Selektive biokatalytische Hydroxylierung von Prolin und
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Selektive biokatalytische Hydroxylierung von Prolin und Prolinanaloga mittels Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Prolinhydroxylasen INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Christian Peter Klein aus Saarlouis 2011 Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Rolf Schubert Referent: Prof. Dr. Michael Müller Korreferent: Prof. Dr. Andreas Bechthold Datum der Promotion: 10.10.2011 „Gut geschüttelt ist halb gewonnen.“ James Bond Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juli 2008 bis April 2011 am Lehrstuhl für Pharmazeutische und Medizinische Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg unter der Leitung von Herrn Dr. Wolfgang Hüttel und Herrn Prof. Dr. Michael Müller angefertigt. Mein besonderer Dank gilt: Herrn Dr. Wolfgang Hüttel für die interessante Themenstellung. Vor allem möchte ich mich für die sehr gute Einführung in die Arbeitsmethodik, die stete Bereitschaft zu helfen, das Korrekturlesen dieser Arbeit und die tolle Atmosphäre im Büro bedanken. Herrn Prof. Dr. Michael Müller für die Übernahme des Referates sowie für die freundschaftliche Betreuung, viele hilfreiche Anregungen und die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Herrn Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Übernahme des Koreferats. Herrn Prof. Dr. Manfred Jung für die Mitwirkung bei der Promotionsprüfung. Frau Olga Fuchs und Alexandra Walter für ihre äußerst engagierte Mitarbeit im Laboralltag und bei den durchgeführten Synthesen. Herrn Volker Brecht für die hervorragende NMR-Analytik, insbesondere von schwierigen Proben, und die Unterstützung bei MS-MS Messungen. Herrn Dr. Philippe Bisel für die fachlichen Diskussionen. Den studentischen Hiwis Franziska Unger, Petko Apostolov, Julian Haas und Jose Luis Romero für ihre Hilfe im Laboralltag. Dem gesamten Arbeitskreis für die gute fachliche Zusammenarbeit und die schöne Zeit während der letzten drei Jahre. Der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) für die finanzielle Förderung im Rahmen des ChemBioTec Projektes „Nachhaltige Biokatalytische Oxidationsprozesse“ (AZ: 13234). Meinen Eltern und Großeltern für Ihre Unterstützung. Judith. Wissenschaftliche Publikationen: C. Klein, W. Hüttel: A Simple Procedure for Selective Hydroxylation of L-Pipecolic L-Proline and Acid with Recombinantly Expressed Proline Hydroxylases, Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 1375 – 1383. C. Klein, W. Hüttel: Tertiary Alcohol Preferred – Hydroxylation of trans-3-Methyl-L-proline with Prolinehydroxylases, Manuskript zur Einreichung im Beilstein J. Org. Chem. (angenommen 11/2011). M. Müller, C. Klein: Bookreview: Practical Biotransformations. A Beginner's Guide. Postgraduate Chemistry Series, von Gideon Grogan. Angewandte Chemie. 2009, 121, 83218322; Angewandte Chemie Int. Ed. 2009, 48, 8175-8176. Poster: C. Klein, W. Hüttel, M. Müller: Converting free L-proline by heterologously overexpressed microbial prolinehydroxylases into hydroxylated derivatives, Tag der Wissenschaft der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften, 2009, Freiburg. Gewinner des Posterpreises für Pharmazeutische Chemie. C. Klein, M. Müller, Wolfgang Hüttel: In vivo conversion of trans-3-hydroxy-L-proline by heterologously overexpressed microbial trans-4-prolinehydroxylase, Tag der Wissenschaft der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften, 2011, Freiburg. Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung ............................................................................... 1 2. Einleitung ............................................................................................. 3 2.1. Enzyme .................................................................................................. 3 2.1.1. Enzyme in der Biotechnologie ................................................................................ 4 2.1.2. C-H aktivierende Enzyme ....................................................................................... 4 2.2. Oxidoreduktasen ................................................................................... 5 2.2.1. Oxygenasen ............................................................................................................. 5 2.2.2. Cytochrom P450 Enzyme ........................................................................................ 6 2.2.3. Mononukleäre Nicht-Häm-Eisenenzyme ................................................................ 7 2.2.4. Eisen(III) Dioxygenasen .......................................................................................... 8 2.3. Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Oxygenasen ................................. 9 2.3.1. Struktur und Bindungsmodus ................................................................................ 11 2.3.2. Hydroxylierungsmechanismus .............................................................................. 14 2.4. Prolylhydroxylasen ............................................................................. 16 2.5. Prolinhydroxylasen ............................................................................. 17 2.5.1. Technische Produktion der Hydroxyproline ......................................................... 19 2.6. Aufgabenstellung ................................................................................ 22 3. Spezieller Teil .................................................................................... 24 3.1. Molekularbiologische Arbeiten........................................................... 24 3.1.1. Produktion der Prolinhydroxylasen ....................................................................... 24 3.2. Analytische Arbeiten........................................................................... 29 3.2.1. Entwicklung eines HPLC- und kolorimetrischen Assays ..................................... 29 3.2.2. Aktivitäten der Prolinhydroxylasen ....................................................................... 31 3.3. in vivo Herstellung von Hydroxy-L-prolinen ...................................... 36 3.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen .......................................... 41 3.4.1. Nicht-physiologische Cosubstrate ......................................................................... 41 3.4.2. Prolinanaloga ......................................................................................................... 43 3.4.2.1. L-Pipecolinsäure .................................................................................................... 43 3.4.2.2. L-Azetidin-2-carbonsäure ...................................................................................... 47 3.4.2.3. 3,4-Dehydro-L-prolin............................................................................................. 48 3.4.3. Entwicklung eines in vivo Systems für die Produktion von hydroxylierten Prolinanaloga ......................................................................................................... 50 3.4.3.1. Hydroxy-L-proline ................................................................................................. 53 3.4.3.2. trans-3-Methyl-L-prolin ........................................................................................ 56 3.4.3.3. alpha-Methyl-L-prolin ........................................................................................... 60 3.4.4. Weitere untersuchte Substrate ............................................................................... 63 3.5. Gerichtete Mutagenese ........................................................................ 66 3.5.1. Mutagenese in der Nähe der katalytischen Triade ................................................ 68 3.5.2. Mutagenese zur Änderung der Aktivitäten der Isoenzyme cisP3H_I und cisP3H_II ............................................................................................................... 73 4. Diskussion und Ausblick .................................................................. 80 5. Experimenteller Teil ......................................................................... 84 5.1. Materialien und Methoden .................................................................. 84 5.1.1. Chemikalien und Reagenzien ................................................................................ 84 5.1.2. Analytik ................................................................................................................. 84 5.1.3. Kulturmedien, Wachstumsbedingungen und Stammhaltung ................................ 87 5.1.4. Molekularbiologische und Proteinbiochemische Methoden ................................. 89 5.1.5. Bakterienstämme, Vektoren, Plasmide und Oligonukleotide................................ 95 5.2. Produktion, Aktivität und Substratspektrum der Prolinhydroxylasen ............................................................................. 99 5.2.1. Proteinproduktion und Isolierung .......................................................................... 99 5.2.2. Prolinhydroxylase Aktivität ................................................................................ 100 5.2.3. Cosubstratspektrum der Prolinhydroxylasen ....................................................... 101 5.2.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen ........................................................... 102 5.3. Produkte der enzymatischen Synthese .............................................. 104 5.3.1. trans-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxyprolin)........................................ 104 5.3.2. cis-3-Hydroxy-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxyprolin) ........................................... 105 5.3.3. cis-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4S)-4-Hydroxyprolin) ............................................ 106 5.3.4. trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,5R)-5-Hydroxypipecolinsäure) ............ 107 5.3.5. cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,5S)-5-Hydroxypipecolinsäure) ................ 107 5.3.6. cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,3R)-3-Hydroxypipecolinsäure) ................ 108 5.3.7. cis-3-Hydroxy-L-azetidin-2-carbonsäure ((2S,3R)-3-Hydroxyazetidin-2carbonsäure) ........................................................................................................ 109 5.3.8. trans-3,4-Epoxy-L-prolin ((1R,2S,5S)-3,4-Epoxyprolin) .................................... 109 5.3.9. cis-3,4-Epoxy-L-prolin ((1S,2S,5R)-3,4-Epoxyprolin) ........................................ 110 5.3.10. trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin ((2S,3R,4S)-3,4-Dihydroxyprolin) .......... 110 5.3.11. trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3-methyl-L-prolin ((2S,3R,4R)-4-Hydroxy-3methylprolin) ....................................................................................................... 111 5.3.12. cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-3-methylprolin) .. 112 5.3.13. trans-4-Hydroxy-α-methyl-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxy-2-methylprolin) ........ 113 5.3.14. cis-3-Hydroxy-α-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-2-methylprolin) ............ 114 5.4. Chemische Synthesen ....................................................................... 115 5.4.1. L-Pipecolinsäure 5.4.2. cis-4-Chlor-L-prolin und cis-4-Azid-L-prolin ...................................................... 117 5.4.2.1. N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester ............................... 117 5.4.2.2. cis-4-Chlor-L-prolin ((2S,4S)-4-Chloroprolin) .................................................... 119 5.4.2.3. cis-4-Azid-L-prolin ((2S,4S)-4-Azidoprolin) ....................................................... 121 5.4.3. Versuche zur Synthese von trans-3-Chlor-L-prolin und trans-3-Azid-Lprolin ................................................................................................................... 124 6. Abkürzungsverzeichnis .................................................................. 130 7. Abbildungsverzeichnis .................................................................... 134 8. Tabellenverzeichnis ......................................................................... 139 9. Anhang ............................................................................................. 140 9.1. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der transP4H aus Dactylosporangium sp. RH1 ............................................................. 140 9.2. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP4H aus Sinorhizobium meliloti ...................................................................... 141 9.3. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP3H_I aus Streptomyces sp. TH1 ....................................................................... 142 9.4. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP3H_II aus Streptomyces sp. TH1 ....................................................................... 143 9.5. Alignments ........................................................................................ 144 9.5.1. Alignment transP4H und cisP4H ........................................................................ 144 9.5.2. Alignment transP4H und cisP3H_I ..................................................................... 144 9.5.3. Alignment transP4H und cisP3H_II ................................................................... 145 9.5.4. Alignment cisP3H_I und cisP3H_II .................................................................... 146 9.5.5. Alignment cisP3H_I und cisP4H ........................................................................ 146 9.5.6. Alignment cisP3H_II und cisP4H ....................................................................... 147 9.5.7. Alignment transP4H und Ectoinhydroxylase EctD aus Virgibacillus salexigens ............................................................................................................ 147 ((S)-Pipecolinsäure) ................................................................. 115 9.5.8. Alignment transP4H und Halogenase SyrB2 aus Pseudomonas syringae pv. syringae ......................................................................................................... 148 10. Literaturverzeichnis........................................................................ 150 ZUSAMMENFASSUNG 1. Zusammenfassung Die enzymkatalysierte selektive Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoff-Wasserstoff Bindungen ist von großer Bedeutung für die Generierung von enantiomerenreinen Substanzen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem durch Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Prolinhydroxylasen drei Hydroxyproline und zahlreiche hydroxylierte Prolinanaloga regio- und stereoselektiv aufgebaut werden (Abb. 1). HO OH N H HO OH O OH N H OH N H _I H ci O H _I I OH N H P4 OH H N H OH tra t ra HO P ns N H 4H N H O O OH HN O P3 cis I H_ I CH3 OH N H O OH OH OH cisP3H_I cisP3H_II N H O CH3 H N H O O transP4H tr a ns O _I I HO CH3 OH OH N H O N H H CH3 OH N H P4 3H HO OH ci s CH3 OH sP HO O HO ci O N H OH P4 N H CH3 OH cisP3H_II tra ns P4 H O OH OH HN O OH OH N H O 4H cisP4H OH OH cisP3H_II O P ns O cisP3H_I OH N H 3 sP s cis N H ci 3H P4 OH O O H P4 ci sP cis HO transP4H O N H O O Abb. 1: Prolinhydroxylase katalysierte Oxidationen. trans-4-Prolinhydroxylase (transP4H), cis-4-Prolinhydroxylase (cisP4H), cis-3- Prolinhydroxylase Typ I (cis3PH_I) und cis-3-Prolinhydroxylase Typ II (cisP3H_II) wurden in Anwesenheit von Chaperonen durch das gleiche Expressionssystem heterolog in E. coli produziert. Es wurde ein Aktivitätstest etabliert, mit dem die Selektivitäten der Prolinhydroxylasen durch HPLC-Analytik einfach und schnell nebeneinander zu identifizieren sind. Bei der Charakterisierung der isolierten Enzyme zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Eisen(II)/Ascorbinsäure Konzentration. Durch 1 ZUSAMMENFASSUNG gerichtete Mutagenese der Prolinhydroxylasen wurde neben Varianten mit deutlich verminderter Aktivität auch eine Variante mit erhöhter Aktivität erhalten. Es wurde nachgewiesen, dass neben α-Ketoglutarat auch andere α-Ketosäuren als Cofaktoren von den Prolinhydroxylasen genutzt werden, allerdings mit deutlich verminderten Aktivitäten. Aufgrund der geringen Stabilität der isolierten Enzyme wurde ein in vivo Verfahren entwickelt, mit dem Hydroxyproline in einfachen Schüttelkulturen effizient im präparativen Maßstab erhalten werden. Insbesondere die Isolierung der Hydroxyproline wurde hierbei gegenüber dem publizierten Verfahren stark vereinfacht. Für die Untersuchung von Prolinanaloga wurde ein in vitro Assay etabliert, der neue Produkte durch HPLC und Massenspektrometrie identifiziert. Diese werden ebenfalls durch Ganzzellbiotransformation in einem Hochzelldichtemedium präparativ produziert und isoliert (Abb. 2). Produktion der Enzyme in vitro Substrattestung Charakterisierung neuer Produkte in vivo Katalyse im präparativen Maßstab Abb. 2: Fließschema für die Charakterisierung und Produktion hydroxylierter Produkte mit Prolinhydroxylasen. Prolinhydroxylasen sind ein einfacher und umweltschonender Weg, synthetisch wertvolle Verbindungen zu generieren, deren chemische Synthese nicht oder nur mit sehr großem Aufwand möglich ist. Durch die hohe Regio- und Stereoselektivität der enzymatischen Reaktion entfällt eine Trennung von Stereoisomeren. Aufgrund der hohen Flexibilität des Systems sind neue Isoenzyme und Substrate leicht zu integrieren und zu charakterisieren („one system fits all“). 2 EINLEITUNG 2. Einleitung 2.1. Enzyme Enzyme sind Biokatalysatoren. Nahezu alle chemischen Prozesse in Zellen werden durch sie katalysiert. Sie erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit einer biochemischen Reaktion um den Faktor 107 - 109, teilweise auch noch darüber.[1-3] Für die Beschleunigung sind verschiedene, synergistisch wirkende Faktoren verantwortlich, deren Beitrag von den Eigenschaften der zu katalysierenden Reaktion, beispielsweise den Substraten, Produkten und Intermediaten, abhängig ist. Bei der Bildung des Produktes [P] wird durch Bindung des Substrates [S] an das Enzym [E] der Grundzustand (ES beziehungsweise EP) destabilisiert, der Übergangszustand [ES#] stabilisiert und die Aktivierungsenergie gegenüber der Reaktion ohne Interaktion zwischen Enzym und Substrat herab gesetzt (Abb. 3).[2] Hierdurch wird die Produktbildung stark beschleunigt beziehungsweise überhaupt erst ermöglicht. E + S# Freie Energie * *Aktivierungsenergie ohne Enzym *Aktivierungsenergie mit Enzym ES# * E+S E+P ES EP Abb. 3: Änderung der freien Energie im Reaktionsverlauf.[2] Enzyme werden entsprechend ihrer Funktionalität in sechs Hauptklassen eingeteilt: 1. Oxidoreduktasen, 2. Transferasen, 3. Hydrolasen, 4. Lyasen, 5. Isomerasen, 6. Ligasen.[4] Für ihre katalytische Aktivität benötigen viele Enzyme Cofaktoren wie Metallionen für Redoxreaktionen, aber auch komplexere Strukturen wie Vitamine, zum Beispiel Thiamindiphosphat (Phosphatester des Thiamins (Vitamin B1)) für C-C Knüpfungsreaktionen.[5,6] Enzyme sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, die die Polypeptidkette bilden und die dreidimensionale Struktur der Enzyme bestimmen. Als Proteine gehören Enzyme zu den Biomakromolekülen, die im aktiven Zentrum eine chirale Umgebung 3 EINLEITUNG erzeugen, was einerseits in einer bevorzugten Umsetzung eines Enatiomers eines Racemates resultiert. Diese Stereoselektivität der Enzyme wird zum einen für eine kinetische Racematspaltung sowie zur Desymmetrisierung oder chiralen Funktionalisierung von mesooder prochiralen Verbindungen genutzt.[7] Andererseits werden Enzyme durch die Bevorzugung eines diastereomeren Übergangszustands für die stereoselektive Katalyse eingesetzt um Substrate an nur einer von mehreren chemisch äquivalenten Stellen gezielt zu funktionalisieren.[8] 2.1.1. Enzyme in der Biotechnologie Ein Beispiel für einen auf enzymatischen Prinzipien beruhenden Prozess, der seit Jahrhunderten angewendet wird, ist das Bierbrauen. Hierbei sorgt zunächst das Enzym Amylase, das beim Keimen der Getreidekörner entsteht, für die Umwandlung von Stärke aus dem Malz in Malzzucker, der anschließend von Hefekulturen zu Alkohol vergoren wird.[9] Enzyme kommen heute bei einer Vielzahl von Prozessen zur Anwendung. So werden beispielsweise Cellulasen bei der Papierherstellung und in Waschmitteln eingesetzt sowie Glucose-Isomerasen [10,11] Fruktosegehalts. bei der Herstellung von Zuckersirup durch Erhöhung des Für die Produktion von Enzymen werden häufig Bakterien, Hefen und Pilze eingesetzt.[8] Aufgrund ihrer Gewinnung aus erneuerbaren Quellen und ihrer biologischen Abbaubarkeit auf der einen Seite sowie ihrer Eigenschaft, Reaktionen in Wasser bei moderaten Temperaturen, Drücken und pH-Werten zu katalysieren, stellt der Einsatz von Enzymen ein umweltfreundliches und nachhaltiges Verfahren dar.[12] Durch ihre Selektivität ist es möglich, Verbindungen in einem Schritt gezielt zu funktionalisieren und so aufwendige chemische Synthesen einzusparen. 2.1.2. C-H aktivierende Enzyme Die gezielte Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoff-Wasserstoff Bindungen stellt für die nicht-enzymatische Katalyse eine große Herausforderung dar.[13,14] Daher ist das Gebiet der Biotransformation mit Oxidoreduktasen von großem Interesse für die Forschung; nicht nur von der biotechnologischen Anwendung her sondern auch zur Erforschung, wie enzymatische Mechanismen möglicherweise auch auf nicht-enzymatische Katalysatoren übertragen werden können.[8,15] 4 EINLEITUNG 2.2. Oxidoreduktasen Oxidoreduktasen (EC-Nummer: 1.) stellen eine weitumfassende Gruppe von Enzymen dar, die Redoxreaktionen katalysieren.[15] Dazu gehören unter anderem Enzyme, die für Hydroxylierungsreaktionen, die Reduktion von Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungen und Oxidationen von Aminen verantwortlich sind.[8] Jedoch benötigen Oxidoreduktasen oftmals komplexe Cofaktoren wie Nicotinamide (NAD+ / NADH, NADP+ / NADPH), Flavine (FAD / FADH2) oder Häm, die entweder zu der enzymatischen Reaktion in stöchiometrischem Verhältnis zugegeben oder aufwendig in situ mit einem zusätzlichen Redoxsystem regeneriert werden müssen.[8] 2.2.1. Oxygenasen Oxygenasen gehören zu der Familie der Oxidoreduktasen.[15] Oxygenasen können in zwei Klassen unterteilt werden; in Dioxygenasen (EC-Nummer: 1.13.) und in Monooxygenasen (EC-Nummer: 1.14.). Bei den Dioxygenasen werden beide Atome des Sauerstoffs auf das Substrat übertragen. Bei den Monooxygenasen hingegen wird nur ein Sauerstoffatom auf das Substrat übertragen und das Zweite in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beispielsweise NAD(P)H zu Wasser reduziert.[15] Oxygenasen haben sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Sie oxidieren Alkane zu Alkoholen, Olefine zu Epoxiden, Sulfide zu Sulfoxiden, spalten aromatische Ringe, oxidieren deren Substituenten und demethylieren O- oder NMethylgruppen.[15,16] Aufgrund ihrer oftmals hohen Stereo- und Regioselektivität sind sie insbesondere für die industrielle Anwendung bei der Herstellung von Wirkstoffen für Arzneimittel geeignet, bei denen die Enantiomerenreinheit eine entscheidende Bedeutung einnimmt, um unerwünschte Wirkungen zu vermeiden.[17] Ein Beispiel für einen solchen enzymatischen Prozess ist die gezielte 11-α-Hydroxylierung von Progesteron durch den Pilz Rhizopus arrhizus, die bereits 1952 entdeckt wurde (Abb. 4).[18] 5 EINLEITUNG O O HO Rhizopus arrhizus H H H O H O Progesteron Hydroxyprogesteron Abb. 4: Regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Progesteron durch Rhizopus arrhizus.[8] Durch diesen Schritt konnte die Synthese von Cortison von vormals 37 Schritten auf 11 reduziert und die Kosten von $200 auf $6; später sogar auf 46 Cent pro Gramm (1980), gesenkt werden.[15,19] 2.2.2. Cytochrom P450 Enzyme Cytochrom P450 Enzyme sind unspezifische Monooxygenasen, welche die Oxidation von zahlreichen Verbindungen katalysieren.[20] Das Substratspektrum umfasst sowohl Verbindungen mit sehr kleinen Molekülmassen wie Ethylen als auch solche mit einer Molekülmasse >1000 Da wie beispielsweise Cyclosporin A.[21,22] Als Prosthetische Gruppe besitzen diese Enzyme eine Häm-Verbindung; Komplexverbindungen aus einem Protoporphyrin Ring mit vier Pyrrolringen, die über die Stickstoffatome an ein zentrales Eisenatom koordiniert sind. Die am häufigsten vorkommende Prosthetische Häm-Gruppe ist dabei das Protoporphyrin IX, Häm b (Abb. 5).[23] 6 EINLEITUNG N N Fe N COOH N COOH Abb. 5: Struktur von Protoporphyrin IX.[23] Cytochrom P450 Enzyme katalysieren NADH und Sauerstoff abhängige Oxidationen wie in Abb. 6 dargestellt. Zwei Elektronen aus NADH werden durch ein Flavoprotein (oder ein Flavoprotein/Eisen-Schwefel-Protein) in Gegenwart des Substrates (R-H) und molekularem Sauerstoff (O2) auf das Hämprotein übertragen. Dabei wird ein Sauerstoffatom auf das Substrat überführt und dieses oxidiert.[23] NADPH + O2 + R-H + H+ NADP+ + R-OH + H2O Abb. 6: Allgemeines Katalyseschema der Cytochrom P450 abhängigen Oxidationsreaktion.[23] 2.2.3. Mononukleäre Nicht-Häm-Eisenenzyme Analog zu den Häm-Enzymen katalysieren auch die Nicht-Häm-Eisenenzyme eine große Anzahl von sauerstoffabhängigen Reaktionen wie Monooxidationen, Dioxidationen und oxidative Eliminierungen.[24,25] Für einige Mitglieder aus der Superfamilie der Nicht-Häm Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Enzyme konnte darüber hinaus eine HalogenaseAktivität nachgewiesen werden.[26,27] 7 EINLEITUNG 2.2.4. Eisen(III) Dioxygenasen Catechol Dioxygenasen (EC-Nummer: 1.13.11.) aus Bakterien katalysieren die oxidative Spaltung einer aromatischen Doppelbindung in einem Catecholmolekül. Es können zwei Familien unterschieden werden: Die Intradiol-spaltenden Dioxygenasen, die ein Eisen(III) im aktiven Zentrum besitzen (Abb. 7) und die Extradiol-spaltenden Dioxygenasen, die Eisen(II) oder auch Mangan(II) verwenden.[25] O O O O FeIII FeII O2 COOCOO- O O O O O O O HO FeIII FeII O O O O FeIII Abb. 7: Vermuteter Reaktionsmechanismus für Intradiol-spaltende Catechol Dioxygenasen.[25] Wie bei den Intradiol-spaltenden Catechol Dioxygenasen ist bei den Lipoxygenasen die Eisen(III) Form ebenfalls die katalytisch aktive. Lipoxygenasen kommen in Tieren und Pflanzen vor und katalysieren die regio- und stereoselektive Oxidation von 1,4-DienEinheiten in Fettsäuren zu den entsprechenden Hydroperoxiden (Abb. 8).[25] 8 EINLEITUNG COOH Arachidonsäure Kaninchen Lipoxygenase COOH OOH Abb. 8: Hydroperoxidation von Arachidonsäure durch Kaninchen Lipoxygenase.[25] 2.3. Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Oxygenasen1 Eine Gruppe innerhalb der Familie der mononukleären Nicht-Häm-Eisen(II)-abhängigen Oxygenasen bilden α-Ketoglutarat abhängige Oxygenasen und verwandte Enzyme.[28-30] Sie katalysieren eine Vielzahl von Reaktionen wie Modifizierungen von Proteinseitenketten, die Reparatur von alkylierter DNA und RNA, sie spielen eine wichtige Rolle in der Biosynthese von Antibiotika und Pflanzenprodukten, im Metabolismus von Lipiden und beim biologischen Abbau verschiedenster Verbindungen, unter anderem Herbiziden.