ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus der Universitäts- Frauenklinik der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Bestimmung von Infektionsmarkern in nicht-invasiv
gewonnenem Fruchtwasser bei Schwangeren mit
frühem vorzeitigen Blasensprung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt 2008
von Nomita Schwöppe
geboren in Freiburg i.Br.
Dekan:
Prof. Dr. C. Peters
1.Gutachter:
PD Dr. W. Schäfer
2.Gutachter:
Prof. Dr. W. Kreisel
Jahr der Promotion: 2008
Meiner Familie
Abkürzungsverzeichnis
AIS
Amnioninfektionssyndrom
ABS
Apnoe- Bradykardie-Syndrom
BCSF
B-cell stimulating factor
CDF
Cytolytic differentiation factor
CRP
Kapsel reaktives Protein
EU
Extrauterin- Gravidität
fVBS
früher vorzeitiger Blasensprung
FW
Fruchtwasser
FG
Frühgeborenes
G
Gravida
HDL
high densitiy lipoprotein
HSF
hepatocyte stimulating factor
ICH
Intrazerebrale Hämorrhagie
IF-γ
Interferon-γ
IL
Interleukin
LBP
LPS- bindendes Protein
LDL
low density lipoprotein
LPS
Lipopolysaccharid
MMP
Matrix- Metallo- Proteinase
NEC
Nekrotisierende Enterokolitis
NO
Stickstoffmonoxid
pPROM
Preterm premature rupture of membranes
P
Para
POCT
Point-of-Care Testing
SSW
Schwangerschaftswoche
sCD14
Soluble CD 14
TIMP
tissue-inhibitory metalloproteinase
TLR
Toll-like receptor
TNFα
Tumor-Nekrose-Faktor α
I
II
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1
1.1 Einführung
1
1.2 Die Frühgeburt
2
1.2.1
Definition
2
1.2.2
Ätiologie und Risikofaktoren der Frühgeburt
2
1.3 Der frühe vorzeitige Blasensprung
1.3.1
Definition
4
1.3.2
Ätiologie und Pathogenese
4
1.3.3
Management des frühen vorzeitigen Blasensprungs
8
1.4 Intrauterine Infektionen
9
1.4.1
Amnioninfektionssyndrom/ Chorioamnionitis
10
1.4.2
Fetal inflammatory response syndrom
12
1.4.3
Neonatale Sepsis
14
1.4.4
Akutmorbidität und Langzeitfolgen
15
1.5 Infektionsmarker
2
4
16
1.5.1
TNF-α
17
1.5.2
IL-6
18
1.5.3
LBP
19
1.5.4
CRP
20
1.6 Fragestellung und Zielsetzung
21
Material und Methoden
22
2.1 Material
22
2.1.1
Immunoassay
22
2.1.2
Materialien zur Fruchtwassergewinnung
22
2.2 Patienten
22
2.2.1
Patientengut
22
2.2.2
Ein- und Ausschlusskriterien
23
2.2.3
Klinische Daten
23
Inhaltsverzeichnis
2.3 Fallgruppeneinteilung
24
2.4 Probengewinnung
26
2.4.1
Spiegeleinstellung
26
2.4.2
Gewinnung von abgehendem Fruchtwasser aus Binden
26
2.4.3
Makroskopische Beschaffenheit des Fruchtwassers
27
2.5 Immunologische Bestimmung von TNF-α, IL-6 und LBP
3
4
III
28
2.5.1
Immulite- Laborautomat
28
2.5.2
Quickline-Schnelltest
29
2.6 Statistische Methoden
31
Ergebnisse
32
3.1 Probengewinnung und Logistik
33
3.2 Studiengruppen
33
3.3 Zytokine und LBP in abgehendem Fruchtwasser
35
3.3.1
TNF-α- Messungen
35
3.3.2
IL-6- Messungen
36
3.3.3
LBP-Messungen
38
3.4 Maternale Serum- CRP und Leukozytenwerte
39
3.5 Mütterliche Parameter und des kindliches Outcomes
40
3.6 Falldarstellungen
42
3.6.1
Typische Fälle aus Fall-bzw. Kontrollgruppe
42
3.6.2
Sonder- und Grenzfälle
44
3.7 Schnelltestuntersuchung für TNF-α
48
Diskussion
49
4.1 Methoden der Fruchtwassergewinnung
49
4.2 Infektionsparameter in abgehendem Fruchtwasser
51
4.2.1
TNF-α
52
4.2.2
IL-6
53
Inhaltsverzeichnis
4.2.3
LBP
IV
55
4.3 Vergleich von Parametern im maternalen Serum vs. Infektionsparameter im
abgehenden Fruchtwasser
55
4.4 Sonder- und Grenzfälle
57
4.5 Ausblick: Schnelltest
59
5
Zusammenfassung
61
6
Literaturverzeichnis
62
7
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen
75
8
Dankansagung
9
Lebenslauf
76
77
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Einführung
Der frühe vorzeitige Blasensprung (fVBS) ist eine Hauptursache perinataler
Morbidität und Mortalität. Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte in der
neonatalen Intensivmedizin gelungen sind, stellt der fVBS weiterhin eine
Herausforderung dar. Zahlreiche Untersuchungen zeigen, dass intrauterine
Infektionen eine wesentliche Ursache des fVBS sind. Die davon betroffenen
schwangeren Frauen stellen eine Hochrisikogruppe dar, weil aszendierende
Infektionen hier zu einer vitalen Gefährdung des ungeborenen Kindes führen können
(Gomez et al. 1998; Mercer 2003).
Die Diagnostik einer intrauterinen Infektion ist schwierig. Anhand klinischer
Symptome werden intrauterine Infektionen in der Schwangerschaft meist spät
erkannt. Die frühzeitige Diagnostik einer intrauterinen Infektion ist aber in Bezug auf
das weitere klinische Management wesentlich, da durch eine rechtzeitige Therapie
schwere Komplikationen und Folgeschäden (Sepsis, zerebrale Langzeitschäden,
chronische Lungenerkrankungen) vermieden werden könnten (Pasquier et al. 2007).
Die rechtzeitige Erkennung einer vitalen Gefährdung des ungeborenen Kindes durch
initial inapparent verlaufenden intrauterinen Infektionen stellt bislang ein ungelöstes
Problem dar. Die etablierten klinischen Parameter, (z.B. maternales CRP, maternale
Leukozytose, maternales Fieber, fetale Tachykardie, Druckdolenz des Uterus oder
übelriechendes Fruchtwasser (FW) (Leitlinien Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie
und Geburtshilfe)) sind für die Erkennung eines erhöhten Risikos für den Feten
weniger aussagekräftig, da es sich um späte und unspezifische Parameter im
Entzündungsgeschehen handelt (Trochez-Martinez et al. 2007). Die Suche nach
diagnostischen Parametern, die frühzeitig eine subklinische intrauterine Infektion
anzeigen, konzentriert sich nun auf biochemische Marker, die direkt am
Infektionsherd gebildet werden und in lokal entnommenen Proben signifikante
Konzentrationsveränderungen zeigen. In diesem Zusammenhang ist aufgrund
zahlreicher publizierter Daten anzunehmen, dass bei intrauterinen Infektionen die
Spiegel von inflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8),
Interleukin-1-beta (IL-1ß), Tumor- Nekrose- Faktor- alpha (TNF-α) im Fruchtwasser
Einleitung
2
stark ansteigen (Holst et al. 2007; Baud et al. 1999; Figueroa-Damian et al. 1999,
Romero et al. 1990; Shobokshi et al. 2002).
Beim heutigen Stand der Diagnostik, kann eine bereits in utero etablierte Infektion
des Kindes, erst postpartal sicher diagnostiziert werden. Im Nabelschnurblut wurden
bei Neugeborenen mit einem FIRS (fetal inflammatory response syndrome)
signifikant erhöhte Spiegel inflammatorischer Zytokine gefunden (Murthy et al. 2007).
1.2 Frühgeburt
1.2.1 Definition
Die Frühgeburt wurde von der WHO als Entbindung vor der vollendeten 37.
Schwangerschaftswoche bzw. weniger als 259 Tage nach dem ersten Tag der
letzten Periode definiert (WHO 1993). Es wird zwischen „ mäßig frühen“ (33.-36.
SSW) Frühgeburten und sehr frühen Frühgeburten (bis Ende 32. SSW)
unterschieden (Saroj et al. 2008).
Etwa 12-13 % aller Kinder kommen in den USA als Frühgeborene zur Welt. In
Europa liegt der Anteil der Frühgeborenen bei 5-9% (Goldenberg et al. 2008).
Die Frühgeburtlichkeit ist für 70 % der neonatalen Mortalität verantwortlich (Mc
Cormick 1985).
Daher ist es ein wichtiges Ziel der heutigen Perinatalmedizin die Zahl der sehr frühen
Frühgeburten zu reduzieren.
1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren der Frühgeburt
In vielen Studien wurden bereits die multifaktoriellen Ursachen der Frühgeburtlichkeit
untersucht (Goldenberg et al. 2008; Iams et al. 2008; Schneider et al.1994). Die
vorzeitige Wehentätigkeit, der vorzeitige Blasensprung und fetale bzw. maternale
Infektionen spielen dabei eine zentrale Rolle (Goldenberg et al. 2008).
Mehr als 1/3 aller Schwangerschaften sind von vorzeitiger Wehentätigkeit betroffen
(Tan et al. 2006). Die vorzeitige Wehentätigkeit stellt damit ein nicht unerhebliches
Krankheitsbild.
Einleitung
3
Mögliche pathogenetische Faktoren für die Entstehung vorzeitiger Wehentätigkeit
sind (Romero et. al 2006):
•
Infektionen
•
Plazentationsstörungen
•
Fetale Ursachen und fetale Pathologie
•
Uteruspathologie und mütterliche Störungen bzw. Erkrankungen
Schwangerschaftsbeendigung aufgrund fetaler oder maternaler Pathologien trägt zur
Frühgeburtlichkeit bei (Schneider et al. 1994, Tucker et al. 1991). Zur effektiven
Therapie und Vermeidung dieser Faktoren für Frühgeburtlichkeit, stellt die
aszendierende genitale Infektion einen möglichen Ansatzpunkt, um neue
diagnostische und therapeutische Strategien zu überdenken. Zahlreiche Studien
bekräftigen, dass Infektionen ein Hauptrisikofaktor bei der Entstehung der Frühgeburt
sind (Mercer 2003).
Bei den weiteren Risikofaktoren kann man zwischen maternalen, kindlichen und
sozioökonomischen Faktoren differenzieren. Dies sind z.B.
•
Mütterliches Alter < 20 oder > 35 Jahre (Ko et al. 2002)
•
Ethnische Faktoren (Steer et al. 2005)
•
Sozioökonomische Faktoren (Smith et al. 2007)
•
Schwangerschaftsanamnese (Roberts et al. 1990)
•
Nikotinabusus (Kyrklund- Blomberg et al. 2005)
•
Genetische Faktoren (De Franco et al. 2007)
Als Hochrisiko-Kollektiv gelten Frauen mit frühem vorzeitigem Blasensprung, auf den
im folgenden Kapitel eingegangen wird.
Einleitung
4
1.3. Der frühe vorzeitige Blasensprung
1.3.1 Definition
Man unterscheidet grundsätzlich zwischen dem rechtzeitigen Blasensprung am
Ende der Eröffnungsphase / während der Austreibungsphase und dem frühzeitigen
Blasensprung, der zwar während der Eröffnungsperiode stattfindet, jedoch bevor der
Muttermund vollständig eröffnet ist.
Von diesen Formen ist der vorzeitige Blasensprung zu unterscheiden, der als Ruptur
der fetalen Membranen vor dem Einsetzen regelmäßiger Wehentätigkeit unabhängig
von der Schwangerschaftsdauer definiert ist.
Als Sonderfall gilt der frühe vorzeitige Blasensprung (pPROM = preterm premature
rupture of membranes). Hier kommt es zum Fruchtwasserabgang vor der vollendeten
37. SSW (Pschyrembel 2006).
1.3.2 Ätiologie und Pathogenese
Der vorzeitige Blasensprung ist definiert als Ruptur der Fruchtblase vor Einsetzen
der Wehentätigkeit. Es besteht dann vor allem die Gefahr der aszendierenden
Infektion, die sowohl die Mutter, als auch das ungeborene Kind betreffen kann. Der
vorzeitige Blasensprung tritt bei circa 20 %, der frühe vorzeitige Blasensprung bei ca.
2-5 % aller Schwangerschaften auf (Doody et al. 1997). Etwa jeder dritten
Frühgeburt geht ein früher vorzeitiger Blasensprung voraus (Mercer 2003).
Ca. 25% der perinatalen Mortalität sind auf einen frühen vorzeitigen Blasensprung
zurückzuführen. Das Risiko für ein solches Ereignis in einer folgenden
Schwangerschaft ist um den Faktor 2-5 erhöht (Reisenberger et al. 2000).
Folgende maternale und fetale Risiken sind im Zusammenhang einem fVBS
beschrieben (Egarter 2001):
•
Maternale Sepsis
•
Abruptio placentae
•
Respiratory distress syndrom
•
Neonatale Sepsis
•
Intraventrikuläre Blutungen des Feten
Einleitung
•
Pulmonale Hypoplasie des Feten
•
Deformitäten und Malformationen der fetalen Extremitäten
5
Von Menon et al. (2007) wurden verschiedene ätiologische Faktoren zum vorzeitigen
Blasensprung beschrieben:
•
Infektionen des weiblichen Genitaltraktes (bakterielle Vaginose,
Trichomonaden, Gonorrhoe, Chlamydien)
•
Verhaltensgewohnheiten ( Rauchen, Drogenmissbrauch, Ernährungsstatus,
Sexualverhalten)
•
Schwangerschaftskomplikationen (Multipara, Polyhydramnion,
Cervixinsuffizienz, zervikale Manipulationen, Blutungen)
•
Veränderung der Umgebung (Luftdruckveränderung)
Einem Blasensprung gehen strukturelle Veränderungen an den Eihäuten voraus.
Diese werden durch verschiedene chemische Interaktionen gesteuert. Solche
Prozesse finden einerseits zwischen unterschiedlichen Zellpopulationen der Eihäute
untereinander statt, andererseits zwischen Zellpopulationen und der extrazellulären
Matrix.
Zwischen Amnion und Chorion liegt die Zona spongiosa (siehe Abb.1). Diese
intermediäre Schicht absorbiert mechanische Belastung, indem sie dem Amnion
gegenüber dem Chorion, welches fest mit der Dezidua verbunden ist, eine gewisse
Bewegungsfreiheit gewährleistet. Das Chorion ist dicker als das Amnion, hält jedoch
mechanischen Belastungen weniger Stand (Egarter 2001).
Einleitung
6
Abb.1 : Histologische Darstellung von Amnion und Chorion
CR: Chorion, AE: Amnion epithelium, AM: Amnion (aus Seyffarth et al. (2004))
Das Chorion besteht aus Zona reticularis, Basalmembran und Trophoblast.
Das Amnion besteht aus Epithel, Basalmembran, Zona compacta, Fibroblastenschicht und Zona
spongiosa
Ab der 20. SSW wird Belastbarkeit geringer und ein Blasensprung somit
wahrscheinlicher. Dies liegt an der physiologischerweise abnehmenden Synthese
von Kollagen in den fetalen Membranen und dem vermehrten Umbau des Amnions.
Der vorzeitige Blasensprung kann heute als multifaktorielles Zusammenwirken
mehrerer Faktoren betrachtet werden. Die Rolle von Infektionen ist besonders
wichtig, da die aszendierende genitale Infektion die häufigste Ursache des
vorzeitigen Blasensprungs ist (Asrat et al. 2001).
Der entscheidende Faktor für die schädigende Wirkung von Bakterien an den
Eihäuten ist die Freisetzung proteolytisch wirksamer Enzyme. Ein Gleichgewicht
zwischen den Proteasen und deren Inhibitoren ist entscheidend für eine intakte
Eihaut. In diesem Zusammenhang spielen die Matrixmetalloproteasen (MMP) eine
wichtige Rolle. Durch verstärkte Aktivität von MMP kommt es zum Abbau von
Kollagen innerhalb des Amnions. Während der normalen Schwangerschaft besteht
ein Gleichgewicht zwischen dem kollagenabbauendem Enzym MMP und dem
Gegenspieler TIMP (= tissue inhibitor of metalloproteinases; spezifischer
Gewebehemmfaktor). Dieses Verhältnis ändert sich z.B. während der Wehentätigkeit
zugunsten der MMP. So wird nach neueren Erkenntnissen der vorzeitige
Blasensprung durch erhöhte MMP –2 und erniedrigte TIMP-1 -Spiegel begünstigt
(Ota et al. 2006). Eine weitere Hypothese ist, dass der genetische Polymorphismus
Einleitung
7
der MMP ethnische Unterschiede bezüglich des Risikos für eine Frühgeburt erklären
könnte (Weiss et al. 2007). Romero et al. (1993) postulierte, dass es bei einer
Infektion des Amnions zur Aktivierung von Makrophagen und anderen
immunkompetenten Zellen kommt, wobei es nach entsprechendem Reiz durch
Bakterien zur Bildung von inflammatorischen Zytokinen kommt. Die chemotaktischen
Zytokine bewirken ein Einwandern von Neutrophilen, die ebenfalls wieder MMP
freisetzen. Einige Zytokine besitzen auch pro- bzw. antiapoptotische Eigenschaften.
Dies ist relevant, denn durch vermehrte Apoptose kommt es zusätzlich zur
Belastung des Amnions, welche in einem Blasensprung enden kann (Parry et al.
