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Aus der
Universitäts-Augenklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Bedeutung CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen in der
Keratoplastik am Babyrattenmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2013 von
Christian Johannes Jarsch
geboren in Den Haag
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum
1.Gutachter:
Prof. Dr. Thomas Reinhard
2.Gutachter:
PD Dr. Matthias Siepe
Jahr der Promotion:
2013
Inhaltsverzeichnis
I
Inhalt
1.
Einleitung ........................................................................................................................... 1
1.1.
Immunsystem............................................................................................................... 1
1.2.
Zelluläres Immunsystem.............................................................................................. 1
1.3.
Immunologie des Auges .............................................................................................. 5
1.4.
Transplantationsimmunologie ..................................................................................... 7
1.4.1.
Immunologie der Hornhauttransplantation ........................................................ 10
1.4.2.
Treg und Transplantation ..................................................................................... 11
1.5.
Hornhauttransplantation ............................................................................................ 12
1.5.1.
Technik der Keratoplastik .................................................................................. 13
1.5.2.
Keratoplastik im frühen Kindesalter .................................................................. 14
1.6.
Das Keratoplastik-Rattenmodell................................................................................ 15
1.7.
Fragestellung der Arbeit ............................................................................................ 16
2. Material und Methoden ........................................................................................................ 17
2.1. Material und Laborgeräte .............................................................................................. 17
2.1.1. Tiere ....................................................................................................................... 17
2.1.2. Laborgeräte ............................................................................................................. 17
2.1.3. Zellkulturmaterial und Medien............................................................................... 17
2.1.4. Durchflusszytometrie ............................................................................................. 18
2.1.5. Antikörper .............................................................................................................. 18
2.1.6. Immunhistochemie ................................................................................................. 18
2.1.7. Medikamente .......................................................................................................... 19
2.1.8. Operationsmaterial ................................................................................................. 19
2.2. Methoden ....................................................................................................................... 20
2.2.1. Versuchstiere .......................................................................................................... 20
2.2.2. Durchflusszytometrische Lymphozytendarstellung ............................................... 20
2.2.3. Kultivierung von Lymphozyten ............................................................................. 26
Inhaltsverzeichnis
II
2.2.4. Isolation von Treg und CD4+CD25- Zellen ............................................................. 28
2.2.5. Lymphozyten-Suppressionsassay mit Zugabe von Treg ......................................... 32
2.2.6. Die immunhistochemische Färbung ....................................................................... 33
2.2.7. Die Fluoreszenzmikroskopie .................................................................................. 36
2.2.8. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion ........................................... 37
2.2.9. Narkotisierung der Tiere ........................................................................................ 41
2.2.10. Durchführung der Keratoplastik bei Ratten ......................................................... 41
2.2.11. Systemische Therapie mit Treg im Babyrattenmodell ........................................... 45
2.2.12. Subkonjunktivale Injektion von Zellen im Babyrattenmodell ............................. 45
2.2.13. Die Entnahme der Organe .................................................................................... 46
2.2.14. Darstellung und statistische Auswertung der Messergebnisse ............................. 46
3. Ergebnisse ............................................................................................................................ 47
3.1. Quantifizierung von T-Helferzellen und Treg in juvenilen und adulten Ratten ............. 47
3.1.1. Der Anteil der T-Helferzellanteil an den Lymphozyten nimmt mit dem Alter
signifikant zu .................................................................................................................... 48
3.1.2. Der Anteil der Treg an den Lymphozyten nimmt mit dem Alter signifikant zu ..... 48
3.1.3. Das Verhältnis von Treg zu T-Helferzellen nimmt mit dem Alter signifikant zu ... 49
3.2. Funktion von juvenilen und adulten Treg ....................................................................... 50
3.2.1. Quantifizierung der Lymphozytenproliferation ..................................................... 50
3.2.2. Isolierte Treg hemmen in vitro die Proliferation von Lymphozyten ....................... 51
3.2.3. Die inhibitorische Potenz der Treg ist konzentrationsabhängig .............................. 52
3.2.4. Treg aus juvenilen und adulten Tieren unterscheiden sich in ihrer inhibitorischen
Potenz nicht signifikant .................................................................................................... 53
3.3. Systemische Therapie mit adulten Treg im Keratoplastik Babyrattenmodell ................ 54
3.4. Lokale Therapie mit adulten Treg nach allogener Keratoplastik im Keratoplatik
Babyrattenmodell ................................................................................................................. 55
3.5. Vergleich der Zellinfiltrate der abgestoßenen Transplantate nach systemischer und
lokaler Therapie mit Treg ...................................................................................................... 61
Inhaltsverzeichnis
III
3.6. Die subkonjunktival injizierten Zellen lassen sich in der Milz, nicht jedoch in den
submandibulären Lymphknoten und der Hornhaut nachweisen .......................................... 63
3.6.1. Untersuchung von Milz und submandibulären Lymphknoten auf das
Vorhandensein subkonjunktival injizierter gfp+ Zellen ................................................... 64
3.6.2. Untersuchung der Transplantate auf injizierte gfp+ Zellen .................................... 66
3.7. Quantifizierung der Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 in juvenilen und
adulten Treg ........................................................................................................................... 68
4. Diskussion ............................................................................................................................ 69
4.1.Vergleich der Quantität, Funktion und FoxP3-Expression juveniler und adulter Treg ... 70
4.1.1. Vergleich der Quantität der Treg bei juvenilen und adulten Ratten ........................ 70
4.1.2. Vergleich der inhibitorischen Potenz juveniler und adulter Treg ............................ 71
4.1.3. Vergleich der FoxP3 Expression juveniler und adulter Treg ................................... 71
4.2. Systemische und lokale Therapie mit Treg ..................................................................... 72
4.3. Nachweis der subkonjunktival injizierten Zellen .......................................................... 73
4.4. Vergleich der Zellinfiltrate in den Transplantaten ........................................................ 74
4.5. Ausblick ........................................................................................................................ 76
5. Zusammenfassung ................................................................................................................ 79
6. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................ 80
7. Literaturverzeichnis .............................................................................................................. 82
8. Anhang ................................................................................................................................. 93
8.1. Design der PCR-Primer ................................................................................................. 93
8.1.1. Das FoxP3 Gen....................................................................................................... 93
8.1.2. Struktur der Primer für die PCR ............................................................................. 94
9. Lebenslauf ............................................................................................................................ 95
10. Danksagung ........................................................................................................................ 96
1. Einleitung
1
1. Einleitung
1.1.
Immunsystem
Der Organismus ist in ständigem Kontakt mit Krankheitsauslösern. Mit der Entwicklung des
Immunsystems brachte die Evolution einen wirkungsvollen Schutz gegen diese pathogenen
Viren, Bakterien, Pilze und Parasiten sowie gegen entartete körpereigene Zellen hervor. Beim
Abwehrvorgang findet eine Unterscheidung zwischen gefährlichen und ungefährlichen
Eindringlingen statt, so dass eine Reaktion zwar gegen Krankheitserreger, nicht jedoch gegen
Nahrungsmittel, Bakterien der Darmflora oder harmlose Pollen stattfindet. Die Tatsache, dass
gesunde körpereigene Zellen keine Abwehrreaktion hervorrufen, bezeichnet man als
Toleranz. Das Immunsystem lässt sich anhand seiner Funktionsweise in ein angeborenes
(unspezifisches) und ein erworbenes (spezifisches) Abwehrsystem unterteilen. Beim
Eindringen eines Krankheitserregers agiert zunächst das angeborene Immunsystem mit einer
äußerst effektiven Antwort, die einen Großteil der Infektionserreger beseitigt. Das angeborene
Immunsystem wird auf zellulärer Ebene von den Zellen des Monozyten-Makrophagensystems
und Natürlichen Killerzellen sowie auf löslicher (humoraler) Ebene vom Komplementsystem
und Interferonen gebildet. Einen wesentlichen Beitrag zu diesem System bildet die intakte
Haut und Schleimhaut, welche den Organismus vor Eindringlingen schützt. Das angeborene
Immunsystem ist jedoch nicht erregerspezifisch und nicht in der Lage eine immunologische
Gedächtnisfunktion auszubilden. Beim Persisitieren der eingedrungenen Erreger kommt das
erworbene Immunsystem ins Spiel. Es besteht im Wesentlichen aus Lymphozyten, sowie
Antikörpern, die den humoralen Teil des Systems bilden. Die Besonderheit dieses Systems ist,
dass sich die Lymphozyten antigenspezifisch vermehren und sich nach einer erfolgreich
bekämpften Infektion ein immunologisches Gedächtnis ausbildet. Bei einem erneuten Einfall
des selben Erregers erfolgt eine verstärkte und schnellere Immunantwort, was zu einer
effektiveren Bekämpfung der Infektion führt. Das angeborene und das erworbene System sind
jedoch nicht streng getrennt zu betrachten, da beide Teile des Immunsystems miteinander
interagieren und für eine effektive Abwehr benötigt werden (van der Tweel 1991; Peter H.-H.
1996; Vollmar 2005; Janeway 2009).
1.2.
Zelluläres Immunsystem
Alle Zellen des Immunsystems haben ihren Ursprung in den Stammzellen des
Knochenmarkes. Aus diesen pluripotenten Zellen entwickeln sich spezifische Vorläuferzellen
1. Einleitung
2
mit einem eingeschränkten Differenzierungspotential: Für die Leukozyten sind dies myeloide
Vorläuferzellen, aus denen sich Granulozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und
Mastzellen entwickeln. Aus den lymphatischen Vorläuferzellen gehen Lymphozyten sowie
Natürliche Killerzellen hervor. Die Vorläuferzellen verbleiben entweder im Knochenmark
und differenzieren sich zu B-Lymphozyten oder wandern in den Thymus, wo sie zu TLymphozyten reifen (Janeway 2009). Die ausgereiften Zellen zirkulieren anschließend im
Blut sowie den lymphatischen Organen und überwachen so das periphere Gewebe
immunologisch. Dabei erfüllen sie unterschiedliche Aufgaben: B-Lymphozyten sind auf die
Produktion von Antikörpern spezialisiert und wirken bei der humoralen Immunantwort mit,
T-Lymphozyten hingegen sind an der zellvermittelten Abwehr beteiligt. Sie können einerseits
körpereigene Zellen töten, die mit intrazellulären Pathogenen infiziert sind und fremde
Antigene auf ihrer Oberfläche tragen (zytotoxische T-Zellen). Andererseits können sie mit THelferzellen interagieren, die Eindringlinge in sich aufgenommen und zerstört haben und
deren antigene Bruchstücke auf der Oberfläche präsentieren (van der Tweel 1991).
B-Zellen sind durch genetische Rekombination dazu in der Lage, bestimmte Proteine, die
Immunglobuline (Ig) mit einer enormen Anzahl unterschiedlicher Antigenspezifitäten
herzustellen. Dabei synthetisiert jede B-Zelle ein Ig mit einer einzigen Spezifität. Diese
Proteine befinden sich an der Außenseite der Zellmembran und werden B-Zell-Rezeptor
(BCR) bezeichnet. Trifft das passende Antigen auf diesen BCR, so wird die B-Zelle aktiviert
und
sezerniert
lösliche
Immunglobuline,
die
sogenannten
Antikörper
in
den
Extrazellulärraum. Dabei besitzen die Antikörper die selbe Spezifität wie der BCR. Diese
können dort an das spezifische Antigen binden, was zu weiteren immunologischen
Reaktionen führt (Janeway 2009).
Die antigenerkennenden Moleküle der T-Zellen existieren nur in membrangebundener Form
(T-Zell Rezeptor), ähneln jedoch in Aufbau und Variabilität bei der Antigenerkennung den BZell Rezeptoren. Diese Rezeptortypen unterscheiden sich darin, dass der T-Zell Rezeptor im
Unterschied zum B-Zell Rezeptor das Antigen eines Eindringlings nicht direkt erkennen kann,
sondern nur, wenn dieses an der Oberfläche von anderen körpereigenen Zellen präsentiert
werden. Die Präsentation dieser Antigene findet über spezielle Glykoproteine, die
sogenannten MHC-Molekülen statt, von denen zwei verschiedene Klassen existieren: MHCKlasse-I-Moleküle kommen auf allen kernhaltigen Körperzellen vor. Sie präsentieren
Fragmente der Proteine, die in der Zelle synthetisiert werden. Krankheitserreger, die sich
innerhalb einer Zelle vermehren, führen dazu, dass körperfremde Proteinfragmente über das
MHC-Klasse-I-Molekül präsentiert werden. Auf diese Weise hinterlassen die Erreger Spuren
1. Einleitung
3
an der Zelloberfläche, die von den zytotoxischen T-Zellen erkannt werden können. Diese
besitzen an ihrer Zelloberfläche den Korezeptor CD8, der eine Bindung mit dem MHCKlasse-I-Molekül ermöglicht. Werden über diesen Mechanismus körperfremde Proteine
präsentiert, so induzieren die CD8+ T-Zellen die Zerstörung der befallenen Körperzellen, um
eine weitere Ausbreitung der Infektion zu verhindern. Um einer Abwehr durch die
zytotoxischen Zellen zu entgehen, besitzen manche Viren die Fähigkeit, die Expression der
MHC-Klasse-I-Moleküle einer befallenen Zelle zu verhindern. Natürliche Killerzellen können
jedoch solche Körperzellen, welche eine geringere Dichte an MHC-Klasse-I-Molekülen an
ihrer Oberfläche exprimieren erkennen und in diesen Zellen den programmierten Zelltod
(Apoptose) auslösen (Moretta, Bottino et al. 2002).
Die MHC-Moleküle der Klasse II finden sich im Unterschied zu MHC-Klasse-I-Molekülen
physiologischerweise nicht auf allen kernhaltigen Körperzellen, sondern nur auf bestimmten
Immunzellen, die dazu in der Lage sind, extrazelluläre Erreger aufzunehmen. Zu dieser
Phagozytose sind vor allem B-Lymphozyten, dendritische Zellen und Makrophagen befähigt.
Über das MHC-Klasse-II-Molekül präsentieren diese Zellen Bruchstücke der phagozytierten
Erreger. Erkennt eine für diesen Komplex spezifische T-Helferzelle die Kombination aus
MHC-Klasse-II-Molekül und Peptid, so wird die Zelle aktiviert. Fehlt einer dieser
Bindungspartner, so ist die Stimulation der T-Zelle nicht ausreichend und sie wird anerg. Dies
bezeichnet man als Kostimulation (Smith-Garvin, Koretzky et al. 2009).
Die MHC-Moleküle weisen in der Bevölkerung eine enorme Vielfalt auf, so dass die
Wahrscheinlichkeit, dass zwei Individuen das selbe MHC-Molekül besitzen, sehr gering ist
(ca. 1: 1000000) (Peter H.-H. 1996). T-Zellen können nur mit denjenigen Zellen interagieren,
die den selben MHC-Genotyp besitzen. Dies bezeichnet man als MHC-Restriktion
(Zinkernagel and Doherty 1974).
Einen besonderen Bestandteil des zellulären Immunsystems stellt eine spezielle Untergruppe
der T-Lymphozyten, die regulatorischen T-Zellen (Treg) dar. Ihr Anteil an den humanen CD4+
Lymphozyten beträgt fünf bis zehn Prozent (Itoh, Takahashi et al. 1999). Ihre Aufgabe ist es,
eine überschießende Immunantwort oder Autoaggression zu verhindern (Sakaguchi,
Sakaguchi et al. 1995), indem sie Zellen, die gegen körpereigenes Gewebe gerichtet sind,
kontrollieren. Dieser Mechanismus wird als periphere Toleranz bezeichnet. Man unterscheidet
natürlich vorkommende Treg, die im Thymus entstehen und als reife Zellen in die Peripherie
auswandern (Hori, Nomura et al. 2003) von induzierten Treg, die aus aktivierten CD4+ TZellen entstehen (Karim, Kingsley et al. 2004). Der immunsuppressive Effekt, den die Treg
vermitteln, ist antigenspezifisch. Ihre Funktion üben die Treg über mehrere Mechanismen aus:
1. Einleitung
4
Zum einen können sie nach Kontakt mit einem spezifischen Antigen antiinflammatorische
Zytokine (TGF-β und IL-10) ausschütten, die besonders auf antigenpräsentierde Zellen (APC)
und
T-Zellen
wirken.
Zum
anderen
benötigen
die
T-Effektorzellen
(Teff)
den
proliferationsfördernden Botenstoff IL-2. Dieser besitzt eine hohe Affinität zum IL-2
Rezeptor der Treg, was dazu führt, dass das Zytokin den Teff entzogen wird und sie anerg
werden. Außerdem können die Treg andere Zellen durch direkte Zell-Zell Kontakte hemmen.
Treg besitzen zudem die Fähigkeit, T-Zellen direkt zu töten, indem sie die Proteasen Granzym
A und B ausschütten, welche die Apoptose in den Teff induzieren (Wing, Fehervari et al.
2006; Vignali, Collison et al. 2008). Neben T-Zellen und APC üben Treg auch eine Inhibition
auf NK-Zellen, NKT-Zellen sowie B-Zellen aus (Cederbom, Hall et al. 2000; Azuma,
Takahashi et al. 2003; Misra, Bayry et al. 2004; Lim, Hillsamer et al. 2005; Taams, van
Amelsfort et al. 2005; Smyth, Teng et al. 2006).
Daran lässt sich erkennen, dass Treg eine immunsuppressive Wirkung sowohl auf die
angeborene als auch die erworbene Abwehr besitzen.
Abb.1: Suppressionsmechanismen der Treg. A) Sekretion löslicher Zytokine wie TGF-β und
IL-10, die hemmend auf Teff wirken. B) Sekretion der löslichen Proteasen Granzym
A und B, die in Teff die Apoptose auslösen. C) Treg. Hierbei wird der der
inhibitorische second messenger cAMP übertragen. Eine weitere Möglichkeit die TZellfunktion zu stören ist der Entzug des proliferationsfördernden IL-2, welches eine
hohe Affinität zu den IL-2 Rezeptoren der Treg besitzt. Außerdem setzten Treg
Adenosin frei, was zu einer Hemmung der Teff führt. D) Hemmung der für die TZell-Aktivierung wichtigen Dendritischen Zellen durch Treg. (Vignali, Collison et al.
2008).
Die Treg exprimieren neben dem Oberflächenantigen CD4 auch CD25, welches der α-Kette
des IL-2 Rezeptors entspricht. Diese Oberflächenmarker stellen die hilfreichsten Strukturen
1. Einleitung
5
für die Charakterisierung von Treg dar, obwohl beide auch von aktivierten T-Helferzellen
exprimiert werden (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995). Einen relativ exklusiven Marker für
die Treg stellt der Transkriptionsfaktor FoxP3 (forkhead-box-protein P3) der eine wichtige
Rolle in der Entwicklung und Funktion der Zellen darstellt (Hori, Nomura et al. 2003). Für
diese Arbeit wurden Treg aus unbehandelten Tieren, die unter sterilen Bedingungen
aufgewachsen sind, isoliert und sowohl in vitro als auch in vivo verwendet. Da der
Transkriptionsfaktor FoxP3 im Gegensatz zu den Oberflächenantigenen nur intrazellulär
vorkommt (Gilliet and Liu 2002), lässt er sich nicht bei lebenden Zellen darstellen und eignet
sich daher nicht für die Zellisolation (Xia, Shah et al. 2009). Bei unbehandelten Tieren, die
noch nicht mit fremden Antigenen in Berührung gekommen sind, werden jedoch kaum
aktivierte T-Helferzellen exprimiert, so dass eine Darstellung von CD4 und CD25
ausreichend ist, um Treg zu identifizieren (Fontenot and Rudensky 2005).
1.3.
Immunologie des Auges
Das Sehen ist für die meisten höheren Lebewesen überlebenswichtig. Obwohl eine starke
immunologische Abwehrantwort
bei
der
Bekämpfung von
Infektionen oder zur
Tumorkontrolle unerlässlich ist, kann sie im Auge durch eine Zerstörung von irreparablen
körpereigenen Zellen zu Erblindung führen. Daher hat die Natur einen Mechanismus
entwickelt, der das Auge, aber auch andere Organe, die sich nur schwer regenerieren können
wie das Gehirn, die Keimdrüsen und die Gebärmutter, vor einer Zerstörung durch das eigene
Immunsystem schützt. Experimentell lässt sich zeigen, dass eingebrachtes fremdes Gewebe
aufgrund einer geänderten Immunantwort in diesen Organen länger überlebt als in anderen
Systemen des Körpers. Diese Eigenschaft, die zu einem längeren Überleben von
Fremdgewebe in manchen Organen führt, nennt man Immunprivileg (Medawar 1948). Bei
einer Infektion ist es wichtig, dass ein Gleichgewicht zwischen effektiver Bekämpfung des
pathogenen Agens und minimalem Organschaden durch die Immunabwehr hergestellt wird
(Streilein 2003).
Das Immunprivileg des Auges bezieht sich nur auf den intraokulären Anteil, da die äußere
Oberfläche des Auges durch den Tränenfilm vor Infektionen geschützt wird. Das
Immunprivileg beruht auf speziellen immunologischen Mechanismen und einigen
anatomischen Besonderheiten: So besitzt das Augeninnere eine spezielle lymphatische
Drainage, die eine Reaktion von Immunzellen mit okulären Antigenen erschwert. Der
lymphatische Abfluss des Auges findet größtenteils über das Trabekelwerk und den
1. Einleitung
6
Schlemmschen Kanal direkt in das venöse System statt. Hierbei passiert die Lymphe keine
Lymphknoten, so dass keine noduläre Antigenpräsentation stattfindet, welche eine
Immunreaktion initiieren könnte (Cursiefen 2007).
Eine Abwehrreaktion gegen die Hornhaut wird durch weitere spezielle Eigenschaften dieses
Gewebes erschwert. Die Kornea besitzt keinerlei Blutgefäße, wodurch Abwehrzellen sie auf
dem Blutwege nicht erreichen können (Cursiefen 2007).
Außerdem kommen in der Hornhaut Strukturen, die für eine Aktivierung einer Immunantwort
nötig sind nur in geringerer Dichte als in anderen Körperregionen vor. So exprimieren die
kornealen Epithelzellen kaum MHC-Klasse-I-Moleküle und sind daher für Immunzellen
„unsichtbar“ (Hori and Niederkorn 2007). Zudem existieren im Bereich der Kornea kaum
MHC-Klasse-II-Molekül tragende Zellen wie Makrophagen, Langerhanszellen und reife
antigenpräsentierende Zellen, die zu einer Sensibilisierung gegen fremde Antigene beitragen
könnten (Streilein, Cousins et al. 1990; Dana 2004).
Der Übertritt von Entzündungsmediatoren aus dem Blut ins Auge wird durch eine sogenannte
„Blut-Augen-Schranke“ verhindert. Das anatomische Korrelat dieser Barriere stellen die
festen Zellverbindungen (tight junctions) zwischen den Endothelzellen der Netzhautgefäße
und den Epithelzellen des Ziliarapparates dar (Kaufman PL 2003; Kaplan 2007).
Eine weitere immunologische Besonderheit des Auges ist die abweichende Immunantwort der
Vorderkammer. Obwohl in die Vorderkammer injiziertes Fremdgewebe dort länger überlebt
als beispielsweise nach einer Injektion unter die Haut, findet eine starke antigenspezifische
Antikörperantwort im Körper statt. Entscheidend für das Verständnis des Immunprivilegs war
die Entdeckung von Kaplan und Streilein. Sie entdeckten, dass ein in die Vorderkammer
eingebrachtes Antigen zu einer peripheren Toleranz gegenüber diesem Antigen führt. Sie
bezeichneten diese vorderkammerassoziierte Abweichung der Immunantwort als ACAID
(Anterior-Chamber-Associated-Immune-Deviation) (Kaplan and Streilein 1977). Für diese
spezielle antigengerichtete Immunsuppression ist eine intakte okulo-splenäre Achse
erforderlich. Das bedeutet, dass Zellen aus der Vorderkammer ungehindert über das
Trabekelwerk in den venösen Kreislauf gelangen müssen. Diese Zellen induzieren in der Milz
die Bildung von Treg mit immunsuppressiven Eigenschaften (Wilbanks and Streilein 1990).
Einen entscheidenden Anteil am ACAID haben in der Vorderkammer gelöste Substanzen, die
immunsuppressiv und entzündungshemmend wirken. Dazu zählen TGF-β (transforming
growth factor) (Cousins, McCabe et al. 1991), α-MSH (α-Melanozyten stimulierendes
Hormon) (Taylor, Streilein et al. 1992), VIP (vasoaktives intestinales Peptid) (Taylor,
Streilein et al. 1994), freies Kortisol (Knisely, Hosoi et al. 1994), das Calcitonin gene related
1. Einleitung
7
peptide (Wahlestedt, Beding et al. 1986) sowie das Enzym IDO (Indolamin-2,3Dioxygenase). Letzteres katalysiert die Abbaureaktion der essentiellen Aminosäure
Tryptophan. Ein niedriger Tryptophanspiegel führt zu einer verringerten T-Zell-Aktivität.
Außerdem benötigen dendritische Zellen das Enzym um die Ausdifferenzierung von CD4+ TZellen zu immunsuppressiven Treg zu induzieren (Chen, Liang et al. 2008). Fehlt die IDO, so
kommt das Phänomen der ACAID nicht zustande (Chen, Liu et al. 2006).
Die Pigmentepithelzellen der Netzhaut (RPE) tragen einen weiteren Teil zum Immunprivileg
des Auges bei. Sie bilden einen Teil der Blut-Augen-Schranke (Rizzolo 2007), geben
immunsuppressive Faktoren in das Augeninnere ab (Holtkamp, Kijlstra et al. 2001) und
exprimieren den Fas-Liganden an ihrer Oberfläche (Zamiri, Sugita et al. 2007). Dieser
Apoptoseligand wird außerdem von Endothelzellen der Hornhaut exprimiert und schützt die
jeweiligen Zellen vor einer Zerstörung durch zytotoxische T-Zellen. Eine Bindung dieses FasLiganden mit dem korrespondierenden Fas-Marker der CD8+ T-Zellen löst den
Selbstzerstörungsmechanismus in den Lymphozyten aus (Griffith, Brunner et al. 1995).
