dritte Schnittstelle und Hae III schneidet das 70 bp-Fragment in 45 und 25 bp. Die 38 2 Material und Methoden Heterozygotenfrequenz für diesen Polymorphismus wird mit 41 % angegeben (Sekido et al. 1994). Es folgen nun die Reaktionsbedingungen im Einzelnen: 1) Zunächst wird das genannte Fragment aus genomischer DNA von je Blut und Tumor durch eine Polymerasekettenreaktion amplifiziert (siehe 2.2.4). In den je 10 µl PCR-Volumen sind enthalten: • 4,9 µl ddH2O • 1 µl 10x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) • 1 µl 10x dNTP-Lösung • 1 µl Primer 14 (20 pmol/ml) • 1 µl Primer 15 (20 pmol/ml) • 1 µl extrahierte DNA (1:10 verdünnt) • 0,1 µl Taq-Polymerase Die Polymerasekettenreaktion wird für 30 Zyklen wie unter 2.2.4 beschrieben ausgeführt. 2) Danach wird in jedes Reaktionsgefäß 5 µl Hae III-Restriktionsgemisch pipettiert. Darin sind enthalten: • 0,1 µl Hae III (10 U/µl) • 1,5 µl Hae III-Inkubationspuffer (10x) • 3,4 µl ddH2O 3) Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37 °C . 4) Am nächsten Tag wird das Inkubat mit 5 µl Agarosegel-Ladepuffer versetzt und auf einem 0,5 x MDE Acrylamid-Gel bei 35 Watt aufgetrennt. 2.2.10.3 Verlust der Heterozygotie am Locus D3S1038 (3p25) (nach Jones et al. 1992) Dieser Polymorphismus besteht in einer unterschiedlichen Anzahl an Wiederholungen von CA-Dinukleotiden in einer repetitiven Sequenz in unmittelbarer Nähe des VHLGens. Diese lautet (CA)7N38(CA)12. Heterozygotie wird hier mit 80 % angegeben (Jones et al. 1992). Die repetitive Sequenz wird mit flankierenden Primern amplifiziert. Die Produkte werden in einem Acrylamid-Gel ihrer Länge entsprechend aufgetrennt. Dabei trennen sich die Allele, wenn sie sich nur um wenige Dinukleotide unterscheiden. 39 2 Material und Methoden Es folgen die einzelnen Reaktionsbedingungen: 1) 1 µl verdünnte genomische DNA wird in einer 10 µl PCR mit den Primern 16 und 17 in 35 Zyklen amplifiziert. Zutaten und Bedingungen sind 2.2.4 zu entnehmen 2) Die Proben werden dann mit 5 µl Agarosegel-Ladepuffer versehen und in einem 0,5x MDE/ 1x TBE-Gel bei 2 Watt über Nacht aufgetrennt (siehe 2.2.6). 3) Darauf werden sie mit Silberbromid gefärbt wie unter 2.2.6.2 beschrieben. 2.2.11 Untersuchung der Hypermethylierung Diese Untersuchung ist eine auf PCR beruhende Technik zum Nachweis einer Hypermethylierung einer Schnittstelle des methylierungssensitiven Restriktionsenzyms Ehe I in einem Bereich des Promoters des VHL-Gens, der reich an CG-Dinukleotiden ist (CpG-island). 1) Ein Mikrogramm konstitutionelle DNA wird mit einem Überschuss von 10 U Ehe I verdaut. Um einen kompletten Verdau zu sichern, wird die DNA in einem großen Volumen von 150 µl verdaut. Zunächst werden folgene Reagenzien zusammenpipettiert: • 110 µl H2O • 15 µl Inkubationspuffer Y+/TangoTM • 1 µl genomischer DNA (1:50 in TE vorverdünnt) Vor Enzymzugabe inkubiert man die DNA für zwei Stunden bei 4 °C , um eine optimale Verteilung der DNA im Inkubationspuffer zu gewährleisten. Daraufhin wird 1µl Ehe I (10 U/µl) zugegeben. Der Ansatz wird vermischt, mit einem Tropfen Öl überschichtet, kurz zetrifugiert und bei 37 °C über Nacht verdaut. Daraufhin werden erneut zu jedem Ansatz 0,5 µl Ehe I zugegeben und für weitere zwei Stunden inkubiert. Schließlich wird das Enzym durch Erhitzen auf 65 °C in 20 Minuten inaktiviert. Für jede Probe wird zur Kontrolle derselbe Ansatz ohne Zugabe von Ehe I gemacht. Um unterschiedliche PCR-Bedingungen durch das im Inkubationspuffer enthaltene MgCl zu vermeiden, wird der Ansatz vor der PCR gereinigt. Dazu wird ein kommerzielles DNA Reinigungskit nach Angaben des Herstellers verwendet 40 2 Material und Methoden (GENECLEAN II KIT, Bio 101). Hierbei werden die 150 µl Inkubat ohne Öl in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 450 µl Bindungslösung und 10 µl Glasmilch vermischt. Dies geschieht durch zwanzigminütiges über Kopf Schütteln. Dabei bindet die DNA an die in der Glasmilch enthaltenen Silikate. In der folgenden Zentrifugation für zwei Minuten bei 13 000 rpm sedimentiert die Glasmilch. Der Überstand wird dekantiert. Danach werden 500 µl New Wash Lösung hinzugefügt und das Sediment mit einer Pipettenspitze darin aufgelöst. Danach folgt wieder eine Zentrifugation, Dekantierung und erneute Zugabe von New Wash Lösung. Dieser Waschvorgang wird insgesamt dreimal wiederholt. Nach der letzten Dekantierung werden alle flüssigen Reste sorgfältig entfernt und das Sediment bei 40 °C für 15 min getrocknet. Danach wird es in 20 µl TE-Puffer aufgenommen und gut vermischt. Dabei löst sich die DNA von der Glasmilch. Diese wird dann abzentrifugiert und die in TE-Puffer gelöste DNA zur PCR entnommen. 2) Bei der nachfolgenden Multiplex-PCR wird der Bereich der Ehe I Schnittstelle im VHL Promoter sowie ein PCR-Kontrollfragment im Exon 3 amplifiziert. Das Gesamtreaktionsvolumen von 15µl enthält: • 3,6 µl H2O • je 1,5 µl Primer 1,2,5 und 6 • 1,5 µl PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) • 1,5 µl dNTP-Mix • 0,15 µl Taq-Polymerase • 2,25 µl verdaute DNA Jeder Ansatz wird mit 4 µl Paraffinöl überschichtet. Die Polymerasekettenreaktion wird für 27 Zyklen wie unter 2.2.3 beschrieben mit einer Annealing-Temperatur von 62 °C ausgeführt. 3) 10 µl PCR-Produkt werden dann mit 3 µl Ladepuffer auf ein 3 % Agarose-Gel aufgetragen und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die methylierungssensitive Restriktionsendonuklease Ehe I hat die Erkennungssequenz 5´-GGCGCC-3´ im Promoter des VHL-Gens und schneidet nicht im Falle einer Methylierung des innen gelegenen Cytosin-Nukleotid. Im Falle einer Methylierung des VHL-Gens wird im Gel zusätzlich zum 266 bp Fragment des Exons 3 ein Fragment von 211 bp sichtbar. Dieses stammt aus dem ersten Exon. 41 2 Material und Methoden Als weitere Kontrolle wird zum Vergleich außerdem jeweils ein weiterer Ansatz mit unverdauter DNA gemacht. Hier erwartet man immer zwei Produkte. 2.2.11 Statistik Zur Überprüfung von Unterschieden auf Signifikanz wurde der Chi-Quadrat Vierfeldertest angewendet. 42 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Register Von den 81 Patienten, die im Zeitraum von 1985 bis 1998 in der Freiburger Universitätsklinik wegen eines zentralnervösen Hämangioblastoms operiert wurden, stimmten 52 (64 %) der genomischen VHL-Analyse zu. Weiterhin lag Material von 41 Tumoren von insgesamt 31 dieser Patienten vor. Neunundachtzig weitere Patienten aus anderen Zentren wurden zur molekulargenetischen Untersuchung überwiesen. Von einem dieser Patienten war auch Tumormaterial zugänglich. Das systematische Register umfasste somit insgesamt 141 „primär symptomatische“ HämangioblastomPatienten mit Blutprobe sowie 46 Tumorproben von 32 Patienten („primär symptomatisch“ soll hierbei bedeuten, dass diejenigen ausgeschlossen sind, die im Familien-Screening entdeckt wurden und erst sekundär symptomatisch wurden). Von allen Patienten wurden klinische Daten systematisch erfasst. Nicht von allen Patienten konnten sämtliche Daten erhoben werden, da teilweise Untersuchungen nicht durchgeführt wurden oder die Befunde nicht zugänglich waren. Tabelle vier zeigt, welche Angaben bei wie vielen Patienten evaluiert werden konnten: Patientendaten Verfügbarkeit [%] Geburtsdatum 99 OP-Datum 83 Alter bei erster Operation 82 Wohnort 74 Explizite neurologische Symptomatik 63 Tumore Verfügbarkeit [%] Tumorzahl pro Patient 84 Lokalisation 91 Erster Tumor (Lok., Zahl, Alter) 60 43 3 Ergebnisse Verfügbarkeit [%] VHL Extra-ZNS Organbefall bei Tumordiagnose 53 Extra-ZNS Organbefall im Follow-Up 84 Ausschluß oder Diagnose von Retinalen Angiomen 55 Nierenkarzinomen 42 Phäochromozytomen 50 Pankreaszysten 42 Nebenhodenzystadenomen 10 Erste Manifestation der von Hippel-Lindau Krankheit Familienanamnese bezüglich VHL 65 Verfügbarkeit [%] ZNS 44 Andere Organe 79 Tabelle 4: Verfügbarkeit klinischer Daten bei 141 Patienten mit primär symptomatischem Hämangioblastom des ZNS. Die Geschlechtsverteilung betrug 53% / 47% (f/m) und das Alter bei der ersten Operation variierte zwischen 11 und 71 Jahren mit einem Mittelwert von 35 Jahren (SD = 15). Achtundsechzig Prozent der Tumore befanden sich infratentoriell, bevorzugt hemisphäral. Fünf Prozent der Tumore waren im Hirnstamm lokalisiert. Zweiunddreißig Prozent der Hämangioblastome fanden sich in spinaler Lokalisation, davon 36 % zervikal, 48 % thorakal und 16 % lumbal. Von den 42 Tumoren, bei denen Material vorhanden war, waren 13 sporadisch und 29 VHL-assoziiert aufgetreten. Alle Tumore wurden histopathologisch nach der World Health Organisation (WHO) als Hämangioblastome klassifiziert (Böhling et al. 2000). 