1998).
Als weitere Ursache zur Entstehung eines frühen vorzeitigen Blasensprungs
beschrieben Arias et al. (1997) plazentare thrombotische Veränderungen, die sich
bei über 40 % der Patientinnen zeigen. Diese können zur weiteren Synthese von
Enzymen führen, die dann einen vorzeitigen Blasensprung bewirken können.
Auch physikalischer Stress kann Ursache eines frühen vorzeitigen Blasensprungs
sein. Guinn et al. (1995) beschrieben, dass bei tokolysepflichtiger, vorzeitiger
Wehentätigkeit das Risiko einen vorzeitigen Blasensprung zu erleiden deutlich erhöht
ist. Auch die intrauterine Druckzunahme bei Polyhydramnion und
Mehrlingsschwangerschaften stellt einen Risikofaktor für einen vorzeitigen
Blasensprung dar (Mercer 2003).
Neben der mechanischen Belastung können auch sozioökonomische Faktoren
(niedriger Sozialstatus, Adipositas mit BMI > 27, Mangelernährung, vaginale
Blutungen) eine Rolle bei der Entstehung eines frühen vorzeitigen Blasensprungs
spielen (Spinillo et al. 1994; Harger et al. 1990).
Einleitung
8
1.3.3 Management des frühen vorzeitigen Blasensprungs
Bei der Therapieentscheidung wird je nach Schwangerschaftswoche zwischen vier
Gruppen unterschieden (siehe Abb. 2). Nach der abgeschlossenen 24.
Schwangerschaftswoche sind alle therapeutischen Maßnahmen voll auszuschöpfen.
Bezüglich des Gestationsalters ist die Untergrenze eines Zeitfensters, innerhalb
dessen ein aktives Management mit einer Entbindung denkbar ist, durch die
Überlebensrate eines Neugeborenen in Abhängigkeit vom Gestationsalter bestimmt.
Obwohl diese Grenze nicht scharf definiert ist, kann die Schwangerschaftswoche 24,
ab der die Überlebensrate von Frühgeborenen 50 % erreicht, als Grenze der
Lebensfähigkeit angesehen werden. Unterhalb der Grenze der kindlichen
Lebensfähigkeit ist ein aktives Management nicht gerechtfertigt (Leitich 2003). Als
therapeutische Möglichkeiten stehen Bettruhe, Antibiose, Lungenreife und
medikamentöse Wehenhemmung zur Verfügung. Nach der abgeschlossenen 35.
Schwangerschaftswoche ist eine Entbindung anzustreben. Das optimale Vorgehen
nach frühem vorzeitigem Blasensprung wird kontrovers diskutiert. Das mütterliche
Risiko muss gegenüber dem fetalen Benefit abgewogen werden. Das Spektrum der
angewandten Maßnahmen reicht von der sofortigen Entbindung bis zum
abwartenden Verhalten unter Einsatz von Tokolytika und Antibiotika. Eine
prophylaktische Gabe von Antibiotika führt zu einer deutlichen Verringerung des
Risikos einer Chorioamnionitis oder des Auftretens einer neonatalen Infektion, sowie
zu einer Reduktion der Häufigkeit von intraventrikulären Hämorrhagien bei den
Frühgeborenen (Kenyon et al. 2003). Eine prophylaktische Lungenreifung nach
vorzeitigem Blasensprung wird zwischen der Schwangerschaftswoche 24 und 32
empfohlen (National Institute of Health 1995). In diesem Zeitfenster ist der Nutzen
der einmaligen Lungenreifung klar erwiesen und führt zu einer Verringerung des
Auftretens eines Atemnotsyndroms oder einer nekrotisierenden Enterokolitis sowie
der Häufigkeit von intraventrikulären Hämorrhagien (Harding et al. 2001). Obwohl es
keinen Beweis gibt, daß Tokolytika zu einer Verbesserung des kindlichen Outcomes
führen, können auch diese im Management des vorzeitigen Blasensprungs eine
wichtige Rolle einnehmen. Klar belegt ist, dass eine medikamentöse
Wehenhemmung zu einer Verlängerung der Schwangerschaft innerhalb eines
Zeitraumes von 2–7 Tagen nach Beginn der Therapie führen (Gyetvai et al. 1999).
Einleitung
Abb.2 Management des frühen vorzeitigen Blasensprungs (Leitlinien, Deutsche Gesellschaft für
Gynäkologie und Geburtshilfe, Nr. 015/029)
1.4 Intrauterine Infektionen
Intrauterine Infektionen, meist als Folge aszendierender Infektionen spielen eine
zentrale Rolle sowohl beim vorzeitigen Blasensprung, als auch in der Pathologie der
Frühgeburt. Die intrauterine Infektion ist als dynamischer Prozess zu verstehen, der
von einer choriodezidualen Infektion bis zum Vollbild der neonatalen Sepsis reicht.
Die verschiedenen Erscheinungsformen intrauteriner Infektionen werden einzeln
besprochen.
9
Einleitung
10
1.4.1 Amnioninfektionssyndrom (AIS) /Chorioamnionitis
Das AIS ist eine klinische Diagnose, die bei 1-2% aller Graviditäten auftritt. Sie
bezeichnet eine intra- oder präpartal erworbene intrauterine Infektion des FW, der
Eihäute, der Plazenta und /oder der Frucht (Bühling, Friedmann: Intensivkurs
Gynäkologie und Geburtshilfe). Meist handelt es sich um aszendierende Infektionen
durch anaerobe und aerobe Bakterien (Briese 1999). In 2-4 % aller Geburten,
besonders häufig bei Frühgeburten und vorzeitigem Blasensprung ist, mit einem AIS
zu rechnen. Eine intrauterine Infektion kann sich in verschiedenen Schichten der
fetomaternalen Einheit (choriodezidualer Raum), in den fetalen Membranen (Amnion
und Chorion), in der Plazenta, im Fruchtwasser, in der Nabelschnur oder am Fetus
manifestieren (siehe Abb.3):
Abb.3 : Bakterielle Infektion am Uterus. Infektionen, die nur die fetalen Membranen betreffen, werden
als Chorioamnionitis bezeichnet. Bei isolierter Infektion der Nabelschnur spricht man von einer
Funisitis, eine Infektion des Fruchtwassers bezeichnet man als Amnionitis (aus Goldenberg et al.
2000)
Einleitung
11
Klinisch macht sich die Infektion erst bemerkbar, wenn das AIS bereits manifest ist.
Häufig verläuft die Infektion subklinisch (Vintzileos et al. 1996).
Folgende Kriterien gelten bisher für die Diagnose eines AIS (Leitlinien DGGG):
•
Mütterlicher Temperaturanstieg (> 38 °C)
•
Maternale Tachykardie (>100 Spm)
•
Fetale Tachykardie (>150 bpm)
•
Druckschmerzhafter Uterus
•
Zunehmende Wehentätigkeit
•
Übelriechendes Fruchtwasser
•
Leukozytose (> 15000/µl)
•
CRP- Erhöhung (serieller Anstieg)
Sobald der Verdacht eines AIS gestellt wurde, müssen umgehend therapeutische
Maßnahmen eingeleitet werden, da es sowohl zu einer erheblichen Gefährdung des
Kindes als auch der Mutter kommen kann (Leitich 2003; Petersen 1997). Oboro et al.
(2006) fanden eine signifikante Beziehung zwischen Chorioamnionitis und
nachteiligem neonatalem Outcome bei Frauen mit frühem vorzeitigem Blasensprung,
im Gegensatz zu Schwangerschaftsverläufen ohne Chorioamnionitis. Andere Studien
bestätigen die erhöhte Morbidität bei Kindern, die in utero einer Chorioamnionitis
ausgesetzt waren (Ramsey et al. 2005). Um das Vollbild der Amnioninfektion zu
verhindern, sind rechtzeitig eine Antibiotikatherapie sowie die Entbindung angezeigt.
Werden die AIS- Warnsymptome nicht wahrgenommen, besteht die Gefahr der
lokalen und systemischen Ausbreitung (z.B. Myometritis, Endomyometritis,
Peritonitis, hämatogene Streuung mit früher septischer Pneumonie oder
Schocklunge) (Bergström et al. 2003; Ustün et al. 1998).
Einleitung
12
1.4.2 Fetal inflammatory response syndrome (FIRS)
Die fetale Inflammationsreaktion (FIRS, fetal inflammatory response syndrome) ist
durch den Nachweis einer umbilikalen Entzündungsreaktion bzw. erhöhten
Serumspiegeln von proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet.
In klinischen und experimentellen Studien wurde die systemische fetale
Inflammationsreaktion als wichtiger Risikofaktor für eine schlechte pulmonale und
neurologische Entwicklung der überlebenden, extrem unreifen Frühgeborenen
determiniert (Kramer et al. 2006, Ville et al. 2001).
Funisitis und/ oder Omphalovaskulitis beschreiben eine fetale Inflammationsreaktion,
die auch biochemisch durch Bestimmung von Inflammationsparametern im fetalen
bzw. neonatalen Serum nachweisbar ist. Bedeutsam ist in diesem Zusammenhang
der Anstieg der fetalen bzw. neonatalen Morbidität bei Nachweis einer fetalen
Inflammationsreaktion gegenüber einer zunächst maternalen Entzündung bei
Vorliegen einer Chorioamnionitis (D’Alquen et al. 2005).
Die Erstbeschreibung des FIRS erfolgte 1998 durch Gomez et al. Romero et al.
(2003) teilten intrauterine Infektionen in vier Stadien ein. Dies verdeutlicht noch
einmal den dynamischen Charakter einer intrauterinen Infektion, der eine Diagnose
mitunter erschwert.
Tab.1 : Phasen der intrauterinen Infektion nach Romero et al. 2003
Stadium 1
Veränderung des pH-Werts der Vaginalflora durch potentiell
pathologische Keime
Stadium 2
Nach Passage der Cervix, Infektion der Dezidua
Stadium 3
Weitere mögliche Infektion : Choriovaskulitis, Amnionitis, sowie
sämtliche Anteile des Uterus und intrauterine Strukturen können
betroffen sein
Stadium 4
Fetale Infektion (FIRS)
Einleitung
13
Die klinischen Symptome einer Infektion des Neugeborenen sind unspezifisch. Zu
diesen zählen laut AWMF –Leitlinien (Leitlinien, Gesellschaft für Neonatologie und
pädiatrische Intensivmedizin, Nr. 024/008):
•
Veränderungen des Hautkolorits
•
Störungen der Atmung (Apnoe, Dyspnoe, Stöhnen)
•
Störung des Kreislaufes (Zentralisierung mit verlängerter
Rekapillarisierungszeit > 3 sec, arterieller Hypotonie, Tachykardie)
•
neurologische Symptome (Hypotonie, Lethargie, Hyperexzitabilität)
•
intestinale Symptome (geblähtes Abdomen, Trinkschwäche)
•
Temperaturinstabilität bzw. Anstieg der zentral-peripheren
Temperaturdifferenz
Zur Identifizierung einer neonatalen Infektion werden laut Leitlinien folgende
Laboruntersuchungen empfohlen (Leitlinien, Gesellschaft für Neonatologie und
pädiatrische Intensivmedizin, Nr. 024/008):
•
Blutbild mit Differenzialblutbild (I/T- Quotient = Quotient aus allen
unreifen (I) und der Zahl aller (T) Granulozyten)
•
C-reaktives Protein
•
Ergänzend hilfreich sind zu Beginn: IL-6 oder IL-8
Besonders B-Streptokokken, Koagulase- negative Staphylokokken, Gruppe A –
Streptokokken, Hämophilus influenza und Escherischia coli (E.coli) sind mit einer
neonatalen Infektion assoziiert. Während die Gebärmutter normalerweise ein steriler
Aufenthaltsort, kann nach einem Blasensprung der Fetus vor allem von den eben
genannten aszendierenden Mikroorganismen des maternalen Genitaltraktes
kolonisiert werden. Das Risiko für das Neugeborene und somit die perinatale
Morbidität korrelieren mit einem FIRS. Gomez et al. (1998) zeigten eine Assoziation
von erhöhter Morbidität des Neugeborenen mit erhöhten IL-6-Spiegeln. Auch die
erhöhten IL-6 Spiegel im Nabelschnurblut sind wahrscheinlich Folge einer
bakteriellen Infektion der Amnionhöhle oder der maternalen Kompartimente.
Infektionsmarker könnten also potentiell für die Diagnose eines FIRS eingesetzt
werden, da Mikroorganismen fetale Zellen direkt zur Zytokinproduktion (z.B. IL-6)
stimulieren können (Romero et al. 1993).
Einleitung
14
1.4.3 Neonatale Sepsis
Eine gravierende Folge einer intrauterinen Infektion ist die nachgewiesene neonatale
Sepsis bzw. die klinische Sepsis.
Die Neugeborenensepsis ist eine bakterielle Erkrankung, die durch die klinischen
Symptome einer systemischen Infektion und durch eine Bakteriämie gekennzeichnet
ist. Bei etwa 2% der Lebendgeborenen tritt eine neonatale Sepsis auf. Bei
vorzeitigem Blasensprung erhöht sich die Inzidenz auf 3-5%. 25% der
Sepsispatienten erkranken auch an einer Meningitis (Muntau, Intensivkurs
Pädiatrie). Man teilt die Sepsis je nach zeitlichem Verlauf ein. Treten die Symptome
innerhalb von 12 Stunden nach Geburt auf spricht man von einer very-early-onsetSepsis, nach 12-72 Stunden von einer early- onset- Sepsis oder nach mehr als 72
Stunden postpartal von einer late- onset- Sepsis. Gerade bei einer early-onset –
Sepsis ist es wahrscheinlich, dass Infektionen schon intrauterin erworben wurden.
Die wahrscheinlichste Ursache dafür ist eine vaginal aszendierende Infektion,
seltener kann es retrograd über die Tuben, iatrogen oder durch hämatogene
Streuung über die Plazenta zu einer intrauterinen Infektion kommen. Das Risiko
steigt mit einem sehr geringen Geburtsgewicht um das 10 - fache an (Stoll et al.
2005). Eine Gefahr für die Mutter besteht insbesondere bei einer Sepsis innerhalb
der ersten 72 Stunden nach Geburt, bei einer late onset Sepsis ist hingegen kein
erhöhtes Risiko für die Mutter bekannt.
Tab. 2: Definitionen von Sepsis und klinischer Sepsis (Pacora et al. 2002):
Sepsis
-
Positive Blut- oder Liquorkultur
Klinische Sepsis
-
negative Blut- / Liquorkultur
-
Leukozyten < 5000 mm³
-
Linksverschiebung im
Differentialblutbild (I/T-Ratio<0,2)
-
Thrombozyten <150000/mm³
-
CRP- Erhöhung
-
klinische Zeichen: Tachykardie,
Hypotension,
Temperaturinstabilität,
Trinkschwäche
Einleitung
15
1.4.4 Akutmorbidität und Langzeitfolgen
Die intrauterin erworbene Infektion des Feten stellt eine besondere Herausforderung
an die pädiatrische Intensivmedizin. Zusätzlich zu den Folgen des inflammatorischen
Geschehens kommt die Frühgeburtlichkeit und somit die Unreife des Kindes.
Folgende Krankheitsbilder treten häufig bei frühgeborenen Kindern mit einem FIRS
auf.
Atemnotsyndrom
Das Atemnotsyndrom des Frühgeborenen (Respiratory Distress Syndrom) stellt eine
durch Surfactantmangel bedingte akute pulmonale Erkrankung einer
morphologischen, biochemischen und funktionell unreifen Lunge dar. Dies führt zu
einer alveolären Instabilität, einem Kollaps der Alveolen mit herabgesetzter
Lungencompliance, verminderter Ventilation und Perfusion. Als Folge länger
dauernder Beatmung können chronisch reparative – proliferative Veränderungen der
Alveolen und Bronchiolen entstehen, die als bronchopulmonale Dysplasie bezeichnet
werden. Die Diagnose erfolgt klinisch, durch Blutgasanalyse und röntgenologisch
(Kulotzig 1994).
Intrazerebrale Hämorrhagie
Die typische Form einer intrazerebralen Hämorrhagie (ICH) bei Frühgeborenen ist
die intra-/ periventrikuläre Hirnblutung. Sie hat ihren Ursprung in der germinalen
Matrix, einer Hirnregion, die sich mit zunehmender Reife des Feten nahezu
vollständig zurückbildet. Kennzeichnend für diese Blutgefäße ist eine besonders
geringe Reißfestigkeit. Sub- und postpartale Schwankungen des zerebralen
Blutflusses führen somit leicht zu intrakraniellen Hämorrhagien (Berger et al. 1998).
Die Einteilung erfolgt sonographisch in vier Stadien (Huang et al. 2006). Bei
Schädigung oder Nekrose in der periventrikulären weissen Substanz droht eine
periventrikuläre Leukomalazie oder ein Hydrocephalus. Je nach Schwere und
Komplikationen können daraus eine infantile Zerebralparese, kognitive oder andere
neurologische Störungen resultieren.
Nekrotisierende Enterokolitis
Unter einer nekrotisierende Enterokolitis (NEC) versteht man eine transmurale
gangränöse Entzündung von Dünn- und Dickdarm. Sie betrifft vor allen Früh- und
Einleitung
16
Mangelgeborene, wobei parenterale Ernährung und maschinelle Beatmung einen
besonderen Risikofaktor darstellen. Noxen wie Sauerstoffmangel- Mangel,
Hypoglycämie, Hypothermie, Medikamente oder pathogene Keime induzieren eine
pathophysiologische Kaskade. Die auslösende Ursache ist unbekannt.