Neben den RPE besitzen auch die Pigmentepithelzellen der Iris immunsuppressive
Eigenschaften. In Kulturversuchen wurde nachgewiesen, dass IPE die Fähigkeit besitzen, die
T-Zell Rezeptor vermittelte Aktivierung von T-Lymphozyten zu unterdrücken (Sugita, Ng et
al. 2004).
1.4.
Transplantationsimmunologie
Die Gewebetransplantation ist eine wichtige Methode um erkrankte, nicht funktionierende
Organe zu ersetzen. Dabei stellt die Abstoßung des fremden (allogenen) Gewebes durch das
Immunsystem des Empfängers das größte Problem dar. Entscheidend für die Abstoßung sind
die unterschiedlich exprimierten MHC-Klasse-I-Moleküle von Spender und Empfänger. Je
ähnlicher sich dabei diese Moleküle sind, desto geringer ist die Abstoßungsreaktion. Bei
Transplantationen zwischen genetisch identischen (syngenen) Individuen findet keine
Abstoßungsreaktion statt. Die MHC-Klasse-I-Moleküle, die man auch als „humane
Leukozyten-Antigene“ (HLA) bezeichnet, werden nach den Mendelschen Regeln vererbt.
Doch auch bei einer Transplantation zwischen nicht eineiigen Geschwistern, die identische
HLA besitzen, kann es, wenn auch verlangsamt, zu einer Abstoßungsreaktion kommen.
Hierfür verantwortlich sind die so genannten Nebenhistokompabilitätsantigene, die aus
Proteinen bestehen, die über die MHC-Klasse-I-Moleküle der Zellen des Transplantates
präsentiert werden.
1. Einleitung
8
Abb.2: Zelluläre Proteine werden in der Zelle abgebaut und deren Bruchstücke über MHCKlasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche den Immunzellen präsentiert.
Nebenhistokompabilitätsantigene sind Bruchstücke aus zellulären Proteinen, die an
MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden sind. Die zellulären Proteine bei Spender (links)
und Empfänger (rechts dargestellt) unterscheiden sich, so dass unterschiedliche
Nebenhistokompabilitätsantigene entstehen (Janeway 2009).
Da die Zellen des Transplantates körperfremde Proteine repräsentieren, werden sie vom
Empfänger als fremd erkannt. Dies löst eine Immunreaktion gegen das Fremdgewebe aus,
welche vor allem durch zytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen vermittelt wird.
1. Einleitung
9
Abb.3: Alloantigene der Transplantate werden auf zwei verschiedene Weisen erkannt. Die
direkte Fremdgenerkennung (links) des Transplantates (rot) erfolgt durch T-Zellen,
die für das fremde MHC-Klasse-I oder MHC-Klasse-II-Molekül mit einem Peptid
spezifisch sind. APC des Spenders aktivieren diese alloreaktiven T-Zellen. Die
indirekte Erkennung (rechts) erfolgt durch T-Zellen, die gegen die Proteine des
Transplantates spezifisch sind. Sie werden von APC des Empfängers stimuliert
(Janeway 2009).
Ein weiter Abstoßungsmechanismus kann durch Antikörper vermittelt werden, die gegen
Fremdgewebe wie z.B. das MHC-Molekül oder gegen Blutgruppenantigene gerichtet sind.
Insbesondere durch Reaktion mit dem Gefäßendothel können sie zu einer sehr schnellen
Transplantatabstoßung führen.
Vor den meisten Transplantationen wird eine HLA-Typisierung von Spender und Empfänger
durchgeführt um möglichst große Übereinstimmung zu erreichen. Dies verbessert die
Ergebnisse der Transplantation von soliden Organen wie der Niere, da ein nicht unerheblicher
Anteil der T-Lymphozyten, der normalerweise spezifisch auf körpereigenes HLA mit fremden
Peptid reagiert (Restriktion der T-Zell Erkennung) auch mit fremden HLA und Peptid
reagiert. Dies erklärt die starke Immunantwort gegen Transplantate. Diese T-Zellantwort trägt
den größten Anteil an der Transplantatabstoßung, wobei auch andere Zellen des
Immunsystems wie NK-Zellen, Makrophagen und Antikörper dazu beitragen (Peter H.-H.
1996).
1. Einleitung
10
1.4.1. Immunologie der Hornhauttransplantation
Die Hornhaut stellt im Gegensatz zu den soliden Organen ein besonderes Transplantat dar.
Obwohl ihre Zellen Antigene des AB0-Systems an ihrer Oberfläche exprimiert, kann die
Hornhaut blutgruppeninkompatibel transplantiert werden, da sie nicht von Blutgefäßen
versorgt wird (Salisbury and Gebhardt 1981). Eine nebenwirkungsreiche systemische
Immunsuppression wie sie bei der Transplantation von soliden Organen von größter
Wichtigkeit ist, ist nach der Hornhauttransplantation aufgrund des Immunprivilegs des Auges
selten
nötig.
Jedoch
kommt
es
auch
nach
Hornhauttransplantationen
zu
Transplantatabstoßungen (Ing, Ing et al. 1998).
Wichtig für die Akzeptanz des Transplantates ist das Zustandekommen eines ACAID,
wodurch eine immunologische Toleranz gegenüber dem Fremdgewebe induziert wird
(Sonoda and Streilein 1993). Dabei gibt es einige klinische Faktoren, die einen Verlust des
ACAID-Signals verursachen. Zu ihnen zählen eine Gefäßneubildung in der Hornhaut
(Khodadoust and Silverstein 1972), eine hohe Anzahl an antigenpräsentierende Zellen im
Transplantat (Jager 1992) oder eine Entzündung des Auges (Khodadoust and Silverstein
1972).
Die Abstoßung des Transplantates nach einer Keratoplastik erfolgt in einem vielschichtigen
Prozess, bei dem die zellvermittelte Abwehr den größten Beitrag leistet (Niederkorn 2001). In
der histologischen Auswertung eines akut abgestoßenen Transplantates lassen sich zahlreiche
Zelltypen wie CD4+ und CD8+ T-Zellen, Makrophagen, natürliche Killerzellen und
neutrophile Granulozyten erkennen (Larkin, Alexander et al. 1997; Mayer, Reinhard et al.
2003). Dabei spielen die CD4+ T-Zellen die wichtigste Rolle bei der Abstoßung (Callanan,
Peeler et al. 1988). Sie kontrollieren die immunologische Antwort auf ein Fremdtransplantat
(He, Ross et al. 1991) und sind dazu in der Lage, eine Überempfindlichkeit vom verzögerten
Typ (DTH) zu induzieren. Dabei sorgen die CD4+ Zellen für die Ausschüttung einer Vielzahl
von Botenstoffen wie IFN-µ, TNF-α, die schwere Schäden an der Hornhaut hervorrufen
können (Torres, De Vos et al. 1996). Zudem induzieren sie über den Fas-Liganden eine
Apoptose der Hornhautzellen, was zu Schäden führt (Lowin, Hahne et al. 1994).
Die Transplantatabstoßung geschieht über den indirekten Weg der Fremdgenerkennung,
indem die APC des Empfängers die Spenderpeptide den Immunzellen präsentieren. Hierbei
sind Mismatches in den Minor-Histokompabilitätsantigenen wichtiger als in den MajorHistokompabilitätsantigenen (Nicholls, Bradley et al. 1991).
Klinisch lässt sich die Abstoßungsreaktion anhand der betroffenen anatomischen Schicht der
Hornhaut unterteilen, wobei die Abstoßungsreaktion des Endothels am häufigsten und am
1. Einleitung
11
schwerwiegendsten ist, da sie zu einem Verlust dieser nicht regenerierbaren Schicht führt
(Kanski 2008).
1.4.2. Treg und Transplantation
Die größte Herausforderung in der Transplantationsmedizin ist die Verhinderung der
Abstoßung des transplantierten Fremdgewebes durch das Immunsystem des Empfängers. Eine
solche Abstoßungsreaktion stellt den häufigsten Grund für ein Transplantatversagen dar
(Peter H.-H. 1996). Je größer die genetischen Unterschiede der MHC-Moleküle zwischen
Spender und Empfänger dabei sind, desto stärker ist diese Alloreaktion des Empfängers
(Janeway 2009). Um diese Reaktion zu verhindern, müssen Transplantatempfänger
lebenslang immunsuppressive Medikamente erhalten, wobei - abgesehen von den
Nebenwirkungen potenter Pharmaka - mit zunehmender Unterdrückung des Immunsystems
die Gefahr von Infektionen steigt (Berchtold and Seitz 1996). Das oberste Ziel der
Transplantationsmedizin ist also eine zielgerichtete Immunsuppression, die ausschließlich die
Immunantwort gegen das Spendergewebe unterdrückt. Treg besitzen die Fähigkeit
Immunantworten zu unterdrücken, die Immunreaktion auf ein spezifisches Antigen wie das
Spenderantigen zu kontrollieren (Shevach 2002). Eine vor der Transplantation durchgeführte
Depletion von Treg mit anti-CD25 monoklonalen Antikörpern im Empfängertier führt bei
Mäusen, die ansonsten das Transplantat tolerieren, zu einem Ausbleiben der Toleranz und zu
einer chronischen Abstoßungsreaktion (Fucs, Jesus et al. 2006). Dies verdeutlicht die
Wichtigkeit der Treg bei der Vermittlung der Transplantattoleranz (Graca, Thompson et al.
2002). Eine induzierte Toleranz lässt sich mit einem adoptiven Transfer von Treg, die aus dem
Empfänger stammen, der ein bestimmtes Transplantat toleriert, auf naive Tiere übertragen
(Graca, Thompson et al. 2002; Chauhan, Saban et al. 2009). Diese Erkenntnisse sind viel
versprechend für eine künftige Behandlung für transplantierte Patienten. Demnach könnten
regulatorische T-Zellen in Kulturen gezüchtet werden und dem Transplantatempfänger
injiziert werden. Dieses Prinzip, dass in Tierversuchen bereits angewendet wurde, scheint
auch auf den Menschen übertragbar zu sein (Fehervari and Sakaguchi 2005; Roncarolo and
Battaglia 2007; Peters, Hilbrands et al. 2008). Dabei würden die Treg vom Empfänger
entnommen werden und in vitro kultiviert werden (Xia, Shah et al. 2009). Jedoch bleiben für
die klinische Anwendung noch einige Probleme offen. Für die genaue Aufreinigung von
regulatorischen T-Zellen ist die Suche nach geeigneteren Oberflächenmarkern nötig, um eine
Verunreinigung mit Teff zu verhindern (Xia, Shah et al. 2009). Außerdem ist für eine
Kontrolle der Transplantatabstoßung eine ausreichende Anzahl an Treg nötig, um ein
1. Einleitung
12
bestimmtes Verhältnis zwischen Treg und Teff zu erhalten. (Nomura, Plain et al. 2006; Xia, He
et al. 2006). Um Toleranz gegenüber einem voll MHC-inkompatiblen Alloantigen zu
erreichen, müsste eine wesentlich größere Anzahl an Treg benötigt werden, als für die
Toleranz gegenüber Autoantigenen, da die Zahl der alloreaktiven T-Lymphozyten sehr viel
höher ist, als die Zahl der autoreaktiven T-Lymphozyten (Suchin, Langmuir et al. 2001; Tang,
Henriksen et al. 2004; Kang, Tang et al. 2007). Zudem muss für einen optimalen Effekt der
Immuntherapie mit regulatorischen T-Zellen vor der Transplantation eine Induktionstherapie
durchgeführt werden um vorhandene T-Effektorzellen zu inaktivieren (Xia, He et al. 2008).
Die bisher verwendeten immunsuppressiven Medikamente eignen sich nicht für eine solche
Induktionstherapie, da sie mit den bereits vorhandenen und den ex-vivo vermehrten
regulatorischen T-Zellen interagieren würden (Demirkiran, Hendrikx et al. 2008). Außerdem
kann bisher nicht vorhergesagt werden, wie sich die eingebrachten Treg im menschlichen
Körper verhalten und verteilen würden (Xia, Shah et al. 2009). Ein weiterer Punkt ist, dass
Antigene in einem direkten und indirekten Weg präsentiert werden und so die Treg nicht alle
Komponenten der Immunantwort unterdrücken können. Ein anderer Aspekt, der den Erfolg
einer Transplantationstherapie mit adoptivem Transfer von regulatorischen T-Zellen
gefährden könnte ist, dass durch das Operationstrauma und die dabei entstehende Ischämie
des transplantierten Organs inflammatorische Signale erzeugt werden, die die inhibitorische
Aktivität von Treg reduzieren und die T-Effektor Antwort verstärken. So verhindert zum
Beispiel der inflammatorische Mediator Interleukin-6 die Entwicklung von CD4+Foxp3Zellen zu CD4+Foxp3+ regulatorischen Zellen (Bettelli, Carrier et al. 2006). Diese Ergebnisse
zeigen,
dass
eine
Minimierung
des
OP-Traumas
ein
Schlüsselelement
für
die
Toleranzinduktion ist (Kang, Tang et al. 2007).
1.5.
Hornhauttransplantation
Die Hornhaut ist die wichtigste Komponente des optischen Systems des Auges und sorgt für
etwa zwei Drittel der benötigten Lichtbrechung. Dementsprechend schwerwiegend wirken
sich Trübungen oder Verletzung der Hornhaut auf das Sehvermögen aus. Die
Wiederherstellung der Sehkraft ist in vielen Fällen nur durch einen Ersatz der Hornhaut
möglich.
Die Transparenz der Hornhaut wird maßgeblich durch das Endothel erhalten. Diese Schicht
besitzt eine Pumpfunktion, die ein osmotisches Aufquellen der Kornea verhindert.
1. Einleitung
13
Während das korneale Epithel durch Zellteilung ständig erneuert wird, so besitzt das Endothel
keine Regenerationsfähigkeit (Mergler and Pleyer 2007). Daher ist bei einer Beschädigung
des Endothels eine Transplantation erforderlich. Sie gilt zudem als Mittel der Wahl bei
narbigen Hornhauttrübungen, angeborenen Anomalien wie dem Keratokonus oder der
Fuchsschen
Endotheldystrophie,
Hornhautdystrophien
sowie
anderweitig
nicht
beherrschbaren Infektionen der Hornhaut (Ghosheh, Cremona et al. 2008). Die häufigste
Indikation für eine Transplantation der Hornhaut stellt jedoch die Rekeratoplastik nach
Transplantatversagen dar (Al-Yousuf, Mavrikakis et al. 2004).
1.5.1. Technik der Keratoplastik
Die Keratoplastik nimmt eine Sonderrolle unter den Transplantationen ein. So ist sie die mit
Abstand am häufigsten durchgeführte Transplantation und wird alleine in den USA etwa
47000 mal jährlich durchgeführt (Tham and Abbott 2002). Die Hornhauttransplantation
schrieb zudem Medizingeschichte, da sie die erste Übertragung menschlichen Gewebes war
und schon 1906 erfolgreich durchgeführt wurde (Zirm 1989). Mit der Einführung von
Mikrochirurgie, Asepsis, Antibiose und lokaler Steroidtherapie ist der Eingriff heute zur
Standardoperation geworden. Damals wie heute handelt es sich bei dem transplantierten
Gewebe um Hornhäute von Verstorbenen.
Es existieren verschiedene Techniken, die es ermöglichen einen Teil der defekten Hornhaut
zu entnehmen und durch intaktes Spendermaterial zu ersetzen. Bei der lamellären
Keratoplastik wird die Hornhaut nicht in ihrer ganzen Dicke entfernt. Das Endothel des
Spenders bleibt erhalten und nur das Epithel sowie ein Teil des Stromas werden ersetzt. Der
Vorteil dieser Methode liegt darin, dass kein fremdes Endothel ins Auge eingebracht wird und
so die Abstoßungswahrscheinlichkeit reduziert wird (Kanski 2008).
Die am häufigsten durchgeführte Technik stellt die perforierende Keratoplastik dar. Bei dieser
Methode wird beim Empfänger eine komplette Hornhautscheibe von sieben bis acht
Millimetern Durchmesser entnommen und durch eine Scheibe des Spenders ersetzt (George
and Larkin 2004). Die Fixation des Gewebes erfolgt mit einer Nylonnaht, welche postoperativ
nach 12-18 Monaten entfernt wird. Zur Reduktion von Abstoßungsreaktionen werden
topische
Steroide
eingesetzt
Langzeittransplantatüberlebenswahrscheinlichkeit
(Kanski
der
2008).
konventionellen
Die
perforierenden
Keratoplastik beträgt in Standartsituationen nach 10 Jahren postoperativ über 90% (Reinhard,
Bohringer et al. 2002).
1. Einleitung
14
Klinisch kann sich eine Transplantatabstoßung durch Verschwommensehen, Photophobie
oder eine periokulären Schmerz äußern. Viele Fälle sind jedoch bis zur Entwicklung einer
fortgeschrittenen Abstoßungsreaktion asymptomatisch (Kanski 2008).
Durch die langjährige Erfahrung mit der Transplantation konnten die Risikofaktoren erhoben
werden, die zu einer Transplantatabstoßung führen (Hoffmann and Pahlitzsch 1989). Dabei
lassen sich Faktoren auf Spender- und Empfängerseite unterscheiden. Bei den Faktoren des
Spendergewebes ist dies vor allem die Zahl der Langerhanszellen im Transplantat. Eine hohe
Zahl dieser antigenpräsentierenden Zellen führt zu einem hohen Abstoßungsrisiko
(Niederkorn 1990; Pleyer 1997). Die Faktoren der Empfängerseite, die zu einer höheren
Wahrscheinlichkeit einer Transplantatabstoßung führen, sind vielseitiger:
-
Hoher Grad der Vaskularisation des Stromas (Rahman, Huang et al. 2009)
-
Großer HLA-Unterschied zwischen Spender und Empfänger (Reinhard, Bohringer et
al. 2003)
-
Erhöhte Anzahl an antigenpräsentierenden Zellen im Empfängergewebe (Williams,
White et al. 1989)
-
Vorangegangene Transplantatabstoßung (Rahman, Huang et al. 2009)
-
Junges Empfängeralter (Rahman, Huang et al. 2009)
-
Rezidivierende Bindehautentzündungen
-
Fehlende Hornhautsensibilität
-
Aktive Hornhautentzündung
-
Vordere Synechie
-
Nicht reguliertes Glaukom
-
Uveitis (Kanski 2008)
Anhand der Risikofaktoren lassen sich die Patienten in eine Gruppe mit normalem und eine
Gruppe mit hohem Risiko für eine Abstoßungsreaktion einteilen. In der Hochrisikogruppe
liegt die 5-Jahrensüberlebenswahrscheinlichkeit abhängig von der Operationsindikation bei 080% (Reinhard, Bohringer et al. 2004). Das postoperative Ergebnis lässt sich auch in der
Normalrisikogruppe durch ein Matching der HLA-Klasse-I und II zwischen Spender und
Empfänger verbessern (Reinhard, Bohringer et al. 2003).
1.5.2. Keratoplastik im frühen Kindesalter
Diese Arbeit beschäftigt sich besonders mit der pädiatrischen Keratoplastik. Angeborene
Missbildungen oder früh erworbene Schäden der Hornhaut müssen so schnell wie möglich
therapiert werden, da die optische Deprivation später zur Amblyopie führt (Wiesel 1982).
1. Einleitung
15
Jedoch liefert die Keratoplastik im Kindesalter eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für eine
Transplantatabstoßung und schlechtere Visusergebnisse als im Erwachsenenalter (Vanathi,
Panda et al. 2009). Wie bei Erwachsenen, so ist auch bei Kindern der häufigste Grund für ein
Transplantatversagen die Immunreaktion (Cowden 1990). Bei Hornhauttransplantationen, die
bei Kindern im Alter unter 3 Jahren durchgeführt werden, tritt in bis zu 85% aller Fälle ein
Transplantatversagen auf, wobei die Ergebnisse stark von der zugrundeliegenden
Operationsindikation abhängen (Althaus and Sundmacher 1996; Vajpayee, Ray et al. 1999;
Yang, Lambert et al. 1999; Aasuri, Garg et al. 2000; Reidy 2001). Neben der schwierigen
Operabilität des kindlichen Auges liegt die Ursache für die vermehrte Abstoßung vor allem
im stärkeren Aktivierungsgrad des Immunsystems jüngerer Patienten begründet. Dieser
erhöhte Aktivierungsgrad ist auf eine geänderte Zusammensetzung des juvenilen
Immunsystems zurückzuführen (Alldredge and Krachmer 1981).
1.6.
Das Keratoplastik-Rattenmodell
Um die immunologischen Grundlagen, die zum erhöhten Transplantatversagen im frühen
Kindesalter führen, erforschen zu können, wurde von Mayer et al ein Rattenmodell
vorgeschlagen, welches von Schwartzkopff etabliert wurde. In diesem Modell wurden
Keratoplastiken zwischen unterschiedlichen Rattenstämmen durchgeführt, die sich lediglich
im Minor-Histokompabilitäts Komplex unterscheiden. Dabei dienen „Fisher“ Ratten als
Hornhautspender und „Lewis“ Ratten als Empfänger. Entscheidend ist die Feststellung, die
sich mit der klinischen Erfahrung am Menschen überschneidet, dass die Transplantation von
adulten Spendermaterial auf eine juvenilen Empfänger zu einer heftigeren und früheren
Abstoßungsreaktion führt, als die Transplantation auf ein adultes Individuum. In syngenen
Vergleichsgruppen des Rattenmodells wurde keine Abstoßung festgestellt.
1. Einleitung
16
Abb.4: Die Kaplan-Meier Analyse des Transplantatüberlebens im Rattenmodell zeigt ein
signifikant verkürztes Transplantatüberleben bei juvenilen Empfängertieren (Gruppe
2) im Vergleich zu adulten Empfängern (Gruppe 1) (Schwartzkopff, Berger et al.
2009).
Die immunhistochemische Auswertung der abgestoßenen Transplantate ergab Hinweise
darauf, dass Natürliche Killerzellen in der juvenilen Empfängergruppe die führende Rolle
einnehmen (Mayer, Reinhard et al. 2003). Durch Depletion der NK-Zellen konnte ein Beitrag
dieser Zellen an der Transplantatabstoßung bestätigt werden (Schwartzkopff, Schlereth et al.).
1.7.
Fragestellung der Arbeit
Untersuchungen der Arbeitsgruppe Schwarztkopff am Rattenmodell zeigten ein verfrühtes
Abstoßen bei juvenilen Transplantatempfängern im Verhältnis zu adulten Empfängern. Dabei
wurde in den histologischen Infiltraten der abgestoßenen Transplantate unter anderem eine
nennenswerte Anzahl an CD4+ T-Lymphozyten nachgewiesen. Zielsetzung dieser Arbeit war
es, die Zusammenhänge zwischen der Keratoplastik im frühen Kindesalter und Treg
herauszufinden.
Dabei wurden folgenden Fragen beantwortet:
1.) Gibt es Unterschiede im Verhältnis von Treg zu Teff bei jugendlichen zu adulten Lewis
Ratten?
2.) Unterscheiden sich juvenile von adulten Treg hinsichtlich ihrer immunsuppressiven
Funktion?
3.) Verbessert ein adoptiver Transfer von adulten Treg in juvenile Ratten das
Transplantatüberleben?
4.) Welche Auswirkungen hat ein adoptiver Transfer von Treg auf die ins Transplantat
infiltrierenden Immunzellen?
2. Material und Methoden
17
2. Material und Methoden
2.1. Material und Laborgeräte
2.1.1. Tiere
Lewis-Ratten (LEW/crl)
Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld
Fisher-Ratten (F-344/crl)
Charles River Deutschland GmbH, Sulzfeld
2.1.2. Laborgeräte
sterile Arbeitsbank
Hera safe; Thermo Electron cooperation, Langenselbold
Zentrifuge
Heraeus Multifuge 1S-R, Thermo Electron cooperation,
Langenselbold
Inkubator
Hera cell 240; Thermo Electron cooperation, Langenselbold
Wasserbad
GFL, Burgwedel
2.1.3. Zellkulturmaterial und Medien
Ficoll-Dichtegradient
PANCOLL human, PAN Biotech GmbH, Aidenbach
DMEM
DMEM Ham’s F-12 (1:1), Biochrom AG, Berlin
PBS
DPBS ohne Ca2+ und Mg2+, Invitrogen, Darmstadt
Proliferationsmarker
CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit, Invitrogen, Darmstadt
Tris-Puffer
Ansatz: 1 Liter Stammlösung 1M, pH 7,6:
121g Tris
750ml Aqua dest.
pH 7,6 mit NaCl einstellen
250ml Aqua dest.
