B-CLL

Inhaltserzeichnis
1
Einleitung
8
1.1
B-chronische lymphatische Leukämie (B-CLL)
8
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.1.5
1.1.6
1.1.7
1.1.8
1.1.8.1
1.1.8.2
1.1.8.2.1
1.1.8.2.1.1
1.1.8.2.1.2
1.1.8.2.1.3
1.1.8.2.1.4
1.1.8.2.1.5
1.1.8.3
Definition
Klinische Symptome
Diagnose
Stadieneinteilung und Verlauf
Andere Risikofaktoren und Prognose
Pathogenese
Immunologie
Therapie
Chemotherapie
Weitere Therapiemöglichkeiten
Immuntherapie
Antikörper
Zytokine
Gentherapie
Adoptive Immuntherapie
Transplantation
Primärtherapie
8
8
9
10
11
12
13
15
16
17
17
17
18
19
20
20
21
1.2
Immunantwort
22
1.2.1
1.2.2
1.2.3
Aktivierung von T-Zellen
Effektorfunktion der zytotoxischen T-Zellen (CTLs)
Tumor-escape Mechanismen
22
24
25
1.3
Tumorantigene
26
1.3.1
1.3.2
1.3.2.1
1.3.2.2
1.3.2.3
Universelle, Tumor-assoziierte und Patienten-spezifische Tumoranti­
gene
Antigene bei der B-CLL
hTERT
Humanes Ly9 (CD229)
CD23
27
28
28
31
32
2
Aufgabenstellung
34
3
Material und Methoden
35
3.1
Material
35
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
3.1.8
3.1.8.1
3.1.8.2
3.1.8.3
3.1.8.4
3.1.8.5
Chemikalien
Zusätzliche Reagenzien
Weitere Materialien
Geräte
Reagenzienkits
Molekulargewichtsmarker
Oligonukleotide (Primer)
Antikörper
Sekundäre Antikörper
Blockierungsantikörper
HLA-A2-lmmunphänotypisierung
Immunphänotypisierung
Isotypkontrollen
35
36
36
36
37
37
37
37
38
38
38
38
39
4
http://d-nb.info/1025914058
3.1.9
3.1.10
3.1.11
3.1.12
Medien und Lösungen
Peptide
Zelllinien
Patientenproben und gesunde Spender
39
40
41
42
3.2
Methoden
43
3.2.1
3.2.1.1
3.2.1.2
3.2.1.3
43
43
44
3.2.1.4
3.2.1.5
3.2.1.6
3.2.1.7
3.2.1.8
3.2.1.9
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.2
3.2.2.3
3.2.2.4
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.5.1
3.2.5.2
3.2.5.3
3.2.5.4
3.2.5.5
3.2.6
Zellkulturtechniken
Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut
Generierung Dendritischer Zellen (DCs)
T-Lymphozyten Isolierung aus gesunden Spendern und B-CLL
Patienten
Generierung Antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen (gesunde Spender)
Herstellung von BLCLs
Generierung der Effektor T-Zellen von B-CLL Patienten
Stimulation der B-CLL Zellen mittels humanem CD40-Ligand (hCD40L)
Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zellkultur der Standardzelllinien
RT-PCR
RNA Extraktion
cDNA Synthese (Reverse Transkription)
PCR
Agarose Gelelektrophorese
IFN-Y-ELISPOT
Chromfreisetzungsnachweis ([Cr51]-Release Assay)
Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)
Immunphänotypische Analysen
HLA-A2-DimerX Färbung der T-Zellen
HLA-A0201-Immunphänotypisierung
Standard T2-Bindungstest
Humaner T h 1/T h 2 Cytometric Bead Array (CBA)
Statistische Auswertung
4
Ergebnisse
57
4.1
Peptidbindungskapazität (T2-Bindungstest)
57
4.2
hTERT
59
4.2.1
4.2.2
hTERT-mRNA Überexpression in B-CLL Zellen
In vitro Generierung hTERT-spezifischer CTLs von gesunden Spendern
mit Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs)
hTERT-spezifische CTLs erkennen B-Zell Tumorzelllinien