[31,32] Wie in Abb. 9 dargestellt, koppeln die meisten Vertreter dieser Enzymgruppe die Hydroxylierung eines Substrates, zumeist an einer nicht-aktivierten C-H Bindung, an die oxidative Decarboxylierung des Cosubstrates α-Ketoglutarat, aus dem dann CO2 und Succinat entsteht. Ein Sauerstoffatom wird dabei auf das Substrat, das andere Sauerstoffatom auf das Cosubstrat übertragen.[25,31] 1 Die Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen werden in der Literatur sowohl als Dioxygenasen wie auch als Monooxygenasen bezeichnet, da das zweite Sauerstoffatom auf das α-Ketoglutarat und nicht auf das eigentliche Substrat übertragen wird. Daher wird hier der Begriff Oxygenasen gewählt. 9 EINLEITUNG OH O HO O O R-OH + CO2 + R-H + O2 + O O OH OH Abb. 9: Allgemeines Reaktionsschema der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen.[31] Neben Hydroxylierungen katalysieren manche Enzyme dieser Gruppe auch Eliminierungen, Ringerweiterungen und Ringschlüsse.[31] Verschiedene Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Oxygenasen sind in der Lage, an einem Substrat verschiedene Reaktionen durchzuführen. So katalysiert die Carbapenem Synthase (CarC) die Bildung einer Doppelbindung und darüber hinaus noch eine Epimerisierung am tertiären Kohlenstoffatom (Abb. 10). [31,33,34] O2 -KG CO2 Succinat H2O N N O O COOH COOH N O COOH Abb. 10: Einbringen einer Doppelbindung/Epimerisierung durch das Enzym CarC.[31] Manche Vertreter der α-Ketoglutarat abhängigen Enzyme benutzen Substrate, die die α-Ketosäurefunktion bereits im Molekülgerüst tragen und daher kein α-Ketoglutarat als Cosubstrat benötigen. Dazu zählen die 4-Hydroxyphenylpyruvat Dioxygenase (HPPD) und die 4-Hydroxymandelat Synthase (HMS), die das gleiche Substrat verwenden aber unterschiedliche Umsetzungen katalysieren (Abb. 11). [25,31,35,36] 10 EINLEITUNG OH O PD HP O HO OH Homogentisinsäure CO2 OH O2 O OH HM S HO OH O2 4-Hydroxyphenylpyruvat CO2 O HO L-Hydroxymandelsäure Abb. 11: Umsetzung von 4-Hydroxyphenylpyruvat mit den Enzymen HPPD und HMS.[31] 2.3.1. Struktur und Bindungsmodus α-Ketoglutarat abhängige Oxygenasen zeichnen sich weniger durch ihre Sequenzhomologie aus als durch ein gemeinsames Motiv für die Bindung von Eisen(II), welches an drei Aminosäuren im aktiven Zentrum bindet (Abb. 12). Diese eisenbindende Triade besteht aus einem Histidin, einer benachbarten Aminosäure mit Carboxylatfunktion (Asparaginsäure oder Glutaminsäure) und einem zweiten, in der Sequenz etwas entfernt stehenden Histidin. Hieraus ergibt sich das typische His1 - X - Asp/Glu - Xn - His2 Motiv (X steht für eine andere Aminosäure; n für eine unterschiedliche Anzahl) dieser Enzymsuperfamilie.[31,37] OH2 OH2 His OH2 His Asp/Glu Abb. 12: Eisenbindende Triade der α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen.[25,38] Strukturelles Merkmal der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Proteine ist eine sogenannte Biskuitrollen-Faltung („jellyroll“), die aus acht β-Faltblättern besteht (Abb. 13). In dieser fassähnlichen Anordnung befindet sich auch die eisenbindende Triade. Wie am Beispiel der 11 EINLEITUNG Isopenicillin N Synthase (IPNS) dargestellt, finden sich zusätzliche β-Stränge und α-Helices am N-Terminus, innerhalb der Biskuitrollen-Faltung und am C-Terminus. Hierdurch wird die Kernstruktur stabilisiert, Protein-Protein-Wechselwirkungen werden ermöglicht und die Substratbindetasche wird angepasst (Abb. 13).[31,39,40] Abb. 13: links: Biskuitrollen-Faltung der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen. rechts: Kristallstruktur der Isopenicillin N Synthase.[31,39] Auf Grundlage der unterschiedlichen Möglichkeiten des α-Ketoglutarates, sich innerhalb des aktiven Zentrums anzuordnen, können zwei Bindungsmodi unterschieden werden. In beiden Gruppen bindet das C-1 Carboxylat und die C-2 Ketogruppe an das Metallion. Das C-5 Carboxylat wird durch eine Wasserstoffbindung zu einem Argininrest oder durch ionische Wechselwirkungen mit einem Lysin aus der Seitenkette stabilisiert. Bei Enzymen der ersten Kategorie befindet sich das Histidin1 (His1) und der Carboxylatligand etwa in der gleichen Ebene wie das α-Ketoglutarat. Das C-1 Carboxylat befindet sich gegenüber dem Histidin1 und das C-2 Keton gegenüber dem sauren Rest. Das eigentliche Substrat bindet nicht an das Metallion sondern es befindet sich über dieser Ebene. Eine offene Metallbindungsstelle bleibt frei in Richtung des Substrates in diesem „in-line“ Bindemodus (Abb. 14).[31] Hierzu zählen die Taurin Dioxygenase (TauD), die Clavaminat Synthase (CAS) und die Alkylsulfatase (AtsK).[41-43] 12 EINLEITUNG Arg/Lys Substrat H2 N H N O HO O His1 N Fe O O Asp/Glu O H2N N HN O NH R Arg His2 N H Abb. 14: "in-line" Bindemodus.[31] Bei dem sogenannten „off-line“ Bindemodus bindet das C-1 Carboxylat des α-Ketoglutarats gegenüber dem Histidin2. Die Ketogruppe ist erneut trans zu dem sauren Rest positioniert. Daraus resultiert, dass sich die offene Metallbindungsstelle gegenüber Histidin1 befindet und somit auf der von dem Substrat abgewandten Seite (Abb. 15).[31] Entweder durch Reorientierung des α-Ketoglutarats in die „in-line“ Geometrie (siehe oben) oder durch einen sogenannten „ferryl flip“ nach Bindung des Sauerstoffs an das Eisen, kann ein aktiviertes Sauerstoffatom im richtigen Abstand zum Substrat positioniert werden.[31,42] Hierzu zählen die Carbapenem Synthase (CarC) und die Anthocyanidin Synthase (ANS).[34,44] Arg NH HN Substrat H2N H2 N H N O O Arg/Lys O HO O His1 N Fe O Asp/Glu N O R His2 N H Abb. 15: "off-line" Bindemodus.[31] 13 EINLEITUNG Je nach Proteinstruktur ist der eine oder der andere Bindungstyp bevorzugt. Die Bindungstypen des α-Ketoglutarats besitzen aber eine gewisse Flexibilität und können sich teilweise innerhalb eines Enzyms umkehren. Dies wurde unter anderem bei der Clavaminat Synthase (CAS) bei Austausch des Sauerstoffs gegen Stickstoffmonoxid oder bei der Alkylsulfatase (AtsK) durch Ersetzen des Fe(II) gegen Na+ beobachtet.[31,42,43] 2.3.2. Hydroxylierungsmechanismus Anhand von kristallographischen und spektroskopischen Untersuchungen der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Enzyme kann ein allgemeiner Reaktionsmechanismus postuliert werden (Abb. 16).[25,30,45,46] Zu Beginn sind drei Bindungsstellen des Eisen(II) von der 2-Histidin-1-Carboxylat Triade besetzt. Die drei verbleibenden Bindungsstellen werden von Wassermolekülen eingenommen (A). Durch die Bindung des α-Ketoglutarats werden zwei Wassermoleküle verdrängt (B) (siehe auch Abb. 14 und Abb. 15). Kinetische Untersuchungen an Prolylhydroxylasen zeigten, dass neben der in (C) dargestellten Koordination des Substrates an den Komplex auch zunächst Sauerstoff an diesen binden kann.[47,48] Durch den Verlust des letzten Wassermoleküls bei der Annäherung des Substrates entsteht ein ungesättigtes Eisen(II) Zentrum. Sauerstoff kann an das Eisen binden, und es entsteht ein Eisen(III)-Superoxid Radikalanion (D), welches die α-Ketosäure decarboxyliert.[49] Dies kann auch unabhängig von der nun folgenden Oxidation des Substrates geschehen, insbesondere in Abwesenheit des Substrates oder in Gegenwart eines nur schlecht umsetzbaren Substratanalogons. Durch den Angriff des Sauerstoffs an die Ketosäure entsteht intermediär eine Eisen(IV)-Peroxo Spezies, die für die Oxidation des Substrates verantwortlich ist (E). Hinweise auf die Beteiligung einer Eisen(IV)-Peroxo-Form ergab die Untersuchung der Reaktion des TauD-α-Ketoglutarat-Taurinkomplexes sowie der Homoprotocatechuat-2,3-dioxygenase mittels Elektronenspin-Resonanz und Mössbauer Spektroskopie.[50,51] Die vermutete Eisen(IV)-Peroxo Spezies (E) wird durch heterologe Spaltung der Sauerstoff-Sauerstoff Bindung in eine Eisen(IV)-Oxo Spezies überführt (F). Die Hydroxylierung des Substrates geschieht vermutlich ähnlich wie bei den Cytochrom P450 Enzymen.[23] Zunächst wird durch die Eisen(IV)-Oxo Spezies ein Wasserstoff-Atom von dem Substrat abstrahiert. Durch anschließende Neukombination der Hydroxygruppe am Eisen mit dem Substratradikal entsteht das hydroxylierte Substrat und das Eisen erreicht wieder die Oxidationsstufe II (G). Als weiteres Reaktionsprodukt wird Kohlenstoffdioxid vermutlich direkt nach dem Verlassen des hydroxylierten Produktes aus dem Komplex freigesetzt. 14 EINLEITUNG R-H OH2 Fe II OH2 OH2 Fe OH2 R-OH RCOOH CO2 R O II FeII O alpha-KG A R O O O SH B O C O2 O R-OH R II O IV Fe O R O O O R III O O O E F R O Fe Fe OCO G O2 O IV Fe OCO R-H R-H O R-H O D Abb. 16: Angenommener Reaktionsmechanismus der α-Ketoglutarat abhängigen Enzyme.[25] Durch die unterschiedliche Bindung des α-Ketoglutarates im „in-line“ beziehungsweise „off-line“ Modus sowie die unterschiedlichen Arten der katalysierten Reaktionen (Hydroxylierungen, Einbringen von Doppelbindungen, Ringerweiterungen und weitere) sind auch Variationen des Reaktionsmechanismus möglich.[31,52] Beispielsweise wird bei der Erzeugung einer Doppelbindung vermutlich durch die Eisen(IV)-Oxo Spezies ein zweites Wasserstoff-Atom von dem Substrat abstrahiert, woraufhin die -Bindung ausgebildet wird (Abb. 17).[31] R2 R2 R3 R1 H H OCO FeIV O O R3 R2 R4 R1 H O= R R3 R1 R4 R4 OHHis OCO R Asp/Glu His FeIII O O OH2 His OCO Asp/Glu His His FeII R O O Asp/Glu His Abb. 17: Angenommener Mechanismus der α-Ketoglutarat abhängigen Einführung einer Doppelbindung.[31] 15 EINLEITUNG 2.4. Prolylhydroxylasen Prolylhydroxylasen sind Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Hydroxylasen, denen peptidisch gebundenes Prolin in der Seitenkette von Proteinen als Substrat dient. Die Prolyl-4Hydroxylase kommt in Tieren, Pflanzen, Insekten und anderen Organismen vor, darunter der Paramecium bursaria Chlorella Virus-1. Sie katalysiert die Hydroxylierung von peptidischen Prolinresten zu trans-4-Hydroxyprolin (Abb. 18).[53-57] Bei Wirbeltieren ist diese Aktivität für die Biosynthese des Kollagens essentiell, da die hydroxylierten Reste für die Ausbildung von inter- und intrasträngigen Wasserstoffbrücken verantwortlich sind, die die Tripel-Helicale Struktur der Proteine stabilisieren.[58-61] Skorbut, eine Vitamin C Mangelerkrankung, ist auf eine verringerte Aktivität der Prolylhydroxylasen zurückzuführen.[62] Dies lässt sich allgemein durch die Eigenschaft der Ascorbinsäure erklären, Eisen(III) in die für die enzymatische Reaktion benötigte Eisen(II)Form zu reduzieren.[63,64] In den meisten Fällen ist das Enzym aus zwei Untereinheiten, der Hydroxylase α und der Protein-Disulfid-Isomerase β, aufgebaut. Die Prolyl-3-Hydroxylase katalysiert die Umsetzung von Prolinresten in Procollagen zu trans-3-Hydroxyprolin (Abb. 19); allerdings ist der Anteil hiervon im fertigen Kollagen nur etwa 10% verglichen mit dem Anteil an trans-4-Hydroxyprolin.[31,58] HO O O R R N N R O2 CO2 -Ketoglutarat Succinat R Abb. 18: Enzymatische Reaktion der Prolyl-4-Hydroxylase.[31] OH O O R R N R N O2 CO2 -Ketoglutarat Succinat Abb. 19: Enzymatische Reaktion der Prolyl-3-Hydroxylase.[31] 16 R EINLEITUNG 2.5. Prolinhydroxylasen Im Gegensatz zu den Prolylhydroxylasen hydroxylieren Prolinhydroxylasen ausschließlich die freie L-Aminosäure. Die bis dato isolierten Prolinhydroxylasen stammen aus Bakterien, wo sie oftmals durch Bereitstellung von Hydroxyprolinen an der Biosynthese von Naturstoffen beteiligt sind, darunter die Peptipantibiotika Etamycin und Telomycin (Abb. 20).[65-67] OH OH H N N HO OH O trans-4-Hydroxyprolin O O Etamycin O N N H O O N H O N O N O N H O N Abb. 20: 4-Hydroxyprolin in Etamycin.[65,68] Bei der Biosynthese kommt es zu einer Inversion der L-Konfiguration hin zur D-Form. trans-4-Prolinhydroxylasen (transP4Hs) wurden bisher in Stämmen von Streptomyces, Amycolatopsis und Dactylosporangium gefunden (Abb. 21).[31,69] Daneben wurden cis-3Prolinhydroxylasen (cisP3Hs) aus Bacillus und Streptomyces-Stämmen isoliert.[31,66] Die Generierung von cis-4-Hydroxyprolin gelang bislang nur mit zwei cis-4-Prolinhydroxylasen (cisP4Hs) aus zwei Stämmen der Ordnung Rhizobiales, Mesorhizobium loti und Sinorhizobium meliloti.[70] In dem Proteinextrakt des Pilzes Glarea lozoyensis, der das antifungal wirkende, Hydroxyprolin-enthaltende Hexapeptid Pneumocandin synthetisiert, konnte neben der transP4H Aktivität auch die enzymatische Umsetzung zu trans-3Hydroxyprolin nachgewiesen werden; allerdings sind keine Sequenzinformationen zu diesen Enzymen verfügbar.[71] In Abb. 21 ist die regio- und stereoselektive Umsetzung von L-Prolin durch die verschiedenen Prolinhydroxylasen zusammenfassend dargestellt.[72] 17 EINLEITUNG OH OH COOH COOH N H cis-3-Hydroxyprolin cis P3 H n tra ( Pr sP ote N H 3H a xtr i ne k t) trans-3-Hydroxyprolin COOH N H cis H P4 t ra L-Prolin ns P4 H HO HO COOH COOH N H N H cis-4-Hydroxyprolin trans-4-Hydroxyprolin Abb. 21: Umsetzung von L-Prolin durch Prolinhydroxylasen.[72] Regio- und stereoisomerenreine Hydroxyproline stellen für die organische Chemie wertvolle Verbindungen dar, sowohl als Liganden chiraler Katalysatoren als auch als Bausteine in der Synthese.[73,74] Hydroxyproline werden für die Synthese von wichtigen pharmazeutischen Wirkstoffen verwendet, Nucleosidanaloga, darunter Carbapenem-Antibiotika, Angiotensin-Converting-Enzym Inhibitoren, antiviral wirkende Selektiven Androgen Rezeptor Modulatoren (SARMs) und antispastisch wirkenden Mitteln (Abb. 22).[75-77] HO HO B O OH OH B N H trans-4-Hydroxyprolin N Boc Uracil Thymin Cytosin 5-Flururacil 3´-Deoxy-4´azaribonucleoside HO OH a b c d H O O N OH CN N N H O cis-3-Hydroxyprolin Cl BMS-564929 (potentieller SARM) Abb. 22: Beispiele von Wirkstoffsynthesen ausgehend von Hydroxyprolinen.[76,77] Hydroxyproline selber werden ebenfalls als Wirkstoffe in der klinischen Forschung diskutiert. So werden die Wirkungen der cis-Hydroxyproline bei verschiedenen Erkrankungen untersucht, die mit einem unkontrollierten Wachstum von Gewebe einhergehen, insbesondere 18 EINLEITUNG Tumorerkrankungen und Verdickungen der Basalmembran.[78,79] Da in Wirbeltieren normalerweise nur die trans-Hydroxyproline vorkommen, die für die Stabilität der Proteine essentiell sind, wird durch den Einbau von cis-Hydroxyprolinen der korrekte Strukturaufbau verhindert, und übermäßige Kollagenansammlungen bei fibrosierenden Prozessen und beim Tumorwachstum werden reduziert.[57,79] 2.5.1. Technische Produktion der Hydroxyproline Im technischen Maßstab werden die trans-Hydroxyproline durch chemische Hydrolyse aus Kollagen gewonnen.[80] Für die Aufarbeitung der Produkte sind dabei eine Reihe von Schritten erforderlich, für die erhebliche Mengen an Lösungsmitteln, darunter auch organische, benötigt werden (Abb. 23).[70,80] Saure Hydrolyse des Kollagens Neutralisation und Eindampfen Fraktionierte Kristallisation Ionentauschchromatographie Abb. 23: Fließschema der Extraktionsmethode für die Gewinnung von trans-Hydroxyprolin aus Kollagen.[80] Eine Alternative hierzu stellt der Einsatz der Prolinhydroxylasen für die technische Synthese dar. So wurde bereits für heterolog in E. coli Stämmen produzierte trans-4- und cis-3Prolinhydroxylasen ein industrielles Verfahren patentiert, das die Produktion von trans-4- und cis-3-Hydroxyprolin durch enzymatische in vivo Umsetzung von L-Prolin mit Produkttitern von bis zu 41 g / L (trans-4-Hydroxyprolin) beziehungsweise 68 g / L (cis-3-Hydroxyprolin) erlaubt.[81-83] Die Verwendung von speziellen E. coli Expressionsstämmen (E. coli W1485) und Vektoren (Tryptophan-Tandem Promoter und Codonoptimierungen) sowie eine Isolierung der Produkte über mehrere chromatographische und chemisch-synthetische Schritte verhindern jedoch die Übertragung des Verfahrens in den Labormaßstab, so dass eine einfache enzymatische Darstellung von Hydroxyprolinen bisher nicht möglich war (Abb. 24). Heterologe Produktion der Prolinhydroxylasen in vivo Umsetzung Ionentauschchromatographie Chemische Derivatisierung Ionentauschchromatographie Abb. 24: Fließschema für die enzymatische Gewinnung von Hydroxyprolin aus L-Prolin.[81,83] 19 EINLEITUNG Prolinhydroxylasen sind in der Lage, außer Prolin noch weitere cyclische L-Aminosäuren regio- und stereoselektiv zu hydroxylieren.[84] So konnte mit einer isolierten trans-4Prolinhydroxylase aus Dactylosporangium sp. RH1 die Umsetzung des 6-Ring-Analogons des Prolins, der L-Pipecolinsäure, sowie des 3,4-Dehydro-L-prolins gezeigt werden. Für zwei isolierte cis-3-Prolinhydroxylasen aus Streptomyces sp. TH1 gelang darüber hinaus noch die Hydroxylierung des 4-Ring Analogons, der L-Azetidin-2-carbonsäure (Tabelle 1). trans-4-Prolinhydroxylase Substrat Produkt cis-3-Prolinhydroxylasen Relative Produkt Relative Aktivität Aktivität cisP3H_I / cisP3H_II OH HO OH OH N H N H O 100 OH N H O 100 / 100 O OH ---- OH HN O O HO OH OH OH N H N H O 109 OH N H O O OH N H O 15 / 3 O O OH N H 3 / 40 OH HN 66 OH N H O 30 / 57 O Tabelle 1: Substratselektivität der trans-4- und cis-3-Prolinhydroxylasen.[84] Diese und weitere Substrattestungen mit den gleichen Enzymen lassen vermuten, dass die freie sekundäre Aminosäurestruktur für die Katalyse mit Prolinhydroxylasen zwingend erforderlich ist.[84] So wird kein peptidisch gebundenes Prolin und kein N- (N-Methylprolin) oder O- (Prolinmethylester) substituiertes Prolin als Substrat akzeptiert. Die Verwendung von isolierten Prolinhydroxylasen für die selektive Einführung einer Hydroxygruppe in P450 Monooxygenasen ein den Zielsubstrat Vorteil, dass hat das gegenüber Cosubstrat NAD(P)H-abhängigen α-Ketoglutarat, das in stöchiometrischer Menge für die Reaktion gebraucht wird, kostengünstig ist und kein 20 EINLEITUNG Regenerationssystem notwendig ist (Preise Sigma Aldrich 06/2011: 25 g α-KetoglutaratDinatrium-Dihydrat: €33; 1 g NADH-Dikalium: €511; 25 mg NADPH-Tetracyclohexylammonium: €57). 21 EINLEITUNG 2.6. Aufgabenstellung Hydroxyproline stellen wertvolle Substanzen dar, zu denen es größtenteils keinen beziehungsweise nur einen sehr aufwendigen chemischen Zugang gibt. Dies gilt insbesondere für cis-Hydroxyproline, die nicht über die Hydrolyse von tierischem Kollagen zugänglich sind. So kosten beispielsweise 10 mg cis-3-Hydroxy-D,L-prolin €418, 50 mg cis-4-HydroxyL-prolin €61.00 (Preise Sigma Aldrich, Stand 06/2011). Durch die regio- und stereoselektive Aktivierung von C-H Bindungen bieten Prolinhydroxylasen eine vielversprechende Möglichkeit zur Produktion dieser Substanzen. In Anlehnung an das bereits patentierte Verfahren für die Herstellung von trans-4- und cis-3-Hydroxyprolin soll ein in vivo Prozess, der auch für die Gewinnung von cis-4-Hydroxyprolin geeignet ist, entwickelt werden. Hierbei soll vor allem eine technisch aufwendige Produktisolierung, insbesondere chemischsynthetische Schritte, vermieden werden, so dass mit einfachen Labormethoden ein Zugang zu den Hydroxyprolinen bis hin zum Gramm-Maßstab möglicht wird. Hierfür muss zunächst ein System zur Produktion der Prolinhydroxylasen gefunden werden, da die heterologe Produktion (transP4H und cisP3H) in verschiedenen E. coli-Stämmen (E. coli BL21(DE3), E. coli Rosetta-gami B(DE3) pLysS, E. coli W1485) mit Standardvektoren (pET19b, pET22b, pET28b, pBluescript II KS+) trotz Variation der Kultur- und Expressionsbedingungen (unterschiedliche Temperaturen, verschiedene IPTG-Konzentrationen bei unterschiedlichen optischen Dichten) größtenteils nur zu unlöslichem Protein führt.[85] Daneben muss ein AssaySystem für Aktivitätstests entwickelt und eine Analytik für die weitere Charakterisierung der Hydroxyproline etabliert werden. Wie von Shibasaki et al. gezeigt, besitzen die Prolinhydroxylasen eine gewisse Flexibilität in ihrem Substratspektrum.[84] Daher sollen neben den bereits getesteten Substanzen weitere Prolinanaloga als Substrate für die Prolinhydroxylasen untersucht werden. Die Struktur der Produkte soll über chromatographische und spektroskopische Methoden, insbesondere HPLC, Massenspektroskopie und NMR, aufgeklärt werden. Falls die potenziellen Substrate der Prolinhydroxylasen nicht kommerziell erhältlich sind, sollen diese über chemische Synthese hergestellt werden. Auch wenn es sich bei diesen Verbindungen nicht um proteinogene Aminosäuren handelt, die leicht von E. coli aufgenommen werden, soll versucht werden, für diese ebenfalls einen in vivo Prozess für eine einfache Gewinnung im präparativen Maßstab zu etabliert. 22 EINLEITUNG Die bis dato charakterisierten Prolinhydroxylasen katalysieren die Umsetzung von Prolin äußerst selektiv zu jeweils nur einem bestimmten Regio- und Stereoisomer. Es soll untersucht werden, ob sich durch gerichtete Mutagenese die hohen Produktspezifitäten verändern beziehungsweise sich Varianten mit höheren Aktivitäten als die der Wildtypenzyme generieren lassen. 23 SPEZIELLER TEIL 3. Spezieller Teil 3.1. Molekularbiologische Arbeiten In dieser Arbeit wurden die trans-4-Prolinhydroxylase (transP4H) aus Dactylosporangium sp. RH1 (GenBank No. BAA20094), die cis-4-Prolinhydroxylase (cisP4H) aus Sinorhizobium meliloti (GenBank No. CAC47686) sowie die cis-3-Prolinhydroxylase Typ I (cis3PH_I) aus Streptomyces sp. TH1 (GenBank No. BAA22406) und die cis-3-Prolinhydroxylase Typ II (cisP3H_II) aus Streptomyces sp. TH1 (GenBank No. AAB60894) verwendet.[66,69,70,86] Da für alle Prolinhydroxylasen keine genomische DNA zur Verfügung stand, wurden die Gene der Prolinhydroxylasen synthetisiert. Aufgrund eines hohen GC-Gehaltes der Originalsequenzen wurden die Gene für die transP4H, die cisP3H_I und die cisP3H_II unter Optimierung der Basencodons für die heterologe Genexpression in E. coli synthetisiert (siehe Anhang). Außerdem wurde bei der cisP4H und cisP3H_II das Stoppcodon entfernt. 3.1.1. Produktion der Prolinhydroxylasen Trotz Verwendung zahlreicher Expressionsvektoren sowie Variation der Kulturbedingungen und der E. coli Expressionsstämme konnten die Prolinhydroxylasen bis dato in den meisten Fällen nur als unlösliches Protein in Form von sogenannten „inclusion bodies“ erhalten werden (siehe Aufgabenstellung).[85] Einzig bei Verwendung der Kälteschock-Vektoren pCold I und II wurde bei der Genexpression von transP4H und cisP3H bei 16 °C eine Fraktion von löslichem und aktivem Enzym erhalten.[85] Allerdings liegt laut Literatur bei dieser Temperatur nur noch eine geringe Restaktivität der Prolinhydroxylasen vor (optimale Aktivität der cisP3H_I, cisP3H_ II und transP4H bei rund 37 °C beziehungsweise der cisP4H bei 25 °C).[70,81,83] Für eine mögliche in vivo Umsetzung soll daher ein Weg gefunden werden, der es erlaubt, auch bei höheren Temperaturen die Enzyme in E. coli in guten Ausbeuten zu produzieren. Chaperone stellen eine Möglichkeit dar, die Löslichkeit von Enzymen zu erhöhen. Von Betancor et al. wurde das Chaperonplasmid pL1SL2 (Expressionsvektor pETcoco2, auf dem sich die Chaperone GroEL1, GroEL2 und GroES aus Streptomyces coelicolor befinden) erfolgreich für die Erhöhung der Löslichkeit von gleichzeitig produzierten Proteinen eingesetzt (Abb. 25).[87] Als Expressionsstamm diente hierbei E. coli BL21(DE3) Codon Plus RP. Dieses System (E. coli BL21(DE3) Codon Plus RP/pL1SL2) wurde freundlicherweise 24 SPEZIELLER TEIL von Peter F. Leadlay (Universität Cambridge, UK) zur Verfügung gestellt. Da der Vektor pETcoco2 und E. coli BL21(DE3) Codon Plus RP bereits eine Ampicillin beziehungsweise eine Chloramphenicol Resistenz besitzen, wurde der Vektor pET28b (Kanamycin Resistenz) für die Expression der Prolinhydroxylasen gewählt (Abb. 25). Abb. 25: Chaperonplasmid pL1SL2 und Vektor pET28 der Fa. Novagen.[87,88] Um die Anwendbarkeit des Chaperonsystems auf die Prolinhydroxylasen zu untersuchen, wurde zunächst die transP4H mit den Chaperonen coexprimiert (Abb. 26).[85] Abb. 26: Plasmide pET28b\transP4H und pET28b\cisP3H_I[85] 25 SPEZIELLER TEIL Dazu wurde das Plasmid pET28b\transP4H in E. coli BL21(DE3) RP Codon Plus/pL1SL2 transformiert und in LB-Medium in Anwesenheit von Antibiotika und Arabinose (für die Vervielfältigung des Plasmides pL1SL2) bis zu einer OD600 = 0.6 bei 37 °C, 140 rpm, inkubiert. Nach IPTG Zugabe (0.4 mM Endkonzentration) konnte bei einer Expressionstemperatur von 37 °C ausschließlich unlösliches Chaperon- und transP4H-Protein erhalten werden. Nach Wiederholung der Expression unter Reduzierung der Temperatur auf 28 °C wurde neben einer unlöslichen Fraktion sowohl von den Chaperonen als auch von der transP4H eine deutliche Fraktion an löslichem Protein erhalten (Abb. 27). MW [kD] 200 1 2 3 4 119 66 43 29 20 14 Abb. 27: SDS-PAGE der löslichen Fraktionen der Expressionen von transP4H in E. coli BL21 (DE3) RP Codon Plus. 1: transP4H/pET28b; 2: transP4H/pET28b + pL1SL2; 3: nur pL1SL2; 4: Negativkontrolle. Die Proteinbande der transP4H ist mit einem Pfeil markiert. Aufgrund dieses positiven Ergebnisses wurden auch die Gene der cisP4H und der cis3PH_II in den Vektor pET28b eingebracht. Das Gen der cis3PH_II wurde direkt von der Fa. GENESCRIPT über die SalI und NotI Schnittstellen in den Vektor ligiert. Das Gen für die cisP4H wurde über die NotI und HindIII Schnittstelle eingefügt (Abb. 28). 26 SPEZIELLER TEIL Abb. 28: Plasmide pET28b\cisP3H_II und pET28b\cisP4H. Aufgrund eines Synthesefehlers befand sich unmittelbar vor dem Startcodon des cisP4H Gens das Stopcodon TAA. Durch gerichtete Mutagenese mittels Quick-Change PCR wurde dieses zu dem Basentriplett TAT, das für Tyrosin codiert, umgewandelt (Abb. 29). 1 Leu Gly Pro *** Met Ser Thr His Phe 5 ctg cag ccc taa atg agc tgg gca agg 15 1 ctg cag ccc tat atg agc tgg gca agg 15 Leu Gly Pro Tyr Met Ser Thr His Phe 5 Abb. 29: Punktmutagenese des Plasmids pET28b\cisP4H. Die Expressionsplasmide der cisP3H_I, cisP3H_II und cisP4H wurden ebenfalls in E. coli BL21 RP Codon Plus/pL1SL2 transformiert. Die Expression der Gene erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben für die Expression der transP4H. Die Isolierung der mit einem N- beziehungsweise einem N- und C-terminalen His·Tag versehenen Prolinhydroxylasen erfolgte nach Zellaufschluss mit Ultraschall über Metallionenaffinitätschromatographie an Ni-NTA und anschließender Entfernung des Imidazols über Größenausschlusschromatographie via PD-10 Säulen. Die Analytik der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (Abb. 30). 27 SPEZIELLER TEIL MW [kD] MW [kD] cisP3H_II 170 130 transP4H cisP4H cisP3H_I Entsalzt Entsalzt Entsalzt 170 Pellet Lysat Imidazol Entsalzt (200 mM) 130 100 100 70 70 55 55 40 40 35 35 25 25 15 15 Abb. 30: SDS-PAGE der Prolinhydroxylasen. Durch Produktion der Prolinhydroxylasen in dem gegenüber LB-Medium deutlich reichhaltigeren TB-Medium wurden für die cisP4H und die cisP3H_I Ausbeuten von circa 5 10 mg/L Kultur, für die transP4H und die cisP3H_II circa 10 - 20 mg/L Kultur erhalten. Durch Ultrazentrifugation besteht ebenfalls die Möglichkeit der Aufkonzentrierung der Lösungen der Prolinhydroxylasen. Um eine längere Stabilität bei der Lagerung zu gewährleisten, wurden die mit 10 mM MES-Puffer pH 6.5 entsalzten Prolinhydroxylasehaltigen Lösungen lyophilisiert und bei -80 °C aufbewahrt. Da keine Kristallstrukturen für die transP4H und die cisP4H existieren, sollte in Kooperation mit Wulf Blankenfeldt (Universität Bayreuth) für die beiden Prolinhydroxylasen diese aufgeklärt werden. Im Zuge dieser Kooperation wurden weitere Systeme für die Produktion der Prolinhydroxylasen untersucht. Außer mit dem oben beschriebenen Chaperonsystem konnte auch durch Coexpression des kommerziell erhältlichen Chaperonplasmids pG-KJE8 (Fa. TAKARA), auf dem sich die aus E. coli stammenden Chaperone groEL, groES, dnak, dnaj und grpE befinden, die Prolinhydroxylasen in löslicher Form erhalten werden. Für Kristallisationsversuche wurden die Gene der transP4H und die cisP4H in den Vektor pET19TEV kloniert, der unmittelbar vor der Multiple Cloning Site eine Schnittstelle für die TEV Protease besitzt. Diese Arbeiten wurden von der Arbeitsgruppe von Wulf Blankenfeldt durchgeführt. Die Plasmide pET19TEV\transP4H und pET19TEV\cisP4H wurden in E. coli BL21(DE3) Zellen, die 28 SPEZIELLER TEIL zusätzlich das Chaperonplasmid pG-KJE8 tragen, transformiert. Die Expression der Gene und die Isolierung der Proteine erfolgten wie oben beschrieben. Für die transP4H konnte hierbei ungefähr die gleichen Ausbeuten an löslichem Protein erhalten werden wie bei der Coexpression mit pL1SL2. Mit der cisP4H wurden allerdings nur geringere Mengen an löslichem Protein erzielt. Coexpressionen des Chaperonplasmids pG-KJE8 in E. coli BL21(DE3) mit den Plasmiden pET28b\cisP3H und pET28b\cisP4H lieferten ebenfalls nur geringere Mengen an löslichem Enzym im Vergleich zu dem Expressionssystem E. coli BL21(DE3) RP Codon Plus/pL1SL2. Trotz Testung von zahlreichen verschiedenen Bedingungen für die Kristallisation durch die Arbeitsgruppe Wulf Blankenfeldt konnten bis dato keine Kristalle für die transP4H und cisP4H erhalten werden. 