Analyse potentieller therapeutischer und diagnostischer Marker am
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UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF Institut für Pathologie Direktor Professor Dr. med. Guido Sauter Analyse potentieller therapeutischer und diagnostischer Marker am Plattenepithelkarzinom des Larynx – eine immunhistochemische Studie Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von Annette Dorothée Francke aus Memmingen Hamburg 2014 Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 19.02.2014 Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Prof. Dr. G. Sauter Prüfungsausschuss, zweiter Gutachter: Prof. Dr. E. Dikomey Prüfungsausschuss, dritter Gutachter: Prof. Dr. Dr. M. Heiland 2 INHALTSVERZEICHNIS 1 HYPOTHESE / FRAGESTELLUNG ...............................................................4 2 EINLEITUNG...................................................................................................5 2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Larynxkarzinoms................................................. 5 2.2 Klinik und Therapie ................................................................................................ 7 2.3 Lokalisation und Morphologie ................................................................................ 8 2.4 pTNM- Klassifikation, Staging und Grading............................................................ 8 2.5 Prognose ............................................................................................................. 12 1.5.1 EGFR............................................................................................................ 12 1.5.2 HER2/neu ..................................................................................................... 15 1.5.3 p63................................................................................................................ 16 1.5.4 p16................................................................................................................ 17 1.5.5 HPV .............................................................................................................. 18 1.5.6 CD117........................................................................................................... 20 3 MATERIAL UND METHODEN......................................................................23 3.1 Patientendaten / Gewebeproben.......................................................................... 23 3.2 Tissue -Microarray-Herstellung ............................................................................ 23 3.3 Immunhistochemie............................................................................................... 25 3.4 Statistik ................................................................................................................ 29 4 ERGEBNISSE...............................................................................................29 4.1 Patientendaten..................................................................................................... 29 4.2 Immunhistochemie............................................................................................... 30 4.2.1 EGFR............................................................................................................ 30 4.2.2 Her2/neu ....................................................................................................... 31 4.2.3 p63................................................................................................................ 32 4.2.4 p16................................................................................................................ 33 4.2.5 HPV .............................................................................................................. 34 4.2.6 CD117........................................................................................................... 34 4.3 Kaplan-Meyer- und Multivariat-Analyse................................................................ 36 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse...................................................................... 36 5 DISKUSSION ................................................................................................37 5.1 Diskussion der Untersuchungsergebnisse ........................................................... 37 5.1.1 EGFR............................................................................................................ 37 5.1.2 HER2 ............................................................................................................ 41 5.1.3 CD117........................................................................................................... 44 5.1.4 p16/HPV ....................................................................................................... 46 5.1.5 p63................................................................................................................ 50 6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................53 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.....................................................................54 8 LITERATURVERZEICHNIS ..........................................................................56 9 DANKSAGUNG ............................................................................................87 10 LEBENSLAUF ............................................................................................88 11 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ...........................................................89 3 1 HYPOTHESE / FRAGESTELLUNG Das Larynxkarzinom ist der häufigste Hals- und Kopftumor weltweit (Cooper et al. 2009). 2011 wurde die Zahl der Larynxkazinom bedingten Todesfälle auf 3560 auf der Welt geschätzt (Siegel et al. 2011). Für das Jahr 2012 werden 4200 Neuerkrankungen in Deutschland prognostiziert, von denen 3600 auf Männer fallen (Kaatsch et al. 2012). Trotz medizinischer Fortschritte in chirurgischen und nicht-chirurgischen Therapiemaßnahmen hat sich an der schlechten Überlebensprognose für das Larynxkarzinom in den letzten Jahren wenig geändert, wobei die Früherkennung eine tragende Rolle spielt und diese eine große Auswirkung auf das Überleben der Patienten hat (Marioni und Marchese-Ragona 2006, Schroeder et al. 2012). Derzeitiger Goldstandard im Rahmen der Diagnostik sind Biopsie, histopathologisches Grading sowie TNMKlassifikation (Jovanovic 2008, Wong et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, inwieweit immunhistochemisch bestimmbare Marker eine Bedeutung für die Diagnostik, beziehungsweise die Beurteilung der Prognose (p16, p63, HPV) und Therapieoption (EGFR, HER2, CD117) eines Larynxkarzinoms haben könnten. Mittels des in dieser Arbeit verwendeten Tissue-Microarrays (TMA) soll eine optimale Untersuchungsmethode verwendet werden, um einen Überblick über die Expression der o.g. Proteine an einem größeren Patientenkollektiv zu erlangen. 4 2 EINLEITUNG 2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Larynxkarzinoms Das Larynxkarzinom ist das häufigste Karzinom in der Kopf-Hals-Region in Deutschland, wobei 90 % der Karzinome auf Plattenepithelkarzinome fallen (Kaatsch et al. 2012, Curado und Hashibe 2009). Männer sind bis zu 4mal häufiger betroffen als Frauen (Jemal et al. 2008). Die Statistik der Gesellschaft des epidemiologischen Krebsregisters Deutschland e.V. ergab, dass in Deutschland jährlich einer von 150 Männer, aber nur eine von 1000 Frauen am Larynxkarzinom erkranken (Lebenszeitrisiko) und dies einen Anteil von 1,3% (Männer) und 0,2 % (Frauen) aller Karzinomerkrankungen ergibt. Das mittlere Erkrankungsalter liegt um das 64. Lebensjahr und die relative 5- JahresÜberlebensrate liegt bei 61-62% (beide Geschlechter). Seit den 1980er Jahren nimmt die Inzidenz bei den Männern in Deutschland ab, während die Mortalität erst seit den 1990er Jahren deutlich zurückgeht. Genauere Prozentzahlen werden nicht aufgeführt. In nachfolgender Tabelle sind die Neuerkrankungen in Deutschland von 2007 und 2008, sowie die Prognose für das Jahr 2012 dargestellt (Kaatsch et al. 2012). Tabelle 1: Daten entnommen aus der gemeinsamen Veröffentlichung des Robert Koch-Instituts und der Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. (Kaatsch et al. 2012) Jahr Geschlecht Inzidenz Die 2007 Männer Frauen 3550 520 weltweite Verteilung des 2008 Männer Frauen 3610 510 Larynxkarzinoms Prognose 2012 Männer Frauen 3600 600 unterliegt erheblichen Schwankungen. Auffällig ist eine Abhängigkeit der Anzahl der Neuerkrankungen vom Entwicklungsstand der Länder. Laut der „Cancer Incidence in Five Continents Database“ mit Hauptsitz in Frankreich lag die Inzidenz in entwickelteren Ländern deutlich über der der weniger entwickelten Länder. Als Gründe hierfür können der niedrigere medizinische Versorgungsstandart und somit spätere Diagnosestellung sowie erschwerter Zugang zu Gesundheitseinrichtungen genannt werden, aber auch eine schlechtere Datenerfassung in den weniger entwickelten Ländern. 5 Innereuropäisch haben das Baskenland in Spanien (25/100.000) und außereuropäisch São Paulo in Brasilien (12.2/100.000) weltweit die höchste Inzidenzrate (Curado und Hashibe 2009). Im europäischen Vergleich steht Deutschland auf Platz 28 bezüglich der für 2012 geschätzten Inzidenz (6.5/100.000) des Larynxkarzinoms (Daten entnommen aus EUCAN, Laryngeal cancer, http://eco.iarc.fr). Chronischer Tabak- und Alkoholkonsum werden als Hauptrisikofaktoren angesehen. Beide Agenzien jedoch getrennt voneinander zu untersuchen stellt sich als problematisch dar, da Alkohol- und Tabakkonsum meist eng miteinander verbunden sind. Über 75% der Larynxkarzinome werden durch kombinierte Exposition verursacht (Hashibe et al. 2007,Syrjänen 2007). Als anfälligstes Organ im Kopf- und Halsbereich zeigt der Larynx die höchste Nikotin- Tumorrisiko-Assoziation, wobei die genaue Karzinogenese bislang ungeklärt ist (Blot et al. 1988, Pelucchi et al. 2008). Das Karzinomrisiko steigt bei Nikotinabusus um das 10-20fache im Gegensatz zu Nichtrauchern und ist abhängig von der Anzahl der Packyears (täglich konsumierte Zigarettenpackungen mal Raucherjahre). Nach zwei Jahren Karenz beginnt das Risiko einer Neuerkrankung zu sinken, wobei nach einer Latenzzeit von 10 Jahren sich das Risiko um über 70 % reduziert (Altieri et al. 2002, Franceschi et al. 1990). Bezugnehmend auf den Alkoholkonsum ist die Wahrscheinlichkeit zu erkranken dosisabhängig und variiert zwischen dem zwei- bis zehnfachem. Eine Metaanalyse aus 20 Studien ergab das zweifache Risiko für 50g Alkohol/Tag und das vierfache Risiko für 100g Alkohol/Tag im Gegensatz zu Nichttrinkern (Altieri et al. 2005). Moderater Konsum (10-19g Alkohol/Tag) zeigt bei Nichtrauchern keine oder nur geringe Auswirkungen auf die Karzinogenese (Lewin et al. 1998). Welche Rolle das Alter vor Beginn und nach Beendigung des Konsums spielt, ist jedoch unklar (Altieri et al. 2005). Im Gegensatz zum Tabakkonsum ist eine Risikoreduktion mit Beginn der Abstinenz erst nach einer Latenzzeit von 20 Jahren zu beobachten. Das Erkrankungsrisiko gleicht sich dann dem von Nichttrinkern in etwa an (Altieri et al. 2002). Larynxkarzinome aufgrund von Alkoholkonsum sind vor allem in der Supraglottis als in Subglottis und Glottis lokalisiert (La Vecchia et al. 2008). 