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Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institut für Mikrobiologie und Weinforschung FI-Übung: Identifizierung, Wachstum und Regulation (WS 2004/05) Sebastian Lux Datum: 19.1.2005 Chromatographie von Penicillin-G-Natriumsalz 1. Theoretische Grundlagen Antibiotika sind Stoffe, die von bestimmten Mikroorganismen gebildet werden, um das Wachstum anderer Mikroorganismen zu inhibieren. Hierbei unterscheidet man zwischen bakteriostatischer (Zellen können sich nicht mehr vermehren) und bakterizider Wirkung (alle lebenden Zellen werden getötet). Oftmals sind Antibiotika in ihrer Wirkung sehr speziell und inhibieren nur wenige Mikroorganismen, allerdings gibt es auch Breitbandantibiotika mit einem großen Wirkungsspektrum. Zu diesen gehören die Tetracycline, welche aus Streptomyces-Arten gewonnen werden. Sie hemmen das Wachstum von fast allen Bakterien, ob grampositiv oder gramnegativ. Das Gründgerüst besteht aus einem Naphtaceensystem, an den vier Resten können verschieden Substituenten gebunden sein, teilweise werden diese chemisch hinzugefügt. Neben Tetracyclin gibt es beispielsweise noch Oxytetracyclin, Doxycyclin oder Minocyclin. Abbildung 1: Tetracycline Tetracycline sind Inhibitoren der Proteinsynthese. Sie binden an die 30SUnterheit der Ribosomen und stören so deren Wirkungsweise. Mittlerweile haben zahlreiche Bakterien eine Resistenz gegen Tetracycline entwickelt, meist durch aktiven Transport der Tetracycline aus der Zelle oder durch Veränderung der Bindungsstellen an welche die Tetracycline angreifen. Makrolide werden wie die Tetracycline aus Steptomyces-Arten gewonnen, obgleich es mittlerweile auch Makrolide gibt, die komplett synthetisch hergestellt werden. Ihren Wirkort haben die Makrolide ebenfalls an den Ribosomen, allerdings an der 50S-Unterheit. Sie wirken bakteriostatisch auf eine Vielzahl von grampositiven Bakterien, zudem auf Arten der gramnegativen Vertreter Neisseria und Legionella. Abbildung 2: Erythromycin Grundgerüst der Makrolidantibiotika sind Lactonringe, welche an Zuckerreste gebunden sind. Hauptvertreter ist das Erythromycin, weitere Vertreter sind Clarithromycin und Azithromycin. Aminoglykoside bestehen aus Aminozuckern, die glykosidisch miteinander verknüpft sind. Sie greifen in die Proteinsysthese ein (30S-Untereinheiten) und bewirken dadurch die Bildung von falschen Proteinen, was zum Auflösen der Bakterienmembran und deren Absterben führt. Aminoglykoside wirken vor allem gegen gram- Abbildung 3: Streptomycin negativen Bakterien, allerdings schlecht gegen gramnegative Kokken und Anaerobier. Zudem werden intrazelluläre Erreger nicht erreicht, da Aminoglykoside im menschlichen Körper aufgelöst werden. Nichtsdestotrotz war Streptomycin das erste Antibiotikum, das gegen Tuberkulose wirkte. Aufgrund massiver Nebenwirkungen (Niere, Gehör) und einer hohen Resistenzquote werden die meisten Aminoglykoside wie Streptomycin heutzutage nur noch eingesetzt, wenn andere Antibiotika nicht ansprechen. Eine der wichtigsten Antibiotikagruppen sind die namensgebenden viergliedrigen Lactame, welche alle den Lactamring gemeinsam haben. Hauptvertreter sind die Penicilline, welche von dem Pilz Penicillum hergestellt werden, und die Cephalosporine, produziert von Cephalosporium. Lactame inhibieren die Zellwandsynthese indem sie an die D-Alanin- Transpeptidasen binden und diese somit inaktivieren. Diese Transpeptidasen (oder Penicillinbindungsproteine) verknüpfen normalerweise die Peptidoglykanketten des Mureins. Somit wirken die Zellen, jedoch ursprünglichste Lactame nur auf wachsende immer bakterizid. Das Lactam, Penicillin, wirkt Abbildung 4: Penicillin überwiegend gegen grampositive Bakterien, da die