44 3 Ergebnisse 3.2 Untersuchung der Blutproben 3.2.1 Genetisches VHL-Screening Bei allen 141 Patienten wurde die aus Blut extrahierte DNA mittels SSCP-Analyse als Screeningverfahren untersucht. Dazu wurden das erste Exon und die Exon-Intron Grenzen mit zwei überlappenden Primerpaaren untersucht, die Exons zwei und drei und deren Exon-Intron Grenzen mit je einem Primerpaar. Blutproben von 30 der 141 Patienten wurden vom Verfasser komplett selbst untersucht, bei den restlichen Proben war die Untersuchung bereits teilweise durchgeführt oder abgeschlossen. Bei insgesamt 71 der 141 Fälle fiel eine aberrierende Bande auf (Beispiel siehe Abb. 9). Durch Reamplifikation und Sequenzierung wurde in 70 Fällen eine veränderte Sequenz nachgewiesen, die Ursache des alterierten Laufverhaltens war. In zwei Fällen handelte es sich um Polymorphismen, während in den anderen 68 Fällen eine Mutation vorlag (siehe Zusammenfassung Tab. 5). Acht der Mutationen wurden im Rahmen dieser Studie erstmals publiziert. Bei einem VHL-Patienten (Patient Nr. 9, Tabelle 5) konnte trotz eines auffälligen Bandenmusters keine veränderte Sequenz festgestellt werden. 45 A 3 Ergebnisse B Mutierte Sequenz: Wildtyp-Sequenz: T G T C T G G A G C . . . T G T C C G G A G C . . . Codon 167 Nukleotid 712 Abbildung 9: Beispiel einer SSCP-Analyse (A) mit nachfolgender Sequenzierung (B). Man sieht ein mit PCR amplifiziertes DNA Fragment des VHL-Gens, das in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt wurde. Auf der linken Seite im Gel sieht man einen Normalbefund (N) des dritten Exons. Auf der rechten Seite (Mut.) fällt die Zusatzbande auf. Wird diese ausgeschnitten, reamplifiziert und sequenziert, so ergibt sich die nebenstehende Sequenz. Vergleicht man diese mit der Wildtypsequenz, so fällt ein Austausch der Base Cytosin gegen Thymidin des Nukleotids 712 im dritten Exon auf. Dieser hat eine Veränderung des Codons 167 von CGG nach TGG zur Folge. Es kodiert daher nicht mehr für Arginin, sondern für Tryptophan. Durch diese sogenannte „Missense-Mutation“ wurde also eine basische Aminosäure gegen eine heterozyklische Aminosäure ausgetauscht, wodurch das VHL-Protein funktionsverändert wird. Zum Nachweis großer Deletionen oder Insertionen, die sich nicht mit der SSCPAnalyse entdecken lassen, wurden die 141 Blutproben mit einem Southern Blot auf Rearrangements des VHL-Gens in der konstitutionellen DNA untersucht. Dabei wurden die Blutproben von 47 Patienten vom Verfasser selbst untersucht, die restlichen Ergebnisse lagen bei Beginn der Arbeit bereits vor. Einige Beispiele für den Southern Blot zeigt die folgende Abbildung: 46 N N Del 3 Ergebnisse Del Marker 23,13 kb 9,42 kb 6,56 kb Abbildung 10: Southern Blot. Die genomische DNA wurde zunächst mit dem Restriktionsenzym Eco RI geschnitten und dann zusammen mit einem markierten DNA-Längenmarker sowie Positiv- und Negativkontrolle in einem Agarose-Gel aufgetrennt. Die aufgetrennte DNA wurde daraufhin auf eine Nylonmembran transferiert und das VHL-Gen durch eine Hybridisierungstechnik spezifisch angefärbt. Normalerweise liegt das komplette VHL-Gen auf einem 20 kb großen Eco RI-Fragment. Im Normalfall ist also nur dieses Fragment zu sehen. Findet sich aber auf einem der Allele eine Insertion oder Deletion, so sieht man in der betreffenden Spur neben der 20 kb Bande eine zusätzliche Bande. Auf den linken beiden Spuren ist jeweils ein Normalbefund dargestellt (N). Man sieht, dass beide Allele gleich groß sind (20 kb). Rechts davon sind zwei Proben mit Deletionen von je 10 kb aufgetragen (Del). Hier ist zusätzlich zum 20 kb Allel ein deletiertes Allel von 9 kb zu sehen. Ganz rechts ist ein Größenmarker aufgetragen. Zusatzbanden ergaben sich bei 13 Probanden. In fünf Fällen handelte es sich um eine Deletion von 2 kb, in einem Fall waren 3 kb deletiert, in fünf Proben waren es 10 kb und in zwei Proben betrug die Größe der Deletion 11 kb (siehe Tab. 5). 3.2.2 Genotypen Insgesamt fanden sich bei 81 der 141 getesteten primär symptomatischen Hämangioblastom-Patienten (57 %) eine konstitutionelle Mutation des VHL-Gens. Es kamen dabei insgesamt 42 verschiedene Mutationen vor (s. Tab 5). Allerdings ist der Anteil der VHL-Patienten am Freiburger Universitätsklinikum durch Überweisungen überrepräsentiert. Durch statistische Berechnungen anhand der Wohnorte ergab sich, dass 22 % der Patienten Südbadens mit primär symptomatischen Hämangioblastom eine konstitutionelle Mutation des VHL-Gens haben. Aufgeteilt in Altersgruppen betrifft dies 36 % der Patienten unter 40 und 10 % der Patienten über 40 Jahren. 47 3 Ergebnisse Betrachtet man alle 81 primär symptomatischen Patienten mit Mutationen, so hatten 48 % eine Missense-Mutation, bei der es zum Austausch einer Aminosäure kommt. Weiterhin fanden sich bei 18 % Nonsense Mutationen, die ein Stopcodon einfügen und damit zum Abbruch der Translation an der entsprechenden Stelle führen. Außerdem ließen sich bei 11 % Mikrodeletionen oder Mikroinsertionen finden, die das Leseraster verschoben (frameshift) und damit auch einen Abbruch der Translation unweit der mutierten Stelle erwarten lassen, oder aber ohne Verschiebung des Leserasters (in-frame) eine Aminosäure einfügen. Weiterhin kamen bei 6 % der Patienten splice site Mutationen vor, die mit dem Spleißen der mRNA interferieren. Große Deletionen, die durch den Southern Blot entdeckt werden konnten, kamen bei 16 % der Patienten vor. Nukleotidaustausch Codon Proteinaustausch Mutation Mutations- Zahl der asymptypus Patienten tomatisch Exon 1 c 407 C/T 65 Ser → Leu S65L Missense 1 c 407 C/G 65 Ser → Trp S65W Missense 2 c 407 C/A 65 Ser → stop S65stop Nonsense 1 c 434 T/G* 74 Val → Gly V74G Missense 3 c 437 Ins. A 76 FS 437insA Frameshift 2 c 437 Del.TCT 76 Del.Phe 437del3 In-frame del. 2 c 443 Ins.TCT* 77 Ins. Leu 443ins3 In-frame ins. 1 c 446 A/G* 78 Asn → Ser N78S Missense 1 c 452 G/A* 80 Ser → Asn S80N Missense 1 c 454 C/T* 81 Pro → Ser P81S Missense 1 c 475 T/A 88 Trp → Arg W88R Missense 1 c 477 G/C 88 Trp → Cys W88C Missense 1 c 479 T/C* 89 Leu → Pro L89P Missense 6 c 493 94 Glu → stop E94stop Nonsense 1 c 505 T/C* 98 Tyr → His Y98H Missense 21 c 529 Ins.GCC 106 Ins. Arg 529ins3 In-frame ins. 1 c 544 111 Ser → Arg S111R Missense 1 553+1 G/A splice defect 1 G/T A/C c 553+1 G/A splice defect 1 1 2 13 Exon 2 c 557 A/G* 115 His → Arg H115R Missense 2 c 559 Ins. T 116 FS 559insT Frameshift 1 1 48 3 Ergebnisse c 597 Del. T* 128 FS 597delT Frameshift 1 c 607 C/T* 132 Gln → stop Q132stop Nonsense 1 c 608 A/C 132 Gln → Pro Q132P Missense 2 c 620 T/C 136 Phe → Ser F136S Missense 1 c 620 T/G 136 Phe → Cys F136C Missense 1 c 646 C/T 145 Glu → stop E145stop Nonsense 3 c 665 T/C 151 Ile → Thr I151T Missense 2 c 676 +1 G/C* splice defect 676 +1 G/C Splice defect 2 c 676 +2 C/T* splice defect 676 +2 C/T Splice defect 1 c 677 -2 A/G* splice defect 677 -2 A/G Splice defect 1 c 694 161 Arg → Gly R161G Missense 1 c 694 C/T* 161 Arg → stop R161stop Nonsense 4 c 695 G/C 161 Arg → Pro R161P Missense 1 c 695 G/A 161 Arg → Gln R161Q Missense 1 c 699 C/G* 162 Cys → Trp C162W Missense 1 c 703 C/T* 164 Gln → stop Q164stop Nonsense 1 c 712 C/T 167 Arg → Trp R167W Missense 5 c 713 G/A* 167 Arg → Gln R167Q Missense 1 c 746 T/A* 178 Leu → Gln L178Q Missense 2 c 746 T/C 178 Leu → Pro L178P Missense 1 c 761 C/A* 183 Ser → stop S183stop Nonsense 4 194 FS 794del2 Frameshift 1 2 kb Deletion Deletion 5 3 kb Deletion Deletion 1 10 kb Deletion Deletion 5 11 kb Deletion Deletion 2 1 Exon 3 C/G* c 794 Del.GT 1 1 Große Deletionen Tabelle 5: Konstitutionelle Mutationen des VHL-Gens bei 141 Patienten mit primär symptomatischem Hämangioblastom des ZNS. (c = Nukleotid, kb = Kilobasen, ins = Insertion, del = Deletion, FS = frameshift). Die mit * gekennzeichneten Mutationen wurden zuvor in Zusammenarbeit mit einer weiteren Arbeitsgruppe ermittelt (Glavac et al. 1996) und erneut bestätigt, außer bei den Mutationen, deren Träger inzwischen verstorben waren und deren DNA aufgebraucht