Gebrauchslösung: 0,05 M, pH 7,6; 0,9 NaCl (1:20)
Zell-Puffer
PBS ohne Ca2+ und Mg2+
0,1 NaN3, SIGMA-Aldrich GmbH, Steinheim
2% FKS, Life Technology, Wiesbaden
2. Material und Methoden
18
2.1.4. Durchflusszytometrie
Fluoreszenz-Selektions Kit AF647-Selection Kit, EasySep, StemCell, Grenoble (Frankreich)
Foxp3-Färbe Set
Foxp3 Staining Buffer Set, eBioscience, Grenoble (Frankreich)
Durchflusszytometer
BD FACSCalibur, BD Biosciences, Heidelberg
Durchflusszytometerlösung BD FACSFlow, BD Biosciences, Heidelberg
Zellsortierer
MoFlow, Cytomation, Fort Collins (USA)
Software
FloJo, Cytomation, Fort Collins (USA)
Software
Cell quest pro Version 5.2.1, BD Biosciences, Heidelberg
2.1.5. Antikörper
CD 4
Mouse Anti Rat CD4, W3/25, Serotec GmbH, Düsseldorf
CD 8
Mouse Anti Rat CD8, MRC OX-8, Serotec GmbH, Düsseldorf
CD 25
Mouse Anti Rat CD25, OX-39, Serotec GmbH, Düsseldorf
CD 161
Mouse Anti Rat CD161, 10/78, Serotec GmbH, Düsseldorf
CD 163
Mouse Anti Rat CD163, RDI, Flanders (USA)
OX-62
Mouse Anti Rat DC-Cells, MRC OX-62 Serotec GmbH,
Düsseldorf
FoxP3
Anti-Foxp3 Alexa Fluor 647, 150D/E4, eBioscience, Frankfurt
Isotypkontrolle
Mouse IgG1 Alexa Fluor 647, κ, MOPC-21, BD Biosciences,
Heidelberg
Sekundärantikörper
Anti-Mouse Immunglobulins/Biotinylated-Polyclonal Rabbit,
Dako Cytomation GmbH, Hamburg
CD3
Anti-Rat CD3 Functional Grade Purified, G4.18, eBioscience,
Frankfurt
CD28
Anti-Rat CD28 Functional Grade Purified, JJ319, eBioscience,
Frankfurt
2.1.6. Immunhistochemie
Trypanblau
Trypan Blue (0,4%), SIGMA-Aldrich GmbH, Steinheim
Färbeautomat
Leica cv5030, Leica Instruments GmbH, Nussloch
Kryostat
Leica cm3050 s, Leica Instruments GmbH, Nussloch
Aceton
Aceton, Merck, Darmstadt
Rinderserum
Newborn Calf Serum, Biochrom AG, Berlin
2. Material und Methoden
19
Substrat
Vector Red Kit-I, SK-5100, Vector Laboratories (USA)
Tissue-Tec®
KGaA, Merck, Darmstadt
alkalische Phosphatase
Streptavidin AP, Dako Cytomation GmbH, Hamburg
Mikroskop
Olympus BH-2, Olympus GmbH, Hamburg
Digitalkamera
ProgRes CF, Jenoptik, Jena
Aufnahmesoftware
ProgRes CapturePro 2.6, Jenoptik GmbH, Jena
Fotosoftware
AnalySIS 3.2, Soft Imaging System, Münster
Fotosoftware
PictureCount, open soure
Statistiksoftware
SPSS Version 11.5.1, SPSS Inc, Chicago (USA)
2.1.7. Medikamente
Isofluran
Forene, ABBOTT GmbH&Co.KG, Wiesbaden
Tropicamid-AT
Mydriatikum Stulln, Pharma Stulln, Stulln
Phenylephrin-AT
Neosinephrin-POS 10%, Ursapharm, Saarbrücken
Atropin AT
Atropinsulfat B.Braun 0,5 mg/ml, B.Braun Melsungen AG,
Melsungen
Ketaminhydrochlorid
Ketamin 10%, Essex Tierarznei, München
Xylazinhydrochlorid
Rompun 2%, Bayer Vital GmbH, Leverkusen
Viskoelastikum
Healon® 10 mg/ml, Pharmacia GmbH, Karlsruhe
Gentamycin Augensalbe
Refobacin Augensalbe Merck, Darmstadt
Bepanthen Augensalbe
Roche Holding AG, Basel (Schweiz)
2.1.8. Operationsmaterial
Operationsmikroskop
Carl Zeiss AG, Göttingen
Trepan
2,0mm, 2,5mm, 3,0mm, 3,5mm, Geuder AG, Heidelberg
Faden 11.0
11.0 Ethilon, Ethicon GmbH, Norderstedt
Faden 8.0
8.0 Prolene, Ethicon GmbH, Norderstedt
Vannas-Hornhautschere
Geuder AG, Heidelberg
Konservierungsmedium
Medium 2, Biochrom AG, Berlin
2.1.9. Polymerase Kettenreaktion
Thermocycler
Thermocycler PTJ-200, MJ Research, St. Bruno (Kanada)
Messeinheit
Chromo 4, Bio-Rad Laboratories GmbH, München
2. Material und Methoden
DNA Polymerasen
20
FastStart Taq DNA Polymerase, Roche applied Science,
Mannheim
Primer
Metabion, Martinsried
Primerdesign-Software
Primer3, open source
RNA-Isolierung
High Pure RNA Isolation Kit, Roche Applied Science,
Mannheim
reverse Transkriptase
Superscript II, Invitrogen, Mannheim
SYBR-Green Kit
SYBR®-Green I qPCR Core Kit, Eurogentec (Belgien)
Normalisierung
REST 384 beta, Version vom 9.8.2006, open source
2.2. Methoden
2.2.1. Versuchstiere
Die verwendeten Ratten stammten aus den Inzuchtstämmen Lewis (RTl1) und Fisher (RTl1v1).
Diese beiden Stämme exprimieren nahezu identische Haupthistokompabilitätsantigene,
unterscheiden sich jedoch in ihren Nebenhistokompabilitätsantigenen. Die Haltung der Tiere
erfolgte in Käfigen mit je zwei gleichgeschlechtlichen Tieren, die ständigen Zugang zu Futter
und Trinkwasser hatten. Die Eingriffe erfolgten nach den Empfehlungen der „Association for
Research in Vision and Ophthalmology“ und erfüllten die Anforderungen der „Guiding
Principles in the Care of Animals“ des National Institute of Health. Für die Versuche wurden
juvenile und adulte Weibchen verwendet, welche am Versuchstag drei bzw. mindestens zehn
Wochen alt waren.
Das Töten der Tiere zur Organ- und Transplantatentnahme erfolgte durch Einleiten von CO2
in einen geschlossenen Käfig. Nach weiteren 10min im gasgefüllten Käfig wurden die Ratten
zur Sicherstellung des Todes gestreckt.
2.2.2. Durchflusszytometrische Lymphozytendarstellung
2.2.2.1. Die Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren zur Differenzierung von Zellen nach bestimmten
Eigenschaften. Das Verfahren macht sich die unterschiedliche Brechung eines Lichtstrahls
beim Auftreffen auf unterschiedliche Zellen zu Nutze. In einem fluoreszenzaktivierten
Zellsorter (fluorescence-activated cell sorter, FACS) wandern die in einer Einzellsuspension
gelöst Zellen durch einen Laserstrahl. Dabei wird das Licht abgelenkt. Diese Streuung wird
durch Photodetektoren an zwei Stellen gemessen und an einem Computer mit Hilfe einer
2. Material und Methoden
21
Software (Cell Quest Pro) ausgewertet. Die erste Messstelle entspricht der Streuung des
Lichtes in Flussrichtung der Zelle (Vorwärtsstreulicht, forward scatter, FSC). Das
Vorwärtsstreulicht korreliert mit der Zellgröße: kleine Zellen verursachen ein kleines
Vorwärtsstreulicht, große Zellen ein großes. Die zweite Messstelle entspricht der seitlichen
Streuung des Lichtstrahles, dem Seitwärtsstreulicht (sideward scatter, SSC). Dieser Messwert
repräsentiert den Inhalt der Zelle: stark granulierte Zellen, die viele Lysosomen in ihrem
Zytoplasma besitzen, verursachen eine starke Seitwärtsstreuung des Lichtstrahls, bei schwach
granulierten Zellen ist nur ein geringer Wert des SSC messbar. Anhand dieser beiden
Messwerte lassen sich die unterschiedlichen Zelltypen wie Leukozyten oder Erythrozyten
unterscheiden. Eine genauere Differenzierung der Leukozyten erreicht man durch eine
farbliche Markierung bestimmter Zellstrukturen. Verschiedene Zelltypen exprimieren an ihrer
Oberfläche
spezifische
Proteinstrukturen.
Diese
Strukturen
werden
als
Differenzierungsantigene bezeichnet und sind nach einem internationalen System nummeriert
(cluster of differentiation, CD). Neben den CD-Molekülen der Zelloberfläche lassen sich auch
intrazelluläre
Strukturen
zur
durchflusszytometrischen
Differenzierung
von
Zellen
verwenden.
Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern, also Antikörpern die ausschließlich gegen ein
bestimmtes Antigen gerichtet sind, lassen sich diese Strukturen markieren. Für eine
Darstellung der intrazellulären Strukturen muss zunächst die Zellmembran lysiert werden. Für
die Durchflusszytometrie werden Antikörper verwendet, an die ein Farbstoff gekoppelt
wurde, welcher in einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Wenn eine Zelle, die auf diese
Weise markiert wurde, durch den Lichtstahl des FACS-Gerätes wandert, wird die jeweilige
Fluoreszenz mit Hilfe eines Photodetektors erkannt und aufgezeichnet. Es lässt sich sowohl
eine quantitative Aussage über die Anzahl, als auch ein qualitative Aussage über die
Fluoreszenzintensität der markierten Zellen machen.
Mit dem verwendeten Durchflusszytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Heidelberg)
lassen sich bis zu vier Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig unterscheiden.
2.2.2.3.
Herstellung
einer
fluoreszenzmarkierten
Einzelzellsuspension
für
die
Durchflusszytometrie
Die spezifische durchflusszytometrische Darstellung von Treg aus der Milz erfolgte durch
Nachweis
der
Oberflächenantigene
CD4
und
CD25
sowie
des
intrazellulären
Transkriptionsfaktors FoxP3 mit der Hilfe von Antikörpern, die mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen markiert waren.
2. Material und Methoden
22
Zuerst wurde das Organ aus dem getöteten Tier entnommen und in ein Gefäß mit 5ml
Grundmedium gegeben. Zur Herstellung einer Zellsuspension wurde die Milz unter der
sterilen Arbeitsbank mit dem Stempel einer 5ml Einwegspritze in einer Petrischale durch ein
sterilisiertes Metallnetz gedrückt. Das Netz wurde anschließend mit weiteren 5ml
Grundmedium mit einer Stabpipette gespült und die gesamte Suspension in ein 15ml
Zentrifugenröhrchen gegeben. Dieses wurde für 2min stehen gelassen, damit sich
Zelltrümmer und Fettgewebe am Boden absetzen. Der Überstand wurde in ein neues
Zentrifugenröhrchen gegeben, welches mit FACS-Puffer aufgefüllt und anschließend für
7min bei 1100rpm zentrifugiert wurde. Zur Lyse der Erythrozyten wurde das verbliebene
Pellet nach dem Absaugen des Überstandes für 5min mit 3ml Ammoniumchlorid
resuspendiert. Anschließend erfolgte ein Waschgang, wobei das Röhrchen mit Grundmedium
aufgefüllt, für 7min bei 1100rpm zentrifugiert und anschließend der Überstand abgesaugt
wurde. Das verbliebene Pellet wurde in 10ml FACS-Puffer aufgenommen. Zum Anfärben der
Oberflächenantigene musste die Zellzahl der Suspension bestimmt werden. Dies erfolgte mit
Hilfe einer Neubauer Zählkammer. Da nur vitale Zellen erfasst werden sollten, wurden 10µl
der Zelllösung mit 190µl Trypanblau verdünnt, welches abgestorbene Zellen blau anfärbt.
Unter dem Mikroskop wurden die vitalen Lymphozyten aus 16 großen Quadraten der
Neubauerkammer gezählt. Die Bestimmung der Zellzahl der Suspension erfolgte mit
folgender Formel:
Gezählte Zellen in 16 Quadraten x Verdünnungsfaktor x 104 = Zellen pro ml
Für jede Messung wurden 106 Zellen benötigt. Die entsprechende Menge an Suspension
wurde jeweils in ein FACS-Röhrchen gegeben, dieses mit FACS-Puffer aufgefüllt und
zentrifugiert. Anschließend wurde die Markierung der Oberflächenantigene mit den
entsprechenden
fluoreszenzgekoppelten
Antikörpern
durchgeführt.
Die
optimalen
Konzentrationen für die Antikörper mit der Spezifität Maus-anti-Ratte wurden in
Vorversuchen ermittelt:
Zielstruktur Fluoreszenz
Konzentration
CD 4
FITC
1:100
CD 25
RPE
5:100
Zu jedem Pellet in den FACS-Röhrchen wurden die entsprechenden Antikörpermengen
hinzugegeben und mit 100µl FACS-Puffer verdünnt. Für eine ausreichende AntigenAntikörperbindungsreaktion wurden die Röhrchen für 30min bei 4°C in Dunkelheit inkubiert
und nach anschließender Zugabe von Zell-Puffer durch Zentrifugation gewaschen.
2. Material und Methoden
23
2.2.2.4. Darstellung des intrazellulären Transkriptionsfaktors FoxP3
Um
den
intrazellulär
gelegenen
Transkriptionsfaktor
FoxP3
mit
einem
fluoreszenzgekoppelten Antikörper markieren zu können, musste die ansonsten für
Antikörper nicht durchlässige Lipiddoppelschicht in den folgenden Schritten lysiert werden.
Hierfür wurde die Zellsuspension zunächst für 30min mit einem Milliliter eines 1:4 mit
Diluent verdünnten Fixations/Permeabilisations Puffers inkubiert. Anschließend erfolgten
durch Zentrifugation zwei Waschschritte mit Permeabilisationspuffer, der zuvor im Verhältnis
1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt wurde. Vor der Zugabe des Antikörpers war es
notwendig, Elemente in der Zellsuspension, die unspezifische Bindungspartner des
Antikörpers darstellten, zu blockieren. Dies erfolgte durch 15 minütige Zugabe von 2µl
Mäuseserum in 100µl verdünntem Permeabilisationspuffer bei 4C°. Nach diesen Schritten
konnte nun der Antikörper mit der Spezifität Maus-anti-Ratte, der gegen FoxP3 gerichtet war,
hinzugefügt werden. Zur Überprüfung, ob der ausgewählte Antikörper eine spezifische
Anfärbung gewährleistet, wurde zudem bei einer ein Isotypkontrollenantikörper mit der
Spezifität Maus-anti-Ratte eingesetzt.
Zielstruktur
Fluoreszenz
Konzentration
FoxP3
AlexaFluor 647
20:100
Isotypkontrolle Maus-anti-Ratte
AlexaFluor 647
5:100
Nach 30 minütiger Inkubation bei 4°C hatten sich die Antikörper an ihre Zielstruktur
gebunden. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimalige Zentrifugation mit
verdünntem Permeabilisationspuffer abgewaschen. Das verbliebene Pellet wurde daraufhin in
500µl FACS-Puffer resuspendiert. Die entstandene Zellsuspension konnte daraufhin im
Durchflusszytometer analysiert werden.
2.2.2.5. Durchführung der Durchflusszytometrie
Die hergestellte Zellsuspension wurde mit Hilfe des Durchflusszytometers analysiert. Im
ersten Schritt erfolgte die Identifizierung der Lymphozyten aus der Zellsuspension. Dies
wurde durch Darstellung der Ablenkung des Forwärts- und Seitwärtsstreulichtes in einem Dot
Plot mit linearer Skalierung erreicht. Die Zellen, deren so ermittelte Größe bzw. Granularität
derjenigen der Lymphozyten entsprachen, wurden mit der „R1“ bezeichneten Linie umrandet.
2. Material und Methoden
24
Abb.5: Darstellung der Größe und der Granularität der Zellen durch Detektion der
Ablenkung des Vorwärts- (X-Achse) bzw. Seitwärtsstreulichtes (Y-Achse) in einem
Dot plot mit linearer Skalierung. Die Fläche „R1“ markiert die Lymphozyten.
Die Unterscheidung der Lymphozyten erfolgte durch Messung der Fluoreszenzemission aller
Zellen, die sich im Bereich von R1 befanden. In einem Density Plot mit logarithmischer
Skalierung wurde die Detektion der Wellenlängen von Fluoreszenz 1 gegen Fluoreszenz 2
aufgetragen.
In
diesen
Wellenbereichen
lag
das
Emmissionsspektum
der
Fluoreszenzfarbstoffe FITC bzw. PE. Zur Justierung der Laser erfolgte zunächst die Analyse
einer Probe, die keine fluoreszenzmarkierten Antikörper enthielt. Dadurch konnte die Energie
der Laser so kalibriert werden, dass sich die unmarkierten Zellen im Fluoreszenzbereich unter
101 befanden.
Abb.6: Das Density Plot zeigt die Messung einer Zellsuspension, welche keine
fluoreszenzmarkierten Antikörper enthielt. Die Laser wurden so verstärkt, dass sich
die Zellen im Fluoreszenzbereich unter 101 befanden.
In den weiteren Schritten erfolgte eine Analyse von zwei Zellsuspensionen, die jeweils einen
der beiden für die Darstellung von CD4+CD25+ Zellen benötigten Antikörper enthielten. Die
Analyse der Zellsuspension mit dem FITC gekoppelten Anti-CD4 Antikörper ermöglichte im
Vergleich zur vorhergegangenen Messung die Definition des Fluoreszenz-positiven Bereiches
auf der X-Achse. Die Messung der nächsten Zellsuspension mit dem PE gekoppelten AntiCD25 ermöglichte diese Unterteilung für die Y-Achse.
2. Material und Methoden
25
Abb.7: Messung einer Zellsuspension mit dem Antikörper FITC anti CD4 (links) und PE
anti CD25 (rechts). Dadurch wurden die für den jeweiligen Farbstoff positiven
Bereiche auf den Achsen festgelegt.
Der so entstandene Quadrant ermöglichte die Unterteilung des Density Plots in vier Bereiche:
Oben links (UL)
Oben rechts (UR)
Unten links (LL)
Unten rechts (LR)
CD4-CD25+ Zellen
CD4+CD25+Zellen
CD4-CD25-Zellen
CD4+CD25-Zellen
Abb.8: Messung einer Zellsuspension mit den Antikörpern FITC-anti-CD4 und PE-antiCD25 mit Darstellung der absoluten Anzahl sowie dem prozentualen Anteil der
Zellpopulationen an den Lymphozyten aus R1.
Der intrazelluläre Transkriptionsfaktor FoxP3 wurde durch den Farbstoff AlexaFluor647
angefärbt, dessen Wellenbereich im Bereich von Fluoreszenz 4 detektiert wurde. Die
Darstellung dieses Transkriptionsfaktors wurde zur Identifizierung der Treg verwendet.
2. Material und Methoden
26
Abb.9: Messung einer Zellsuspension mit den Antikörpern FITC-anti-CD4 und AF647FoxP3. Die Treg stellen sich doppelt positiv dar und befinden sich im rechten oberen
Quadranten.
2.2.3. Kultivierung von Lymphozyten
2.2.3.1. Isolierung von Lymphozyten aus der Milz
Die Wirkung, die verschiedene Zellarten auf die Proliferation von Lymphozyten haben, ließ
sich anhand eines Kulturversuches herausfinden. Die benötigten Lymphozyten wurden durch
Isolation aus Rattenmilzen gewonnen. Im ersten Schritt wurden die Milzen mit einem
Spritzenstempel durch ein steriles Netz (70µm, BD Biosciences, Heidelberg) gedrückt. Die so
filtrierten Zellen wurden nach dem Waschen in der Zentrifuge in 15ml PBS-Medium gelöst.
Zur Isolation der Lymphozyten aus dem Gemisch an unterschiedlichen Milzzellen wurde ein
Ficoll-Dichtegradient verwendet. Hierfür wurden 15ml des Ficoll-Mediums in ein 50ml
Zentrifugenröhrchen gegeben und die Zellsuspension vorsichtig mit einer Pipette darauf
geschichtet. Durch 25 minütige Zentrifugation mit 1800rpm bei 20°C wurden die Zellen ihrer
Dichte nach aufgetrennt. Erythrozyten und Granulozyten besitzen eine größere Dichte und
wanderten durch die Zentrifugalkraft getrieben weiter durch das Ficoll-Medium als
Lymphozyten. Diese besitzen eine geringere Dichte und setzten sich an der Phasengrenze des
Mediums ab. Diese Interphase wurde mit einer Stabpipette entnommen und in ein neues 50ml
Röhrchen gegeben, welches mit PBS aufgefüllt und anschließend für 7min zentrifugiert
wurde. Nach dem Absaugen des Überstandes wurde das verbleibende Pellet in einem
Milliliter PBS resuspendiert.
2.2.3.2. Markierung der Lymphozyten mit dem Proliferationsindikator CFSE
Zur Quantifizierung der Proliferation der Lymphozyten wurden diese mit CarboxyfluoresceinDiacetat-Succinimidyl-Ester (CFSE) markiert. Dieses ist ein vorerst farbloser Stoff, der passiv
ins Zytoplasma der Zellen diffundiert. Dort wurde das CFSE durch intrazelluläre Enzyme zu
einem fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt, der die Zellen nicht mehr verlassen konnte.
2. Material und Methoden
27
Bei jeder Zellteilung wurde ein Teil des Farbstoffes an die jeweilige Tochterzelle
weitergegeben. Durch Detektion der Fluoreszenzintensität jeder einzelnen Zelle ließen sich
bei einer durchflusszytometrischen Analyse Aussagen über die Anzahl der erfolgten
Zellteilungen machen. Je mehr Teilungen stattfanden, desto weniger Farbstoff verblieb in den
einzelnen Zellen. Folglich waren bei Zellkulturen mit einer starken Proliferationsrate später
viele Zellen mit einer schwachen CFSE Fluoreszenz zu erkennen (Lyons 2000).
+CFSE
Abb.10: Proliferationsindikator CFSE: Nach jeder Zellteilung halbierte sich die
Fluoreszenzintensität in den Zellen. Rechts: Histogramm-Plot einer
Lymphozytenkultur. Fluoreszenz 1 auf der Abszisse entspricht dem Spektrum von
CFSE. Die ungeteilten Zellen besaßen die größte Fluoreszenzintensität (Marker M1).
Jeder Teilungsschritt ist als Spitze im Diagramm erkennbar (Marker M2).
Zur Färbung mit CFSE wurden die Lymphozyten zu einer Suspension mit einer
Konzentration von 1x107 Zellen/ml mit PBS verdünnt. Pro Milliliter wurden anschließend 2µl
CFSE-Lösung gegeben. Die Inkubation erfolgte für 30min unter ständigem Schütteln im 37°C
warmen Wasserbad. Überschüssiges CFSE wurde durch Zugabe von 30ml DMEM Medium
mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gebunden. Nach siebenminütiger Zentrifugation wurde
der Überstand abgesaugt und das verbliebene Pellet mit Grundmedium zu einer Konzentration
von 2,5x106 Zellen pro ml verdünnt.
2.2.3.3. Beschichtung der Kulturplatten mit den stimulierenden Antikörpern
Um eine optimale Proliferation der Lymphozyten in vitro zu erreichen, benötigen diese ein
Wachstumssignal. T-Zellen besitzen an ihrer Oberfläche den als CD28 bezeichneten Rezeptor
für das costimulierende B7-Molekül der APC. Wird dieser Rezeptor zusammen mit dem als
CD3 bezeichneten T-Zell-Rezeptor stimuliert, so findet eine Proliferationsstimulation der TZelle statt (Gonzalo, Delaney et al. 2001). Im Kulturversuch wurde diese Stimulation durch
monoklonale Antikörper, die gegen CD3 sowie CD28 gerichtet waren, erreicht. Mit diesen
Antikörpern wurde die Kulturplatte vor dem Aufbringen der Lymphozytensuspension
2. Material und Methoden
28
beschichtet. Hierfür wurden in jede Vertiefung der 96-well Platte je 2µl der beiden Antikörper
zusammen mit 96µl PBS Medium gegeben. Eine Inkubation der Platte für drei Stunden bei
37°C bewirkte, dass die Antikörper sich am Plattenboden anlagerten.
2.2.3.4. Aufbringen der Lymphozytenzellsuspension auf die Kulturplatte
Vor dem Aufbringen der Zellsuspension in die Vertiefungen der Kulturplatte wurde das von
der Beschichtung mit den Antikörpern verbliebene PBS-Medium mit einer Pipette abgesaugt.
In jede Vertiefung wurden 5x105 Zellen in 200µl Grundmedium gegeben.
2.2.4. Isolation von Treg und CD4+CD25- Zellen
Zur Aufreinigung der Zellen konnte der exklusive Treg Marker FoxP3 nicht verwendet werden,
da eine Darstellung dieses intrazellulären Transkriptionsfaktors eine Lyse der Zellmembran
erfordert und daher bei vitalen Zellen nicht möglich ist. Die Identifizierung der T reg erfolgte
anhand der Oberflächenantigene CD4 und CD25. Die Kombination dieser beiden Marker ist
jedoch nicht spezifisch für Treg, da auch aktivierte CD4+ T-Zellen den als CD25 bezeichneten
Interleukin-2 Rezeptor exprimieren. Obwohl bisher noch kein spezifischer Marker zur
Definition der Treg beschrieben wurde, eignet sich für eine Zellsortierung die Verwendung
dieser beiden Oberflächenantigene am besten, um Treg anzureichern, zumal unbehandelte
Tiere verwendet wurden, die in fremdantigenfreier Umgebung aufwuchsen und kaum
aktivierte T-Helferzellen besaßen (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995; Shevach 2001; Fontenot
and Rudensky 2005).
Die Treg und die CD4+CD25- Zellen wurden mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters
aus einer Milzzellsuspension isoliert. Da die absolute Zellzahl der Zellen, die im Zellsorter
gemessen wurden, sehr kosten- und zeitaufwändig ist, wurde die Zellsuspension in mehreren
Schritten hinsichtlich CD4+ Lymphozyten aufkonzentriert. Hierfür wurden die Lymphozyten
aus der Milzzellsuspension zunächst durch einen Ficoll-Dichtegradienten aufgereinigt.
Anschließend wurde ein AlexaFluor647 (AF647) gekoppelter Antikörper aufgetragen, der
gegen das CD4 Antigen gerichtet war. Im nächsten Aufreinigungsschritt erfolgte die
Separation der CD4+ Zellen mit Hilfe eines Magnet-bead-arrays. Diese Methode beruht auf
einem monoklonalen Antikörper, der gegen den Farbstoff AF647 gerichtet und zudem mit
magnetischen Nanopartikeln versehen war. Durch einen Magneten können so die AF647
positiven von den AF647 negativen Zellen getrennt werden. Die so verbliebenen CD4+ Zellen
wurden anschließend mit einem Zellsortierer in CD25+ und CD25- Zellen aufgetrennt.
2. Material und Methoden
29
Abb.11: Die Grafik zeigt die Aufkonzentrierung von CD4+ Zellen aus einer
Milzzellsuspension. Links: Aus Rattenmilzen wird eine Einzelzellsuspension erstellt.