6 Betrachtet man Tabakkonsum kombiniert mit Alkoholkonsum so fällt ein synergistischer Effekt auf. Das Risikoverhältnis steigt eher in multiplikativer als additiver Weise (Pellucchi et al. 2008). Bei einer hohen Tabak- (>60 Packyears) und Alkoholexposition (> 100g/d) steigt das Karzinomrisiko um das 200fache (Andre et al.1995). Ein weiterer Risikofaktor stellt eine Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) dar. Die Prävalenz liegt beim Larynxkarzinom zwischen 24-28%, wobei in ca.15- 20% der Fälle der HPV-Typ 16 nachgewiesen wird (Kreimer et al. 2005, Li et al. 2013). Patienten mit diesem Hochrisiko-HPV-Typen besitzen ein zwei- bis dreifaches Risiko an diesem Karzinom zu erkranken (D’Souza et al. 2007). Neben den o.g. Einflussfaktoren gibt es Berufsgruppen, bei denen ein erhöhtes Risiko an einem Larynxkarzinom zu erkranken, beschrieben ist, wobei hier vor allem Berufe mit erhöhter Exposition gegenüber Lacken, Farben und Lösungsmitteln besonders betroffen sind (Maier et al. 1997). 2.2 Klinik und Therapie Bei Diagnosestellung liegen zwei Drittel der Patienten zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr, wobei das mittlere Alter 64 Jahre beträgt. Die Symptomatik ist abhängig von der Tumorlokalisation (Fang et al. 2008). Stimmlippenkarzinome z.B. weisen als Frühsymptom Heiserkeit auf, die auch schon bei sehr Schluckbeschwerden, kleinen Tumoren chronischer auftritt. Husten, Später Haemoptysen, können auch ausstrahlende Schmerzen meist ins Ohr sowie ein inspiratorischer Stridor mit Dyspnoe hinzukommen (Raitiola et al. 2000). Supraglottische Tumoren hingegen fallen meist erst in fortgeschrittenen Stadien mit Schluckbeschwerden oder Atemwegsobstruktion auf. Nicht selten tritt als erstes Symptom eine ipsi- oder kontralaterale zervikale Lymphknotenschwellung auf. Die sehr seltenen subglottischen Karzinome gehen typischerweise mit Symptomen wie inspiratorischem Stridor und Dyspnoe einher (Fang et al. 2008). 7 Lokalisation und Häufigkeit von Metastasen ist abhängig von der Tumorlokalisation. Am häufigsten werden lymphogene Metastasen in den regionalen Halslymphknoten entdeckt. Hämatogene Metastasen sind selten, können aber in fortgeschrittenen Tumorstadien vorkommen und sind dann vor allem in der Lunge zu finden (Barnes et al. 2005). Aufgrund der Funktion des Larynx als Sprachorgan und dessen Beteiligung beim Schluckakt muss das genaue therapeutische Vorgehen gründlich geprüft werden. Dabei sollten Überlegungen bezüglich des Überlebens und der funktionalen Konsequenz gegeneinander abgewogen werden. Die möglichen Therapieoptionen sind vor allem abhängig vom Tumorstadium. Als organerhaltende Maßnahmen kommen die endoskopische (Laser)Resektion, Chemo- und Strahlentherapie (auch in Kombination) in Frage (Pfister et al. 2006). Erst bei weit fortgeschrittenen Stadien wird eine partiale oder totale Laryngektomie durchgeführt, wobei abhängig vom Lymphknotenbefall eine (einoder beidseitige) Neck Dissection notwendig ist (Remmert et al. 2001). 2.3 Lokalisation und Morphologie Das Larynxkarzinom wird in Karzinome der Supraglottis, Glottis und Subglottis unterteilt. Die Supraglottis besteht aus Suprahyoidale Epiglottis, Aryepiglottische Falte, Arythenoidgegend, Infrahyoidale Epiglottis und den Taschenfalten. Zu der Glottis zählen die Stimmlippen, sowie vordere und hintere Kommissur. Die Subglottis reicht bis zum Beginn der Trachea. Die meisten Karzinome sind in der Supraglottis und Glottis lokalisiert (Wittekind et al. 2005). Über 90% der Larynxkarzinome sind Plattenepithelkarzinome, die ihren Ursprung in der obersten Schicht der Mukosa, dem Epithel haben. Seltener finden sich Karzinome, Adenokarzinome, Neuroendokrine Adenoidzystische Karzinome, Karzinome, Melanome, kleinzellige Sarkome, maligne Lymphome und Tumormetastasen (Barnes et al. 2005). 2.4 pTNM- Klassifikation, Staging und Grading Das TNM-System dient der einheitlichen Erfassung des Stadiums maligner Tumorerkrankungen. Es wurde von der Union Internationale Contre le Cancer 8 (UICC) und dem äquivalenten American Joint Comittee for Cancer Staging (AJCC) erarbeitet. Aus der Tumorgröße (T), dem Lymphknotenstatus (N) und dem Fernmetastasierungsstatus (M) wird das jeweilige Tumorstadium ermittelt. Es gibt eine klinische (präoperative) und eine pathologische (postoperative) TNMKlassifikation. Die Endklassifikation ergibt sich immer aus der Kombination beider Klassifikationen: der klinische Angaben und Makro-/Histopathologie (Wittenkind et al. 2005). 9 TNM-Klassifikation Tabelle 2: UICC-Klassifikation des Larynxkarzinoms nach dem TNM-System (Sobin et al. 2009, S. 40-43) T/pT (Tumorstadium) Supraglottis T1/ Tumor auf einen Unterbezirk pT1 der Supraglottis begrenzt, mit normaler Stimmlippenbeweglichkeit T2/ pT2 T3/ pT3 T4a/ pT4a T4b/ pT4b Tx/pTx T0/pT0 Tis/pTis Glottis Subglottis Tumor auf Stimmlippe(n) be- Tumor auf die Subglottis grenzt (kann auch vordere begrenzt oder hintere Kommissur befallen), mit normaler Stimmlippenbeweglichkeit Tumor infiltriert Schleimhaut Tumor breitet sich auf eine Tumor breitet sich auf eine von mehr als einem Unterbe- oder beide Stimmlippen aus; oder beide Stimmlippen aus; zirk der Supraglottis oder diese mit normaler oder diese mit normaler oder eineingeschränkter Beweglich- geschränkter Beweglichkeit, Glottis oder eines Areals außerhalb der Supraglottis, keit, ohne Fixation ohne Fixation ohne Fixation des Larynxs Tumor auf den Larynx beTumor auf den Larynx beTumor auf den Larynx grenzt, mit Stimmlippengrenzt, mit Stimmlippenbegrenzt mit Stimmbandfixation, und/oder Tumor mit fixation und/oder Invasion der fixation Infiltration des PostkrikoidPoskrikoidregion und/oder bezirks, des präglottischen des präepiglottischen Gewebes und/oder der paraepiGewebes, des paraglottischen Raumes und/ glotischen Raumes mit geoder geringgradiger Erosion ringer Erosion des Schilddes Schildknorpels knorpels Tumor infiltriert durch den Schildknorpel und/oder breitet sich außerhalb des Kehlkopfes aus z.B. Trachea, Weichteile des Halses eingeschlossen äußere Muskulatur der Zunge, gerade Halsmuskulatur, Schilddrüse, Ösophagus. Tumor infiltriert den Prävertebralraum, mediastinale Strukturen oder umschließt die A. carotis interna kein Primärtumor beurteilbar Kein Anhalt für Primärtumor Carcinoma in situ N/pN (Lymphknotenmetastasen alle Bezirke) N0/pN0 keine Lymphknotenmetastasen N1/pN1 Metastase(n) in solitärem ipsilateralen Lymphknoten 3 cm oder weniger N2a/ Metastase(n) in solitärem ipsilateralen Lymphknoten mehr als 3 cm, weniger als 6 cm in pN2a größter Ausdehnung N2b/ Metastasen in multipel ipsilateralen Lymphknoten, keiner mehr als 6 cm in größter pN2b Ausdehnung N2c/ Metastasen in bilateralen oder kontralateral Lymphknoten, keiner mehr als 6 cm in größter pN2c Ausdehnung N3/pN3 Metastase(n) in Lymphknoten, mehr als 6 cm in größter Ausdehnung M (Fernmetastasen) Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen können nicht beurteilt werden 10 Staging Tabelle 3: Stadieneinteilung des Larynxkarzinoms auf histopathologischer Grundlage (Sobin et al. 2009, S.43) Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium 1 T1 N0 M0 Stadium 2 T2 N0 M0 T1, T2 N1 M0 T3 N0, N1 M0 T1,T2,T3 N2 M0 T4a N0, N1, N2 M0 T4b Jedes N M0 Jedes T N3 M0 Jedes T Jedes N M1 Stadium 3 Stadium 4a Stadium 4b Stadium 4c Grading beim Larynxkarzinom (Sobin et al. 2009, S. 16) Nach den Richtlinien der UICC wird der Malignitätsgrad (G) der entarteten Zellen anhand der histologischen und zytologischen Kriterien (z.B. Kernatypie, Mitosezahl) eingeteilt: Gx: Der histologische Grad kann nicht beurteilt werden G1: Vorliegen gut differenzierter Zellen G2: Vorliegen mäßig differenzierter Zellen G3: Vorliegen schlecht differenzierter Zellen 11 2.5 Prognose Relevant für die Prognose sind Tumorlokalisation, Behandlungsverfahren, Tund N-Stadium sowie das Jahr bei Diagnosestellung (Marshak et al. 1999). Das Überleben variiert mit Tumorstadium und Behandlung. Unter adäquater Therapie erreicht man bei kleinen Stimmlippentumoren (Stadium I oder II) ein 5Jahres-Überleben von über 90% (Cosetti et al. 2008). Bei Patienten mit Tumorstadium III oder IV (Glottis) schwankt das 5-Jahres-Überleben zwischen 50-60% (Browman 1994, Cosetti et al 2008). Trotz neuer Behandlungsmethoden hat sich das Überleben in den letzten 25 Jahren nicht signifikant geändert (Hardisson 2003, Cosetti et al. 2008). Neben der konventionellen histomorphologischen werden zusätzliche immunhistologische und molekulare Techniken angewandt, um mögliche neue prognostische Faktoren zu bestimmen. Hierzu gehören beispielsweise Marker, die Wachstumsfaktoren, Onkogene und Tumorsupressorgene identifizieren können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollen ausgewählte bereits etablierte Marker an einer Kohorte von Larynxkarzinomen beschrieben werden. 2.5.1 EGFR Der EGF-Rezeptor (EGFR engl.: Epidermal-Growth-Factor-Receptor), eine transmembrane Tyrosinkinase, ist eines der etabliertesten therapeutischen Ziele (Ciardiello und Tortora 2008). Er gehört zur EGF-Rezeptor-Familie, zu der ebenfalls die „human-growth-factor-receptors 2-4“ (HER2, HER3 und HER4) zählen (Dutta und Maity 2007). Die Rezeptoren der EGF-Familie bestehen aus einer extrazellulären, transmembranen und zytoplasmatischen Domäne. Im Rahmen der Aktivierung der extrazellulären Domäne durch z. B. EGF (epidermal growth factor) und TGF alpha (transforming growth factor) (Riese und Stern 1998), kommt es mittels Phosphorylierung zu einer Aktivierung der zytoplasmatischen Domäne/Tyrosinkinase. Diese wiederum führt zu einer Aktivierung einer komplexen Signalkaskade, die Wachstum, Überleben, Proliferation und Differenzierung der Zelle steuert sowie das Einleiten der Apoptose verhindert (Riese et al. 1996, Oda et al. 2005). 