Wahrscheinlich führt eine mesenterial-intestinale Ischämie zur Mukosaschädigung
und bakteriell aeroben und anaeroben sowie viralen Infektionen. Es bilden sich
Ulzerationen, Nekrosen und in der Submukosa Hämorrhagien und gasförmige
Zystchen (Pneumatosis intestinalis). Im weiteren Verlauf kann es zu einer
Durchwanderungs-Peritonitis und Darmperforation kommen. 90% der Fälle betreffen
Frühgeborenen vor der 33. SSW, FG unter 1500g KG sind bis zu 10%, FG unter
1000g KG bis 20% gefährdet (Leitlinien, Deutsche Gesellschaft für Kinderchirurgie,
Nr. 006/116).
1.5 Infektionsmarker
Entzündungsmarker werden als zentrale pathophysiologische Mediatoren
angesehen, die bei intrauterinen Infektionen gebildet und im Fruchtwasser
nachgewiesen werden können. Es liegen zahlreiche Studien vor, die den
Zusammenhang zwischen einem Anstieg von Markern im Fruchtwasser oder im
Serum mit intrauterinen Infektionen dokumentieren (Jun et al. 2000; Gibbs et al.
2004; Romero et al. 1993). Bei aszendierenden genitalen Infektionen induzieren die
einwandernden Keime die Zytokinproduktion in intrauterinen Geweben. Der
histologische Nachweis einer akuten entzündlichen Reaktion der Plazenta korreliert
mit erhöhten Konzentrationen an Interleukin-1, Interleukin-8 und Tumornekrosefaktor
im Fruchtwasser (Potter et al. 1992). Dies ist auf die lokalen Veränderungen im
Zusammenhang mit einer aszendierenden Infektion zurückzuführen und nicht auf
systemische Veränderungen im mütterlichen Organismus. Die histologischen
Zeichen einer mütterlichen Inflammation im Amnion und einer fetalen Reaktion in der
Nabelschnur korrelieren mit Zytokinkonzentrationen der Nabelschnur. Keinen Bezug
haben solche Veränderungen zu den mütterlichen Serumzytokinkonzentrationen
(Salafia et al. 1997). Diese Erkenntnisse wurden auch von Shobokshi et al. (2002)
bestätigt, die bei Frauen mit einem vorzeitigen Blasensprung und einer
nachgewiesenen Infektion erhöhte Zytokine (IL-6, TNF-α, IL-1 beta) im Fruchtwasser
fanden, nur die Hälfte dieser Patienten hatten unterdessen erhöhte Serum-ZytokineKonzentrationen.
Einleitung
17
1.5.1 Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-α )
TNF-α (Synonyme: Lymphotoxin B, Catechin) ist ein pleiotropes
proinflammatorisches Zytokin. Es wurde 1975 zum erstem mal von Carswell et al.
(1975) isoliert. Es hat verschiedene Effekte, darunter die Stimulation der
Immunantwort. Das Zytokin mit einer Molekülgröße von 26 kDa wird vorwiegend in
Fett, Muskelgewebe aber auch der Plazenta von Zellen des
Makrophagen/Monozytensystems produziert. Röntgenstrukturanalysen haben
gezeigt, dass die biologisch aktive Form von TNF-α ein Homotrimer ist, in dem
TNF-α Monomere nicht-kovalent zusammen gelagert sind, um eine pyramidale
Struktur auszubilden (Smith et al. 1987; Eck et al. 1998; Eck et al. 1989; Jones et al.
1989). Sowohl die C- als auch die N-Termini der Monomere befinden sich nahe der
Basis der pyramidalen Struktur. Ein TNF-α Trimer kann bis zu drei Rezeptormoleküle
binden (Loetscher et al. 1991). Dadurch kann eine Aggregation von
Rezeptormolekülen erfolgen, welche die Aktivierung der rezeptorgekoppelten
Signalwege induziert. Die membranständige Form des TNF ist nicht nur als
membranständige Proform des löslichen Liganden anzusehen, sondern als
biologisch aktiver Ligand, der seine Antworten im Zell-Zell-Kontakt vermittelt (Kriegler
et al. 1988; Perez et al. 1990). TNF-α ist ein akutes Phase-Protein, das eine
Kaskade von inflammatorischen Zytokinen aktiviert, die Gefäßpermeabilität erhöht
und auf Makrophagen und Neutrophile wirkt. Verschiedene Zellen zeigen die
Fähigkeit zur TNF-α-Produktion, wie Makrophagen, CD4- Zellen und NatürlicheKiller- Zellen nach Stimulation mit Lipopolysacchariden. Dabei wirkt TNF-α auch auf
folgende Zellen: Granulozyten, Endothelzellen, Fett- und Muskelzellen, Monozyten/
Makrophagen. TNF-α aktiviert Interleukin-1, wird aber auch durch IL-1 reguliert.
TNF-α dient in niedrigen Konzentrationen der autokrinen und parakrinen Regulation
von Entzündungszellen im Gewebe. Mittels der durch TNF-α initiierten Expression
von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen und der Aktivierung eingewanderter
Leukozyten kommt es zur weiteren Zytokinausschüttung und zur Akkumulation von
Entzündungszellen am Ort der Inflammation (Vassali 1992). Wird TNF-α in größeren
Mengen freigesetzt, kann es in den Blutkreislauf gelangen und so systemisch
wirksam werden. Dies führt u.a. durch Temperatursollwertverstellung im
Hypothalamus zur Fieberinduktion, zur Ausschüttung weiterer Zytokine wie IL-1 und
IL-6 und synergistisch mit diesen zu veränderter Proteinsynthese in den Hepatozyten
der Leber. Weiterhin beeinflusst TNF-α die Gerinnung, bewirkt eine katabole Stoff-
Einleitung
18
wechsellage und führt direkt oder indirekt durch Induktion von Mediatoren wie Stickstoffoxid (NO) - über die Reduktion des Gefäßmuskeltonus und der Myokardkontraktilität zur Abnahme des Blutdrucks. Bei massiver TNF-α -Ausschüttung kann es
so zu verminderter Gewebeperfusion, zu schweren metabolischen und Gerinnungsstörungen bis hin zum Multiorganversagen und Schock kommen (Vassali
1992; Parrillo 1993; Hack et al. 1997). TNF-α ist bei Schwangeren mit vorzeitigen
Wehen und Amnioninfektion erhöht, während es bei gesunden
Schwangerschaftsverläufen nicht detektierbar ist (Romero et al. 1992). Im
Fruchtwasser wird TNF-α als bester prädiktiver Infektionsmarker angesehen (Baud
et al. 1999).
1.5.2 Interleukin-6 (IL-6)
IL-6 ist ein multifunktionales Protein aus 184 Aminosäuren mit vielfältiger
biologischer Wirksamkeit. Deshalb existieren auch zahlreiche Synonyme wie B-cell
stimulating protein (BCSF), cytolytic differentiation factor (CDF) oder hepatocyte
stimulating factor (HSF). IL-6, zusammen mit IL-1 und Glucocorticoiden, sind in
erster Linie verantwortlich für die Aktivierung der Akute-Phase-Proteine in der Leber,
bei inflammatorischen Prozessen oder Läsionen. Der Hauptbildungsort von IL-6 im
Knochenmark sind Makrophagen, wo es zusammen mit anderen Zytokinen,
Vorläuferzellen der hämatopoetischen Reihe stimuliert. Aktivierte B-Zellen
exprimieren IL-6 Rezeptoren, die zu Antikörperproduktion führen. Physiologisch wird
IL-6 durch extraembryonales mütterliches Gewebe in der späten Schwangerschaft
gebildet, um Interaktionen wie Angiogenese und die Ausbildung von neuen
Blutgefäßen zu kontrollieren. Erhöhte IL-6-Werte im Fruchtwasser können bei
Schwangeren mit einer Amnioninfektion gemessen werden und können auf eine
fetale Infektion hinweisen (Steinborn et al. 1998). Die IL-6 Spiegel sind während der
Schwangerschaft im mütterlichen Blut und auch im fetalen Nabelschnurblut sehr
niedrig. Im Fruchtwasser liegen die Werte etwa um den Faktor 100 höher als im
mütterlichen Blut (Stallmach et al. 1995). Eine Erhöhung der Konzentration
inflammatorischer Zytokine im Fruchtwasser als ein zuverlässiger Indikator für eine
intrauterine Infektion ist auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben worden (ElBastawisti et al. 2000; Hatzidaki et al. 2005; Holst et al. 2007). Interleukin-6 wird
intrauterin von der fetomaternalen Einheit produziert. Ein Großteil dieses Zytokins
scheint seinen Ursprung in der Eihaut zu haben, denn diese ist zur Interleukin-6-
Einleitung
19
Produktion in der Lage. Die Freisetzung erfolgt zum Beispiel nach einer Stimulation
mit Lipopolysacchariden, also einer Stimulation, die eine bakterielle Infektion
simuliert (Menon et al. 1995; Fortunato et al. 1996). Erhöhte IL-6-Konzentrationen im
Fruchtwasser korrelieren mit einem positiven mikrobiologischen Befund aus
Fruchtwasser- und Plazentakulturen (Andrews 1995). Es gibt eine Korrelation
zwischen erhöhten Interleukin-6-Konzentrationen im Fruchtwasser und einer höheren
perinatalen Morbidität. Das erhöhte Risiko besteht bei dieser Konstellation für das
Auftreten einer neonatalen Sepsis, einer nekrotisierenden Enterokolitis und weiteren
Erkrankungen, die im Zusammenhang mit prä- und perinatal erworbenen Infektionen
stehen (Yoon et al.1995).
1.5.3 Lipopolysaccharid- bindendes Protein (LBP)
Die Synthese von LBP (LPS bindendes Protein) erfolgt hauptsächlich in den
Hepatozyten und wird durch Synergie mit IL-1-ß und IL-6 stimuliert. Das LBP bindet
an den Lipidanteil des Lipopolysacharids (Endotoxin) der gram- negativen Zellwand.
Zusätzlich werden aber auch Lipidanteile der gram- positiven Bakterienzellwand
gebunden. Die vom LBP gebundenen Bakterienbestandteile werden zu den CD 14
Rezeptoren (LPS- Rezeptor) auf Monozyten transportiert, die wiederum die
Entzündungskaskade stimulieren. Gebundenes LPS komplexiert über LBP/
HDL/LDL/ Apolipoprotein. Dieser Komplex kann abgebaut und aus der Zirkulation
entfernt werden. Von Gardella et al. (2001) wurden LBP und sCD14 als Mediatoren
der frühen Entzündungsphase in Fruchtwasserproben schon ab der 20. SSW
nachgewiesen. Die Werte waren jedoch deutlich niedriger als im mütterlichen Serum.
In den letzten Jahren wurden im Rahmen der Grundlagenforschung die Interaktionen
von LPS, LBP, Endotoxin-Rezeptor (CD14) und inflammatorischen Zytokinen in der
Frühphase der unspezifischen Abwehr gegen gram- negative Bakterien intensiv
erforscht (Schuhmann et al. 1999). Niedrige Konzentrationen von LBP vermitteln den
Transfer von LPS (Endotoxin, Zellwandbestandteil von gram –negativen Bakterien)
zu zellständigen Endotoxinrezeptoren (CD14) auf Makrophagen und anderen Zellen,
die daraufhin mit einer Aktivierung der Zytokinkaskade (z.B. IL-6, IL-8, IL-1ß, TNF-α)
reagieren. Der LPS-LBP –Komplex aktiviert dabei Makrophagen in bis zu 1000-fach
niedrigeren Konzentrationen als LPS alleine (Amplifizierungsmechanismus). Damit
tragen niedrige LBP- Konzentrationen zu einer initialen Verstärkung der
Entzündungsreaktion bei (Gardella et al. 2001). Reichelt et al. (2005) beschrieben
Einleitung
20
LBP zur postmortem Diagnose bei Sepsis (>10 µg /ml). Berner et al. (2001) fanden
im Nabelschnurblut bei Neugeborenen mit early-onset Sepsis signifikant erhöhte
LBP- und sCD14 –Spiegel, während die CRP-Konzentrationen in diesen Fällen in der
Regel noch unauffällig waren. Diese Arbeit postulierte auch, dass LBP und sCD14
schon zum Zeitpunkt der Geburt vom Neugeborenen gebildet werden und damit zum
angeborenen Immunsystem gehören.
Abb. 4: LPS-abhängige Induktion proinflammatorischer Abwehrmechanismen in Monozyten,
Makrophagen und Endothelzellen. Das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien wird durch
das LPS bindende Protein (LBP) monomerisiert und von LBP und sCD14 zu seinem zellulären
CD14/TLR4 (toll-like receptor)/MD2-Rezeptorkomplex transportiert. Das sCD14 ermöglicht die
Stimulation CD14-negativer Zellen. Über die intrazelluläre Domäne von TLR4 kommt es zur
Aktivierung intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden, die u.a. die Synthese proinflammatorischer
Zytokine bewirken. Es kommt zu einer systemischen Wirkung der Zytokine. (Büttner M, Dissertation
HU Berlin).
1.5.4 C- reaktives Protein (CRP)
Das CRP oder Kapselreaktive Protein ist ein kohlenhydratfreies Protein, das in der
Leber gebildet wird. Gemeinsam mit Coeruloplasmin, Fibrinogen, Haptoglobin,
Ferritin und Präalbumin gehört das CRP zu den Akute-Phase-Proteinen. CRP stellt
diagnostisch bisher das wichtigste Akute- Phase-Protein dar. Den stärksten Stimulus
Einleitung
21
der Akute-Phase-Reaktion bilden dabei bakterielle Infektionen. Das CRP wird als
unspezifischer Entzündungsparameter, unter anderem zur Beurteilung des
Schweregrades entzündlicher Erkrankungen herangezogen. Auch ohne klinische
Symptomatik müssen erhöhte CRP-Konzentrationen immer abgeklärt werden. Die
Plasmahalbwertszeit von nicht mit Liganden beladenem CRP beträgt ungefähr 19
Stunden. Bei Bindung an den Liganden erfolgt eine schnellere Elimination.
Grundsätzlich steigt die CRP- Konzentration im Plasma mit 12-24 Stunden Latenz
zur Krankheitsaktivität an (Egarter 2001). CRP ist Teil des Immunsystems. Es ist ein
Opsonin, welches das Komplementsystem aktivieren kann. Die CRP Produktion der
Leber wird am stärksten durch IL-6 angeregt.
1.6. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
1. In dieser Studie soll mit Hilfe einer nicht- invasiven Methode der
Fruchtwassergewinnung eine intrauterine Infektion frühzeitig erkannt werden, um so
Risikopatientinnen für ein fortgeschrittenes Amnioninfektionssyndrom und eine
manifeste fetale Infektion zu identifizieren. Das Fruchtwasser soll durch tägliches
Auspressen von Binden gewonnen werden.
2. Durch den Vergleich der zeitlichen Verläufe von frühen Infektionsmarkern im
Fruchtwasser (IL-6, TNF-α, LBP) mit maternalem Serum- CRP soll ermittelt werden,
ob diese Parameter ein AIS und/ oder eine fetale Infektion früher anzeigen als die
CRP- Messung. Die Bestimmung der Infektionsmarker erfolgt auf einem ImmuliteLaborautomaten.
4. Durch retrospektive Evaluation der Plazentahistologie und der kindlichen
peripartalen Anamnese mit den präpartal gemessenen frühen Infektionsmarkern soll
die prognostische Aussagekraft der Parameter beurteilt werden.
5. Weiterhin soll geklärt werden, inwieweit abgehendes Fruchtwasser als
Probematerial für die klinische Diagnostik geeignet ist, da diese Proben mit
variierenden Anteilen von Zervix-/Vaginalsekreten kontaminiert sind.
6. Im Rahmen der Studie sollen die prognostischen Wertigkeiten von IL-6, TNF-α und LBP
verglichen werden. Für prognostisch nutzbare Parameter sollen immunologisch
quantifizierbare Streifen-Schnellteste getestet werden.
Material und Methoden
22
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Immunoassays
LBP Immulite-Kit und Verdünner
DPC Biermann, Bad Nauheim
TNF-α Immulite-Kit
DPC Biermann, Bad Nauheim
IL-6 Immulite-Kit und Verdünner
DPC Biermann, Bad Nauheim
Zytokin-Kontrollen
DPC Biermann, Bad Nauheim
LBP-Kontrolle
DPC Biermann, Bad Nauheim
2.1.2 Material zur Fruchtwassergewinnung
•
Pipetten: Pasteurpipetten, 150mm Länge, Füllvolumen 8,0ml steril,
geringe Adsorptioneigenschaften, integrierter Pumpballon verhindert
Kreuzkontamination. Unzerbrechlich aus PE-LD, nicht toxisch, zum Einfrieren
in flüssigem Stickstoff geeignet. VWR International ,Darmstadt
•
Handelsübliche Knoblauchpresse zur Fruchtwassergewinnung aus Binden
•
Wöchnerinnen- Vorlagen, Samu plus, Paul Hartmann AG, 89522 Heidenheim
•
Plastikgefäße, 15 ml, unsteril
2.2 Patienten
Die vorliegende Studie wurde nach positivem Votum durch die lokale Ethikkomission
der Medizinischen Fakultät an der Albert-Ludwig-Universität Freiburg durchgeführt
(Nr.312/2001).
Die Patientinnen wurden über den Inhalt der Studie aufgeklärt und erst nach einer
schriftlichen Einverständniserklärung in die Studie aufgenommen.