Mitte: Durch Ficoll-Dichtezentrifugation lagerten sich die Lymphozyten in der
Interphase des Röhrchens ab. Rechts: Die CD4+ Zellen wurden mit magnetischen
Antikörpern markiert. Dadurch wurden die CD4+ Zellen in einem Magnetfeld
zurückgehalten. Anschließend fand mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters
eine Auftrennung der verbliebenen Zellen in CD4+CD25- und CD4+CD25+ statt.
2.2.4.1. Isolation der CD4+ Zellen aus einer Milzlymphozytensuspension
Für die magnetische Selektion wurden die Zellen mit einem Selektionsmedium zu einer
Konzentration von 1x108 Zellen pro ml verdünnt und in ein FACS-Röhrchen gegeben.
Anschließend wurde ein AF647-gekoppelter monoklonaler Antikörper gegen CD4 in einer
Konzentration von 1µg/ml hinzugefügt und für 15min inkubiert. An diesen gekoppelten
Farbstoff band der im nächsten Schritt hinzugefügte AF647-Selektionscocktail, der in einer
Konzentration von 100µl/ml eingesetzt wurde. Mit dem freien Ende dieses Cocktails
verbanden sich die nach 15 minütiger Inkubation hinzugefügten magnetischen Nanopartikel.
Die eingesetzten 50µl/ml wurden durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipettenspitze gut mit
der Suspension vermischt und für 10min inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit
Separationsmedium zu einem Volumen von 2,5ml verdünnt und das Röhrchen für 5min in
den Magneten gebracht. Die Zellen mit den gebundenen magnetischen Nanopartikeln lagerten
sich am Rand des Röhrchens ab. Der Überstand wurde ausgeleert. Um eine höhere Reinheit
der selektionierten Zellen zu erreichen, wurde dieser Vorgang durch erneutes Auffüllen des
Röhrchens mit Selektionsmedium noch zweimal wiederholt.
2.2.4.2. Auftrennung der CD25+ und CD25- Zellen
Um die gewonnene CD4+ Zellen in CD25+ und CD25- Zellen auftrennen zu können, wurde
nach der Aufkonzentrierung eine Fluoreszenzmarkierung des Il-2 Rezeptors durchgeführt.
Hierfür wurde ein an den Farbstoff R-Phycoerythrin gekoppelter monoklonaler anti-CD25
Antikörper in einer Konzentration von 5µl pro 1x106 Zellen verwendet. Nach 30 minütiger
2. Material und Methoden
30
Inkubation bei 4°C in Dunkelheit wurden überschüssige Antikörper durch Zentrifugation mit
PBS entfernt. Das verbliebene Pellet wurde zu einer Konzentration von 2x107 Zellen/ml
verdünnt.
Die Zellsuspension wurde in einem fluoreszenzaktiverten Zellsorter (MoFlow, Cytomation,
Fort Collins, USA) unter Verwendung einer Software (FlowJo, Cytomation, Fortt Collins,
USA) weiter bearbeitet. Zunächst wurde hierbei in einem Density-Plot, in dem FSC gegen
SSC aufgetragen wurde, mit „R1“ der Bereich, in dem sich die Lymphozyten befinden,
definiert.
Abb.12: Aufgetragen ist das Seitwärts- gegen Vorwärtsstreulicht. Mit „R1“ wurde der
Bereich, in dem sich die zu sammelnden Lymphozyten befinden, definiert.
Im zweiten Schritt wurde in einem FSC-FSC Density-Plot Zelldubletten, die sich im mit „R2“
markierten Bereich befanden, vom Sortiervorgang ausgeschlossen.
2. Material und Methoden
31
Abb.13: Im Gate R2 befinden sich Zelldubletten, welche aus dem Sortierungsvorgang
ausgeschlossen wurden.
Zur eigentlichen Sortierung der Zellen wurde in einem Density-Plot die Fluoreszenz 4
(entspricht dem Farbstoff AF647) gegen die Fluoreszenz 3 (entspricht R-PE) aufgetragen.
Darin wurden mit dem Gate „R3“ die CD4+CD25- sowie mit „R4“ die CD4+CD25+ Zellen
definiert. Die Zellen aus „R3“bzw. „R4“ wurden bei der anschließenden Sortierung in zwei
getrennten FACS-Röhrchen, die mit jeweils mit einem Milliliter FKS-freiem Kulturmedium
gefüllt waren, gesammelt.
Abb.14: Im Schaubild ist Fluoreszenz 4 (entspricht CD4-AF647) gegen Fluoreszenz 3
(entspricht CD25-R-PE) aufgetragen. Gezeigt sind alle Zellen, die sich in R1 und
nicht in R2 befinden. In R3 definiert die CD4+CD25-, R4 die CD4+CD25+ Zellen, die
in zwei verschiedenen Röhrchen gesammelt werden.
2. Material und Methoden
32
2.2.5. Lymphozyten-Suppressionsassay mit Zugabe von Treg
Um
den
Einfluss
von
juvenilen
und
adulten
Treg
bzw.
CD4+CD25-
auf
die
Lymphozytenproliferation zu untersuchen, wurden verschiedene Zellkulturen angelegt.
Hierfür wurden die isolierten Zellen jeweils in bestimmten Konzentrationen zu CFSEmarkierten Lymphozyten in die Vertiefungen einer 96-well Kulturplatte gegeben. Diese
Lymphozyten wurden zuvor durch Ficoll-Dichtezentrifugation aus adulten Lewis-Milzen
gewonnen. Entsprechend dem Versuch wurden einige Vertiefungen der Kulturenplatte zuvor
mit den Antikörpern anti-CD3 und anti-CD28 beschichtet. In jedem Versuchsansatz wurden
insgesamt 1x105 Zellen in 200µl Grundmedium verwendet. Folgende Kombinationen wurden
inkubiert:
- Lymphozyten ohne anti CD3/CD28
- Lymphozyten mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : Treg im Verhältnis 9:1 mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : Treg im Verhältnis 3:1 mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : Treg im Verhältnis 1:1 mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : CD4+CD25- im Verhältnis 9:1 mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : CD4+CD25- im Verhältnis 3:1 mit anti CD3/CD28
- Lymphozyten : CD4+CD25- im Verhältnis 1:1 mit anti CD3/CD28
Es wurde jeweils ein Ansatz mit juvenilen und ein Ansatz mit adulten Treg bzw. CD4+CD25Zellen angesetzt. Die Inkubation der Kulturplatte erfolgte für 72h bei 37°C und 5% CO2.
Nach der Inkubation wurde der Inhalt aus jeder Vertiefung der Kulturplatte in ein FACSRöhrchen pipettiert und mit 300µl FACS-Puffer verdünnt und die CFSE-Fluoreszenzintensität
der einzelnen Zellen durchflusszytometrisch ermittelt. Mit jeder Zellteilung nahm die
Fluoreszenzintensität der Zellen ab. Die Lymphozyten, welche sich einfach oder mehrfach
geteilt hatten, wurden im Histogramm mit dem Marker „M2“ markiert. Die zugegebenen T reg
bzw. CD4+CD25- Zellen wurden nicht mit CFSE markiert. Sie erschienen im HistogrammPlot links von Marker „M2“. Es wurde ein Quotient aus den proliferierten Zellen und nicht
proliferierten Zellen erstellt. Dieser Quotient war umso höher, je mehr Proliferation in einem
Ansatz stattfand.
2. Material und Methoden
33
2.2.6. Die immunhistochemische Färbung
2.2.6.1. Prinzip der Immunhistochemie
Mit Hilfe der Immunhistochemie lassen sich in feingeweblichen Proben die einzelnen
Zellarten anhand ihrer unterschiedlichen Expression der Oberflächenantigene unterscheiden.
Die Methode basiert auf der unterschiedlichen Anfärbung dieser Antigene mit Hilfe
monoklonaler Antikörper, welche gegen bestimmte Zielstrukturen gerichtet sind. Dies
ermöglicht
eine
lichtmikroskopische
Differenzierung
der
Zellen.
Diese
direkte
Nachweismethode, bei der die Primärantikörper direkt mit einem Farbstoff verbunden sind,
liefert allerdings nur eine geringe Anfärbung der Zielzelle.
Um die Farbreaktion zu verstärken, wurde bei der indirekten Nachweismethode Antikörper
verwendet, die –in diesem Falle- aus Mäuseserum stammten und nicht mit einem Farbstoff
gekoppelt
wurden.
Der anschließend aufgetragene Sekundärantikörper wurde
aus
Kaninchenserum gewonnen, besaß die Spezifität „anti-Maus“ und band sich dadurch an den
Primärantikörper. Da mehrere Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden konnten,
diente die Verwendung von zwei Antikörpern der Signalverstärkung. An den Fc-Teil des
Sekundärantikörpers war wiederum der Enzymkofaktor Biotin gekoppelt, welcher eine hohe
Affinität zu Streptavidin besaß. Dieses Protein, welches an das Enzym Alkalische
Phosphatase (AP) gebunden war, wurde im nächsten Schritt hinzugegeben. Die AP
katalysierte die Reaktion eines farblosen Substrates in ein rotes Produkt, welches sich
lichtmikroskopisch gut erkennen ließ. Nach dieser Anfärbung der Zielzellen folgte im letzten
Schritt eine Gegenfärbung aller kernhaltigen Zellen mit dem Farbstoff Hämalaun, welcher die
basophilen DNA-haltigen Zellkerne blau färbte. Durch diese Kontrastierung ließen sich die
Zielzellen, die an ihrer Oberfläche rot gefärbt waren, von den ungefärbten Zellen
unterscheiden.
2. Material und Methoden
34
Abb.15: Das Schema zeigt das Prinzip der immunhistochemischen Färbung. Der
Erstantikörper bindet spezifisch an das Oberflächenantigen, der biotinylierte Zweitbindet an den Erstantikörper. Streptavidin, welches eine hohe Affinität zu Biotin
besitzt, ist mit dem Enzym alkalische Phosphatase gekoppelt, welche eine
Farbreaktion katalysiert.
2.2.6.2. Durchführung einer immunhistochemischen Färbung
Die histologische Aufarbeitung der Präparate erfolgte in einem Kryostat (Leica cm3050 s,
Leica Instruments GmbH, Nussloch). Bei einer Objektträgertemperatur von -11°C wurden die
Organe in 7µm dicke Scheiben geschnitten und auf silanisierte Objektträger gebracht. Zur
Fixation wurden die Objektträger für 10min in auf -20°C abgekühltes Azeton gelegt. Bis zur
weiteren Verwendung wurden die Schnitte nach dem Trocknen bei -20°C tiefgekühlt.
Vor der immunhistochemischen Anfärbung mussten die Schnitte für zwei Stunden bei
Raumtemperatur auftauen und trocknen. Anschließend wurden die Präparate mit einem
Fettstift umrandet, damit aufgebrachte Flüssigkeiten einen Tropfen über dem Präparat
bildeten. Zur Blockade unspezifischer Bindungen wurden die Objektträger nach dem
Trocknen für 30min in eine 50mM Tris Puffer Lösung (pH 7,6) gebracht, welche 10% fetales
Kälberserum (FKS) enthielt. Nach zweimaligem Waschen mit Pufferlösung (50mM TrisPuffer mit 1% FKS, pH 7,6) wurden je Schnitt 100µl des verdünnten Erstantikörpers
aufgetragen. Dabei wurden die Antikörper zu folgenden Konzentrationen mit Pufferlösung
verdünnt:
2. Material und Methoden
Antikörper gerichtet gegen
CD4
CD8
CD25
CD161
CD163
Ox62
35
Zielzelle
T-Helferzellen
Zytotoxische T-Zellen
Treg/aktivierte T+B-Zellen
Natürliche Killerzellen
Monozyten/Makrophagen
Dendritische Zellen
Konzentration
1:200
1:200
1:200
1:200
1:200
1:100
Von jedem zu untersuchenden Gewebe wurden jeweils mehrere Schnittpräparate angefertigt.
Jeder der sechs Antikörper wurde auf einem separaten Schnitt inkubiert, wobei die Inkubation
des Antikörpers für eine Stunde in einer abgedunkelten Feuchtkammer bei Zimmertemperatur
erfolgte. Nach dem anschließenden zweimaligen Waschen mit Pufferlösung wurden 100µl
des biotinylierten Zweitantikörpers (Kaninchen anti Maus, Verdünnung 1:300) aufgetragen,
ebenfalls für eine Stunde in der Feuchtkammer inkubiert und zweimal mit Pufferlösung
gewaschen. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von 100µl der streptavidingebundenen
Alkalischen Phosphatase (Verdünnung 1:200) und ein zweimaliges Waschen. Darauf folgend
wurden 100µl des Substrat-Vektor-Kits auf jeden Objektträger pipettiert. Zum Stoppen der
Farbreaktion wurden die Präparate nach 15min drei Mal mit Leitungswasser abgewaschen.
Zum Schluss wurde das Präparat mit Hämalaun gegengefärbt. Dafür wurden auf jeden Schnitt
für 2min 100µl Hämalaun aufgetragen. Nach fünfmaligem Waschen mit Leitungswasser
wurden die Schnitte mit einem Deckglas eingedeckelt.
2.2.6.3. Auswertung der immunhistochemischen Präparate
Bei jedem Färbevorgang wurden zur Überprüfung der richtigen Anfärbung neben den
Hornhautpräparaten auch Kontrollschnitte aus einer Milz angefärbt. Dabei wurde eine
Positivkontrolle durchgeführt, die entsprechend den Hornhautpräparaten behandelt wurde.
Hiermit sollte nachgewiesen werden, dass die Färbung mit dem jeweiligen Antikörper die
Immunzellen spezifisch anfärbt. Mit der Negativkontrolle, in der kein Erstantikörper
verwendet wurde, konnte gezeigt werden, dass keine Zellen durch den Färbevorgang
unspezifisch angefärbt wurden.
2. Material und Methoden
36
Abb.16: Die Fotos zeigen Milzkontrollschnitte in der 20-fachen Vergrößerung. Links ist die
Negativkontrolle, rechts die Positivkontrolle mit dem Anti-CD163-Antikörper,
wodurch Monozyten/Makrophagen wurden rot dargestellt werden.
Nach dem Färbevorgang wurden die Präparate unter dem Lichtmikroskop (Olympus BH-2,
Olympus GmbH, Hamburg) betrachtet. Mit Hilfe einer angeschlossenen Digitalkamera
(ProgRes CF, Jenoptik, Jena) wurden von jedem Präparat Fotos mit dem zehn- und
zwanzigfach vergrößernden Okular erstellt. Die Auszählung aller Zellkerne der rot
angefärbten Zellen erfolgte mit der Software PictureCount (open source). Vom jedem Schnitt
wurden jeweils drei zufällig ausgewählte 0,01mm2 Quadrate ausgezählt. Anschließend
wurden drei weitere Quadrate von einer anderen Person ausgezählt und der Mittelwert der
Ergebnisse gebildet.
Zur Ermittlung der absoluten Zellzahl der Infiltrate wurde von jedem Transplantat ein
histologischer Schnitt mit einer Hämalaun-Eosinfärbung (HE) angefertigt. Diese Methode
basiert auf zwei Farbstoffen und färbt alle Zellen eines Präparates an. Hämalaun lässt alle
basophilen Substanzen wie den Zellkern blau erscheinen, Eosin färbt alle eosinophilen
Strukturen wie das Zytoplasma rot. Die HE-Präparate wurden ebenfalls unter dem Mikroskop
fotografiert und die Dichte der Zellen ermittelt.
2.2.7. Die Fluoreszenzmikroskopie
Zur Darstellung der Zellen aus dem Rattenstamm Lewis green fluorescent proteine (gfp)
wurde das Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie angewandt. Dabei wurde mit einer
Quecksilberdampflampe ein Licht einer großen Wellenlänge erzeugt. Dieses wurde durch
einen optischen Filter geleitet, der nur für die Wellenlänge, die den Farbstoff gfp zur
Fluoreszenz anregt, durchlässig war. Das so gefilterte Licht traf von unten auf das Präparat im
Mikroskop. Die auf diese Weise angeregten gfp+-Zellen konnten so deutlich von nicht
fluoreszierenden Zellen unterschieden werden.
2. Material und Methoden
37
Um Stelle des Präparates ausfindig zu machen, in der sich die zu untersuchende Struktur
befindet, wurde der Schnitt zunächst lichtmikroskopisch betrachtet. Anschließend wurde das
Licht ausgeschaltet und nach dem Einschalten der Fluoreszenzlampe Fotos erstellt.
Abb.17: Die Bilder zeigen die histologischen Schnitte eines Transplantates. Links die
lichtmikroskopische, rechts die fluoreszenzmikroskopische Darstellung in der 20fachen Vergrößerung.
2.2.8. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
2.2.8.1. Prinzip der Polymerasen-Kettenreaktion
Die menschliche Erbinformation ist in der DNA als Abfolge von vier verschiedenen
Nukleotiden in einem Strang codiert. Zu jedem dieser Einzelstränge existiert ein weiterer
Strang mit der komplementären Nukleotidsequenz. Beide Stränge sind zu einem Doppelstrang
miteinander verbunden. Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, pcr) ist
ein Verfahren, mit dem sich DNA vervielfältigen lässt. Die Verwendung von Primern
ermöglicht es, nur bestimmte Abschnitte der DNA zu vervielfältigen.
Das Prinzip der PCR beruht auf einer vielfachen Wiederholung von drei Einzelschritten.
1. Im ersten Schritt werden die DNA-Doppelstränge thermisch in zwei Einzelstränge
aufgespalten (Denaturierung). Jeder dieser Einzelstränge dient anschließend als Matrize für
die Synthese eines neuen Stranges.
2. Im zweiten Schritt lagern sich die Primer an die gesuchte zu ihnen komplementäre
Nukleinsäuresequenz an (Annealing).
3. Im dritten Schritt verlängern die DNA-Polymerasen beginnend an den Primern den neuen
DNA-Strang komplementär zur Matrize (Elongation).
Unter optimalen Reaktionsbedingungen hat sich nach jedem Durchlaufen dieses Zyklus sich
die gesuchte DNA verdoppelt.
2.2.8.2. Primerdesign und Zielgen
Damit während der Replikationsschritte der PCR ausschließlich die gewünschte Ziel-DNA
amplifiziert wird, müssen die Primer so konstruiert werden, dass sie sich an Strukturen
2. Material und Methoden
38
binden, die für das Zielgen spezifisch sind. Da die DNA aus zwei komplementären Strängen
besteht, müssen für jeden zu amplifizierenden Genabschnitt ein forward und ein reverse
Primer eingesetzt werden. Ein Primer besteht aus einer synthetisch hergestellten Abfolge aus
18-22 Nukleotiden, welche die komplementäre Struktur der Bindungsstellen am DNA
Einzelstrang repräsentieren. Die Basenabfolge des FoxP3 Gens war bekannt, so dass hierzu
mit Hilfe einer Software (Primer3, open source) passende Primer entworfen und in einem
externen Labor hergestellt werden konnten (Metabion, Martinsried). Zudem wurden Primer
eingesetzt, die sich an das Housekeeping Gen anlagerten (Primerdesign und Zielgen: siehe
Anhang).
2.2.8.3. Die quantitative Echtzeit-PCR
Die klassische PCR ist eine qualitative Methode. Sie erlaubt lediglich die Aussage, ob ein
gesuchter Genabschnitt in einer Probe vorhanden ist und somit amplifiziert wird, oder nicht.
Die quantitative-Echtzeit-PCR ist eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens und ermöglicht
zusätzlich eine Quantifizierung der replizierten DNA. Das Prinzip diese Methode beruht auf
der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, welche sich an doppelsträngige DNA binden
(interkalieren). Der Cyanfarbstoff SYBR®-Green emittiert Licht der Wellenlänge 530nm,
sobald er mit doppelsträngiger DNA interkaliert und mit kurzwelligem UV-Licht angeregt
wird. Nach jedem Replikationszyklus erfolgt die Detektion der Fluoreszenz der Wellenlänge
530nm. Der Replikationszyklus, bei dem die Fluoreszenzintensität erstmals messbar über die
Hintergrundfluoreszenz ansteigt, wird als Ct-Wert (threshold cycle) bezeichnet. Je mehr
Kopien der gesuchten DNA ursprünglich vorhanden waren, desto niedriger ist der Ct-Wert.
Diese Methode beinhaltet jedoch eine gewisse Ungenauigkeit, da in der Probe neben der
amplifizerten DNA noch weitere doppelsträngige DNA wie zum Beispiel Primer-Dimere
enthalten sind, an die sich SYBR®-Green bindet. Um diese Ungenauigkeit auszugleichen,
muss
im Anschluss an die quantitative-Echtzeit-PCR eine Schmelzkurvenanalyse
durchgeführt werden. Während einer schrittweisen Temperaturerhöhung wurde die SYBR®Green Fluoreszenz gemessen. Je höher die Temperatur stieg, desto mehr DNA-Doppelstränge
zerfielen in die beiden Einzelstränge. Hierbei wurde der gebundene Farbstoff frei und
Emission des Fluoreszenzfarbstoffes nahm dadurch ab. In der durchgeführten PCR entstanden
mehrere Fluoreszenzpeaks: ein Peak bei niedriger Schmelztemperatur, welcher mit
unspezifischen Primerdimeren korreliert. Der zweite Peak entsprach dem Schmelzpunkt der
amplifizierten FoxP3-DNA. Ein weiterer Peak korrelierte mit dem Zerfall des Doppelstranges
2. Material und Methoden
39
des Housekeeping-Gens. Im Vergleich zu einer mitgeführten Probe lieferte die Höhe des
Schmelzpunktes einen Hinweis auf die Anzahl an gebildeten Amplifikaten.
Die Schmelzkurvenanalyse diente außerdem der Überwachung des Versuches auf
unspezifische DNA Verunreinigungen, welche zusätzliche Fluoreszenzpeaks erzeugt hätten.
2.2.8.4. Normalisierung der Expressionsergebnisse
Um die Menge der Ziel-DNA in zwei verschiedenen Proben miteinander vergleichen zu
können, musste berücksichtigt werden, dass die Gesamt-DNA-Menge zweier Proben variieren
kann. Daher wurde die Expression des gesuchten Genes in Relation zu einem sogenannten
„Housekeeping Gen“ gesetzt. Dieses Kontrollgen wird in jeder Zelle etwa gleich exprimiert
und ist keiner Regulation unterstellt. Üblicherweise wird hierfür das Gen für den
Muskelbestandteil Aktin verwendet. Die Ct-Werte des gesuchten Genes der zu
vergleichenden Proben wurden ins Verhältnis zu den Ct-Werten der Housekeeping Gene
gesetzt. Für diese sogenannte Normalisierung der Expressionsergebnisse wurde die Software
REST 384 beta (Version vom 9.8.06, open source) verwendet.
2.2.8.5. Durchführung der quantitativen Echtzeit-PCR
Mit Hilfe der Polymerasen-Kettenreaktion wurde die Expression des Transkriptionsfaktors
FoxP3 in verschieden Zellen verglichen. Bei der Expression eines Genes wird in der Zelle aus
der DNA eine RNA Kopie erstellt. Da die bei der PCR eingesetzten Polymerasen lediglich
dazu in der Lage sind, DNA zu amplifizieren, muss zur Messung der Genexpression einer
Zelle die RNA des transkribierten Genes mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase in DNA
umgewandelt werden. Diese zur RNA komplementäre DNA wird cDNA (complementary
DNA) genannt.
2.2.8.6. Isolierung der RNA
Die untersuchten Zellen stammten aus Lewis Ratten und wurden durch Dichtezentrifugation
mit konsekutiver fluoreszenzaktivierter Zellsortierung aus Milzen gewonnen.
Zur Isolierung der RNA wurde das „High Pure RNA Isolation Kit“ (Roche Applied Science,
Mannheim) verwendet. Das Prinzip dieser Aufreinigungsmethode beruht zunächst auf einer
Zerstörung der Zellmembranen durch einen Lysepuffer. Anschließend wurden die
freigesetzten Nukleinsäuren, welche in DNA und RNA enthalten sind, an die Oberfläche
eines Glasfaservlieses gebunden. Diese Bindungsreaktion wurde durch Zugabe eines Salzes,
welches bestehende Wasserstoffbrücken zerstört, begünstigt. Die gebundene DNA wurde
2. Material und Methoden
40
durch Zugabe eines DNA verdauenden Enzyms zersetzt, so dass ausschließlich RNA an den
Glasfasern verblieb.
Entsprechend der Gebrauchsinformation des Isolations-Kits wurden von jeder Zellprobe
jeweils 1x104 Zellen mit 200µl PBS in einem Eppendorfgefäß resuspendiert und anschließend
mit 400µl Lysepuffer vermischt. Anschließend wurde der Ansatz in ein Filtrationsgefäß
pipettiert und für 15 Sekunden mit 10000rpm zentrifugiert. Nach dem Abpipettieren des
Filtrates wurden in jede Probe 90µl DNase-Inkubationspuffer sowie 10µl DNase
hinzugegeben und für 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgten zwei
Waschschritte. Im ersten Schritt wurden 500µl Waschpuffer I, im zweiten Schritt 500µl
Waschpuffer II hinzugefügt und für jeweils 15 Sekunden bei 10000rpm abzentrifugiert. Nach
dem Abgießend des Filtrates wurden erneut 200µl Waschpuffer II auf jede Probe pipettiert.
Durch zweiminütige Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurden die Reste des
Waschpuffers entfernt. Zum Lösen der RNA wurden 100µl Elutionspuffer in jedes
Filtrationsgefäß gegeben und für eine Minute bei 10000rpm zentrifugiert. Anschließend
erfolgte die photometrische Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA. Diese konnte bis
zur weiteren Verwendung bei -80°C tiefgekühlt werden.