3.2. Analytische Arbeiten 3.2.1. Entwicklung eines HPLC- und kolorimetrischen Assays Die in der Literatur zu findende Hochleistungsflüssigkeitschromatographien zur Analytik der Hydroxyproline basieren auf der Auftrennung und Detektion nach vorangegangener Derivatisierung mit einem Fluoreszenzreagenz.[70,81,83] Da Hydroxyproline und Prolin wie die meisten anderen Aminosäuren auch, nicht beziehungsweise nur sehr schwach UV-aktiv sind, wird üblicherweise am Stickstoffmolekül durch chemische Reaktion eine fluoreszierende Gruppe eingefügt. Zunächst wurde die von Ozaki et al. angewendete VorsäulenDerivatisierung mit 4-Chlor-7-nitrobenzofurazan (Cl-NBD) angewendet.[85,89] Allerdings konnte hiermit auch mit verschiedenen Umkehrphasen keine eindeutige Trennung der verschiedenen Hydroxyproline erreicht werden. Zudem war die aufwendige Vorbereitung der Proben für diese Methode ein Nachteil. Von Kunte et al. wurde eine Methode basierend auf einer Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC) zum Nachweis von Aminosäuren und davon abgeleiteten Derivaten berichtet.[90] FMOC hat gegenüber anderen Derivatisierungsverfahren den Vorteil, dass es sehr schnell (~30 s) stabile Derivate bildet, die bei Raumtemperatur über 24 h und bei -20 °C bis zu 2 Wochen lagerbeständig sind.[90] Hiermit konnte durch Gradientenelution auf einer Umkehrphase eine Basislinientrennung der vier Hydroxyproline und Prolin erreicht werden (Abb. 31). 29 SPEZIELLER TEIL FMOC-Addukte 350 250 150 100 22.668 trans-3-Hyp trans-4-Hyp 200 27.180 300 25.628 cis-3-Hyp cis-4-Hyp 30.218 L-Prolin 400 20.076 Fluoreszenz Intensität (Lu) LU 50 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 31: Auftrennung der Hydroxyproline im HPLC Chromatogramm nach Derivatisierung mit FMOC an einer RP-18 Phase. Anregungswellenlänge = 254 nm, Emissionswellenlänge = 316 nm.[72] Aufgrund der Vermeidung weiterer Aufarbeitungsschritte bei der Probenherstellung erlaubt diese Methode auch eine einfache quantitative Bestimmung der Hydroxyproline und Prolin.[90] Durch die Aufnahme von Kalibriergeraden mit den kommerziell erhältlichen Referenzen können Konzentrationen von 20 - 120 µmol·L-1 in der Probe durch Fluoreszenzdetektion quantifiziert werden. Neben dem HPLC Assay besteht außerdem die Möglichkeit, 4-Hydroxyproline, also trans-4und cis-4-Hydroxyprolin, durch eine Farbreaktion mit Ehrlichs Reagenz (4-(N,NDimethylamino)benzaldehyd nach vorheriger Oxidation mit Chloramin T als farbige Komplexe photometrisch bei λ = 558 ± 2 nm zu vermessen (Abb. 32).[91,92] Abb. 32: Farbreaktion von trans-4-Hydroxyprolin mit Ehrlichs Reagenz. 30 SPEZIELLER TEIL Der Proportionalitätsbereich des Farbassays liegt bei 0.5 - 2.25 µg·mL-1 (3.8 - 17.2 µmol·L-1). Für trans-4- und cis-4-Hydroxyprolin wurden identische Werte bei der Quantifizierung erhalten. Diese Methode kann nicht zur Bestimmung der 3-Hydroxyproline und Prolin angewendet werden, da es hierbei nicht zur Bildung der farbigen Verbindungen kommt. 3.2.2. Aktivitäten der Prolinhydroxylasen Für die analytische Untersuchung der Prolinhydroxylasen als Biokatalysator wurden diese über Metallionenaffinitätschromatographie an Ni-NTA isoliert und unmittelbar nach dem Entsalzen eingesetzt. Bei dem Umsatz von L-Prolin durch die vier Prolinhydroxylasen konnte, wie in vorherigen Arbeiten auch berichtet, ausschließlich das entsprechende Stereoisomer nachgewiesen und somit die Angaben aus der Literatur reproduziert werden.[66,69,70,86] Mit D-Prolin konnte kein hydroxyliertes Produkt nachgewiesen werden. Obwohl bei allen Ansätzen bereits wenige Minuten nach dem Start der Reaktion ein Proteinausfall der Prolinhydroxylasen beobachtet wurde, war eine konstante Aktivität der Prolinhydroxylasen (transP4H, cisP3H_I, cisP4H) über zwei Stunden zu beobachten (Abb. 33). Nach 24 h konnte kein Umsatz mehr festgestellt werden. 300 Molares Verhältnis (Produkt / Enzym) 250 200 transP4H cisP3H_I 150 cisP4H 100 50 0 0 50 100 150 Zeit in min Abb. 33: Hydroxyprolin Produktion mit transP4H, cisP3H_I und cisP4H. Bei Reaktionsansätzen mit transP4H unter Zusatz von Additiva zur Enzymstabilisierung (5% w/v Glucose, 5% w/v Lactose, Tween20 0.1% v/v, BSA 2 g/L) konnte eine Zunahme des Gesamtumsatzes um mindestens 50% erreicht werden. Allerdings werden durch solche 31 SPEZIELLER TEIL Zusätze weitere analytische Untersuchungen wie Massenspektrometrie oder NMR erschwert. Daher wurde standardmäßig darauf verzichtet. Bei in vitro Umsetzungen der Prolinhydroxylasen zeigte sich keine Inhibierung der Aktivität durch Prolin (Substrat) und α-Ketoglutarat (Cosubstrat) innerhalb des getesteten Bereichs von bis zu 20 mM (Prolin) beziehungsweise 30 mM (α-Ketoglutarat). Dahingegen gab es eine deutliche Abhängigkeit des Gesamtumsatzes von der eingesetzten Eisen(II)/Ascorbinsäure Konzentration trans-4-Hyp in µM Konzentration (Abb. 34). trans-4-Prolinhydroxylase 120 100 FeSO4 80 FeSO4/Ascorbinsäure (1:3) 60 40 20 0 0,1 1 10 Konzentration FeSO4 in mM Konzentration cis-3-Hyp in µM cis-3-Prolinhydroxylase Typ I 18 FeSO4 16 FeSO4/Ascorbinsäure (1:3) 14 12 10 8 6 4 2 0 0,001 0,01 0,1 1 Konzentration FeSO4 in mM Konzentration cis-4-HYP in µM cis-4-Prolinhydroxylase 25 FeSO4 20 FeSO4/Ascorbinsäure (1:3) 15 10 5 0 0,001 0,01 0,1 1 Konzentration FeSO4 in mM Abb. 34: Hydroxyprolin-Produktion in Abhängigkeit von der Eisen(II) und Eisen(II)/Ascorbinsäure (Verhältnis 1:3) Konzentration. Aufgrund des großen Konzentrationsbereiches der eingesetzten Eisen(II) Konzentrationen wurde eine logarithmische Skala gewählt. Die optimale Eisen(II)konzentration lag bei etwa 0.1 mM für die cis-selektiven Enzyme (cisP3H und cisP4H). Für die transP4H lag dieser Wert etwas höher bei etwa 0.5 mM. Im Gegensatz zu den Prolylhydroxylasen ist Ascorbinsäure nicht zwingend für die katalytische Aktivität der Prolinhydroxylasen erforderlich.[63] Jedoch kann durch den Zusatz von 32 SPEZIELLER TEIL Ascorbinsäure im richtigen Verhältnis deren Aktivität deutlich gesteigert werden. Dieser Effekt, der für zahlreiche Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängige Enzyme zu beobachten ist, wird allgemein durch die Reduktion des nicht-katalytischen Eisen(III) zu dem katalytisch-aktiven Eisen(II) durch die Ascorbinsäure erklärt (siehe Einleitung).[63,64] Allerdings dominiert in eigenen Messungen schon ab einer Ascorbinsäurekonzentrationen >3 mM ein inhibitorischer Effekt. So war die Aktivität der transP4H bei Zusatz von 6 mM Ascorbinsäure geringer als wenn 2 mM FeSO4 allein eingesetzt wurden (Abb. 34 oben). Dieser inhibitorische Effekt konnte für transP4H auch durch Messung des Gesamtumsatzes in Abhängigkeit von der Ascorbinsäurekonzentration bei Gegenwart von 0.5 mM FeSO4 bestätigt werden (Abb. 35). Konzentration trans-4-Hyp in µM trans-4-Prolinhydroxylase 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konzentration Ascorbinsäure in mM Abb. 35: Produktion von trans-4-Hydroxy-L-prolin durch transP4H in Gegenwart von 0.5 mM FeSO4 in Abhängigkeit von der Ascorbinsäurekonzentration. Diese Beobachtungen stimmen auch mit den in der Literatur berichteten unterschiedlichen Effekten von Ascorbinsäure auf die Aktivität von verschiedenen anderen Prolinhydroxylasen überein. Für die meisten charakterisierten Prolinhydroxylasen wird eine Zunahme der Aktivität durch Ascorbinsäure angegeben.[70,82,83] Von Lawrence et al. wird hingegen für eine trans-4-Prolinhydroxylase aus Streptomyces griseoviridus P8648 eine Abnahme der Aktivität bei Zusatz von 1 mM Ascorbinsäure zu einem Reaktionsansatz mit 0.5 mM (NH4)2Fe(SO4)2 berichtet.[65] Schwermetallionen wie beispielsweise Zn2+, Cu2+, Co3+ oder Ni2+ sind in der Literatur für die Prolinhydoxylasen als Inhibitoren der enzymatischen Reaktion beschrieben.[70,81,83,86] Diese Aussage sollte für die transP4H und die cisP4H am Beispiel von ZnSO4 überprüft werden (Tabelle 2). 33 SPEZIELLER TEIL trans-4-Prolinhydroxylase cis-4-Prolinhydroxylase Reaktionsansatz Relative Aktivität (%) Reaktionsansatz Relative Aktivität (%) Standard* 100 Standard* 100 - L-Prolin 0 - L-Prolin 0 - α-KG 0 - α-KG 0 - Enzym 0 - Enzym 0 + ZnSO4 2 + ZnSO4 1 Tabelle 2: Aktivitäten der transP4H und cisP4H. *Standard Reaktionsansatz: 50 mM Mes Puffer pH 6.5, 4 mM L-Prolin, 10 mM α-KG, 2 mM FeSO4, 2 mM Ascorbinsäure und transP4H beziehungsweise cisP4 in einem Gesamtvolumen von 3 mL. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Sauerstoffabhängigkeit der Prolinhydroxylasen-Katalyse wurde am Beispiel der transP4H verifiziert (Abb. 36). Hierfür wurde zunächst mit Stickstoff der gelöste Sauerstoff aus dem vorgelegten Puffer/Reaktionsmix ausgetrieben und nach Enzymzugabe durch kontinuierliches Begasen die erneute Aufnahme von Sauerstoff verhindert. Durch Verwendung eines Zweihalskolben konnten Proben während des Versuches ohne Unterbrechung des Stickstoffflusses nach 20, 40, 60 und 240 min entnommen werden. Konzentration trans-4-Hyp in µM trans-4-Prolinhydroxylase 400 350 300 250 Ref erenz 200 ohne Sauerstof f 150 100 50 0 0 50 100 150 200 250 300 Zeit in min Abb. 36: Umsatz der transP4 in Abhängigkeit von Sauerstoff. Reaktionsansätze: 50 mM Mes Puffer pH 6.5, 4 mM L-Prolin, 10 mM α-KG, 2 mM FeSO4, 2 mM Ascorbinsäure und transP4H in einem Gesamtvolumen von 8 mL in einem 10 mL Zweihalskolben. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. 34 SPEZIELLER TEIL Für die weitere Reaktionsoptimierung im Rahmen des durch die Deutsche Bundestiftung Umwelt geförderten Projektes ChemBioTec „Nachhaltige Biokatalytische Oxidationsprozesse“ (Aktenzeichen 13234), wurde in Kooperation mit Udo Kragel (Universität Rostock) die Stabilität und Aktivität der transP4 gegenüber dem Sauerstoffeintrag untersucht. Hierfür wurden mehrmals verschiedene Chargen an isolierter transP4H hergestellt und nach Aktivitätstestung übersendet. Allerdings konnte trotz zahlreicher durchgeführter Versuche und Messungen keine definitive Aussage über die Rolle des Sauerstoffgehalts bei der Reaktion getroffen werden. Um die Kinetik der transP4H nach Michaelis-Menten zu beschreiben, wurde für dieses Enzym die Michaeliskonstante Km ermittelt (Abb. 37). Hierfür wurde der Umsatz von vier verschiedenen Konzentrationen L-Prolin (0.025, 0.05, 0.2 und 0.5 mM) über verschieden lange Zeiträume (30, 60, 120, 180 und 300 s) in der Anfangsphase der enzymatischen Reaktion bestimmt. Die Quantifizierung der Hydroxyprolinkonzentration erfolgte über HPLC nach Derivatisierung mit FMOC. Da diese allerdings teilweise unter dem Proportionalitätsbereich der HPLC Methode lag, kann hierbei nur von einem ungefähren Reaktionsgeschwindigkeit in nmol/s Km-Wert gesprochen werden. 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Reaktionsgeschwindigkeit in nmol/s Substratkonzentration L-Prolin in mmol/L 0,1 0,09 0,08 0,07 y = -246,2x + 0,1279 R² = 0,9434 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 Substratumsatz in nmol/s / Konzentration in nmol/mL Abb. 37: Michaelis-Menten Diagramm (oben) und Eadie-Hofstee Auftragung (unten). 35 SPEZIELLER TEIL Aus der Eadie-Hofstee Auftragung ergab sich ein Km-Wert von 0.25 mM für die transP4H. In der Literatur wird der Wert mit 0.27 mM angegeben.[81] 3.3. in vivo Herstellung von Hydroxy-L-prolinen Obwohl sich durch die oben genannten Verbesserungen bei der enzymatischen Reaktion mit den isolierten Prolinhydroxylasen höhere Umsätze erreichen ließen, war der Gesamtumsatz allerdings immer noch sehr gering. Die höchsten Hydroxyprolinkonzentrationen konnten bei Umsetzungen mit transP4H erreicht werden. Mit etwa 0.5 mg·ml-1 transP4H wurde eine Produktkonzentration von ca. 8 mM erzielt. Für die Gewinnung großer Produktmengen ist diese in vitro Vorgehensweise aufgrund der geringen spezifischen Aktivität der Prolinhydroxylasen daher nicht geeignet. Durch die Verwendung des beschriebenen Chaperon Systems ist es möglich, Prolinhydroxylasen bei einer Temperatur zu produzieren, bei der sie laut Literatur noch eine gute (transP4H, cisP3H_I und cisP3H_II) beziehungsweise eine optimale (cisP4H) Aktivität besitzen.[70,81,83,86] Dies ermöglicht prinzipiell eine gleichzeitige Produktion der Prolinhydroxylasen und Umsetzung von L-Prolin in vivo im Medium. Allerdings sind für eine einfache Gewinnung der reinen Hydroxyproline aus dem Kulturmedium noch einige Schwierigkeiten zu überwinden. Üblicherweise besteht das Nährmedium der Kulturen (zum Beispiel LB- oder TB-Medium) zu einem guten Teil aus Proteinhydrolysat. Aufgrund ihrer ähnlichen chemischen Eigenschaften lassen sich Aminosäuren, insbesondere im präparativem Maßstab, nur schwer voneinander trennen. Ozaki et al. geben in ihrer Patentschrift die Möglichkeit der Derivatisierung von primären Aminosäuren mit o-Phthalaldehyd (OPA) und β-Mercaptoethanol gefolgt von anschließender Trennung der Fraktionen durch Affinitätschromatographie und eines Ionenaustauscherschritts an.[82,83] Um diesen aufwendigen Prozess zu umgehen, sollen die Produktion der Prolinhydroxylasen und die enzymatische Umsetzung in einem bis auf das Substrat L-Prolin Aminosäure-freien Minimalmedium erfolgen. Da auch eine präparative Trennung von Prolin und Hydroxyprolin aufwendig ist, soll die Konzentration an Prolin so gewählt werden, dass es vollständig zu Hydroxyprolin umgesetzt beziehungsweise von den Kulturen metabolisiert wird und ein Trennschritt entfällt. 36 SPEZIELLER TEIL Um einen möglichst hohen Produktumsatz auch in Schüttelkolben zu erzielen, wurden verschiedene Zusammensetzungen von Kulturmedien untersucht. Als Stickstoffquelle wurden anorganische Ammoniumverbindungen wie (NH4)2SO4 und NH4Cl gewählt. Da Glucose als Kohlenstoffquelle die Amplifikation des Chaperonvektors pETcoco2 unterdrücken würde, wurden stattdessen Glycerol und Acetet verwendet.[93] Glycerol bietet weiterhin gegenüber Glucose den Vorteil, dass ein Abfall des pH-Wertes während der Fermentation aufgrund von sauren Stoffwechselprodukten wie Milchsäure und Essigsäure reduziert und die damit verbundene Wachstumsinhibition erst später auftritt. Damit kann eine längere Wachstumsphase erreicht werden.[94] Aus industrieller beziehungsweise umwelttechnischer Sicht ist die Verwendung von Glycerol günstig, da es als Nebenprodukt bei der Herstellung von Biodiesel entsteht, und somit in Zukunft in immer größeren Mengen zur Verfügung stehen dürfte.[95] Gute Wachstumsergebnisse wurden mit dem selbst hergestellten Minimalmedium Medium 5 erzielt. Um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr im Schüttelkolben zu gewährleisten, wurde für 800 mL Medium 5 ein 2 L Drei-Schikanenkolben ausgewählt, der bei mindestens 140 UpM bewegt wurde. Nach Animpfung durch eine 1% (v/v) Vorkultur wurde nach circa 24 h Wachstum bei 37 °C eine OD600 zwischen 1.1 - 1.4 erreicht. Nach Temperaturreduktion auf 28 °C erfolgte die Induktion der Genexpression und die Zugabe des Reaktionsmixes (500 mg L-Prolin (6.25 mM) und 111 mg FeSO4·7H2O (0.5 mM)). Auf den Zusatz von α-Ketoglutarat kann bei diesem in vivo Ansatz verzichtet werden, da es durch die Bildung im Citratzyklus von E. coli den Prolinhydroxylasen als Cosubstrat zur Verfügung steht (Abb. 38). E.coli Zelle L-Prolin L-Prolin dweProlinhydroxylase Hyp Hyp Citratzyklus α-KG Succinat Glycerol Abb. 38: in vivo Produktion von Hydroxyprolin (Hyp).[96] Die Kontrolle der Produktion von Hydroxyprolin im Medium erfolgte über HPLC nach Derivatisierung mit FMOC. Üblicherweise ist 72 h nach Zugabe des Reaktionsmixes kein 37 SPEZIELLER TEIL Prolin mehr im Medium nachweisbar. In circa 20% der Fälle wurde neben dem gebildeten Hydroxyprolin aus unbekannten Gründen die Aminosäure Valin von den E. coli Zellen produziert und ins Medium abgegeben. In den meisten in vivo Ansätzen konnte jedoch durch längere Inkubationszeiten der Kulturen das Valin wieder vollständig abgebaut werden. Für die Isolierung von Aminosäuren werden üblicherweise Ionentauscher verwendet. Sie bieten die Möglichkeit, je nach Art und Menge des eingesetzten Ionentauscherharzes, sowohl sehr kleine Probenmengen (wenige mg) als auch größere Produktmengen (mehrere hundert mg) ohne beziehungsweise mit geringem Produktverlust (<10%) zu isolieren. Aufgrund der Funktionalitäten der Aminosäuren kann die Isolierung sowohl über Kationen- als auch Anionentauscher erfolgen. Da sich im Medium sowohl kationische als auch anionische Verbindungen befinden, wurde die Isolierung des Hydroxyprolins aus dem Medium über zwei Ionentauscher Schritte durchgeführt. Als stationäre Phasen wurden ein stark saures Harz (Dowex® 50 W X 8) und ein stark basiches Harz (Dowex® 1 X 8) gewählt. Wie auch schon bei der in vitro Umsetzung mit den Prolinhydroxylasen war jeweils nur ein Stereoisomer sowohl im Medium als auch im isolierten Produkt nachweisbar. Neben den Hydroxy-L-prolinen war in den Produktfraktionen noch anorganisches Salz, vermutlich Natriumchlorid von der Isolierung über Ionentauscher, zu finden. Enzym Produkt Produktumsatz Isolierte Ausbeute HO OH transP4H N H 63% O Tabelle 3: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit transP4H. 38 51% (255 mg) SPEZIELLER TEIL Abb. 39: 1H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten trans-4-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). Die Pfeile verweisen auf die Signale des Valins, das ebenfalls als Nebenprodukt mit isoliert wurde. Enzym Produkt Produktumsatz Isolierte Ausbeute HO OH cisP4H N H 41% 35% (175 mg) O Tabelle 4: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit cisP4H. Abb. 40: 1H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten cis-4-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). 39 SPEZIELLER TEIL Enzym Produkt Produktumsatz Isolierte Ausbeute OH OH cisP3H_I N H 63% 5 51% (255 mg) O Tabelle 5: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit cisP3H_I. Abb. 41: 1H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten cis-3-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). Da kommerziell erhältliches cis-3-Hydroxyprolin äußerst teuer ist (siehe Einleitung), wurden für die Kooperation mit Frank Schulz (MPI Dortmund) insgesamt mehrere Gramm cis-3Hydroxy-L-prolin über dieses in vivo Verfahren hergestellt und übersendet. Dieses konnte dann erfolgreich von der Arbeitsgruppe Frank Schulz für die weitere Synthese von Verbindungen, die bei Verfütterungsexperimenten eingesetzt werden sollen, verwendet werden. 40 SPEZIELLER TEIL 3.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen 3.4.1. Nicht-physiologische Cosubstrate Die α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen weisen zum Teil ein unterschiedliches Cosubstratspektrum auf. In der Literatur sind zahlreiche Enzyme aus dieser Familie beschrieben, die in der Lage sind, außer α-Ketoglutarat auch mehrere andere mono- und dicarboxylierte α-Ketosäuren als Cosubstrate in der enzymatischen Reaktion zu verwenden. So kann die Alkylsulfatase AtsK aus Pseudomonas putida S-313 unter anderem auch α-Ketovalerat und α-Ketoadipat mit einer guten Aktivität (87% beziehungsweise 81% verglichen mit α-Ketoglutarat) für die Spaltung von Alkylsulfatestern benutzen.[97] Dahingegen können die beiden α-Ketoglutarat abhängigen Dioxygenasen RdpA und SdpA aus Sphingomonas herbicidovorans MH neben α-Ketoglutarat nur α-Ketoadipat mit einer vergleichsweise geringen Aktivität (2% beziehungsweise 5% verglichen mit α-Ketoglutarat) für den Abbau von Phenoxypropansäuren verwenden.[98] Daher wurde untersucht, ob auch die transP4H, cisP4 und cisP3H_I noch weitere α-Ketosäuren als Cosubstrate für die Hydroxylierung von Prolin nutzen können (Tabelle 6). α-Ketodicarbonsäuren transP4H cis3P3H_I cisP4H Aktivität / relative Aktivität (%) Aktivität / relative Aktivität (%) Aktivität / relative Aktivität (%) O - O- O Na+ + Na / 100 / < 1 / ca. 1 / 100 / 100 O O α-Ketoglutarat-Dinatrium O O OH HO ---- ---- O Oxalessigsäure O O OH HO / ca. 1 / ca. 1 O α-Ketoadipinsäure 41 SPEZIELLER TEIL α-Ketocarbonsäuren transP4H cisP3H_I cisP4H Aktivität / relative Aktivität (%) Aktivität / relative Aktivität (%) Aktivität / relative Aktivität (%) O O- Na+ ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- O Na-Pyruvat O OH O α-Ketovaleriansäure O OH O 4-Methyl-α-ketovaleriansäure Tabelle 6: Untersuchte α-Ketosäuren. Die relative Aktivität der transP4H, cisP4H und cisP3H_I mit α-Ketoglutarat wurde jeweils auf 100% standardisiert. Für alle drei Prolinhydroxylasen ergab sich mit der α-Ketoadipinsäure, dem sechskettigen Analogon der α-Ketoglutarsäure, ein Umsatz von circa 1%. Für Oxalessigsäure, dem vierkettigen Analogon der α-Ketoglutarsäure, konnte nur mit der transP4 ein geringer Umsatz zu trans-4-Hydroxyprolin von unter 1% nachgewiesen werden. Für die cisP4H und cisP3H_I konnte hierbei kein entstandenes Hydroxyprolin detektiert werden. Für alle drei untersuchten α-Ketomonocarbonsäuren konnte bei allen drei Enzymen keine Aktivität festgestellt werden. 42 SPEZIELLER TEIL 3.4.2. Prolinanaloga Von Shibasaki et al. wurde für die transP4H, cisP3H_I und cisP3H_II gezeigt, dass sie in der Lage sind, neben dem physiologischen Substrat L-Prolin selektiv zu hydroxylieren, wohingegen die jeweiligen noch weitere D-Prolinanaloga L-Prolinanaloga nicht als Substrate akzeptiert wurden (siehe Tabelle 1).[84] Eine Hydroxylaseaktivität konnte dabei für das Sechsring-Analogon des L-Prolins, die L-Pipecolinsäure, sowie das 3,4-Dehydro-L-prolin mit allen drei Enzymen nachgewiesen werden. Für das Vierring-Analogon, die L-Azetidin-2carbonsäure wurde nur mit den beiden cis-3-selektiven Enzymen ein neues Produkt gefunden. Die cisP4H wurde hingegen bisher nur mit charakterisiert.[70] Es sollen daher L-Prolin zunächst die Ergebnisse von Shibasaki et al. mit den bekannten Substraten reproduziert und anschließend die Testung auf die cisP4H erweitert werden. 3.4.2.1. L-Pipecolinsäure Die Umsetzung von L-Pipecolinsäure durch die transP4H, cisP4H und cisP3H_I wurde in vitro im semi-präparativem Maßstab (8 mg, 1 mM) durchgeführt. Im HPLC-Chromatogramm konnte für alle drei Prolinhydroxylasen ein (transP4H, cisP3H_I) beziehungsweise zwei (cisP4H) hydroxylierte Produkte gefunden werden (Abb. 42). FMOC-Addukte HO LU OH 400 200 O 19.160 a) transP4H 300 trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure 100 0 0 OH HO LU 400 b) cisP4H cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure + cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure 200 100 OH OH N H O 24.522 300 21.202 N H O 0 0 OH LU 400 c) cisP3H_I 300 OH cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure 200 24.691 Fluoreszenz Intensität (Lu) N H 100 O 1 0 . 0 7 0 0 N H 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 42: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. a) transP4H b) cisP4H c) cisP3H_I. 43 SPEZIELLER TEIL Die in vitro Umsetzung von transP4H mit L-Pipecolinsäure ergab einen Produktumsatz von 68%. Durch NMR Spektroskopie konnte das Produkt als die in der Literatur beschriebene trans-5-Hydroxypipecolinsäure identifiziert werden (Abb. 43).[84] Aufgrund der L-Konfiguration des Eduktes wird davon ausgegangen, dass es sich um die trans-5-Hydroxy- L-pipecolinsäure handelt. H H H HO H H H H OH H N O H Abb. 43: 1H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit transP4H. Lösungsmittel: MeOD (400MHz). Bei der Umsetzung von cisP3H_I konnte nur ein Produktumsatz von 17% erreicht werden. Das Produkt wurde 1 durch H-1H-COSY-NMR Spektroskopie als die cis-3- Hydroxypipecolinsäure identifiziert, die auch in der Literatur als Produkt dieser enzymatischen Reaktion angegeben wird.[84] Die Kopplungskonstante zwischen H-2 und H-3 betrug <3 Hz, was in guter Übereinstimmung mit dem cis-Produkt ist (7.1 Hz für das entsprechende trans-Produkt (Abb. 44).[99,100] Aufgrund der L-Konfiguration des Eduktes wird davon ausgegangen, dass es sich um die cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure handelt. H OH H H H H H H N H OH H-3 H J <3 Hz O H-2 H-3 H-2 Abb. 44: Kopplung der H-2 und H-3 Wasserstoffatome der cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure im 1 H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit cisP3H_I. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). 44 SPEZIELLER TEIL Mit cisP4H ergab sich ein Gesamtproduktumsatz der L-Pipecolinsäure von insgesamt 66%. Der relative Umsatz der cisP4H mit der L-Pipecolinsäure betrug 55% verglichen mit dem Umsatz, der in vitro unter den gleichen Bedingungen für L-Prolin gefunden wurde. Im HPLC Chromatogramm und im 1H-NMR Spektrum zeigten sich zwei Produkte in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 (Abb. 42, Abb. 45). 4.22 ppm H OH H H 3.24 ppm 3.37 ppm H H H OH H N H H O 3.94 ppm H OH 4.58 ppm H H H 3.04 ppm 3.46 ppm H H H N H OH H O 4.07 ppm Abb. 45: 1H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit cisP4H. oben: Signale im 1H-NMR-Spektrum, die zur cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure gehören, unten: Signale im 1H-NMR-Spektrum, die zur cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure gehören. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). Dies ist in so fern überraschend, da bei allen bis jetzt berichteten Reaktionen der Prolinhydroxylasen nur ein einziges Produkt nachgewiesen werden konnte.[65,66,69,70,84,86] Durch 1H-1H-COSY-NMR Spektroskopie wurden die beiden Produkte als die an der Position 3- und 5- substituierte Pipecolinsäuren identifiziert (Abb. 46). 45 SPEZIELLER TEIL Abb. 46: 1H-1H-COSY-NMR Spektrum (oben) und HSQC-NMR Spektrum (unten) der enzymatischen in vitro Umsetung von L-Pipecolinsäure mit cisP4H. Lösungsmittel: D2O (1H NMR: 400 MHz, 13C NMR: 100 MHz). Im HPLC Chromatogramm besitzt das eine Produkt die gleiche Retentionszeit wie die cis-3Hydroxypipecolinsäure und die Lage sowie die Kopplungskonstanten der H-2 und H-3 46 SPEZIELLER TEIL Wasserstoffatome im 1H-NMR Spektrum waren identisch. Die zweite Verbindung wurde im HPLC Chromatogramm etwa zwei Minuten später Hydroxypipecolinsäure. Die Kopplungskonstanten im Übereinstimmung den mit in der Literatur eluiert 1 als die trans-5- H-NMR Spektrum sind in angegeben Werten für die cis-5- Hydroxypipecolinsäure.[101] Daher kann für beide Produkte von der cis-Konfiguration ausgegangen werden, was mit der cis-Selektivität der cisP4H einhergeht. Aufgrund der L-Konfiguration des eingesetzten Edukts wird bei den beiden Produkten von der cis-3- beziehungsweise cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure ausgegangen. 3.4.2.2. L-Azetidin-2-carbonsäure Die Ansätze zur Testung der L-Azetidin-2-carbonsäure mit den Enzymen transP4H, cisP4H, cisP3H_I und cisP3H_II wurden im analytischen Maßstab durchgeführt. Wie auch in der Literatur beschrieben, konnte bei in vitro Umsetzungen mit transP4H kein neues Produkt gefunden werden (siehe Tabelle 1).