2.2.1 Patientengut
Zwischen Juli 2005 und Mai 2007 wurden 27 Patientinnen, bei denen die Diagnose
eines frühen vorzeitigen Blasensprungs gestellt wurde und die sich in stationärer
Behandlung befanden, in die Studie eingeschlossen.
Material und Methoden
23
Von diesen Patientinnen wurde täglich abgehendes Fruchtwasser aus Binden
gewonnen. Sofern es möglich war, wurde auch bei Aufnahme während der
Spiegeleinstellung Fruchtwasser entnommen.
2.2.2 Ein- und Ausschlußkriterien
Einschlusskriterien :
Patientinnen mussten folgende Kriterien erfüllen, um in die Studie aufgenommen zu
werden:
•
Vorzeitiger Blasensprung bis einschließlich der vollendeten 34. SSW
•
Fruchtwasser-Proben aus den letzten drei Tagen vor Geburt vorhanden
Ausschlusskriterien:
Patientinnen, die ein oder mehrere der nachfolgenden Kriterien erfüllten, wurden
nicht in die Studie aufgenommen:
•
Stoffwechselerkrankungen der Mutter
•
Fetale Anomalien
•
Chromosomale Aberrationen des Feten
•
Signifikante vaginale Blutungen
•
Höhergradige Mehrlingsschwangerschaft (>2)
2.2.3 Klinische Daten
Es wurden folgende Daten erfasst:
a) Mutter
•
Patientenidentifikationsnummer (PIZ)
•
Hinweise auf eine mütterliche Infektion
•
Zuteilung zu Fall- bzw. Kontrollgruppe
•
Vaginalabstrich
•
Antibiotikatherapie
•
Indikation zur Sectio caesarea
•
Parität
•
Sonstige relevante Daten
Material und Methoden
24
b) Neugeborene
•
Patientenidentifikationsnummer (PIZ)
•
IL-6 im Nabelschnurblut
•
CRP im Nabelschnurblut
•
Neonatale Sepsis
•
Plazentahistologie
•
Daten aus dem Arztbrief (Gewicht, Status bei den Erstuntersuchungen,
Diagnose scherwiegender Morbidität (siehe Tab.3))
•
Nachgewiesene Erreger
c) Daten zu Blasensprung und Geburt
•
Datum des Blasensprungs
•
Gestationswoche bei Blasensprung
•
Datum der Geburt
•
Gestationswoche bei Geburt
2.3 Fallgruppen-Einteilung
Die Einteilung in die jeweiligen Gruppen erfolgte retrospektiv, nach Auswertung der
klinischen Daten aus der Frauenklinik und der Kinderklinik. Als Parameter dienten
hierzu Befunde der Plazenta- Histologie, IL-6 und CRP-Werte im Nabelschnurblut,
positive Abstriche der Plazenta und ein positiver Keimnachweis beim Neugeborenen.
Aus der Kinderklinik wurden dabei folgende Befunde herangezogen:
•
Laborwerte des Neugeborenen
•
Klinik des Neugeborenen
•
Plazentahistologie
Insgesamt wurden drei Studiengruppen definiert
•
Kontrollgruppe (K-Gruppe)
•
Amnioninfektion (AIS-Gruppe)
•
Fetale Infektionsgruppe ( FIRS-Gruppe)
Material und Methoden
25
Die Einteilung in die Gruppen erfolgte retrospektiv nach klinischer Beurteilung des
Neugeborenen und Beurteilung der Plazenta durch die Pathologie:
Tab. 3: Zuordnung zu Kontroll- und Fallgruppen anhand der Plazentahistologie und
klinischen Befunde der Neugeborenen:
Klinik des
Plazenta –
CRP
IL-6 des
Abstriche Blutkultur
Neugeborenen 1)
histologie 2)
Des NG zyten des
NG
des NG 5) /Liquorkultur
3)
(pg/ml)
LeukoNG 4)
des NG
6)
K
Unauffällig
unauffällig
Keine
Chorio-
schwerwiegende
amnionitis
Morbidität
(CA)
FIRS Schwerwiegende
Aus-
AIS
Morbidität
geprägte
CA
N
N/
N
N/
<100
negativ
negativ
>100
negativ
negativ
>100
negativ/
negativ/
positiv
positiv
Klinik des Neugeborenen (nach Gomez et al. (1998)): unter schwerwiegende Morbidität fallen
Krankheitsbilder wie Nekrotisierende Enterokolitis, Intrazerebrale Hämorrhagie, periventrikuläre
Leukomalazie, schweres Atemnotsyndrom, Pneumonie, Meningitis, neonatale Sepsis ( positive
Blutkultur oder Liquorkultur) und klinische Sepsis (negative Blut-/Liquorkultur,
Leukozyten < 5000/mm³, Linksverschiebung im Differentialblutbild, Thrombozyten <150000/mm³,
CRP- Erhöhung, klinische Zeichen: Tachykardie, Hypotonie, Temperaturinstabilität, Trinkschwäche),
(Pacora et al. (2002)). Die klinische Beurteilung ist für die Diagnose eines FIRS maßgebend.
2) Positive Plazentahistologie: nachgewiesenes inflammatorisches Geschehen. Die Beurteilung
erfolgte durch den Pathologen.
CA= Amnion + Chorion-Dezidua: 5-20 Polymorphkernige Leukozyten/Gesichtsfeld,
ausgeprägte CA: Amnion + Chorion-Dezidua: Funisitis, und/oder zahlreiche Polymorphkernige
Leukozyten in der Chorionplatte und/ oder Chorionvaskulitis, (nach Salafia et al. 1989).
3) CRP in mg/l: normal (N) = <3mg/ l; Erhöhung: > 3mg/l
4) Leukozyten /mm³: normal (N) : < 5000 /mm³; erhöht : >5000/mm³
5) Positive Abstriche/ Blutkulturen des Neugeborenen (NG): Keimnachweis in Oberflächenabstrichen
des Neugeborenen (NG) durch die Mikrobiologie.
6) Blutkultur/Liquorkultur des Neugeborenen (NG): Keimnachweis in der Blutkultur durch die
Mikrobiologie.
1)
Material und Methoden
2.4 Probengewinnung
Abgehendes Fruchtwasser wurde von Patientinnen mit frühem vorzeitigen
Blasensprung bis zur 34. Schwangerschaftswoche, die in der Universität
Frauenklinik zur Behandlung aufgenommen wurden, gesammelt.
Das Fruchtwasser wurde durch zwei verschiedene Methoden gewonnen.
2.4.1 Spiegeleinstellung
Als Eingangsprobe wurde abgehendes Fruchtwasser durch Spiegeleinstellung, die
bei allen Patientinnen mit Verdacht auf einen frühen vorzeitigen Blasensprung
routinemäßig bei der Eingangsuntersuchung durchgeführt wird, entnommen.
Dazu wurde ein steriles Spekulum in den Vaginalkanal eingelegt und mit einer
Pipette das abgehende Fruchtwasser aufgenommen. Die Proben wurden dann
unverzüglich bei - 20° C eingefroren.
Abb. 5: Darstellung einer Spiegeleinstellung und steriler Pipetten
2.4.2 Gewinnung von abgehendem Fruchtwasser aus Binden
Die Patientinnen wurden gebeten, ihre Einmalbinden in einen Plastikbeutel zu
verpacken und diesen luftdicht zu schließen. Bis zur täglichen FW-Asservierung
wurden die Beutel in einem Sammelcontainer bei Raumtemperatur
zwischengelagert. Die Patientin dokumentierte auf dem Plastikbeutel Probedatum
und Uhrzeit der Binde.
Es wurde darüber aufgeklärt, eine eventuelle Kontamination der Binde mit Urin zu
dokumentieren, bzw. die Binde zu verwerfen.
26
Material und Methoden
27
Ärzte und Laborpersonal sammelten die Binden täglich ein, um daraus
Fruchtwasserproben zu gewinnen. Alle relevanten Daten wie Datum, Uhrzeit,
Probenbeschaffenheit und eventuelle Besonderheiten wurden in einem
vorgefertigten Dokumentationsbogen festgehalten.
Auspressen des Fruchtwassers aus der Binde:
Die Binde wurde innerhalb von 24 Stunden bearbeitet. Das abgehende Fruchtwasser
wurde mit einer Presse aus der Binde gewonnen. Dazu wurde die oberste Membran
der Binde entfernt, um die mit Fruchtwasser getränkten Wattestücke auszuschneiden
und in der Presse zu platzieren.
Durch mehrmaliges Auspressen der Wattestücke wurden in der Regel bis zu 5 ml
Probe gewonnen. Bei sehr trockenen Binden war es teilweise nicht möglich,
Fruchtwasser zu extrahieren.
Abb.6: Manuelles Auspressen der Binden
2.4.3 Makroskopische Beschaffenheit der Proben
In einem vorgefertigten Dokumentationsbogen wurde die Fruchtwasserprobe
makroskopisch bezüglich Auffälligkeiten in Farbe, Geruch, Konsistenz und
Blutbeimengung beschrieben. Dabei wurde die Beimengung von Blut
blickdiagnostisch in drei Grade eingeteilt. Zur möglichen Identifizierung einer
Urinkontamination der Probe, war die geruchliche Beurteilung relevant.
Material und Methoden
28
2.5 Immunologische Bestimmungen von TNF-α, IL-6 und
LBP
2.5.1 Immulite- Laborautomat
Die TNF-α, IL-6 und LBP- Bestimmung wurden auf einem Immulite-Laborautomaten
mit Festphasen-Sandwich-Chemilumineszenz-Enzymimmunoassays der Firma DPC
Biermann, Bad Nauheim durchgeführt. Die Immulite-Teströhrchen enthalten eine mit
spezifischen monoklonalen Primärantikörpern (Maus-AK) beschichtete
Polystyrolkugel als Festphase. LBP, IL-6 bzw. TNF-α aus der Probe, der mit
alkalischer Phosphatase-markierte polyklonale Sekundärantikörper (Kaninchen-AK)
und der primäre Antikörper bilden während der 30-minütigen Inkubation bei 37°C
einen Sandwichkomplex. Ungebundene Reaktionspartner werden mit einer
Zentrifugal-Waschtechnik entfernt. Zugegebenes Chemilumineszens- Substrat (PPD)
wird vom gebundenen Enzym während der folgenden 10-minütigen Inkubation
umgesetzt. Die dabei ausgelöste Lichtemission ist der Konzentration des in der
Probe gemessenen Parameters direkt proportional.
Immulite nutzt eine Chemilumineszenztechnik, bei der die Menge des gebundenen
Enzymkonjungats mit Hilfe eines extrem sensitiven Chemilumineszenzsubstrates,
dem Adamantyldioxyetanphenylphosphat (ADDPP), bestimmt wird. Durch
enzymkatalysierte Dephosphorylierung wird über einen längeren Zeitraum ein
instabiles Adamantyldioxyetanphenyl-Anion (ADP) gebildet. Dessen Zerfall führt zu
einer Lichtemission. Die dauernde Bildung des instabilen Zwischenproduktes und die
somit anhaltende Aussendung von Licht ermöglichen es, mehrere Messungen
durchzuführen. Der Immulite TNF-α-Assay erfasst neben der bioaktiven Form auch
inaktive Formen des TNF-α (persönliche Mitteilung, DPC Biermann).
Zur Messung wurden die Proben aufgetaut, gevortext und bei Zimmertemperatur in
den Immulite eingesetzt.
Da die Erwartungsbereiche für Infektionsparameter im Fruchtwasser unterschiedlich
sind, wurden die Proben mit den assayspezifischen Verdünnungesreagenzien
vorverdünnt. Für den Messparameter LBP wurde der in der Anleitung beschriebene
Verdünnungsschritt für Serum-LBP (1:100) modifiziert (siehe Tab.4+5).
Material und Methoden
29
Auf der Basis von Literaturdaten wurde mit folgenden Erwartungsbereichen
gerechnet:
Tab. 4: Erwartungsbereiche der verschiedenen Messparameter:
IL-6 (pg/ ml)
TNF-α (pg/ml)
LBP (ng/ml)
<100000
< 20000
<10000
Tab. 5: Vorverdünnung der verschiedenen Messparameter:
IL-6
TNF-α
LBP
1:50 oder höher
1:5 oder 1:20
1:5
Nachweisgrenzen:
Laut Herstellerangaben liegen die unteren Nachweisgrenzen des Assays für IL-6 bei
5pg/ml, für LBP bei 0,2µg/ml und für TNF-α bei 1,7pg/ml.
Die Nachweisgrenzen gelten für die vom Hersteller empfohlenen Vorverdünnungen.
Bei Proben mit zu hohen Analytkonzentrationen wurde die Messung mit verdünnten
Proben wiederholt.
2.5.2 Quickline-Schnelltest
Der Schnelltest der Firma Milenia ist ein Lateralflussimmunoassay, mit welchem die
Analyte qualitativ bzw. semiquantitativ erfasst werden können. Bisher stehen
Schnellteste für IL-6, IL-8 und LBP im Serum zur Verfügung. Schnellteste für TNF-α
und IL-6 im abgehenden Fruchtwasser wird im Rahmen der vorliegenden Studie
entwickelt. Die Testbestecke bestehen aus einem Streifen, der aus mehreren
Membranen zusammengesetzt ist und sich in der Regel in einem speziell
entwickelten Plastikgehäuse befindet. Nach Auftragen der Probe an der
entsprechenden Stelle des Plastikgehäuses strömt diese in Folge der wirkenden
Kapillarkräfte durch das Membransystem. Die Probe wird von einem „Sample
Application Pad“ aufgesaugt. Wird Vollblut als Probe eingesetzt, so trennt sich im
„Sample Application Pad“ das Plasma von den Zellen. Die Zellen werden
zurückgehalten, das Plasma fließt weiter durch das System.
Unter dem „Sample Application Pad“ liegt das „Conjugate Release Pad“, in dem sich
Material und Methoden
30
ein Gold-Konjugat des Primärantikörpers befindet. Im „Conjugate Release Pad“
bindet der Analyt an den Gold- konjugierten Antikörper.
Danach strömt der Immunkomplex auf die analytische Membran. Dort sind
hintereinander zwei Linien aufgetragen. Auf der ersten Testlinie ist ein Analytspezifischer sekundärer Antikörper immobilisiert, der ein zum Primärantikörper
unterschiedliches Epitop erkennt. Auf der anderen Kontrolllinie werden
überschüssige Goldpartikel durch Goldkonjugat-spezifische Antikörper abgefangen.
Somit können sich eine oder zwei farbige Banden bilden. Eine Bande, wenn der
Analyt nicht in der Probe enthalten ist, zwei Banden, wenn der Analyt in der Probe
enthalten ist. Dabei ist die Intensität der Testlinie proportional zur Konzentration des
Analyten. Die ungebundene Flüssigkeit mit den an der Test- bzw. Kontrolllinie nicht
gebundenen Goldpartikeln strömt weiter durch das Membransystem, bis sie vom
„Wicking Pad“ aufgesaugt werden, das dementsprechend einen Rückfluss
verhindert.
Durchführung:
Testeinheit und Laufpuffer werden vor dem Öffnen auf Raumtemperatur (18-28°C)
gebracht.
1.) 100µl Fruchtwasser oder Serum werden mit einer Pipette oder 3 Tropfen mit
der im Kit beiliegenden Einweg-Transferpipette in den Probenauftrag der
Testeinheit gegeben.
2.) Nach 5-10 Minuten Inkubation (die Membran darf in der Zeit jedoch nicht
austrocknen) werden 1-2 Tropfen Laufpuffer direkt aus dem Fläschchen in die
Auftragsstelle gegeben.
3.) Wird ein hoher Wert erwartet, ist das Ablesen bereits nach 5 Minuten möglich,
nach maximal 15 Minuten kann der Test mittels der speziellen Auswertekarte
im Auswertefenster abgelesen werden. Die Ergebnisse sollten nicht später
beurteilt werden.
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt qualitativ und quantitativ:
Die Konzentration des gemessenen Parameters korreliert direkt mit der
Farbintensität der Testlinie. Die qualitative Auswertung des Quickline-Tests erfolgt
durch visuellen Vergleich der Farbintensität der Testlinie von den drei verschiedenen
Referenzbanden, die auf der im Kit befindlichen Auswertekarte abgebildet sind.
Die Kontrollbande muss immer sichtbar werden. Sie dient als Funktionskontrolle des
Tests.
Material und Methoden
31
Die quantitative Auswertung erfolgt mit dem Pico Scan, einem Gerät, das die
Intensität der Banden auf dem Teststreifen densitometrisch auswertet und
entsprechend der Signalstärke eine Beurteilung der untersuchten Probe vornimmt.
Die Messergebnisse des Pico Scan-Gerätes sind über eine logistische Funktion mit
der Konzentration korreliert. Die Intensität der optischen Dichte kann als
Konzentration interpretiert werden und einer Klasse zugeordnet werden.
Abb.7: Pico Scan- Messsystem der
Fa Matest
2.6 Statistische Methoden
Für die statistische Auswertung und die graphische Darstellung wurden die
Mittelwerte der jeweils letzten zwei gültigen Messwerte der Fruchtwasserproben
gebildet. Dies wurde so festgelegt, um möglichst zeitnah zur Geburt Werte für
inflammatorische Marker im Fruchtwasser zu erhalten.
Die statistische Auswertung erfolgte computergestützt mittels Sigma Stat (Fa. Systat
Software, Erkrath). Für die deskriptive Analyse der Daten dienten Mittelwert und
Mediane. Die Normalverteilung wurde mit dem Kolmogorov- Smirnov Test und
Gruppenunterschiede mittels Kruskal- Wallis Test untersucht. Für die Überprüfung
der statistischen Signifikanz wurde der paarweise Vergleich zwischen Kontroll- und
Fallgruppe nach der Methode von Dunn durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde
dabei auf p < 0,05 festgesetzt.