war. 49 3 Ergebnisse 3.2.3 Asymptomatische Hämangioblastome Bei den Patienten mit konstitutionellen Mutationen des VHL-Gens wurden auch deren Familienangehörige untersucht. Dabei wurde je nach Mutation entweder ein Southern Blot oder eine PCR-SSCP für das entsprechende Exon durchgeführt. Abbildung 11 zeigt ein Beispiel für eine solche Familienuntersuchung. Abbildung 11: Molekulargenetische Familienuntersuchung. Der Indexfall, hier mit einem Pfeil gekennzeichnet, war primär symptomatisch und wurde zuerst familienanamnestisch als VHL-Patient identifiziert. Daraufhin wurde durch den genetischen Test eine Mutation im VHL-Gen nachgewiesen. Nachfolgend wurden fast alle noch lebenden Verwandten auf die Familienmutation, in diesem Fall 479 T/C, untersucht. Der genetische Befund ist als SSCP direkt unterhalb der getesteten Personen aufgetragen (nt = nicht getestet). Diejenigen Patienten, die drei Banden zeigen, tragen die Mutation. Diese wurden dann dem klinischen Screeningprogramm (s. Tab 2) unterzogen (nt= nicht getestet, schwarze Figuren stehen für symptomatische VHL-Patienten, quer durchgestrichene Figuren stehen für Verstorbene). Durch dieses genetische Familienscreening und die nachfolgende klinische Untersuchung von Mutationsträgern wurden am Freiburger Universitätsklinikum 82 asymptomatische Hämangioblastome bei 21 Patienten neu entdeckt. Deren Tumore befanden sich in drei Fällen infratentoriell, in zehn Fällen spinal und in acht Fällen sowohl infratentoriell als auch spinal. Weiterhin wurde eine Vielzahl von Läsionen außerhalb des ZNS entdeckt. 50 3 Ergebnisse 3.2.5 Sensitivität Um den Nutzen der molekulargenetischen Untersuchung für die HämangioblastomPatienten abzuschätzen, wurde ihre Sensitivität zur Etablierung der Diagnose VHL mit der Sensitivität von klinischer Untersuchung und Familienanamnese verglichen. Einundachtzig von 94 VHL-Patienten (86 %) konnten durch den genetischen Test identifiziert werden. Eine positive Familienanamnese hatten zum Zeitpunkt des Auftretens des Hämangioblastoms 50 % für Hirntumore und 84 % hinsichtlich anderer VHL-assoziierter Läsionen. Sechsunddreißig Prozent der VHL-Patienten hatten zum Zeitpunkt des Auftretens des Hämangioblastoms bereits andere Läsionen aus dem Spektrum der von Hippel-Lindau´schen Erkrankung, die durch klinische Untersuchung entdeckt wurden. Dabei hatten 30 % retinale Angiome und 6 % Phäochromozytome. Keiner der Patienten hatte vorher ein symptomatisches Nierenzellkarzinom. Bei Erstvorstellung hatten 19 % der VHL-Patienten bereits multiple Tumore. Diese Zahl steigerte sich im Verlauf der Erkrankung auf 73 %. Abbildung 12 zeigt die Tumorzahl bei den VHL-Patienten am Ende der Studie. 30% 27% Prozentualer Anteil der Patienten 25% 22% 20% 15% 15% 13% 10% 7% 5% 4% 4% 2% 2% 2% 9 10 0% 1 2 3 4 5 6 7 8 Tumoren Abbildung 12: Tumoranzahl bei VHL-Patienten am Ende der Studie (n = 94 Patienten). 3.2.5 Genotyp-Phänotyp Korrelationen Hier sollten Zusammenhänge zwischen Genetik und Krankheitsverlauf aufgeklärt werden. Anhand ihrer Mutationen wurden die VHL-Patienten in zwei Gruppen 51 3 Ergebnisse aufgeteilt. In der ersten Gruppe waren die Patienten mit Mutationen, die ein VHLProtein mit voller Länge ("full-length") erwarten ließen (F-Typ). Dazu gehören Missense-Mutationen und Mikrodeletionen/ -insertionen, bei denen das Leseraster nicht verschoben wird. Dieser Mutationstypus fand sich bei 64 Patienten. Die Zweite Gruppe wurde von Patienten gebildet, deren Mutationen zum Abbruch der Translation ("truncation") führen (T-Typ). Darunter fielen Nonsense Mutationen, große Deletionen/ Insertionen, sowie solche Mikrodeletionen/ -insertionen, die zu einer Verschiebung des Leserasters führen. in diese Gruppe fielen 16 Patienten. Folgendes wurde dabei beobachtet: Die Patienten mit T-Typ Mutationen entwickelten signifikant häufiger multiple Hämangioblastome als die mit F-Typ Mutationen (78 % vs. 57 %, p<0.02) und mussten häufiger mehrmals operiert werden (56 % vs. 23 %, p<0.05). Weiterhin hatten die Patienten mit T-Typ Mutationen eine höhere Tendenz, Tumore im Spinalkanal zu entwickeln (52 % vs. 30 %). Statistisch war dieser Unterschied allerdings nicht signifikant. Auch bezüglich der Tumorgröße und des Manifestationsalters ergab sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Betrachtet man ausschließlich die Gruppe der Patienten mit F-Typ Mutationen, so ergaben sich hinsichtlich der oben genannten Kriterien auch keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit der häufigen Mutation 505 T/C und denjenigen mit anderen Missense-Mutationen. Weiterhin sollten Unterschiede zwischen Hämangioblastom-Patienten mit und ohne konstitutionellen Mutationen des VHL-Gens aufgeklärt werden. Es fiel auf, dass 35 % der VHL-assoziierten Hämangioblastome im Spinalkanal lokalisiert waren, während dies nur bei 20 % der sporadischen Tumore der Fall war (p<0,02). Darüber hinaus war auch das Alter der Patienten bei Auftreten des Hämangioblastoms unterschiedlich, denn das Durchschnittsalter der VHL-Patienten lag 11 Jahre unter dem der anderen. Auch dieser Unterschied war statistisch signifikant (p<0,001). Abbildung 13 zeigt die Altersverteilungen zum Operationszeitpunkt konstitutionellen Mutationen des VHL-Gens. von Patienten mit und ohne 52 35% 30% 30% 25% 3 Ergebnisse mit konstitutionellen VHL Mutationen 26% ohne konstitutionelle VHL Mutationen 22% 21% 22% 19% 20% 16% 14% 15% 12% 8% 10% 6% 3% 5% 1% 0% 10-20 J 21-30 J 31-40 J 41-50 J 51-60 J 61-70 J 71-80 J Abbildung 13: Altersverteilung von Patienten mit und ohne konstitutionellen Mutationen des VHL-Gens zum Zeitpunkt der Operation. (Patienten mit konstitutionellen VHL Mutationen n = 81, Patienten ohne konstitutionelle VHL Mutationen n = 60). 3.1.6 Kosten Um auch die materielle Bedeutung der molekulargenetischen Analyse abschätzen zu können, wurden außerdem die Kosten des klinischen und genetischen Screenings evaluiert. Ein klinisches Screeningprogramm, wie es in Tabelle zwei (Seite sechs) aufgelistet ist und jährlich durchgeführt werden muss, kostet 2570 Euro. Das genetische Screening kostet 960 Euro (beziehungsweise 1070 Euro mit Sequenzierung). Ist die Mutation bei einem Indexfall identifiziert, so kostet die genetische Familienuntersuchung 290 Euro pro Familienmitglied. 3.3 Analyse der Tumorproben Es wurden 29 VHL-assoziierte und 13 sporadische Hämangioblastome mittels SSCP, LOH und Methylierungsanalyse auf konstitutionelle und somatische Mutationen des VHL-Gens untersucht. 53 3 Ergebnisse 3.3.1 Ergebnisse der SSCP-Analyse Bei der SSCP-Untersuchung der 29 VHL-assoziierten Tumoren wurde in jedem Fall die konstitutionelle Mutation auch im Tumor nachgewiesen. Bei keinem der Tumore wurde durch die SSCP-Analyse eine zusätzliche somatische Mutation gefunden. Dagegen fand sich bei 3 der 13 sporadischen Tumore in der SSCP-Analyse eine somatische Mutation (siehe Tab. 6), wobei aber keiner der sporadischen Tumoren mehr als eine somatische Mutation hatte. In allen drei Fällen handelte es sich um eine Typ T Mutation, die zum Abbruch der Translation führt (eine Nonsense- und zwei Frameshift-Mutationen). Im Gegensatz dazu hatten 64 der 81 Patienten mit konstitutioneller Mutation (79 %) eine Typ F Mutation, die keinen Translationsabbruch zur Folge hat. Zwei der Mutationen (612 del TG und 681 ins 11bp) wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals beschrieben. Abbildung 14 zeigt zwei Beispiele für die SSCPAnalyse bei Tumoren. Mutierte Sequenz: Wildtyp-Sequenz: Codon 162: G A T G GC T C C A G G T G A T G CC T C C A G G T T G T G T G C (Cys) → T G G (Trp) Abbildung 14: SSCP-Analyse bei VHL-assoziierten und sporadischen Blut-Tumor Paaren. Beispiele für die SSCP-Analyse bei Tumoren: Auf der linken Seite (Patient 28) ist im Blut (B) ein Normalbefund zu sehen, während sein sporadischer Tumor (T) eine somatische Mutation aufweist, was an der Zusatzbande erkennbar ist. Die Sequenzierung (nicht abgebildet) ergab in diesem Fall die Mutation 694 C/T, welche im Codon 161 zu einem Stopcodon führt (ArgStop). Bei einem anderen Fall (Pat. 3) lag bereits in der Blutprobe (B) eine konstitutionelle Mutation vor. Dieselbe aberrierende Bande findet sich auch in seinem Tumor (T). Nebenstehend ist die zugehörige Sequenz abgebildet. Es ergab sich am Codon 162 ein Austausch von Cystein nach Tryptophan. 