[84] Mit der bisher nicht untersuchten cisP4H konnte ebenfalls kein Umsatz der L-Azetidin-2-carbonsäure festgestellt werden. Für cisP3H_I ist in der Literatur eine geringe Aktivität für die L-Azetidin-2-carbonsäure angegeben (siehe Tabelle 1).[84] Jedoch konnte trotz mehrmaliger Wiederholung des Ansatzes kein Produkt mit dem Enzym gefunden werden. Einzig mit cisP3H_II konnte ein neues Produkt im HPLC Chromatogramm detektiert werden (Abb. 47). Durch Massenspektrometrie wurde die Masse von 118 amu [M + 1]+ eines entsprechenden hydroxylierten Produktes nachgewiesen (Abb. 48). FMOC-Addukte 400 OH OH HN O 200 OH HN O 27.582 300 24.037 Fluoreszenz Intensität (Lu) LU 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 47: HPLC Chromatogramm der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Azetidin-2carbonsäure mit cisP3H_II nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 47 SPEZIELLER TEIL 72.1 2.0e5 1.9e5 + OH 1.8e5 HN 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 Intensität 1.3e5 1.2e5 1.1e5 + 1.0e5 9.0e4 N 8.0e4 OH + 7.0e4 6.0e4 + 54.1 5.0e4 OH 3.0e4 O 44.1 2.0e4 OH HN OH HN 4.0e4 + O 118.2 100.2 1.0e4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 m/z, amu Abb. 48: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Azetidin-2-carbonsäure mit cisP3H_II. Tandem-Massenspektrometrie des Molekülions + bei 118 amu [M + 1] . Bei präparativen in vivo Ansätzen in einem Hochzelldichtemedium (20 mg L-Azetidin-2carbonsäure, 2 mM, siehe unten) mit cisP3H_II wurde ein Umsatz von über 90% zu dem hydroxylierten Produkt erreicht. Nach der Isolierung über Ionentauscher (saurer Kationenund basischer Anionentauscher) wurde jedoch kein Produkt mehr im Eluat gefunden. Aufgrund der hohen Ringspannung des Vierringsystems der L-Azetidin-2-carbonsäure und des hydroxylierten Produktes, wurde dieses möglicherweise durch das stark saure (5 M Salzsäure) beziehungsweise stark basischen Milieu (2.5 M Natronlauge) während des Ionentauschprozesses zersetzt. Bei Isolierung mittels Kieselgel konnte keine Trennung des Produktes von Bestandteilen des Hochzelldichtemediums erreicht werden. Aufgrund der cis3-Selektivität des Enzyms und der eingesetzten L-Azetidin-2-carbonsäure kann jedoch die in der Literatur beschriebene cis-3-Hydroxy-L-azetidin-2-carbonsäure als Produkt der enzymatischen Umsetzung angenommen werden.[84] 3.4.2.3. 3,4-Dehydro-L-prolin Da nur wenige Milligramm 3,4-Dehydro-L-prolin als Substrat zur Verfügung standen, wurden alle Ansätze im analytischen Maßstab durchgeführt. Bei der Umsetzung mit der bisher noch nicht untersuchten cisP4H zeigte sich im HPLC Chromatogramm ein Produktpeak bei der gleichen Retentionszeit wie die Produkte aus der Umsetzung mit cisP3H_I und cisP3H_II. 48 SPEZIELLER TEIL Die relative Aktivität betrug 77% verglichen mit der Aktivität für L-Prolin. Bei transP4H zeigte sich ein hoher Produktpeak mit einer um circa eine Minute späteren Retentionszeit (Abb. 49). Im Massenspektrum wurde für alle Produkte eine Masse von 130 amu [M + 1]+ detektiert, die mit dem in der Literatur angegebenen 3,4-Epoxyprolin übereinstimmt (Abb. 50, am Beispiel des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von 3,4-Dehydro-Lprolin mit cisP4H).[84] Aufgrund der cis beziehungsweise trans-Selektivitäten der Enzyme und der L-Konfiguration des Eduktes wird eine entsprechende Konfiguration der Produkte angenommen. FMOC-Addukte cisP3H_II 400 OH 300 200 cis-3,4-Epoxy-L-prolin N H 19.273 O LU O 100 0 0 5 10 20 30 35 200 cis-3,4-Epoxy-L-prolin 100 N H O 25 30 35 min 20 25 30 35 min 20 25 30 35 min 25 30 35 23.900 OH 300 min 25 19.255 cisP3H_I 400 0 0 5 10 15 20 cisP4H 300 OH 200 cis-3,4-Epoxy-L-prolin 100 N H O 19.229 400 23.886 O LU 0 0 5 10 LU 15 O transP4H 400 300 200 OH trans-3,4-Epoxy-L-prolin 100 N H 20.111 Fluoreszenz Intensität (Lu) 15 O LU O 0 0 5 10 15 400 OH 300 N H Referenz 3,4-Dehydro-L-prolin 200 24.018 LU O 100 0 0 5 10 15 20 min Retentionszeit in min Abb. 49: HPLC-Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzungen von 3,4Dehydro-L-prolin mit transP4H, cisP4H, cisP3H_I und cisP3H_II nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 49 SPEZIELLER TEIL 84.1 1.4e6 1.3e6 + O 1.2e6 1.1e6 N 1.0e6 Intensität 9.0e5 8.0e5 7.0e5 O 6.0e5 + OH 5.0e5 N H 4.0e5 O 3.0e5 130.1 2.0e5 1.0e5 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 m/z, amu Abb. 50: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von 3,4-Dehydro-L-prolin mit cisP4H. Tandem-Massenspektrometrie des Molekülions bei 130 amu [M + 1]+. 3.4.3. Entwicklung eines in vivo Systems für die Produktion von hydroxylierten Prolinanaloga Bisher erfolgte die Testung von Prolinanaloga in vitro mit isolierten Prolinhydroxylasen. Wie auch für die Gewinnung der Hydroxyproline stellt die in vitro Umsetzung aufgrund der geringen spezifischen Aktivität der Prolinhydroxylasen auf lange Sicht keine Option für den Zugang zu den neuen Produkte im präparativen Maßstab dar (siehe in vivo Herstellung von Hydroxy-L-prolinen). Jedoch handelt es sich bei den Prolinanaloga anders als bei L-Prolin nicht um proteinogene Aminosäuren. Daher muss zunächst untersucht werden, ob diese ebenfalls von lebenden E. coli Zellen aufgenommen und nach der enzymatischen Reaktion im Cytoplasma wieder ins Medium abgegeben werden (siehe auch Abb. 38). Um die generelle Anwendbarkeit dieses Verfahrens zu testen, soll die L-Pipecolinsäure als Modellverbindung in vivo mit der transP4H umgesetzt werden. Da hierfür größere Mengen an L-Pipecolinsäure nötig sind, wurde diese zunächst kostengünstig in einer chemischen Einstufensynthese aus L-Lysin hergestellt (Abb. 51).[102] 50 SPEZIELLER TEIL O Na2[Fe(CN)5NO] H2N OH H2O, 60 °C, pH 9.5, 4 h 8% Ausbeute NH2 N H COOH Abb. 51: Reaktionsschema der Einstufensynthese von L-Pipecolinsäure.[102] Die Bedingungen für die in vivo Umsetzung der L-Pipecolinsäure wurden analog zu denen bei der Generierung der Hydroxyproline gewählt. Zu exponentiell wachsenden E. coli Kulturen in 100 mL Medium 5 wurden nach Induktion der Genexpression der transP4H 52 mg L-Pipecolinsäure (4 mM) und 14 mg FeSO4·7H2O (0.5 mM) gegeben. Nach drei Tagen wurden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und die Produkte aus dem Überstand über Ionentauscher (saurer Kationen- und basischer Anionentauscher) isoliert (Abb. 52). FMOC-Addukte LU HO OH N H 400 300 O 19.031 HO OH N H 200 O 16.066 Fluoreszenz Intensität (Lu) 500 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 52: HPLC Chromatogramm der in vivo Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. Es konnte durch die in vivo Umsetzung im Fermentationsmedium ein Umsatz von 78% (3.12 mM) zum Produkt und nach Isolierung über Ionentauschchromatographie eine Ausbeute von 61% (2.44 mM) an trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure erzielt werden (Bestimmung über HPLC Chromatographie) (Tabelle 7). Da jedoch von den E. coli Kulturen endogen produziertes L-Prolin ebenfalls durch die transP4H hydroxyliert wurde, findet sich auch trans-4-Hydroxy-L-prolin nach chromatographischer Aufarbeitung in der gleichen Fraktion wie die trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure. 51 SPEZIELLER TEIL Produktumsatz Isolierte Ausbeute HO OH N H 100 mL Medium OH E. coli transP4H N H O 78% 61% (= 35 mg) O Tabelle 7: Produktumsatz und isolierte Ausbeute der in vivo Umsetzung von L-Pipecolinsäure im Medium 5. Nachdem zunächst die generelle Möglichkeit der in vivo Umsetzung auch von Prolinanaloga gezeigt werden konnte, wurde durch weitere Verbesserungen der Fermentationsbedingungen die Produktausbeute der enzymatischen in vivo Reaktion erhöht. Durch Verwendung eines speziellen Hochzelldichtemediums wurde die Wachstumsphase der Kulturen in Schüttelkulturen verlängert und somit eine höhere Dichte an Zellen, die die Prolinhydroxylasen produzieren, erreicht. Als Hochzelldichtemedium (HZD-Medium) wurde ein von Horn et al. beschriebenes Minimalmedium, basierend auf Glycerol, Ammoniak und Spurenelementen, in leicht veränderter Zusammensetzung verwendet.[103] Als Modellsystem wurde wiederum die Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit der transP4H gewählt. Die Durchführung erfolgte analog wie bei der in vivo Umsetzung in Medium 5 (Abb. 53). H H H HO H H H H N H OH H O Abb. 53: 1H-NMR Spektrum der durch in vivo Umsetzung im HZD-Medium hergestellten trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure nach Isolierung über Ionentauscher. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). 52 SPEZIELLER TEIL Durch Verwendung des Hochzelldichtemediums war es möglich, die Genexpression der transP4H erst bei einer OD600 von 3 - 4 in den Schüttelkulturen zu induzieren. Wie auch im Medium 5 wurde kein oder nur ein geringer Produktverlust durch Metabolisierung in E. coli festgestellt, und die trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure konnte in ähnlichen Ausbeuten isoliert werden. Daher ist es möglich, auch kleine Mengen an Edukt (12 - 25 mg) einzusetzen und die Produkte nach Biotransformation wieder zu isolieren. So können auch solche Prolinanaloga, für die die Prolinhydroxylasen in vitro nur eine geringe Aktivität besitzen, erfolgreich im präparativen Maßstab hydroxyliert werden. Die Entstehung von Valin konnte im Hochzelldichtemedium vermieden werden beziehungsweise entstandenes Valin wurde wieder vollständig abgebaut. trans-4-Hydroxy-Lprolin wurde nur in ca. 1 / 3 der Ansätze gebildet und teilweise auch wieder abgebaut. Trotz zahlreicher Variationen der Reaktionsbedingungen (Tabelle 8) und genauer Reaktionskontrolle konnte die Ursache, warum in manchen Ansätzen endogenes Prolin hydroxyliert wird und in anderen wiederum so gut wie keins, nicht geklärt werden. OD600 bei der Induktion 1 - 2, 3 - 4, 6 - 7, 9 - 10, 11 - 12 IPTG Konzentration 0.1 mM, 0.4 mM, 1 mM, 2 mM Schüttelgeschwindigkeit 120 UpM, 140 UpM, 180 UpM Kolben 2-Schikanen, 3-Schikanen flach, 3-Schikanen tief Temperatur 24 °C, 28 °C Stopfen Cellulose, Schaumstoff Tabelle 8: Variationen der Reaktionsbedingungen der in vivo Umsetzung im HZD-Medium. 3.4.3.1. Hydroxy-L-proline Bisher wurde noch nicht untersucht, ob die Prolinhydroxylasen in der Lage sind, bereits hydroxyliertes L-Prolin als Substrat zu verwenden und eine zweite Hydroxygruppe einzubringen. Als Substrate wurden hierfür alle Regio- und Stereoisomere der Hydroxy-Lproline untersucht (siehe Abb. 21). 53 SPEZIELLER TEIL Die Testung der Hydroxy-L-proline erfolgte mit den vier Prolinhydroxylasen transP4H, cisP4H, cisP3H_I und cisP3H_II in vitro im analytischen Maßstab. Einzig bei der Umsetzung von trans-3-Hydroxy-L-prolin mit der transP4H wurde im HPLC Chromatogramm ein neuer Peak bei einer kürzeren Retentionszeit als dem eingesetzten Substrat gefunden (Abb. 54). Die relative Aktivität betrug 16% verglichen mit der in vitro Aktivität für L-Prolin. 400 HO 300 OH OH OH OH N H 200 N H O 100 O 23.167 17.895 Fluoreszenz Intensität (Lu) FMOC-Addukte LU 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 54: HPLC Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von trans-3-Hydroxy-L-prolin mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. Im Massenspektrum wurde ein Molekülpeak von 148 amu [M + 1]+ für das neue Produkt gefunden, was einer dihydroxylierten Verbindung entspricht. Für die Aufklärung der Struktur wurde das Produkt in vivo nach dem oben beschriebenen Verfahren (100 mL HZD-Medium, Induktion der Schüttelkulturen bei OD600 = 3 - 4) hergestellt. Es wurden insgesamt 26 mg (= 2 mM in 100 ml HZD-Medium) trans-3-HydroxyL-prolin in vivo durch die transP4H vollständig umgesetzt und anschließend über Ionenaustauscher mit einer Ausbeute >90% isoliert (Abb. 55). HO OH OH N H O Abb. 55: 1H-NMR Spektrum des in vivo produzierten trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin mit transP4H nach Isolierung über Ionentauscher. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). 54 SPEZIELLER TEIL Aufgrund der Ergebnisse der NMR-Spektroskopie, der L-Konfiguration des eingesetzten Edukts und der trans-4-Selektivität der eingesetzten Prolinhydroxylase wird angenommen, dass es sich bei dem Produkt um das trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin handelt. Da trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin sowie trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure und cis-3Hydroxy-L-prolin nicht kommerziell erhältlich sind und als hydroxylierte Prolinanaloga möglicherweise als chirale Katalysatoren genutzt werden können, wurden in einer Kooperation mit Lo´ay Al-Momani die drei Verbindungen enzymatisch mit den entsprechenden Prolinhydroxylasen hergestellt.[73,74] Bei der Untersuchung der Verbindungen in der chiralen Katalyse (Aldol Addition, Michael Addition und Mannich Reaktion, Abb. 56) konnte jedoch kein besserer Enantiomerenüberschuss als mit den schon in der Literatur bekannten Verbindungen erreicht werden.[104] O NH2 O O H 35 mol % Katalysator O HN + + DMSO/Aceton (4:1), RT O2N O NO2 O O O O + O O O 1 - 4 Äq. Piperidin, RT O + O2N O O 20 mol % Katalysator O H O O OH 20 mol % Katalysator DMSO/Aceton (4:1), RT NO2 Abb. 56: Allgemeine Reaktionsschema der Mannich Reaktion (oben), Michael Addition (mitte) und Aldol Addition (unten) mit hydroxylierten Prolinanaloga als Katalysator. Die Synthesearbeiten wurden von Lo´ay Al-Momani durchgeführt.[104] 55 SPEZIELLER TEIL 3.4.3.2. trans-3-Methyl-L-prolin Das Beispiel der Umsetzung von trans-3-Hydroxy-L-prolin mit der transP4H zeigte, dass auch Prolinanaloga mit einem Substituenten am Ringgerüst von den Prolinhydroxylasen umgesetzt werden können. Daher wurde das kommerziell erhältliche trans-3-Methyl-L-prolin als Substrat getestet. transP4H Bei der analytischen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit transP4H zeigte sich im HPLC Chromatogramm ein neuer Peak (Abb. 57). Die relative Aktivität betrug 77% verglichen mit der in vitro Aktivität der transP4H für L-Prolin. FMOC-Addukte LU 500 HO CH3 400 CH3 OH 300 N H O O 29.150 200 OH N H 19.832 Fluoreszenz Intensität (Lu) 600 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min Retentionszeit in min Abb. 57: HPLC Chromatogramm der enzymatischen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-Lprolin mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. Durch vollständige semi-präparative in vitro Umsetzung (8 mg, 1 mM) und anschließender Isolierung über Ionentauscher konnte mittels NMR-Spektroskopie das Produkt als an der Position 4 substituiertes trans-3-Methylprolin identifiziert werden (Abb. 58). Aufgrund der trans-4-Selektivität der Prolinhydroxylase und der L-Konfiguration des eingesetzten Edukts kann angenommen werden, dass es sich bei dem Produkt um trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3methyl-L-prolin handelt. 56 SPEZIELLER TEIL HO CH3 OH N H O Abb. 58: 1H-NMR Spektrum des trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3-methyl-L-prolin nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen semi-präparativen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit transP4H. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). cisP3H_II und cisP4H Umsetzungen von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP4H und cisP3H_II zeigten im HPLCChromatogramm einen Produktpeak bei gleicher Retentionszeit (Abb. 59). Die relativen Aktivitäten betrugen 7% für die cisP3H_II und 112%2 für die cisP4H verglichen mit den entsprechenden Aktivitäten für L-Prolin. 2 mit 112% ist die 1,12-fache Aktivität gegenüber der Umsetzung mt L-Prolin gemeint. 57 SPEZIELLER TEIL FMOC-Addukte LU CH3 500 300 O OH O 25.342 N H 200 29.076 N H CH3 HO 100 0 0 5 10 15 20 25 LU 30 35 min 30 35 min CH3 OH 500 HO Enzym: cisP4H 400 CH3 N H O N H O 200 100 29.178 OH 300 25.497 Fluoreszenz Intensität (Lu) OH Enzym: cisP3H_II 400 0 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit in min Abb. 59: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-Lprolin mit cisP3H_II (oben) und cisP4H (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. Um die Struktur der Verbindungen aus der Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II und cisP4H aufzuklären, wurden jeweils 26 mg (= 2 mM) trans-3-Methyl-L-prolin in vivo in 100 mL HZD-Medium mit den Enzymen cisP3H_II und cisP4H vollständig umgesetzt. Nach Isolierung der Produkte aus dem Medium über Ionentauscher wurden die Produkte mittels NMR-Spektroskopie untersucht (Abb. 60, Abb. 61, Abb. 62). HO CH3 OH N H O Abb. 60: 1H-NMR Spektrum des cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen in vivo Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II. Lösungsmittel: D2O (400 MHz). 58 SPEZIELLER TEIL HO CH3 OH N H O Abb. 61: 1H-NMR Spektrum (oben), 1H-1H-COSY-NMR Spektrum (mitte) und HSQC-NMR Spektrum (unten) des cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen in vivo Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP4H. Lösungsmittel: D2O (1H-NMR: 400 MHz, 13C-NMR: 100 MHz). 59 SPEZIELLER TEIL Abb. 62: Vergleich der 13C-NMR Spektren der Produkte aus der in vivo Umsetzung von trans-3Methyl-L-prolin mit cisP3H_II (rot) und cisP4H (blau). Lösungsmittel: D2O (100 MHz). Die NMR Spektren bestätigten die Vermutung aus den HPLC Chromatogrammen, dass es sich bei den beiden Produkten um ein und denselben tertiären Alkohol handelt. Aufgrund des eingesetzten Edukts (trans-3-Methyl-L-prolin) und der cis-Selektivität der beiden Enzyme, wird angenommen, dass es sich bei dem Produkt um das cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-Lprolin handelt. Dass die cisP4H das gleiche Produkt bildet wie die cisP3H_II unterstreicht eine Tendenz, die bereits bei der Umsetzung mit der L-Pipecolinsäure zu beobachten war, bei der die cisP4H zu etwa 50% die cis-3-Hydroxypipecolinsäure als Produkt lieferte. (siehe Abschnitt 3.4.2.1., L-Pipecolinsäure). 3.4.3.3. alpha-Methyl-L-prolin Bei der in vitro Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit transP4H und cisP3H_II konnte im HPLC Chromatogramm jeweils ein neuer Peak beobachtet werden (Abb. 63). Die relative Aktivität bei der Umsetzung mit transP4H betrug 16%, die von cisP3H_II <3% verglichen mit der jeweiligen in vitro Aktivität für L-Prolin. 60 SPEZIELLER TEIL FMOC-Addukte transP4H 500 N H HO 400 O CH3 OH N H O 200 24.506 300 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min 35 min LU CH3 OH cisP3H_II 500 N H 400 O 300 200 N H 100 30.713 OH CH3 OH 27.282 Fluoreszenz Intensität CH3 OH 30.785 LU O 0 0 5 10 15 20 25 30 Retentionszeit in min Abb. 63: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit transP4H (oben) und cisP3H_II (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. Für die Aufklärung der Struktur der neuen Verbindung aus der Umsetzung mit transP4H wurde das Produkt in vivo hergestellt. Es wurden insgesamt 26 mg (= 2 mM) α-Methyl-Lprolin in 100 ml HZD-Medium eingesetzt (Abb. 64). HO Kopplungspartner des Signals bei 4.55 ppm N H CH3 OH O 1H-NMR Abb. 64: 1H-NMR Spektrum der in vivo Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit transP4H (unten) nach Isolierung über Ionentauscher sowie Kopplungspartner des Signals des 4-Hydroxy-α-methyl-L-prolin bei 4.55 ppm in einem TOCSY-Experiment (oben). Lösungsmittel: D2O (400 MHz). Da kein vollständiger Umsatz erreicht wurde, sind im 1H-NMR Signale des α-Methyl-Lprolins (Edukt) und des 4-Hydroxy-α-methyl-L-prolin (Produkt) zu sehen. 61 SPEZIELLER TEIL Bei der enzymatischen in vivo Umsetzung des α-Methyl-L-prolins mit transP4H konnte trotz mehrmaliger Wiederholung des Versuchs nur ein Gesamtumsatz von maximal 40% erreicht werden. Anhand der Kopplungspartner und Kopplungskonstanten im 1H-NMR-Spektrum, konnte die neue Verbindung als 4-Hydroxy-α-methylprolin identifiziert werden. Infolge der trans-4-Selektivität der Prolinhydroxylase und der L-Konfiguration des eingesetzten Edukts kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem Produkt um das trans-4-Hydroxy-αmethyl-L-prolin handelt. Aufgrund der sehr geringen Aktivität von cisP3H_II bei der Umsetzung von α-Methyl-Lprolin konnte ein hydroxyliertes α-Methylprolin nur massenspektrometrisch anhand der Masse von 146 amu [M + 1]+ bestimmt werden (Abb. 65). 100.1 3.8e6 OH 3.6e6 + 3.4e6 3.2e6 N 3.0e6 CH3 2.8e6 2.6e6 Intensität 2.4e6 2.2e6 2.0e6 + 1.8e6 OH 1.6e6 1.4e6 CH3 N 1.2e6 N H 82.0 1.0e6 8.0e5 + CH3 OH O 146.1 6.0e5 4.0e5 2.0e5 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 m/z, amu Abb. 65: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II. Tandem-Massenspektrometrie des Molekülions bei 146 amu [M + 1]+. Aufgrund der cis-3-Selektivität und der L-Konfiguration des eingesetzten Edukts ist zu vermuten, dass es sich bei dem Produkt um das cis-3-Hydroxy-α-methyl-L-prolin handelt. 62 SPEZIELLER TEIL 3.4.4. Weitere untersuchte Substrate Neben den bis hierhin untersuchten Substraten wurden die in Tabelle 9 angegebenen Substrate ebenfalls mit allen vier Prolinhydroxylasen in analytischen in vitro Ansätzen getestet. S OH O N H N H O 5-Oxo-L-prolin O N H HN OH OH H3C O N H 4-Thio-L-prolin CH3 O Ectoin OH N H O L-Prolinmethylester L-Prolinol Tabelle 9: weitere Prolinanaloga für die Substattestung. Es konnte jedoch bei keinem dieser Substrate durch HPLC und Massenspektroskopie ein Umsatz zu einem hydroxylierten Produkt nachgewiesen werden. Desweiteren wurden die in Tabelle 10 aufgelisteten Verbindungen durch chemische Synthese nach dem in Abb. 66 angegeben Reaktionsschema hergestellt und mit transP4H und cisP3H_II in analytischen in vitro Ansätzen getestet.[105-107] N3 Cl OH N H O cis-4-Chlor-L-prolin OH N H O cis-4-Azid-L-prolin Tabelle 10: synthetisierte Verbindungen. 63 SPEZIELLER TEIL N3 N3 NaOH OH N H N3 O MeOH, 16 h, RT N H O TFA O CCl2H2, 6 h, 0 °C N 84% O O O O O NaN3 DMF, 16 h, 55 °C 79% CH3 S O O O N O O Pyridin, 18 h, 0 ° O RT S 73% HO Cl OH N H O O S HO O N H Boc2O O Dioxan, 18 h, RT N 22% O O O 18 h, RT 46% OH N H O NaOH MeOH, 16 h, RT O CCl2H2 CCl4 Cl Cl Cl O O HO Cl EtOH, 4 h, RF >98% Cl H3C O N H O TFA CCl2H2, 6 h, 0 °C N >98% O O O O Abb. 66: Reaktionsschema der Synthese von cis-4-Chlor- und cis-4-Azid-L-prolin. Jedoch konnte durch HPLC und Massenspektroskopie bei keiner in vitro Umsetzung der beiden Prolinhydroxylasen ein neues, hydroxyliertes Produkt gefunden werden. Syntheseansätze zur Generierung von trans-3-Chlor- und trans-3-Azid-L-prolin (unter den gleichen Bedingungen wie bei der Synthese von cis-4-Chlor- und cis-4-Azid-L-prolin) (Abb. 67), ausgehend von dem durch das in vivo Verfahren selbst hergestellten cis-3Hydroxy-L-prolin, lieferten trotz Wiederholung bis dato kein Produkt für die Substrattestung. Da nach dem letzten Syntheseschritt nur das eingesetzte Edukt, das cis-3-Hydroxy-L-prolin, wieder isoliert wurde, scheint die cis-3-Position unter den eingesetzten Reaktionsbedingungen für eine nucleophile Substitution zu stark abgeschirmt zu sein. 64 SPEZIELLER TEIL N3 N3 N3 O O OH N H N N H O O O O Pyridin, 18 h, 0 ° O RT NaN3 DMF O O S O CH3 O N O O Pyridin, 18 h, 0 ° 79% OH Cl OH N H O S RT S O OH O N H Cl H3C O OH Cl EtOH, 4 h, RF >95% O O Boc2O O Dioxan, 18 h, RT N 72% O O O O CCl2H2 18 h, RT Cl Cl Cl O OH N H O CCl4 N H O N O O O O Abb. 67: Reaktionsschema der Synthese von trans-3-Chlor- und trans-3-Azid-L-prolin. 65 SPEZIELLER TEIL 3.5. Gerichtete Mutagenese Die Isoenzyme cisP3H_I und cisP3H_II (aus Streptomyces sp. TH1) sind zu 76% in der Aminosäuresequenz identisch und besitzen wiederum eine Identität der Aminosäuren von 31% beziehungsweise 32% zu der cisP4H. Alle drei cis-selektiven Prolinhydroxylasen besitzen jedoch nur eine sehr geringe Identität der Aminosäuren von 13% beziehungsweise 14% zu der trans-selektiven transP4H (Abb. 68, Abb. 69). Die transP4H besitzt darüber hinaus eine Sequenzidentität auf Aminosäureebene von 31% zu der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Ectoinhydroxylase EctD aus Virgibacillus salexigens (GenBank No. AAY29689) und von 15% zu der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Halogenase (Chlorinase) SyrB2 aus Pseudomonas syringae pv. syringae (GenBank No. AAD50521).[108-110] Jedoch stellt Ectoin und Chlorid kein Substrat für die transP4H da (siehe 3.4.4. Weitere untersuchte Substrate).[111] transP4H His109-Asp111-His215 14% cisP3H_I 14% 76% cisP3H_II His107-Asp109-His158 His107-Asp109-His158 13% 31% 32% cisP4H His106-Asp108-His154* Abb. 68: Identitäten der Aminosäuren und Positionen der katalytischen Triade der Prolinhydroxyasen.[31,70,112] *Die Position His154 wurde durch Sequenzvergleich ermittelt. 66 SPEZIELLER TEIL cisP3H_I MRSHILGRIELDQERLGRDLEYLATVPTVEEEYDEFSNGFWKNIPLYNASGGSEDRLYRD 60 cisP3H_II MRSHILGKIELDQTRLAPDLAYLAAVPTVEEEYDEFSNGFWKHVPLWNASGDSEDRLYRD 60 cisP4H MSTHFLGKVKFDEARLAEDLSTLEVA-EFSSAYSDFACGKWEACVLRNRTGMQEEDIVVS 59 transP4H ----MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREVDC------LRRAAAALYAQDSPDRTLEKD 50 :* ::.: * . * . . . : : . cisP3H_I LEGSPAQPTKHAEQVPYLNEIITTVYNGERLQMARTRNLKN-AVVIPHRDFVELDRELDQ 119 cisP3H_II LKDAAAQPTAHVEHVPYLKEIVTTVFDGTHLQMARSRNLKN-AIVIPHRDFVELDREVDR 119 cisP4H HN-APALATPLSKSLPYLNELVETHFDCSAVRYTRIVRVSENACIIPHSDYLELD---ET 115 transP4H GRTVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSG---------DVYVHQFKINAKAPM 101 . * . . : . :: : . .::: cisP3H_I YFRTHLMLEDSPLAFHSDDDTVIHMRAGEIWFLDAAAVHSAVNFAEFSRQSLCVDLAFDG 179 cisP3H_II YFRTFMVLEDSPLAFHSNEDTVIHMRPGEIWFLDAATVHSAVNFSEISRQSLCVDFAFDG 179 cisP4H FTRLHLVLDTNSGCANTEEDKIFHMGLGEIWFLDAMLPHSAACFSKTPRLHLMIDFEAT- 174 transP4H TGDVWPWHQDYIFWAREDGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPLLFVPGTHELGLIDVERR- 160 : . : *: : : :* :.. * .: :*. cisP3H_I AFDEKEAFADATVYAPNLSPDVRERKPFTKEREAGILALSGVIGRENFR-DILFLLSKVH 238 cisP3H_II PFDEKEIFADATLYAPGSTPDLPERRPFTAEHRRRILSLGQVIERENFR-DILFLLSKVH 238 cisP4H --AFPESFLRNVEQPVTTRDMVDPRKELTDEVIEGILGFSIIISEANYR-EIVSILAKLH 231 transP4H ----APAGDGDAQWLPQLSADLD--YAIDADLLARLTAGRGIESATGPAGSILLFDSRIV 214 . : : : : . : . .*: : ::: cisP3H_I YTYDVHPGETFEWLVSVSKGAGDDKMVEKAERIRDFAIGARA-----LGERFSLTTW- 290 cisP3H_II YKYDVHPSETYDWLIEISKQAGDEKMVVKAEQIRDFAVEARA-----LSERFSLTSW- 290 cisP4H FFYKADCRSMYDWLKEICKRRGDPALIEKTASLERFFLGHRE-----RGEVMTY---- 280 transP4H HGSGTNMSPHPRGVVLVTYNRTDNALPAQAAPRPEFLAARDATPLVPLPAGFALAQPV 272 . .. : : * : :: * :: Abb. 69: Aminosäuresequenzvergleich aller vier Prolinhydroxylasen.[113] Das Zeichen “*“ steht für identische Aminosäuren, das Zeichen “:“ markiert hoch konservierte Bereiche, das Zeichen “.