Ergebnisse
32
3 Ergebnisse
Ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Studie war es, intrauterine Infektionen
bei frühem vorzeitigem Blasensprung durch Bestimmung von inflammatorischen
Markern im abfließenden Fruchtwasser zu identifizieren. Als Parameter wurden
hierzu TNF-α, IL-6 und LBP untersucht. Insgesamt wurden im Zeitraum von Juli 2005
bis Mai 2007 in der Universitätsfrauenklinik Freiburg 56 Patientinnen mit einem
Blasensprung vor der vollendeten 34. SSW stationär aufgenommen. In die Studie
konnten 27 dieser Patientinnen aufgenommen werden. Bei dem größten Teil der
übrigen Patientinnen folgte dem Blasensprung innerhalb von 24 Stunden die
Entbindung, so dass es nicht möglich war, von diesen Patientinnen eine Proben zu
gewinnen. Bei einigen Patientinnen konnte bei Ahydramnion kein Fruchtwasser
asserviert werden. Aus organisatorischen Gründen konnten 8
Patientinnen nicht in die Studie aufgenommen werden. Nur eine Patientin lehnte es
ab an der Studie teilzunehmen, aufgrund ihrer psychosozialen Belastungssituation
bei mehrfacher Abortanamnese (siehe Abb. 8).
8
4
Studie
1
27
16
Entbindung innerhalb
von 24 h
Oligohydramnion
Organisatorische
Probleme/ Ausschluss
Keine Einwilligung
Abb. 8: Anteil der Studienteilnehmerinnen an der Gesamtzahl der stationären Patientinnen mit frühem
vorzeitigem Blasensprung an der Universitätsfrauenklinik Freiburg (Juli 2005 bis Mai 2007) und
Verteilung der Patientinnen, die nicht in die Studie aufgenommen wurden.
Ergebnisse
33
Ursprünglich sollten 100 Patientinnen in die Studie aufgenommen werden. Diese
Zielsetzung der Fallzahl beruht auf den Ergebnissen einer Fallzahlabschätzung nach
einer Pilotstudie an der Universitätsfrauenklinik (Breuer, Promotion 2008). Im
Rahmen dieser Pilotstudie wurden im Zeitraum eines Jahres etwa 50 Patientinnen
mit einem vorzeitigen Blasensprung vor der 34. SSW aufgenommen. Diese Fallzahl
wurde im hier untersuchten Zeitraum nicht erreicht.
3.1 Probengewinnung und Logistik
Bei Aufnahme der Patientin wurde in der Regel eine erste Fruchtwasser-Probe bei
der routinemäßigen Spiegeleinstellung gewonnen. Teilweise war dies aus
technischen/organisatorischen Gründen nicht möglich. Bei vier Patientinnen konnte
keine Probe gewonnen werden, da die Binden zu trocken waren. Dies war vor allem
dann problematisch, wenn dadurch eine Probe der letzten drei Tage vor Geburt
verloren ging.
Bei der makroskopischen Beurteilung wurde die Blutbeimengung in drei Grade
eingeteilt (siehe Kap. 2.4.3). Drei Patientinnen hatten Fruchtwasserproben mit
Blutbeimengungen 2. Grades, eine Patientin eine Blutbeimengung 1. Grades.
Der Mittelwert der Lagerungszeitdauer (bei -20°C) bis zur Messung betrug 70 Tage,
(Medianwert = 57 Tage).
3.2. Studiengruppen
Die Patientinnen wurden retrospektiv nach der Geburt anhand der Plazentahistologie
und des kindlichen Outcomes, den Fall- bzw. Kontrollgruppen zugeordnet. Für jede
Patientin wurde TNF-α, IL-6 und LBP im abgehenden Fruchtwasser in den letzten
Tagen vor der Geburt gemessen.
Von den 27 Studienteilnehmerinnen ließen sich 10 Patientinnen eindeutig der
Kontrollgruppe zuordnen. Die Plazentahistologie zeigte in dieser Gruppe keine
Anzeichen einer Entzündung. Die Oberflächenabstriche des Kindes, sowie die
mikrobiologischen Untersuchungen von Magensaft, Blut und Mekonium waren
bezüglich spezifischer Erreger negativ. Die CRP-Werte des Kindes bei der
Erstuntersuchung lagen im Normbereich (alle <3 mg/l), und auch die IL-6-Werte im
Nabelschnurblut waren nicht erhöht. Der Mittelwert lag bei 38,0 pg/ml.
Ergebnisse
34
Zehn Patientinnen in der Studie wurden der AIS- Gruppe zugeordnet. Die
Entscheidung für die Einteilung in diese Gruppe erfolgte durch die Beurteilung der
Plazentahistologie und der klinischen Beurteilung des Neugeborenen. Die Histologie
der Plazenta zeigte bei allen Fällen dieser Gruppe entzündliche Veränderungen im
Sinne einer Chorioamnionitis. In zwei Fällen zeigte der Entzündungsverlauf schon
ein fortgeschritteneres Stadium, wie eine Omphalovaskulitis und eine beginnenden
Funisitis. In den Oberflächenabstrichen der Neugeborenen wurden keine
spezifischen Erreger nachgewiesen. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe war der IL-6 –
Wert im Nabelschnurblut in dieser Gruppe erhöht (>100 pg/ml). Es gab jedoch auch
Fälle in der AIS- Gruppe, bei denen der IL-6-Wert unter dieser Grenze lag, die aber
aufgrund der eindeutigen Plazentahistologie der AIS- Gruppe zugeordnet wurden.
Der Mittelwert von IL-6 im Nabelschnurblut lag bei 763 pg /ml, der CRP- Wert lagen
bei allen Kindern < 3 mg/l.
Sieben Fälle wurden der FIRS-Gruppe zugeordnet. Die Plazentahistologie verifizierte
ein fulminantes fortgeschrittenes Entzündungsgeschehen (z.B. eine ausgeprägte
Funisitis). Der IL-6 Wert im Nabelschnurblut war mit einem Mittelwert von 11690
pg/ml deutlich erhöht, und es wurden spezifische Erreger wie Escherischia coli, BStreptokokken oder Pilze in den Oberflächenabstrichen oder Blutkulturen der
Neugeborenen nachgewiesen. Der CRP- Mittelwert lag < 3 mg/l. Bei diesen Fällen
traten schwerwiegende Krankheitssymptome wie beispielsweise kongenitale Sepsis,
schweres Atemnot-Syndrom, intraventrikuläre Blutung oder nekrotisierende
Enterokolitis auf.
Ergebnisse
35
3.3 Zytokine und LBP in abgehendem Fuchtwasser
3.3.1 TNF-α-Messung
In der Kontrollgruppe lagen TNF-α-Werte im Fruchtwasser aus Bindenextraktion
zwischen 4 pg/ml und 151 pg /ml. Der Mittelwert der gemessenen Proben betrug 38
pg/ml (Median = 25 pg/ml). In der AIS- Gruppe lagen die TNF-α-Werte zwischen 47
pg/ml und 3910 pg /ml. Dabei lag der Mittelwert für TNF-α mit 785 pg/ml signifikant
über dem der Kontrollgruppe (Median = 706 pg/ml). In der FIRS-Gruppe wurden
erhöhte Werte gegenüber der Kontrollgruppe gemessen. Auch im Vergleich zur AISGruppe waren die TNF-α-Werte erhöht, zeigten in der statistischen Auswertung
jedoch keine signifikanten Unterschiede. Bei zwei Fällen der FIRS-Gruppe wurden
ähnlich niedrige Konzentrationen, wie bei Fällen der Kontrollgruppe gemessen. Diese
Fälle werden in der Diskussion noch gesondert besprochen. Insgesamt lagen die
gemessenen Werte zwischen 37 pg/ml und 5440 pg/ml. Der Mittelwert lag bei 2264
pg/ml und ist somit der höchste Wert von den drei Gruppen (Median = 2570 pg/ml).
Die Messdaten wurden sowohl für alle drei Gruppen, als auch im Vergleich für
Kontrollgruppe vs. Intrauterine Infektionen (AIS+ FIRS) ausgewertet.
Die statistische Auswertung zeigte signifikante Unterschiede zwischen der AIS- und
Kontrollgruppe bzw. zwischen der FIRS- und der Kontrollgruppe (p<0,05). Ein
signifikanter Unterschied zwischen der AIS- und FIRS- Gruppe wurde nicht
nachgewiesen.
Tab. 6 : Mittelwerte und Mediane für TNF-α:
TNF-α-Mittelwert
Kontrollgruppe
AIS-Gruppe
FIRS-Gruppe
38,8
785,3
2264,3
25,0
706,7
2570,0
(pg/ml)
TNF-α-Median
(pg/ml)
Ergebnisse
36
A
B
1000
1000
pg/ml
10000
pg/ml
10000
100
10
1
100
10
Kontrolle
AIS+FIRS
1
Kontrolle
AIS
FIRS
Abb. 9: A TNF-α –Werte in pg /ml für zwei Gruppen. B Aufspaltung in drei Gruppen.
AIS- und FIRS- Gruppe unterscheiden sich jeweils signifikant von der Kontrollgruppe (p<0,05).
AIS+FIRS vs. Kontrollgruppe unterscheidet sich ebenfalls signifikant (p<0,05). Ein signifikanter
Unterschied zwischen AIS und FIRS besteht nicht.
Für die Werte der graphischen Darstellung wurden jeweils die letzten beiden gültigen Messwerte
genommen und daraus der Mittelwert gebildet.
Bei einem Cut-off- Wert von 200 pg/ml lag die Sensitivität bei 76,5 % die Spezifität
bei 100% für die Unterscheidung zwischen Kontrollgruppe vs. Infektionsgruppe (AIS+
FIRS). Werte > 2000 pg/ml wurden ausschließlich in der FIRS-Grupppe gemessen.
3.3.2 IL-6- Messungen
Aus den Messdaten ist ersichtlich, dass IL-6-Konzentrationen im FW allgemein höher
waren, als die anderen Entzündungsparameter. In der Kontrollgruppe wurden IL-6Werte zwischen 2 pg/ml und 2665 pg/ml gemessen. Der Mittelwert für IL-6 lag in der
Kontrollgruppe bei 463 pg/ml (Median = 600 pg/ml). In der AIS-Gruppe wurden IL-6Konzentrationen zwischen 3891 und 74740 pg /ml gemessen. Die Verteilungen der
IL-6-Werte, waren in der AIS-Gruppe also wesentlich breiter gestreut. Der Mittelwert
der IL-6- Messungen lag mit 26502 pg/ml deutlich über dem der Kontrollgruppe
(Median = 21300 pg /ml). In der FIRS- Gruppe wurden signifikant erhöhte IL- 6 Werte
gemessen. Die Werte lagen ähnlich der AIS- Gruppe breit gestreut zwischen 1000
und 100000 pg/ml. So lag auch der Mittelwert mit 24281 pg/ml deutlich über dem der
Kontrollgruppe, jedoch unter dem der AIS- Gruppe (Median = 5075 pg/ml). Die
statistische Auswertung zeigte signifikante Unterschiede zwischen der AIS- und
Kontrollgruppe bzw. zwischen der FIRS- und der Kontrollgruppe (p<0,05). Ein
Ergebnisse
37
signifikanter Unterschied zwischen der AIS- und FIRS- Gruppe wurde nicht
nachgewiesen.
Tab. 7: Mittelwerte und Mediane für IL-6:
IL-6- Mittelwert
Kontrollgruppe
AIS-Gruppe
FIRS-Gruppe
463,9
26502,2
24281,7
600,0
21300,0
5075,0
(pg/ml)
Il-6 Median
(pg/ml)
A
B
104
104
103
103
pg/ml
105
pg/ml
105
102
102
101
101
100
Kontrolle
AIS + FIRS
100
Kontrolle
AIS
FIRS
Abb. 10: A IL-6 –Werte in pg /ml für zwei Gruppen. B Aufspaltung in drei Gruppen.
Die Kontrollgruppe unterscheidet sich signifikant von der AIS- und FIRS- Gruppe(p<0,05). AIS+FIRS
vs. Kontrollgruppe unterscheidet sich ebenfalls signifikant (p<0,05). Die Darstellung in drei Gruppen
zeigt, dass sich die AIS- und FIRS- Gruppe nicht signifikant voneinander unterscheiden.
Die Werte wurden aus den jeweils letzten zwei gültigen Werten der Fruchtwasserproben errechnet.
Bei einem Cut-off- Wert von 1000 pg/ml lag die Sensitivität bei 94,1 % die Spezifität
bei 100% für die Unterscheidung zwischen Kontrollgruppe vs. Infektionsgruppe (AIS+
FIRS).
Ergebnisse
38
3.3.3 LBP-Messung
In der Kontrollgruppe wurden LBP-Konzentrationen zwischen 35 ng/ml und 2250
ng/ml gemessen. Der Mittelwert für LBP lag in der Kontrollgruppe bei 542 ng/ml
(Median = 265 ng/ml). In der AIS-Gruppe wurden LBP-Konzentrationen zwischen
158 und 1899 ng /ml nachgewiesen. Der Mittelwert lag in dieser Gruppe bei 579
ng/ml (Median = 385 ng/ml). In beiden Gruppen wurden ähnliche Werte gemessen
und auch in der FIRS- Gruppe waren die Werte im Gegensatz zur Kontroll- oder AISGruppe nicht signifikant erhöht. Sie lagen in der FIRS- Gruppe breit gestreut
zwischen 86 ng/ml und 4228 ng/ml. Der Mittelwert lag bei 1327 ng /ml (Median = 758
ng/ml). Die statistische Auswertung ergab keine signifikanten Unterschiede unter den
Gruppen.
Tab. 8: Mittelwerte und Mediane für LBP:
Kontrollgruppe
LBP-Mittelwert
AIS-Gruppe
FIRS-Gruppe
541,6
578,9
1326,8
264,8
385,4
758,4
(ng/ml)
LBP- Median
(ng/ml)
B
105
105
104
104
ng/ml
ng/ml
A
103
103
102
102
101
101
Kontrolle
AIS+FIRS
Kontrolle
AIS
FIRS
Abb.11: A graphische Darstellung der LBP- Werte in ng/ml in 2 Gruppen. B Aufspaltung in drei
Gruppen. Die drei Gruppen zeigen Überlappungen. Die Werte erlauben keine Unterscheidung der
einzelnen Gruppen. Die statistische Auswertung zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen den
drei Gruppen untereinander.
Ergebnisse
39
3.4. Maternales Serum- CRP und Leukozyten-Werte
Routinemäßig wurden während des stationären Aufenthaltes der Patientin
regelmäßig die CRP- und Leukozytenwerte im mütterlichen Serum bestimmt.
In den folgenden Graphiken sind die mütterlichen Werte in den letzen drei Tagen vor
der Geburt für die verschiedenen Studiengruppen gezeigt.
In der statistischen Auswertung, wurden keine signifikanten Unterschiede in den
Studiengruppen für CRP und Leukozytenzahl gefunden.
50
Abb. 12: Mütterlichen CRP-Werte vor der Geburt.
Die Werte bilden sich als Mittelwert aus den letzten
drei Tagen vor der Geburt. Die statistische
Auswertung zeigte keinen signifikanten Unterschied
der drei Studiengruppen untereinander (p>0,05).
40
mg/l
30
20
10
0
Kontrolle
AIS
FIRS
Abb.13 : Mütterlichen Leukozyten vor Geburt
Die Werte stellen die Mittelwerte der
letzten drei Tagen vor Geburt dar.
Auch bei der mütterlichen Leukozytenzahl
besteht kein signifikanter Unterschied der drei
Studiengruppen untereinander (p>0,05).
Tsd/µl
20
10
0
Kontrolle
AIS
FIRS
Ergebnisse
40
3.5 Mütterliche Parameter und kindliches Outcome
Mütterliche und kindliche Klinik sind in Tabelle 9 zusammenfassend dargestellt. Die
Gruppen wurden nach Plazentahistologie eingeteilt. Als mütterliche Faktoren wurden
Alter, Multiparität, Primiparität, Gestationsalter bei Blasensprung und zervikale
Insuffizienz mit einbezogen. Als kindliche Kriterien wurden kongenitale Sepsis,
schweres Atemnotsyndrom, intraventrikuläre Blutung und nekrotisierende
Enterokolitis gewählt. Junge Erstgebärende dominieren in der Gruppe mit einer
negativen Plazentahistologie, wohingegen ältere Mehrgebärende in den beiden
anderen Gruppen zu einem größeren Prozentsatz vertreten waren. Das
Gestationsalter bei Blasensprung war in der Kontrollgruppe mit durchschnittlich 30, 6
Wochen höher. Mit Fall 7 wurde auch ein Fall mit neonataler Morbidität und Mortalität
der Kontrollgruppe zugeordnet. Unter schwerwiegender neonataler Morbidität
wurden Parameter wie neonatale Sepsis, schweres Atemnotsyndrom,
bronchopulmonale Dysplasie, intraventrikuläre Blutungen und nekrotisierende
Enterokolitis mit einbezogen (siehe Tab.3).