12 Eine der Hauptsignalkaskaden ist der RAS-RAF-MEK-ERK- Signaltransduktionsweg (Alroy und Yarden 1997), wie in Abbildung 1 dargestellt: TGFα EGFR* Sos Grb2 Ras* Raf* MEK ERK * Mutation Abbildung 1: RAS-RAF-MEK-ERK-Signaltransduktionsweg (modifiziert nach Roberts und Der 2007) Durch den Komplex Shc/Grb2/SOS aktiviert, kann das GPT-bindende Protein RAS Signale an das Protein RAF weitergeben. RAF kann seinerseits die nächsten Glieder MEK und ERK des Signalwegs aktivieren. Schließlich werden über Transkriptionsfaktoren die Zellproliferation stimuliert (McCubrey at al. 2006). Eine andere bedeutende Signalkaskade stellt der PI3K-Akt-Signalweg dar. PI3K kann neben der Autophosphorilierung der intrazellulären Rezeptordomäne auch durch das eben beschriebene RAS phosphoriliert und aktiviert werden. Durch das phosphorilierte PI3K wird aus PIP2 der second messenger PIP3. PIP 3 kann die Serine/Threonin Kinase Akt binden und aktivieren, wodurch Zellvorgänge wie z.B. Überleben, Wachstum oder Zellzyklus-Progression reguliert werden können (Datta et al. 1997). Immunhistochemisch lässt sich EGFR auch in benignem Gewebe anfärben. Weitaus höhere Färbeintensitäten werden jedoch in Karzinomgewebe erreicht, 13 was einen Zusammenhang zwischen EGFR-Expression und Karzinogenese vermuten lässt. Je höher die Färbeintensität, desto schlechter scheint die Tumordifferenzierung zu sein (Demiral et al. 2004). Vergleicht man normales Epithel von Nicht-Tumor-Patienten mit Epithel von Larynxkarzinompatienten, so fällt eine deutliche Reaktion bei Karzinompatienten auf, die auch schon in frühen Tumorstadien ausgeprägt ist (Grandis et al.1998). Verglichen mit einer normalen Zelle kann eine Dysregulation von EGFR in einer Tumorzelle zu einer unkontrollierten Differenzierung, invasivem Wachstum sowie vermehrte Angiogenese führen (Normanno et al. 2005). Eine EGFRDysregulation kann durch unterschiedliche Mechanismen bedingt sein, wobei es einerseits zu einer Überexpression des Rezeptors und einer Liganden unabhängigen Aktivierung kommt (Lynch et al. 2004). Andererseits können Punktmutationen oder Deletionen im kodierenden Genabschnitt (Exon 18-21) für die Tyrosinkinase (zytoplasmatische Domäne) zu einer gestörten Aktivierung des Rezeptors führen (Paez et al. 2004). Für das Nicht-kleinzelligeBronchialkarzinom (NSCLC) existieren bereits viele Untersuchungen zum EGFRezeptor, wobei dieser als etabliertes therapeutisches Ziel genutzt wird. Hierbei kommen Rezeptorantikörper wie z. B. Cetuximab oder Tyrosinkinaseinhibitoren wie z. B. Erlotinib und Gefitinib zum Einsatz (Domingo et al. 2010). In Kombination mit Chemo- und Strahlentherapie konnten vielversprechende Ergebnisse wie längere Überlebensraten und höhere Ansprechraten auf die Chemotherapie nachgewiesen werden (Pirker und Filipits 2011, Shepherd und Pereira 2005). Im Falle des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) empfiehlt die American Society of Clinical Oncology in ihren Leitlinien, bei Patienten mit nachgewiesener EGFR-Mutation, Gefitinib einzusetzen. Patienten, die keine EGFR-Mutationen aufweisen, sollten jedoch weiterhin mit Chemotherapie behandelt werden (Azzoli et al. 2009). Diese Erkenntnisse in der Behandlung mit EGFR-Inhibitoren in NSCLC lassen darauf hoffen, auch Fortschritte bei der Therapie von Larynxkarzinomen zu erreichen. 14 2.5.2 HER2/neu Der „human epidermal growth factor receptor 2“ (Her2/neu, erb-B2, c-erbB2), ein weiterer Rezeptor der EGF-Rezeptor-Familie, ähnelt dem bereits beschriebenen EGF-Rezeptor in strukturellem Aufbau sowie Funktion (Olayioye 2001). Auch Her2/neu wird in einer Vielzahl von Tumoren wie z.B. in Adenokarzinome des gastroösophagealen Gastrointestinaltrakts Übergangs) (Magen überexprimiert und sowie aufgrund des einer Konformationsänderung dauerhaft aktiviert (Di Fiore et al. 1987, Lorenzen und Lordick 2011). Für das Mammakarzinom ist eine HER2/neu Genexpression in 20-25% der Fälle beschrieben, wobei dies als therapeutisches Ziel genutzt wird (Slamon et al. 1989). Die adjuvante Therapie mit dem Her2/neu-Antikörper Trastuzumab (Herceptin®) zeigt verglichen zur Chemotherapie für das Mammakarzinom ein signifikant besseres Gesamtüberleben sowie eine Verbesserung der Lebensqualität. (Slamon et al. 1987, Untch et al. 2010). Zudem zeigt eine adjuvante Behandlung mit Herceptin® in Sequenz oder Kombination mit einer Standard-Chemotherapie eine Senkung der Rezidivrate um 45-50% und der Mortalität um ca. 30% (Joensuu et al. 2006). Wie bei der anti-EGFR Therapie beim NSCLC handelt es sich bei der Therapie gegen Her2/neu um eine etablierte und leitliniengerechte Therapieform. Neben dem Mammakarzinom wurden 2010 die Leitlinien um die Behandlung des Magenkarzinoms mit Trastuzumab erweitert (Bang et al. 2010, Albert et al. 2008). Etablierte Verfahren zur Bestimmung der Her2/neu Überexpression sind auf der einen Seite die Immunhistochemie (Herceptest®) sowie die Fluoreszenz in-situHybridisierung (FISH) (Masood et al. 2002), wobei die Genauigkeit und Sensitivität der Verfahrensweisen zur diskutiert werden (Sauter et al. 2009). Her2/neu-Bestimmung kontrovers Bei der immunhistochemischen Expressionsbestimmung können fluorophor- oder enzymarkierte Antikörper Epitope (z.B. Proteine) in Zellen erkennen. Man unterscheidet dabei eine direkte (markierter Antikörper bindet an das Antigen und wird detektiert) und indirekte Methode (ein nicht markierter Antikörper bindet das Antigen und wird von einem zweiten markierten Antikörper gebunden und detektiert) (Idiko 2009). 15 Im Falle der FISH können durch markierte einzelsträngige Sonden DNA oder RNA in Zellen oder einzelnen Chromosomen nachgewiesen werden, indem die Sonden an den komplementären Strang im Präparat binden. Die Sonde wird dann mittels eines fluoreszierenden Farbstoffs mikroskopisch nachgewiesen (Levsky et al. 2003). 2.5.3 p63 p63 ist ein Transkriptionsfaktor der zu der p53-Familie zählt und Zielgene von p53 reguliert. Strukturell ist es p53 sehr ähnlich, wobei sechs Isoformen von p63 existieren. Eine dieser Isoformen ist ∆Np63α, die gewöhnlich in Plattenepithel exprimiert wird. Der Verlust von p63 zeigen kraniofaziale und epitheliale Defekte sowie schwerwiegende Malformationen der Extremitäten im Mausmodell. Diese Erkenntnisse sprechen für einen Einfluss von p63 auf die epitheliale Entwicklung (Dong et al. 2005). Durch Überexpression von ∆Np63α wird die TAp73 Aktivität supprimiert und verhindert somit die durch p53 getriggerte Apoptose (Abb. 2) (Deyoung und Ellisen 2007). p63-Mutationen sind in Karzinomen eine eher seltene Beobachtung (Hagiwara et al. 1999). mutation, allelic loss p53 DNA Damage Apoptosis TAp73 mtp53 Tumorigenesis Bcl-2 ∆Np63α Abbildung 2: Wege zur Tumorgenese in Plattenepithelkarzinomen bzgl. der p53 Familie (modifiziert nach Deyoung und Ellisen 2007) Diverse Tumoren (z.B. Lunge, Nasopharynx, Ösophagus) weisen eine ∆Np63αÜberpression auf. Im Plattenepithelkarzinom der Lunge z.B. ist die p63 Überexpression mit einem verbesserten Gesamtüberleben assoziiert, wohingegen Adenokarzinome der Lunge eine schlechtere Prognose aufweisen (Massion et al. 2003, Narahashi et al. 2006). 16 In HNSCC wird von über 80% p63 Positivität berichtet, wobei eine prognostische Relevanz auch für das Larynxkarzinom bislang nicht bewiesen werden konnte (Ratikovski et al. 2001, Dong et al. 2004, Pruneri et al. 2002, Weber und Tannapfel 2002). Im Gegensatz hierzu konnte gezeigt werden, dass eine Degradation des ∆Np63α-Levels zu einem verbesserten Gesamtüberleben aufgrund einer besseren Ansprechrate auf platinhaltige Chemotherapeutika bei HNSCC Patienten geführt hat (Zangen et al. 2005). 2.5.4 p16 Der Zellzyklus wird über mehrere Kaskaden von Molekülen wie u.a. Onkoproteinen, Cyclin-dependent-Kinasen (CDK) und Tumorsuppressorgenen wie p16 geregelt. CDKs spielen eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von Zellprozessen. Bisher wurden 11 Mitglieder der CDK Familie identifiziert. CDKs werden durch nonkonvalente Komplexe aktiviert, die sie mit Zyklinen (A-E) bilden, wobei jede CDK für einen spezifischen Schritt im Zellprozess verantwortlich ist (Sridhar et al. 2006). Der späte G1-Phase - Kontrollpunkt im Zellzyklus - wird aus einem Komplex aus Proteinen kontrolliert. Dadurch wird der Übertritt von G1-Phase (gap=Pause) in die S-Phase (Synthese) des Zellzyklus inhibiert und somit ein unkontrolliertes Wachstum der Zelle verhindert. Zu den daran Beteiligten zählen das Tumorsuppressorgen p16, Zyklin D1, CDK 4 und 6 und pRB (Serrano et al. 1993), die wie folgt interagieren: Im pRb-Zellzyklus-Kontrollweg stimuliert Zyklin D1 die Phosphorilierung von pRb indem es an CDKs bindet. p16 bindet an CDK4 und 6 und blockiert so die Anbindung an Typ-D-Zyklinen (Weinberg 1995). Durch p16-Inaktivierung kann die Zelle genotoxischen Einflüssen oder Onkogenaktivierungen nicht mehr gegensteuern, wobei die fehlende Hemmung der Proteinkinase CDK4 durch p16 dazu führt, dass der Zellzyklus nicht mehr in der G1-Phase aufgehalten werden kann und somit neoplastische Zellen entstehen (Lundberg und Weinberg 1999). 17 Es wird vermutet, dass eine p16-Inaktivierung in 50% aller Karzinome durch Deletion, Methylierung oder Punktmutation verursacht wird (Gonzalez und Serrano 2006). Eine HPV-Infektion nimmt indirekt durch Inaktivierung des Retinoblastom Gens durch das Onkoprotein E7 Einfluss auf die Expression von p16. Aufgrund eines negativen Feedbacks ist die Transkription des p16-Gens nicht supprimiert (Weinberger et al. 2004). Die Überexpression von p16 scheint in unterschiedlichen Karzinomen (z.B. Zervix, Ovar) eine Rolle zu spielen (Li und Poi 2011, Lee et al. 1999). Für HNSCC werden in über 70% der Fälle HPV-Infektionen nachgewiesen, die zu einer p16-Überexpression führen (Bova et al. 1999, Wildemann et al. 2009). Bezüglich des Überlebens wird eine HPV-Infektion mit einem besseren Outcome in Verbindung gebracht (Lewis et al. 2010, Weinberger et al. 2004, Hoffmann et al. 2010). Ähnliche Ergebnisse werden auch für p16-Überexpressionen Larynxkarzinom berichtet (König et al. 2007). Aufgrund der Interaktion wird p16 als Surrogatmarker für eine (Klussmann et al. 2003, Wildemann et al. beim HPV-p16- HPV-Infektion diskutiert 2009), wobei eine immunhistochemische p16 Bestimmung daher möglicherweise die aufwändige HPV DNA Detektion ersetzen könnte (Wittekindt et al. 2005). 2.5.5 HPV Bei den humanen Papilloma Viren (HPV) handelt es sich um doppelsträngige DNA-Viren und Mitglieder der Familie der Papillomaviridae (Bernard et al. 2006). Bislang wurden über 200 verschiedene Subtypen beschrieben. Einerseits gibt es die Gruppe von „low risk“-Viren (Typen: 6,11,13,32,34, 40,42, 44, 53,54, 55 und 63), denen eine Assoziation zur Genese benigner Tumoren nachgesagt wird, wie z.B. Genitalwarzen (Condyloma accuminata) (Mc Kaig et al. 1998, Ault 2006). Andererseits gibt es die Gruppe von „high risk“-Viren (Typen: 16,18,31,33 und 35), die an der Entstehung von malignen Tumoren u.a. der 18 Cervix, den Tonsillen oder der Anogenitalregion beteiligt sein sollen (zur Hausen 2009). High risk HP-Viren induzieren chromosomale Störungen, aus denen aneuploide Zellen hervorgehen, deren Chromosomenzahl verändert ist (Zimonjic et al. 2001). High risk HP-Viren kodieren Onkoproteine (E6, E7), die spezifisch mit den Tumorsuppressorgenen p53 und Retinoblastom (pRB) interagieren und Einfluss auf proliferative Prozesse nehmen. Das Onkoprotein E6 inhibiert p53 was eine Blockade der Apoptose zur Folge hat. E7 hingegen blockiert pRB und setzt als Folge den Zellzyklusarrest außer Kraft, indem es nicht die G1-Phase arretiert sondern die S-Phase des Zellzyklus einleitet (zur Hausen 1994). Die Onkoproteine E6+7 begünstigen somit eine Dysregulation des Zellzyklus, die Genmutationen sowie chromosomale Aberrationen zur Folge haben können (Zerfass et al. 1995). Im Gegensatz zu den high risk HP-Viren greifen low-risk Viren zwar in den Lebenszyklus der Zelle ein, integrieren jedoch ihr Genom nicht mit zunehmender Lebensdauer in das der Wirtszelle, sodass sie kein kanzerogenes Potential entfalten (Garnett und Duerksen-Hughes 2006). Es gilt als gesichert, das HPV für die Entstehung von Zervixkarzinomen verantwortlich ist (Schiffmann et al. 2007). In 99% der Fälle werden high risk HPV detektiert, wobei 70% der Karzinome durch die HPV-Subtypen 16 und 18 verursacht werden (Uusküla et al. 2011). Als präventive Maßnahme besteht seit 2006 die Möglichkeit einer HPVImfpung, für die zwei Impfstoffe zugelassen sind (Gardasil und Cevarix), die unterschiedliche Subtypen erfassen (Typen: 6,11,16,18 vs. 16+18). Sie schützen 98% der HPV-naiven Frauen vor HPV 16/18 bedingten Dysplasien. Die Effektivität bei Geimpften unabhängig vom HPV-Status ist deutlich geringer (Zollner und Schwarz 2011). Es zeigte sich, dass eine prophylaktische Impfung eine sehr effektive Prävention vor HPV-Infektionen und präkanzerösen Läsionen der Cervix v.a. bei Frauen zwischen 15-25 Jahren darstellt. Eine Senkung der Inzidenz und Mortalität scheint dadurch erreicht werden zu können (Rambout et al. 2007). Auf vorbestehende Läsionen hat die Impfung allerdings keinen Einfluss (Hildesheim et al. 2007). 