“ zeigt ungleiche aber ähnliche Aminosäuren an. 67 SPEZIELLER TEIL 3.5.1. Mutagenese in der Nähe der katalytischen Triade Da außer für die cisP3H_II keine Kristallstruktur der Prolinhydroxylasen existiert und bis jetzt keine Mutageneseexperimente für diese Enzyme in der Literatur beschrieben sind, gibt es keine konkreten Anhaltspunkte für eine gerichtete Mutagenesestrategie, um eine andere Regio- beziehungsweise Stereoselektivität der Prolinhydroxylasen zu erzielen. Wie bei der Testung der Prolinanaloga (3.4.2.1. L-Pipecolinsäure) gezeigt, kann die enzymatische Umsetzung von Verbindungen mit den cisP3Hs und cisP4H zu ein und demselben Produkt führen. Die katalytische Verwandtschaft zeigt sich auch in der Aminosäure-Identität von 31% beziehungsweise 32% zwischen diesen cis-selektiven Enzymen (Abb. 68). Darüber hinaus befinden sich die ersten beiden Aminosäuren des katalytischen His-X-Asp/Glu-Xn-His Motivs an ähnlichen Positionen in der Peptidkette (His107-Asp109 bei den cisP3Hs und His106-Asp108 bei der cisP4H; siehe Abb. 68). Daher wurde untersucht, ob durch Austausch, Einbringen oder Deletieren einer Aminosäure unmittelbar vor dem aktiven Zentrum die Regioselektivität verändert werden kann (Abb. 70). In gleicher Weise wurde auch bei der transP4H ein Glycin (V105_W106insG) vor dem aktiven Zentrum eingebracht sowie in einer zweiten Mutante Glutamin, das sich zwischen den ersten beiden Aminosäuren der katalytischen Triade (His-X-Asp) befindet, gegen ein basisches Arginin (Q110R) ausgetauscht (Abb. 70). transP4H native Sequenz 105 110 mutierte Sequenz 115 105 110 115 V W P W H Q D Y I F W V W P W H R D Y I F W (Q110R) 105 105 110 115 V W P W H Q D Y I F W 110 115 V G W P W H Q D Y I F W (V105_W106insG) cisP3H_I native Sequenz 105 110 I V I P H R D F V E L mutierte Sequenz 105 110 I _ I P H S D F V E L (V104del,R108S) 105 110 (C I I P H S D Y L E L cisP4H) 68 SPEZIELLER TEIL cisP4H native Sequenz 105 mutierte Sequenz 110 A C I I P H S D Y L E L 105 110 A C I V I P H R D Y L E L (I103_I104insV,S107R) 105 110 (A I V I P H R D F V E L cisP3H_I) Abb. 70: Gerichtete Mutagenese der transP4H, cisP3H_I und cisP4H. Die Aminosäuren der katalytischen Triade sind blau hinterlegt, die Mutationen in roter Schrift. Die gerichtete Muatgenese wurde mittels Quick-Change PCR und den entsprechenden Primern durchgeführt. Nachdem die Mutation auf den Gensequenzen der Prolinhydroxylasen durch Sequenzierung bestätigt wurde, erfolgte die Transformation in den Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) CodonPlus RP/pL1SL2. Zum Vergleich der Aktivitäten wurden die nativen Prolinhydroxylasen ebenfalls produziert. Die Umsetzung mit L-Prolin als Substrat erfolgte im analytischen Maßstab. transP4H Bei der Produktion der beiden Enzymvarianten der transP4H wurden ähnliche Proteinmengen erhalten wie bei der Produktion der nativen transP4H (Abb. 71). Mit beiden Varianten wurde ein um circa 70% (Variante Q110R) beziehungsweise circa 95% (Variante V105_W106insG) geringerer Umsatz des L-Prolins zu trans-4-Hydroxyprolin als mit dem nativen Enzym erreicht (Abb. 72). Die Regio- und Stereoselektivität der Varianten blieb gegenüber der nativen transP4H unverändert. 69 SPEZIELLER TEIL native transP4H Variante Q110R Pellet Pellet Lysat Lysat Entsalzt Variante V105_W106insG Entsalzt Pellet Lysat Entsalzt MW [kD] 200 119 66 43 29 20 14 Abb. 71: SDS-PAGE der Produktion von nativer transP4H, von VarianteQ110R sowie von VarianteV105_W106insG. Die Banden von transP4H beziehungsweise den Varianten sind mit einem roten Pfeil markiert, die Banden der Chaperone mit einem grünen Pfeil. OH N H O O 100 0 0 5 10 15 10 15 20 25 30 35 min 35 min 35 min LU 400 30.209 Variante Q110R 300 20.225 Fluoreszenz Intensität (Lu) OH N H 200 30.185 HO native transP4H 300 20.476 LU 400 200 100 0 0 5 20 25 30 LU 400 30.206 Variante V105_W106insG 300 20.381 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 Retentionszeit in min Abb. 72: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin mit transP4H und den beiden Varianten nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 70 SPEZIELLER TEIL cisP3H_I und cisP4H Bei der Produktion der Varianten von cisP3H_I und cisP4H wurde jeweils eine geringere Menge an Protein erhalten als bei der Produktion der nativen Enzyme (Abb. 73). native cisP3H_I Pellet Lysat Variante V104del,R108S Entsalzt Pellet Lysat Entsalzt MW [kD] 200 119 66 43 29 20 native cisP4H Pellet Lysat Variante I103_I104insV,S107R Entsalzt Pellet Lysat Entsalzt MW [kD] 200 119 66 43 29 20 Abb. 73: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_I und Variante V104del,R108S (oben) sowie von cisP4H und Variante I103_I104insV,S107R (unten). Die Banden von cisP3H_I, cisP4H und den Varianten sind mit einem orangen beziehungsweise lilanen Pfeil markiert, die Banden der Chaperone mit einem grünen Pfeil. 71 SPEZIELLER TEIL Bei der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin mit den jeweiligen Varianten wurde nur eine sehr geringe Konzentration an Hydroxyprolin erhalten. Hierbei konnte von den Hydroxyprolinen ausschließlich das gleiche Regio- und Stereoisomer gefunden werden, wie bei der Umsetzung mit den nativen Prolinhydroxylasen (Abb. 74). OH LU N H native cisP4H 30.225 400 OH N H 200 25.785 HO 300 O 100 0 0 5 10 15 20 25 20 25 30 35 min 35 min 35 min 35 min LU 400 Variante I103_I104insV,S107R 30.282 Fluoreszenz Intensität (Lu) O 300 200 25.892 100 0 0 5 10 15 30 Retentionszeit in min OH native cisP3H_I OH 27.313 OH 300 N H O 200 100 0 0 5 10 15 20 25 15 20 25 30 LU 30.222 Fluoreszenz Intensität (Lu) 400 O 30.265 N H LU 400 Variante V104del,R108S 300 200 27.258 100 0 0 5 10 30 Retentionszeit in min Abb. 74: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin mit cisP4H und Variante (oben) sowie cisP3H_I und Variante (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 72 SPEZIELLER TEIL 3.5.2. Mutagenese zur Änderung der Aktivitäten der Isoenzyme cisP3H_I und cisP3H_II Die beiden Isoenzyme cisP3H_I und cisP3H_II aus Streptomyces sp. TH1 besitzen eine Identität der Aminosäuren von 76% (siehe Abb. 68). In Bezug auf Prolin besitzen die beiden Enzyme eine ähnliche Aktivität.[86] Jedoch wurde das viergliedrige Ringanalogon, die LAzetidin-2-carbonsäure, nur von der cisP3H_II umgesetzt (siehe 3.4.2.2. L-Azetidin-2- carbonsäure). Von Clifton et al. wurde eine Kristallstruktur der cisP3H_II beschrieben.[114] Anhand dieser wurden neben der eisenbindenden Triade weitere Aminosäuren aus der Peptidkette identifiziert, die vermutlich an der enzymatischen Katalyse durch Bindung des α-Ketoglutarat (Arg168, Ser170 und His135) sowie des Carboxylat (Arg95, Arg97, Arg122 und His43) und der Imino-Gruppe (Glu30,Glu31,Glu32,Tyr33,Asp34,Glu35) des Prolins beteiligt sind (Abb. 75).[114] Asp34 Glu32 Tyr33 Glu30 Glu35 Glu31 His107 Arg168 His135 His158 Ser170 His43 Arg95 Arg122 Asp109 Asp97 Abb. 75: Aktives Zentrum der cisP3H_II (PDB:1E5S).[114,115] Die gelb eingefärbten Aminosäuren sind in der Kristallstruktur nicht aufgelöst. Das gezeigte Strukturfragment stammt aus einem Homologiemodell mit PDB:1E5S als Templat, das mit MODELLER 9.8 erstellt wurde. 73 SPEZIELLER TEIL Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von cisP3H_II und cisP3H_I zeigt, dass außer der Position 43 alle weiteren Aminosäuren, die an der enzymatischen Katalyse beteiligt sein könnten (siehe oben), bei den beiden Isoenzymen übereinstimmen (Abb. 76). 105 110 160 cisP3H_I V I P H R D F V E . . . V H S A V cisP3H_II V I P H R D F V E . . . V H S A V 135 165 170 cisP3H_I A F H S N . . .E I S R Q S L C cisP3H_II A F H S D . . .E F S R Q S L C 30 35 cisP3H_I V P T V E E E Y D E F S N cisP3H_II V P T V E E E Y D E F S N 40 45 95 120 cisP3H_I G F W K N I F L . . . M A R S R N . . . Y F R T F cisP3H_II G F W K H V F L . . . M A R T R N . . . Y F R T H Abb. 76: Vergleich der Aminosäuresequenzen von cisP3H_I und cisP3H_II mit den Aminosäuren (magenta und hellbraun), die vermutlich an der enzymatischen Katalyse beteiligt sind. Möglicherweise ist His43 für die erhöhte Aktivität der cisP3H_II gegenüber der L-Azetidin-2carbonsäure verantwortlich. Daher soll durch gerichtete Mutagenese in der Aminosäuresequenz der cisP3H_I Asn43 durch His ersetzt werden. Da sich auch an Position 44 die Aminosäuresequenzen unterscheiden, soll gleichzeitig auch hier ein Austausch durchgeführt werden. Umgekehrt werden bei der cisP3H_II His43 und Val44 durch Asn und Ile ersetzt (Abb. 77). 74 SPEZIELLER TEIL cisP3H_I cisP3H_II Asn43 Ile44 His43 Val44 Abb. 77: Aktives Zentrum der cisP3H und der cisP3H_II.[115,116] Nach Mutagenese mittel Quick-Change Technik wurden die Gensequenzen der Varianten sequenziert, in E. coli BL21(DE3) Codon Plus RP/pL1SL2 transformiert und exprimiert. Zum Vergleich der Aktivitäten wurden auch die nativen Prolinhydroxylasen neben den Varianten produziert (Abb. 78, Abb. 79). Die Testung von L-Azetidin-2-carbonsäure und L-Prolin als Substrate erfolgte im analytischen Maßstab. 75 SPEZIELLER TEIL native cisP3H_I Pellet Variante N43H,I44V Lysat Imidazol Entsalzt MW [kD] (200 mM) Pellet Lysat Imidazol Entsalzt (200 mM) 245 119 77 42 30 25,4 17 Abb. 78: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_I und Variante N43H,I44V. native cisP3H_II Pellet Lysat Variante H43N,V44I Imidazol Entsalzt MW [kD] Pellet (200 mM) 245 Lysat Imidazol Entsalzt (200 mM) 119 77 42 30 25,4 17 Abb. 79: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_II und Variante H43N,V44I. 76 SPEZIELLER TEIL Ergebnis cisP3H_I Bei der enzymatischen in vitro Testung von L-Prolin wurde mit der Variante der cisP3H_I ein geringerer Umsatz zu cis-3-Hydroxyprolin erreicht als mit der nativen cisP3H_I (73% mit der Variante gegenüber >95% mit der nativen cisP3H_I) (Abb. 80). Mit L-Azetidin-2-carbonsäure konnte weder mit der Variante noch mit dem nativen Enzym ein Umsatz zu einem hydroxylierten Produkt im HPLC Chromatogramm detektiert werden (Abb. 80). LU cisP3H_I 500 OH OH O N H 20 25 N H O 27.163 200 100 0 0 5 10 15 30 35 min 30 35 min 25 30 35 min 25 30 35 min LU Variante N43H,I44V 500 OH 400 OH OH N H 200 O N H O 27.146 300 23.095 Fluoreszenz Intensität (Lu) 300 23.083 OH 400 100 0 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit in min LU 500 cisP3H_I OH HN 300 O 21.148 200 100 0 0 5 10 15 20 LU 500 Variante N43H,I44V 400 OH HN O 300 21.246 Fluoreszenz Intensität (Lu) 400 200 100 0 0 5 10 15 20 Retentionszeit in min Abb. 80: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin (oben) und L-Azetidin-2-carbonsäure (unten) mit cisP3H_I und deren Variante nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 77 SPEZIELLER TEIL Ergebnis cisP3H_II Sowohl mit L-Prolin (55% mit der Variante gegenüber 31% mit der nativen cisP3H_II) als auch mit L-Azetidin-2-carbonsäure (23% mit der Variante gegenüber 8% mit der nativen cisP3H_II) wurde bei der enzymatischen in vitro Umsetzung durch die Variante der cisP3H_II ein höherer Umsatz zu cis-3-Hydroxyprolin beziehungsweise cis-3- Hydroxyazetidin-2-carbonsäure erreicht als mit der nativen cisP3H_II (Abb. 81). LU 500 cisP3H_II 400 OH 100 N H O 23.587 OH N H 200 O 19.367 Fluoreszenz Intensität (Lu) OH 300 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min 30 35 min LU OH 500 Variante H43N,V44I OH 400 N H OH O N H 200 O 23.594 19.361 300 100 0 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit in min LU 500 19.577 cisP3H_II OH HN OH 300 O OH HN 200 O 17.064 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 min 30 35 min LU 500 Variante H43N,V44I 400 OH 300 OH HN 19.751 Fluoreszenz Intensität (Lu) 400 OH HN O 200 17.236 O 100 0 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit in min Abb. 81: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin (oben) und L-Azetidin-2-carbonsäure (unten) mit cisP3H_II und dessen Variante nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. 78 SPEZIELLER TEIL Da bei den Varianten der cisP3H_I und cisP3H_II jeweils zwei Aminosäuren ausgetauscht wurden, muss durch weitere Untersuchungen noch geklärt werden, ob der Austausch von nur einer Aminosäure oder der gemeinsame Austausch von beiden Aminosäuren für die beobachtete Steigerung beziehungsweise Verminderung der Aktivität der Enzyme verantwortlich ist. 79 DISKUSSION UND AUSBLICK 4. Diskussion und Ausblick Zum ersten Mal wurden vier Eisen(II)/α-Ketoglutarat abängige Prolinhydroxylasen, die den Zugang zu drei von insgesamt vier möglichen Stereoisomeren des Hydroxyprolins erlauben, durch das gleiche Expressionssystem heterolog in E. coli produziert und durch einen HPLCAssay nebeneinander charakterisiert. Die drei Hydroxyproline wurden durch dasselbe Verfahren in vivo bis hin zum Gramm-Maßstab produziert und ohne großen Produktverlust (<10%) aus dem Kulturmedium isoliert. Durch Substrattestung wurden neue Hydroxylaseaktivitäten der Prolinhydroxylasen nachgewiesen und hydroxylierte Verbindungen stereoselektiv aufgebaut (Abb. 82). Durch in vivo Ganzzellbiotransformation wurde ein Weg aufgezeigt, mit dem fast alle hydroxylierten Produkte im präparativen Maßstab produziert und anschließend über zweistufige Ionentauschchromatographie isoliert werden können. Ein erheblicher Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass die aufwendige Reinigung der Enzyme entfällt, da die Substanzen von E. coli aufgenommen und nach der enzymatischen Reaktion ohne erkennbare Metabolisierung wieder ins Medium abgegeben werden. Ein Zusatz von Cosubstrat entfällt, da α-Ketoglutarat durch Metabolisierung von Glycerol im Citratzyklus in ausreichendem Maße für die enzymatische Reaktion zur Verfügung steht (siehe Abb. 38). HO OH OH N H cis re P3 l. H_ Ak ti v II itä t7 % O HO OH N H OH OH CH3 CH3 N H CH3 N H OH O transP4H N H O HO cisP3H_II cisP3H_II CH3 CH3 OH rel. Aktivität <3% O N H OH O O O OH N H OH CH3 tra ns Ak P4H t iv itä t7 7% CH3 O re l. transP4H HO rel. Aktivität 16% OH N H CH3 transP4H OH rel. Aktivität 16% N H O CH3 OH N H O cisP4H OH CH3 O OH N H O cisP4H OH N H OH N H O rel. Aktivität 77% HO H P4 2% 11 cis ät vit i t k l. A re N H O cis re P4 l. Ak H tiv itä t5 5% OH HO OH N H O + OH N H O 1 : O 1 OH N H O Abb. 82: Im Rahmen dieser Arbeit, in der Literatur bisher nicht beschriebene, Reaktionen der Prolinhydroxylasen. Die relativen Aktivitäten beziehen sich auf den in vitro Umsatz von L-Prolin 80 durch die Prolinhydroxylasen. DISKUSSION UND AUSBLICK Mit dem hier verwendeten Expressionssystem E. coli BL21(DE3) Codon Plus RP/pL1SL2 wurden alle vier Prolinhydroxylasen in hohen Ausbeuten (5 - 20 mg / L Kultur) produziert. Weitere Prolinhydroxylasen aus anderen Organismen, die bis dato noch nicht charakterisiert sind, lassen sich mit diesem Expressionssystem wahrscheinlich ebenfalls in löslicher Form erhalten. Das in dieser Arbeit etablierte HPLC-Verfahren erlaubt eine vergleichsweise schnelle, kostengünstige und eindeutige Identifizierung der Hydroxyproline nebeneinander im HPLC-Chromatogramm. Dadurch ist die Aktivität und Selektivität von noch nicht charakterisierten Prolinhydroxylasen auf einfachem Wege zu bestimmen. Es wurde gezeigt, dass auch nicht-physiologische Cosubstrate (α-Ketoadipinsäure) anstelle von α-Ketoglutarat von den hier untersuchten Prolinhydroxylasen verwendet werden. In der Literatur ist für die Deacetoxycephalosporin C Synthase (DAOCS), einer Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenase, die Änderung der Cosubstratselektivität durch gerichtete Mutagenese beschrieben.[117] Diese Ergebnisse sind möglicherweise auf die Prolinhydroxylasen zu übertragen, sodass hier ebenfalls eine neue Selektivität erreicht werden könnte. Bei der Substrattestung zeigte sich, dass die Prolinhydroxylasen in der Lage sind, Prolinanaloga mit Substitutionen am Ringgerüst umzusetzen. Insbesondere die in 3-Position trans-substituierten Verbindungen wie beispielsweise trans-3-Methyl-L-prolin werden mit guten Aktivitäten hydroxyliert. Jedoch sind nur wenige dieser ringsubstituierten Prolinderivate kommerziell erhältlich. Von Tobias Huber (Universität Freiburg) wurde die Synthese von cis-3-Fluorprolin, ausgehend von trans-3-Hydroxyprolin, gezeigt.[118] Die Darstellung von neuen, potentiellen Substraten kann ebenso ausgehend von dem durch in vivo Umsetzung produzierten cis-3- und cis-4-Hydroxyprolin durch nucleophile Substitution unter Inversion der Konfiguration erfolgen (siehe Abb. 67). Die durch Biotransformation der Prolinhydroxylasen produzierten Produkte sind wertvolle Ausgangssubstanzen für die Wirkstoffsynthese. Ein Beispiel hierfür ist das aus trans-3Hydroxy-L-prolin durch Katalyse mit transP4H gewonnene trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-Lprolin ((2S,3R,4S)-3,4-Dihydroxyprolin) (siehe Abb. 82). Es wurde gezeigt, dass mindestens 2 mM (= 26 mg in 100 mL HZD-Medium) des relativ kostengünstigen trans-3-Hydroxy-Lprolins3 vollständig in das dihydroxylierte Produkt umgesetzt werden. Für die chemische Synthese dieser Verbindung, ausgehend von 3 D-Gulonolacton, sind wenigstens 10 Schritte 1 g trans-3-Hydroxyprolin kosten €31.30 bei Acros Organics, Stand 06/2011. 81 DISKUSSION UND AUSBLICK notwendig.[119,120] trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin stellt die Grundstruktur für Inhibitoren der Glycosyltransferase Glucosylceramid-Synthase (GCS) dar, die ein Angriffspunkt für die Behandlung von Morbus Gaucher ist (Abb. 83).[121,122] HO OH OH transP4H OH N H OH E. coli N H O HO O HO OH OH H N H N N H O N O Abb. 83: transP4H katalysierte Produktion von trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin und Beispiele für Inhibitoren der Glycosyltransferase Glucosylceramid-Synthase.[121] Die Produktion der Verbindungen durch in vivo Ganzzellbiotransformation erfolgte in Schüttelkolben, in denen E. coli Kulturen eine optischen Dichte von ca. 20 erreichten. Für das verwendete Hochzelldichtemedium wurde gezeigt, dass in einem Fermenter optische Dichten von bis zu 500 möglich sind.[103] Daher ist prinzipiell die Produktion der Verbindungen noch erheblich zu steigern. Durch kontrollierte Fermenterbedingungen lässt sich ebenfalls die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöhen. Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Vermeidung von Valin und Hydroxyprolin bei der Umsetzung von Prolinanaloga wichtig, die aus unbekannten Gründen in machen Ansätzen gebildet wurden, da eine spätere präparative Trennung der Aminosäuren aufgrund ihrer ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften nur schwer zu erreichen ist. Aufgrund von fehlenden Informationen zur Orientierung des Substrates im aktiven Zentrum, orientierte sich die Generierung von Enzymvarianten in dieser Arbeit zumeist an konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum. Für die gezielte Mutagenese sollten daher die Prolinhydroxylasen kristallisiert werden (bisherige Kristallisationsversuche lieferten bis dato keine Kristalle), insbesondere wäre hierbei ein Komplex mit Substrat und Cofaktor wünschenswert. Informationen sind auch durch die Kristallisation von potentiellen Isoenzymen (bislang konnte nur für wenige Enzyme eine postulierte Prolinhydroxylaseaktivität auch experimentell nachgewiesen werden) der hier verwendeten Prolinhydroxylasen zu erhalten. 82 DISKUSSION UND AUSBLICK Zur Aufklärung der Reaktivität der Prolinhydroxylasen sind auch bioinformatische Methoden geeignet. Anhand von Dockingmodellen lassen sich potentielle Substrate identifizieren beziehungsweise ermöglichen es, gezielt Enzymvarianten zu generieren, die in der Lage sind, neue Substrate zu akzeptieren. So sind Enzymvarianten vorstellbar, die auch Verbindungen ohne das Motiv der sekundären Aminosäure, das für die Katalyse mit den Wildtypenzymen notwendig ist, umsetzen.[84] Denkbare Substrate wären dann zum Beispiel Cyclopentancarbonsäure oder Pyrrolidin. Die absolute Stereochemie der neuen, hydroxylierten Verbindungen wird infolge der L-Konfiguration der eingesetzten Substrate und den Selektivitäten der Prolinhydroxylasen angenommen. Eine Möglichkeit zur Strukturaufklärung bietet die Röntgenstrukturanalyse nach vorangegangener Kristallisation der Verbindungen mit einem Schwermetallatom. Eine Alternative hierzu stellt die Messung mit Vibrational Circular Dichroism (VCD), einer Kombination aus Circulardichroismus- und IR-Spektroskopie, dar. So wurde kürzlich von Lüdeke et al. mit einem Quantenkaskadenlaser als IR-Lichtquelle die Unterscheidung der L- und D-Form des Prolins in Wasser mit dieser spektroskopischen Methode gezeigt.[123] Elektronenspin-Resonanz (EPR) Methoden bieten die Möglichkeit, das aktive Zentrum der Prolinhydroxylasen und Reaktionsintermediate zu charakterisieren und die für die Stereoselektivität verantwortlichen Aminosäuren zu identifizieren. Die EPR-Spektroskopie wird primär zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des EisenZentrums genutzt werden. Bei ersten Messungen mit unterschiedlichen Prolinhydroxylasen (transP4H und cisP4H) durch die Arbeitsgruppe von Erik Schleicher (Universität Freiburg) wurden kleine Signalunterschiede in den Spektren festgestellt, die auf eine unterschiedliche chemischen Umgebung des Cofaktors beziehungsweise Bindung/Koordination an Sauerstoff hindeuten. Diese Differenzen in den Messungen korrelieren möglicherweise mit den verschiedenen Regio- und Stereoselektivitäten der Prolinhydroxylasen.[124] In mechanistischer Hinsicht sollte die EPR-Spektroskopie im Stande sein, die bei der Reaktion entstehenden Intermediate des Cofaktors Eisen(II) zu identifizieren. So lässt sich beispielweise klären, ob die bei anderen Hydroxylasen beobachtete Elektronenübertragung über eine intermediär entstehende Eisen(IV)-Oxo-Spezies auch bei den Prolinhydroxylasen auftritt (siehe Abb. 16).[50,51] 83 EXPERIMENTELLER TEIL 5. Experimenteller Teil 5.1. Materialien und Methoden 5.1.1. Chemikalien und Reagenzien Die verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen SIGMA ALDRICH, ROTH, MERCK, APPLICHEM, HARTENSTEIN, FLUKA und ACROS ORGANICS bezogen. Die Bestandteile der Kulturmedien stammen von der Fa. ROTH. Polymerasen, Ligasen und Restriktionsenzyme wurden von den Firmen STRATAGENE, NEW ENGLAND BIOLABS und FERMENTAS bezogen. 5.1.2. Analytik NMR NMR Spektren wurden mit dem Spektrometer "Avance DRX 400" der Fa. BRUKER (1H: 400 MHz, 13 C: 100 MHz) bei Raumtemperatur aufgenommen. Angegeben werden die chemischen Verschiebungen δ in ppm, die Kopplungskonstanten in Hz und die Multiplizitäten: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), qui (Quintett), m (Multiplett). Die Spektren wurden auf den undeuterierten (1H-NMR) beziehungsweise deuterierten (13C-NMR) Anteil des jeweiligen Lösungsmittel kalibriert (1H-NMR: Wasser 4.80, Methanol 3.31, DMSO 2.50, Chloroform 7.28; 13 C-NMR: Chloroform-d1 77.1, Methanol-d4 49.2, DMSO 39.5). Zur Unterstützung der Signalzuordnung wurden zusätzlich 1 H-1H-COSY-, HMBC-, HSQC-, NOESY-, ROSEY- sowie TOCSY-Experimente durchgeführt. Dünnschichtchromatographie Die analytische Dünnschichtchromatographie erfolgte auf DC-Alufolien, beschichtet mit Kieselgel 60 F254, der Fa. MERCK. Die Detektion erfolgte über Fluoreszenzlöschung (λ = 254 nm) oder bei Prolin und Prolinderivaten nach Reaktion mit Ninhydrin-Lösung (0.1 g Ninhydrin in 10 ml 96% Ethanol lösen und auf 100 ml mit destilliertem Wasser auffüllen) und anschließenden Erhitzen mit der Heißluftpistole. 84 EXPERIMENTELLER TEIL Säulenchromatographie Präparative Trennungen durch Säulenchromatographie wurden an neutralem Kieselgel 60 der Fa. MERCK mit einer Korngröße von 40 - 63 μm durchgeführt (Flashchromatographie).[125] Gefriertrocknung Die Lyophilisierung von Enzymlösungen wurde mit der Gefriertrocknungsanlage "Alpha 2-4 LD" der Fa. CHRIST durchgeführt. Polarimetrie Spezifische Drehwerte der Hydroxyproline wurden in Wasser mit einem Polarimeter P-1020 der Fa. JASCO bestimmt. Angegeben werden neben der spezifischen Drehung [α] D20 die Konzentration (g / 100 mL) und das Lösungsmittel. Alle Werte wurden mit der D-Linie einer Na-Lampe (λ = 589 nm) gemessen. Die Länge der Küvette betrug l = 1 dm. HPLC-FLD Für die HPLC Messungen wurde ein LC Series 1100 System der Fa. AGILENT TECHNOLOGIES verwendet. Die Proben wurden zunächst mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC) wie folgt derivatisiert.[90,108] Zu 40 µL Probenlösung wurden 40 µL Natriumborat-Puffer (0.5 M, pH 7.7) gegeben. Nach Zugabe von 80 µL FMOC (1.5 mM, in Aceton gelöst) wurde der Ansatz für 60 s mit einer Vortex-Anlage geschüttelt. Um das überschüssige FMOC zu zerstören, wurden 100 µL 1-Adamantanamin (ADAM, gelöst in Aceton / Natriumborat-Puffer (0.5 M, pH 7.7), 1:1) zugegeben und für 45 s mit einer Vortex-Anlage geschüttelt. Für die Analyse wurde die Mischung mit 140 µL HPLC Puffer A (Zusammensetzung siehe unten) verdünnt. Zur Detektion diente ein Series 1100 Fluoreszenzdetektor der Fa. AGILENT TECHNOLOGIES (FLD, Anregungswellenlänge λ = 254 nm, Emissionswellenlänge λ = 316 nm). Stationäre Phase: LiChrosorb RP18 - 5µ (250 x 4.0 mm) oder LiChrosorb100 RP18 EC 5µ (250 x 4.0 mm) der Fa. CS (CHROMATOGRAPHIE-SERVICE), Säulentemperatur: 45 °C, Flussrate: 0.75 ml/min, Injektionsvolumen: 10 µL. Als mobile Phase wurde ein Gradient von Puffer A (20% Acetonitril / 80% 50 mM Natriumacetat pH 5) und Puffer B (80% Acetonitril / 20% 50 mM Natriumacetat pH 5) verwendet. 85 EXPERIMENTELLER TEIL Gradientenprogramm 1: Puffer A: 0 - 2 min: 100%; 2 - 17 min: 100% → 91%; 17 - 25 min: 91% → 70%; 25 - 27 min: 70% → 0%; 27 - 32 min: 0%; 32 - 34 min: 0% → 100%; 34 - 40 min: 100%. Gradientenprogramm 2: Puffer A: 0 - 2 min: 100%; 2 - 19 min: 100% → 75%; 19 - 25 min: 75% → 45%; 25 - 27 min: 45% → 0%; 27 - 32 min: 0%; 32 - 34 min: 0% → 100%; 34 - 40 min: 100%. UV/VIS Die Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford-Reagenz, die Bestimmung der optischen Dichte (OD) von Bakterienkulturen und die quantitativ-kolorimetrische Bestimmung von 4-Hydroxyprolinen erfolgten mit den Spektrophotometern „UV mini – 1240“ oder „UV1650 PC“ der Fa. SHIMADZU. MS und MS-MS (Tandem-Massenspektrometrie) MS- und MS-MS-Analysen wurden an einem API2000 Massenspektrometer, das mit einer Turbosprayionenquelle der Fa. APPLIED BIOSYSTEMS ausgestattet ist, durchgeführt. Da Proben aus enzymatischen Reaktionen noch Eisen enthalten, wurde dieses vor der Massenspektrometrie durch Ausfällung mit (NH4)2S entfernt.[126] MS: Parameter Q1 MS (Q1): Ion Source Gas 1: 25 psi, Ion Source Gas 2: 25 psi, Curtain Gas: 15 psi, IonSpray Voltage: 4500 V, Temperature: 420 °C, Declustering Potential: 50 V, Focusing Potential: 400 V, Entrance Potential: 8 V. MS-MS (Tandem-Massenspektrometrie): Parameter Produkt Ion (MS2): Ion Source Gas 1: 30 psi, Ion Source Gas 2: 30 psi, Collision Gas: 6 psi, Curtain Gas: 10 psi, IonSpray Voltage: 5500 V, Temperature: 400 °C, Declustering Potential: 50 V, Focusing Potential: 300 V, Entrance Potential: 10 V, Collision Energy: 25, Collision Cell Exit Potential: 3. Computergestützte DNA- und Proteinsequenzanalyse Für die Analyse von DNA- und Proteinsequenzen wurden die Programme Vector NTI 10 (Fa. INVITROGEN) und Geneious Pro (Fa. BIOMATTERS) verwendet. 86 EXPERIMENTELLER TEIL 5.1.3. Kulturmedien, Wachstumsbedingungen und Stammhaltung Vollmedien LB-Medium Trypton 10 g/L Hefeextrakt 5 g/L NaCl 5 g/L Trypton 16 g/L Hefeextrakt 10 g/L 5 g/L Trypton 12 g/L Hefeextrakt 24 g/L 2xYT-Medium NaCl TB-Medium K2HPO4 9.4 g/L KH2PO4 2.2 g/L Glycerol 4 mL / L Tabelle 11: Zusammensetzungen der Vollmedien. 87 EXPERIMENTELLER TEIL Minimalmedien Medium 5 Glycerol 1 (NH4)2SO4 % (v/v) 10 g/L NaCl 2 g/L K2HPO4 1 g/L MgSO4·7H2O 1 g/L NH4Cl 5 g/L Na-Acetat 5 g/L 16.6 g/L NH4NaHPO4 4.0 g/L Citronensäure 2.1 g/L Fe2(SO4)3 0.075 g / L Borsäure 3.8 mg / L MnCl2· 4H2O 18.8 mg / L EDTA · 2H2O 10.5 mg / L CuCl2 · 2H2O 1.9 mg / L Na2MoO4 · 2H2O 3.1 mg / L CoCl2 · 6H2O 3.1 mg / L ZnSO4 · 2H2O 10.0 mg / L Hochzelldichtemedium[103] KH2PO4 Nach dem Autoklavieren Zugabe von Glycerol 1 % (v/v) MgSO4 · 2H2O 1.5 g/L pH mit 25% (v/v) NH3 einstellen auf 6.8 Tabelle 12: Zusammensetzung der Minimalmedien. 88 EXPERIMENTELLER TEIL Antibiotika Konzentrationen Antibiotikum Endkonzentration im Medium (µg · ml-1) Ampicillin 100 Chloramphenicol 34 Kanamycin 50 Tabelle 13: Konzentrationen der Antibiotika. Konzentrationen sonstiger Additiva Bestandteil Endkonzentration im Medium in % (m/v) L-Arabinose 0.001 D-Glucose 0.01 Tabelle 14: Konzentrationen sonstiger Additiva. Stammhaltung Die Anzucht der E. coli Stämme erfolgte aerob bei 37 °C auf LB-Agarplatten und in Flüssigkulturen unter Schütteln bei 140 - 200 UpM. Für die kurzzeitige Kultivierung wurden die Stämme auf LB-Agarplatten (bis zu drei Wochen) gehalten. Die langfristige Lagerung erfolgte bei -20 °C und -80 °C in Form von Glycerol-Dauerkulturen. Hierfür wurden frische Übernachtkulturen mit 50% (v/v) eines 1:1 Gemisches aus sterilem Glycerol und 2xYTMedium versetzt. 