Ergebnisse
41
Tab. 9: Mütterliche und kindliche klinische Daten:
Parameter
Kontrollgruppe (n=10)
AIS und FIRS- Gruppe
(n=17)
Alter der Mutter
27,75
31,7
Primiparität
40 % (n= 4)
29,4 % (n= 5)
Multiparität
60% (n= 6)
70,5 % (n=12)
Gestationsalter beim
30,6 Wochen
27,7 Wochen
12 Tage
14 Tage
31,4 Wochen
29,3 Wochen
Zervikale Insuffizienz
25 %
14,2%
Kongenitale Sepsis
0% (n=0)
11,8 % (n=2)
schweres
20 % (n=2)
35,2 (n=6)
Intraventrikuläre Blutung
0% (n=0)
11,8 % (n=2)
Nekrotisierende
0% (n=0)
11,8 % (n=2)
Geburtsgewicht
1652,5 g
1347,8 g
Signifikante neonatale
0% (n=0)
41,1 % (n=7)
10 % (n=1)*
0% (n=0)
Blasensprung (MW)
Latenzzeit zwischen
Blasensprung und Geburt
Gestationalter bei Geburt
(MW)
Atemnotsyndrom
Enterokolitis (NEC)
Morbidität
Neonatale Mortalität
(*Fall 7, siehe auch Kap. 3.5.2)
Ergebnisse
42
3.6 Falldarstellungen
Neben typischen Verläufen in den verschiedenen Gruppen werden auch einige
Grenzfälle dargestellt werden, um die Problematik der Gruppenzuordnung zu
verdeutlichen.
3.6.1.Typische Fälle aus Fall- bzw. Kontrollgruppen
Im folgenden Kapitel wurden drei Fälle mit kurzer Anamnese aus der jeweiligen
Studiengruppe vorgestellt. Es wurden die TNF-α, IL-6 und LBP-Konzentrationen im
Fruchtwasser mit mütterlichem Serum- CRP verglichen (siehe Tabelle 5).
Fall 1: Kontrollgruppe (Patientin 4)
Mutter : 20-jährige GI/PI, Schwangerschaft kompliziert durch Zervixinsuffizienz,
vorzeitige Wehen und fVBS in der 30+6 SSW. Lungenreife erfolgt, CRP unter
Antibiose zuletzt <3 mg/l. Indikation zur Sectio caesarea in der 31+1 SSW wegen
mütterlicher Infektionshinweise.
Kind: Frühgeborenes (FG) in der 31+1 SSW, 1780g, Atemnot- Syndrom, ApnoeBradykardie-Syndrom, IL-6 im Nabelschnur-Blut: 4 pg /ml.
Plazentahistologie: unauffällig, normgerecht, kein Hinweis auf Infektion.
Fall 2: AIS- Gruppe (Patientin 2)
Mutter: 34-jährige GIV/GI, Z.n Spätabort in der 19.SSW, sowie zwei ExtrauterinGraviditäten. Schwangerschaft kompliziert durch vorzeitige Wehen und VBS in der
24+5 SSW. Lungenreifeinduktion abgeschlossen, Antibiose erfolgt, Abstriche
negativ, CRP zuletzt 3 mg/l. Indikation zur Sectio caesarea: zunehmende
Wehentätigkeit trotz maximaler Tokolyse.
Kind: FG in der 25+2 SSW, 740 g, AIS, Apnoe-Bradykardie-Syndrom,
Hyperbilirubinämie, IL-6 : 210 pg/ml.
Plazentahistologie: floride Chorioamnionitis und Omphalovaskulitis.
Ergebnisse
43
Fall 3: FIRS- Gruppe (Patientin 17)
Mutter : 31-jährige GV/PI mit VBS in der 25+6 SSW, Lungenreife abgeschlossen,
Antibiose und Antimykotika, da Candida albicans im Vaginalabstrich, CRP am Tag
vor der Geburt auf 43 mg/l angestiegen, davor 3 mg/l. Indikation zur Sectio in der
26+4 SSW: Verdacht auf AIS.
Kind : FG in der 26+4 SSW, 820 g, AIS, Konnatale Pilzinfektion, Nekrotisierende
Enterokolitis, Apnoe-Bradykardie-Syndrom, IL-6: 179 pg/ml.
Plazentahistologie: floride Chorioamnionitis placentae et parietalis, mit
Deckplattenvaskulitis, Omphalovaskulitis und Funisitis, ausgeprägte Amnioninfektion.
Tab. 10: Zytokinkonzentrationen bei den dargestellten Fallbeispielen (siehe Text) im
zeitlichen Verlauf der letzten Tage vor der Geburt:
IL-6 (pg/ml)
LBP
CRP (mg/l)
Zeitverlauf
TNF-α
(d) ¹
(pg/ml)
E-2
28
375
401
12
E-1
54
305
203
50
E
<20
660
228
47
E-2
256
3690
1564
13
E-1
295
2410
517
8
E
1610
15850
470
3
FIRS-
E-4
1615
23450
1238
3
Gruppe
E-3
336
nicht messbar
1416
3
E-2
1910
100000
1441
27
E-1 (7 Uhr)
6750
>100000(1:150)²
2530
43
E-1 (17 Uhr)
4130
>100000 (1:150)
2465
Kontrolle
AIS-Gruppe
(µg/ml)
¹ E = Entbindungstag, (E- 1 = ein Tag vor der Entbindung)
² 1: 150: Probe wurde im Verhältniss 1: 150 vorverdünnt
In Tabelle 10 wurden TNF-α, IL-6 und LBP im Fruchtwasser und mütterliches SerumCRP von den letzten Tagen vor der Geburt verglichen. Bei den letzten beiden
Proben der FIRS-Fälle, waren die Werte selbst bei einer Verdünnung von 1: 150 für
Ergebnisse
44
die Immulitemessung zu stark konzentriert. Der TNF- Verlauf zeigte steigende Werte
bei den AIS- und FIRS-Fällen, wobei dies bei dem FIRS-Fall am deutlichsten war. In
der Kontrolle waren die Werte deutlich niedriger. Ähnliche Verläufe ließen sich auch
für IL-6 nachweisen. Durch den CRP- Verlauf, ließen sich die drei Gruppen nicht
voneinander unterscheiden. Der Kontrollfall zeigte z.B. höhere Werte, als der FIRSFall.
3.6.2 Sonder- und Grenzfälle
Fall 4: Mütterlicher Diabetes mellitus Typ 1
Dieser Fall, der nach der Beurteilung der Plazenta und des kindlichen Outcomes in
die Kontrollgruppe eingeteilt worden wäre, wurde nicht in die Studie einbezogen. Bei
diesem Fall wurden trotz fehlenden Infektionszeichen beim Neugeborenen hohe
TNF-α-Konzentrationen im Fruchtwasser nachgewiesen. Diese Proben waren mit
Blut kontaminiert und die TNF-α-Werte waren bei diesen Proben schon eine Woche
vor Geburt auffällig hoch (ca. 400 pg /ml) Dieser Fall wurde jedoch aufgrund eines
mütterlichen Diabetes Typ 1 nicht berücksichtigt, da eine mütterliche
Stoffwechselerkrankung zu den Ausschlusskriterien der Studie zählt. Dieser Fall
zeigt, dass mütterliche Erkrankungen Ergebnisse verfälschen können.
Mutter : 38-jährige GI /PI, mit VBS in der 28+ 6 SSW. Diabetes mellitus Typ I mit
Insulinpumpe seit 1981, seit 3 Jahren mit Pumpe. Indikation zur Sectio in der 32+5
SSW wegen Beckenendlage und blutigem Fruchtwasser. Die mütterlichen
Infektionswerte peripartal, waren nicht erhöht.
Kind : FG in der 32+5 SSW, Geburtsgewicht 1850 g, respiratorische
Anpassungsstörung, Labor: IL-6 im Nabelschnurblut: 8 pg/ml, CRP <3 pg/ml.
Mikrobiologie: unauffällig
Plazentahistologie: normgewichtig, altersentprechend
Ergebnisse
45
Fall 5: Fulminante Escherischia coli (E.coli) – Infektion (Patientin 5+ 3)
Patientin 5:
Mutter: 31-jährige GIV/PII mit VBS in der 30+4 SSW, im Vaginalabstrich wurde
E.coli nachgewiesen, es erfolgte eine antibiotische Behandlung mit Zinacef. Die
Geburt erfolgte spontan in der 32+5 SSW morgens.
Kind: FG in der 32+5 SSW, Geburtsgewicht 1860 g, Neugeborenensepsis durch
E.coli, Atemnotsyndrom, Kreislaufinsuffizienz. Labor : IL-6 im Nabelschnurblut: 5497
pg/ml, CRP <3 mg/l.
Mikrobiologie: Oberflächenabstrich und Blutkultur : Nachweis von E.coli.
Plazentahistologie: Chorioamnionitis placentae et parietalis, geringe
Omphalovaskulitis.
Patientin 3 :
Mutter: 31-jährige GVI/PV mit VBS in der 28+4 SSW, Adipositas, im Vaginalabstrich
vereinzelt E.coli, es erfolgte eine antibiotische Behandlung mit Zinacef. Die Geburt
erfolgte spontan in der 30+2 SSW.
Kind: FG in der 30+2 SSW, Geburtsgewicht 2180 g, Frühgeboreneninfektion mit
E.coli, phototherapiepflichtige Hyperbilirubinämie. Labor : IL-6 im Nabelschnurblut:
2400 pg/ml, CRP <3 mg/l.
Mikrobiologie: Oberflächenabstrich und Blutkultur : Nachweis von E.coli.
Plazentahistologie: Chorioamnionitis placentae et parietalis, Deckplattenvaskulitis,
Omphalovaskulitis.
Die TNF-α-Werte im abgehenden Fruchtwasser von Patientin 5 waren mit Werten
zwischen 20 und 60 pg /ml niedrig und auch die IL-6- und LBP- Werte waren nicht
erhöht. Hier ist der Zeitpunkt der letzten Probenentnahme von besonderer
Bedeutung. Diese erfolgte ca. 24 h vor der Geburt.
Bei Patientin 3 konnte ein massiver Anstieg des TNF-α-Konzentration im
abgehenden Fruchtwasser zeitlich dokumentiert werden. Bei dieser Patientin konnte
innerhalb der letzten 24 Stunden noch eine Probe gewonnen werden.
Ergebnisse
46
Tab. 11: TNF-α-Werte am Tag der Entbindung bei Patientin 3:
Zeitpunkt der Probengewinnung
TNF-α-Wert in pg/ml
Tag vor der Entbindung 9.30 Uhr
140 pg/ml
Tag vor der Entbindung 22.00 Uhr
5000 pg/ml
Ähnlich der Konzentration der Probe von Patientin 5, bei der die letzte
Probengewinnung auch am morgen des Tages vor der Entbindung war, wurden in
dieser Probe relativ niedrige Werte gemessen. In diesem Fall lässt sich der
fulminante TNF-α Anstieg dokumentieren. Bereits bei einer Latenzzeit von 12
Stunden zwischen den beiden Probengewinnungen fand ein deutlicher Anstieg statt.
Fall 6: Typischer Grenzfall zwischen Kontrollgruppe und AIS-Gruppe (Patientin
23)
Mutter : 23-jährige GI/PI mit VBS in der 27+5 . Es kam zu einer nicht hemmbaren
Wehentätigkeit und aufgrund eines leichten Anstiegs der mütterlichen
Infektionsparameter wurde die Indikation zur Sectio in der 29+ 4 SSW gestellt.
Kind: FG in der 29+4 SSW, Geburtsgewicht 1350 g, Apnoe-Bradykardie-Syndrom,
Verdacht eines Amnioninfektionssydroms. Labor: IL-6 im Nabelschnurblut: 110
pg/ml, CRP< 3 mg/l. Mikrobiologie : negativ
Plazentahistologie: es fand sich eine diskrete Entzündung im Bereich der
Nabelschnur, ansonsten keine wesentlichen Entzündungszeichen.
Die TNF-α und IL-6 Werte im abgehenden Fruchtwasser waren mit Werten von 50 –
240 pg/ml niedrig bis mäßig erhöht. Der IL-6 Wert im Nabelschnurblut lag mit 110
pg/ml leicht über dem festgelegten Cut-off- Wert von 100 pg/ml. In der
Plazentahistologie fanden sich nur diskrete Entzündungszeichen, das Labor des
Kindes zeigte nur mässig erhöhte IL-6 Werte. Dieser Fall wurde in die AIS-Gruppe
eingestuft, war jedoch nicht deutlich von der Kontrollgruppe abzugrenzen. Dies ist ein
Grenzfall, bei welchem es schwierig ist, eine eindeutige Gruppenzuteilung
vorzunehmen.
Ergebnisse
47
Fall 7: Postpartaler Tod eines Kindes aus der Kontrollgruppe (Patientin 20)
Mutter: 36-jährige GI/PI mit VBS in der 20+2 SSW, Oligohydramnion/ Ahydramnie,
zuletzt E.coli- Besiedlung vaginal, keine mütterlichen Infektionshinweise peripartal.
Indikation zur Sectio in der 30+0 SSW, da vaginale Besiedlung mit E.coli und
Ahydramnie.
Kind: FG in der 30+0 SSW, Gewicht 1270 g, Lungenhypoplasie bei Ahydramnie,
pulmonale Hypertonie mit Rechts- Links- Shunt über persistierenden Ductus
arteriosus, metabolische Azidose, persistierendes foramen ovale mit Links- RechtsShunt, Kreislaufinsuffizienz. Labor : CRP<3 mg/l, IL-6 21 pg/ml.
Mikrobiologie: Abstriche negativ
Plazentahistologie: keine Hinweise für eine Infektion.
Das Besondere an diesem Fall ist die lange Latenzzeit von 70 Tagen zwischen
Blasensprung und Entbindung. Bei dem Neugeborenen wurde eine
Lungenhypoplasie bei Ahydramnie in utero nachgewiesen. Das Kind verstarb circa
zwei Wochen nach der Geburt aufgrund von Kreislauf-Insuffizienz und
respiratorischer Insuffizienz. Eine intrauterine Infektion oder eine Infektion in den
ersten Tagen nach Geburt wurde nicht diagnostiziert. Die gemessenen
Infektionsparameter passen zu diesem Befund, sie waren mit 4-50 pg/ml für TNF-α
und 600-800 pg/ml für IL-6 entsprechend der fehlenden Infektion niedrig.
Ergebnisse
48
3.7 Schnelltestuntersuchungen für TNF- α
In Zusammenarbeit mit der Firma Milenia (Bad Nauheim) wird an der Entwicklung
eines Schnelltest-Sytems zur Messung von TNF-α aus abgehendem Fruchtwasser
gearbeitet. Bei einem ersten Testdurchlauf wurde deutlich, dass die Empfindlichkeit
des Schnelltests bisher zu hoch war. Die die TNF- α -Konzentrationen im
abgehenden Fruchtwasser waren für den bisher entwickelten Test zu hoch. Der Test
ist derzeit noch in weiterer Entwicklung, zur Optimierung der Messgenauigkeit.
Abb. 14 Ausschnitt aus den ersten Messungen von TNF-α im abgehenden Fruchtwasser mit Hilfe des
Schnelltests. In der linken Spalte sind die Schnellteste mit deutlicher Kontrollbande sichtbar. In der
mittleren Spalte wurden die Probennummern notiert. Darstellung der Messergebnisse in pg/ml in der
rechten Spalte.
Diskussion
49
4 Diskussion
Der fVBS ist eine Hauptursache perinataler Morbidität und Mortalität. Das
therapeutische Vorgehen bei Patientinnen mit fVBS ist unter anderem durch bisher
unzureichende diagnostische Möglichkeit schwierig. Die etablierten klinischen
Parameter (z.B. maternales CRP, maternale Leukozytose, maternales Fieber, fetale
Tachykardie, Druckdolenz des Uterus oder übelriechendes Fruchtwasser (FW)
(Leitlinien DGGG)) sind für die Erkennung eines erhöhten Risikos für den Feten
weniger aussagekräftig, da es sich um späte und unspezifische Parameter im
Entzündungsgeschehen handelt. Der Konflikt zwischen abwartendem und aktivem
Vorgehen ist entscheidend für das mütterliche Wohl und die Prognose des Kindes.
Für ein rational begründetes Management des fVBS spielt die Infektionsdiagnostik
eine entscheidende Rolle. In der vorliegenden Studie wurde durch eine nichtinvasive Methode abgehendes Fruchtwasser gewonnen und auf inflammatorische
Zytokine untersucht. Es wurden TNF-α, IL-6 und LBP als potentielle frühe
Entzündungsmarker im abgehenden Fruchtwasser gemessen. Ziel war es zu
evaluieren, ob diese Parameter ein intrauterines inflammatorisches Geschehen (AIS
oder FIRS) anzeigen können. Gleichzeitig wurde an der Entwicklung eines
Schnelltests für TNF-α und IL-6 gearbeitet, die eine Untersuchung im Rahmen einer
Bedside-Diagnostik ermöglichen.
4.1 Methoden der Fruchtwassergewinnung
In zahlreichen Studien wurde bereits untersucht, ob Zytokine bei Infektionen
aussagekräftige Parameter darstellen, um eine intrauterine Infektion frühzeitig zu
erkennen (Holst et al. 2007; Baud et al. 1999; Menon et al. 2007). Für die klinische
Praxis wird angestrebt, die Bestimmung inflammatorischer Zytokine direkt aus dem
Fruchtwasser vorzunehmen, da Zytokinbestimmungen im maternalen Serum in ihrer
Aussagekraft beschränkt sind (Shobokshi et al. 2002).
In der Literatur wurden bereits die Untersuchungen von Infektionsparametern im
Fruchtwasser beschrieben, welches durch Amniozentese gewonnen wurde. Jedoch
ist diese Art der Fruchtwassergewinnung vor allem bei persistierendem Oligo- bzw.
Anhydramnion technisch schwierig durchführbar und nicht mehrmals wiederholbar.