Lipopolysaccharidschicht der gramnegativen Bakterien eine Mittlerweile große wurden Barriere aber darstellt. zahlreiche halbsynthetische Penicilline hergestellt, die zum Teil auch gegen gramnegative Bakterien wirken. Eine Schwachstelle der Lactame ist der Lactamring, welcher vom Enzym Lactamase, das von resistenten Bakterien gebildet wird, gespalten wird. Dadurch werden Penicilline und Cephalosporine inaktiviert. Allerdings gibt es auch halbsynthetische, Lactamaseresistente Penicilline wie Ampicillin und Methicillin oder Cephalosporine wie Ceftriaxon. Andere resistente Bakterien entwickelten unempfindliche Penicillinbindungsproteine oder Membranen, die von Penicillinen und Cephalosporinen nicht passiert werden können. 2. Material und Methode Im folgenden Versuch soll die Wirkung von Penicillin anhand dreier Teilversuche veranschaulicht werden. Mittels einer Chromatographie soll die Löslichkeit von Penicillin in Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität untersucht werden. Die Chromatogramme werden auf Doppelschichtplatten aufgelegt, die mit Staphylococcus carnosus beimpft sind. Je weiter der Hemmhof „wandert“, desto löslicher ist Penicillin im jeweiligen Lösungsmittel. Mit Hilfe des Lochtests wird die Wirkung von Penicillin auf verschieden Bakterien untersucht. Hierbei wird in die Mitte einer Nährplatte ein Loch gestanzt, in das ein Tropfen Penicillinlösung (1700 E/ml) pipettiert wird. Die vier Testorganismen Escherichia coli, Staphylococcus carnosus, Micrococcus luteus und (abweichend vom Skript) Pseudomonas stutzeri werden radial strichförmig aufgetragen. Je näher die Organismen zum Mittelpunkt wachsen, desto geringer ist die Wirkung des Penicillins. Beim Gradientenplattentest wird auf Platten mit Schrägagar antibiotikahaltiger Agar in verschiedenen Konzentrationen geschichtet. So erhält man Platten, die auf der einen Seite fast nur Nähragar, auf der anderen antibiotikahaltigen Agar aufweisen. Auf den Platten werden 0,1 ml einer Staphylococcus carnosus-Lösung ausplattiert. Anhand des zu beobachtenden Wachstums lassen sich Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Antibiotikums bzw. die Häufigkeit resistenter Bakterien ziehen. 3. Ergebnisse & Diskussion Abbildung 5: Chromatographie Rf-Werte: Wasser: 7,5/8,4 = 0,89 Ethylacetat: 5,2/8,0 = 0,65 Methanol: 6,3/8,0 = 0,79 Trichlormethan: 0,2/8,0 = 0,03 Anhand der Chromatographieergebnisse stellt sich Penicillin als eindeutig polare Substanz heraus. In Wasser und Methanol ist die Löslichkeit recht hoch (Rf-Werte von 0,89 bzw. 0,79), in Ethylacetat mittel (Rf-Wert 0,65), während sich Penicillin in Trichlormethan so gut wie gar nicht löst (Rf-Wert 0,03). Abbildung 6: Lochtest Beim Lochtest zeigt sich deutlich, wie Penicillin G das Wachstum der grampositiven Bakterien Micrococcus und Staphylococcus unterbindet. Auf die gramnegativen Vertreter Pseudomonas und E. coli hat es zumindest noch eine geringe Wirkung, auch wenn diese lange nicht an die Wirkung auf grampositive Bakterien herankommt. Auf der Kontrollplatte wuchsen alle Bakterien gleichermaßen ungestört. Abbildung 7: Gradientenplatte 10-2 mg/ml Penicillin Auf der Platte mit einer Penicillinkonzentration von 10-2 mg/ml sowie der Kontrollplatte läßt sich Wachstum feststellen, auf den Platten mit den Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 0,1 mg/ml nicht. Auffallend ist, dass selbst auf der Kontrollplatte, auf der man gleichmäßiges Wachstum feststellen sollte, ein Bakterienrasen entsteht wie in Abbildung 7 zu sehen. Ob das auf Zufall oder unsauberes Ausplattieren zurückzuführen ist, lässt sich nicht mit Gewissheit sagen. Literatur: MADIGAN, MICHAEL T. et. al (2001): Brock. Mikrobiologie, Heidelberg. SCHLEGEL, HANS G. (1992): Allgemeine Mikrobiologie. Stuttgart.