2.2.8.7. Die reverse Transkription
Zur Umwandlung von RNA in cDNA wurde die reverse Transkriptase „Superscript II“
(Invitrogen, Mannheim) verwendet. Für die Reaktion wurden zunächst 2µg RNA mit 10µl
Nukleotidmix (dTNP), 1µl Primern sowie 24µl RNase-freiem Wasser gegeben. Zur
Denaturierung der RNA wurde der Ansatz zunächst für 5min bei 70°C inkubiert und
anschließend sofort auf Eis abgekühlt. Nach kurzer Zentrifugation wurde 1µl der reversen
Transkriptase (Superscript II) in einer Konzentration von 200U/µl hinzugegeben. Um ein
optimales Milieu für die Reaktion zu erreichen, wurden neben 4µl DTT auch 8µl Single
Strand Buffer hinzugegeben. Diese Puffergemisch besteht aus 250mM Tris/HCL Puffer (pH
8,3), 375 mM KCl sowie 15mM MgCl2. Die reverse Transkription fand für 50min bei 42°C
statt. Zum Beenden der Reaktion wurde die Temperatur für 15min auf 70°C erhöht und
anschließend für 2min auf 4°C abgekühlt.
2.2.8.8. Amplifikation der cDNA durch quantitative Echtzeit-PCR
Bei jeder Versuchsdurchführung wurden neben den zu untersuchenden Proben eine
Negativkontrolle, welcher keine DNA zugesetzt wurde sowie eine Positivkontrolle
durchgeführt. Letztere enthielt aus Milzzellen isolierte DNA; welche das FoxP3 Gen enthielt.
2. Material und Methoden
41
Jeder Probenansatz wurde in ein separates Eppendorfgefäß pipettiert. Neben 20ng DNA, die
in 2µl gelöst waren enthielten die Ansätze die Bestandteile des SYBR®-Green I qPCR Core
Kits (Eurogentec, Belgien). Dies waren 2,5µl PCR Puffer, 1µl 50mM MgCl2, 1µl NukleotidMix (dTNP), 0,75µl 1:2000 mit DMSO verdünnte SYBR®-Green-Lösung, sowie 0,12µl
HotStarTaq Polymerase mit der Konzentration 5U/µl. Außerdem wurden jeweils 5pmol der
beiden Primer in einem Mikroliter hinzugegeben. Anschließend wurde das Gemisch mit
15,63µl Wasser zu einem Volumen von 25µl aufgefüllt. Es wurden jeweils 40
Amplifikationsschritte in einem Thermocycler (Bio-Rad, München) durchgeführt. Die initiale
Denaturierung der DNA-Doppelstränge fand für 10min bei 95°C statt. Die anschließenden
Zyklen liefen nach folgendem Schema ab: Denaturierung für 30 Sekunden bei 94°C,
Annealing für 30 Sekunden bei 56°C und dann für weitere 30 Sekunden bei 72°C, Elongation
für 5 Sekunden bei 84°C mit anschließender Messung der SYBR®-Green Fluoreszenz bei
520nm Wellenlänge. Nach Ablauf der 40 Zyklen wurde die Temperatur auf 25°C gehalten.
Im Anschluss an die Amplifikation fand eine Schmelzkurvenanalyse statt, welche der
Überwachung des Versuches auf eventuelle Verunreinigungen diente.
2.2.8.9. Auswertung der Messergebnisse
Nach der Schmelzkurvenanalyse fand die Auswertung der Messergebnisse statt. Dabei
wurden die eingesetzten Proben auf eine unterschiedliche Expression des FoxP3 Genes
untersucht. Der Vergleich fand nach Normalisierung auf das Housekeeping Gen Aktin mit
Hilfe der Software REST 384 statt. Von jeder zu untersuchenden Population wurden die CtWerte dreier Proben gemittelt.
2.2.9. Narkotisierung der Tiere
Die kurzzeitige Narkotisierung der Ratten geschah durch Inhalation des volatilen
Anästhetikums Isofluoran. Zur längerfristigen Narkose erfolgte im Abschluss an die
Gasinhalation eine intraperitoneale Mischinjektion von 60mg/kg Ketaminhydrochlorid,
4mg/kg Xylazinhydrochlorid und 0,2 mg/kg Atropinsulfat. Diese Injektion bewirkte eine etwa
eineinhalbstündige Analgosedierung.
2.2.10. Durchführung der Keratoplastik bei Ratten
Die penetrierende Keratoplastik wurden nach der Technik von Herbort et al durchgeführt
(Herbort, Matsubara et al. 1989). Im verwendeten Modell von Mayer et al (Mayer, Reinhard
2. Material und Methoden
42
et al. 2003) stammten die Transplantate aus adulten Tieren, von denen jeweils beide
Hornhäute verwendet wurden. In den allogenen Gruppen waren diese Spendertiere vom
Fisher, in der syngenen Gruppe vom Lewis Stamm. Als Transplantatempfänger wurden
juvenile Lewis Ratten verwendet. Entsprechend der oben genannten Richtlinien wurde jedem
Tier stets nur ein Transplantat eingenäht.
Präoperativ wurden alle Tiere auf ihren Gesundheitszustand sowie auf eventuelle
Augenanomalien untersucht. Zur Vermeidung von perioperativen Synechien oder Irisschäden
wurden vor der Operation drei Mal im Abstand von 10min die Mydriatika Tropicamid und
Phenylephrinhydrochlorid als Augentropfen appliziert. Die intraperitoneale Narkose wurde
wie oben beschrieben eingeleitet. Um einen Kontakt von Barthaaren mit dem
Operationsgebiet zu vermeiden, wurden diese präoperativ entfernt. Zur Operation und zur
Transplantatentnahme wurden die Tiere in einer lateralen Position unter einem
ophthalmologischen
Operationsmikroskop
(Zeiss,
Jena)
fixiert.
Den
narkotisierten
Spendertieren wurden mit Hilfe eines 2,5mm Trepans beide Hornhäute entnommen und bis
zur Implantation in einer Petrischale mit Konservierungsmedium (Biochrom AG, Berlin) bei
Raumtemperatur aufbewahrt. Anschließend wurden die Tiere durch CO2-Inhalation getötet.
Das nicht operierte Auge der Empfängertiere wurde mit Augensalbe (Roche, Schweiz)
behandelt um aufgrund des narkosebedingten Fehlens der Schutzreflexe ein Austrocknen der
Hornhaut zu verhindern. Auf der Kornea des zu operierenden Auges wurde mit einem 2,0mm
Trepan der zu entfernende Teil markiert. Nach dem Einstechen mit einer Kanüle wurde der
markierte Teil mit einer Rundschere ausgeschnitten. Das Transplantat wurde mit einem
nichtresorbierbaren Faden der Stärke 11-0 (Ethicon, Norderstedt) mit acht Einzelknüpfnähten
eingenäht. Intraoperativ wurde zur Vermeidung von Synechien die Vorderkammer durch
Injektion des Viskoelastikums Healon (Abbott, Wiesbaden) mit einer Spritzampulle gestellt.
Nach
der
letzten
Naht
wurde
das
Healon
durch
Spülen
mit
einer
isotonen
Natriumchloridlösung (Braun, Melsungen) aus der Vorderkammer entfernt. Die Dichtigkeit
des Transplantates wurde durch Injektion von Luft in die Vorderkammer überprüft. Zur
antibiotischen Prophylaxe wurde eine Gentamicinsalbe (Refobacin, Merck, Darmstadt)
aufgetragen. Anschließend wurde zum Schutze des Transplantates eine Blepharorrhaphie mit
einem Faden der Stärke 6-0 (Ethicon, Norderstedt) durchgeführt. Diese Naht wurde am dritten
postoperativen Tag entfernt.
2. Material und Methoden
43
Abb.18: Ablauf einer Keratoplastik. A) Das Tier wurde in einer lateralen Position unter dem
Operationsmikroskop gelagert. B) Das Transplantat des Spenders bzw. der Teil der
Kornea, auf dem das Transplantat beim Empfänger eingenäht werden sollte, wurde
durch Trepanation gekennzeichnet. C) Die Hornhaut wurde mit einer Kanüle
durchstochen. D) Während der Operation wurde die Vorderkammer durch Injektion
eines Viskoelastikums gestellt. E) Die Hornhaut wurde entlang der Trepanationslinie
mit einer Rundschere ausgeschnitten. E) Das Transplantat wurde mit acht
Einzelknüpfnähten eingenäht. G) Nach dem Einnähen des Transplantates wurde das
Viskoelastikum durch Injektion von isotoner Natriumchloridlösung in die
Vorderkammer entfernt. Durch Luftinjektion wurde das Transplantat auf Dichtigkeit
überprüft. H) Nach dem Auftragen einer antibiotischen Salbe wurde eine
Blepharorrhaphie durchgeführt und die Fäden für drei Tage belassen.
2. Material und Methoden
44
2.2.10.1. Syngene und allogene Transplantation
Die Keratoplastiken wurden stets zwischen adulten Tieren, welche als Spender dienten und
juvenilen Empfängertieren vom Lewis Stamm durchgeführt. In der syngenen Gruppe
stammten die Transplantate ebenfalls von Lewis Tieren, in den allogenen Gruppen wurden
Fisher-Hornhäute verwendet. Die unbehandelten syngenen und allogenen Vergleichsgruppen
wurden in Vorarbeiten von Dr. Johannes Schwartzkopff und Moritz Berger durchgeführt.
Abb.19: Die Schaubilder zeigen eine systematische Darstellung der verschiedenen
transplantierten Gruppen. Es wurden jeweils Hornhaute adulter Spendertiere in
juvenile Empfängertiere transplantiert. Links oben: Allogene Transplantation. Rechts
oben: Syngene Transplantation. Links unten: Allogene Transplantation mit
systemischer Applikation von Zellen. Rechts Unten: Allogene Transplantation mit
lokaler Applikation von Zellen.
2.2.10.2. Klinische Evaluation der Transplantate
Die Transplantate wurden nach dem Öffnen der Lidnähte am dritten postoperativen Tag
täglich unter dem ophthalmologischen Mikroskop untersucht. Hierfür wurden die Tiere
kurzzeitig durch eine Isofluoraninhalation narkotisiert. Die Transplantate wurden von zwei
Begutachtern nach folgendem international verwendeten Schema evaluiert (Claerhout,
Kestelyn et al. 2004; Birnbaum, Schwartzkopff et al. 2007):
2. Material und Methoden
45
Opazität
Ödem
0= keine Opazität
0= kein Ödem
1= leicht Opazität; Irisdetails 1= mildes Ödem
klar sichtbar
Neovaskularisation
0= keine Gefäße
1= Gefäße in der Peripherie
bis
maximal
zum
Transplantatrand
2= mittlere Opazität;
2= starkes Ödem mit leicht 2= Gefäße im Transplantat
einige Irisdetails nicht mehr erhöhtem Transplantat
sichtbar
3= starke Opazität; Pupille 3= massives Ödem mit 3=
Gefäße
erreichen
kann noch erkannt werden
deutlich
erhöhtem Transplantatmitte
Transplantat
4= totale Opazität
Die Bewertung der Opazität stellte den wichtigsten Parameter dar. Bei einem Opazitätsgrad
von vier galt ein Transplantat als abgestoßen.
2.2.11. Systemische Therapie mit Treg im Babyrattenmodell
Für die systemische Zelltherapie im Rahmen der Keratoplastik wurden die Treg unmittelbar
vor der Transplantation intravenös injiziert. Um eine venöse Dilatation zu erreichen, wurden
die Tiere 10min vor der Injektion unter eine Infrarot-Wärmelampe gebracht. Anschließend
wurden die Ratten kurzzeitig mit Isofluoran betäubt. Mit einer pädiatrischen Verweilkanüle
(BD Biosciences, Heidelberg) wurde ein venöser Zugang in die laterale Schwanzvene gelegt.
Der korrekte Sitz der Kanüle wurde durch Aspiration von Blut überprüft. Es erfolgte die
Injektion von 1x107 Treg in 100µl PBS. Anschließend wurde die Verweilkanüle wieder
entfernt und die Blutung durch Druck mit einem Tupfer auf die Injektionsstelle gestillt.
2.2.12. Subkonjunktivale Injektion von Zellen im Babyrattenmodell
Die subkonjunktivale Applikation von Zellen erfolgte direkt im Anschluss an die
Transplantation, noch bevor die Augenlider durch einen Faden verschlossen wurden. Die
Tiere waren zu diesem Zeitpunkt noch durch die intraperitoneale Operationsnarkose sediert.
Unter dem Lichtmikroskop wurden jeweils 1x105 Zellen mit einer Kanüle subkonjunktival
injiziert. Hierbei waren die Zellen zunächst in 100µl, in späteren Operationsserien in 30µl
PBS gelöst.
2. Material und Methoden
46
2.2.13. Die Entnahme der Organe
Zur Entnahme von Organen, wurden die Tiere wurden durch Einleitung von CO2 getötet.
Nach Sicherstellung des Todes und dem Strecken des Genicks wurden die Organe mit einer
Schere entnommen und in eine Plastikschale mit flüssigem OCT-Medium eingebettet. Zur
späteren Orientierung wurde bei entnommen Augen die Position der Hornhaut mit einem
Filzstift auf der Plastikschale markiert. Anschließend wurde die Schale in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Bis zur weiteren Verarbeitung wurde der gefrorene Block bei -20°C gelagert.
2.2.14. Darstellung und statistische Auswertung der Messergebnisse
Aus den unabhängigen Messungen mit der Anzahl n, wurde der Mittelwert sowie die
Standartabweichung errechnet. Die Darstellung erfolgte als Mittelwert ± Standartabweichung,
sowie grafisch. Die Überprüfung auf Varianzhomogenität erfolgte mit dem Levene-Test. Die
Überprüfung auf Mittelwertgleichheit erfolgte mit dem T-Test für unabhängige Stichproben,
wobei die Mittelwerte bei einem Signifikanzniveau von p<0,05 als signifikant verschieden
galten.
Das Überleben der Transplantate wurde im Vergleich zu einer unbehandelten syngenen sowie
einer unbehandelten allogenen Kontrollgruppe mit Hilfe der Kaplan-Meier-Methode
analysiert.
3. Ergebnisse
47
3. Ergebnisse
3.1. Quantifizierung von T-Helferzellen und Treg in juvenilen und adulten
Ratten
Um Unterschiede des Anteils von T-Helferzellen und Treg am Lymphozytenpool juveniler und
adulter Ratten darzustellen, wurden Lymphozytensuspensionen drei und zehn Wochen alter
Ratten durchflusszytometrisch analysiert. Dazu wurden die Oberflächenantigene CD4, CD25
sowie der Transkriptionsfaktor FoxP3 aus den Milzen jeweils dreier Tiere analysiert.
Abb.20: Das SSC/FSC Diagramm zeigt eine repräsentative Darstellung der
Milzzellsuspension einer Ratte. Der Bereich der untersuchten Lymphozyten wurde
mit „R1“ markiert.
Abb.21: Die Density-Plots zeigen eine beispielhafte Darstellung der Milzlymphozyten aus
R1. Aufgetragen wurde die Fluoreszenz 1 (entspricht CD4) gegen Fluoreszenz 4
(entspricht FoxP3). Links: adultes Tier. Rechts: juveniles Tier. Für jede Altersklasse
wurden auf diese Weise drei Tiere untersucht.
3. Ergebnisse
48
3.1.1. Der Anteil der T-Helferzellanteil an den Lymphozyten nimmt mit dem Alter
signifikant zu
Bei den dreiwöchigen Tieren betrug der Anteil der T-Helferzellen an den Lymphozyten
30,88% ± 0,89%, wohingegen er bei den zehnwöchigen Tieren bei 39,99% ± 0,67% lag.
Der Anteil der T-Helferzellen an den Lymphozyten war bei adulten Tieren signifikant höher,
als bei juvenilen Tieren (p=0,00).
Abb.22: Das Diagramm zeigt den Anteil der T-Helferzellen an den Milzlymphozyten bei dreiund zehnwöchigen Tieren. Er lag bei adulten signifikant höher als bei juvenilen
Tieren. (p<0,01)
3.1.2. Der Anteil der Treg an den Lymphozyten nimmt mit dem Alter signifikant zu
Bei den dreiwöchigen Tieren lag der Anteil der FoxP3+ Lymphozyten bei 1,25%±0,09%.
Dieser Anteil erhöhte sich auf 2,81%±0,29% bei zehnwöchigen Ratten. Der Anteil der Treg bei
adulten Tieren lag signifikant höher als bei juvenilen Tieren (p=0,001).
3. Ergebnisse
49
Abb.23: Das Diagramm zeigt den altersabhängigen Anteil der Treg an den Milzlymphozyten.
Er lag bei adulten Tieren signifikant höher, als bei juvenilen Tieren. (p<0,01)
3.1.3. Das Verhältnis von Treg zu T-Helferzellen nimmt mit dem Alter signifikant zu
Es wurde untersucht, ob sich das Verhältnis von T-Helferzellen und Treg mit dem Alter ändert.
Während bei juvenilen Tieren der Anteil der FoxP3+ Zellen an den CD4+ Zellen
4,03%±0,20% betrug, stieg dieser Anteil bei adulten Tieren signifikant auf 7,02%±0,67% an
(p=0,002).
Abb.24: Der Anteil der FoxP3+ Zellen an den CD4+ Zellen lag bei adulten Tieren signifikant
höher, als bei juvenilen Tiere.
3. Ergebnisse
50
3.2. Funktion von juvenilen und adulten Treg
3.2.1. Quantifizierung der Lymphozytenproliferation
Zur Untersuchung der inhibitorischen Potenz, welche die Treg auf die Lymphozyten ausüben,
wurde ein Kulturversuch etabliert. Als Maß für die Inhibition wurde die Fähigkeit der Treg, die
Proliferation von wachstumsstimulierten Lymphozyten zu hemmen, quantifiziert. Dies
ermöglichte einen Vergleich der inhibitorischen Potenzen von juvenilen und adulten Treg.
Nach dreitägiger Inkubation wurde durchflusszytometrisch die Intensität des verwendeten
Proliferationsmarkers CFSE bestimmt und in einem Histogramm-Plot dargestellt. Geteilte
Zellen besaßen eine niedrige CFSE-Intensität. Sie wurden im Histogramm-Plot mit dem
Marker M2 markiert. Der Kulturversuch wurde je vier Mal durchgeführt.
M2= 1,74%
M2= 68,09%
Abb.25: Das Histogramm-Plot zeigt beispielhaft die CFSE Fluoreszenzintensität einer
markierten
Lymphozytenkultur
nach
dreitägiger
Inkubation.
Links:
Lymphozytenkultur ohne proliferationsstimulierende Antikörper. M1 markiert die
nicht
proliferierten
Zellen.
Rechts:
Lymphozytenkultur
mit
proliferationsstimulierenden Antikörpern. M2 markiert die proliferierten Zellen,
welche eine schwächere Fluoreszenzintensität für CFSE besitzen. Zellen, die keine
CFSE-Fluoreszenz besitzen, befinden sich im Diagramm links von M2.
3. Ergebnisse
51
Durch die Zugabe der wachstumsstimulierenden Antikörper konnte im Vergleich zur
unstimulierten Kultur eine deutliche Zunahme der Proliferation erreicht werden.
Abb.26: Das Diagramm zeigt den Quotienten aus geteilten/ungeteilten Zellen nach dreitägiger
Inkubation
von
Lymphozytenkulturen
mit
und
ohne
Zugabe
proliferationsstimulierender Antikörper.
3.2.2. Isolierte Treg hemmen in vitro die Proliferation von Lymphozyten
Durch Zugabe von Treg verringerte sich das Lymphozytenwachstum signifikant (p=0,00). Der
Quotient aus geteilten/ungeteilten Zellen betrug bei der reinen Lymphozytenkultur im Mittel
2,12 ± 0,74, wohingegen der Quotient bei Treg Zugabe 0,66 ± 0,34 betrug.
M2=68,09%
M2= 17,97%
Abb.27: Die Schaubilder zeigen die CFSE-Fluoreszenz der Kulturen nach dreitägiger
Inkubation. Links unverdünnte Lymphozyten, rechts Lymphozyten 1:1 mit Treg
verdünnt. Die zugegebenen Treg wurden nicht CFSE markiert und erscheinen im
Histogramm links von M2.
3. Ergebnisse
52
Abb.28: Die Abbildung zeigt den Quotienten aus geteilten/ungeteilten Zellen von
proliferationsstimulierte Lymphozytenkulturen. Links ohne und rechts mit Zugabe
von Treg. Es wurden jeweils mehrere Versuchsansätze durchgeführt, wobei die Treg in
den Verhältnissen 1:9, 1:3 und 1:1 aus juvenilen und adulten zugegeben wurden
(p<0,01).
3.2.3. Die inhibitorische Potenz der Treg ist konzentrationsabhängig
Der Inhibitionsassay wurde mit verschiedenen Verhältnissen von Treg zu Lymphozyten
durchgeführt. Je höher dabei der Anteil der Treg lag, desto stärker wurde die
Lymphozytenproliferation gehemmt. Während bei einem Verhältnis der Lymphozyten zu Treg
von 9:1 der Mittelwert des Quotienten aus geteilten/ungeteilten Zellen bei 0,91 ± 0,39 lag, so
fiel er bei einem Verhältnis von 3:1 auf 0,68 ± 0,21. Bei dem Versuch mit der höchsten
Konzentration an Treg lag der Quotient mit 0,39 ± 0,21 am niedrigsten.
Abb.29: Das Diagramm zeigt den Quotienten aus geteilten/ungeteilten Zellen. Links:
proliferationsstimulierte Lymphozytenkultur ohne Zugabe von Treg. Rechts:
Verdünnung der Lymphozyten mit adulten und juvenilen Treg in den Verhältnissen
1:1, 3:1 sowie 9:1.
3. Ergebnisse
53
Die konzentrationsabhängige Steigerung der inhibitorischen Potenz ist bei einem p-Wert von
0,055 nicht signifikant.
Abb.30: Das Diagramm zeigt eine Gegenüberstellung der Proliferationsquotienten der
Kulturversuche mit unterschiedlichen Verhältnissen von Lymphozyten zu Treg. Bei
einem hohen Anteil an Treg fällt der Quotient aus geteilten/ungeteilten Lymphozyten
geringer aus. (p=0,055)
3.2.4. Treg aus juvenilen und adulten Tieren unterscheiden sich in ihrer inhibitorischen
Potenz nicht signifikant
Im Kulturversuch wurde die inhibitorische Potenz, welche juvenile und adulte Treg auf die
Proliferation
naiver
Lymphozyten
ausüben,
verglichen.
Der
Mittelwert
des
Lymphozytenproliferationsquotienten lag bei den dreiwöchigen Treg mit 0,40 ± 0,17 etwas
niedriger als bei den zehnwöchigen Treg mit 0,74 ± 0,34. Der Unterschied ist mit einem pWert von 0,141 nicht signifikant.
3. Ergebnisse
54
Abb.31: Die Inhibitionspotenz der drei- und zehnwöchigen Treg unterschied sich nicht
signifikant. (p=0,141)
3.3.
Systemische
Therapie
mit
adulten
Treg
im
Keratoplastik
Babyrattenmodell
Ziel dieser Versuchsreihe war es, die Auswirkung einer Therapie mit Treg auf das Ergebnis
einer allogenen Keratoplastik herauszustellen. Für die systemische Therapie wurden vier
juvenile Lewis Ratten präoperativ jeweils 1x107 Treg in 100µl Volumen in die Schwanzvene
injiziert. Die Zellen wurden zuvor aus Milzen adulter Lewis Ratten isoliert. Die Entnahme
und histologische Auswertung der Hornhäute erfolgte am Tage der Abstoßung, welche durch
den Opazitätsgrad 4 definiert war. Das Überleben der Transplantate wurde im Vergleich zu
den beiden Kontrollgruppen analysiert.
3. Ergebnisse
55
Abb.32: Kaplan-Meier-Überlebensanalyse der Transplantate. Beobachtungszeitraum: 29 Tage
Transplantatabstoßung ist definiert als Opazität=4. (nallogen=15; nsyngen=8,
nTregi.v.=4); (p<0,01).
Der Median der Abstoßung lag bei der unbehandelten allogenen Gruppe am neunten Tag. Die
intravenöse Behandlung mit Treg verzögerte den Median der Abstoßung um zwei Tage auf den
elften postoperativen Tag. Dieser Unterscheid ist statistisch hochsignifikant (p<0,01). In
beiden Gruppen wurden alle Transplantate innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 29
Tagen abgestoßen. Kein Transplantat der syngenen Kontrollgruppe erreichte Opazitätsgrad
vier.
3.4. Lokale Therapie mit adulten Treg nach allogener Keratoplastik im
Keratoplatik Babyrattenmodell
In der anschließenden Versuchsreihe erfolgte nach einer allogenen Transplantation die
subkonjunktivale Injektion von Treg oder CD4+CD25- Zellen, welche aus adulten Lewis
Ratten isoliert wurden. Es wurden drei Versuchsreihen durchgeführt, die sich durch das
injizierte Volumen, in dem die Zellen gelöst wurden und den Zeitpunkt der Entnahme des
transplantierten Auges für die histologische Analyse unterschieden. Gruppe 3 erhielt
Injektionen mit Zellen, welche aus dem gentechnisch veränderten Rattenstamm Lewis-gfp
(green fluorescent proteine) isoliert wurden. Diese Treg bzw. CD4+CD25- Zellen besaßen eine
3. Ergebnisse
Eigenfluoreszenz,
56
wodurch
sie
sich
sowohl
durchflusszytometrisch
als
auch
fluoreszenzmikroskopisch darstellen ließen.
Gruppe
injizierte Zellen
1
Treg/CD4+CD252
Treg/CD4+CD253
Treg-gfp/CD4+CD25--gfp
injiziertes Volumen
100µl
30µl
30µl
Organentnahme
bei Abstoßung
bei Abstoßung
post Op Tag 9
Abb.33: Übersicht der Versuchsgruppen mit lokaler Therapie von Immunzellen.
In der postoperativen Verlaufsbeobachtung von Gruppe 1 wurden alle Transplantate der
Tiere, die mit CD4+CD25- Zellen lokal behandelt wurden, abgestoßen. Der Median der
Abstoßung lag ebenso wie in der allogenen Vergleichsgruppe am neunten postoperativen Tag.