Expansion autologer T-Zellen von B-CLL Patienten
Naive und CD40L-aktivierte B-CLL Zellen als Stimulatoren
Naive B-CLL Zellen als Stimulatorzellen
HLA-A2-Dimer/Peptid Färbung der mit naiven autologen B-CLL Zellen
expandierten T-Zellen von B-CLL Patienten
CD40L-aktivierte B-CLL Zellen als Stimulatoren
Dimerfärbung der mit CD40L-aktivierten B-CLL Zellen expandierten
T-Zellen von B-CLL Patienten
59
4.3
CD229
72
4.3.1
4.3.2
Überexpression von CD229 (humanes Ly9) in B-CLL Zellen
Generierung CD229-spezifischer CTL Antworten mit Peptid-beladenen
DCs als APCs in vitro
CD229-spezifische CTLs erkennen Tumorzelllinien verschiedenen
72
4.2.3
4.2.4
4.2.4.1
4.2.4.1.1
4.2.4.1.2
4.2.4.1.3
4.2.4.1.4
4.3.2.1
45
45
46
47
47
48
48
48
48
49
49
50
50
51
52
52
52
53
53
54
56
59
61
63
64
65
66
68
69
74
5
B-Zellursprungs
Antigen-spezifische CTLs gesunder Spender erkennen naive
B-CLL Zellen
Expansion autologerT-Zellen von B-CLL Patienten
Naive B-CLL Zellen als Antigen-präsentierende Zellen
Naive B-CLL Zellen können spezifisch autologe T-Zellen expandieren
CD229-spezifische HLA-A2-Dimer/Peptid Färbung der expandierten
T-Zellen
CD40L-stimulierte B-CLL Zellen als Antigen-präsentierende Zellen
Expansion autologer CD229-spezifischer T-Zellen mit CD40Lstimulierten B-CLL Zellen
CD229-spezifische HLA-A2-Dimer/Peptid Färbung expandierter
T-Zellen nach Stimulation mit CD40-aktivierten B-CLL Zellen
76
4.4
CD23
90
4.4.1
4.4.2
Überexpression von CD23 auf B-CLL Zellen
Generierung CD23-spezifischer CTL Antworten in vitro mit Hilfe
Peptid-beladener DCs
Erkennung B-zellulärer Tumorzelllinien durch CD23-spezifische CTLs
Naive B-CLL Zellen werden effizient von in vitro generierten, gesunden
CD23-spezifischen CTLs erkannt
Autologe T-Zellexpansion von B-CLL Patienten
Naive B-CLL Zellen als Antigen-präsentierende Zellen (APCs)
CD23-spezifische T-Zellexpansion durch autologe B-CLL Zellen
CD23-spezifische HLA-A2-Dimer/Peptid Färbung der expandierten
T-Zellen
CD40L-stimulierte B-CLL Zellen (CD40L-B-CLLs) als Antigenpräsentierende Zellen
CD23-spezifische T-Zellexpansion durch autologe CD40L-B-CLLs
CD23-spezifische HLA-A2-Dimer/Peptid Färbung der expandierten
T-Zellen nach Stimulation mit CD40L-stimulierten B-CLL Zellen
90
101
Zytokinprofile der naiven und CD40L-aktivierten B-CLL
Zellen
105
5
Diskussion
107
5.1
Zusammenfassung der Daten und kritische Beurteilung
107
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4
Erfüllung der TAA-Kriterien
Autologe T-Zellstimulation - naive B-CLL Zellen als APCs
Autologe T-Zellstimulation - CD40L-stimulierten B-CLL Zellen als APCs
Naive B-CLL Zellen als APCs: Mögliche Mechanismen
107
110
111
112
5.2
Potential der Antigene hTERT, CD23 und CD229 in der
Immuntherapie und Ausblick
113
5.2.1
5.2.2
Vergleich der untersuchten Antigene
Ausblick
113
117
6
Zusammenfassung
119
7
Abkürzungen
121
8
Literatur
124
4.3.2.2
4.3.3
4.3.3.1
4.3.3.1.1
4.3.3.1.2
4.3.4
4.3.4.1
4.3.4.2
4.4.2.1
4.4.2.2
4.4.3
4.4.3.1
4.4.3.1.1
4.4.3.1.2
4.4.3.2
4.4.3.2.1
4.4.3.2.2
4.5
77
78
79
79
82
84
84
86
92
92
94
96
96
96
98
100
100
6
Anhang
Danksagung