54 3 Ergebnisse 3.3.2 Verlust der Heterozygotie auf dem Chromosomenarm 3P (3PLOH) Der Verlust eines kompletten Allels des VHL-Gens in der Tumor-DNA lässt sich durch den Verlust der Heterozygotie für polymorphe DNA-Marker nachweisen. Dabei werden Polymorphismen im Bereich des VHL-Gens verwendet, die in der DNA mit ausreichend hoher Wahrscheinlichkeit heterozygot vorliegen. Die Heterozygotie stellt sich im Blut durch das Vorliegen zweier Banden dar. Fehlt in der korrespondierenden Tumor-DNA dann eine Bande, so kann man einen Allelverlust - oder Verlust der Heterozygotie - annehmen (Abb. 15). Es können bezüglich LOH nur solche Patienten untersucht werden, bei denen das jeweilige Allel heterozygot vorliegt. Drei dieser Polymorphismen wurden verwendet, wobei zwei im VHL-Gen lagen und der dritte in Richtung Zentromer an das VHL-Gen angrenzte (siehe Abb. 16). Die Heterozygotenrate wird in der Literatur für D3S1038 mit 80 % angegeben (Jones et al. 1992). Für VHL 1149 liegt sie bei 44 % (Payne et al. 1994) und für VHL 19 bei 41 % (Sekido et al. 1994). Abbildung 15 zeigt Beispiele für einen Tumor mit und einen ohne LOH bei demselben Patient (Nr. 17). Patient 17 Patient 17 Acc I RFLP 1149 D3S1038 Abbildung 15: Abbildung 15 zeigt Beispiele für einen Tumor mit und einen ohne LOH bei demselben Patient (Nr. 17). Zwei der untersuchten Loci (VHL 1149 und D3S1038) sind hier abgebildet. Der links abgebildete Tumor (T1) zeigt einen Verlust der Heterozygotie (LOH), was man an der Abschwächung einer Bande erkennt, während im rechts abgebildeten Tumor (T2) und in der Blutprobe (B) beide Allele gleich stark vertreten sind. Die Tatsache, dass das verlorene Allel im Tumorgewebe nicht ganz verschwindet, lässt sich durch Kontamination mit normaler DNA erklären, die aus infiltrierenden Lymphozyten und reaktiv wuchernden Astrozyten stammen kann (Oberstrass et al. 1996). Weiterhin gibt es Hinweise, dass auch das Gefäßendothel bei Hämangioblastomen nicht entartet ist, sondern nur die Stromazellen maligne transformiert sind (Lee et al. 1998). Die Ergebnisse der LOH-Untersuchung sind in Abbildung 16 dargestellt. Insgesamt waren 22 der 31 Patienten (71 %) für wenigstens einen der drei Polymorphismen 55 3 Ergebnisse heterozygot und damit für die LOH-Untersuchung informativ. Von den 31 informativen Tumoren zeigten 18 (58 %) einen LOH an mindestens einem der untersuchten Genloci. Diese Rate differierte nicht signifikant zwischen VHL-assoziierten (62 %) und sporadischen Tumoren (50 %). Auch beim Vergleich von Patienten mit Mutationen vom T-Typ und F-Typ fiel kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit des Auftretens von LOH auf (71 % vs. 60 %, p>0,05). Chromosom 3p 24 25 26 VHL Untersuchte Loci: Tumor D3S1038 VHL19 Familiäre Tumoren 1a 1b 1c 2 3a 3b 4 5a 5b 6 7a 7b 8a 8b 8c 8d 9 10 11 12 13 14a VHL1149 Tumor D3S1038 VHL19 Familiäre Tumoren 14b 15 16 17a 17b 18a 18b VHL1149 Sporadische Tumoren 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 20 31 Abbildung 16: Skizze des kurzen Arms des dritten Chromosoms mit den untersuchten Markern für die LOH-Analysen. Ergebnisse der LOH Untersuchungen an drei verschiedenen Loci bei VHL-assoziierten und sporadischen Hämangioblastomen. ■ = LOH, = erhaltene Heterozygotie, = nicht informativ. 56 3 Ergebnisse 3.3.3 DNA Methylierung Die DNA aller Tumore und korrespondierender Blutproben wurde mit dem methylierungssensitiven Restriktionsenzym Ehe I verdaut. In keinem Fall war der untersuchte Teil des Promoters im Exon 1 hypermethyliert. Abbildung 17 zeigt ein Beispiel der Mehtylierungsuntersuchung. Pat. 1 B T M 1 2 3 B 4 5 Pat. 2 T 6 7 B Pat. 3 . T 8 9 10 11 12 Abbildung 17: Untersuchung von drei korrespondierenden Blut-Tumor-Paaren hinsichtlich Methylierung des VHL Gens (M = Marker, B = Blut, T = Tumor). Dabei wurden für jede DNA zwei Ansätze gemacht. Auf der linken Spur (jeweils ungerade Zahlen) wurde das Verfahren ohne Zugabe von Restriktionsenzym durchgeführt. In jedem Fall ist die Kontrollbande des Exons 3 (266 bp) und zusätzlich die Bande aus Exon 1 (211 bp), die den Promoter amplifiziert, zu sehen. Auf der rechten Spur (jeweils gerade Zahlen) wurde vor der PCR das methylierungssensitive Restriktionsenzym Ehe I zugegeben. Daraufhin hat das Fragment aus Exon 1 nicht mehr amplifiziert, was auf das Schneiden von Ehe I zurückzuführen ist, während das Kontrollfragment aus Exon 3 korrekt amplifizierte. Das Schneiden von Ehe I zeigt an, dass der Promoter bei den vorliegenden Fällen weder in der Blutprobe noch im Tumorgewebe hypermethyliert war. 57 3 Ergebnisse 3.3.4 Synopsis Tabelle 6 zeigt synoptisch alle Ergebnisse der Untersuchungen der Tumorproben. Tabelle 6A fasst die VHL-assoziierte Tumore zusammen, Tabelle 6B zeigt die sporadischen Hämangioblastome Tabelle 6A: VHL-assoziierte Tumore (n=29) Nr. 1a 1b 1c 2 3a 3b 4 5a 5b 6 7a 7b 8a 8b 8c 8d 9 10 11 12 13 14a 14b 15 16 17a 17b 18a 18b Tumorlokalisation Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Spinal T8/9 Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Spinal C4/5 Cerebellum Cerebellum Vermis Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Cerebellum Medulla obl. Spinal C8 Cerebellum Spinal T7/8 Keimbahnmutation Nukleotid 446 A/G 446 A/G 446 A/G 746 T/A 699 C/G 699 C/G 479 T/C 761 C/A 761 C/A 2 kb del 2 kb del 2 kb del 443 ins TCT 443 ins TCT 443 ins TCT 443 ins TCT nicht entdeckt 479 T/C 505 T/C 665 T/C 505 T/C partielle Deletion* partielle Deletion* 529 ins GCC 2 kb del 505 T/C 505 T/C 475 T/A 475 T/A AS N78S N78S N78S L178P C162W C162W L89P S183X S183X Mutationstyp Missense Missense Missense Missense Missense Missense Missense Nonsense Nonsense Deletion Deletion Deletion 77insL In-frame insertion 77insL In-frame insertion 77insL In-frame insertion 77insL In-frame insertion nicht entdeckt L89P Missense Missense Y98H Missense I151T Missense Y98H Deletion Deletion 106insR In-frame insertion Deletion Missense Y98H Missense Y98H Missense W88R Missense W88R Somatische Mutation LOH Methyl. LOH neg LOH neg LOH neg LOH neg neg neg LOH neg ni neg ni neg ni neg LOH neg LOH neg LOH neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg ni neg ni neg LOH neg neg neg ni neg ni neg ni neg LOH neg LOH neg neg neg LOH neg LOH neg 58 3 Ergebnisse Tabelle 6B: Sporadische Tumore (n=13) Tumor Nr. 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Tumorlokalisation Cerebellum Cerebellum Medulla obl. Cerebellum Medulla obl. Cerebellum Cerebellum Medulla obl. Cerebellum Spinal, C1/2 Cerebellum Spinal, T11 Cerebellum Keimbahnmutation Somatische Mutation SSCP nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt 612 del TG frameshift nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt 694 C/T R161X nicht entdeckt 681 ins 11bp fs nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt nicht entdeckt LOH LOH neg neg neg LOH neg LOH ni ni neg LOH ni LOH Methyl. neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Tabelle 6: Synopsis der Befunde der Untersuchung des VHL-Gens bei 42 Hämangioblastomen. (LOH = Verlust eines Allels, neg = negativ, ni = nicht informativ für die LOH Analyse, nicht entdeckt = keine Mutation durch SSCP und Sequenzierung identifiziert. *Ergebnis mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. Stolle, Department of Medical Genetics, University of Pennsylvania, Philadelphia.) 59 4 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Molekulargenetische Diagnostik Hämangioblastome können sporadisch vorkommen oder familiär als Manifestation der von Hippel-Lindau Krankheit auftreten. Obwohl die Behandlung der sporadischen Tumore heutzutage Standard ist und nur selten größere Probleme verursacht, benötigen die Patienten mit VHL-assoziierten Hämangioblastomen sowie deren Familien eine sehr unterschiedliche Betreuung. Wie in der Einleitung ausführlich erläutert, stehen für viele der VHL-assoziierten Läsionen chirurgische Therapiemöglichkeiten zu Verfügung, die weniger invasiv und organerhaltend sind (Neumann und Zbar 1997, Neumann et al. 1999). Dies trifft insbesondere auch für die Hämangioblastome zu, da bei Patienten mit multiplen Tumoren die radiochirurgische Therapie eine Alternative zur mikrochirurgischen Tumorexstirpation bietet (Chang et al. 1998). 