Die subkonjunktivale Injektion von Treg verhinderte während des Beobachtungszeitraumes
von 29 Tagen bei drei der acht (37,5%) behandelten Tiere eine Transplantatabstoßung. Der
Median der Abstoßung lag am 13. postoperativen Tag vier Tage nach dem Abstoßungsmedian
der allogenen Kontrollgruppe. Somit weißt die behandelte Gruppe eine statistisch
hochsignifikant spätere Abstoßung auf (p<0,01). Die Tiere, welche ihr Transplantat nicht
abgestoßen hatten, wurden nach dem Beobachtungszeitraum von 29 Tagen weiterhin in
größeren Intervallen untersucht. Es konnte keine weitere Abstoßung mehr festgestellt werden.
3. Ergebnisse
57
Abb.34: Die Kaplan-Meier-Analyse zeigt das Überleben der Transplantate der
Versuchsgruppe 1 während des Beobachtungszeitraumes von 29 Tagen. Die
Transplantatabstoßung wurde durch den Opazitätsgrad vier definiert. (nallogen=15;
nsyngen=8, nTregsubkonjunktival=8, nCD4+CD25-subkonjunktival=3); (p<0,01)
Die immunhistochemische Analyse der abgestoßenen Transplantate ergab keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der Art der infiltrierten Immunzellen zwischen den mit Treg bzw.
CD4+CD25- Zellen behandelten Tieren (Signifikanzniveau p<0,05). In der mit Treg
behandelten Gruppe erschienen im Vergleich tendenziell mehr CD8+ (p=0,084), CD163+
(p=0,096) und dendritische Zellen (p=0,135).
3. Ergebnisse
58
Abb.35: Das Diagramm zeigt die Dichte der Immunzellen in den Zellinfiltraten der
abgestoßenen Transplantate der Versuchsgruppe 1. Die Tiere wurden mit einer
subkonjunktivalen Injektion von 1x105 Zellen in 100µl Volumen behandelt.
Die Behandlung der Tiere in Gruppe 2 unterschied sich von Gruppe 1 lediglich durch das
geringere Volumen, in dem die 1x105 Zellen subkonjunktival appliziert wurden. Die
postoperative Verlaufsbeobachtung gestaltete sich wie folgend:
3. Ergebnisse
59
Abb.36: Kaplan-Meier-Überlebensanalyse der Transplantate der Gruppe 2. Die Zellen wurden
subkonjunktival in 30µl injiziert. (nTreg=6, nCD4+CD25-=4); (p<0,01)
Bei zwei von sechs Tieren mit subkonjunktivaler Injektion von Treg wurden die Transplantate
am 13. bzw. 15. Tag abgestoßen. Da in dieser Gruppe weniger als die Hälfte der Transplantate
abgestoßen wurden, ließ sich ein Median nicht errechnen. Die Transplantate von vier Tieren
der Gruppe (66,7%) erreichten auch nach dem Zeitraum von 29 Tagen nicht den
Opazitätsgrad 4. Somit wurden diese Transplantate nicht abgestoßen, der beobachtete
Unterschied ist statistisch hochsignifikant (p<0,01).
Von den vier Tieren, die in Gruppe 2 mit subkonjunktivaler Injektion von CD4+C25- Zellen
behandelt wurden, fanden bei 3 (75%) Tieren innerhalb des Beobachtungszeitraumes eine
Transplantatabstoßung statt. Der Median der Abstoßung war am elften postoperativen Tag
und somit zwei Tage nach der der unbehandelten allogenen Kontrollgruppe.
In der immunhistochemischen Analyse der Infiltrate der abgestoßenen Transplantate aus
Gruppe 2 traten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren mit Injektion von Treg
bzw. CD4+CD25- auf. Tendenziell ließen sich in den Treg behandelten Transplantaten mehr
CD161+ (p=0,469) sowie mehr CD163+(p=0,314) Zellen erkennen.
3. Ergebnisse
60
Abb.37: In der immunhistochemische Analyse der Zellinfiltrate in den abgestoßenen
Transplantate aus Gruppe 2 fanden sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich
der Dichte der infiltrierenden Zellenarten.
Die dritte Gruppe wurde im Anschluss an die Keratoplastik durch subkonjunktivale Injektion
von 1x105 gfp+ Zellen in 30µl behandelt. Die Entnahme der Transplantate erfolgte jedoch
nicht am Tag der Abstoßung, sondern am neunten postoperativen Tag. Dies entspricht dem
Tag der mittleren Abstoßung der unbehandelten allogenen Kontrollgruppe (Schwartzkopff,
Berger et al. 2009).
Die Infiltrate der Transplantate dieser Gruppe zeigen hinsichtlich der Zelldichte und des
immunologischen Phänotyps der infiltrierten Zellen keinen signifikanten Unterschied
zwischen Tieren mit injizierten Treg bzw. CD4+CD25- Zellen (Signifikanzniveau p=0,05).
3. Ergebnisse
61
Abb.38: Dargestellt ist die Zelldichte des Infiltrates der Hornhäute aus Gruppe 3. Zwischen
Tieren mit injizierten Treg bzw. CD4+CD25- Zellen besteht kein signifikanter
Unterschied.
Abb.39: Die Abbildung zeigt die immunhistochemische Analyse der Zellinfiltrate der
Transplantate aus Gruppe 3. Die Tiere wurden mit 1x105 gfp+ Treg bzw. CD4+CD25Zellen in 30µl subkonjunktival behandelt. Die Entnahme der Organe erfolgte am
neunten postoperativen Tag. Es fanden sich zwischen den beiden Injektionen keine
signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Zahl der infiltrierenden Zellen.
3.5. Vergleich der Zellinfiltrate der abgestoßenen Transplantate nach
systemischer und lokaler Therapie mit Treg
Im Folgenden werden die Zellinfiltrate aller abgestoßenen Transplantate der mit Treg
systemisch bzw. lokal behandelten Tiere verglichen.
3. Ergebnisse
62
Abb.40: HE-Färbung der histologischen Schnitte der abgestoßenen Transplantate nach
systemischer (links) und lokaler Behandlung mit Treg (rechts).
Abb.41: Das Diagramm vergleicht die Gesamtzelldichte der Infiltrate der abgestoßenen
Transplantate nach lokaler und nach systemischer Applikation von Treg. Die Infiltrate
beider Gruppen unterschieden sich nicht signifikant (p=0,066)
Bei lokaler Applikation der Treg fiel die Dichte der infiltrierenden Zellen mit 58,55 ± 21,52
pro mm2 geringer aus als bei systemischer Applikation 85,75± 16,46mm2. Der Unterschied ist
nicht signifikant (p=0,066).
3. Ergebnisse
63
Abb.42: Das Diagramm zeigt die immunhistochemische Auswertung der Zellinfiltrate der
abgestoßenen Transplantate der mit Treg behandelten Tiere. Im Infiltrat der
subkonjunktival behandelten Tiere fanden sich signifikant mehr CD163+ Zellen als
im Infiltrat der systemisch behandelten Tiere. (p=0,02)
Nach einer lokalen Applikation ist die Dichte der CD4+ Zellen in den Infiltraten der
abgestoßenen Transplantate tendenziell geringer, die Dichte der CD8+ Zellen größer als nach
systemischer Applikation von Treg. Die Dichte der infiltrierten CD163+ Zellen in der Gruppe
mit lokaler Applikation von Treg ist im Vergleich zur systemischen Applikation signifikant
erhöht (p=0,02).
3.6. Die subkonjunktival injizierten Zellen lassen sich in der Milz, nicht
jedoch in den submandibulären Lymphknoten und der Hornhaut
nachweisen
Zur Untersuchung, in welchem Organsystem sich die subkonjunktival applizierten
Immunzellen anreichern, wurde die fluoreszierende Eigenschaft der in Versuchsgruppe 3
applizierten gfp+-Zellen genutzt. Diese Zellen ließen sich sowohl durchflusszytometrisch als
auch fluoreszenzmikroskopisch darstellen.
Am neunten postoperativen Tag wurden Milz, submandibuläre Lymphknoten der operierten
und der kontralateralen Seite, sowie die transplantierten Hornhäute entnommen und auf das
Vorhandensein dieser fluoreszierenden Zellen untersucht.
3. Ergebnisse
64
3.6.1. Untersuchung von Milz und submandibulären Lymphknoten auf das
Vorhandensein subkonjunktival injizierter gfp+ Zellen
Zunächst
erfolgte
die
durchflusszytometrische
Analyse
der
Milzen,
aus
denen
Zellsuspensionen hergestellt wurden. Zur besseren Darstellung der gfp+ Zellen, deren
Fluoreszenzspektrum im Bereich der Fluoreszenz 1 des Durchflusszytometers liegt, wurde die
Suspension zusätzlich mit einem anti-CD4-Antikörper angefärbt. Dieser war mit dem
Fluoreszenzfarbstoff PE gekoppelt, welcher in Fluoreszenz 2 darstellbar war. Sowohl die Treg,
als auch die CD4+CD25- Zellen aus dem gfp-Tier, erscheinen anschließend in Fluoreszenz 1
und 2 positiv.
Abb.43: Dargestellt ist die durchflusszytometrische Analyse der Milz einer Ratte, welche eine
subkonjunktivale Injektion von gfp+-Zellen erhielt. Die gfp+ Zellen erscheinen positiv
in Fluoreszenz 1.
Abb.44: Beispielhafte durchflusszytometrische Darstellung der Milzen nach Injektion von
gfp+ Zellen und Anwendung des PE-gekoppelten anti-CD4-Antikörpers. Die
injizierten gfp+ Treg bzw. CD4+CD25- Zellen erschienen doppelt positiv. Links:
Subkonjunktivale Injektion von Treg Rechts: Subkonjunktivale Injektion von
CD4+CD25-.
Auf die gleiche Art wurden ebenso die submandibulären Lymphknoten analysiert. Hierbei
wurde zwischen den Lymphknoten der Seite des operierten Auges und der kontralateralen
Seite unterschieden.
3. Ergebnisse
65
Abb.45: Durchflusszytometrische Analyse der submandibulären Lymphknoten der operierten
Seite. Links: Subkonjunktivale Injektion von Treg Rechts: Subkonjunktivale Injektion
von CD4+CD25-.
Abb.46: Durchflusszytometrische Analyse der submandibulären Lymphknoten der
kontralateralen Seite. Links: Subkonjunktivale Injektion von Treg Rechts:
Subkonjunktivale Injektion von CD4+CD25-.
Die Messungen wurden für alle sechs operierten Tiere durchgeführt. Für jedes Organ wurde
der Anteil der gfp+ Zellen an den CD4+ Zell errechnet.
Abb.47: Das Schaubild zeigt den Anteil der gfp+ Zellen an den CD4+ Zellen. Gemessen
wurden sowohl die Tiere mit subkonjunktivaler Treg als auch CD4+CD25--Injektion.
(jeweils p<0,01)
3. Ergebnisse
66
In den Milzen erschienen 4,00% ± 0,92% der CD4+ Zellen gfp+. Im Vergleich dazu waren es
in den submandibulären Lymphknoten der operierten Seite 0,40% ± 0,14% und den
Lymphknoten der kontralateralen Seite 0,45% ± 0,22%. Es bestand ein signifikanter
Unterschied zwischen den dem Anteil der gfp+ Zellen in den Milzen und den Lymphknoten
beider Seiten (jeweils p=0,00).
In den Milzen wurde kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der gfp+ Zellen zwischen
Tieren mit Treg und CD4+CD25- Zellen festgestellt. Nach der Injektion von Treg betrug der
Anteil der gfp+ Zellen an den CD4+ Zellen 3,71% ± 0,90%. Nach der Injektion von
CD4+CD25- Zellen betrug dieser Anteil 4,30% ± 1,02%.
Abb.48: Das Diagramm zeigt den Anteil der gfp+ an den CD4+ Zellen in den Milzen von je
drei operierten Tieren. Der Unterschied zwischen Treg- und CD4+CD25--Injektion ist
nicht signifikant. (p=0,215)
3.6.2. Untersuchung der Transplantate auf injizierte gfp+ Zellen
Um zu untersuchen, ob sich die nach der Transplantation subkonjunktival injizierten Zellen in
der Hornhaut wiederfinden, wurden histologische Präparate der Transplantate erstellt und
diese fluoreszenzmikroskopisch auf das Vorhandensein von gfp+ Zellen untersucht.
Zur Kontrolle der Methode wurde zunächst der Gefrierschnitt der Milz eines Tieres nach
Injektion gfp+-Zellen untersucht. Zuvor wurde in dieser Milz die gfp+ Zellen
durchflusszytometrisch nachgewiesen.
3. Ergebnisse
67
Abb.49: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung gfp+ Zellen. Das Bild rechte zeigt das
histologische Milzpräparat einer Ratte, welche zuvor eine subkonjunktivale Injektion
von gfp+ Lymphozyten erhielt. Diese fluoreszierenden Zellen erscheinen grün (rote
Pfeile). Links: Milz einer Ratte ohne Injektion gfp+ Zellen. Vergrößerung: 20-fach.
Nachdem der mikroskopische Nachweis der fluoreszierenden gfp+ Zellen im histologischen
Präparat gelang, erfolgte die Untersuchung der Transplante der sechs Tiere, welche
postoperativ eine subkonjunktivale Injektion von gfp+ Zellen erhielten.
In keiner der untersuchten Hornhäute ließen sich fluoreszierende Zellen nachweisen.
Abb.50: Die Fotos zeigen beispielhaft mikroskopischen Aufnahmen der Transplantate der
Tiere aus Gruppe 3 bei 20-facher Vergrößerung. In der linken Spalte befinden sich
zur Orientierung die lichtmikroskopischen Aufnahmen der Hornhäute. In der rechten
Spalte sind jeweils die Fluoreszenzaufnahmen der Präparate gegenübergestellt. In
keiner der untersuchten Hornhäute ließen sich fluoreszierende Zellen nachweisen.
3. Ergebnisse
68
3.7. Quantifizierung der Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 in
juvenilen und adulten Treg
Die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 der aufgereinigten Treg Zellen wurde mit
Hilfe der quantitativen Echtzeit PCR bestimmt. Dabei wurden die FoxP3 Expression von
juvenilen und adulten Treg verglichen.
Die Zellen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aus Lewis Milzen isoliert. Der
Versuch wurde dreimalig durchgeführt. In jeder Versuchsgruppe wurden Proben aus drei
verschiedenen Tieren gemessen und die Ct-Werte gemittelt. Es wurden sowohl Negativ- als
auch Positivkontrollen ohne DNA bzw. mit FoxP3 DNA aus Milzzellen durchgeführt. Eine
Normalisierung wurde in Bezug auf das Kontrollgen Aktin durchgeführt.
Es ergaben sich folgende Ct-Werte:
juvenile Tiere
adulte Tiere
Aktin
FoxP3
Aktin
FoxP3
32,61
39,09
26,98
37,32
31,75
36,62
28,22
34,53
*
*
27,94
33,08
Abb.51: Darstellung der Ct-Werte, die jeweils aus drei Messungen gemittelt wurden.
(*=keine Messung erfolgt)
Nach Normalisierung unterschied sich die Expression des FoxP3 Gens in juvenilen und
adulten Treg nicht signifikant (p=0,2997).
4. Diskussion
69
4. Diskussion
Kongenitale Fehlbildungen sind die häufigste Ursache für Hornhauttrübungen im Kindesalter
(Vanathi, Panda et al. 2009). Da sich das visuelle System von Kindern noch in der
Entwicklung befindet, sind früh auftretende Störungen des optischen Systems besonders
schwerwiegend und führen unbehandelt zu Amblyopie (Wiesel 1982). Eine frühzeitige
Korrektur des Sehfehlers durch eine Keratoplastik stellt für einige dieser Patienten die einzige
Möglichkeit dar, eine adäquate Sehleistung zu entwickeln (Dana, Moyes et al. 1995). Jedoch
erzielt eine Hornhauttransplantation im Kindesalter schlechtere Ergebnisse als im
Erwachsenenalter. Während die Abstoßungsrate bei erwachsenen Transplantatempfängern mit
normalem Risikoprofil ohne die Anwendung systemischer Immunsuppressiva nur 10%
beträgt (Reinhard, Bohringer et al. 2004), tritt bei Hornhauttransplantationen, die bei Kindern
im Alter von unter drei Jahren durchgeführt werden, in bis zu 65-85% der Fälle ein
Transplantatversagen auf (Althaus and Sundmacher 1996; Yang, Lambert et al. 1999; Reidy
2001). Ursache für diesen Funktionsverlust der transplantierten Hornhäute ist in den meisten
Fällen eine immunologische Abstoßungsreaktion des Fremdgewebes (Vanathi, Panda et al.
2009). Die schlechteren Ergebnisse der pädiatrischen Keratoplastik sind hauptsächlich auf
Unterschiede zwischen dem erwachsenen und dem kindlichen Immunsystem zurückzuführen
(Alldredge and Krachmer 1981).
Untersuchungen an Tiermodellen zeigten, dass CD4+ Zellen eine führende Rolle an der
Abstoßungsreaktion von adulten Hornhauttransplantaten einnehmen (Yamada, Kurimoto et al.
1999; Claerhout, Kestelyn et al. 2004). Die Funktion dieser T-Helferzellen wird maßgeblich
durch Treg reguliert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Zellreihe brachte
zahlreiche Therapieansätze in der Transplantationsmedizin hervor (Wood and Sakaguchi
2003). In experimentellen Ansätzen gelang bereits die Induktion von Toleranz gegenüber
allogenen Transplantaten durch adoptiven Transfer von Treg (Wood and Sakaguchi 2003;
Nagahama, Nishimura et al. 2007).
Untersuchungen an thymektomierten Mäusen ergaben Hinweise darauf, dass sich Treg erst
spät postnatal vollständig entwickeln (Dujardin, Burlen-Defranoux et al. 2004). Für das
Rattenmodell gibt es bezüglich der Entwicklung der Treg in der Kindheit keine vergleichbaren
Untersuchungen. Dagegen ist anzunehmen, dass das CD4/CD8 T-Zell System, welches als
„Gegenspieler“ der Treg bezeichnet werden könnte, in drei Wochen alten Ratten bereits voll
ausgebildet ist (Schwartzkopff, Berger et al. 2009). Eine aktuelle Veröffentlichung zeigt, dass
sich das Verhältnis von naiven T-Zellen zu Treg im Laufe des Lebens ändert, da die Fähigkeit
4. Diskussion
70
des Thymus, naive T-Zellen zu ersetzen, mit dem Alter nachlässt. Die peripher zirkulierenden
naiven T-Zellen hingegen entwickeln sich durch Antigenkontakt zunehmend zu
Gedächtniszellen. Dadurch nimmt das Verhältnis der naiven T-Zellen zu Treg mit dem Alter
ab (Han, Zhao et al. 2009). Diese Erkenntnis brachte uns zu der Vermutung, dass diese
altersabhängige
Veränderung
im
Teff‘/Treg
Verhältnis
zu
einem
besseren
Transplantatüberleben im Erwachsenenalter führen könnte.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob sich der Treg Pool in juvenilen und
adulten Organismen hinsichtlich Anzahl und Funktion der Zellen, sowie der Expression des
Transkriptionsfaktors FoxP3 unterscheidet. Dies könnte die geänderte Reaktion des juvenilen
Immunsystems auf ein Hornhauttransplantat verursachen.
Darüber hinaus wurde untersucht, ob eine Therapie mit Treg im Rahmen einer Keratoplastik
am Babyrattenmodell möglich ist, wie diese gestaltet sein sollte und ob diese einen Einfluss
auf das Ergebnis der Transplantation hat.
4.1.Vergleich der Quantität, Funktion und FoxP3-Expression juveniler und
adulter Treg
4.1.1. Vergleich der Quantität der Treg bei juvenilen und adulten Ratten
Die durchflusszytometrische Analyse der Milzlymphozyten aus juvenilen und adulten Lewis
Ratten ergab, dass sowohl der Anteil der CD4+-Zellen als auch der Anteil der Treg in adulten
Tieren signifikant über dem der juvenilen Tiere lag (Abb.22 und Abb.23). Eine mögliche
Erklärung für den verhältnismäßig höheren Spiegel an Treg in adulten Tieren wäre, dass die
ausgewachsenen Tiere in ihrem längeren Leben verstärkten Kontakt zu Umweltantigenen
hatten. Antigene, die vom Immunsystem als „harmlos“ eingestuft wurden, können von
dendritischen Zellen präsentiert werden und die Induktion von Treg hervorrufen (Roncarolo,
Levings et al. 2001). Dies könnte zwar einen höheren Spiegel an Treg bei älteren Tieren
erklären, jedoch wuchsen die verwendeten Tiere unter fremdantigenfreien Zuchtbedingungen
auf und wurden erst unmittelbar vor der Organentnahme aus ihren mit Filtern versehenen
Käfigen entnommen. Die erhöhte Zahl der Treg ist daher eher mit einer quantitativen
Entwicklung des Immunsystems in der Adoleszenz zu begründen.
Um herauszufinden, ob ein höherer Anteil an Treg in einer Lymphozytenpopulation eine
stärkere Inhibition der Effektorlymphoztenaktivität bewirkt, verwendeten wir einen
Kulturversuch. Dabei wurde die inhibitorische Aktivität, welche Treg auf Teff ausüben, anhand
der
Lymphozytenproliferation
quantifiziert.
Zur
Isolierung
der
Treg wurden
die
4. Diskussion
71
Oberflächenantigene CD4 und CD25 dargestellt. In den isolierten CD4+CD25+ Zellen wurde
mittels PCR das FoxP3 Gen nachgewiesen, was das Vorhandensein von Treg bestätigte.
Die isolierten Treg bewirkten im Kulturversuch eine signifikante Hemmung der
Lymphozytenproliferation (Abb.28). Die inhibitorische Wirkung war umso stärker, je höher
die Konzentration der Treg gewählt wurde (Abb.30). Diese Beobachtung lieferte einen
Hinweis auf eine schwächere Kontrolle der CD4-Zell Antwort im juvenilen Organismus, da in
diesem weniger Treg pro CD4+ Zellen vorhanden sind. Die Konzentrationsabhängigkeit des
inhibitorischen Effektes war nicht signifikant. Möglicherweise müssten die Versuche mit
stärkeren Verdünnungen sowie einer höheren Anzahl an Kulturen durchgeführt werden, um
diesen Effekt deutlicher herauszustellen.
4.1.2. Vergleich der inhibitorischen Potenz juveniler und adulter Treg
Eine weitere Möglichkeit für die stärkere Antwort, mit der das juvenile Immunsystem im
Vergleich zum adulten auf ein allogenes Transplantat reagiert, stellt eine eventuell noch nicht
voll ausgereifte Funktion der juvenilen Treg dar. Um herauszufinden, ob Treg ihre volle
inhibitorische
Potenz
erst
in
der
Adoleszenz
besitzen,
untersuchten
wir
die
Suppressionspotenz von juvenilen und adulten Treg auf die Lymphozytenproliferation. Hierbei
zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Inhibitionspotenzen der eingesetzten
Zellen.
Die
stärkere
Transplantatabstoßungsreaktion
bei
jugendlichen
Empfängertieren
im
Rattenmodell lässt sich demnach nicht auf eine eingeschränkte inhibitorische Potenz juveniler
Treg zurückführen.
4.1.3. Vergleich der FoxP3 Expression juveniler und adulter Treg
Die Arbeitsgruppe um Chauhan untersuchte die Anzahl der Treg in adulten Mäusen nach
Keratoplastik. Sie stellten fest, dass nur ein Teil der Tiere das Transplantat abstießen, andere
wiederum eine Toleranz gegenüber dem Fremdgewebe entwickelten. Zwischen diesen beiden
Gruppen stellten sie keinen quantitativen Unterschied der Treg am Lymphozytenpool fest. Sie
postulierten erstmalig, dass zur Entwicklung einer Toleranz gegenüber einem allogenen
Transplantat im Mäusemodell die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 entscheidender
ist, als die Anzahl der Treg (Chauhan, Saban et al. 2009). Dabei korreliert die Höhe der
Genexpression mit der inhibitorischen Potenz der Treg auf die Lymphozytenaktivität
(Chauhan, Saban et al. 2009).
4. Diskussion
72
Vor diesem Hintergrund quantifizierten wir die Expression des FoxP3 Gens mittels EchtzeitPCR bei Treg verschiedener Altersgruppen. Dabei stellte sich kein signifikanter Unterschied
zwischen juvenilen und adulten Treg heraus.
Die Erkenntnisse von Chauhan et al decken sich in diesem Aspekt mit unseren
Beobachtungen, da die von uns untersuchten juvenilen und adulten Treg sich sowohl in der
Höhe der Expression des FoxP3 Gens, als auch in der inhibitorischen Funktion nicht
wesentlich unterscheiden.
Wir gingen daher weiterhin davon aus, dass eine quantitative Veränderung im
Lymphozytenpool und nicht eine verminderte Inhibitionspotenz juveniler Treg einen
entscheidenden Einfluss auf das schlechtere Transplantatüberleben bei drei Wochen alten
Tieren hat. Entsprechend dieser Hypothese konnte eine Therapie mit Treg im juvenilen
Empfänger ein verlängertes Transplantatüberleben bewirken.
4.2. Systemische und lokale Therapie mit Treg
Die Feststellung, dass sich die Treg juveniler und adulter Tiere in vitro nicht in ihrer
inhibitorischen Potenz, jedoch in ihrem Anteil am Lymphozytenpool unterscheiden, brachte
uns dazu, Treg in vivo im Rahmen einer allogenen Keratoplastik einzusetzen. Hierfür führten
wir einen adoptiven Transfer von adulten Treg auf juvenile Ratten durch.
Die systemische Applikation von Treg bewirkte nur einen geringen Effekt auf das mittlere
Transplantatüberleben (Abb.32).
Diese Beobachtung deckte sich mit der, die Chauhan et al an Mäusen feststellten. Sie
beschrieben, dass eine intravenöse Injektion von naiven Treg das Transplantatüberleben bei
ihrem Modell nicht signifikant verlängert (Chauhan, Saban et al. 2009).
Zusätzlich zur systemischen Therapie untersuchten wir die Wirkung von lokal applizierten
naiven Treg im Rahmen allogener Keratoplastik an juvenilen Ratten. Hierfür injizierten wir
1x105 Treg postoperativ zunächst in 100µl Volumen subkonjunktival.