5.1.4. Molekularbiologische und Proteinbiochemische Methoden Präparation von Plasmid-DNA Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde das „Wizard SV DNA Purification System“ der Fa. PROMEGA oder das „Accu Prep Plasmid Mini Extraktion Kit“ der Fa. BIONEER nach Angaben der Hersteller verwendet. Reinigung von PCR-Produkten Die durch DNA-Gelelektrophorese aufgetrennten PCR-Produkte wurden mit dem „Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System“ der Fa. PROMEGA von Agarosegel gereinigt. 89 EXPERIMENTELLER TEIL Transformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen Die Transformation von Plasmid-DNA (ca. 20 - 200 ng) erfolgte durch Hitzeschock (40 s bei 42 °C) in CaCl2-kompetente Stämme von E. coli.[127] Sterilisation Alle Kulturmedien, Glaswaren, Pipettenspitzen und Puffer für molekularbiologische Arbeiten wurden für 15 Minuten bei 121 °C und einem bar Überdruck dampfsterilisiert. Konstruktion der Expressionsplasmide Die Restriktion der Zielvektor-DNA sowie der PCR-Produkte beziehungsweise der Trägervektoren der Prolinhydroxylasen erfolgte mit den Enzymen SalI / HindIII und NotI. Die Ligationsreaktionen wurde mit T4 DNA-Ligase in variierenden Verhältnissen von VektorDNA und des Insert DNA-Fragments durchgeführt. Ultrafiltration Für die Aufkonzentrierung der Prolinhydroxylasen wurden die Zentrifugenfilter „Vivaspin 6 Zentrifugalkonzentratoren 10,000 MWCO“ der Fa. SATORIUS nach Angaben des Herstellers verwendet. DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung der Prolinhydroxylasegene im Vektor pET28b wurde mit dem T7 Primer am 5´- und dem T7term Primer am 3´-Ende von der Fa. MWG EUROFINS und der Fa. GATC BIOTECH durchgeführt. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Vervielfältigung von DNA-Sequenzen wurde auf einem „Gradient PCR Cycler“ der Fa. EPPENDORF durchgeführt. Die Temperaturprofile sowie die Dauer und Anzahl der Zyklen wurden entsprechend dem verwendeten DNA-Template, der Polymerase und den Oligonukleotiden angepasst. 90 EXPERIMENTELLER TEIL Gerichtete Mutagenese Die gerichtete Mutagenese der Prolinhydroxylasen wurde mit Hilfe des „QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit“ der Fa. STRATAGENE nach Herstellerangaben durchgeführt. Agarose-Gelelektrophorese Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Präparationen erfolgte mit dem Gel-System der Fa. PEQLAB nach Sambrook et al. in 1%igen (m/v) Agarosegelen.[128] Die DNAFragmente wurden durch Ethidiumbromid angefärbt und durch UV-Licht bei λ = 254 mn sichtbar gemacht. Als Elektrophoresepuffer diente ein Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE: TrisAcetat (40 mM), EDTA (1 mM), pH 8). Als Ladepuffer für die Proben diente eine selbst hergestellte „Loading Dye Solution“ (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.003% Bromphenolblau, 60% Glycerol, 60 mM EDTA). SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Für die Analytik der Proteine durch Auftrennung nach ihrer molaren Masse wurde die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese nach Laemmli verwendet.[129] Die Polyacrylamid-Gele waren wie in Tabelle 15 angegeben zusammengesetzt. Die Durchführung erfolgte in 0.1% SDS-Elektrophorese-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1% SDS (w/v)) auf einem Gelsystem der Fa. PEQLAB. Vor der Auftrennung wurden die Proteinproben in Probenpuffer (62.5 mM Tris/HCl pH 6.8, 2% SDS, 20% Glycerol, 5% β-Mercaptoethanol, 0.0025% Bromphenolblau) aufgenommen und mindestens 12 min bei 65 °C denaturiert. Zur Färbung der Proteinbanden wurde das Gel ca. 30 min mit Färbelösung (0.25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G 250 in Ethanol/Wasser/Eisessig 45:10:45 (v/v/v)) behandelt. Das Entfärben erfolgte anschließend über Nacht in einer Mischung aus Methanol/Wasser/Eisessig 50:19:31 (v/v/v). 91 EXPERIMENTELLER TEIL Lösungen Trenngel Acrylamid-Stammlösung 30% (Fa. ROTH) 4.00 mL Tris/HCL-Lösung 1.5 M, pH 8.8 2.50 mL Tris/HCL-Lösung 0.5 M, pH 6.8 - Sammelgel 0.65 mL 1.25 mL H2Odemin 3.35 mL 3.05 mL Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS) 10% (m/m) 100 µL 50 µL N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 5 µL 5 µL 100 µL 50 µL frische Ammoniumperoxodisulfat-Lösung 10% (m/v) Tabelle 15: Zusammensetzung der Polyacrylamid-Gele. Ultraschall-Desintegrator Für den Zellaufschluss wurde der Ultraschall-Desintegrator BRANSON Sonifier II „Modell W-250“ der Fa. HEINEMANN verwendet. (Duty Cycle = 60%, Output Control = 6; 6 x 12 s mit je 30 s Pause). Bestimmung der DNA-Konzentration Die Konzentration und Reinheit von DNA-Präparationen wurde auf einem NanoDrop ND-1000 UV/Vis Spectrophotometer der Fa. PEQLAB bestimmt. Bestimmung der Proteinkonzentration Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte entweder fluorimetrisch mit dem Quant-iT Protein Assay Kit der Fa. INVITROGEN auf einem Qubit Fluorometer der Fa. INVITROGEN nach Angaben des Herstellers oder nach der Methode von Bradford mit kommerziell erhältlichen Bradford-Reagenz der Fa. ROTH photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 595.[130] Bestimmung von Eisen(II) Eisen(II) wurde kolorimetrisch mit 1,10-Phenanthrolin als Komplex nachgewiesen.[131] 92 EXPERIMENTELLER TEIL Kolorimetrischer Nachweis von 4-Hydroxyprolin[91,92] Qualitativ Zu 100 µL einer annähernd pH-neutralen Probenlösung wurden 100 µL Oxidationslösung gegeben und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Anschließend wurden 100 µL Färbelösung zupipettiert und der Ansatz für circa 5 min bei 60 °C stehen gelassen. Bei Anwesenheit von 4-Hydroxyprolin trat eine Rotfärbung auf. Quantitativ Zu 2 mL Probenlösung wurden 1 mL Oxidationslösung gegeben und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 1 mL Färbelösung zupipettiert und genau 20 min bei 60 °C stehen gelassen. Die Proben wurden mit Leitungswasser gründlich abgekühlt und photometrisch bei λ = 558 ± 2 nm vermessen. Pufferlösung Citronensäure Monohydrat 3.0 g Natriumhydroxid 1.5 g Natriumacetat Trihydrat 9.0 g H2O 50 mL Isopropanol 29 mL mit Salzsäure / Natronlauge auf pH = 6.0 einstellen und mit H2Odemin auf 100 mL auffüllen. Oxidationslösung 141 mg Chloramin-T in 10 mL Pufferlösung gelöst. Färbelösung 4-(N,N-Dimethylamino)benzaldehyd 1.0 g Perchlorsäure (60%) 3.5 mL Isopropanol 6.5 mL Tabelle 16: Zusammensetzung der Puffer-, Oxidations- und Färbelösung. 93 EXPERIMENTELLER TEIL Thermomixer Es wurde der Thermomixer Comfort der Fa. EPPENDORF verwendet. Inkubationsschüttler Flüssigkulturen wurden auf dem „Multitron“ Inkubationsschüttler der Fa. INFORS inkubiert. Vortexer Zur Durchmischung von Proben wurde ein Vortex-Genie 2 Schüttelgerät der Fa. SCIENTIFIC INDUSTRIES verwendet. Zentrifugen Für Volumina bis zu 2 mL pro Eppendorf-Reaktionsgefäß wurde die Zentrifuge „5417 R“ mit dem Rotor “F45-30-11“ der Fa. EPPENDORF genutzt, für Volumina bis zu 50 mL pro FalconGefäß wurde die Zentrifuge „5804 R“ mit den Rotoren „F-34-6-38“ oder „A-4-44“ der Fa. EPPENDORF genutzt. Für größere Volumina kam die Zentrifuge „RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge“ der Fa. SÖRVALL zum Einsatz. Gel-Dokumentation Agarose- und Proteingele wurden mittels des Bio-Vision 3000 Systems der Fa. PEQLAB / VILBER LOURMAT dokumentiert. 94 EXPERIMENTELLER TEIL 5.1.5. Bakterienstämme, Vektoren, Plasmide und Oligonukleotide Bakterienstämme Stamm Genotyp Referenz E. coli TG1 supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK- STRATAGENE mK-) [F′ traD36 proAB lacIq ZΔM15] E. coli BL21(DE3) E. coli B F– dcm ompT hsdS(rB– mB–) gal STRATAGENE λ(DE3) E. coli BL21(DE3) E. coli B F- ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal STRATAGENE CodonPlus RP λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr] Tabelle 17: Verwendete Bakterienstämme. Vektoren Vektor Genetische Marken Referenz pET28b Kanr, oripBR322, PT7/lac, N- und C- terminal 6x NOVAGEN His·Tag pETcoco2 Ampr, oriV, oriS, repE. parABC, trfA, araC NOVAGEN PT7/lac pET19TEV Ampr, oripBR322, PT7/lac, N- terminal 6x Arbeitsgruppe His·Tag, Schnittstelle für die TEV Protease Wulf Blankenfeldt Tabelle 18: Verwendete Vektoren. Plasmide Plasmid Genotyp Referenz pL1SL2 pETcoco2 mit den Chaperonen groEL1, Betancor et al.[87] groEL2 und groES. pG-KJE8 Plasmid mit den Chaperonen dnaK, dnaJ, TAKARA[132] grpE, groES, groEL. 95 EXPERIMENTELLER TEIL pET28b/transP4H pET28b mit transP4H, kloniert über SalI Diplomarbeit[85] und NotI. pET19TEV/transP4H pET19TEV mit transP4H, kloniert über Arbeitsgruppe NdeI und XhoI. Wulf Blankenfeldt pET28b/transP4H- pPET28b/transP4H mit Insertion eines diese Arbeit V105_W106insG Gly zwischen Val105 und Trp106 in der transP4H-Aminosäuresequenz. pET28b/transP4H- pPET28b/transP4H mit Austausch diese Arbeit Q110R Gln110 → Arg110 in der transP4HAminosäuresequenz. pET28b/cisP3H_I pET28b mit cisP3H_I, kloniert über SalI Diplomarbeit[85] und NotI. pET28b/cisP3H_I- pET28b/cisP3H_I mit Deletion des diese Arbeit V104del,R108S Val104 und Austausch Arg108 → Ser108 in der cisP3H_I Aminosäuresequenz. pET28b/cisP3H_IN43H,I44V pET28b/cisP3H_I mit Austausch diese Arbeit Asn43/Ile44 → His43/Val44 in der cisP3H_I-Aminosäuresequenz. pET28b/cisP3H_II pET28b mit cisP3H_II, kloniert über SalI diese Arbeit und NotI. pET28b/cisP3H_II- pET28b/cisP3H_II mit Austausch diese Arbeit H43N, V44I His43/Val44 → Asn43/Ile44 in der cisP3H_II-Aminosäuresequenz. pET28b/cisP4H pET28b mit cisP4H, kloniert über SalI diese Arbeit und NotI. 96 EXPERIMENTELLER TEIL pET19TEV/cisP4H pET19TEV mit cisP4H, kloniert über Arbeitsgruppe NdeI und SalI. Wulf Blankenfeldt pET28b/cisP4H- pET28b/cisP4H mit Insertion eines Val diese Arbeit I103_I104insV,S107R zwischen Ile103 und Ile104 und Austausch Ser107 → Arg107 in der cisP4H-Aminosäuresequenz. Tabelle 19: Verwendete Plasmide. Oligonukletotide Die Synthese der Oligonukleotid-Primer wurde von der Fa. MWG EUROFINS durchgeführt. Primer Bezeichnung Sequenz 5` → 3´ SDM_cisP4_*-1_f GAATTCCTGCAGCCCTATATGA Forward Primer zum Austausch GCACCCATTTC4 SDM_cisP4_*-1Y_r Bemerkung Stopcodon-1 → Tyr-1. GAAATGGGTGCTCATATAGGGC Revers Primer zum Austausch TGCAGGAATTC Stopcodon-1 → Tyr-1. SDM_transP4H- GACCGGTGACGTTGGTTGGCCG Forward Primer zum Einfügen V105_W106insG_f TGGCAC4 eines Gly zwischen Val105 und Trp106. SDM_transP4H- GTGCCACGGCCAACCAACGTCA Revers Primer zum Einfügen V105_W106insG _r CCGGTC eines Gly zwischen Val105 und Trp106. SDM_transP4H- GTTTGGCCGTGGCACCGTGACT Forward Primer zum Austausch Q110R_f ACATCTTCTGG4 4 Gln110 → Arg110. Die Mutationsstellen sind unterstrichen 97 EXPERIMENTELLER TEIL SDM_transP4H- CCAGAAGATGTAGTCACGGTGC Revers Primer zum Austausch Q110R_r CACGGCCAAAC SDM_cisP3H_I- CTGAAAAACGCTATAATCCCGC Forward Primer zur Deletion V104del,R108S_f ACAGTGACTTCGTTGAAC4 Gln110 → Arg110. des Val104 und Austausch Arg108 → Ser108. SDM_cisP3H_I- GTTCAACGAAGTCACTGTGCGG Revers Primer zur Deletion des V104del,R108S_r GATTATAGCGTTTTTCAG Val104 und Austausch Arg108 → Ser108. SDM_cisP3H_I- CTAACGGTTTCTGGAAACATGT Forward Primer zum Austausch N43H,I44V_f GCCGCTGTACAACGCTTCTG4 SDM_cisP3H_I_ CAGAAGCGTTGTACAGCGGCAC Revers Primer zum Austausch N43H,I44V_r ATGTTTCCAGAAACCGTTAG SDM_cisP3H_II_ CTAACGGCTTCTGGAAAAACAT Forward Primer zum Austausch H43N,V44I _f CCCGCTGTGGAATGCTAGCG4 SDM_cisP3H_II_ CGCTAGCATTCCACAGCGGGAT Revers Primer zum Austausch H43N,V44I_r GTTTTTCCAGAAGCCGTTAG SDM_cisP4H_ GAAAACGCATGTATAGTCATCC Forward Primer zum Einfügen I103_I104insV, CCCATCGGGATTACCTAGAAC4 Asn43/Ile44 → His43/Val44. Asn43/Ile44 → His43/Val44. His43/Val44 → Asn43/Ile44. His43/Val44 → Asn43/Ile44. eines Val zwischen Ile103 und Ile104 und Austausch Ser107 → S107R_f Arg107. SDM_cisP4H_ GTTCTAGGTAATCCCGATGGGG Revers Primer zum Einfügen I103_I104insV, GATGACTATACATGCGTTTTC S107R_r eines Val zwischen Ile103 und Ile104 und Austausch Ser107 → Arg107. Tabelle 20: Verwendete Oligonukleotide. 98 EXPERIMENTELLER TEIL 5.2. Produktion, Aktivität und Substratspektrum der Prolinhydroxylasen 5.2.1. Proteinproduktion und Isolierung Proteinproduktion der Prolinhydroxylasen Die Produktion der Prolinhydroxylasen erfolgte in E. coli BL21(DE3) CodonPlus RP, der das Chaperonplasmid pL1SL2 trägt. Dieser Stamm wurde mit den Plasmiden, die die Prolinhydroxylasen tragen, transformiert. Durch eine Animpfung mit 0.1% (v/v) eines Glycerolstocks in LB- oder 2xYT-Medium unter Zusatz von Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Glucose erfolgte zunächst für ca. 16 Stunden bei 37 °C und 160 UpM die Anzucht einer Vorkultur. Die Hauptkulturen wurden in TB-Medium, zu dem Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Arabinose gegeben wurde, durch Überimpfung mit 1% (v/v) der Vorkultur bei 37 °C und 140 UpM angezogen. Bei einer OD600 = 1.2 wurde die Temperatur auf 28 °C reduziert und zur Induktion der Expression der Prolinhydroxylase-Gene Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0.2 mM zugegeben. Nach 16 - 20 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren (3300 x g, 20 min, 4 °C) pelletiert. Isolierung der Prolinhydroxylasen Das Zellpellet wurde in ca. 5% des ursprünglichen Kulturvolumens in Equilibrierung-Puffer (Imidazol 20 mM, Glycerol 20% (v/v), Mes-Puffer (50 mM, pH 6.5), Tween 20 (0.1% (v/v)) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung unter Eiskühlung aufgeschlossen und die nicht-löslichen Bestandteile durch Zentrifugieren (9290 x g, 60 min, 4 °C) entfernt. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA (Superflow der Firma QIAGEN) Säule geladen, welche zuvor mit dem 10-fachen Säulenvolumen an Waschpuffer (Mes-Puffer 50 mM, pH 6.5, Imidazol 50 mM) gespült wurde.[133] Nach Inkubation des Überstandes mit dem Ni-NTA für 15 - 20 min auf Eis wurde mit Waschpuffer gewaschen und das gebunden Protein mit Elutionspuffer (Mes-Puffer 50 mM, pH 6.5, Imidazol 200 mM) eluiert. Die Entfernung des Imidazols erfolgte durch Größenausschlusschromatographie über „Sephadex G-25 M PD-10 Columns“ der Firma GE HEALTHCARE nach Angaben des Herstellers mit 10 mM Mes-Puffer pH 6.5. 99 EXPERIMENTELLER TEIL 5.2.2. Prolinhydroxylase Aktivität Analytische Ansätze Der Nachweis der Prolinhydroxylase Aktivität erfolgte in vitro durch Umsatz von L-Prolin (8 mM) in Gegenwart L-Ascorbinsäure von α-Ketoglutarat (14 mM), Eisen(II)sulfat (0.5 mM), (1.5 mM), Mes-Puffer (50 mM, pH 6.5) und einer Enzymlösung in einem Gesamtvolumen von 1 mL in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1.5 mL oder 2 mL). Die Reaktionsansätze wurden bei 37 °C (transP4H und beide cisP3Hs) beziehungsweise 25 °C (cisP4H) unter Schütteln bei 300 UpM auf einem Thermomixer für 14 - 18 Stunden inkubiert. Um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten, wurde der Deckel der EppendorfReaktionsgefäße offen gelassen. Die Identifizierung des Hydroxyprolins sowie die Bestimmung des Umsatzes erfolgten nach Derivatisierung mit FMOC / ADAM über HPLC. In vivo Produktion von Hydroxy-L-prolinen Für die in vivo Produktion von Hydroxy-L-prolinen wurde das Medium 5 (Zusammensetzung siehe 5.1.3.) verwendet, in dem die Prolinhydroxylase-produzierenden E. coli Stämme unter aeroben Bedingungen kultiviert wurden. Durch eine Animpfung mit 0.1% eines Glycerolstocks in LB- oder 2xYT-Medium unter Zusatz von Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Glucose erfolgte zunächst bei 37 °C und 160 UpM die Anzucht einer Vorkultur. 800 mL Medium 5 in einem 2 L DreiSchikanen-Kolben, zu dem Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Arabinose zugegeben wurde, wurden mit 1% (v/v) der Vorkultur angeimpft. Die Kultur wurde bei 37 °C und 140 UpM bis zu einer OD600 = 1.1 - 1.4 wachsen gelassen. Nach Reduktion der Temperatur auf 28 °C wurde durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0.2 mM die Expression der Prolinhydroxylase-Gene induziert. Gleichzeitig wurde ein Reaktionsmix, bestehend aus 500 mg L-Prolin (6.25 mM) und 111 mg FeSO4·7H2O (0.5 mM) zugegeben. Die Kulturen wurden für insgesamt 72 - 120 Stunden bei 28 °C und 140 UpM inkubiert. Die Produktion der Hydroxy-L-proline wurde über HPLC verfolgt. 100 EXPERIMENTELLER TEIL Isolierung der Produkte Die Entfernung von Zellbestandteilen (in vivo Ansätze) beziehungsweise denaturiertem Protein (in vitro Ansätze) erfolgte durch Zentrifugieren (3300 x g, 45 min, 4 °C). Der Überstand wurde mit Salzsäure auf pH = 1.3 - 1.6 eingestellt und auf ein Kationentauscherharz gegeben (Dowex® 50 W x 8, 50 - 100 Mesh, H+ Form). Für Produktmengen von 8 - 60 mg wurde 55 mL (in einer Chromatographiesäule mit Ø 2 cm), für Produktmengen von bis zu 150 mg wurde 110 mL (in einer Chromatographiesäule mit Ø 3 cm) Kationentauscherharz verwendet. Dieses wurde zuvor mit H2Odemin gespült, anschließend mit 2.5 M Salzsäure (130 mL beziehungsweise 160 mL) behandelt und mit H2Odemin bis zur Neutralität gewaschen. Nach dem Probendurchlauf wurde das Harz mit circa dem doppelten Säulenvolumen an H2Odemin nachgewaschen. Die Elution wurde mit 7.5% Natronlauge (80 mL beziehungsweise 100 mL) und H2Odemin (100 mL beziehungsweise 150 mL) durchgeführt. Das so erhaltene alkalische Eluat wurde auf ein Anionentauscherharz gegeben (Dowex® 1 x 8, 20 - 50 Mesh, OH- Form). Für Produktmengen von 8 - 60 mg wurde 75 mL (in einer Chromatographiesäule mit Ø 2 cm), für Produktmengen von bis zu 150 mg wurde 140 mL (in einer Chromatographiesäule mit Ø 3 cm) Anionentauscherharz verwendet. Dieses wurde zuvor mit H2Odemin gespült, anschließend mit 20% Natronlauge (80 mL beziehungsweise 110 mL) behandelt und mit H2Odemin bis zur Neutralität gewaschen. Nach dem Probendurchlauf wurde das Harz mit circa dem doppelten Säulenvolumen an H2Odemin nachgewaschen. Die Elution wurde mit 5 M Salzsäure (70 mL beziehungsweise 100 mL) und H2Odemin (90 mL beziehungsweise 150 mL) durchgeführt. Das salzsaure Eluat wurde im Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. 5.2.3. Cosubstratspektrum der Prolinhydroxylasen Die Ansätze zur Untersuchung von nicht-physiologischen α-Ketosäuren als Cosubstrate der Prolinhydroxylasen erfolgten im analytischen Maßstab mit isoliertem Enzym (transP4H, cisP3H_I und cisP4H) in Gegenwart von L-Ascorbinsäure L-Prolin (4 mM), Eisen(II)sulfat (0.5 mM), (1.5 mM), Mes-Puffer (100 mM, pH 6.5) und α-Ketosäure (10 mM) in einem Gesamtvolumen von 1 mL in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1.5 mL oder 2 mL). Die Reaktionsansätze wurden bei 37 °C (transP4H und cisP3H_I) beziehungsweise 25 °C (cisP4H) unter Schütteln bei 300 UpM auf einem Thermomixer für 14 - 18 Stunden inkubiert. Um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten, wurde der Deckel der EppendorfReaktionsgefäße offen gelassen. Eine Blindprobe ohne α-Ketosäure wurde ebenfalls 101 EXPERIMENTELLER TEIL durchgeführt. Der Nachweis von Hydroxyprolin erfolgte mittels HPLC (qualitativ und quantitativ) sowie zusätzlich für die 4-Hydroxyproline über den Farbassay (nur qualitativ). 5.2.4. Substratspektrum der Prolinhydroxylasen Analytische Ansätze Die analytische Testung von Prolinanaloga erfolgte in vitro in Ansätzen mit der zu untersuchenden Verbindung (4 mM) in Gegenwart von α-Ketoglutarat (10 mM), Eisen(II)sulfat (0.5 mM), L-Ascorbinsäure (1.5 mM), Mes-Puffer (50 mM, pH 6.5) und einer Enzymlösung in einem Gesamtvolumen von 1 mL in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1.5 mL oder 2 mL). Die Reaktionsansätze wurden bei 37 °C (transP4H und beide cisP3Hs) beziehungsweise 25 °C (cisP4H) unter Schütteln bei 300 UpM auf einem Thermomixer für 14 - 18 Stunden inkubiert. Um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten, wurde der Deckel der Eppendorf-Reaktionsgefäße offen gelassen. Die Detektion eines neuen hydroxylierten Produktes erfolgte über HPLC nach Derivatisierung mit FMOC / ADAM sowie durch Massenspektrometrie. Semi-präparative Ansätze Die semi-präparative Umsetzung von Prolinanaloga erfolgte mit isoliertem Enzym durch Umsetzung des Substrates (8 mg = ~1 mM) in Gegenwart von α-Ketoglutarat (10 mM), Eisen(II)sulfat (0.5 mM), L-Ascorbinsäure (1.5 mM) und Mes-Puffer (50 mM, pH 6.5) in einem Gesamtvolumen von 60 mL, verteilt auf vier Ansätze zu je 15 mL (in 50 mL Zentrifugenröhrchen). Die Reaktionsansätze der transP4H und der beiden cisP3Hs wurden bei 37 °C, die Reaktion der cisP4H bei 25 °C für 14 - 18 Stunden inkubiert. Um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten, wurde der Deckel der Zentrifugenröhrchen offen gelassen. Die Isolierung der Produkte erfolgte über Ionentauscher. In vivo Produktion von trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure in Medium 5 Die Produktion von trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure in Medium 5 erfolgte analog der Produktion der Hydroxyproline in Medium 5, jedoch im 100 mL Maßstab in einem 500 mL Drei-Schikanen-Kolben. Als Reaktionsmix wurde 52 mg L-Pipecolinsäure (4 mM) und 14 mg FeSO4·7H2O (0.5 mM) zugegeben. 102 EXPERIMENTELLER TEIL In vivo Produktion von hydroxylierten Prolinanaloga im Hochzelldichtemedium Für die in vivo Hochzelldichtemedium Produktion von (Zusammensetzung hydroxylierten siehe oben) Prolinanaloga verwendet, in wurde das dem die Prolinhydroxylase-produzierenden E. coli Stämme unter aeroben Bedingungen kultiviert wurden. Durch eine Animpfung mit 0.1% (v/v) eines Glycerolstocks in LB- oder 2xYT-Medium unter Zusatz von Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Glucose erfolgte zunächst bei 37 °C und 160 UpM die Anzucht einer Vorkultur. 100 mL Hochzelldichtemedium, in einem 500 mL Drei-Schikanen-Kolben, zu dem Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol und Arabinose zugegeben wurde, wurden mit 1% (v/v) der Vorkultur angeimpft. Die Kulturen wurden bei 37 °C und 140 UpM bis zu einer OD600 = 3 - 4 wachsen gelassen. Nach Reduktion der Temperatur auf 28 °C wurde durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0.2 mM die Expression der Prolinhydroxylase-Gene induziert. Gleichzeitig wurde der Reaktionsmix, bestehend aus dem Prolinanalogon (1 mM bis 4 mM) und 14 mg FeSO4·7H2O (0.5 mM) zugegeben. Die Kulturen wurden für insgesamt 72 - 120 Stunden bei 28 °C und 140 UpM inkubiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte über HPLC. Die Isolierung der Produkte erfolgte über Ionentauscher. 103 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3. Produkte der enzymatischen Synthese 5.3.1. trans-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxyprolin)5 HO E H B 1 O H 2 H NH A 3 5 H 4 F HO HC H D HPLC Rt = 20.1 min (Gradientenprogramm 1) 1 (400 MHz, D2O) δ = 2.10 (ddd, J = 14.1 Hz, J = 10.5 Hz, J = 4.2 Hz, 1H, H NMR CH2-B), 2.35 (tdd, J = 14.1 Hz, J = 7.9 Hz, J = 1.8 Hz, 1H, CH2-A), 3.27 (td, J = 12.6 Hz, J = 1,8 Hz, 1H, CH2-D), 3.39 (dd, J = 12.6 Hz , J = 3.6 Hz, 1H, CH2-C), 4.34 (dd, J = 10.3 Hz , J = 8.0 Hz, 1H, CH2-E), 4.57 (m, 1H, CH-F) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 36.8 (C-3), 53.5 (C-5), 58.2 (C-2), 69.5 (C-4), 171.4 (C-1) C5H9NO3 5 131 g · mol-1 Die L-Konfiguration wird angenommen aufgrund des eingesetzten L-Prolins und da D-Prolin kein Substrat für die Prolinhydroxylase darstellt. 104 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.2. cis-3-Hydroxy-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxyprolin)5 HO B 1 H O HO 2 H NH A 3 5 H 4 E H H F H C D HPLC Rt = 27.2 min (Gradientenprogramm 1) 1 (400 MHz, D2O) δ = 2.09 (ddd, J = 14.1 Hz, J = 7.2 Hz, J = 2.6 Hz, 1H, H NMR CH2-E), 2.20 (dddd, J = 14.1 Hz, J = 10.8 Hz , J = 10.2 Hz , J = 5.0 Hz, 1H, CH2-F), 3.46 (ddd, J = 10.8 Hz, J = 10.1 Hz , J = 2.8 Hz, 1H, CH2-C), 3.52 (ddd, J = 11.3 Hz, J = 10.6 Hz, J = 7.4 Hz, 1H, CH2-D), 4.35 (d, J = 3.8 Hz, 1H,CH-B), 4.74 (t, J = 3.8 Hz, 1H, CH-A) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 32.7 (C-4), 43.9 (C-5), 66.1 (C-2), 70.8 (C-3), 169.0 (C-1) Drehwert [α]D20 = -61.3 (c = 0.3, H2O) C5H9NO3 131 g · mol-1 105 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.3. cis-4-Hydroxy-L-prolin ((2S,4S)-4-Hydroxyprolin)5 HO E 1 H O A H 2 H B NH 3 5 HO 4 H F H HC D HPLC Rt = 25.6 min (Gradientenprogramm 1) 1 (400 MHz, D2O) δ = 2.29 (ddt, J = 14.5 Hz, J = 3.9 Hz, J = 1.9, 1H, CH2-A), H NMR 2.43 (ddd, J = 14.4 Hz , J = 10.3 Hz, J = 3.4 Hz, 1H, CH2-B), 3.31 (dd, J = 12.6 Hz, J = 3.3 Hz, 1H, CH2-C), 3.38 (td, J = 12.6 Hz, J = 1.6 Hz, 1H, CH2-D), 4.42 (dd, J = 10.2 Hz, J = 3.4 Hz, 1H, CH-E), 4.53 (m, 1H, CH-F) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 36.8 (C-3), 53.3 (C-5), 58.6 (C-2), 68.9 (C-4), 172.4 (C-1) Drehwert [α]D20 = -43.9 (c = 0.3, H2O) C5H9NO3 131 g · mol-1 106 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.4. trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,5R)-5-Hydroxypipecolin- säure)6 D H H 5 H HO C 4 E OH H H N H HO 3 = 1 2 H 6 N H O B H A H CO2H HPLC Rt = 19.2 min (Gradientenprogramm 2) 1 (400 MHz, CD3OD) δ = 1.68-2.42 (m, 4H, 2 x CH2-E, 2 x CH2-C), H NMR 2.88 (dd, 1H, J = 12.1 Hz, J = 9.3 Hz, CH2-Bax), 3.44 (dd, 1H, J = 12.6, J = 3.0 Hz, CH2-Beq), 3.93 (m, 1H, CH-D), 4.00 (dd, 1H, J = 10.2, J = 3.2, CH-A) 13 (100 MHz, D2O) δ = 26.0 (C-3), 32.1 (C-4), 50.1 (C-6), 58.9 (C-2), C NMR 65.7 (C-5), 174.3 (C-1) 145 g · mol-1 C6H11NO3 5.3.5. cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,5S)-5-Hydroxypipecolin- säure)6 D OH 5 H HO H H 3 4 H H N E H 6 C 2 HPLC 6 = 1 H O B H OH H A N H CO2H Rt = 21.2 min (Gradientenprogramm 2) Die L-Konfiguration wird angenommen aufgrund der eingesetzten L-Pipecolinsäure 107 EXPERIMENTELLER TEIL 1 (400 MHz, D2O) δ = 1.50-2.29 (m, 4H, 2 x CH2-E, 2 x CH2-C), H NMR 3.24 (dd, 1H, J = 13.2 Hz, J = 2.3 Hz, CH2-B), 3.37 (dd, 1H, J = 13.2, J = 4.4 Hz, CH2-B), 3.94 (dd, J = 10.6 Hz, J = 2.3 Hz, 1H, CH-A), 4.22 (m, 1H, CH-D) 13 (100 MHz, D2O) δ = 23.3 (C-3), 30.8 (C-4), 51.5 (C-6), 59.8 (C-2), C NMR 64.0 (C-5), 175.0 (C-1) 145 g · mol-1 C6H11NO3 5.3.6. cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure ((2S,3R)-3-Hydroxypipecolin- säure)6 D H 5 OH H H 4 H 6 OH H H N E C 3 2 OH O B H = 1 H H A N H CO2H HPLC Rt = 24.6 min (Gradientenprogramm 2) 1 (400 MHz, D2O) δ = 1.51-2.23 (m, 4H, 2 x CH2-E, 2 x CH2-D,), H NMR 3.04 (m, 1H, CH2-B), 3.46 (m, 1H, CH2-B), 4.07 (d, J = 1.6 Hz, 1H, CH-A), 4.58 (m, 1H, CH-C) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 18.7 (C-5), 31.2 (C-4) 46.6 (C-6), 63.5 (C-2), 66.7 (C-3), 175.0 (C-1) C6H11NO3 108 145 g · mol-1 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.7. cis-3-Hydroxy-L-azetidin-2-carbonsäure ((2S,3R)-3-Hydroxy- azetidin-2-carbonsäure)7 OH OH HN O HPLC Rt = 24.0 min (Gradientenprogramm 1) MS m/z (%) 118 (13) [M + 1]+, 100 (7) [C4H5NO2 + 1]+, 72 (100) [C3H5NO + 1]+, 54 (25) [C3H3N + 1]+, 44 (14) [C2H3O + 1]+ 117 g · mol-1 C4H7NO3 5.3.8. trans-3,4-Epoxy-L-prolin ((1R,2S,5S)-3,4-Epoxyprolin)7 O OH N H O HPLC Rt = 20.1 min (Gradientenprogramm 2) MS m/z (%) 130 (25) [M + 1]+ 112 (2) [C5H5NO2 + 1]+, 94 (4) [C5H3NO + 1]+, 84 (100) [C4H5NO + 1]+, 68 (21) [C4H5N + 1]+, 57 [C3H5O]+ (34) C5H7NO3 7 129 g · mol-1 Die Stereochemie der Verbindung wird angenommen aufgrund der Regio- und Stereoselektivität der verwendeten Prolinhydroxylase und der L-Konfiguration des eingesetzten Eduktes. 