19 HPV-Viren sind nicht nur in Zervixkarzinomen zu finden. Eine Rolle in der Tumorgenese wird auch für das Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Halsbereichs (HNSCC, head and neck squamous cell carcinomas) diskutiert. Geschätzt werden, dass 25 % der HNSCC HPV-positiv sind, wobei zu einer großen Mehrheit in den Plattenepithelkarzinomen des Oropharynx und der Tonsille HPV-DNA vom Typ 16 nachgewiesen wurde (Dayyani et al. 2010). Eine HPV-Positivität kann als Indikator für ein besseres Überleben und geringeres Rezidivrisiko angesehen werden (Mannarini et al. 2009). 2.5.6 CD117 CD117 (c-Kit), ein weiteres Mitglied der Tyrosinkinaserezeptoren, ist ein Genprodukt des Onkogens c-kit und gehört zu der Untergruppe III der Tyrosinkinaserezeptoren, zu denen auch der „Platelet-derived-growth-factor“ (PDGFR) und „colony stimulating factor“ (CSF1R) zählen. Der Grundaufbau des Rezeptors ist ähnlich dem EGF- und Her2/neu-Rezeptor, wobei der Unterschied der Untergruppe III der Tyrosinkinaserezeptoren in der extrazellulären Domäne liegt, die aus fünf Immunglobulin-ähnlichen Domänen besteht (Blechmann et al. 1993). CD117, durch den Stammzellfaktor (SCF) aktiviert (Lev et al. 1993), spielt eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und Differenzierung von Stammzellen. CD117 nimmt Einfluss auf verschiedenste Prozesse wie z. B. die Hämatopoese, Angiogenese, dermale Pigmentierung, die Darmfunktion und die Spermatogenese (Lennartsson et al. 2005). Für verschiedene Tumorentitäten wie z.B. dem Gastrointestinalen Stroma Tumor (GIST), Keimzelltumoren oder Leukämien wurde CD117 als ein beeinflussender Faktor beschrieben (Miettinen et al. 2002, Leroy et al. 2002, Jung et al. 2011). Hierbei spielt wie bereits für EGFR beschrieben die Gen-Mutation eine Rolle. Aberrationen des Gens für c-KIT können Deletionen, Insertionen und Punktmutationen beinhalten. Am häufigsten ist Exon 11 betroffen. Seltener finden sich Mutationen in den Exons 9, 13 oder 17 (Braggio et al. 2010). Die Mutationen führen zu einer dauerhaften ligandenunabängigen Rezeptoraktivierung und somit zur Tumorentstehung (Masson und Rönnstrand 20 2009). Nachweise von solchen Mutationen sind mit einer schlechteren Prognose der Tumoren verbunden. Allerdings können sie aber auch als prädiktiver Marker in Bezug auf eine Imatinibtherapie verwendet werden (Braggio et al. 2010). Für den GIST werden c-kit-Mutationen als definierendes Charakteristikum angesehen, wobei über 90% dieser Tumoren eine c-kit Mutation aufweisen. Eine CD117-Überexpression in Hals- und Kopftumoren und Larynxkarzinomen im Speziellen wurde in nur wenigen Studien mit sehr kleinen Patientenkollektiven bisher untersucht. In den Studien konnte zwar eine CD117Positivität bei Larynxkarzinomen festgestellt werden, inwieweit CD117 als prognostischer und prädiktiver Marker zu werten ist, bleibt zu klären (Ongkeko et al. 2006, Barth et al. 2004). Ein wesentlicher Fortschritt in der Behandlung von GIST war die Einführung des Tyrosinkinaseinhibitors Imatinib, der gute Erfolge in der Therapie von nichtmetastasierten und metastasierten GIST zeigt. Der Wirkmechanismus von Imatinib beruht in einer Blockade der ATP-Bindungsstelle innerhalb der Kinasendomäne (Badalamenti et al. 2007). 21 Zielsetzung der Arbeit: Um das genaue immunhistologische Expressionsmuster der oben beschriebenen Marker zu evaluieren und ihren möglichen Einfluss auf Prognose und Prädiktion am Larynxkarzinom zu beurteilen, setzen wir einen eigens dafür am Institut für Pathologie des Universitätsklinikums HamburgEppendorf erstellten Tissue-Microarray (TMA) mit primären Larynxkarzinomen ein. Dieses Verfahren wurde bereits in zahlreichen Studien etabliert, wobei die TMA-Technik es ermöglicht bis zu 1000 verschiedene Gewebeproben auf einen einzigen Gewebeschnitt zu bringen und diese gleichzeitig mittels diverser Methoden (z. B. Immunhistochemie und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) zu untersuchen (Kononen et al. 1998, Bubendorf 2001, Dancau et al. 2010). 22 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Patientendaten / Gewebeproben Die in dieser Arbeit untersuchten Larynxkarzinome von 97 Patienten wurden auf der Basis klinischer Daten von über 470 Patienten, die im Zeitraum von 1998 bis 2008 an der Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde (HNO) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf behandelt wurden, ermittelt. Die zugehörigen Gewebeproben sowie zugehörigen pathologische Parameter (TNM) wurden mittels der Datenbank des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Hamburg –Eppendorf erhoben. Das in Paraffin geblockte Biopsiematerial der evaluierten Patienten wurde anhand von Hematoxylin und Eosin (HE)-Schnitten, auf das Vorhandensein von Tumorgewebe, Tumormenge (mindestens für die Entnahme von 3x0,6 mm großen Stanzen geeignet) und auf ihre Verwendbarkeit im Rahmen der Fragestellung dieser Arbeit überprüft. Hierbei wurde zusätzlich auch der Differenzierungsgrad (G1-G3) der Tumoren erneut bestimmt. Hinzu wurden klinisch-pathologische Daten erhoben. Diese beinhalteten das Alter bei Erstdiagnose, Operationsdatum, TNM-Stadium, Tumorgrad (G), Rezidivfreies- und Gesamtüberleben. Unter Berücksichtigung der oben genannten Auswahlkriterien und der ermittelten klinischen Daten der HNO-Abteilung waren insgesamt 105 Fälle zur TMA-Erstellung geeignet. 3.2 Tissue -Microarray-Herstellung Die TMA-Herstellung ermöglicht das Einbringen von bis zu 1000 Gewebezylindern mit einem Durchmesser von 0,6 mm in einen einzigen Paraffinblock. Unter Anlage eines Koordinatensystems zur besseren Orientierung, sowohl während des Stanzens als auch bei der Auswertung, werden die Proben in den Paraffinlock eingebettet. In diesem Fall sollten die 105 Gewebestanzen mit zusätzlich 28 Kontrollgewebestanzen auf dem Empfängerblock platziert werden. Der TMA wurde in neun Spalten unterteilt, wobei 7 Spalten Karzinomgewebe und 2 Spalten (Nr. 8 und 9) Normalgewebe enthielten. Das Normalgewebe setzte sich wie folgt zusammen: 10 Larynxnormalgewebe und je 2 23 Normalgewebe aus Niere, Lunge, Colon, Endometrium, Prostata, Lymphknoten, Muskel und Haut. Nach der bereits o. g. Bewertung auf Eignung des verwendbaren Patientengewebes und der Gewebequantifizierung mittels der zugehörigen HESchnitte erfolgte das Stanzen zur TMA-Herstellung. Unter Verwendung einer speziellen Apparatur, bestehend aus Bohrer und Stanzer, werden die Gewebeproben mit einem Durchmesser von 0,6mm von den Spenderblöcken auf den Empfängerblock übertragen. Abbildung 3 (mit Erlaubnis entnommen der Dissertation L. Tharun 2009): Herstellung eines Tissue Microarrays: Der halbautomatische Tissue Arrayer (A) ermöglicht die Anordnung von bis zu 1000 Gewebszylindern auf einem TMA-Block. Anhand des korrespondierenden HESchnittes kann das auszustanzende Areal auf dem in diesem Beispiel gelben Gewebeblock identifiziert und anschließend mit einer Hohlnadel (Innendurchmesser 0,6mm) aus dem Gewebeblock entnommen werden (B). Mit einem feinen Bohrkopf wird dann ein Loch mit einem Außendurchmesser von 0,6mm in den pinkfarbenen TMA-Block gebohrt (C). Dies erfolgt an einer zuvor für diesen Gewebeblock festgelegten Koordinate innerhalb eines X-Y- Koordinatensystems. Der entnommene Gewebezylinder wird dann an dieser Stelle in den TMABlock eingesetzt (D). 24 Aus diesem neu entstanden Paraffinblock konnte nun mit Hilfe eines so genannten „tape sectioning kits“ (Instrumedics Inc., NJ, USA) Schnitte erstellt werden. Dieses ermöglicht ein besseres Haften der Proben während der weiteren Verarbeitung. Die Schnitte wurden auf einen Objektträger übertragen und fixiert. Eine zunächst erstellte Hematoxylin und Eosin (HE) -Probe des TMA wurde das Vorhandensein von Tumorgewebe jedes einzelnen Spots (Gewebestanzen im Microarray) überprüft. Nur die tumorpositiven Proben konnten für die weitere Auswertung genutzt werden. Erst jetzt erfolgte die Untersuchung der gewünschten Gewebemarker: EGFR, HER2, p63, p16, HPV und CD117. Die Auswertung der Proben war nur unter Einbeziehung der Negativkontrollen in Spalte 8 und 9 möglich. Abbildung 4:Hämatoxylin-Eosin gefärbter Larynx-Tissue-Microarray 3.3 Immunhistochemie Das Prinzip der Immunhistochemie beruht auf dem Nachweis von Antigenen (Epitop) in Zellen und Geweben unter Einsatz spezieller Antikörper. Mittels Indikatoren (z.B. Fluoreszenz-Farbstoffe, Enzyme) wird die spezifische AntigenAntikörper-Bindung durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Man unterscheidet dabei direkte von indirekter Methode. Bei der „direkten“ Methode 25 wird der spezifische Antikörper für das zu untersuchende Protein direkt mit dem Enzym gekoppelt. Bei der „indirekten“ Methode wird die Bindung des unmarkierten Antikörpers an das Antigen durch ein Indikatorsystem (z.B. Avidin-Biotin-Enzym-Komplex) nachgewiesen. Ziel ist es eine spezifische und starke Bindung zwischen Antikörper und Epitop zu erreichen. Die einzelnen Komponenten des Detektionssystems werden in mehreren Schritten dem Präparat zugeführt. Das Ergebnis der Enzym-Aktivität ist abhängig durch Faktoren, wie z.B. Fixierungsart Vorbehandlungsmethoden Temperatur, und -dauer, („antigen-retrieval“) Konzentration, Inkubationszeit der oder Einbettungsmethode, Präparate dem sowie optimalen Reaktionsmilieu (pH-Wert, Salzkonzentrationen). Um das Verfahren fehlerfrei durchführen zu können, sind standardisierte Mengen und Systeme von Vorteil (Dabbs 2001). Für die immunhistochemische Analyse der Präparate dieser Arbeit wurde die sogenannte Avidin-Biotin-Complex (ABC)-Peroxidase-Technik angewandt, über die sich ein bestimmtes Eiweiß lichtmikroskopisch darstellen lässt (Hsu et al. 1981). Hierzu wurden die in folgender Tabelle aufgelisteten Antikörper verwendet: Tabelle 4: Verwendete Antikörper Antikörper EGFR Kit HER2 Kit CD117 HPV p16 p63 Firma EGFR pharm DX Dako Code K1492 HERCEPTEST Dako Code K5207 Clone Monoklonaler MausAnti-Human EGFR (Klon 2-18C9) Rabbit Anti-Human HER2 Protein Dako Code A4502 Dako Code M3528 BD, Pharmingen Biosciences Cat. No.551153 Dako Code M7247 Rabbit p145(C-Kit) K1H8 Vorbehandlung Verdünnung Proteinase K Ready Gebrauchsto use 5', RT fertiger AK Epitope Retrieval GebrauchsSolution: Citratpuffer fertiger AK mit antimikrobiellem Wirkstoff Mikrowelle TEC Puffer 1 : 400 pH 6,1 Mikrowelle 1 : 50 Mouse G175-405 TEC Puffer pH 7,8 1 : 100 4A4 pH 9,0 Dampfgarer 1 : 25 26 Für jeden Antikörper wurde die Farbintensität (Skala von 0 bis 3+) und der prozentuale Anteil positiver Tumorzellen durch einen Pathologen (T.S.C.) ermittelt. Die untersuchten Proben wurden für den jeweiligen Marker als positiv gewertet, wenn bei mehr als 1% der Tumorzellen eine eindeutige Färbung nachweisbar war. Im Rahmen der Auswertung der immunhistochemische behandelten TMAGewebeproben erfolgte des Weiteren eine quantitative Einteilung der als positiv gewerteten Stanzen mittels eines Scores mit folgender Zuordnung (Tabelle 5): Tabelle 5: Scoreeinteilung Score Negativ Schwach Mäßig Stark Intensität 0 1 1 2 1 2 3 2 3 Tumorzellen 100% < 10% 10 - 70% < 30% > 70% 30 - 70% < 30% > 70% > 30% Zur Auswertung der Her2/neu Immunhistologie wurde der im Protokoll des Herstellers empfohlene sog. Hercept-Test-Score genutzt (Dako, Dänemark). Hierbei wird ein Score (0, 1+, 2+, 3+) ermittelt, der sich aus einem bestimmten Reaktionsmuster und Färbeintensität ergibt (vgl. Tabelle 6). Tabelle 6: Hercep-Test-Score HercepTest-Score Reaktion Keine Reaktion, < 10% der Tumorzellen 0 mit membranöser Reaktion > 10% der Tumorzellen schwache 1+ Reaktion der inkompletten Zellmembran > 10 % der Tumorzellen gering bis mäßige 2+ Intensität der kompletten Zellmembran > 10 % der Tumorzellen mit starker 3+ Intensität der kompletten Zellmembran Ergebnis Negativ Negativ Schwach positiv (geringe HER2/neu Überexpression) Stark positiv (starke HER2/neu Überexpression) 27 3.4 Statistik Die Beziehung zwischen klinisch-pathologischen Daten und den einzelnen immunhistochemischen Untersuchungsergebnissen wurde mittels Chi-QuadratTest erhoben. Zur Beurteilung von rezidivfreiem Überleben sowie Gesamtüberleben in Bezug auf die Untersuchungsergebnisse wurde die Kaplan-Meier-Analyse verwand. Die statistische Auswertung erfolgte mit JMP 8.0 (SAS Institute GmbH, NC, USA). 