Fünf der acht transplantierten Hornhäute zeigten im Verlauf eine Eintrübung, die den
Opazitätsgrad vier erreichte. Hierbei hatten wir klinisch den Verdacht, dass das
Injektionsvolumen zu einer Erhöhung des intraokulären Druckes führte, was das
Transplantatversagen begünstigte. Daher führten wir die Versuchsreihe erneut mit einem
geringeren Injektionsvolumen durch. Dabei wurden die 105 Zellen in 30µl gelöst. Durch diese
Behandlung wurde das Transplantatüberleben signifikant verlängert (p<0,01) (Abb.36).
4. Diskussion
73
4.3. Nachweis der subkonjunktival injizierten Zellen
Die Beobachtung, dass die subkonjunktivale Injektion im Vergleich zur intravenösen Gabe
einer identischen Anzahl an Treg ein signifikant besseres Transplantatüberleben hervorruft,
lässt darauf schließen, dass die lokal applizierten Zellen eine stärkere immunsuppressive
Funktion entwickeln.
Chauhan et al fanden heraus, dass Treg primär die Induktion der Alloimmunität in den
regionalen Lymphknoten hemmen, statt die Effektorphase der Immunantwort in der
Peripherie zu unterdrücken (Chauhan, Saban et al. 2009). Es ist denkbar, dass subkonjunktival
injizierte Treg zunächst eine Wirkung in den drainierenden Lymphknoten des Auges (Kaplan
2007) vollführen. Dort findet die Induktion der Alloimmunität durch APC statt, die Antigene
des Spendergewebes aus dem Auge präsentieren. Falls die Drainage der subkonjunktival
injizierten Zellen in die Lymphknoten stattfände, wäre es möglich, dass diese dort die
Wirkung der APC unterdrücken. Es ist anzunehmen, dass sich die systemisch applizierten Treg
nur gering in den submandibulären Lymphknoten anreichern und daher keinen lokalen Effekt
ausüben.
Um Hinweise zu erhalten, ob sich die lokal applizierten Zellen in den submandbibulären
Lymphknoten oder einem anderen Organsystem anreichern, führten wir Keratoplastiken an
Tieren durch, welche postoperativ eine subkonjunktivale Injektion von gfp+ Zellen erhielten.
Am neunten postoperativen Tag, welcher dem Zeitpunkt der mittleren Abstoßung bei
allogener Transplantation eines unbehandelten juvenilen Tieres entspricht, wurden Hornhäute,
Milzen sowie die submandibulären Lymphknoten der operierten und der kontralateralen Seite
entnommen und auf das Vorhandensein fluoreszierender Zellen untersucht. Dabei wurden die
injizierten gfp+ Zellen fast ausschließlich in der Milz nachgewiesen (Abb.44).
Diese Feststellung steht im Widerspruch zur Überlegung, dass die Treg ihre Funktion in den
drainierenden Lymphknoten ausüben.
Eine Erklärung für die stärkere immunsuppressive Wirkung der subkonjunktival injizierten
Zellen liefert die Beobachtung von Chauhan et al. Sie wiesen nach, dass APC, welche im
Auge Antigene des Spendergewebes endozytierten, in den drainierenden Lymphknoten ein
alloantigenspezifisches Priming der Treg bewirken (Chauhan, Saban et al. 2009). Die so
geprimten Treg besitzen eine stärkere Potenz, aktivierte Teff, die mit den selben Antigenen
spezifisch geprimt wurden, zu unterdrücken (Chauhan, Saban et al. 2009). Möglicherweise
findet dieses Spenderantigenpriming nach systemischer Applikation der Treg nicht oder nur in
geringerem Maße statt. Um Treg auf ein solches antigenspezifisches Priming zu untersuchen,
könnten die fluoreszenzmarkierten Zellen nach subkonjunktivaler bzw. intravenöser
4. Diskussion
74
Applikation im Rahmen einer Keratoplastik postoperativ aus dem lymphatischen Gewebe der
Ratten isoliert werden. Diese Treg könnten in einem Suppressionsversuch zusammen mit Teff
inkubiert werden. Um ein antigenspezifisches Priming der Teff zu erreichen, könnten APC des
Spenderstammes hinzugefügt werden. Treg, welche eine Allogenspezifität gegen das
Spendergewebe entwickeln, sind dazu in der Lage Teff, welche mit APC des Spenders
inkubiert wurden, stärker zu hemmen, als naive Treg (Chauhan, Saban et al. 2009).
Chauhan et al stellten dieses alloantigenspezifische Priming jedoch nur in den drainierenden
Lymphknoten fest (Chauhan, Saban et al. 2009), wohingegen wir am neunten postoperativen
Tag keine Anreicherung der inijzierten Treg in den submandibulären Lymphknoten feststellen
konnten. Möglicherweise befindet sich unmittelbar nach der subkonjunktivalen Applikation
ein Teil der injizierten Zellen in den drainierenden Lymphknoten und migriert erst später in
die Milz. So könnten die injizierten Zellen in den Lymphknoten alloantigenspezifisch geprimt
werden. Um auszuschließen, dass sich die subkonjunktival applizierten Zellen zeitweise in
den Lymphknoten anreichern, könnte der Versuch in nachfolgenden Arbeiten wiederholt
werden, wobei in kürzeren Abständen nach der Injektion die Lymphknoten auf das
Vorhandensein fluoreszenzmarkierter Zellen untersucht werden müssten. Dies könnte in
Bezug auf die Ergebnisse von Ochondo et al von Bedeutung sein, die bereits feststellten, dass
die Akkumulation von Treg in den Lymphknoten essentiell für das Entstehen einer
Transplantattoleranz ist (Ochando, Yopp et al. 2005).
4.4. Vergleich der Zellinfiltrate in den Transplantaten
In der histologischen Aufarbeitung wurden zunächst die Zellinfiltrate der abgestoßenen
Transplantate verglichen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Zelldichte der
Infiltrate der intravenös bzw. subkonjunktival mit Treg behandelten Gruppe (Abb.42). Dies
lässt sich dadurch erklären, dass die Transplantatabstoßung klinisch durch den Grad der
Opazität bestimmt wurde, welche mit der Dichte der infiltrierten Immunzellen korreliert
(Schwartzkopff, Bredow et al. ; Schwartzkopff, Berger et al. 2009).
Die immunhistochemische Analyse zeigte bei Tieren mit subkonjunktivaler Applikation von
Treg im Vergleich zu systemisch behandelten Tieren eine signifikant erhöhte Dichte an
CD163+ Zellen. Eine Erklärung hierfür ist, dass Treg durch Zytokine wie IL-10 und TGF-β
Makrophagen vom Subtyp M2 induzieren (Liu, Ma et al.). Diese Zellen exprimieren eine
hohe Anzahl des Hämoglobin Scavenger Rezeptors CD163 und produzieren ihrerseits
antiinflammatorische Zytokine wie IL-10, TGF-β, Il-1 Rezeptoragonisten und das Enzym
4. Diskussion
75
Arginase (Gordon and Martinez). Möglicherweise leistete eine verstärkte Induktion dieses
immunsuppressiv wirkenden Makrophagensubtypes einen Beitrag für das bessere
Transplantatüberleben in den Tieren, welche eine lokale Therapie mit Treg erhielten.
In der Versuchsgruppe mit der längsten Transplantatüberlebenszeit wurde die geringste
Dichte an CD4+ Zellen im Transplantat nachgewiesen. Es ist anzunehmen, dass auch hierfür
der T-Zell supprimierende Effekt der Treg zugrunde liegt (Workman, Szymczak-Workman et
al. 2009).
Um herauszufinden, ob eine lokale Therapie mit Treg Auswirkungen auf die Kinetik der
Immunantwort hat, wurden in einer weiteren Versuchsreihe erneut Keratoplastiken mit
subkonjunktivaler Injektion von Treg durchgeführt. Dabei wurden die Transplantate zur
histologischen Aufarbeitung am neunten postoperativen Tag entnommen, was dem Zeitpunkt
der mittleren Abstoßung bei allogener Keratoplastik mit unbehandelten juvenilen
Empfängertieren entspricht. Hier zeigte sich im Vergleich zum Abstoßungstag eine geringere
Zelldichte in den Transplantaten (nicht gezeigt). Diese histologische Erkenntnis entsprach der
klinischen Evaluation der Opazität, da der Opazitätsgrad am neunten postoperativen Tag
geringer als zum Zeitpunkt der Transplantatabstoßung war und die Trübung des
Transplantates mit der Dichte der infiltrierten Zellen korreliert, wie auch Schwartzkopff und
Berger zeigten (Schwartzkopff, Berger et al. 2009).
Die immunhistochemische Auswertung der Zellinfiltrate wurde mit einer Kontrollgruppe
verglichen, welche mit CD4+CD25- Zellen behandelt wurde. Hierbei fiel eine geringere
Dichte an CD25+ Zellen in der behandelten Kohorte auf, was mit der Hemmung der
Aktivierung CD4+ Zellen durch Treg zu erklären sein könnte (Workman, Szymczak-Workman
et al. 2009).
Die Tatsache, dass auch in der subkonjunktival therapierten Gruppe Transplantatversager
vorkamen ist damit zu erklären, dass eine Abstoßungsreaktion auch unabhängig von CD4+
Zellen stattfindet. Selbst bei einer vollständigen Unterdrückung der T-Helferzellantwort durch
Treg könnte es zu Transplantatversagen kommen. Niederkorn et al führten Keratoplastiken an
Mäusen durch, bei denen es trotz Depletion der CD4+ Zellen zu Abstoßungsreaktionen kam.
In der histologischen Auswertung dieser Transplantate wurde eine erhöhte Zahl an CD8+
Zellen nachgewiesen. Diese verstärkte Aktivität einer unter physiologischen Bedingungen
weniger aktiven Zellreihe lässt sich durch die redundante Anlage des Immunsystems erklären.
Der Ausfall eines Pfades der Immunabwehr kann so durch einen anderen Mechanismus
zumindest teilweise kompensiert werden (Niederkorn, Stevens et al. 2006). Entsprechend den
Beobachtungen Niederkorns wiesen wir in der histologischen Auswertung der abgestoßenen
4. Diskussion
76
Transplantate der Tiere, die mit Treg behandelt wurden eine im Vergleich zur Kontrollgruppe
leicht erhöhte Dichte an infiltrierten CD8+ Zellen nach.
NK-Zellen nehmen an der Transplantatabstoßung bei jungen Tieren eine herausragende Rolle
ein (Schwartzkopff, Schlereth et al. ; Mayer, Reinhard et al. 2003). In unserer Versuchsreihe
wiesen Tiere, welche eine subkonjunktivale Behandlung mit Treg erhielten, im Vergleich zur
Kontrollgruppe eine leicht erhöhte Dichte an CD161+ Zellen in den Infiltraten der
Transplantate auf. Dies ist ein Hinweis dafür, dass die NK-Zellfunktion aufgrund der Tregvermittelten Suppression der CD4+ Zellen kompensatorisch gesteigert ist.
Dieser
Effekt
der
gesteigerten
NK-Zellfunktion
lässt
sich
ebenfalls
in
der
Transplantatabstoßung bei Organismen beobachten, welche ein unvollständig ausgereiftes TZell System besitzen (Freud and Caligiuri 2006; Kirwan and Burshtyn 2007).
4.5. Ausblick
Das positive Ergebnis hinsichtlich des Transplantatüberlebens durch lokale Therapie mit Treg
eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten zur Verbesserung der Keratoplastik im frühen
Kindesalter.
Möglicherweise ließe sich die Wirkung der applizierten Treg noch weiter verbessern. In
unseren Versuchen verwendeten wir frisch isolierte naive Treg. In vitro Untersuchungen
zeigten, dass Treg durch Stimulation über den T-Zell Rezeptor aktiviert werden müssen, um
ihre volle inhibitorische Aktivität zu entfalten (Thornton and Shevach 1998; Itoh, Takahashi
et al. 1999). Diese Aktivierung kann durch Inkubation der Treg mit einem anti-CD3
Antikörper, antigenpräsentierenden Zellen sowie dem IL-2 erreicht werden (Thornton,
Piccirillo et al. 2004). In nachfolgenden Versuchen sollte daher untersucht werden, ob sich
das Transplantatüberleben weiter verbessert, wenn die Treg vor der in vivo Applikation durch
in vitro-Inkubation aktiviert werden.
Chauhan und Saban stellten an ihrem Keratoplastik Mäusemodell fest, dass peripher
induzierte Treg eine stärkere proliferationshemmende Wirkung auf T-Effektorzellen besitzen,
als naive Treg (Chauhan, Saban et al. 2009). Sie isolierten einige Tage postoperativ Treg aus
Tieren, welche eine Keratoplastik erhielten. Dabei stellten sie fest, dass sich Treg aus
Transplantatakzeptoren
und Transplantatversagern in
ihrem
Zytokinsekretionsmuster
unterscheiden. Sie führten den Unterschied zwischen Akzeptoren und Versagern darauf
zurück, dass nur in Akzeptoren eine alloantigenspezifische Aktivierung von Treg gegenüber
den transplantierten Fremdantigenen stattfindet. Diese alloantigenspezifischen peripher
4. Diskussion
77
induzierten Treg besitzen demnach eine stärkere Inhibitionspotenz. Sie weisen eine erhöhte
Sekretion von TGF-β und IL-10, sowie höhere Spiegel von FoxP3 aus.
Es wäre interessant, diese Beobachtungen auf das Babyrattenmodell, welches sich in einigen
Punkten vom Mäusemodell unterscheidet, zu übertragen. Hierfür sollten zunächst im
Anschluss an die Keratoplastik Treg von allen Tieren isoliert und das ZytokinSekretionsmuster sowie der FoxP3-Spiegel untersucht werden. Analog zu Chauhan und Saban
wäre zu erwarten, dass auch im Rattenmodell die Treg der Transplantatakzeptoren höhere
Spiegel der Zytokine TGF-β, IL-10 sowie des Transkriptionsfaktors FoxP3 exprimieren und
eine höhere Suppressionspotenz besitzen. Aufschlussreich wäre zudem ein Vergleich
zwischen Tieren, welche eine subkonjunktivale bzw. eine intravenöse Injektion erhielten.
Entsprechend dem klinischen Ergebnis wären bei den Treg der intravenös behandelten Gruppe
eine geringere Anzahl peripher induzierter Treg zu erwarten. Diese Zellen besäßen eine
geringere Inhibitionspotenz auf die Proliferation von Lymphozyten sowie geringere Spiegel
von TGF-β, IL-10 und FoxP3.
Im nächsten Schritt wäre es interessant zu untersuchen, ob sich die Entwicklung der
injizierten
Treg
bei
Akzeptoren
und
Versagern
unterscheidet.
Hierfür
könnten
fluoreszenzmarkierte Treg in verschiedene juvenile Ratten injiziert und Keratoplastiken
durchgeführt werden. Postoperativ könnten die fluoreszierenden Treg aus Akzeptoren und
Versagern getrennt isoliert und erneut im Rahmen von Keratoplastiken in zwei Gruppen von
Ratten injiziert werden. Falls sich Unterschiede in der Transplantatüberlebenszeit beider
Gruppen einstellten, ließe sich erkennen, welche Rolle die alloantigenspezifische periphere
Induktion von Treg im Rahmen des Babyrattenmodelles spielt.
Im Unterschied zum Tierversuch mit syngenen Tieren kann man in der klinischen
Anwendung nicht auf Spender mit HLA-identische Treg zurückgreifen. Eine elegante
Möglichkeit, die Anzahl der Treg in vivo zu erhöhen, stellt die Isolation der Zellen aus dem
peripheren Blut mit anschließender in vitro Vermehrung und Retransfusion dar (June and
Blazar 2006). Diese Therapiemöglichkeit ist aktuell Gegenstand intensiver immunologischen
Forschung (Miyara, Wing et al. 2009). Vor einem routinemäßigen Einsatz müssen jedoch
noch einige Schlüsselfragen beantwortet werden (Sakaguchi, Miyara et al.). Zudem birgt
dieses Verfahren Risiken, da ein kleiner Anteil der adoptiv transferierten Treg die FoxP3Expression verlieren und sich zu Teff differenzieren kann (Komatsu, Mariotti-Ferrandiz et al.
2009). Außerdem besteht die Möglichkeit, dass ein zu hoher Spiegel an Treg die
Immunantwort auf Infektionserreger unterdrücket oder das Ausbreiten von Tumorzellen
ermöglicht (Riley, June et al. 2009).
4. Diskussion
78
Für die klinische Anwendung im Rahmen der Keratoplastik bleibt unklar, welche Mengen an
Treg injiziert werden müssten und ob diese Injektion einmalig oder zur Aufrechterhaltung
eines bestimmten Zellspiegels wiederholt erfolgen sollte. Für die Isolation von Treg zum
therapeutischen Einsatz beim Menschen müssen außerdem weitere Zellmarker verwendet
werden (Sakaguchi, Miyara et al.), da im Blut des Menschen im Gegensatz zu naiven
Nagetieren (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995) nur etwa 1-2% der CD4+CD25+ Zellen Treg
sind (Baecher-Allan, Brown et al. 2001).
Bei Beantwortung aller dieser Fragen lässt sich die immunologische Reaktion auf ein im
Kindesalter erhaltenes Hornhauttransplantat durch alleinige Therapie mit Treg nicht
verhindern, da, zumindest im Tierversuch, die NK-Zellen bei Abstoßungsreaktion
jugendlicher Empfängertiere eine große Rolle spielen (Schwartzkopff, Schlereth et al.).
5. Zusammenfassung
79
5. Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bedeutung regulatorischer T-Zellen in der
Keratoplastik am Babyrattenmodell. Während die Keratoplastik im Erwachsenenalter
heutzutage exzellente Resultate hervorbringt, liegen die Ergebnisse der Keratoplastik im
frühen Kindesalter noch deutlich zurück. Zur Erforschung der hierfür zugrundeliegenden
Mechanismen verwendeten wir ein Rattenmodell, bei dem junge Empfängertiere ein
Transplantat mit einer signifikant stärkeren Immunreaktion abstoßen, als ältere Tiere. Wir
stellten die Hypothese auf, dass der Treg Pool in jungen Tieren noch nicht voll ausgebildet ist,
was eine verstärkte Transplantatabstoßung bei juvenilen Empfängertieren bewirken könnte.
Hierbei stellte sich die Frage, ob ein geringerer Anteil der Treg am Lymphozytenpool oder
eine geringere inhibitorische Potenz juveniler Treg für die Unterschiede verantwortlich sein
könnte. Wir stellten fest, dass junge Tiere im Vergleich zu adulten Tieren signifikant weniger
Treg im Verhältnis zu T-Helferzellen besitzen. In Zellkulturversuchen zeigten wir, dass sich
Treg juveniler und adulter Ratten nicht signifikant in ihrer inhibitorischen Potenz auf die
Lymphozytenproliferation
unterscheiden.
Diese
Feststellung
wurde
durch
unsere
Untersuchung untermauert, dass sich juvenile und adulte Treg nicht signifikant in der
Expression des mit der inhibitorischen Funktion korrelierenden FoxP3 Genes unterscheiden.
Zum Ausgleich des relativen Treg-Mangels, welchen juvenile Tiere gegenüber adulten Tieren
aufweisen, führten wir einen adoptiven Zelltransfer im Rahmen von Keratoplastiken durch.
Hierfür isolierten wir naive Treg aus adulten Tieren und applizierten diese zunächst
systemisch, was nur eine geringe Verbesserung des Transplantatüberlebens bewirkte. Eine
subkonjunktivale Applikation der Treg führte jedoch zu einem signifikant verlängerten
Transplantatüberleben (p<0,01). Postoperativ ließen sich die injizierten Zellen ausschließlich
in den Milzen, nicht jedoch in den Hornhäuten oder den drainierenden Lymphknoten
nachweisen.
Schlussfolgerung: Eine Substitution mit adulten naiven Treg führt zu einer signifikanten
Verlängerung des Keratoplastik-Transplantatüberlebens bei juvenilen Ratten. Dieser Effekt ist
bei lokaler Applikation deutlich stärker, als bei systemischer Injektion. Wir schlussfolgern
daher, dass naive Treg im Rahmen der lokalen Applikation ein antigenspezifisches Priming
erhalten
und
regulatorische
Funktionen
erlangen,
wodurch
sie
die
Transplantatabstoßungsreaktion supprimieren. Naive Treg könnten daher als therapeutische
Option in der pädiatrischen Keratoplastik eingesetzt werden.
6. Abkürzungsverzeichnis
80
6. Abkürzungsverzeichnis
ACAID
Anterior-Chamber-Associated-Immune-Deviation
AF647
AlexaFluor® 647
AP
alkalische Phosphatase
APC
antigenpräsentierende Zelle
AT
Augentropfen
BCR
B-Zell Rezeptor
CD
cluster of differentiation
cDNA
complementary DANN
CFSE
Carboxyfluoreszein-Succinimidyl Ester
CO2
Kohlenstoffdioxid
Ct
threshold cycle
DMEM
Dubelcco’s Modified Essential Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonucleic acid
DTH
delayed type hypersensitivity
FACS
fluorescence activated cell sorting
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
FKS
fetales Kälberserum
FoxP3
forkhead-box-protein P3
FSC
forward scatter
gfp
green fluorescent protein
HCl
Chlorwasserstoff
HE
Hämalaun-Eosin
HLA
human leukocyte antigen
IDO
Indolamin-2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IPE
Iris Pigmentepithel
KCl
Kaliumchlorid
MgCl2
Magnesiumchlorid
6. Abkürzungsverzeichnis
81
MHC
major histocompability complex
MSH
Melanozyten stimulierendes Hormon
NK-Zelle
natürliche Killerzelle
OCT
optimal cutting temperature
PBS
Phosphat gepufferte Saline
PCR
polymerase chain reaction
PE
Phycoerythrin
RNA
ribonucleic acid
RPE
retinales Pigementepithel
Rpm
revolutions per minute
rt-PCR
real-time polymerase chain reaction
SSC
sideward scatter
Teff
T-Effektorzelle
TGF
transforming growth factor
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
Treg
regulatorische T-Zelle
VIP
vasoaktives intestinales Peptid
7. Literaturverzeichnis
82
7. Literaturverzeichnis
Aasuri, M. K., P. Garg, N. Gokhle and S. Gupta (2000). Penetrating keratoplasty in children.
Cornea 19(2): 140-4.
Al-Yousuf, N., I. Mavrikakis, E. Mavrikakis and S. M. Daya (2004). Penetrating keratoplasty:
indications over a 10 year period. Br J Ophthalmol 88(8): 998-1001.
Alldredge, O. C. and J. H. Krachmer (1981). Clinical types of corneal transplant rejection.
Their manifestations, frequency, preoperative correlates, and treatment. Arch Ophthalmol
99(4): 599-604.
Althaus, C. and R. Sundmacher (1996). Keratoplasty in newborns with Peters' anomaly. Ger J
Ophthalmol 5(1): 31-5.
Azuma, T., T. Takahashi, A. Kunisato, T. Kitamura and H. Hirai (2003). Human CD4+
CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions. Cancer Res 63(15): 4516-20.
Baecher-Allan, C., J. A. Brown, G. J. Freeman and D. A. Hafler (2001). CD4+CD25high
regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol 167(3): 1245-53.
Berchtold, P. and M. Seitz (1996). [Immunosuppression--a tightrope walk between iatrogenic
harm and therapy]. Schweiz Med Wochenschr 126(38): 1603-9.
Bettelli, E., Y. Carrier, W. Gao, T. Korn, T. B. Strom, M. Oukka, H. L. Weiner and V. K.
Kuchroo (2006). Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic
effector TH17 and regulatory T cells. Nature 441(7090): 235-8.
Birnbaum, F., J. Schwartzkopff, C. Scholz, A. Reis and T. Reinhard (2007). The new
malononitrilamide immunosuppressant FK778 prolongs corneal allograft survival in the rat
keratoplasty model. Eye (Lond) 21(12): 1516-23.
Callanan, D., J. Peeler and J. Y. Niederkorn (1988). Characteristics of rejection of orthotopic
corneal allografts in the rat. Transplantation 45(2): 437-43.
Cederbom, L., H. Hall and F. Ivars (2000). CD4+CD25+ regulatory T cells down-regulate costimulatory molecules on antigen-presenting cells. Eur J Immunol 30(6): 1538-43.
Chauhan, S. K., D. R. Saban, H. K. Lee and R. Dana (2009). Levels of Foxp3 in regulatory T
cells reflect their functional status in transplantation. J Immunol 182(1): 148-53.
7. Literaturverzeichnis
83
Chen, W., X. Liang, A. J. Peterson, D. H. Munn and B. R. Blazar (2008). The indoleamine
2,3-dioxygenase pathway is essential for human plasmacytoid dendritic cell-induced adaptive
T regulatory cell generation. J Immunol 181(8): 5396-404.
Chen, X., L. Liu, P. Yang, C. Wu, H. Jin, L. Xing, B. Li, H. Zhou, X. Huang and L. Zhu
(2006). Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is involved in promoting the development of
anterior chamber-associated immune deviation. Immunol Lett 107(2): 140-7.
Claerhout, I., P. Kestelyn, V. Debacker, H. Beele and G. Leclercq (2004). Role of natural
killer cells in the rejection process of corneal allografts in rats. Transplantation 77(5): 676-82.
Cousins, S. W., M. M. McCabe, D. Danielpour and J. W. Streilein (1991). Identification of
transforming growth factor-beta as an immunosuppressive factor in aqueous humor. Invest
Ophthalmol Vis Sci 32(8): 2201-11.
Cowden, J. W. (1990). Penetrating keratoplasty in infants and children. Ophthalmology 97(3):
324-8; discussion 328-9.
Cursiefen, C. (2007). Immune privilege and angiogenic privilege of the cornea. Chem
Immunol Allergy 92: 50-7.
Dana, M. R. (2004). Corneal antigen-presenting cells: diversity, plasticity, and disguise: the
Cogan lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci 45(3): 722-7; 721.
Dana, M. R., A. L. Moyes, J. A. Gomes, K. M. Rosheim, D. A. Schaumberg, P. R. Laibson,
E. J. Holland, A. Sugar and J. Sugar (1995). The indications for and outcome in pediatric
keratoplasty. A multicenter study. Ophthalmology 102(8): 1129-38.