Ausserdem kann die Anmniozentese selbst eine Infektion hervorrufen, den Fetus
verletzen oder eine Frühgeburt auslösen (Kolibianakis et al. 2003; Scott et al. 2002).
Diskussion
50
In der Pilotstudie von Breuer (2008) an unserer Klinik, wurden Methoden der
invasiven und nicht-invasiven Fruchtwassergewinnung untersucht und Unterschiede
der Zytokinkonzentrationen im reinen Fruchtwasser (aus Spiegeleinstellungen) vs.
abgehendem Fruchtwasser (aus Bindenextraktion), welches durch andere Sekrete
des weiblichen Urogenitaltraktes kontaminiert sein könnte, verglichen.
Dabei standen die Sicherheit der Patientin und des Feten in utero im Vordergrund.
Ein wesentliches Ziel war es auch eine Möglichkeit zu finden, das abfließende
Fruchtwasser täglich zu gewinnen.
Bei der Probengewinnung durch eine sterile Pipette ist eine Keimeinschleppung
unwahrscheinlich. Dieses Verfahren ist jedoch für eine tägliche
Fruchtwassergewinnung nicht praktikabel, da eine Spiegeleinstellung meistens nur
bei der Aufnahme erfolgt.
Bei der Gewinnung von abgehendem Fruchtwasser aus Binden ist die Kontamination
der Fruchtwasserprobe durch andere Sekrete ein größeres Problem. So könnten
durch Verdünnung falsch niedrige Zytokinwerte trotz einer manifesten Infektion
gemessen werden. Jedoch könnten Werte bei dieser Art der Fruchtwassergewinnung
auch falsch hoch gemessen werden, z.B. bei einer bakteriellen Vaginose der
Patientin.
Außerdem ist die Lagerungsdauer der Binden bis zum Auspressen des
Fruchtwassers und anschließendem sofortigen Einfrieren ein kritischer Faktor.
So zeigte sich in einer Studie zur Stabilität von Infektionsparmetern (Yu 2008,
Promotion), dass es bei einer Probenlagerung bei 2-8 °C zu einem Abbau der
Analyte von 5-8 % kommen kann, bedingt durch den Proteasegehalt des
Vaginalmilieus. Bei höheren Temperaturen könnte der Zytokinabfall noch stärker
ausfallen. Es sollte also darauf geachtet werden, dass die Binden nicht zu lange
lagern und das Fruchtwasser möglichst zeitnah zur Gewinnung eingefroren bzw.
direkt untersucht werden sollte. Durch Einsatz von Proteaseinhibitoren können die
Proben zusätzlich stabilisiert werden.
Problematisch sind Fälle mit fVBS, bei denen aufgrund des geringen
Fruchtwasserabgangs keine Probe gewonnen werden kann. Bei Patientinnen mit
einem Oligohydramnion kann dieses Phänomen über Tage anhalten. Eine Diagnostik
wäre in diesem Zeitraum somit nicht möglich.
Diskussion
51
Der Vorteil der Fruchtwasserasservierung aus Binden ist die Möglichkeit dieses
täglich zu gewinnen. Damit wäre eine engmaschige Kontrolle möglich, um eine
intrauterine Infektion zeitnah zu erkennen.
Außerdem kann bei Fruchtwassergewinnung durch Bindenextraktion eine Art
Arbeitsteilung stattfinden, die ohne Beteiligung ärztlichen Personals möglich ist. Die
Patientin selbst sammelt die Binden in entsprechenden Tüten und beschriftet diese
mit Datum und Uhrzeit. Das Auspressen der Binde kann nach einer kurzen Schulung
von Labormitarbeitern, pflegerischem Personal oder anderen Personen durchgeführt
werden. Zusammenfassend stellt die Bindenextraktion somit eine sinnvolle
Alternative zur Gewinnung durch eine Pipette bei Spiegeleinstellung und zur
invasiven Fruchtwasserentnahme wie der Amniozentese dar.
4.2 Infektionsparameter in abgehendem Fruchtwasser
In der vorliegenden Studie wurde abgehendes Fruchtwasser bei Patientinnen mit
frühem vorzeitigem Blasensprung auf die Infektionsparameter TNF-α, IL-6 und LBP
untersucht. Die Auswertung der TNF-α –Messungen ergab signifikante Unterschiede
zwischen der Kontrollgruppe vs. AIS – und FIRS-Gruppe (p<0,05) (siehe Abb. 9). Bei
einem Cut-off-Wert von 200 pg/ml lag die Sensitivität bei 76%, die Spezifität bei
100% zur Identifikation Kontrollgruppe vs. Intrauterine Infektions-Gruppe (AIS+
FIRS). TNF-α-Werte von > 2000pg/ml wurden ausschließlich in der FIRS-Gruppe
gemessen.
Die IL-6-Messungen in abgehendem Fruchtwasser ergaben ebenfalls signifikante
Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der AIS- bzw. FIRS-Gruppe (siehe
Abb. 10). Bei einem Cut-off-Wert von 1000pg/ml lag die Sensitivität bei 94 %, die
Spezifität bei 100% zur Unterscheidung der Kontrollgruppe vs. einer Intrauterinen
Infektion (AIS+ FIRS). Bei LBP wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen
den drei Gruppen beobachtet (siehe Abb. 11).
Aufgrund zahlreicher publizierter Daten ist es heute belegt, dass bei intrauterinen
Infektionen die Spiegel von inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, IL-1ß, TNF-α) im
Fruchtwasser ansteigen (Holst et al. 2007; Baud et al. 1999; Romero et al. 1990;
Shobokshi et al. 2002; Wang et al. 1998).
Die Studie von Saito et al. (2001) untersuchte mögliche Entstehungsort der Zytokine
und eine mögliche fetale Beteiligung der Zytokinproduktion. Nach dieser Arbeit sind
Diskussion
52
sowohl die Dezidua, als auch die fetale Seite an der Zytokinproduktion beteiligt. Auf
dezidualer Seite sind dies Makrophagen der Plazenta und deziduale Zellen. Zellen
der fetalen Membran (=Amniochorion) exprimieren mRNA und Proteine für
verschiedene Zytokine, wie IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α.
4.2.1 TNF-α
In der vorliegenden Studie wurden signifikant höhere TNF-α-Konzentrationen bei
Frauen mit fVBS mit nachweisbarer intrauteriner Infektion gemessen (siehe Abb. 9).
Der Cut-off-Wert von 200 pg/ml (siehe 3.3.1) zur Unterscheidung von Kontrollgruppe
vs. Intrauterine Infektion, kann aufgrund des kleinen Studienkollektivs zunächst nur
als Orientierungswert angesehen werden. Bei allen drei gemessenen
inflammatorischen Markern war kein signifikanter Unterschied zwischen AIS- und
FIRS-Gruppe nachweisbar. Bei der Messung von TNF-α traten Werte > 2000 pg/ml
ausschließlich in der FIRS-Gruppe auf. Bei zwei Fällen der FIRS Gruppe wurden
aber deutlich niedrigere Werte als 2000 pg/ml gemessen. Diese Fälle werden in
Kapitel 4.5 gesondert besprochen (siehe 4.5). Da die Fallzahl in der FIRS-Gruppe
klein ist, spielen diese zwei Fälle durchaus eine Rolle bei der statistischen
Auswertung.
Trotz dieser Einschränkungen ließen sich besonders schwere Verläufe einer
Infektion in utero in der vorliegenden Studie also am besten durch TNF-α-Messung
identifizieren.
Diese vorgelegten Ergebnisse stimmen mit bisherigen wissenschaftlichen
Erkenntnissen z.B. von Park et al. (2004) überein. In dieser Arbeit wurde TNF-α im
Fruchtwasser untersucht, um eine mögliche early-onset Sepsis eines Frühgeborenen
zu identifizieren. Das Fruchtwasser wurde mittels Amniozentese bei Frauen
gewonnen, die innerhalb der nächsten 72 h eine Frühgeburt hatten. Die
Arbeitsgruppe zeigte, dass TNF-α im Fruchtwasser bei einer Frühgeburt mit earlyonset -Sepsis erhöht war und als diagnostisch besser geeignet war, als eine
Fruchtwasserkultur oder Plazentahistologie.
Auch in der Arbeit von Baud O et al. (1999) wurde TNF-α, als der beste
Vorhersageparameter für eine schwere kindliche Infektion beschrieben. Hier wurde
Fruchtwasser auf die inflammatorischen Zytokine IL-1ß, IL-6 und TNF-α im
Zusammenhang mit intrauterinen Infektionen untersucht. IL-1ß wurde als bester
Diskussion
53
Vorhersageparameter der histologischen Chorioamnionitis identifiziert, TNF-α für
eine frühe schwere neonatale Infektion. Jean-Pierre et al. (2006) untersuchten
Fruchtwasser bei Patientinnen ohne frühen vorzeitigen Blasensprung mittels
Amniozentese. Es konnte durch FW-Untersuchungen ex vivo nachgewiesen werden,
dass es durch bakterielle Stimulation zu einer Potenzierung der TNF-α -Produktion
kam. Die TNF-α-Konzentration kann also intrauterin im Fruchtwasser durch
bestimmte Faktoren, z.B. bakterielle Besiedlung, erhöht werden und liefert so
Hinweise auf eventuelle pathologische Veränderungen des Milieus.
Der TNF-α-Spiegel kann durch weitere Faktoren beeinflusst werden.
Bei einigen Fällen der vorliegenden Studie konnte beobachtet werden, dass manche
Frauen extrem viel Fruchtwasser verloren und somit intrauterin ein sehr hohes
Reservevolumen aufwiesen. Bei einigen dieser Patientinnen wurden im
Fruchtwasser trotz einer nachgewiesenen Chorioamnionitis nur relativ niedrige TNFα -Spiegel nachgewiesen. Hier könnte durch ein besonders großes intrauterines
Fruchtwasservolumen eine Verdünnung der Infektionsparameter erfolgt sein.
Umgekehrt wurde von Yoon et al. (1999) berichtet, dass bei Frauen mit
Oligohydramion und fVBS höhere Spiegel, unter anderem von IL-6 und TNF-α
gemessen wurden.
Zusammenfassend kann aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und der
bisherigen wissenschaftlichen Erkenntnisse postuliert werden, dass TNF-α intrauterin
im Fruchtwasser bei Frauen mit fVBS als aussagekräftiger Marker für eine
intrauterine Infektion angesehen werden kann. In der vorliegenden Arbeit konnten
jedoch nicht alle Fälle mit einer intrauterinen Infektion eindeutig identifiziert werden
(Sensitivität = 76%).
4.2.2 IL-6
In der vorliegenden Studie wurden signifikant höhere IL-6-Konzentrationen bei
Frauen mit fVBS mit nachweisbarer intrauteriner Infektion gemessen (siehe Abb. 10).
Der Cut-off-Wert von 1000 pg/ml (siehe 3.3.2) zur Unterscheidung von
Kontrollgruppe vs. Intrauterine Infektion, kann aufgrund des kleinen Studienkollektivs
zunächst nur als Orientierungswert angesehen werden. Im Gegensatz zu TNF-α
wurden in der FIRS-Gruppe keine höheren Zytokinkonzentrationen im Vergleich zur
AIS-Gruppe gemessen. Aus den Messergebnissen der vorliegenden Arbeit ist
Diskussion
54
ersichtlich, dass allgemein die Spiegel von IL-6 im Fruchtwasser sehr hohe Werte
annehmen können. Dies wurde unter anderem auch von Shobokshi et al. (2002)
beschrieben, die im Gegensatz zum Serum, viel höhere Spiegel IL-6Konzentrationen im Fruchtwasser fanden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit werden durch andere Studien untermauert,
bei denen eine Erhöhung der Konzentration inflammatorischer Zytokine im
Fruchtwasser bzw. Zervixsekret als ein zuverlässiger Indikator für eine intrauterine
Infektion beschrieben wurde (Holst et al. 2007; Wang et al. 1998; Gomez et al. 1995;
Yoon et al. 1995; Kayem et al. 2005).
Interleukin-6 wird intrauterin von der fetomaternalen Einheit produziert. Ein Großteil
dieses Zytokins entstammt wahrscheinlich der Eihaut, die nach Stimulation mit LPS
zur Interleukin-6-Produktion in der Lage ist.
Es gibt eine Korrelation zwischen erhöhten Interleukin-6-Konzentrationen im
Fruchtwasser und einer höheren perinatalen Morbidität. Bei erhöhter IL-6Konzentration ist das Risiko für das Auftreten einer neonatalen Sepsis, einer
nekrotisierenden Enterokolitis und weiteren Erkrankungen, die im Zusammenhang
mit prä- und perinatal erworbenen Infektionen stehen, erhöht (Yoon 1995).
Kayem et al. (2005) untersuchten das vaginale Sekret von Frauen mit frühem
vorzeitigem Blasensprung auf IL-6 und wertete dies mit Hilfe eines Schnelltests aus
(Sensitivität 79%, Spezifität 56%). Der positive prädiktive Wert war in dieser Studie
mit 30% recht niedrig. Dazu gibt es verschieden Erklärungsmöglichkeiten. Einerseits
ist ein inflammatorisches intrauterines Geschehen nicht gleichbedeutend mit einer
fetalen Infektion. Außerdem war die Latenzzeit bei dieser Arbeit zwischen
Probenentnahme und Entbindung oft sehr lang. Dies unterstreicht noch einmal, dass
eine tägliche oder sogar mehrmals tägliche Probengewinnung, einen entscheidenden
Faktor darstellt, um eine verbesserte Diagnostik zu ermöglichen.
In der vorliegenden Studie wurden auch erhöhte IL-6-Konzentrationen im
Nabelschnurblut der Neugeborenen aus der AIS- und FIRS-Gruppe gemessen.
Interleukin-6 wird als ein inflammatorisches Zytokin schon routinemässig im
Nabelschnurblut von Neugeborenen gemessen (Satar et al. 2008; Berner et al. 2001;
Krueger et al. 2001; Khassawneh et al. 2007). Die Erhöhung von Interleukin-6 im
Nabelschnurblut deutet auf ein intrauterin begonnenes infektiöses Geschehen hin,
welches auf den Feten übergreift. Dieser Zusammenhang erklärt auch die
Verbindung zwischen erhöhten Konzentrationen an Interleukin-6 im Nabelschnurblut
Diskussion
55
und der Entwicklung einer Sepsis und auch dem Auftreten von periventrikulären
Läsionen im Sinne einer Leukomalazie (Yoon 1996).
Die Studie von Berner et al. (2001) gibt Hinweise darauf, dass eine Besiedlung der
Nabelschnur mit Erregern bereits in utero eine Zytokinproduktion auslöst, die als
Folge hohe IL-6-Spiegel im Fruchtwasser nach sich ziehen und somit auch eine
mögliche Infektion anzeigen. In der vorliegenden Studie zeigt sich dieser mögliche
Zusammenhang durch präpartal erhöhte IL-6 Spiegel im Fruchtwasser bei einer
postpartal nachgewiesenen Infektion des Kindes.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und die bisherigen
wissenschaftlichen Erkenntnisse, dass IL-6 bei intrauterinen Infektionen, als valider
Marker beurteilt werden kann und somit die Untersuchung des abgehenden
Fruchtwassers, eine diagnostischen Option darstellt. In der vorliegenden Arbeit
konnte jedoch ein fetal inflammatory response syndrom nicht von einem AIS
abgegrenzt werden.
4.2.3 LBP
Der diagnostische Marker LBP zeigte keine signifikante Unterscheidung zwischen
den Gruppen. In unserer Studie konnte LBP damit nicht als möglicher diagnostischer
Parameter für eine intrauterine Infektion identifiziert werden.
4.3 Vergleich von Parametern im maternalen Serum vs.
Infektionsparametern im abgehenden Fruchtwasser
In der vorliegenden Arbeit wurden die CRP- und Leukozytenkonzentrationen im
maternalen Serum in den letzten drei Tagen vor der Geburt statistisch ausgewertet.
Hier traten keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Studiengruppen auf
(siehe Abb.12/13).
Die untersuchten Verläufen von TNF-α, IL-6, LBP und Serum-CRP zeigte, dass IL-6
und TNF-α-Konzentrationen früher anstiegen, als das CRP (siehe Tab. 10).
Aufgrund mangelnder diagnostischer Alternativen richtet sich die Entscheidung zu
aktiven vs. abwartenden therapeutischen Maßnahmen bei Patientinnen mit fVBS
derzeit noch wesentlich an diesen Parametern im mütterlichen Serum (siehe Abb.2).
Diskussion
56
Nach derzeitigem Wissensstand, ist das maternale Serum-CRP als diagnostischen
Marker zur Identifizierung einer intrauterinen Infektion bei Frauen mit fVBS aber nicht
ausreichen sensitiv oder spezifisch (Giles et al. 2005; Leitich 2003).
Inflammatorische Zytokine im mütterlichen Serum wurden aufgrund der Ergebnisse
der Pilotstudie (Breuer 2008) in der vorliegenden Studie nicht gemessen. In der
Pilotstudie wurde ersichtlich, dass die Serum-Zytokine bei weitem nicht die
diagnostischen Erfolge bieten, wie Zytokine des Vaginalsekretes oder des
abgehenden Fruchtwassers. Die unmittelbare Nähe zum Entzündungsgeschehen, ist
also ausschlaggebend. Zahlreiche Studien untersuchten bereits die Zytokine im
mütterlichen Serum bei Frauen mit fVBS (Murtha et al. 2007; Saji et al. 2000; von
Minckwitz et al. 2000, Pfeiffer et al. 1999).