28 4 ERGEBNISSE 4.1 Patientendaten In 97 Fällen waren Patientendaten vorhanden, die über den Krankheitsverlauf zwischen zwei und 120 Monaten nach operativem Eingriff des Patienten Auskunft gaben. Der Altersschnitt der Patienten lag zwischen 39 und 81 Jahren (Mittel: 60 Jahre). Von den 97 Patienten waren 78 Patienten männlich und 19 weiblich. Im Rahmen der mikroskopischen Auswertung der vom Tissue-Microarray angefertigten Schnitte erwiesen sich jeweils nicht alle Spots als geeignete Gewebe für eine Analyse im Sinne der Zielsetzung dieser Arbeit. Sie konnten nicht zur Auswertung Larynxkarzinomgewebe genutzt enthielten werden, oder der da sie entweder Gewebe-Spot an kein der entsprechenden Arrayposition völlig fehlte. Die Anzahl der auswertbaren Fälle variierte daher von Tumor-Untersuchung zu Untersuchung. Eine Übersicht der Anzahl auswertbarer Fälle bezogen auf die untersuchten Marker, ist in Tabelle 7 zu finden. Tabelle 7: Gesamtübersicht der auswertbaren Spots in Bezug auf Marker und vorliegende klinisch-pathologische Daten Marker EGFR HER2 p16 HPV CD117 p63 pT 86 91 89 90 90 88 pN 86 91 89 89 90 88 pM 85 90 88 89 89 87 G 82 89 87 88 88 86 29 4.2 Immunhistochemie 4.2.1 EGFR Die immunhistologischen Ergebnisse wiesen eine Positivität für EGFR in allen untersuchten Fällen auf, wobei der überwiegende Anteil eine starke Reaktion aufwies (90%; Abb. 5B). Lediglich ein Fall zeigte eine schwache (1.1 %) sowie sechs (6.5 %) eine moderate immunhistologische Reaktion. Zwei Fälle waren negativ (2.1%). Eine signifikante Korrelation der klinisch-pathologischen Daten zur EGFRExpression (pT, pN, cM und G) ergaben sich nicht (p>0.1). Eine Übersicht der immunhistologischen Ergebnisse kann der Tabelle 8 entnommen werden. Tabelle 8: Ergebnisse EGFR-Immunhistochemie bezogen auf vorliegende klinisch- pathologische Daten 1 23 Negative N (%) 1 (4.4) 2 24 - - 3 (12.5) 21 (87.5) 3 16 - - 2 (12.5) 14 (87.5) 4 23 1 (4.4) - 1 (4.4) 21 (91.3) 0 59 1 (1.7) 1 (1.7) 5 (8.5) 52 (88.1) 1 10 - - - 10 (100.0) 2 15 - - - 15 (100.0) 3 2 1 (50.0) - - 1 (50.0) 0 80 2 (2.5) 1 5 1 9 - 2 59 2 (3.3) 3 16 - N pT pN pM G - Schwach N (%) 1 (4.4) 1 (1.3) Mäßig N (%) - Stark N (%) 21 (91.3) 6 (7.5) 1 (11.1) - 71 (88.8) 5 (100.0) - 8 (88.9) - 6 (10.2) 51 (86.4) - - 16 (100.0) p-Wert 0.345 0.390 0.763 0.109 30 4.2.2 Her2/neu Immunhistologisch waren insgesamt 84 von 86 Plattenepithelkarzinomen des Larynx (97.7%) negativ für Her2/neu. Genauer hatten 77 von 86 Karzinomen den Score 0 (89.5 %), sieben den Score 1+ (8.2 %) und zwei einen Score von 3+ (2.3 %, Abb. 5C). Eine signifikante Korrelation der klinisch-pathologischen Daten zur Her2/neuExpression (pT, pN, cM und G) ergaben sich nicht. Eine Übersicht der immunhistologischen Ergebnisse kann der Tabelle 9 entnommen werden. Tabelle 9: Ergebnisse Her2/neu-Immunhistochemie bezogen auf vorliegende klinischpathologische Daten N pT pN pM G 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 1 2 3 21 24 14 20 54 11 14 0 72 6 9 51 17 Negative N (%) 20 (95.2) 21 (87.5) 13 (92.7) 17 (85.0) 50 (92.6) 10 (90.9) 11 (78.6) Schwach N (%) 1 (4.8) 3 (12.5) 2 (10.0) 3 (5.6) 3 (21.4) - 66 (91.7) 4 (66.7) 8 (88.9) 46 (90.2) 15 (88.2) 4 (5.6) 2 (33.3) 1 (11.1) 4 (7.8) 1 (5.9) Mäßig N (%) - Stark N (%) 1 (7.3) 1 (5.0) 1 (1.8) 1 (9.1) 2 (2.7) 1 (2.0) 1 (5.9) p-Wert 0.346 0.163 0.135 0.865 31 4.2.3 p63 Die p63-Immunhistochemie ergab eine hundertprozentige Positivität aller untersuchbaren Karzinomproben (95 Stück). Auffallend war eine überwiegend starke p63-Expression in 73 von 95 Fällen (76.8%). Hingegen zeigten lediglich drei Fälle eine schwache (3.1%) sowie 19 Fälle (20%) eine moderate p63-Expression (Abb. 5E). Eine signifikante Korrelation der klinisch-pathologischen Daten zur p63-Expression (pT, pN, cM und G) ergaben sich nicht (p≥0.4). Eine Übersicht der immunhistologischen Ergebnisse kann der Tabelle 10 entnommen werden. Tabelle 10: Ergebnisse p63-Immunhistochemie bezogen auf vorliegende klinisch-pathologische Daten pT pN pM G 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 1 2 3 N Negative N (%) Schwach N (%) Mäßig N (%) Stark N (%) 22 26 16 24 60 11 15 2 82 5 9 60 17 - 1 (4.5) 1 (3.8) 1 (4.2) 3 (5) 3 (3.7) 3 (5) - 3 (13.6) 4 (15.4) 4 (25.0) 5 (20.9) 12 (20.0) 1 (9.0) 3 (20.0) 14 (17.1) 2 (40.0) 1 (11.1) 12 (20.0) 2 (11.7) 18 (81.8) 21 (80.8) 12 (75.0) 18 (75.0) 45 (75.0) 10 (91.0) 12 (80.0) 2 (100.0) 65 (79.2) 3 (60.0) 8 (88.9) 45 (75.0) 16 (88.3) p-Wert 0.902 0.651 0.444 0.497 32 4.2.4 p16 Die p16-Immunhistochemie ergab eine Positivität in 90.5% aller evaluierbaren Karzinomproben (95 Stück). Eine starke p16-Expression war in 21 Fällen (22.1%; Abb. 5D), eine schwache Expression in 25 Fällen (26.3%) zu erkennen. Den Hauptteil machte die moderate p16-Expression mit 40 Fällen (42.1%) aus. Eine signifikante Korrelation der klinisch-pathologischen Daten zur p16 Expression ergab sich im histologischen Grad (p< 0.039). Kein Zusammenhang bestand zu pT, pN und cM. Eine Übersicht der immunhistologischen Ergebnisse kann der Tabelle 11 entnommen werden. Tabelle 11: Ergebnisse p16-Immunhistochemie bezogen auf vorliegende klinisch-pathologische Daten N pT pN pM G 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 1 2 3 22 27 16 24 61 11 15 2 83 5 9 61 17 Negative N (%) 2 (9.1) 2 (7.4) 1 (6.3) 2 (8.3) 4 (6.6) 2 (18.2) 1 (6.7) 7 (8.4) 5 (8.1) 2 (11.8) Schwach N (%) 6 (27.3) 6 (22.2) 6 (37.5) 5 (20.8) 16 (26.3) 4 (36.4) 3 (20.0) 20 (24.1) 3 (60.0) 19 (31.1) 4 (23.5) Mäßig N (%) 10 (45.4) 14 (51.6) 6 (37.5) 9 (37.5) 28 (46.0) 4 (36.4) 5 (33.3) 2 (100.0) 37 (44.6) 2 (40.0) 8 (88.9) 26 (42.6) 5 (29.4) Stark p-Wert N (%) 4 (18.2) 5 (18.5) 0.934 3 (18.8) 8 (33.3) 13 (21.3) 1 (9.1) 0.471 6 (40.0) 19 (22,9) 0.125 1 (11.1) 0.039 11 (18.0) 6 (35.3) 33 4.2.5 HPV Von insgesamt 97 Spots des Larynx-TMA waren 90 bezüglich der HPVImmunhistochemie auswertbar (92.8%). Es konnte im Rahmen der Auswertungen keine Positivität der HPV-Färbung belegt werden. 4.2.6 CD117 Von den 90 auswertbaren Gewebestanzen zeigte nur jeweils eine einzige eine schwach positive Färbung (Abb. 5F). Alle restlichen 89 Spots waren negativ. Die schwach positive Färbung war jeweils bei pT3, pN2, pM1 und G3 zu sehen. Signifikanzen bezüglich der vorliegenden klinisch-pathologischen Daten ergaben sich nicht (p>0.1). Tabelle 12: Ergebnisse CD117-Immunhistochemie bezogen auf vorliegende klinischpathologische Daten N 1 2 pT 3 4 0 1 pN 2 3 0 pM 1 1 G 2 3 22 27 17 24 62 11 15 2 84 5 9 62 17 Negative N (%) 22 (100.0) 27 (100.0) 16 (94.1) 24 (100.0) 62 (100.0) 11 (100.0) 14 (93.3) 2 (100.0) 84 (100.0) 4 (80.0) 9 (100.0) 62 (100.0) 16 (93.7) Schwach N (%) 1 (5.9) 1 (6.7) 1 (20) 1 (6.3) p-Wert 0.336 0.303 0.140 0.188 34 A B C D E F Abbildung 5: Beispiele von (A) HE-Färbung und immunhistochemische Befunden: (B) starke EGFR-Expression, (C) starke HER2-Expression, (D) starke p16-Expression, (E) starke p63Expression, (F) schwache CD117-Expression 35 4.3 Kaplan-Meyer- und Multivariat-Analyse Für das Plattenepithelkarzinom des Larynx konnten Signifikanzen bezogen auf den Nodal-Status (p=0.034) gefunden werden. Die Übrigen vorliegenden klinisch-pathologischen Parameter (pT, cM, G) wiesen keine signifikante Korrelation auf (p>0.1). Weiter konnte keine Korrelation der untersuchten Markern untereinander (EGFR, Her2/neu, p63, p16, HPV und CD117) festgestellt werden (p>0.3). 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse Zusammenfassend bestanden keine eindeutigen Assoziationen zwischen Expression der untersuchten Marker (EGFR, HER2, p63, p16, CD117, HPV) und den vorliegenden klinisch-pathologischen Parametern (pT, pN, pM, G, Rezidivfreies- und Gesamt-Überleben). Jedoch zeigen einzelne Marker (EGFR, HER2, p63, p16) eine teils starke Expression, deren möglicher Einfluss auf Tumortherapie bzw. -genese im folgenden Abschnitt näher diskutiert werden soll. 36 5 DISKUSSION In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression sechs verschiedener Proteine (EGFR, Her2/neu, p63, p16, HPV, CD117) an einem Kollektiv von 97 Larynxkarzinomen untersucht, um ihre Bedeutung beim Larynxkarzinom zu evaluieren. Trotz geringer signifikanter Korrelationen der untersuchten Marker zu den vorliegenden klinisch-pathologischen Daten, erlauben die Untersuchungsergebnisse Rückschlüsse auf eine mögliche diagnostische Verwendung oder therapeutische Konsequenz. 