4.1.1 Primär symptomatische Hämangioblastome Wegen der starken Variabilität, der Anzahl und des Schweregrades der einzelnen Läsionen, sowie der sehr unterschiedlichen Zahl der betroffenen Organe (Neumann 1996) und der oft nicht sorgfältig genug erhobenen Familienanamnese bereitet die Diagnose der von Hippel-Lindau Krankheit noch immer Schwierigkeiten und wird oftmals nicht gestellt. Durchschnittlich wird die von Hippel-Lindau Krankheit erst 4,5 Jahre nach dem Einsetzen von Symptomen diagnostiziert (Maddock et al. 1996) und hat großen Einfluss auf die Prognose. Wie eingangs erwähnt, ist aber ein frühzeitiges Entdecken und konsequente Folgeuntersuchungen aller VHL-assoziierten Läsionen für eine adäquate Therapie unabdingbar (Lamiell et al. 1989). Da Hämangioblastome zumeist die erste Manifestation der Erkrankung sind (Maddock et al. 1996), kommt der molekulargenetischen Untersuchung dieser Patienten als sicherster Möglichkeit neben Familienanamnese und klinischer Untersuchung bei der Diagnostik eine Schlüsselstellung zu. Wie im Folgenden erläutert, hat sie bei primär symptomatischen Patienten mit Hämangioblastom die höchste Sensitivität aller Verfahren für sich betrachtet (siehe Tab. 7). 60 4 Diskussion Sensitivität der VHL Diagnostik Klinische Diagnostik Familienanamnese andere symptomatische Läsion 36% andere nicht symptomatische Läsion 70% multiple Tumore 19% "Gehirntumor" 50% Andere Läsionen des VHL Komplexes 84% Molekulargenetik 86% Tabelle 7: Sensitivität der VHL Diagnostik bei VHL-Patienten mit primär symptomatischem Hämangioblastom des ZNS. Die angegebenen Sensitivitäten beziehen sich auf den Zeitpunkt der Diagnose des Hämangioblastoms. 100 100 Prozent VHL-assoziiert sporadisch 90 80 74 70 60 50 40 35 30 20 20 19 11 10 1 1 0 Patienten mit multiplen Hämangioblastomen bei Erstvorstellung Patienten mit multiplen Hämangioblastomen bei Studienende Patienten mit eingangs neg. FA und keinen weiteren Manifestationen Patienten mit spinalen Hämangioblastomen Abbildung 18: Relative Verteilung klinischer Gegebenheiten bei VHL-assoziierten und sporadischen Hämangioblastomen des ZNS. Da das multiple Auftreten von Hämangioblastomen bei nur einem sporadischen Fall vorkam, wohingegen 74 % der VHL-assoziierten Fälle am Ende der Studie mehr als einen Tumor hatten (siehe Abb. 18), kann multiples Auftreten von Tumoren als ein guter Hinweis auf das Vorliegen der von Hippel-Lindau Krankheit gewertet werden. Doch nur 19 % des Patientengutes dieser Studie zeigten bereits bei Einsetzen ihrer neurologischen Symptomatik multiple Tumore. Weiterhin hatten nur 36 % der VHLPatienten zum Zeitpunkt des Auftretens des Hämangioblastoms bereits andere symptomatische Manifestationen. Dagegen hatte eine sorgfältige Familienanamnese eine höhere Sensitivität. Bei expliziter Befragung gaben 50 % der VHL-Patienten ein Vorkommen von 61 4 Diskussion „Gehirntumoren“ und 84 % der Patienten das Auftreten anderer VHL-assoziierter Läsionen in der Familie an. Damit erweist sich eine sorgfältige Familienanamnese als eine sehr sensitive Methode, um die Diagnose VHL bei Patienten mit primär symptomatischem Hämangioblastom des ZNS zu stellen. Fasst man die klinische Diagnostik und die Familienanamnese zusammen, so ergibt sich eine Sensitivität von 96 %. Das bedeutet, dass man mit einer Kombination aus ausführlicher Familienanamnese und dem aufwendigen und kostenintensiven klinischen Screeningprogramm eine sehr hohe Sensitivität erreicht. Für sich allein betrachtet hatte jedoch die molekulargenetische Untersuchung die höchste Sensitivität. Es konnte bei 86 % der VHL-Patienten eine Mutation entdeckt werden. Weiterhin ist die molekulargenetische Untersuchung weitaus kostengünstiger als die klinische Diagnostik und weniger belastend für den Patienten. Daher sollte sie zur Diagnostik bei Patienten mit Verdacht auf das Vorliegen der von Hippel-Lindau Krankheit vorgezogen werden. Durch eine Verbesserung der molekulargenetischen Untersuchung Methodik kann die Sensitivität der weiter gesteigert werden. Eine erste Studie berichtet bereits von einer Sensitivität von 100 %. Dies wird erreicht durch das Einsetzen eines quantitativen Southern Blots zum Aufdecken von Deletionen eines gesamten Allels, bei denen die Bindungsstellen der Sonden für den herkömmlichen Southern Blot verloren gehen. Außerdem wird die SSCP-Analyse durch eine sensitivere Methode namens Conformational Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) ersetzt (Stolle et al. 1998). Diese unterscheidet sich von der hier verwendeten SSCP im Wesentlichen dadurch, dass an Stelle der Einzelstränge sogenannte HeteroduplexKomplexe beobachtet werden. Dies sind doppelsträngige DNA Komplexe, die im Falle einer Mutation teilweise heterogen aus Wildtyp und mutierter DNA zusammengesetzt sind und dadurch in ihrem Laufverhalten aberrieren. Da außerdem alle positiv getesteten Patienten im Verlauf der Studie auch klinisch weitere VHL-Manifestationen zeigten, ist die molekulargenetische Untersuchung zugleich auch hochspezifisch. In dem in Tabelle 2 aufgelisteten klinischen Screeningprogramm für VHL Patienten wurden bei 70 % der Patienten asymptomatische Läsionen anderer Organe entdeckt. Diese wurden durch Nachfolgeuntersuchungen überwacht und – falls notwendig – in einem frühen Stadium operiert. Dadurch konnte die molekulargenetische 62 Untersuchung den Krankheitsverlauf 4 Diskussion dieser Patienten wesentlich positiv beeinflussen. 4.1.2 Asymptomatische Hämangioblastome Durch die molekulargenetische Familienuntersuchung und nachfolgende klinische und radiologische Untersuchung von Personen, deren Testergebnis positiv ausfiel, konnten 82 Hämangioblastome bei insgesamt 21 klinisch unauffälligen Patienten entdeckt werden. Diese konnten in einem frühen Stadium kontrolliert und operiert werden, bevor Symptome auftraten. Im Gegensatz dazu werden die Hälfte der symptomatischen Patienten als Notfälle eingeliefert (Neumann et al. 1989). Dies zeigt deutlich den Nutzen der molekulargenetischen Diagnostik für die Familienmitglieder der Hämangioblastom-Patienten. 4.1.3 Genotyp-Phänotyp Korrelationen Wie eingangs erläutert bestehen bei der von Hippel-Lindau Krankheit Korrelationen zwischen Genotyp und Phänotyp. So finden sich beispielsweise bei Patienten mit Phäochromozytom in 96 % Missense-Mutationen. In dieser Studie wurden GenotypPhänotyp Korrelationen bei Hämangioblastom-Patienten nachgewiesen. Es fiel auf, dass die Patienten mit solchen Mutationen, die zum Abbruch der Translation führen (T-Typ), einen schwereren klinischen Verlauf der Erkrankung aufzeigen. Dies spiegelt sich in dem häufigeren Auftreten von multiplen Tumoren, der Anzahl der Operationen und der Lokalisation der Tumore wieder. Wenn solche Ergebnisse in einer höheren Fallzahl bestätigt und durch internationale Kooperation erweitert werden, könnten sie in Zukunft Auswirkungen auf die Behandlung haben und von großem Nutzten für die betroffenen Patienten sein. Neben den erwähnten Daten wären außerdem mutationsspezifische Daten zum Tumorwachstum, Tumorgröße, Komplikationen und Manifestationsalter von Interesse. 63 4 Diskussion 4.1.4 Bedeutung der molekulargenetischen Diagnostik Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die molekulargenetische Untersuchung bei allen Hämangioblastom-Patienten von entscheidender Bedeutung ist: (I) Bei Patienten, die eingangs ein solitäres Hämangioblastom, eine negative Familienanamnese und keine weiteren Manifestationen der Erkrankung aufweisen, die also scheinbar nicht von der von Hippel-Lindau Krankheit betroffen sind, ist die molekulargenetische Diagnostik eine wertvolle Ergänzung zur klinischen Diagnostik. Immerhin fanden sich bei 9 von 66 (14 %) der Patienten in dieser primär scheinbar nicht betroffenen Gruppe Mutationen. Zwei davon waren älter als 60 Jahre, drei zeigten auch nach kompletten klinischem Screening zunächst keine weiteren Läsionen und weitere drei hatten eine negative Familienanamnese. Zwar zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass der Anteil der VHL-assoziierten Hämangioblastome nach der vierten Lebensdekade abnimmt (10 % vs. 36 %), trotzdem aber nicht zu vernachlässigen ist. Daraus kann gefolgert werden, dass auch in dieser Altersgruppe eine molekulargenetische Untersuchung sinnvoll ist. Weiterhin zeigt die Tatsache, dass 64 % der Patienten nach eingehender Aufklärung über eventuelle Folgen und Konsequenzen dem genetischen Test zustimmten, eine hohe Akzeptanz von Seiten der Patienten. Da die Erkrankung genetisch verankert ist, müssen die betroffenen Patienten Zeit ihres Lebens mit dem Auftreten neuer Tumore rechnen (Abb. 19). Bei Patienten mit einem solitären Hämangioblastom vermag einzig die molekulargenetische Diagnostik das Vorliegen dieser Erkrankung nachzuweisen oder auszuschließen. 