Die Literatur ist bezüglich mütterlicher Serumparameter zur Identifizierung einer
intrauterinen Infektion nicht einheitlich. Pfeiffer et al. (1999) identifizierte mütterliches
IL-6 als aussagekräftigen Parameter, der eine Infektion in utero früher anzeigt, als
mütterliches Serum-CRP. Bei dieser Studie wurden Infektionsparameter im
Fruchtwasser jedoch nicht im Vergleich untersucht.
Shobokshi et al. (2002) fand bei Frauen mit frühem vorzeitigen Blasensprung mit
nachgewiesener Infektion erhöhte inflammatorische Zytokine im Fruchtwasser. Bei
nur der Hälfte der Fälle konnten auch erhöhte Serumzytokine nachgewiesen werden.
Dies kann dadurch erklärt werden, dass proinflammatorische Zytokine normalerweise
die Plazenta nicht passieren (Aalton et al. 2005). Maternale Serumspiegel sind also
bezüglich der kindlichen Gefährdung nicht sehr spezifisch. Ihre Bestimmung zur
Diagnostik einer intrauterinen Infektion scheint deshalb nicht sinnvoll.
Diskussion
57
4.4 Sonder- und Grenzfälle
Patientin mit Diabetes Typ I
Bei einer Patientin mit fVBS und einem Diabetes Typ I wurden trotz fehlender
Infektion hohe TNF-α –Konzentrationen im abgehenden Fruchtwasser gemessen
(siehe 3.6.2). Die Patientin wurde aufgrund der mütterlichen Stoffwechselerkrankung
nicht in die Studie miteinbezogen (siehe 2.2.2). In mehreren Studien wurde die Rolle
von TNF-alpha bei diabetischer Stoffwechsellage untersucht. (Coughlan et al. 2001;
Gonzales-Clemente et al. 2005; Cantor et al. 2005; Lee et al. 2005).
Coughlan et al. (2001) fanden bei Frauen mit mütterlichem Gestationsdiabetes
erhöhte TNF-α–Spiegel im Serum. In Geweben von Patientinnen mit einem
Gestationsdiabetes korrelierten hohe Glucosewerte mit erhöhten TNF-αKonzentrationen. Die Autoren postulierten, dass TNF-α demnach eine regulatorische
Funktion im Glucose- und Lipidstoffwechsel und bei der Insulinresistenz besitzt. In
Anbetracht dass ein Gestationsdiabetes keine seltene Komplikation in der
Schwangerschaft ist, sind diese Forschungsergebnisse von Relevanz für eine
mögliche diagnostische Einschränkung.
Patientin mit fulminanter Escherischia coli-Infektion.
Bei einem Fall der FIRS-Gruppe wurden trotz fulminanter Infektion nur niedrige
TNF-α-Konzentrationen im abgehenden Fruchtwasser gemessen (siehe 3.6.2, Fall
5). Es handelte sich um eine Patientin mit fVBS, bei der eine E. coli-Infektion
nachgewiesen wurde. Die Latenzzeit zwischen letzter Probengewinnung und
Entbindungszeitpunkt war > 24 Stunden. Der Vergleichsfall (siehe 3.6.2, Fall 3),
ebenfalls mit E.coli- Infektion, bei dem innerhalb der letzten 24 Stunden vor Geburt
noch eine Probe gewonnen werden konnte zeigte einen deutlichen Anstieg von TNFα in den letzten 24 Stunden vor Geburt.
Gibbs et al. (2004) untersuchten intrauterine Infektionen bei schwangeren
Kaninchen.
In Rahmen dieser Untersuchungen wurden die Versuchstiere unter anderem mit dem
Keim E.coli intrauterin infiziert, um das Infektionsgeschehen zu dokumentieren. Die
Ergebnisse zeigten, dass bei einer Kontamination mit diesem Keim ein rascher
Anstieg von TNF-α im Fruchtwasser stattfand. Dies zeigt, dass E.coli für ein
fulminantes intrauterines Infektionsgeschehen verantwortlich ist. Ein massiver
Diskussion
58
TNF-α-Anstieg im Fruchtwasser korrelierte dazu.
Dieser Fall zeigt, dass sehr schnell verlaufende intrauterine Infektionen unter
Umständen auch bei täglicher Probennahme nicht erkannt werden können.
Schwierige Zuordnung zwischen Kontrolle- und AIS- Gruppe
Die Einteilung der Fälle in die verschiedenen Gruppen war teilweise schwierig und
nicht immer konnten die Fälle eindeutig voneinander abgegrenzt werden.
Insbesondere die genaue Differenzierung zwischen der Kontrollgruppe und der
Patientinnen mit einer manifesten Chorioamnionitis stellte sich im Einzelfall als
schwierig dar. So zeigte bei Fall 6 (siehe 3.6.2) die Plazentahistologie eine diskrete
Entzündung im Bereich der Nabelschnur, jedoch wurden bei der weiteren
Begutachtung keine sonstigen Zeichen einer Entzündung gefunden. Das kindliche
CRP war unauffällig und der IL-6-Wert im Nabelschnurblut lag mit 110 pg/ml knapp
über dem Cut-off-Wert. Die TNF-α-Konzentrationen, sowie die anderen
Infektionsparameter, waren dementsprechend nur mäßig erhöht und lagen somit
genau zwischen den Werten der Kontrollgruppe und der AIS-Gruppe. Es lässt sich
somit vermuten, dass die Höhe der Zytokinspiegel mit dem Grad und Ausmaß der
Entzündung korrelieren. Dies bestätigen auch Holst et al. (2007).
Solche Grenzfälle sind mitunter oft schwierig zu bewerten und verdeutlichen die
Dynamik im Infektionsgeschehen (Goldenberg et al. 2000). Oft findet ein
kontinuierlicher Übergang zwischen einer Chorioamnionitis bis hin zur fulminanten
Sepsis des Kindes statt.
Patientin mit Oligohydramnion
Bei einer Patientin mit fVBS bereits in der 21. Woche konnte die Schwangerschaft
konnte bis zur 31.Woche prolongiert werden (siehe 3.6.2 Fall 7). Die Latenzzeit
zwischen Blasensprung und Entbindung der Patientin belief sich auf insgesamt über
70 Tage. Die klinischen Parameter der Mutter waren während dieser Zeit unauffällig.
Sonographisch wurde bei der Patientin ein persistierendes Oligohydramnion
diagnostiziert. Das Kind verstarb etwa zwei Wochen nach der Geburt. Die
Plazentahistologie lieferte keine Hinweise auf ein entzündliches Geschehen. Die
Ursache für das Versterben des Kindes waren eine Kreislaufinsuffizienz und
pulmonale Hypoplasie. Laut der Einteilungskriterien (siehe Tab. 3) wurde die
Diskussion
59
Patientin der Kontrollgruppe zugeordnet und auch die Zytokin-Messungen im
abgehenden Fruchtwasser zeigten keine erhöhten Werte. Ein früherer
Entbindungszeitpunkt hätte für das Kind wahrscheinlich keine Vorteile ergeben.
In diesem Zusammenhang ist die Arbeit von Mercer (2003) zu erwähnen. Hier wurde
unter anderem das Outcome von Kindern bei Müttern mit vorzeitigem Blasensprung
in unterschiedlichen Schwangerschaftswochen untersucht. Er betrachtete bei einem
Blasensprung vor der 24. Woche vor die Entwicklung eines andauernden
Oligohydramnions mit konsekutiver Lungenhypoplasie als kritischen Faktor.
Diagnostisch dient zur Identifizierung eines Oligohydramnions ein sonographisches
Screening (Lauria et al. 1995).
4.5 Ausblick: Schnelltest
Diverse Schnelltests werden in der klinischen Praxis bereits standardmäßig
eingesetzt. Sie bieten die Möglichkeit einer schnellen Diagnostik und ihre
Auswertung erfordert wenig Hilfsmittel. Beispiele für gebräuchliche Schnelltest sind
z.B. Schwangerschaftstest (hCG), Troponintestung in der Kardiologie oder
Urinteststreifen.
Für die Identifikation von Entzündungsparametern im abgehenden Fruchtwasser sind
diese Testsysteme bisher nicht angelegt, da die Spiegel weit über der bisherigen Cut
off-Grenze der Teststreifen liegen.
In Zusammenarbeit mit der Firma Milenia wurde auf Grund der Ergebnisse der
Pilotsstudie und der vorliegenden Studie ein Schnelltest für die semiquantitative
Bestimmung von TNF-α und IL-6 im abgehenden Fruchtwasser entwickelt. Aktuell
sind die Tests noch nicht fertig entwickelt und werden derzeit auf Grundlage der
Studienergebnisse auf die Probenmatrix und die abzudeckenden
Konzentrationsbereiche adaptiert.
Vorteile solcher Schnellteste liegen z.B. in der Möglichkeit einer schnellen
Entscheidungsfindung bezüglich der weiteren Therapie. Das Messsystem würde eine
kontinuierliche, nicht-invasise Möglichkeit bieten, das Infektionsgeschehen
fortlaufend und zeitnah zu überwachen und die Dringlichkeit einer notwendigen
therapeutischen Maßnahme in einem angemessenen Zeitrahmen anzuzeigen. Ein
Schnelltestdurchlauf nimmt nur etwa 20 Minuten in Anspruch, erfordert nur einen
bescheidenen Arbeits- und Geräteaufwand und lässt sich nach einer Schulung durch
Diskussion
60
das Pflegepersonal oder den behandelnden Arzt durchführen. Der Tests könnte sich
somit problemlos in den Stationsalltag integrieren lassen.
Eventuelle Problempunkte sollten an dieser Stelle auch diskutiert werden.
Das Probenvolumen spielt eine weitere wichtige Rolle. Zur Durchführung des Test
muss ein Volumen von mindestens 100µl zur Verfügung stehen. Es gibt Fälle bei
denen die Frauen nur tröpfchenweise Fruchtwasser verlieren. Hier könnte der
Schnelltest keine brauchbaren Ergebnisse liefern.
Als weiterer Problempunkt sollte die Richtigkeit und Präzision genannt werden. Oft
bieten diverse Schnelltest nicht die Präzision, wie quantitative Bestimmungen z.B.
mit Immulite. Die Genauigkeit solcher Messsysteme sollte vor Einsatz deshalb
genauestens geprüft werden.
Zusammenfassend sind Schnellteste eine diagnostische Option, die es erlaubt einen
zeitnahen und kontinuierlichen Einblick in ein dynamisches inflammatorisches
Geschehen zu gewinnen und damit zu einer Optimierung der Diagnostik beitragen.
Zusammenfassung
61
5 Zusammenfassung
Der frühe vorzeitige Blasensprung (fVBS) ist eine Hauptursache perinataler
Morbidität und Mortalität. Die davon betroffenen schwangeren Frauen stellen eine
Hochrisikogruppe dar, weil aszendierende Infektionen hier zu einer vitalen
Gefährdung des ungeborenen Kindes führen können. Die Schwierigkeit bei
Patientinnen mit fVBS ist die frühzeitige Erkennung einer Infektion. Die aktuellen
Testverfahren im maternalen Serum (CRP, Leukozytenzahl) sind für eine frühzeitige
Erkennung einer fetalen Infektion nicht optimal. In der vorliegenden Studie wurde die
diagnostische Wertigkeit von Infektionsmarkern in abgehendem Fruchtwasser
evaluiert. Es wurden 27 Patientinnen mit einem fVBS vor der vollendeten 34. SSW
untersucht. Die Patientinnen wurden in drei Gruppen eingeteilt (Kontroll-, AIS- und
fetale Infektionsgruppe). Abgehendes Fruchtwasser wurde durch Auspressen von
Binden in den letzten drei Tagen vor der Geburt gewonnen. Diese Art der
Fruchtwassersammlung ist schonend und nicht-invasiv. Die Proben können jedoch
durch Sekrete aus dem Uro-Genitaltrakt kontaminiert sein, oder das abgehende
Fruchtwasser kann quantitativ nicht ausreichend sein. Es wurden die
Infektionsmarker TNF-α, IL-6 und LPB gemessen. Dabei waren TNF-α- und IL-6Konzentrationen in der AIS- und FIRS- Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe
signifikant erhöht. Zwischen den beiden Studiengruppen AIS und FIRS wurde bei
diesen Parametern kein signifikanter Unterschied gefunden. Bei TNF-α lag die
Sensitivität bei einem Cut-off von 200 pg/ml bei 77%, die Spezifität bei 100%. TNF-αWerte > 2000 pg/ml wurden ausschließlich in der FIRS- Gruppe gemessen. Die
Messungen von IL-6 zeigten bei einem Cut-off-Wert von 1000 pg/ml eine Sensitivität
von 94,1% und eine Spezifität von 100%. Bei LBP wurden, ebenso bei der CRP- und
Leukozytenmessungen im mütterlichen Serum keine signifikanten Unterschiede
beobachtet. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Fruchtwasser aus Binden als
Probenmatrix geeignet ist und die Infektionsparameter TNF-α und IL-6 in dieser
Probenart eine höhere prognostische Aussagekraft bezüglich einer drohenden
intrauterinen Infektion besitzen als die CRP- und Leukozytenmessung im
mütterlichen Serum. Ob diese Parameter für die klinische Routinediagnostik geeignet
sind, muss allerdings an einer größeren Fallzahl überprüft werden. Für die POCTDiagnostik sind Schnellteste für TNF-α und IL-6 in Entwicklung.
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Literaturverzeichnis
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Dissertation Universitätsfrauenklinik Freiburg, unveröffentlicht
Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen
7 Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1: Phasen der intrauterinen Infektion
Tab. 2: Definition von Sepsis und klinischer Sepsis
Tab. 3: Zuordnung zu Fall- und Kontrollgruppen
Tab. 4: Erwartungsbereiche der verschiedenen Messparameter
Tab. 5: Vorverdünnung der Proben
Tab. 6: Mittelwerte und Mediane für TNF-α
Tab. 7: Mittelwerte und Mediane für IL-6
Tab. 8: Mittelwerte und Mediane für LBP
Tab. 9: Mütterliche und kindliche klinische Daten
Tab. 10: Zytokinkonzentrationen im zeitlichen Verlauf
Tab. 11: TNF-α am Tag der Entbindung bei Patientin 3
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1:
Histologische Darstellung von Amnion und Chorion
Abb. 2:
Management des frühen vorzeitigen Blasensprungs
Abb. 3:
Bakterielle Infektion am Uterus
Abb. 4:
LPS-abhängige Induktion proinflammatorischer Abwehrmechanismen
Abb. 5:
Darstellung einer Spiegeleinstellung
Abb. 6:
Manuelles Auspressen der Binden
Abb. 7:
Pico Scan-Messsystem
Abb. 8:
Anteil der Studienteilnehmerinnen
Abb. 9:
Graphische Darstellung der TNF-α-Werte
Abb. 10: Graphische Darstellung der IL-6- Werte
Abb. 11: Graphische Darstellung der LBP- Werte
Abb. 12: Graphische Darstellung der mütterlichen CRP-Werte
Abb. 13: Graphische Darstellung der mütterlichen Leukozyten-Werte
Abb. 14: TNF-α- Messung mittels Schnelltest
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Dankansagung
76
8 Dankansagung
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2005 bis Mai 2007 im
Endokrinologischen Labor der Universitätsfrauenklinik der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg.
Meinen herzlichen Dank möchte ich allen aussprechen, die zum Entstehen und
Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben!
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Wolfgang Schäfer dafür, dass er mit mir das
Thema dieser Arbeit überlassen hat und für seine vielseitige Unterstützung und
ermutigende Hilfestellung während der Phase des Zusammenschreibens.
Ein herzliches Dankeschön an Herrn Prof. Dr. W. Kreisel für die Übernahme des
Zweitgutachtens.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei OÄ Frau Dr. Mirjam Kunze, die
immer ein offenes Ohr für meine Fragen und Sorgen hatte, für den exzellenten
fachlichen, wissenschaftlichen Rat, die aktive Mitarbeit bei der Probengewinnung, die
Ermutigungen und seelisch- moralische Unterstützung, vor allem während der Phase
des Zusammenschreibens.
Außerdem möchte ich mich auch bedanken bei bei...
... Dr. Lena Otto für die Mitarbeit bei der Probensammlung
... Frau Sibylle Ritter für die Zusammenarbeit bei den Immulite-Messungen
... den Schwestern auf Station Pankow, für Informationen über neue Patientinnen.
Mein Dank gilt ganz besonders allen Patientinnen, die ihr Einverständnis zur
Teilnahme an dieser Studie bereitwillig gegeben haben.
Den Mitarbeitern des Endokrinologischen und Klinisch-Chemischen Labors der
Universitätsfrauenklinik danke ich für die freundliche Aufnahme im Labor.
Meiner Familie und meinen Freunden und vor allem meinem Freund Holger danke
ich für die seelische und moralische Unterstützung während der gesamten Arbeit.
Lebenslauf
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9 Lebenslauf
•
PERSÖNLICHE DATEN
Name:
Nomita Schwöppe
Geburtstag:
07.06.1983
Geburtsort:
Freiburg i.Br.
Nationalität:
deutsch
Familienstand: ledig
•
•
SCHULBILDUNG
09/1989 - 07/1993
Emil-Thoma- Grundschule Freiburg
09/1993 - 07/2002
Berthold-Gymnasium Freiburg
07/2002
Allgemeine Hochschulreife
STUDIUM
10/2002
Beginn Studium der Humanmedizin, Albert-Ludwigs-Universität,
Freiburg i.Br.
08/04
Physikum
07/ 2005
Beginn der Promotion, Universitätsfrauenklinik
08/2007
Beginn des Praktischen Jahrs, Paris, Freiburg