109 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.9. cis-3,4-Epoxy-L-prolin ((1S,2S,5R)-3,4-Epoxyprolin)7 O OH N H O HPLC Rt = 19.2 min (Gradientenprogramm 2) MS m/z (%) 130 (17) [M + 1]+, 84 (100) [C4H5NO + 1]+, 57 [C3H5O]+ (7) C5H7NO3 129 g · mol-1 5.3.10. trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-L-prolin ((2S,3R,4S)-3,4-Dihydroxy- prolin)8 HO A H B 1 O H 2 HO NH 3 5 H 4 C HO HD H E HPLC Rt = 17.9 min (Gradientenprogramm 1) 1 (400 MHz, D2O) δ = 3.32 (dd, J = 12.8 Hz, J = 2.4 Hz, 1H, CH2-E), 3.48 (dd, H NMR J = 12.8 Hz, J = 4.2 Hz, 1H, CH2-D), 4.16 (d, J = 7.4 Hz, 1H, CH-A), 4.32 (ddd, J = 4.2 Hz, J = 4.0 Hz, J = 2.4 Hz, 1H, CH-C), 4.44 (dd, J = 7.5 Hz, J = 4.0 Hz, 1H, CH-B) 8 Die Stereochemie der Verbindung wird angenommen aufgrund der L-Konfiguration des eingesetzten Eduktes und der Stereoselektivität der verwendeten Prolinhydroxylase. 110 EXPERIMENTELLER TEIL 13 (100 MHz, D2O) δ = 49.8 (C-5), 61.4 (C-2), 69.8 (C-4), 73.8 (C-3), C NMR 170.2 (C-1) MS m/z (%) 148 (19) [M + 1]+, 102 (100) [C4H7NO2 + 1]+, 84 (7) [C4H5NO + 1]+ C5H9NO4 147 g · mol-1 5.3.11. trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3-methyl-L-prolin ((2S,3R,4R)-4- Hydroxy-3-methylprolin)8 HO A H B 1 O H 2 H3C NH 3 4 6 H 5 C HO HD H E HPLC Rt = 19.8 min (Gradientenprogramm 2) 1 (400 MHz, D2O) δ = 1.12 (d, J = 6.4 Hz, 3H, CH3), 2.43 (m, 1H, CH-B), 3.34 H NMR (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2-E), 3.46 (dd, J = 12.4 Hz, J = 3.0 Hz, 1H, CH2-D), 3.91 (d, J = 11.0 Hz, 1H, CH-A), 4.33 (m, 1H, CH-C) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 10.8 (C-4), 42.9 (C-3), 52.9 (C-6), 62.8 (C-2), 72.2 (C-5), 171.8 (C-1) MS m/z (%) 146 (18) [M + 1]+, 128 (5) [C6H9NO2 + 1]+, 100 (100) [C5H9NO + 1]+, 82 (33) [C5H7N + 1]+, 72 (10), 55 (10). C6H11NO3 145 g · mol-1 111 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.12. cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-3methylprolin)8 HO A H 1 O HO 2 H3C NH 3 4 6 H 5 C H HD H E B HPLC Rt = 25.4 min (Gradientenprogramm 2) 1 (400 MHz, D2O) δ = 1.55 (s, 3H, CH3) 2.13 (dd, J = 8.89 Hz, J = 6.10 Hz, 2H, H NMR CH2-C, CH2-B), 3.46 (m, 2H, CH2-D, CH2-E), 4.16 (s, 1H, CH-A) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 23.0 (C-4), 38.6 (C-5), 43.3 (C-6), 67.9 (C-2), 78.5 (C-3), 168.4 (C-1) MS m/z (%) 146 (31) [M + 1]+, 128 (75) [C6H9NO2 + 1]+, 110 (11) [C6H7NO + 1]+, 100 (97) [C5H9NO + 1]+, 84 (16) [C4H5NO + 1]+, 82 (100) [C5H7N + 1]+, 55 (45) C6H11NO3 112 145 g · mol-1 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.13. trans-4-Hydroxy-α-methyl-L-prolin ((2S,4R)-4-Hydroxy-2methylprolin)8 HO 3 H3C B A 1 O H 2 H NH 4 6 H 5 C HO HD H E HPLC Rt = 24.5 min (Gradientenprogramm 2) 1 (400 MHz, D2O) δ = 1.69 (s, 3H, CH3), 2.06 (d, J = 14.1 Hz, 1H,CH2-A), 2.56 H NMR (dd, J = 14.0 Hz, J = 5.4 Hz, 1H, CH2-B), 3.31 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH2-E), 3.40 (dd, J = 12.6 Hz, J = 4.3 Hz, 1H, CH2-D), 4.54 (m, 1H, CH-C) 13 C NMR (100 MHz, D2O) δ = 22.8 (C-3), 43.2 (C-4), 53.6 (C-6), 68.3 (C-2), 69.5 (C-5), 174.1 (C-1) MS m/z (%) 146 (23) [M + 1]+, 128 (3) [C6H9NO2 + 1]+, 100 (100) [C5H9NO + 1]+, 82 (89) [C5H7N + 1]+, 55 (5) C6H11NO3 145 g · mol-1 113 EXPERIMENTELLER TEIL 5.3.14. cis-3-Hydroxy-α-methyl-L-prolin ((2S,3R)-3-Hydroxy-2-methyl- prolin)9 OH N H CH3 OH O HPLC Rt = 27.3 min (Gradientenprogramm 2) MS m/z (%) 146 (16) [M + 1]+, 100 (100) [C5H9NO + 1]+, 82 (24) [C5H7N + 1]+ C6H11NO3 145 g · mol-1 9 Die Stereochemie der Verbindungen wird angenommen aufgrund der L-Konfiguration der eingesetzten Verbindung sowie der cis-3-Selektiviät der verwendeten Prolinhydroxylase. 114 EXPERIMENTELLER TEIL 5.4. Chemische Synthesen 5.4.1. L-Pipecolinsäure ((S)-Pipecolinsäure) H D 5 H H H H H N E 6 3 4 H C 2 = 1 H O B H OH H A N H CO2H Für die Synthese von L-Pipecolinsäure wurden 5.0 g (27.3 mmol) L-Lysin-hydrochlorid in 100 mL Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde mit 4 M Natronlauge auf 9.5 eingestellt. Nach Erhitzen der Lösung auf 60 °C wurden unter kräftigen Rühren 9.6 g (32.2 mmol) Dinatrium-Nitrosyl-pentacyanoferrat(II) Dihydrat zugegeben (Abb. 84). Abb. 84: Versuchsaufbau der Synthese von L-Pipecolinsäure. Die Aufrechterhaltung des pH-Wertes erfolgte durch tropfenweise Zugabe von 4 M Natronlauge (pH-Wert Kontrolle über ein pH-Meter). Nach 4 Stunden unter Rühren bei 60 °C wurde der Reaktionsansatz abgekühlt, filtriert und mit 6 M Salzsäure auf pH 5.5 angesäuert. Der Gesamtverbrauch an 4 M Natronlauge betrug 12.5 mL während der gesamten Reaktion. Im Anschluss wurde das Lösungsmittel unter verminderten Druck am Rotationsverdampfer entfernt. Die Reinigung des Produktes erfolgte durch Säulenchromatographie an Kieselgel (220 g) mit deionisiertem Wasser als Laufmittel und ergab 0.27 g L-Pipecolinsäure (Ausbeute 8%) in Form eines weißen Feststoffes. 115 EXPERIMENTELLER TEIL H D 5 H H H C 3 4 H OH H H N E H A H H NMR N H O B 1 = 1 2 H 6 CO2H (400 MHz, D2O) δ = 1.55 (m, 3H, 2 x CH2-E, CH2-C), 1.79 (m, 2H, 2 x CH2-D, CH2-D), 2.13 (m, 1H, CH2-C), 2.91 (dt, J = 12.1 Hz, J = 3.0 Hz, 1H, CH2-B), 3.33 (td, J = 12.8 Hz, J = 3.6 Hz, 1H, CH2-B), 3.49 (dd, J = 11.4 Hz, J = 3.4 Hz, 1H, CH-A) H D 5 H H H H 6 H H N E C 3 4 2 H C NMR = 1 H O B 13 OH H A 116 CO2H (100 MHz, D2O) δ = 21.5 (C-4), 21.8 (C-5), 26.5 (C-3), 43.6 (C-6), 58.9 (C-2), 174.7 (C-1) C6H11NO2 N H 129 g · mol-1 EXPERIMENTELLER TEIL 5.4.2. cis-4-Chlor-L-prolin und cis-4-Azid-L-prolin 5.4.2.1 N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester ist Ausgangsprodukt der Synthese von cis-4-Chlor-L-prolin und cis-4-Azid-L-prolin. trans-4-Hydroxy-L-prolinethylester ((2S,4R)-4-Hydroxyprolinethylester) HO O N H O 4.0 g (30.5 mmol) trans-4-Hydroxy-L-prolin wurden in 16 mL trockenem Ethanol suspendiert. Mit einer Spritze wurden über ein Septum 2.7 mL (36.6 mmol) Thionylchlorid langsam zugetropft, 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt und anschließend über Nacht (16 h) bei Raumtemperatur weiter gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und die farblosen Kristalle wurden mit Ethylacetat gewaschen. Auf diese Weise wurden 5.9 g (37.1 mmol) Rohprodukt von trans-4-Hydroxy-L-prolinethylester erhalten (Rohausbeute >98%). N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester ((2S,4R)-1-tert-Butoxycarbonyl-4-hydroxy-L-prolinethylester) HO O N O O O 1.0 g (6.3 mmol) trans-4-Hydroxy-L-prolinethylester wurden in 3 mL Dioxan suspendiert und mit 1.35 mL (7.3 mmol) Triethylamin versetzt. 1.6 g (7.3 mmol) Di-tert-Butyldicarbonat wurden zunächst in 7 mL Dioxan gelöst und zu dem Ansatz zugetropft. Anschließend wurde eine Spatelspitze Dimethylaminopyridin zugegeben und der Ansatz über Nacht (18 h) bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde das Rohprodukt in Ethylacetat gelöst und je dreimal mit 40 mL 1 M Citronensäure, 40 mL 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 40 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter 117 EXPERIMENTELLER TEIL vermindertem Druck eingeengt. Anschließend wurde Petrolether zugegeben und der Ansatz wurde bei 4 °C inkubiert. Nach drei Tagen wurde der Petrolether abdekantiert, der Bodensatz mit etwas Petrolether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 0.36 g Rohprodukt (Rohausbeute 22.1%) erhalten. 8 A B 7 O C 1 H O H D H 4 6 O 9 10 5 O E HO H NMR G 10 N 3 H 1 10 2 H H F (400 MHz, CDCl3) δ = 1.25 (t, J = 7.14 Hz, 3H, CH3-A), 1.38 (s, 6H,CH3-G), 1.42 (s, 3H, CH3-G), 2.02 (m, 1H, CH2-D), 2.26 (m, 1H, CH2-D), 3.51 (td, J = 11.58 Hz, J = 1.84 Hz, 1H, CH2-F), 3.58 (dd, J = 11.58 Hz, J = 4.4 Hz, 1H, CH2-F), 4.15 (m, 2H, CH2-B), 4.35 (m, 1H, CH-C), 4.43 (m, 1H, CH-E) 8 A B 7 O C H 1 O H D H 4 6 O 9 10 5 O E HO C NMR G 10 N 3 H 13 10 2 H H F (100 MHz, CDCl3) δ = 14.2 (C-8), 28.3 (C-10), 39.0 (C-3), 54.7 (C-5), 58.1 (C-2), 61.1 (C-7), 69.2 (C-4), 80.3 (C-9), 154.1 (C-6), 173.3 (C-1) C12H21NO5 118 259 g · mol-1 EXPERIMENTELLER TEIL 5.4.2.2. cis-4-Chlor-L-prolin ((2S,4S)-4-Chloroprolin) N-tert-Butoxycarbonyl-cis-4-chlor-L-prolinethylester ((2S,4S)-1-tert-Butoxycarbonyl-4chloroprolinethylester) Cl O N O O O 260 mg (1 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester wurden in 5 mL trockenem Dichlormethan und 5 mL Tetrachlormethan gelöst, mit 0.55 g (2.1 mmol) Triphenylphosphin versetzt und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 500 µL Ethanol wurde über Nacht (15 h) weiter gerührt. Zur Aufarbeitung wurde die Lösung zunächst bei vermindertem Druck auf ca. 5 mL eingeengt, auf -20 °C abgekühlt und durch Zugabe von 5 mL Diethylether wurde ein weißer Feststoff ausgefällt. Durch Vakuumfiltration wurde der Feststoff entfernt, das Filtrat mit 5 mL Diethylether gewaschen und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.10 Die Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Diethylether / n-Hexan 1 : 1) und ergab 0.128 g (0.46 mmol) Rohprodukt (Rohausbeute 46%). cis-4-Chlor-L-prolinethylester ((2S,4S)-4-Chloroprolinethylester) Cl O N H O 0.128 g (0.46 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-cis-4-chlor-L-prolinethylester wurden in 4 mL Dichlormethan gelöst, auf 0 °C gekühlt und tropfenweise mit insgesamt 4 mL Trifluoressigsäure versetzt. Nach 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde der Ansatz bei vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 0.179 g Rohprodukt (Rohausbeute >98%) erhalten. 10 Die Fritte oder Nutsche sowie die Saugflasche und der Diethylether zum waschen wurden vorher für ca. 30 min bei - 20 °C gelagert. 119 EXPERIMENTELLER TEIL cis-4-Chlor-L-prolin ((2S,4S)-4-Chloroprolin) Cl OH N H O 0.179 mg cis-4-Chlorprolinethylester wurden in 20 mL Methanol gelöst, tropfenweise mit insgesamt 3 mL 1 M Natronlauge versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde 100 mL deionisiertes Wasser zugegeben, und das cis-4-Chlorprolin über Anionentauscherharz isoliert (Durchführung siehe Isolierung der hydroxylierten Produkte).11 HO 1 C H O A H 2 H NH 3 5 Cl 4 H 1 H NMR D H H B (400 MHz, MeOD) δ = 2.68 (ddt, J = 14.7 Hz, J = 4.11 Hz, J = 2.25 Hz, 1H, CH2-A), 2.98 (ddd, J = 14.69 Hz, J = 10.22 Hz, J = 5.57 Hz, 1H, CH2-A), 3.70 (td, J = 12.87 Hz, J = 1.82 Hz, 1H, CH2-B), 3.79 (dd, J = 12.88 Hz, J = 4.90 Hz, 1H, CH2-B), 4.65 (dd, J = 10.30 Hz, J = 4.11 Hz, 1H, CH-C), 4.85 (m, 1H, CH-D) 11 Die Ausbeute an cis-4-Chlor-L-prolins wurde nicht bestimmt, da sich nach der Anionentauschersäule noch Natriumchlorid in der Produktfraktion befand. 120 EXPERIMENTELLER TEIL HO 1 C H O A H 2 H NH 3 5 Cl 4 H 13 D H H B (100 MHz, MeOD) δ = 38.3 (C-3), 54.5 (C-5), 55.3 (C-4), 58.2 (C-2), 169.6 C NMR (C-1) m/z (%) 150 (11) [M + 1]+, 104 (100) [C4H6ClN + 1]+, 87 (21), 86 (13), 69 (6) MS [C4H6N + 1]+, 68 (20) [C4H5N + 1]+ 149 g · mol-1 C5H8ClNO2 5.4.2.3. cis-4-Azid-L-prolin ((2S,4S)-4-Azidoprolin) N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-mesyl-L-prolinethylester ((2S,4R)-1-tert-Butoxycarbonyl4-(methylsulfonyloxy)prolin) O S O CH3 O O N O O O 0.66 g (2.55 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-hydroxy-L-prolinethylester wurden in trockenem Pyridin gelöst, auf 0 °C abgekühlt, tropfenweise mit 420 µL Methansulfonylchlorid (5.35 mmol) versetzt und über Nacht (18 h) bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst und je dreimal mit 40 mL 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 121 EXPERIMENTELLER TEIL 40 mL 1 M Citronensäure und 40 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 0.62 g Rohprodukt erhalten (Rohausbeute: 73%). N-tert-Butoxycarbonyl-cis-4-azid-L-prolinethylester ((2S,4S)-1-tert-Butoxycarbonyl-4azidoprolin) N3 O N O O O 0.6 g (1.87 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-trans-4-mesyl-L-prolinethylester wurden in 20 mL Dimethylformamid gelöst und mit 0.55 g (8.5 mmol) Natriumazid versetzt. Anschließend wurde auf 55 °C erhitzt und über Nacht (16 h) gerührt. Nach Zugabe von 200 mL Eiswasser zu dem Reaktionsgemisch wurde zweimal mit 50 mL Ethylacetat, zweimal mit 80 mL Ethylacetat und anschließend dreimal mit 50 mL Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase mit Magnesiumsulfat wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Es wurden 0.42 g eines gelblichen Öls erhalten (Rohausbeute: 79%). cis-4-Azid-L-prolinethylester ((2S,4S)-4-Azidoprolinethylester) N3 O N H O 0.40 g N-tert-Butoxycarbonyl-cis-4-azid-L-prolinethylester wurden in 15 mL Dichlormethan gelöst, auf 0 °C abgekühlt, tropfenweise mit insgesamt 15 mL Trifluoressigsäure versetzt und für 6 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Nach Aufreinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Ethylacetat / Essigsäure / Methanol / Wasser 14 : 3 : 3 : 2) wurden 0.22 g Rohprodukt erhalten (Rohausbeute: 84%). 122 EXPERIMENTELLER TEIL cis-4-Azid-L-prolin (((2S,4S)-4-Azidoprolin) N3 OH N H O 0.22 g cis-4-Azid-L-prolinethylester wurden in 20 mL Methanol gelöst, mit insgesamt 3 mL 1 M Natronlauge versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde 100 mL deionisiertes Wasser zugegeben und das cis-4-Azidprolin über Anionentauscherharz isoliert (Durchführung siehe Isolierung der hydroxylierten Produkte).12 HO 1 C H O H 2 A H NH 3 5 N3 4 H 1 H NMR D H H B (400 MHz, MeOD) δ = 2.46 (td, J = 14.1 Hz, J = 2.11 Hz, 1H, CH2-A), 2.70 (ddd, J = 14.49 Hz, J = 9.44 Hz, J = 5.37 Hz, 1H, CH2-A), 3.47 (d, J = 12.36 Hz, 1H, CH2-B), 3.55 (dd, J = 12.57 Hz, J = 4.70 Hz, 1H, CH2-B), 4.56 (m, 2H, CH-C, CH-D) 12 Die Ausbeute an cis-4-Azid-L-prolin wurde nicht bestimmt, da sich nach der Anionentauschersäule noch Natriumchlorid in der Produktfraktion befand. 123 EXPERIMENTELLER TEIL HO 1 C H O H 2 A H NH 3 5 N3 4 H 13 D H H B (100 MHz, MeOD) δ = 34.0 (C-3), 50.8 (C-5), 58.2 (C-2), 59.3 (C-4), 169.5 C NMR (C-1) m/z (%) 157 [M + 1]+ (6), 111 [C4H6N4 + 1]+ (9), 100 (9), 83 [C4H6N2 + 1]+ MS (51), 82 [C4H6N2]+, 68 [C4H5N + 1]+, 56 (100) [C3H5N + 1]+, 54 (49) 156 g · mol-1 C5H8N4O2 5.4.3. Versuche zur Synthese von trans-3-Chlor-L-prolin und trans-3Azid-L-prolin cis-3-Hydroxy-L-prolinethylester ((2S,3R)-3-Hydroxyprolinethylester) OH O N H O 1.5 g (11.5 mmol) des aus dem in vivo Verfahren selbst hergestellten cis-3-Hydroxy-L-prolin wurden in 16 mL trockenem Ethanol suspendiert. Mit einer Spritze wurden über ein Septum 1 mL (14 mmol) Thionylchlorid langsam zugetropft, 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt und anschließend über Nacht (16 h) bei Raumtemperatur weiter gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und die Kristalle mit Ethylacetat gewaschen. Auf diese Weise wurden 1.8 g (11.3 mmol) Rohprodukt von cis-3-Hydroxy-L-prolinethylester erhalten (Rohausbeute >95%). 124 EXPERIMENTELLER TEIL N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-hydroxy-L-prolinethylester ((2S,3R)-1-tert-Butoxycarbonyl3-hydroxyprolinethylester OH O N O O O 1.8 g (11.3 mmol) cis-3-Hydroxy-L-prolinethylester wurden in 6 mL Dioxan suspendiert und mit 2.26 mL (15.6 mmol) Triethylamin versetzt. 2.62 g (12.0 mmol) Di-tert-Butyldicarbonat wurden zunächst in 14 mL Dioxan gelöst und zu dem Ansatz zugetropft. Anschließend wurden zwei Spatelspitzen Dimethylaminopyridin zugegeben und der Ansatz über Nacht (18 h) bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde das Rohprodukt in Ethylacetat gelöst und je dreimal mit 40 mL 1 M Citronensäure, 40 mL 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 40 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Anschließend wurde Petrolether zugegeben und der Ansatz wurde bei 4 °C inkubiert. Nach drei Tagen wurde der Petrolether abdekantiert, der Bodensatz mit etwas Petrolether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 2.11 g Rohprodukt (Rohausbeute 72.9%) erhalten. 8 A B 7 O C H 1 O D HO H 4 O 9 10 O H (Roh-NMR) 6 5 E H NMR G 10 N 3 H 1 10 2 H H F (400 MHz, CDCl3) δ = 1.28 (m, 3H, CH3-A), 1.42 (s, 6H,CH3-G), 1.49 (s, 3H, CH3-G), 2.01 (m, 2H, CH2-E), 3.48 (m, 1H, CH2-F), 3.67 (m, 1H, CH2-F), 4.23 (m, 3H, CH2-B, CH-C), 4.60 (m, 1H, CH-D) 125 EXPERIMENTELLER TEIL 8 A B 7 O C H 1 O D HO 10 G 2 H 10 N 3 4 6 O 9 10 5 O H E H H H F 13 (100 MHz, CDCl3) δ = 14.3 (C-8), 28.2 (C-10), 31.6 (C-4), 43.5 (C-5), (Roh-NMR) 60.9 (C-7), 63.7 (C-2), 75.0 (C-3), 80.2 (C-9), 153.2 (C-6), 171.1 (C-1) C12H21NO5 259 g · mol-1 C NMR N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-mesyl-L-prolinethylester ((2S,3R)-1-tert-Butoxycarbonyl-3(methylsulfonyloxy)prolinethylester) O O S O CH3 O N O O O 0.31 g (1.18 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-hydroxy-L-prolinethylester wurden in 7 ml trockenem Pyridin gelöst, auf 0 °C abgekühlt, tropfenweise mit 210 µL Methansulfonylchlorid (2.68 mmol) versetzt und über Nacht (18 h) bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst und je dreimal mit 40 mL 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 40 mL 1 M Citronensäure und 40 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 0.308 g Rohprodukt erhalten (Rohausbeute: 79%). 126 EXPERIMENTELLER TEIL A 8 B 7 11 O O H CH3 S 1 H C O O O D H 4 10 O H (Roh-NMR) 9 O 6 5 E H NMR G 10 N 3 H 1 10 2 H H F (400 MHz, CDCl3) δ = 1.30 (m, 3H, CH3-A), 1.42 (s, 6H,CH3-G), 1.49 (s, 3H, CH3-G), 2.10 (m, 2H, CH2-E), 3,04 (s, 3H, CH3-H) 3.58 (m, 1H, CH2-F), 3.69 (m, 1H, CH2-F), 4.24 (m, 3H, CH2-B, CH-C), 4.61 (m, 1H, CH-D) 8 A B 7 11 O O H CH3 S H 1 C O O O 10 G 2 D H 10 N 3 4 6 O 9 10 5 O H E H H H F 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ = 14.3 (C-8), 28.2 (C-10), 31.6 (C-4), 38.5 (C-11), 43.5 (Roh-NMR) (C-5), 60.9 (C-7), 63.7 (C-2), 75.0 (C-3), 80.2 (C-9), 153.2 (C-6), 171.1 (C-1) C13H23NO7S 337 g · mol-1 127 EXPERIMENTELLER TEIL Syntheseschritt N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-hydroxy-L-prolinethylester zu N-tert- Butoxycarbonyl-trans-3-chlor-L-prolinethylester CCl2H2 OH Cl CCl4 O O N N O O O 18 h, RT O O O 0.5 g (1.9 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-hydroxy-L-prolinethylester wurden in 10 mL trockenem Dichlormethan und 10 mL Tetrachlormethan gelöst, mit 1.15 g (3.8 mmol) Triphenylphosphin versetzt und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 1000 µL Ethanol wurde über Nacht (15 h) weiter gerührt. Zur Aufarbeitung wurde die Lösung zunächst bei vermindertem Druck auf ca. 5 mL eingeengt, auf -20 °C abgekühlt und durch Zugabe von 20 mL Diethylether wurde ein weißer Feststoff ausgefällt. Durch Vakuumfiltration wurde der Feststoff entfernt, das Filtrat mit 10 mL Diethylether gewaschen und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.13 Die Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Diethylether / n-Hexan 1 : 1). Es konnte jedoch kein N-tert-Butoxycarbonyl-trans-3-chlor-L-prolinethylester erhalten werden. Syntheseschritt N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-mesyl-L-prolinethylester zu N-tert-Butoxycarbonyl-trans-3-azid-L-prolinethylester O O S O CH3 O NaN3 DMF N3 O N O O O N Pyridin, 18 h, 0 ° O RT O O 0.27 g (0.79 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-cis-3-mesyl-L-prolinethylester wurden in 10 mL Dimethylformamid gelöst und mit 0.27 g (4.2 mmol) Natriumazid versetzt. Anschließend wurde auf 55 °C erhitzt und über Nacht (16 h) gerührt. Nach Zugabe von 150 mL Eiswasser zu dem Reaktionsgemisch wurde eimal mit 50 mL Ethylacetat, eimal mit 80 mL Ethylacetat 13 Die Fritte oder Nutsche sowie die Saugflasche und der Diethylether zum waschen wurden vorher für ca. 30 min bei - 20 °C gelagert. 128 EXPERIMENTELLER TEIL und anschließend dreimal mit 50 mL Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase mit Magnesiumsulfat wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Es konnte jedoch kein N-tert-Butoxycarbonyl-trans-3-azid-L-prolinethylester erhalten werden. 129 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6. Abkürzungsverzeichnis [α]D20 Spezifische Drehung, gemessen bei 20 °C und der Natrium-D-Linie Abb Abbildung ADAM 1-Adamantanamin Amp Ampicillin amu Atom Massen Einheit Äq Äquivalent BSA Rinderserumalbumin C-C Kohlenstoff-Kohlenstoff C-H Kohlenstoff-Wasserstoff Cm Chloramphenicol COSY Correlation Spectroscopy (NMR-Messtechnik Untersuchung der Kopplungen benachbarter Protonen) Da Dalton DC Dünnschichtchromatographie del deletition DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure EC Enzyme Commission E. coli Escherichia coli et al. und andere f forward FAD / FADH2 Flavinadenindinukleotid (oxidierte / reduzierte Form) Fe Eisen FLD Fluoreszenz-Detektor FMOC 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid h Stunden H2Odemin deionisiertes Wasser 130 für die ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (NMR-Messtechnik für die Untersuchung der Kopplung von Protonen zu weiter entfernten Kohlenstoff-Atomen) HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatograhie (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence (NMR-Messtechnik für die Untersuchung der direkten Kopplung von Protonen an Kohlenstoff-Atome) Hyp Hydroxyprolin ins insertion IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid J Kopplungskonstante [Hz] Kan Kanamycin kb Kilobasenpaare KG Ketoglutarat LB Luria Bertani Lu Lux (Einheit für die Beleuchtungsstärke) m Masse M Molare Masse in g/mol oder Molare Konzentration in mol/L m/v Masse / Volumen-Verhältnis m/z Masse / Ladung-Verhältnis MeOH / MeOD Methanol / deuteriertes Methanol Mes 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure min Minuten mM Millimolar (Konzentration in mmol/L) MS Massenspektrometrie MS-MS Tandem-Massenspektrometrie NAD+ / NADH Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte / reduzierte Form) NADP+ / NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (oxidierte / reduzierte Form) ng Nanogramm 131 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS nM Nanomolar (Konzentration in nmol/L) NMR Kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance) NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy (NMR- Messtechnik für die Zuordnung räumlich benachbarter Protonen) NTA Nitrilo-tri-Essigsäure PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase Kettenreaktion ppm parts per million r revers rel relative ROESY Rotating Frame Overhause Effect Spectroscopy (NMR- Messtechnik für die Zuordnung räumlich benachbarter Protonen) RT Raumtemperatur Rt Retentionszeit s Sekunden SDM Site-Directed-Mutagenesis SDS Sodiumdodecylsulfat sp. / spp. Art (species) Sr Substrat T Reaktionstemperatur [°C] TAE Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure TB Terrific Broth TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure TOCSY Total Correlated Spectroscopy Signal Improved (NMR- Messtechnik, bei der Protonen über ihre Kopplungen miteinander korreliert werden) Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan µM Mikromolar (Konzentration in µmol/L) UpM Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett 132 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS v/v Volumen / Volumen-Verhältnis VIS Visuell wahrnehmbares Licht, optisches Fenster 2xYT Name für ein Vollmedium δ Chemische Verschiebung [ppm] λ Wellenlänge ---- nicht detektiert * Stopcodon Ø Durchmesser 133 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 7. Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Prolinhydroxylase katalysierte Oxidationen. ........................................................ 1 Abb. 2: Fließschema für die Charakterisierung und Produktion hydroxylierter Produkte mit Prolinhydroxylasen.......................................................................... 2 Abb. 3: Änderung der freien Energie im Reaktionsverlauf. .............................................. 3 Abb. 4: Regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Progesteron durch Rhizopus arrhizus. ................................................................................................. 6 Abb. 5: Struktur von Protoporphyrin IX. ........................................................................... 7 Abb. 6: Allgemeines Katalyseschema der Cytochrom P450 abhängigen Oxidationsreaktion. ............................................................................................... 7 Abb. 7: Vermuteter Reaktionsmechanismus für Intradiol-spaltende Catechol Dioxygenasen. ....................................................................................................... 8 Abb. 8: Hydroperoxidation von Arachidonsäure durch Kaninchen Lipoxygenase. .......... 9 Abb. 9: Allgemeines Reaktionsschema der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen. ........................................................................................................ 10 Abb. 10: Einbringen einer Doppelbindung/Epimerisierung durch das Enzym CarC. ....... 10 Abb. 11: Umsetzung von 4-Hydroxyphenylpyruvat mit den Enzymen HPPD und HMS. ................................................................................................................... 11 Abb. 12: Eisenbindende Triade der α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen. .................. 11 Abb. 13: links: Biskuitrollen-Faltung der Eisen(II)/α-Ketoglutarat abhängigen Oxygenasen. rechts: Kristallstruktur der Isopenicillin N Synthase. ................... 12 Abb. 14: "in-line" Bindemodus. ......................................................................................... 13 Abb. 15: "off-line" Bindemodus. ....................................................................................... 13 Abb. 16: Angenommener Reaktionsmechanismus der α-Ketoglutarat abhängigen Enzyme................................................................................................................ 15 Abb. 17: Angenommener Mechanismus der α-Ketoglutarat abhängigen Einführung einer Doppelbindung. .......................................................................................... 15 Abb. 18: Enzymatische Reaktion der Prolyl-4-Hydroxylase. ............................................ 16 Abb. 19: Enzymatische Reaktion der Prolyl-3-Hydroxylase. ............................................ 16 Abb. 20: 4-Hydroxyprolin in Etamycin. ............................................................................ 17 Abb. 21: Umsetzung von L-Prolin durch Prolinhydroxylasen. .......................................... 18 Abb. 22: Beispiele von Wirkstoffsynthesen ausgehend von Hydroxyprolinen. ................ 18 134 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 23: Fließschema der Extraktionsmethode für die Gewinnung von transHydroxyprolin aus Kollagen. .............................................................................. 19 Abb. 24: Fließschema für die enzymatische Gewinnung von Hydroxyprolin aus L-Prolin................................................................................................................ 19 Abb. 25: Chaperonplasmid pL1SL2 und Vektor pET28 der Fa. Novagen. ....................... 25 Abb. 26: Plasmide pET28b\transP4H und pET28b\cisP3H_I ........................................... 25 Abb. 27: SDS-PAGE der löslichen Fraktionen der Expressionen von transP4H in E. coli BL21 (DE3) RP Codon Plus. ................................................................... 26 Abb. 28: Plasmide pET28b\cisP3H_II und pET28b\cisP4H. ............................................ 27 Abb. 29: Punktmutagenese des Plasmids pET28b\cisP4H. ............................................... 27 Abb. 30: SDS-PAGE der Prolinhydroxylasen. .................................................................. 28 Abb. 31: Auftrennung der Hydroxyproline im HPLC Chromatogramm nach Derivatisierung mit FMOC an einer RP-18 Phase. ............................................. 30 Abb. 32: Farbreaktion von trans-4-Hydroxyprolin mit Ehrlichs Reagenz. ....................... 30 Abb. 33: Hydroxyprolin Produktion mit transP4H, cisP3H_I und cisP4H. ...................... 31 Abb. 34: Hydroxyprolin-Produktion in Abhängigkeit von der Eisen(II) und Eisen(II)/Ascorbinsäure (Verhältnis 1:3) Konzentration.. ................................. 