5.1 Diskussion der Untersuchungsergebnisse 5.1.1 EGFR In der vorliegenden Arbeit wiesen 90 von 92 Fällen (97.8 %) der untersuchten Plattenepithelkarzinome des Larynx eine EGFR-Expression auf. In 90% der Fälle handelte es sich um eine starke membranöse EGFR-Positivität. Lediglich zwei Fälle waren negativ (2.2%). Eine signifikante Assoziation der EGFRExpression in Korrelation zu den vorliegenden pathologischen und klinischen Parametern (TNM-Stadium und Tumorgrad), als auch den Überlebensdaten, ergab sich nicht. Verschiedene Forschungsgruppen beschäftigen sich seit längerem mit der Frage, inwieweit EGFR für die Diagnostik bzw. die Prognoseabschätzung beim Larynxkarzinom geeignet ist und in welchem Zusammenhang eine EGFRÜberexpression mit der TNM-Klassifikation, Metastasenstatus und histologischem Grad steht (Jiang et al. 2009, Christensen 1998, Wildemann et al. 2009, Nicholson et al. 2001, Wei et al. 2008, Dassonville et al. 1993). Ähnliche wie unsere Ergebnisse wurden auch von anderen Forschungsgruppen beschrieben, in denen im Mittel 105,4 Larynxkarzinom-Fälle untersucht worden waren (60 bis 156 Patienten). Diese Gruppen fanden ebenfalls keine Korrelation zu klinisch-pathologischen Parametern wie Grading, Tumorphänotyp, Überleben, Tumor- und Nodal-Stadium sowie Rezidivrisiko 37 (Jiang et al. 2009, Christensen 1998, Wildemann et al. 2009, Almadori et al. 1999, Resnick et al. 1995, Parikh et al. 2007). Hingegen berichteten andere Autoren einen Einfluss der EGFR-Überexpression auf Tumorstadium bzw. das Gesamtüberleben: Maurizi et al. zeigten unter Verwendung eines Radioliganden-Rezeptor-Assay ein reduziertes Gesamtüberleben, wobei das 5-Jahres-Gesamtüberleben der Patienten mit EGFR-positiven Tumoren bei 25% und das der Patienten mit EGFR-negativen Tumoren bei 81% lag. Einen Zusammenhang zu Tumorstadium, Lymphknotenstatus oder histologisches Grading zeigte sich hierbei nicht (Maurizi et al. 1996). Eine weitere Studie von 40 Larynxkarzinomen konnte eine immunhistologische Überexpression in rund 88% der Fälle feststellen, wobei 83% der EGFR-positiven Karzinome Lymphknotenmetastasen aufwiesen. Auch für diese Kohorte wurde ein aggressiveres Tumorverhalten und eine schlechtere Überlebensprognose EGFR-positiver Tumoren nachgewiesen (Wei et al. 2008). Dassonville et al. berichten über eine Überexpression in 93 von 94 Fällen in Abhängigkeit des Tumorstadiums wobei in dieser Untersuchung eine höhere EGFR-Expression mit einem höheren Tumorstadium assoziiert war (p=0.007) (Dassonville et al. 1993). Scambia et al. beschrieben eine höhere EGFR-Expressionsrate in G3Larynxkarzinomen als in G1-G2 Tumoren beim Larynx (p=0.05) und postulierten deshalb einen Zusammenhang zwischen höherer EGFR- Expression und höherer Tumoraggressivität (Scambia et al. 1991). Für diese uneinheitlichen Ergebnisse könnten diverse Faktoren eine Rolle spielen, wie zum Beispiel die Patientenauswahl, unterschiedlich angewandte immunhistochemische Verfahren, Scoreeinteilungen oder die Definition der Überexpression. Einfluss auf das Ergebnis könnte auch die Bewertung der Lokalisation einer EGFR-Färbung haben, also ob membranöse oder zytoplasmatische Färbungen als positive Expression angesehen werden (Wei et al. 2008). Aufgrund der kontroversen Datenlage, ist eine Standardisierung der immunhistochemischen Prozesse notwendig. Gerade dafür ist das TMAVerfahren von Vorteil, da bei dieser Methode eine genaue Analyse zum Beispiel der Expression eines bestimmten Proteins (hier EGFR) in unterschiedlichen 38 Gewebearten, sowie die Darstellung der Expressionsmuster unterschiedlicher Malignitätsgrade einer bestimmten Tumorentität gelingt. Eine simultane Analyse einer Vielzahl von Gewebeproben in einem Experiment wird dadurch ermöglicht (Kononen et al. 1998, Kuefer et al. 2004). Weitere mögliche Faktoren für variable EGFR-Befunde könnten das verwendete Biopsiematerial (Frischmaterial oder Paraffinmaterial), das Alter der verwandten Paraffin-geblockten Gewebe oder auch technische Aspekte wie z.B. das immunhistochemische Färbeprotokoll und der verwandte Antikörper darstellen. Neben den bereits genannten technischen Unterschieden könnte es die weite Spannbreite an untersuchten Fällen (7 – 1385 Stück) sein, die zu den sehr unterschiedlichen Untersuchungsergebnissen geführt haben könnte (Koynova et al. 2005, Wei et al. 2008, Demiral et al. 2004, Parikh et al. 2007, Irish et al. 1993). Eine tragende Rolle spielt der EGF-Rezeptor im Rahmen der heutigen Therapiekonzepte, wobei monoklonale Antikörper (z.B. Cetuximab), bzw. Tyrosinkinasinhibitoren (z.B. Gefitinib, Erlotinib) den Rezeptor als Ziel nutzen (Grandis et al. 1998, Sun et al. 2009). Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) sind ein vielversprechender Behandlungsansatz, wobei diese Therapiemethode schon erfolgreich bei der Behandlung von nichtkleinzelligen Bronchialkarzinomen (NSCLC) eingesetzt wird (Zimmer et al. 2009). Gefitinib z. B. wurde als erstes Agents von der Food and Drug Administration (FDA) für die Therapie des NSCLC zugelassen (Lynch et al. 2006). Der Einsatz monoklonaler Antikörper beim HNSCC wurde im Rahmen mehrerer Studien untersucht, bei denen ebenfalls Larynxkarzinome eingeschlossen waren: Der Unterschied der Studien lag meist in der Auswahl der behandelten Patienten bzw. dem Behandlungsschema. Bonner et al. zeigte an 200 primären nichtmetastasierten HNSCC ein besseres Gesamtüberleben (55% vs. 45%), progressionsfreies Überleben (42% vs. 31%) und lokoregionären Kontrolle (47% vs. 34%) unter Radiotherapie kombiniert mit Cetuximab gegenüber alleiniger Radiotherapie (Bonner et al. 2006). Vergleichbare Ergebnisse 39 konnten in ähnlicher Form ebenfalls für metastasierte Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches nachgewiesen werden (Kearsley et al 1991). Weitere Studien verglichen die konventionelle Chemotherapie (Cisplation oder Carboplatin mit 5 Fluorouracil) mit einer kombinierten Chemotherapie unter Einschluss von Cetuximab an metastasierten HNSCC, die zeigen konnten, dass die mit dem monoklonalen Antikörper behandelten Patienten ein bessere Ansprechrate, besseres progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben aufwiesen (Vermorken et al. 2007, Wheeler et al. 1999). Nach aktueller Empfehlung (2011) des „Cancer Care Ontario /program in evidence-based care“ (PEBC) ist die Behandlung von HNSCC wie folgt anzustreben: Platinbasierte Radiochemotherapie (5-Fluorouracil mit Platin oder Monotherapie mit Platin) ist der Goldstandard für nichtmetastasierte HNSCC (Stadium III-IVB). Bei Patienten über 70 Jahre wird eine alleinige Radiotherapie empfohlen. Rezidivierende oder metastasierte HNSCC sollten mit der Kombinationstherapie Cetuximab und platinbasierter Chemotherapie behandelt werden (Winquist et al. 2011). 40 5.1.2 HER2 Von 86 auswertbaren Tumorspots waren 84 HER2 negativ (97.7%). Eine membranöse HER2-Überexpression (3+) war lediglich in 2.3 % der Fälle nachweisbar. Statistisch konnte dementsprechend kein signifikanter Zusammenhang zwischen TNM-Stadium, histologischem Grad und Randstatus nachgewiesen werden. Diverse Forschungsgruppen haben sich mit der HER2-Expression von Larynxkarzinomen beschäftigt, wobei dessen prognostische Relevanz kontrovers diskutiert wird (Koynova et al. 2005, Cavalot et al. 2007, Tantawy et al. 1999). Khademi et al. fand in 76% der 53 analysierten Larynxkarzinomen eine starke HER2-Expression (3+), wobei keine Korrelation zum TNM-Stadium oder histologischem Grad gefunden wurde (Khademi et al. 2002). Tantawy et al. untersuchte immunhistochemisch 34 Larnynxkarzinompatienten, die in 53% HER2 positiv waren (33%→3+, 50%→2+, 17%→1+). Kein Zusammenhang wurde mit Tumorstadium, Nodalstatus oder histologischem Grad gezeigt (Tantawy et al. 1999). In weiteren immunhistochemischen Studien wurden 27 bzw. 154 Patienten untersucht, wobei jeweils in 48% bzw. 52% eine Überexpression von HER2 nachgewiesen wurde. Eine Scoreeinteilung wurde jeweils nicht berücksichtigt. Keine der Studien konnte einen Zusammenhang zwischen Positivität und klinischen Parametern (T, N, klinisches Stadium, G) zeigen (Krecicki et al. 1999, Kazkayasi et al. 2001). Wie auch beim Larynxkarzinom ist die Datenlage bei HER2-Untersuchungen an HNSCC Populationen sehr inkonsistent. In unterschiedlichen Studien wird von einer HER2-Positivität Auswertungsmethoden in sehr 20-60% der unterschiedlich Fälle berichtet, waren und wobei auch z. die T. zytoplasmatische Expressionen gewertet wurden (Tse et al. 2009, Cavalot et al. 2007, Tantawy et al. 1999, Craven et al. 1992, Field et al. 1992, Kearsley et al. 1991). Tse et al. wiesen ein besseres Gesamtüberleben sowie eine verkürzte Diseasefree survival nach (Tse et al. 2009). Cavalot et al. hingegen fand an 87 HNSCC 41 eine signifikant höhere HER2-Expression in HNSCC mit Lymphknotenmetastasen (p=0.046) und deklarierte HER2 als unabhängigen prognostischen Faktor. Das 5-Jahres-Überleben von HER2 positiven Patienten war um 64% geringer als bei HER2 negativen Patienten (84%) (Cavalot et al. 2007). Verglichen mit dem Großteil der früheren Studien wurde in der vorliegenden Arbeit eine deutlich geringere immunhistologische nachweisbare Überexpression gefunden. Neben dem Probenalter und möglicher Unterschiede in der Fixierung, sind als Hauptursachen für die unterschiedlichen Ergebnisse zum einen das Alter der Studien und zum anderen die Diskrepanzen der Auswertungen zu sehen. Zum Zeitpunkt der älteren Studien existierte der in dieser Arbeit verwendete und von der „Federal Food and Drug Administration“ (FDA) zugelassene HER2/neu-immunhistologische Test (Herceptest ®) noch nicht. Der von uns verwendete HER2-Test war erst im September 1998 in den USA zugelassen worden (Wolff et al. 2007). Die Ergebnisse der Arbeiten der 90er Jahre ermittelten zytoplasmatische sowie membranöse Expression (Craven et al. 1992, Kearsley et al. 1991, Tantawy et al. 1999), wobei eine der Arbeiten die zytoplasmatische Expression als ein mögliches Artefakt aufgrund des Präparatealters bzw. der Probenaufarbeitung deutete (Craven et al. 1992). Die jüngeren Arbeiten jedoch orientierten sich ebenfalls nicht an dem etablierten Auswertungverfahren des Herceptest ®. Lediglich eine Studie beurteilte die HER2/neu-Expression, wie auch wir, nach dem Schema des Hercept-Test-Scores®, wobei hier 3.1% von 129 untersuchten Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (Pharynx und Mundhöhle) eine HER2/neu-Überexpression aufwiesen, die mit einem verminderten Gesamtüberleben korrelierte (Schartinger et al. 2004). Ein weiterer möglicher Einflussfaktor könnte ferner die Größe der Kohorten (271382 Tumoren) gewesen sein, die zu den unterschiedlichen Ergebnissen gegenüber den klinisch-pathologischen Daten geführt haben könnten. Dennoch ist unserer Meinung nach das Fehlen eines etablierten und standardisierten Auswertungsverfahrens wie der Herceptest ® (DAKO) als eigentliche Ursache der inhomogenen Ergebnisse anzusehen. 42 Kearsly et al. untersuchten immunhistochemisch die HER2 Expression in 46 HNSCC und konnten keine starke membranöse Färbung nachweisen. Es wurde nur in zwei Fällen von einer schwachen membranöse Positivität berichtet. Auch wurde per Southern blot keine Amplifikation des HER2- Rezeptoronkoproteins gezeigt (Kearsley et al. 1991). Diverse Studien bestätigen, dass eine gezielte Therapie gegen HER2 (z. B. Herceptin®, Trastuzumab), eine bessere Ansprechrate als auch einen Langzeit Benefit bei nicht- bzw. metastasierten Mammakarzinomen hat (Freier et al. 2003, Junttila et al. 2009, Cobleigh et al. 1999, Vogel et al. 2002, Egervari et al. 2008, Slamon et al. 2001). Neben dem Mammakarzinom wird auch das Magenkarzinom mittlerweile erfolgreich mittels einer anti-HER2/neu-Therapie behandelt (Okines und Cunningham 2012, Jørgensen und Hersom 2012). Die große internationale Phase-3-Studie ToGA (Trastuzumab for Gastric Cancer) postulierte Trastuzumab als neue standardisierte Therapie für Patienten mit HER2positivem fortgeschrittenem Karzinom des Magens oder Gastroösophagealem Übergang in Kombination mit einer Chemotherapie bestehend aus Capecitabine plus Cisplatin oder Fluorouracil plus Cisplatin (Bang et al. 2010). Zusammenfassend kann man in Bezug auf unsere HER2-Ergebnisse sagen, dass innerhalb unserer Kohorte keine Korrelation der klinisch-pathologischen Parameter in Bezug auf die HER2/neu Expression gefunden wurde, dennoch in einzelnen Fällen eine HER2/neu Überexpression (3+) nachweisbar war. Im Falle des Vorliegens einer HER2/neu Überexpression könnte eine zusätzliche Therapie gegen HER2/neu in Erwägung gezogen werden, die in Einzelfällen zu einem besseren Therapieansprechen führen könnte. 