64 1982 4 Diskussion 1987 1989 1988 Abbildung 19: Multiples Auftreten von Hämangioblastomen im Krankheitsverlauf bei einer 22 jährigen Patientin mit VHL. In den Jahren nach der Diagnose des ersten Tumors treten Rezidive und neue Hämangioblastome auf. Die Patientin hatte die Mutation 676+2 C/T, eine T-Typ Mutation. Diese gehen typischerweise mit einem schwereren Verlauf einher. (II) Für Familienmitglieder der positiv getesteten Hämangioblastom-Patienten, die keine Manifestation des Krankheitskomplexes zeigen, ist die molekulargenetische Untersuchung die einzige sichere diagnostische Möglichkeit. Die Durchführung des kompletten klinischen Screening-Programms an allen negativen Familienmitgliedern wäre unökonomisch, unnötig belastend und resultiert mit hoher Wahrscheinlichkeit in einer geringen Compliance. Weiterhin wäre es besonders für junge Familienmitglieder, die wahrscheinlich noch keine Manifestation haben, zu unsicher, sich auf ein klinisches Screening zu verlassen. Darüber hinaus kann nur durch die molekulargenetische Untersuchung eine Entlastung der nicht betroffenen 65 Familienmitglieder erreicht werden, 4 Diskussion da bei bekannter Familienmutation die Erkrankung hierdurch definitiv ausgeschlossen werden kann und damit unnötige Untersuchungen und auch psychische Belastungen vermieden werden. (III) Auch für die Hämangioblastom-Patienten, die offensichtlich von der von HippelLindau Krankheit betroffen sind, ist der genetische Test zu empfehlen, da hierdurch zum einen die Diagnose gesichert werden kann und zum anderen vielleicht in Zukunft ein spezieller Verlauf der Erkrankung vorhergesagt werden kann, was für die Therapie von Bedeutung wäre. Des weiteren liefert diese Untersuchung den Schlüssel zum genetischen Familienscreening. Mutationen des VHL-Gens kamen in der untersuchten Patientengruppe nicht selten vor und ihre Kenntnis ist sowohl für die Klinik als auch für die Grundlagenforschung von hohem Interesse. Die Erkenntnisse dieser Arbeit stehen in Einklang mit den Empfehlungen der American Society of Clinical Oncology (ASCO). Diese fordert, dass genetische Untersuchungen für Risikopatienten angeboten werden sollten und in verantwortlicher Weise in die Behandlung und Prävention onkologischer Erkrankungen eingebunden werden sollten (ASCO 1996). Alle Patienten mit Hämangioblastomen des ZNS sollten als Risikopatienten in diesem Sinne angesehen werden. Es folgt der Schluss, dass bezüglich der VHL Diagnostik die Molekulargenetik gegenüber klinischen Informationen klar im Vorteil ist. Sie ist sicherer, kostengünstiger und leichter verfügbar. Obwohl der Anteil der VHL-assoziierten Hämangioblastome bei Patienten ohne weitere symptomatische Läsionen geringer ist und die Wahrscheinlichkeit oberhalb des vierzigsten Lebensjahres abnimmt, legen die Erkenntnisse dieser Arbeit die Empfehlung nahe, bei allen Patienten mit Hämangioblastom des ZNS ohne Altersbegrenzung eine molekulargenetische Untersuchung durchzuführen. Diese liefert die Schlüsselinformation für eine sinnvolle Suche nach weiteren Läsionen des Krankheitskomplexes bei den betreffenden Patienten sowie deren Verwandten. Hierdurch kann die Behandlung der von HippelLindau Krankheit nachhaltig verbessert werden. 66 4 Diskussion 4.2 Die molekulare Pathogenese des Hämangioblastoms Die Inaktivierung beider Allele eines Tumorsuppressorgens durch Mutation, Allelverlust, Hypermethylierung oder Kombinationen dieser Mechanismen ist ein entscheidender Schritt in der Entstehung menschlicher Tumore. Vorangegangene Untersuchungen des VHL-Gens in sporadischen und VHL-assoziierten Hämangioblastomen basierten auf kleinen Fallzahlen und wurden nicht systematisch auf alle bekannten Inaktivierungsmechanismen des Gens untersucht. Dadurch entstand ein breites Spektrum sehr unterschiedlicher Ergebnisse. So basierten die vorhergehenden Untersuchungen anderer Gruppen auf Fallzahlen von 7-20 Tumore (Crossey et al. 1994; Kanno et al. 1994; Lee et al. 1998; Oberstrass et al. 1996; Prowse et al. 1997; Tse et al. 1997; Vortmeyer et al. 1997). Um die genetischen Grundlagen der Entstehung des Hämangioblastoms besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit die bisher größte Serie von 42 Hämangioblastomen des ZNS, bestehend aus 29 VHL-assoziierten und 13 sporadischen Tumoren, systematisch auf alle bekannten Inaktivierungsmechanismen des VHL-Gens untersucht. 4.2.1 Intragenische Mutationen des VHL-Gens 4.2.1.1 VHL-assoziierte Tumore Bei allen bis auf einen VHL-assoziierten Tumor (Nr. 9) wurde eine intragenische konstitutionelle Mutation gefunden, die mit der korrespondierenden Blutprobe identisch war. Zusätzliche somatische Mutationen des VHL-Gens kamen bei den VHL-assoziierten Tumoren nicht vor. Zwar ist die Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens durch intragenische Mutationen beschrieben (Prowse et al. 1997), scheint aber für die Pathogenese des Hämangioblastoms von geringerer Bedeutung zu sein. Der wesentliche Mechanismus zur Inaktivierung des zweiten Allels scheint hier ein Allelverlust zu sein. Durch die Southern Blot Methode fanden sich als intragenische konstitutionelle Mutation außerdem partielle Deletionen verschiedener Größe bei sechs VHLassoziierten Tumoren von vier VHL-Patienten. Interessanterweise waren alle diese Tumore, die informativ waren (n = 4), auch positiv bei der LOH-Analyse. 67 4 Diskussion 4.2.1.2 Sporadische Tumore Somatische Mutationen des VHL-Gens wurden in 3/13 (23 %) der sporadischen Tumore gefunden. In allen Fällen wurde die Mutation durch ihre Abwesenheit in der Blut-DNA als somatische Mutation bestätigt. Nur einer der Tumore (8 %) zeigte zusätzlich einen LOH in der Region des VHL-Gens und damit eine Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens. Daraus folgt, dass die biallelische Inaktivierung des VHL-Gens für die Pathogenese des sporadischen Hämangioblastoms eine untergeordnete Rolle spielt. Diese Beobachtung steht im Widerspruch zum Postulat der „two-hit“ Theorie. Drei vorangehende Studien untersuchten bereits Mutationen des VHL-Gens bei sporadischen Tumoren und fanden in 8 % (3/13) (Kanno et al. 1994), 40 % (2/5) (Tse et al. 1997) und 10 % (2/20) (Lee et al. 1998) der Fälle Mutationen. Jedoch wurde bei den vorangegangenen Studien in keinem Fall eine Inaktivierung beider Allele des VHLGens bei sporadischen Hämangioblastomen nachgewiesen, da die LOH Untersuchung entweder nicht durchgeführt wurde, negativ oder nicht informativ war, und der VHL-Promoter nicht auf Methylierung untersucht wurde. 4.2.1.3 Verteilung der intragenischen Mutationen Die Verteilung der somatischen und konstitutionellen Mutationen ist in Abbildung 20 wiedergegeben. Die Struktur des VHL-Elongin C - Elongin B Komplexes wurde kürzlich aufgeklärt (Stebbins et al. 1999). Die Sekundärstruktur des VHL-Proteins lässt sich in eine Elongin C bindende α-helikale Domäne und eine β-Faltblatt Domäne unterteilen, die aus einem siebenlagigen β-Sandwich (Aminosäuren 63-154) und einer α-Helix besteht (Aminosäuren 193-204), die durch hydrophobe Bindungen an eines der β-Faltblätter gebunden ist (siehe Abb. 4, Seite 9). 68 4 Diskussion Abbildung 20: Verteilung der Mutationen, die in den VHL-assoziierten und sporadischen Tumoren gefunden wurden. Einzelheiten im Text. (Pfeile von oben stehen für VHL-assoziierte Tumore und Pfeile von unten für sporadische Tumore. Es sind hier nur strukturelle Mutationen aufgetragen. Weiterhin fanden sich größere Deletionen. utr = untranslatierte Bereiche, α=Bereich der α-helikalen Domäne, β=Bereiche, die an der β-Faltblatt Domäne beteiligt sind). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass intragenische Mutationen, die Hämangioblastome verursachen, vorwiegend in der α-helikalen Domäne und außerdem in einem Teil der β-Domäne, dessen hydrophobe Kernbestandteile für die Integrität des β-Sandwichs wichtig sind, liegen (Stebbins et al. 1999). Die häufigste konstitutionelle Mutation in dieser Serie (c 505 T/C), welche bei insgesamt vier Tumoren von drei Patienten vorkam, hat offenbar keinen entscheidenden Einfluss auf die Struktur des Proteins und interferiert nicht mit der Bindung an Elongin C (Duan et al. 1995; Kishida et al. 1995; Ohh et al. 1998). Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass ein anderes Protein eine wichtige Rolle in der Pathogenese des Hämangioblastoms spielt. 4.2.2 Allelverluste 4.2.2.1 VHL-assoziierte Tumore Vorangehende LOH-Untersuchungen bei VHL-assoziierten Hämangioblastomen haben sehr unterschiedliche Resultate erzielt: : 1/7 (14 %) (Crossey et al. 1994), 3/11 (27 %) (Prowse et al. 1997), 2/3 (66 %) (Tse et al. 1997) and 4/4 (100 %) (Vortmeyer et al. 1997) der informativen Tumore zeigten einen Verlust der Heterozygotie. Dies könnte durch die geringe Zahl der untersuchten Tumore und die Verwendung unterschiedlicher Marker erklärt werden. In dieser Studie zeigten 62 % der informativen VHL-assoziierten Tumore einen LOH. Dies verdeutlicht, dass, wie von der „two-hit“ Theorie vorhergesagt, der Allelverlust als Mechanismus der Inaktivierung des Wildtypallels eine bedeutende Rolle in der Pathogenese des VHLassoziierten Hämangioblastoms spielt. 69 4 Diskussion 4.2.2.2 Sporadische Tumore LOH in der Region des VHL-Gens wurde bei sporadischen Hämangioblastomen bisher in zwei Studien untersucht und wurde in 50 % (1/2) (Tse et al. 1997) und 53 % (10/19) (Lee et al. 1998) gefunden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit der vorliegenden Arbeit, bei der 50 % der sporadischen Tumore einen LOH zeigten. 4.2.3 DNA Methylierung Seit einiger Zeit häufen sich die Hinweise, dass neben Mutationen und Allelverlusten als üblichen Inaktivierungsmechanismen normalerweise nicht methylierten auch CpG-islands die im Hypermethylierung von Promoterbereich von Tumorsuppressorgenen eine Rolle in der Tumorgenese spielt (Gonzalez-Zulueta et al. 1995; Herman et al. 1994; Herman et al. 1995; Jones 1996; Merlo et al. 1995). Frühere Untersuchungen des Methylierungsstatus des VHL-Gens bei Hämangioblastomen erzielten sehr unterschiedliche Ergebnisse und basierten auf kleinen Fallzahlen. So untersuchten Tse et al. acht (drei VHL-assoziierte und fünf sporadische) Hämangioblastome und fanden bei keinem der Tumoren eine Hypermethylierung des Promoters (Tse et al. 1997). Im Gegensatz dazu fanden Prowse et al. eine Hypermethylierung in 50 % (4/8) der von ihnen untersuchten VHL-assoziierten Hämangioblastomen (Prowse et al. 1997). Beide Gruppen benutzten eine Methode, die der in dieser Arbeit verwendeten ähnelt: Dem Verdau mit einem methylierungssensitiven Restriktionsenzym folgte eine PCR mit flankierenden Primern. Allerdings wurden jeweils unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet. Auch die Untersuchung des Methylierungsstatus bei anderen Tumoren des VHL Spektrums erzielte unterschiedliche Resultate (Clifford et al. 1998; Graff et al. 1997; Prowse et al. 1997). Diese stark abweichenden vorhergehenden Ergebnisse unterstreichen den Bedarf an weiteren Untersuchungen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das VHL-Gen in keinem der 42 untersuchten VHLassoziierten und sporadischen Tumoren methyliert war. Während Hypermethylierung ein bekannter Mechanismus der genetischen Inaktivierung bei VHL-assoziierten Nierenzellkarzinomen ist (Herman et al. 1994), scheint dieser epigenische Mechanismus 70 4 Diskussion für die Pathogenese sowohl des VHL-assoziierten als auch des sporadischen Hämangioblastoms nicht signifikant zu sein. 4.2.4 Die Pathogenese VHL-assoziierter und sporadischer Hämangioblastome 4.2.4.1 VHL-assoziierte Tumore Für die Mehrzahl der VHL-assoziierten Tumore bestätigt sich der klassische „two-hit“ Mechanismus der Tumorgenese bezüglich des VHL-Gens. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens bei 62 % der informativen Tumore gezeigt. Jedoch wurde bei 33 % der informativen Tumore die Inaktivierung nur eines Allels gezeigt. Hierfür gibt es drei mögliche Erklärungen: Zum Einen besteht die Möglichkeit, dass ein dominant negativer Effekt eine Rolle in der molekularen Pathogenese des Hämangioblastoms spielen könnte. Damit ist gemeint, dass das strukturell veränderte Protein die Funktion des Wildtypproteins behindert und damit bei bestimmten Mutationen eine Inaktivierung des zweiten Allels nicht vonnöten ist. Ein solcher dominant negativer Effekt ist bereits für das p53 Tumorsuppressorgen beschrieben (Oren 1992), allerdings nicht für das VHL-Gen. Die Beobachtung, dass große Deletionen in der konstitutionellen DNA stets von LOH begleitet sind, während LOH bei Tumoren mit strukturellen Mutationen in der konstitutionellen DNA fehlen kann, passt zu dieser Beobachtung. Denn es ist unwahrscheinlich, dass ein dominant negativer Effekt durch große Deletionen in der konstitutionellen DNA verursacht wird, und daher benötigen diese Tumore den Allelverlust zur Inaktivierung des zweiten Allels. Eine zweite Erklärungsmöglichkeit wäre, dass ein weiteres Gen in der Pathogenese einiger VHL-assoziierter Hämangioblastome eine Rolle spielt. Schließlich könnten auch noch andere genetische oder epigenische Phänomene, die durch die hier verwendeten Methoden nicht entdeckt werden konnten, eine Rolle spielen. Beispielsweise wurden in dieser Arbeit keine Phänomene auf RNA Ebene untersucht. Die Untersuchung von RNA Expression in Hämangioblastomen könnte weitere Aspekte der Tumorgenese klären. 71 4 Diskussion 4.2.4.2 Sporadische Tumore Im Gegensatz zu den VHL-assoziierten Tumore zeigte in der vorliegenden Arbeit nur einer von zehn informativen sporadischen Tumoren eine Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens. Dies legt nahe, dass den sporadischen Hämangioblastomen eine von den VHL-assoziierten Tumoren verschiedene Pathogenese zugrunde liegt und wahrscheinlich andere Gene als VHL für die sporadische Tumorgenese entscheidend sind. Zwei sporadische Tumore zeigen eine alleinige Inaktivierung eines Allels durch eine somatische Mutation, die nicht von einem LOH begleitet wird. Dies könnte wie auch bei den VHL-assoziierten Tumoren durch das Vorkommen anderer genetischer oder epigenischer Mechanismen erklärt werden, oder aber bedeuten, dass die Mutation erst in einem späteren Stadium der Tumorprogression entstanden ist und keine kausale Rolle für die Entstehung des Hämangioblastoms gespielt hat. Die Tatsache, dass fünf von zehn sporadischen Tumoren einen LOH auf Chromosom 3p zeigen, aber vier von ihnen keine strukturelle Mutation des VHLGens haben, lässt vermuten, dass es weitere Gene auf Chromosom 3p gibt, die eine Rolle in der Pathogenese des sporadischen Hämangioblastoms spielen. Eine unterschiedliche, VHL-unabhängige Pathogenese wurde außerdem schon für das sporadische Phäochromozytom (Bender 2000) und für einige klarzellige Nierenkarzinome vorgeschlagen, bei denen Mutationen in Tumorsuppressorgenen im Bereich 3p14-21 eine primäre Rolle in der Tumorgenese bei Tumoren mit 3p LOH aber ohne strukturelle VHL-Mutationen zu spielen scheinen (Clifford et al. 1998). VHL-assoziierte Hämangioblastome 2.Allel VHL 1.Allel Mutation teils VHL, teils eines anderen Gens nahe VHL VHL VHL VHL LOH Konstitutionelle VHL Mutation Sporadische Hämangioblastome LOH 1.Allel 2.Allel Abbildung 21: Neues Modell für die Pathogenese VHL-assoziierter und sporadischer Hämangioblastome. 72 4 Diskussion 4.2.4.3 Schlussbetrachtung Bisher galt Knudsons klassische „two hit“ Inaktivierung des VHL-Gens als das zentrale Dogma für die molekulare Pathogenese VHL-assoziierter und sporadischer Hämangioblastome (Kanno et al. 1994; Lee et al. 1998; Oberstrass et al. 1996). Diese würde die Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens bei allen untersuchten VHLassoziierten und sporadischen Tumore vorhersagen. Für die VHL-assoziierten Hämangioblastome scheint dies zuzutreffen. Die Tatsache aber, dass nur einer von 13 sporadischen Tumoren eine Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens zeigt, legt allerdings nahe, dass nur ein kleiner Teil dieser Tumore durch biallelische Inaktivierung des VHL-Gens verursacht wird. Die Mehrzahl der sporadischen Hämangioblastome scheint jedoch durch andere, noch unbekannte, pathogenetische Ereignisse zu entstehen. Diese Hypothese sollte durch weitere Studien geklärt werden. Es sollte insbesondere nach anderen Genen auf Chromosom 3p gesucht werden, die in die Pathogenese der sporadischen Hämangioblastome involviert sind. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass VHL-assoziierten und sporadischen Hämangioblastomen des Zentralen Pathogenese zugrunde liegen dürfte. Nervensystems eine unterschiedliche 73 6 Literatur 5 Zusammenfassung Hämangioblastome des Zentralen Nervensystems treten entweder sporadisch oder als Manifestation der autosomal dominant vererbten von Hippel-Lindau Krankheit auf, die sich des Nierenzellkarzinome weiteren und im Wesentlichen Phäochromozytome durch retinale auszeichnet. Die Angiome, moderne molekulargenetische Diagnostik hat Perspektiven geschaffen, die es ermöglichen, diese Krankheit auf genetischem Weg festzustellen. Um die Bedeutung der genetischen Untersuchung konstitutioneller DNA für Patienten mit Hämangioblastomen zu klären, wurde in der vorliegenden Arbeit das bisher größte Register klinischer Daten von 141 Patienten mit Hämangioblastomen erstellt und auf konstitutionelle Mutationen hin untersucht. Die genetische Diagnostik ist mit einer Sensitivität von 86 % sicherer als eine klinische Diagnostik und bildgebenden Verfahren im Einzelnen betrachtet. Darüber hinaus ist eine genetische Diagnostik kostengünstiger und Schlüsselinformationen altersunabhängig. und ermöglicht Sie eine liefert die sinnvolle entscheidenden Durchführung von Vorsorgeuntersuchungen bei den Patienten und deren Familien. Mutationen des VHL-Gens sind bei etwa 22 % der Hämangioblastom-Patienten zu erwarten und sind selbst bei Patienten ohne weitere klinische Hinweise auf die Erbkrankheit in 14 % zu finden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die genetische Untersuchung für alle Hämangioblastom-Patienten ohne Altersbegrenzung empfohlen werden sollte. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die Grundlagen der molekularen Pathogenese des Hämangioblastoms neu überdacht. Bisher galt Knudsons klassische “two hit“ Inaktivierung des VHL-Gens als Dogma für die molekulare Pathogenese des Hämangioblastoms. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 42 Hämangioblastomen, darunter 13 sporadische und 29 VHL-assoziierte Tumore, erstmals gleichzeitig alle momentan vermuteten Inaktivierungsmechanismen des VHL-Gens systematisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass der “two hit“-Mechanismus offenbar nur für die familiäre Form des Tumors wesentlich ist, bei denen in 62 % der Fälle eine Inaktivierung beider Allele des VHL-Gens nachgewiesen wurde. Dies konnte hingegen bei den sporadischen Tumoren nur in 8 % der Fälle nachgewiesen werden. Die Mehrzahl der sporadischen Tumore scheint also in ihrer Pathogenese einen anderen Weg zu beschreiten und andere Gene zu involvieren. 74 6 Literatur 6 Literatur Adler J.R., Murphy M.J., Chang S.D., Hancock S.L. (1999) Image-guided robotic radiosurgery. Neurosurgery 44(6):1299-306. Ainsworth P.J., Surh L.C., Coulter-Mackie M.B. (1991) Diagnostic single strand conformational polymorphism, (SSCP): a simplified nonradioisotopic method as applied to a Tay-Sachs B1 variant. 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Weiterhin danke ich ihm für die Unterstützung bei der Arbeit im Labor. Für die Mithilfe bei der grafischen Gestaltung danke ich Marco Gässler. Bei Antje Bohnsack bedanke ich mich für das Korrekturlesen. Meinen Eltern und meinen Schwestern sowie meinen Großeltern, meiner Großtante und allen anderen Verwandten danke ich für die finanzielle und moralische Unterstützung während meines Studiums. Meinen Freunden und Bundesbrüdern danke ich für Unterstützung und Rücksichtnahme. 88 8 Lebenslauf 8 Lebenslauf Persönliche Daten Sven Gläsker geboren am 14.07.1973 in Bünde/ Westfalen ledig Schulbildung 1980 bis 1984 Grundschule Niedereschach 1984 bis 1993 Gymnasium am Hoptbühl, Villingen Wehrdienst 1993 bis1994 Ableistung des Grundwehrdienstes beim Feldartilleriebataillon 295 in Immendingen Hochschulausbildung Seit Okt 1994 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs Universität Freiburg Aug 1996 Ärztliche Vorprüfung Aug 1997 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Sept 1997 Beginn der Doktorarbeit bei Prof. Dr. med. Neumann, Abteilung Innere Medizin IV, Universitätsklinikum Freiburg März 2000 United States Medical Licensing Examination (USMLE 1) Sept 2000 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Famulaturen 1999 Neurochirurgie, 9 Wochen (Department of Neurosurgery, Stanford University Medical Center, Stanford, CA, USA) 1999 Praxisfamulatur, 5 Wochen (Dr. med. Bernhard Gläsker, Internist) 1999 Anästhesie, 4 Wochen (St. Hildegardis Krankenhaus, Köln) 1998 Gynäkologie und Geburtshilfe, 1 Woche (St. Josefs Krankenhaus, FR) 1997 Unfallchirurgie, 4 Wochen (Klinikum der Stadt Villingen-Schwenningen) 89 8 Lebenslauf Praktisches Jahr (2000/2001) 1. Tertial Neurochirurgie: Department of Neurosurgery, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (2 Monate) und Department of Neurosurgery, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA (2 Monate). 2. Tertial Innere Medizin: Klinikum der Stadt Villingen-Schwenningen 3. Tertial Chirurgie: Klinikum der Stadt Villingen-Schwenningen 90 8 Lebenslauf VERÖFFENTLICHUNGEN Im Rahmen dieser Dissertation entstanden die folgenden wissenschaftlichen Publikationen und Vorträge: PUBLIKATIONEN Sven Gläsker, Bernhard U Bender, Thomas W. Apel, Ernst Natt, Vera van Velthoven, Rudolf Scheremet, Josef Zentner , Hartmut P.H. Neumann (1999) The impact of molecular genetic analysis of the VHL-Gene in patients with hemangioblastomas of the central nervous system. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 67:758-762 Bernhard U. Bender, Markus Gutsche, Sven Gläsker, Barbara Müller, Günter Kirste, Charis Eng, Hartmut P.H. Neumann (2000) Differential genetic alterations in von Hippel-Lindau syndrome-associated and sporadic pheochromocytomas. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 85:4568-74 P. Riegler, W. Huber, R. Corradini, H.P.H. Neumann, S. Gläsker, A. Sessa (2000) Von Hippel-Lindau disease: the role of gene analysis in affected families. Nephron 84(1):95-7 Sven Gläsker, Bernhard U. Bender, Thomas W. Apel, Vera van Velthoven, Lois M. Mulligan, Josef Zentner , Hartmut P.H. Neumann (2001) Reconsidering of biallelic inactivation of the VHL tumor suppressor gene in hemangioblastomas. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 70:644-648 Weng-Onn Lui, Jindong Chen, Sven Glasker, Bernhad U Bender, Casey Madura, SokKean Khoo, Eric Kort, Catharina Larsson, Harmut P H Neumann, Bin-Tean The (2002) Selective loss of chromosome 11 in pheochromocytomas associated with the VHL syndrome. Oncogene 21(7): 1117-22. 91 8 Lebenslauf Hartmut P.H. Neumann, M.D., Birke Bausch, Sarah R. McWhinney, B.A., Bernhard U. Bender, M.D., Oliver Gimm, M.D., Gerlind Franke, Ph.D., Joerg Schipper, M.D., Joachim Klisch, M.D., Carsten Altehoefer, M.D., Klaus Zerres, M.D., Andrzej Januszewicz, M.D., Wendy M. Smith, B.A., Robin Munk, M.D., Tanja Manz, M.D., Sven Glaesker, M.D., Thomas W. Apel, Ph.D., Markus Treier, M.D., Martin Reineke, M.D., Martin K. Walz, M.D., Cuong Hoang-Vu, M.D., Michael Brauckhoff, M.D., Andreas Klein-Franke, M.D., Peter Klose, M.D., Heinrich Schmidt, M.D., Margarete Maier-Woelfle, M.D., Mariola Peçzkowska, M.D., Cesary Szmigielski, M.D., Charis Eng, M.D., Ph.D. (2002) Germ-Line Mutations in Nonsyndromic Pheochromocytoma. The New England Journal of Medicine 346:1459-1466. WISSENSCHAFTLICHE VORTRÄGE UND POSTERS „VHL germline testing: The impact for timely diagnosis of pheochromocytoma“ Deutsche Medizinische Wochenschrift, Abstractband zur 23. Wissenschaftlichen Tagung der Deutschen Liga zur Bekämpfung des hohen Blutdrucks und der Deutschen Hypertonie Gesellschaft. Karlsruhe, 20. Nov. 1999. (Vortrag) “Screening for VHL in patients with hemangioblastomas of the CNS”. Fourth International Symposium on von Hippel-Lindau Disease, Mayo Clinic, Rochester, MN, 22. Jul. 2000. (Vortrag) „Molecular Pathogenesis of CNS Hemangioblastomas“ Fifth International Symposium on von Hippel-Lindau Disease, Padua, Italien, 9. Juni 2002 (Poster)