32 Abb. 35: Produktion von trans-4-Hydroxy-L-prolin durch transP4H in Gegenwart von 0.5 mM FeSO4 in Abhängigkeit von der Ascorbinsäurekonzentration. ....... 33 Abb. 36: Umsatz der transP4 in Abhängigkeit von Sauerstoff. ......................................... 34 Abb. 37: Michaelis-Menten Diagramm (oben) und Eadie-Hofstee Auftragung (unten). ............................................................................................. 35 Abb. 38: in vivo Produktion von Hydroxyprolin (Hyp). .................................................... 37 Abb. 39: 1 H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten trans-4-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. ................................................................... 39 Abb. 40: 1 H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten cis-4-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. ............................................................................ 39 Abb. 41: 1 H-NMR Spektrum des in vivo hergestellten cis-3-Hydroxy-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher. ............................................................................ 40 Abb. 42: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. a) transP4H b) cisP4H c) cisP3H_I. .................................. 43 Abb. 43: 1 H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit transP4H. Lösungsmittel: MeOD (400MHz). .................. 44 135 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 44: Kopplung der H-2 und H-3 Wasserstoffatome der cis-3-HydroxyL-pipecolinsäure im 1H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit cisP3H_I. ............................................... 44 Abb. 45: 1 H-NMR Spektrum der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit cisP4H. oben: Signale im 1H-NMR-Spektrum, die zur cis-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure gehören, unten: Signale im 1H-NMRSpektrum, die zur cis-3-Hydroxy-L-pipecolinsäure gehören.. ............................ 45 Abb. 46: 1 H-1H-COSY-NMR Spektrum (oben) und HSQC-NMR Spektrum (unten) der enzymatischen in vitro Umsetung von L-Pipecolinsäure mit cisP4H. .......... 46 Abb. 47: HPLC Chromatogramm der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Azetidin-2-carbonsäure mit cisP3H_II nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. ............................................................. 47 Abb. 48: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Azetidin-2-carbonsäure mit cisP3H_II. .................................................... 48 Abb. 49: HPLC-Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzungen von 3,4-Dehydro-L-prolin mit transP4H, cisP4H, cisP3H_I und cisP3H_II nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase.................. 49 Abb. 50: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von 3,4-Dehydro-L-prolin mit cisP4H. ............................................................... 50 Abb. 51: Reaktionsschema der Einstufensynthese von L-Pipecolinsäure. ......................... 51 Abb. 52: HPLC Chromatogramm der in vivo Umsetzung von L-Pipecolinsäure mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP18 Phase. ............................................................................................................. 51 Abb. 53: 1 H-NMR Spektrum der durch in vivo Umsetzung im HZD-Medium hergestellten trans-5-Hydroxy-L-pipecolinsäure nach Isolierung über Ionentauscher. ..................................................................................................... 52 Abb. 54: HPLC Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von trans-3Hydroxy-L-prolin mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase.. ................................................................... 54 Abb. 55: 1 H-NMR Spektrum des in vivo produzierten trans-2,3-cis-3,4- Dihydroxy-L-prolin mit transP4H nach Isolierung über Ionentauscher. ............ 54 Abb. 56: Allgemeine Reaktionsschema der Mannich Reaktion (oben), Michael Addition (mitte) und Aldol Addition (unten) mit hydroxylierten Prolinanaloga als Katalysator. ............................................................................. 55 136 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 57: HPLC Chromatogramm der enzymatischen in vitro Umsetzung von trans3-Methyl-L-prolin mit transP4H nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. .................................................................... 56 Abb. 58: 1 H-NMR Spektrum des trans-2,4-Hydroxy-trans-2,3-methyl-L-prolin nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen semi-präparativen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit transP4H. ............................ 57 Abb. 59: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II (oben) und cisP4H (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase.................. 58 Abb. 60: 1 H-NMR Spektrum des cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-L-prolins nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen in vivo Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II........................................................ 58 Abb. 61: 1 H-NMR Spektrum (oben), 1H-1H-COSY-NMR Spektrum (mitte) und HSQC-NMR Spektrum (unten) des cis-3-Hydroxy-trans-3-methyl-Lprolins nach Isolierung über Ionentauscher aus der enzymatischen in vivo Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP4H. ............................ 59 Abb. 62: Vergleich der 13C-NMR Spektren der Produkte aus der in vivo Umsetzung von trans-3-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II (rot) und cisP4H (blau). ................ 60 Abb. 63: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit transP4H (oben) und cisP3H_II (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase.................. 61 Abb. 64: 1 H-NMR Spektrum der in vivo Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit transP4H (unten) nach Isolierung über Ionentauscher sowie Kopplungspartner des Signals des 4-Hydroxy-α-methyl-L-prolin bei 4.55 ppm in einem TOCSY-Experiment (oben). ........................................................ 61 Abb. 65: Massenspektrum des Produktes aus der enzymatischen in vitro Umsetzung von α-Methyl-L-prolin mit cisP3H_II. ................................................................ 62 Abb. 66: Reaktionsschema der Synthese von cis-4-Chlor- und cis-4-Azid-L-prolin. ........ 64 Abb. 67: Reaktionsschema der Synthese von trans-3-Chlor- und trans-3-AzidL-prolin. ............................................................................................................... 65 Abb. 68: Identitäten der Aminosäuren und Positionen der katalytischen Triade der Prolinhydroxyasen. ....................................................................................... 66 Abb. 69: Aminosäuresequenzvergleich aller vier Prolinhydroxylasen. ............................. 67 Abb. 70: Gerichtete Mutagenese der transP4H, cisP3H_I und cisP4H. ............................ 69 137 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 71: SDS-PAGE der Produktion von nativer transP4H, von VarianteQ110R sowie von VarianteV105_W106insG. ................................................................. 70 Abb. 72: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin mit transP4H und den beiden Varianten nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. ................................................. 70 Abb. 73: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_I und Variante V104del,R108S (oben) sowie von cisP4H und Variante I103_I104insV,S107R (unten).. ............ 71 Abb. 74: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin mit cisP4H und Variante (oben) sowie cisP3H_I und Variante (unten) nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. .................................................................................................................. 72 Abb. 75: Aktives Zentrum der cisP3H_II (PDB: 1E5S). ................................................... 73 Abb. 76: Vergleich der Aminosäuresequenzen von cisP3H_I und cisP3H_II mit den Aminosäuren (magenta und hellbraun), die vermutlich an der enzymatischen Katalyse beteiligt sind. ............................................................... 74 Abb. 77: Aktives Zentrum der cisP3H und der cisP3H_II. ............................................... 75 Abb. 78: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_I und Variante N43H,I44V. ................ 76 Abb. 79: SDS-PAGE der Produktion von cisP3H_II und Variante H43N,V44I................ 76 Abb. 80: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin (oben) und L-Azetidin-2-carbonsäure (unten) mit cisP3H_I und deren Variante nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. ....................................................................................................... 77 Abb. 81: HPLC Chromatogramme der enzymatischen in vitro Umsetzung von L-Prolin (oben) und L-Azetidin-2-carbonsäure (unten) mit cisP3H_II und dessen Variante nach Derivatisierung mit FMOC und Auftrennung an einer RP-18 Phase. ....................................................................................................... 78 Abb. 82: In der Literatur bisher nicht beschriebene Reaktionen der Prolinhydroxylasen. ............................................................................................ 80 Abb. 83: transP4H katalysierte Produktion von trans-2,3-cis-3,4-Dihydroxy-Lprolin und Beispiele für Inhibitoren der Glycosyltransferase Glucosylceramid-Synthase.................................................................................. 82 Abb. 84: 138 Versuchsaufbau der Synthese von L-Pipecolinsäure. ........................................ 115 TABELLENVERZEICHNIS 8. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Substratselektivität der trans-4- und cis-3-Prolinhydroxylasen.......................... 20 Tabelle 2: Aktivitäten der transP4H und cisP4H. ............................................................... 34 Tabelle 3: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit transP4H.............................. 38 Tabelle 4: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit cisP4H. ................................ 39 Tabelle 5: Ergebnis der in vivo Umsetzung von L-Prolin mit cisP3H_I. ............................. 40 Tabelle 6: Untersuchte α-Ketosäuren. .................................................................................. 42 Tabelle 7: Produktumsatz und isolierte Ausbeute der in vivo Umsetzung von L-Pipecolinsäure Tabelle 8: im Medium 5. .......................................................................... 52 Variationen der Reaktionsbedingungen der in vivo Umsetzung im HZDMedium. .............................................................................................................. 53 Tabelle 9: weitere Prolinanaloga für die Substattestung. ..................................................... 63 Tabelle 10: synthetisierte Verbindungen. ............................................................................... 63 Tabelle 11: Zusammensetzungen der Vollmedien. ................................................................ 87 Tabelle 12: Zusammensetzung der Minimalmedien. ............................................................. 88 Tabelle 13: Konzentrationen der Antibiotika. ........................................................................ 89 Tabelle 14: Konzentrationen sonstiger Additiva. ................................................................... 89 Tabelle 15: Zusammensetzung der Polyacrylamid-Gele. ...................................................... 92 Tabelle 16: Zusammensetzung der Puffer-, Oxidations- und Färbelösung. ........................... 93 Tabelle 17: Verwendete Bakterienstämme. ............................................................................ 95 Tabelle 18: Verwendete Vektoren. ......................................................................................... 95 Tabelle 19: Verwendete Plasmide. ......................................................................................... 97 Tabelle 20: Verwendete Oligonukleotide. .............................................................................. 98 139 ANHANG 9. Anhang 9.1. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der transP4H Dactylosporangium sp. RH1 Nukleotidsequenz 1 atgctgaccc cgaccgaact gaaacagtac cgtgaagctg gttacctgct gatcgaagac 61 ggtctgggtc cgcgtgaagt tgactgcctg cgtcgtgctg ctgctgctct gtacgctcag 121 gactctccgg accgtaccct ggaaaaagac ggtcgtaccg ttcgtgctgt tcacggttgc 181 caccgtcgtg acccggtttg ccgtgacctg gttcgtcacc cgcgtctgct gggtccggct 241 atgcagatcc tgtctggtga cgtttacgtt caccagttca aaatcaacgc taaagctccg 301 atgaccggtg acgtttggcc gtggcaccag gactacatct tctgggctcg tgaagacggt 361 atggaccgtc cgcacgttgt taacgttgct gttctgctgg acgaagctac ccacctgaac 421 ggtccgctgc tgttcgttcc gggtacccac gaactgggtc tgatcgacgt tgaacgtcgt 481 gctccggctg gtgacggtga cgctcagtgg ctgccgcagc tgtctgctga cctggactac 541 gctatcgacg ctgacctgct ggctcgtctg accgctggtc gtggtatcga atctgctacc 601 ggtccggctg gttctatcct gctgttcgac tctcgtatcg ttcacggttc tggtaccaac 661 atgtctccgc acccgcgtgg tgttgttctg gttacctaca accgtaccga caacgctctg 721 ccggctcagg ctgctccgcg tccggaattc ctggctgctc gtgacgctac cccgctggtt 781 ccgctgccgg ctggtttcgc tctggctcag ccggtttaa Aminosäuresequenz 1 10 20 30 40 50 | | | | | | MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREVDCLRRAAAALYAQDSPDRTLEKD GRTVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSGDVYVHQFKINAKAP MTGDVWPWHQDYIFWAREDGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPLLFVPGTH ELGLIDVERRAPAGDGDAQWLPQLSADLDYAIDADLLARLTAGRGIESAT GPAGSILLFDSRIVHGSGTNMSPHPRGVVLVTYNRTDNALPAQAAPRPEF LAARDATPLVPLPAGFALAQPV* 140 aus ANHANG 9.2. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP4H aus Sinorhizobium meliloti Nukleotidsequenz 1 atgagcaccc atttcttggg caaggtcaag ttcgatgaag cgcgattggc agaagatcta 61 tctaccttgg aagttgccga gttctcgagt gcatactcgg acttcgcgtg cggtaaatgg 121 gaggcatgcg tgctacgcaa tcggaccgga atgcaggagg aagatatcgt cgtaagtcac 181 aacgctcctg cactggccac gccgctgagc aagtcgctgc cgtatctgaa cgaacttgtt 241 gaaacccact tcgattgcag cgctgttcgg tatacaagaa ttgtccgtgt atcagaaaac 301 gcatgtataa tcccccatag tgattaccta gaactagatg agaccttcac aaggttacac 361 ctggtgttag acactaattc aggatgcgct aatactgagg aagataaaat atttcatatg 421 ggactgggag agatttggtt ccttgacgct atgttaccgc atagcgctgc ttgtttttcc 481 aaaactccgc gcctgcatct gatgatcgac tttgaggcta ccgcttttcc cgaatctttt 541 ctgcgaaatg tcgaacaacc agtgacaaca cgagacatgg ttgatcctcg gaaggaacta 601 accgatgagg ttatcgaagg tattctgggg ttttcaataa ttattagcga agccaattac 661 cgggaaattg tttctattct ggcgaagcta cacttcttct acaaggcaga ctgtcgatca 721 atgtacgact ggctgaagga aatctgcaaa cgtcgagggg atcctgcact tattgaaaag 781 accgcctcgc tcgagcgatt ttttctaggg caccgtgaac gtggcgaggt gatgacatac Aminosäuresequenz 1 10 20 30 40 50 | | | | | | MSTHFLGKVKFDEARLAEDLSTLEVAEFSSAYSDFACGKWEACVLRNRTG MQEEDIVVSHNAPALATPLSKSLPYLNELVETHFDCSAVRYTRIVRVSEN ACIIPHSDYLELDETFTRLHLVLDTNSGCANTEEDKIFHMGLGEIWFLDA MLPHSAACFSKTPRLHLMIDFEATAFPESFLRNVEQPVTTRDMVDPRKEL TDEVIEGILGFSIIISEANYREIVSILAKLHFFYKADCRSMYDWLKEICK RRGDPALIEKTASLERFFLGHRERGEVMTY 141 ANHANG 9.3. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP3H_I aus Streptomyces sp. TH1 Nukleotidsequenz 1 atgcgttctc acatcctggg tcgtatcgaa ctggaccagg aacgtctggg tcgtgacctg 61 gaatacctgg ctaccgttcc gaccgttgaa gaagaatacg acgaattctc taacggtttc 121 tggaaaaaca tcccgctgta caacgcttct ggtggttctg aagaccgtct gtaccgtgac 181 ctggaaggtt ctccggctca gccgaccaaa cacgctgaac aggttccgta cctgaacgaa 241 atcatcacca ccgtttacaa cggtgaacgt ctgcagatgg ctcgtacccg taacctgaaa 301 aacgctgttg ttatcccgca ccgtgacttc gttgaactgg accgtgaact ggaccagtac 361 ttccgtaccc acctgatgct ggaagactct ccgctggctt tccactctga cgacgacacc 421 gttatccaca tgcgtgctgg tgaaatctgg ttcctggacg ctgctgctgt tcactctgct 481 gttaacttcg ctgaattctc tcgtcagtct ctgtgcgttg acctggcttt cgacggtgct 541 ttcgacgaaa aagaagcttt cgctgacgct accgtttacg ctccgaacct gtctccggac 601 gttcgtgaac gtaaaccgtt caccaaagaa cgtgaagctg gtatcctggc tctgtctggt 661 gttatcggtc gtgaaaactt ccgtgacatc ctgttcctgc tgtctaaagt tcactacacc 721 tacgacgttc acccgggtga aaccttcgaa tggctggttt ctgtttctaa aggtgctggt 781 gacgacaaaa tggttgaaaa agctgaacgt atccgtgact tcgctatcgg tgctcgtgct 841 ctgggtgaac gtttctctct gaccacctgg taa Aminosäuresequenz 1 10 20 30 40 50 | | | | | | MRSHILGRIELDQERLGRDLEYLATVPTVEEEYDEFSNGFWKNIPLYNAS GGSEDRLYRDLEGSPAQPTKHAEQVPYLNEIITTVYNGERLQMARTRNLK NAVVIPHRDFVELDRELDQYFRTHLMLEDSPLAFHSDDDTVIHMRAGEIW FLDAAAVHSAVNFAEFSRQSLCVDLAFDGAFDEKEAFADATVYAPNLSPD VRERKPFTKEREAGILALSGVIGRENFRDILFLLSKVHYTYDVHPGETFE WLVSVSKGAGDDKMVEKAERIRDFAIGARALGERFSLTTW* 142 ANHANG 9.4. Nukleotid- und Aminosäuresequenz der cisP3H_II aus Streptomyces sp. TH1 Nukleotidsequenz 1 atgcgctctc atattctggg taaaattgaa ctggaccaaa cccgcctggc cccggacctg 61 gcttatctgg ctgctgtgcc gaccgtggaa gaagaatatg atgaattttc taacggcttc 121 tggaaacatg tgccgctgtg gaatgctagc ggtgattctg aagaccgcct gtatcgtgat 181 ctgaaagatg cggcggcaca gccgaccgca catgtcgaac acgtgccgta cctgaaagaa 241 attgttacca cggtctttga cggcacgcat ctgcaaatgg ctcgctcacg taacctgaaa 301 aatgcgattg ttatcccgca ccgcgatttc gtcgaactgg atcgtgaagt ggaccgctac 361 tttcgtacct tcatggtgct ggaagactcg ccgctggcgt ttcatagcaa cgaagatacc 421 gttattcaca tgcgcccggg tgaaatctgg tttctggatg ctgcgacggt gcattcggcc 481 gttaatttca gtgaaatttc ccgtcagtca ctgtgcgtcg attttgcatt cgacggcccg 541 tttgatgaaa aagaaatctt cgccgacgca accctgtatg ctccgggtag cacgccggat 601 ctgccggaac gtcgcccgtt taccgcggaa caccgtcgcc gtattctgtc cctgggccaa 661 gttatcgaac gcgaaaactt tcgtgatatc ctgttcctgc tgtcaaaagt tcattataaa 721 tacgacgtcc acccgtctga aacgtacgat tggctgattg aaatcagtaa acaggccggt 781 gatgaaaaaa tggtggttaa agcagaacaa atccgtgact ttgctgtgga agcccgtgcc 841 ctgtccgaac gcttttctct gacctcgtgg Aminosäuresequenz 1 10 20 30 40 50 | | | | | | MRSHILGKIELDQTRLAPDLAYLAAVPTVEEEYDEFSNGFWKHVPLWNAS GDSEDRLYRDLKDAAAQPTAHVEHVPYLKEIVTTVFDGTHLQMARSRNLK NAIVIPHRDFVELDREVDRYFRTFMVLEDSPLAFHSNEDTVIHMRPGEIW FLDAATVHSAVNFSEISRQSLCVDFAFDGPFDEKEIFADATLYAPGSTPD LPERRPFTAEHRRRILSLGQVIERENFRDILFLLSKVHYKYDVHPSETYD WLIEISKQAGDEKMVVKAEQIRDFAVEARALSERFSLTSW 143 ANHANG 9.5. Alignments Die Alignments auf Aminosäureebene wurden mit ClustalW durchgeführt.[113] Das Zeichen “*“ steht für identische Aminosäuren, das Zeichen “:“ markiert hoch konservierte Bereiche, das Zeichen “.“ zeigt ungleiche aber ähnliche Aminosäuren an. 9.5.1. Alignment transP4H und cisP4H transP4H MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREVDCLRRAAAALYAQDSPDRTLE-KDGRTVRAVHG cisP4H -MSTHFLGKVKFDEARLAED-LSTLEVAEFSSAYSDFACGKWEACVLRNRTGMQEEDIVV ::. * : : * ** *.. ** : * : : . . .*. : * . : transP4H CHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSGDVYVHQFKINAKAPMTGDVWPWHQDYIFWARED cisP4H SHNAPALATPLSKSLPYLN-ELVETHFDCSAVRYTRIVRVSENACIIPHSDYLELDETFT .*. .:. * : *. : * . ::. .:.. .. : * : : transP4H GMDRPHVVNVAVLLDEATHLN----GPLLFVPGTHELGLIDVERRAPAGDGDAQWLPQLS cisP4H RLHLVLDTNSGCANTEEDKIFHMGLGEIWFLDAMLPHSAACFSKTPRLHLMIDFEATAFP :. .* . * :: * : *: . . ..: . . :. transP4H ADLDYAIDADLLARLTAGRGIESATGPAGSILLFDSRIVHGSG---TNMSPHPRGVVLVT cisP4H ESFLRNVEQPVTTRDMVDPRKELTDEVIEGILGFSIIISEANYREIVSILAKLHFFYKAD .: :: : :* .. * : .** *. * ... transP4H YNRTDNALPAQAAPRPEFLAARDATPLVPLPAGFALAQPV--- cisP4H CRSMYDWLKEICKRRGDPALIEKTASLERFFLGHRERGEVMTY . : * . * : ..::.* : *. ..: .: : . . * 9.5.2. Alignment transP4H und cisP3H_I transP4H ----MLTPTELKQY---REAGYLLIEDGLGPREVDCLR---RAAAALYAQDSPDRTLEKD 50 cisP3H_I MRSHILGRIELDQERLGRDLEYLATVPTVEEEYDEFSNGFWKNIPLYNASGGSEDRLYRD 60 :* **.* *: ** : . : . : . *....: * :* transP4H GRTVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSGDVYVHQFKINAK--APMTGDVWPW 108 cisP3H_I LEGSPAQPTKHAEQVPYLNEIITTVYNGERLQMARTRNLKNAVVIPHRDFVELDRELDQY 120 . 144 * * .: : : . * :*: : . * : . : :: : ANHANG transP4H HQDYIFWARE------DGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPLLFVPGTHELGLIDVERRAP 162 cisP3H_I FRTHLMLEDSPLAFHSDDDTVIHMRAGEIWFLDAAAVHSAVNFAEFSRQSLCVDLAFDG- 179 .: ::: . *. *: : : :*: ::..: *. ::: :*: . transP4H AGDGDAQWLPQLSADLDYAIDADLLARLTAGR--GIESATGPAG-----SILLFDSRIVH 215 cisP3H_I AFDEKEAFADATVYAPNLSPDVRERKPFTKEREAGILALSGVIGRENFRDILFLLSKVHY 239 * * . : : : *. :* * ** : :* * .**:: *:: : transP4H GSGTNMSPHPRGVVLVTYNRTDNALPAQAAPRPEFLAARDATPLVPLPAGFALAQPV 272 cisP3H_I TYDVHPGETFEWLVSVSKGAGDDKMVEKAERIRDFAIG-----ARALGERFSLTTW- 290 ..: . . :* *: . *: : :* :* . .* *:*: 9.5.3. Alignment transP4H und cisP3H_II transP4H ----MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREVDC------LRRAAAALYAQDSPDRTLEKD 50 cisP3H_II MRSHILGKIELDQTRLAPDLAYLAAVPTVEEEYDEFSNGFWKHVPLWNASGDSEDRLYRD 60 :* **.* * * * .: . * : : : .. *....: * :* transP4H GRTVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSGDVYVHQFKINAK--APMTGDVWPW 108 cisP3H_II LKDAAAQPTAHVEHVPYLKEIVTTVFDGTHLQMARSRNLKNAIVIPHRDFVELDREVDRY 120 : . * .* .. . : . : *. :*: . : : * : . : :* : transP4H HQDYIFWARE------DGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPLLFVPGTHELGLIDVERRAP 162 cisP3H_II FRTFMVLEDSPLAFHSNEDTVIHMRPGEIWFLDAATVHSAVNFSEISRQSLCVDFAFDGP 180 .: ::. . : *: : : :*: ::..: * ::: :*. .* transP4H AGD-----GDAQWLPQLSADLDYAIDADLLAR---LTAGRGIESATGPAGSILLFDSRIV 214 cisP3H_II FDEKEIFADATLYAPGSTPDLPERRPFTAEHRRRILSLGQVIEREN--FRDILFLLSKVH 238 .: . : : * :.** * *: *: ** . .**:: *:: transP4H HGSGTNMSPHPRGVVLVTYNRTDNALPAQAAPRPEFLAARDATPLVPLPAGFALAQPV 272 cisP3H_II YKYDVHPSETYDWLIEISKQAGDEKMVVKAEQIRDFAVEARA-----LSERFSLTSW- 290 : ..: * :: :: : *: : .:* :* . * *. *:*:. 145 ANHANG 9.5.4. Alignment cisP3H_I und cisP3H_II cisP3H_I MRSHILGRIELDQERLGRDLEYLATVPTVEEEYDEFSNGFWKNIPLYNASGGSEDRLYRD 60 cisP3H_II MRSHILGKIELDQTRLAPDLAYLAAVPTVEEEYDEFSNGFWKHVPLWNASGDSEDRLYRD 60 *******:***** **. ** ***:*****************::**:****.******** cisP3H_I LEGSPAQPTKHAEQVPYLNEIITTVYNGERLQMARTRNLKNAVVIPHRDFVELDRELDQY 120 cisP3H_II LKDAAAQPTAHVEHVPYLKEIVTTVFDGTHLQMARSRNLKNAIVIPHRDFVELDREVDRY 120 *:.:.**** *.*:****:**:***::* :*****:******:*************:*:* cisP3H_I FRTHLMLEDSPLAFHSDDDTVIHMRAGEIWFLDAAAVHSAVNFAEFSRQSLCVDLAFDGA 180 cisP3H_II FRTFMVLEDSPLAFHSNEDTVIHMRPGEIWFLDAATVHSAVNFSEISRQSLCVDFAFDGP 180 ***.::**********::*******.*********:*******:*:********:****. cisP3H_I FDEKEAFADATVYAPNLSPDVRERKPFTKEREAGILALSGVIGRENFRDILFLLSKVHYT 240 cisP3H_II FDEKEIFADATLYAPGSTPDLPERRPFTAEHRRRILSLGQVIERENFRDILFLLSKVHYK 240 ***** *****:***. :**: **:*** *:. **:*. ** ****************. cisP3H_I YDVHPGETFEWLVSVSKGAGDDKMVEKAERIRDFAIGARALGERFSLTTW 290 cisP3H_II YDVHPSETYDWLIEISKQAGDEKMVVKAEQIRDFAVEARALSERFSLTSW 290 *****.**::**:.:** ***:*** ***:*****: ****.******:* 9.5.5. Alignment cisP3H_I und cisP4H cisP3H_I MRSHILGRIELDQERLGRDLEYLATVPTVEEEYDEFSNGFWKNIPLYNASGGSEDRLYRD 60 cisP4H MSTHFLGKVKFDEARLAEDLSTLEVA-EFSSAYSDFACGKWEACVLRNRTGMQEEDIVVS 59 * :*:**::::*: **..**. * .. ... *.:*: * *: * * :* .*: : . cisP3H_I LEGSPAQPTKHAEQVPYLNEIITTVYNGERLQMARTRNLKN-AVVIPHRDFVELDRELDQ 119 cisP4H HN-APALATPLSKSLPYLNELVETHFDCSAVRYTRIVRVSENACIIPHSDYLELD---ET 115 : :** .* ::.:*****:: * :: . :: :* .:.: * :*** *::*** : cisP3H_I YFRTHLMLEDSPLAFHSDDDTVIHMRAGEIWFLDAAAVHSAVNFAEFSRQSLCVDLAFDG 179 cisP4H FTRLHLVLDTNSGCANTEEDKIFHMGLGEIWFLDAMLPHSAACFSKTPRLHLMIDFEAT- 174 : * **:*: .. . ::::*.::** ******** ***. *:: .* * :*: cisP3H_I AFDEKEAFADATVYAPNLSPDVRERKPFTKEREAGILALSGVIGRENFRDILFLLSKVHY 239 cisP4H AFP--ESFLRNVEQPVTTRDMVDPRKELTDEVIEGILGFSIIISEANYREIVSILAKLHF 232 ** 146 *:* . . . * ** :*.* ***.:* :*.. *:*:*: :*:*:*: ANHANG cisP3H_I TYDVHPGETFEWLVSVSKGAGDDKMVEKAERIRDFAIGARALGERFSLTTW 290 cisP4H FYKADCRSMYDWLKEICKRRGDPALIEKTASLERFFLGHRERGEVMTY--- 280 *... . ::** .:.* ** ::**: :. * :* * ** :: 9.5.6. Alignment cisP3H_II und cisP4H cisP3H_II MRSHILGKIELDQTRLAPDLAYLAAVPTVEEEYDEFSNGFWKHVPLWNASGDSEDRLYRD 60 cisP4H MSTHFLGKVKFDEARLAEDLSTLEVA-EFSSAYSDFACGKWEACVLRNRTGMQEEDIVVS 59 * :*:***:::*::*** **: * .. ... *.:*: * *: * * :* .*: : . cisP3H_II LKDAAAQPTAHVEHVPYLKEIVTTVFDGTHLQMARSRNLKN-AIVIPHRDFVELDREVDR 119 cisP4H HN-APALATPLSKSLPYLNELVETHFDCSAVRYTRIVRVSENACIIPHSDYLELD---ET 115 : *.* .*. : :***:*:* * ** : :: :* .:.: * :*** *::*** : cisP3H_II YFRTFMVLEDSPLAFHSNEDTVIHMRPGEIWFLDAATVHSAVNFSEISRQSLCVDFAFDG 179 cisP4H FTRLHLVLDTNSGCANTEEDKIFHMGLGEIWFLDAMLPHSAACFSKTPRLHLMIDFEAT- 174 : * .:**: .. . :::**.::** ******** ***. **: .* * :** cisP3H_II PFDEKEIFADATLYAPGSTPDLPERRPFTAEHRRRILSLGQVIERENFRDILFLLSKVHY 239 cisP4H --AFPESFLRNVEQPVTTRDMVDPRKELTDEVIEGILGFSIIISEANYREIVSILAKLHF 232 * * . . : : *: :* * . **.:. :*.. *:*:*: :*:*:*: cisP3H_II KYDVHPSETYDWLIEISKQAGDEKMVVKAEQIRDFAVEARALSERFSLTSW 290 cisP4H FYKADCRSMYDWLKEICKRRGDPALIEKTASLERFFLGHRERGEVMTY--- 280 *... . **** **.*: ** :: *: .:. * : * .* :: 9.5.7. Alignment transP4H und Ectoinhydroxylase EctD aus Virgibacillus salexigens transP4H ---------------------------------MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREV 27 EctD MEDLYPSRQNNQPKILKRKDPVIYTDRSKDNQAPITKEQLDSYEKNGFLQIKNFFSEDEV 60 :* :*..*.: *:* *:: :. ** transP4H DCLRRAAAALYAQD----SPDRTLEKDGRTVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQI 83 EctD IDMQKAIFELQDSIKDVASDKVIREPESNDIRSIFHVHQDDNYFQDVANDKRILDIVRHL 120 :::* * . * . * :.. :*::. *: * :*:... *:*. . :: 147 ANHANG transP4H LSGDVYVHQFKINAKAPMTGDVWPWHQDYIFWAREDGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPL 143 EctD LGSDVYVHQSRINYKPGFKGKEFDWHSDFETWHVEDGMPRMRAISVSIALSDNYSFNGPL 180 *..****** :** *. :.*. : **.*: * **** * :.:.*:: *.: :**** transP4H LFVPGTHELGLIDVERRAPAGDGDAQWLPQLSADLDYAIDADLLARLTAGRGIESATGPA 203 EctD MLIPGSHNY-FVSCVGETPDNNYKESLKKQK---LGVPDEESLRELTRIGGGISVPTGKA 236 :::**:*: ::. .:* .: . . * *. . : .* * **. .** * transP4H GSILLFDSRIVHGSGTNMSPHPRGVVLVTYNRTDNALPAQAAP---RPEFLAARDATPLV 260 EctD GSVTLFESNTMHGSTSNITPYPRNNLFMVYNSVKNRLVEPFSGGEKRPEYIAVREKQPVY 296 **: **:*. :*** :*::*:**. :::.** ..* * transP4H PLPAGFALAQPV 272 EctD SAVN-------- 300 : ***::*.*: *: 9.5.8. Alignment transP4H und Halogenase SyrB2 aus Pseudomonas syringae pv. syringae transP4H -----MLTPTELKQYREAGYLLIEDGLGPREVDCLRRAAAALYAQDSPDRTLEKD---GR 52 SyrB2 MSKKFALTAEQRASFEKNGFIGPFDAYSPEEMKETWKRTRLRLLDRSAAAYQDLDAISGG 60 **. : .:.: *:: *. .*.*:. : : : *. : * * transP4H TVRAVHGCHRRDPVCRDLVRHPRLLGPAMQILSGDVYVHQFKINAKAPMTGDVWPWHQDY 112 SyrB2 TNIANYDRHLDDDFLASHICRPEICDRVESILGPNVLCWRTEFFPKYPGD-EGTDWHQAD 119 * * :. * * . . : :*.: . . .**. :* : :: .* * : *** transP4H IFWARE--------DGMDRPHVVNVAVLLDEATHLNGPLLFVPGTHELGLIDVERRAPAG 164 SyrB2 TFANASGKPQIIWPENEEFGGTITVWTAFTDANIANGCLQFIPGTQNSMNYDETKRMTYE 179 * . :. : .:.* . : :*. ** * *:***:: * :* . transP4H DGDAQWLPQLSADLDYAIDADLLARLTAGRGIESATGP-----AGSILLFDSRIVHGSGT 219 SyrB2 PDANNSVVKDGVRRGFFGYDYRQLQIDENWKPDEASAVPMQMKAGQFIIFWSTLMHASYP 239 . 148 : : : .. .: :: . :.*:. **.:::* * ::*.* . ANHANG transP4H N--------MSPHPRGVVLVTYNRTDN----------ALPAQAAPRPEFLAARDATPLVP 261 SyrB2 HSGESQEMRMGFASRYVPSFVHVYPDSDHIEEYGGRISLEKYGAVQVIGDETPEYNRLVT 299 : *. .* * transP4H LPAGFALAQPV 272 SyrB2 HTTRGKKFEAV 310 .: ..: .*. :* .* : : : . **. :.* 149 LITERATURVERZEICHNIS 10. Literaturverzeichnis [1] L. Stryer, Biochemie, 2007, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. [2] R. Wolfenden, M. J. Snider, Acc. Chem. Res. 2001, 34, 938-945. [3] K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 2004, Springer Verlag, Berlin. [4] BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System, Technische Universität Braunschweig. http://www.brenda-enzymes.org/ (abgerufen am 29.07.2011). [5] T. D. H. Bugg, Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, 2004, Blackwell Publishing, Oxford. [6] P. Lehwald, M. Richter, C. Röhr, H.-W. Liu, M. Müller, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 2389 –2392. [7] J. B. Jones, Tetrahedron 1986, 42, 3351-3403. [8] G. 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