43 5.1.3 CD117 In der vorliegenden Studie wurde bei nur einem der 90 Gewebespots eine CD117-Positivität festgestellt. Alle übrigen Spots waren negativ. Es konnte somit logischerweise kein Zusammenhang zwischen Expression und TNMKlassifikation, Randstatus, histologischem Grad und Überleben gefunden werden. Die Datenlage zur CD117-Expression an Plattenepithelkarzinomen des Larynx ist sehr spärlich. Lediglich eine Arbeitsgruppe wies immunhistochemisch in 50% von insgesamt sechzehn Larynxkarzinomen eine CD117 Expression nach, wobei eine noch höhere Expressionsrate von 86% in parallel untersuchten 21 Pharynxkarzinomen gefunden wurde (p 0.04) (Ongkeko et a. 2006). Mino et al. verglichen immunhistochemisch die CD117-Expressionsrate an diversen Malignomen des Kopf-Hals-Bereiches (z. B. Adenoidzystisches Karzinom, Mucoepidermoidkarzinom, adenosquamöses Karzinom, basaloides Plattenepithelkarzinom). In dieser Studie fand sich keine Positivität bei den sechs untersuchten basaloiden Plattenepithelkarzinomen (Mino et al. 2003). In der Literatur werden unterschiedliche CD117 Untersuchungsmethoden diskutiert, die von Immunhistochemie (an in Paraffin eingebettet oder gefrorenen Präparaten) über Flusszytometrie bis hin zum mRNA Nachweis reichen. Im Falle der Immunhistochemie spielt auch hier die Interpretationsweise der Färbung eine tragende Rolle, wobei ein etabliertes Scoringsystem wie z. B. bei HER2 bislang nicht existiert (Arber et al. 1998, Sabah et al. 2003, López-Martin et al. 2007, Fletcher C. und Fletcher J. 2002). Neben der Interpretation der Ergebnisse können auch technische Aspekte wie Alter der Tumorproben, Fixierung, Inkubationszeiten sowie Hersteller und Verdünnung des Antikörpers zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Als eine Ursache für die Diskrepanz unserer Ergebnisse mit denen von Ongkeko et al. könnte vor allem der angewandte Antikörper und dessen Verdünnung ein Grund für die hohe CD117-Positivität sein. Im Gegensatz zu unserer Methode wurde der bei Ongkeko genutzte Antikörper in einer geringeren Verdünnung (1:100) inkubiert, was als eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse heranzuziehen ist. Hingegen muss man sich ebenfalls die Frage 44 stellen ob die Untersuchungen an einem größeren Patientenkollektiv wie beispielsweise in unserer Arbeit, ebenfalls zu denselben Ergebnissen geführt hätten. Ein weiterer nicht beeinflussbarer Faktor ist auch hier die Qualität des Tumormaterials (Fixierung, Alter der Proben usw.), die in den Studien Verwendung fanden. Aus therapeutischer Sicht ist die CD117 Expression von großem Interesse, da CD117 als Ziel für den Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib-Mesylate (Glivec) genutzt wird. Imatinib ist ein etablierter Antikörper zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) sowie des gastrointestinalen Stromatumors (GIST) (Dagher et al. 2002, Renouf et al. 2009). Für die CML z.B. konnte in einer Phase III Studie unter Einschluss von 553 Patienten gezeigt werden, dass die first-line Therapie nach sechs Jahren ein Gesamtüberleben von 88% gegenüber 84% in der second-line Therapie ergab (Hochhaus et al. 2009). Eine Phase III Studie an 773 GIST-Patienten erbrachte ähnliche Ergebnisse bezüglich des Gesamtüberlebens unter Imatinib-Therapie (38 vs. 20 Monate) (Duffaud et al. 2010). Im Rahmen eines Zelllinienexperiments von Plattenepithelkarzinomen des Larynx konnte gezeigt werden, dass es unter Kombinationstherapie mit Imatinib und Carboplatin zu einem Rückgang der CD117 Expression sowie des Zellwachstums kam (Schultz et al. 2011). Im Gegensatz zu den Zelllinienexperimenten berichtete Tsao et al. im Rahmen einer Phase II-Studie an HNSCC über eine Ansprechrate von 0% unter kombinierter Chemotherapie mit Docetaxel und Imatinib (Tsao et al. 2011). Trotz des Nachweises einer CD117 Expression in Plattenepithelkarzinomen des Larynx scheint bei aktueller Datenlage, verglichen mit der CML oder dem GIST, eine Therapie mit Imatinib nicht besonders zielführend zu sein. 45 5.1.4 p16/HPV In der vorliegenden Untersuchung war in 90.5% der evaluierbaren Fälle eine p16-Positivität nachweisbar, wobei hiervon 22% (20 von 89 Fällen) eine starke p16-Intensität aufwiesen. Die Korrelation der immunhistologischen Ergebnisse ergab jedoch lediglich eine Signifikanz bezüglich des Tumor-Grades (p=0.039), wobei hier ein überproportionaler Anteil der Karzinome ein G2-Stadium mit einer moderaten p16-Expression aufwiesen. Wertet man jedoch lediglich die starke p16-Expression (22% der untersuchten Fälle) als positiv, so wie es in der Literatur diskutiert wird (Lewis et al. 2010, Weinberger et al. 2004, Fischer et al. 2010, Smeets et al. 2007), liegen unsere Ergebnisse im Rahmen anderer Studien. Mehrere Studien ergaben an Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs eine p16 Positivität in 28- 78 % (Lewis et al. 2010, Allegra et al. 2012, Yuen et al. 2002, Smith et al. 2010, Silva et al. 2012). In Bezug auf p16 in Zusammenhang mit HPV-Infektionen wurde am ausführlichsten das Tonsillenkarzinom untersucht. Hier zeigt sich in ca. 25% der Fälle eine HPVAssoziation (Kreimer et al. 2005, Herrero et al. 2003), meist in Verbindung mit einer p16-Überexpression (Klussmann et al. 2003. Song et al. 2012). Im Gegensatz zu den immunhistologischen Untersuchungen berichteten diverse Studien von einer reduzierten p16-Expression aufgrund von Deletionen oder Promotormethylierung in mehr als 50% der untersuchten HNSCC (29-171 Fälle) , häufig auch in Zusammenhang mit Nikotinabusus (Miracca et al. 1999, Geisler et al. 2002, Reed et al. 1996, Weinberger 2004). Yuen et al. zeigten, dass eine p16-Inaktivierung öfters in Larynxkarzinomen zu detektieren ist als in anderen Kopf- und Halsorganen (Mundhöhle, Pharynx), wobei eine Korrelation zu den klinisch-pathologischen Daten nicht gezeigt wurde (Yuen et al. 2002). Für das Plattenepithelkarzinom der Cervix uteri konnte gezeigt werden, dass eine p16 Expression mit einer HPV-Infektion in Verbindung steht, wobei hier eine Inaktivierung von Rb über die HP-Virusproteine (E6 und E7) zu einer Hochregulierung von p16 führt, die immunhistochemisch als deutliche 46 Überexpression erkennbar ist (Carozzi et al. 2008, Tsoumpou et al. 2009, Nieh et al. 2005). Bezüglich der Assoziation zu klinisch-pathologischen Parametern konnte ein Bezug der p16-Expression zu Vorläuferläsionen (zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN I-III)) sowie zur Lymphknotenmetastasierung und zum rezidivfreien- bzw. Gesamtüberleben gefunden werden (Klaes et al. 2001, Huang und Lee 2012, Yamazaki et al. 2006). Aufgrund des engen Bezugs der p16 Expression zu einer HPV-Infektion wird p16 als Surrogatmarker für eine stattgehabte HPV-Infektion diskutiert (Weinberger et al. 2004, Fischer et al. 2010, Hoffmann et al. 2010, Lewis et al. 2010, Gilbert et al. 2012). Am Beispiel des Oropharynxkarzinoms lässt sich eine Korrelation zwischen starker p16-Expression sowie HPV-Positivität feststellen: eine Studie von Rischin et al. zeigte exemplarisch dafür eine p16 Überexpression in 60% der Oropharynxkarzinomen, wovon 52% p16 +/HPV + waren (Rischin et al. 2010). Aspekte wie Untersuchungskosten, immunhistochemischer Interpretierbarkeit Methoden, die weite einfache Verfügbarkeit Durchführung, etablierter sowie gute sprechen für p16 als indirekten Marker einer möglichen HPV-Infektion. Ein großer Nachteil dieser Methode ist jedoch das Fehlen von standardisierten Kriterien bei der Auswertung der immunhistologischen p16 Expression, wie z. B. beim Herceptest ®. In der derzeitigen Literatur wird p16 als positiv gewertet, wenn Tumoren eine starke und diffuse zytoplasmatische sowie nukleare Färbung aufweisen (Lewis et al. 2010, Weinberger et al. 2004, Fischer et al. 2010, Smeets et al. 2007). Bei der Beurteilung von Parametern wie Intensitätsstärke und Reaktionsmuster spielt sicher die Interobservervariabilität eine große und nicht unterzuordnende Rolle. Daher sollte zur Etablierung des Verfahrens der p16 Immunhistochemie als verlässlicher Surrogatmarker ein standardisiertes Verfahren angestrebt werden, das einem festgelegten Protokoll folgt. Ein weiterer Aspekt der bei der Nutzung von p16 als Surrogatmarker nicht außer acht gelassen werden darf, ist die Spezifität von p16 für eine HPVInfektion, da p16 durch andere Mechanismen überexprimiert werden kann. Über den zugrunde liegenden Mechanismus, ob Rb unabhängig von viralen 47 Protein Expressionen supprimiert wird, oder ob einer Rb-Gendeletion vorliegen könnte, kann derzeit nur spekuliert werden (Chernock et al 2009, Smeets et al. 2007). Neben der immunhistochemischen Bestimmung von p16 wurde das Material auch auf eine mögliche HPV-Infektion hin untersucht. Immunhistologisch waren alle untersuchten Fälle HPV-negativ. Die Datenlage zu immunhistologischen HPV-Untersuchungen am Larynxkarzinom ist sehr dürftig. Lediglich eine Studie untersuchte KarzinomVorläuferläsionen des Larynx mittels Immunhistochemie und PCR, wobei gegenüber achtundzwanzig von fünfzig PCR-positiven Fällen, immunhistochemisch lediglich zwei positive Fälle gefunden wurden (Azzimonti et al. 1999). Hingegen wurden diverse Studien zum Nachweis von HPV-DNA in Plattenepithelkarzinomen des Larynx durchgeführt. Die Fallzahlen lagen zwischen 38 und 93 Patienten, bei denen in 15-35% der Fälle eine Positivität für HPV mittels PCR nachgewiesen wurde (Baumann et al. 2009, Morshed et al. 2005, Morshed et al. 2008, Stephen et al. 2012). Lediglich eine dieser Studien wies eine bessere Prognose bei HPV-positiven Karzinomen nach (Baumann et al. 2009). Eine Metaanalyse ergab an 2559 Larynxkarzinomen eine high-risk HPVPrävalenz von 26,6% mit in fast 20% der Fälle nachgewiesenem HPV-Typ 16 (Li et al. 2013). Eine weitere Metaanalyse jedoch HNSCC betreffend, zeigte in 5681 Fällen eine Prävalenz von 22%, von der in 95% der Infektionen der HPV-Typ 16 nachweisbar war (Dayyani et al. 2010). Grund für die HPV-Negativität der vorliegenden Studie ist mit aller Wahrscheinlichkeit die Methode der Immunhistochemie anzusehen, bei der zum einen virale Onkoproteine immunhistochemisch nicht verlässlich in Formalin fixiertem Gewebe nachweisbar sein könnten (Begum et al. 2003). Ferner ist lediglich eine frühe HPV-Infektion immunhistologisch nachweisbar, da das L1-Capsid, wie für das Plattenepithelkarzinom der Zervix beschrieben, nach 48 Integration der HPV-DNA in die Wirts-DNA nicht mehr nachweisbar ist (Doorbar 2005). Neben der Immunhistochemie stellen die in-situ Hybridisierung (ISH) sowie die PCR weitere Methoden der HPV-Detektion auf DNA-Ebene dar. Die in-situ Hybridisierung weist gegenüber der PCR, jedoch eine geringere Sensitivität auf, da diese Färbemethode nur nach HPV-DNA Integration in das Host Genom gelingt (Begum et al. 2003, Westra 2009). Die PCR hingegen stellt sich als ein möglicherweise zu sensitives Verfahren dar, da sie die biologisch bedeutende von irrelevanter HPV-Infektion nicht zu unterscheiden vermag (van Houten et al. 2001, Lewis et al. 2010, Westra 2009). Unsere Ergebnisse in Zusammenschau der Gesamtstudienlage sprechen für p16 als Surrogatparameter, wobei eine Kombination der p16 Immunhistochemie kombiniert mit einer HPV-PCR, im Falle einer starken p16-Expression, am sinnvollsten erscheint. Alternativ zur PCR wäre eine ISH möglich, wobei hier in ungefähr 10% der Larynxkarzinome ein anderer HPV-Subtyp als HPV-16 nachzuweisen ist (van Houten et al. 2001). Klinisch zeigen HPV positive Tumoren eine erhöhte Radiosensitivität (Chen et al. 2013) sowie eine bessere Prognose, die vor allem für Plattenepithelkarzinome des Oropharynx beschrieben wurden (Rischin et al. 2010, Lewis et al. 2010, Fischer et al. 2010). Eine Studie an 239 oropharyngealen Tumoren, die p16 als Surrogatparameter mit HPV Infektion untersuchte, zeigte, dass p16+/HPV+ Tumoren ein gutes klinisches Outcome aufweisen und keinen signifikanten Unterschied zu p16+/HPV- Tumoren zeigten. p16-/HPV- Tumoren hingegen, waren mit einer schlechteren Prognose assoziiert (Lewis et al. 2010). Eine Phase-III-Studie an 172 Patienten berichtete ebenfalls über die prognostische Signifikanz von p16 bei oropharyngealen Tumoren unter cisplatinbasierter Radiochemotherapie. Zudem wurde in derselben Studie die mangelnde Sensitivität der HPV-ISH gegenüber der HPV-PCR gezeigt (79% vs. 86%) (Rischin et al. 2010). 49 5.1.5 p63 Das Ergebnis der vorliegenden Arbeit ergab bezüglich der p63-Expression eine 100%ige nukleäre Positivität der 88 evaluierbaren Patienten. Ein signifikanter Zusammenhang zwischen Expression und vorliegenden klinisch-pathologischen Daten ergab sich demnach nicht. Plattenepitheliales Normalgewebe weist p63 immunhistologisch in den basalen und suprabasalen Zellschichten auf. Im Falle plattenepithelialer Dysplasien der Larynxschleimhaut ist die p63-Expression nicht länger auf die basalen Zellschichten beschränkt, sondern über die gesamten Schichten des Epithels nachweisbar (Pruneri et al. 2002, Jeon et al. 2012). Unsere Ergebnisse decken sich mit den Angaben diverser anderer Studien, die die p63-Expression an Kohorten von 6 bis 150 Larynxkarzinomen untersucht haben. In diesen Studien wurden Positivitäten für p63 in 73-100% der Fälle beschrieben (Pruneri et al. 2002, Wen et al. 2005, Sniezek et al. 2004, Dong et al. 2005, Jia et al. 2006). Wie auch in unserer Studie konnte im überwiegenden Teil keine signifikanten Zusammenhänge zwischen klinisch-pathologischen Parametern (TNM-Klassifikation) und p63-Expression gefunden werden (Wen et al. 2005, Sniezek et al. 2004, Dong et al. 2005, Jia et al. 2006). Pruneri et al. berichten von einer p63-Positivität in 100% von 150 untersuchten Larynxkarzinomen, wobei hier eine Assoziation zwischen schlechterem klinischen Outcome und p63 Überexpression beschrieben wurde (Pruneri et al. 2002). Verglichen hierzu wurden z. B. für das Harnblasenkarzinom eine erhöhte Invasivität in Bezug auf die p63-Expression beschrieben (Berbieri et al. 2006). Hingegen berichteten Massion et al. von einer verbesserten Prognose und längerem Überleben bezogen auf eine erhöhte p63-Expression beim NichtKleinzelligen Bronchialkarzinom (Massion et al. 2003, Massion et al. 2004). Als Ursache für die außerordentlich hohe Positivität von p63 in dieser und anderen Arbeiten am ehesten seine Funktion im Zellzyklus in Betracht. p63 konnte als wichtiger Mediator bei der chemoinduzierten Apoptose in HNSCC identifiziert werden, wobei p63 die proapoptotische Funktion von p73 maligner 50 epithelialer Zellen supprimiert, was die p63-Überexpression erklären könnte (Rocco et al. 2006). Ein weiterer Aspekt der die hohe p63-Positivität in den untersuchten Karzinomen erklärt, ist seine Rolle im Rahmen der Zellproliferation, bei der es eine wichtige Rolle im Rahmen der Synthesephase (S-Phase) des Zellzyklus spielt und mit verantwortlich für das Zellwachstum ist (Lefkimmiatis et al. 2009). Somit würde sich die erhöhte Positivität von p63 bei den untersuchten Karzinomen erklären, da diese meist eine erhöhte proliferative Aktivität gegenüber normalem Gewebe aufweisen. Die außerordentlich hohe p63-Positivität in den Plattenepithelkarzinomen des Larynx könnte in Zukunft im Rahmen in der Diagnostik und möglicherweise therapeutisch eine tragende Rolle spielen. Der Vorteil von p63 gegenüber anderen Markern liegt darin, dass p63 fast ausschließlich in Plattenepithelzellen exprimiert wird und kaum Mutationen unterliegt (Hagiwara et al. 1999, Kato et al. 1999, Weber und Tannapfel 2002). Hinzu kommt eine bekannte Überexpression in Tumoren (z.B. Haut, Mundhöhle, Lunge, Ösophagus), die eine onkogene Rolle in der Regulation von Proliferation und Differenzierung in malignen Läsionen epithelialen Ursprungs vermuten lässt (Tsujita-Kyutoku et al. 2003, Lo Muzio et al. 2005, Thurfjell et al. 2005, Rocco et al. 2009). Somit könnte p63 als unterstützendes diagnostisches Mittel zum Nachweis eines möglichen epithelialen Ursprungs bei niedriger Tumordifferenzierung herangezogen werden. Diese mögliche Verwendung wird durch Vergleichstudien an Plattenepithelkarzinomen der Lunge untermauert. In einer der Studien wurde gezeigt, dass bis zu 96.2% der Plattenepithelkarzinome, jedoch nur bis 15.8% der Adenokarzinome eine p63Expression aufwiesen (Au et al. 2004, Pelosi et al. 2002). Hingegen berichteten Zhang et al. in einer Vergleichsstudie zwischen Plattenepithelkarzinomen der Lunge und kleinzelligen Bronchialkarzinomen von einer 100%igen p63 Positivität bei den Plattenepithelzellkarzinomen im Gegensatz zu 0% bei den kleinzelligen Bronchialkarzinomen (Zhang et al. 2005). Aufgrund der geringen Datenlage von p63 in Larynxkarzinomen und der Unklarheit über dessen allgemeine Rolle in der Tumorentstehung, ist p63 bislang nicht als Therapieziel in Erwägung gezogen worden. Es wird jedoch 51 vermutet, dass eine p63-Inhibition Zellen womöglich für Bestrahlungs- und Chemotherapien sensibilisieren könnte. An Zelllinien zeigten sich unter Einfluss von Zytostatika am überexprimierten p63 Konformationsänderungen, durch die p73 mit seiner pro-apoptischer Funktion nicht mehr durch p63 supprimiert wird, sodass Tumorzellen absterben (Gwosdz et al. 2005, Müller et al. 2006, Jeon et al. 2012). Diese Vermutung wurde von Zangen et al. untermauert, in dessen Studie für das Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches gezeigt wurde, dass unter Chemotherapie mit Cisplatin die Expression der p63-Isoform ∆Np63α direkt mit der Ansprechrate Patienten dieser der Chemotherapie Studie wiesen korrelierte. höhere Die chemosensitiven ∆Np63α-Proteinlevel als die chemoresistenten Patienten auf (Zangen et al. 2005). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die p63-Expression sehr häufig in Karzinomen epithelialer Herkunft nachzuweisen ist, was vor allem in der Diagnostik Anwendung finden kann. Bezüglich der Korrelation von klinischpathologischen Daten und p63-Expression fanden sich bezüglich der Prognose keine Signifikanzen. Hingegen könnte die Anwendung von p63 in Bezug auf die Diagnosestellung und in Zukunft womöglich auch als „prädiktiver“ Marker zur Therapiewahl eine Rolle spielen. 52 6 ZUSAMMENFASSUNG Das Larynxkarzinom ist der häufigste bösartige Tumor in der Hals- und Kopfregion. Da sich seine ungünstige Prognose in den letzten zwei Jahrzehnten kaum verbessert hat, besteht, neben der herkömmlichen TNM-Klassifikation, ein Bedarf an möglichen neuen prognostischen und/oder prädiktiven Parametern, die mittels TMA-Analyse gut ermittelt werden können. Neben den etablierten Prognosefaktoren wie Tumorstadium, Nodalstatus und Differenzierungsgrad gibt es eine Vielzahl von potentieller Prognosemarker. In dieser Studie wurde mittels Immunhistochemie am pathologischen Institut des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf die Expression an einer Auswahl potentiell relevanter Biomarker (EGFR, HER2, p16, p63, HPV und CD117) an 97 Larynxkarzinomen mittels Tissue-Mikroarray (TMA) untersucht. Zusammenfassend ergaben die Untersuchungen einen positiven Befund für EGFR in 97.8 %, für HER2 in 2.3 %, für p16 in 90.5 %, für p63 in 100 % und für CD117 in 1.1 % der Fälle. Dagegen waren alle Fälle immunhistologisch HPVnegativ. Es fanden sich für alle untersuchten Marker keine signifikanten Zusammenhänge, bezogen auf die vorliegenden klinisch-pathologischen Daten. Dennoch könnten einzelne Marker (EGFR, HER2, p63) eventuell für Therapie und Diagnostik genutzt werden. Therapeutisch gesehen stimmt die sehr hohe Anzahl an EGFR positiven Plattenepithelkarzinomen des Larynx optimistisch, dass bei diesem Tumor eine zielgerichtete Therapie (z. B. mit Cetuximab) eine Rolle spielen könnte. Ferner zeigten Einzelfälle eine Her2/neu-Positivität (3+). Hierzu muss in weiteren Studien untersucht werden, ob eine mögliche zusätzliche Therapie mit Herceptin® zu einem besseren „Outcome“ führen könnte. Diagnostisch und möglicherweise als Mittel bezüglich der Auswahl des bestmöglichen Therapieregimes könnte auch p63 in Zukunft möglicherweise eine Rolle spielen. 53 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AJCC American Joint Comitee for Cancer Staging c-erbB2 Human epidermal growth factor receptor 2 CDK Cyclin-abhängige Kinase CIN Cervikale Intraepitheliale Neoplasie CSF Colony Stimulating Factor DNA Desoxyribonukleinsäure EGF Epiderdermal growth factor EGFR Epiderdermal growth factor receptor erb-B2 Human epidermal growth factor receptor 2 FDA Food and Drug Administration FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung G Histologisches Grading GIST Gastrointestinaler Stromatumor HE Hematoxylin und Eosin HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 HNO Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde HNSCC Head and neck squamous cell carcinoma HPV Humanes Papilloma Virus ISH In-situ-Hybridisierung M Fernmetastase mRNA messenger Ribonukleinsäure N Regionäre Lymphknotenmetastase NSCLC Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom PCR Polymerase-Kettenreaktion 54 PEBC Cancer Care Ontario /program in evidence-based care PDGRF Platelet-derived-growth-factor-receptor R Randstatus Rb Retinoblastom-Protein RNA Ribonukleinsäure SCF Stammzellfaktor T Ausdehnung Primärtumor TGF α Transforming growth factor α TKI Tyrosinkinase-Inhibitor ToGA Trastuzumab for Gastric Cancer TMA Tissue-Microarray TNM–Klassifikation Ausdehnung Primärtumor/ regionäre Lymphknotenmetastase/Fernmetastase UICC Union internationale contre le cancer 55 8 LITERATURVERZEICHNIS Albert US, Altland H, Duda V, Engel J, Geraedts M, Heywang-Köbrunner S, Hölzel D, Kalbheim E, Koller M, König K, Kreienberg R, Kühn T, Lebeau A, Nass-Griegoleit I, Schlake W, Schmutzler R, Schreer I, Schulte H, SchulzWendtland R, Wagner U, Kopp I. 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Dank seines enormen Engagements, seiner tatkräftigen Unterstützung sowie geduldigen und motivierenden Betreuung war diese Arbeit erst möglich. Zuletzt möchte ich mich bei Max Focke und meinen Eltern für deren Unterstützung und Rückhalt bedanken. 87 10 LEBENSLAUF Entfällt aus datenschutzrechtlichen Gründen 88 11 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG: Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe. Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe. Ich erkläre mich einverstanden, dass meine Dissertation vom Dekanat der Medizinischen Fakultät mit einer gängigen Software zur Erkennung von Plagiaten überprüft werden kann. Unterschrift: ...................................................................... 89