Demirkiran, A., T. K. Hendrikx, C. C. Baan and L. J. van der Laan (2008). Impact of
immunosuppressive drugs on CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells: does in vitro evidence
translate to the clinical setting? Transplantation 85(6): 783-9.
Dujardin, H. C., O. Burlen-Defranoux, L. Boucontet, P. Vieira, A. Cumano and A. Bandeira
(2004). Regulatory potential and control of Foxp3 expression in newborn CD4+ T cells. Proc
Natl Acad Sci U S A 101(40): 14473-8.
Fehervari, Z. and S. Sakaguchi (2005). CD4+ regulatory cells as a potential immunotherapy.
Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360(1461): 1647-61.
Fontenot, J. D. and A. Y. Rudensky (2005). A well adapted regulatory contrivance: regulatory
T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat Immunol 6(4):
331-7.
7. Literaturverzeichnis
84
Freud, A. G. and M. A. Caligiuri (2006). Human natural killer cell development. Immunol
Rev 214: 56-72.
Fucs, R., J. T. Jesus, P. H. Souza Junior, L. Franco, M. Vericimo, M. Bellio and A. Nobrega
(2006). Frequency of natural regulatory CD4+CD25+ T lymphocytes determines the outcome
of tolerance across fully mismatched MHC barrier through linked recognition of self and
allogeneic stimuli. J Immunol 176(4): 2324-9.
George, A. J. and D. F. Larkin (2004). Corneal transplantation: the forgotten graft. Am J
Transplant 4(5): 678-85.
Ghosheh, F. R., F. A. Cremona, C. J. Rapuano, E. J. Cohen, B. D. Ayres, K. M.
Hammersmith, I. M. Raber and P. R. Laibson (2008). Trends in penetrating keratoplasty in
the United States 1980-2005. Int Ophthalmol 28(3): 147-53.
Gilliet, M. and Y. J. Liu (2002). Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40
ligand-activated plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med 195(6): 695-704.
Gonzalo, J. A., T. Delaney, J. Corcoran, A. Goodearl, J. C. Gutierrez-Ramos and A. J. Coyle
(2001). Cutting edge: the related molecules CD28 and inducible costimulator deliver both
unique and complementary signals required for optimal T cell activation. J Immunol 166(1):
1-5.
Gordon, S. and F. O. Martinez Alternative activation of macrophages: mechanism and
functions. Immunity 32(5): 593-604.
Graca, L., S. Thompson, C. Y. Lin, E. Adams, S. P. Cobbold and H. Waldmann (2002). Both
CD4(+)CD25(+) and CD4(+)CD25(-) regulatory cells mediate dominant transplantation
tolerance. J Immunol 168(11): 5558-65.
Griffith, T. S., T. Brunner, S. M. Fletcher, D. R. Green and T. A. Ferguson (1995). Fas ligandinduced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science 270(5239): 1189-92.
Han, G. M., B. Zhao, S. Jeyaseelan and J. M. Feng (2009). Age-associated parallel increase of
Foxp3(+)CD4(+) regulatory and CD44(+)CD4(+) memory T cells in SJL/J mice. Cell
Immunol 258(2): 188-96.
He, Y. G., J. Ross and J. Y. Niederkorn (1991). Promotion of murine orthotopic corneal
allograft survival by systemic administration of anti-CD4 monoclonal antibody. Invest
Ophthalmol Vis Sci 32(10): 2723-8.
7. Literaturverzeichnis
85
Herbort, C. P., M. Matsubara, M. Nishi and M. Mochizuki (1989). Penetrating keratoplasty in
the rat: a model for the study of immunosuppressive treatment of graft rejection. Jpn J
Ophthalmol 33(2): 212-20.
Hoffmann, F. and T. Pahlitzsch (1989). Predisposing factors in corneal graft rejection. Cornea
8(3): 215-9.
Holtkamp, G. M., A. Kijlstra, R. Peek and A. F. de Vos (2001). Retinal pigment epitheliumimmune system interactions: cytokine production and cytokine-induced changes. Prog Retin
Eye Res 20(1): 29-48.
Hori, J. and J. Y. Niederkorn (2007). Immunogenicity and immune privilege of corneal
allografts. Chem Immunol Allergy 92: 290-9.
Hori, S., T. Nomura and S. Sakaguchi (2003). Control of regulatory T cell development by the
transcription factor Foxp3. Science 299(5609): 1057-61.
Ing, J. J., H. H. Ing, L. R. Nelson, D. O. Hodge and W. M. Bourne (1998). Ten-year
postoperative results of penetrating keratoplasty. Ophthalmology 105(10): 1855-65.
Itoh, M., T. Takahashi, N. Sakaguchi, Y. Kuniyasu, J. Shimizu, F. Otsuka and S. Sakaguchi
(1999). Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and
suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic selftolerance. J Immunol 162(9): 5317-26.
Jager, M. J. (1992). Corneal Langerhans cells and ocular immunology. Reg Immunol 4(3):
186-95.
Janeway, C., Travers P.,
Walport M., Shlomchik M. (2009). Immunologie 7. Auflage,
Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin
June, C. H. and B. R. Blazar (2006). Clinical application of expanded CD4+25+ cells. Semin
Immunol 18(2): 78-88.
Kang, S. M., Q. Tang and J. A. Bluestone (2007). CD4+CD25+ regulatory T cells in
transplantation: progress, challenges and prospects. Am J Transplant 7(6): 1457-63.
Kanski, J. (2008). Klinische Ophthalmologie 6. Auflage, Urban& Fischer, München - Jena
Kaplan, H. J. (2007). Anatomy and function of the eye. Chem Immunol Allergy 92: 4-10.
Kaplan, H. J. and J. W. Streilein (1977). Analysis of immunologic privilege within the
anterior chamber of the eye. Transplant Proc 9(1): 1193-5.
7. Literaturverzeichnis
86
Karim, M., C. I. Kingsley, A. R. Bushell, B. S. Sawitzki and K. J. Wood (2004). Alloantigeninduced CD25+CD4+ regulatory T cells can develop in vivo from CD25-CD4+ precursors in
a thymus-independent process. J Immunol 172(2): 923-8.
Kaufman PL, A. A. (2003). Adler's Physiology of the Eye, St. Louis, Mosby
Khodadoust, A. A. and A. M. Silverstein (1972). Studies on the nature of the privilege
enjoyed by corneal allografts. Invest Ophthalmol 11(3): 137-48.
Kirwan, S. E. and D. N. Burshtyn (2007). Regulation of natural killer cell activity. Curr Opin
Immunol 19(1): 46-54.
Knisely, T. L., J. Hosoi, R. Nazareno and R. D. Granstein (1994). The presence of
biologically significant concentrations of glucocorticoids but little or no cortisol binding
globulin within aqueous humor: relevance to immune privilege in the anterior chamber of the
eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 35(10): 3711-23.
Komatsu, N., M. E. Mariotti-Ferrandiz, Y. Wang, B. Malissen, H. Waldmann and S. Hori
(2009). Heterogeneity of natural Foxp3+ T cells: a committed regulatory T-cell lineage and an
uncommitted minor population retaining plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A 106(6): 1903-8.
Larkin, D. F., R. A. Alexander and I. A. Cree (1997). Infiltrating inflammatory cell
phenotypes and apoptosis in rejected human corneal allografts. Eye 11 ( Pt 1): 68-74.
Lim, H. W., P. Hillsamer, A. H. Banham and C. H. Kim (2005). Cutting edge: direct
suppression of B cells by CD4+ CD25+ regulatory T cells. J Immunol 175(7): 4180-3.
Liu, G., H. Ma, L. Qiu, L. Li, Y. Cao, J. Ma and Y. Zhao Phenotypic and functional switch of
macrophages induced by regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in mice. Immunol Cell Biol.
Lowin, B., M. Hahne, C. Mattmann and J. Tschopp (1994). Cytolytic T-cell cytotoxicity is
mediated through perforin and Fas lytic pathways. Nature 370(6491): 650-2.
Lyons, A. B. (2000). Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric
measurement of CFSE dye dilution. J Immunol Methods 243(1-2): 147-54.
Mayer, K., T. Reinhard, A. Reis, T. Niehues, F. H. Claas and R. Sundmacher (2003).
Differential contribution of natural killer cells to corneal graft rejection in 3-week-old versus
mature rats. Transplantation 76(3): 578-82.
Medawar, P. B. (1948). Immunity to homologous grafted skin; the fate of skin homografts
transplanted to the brain, to subcutaneous tissue, and to the anterior chamber of the eye. Br J
Exp Pathol 29(1): 58-69.
7. Literaturverzeichnis
87
Mergler, S. and U. Pleyer (2007). The human corneal endothelium: new insights into
electrophysiology and ion channels. Prog Retin Eye Res 26(4): 359-78.
Misra, N., J. Bayry, S. Lacroix-Desmazes, M. D. Kazatchkine and S. V. Kaveri (2004).
Cutting edge: human CD4+CD25+ T cells restrain the maturation and antigen-presenting
function of dendritic cells. J Immunol 172(8): 4676-80.
Miyara, M., K. Wing and S. Sakaguchi (2009). Therapeutic approaches to allergy and
autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansion. J Allergy Clin
Immunol 123(4): 749-55; quiz 756-7.
Moretta, A., C. Bottino, M. C. Mingari, R. Biassoni and L. Moretta (2002). What is a natural
killer cell? Nat Immunol 3(1): 6-8.
Nagahama, K., E. Nishimura and S. Sakaguchi (2007). Induction of tolerance by adoptive
transfer of Treg cells. Methods Mol Biol 380: 431-42.
Nicholls, S. M., B. B. Bradley and D. L. Easty (1991). Effect of mismatches for major
histocompatibility complex and minor antigens on corneal graft rejection. Invest Ophthalmol
Vis Sci 32(10): 2729-34.
Niederkorn, J. Y. (1990). Immune privilege and immune regulation in the eye. Adv Immunol
48: 191-226.
Niederkorn, J. Y. (2001). Mechanisms of corneal graft rejection: the sixth annual Thygeson
Lecture, presented at the Ocular Microbiology and Immunology Group meeting, October 21,
2000. Cornea 20(7): 675-9.
Niederkorn, J. Y., C. Stevens, J. Mellon and E. Mayhew (2006). CD4+ T-cell-independent
rejection of corneal allografts. Transplantation 81(8): 1171-8.
Nomura, M., K. M. Plain, N. Verma, C. Robinson, R. Boyd, S. J. Hodgkinson and B. M. Hall
(2006). The cellular basis of cardiac allograft rejection. IX. Ratio of naive CD4+CD25+ T
cells/CD4+CD25- T cells determines rejection or tolerance. Transpl Immunol 15(4): 311-8.
Ochando, J. C., A. C. Yopp, Y. Yang, A. Garin, Y. Li, P. Boros, J. Llodra, Y. Ding, S. A.
Lira, N. R. Krieger and J. S. Bromberg (2005). Lymph node occupancy is required for the
peripheral development of alloantigen-specific Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol
174(11): 6993-7005.
Peter H.-H., P. W. J. (1996). Klinische Immunologie 2. Auflage, Urban&Schwarzenberg,
München-Wien-Baltimore
7. Literaturverzeichnis
88
Peters, J. H., L. B. Hilbrands, H. J. Koenen and I. Joosten (2008). Ex vivo generation of
human alloantigen-specific regulatory T cells from CD4(pos)CD25(high) T cells for
immunotherapy. PLoS One 3(5): e2233.
Pleyer, U. (1997). [Immune reaction after penetrating keratoplasty. Immunobiology,
prevention and therapy]. Ophthalmologe 94(12): 933-50.
Rahman, I., M. C. Huang, F. Carley, M. C. Hillarby, G. T. Vasileiadis and A. Tullo (2009).
The influence of donor and recipient factors in allograft rejection of the human cornea. Eye.
Reidy, J. J. (2001). Penetrating keratoplasty in infancy and early childhood. Curr Opin
Ophthalmol 12(4): 258-61.
Reinhard, T., D. Bohringer, J. Enczmann, G. Kogler, S. Mayweg, P. Wernet and R.
Sundmacher (2003). HLA class I and II matching improves prognosis in penetrating normalrisk keratoplasty. Dev Ophthalmol 36: 42-9.
Reinhard, T., D. Bohringer, J. Enczmann, G. Kogler, S. Mayweg, P. Wernet and R.
Sundmacher (2004). Improvement of graft prognosis in penetrating normal-risk keratoplasty
by HLA class I and II matching. Eye (Lond) 18(3): 269-77.
Reinhard, T., D. Bohringer, D. Huschen and R. Sundmacher (2002). [Chronic endothelial cell
loss of the graft after penetrating keratoplasty: influence of endothelial cell migration from
graft to host]. Klin Monbl Augenheilkd 219(6): 410-6.
Riley, J. L., C. H. June and B. R. Blazar (2009). Human T regulatory cell therapy: take a
billion or so and call me in the morning. Immunity 30(5): 656-65.
Rizzolo, L. J. (2007). Development and role of tight junctions in the retinal pigment
epithelium. Int Rev Cytol 258: 195-234.
Roncarolo, M. G. and M. Battaglia (2007). Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to
self antigens and alloantigens in humans. Nat Rev Immunol 7(8): 585-98.
Roncarolo, M. G., M. K. Levings and C. Traversari (2001). Differentiation of T regulatory
cells by immature dendritic cells. J Exp Med 193(2): F5-9.
Sakaguchi, S., M. Miyara, C. M. Costantino and D. A. Hafler FOXP3+ regulatory T cells in
the human immune system. Nat Rev Immunol 10(7): 490-500.
Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M. Itoh and M. Toda (1995). Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).
7. Literaturverzeichnis
89
Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J
Immunol 155(3): 1151-64.
Salisbury, J. D. and B. M. Gebhardt (1981). Blood group antigens on human corneal cells
demonstrated by immunoperoxidase staining. Am J Ophthalmol 91(1): 46-50.
Schwartzkopff, J., M. Berger, F. Birnbaum, D. Bohringer and T. Reinhard (2009).
Accelerated Corneal Graft Rejection in Baby Rats. Br J Ophthalmol.
Schwartzkopff, J., L. Bredow, S. Mahlenbrey, D. Boehringer and T. Reinhard Regeneration of
corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Mol Vis 16:
2368-75.
Schwartzkopff, J., S. L. Schlereth, M. Berger, L. Bredow, F. Birnbaum, D. Bohringer and T.
Reinhard NK cell depletion delays corneal allograft rejection in baby rats. Mol Vis 16: 192835.
Shevach, E. M. (2001). Certified professionals: CD4(+)CD25(+) suppressor T cells. J Exp
Med 193(11): F41-6.
Shevach, E. M. (2002). CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nat
Rev Immunol 2(6): 389-400.
Smith-Garvin, J. E., G. A. Koretzky and M. S. Jordan (2009). T cell activation. Annu Rev
Immunol 27: 591-619.
Smyth, M. J., M. W. Teng, J. Swann, K. Kyparissoudis, D. I. Godfrey and Y. Hayakawa
(2006). CD4+CD25+ T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer.
J Immunol 176(3): 1582-7.
Sonoda, Y. and J. W. Streilein (1993). Impaired cell-mediated immunity in mice bearing
healthy orthotopic corneal allografts. J Immunol 150(5): 1727-34.
Streilein, J. W. (2003). Ocular immune privilege: therapeutic opportunities from an
experiment of nature. Nat Rev Immunol 3(11): 879-89.
Streilein, J. W., S. Cousins and J. S. Williamson (1990). Ocular molecules and cells that
regulate immune responses in situ. Int Ophthalmol 14(5-6): 317-25.
Suchin, E. J., P. B. Langmuir, E. Palmer, M. H. Sayegh, A. D. Wells and L. A. Turka (2001).
Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J
Immunol 166(2): 973-81.
7. Literaturverzeichnis
90
Sugita, S., T. F. Ng, J. Schwartzkopff and J. W. Streilein (2004). CTLA-4+CD8+ T cells that
encounter B7-2+ iris pigment epithelial cells express their own B7-2 to achieve global
suppression of T cell activation. J Immunol 172(7): 4184-94.
Taams, L. S., J. M. van Amelsfort, M. M. Tiemessen, K. M. Jacobs, E. C. de Jong, A. N.
Akbar, J. W. Bijlsma and F. P. Lafeber (2005). Modulation of monocyte/macrophage function
by human CD4+CD25+ regulatory T cells. Hum Immunol 66(3): 222-30.
Tang, Q., K. J. Henriksen, M. Bi, E. B. Finger, G. Szot, J. Ye, E. L. Masteller, H. McDevitt,
M. Bonyhadi and J. A. Bluestone (2004). In vitro-expanded antigen-specific regulatory T
cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med 199(11): 1455-65.
Taylor, A. W., J. W. Streilein and S. W. Cousins (1992). Identification of alpha-melanocyte
stimulating hormone as a potential immunosuppressive factor in aqueous humor. Curr Eye
Res 11(12): 1199-206.
Taylor, A. W., J. W. Streilein and S. W. Cousins (1994). Immunoreactive vasoactive
intestinal peptide contributes to the immunosuppressive activity of normal aqueous humor. J
Immunol 153(3): 1080-6.
Tham, V. M. and R. L. Abbott (2002). Corneal graft rejection: recent updates. Int Ophthalmol
Clin 42(1): 105-13.
Thornton, A. M., C. A. Piccirillo and E. M. Shevach (2004). Activation requirements for the
induction of CD4+CD25+ T cell suppressor function. Eur J Immunol 34(2): 366-76.
Thornton, A. M. and E. M. Shevach (1998). CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med 188(2):
287-96.
Torres, P. F., A. F. De Vos, R. van der Gaag, B. Martins and A. Kijlstra (1996). Cytokine
mRNA expression during experimental corneal allograft rejection. Exp Eye Res 63(4): 45361.
Vajpayee, R. B., M. Ray, A. Panda, N. Sharma, H. R. Taylor, G. V. Murthy, G. Satpathy and
R. M. Pandey (1999). Risk factors for pediatric presumed microbial keratitis: a case-control
study. Cornea 18(5): 565-9.
van der Tweel, J. (1991). ImmunologieSpektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH,
Vanathi, M., A. Panda, S. Vengayil, Z. Chaudhuri and T. Dada (2009). Pediatric keratoplasty.
Surv Ophthalmol 54(2): 245-71.
7. Literaturverzeichnis
91
Vignali, D. A., L. W. Collison and C. J. Workman (2008). How regulatory T cells work. Nat
Rev Immunol 8(7): 523-32.
Vollmar, A., Dingermann T. (2005). Immunologie 1. Auflage, Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart
Wahlestedt, C., B. Beding, R. Ekman, O. Oksala, J. Stjernschantz and R. Hakanson (1986).
Calcitonin gene-related peptide in the eye: release by sensory nerve stimulation and effects
associated with neurogenic inflammation. Regul Pept 16(2): 107-15.
Wiesel, T. N. (1982). Postnatal development of the visual cortex and the influence of
environment. Nature 299(5884): 583-91.
Wilbanks, G. A. and J. W. Streilein (1990). Characterization of suppressor cells in anterior
chamber-associated immune deviation (ACAID) induced by soluble antigen. Evidence of two
functionally and phenotypically distinct T-suppressor cell populations. Immunology 71(3):
383-9.
Williams, K. A., M. A. White, J. K. Ash and D. J. Coster (1989). Leukocytes in the graft bed
associated with corneal graft failure. Analysis by immunohistology and actuarial graft
survival. Ophthalmology 96(1): 38-44.
Wing, K., Z. Fehervari and S. Sakaguchi (2006). Emerging possibilities in the development
and function of regulatory T cells. Int Immunol 18(7): 991-1000.
Wood, K. J. and S. Sakaguchi (2003). Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat Rev
Immunol 3(3): 199-210.
Workman, C. J., A. L. Szymczak-Workman, L. W. Collison, M. R. Pillai and D. A. Vignali
(2009). The development and function of regulatory T cells. Cell Mol Life Sci 66(16): 260322.
Xia, G., J. He and J. R. Leventhal (2008). Ex vivo-expanded natural CD4+CD25+ regulatory
T cells synergize with host T-cell depletion to promote long-term survival of allografts. Am J
Transplant 8(2): 298-306.
Xia, G., J. He, Z. Zhang and J. R. Leventhal (2006). Targeting acute allograft rejection by
immunotherapy with ex vivo-expanded natural CD4+ CD25+ regulatory T cells.
Transplantation 82(12): 1749-55.
Xia, G., M. Shah and X. Luo (2009). Prevention of allograft rejection by amplification of
Foxp3(+)CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. Transl Res 153(2): 60-70.
7. Literaturverzeichnis
92
Yamada, J., I. Kurimoto and J. W. Streilein (1999). Role of CD4+ T cells in immunobiology
of orthotopic corneal transplants in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 40(11): 2614-21.
Yang, L. L., S. R. Lambert, M. J. Lynn and R. D. Stulting (1999). Long-term results of
corneal graft survival in infants and children with peters anomaly. Ophthalmology 106(4):
833-48.
Zamiri, P., S. Sugita and J. W. Streilein (2007). Immunosuppressive properties of the
pigmented epithelial cells and the subretinal space. Chem Immunol Allergy 92: 86-93.
Zinkernagel, R. M. and P. C. Doherty (1974). Restriction of in vitro T cell-mediated
cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system.
Nature 248(450): 701-2.
Zirm, E. K. (1989). Eine erfolgreiche totale Keratoplastik (A successful total keratoplasty).
1906. Refract Corneal Surg 5(4): 258-61.
8. Anhang
93
8. Anhang
8.1. Design der PCR-Primer
8.1.1. Das FoxP3 Gen
1 CGTTTCGGCAGCTCCTCTGCCGTTATCCAGCCTGCCTCAGACAAGAACCTGATGCCCAAC
61 CCAAGGCCAGCTAAGCCTATGGCTCCTTCCTTGGCCCCTGGCCCGTCCCCAGGAGGCTTG
121 CCAAGCTGGAAGACTGCGCCCAAGGGCTCAGAACTCCTAGGGACCAGGGGTCCTGGGGGA
181 CCCTTCCAAGGCCGGGACCTGCGAAGTGGGGCCCACACCTCCTCTTCTTCCTTGAACCCC
241 CTGCCACCATCACAGCTGCAGCTGCCTACAGTGCCCCTAGTCATGGTGGCACCCTCTGGG
301 GCCCGACTAGGCCCCTCACCGCACCTGCAGGCACTTCTCCAGGACAGACCACACTTTATG
361 CATCAGCTCTCCACTGTAGACGCACATGGCCACACCCCTGTGCTACAAGTGCGCCCACTG
421 GACAACCCAGCGATGATCGGCCTCCCACCGCCTACTGCTGCCACTGGAGTCTTCTCCCTC
481 AAGGCCCGGCCTGGCCTGCCACCTGGGATCAATGTGGCCAGTCTGGAATGGGTGTCCAGG
541 GAGCCGGCTCTACTCTGCACCTTCCCACGCTCAGGTACACCCAGGAAAGACAGCAACCTT
601 CTGGCTGCACCACAAGGATCCTACCCACTGCTGGCAAACGGAGTCTGCAAGTGGCCGGGT
661 TGTGAGAAGGCCTTCGAGGAGCCGGGAGAGTTTCTCAAGCACTGCCAAGCAGATCACCTC
721 TTGGATGAGAAGGGCAAGGCCCAGTGCCTCCTCCAGAGAGAAGTGGTGCAGTCTCTGGAG
781 CAGCAGCTGGAGCTGGAAAAGGAGAAGCTGGGAGCTATGCAGGCCCACCTGGCTGGGAAG
841 ATGGCATTGACAAAAGCTCCACCTGTGGCCTCAGTGGACAAGAGCTCCTGCTGCCTCGTA
901 GCCACCAGCACCCAGGGCAGCGTCCTCCCGGCCTGGTCTAGTCCCCGGGAAGCTTCAGAC
961 AGCTTGTTTGCTGTGCGGAGACACCTCTGGGGAAGCCATGGAAACAGCACCTTTCCAGAG
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
1021 TTCTTCCACAACATGGACTACTTCAAGTACCATAATATGCGGCCCCCTTTCACCTATGCC
>>> *******************************************************
1081 ACCCTCATCCGATGGGCCATCCTGGAAGCTCCAGAGAGGCAGAGGACACTCAATGAAATC
*********************************************
1141 TACCATTGGTTCACACGCATGTTCGCCTACTTCAGAAACCACCCCGCCACCTGGAAGAAT
1201 GCCATCCGCCACAACCTGAGCCTGCACAAGTGCTTTGTGCGAGTGGAGAGTGAGAAGGGA
<<<<<<<<<
1261 GCAGTGTGGACCGTAGATGAATTTGAGTTTCGCAAGAAGAGGAGCCAACGCCCCAGCAAG
<<<<<<<<<<<
1321 TGCTCCAACCCCTGCCCTTGACCTCAAAACCAAGAAAACATGGACGGGGGCCAAAACATG
8. Anhang
94
8.1.2. Struktur der Primer für die PCR
FoxP3 5’-AAACAGCACCTTTCCAGAGTTC-3’
5’-GTCCACACTGCTCCCTTCTC-3’
Aktin
5‘-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3‘
5‘-CGGTGAGGATCTTCATGAGG-3‘
9. Lebenslauf
95
9. Lebenslauf
Die Seite 95 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Ist deshalb nicht Bestandteil der OnlineVeröffentlichung
10. Danksagung
96
10. Danksagung
Mein Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Thomas Reinhard für die
Möglichkeit in seiner Abteilung promovieren zu können.
Ich danke Herrn PD Dr. med. Matthias Siepe für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. med. Johannes Schwartzkopff für die Vergabe
des spannenden Themas und die gute Betreuung und Zusammenarbeit während der gesamten
Zeit bedanken. In den vielen Stunden, die wir zusammen im Labor, bei Besprechungen und
im Operationsaal verbrachten, wurde ich von seiner Begeisterung für die wissenschaftliche
Arbeit angesteckt.
Ich möchte mich herzlich bei Yvonne Kern, die durch Ihre Hilfsbereitschaft und Kompetenz
den „Mittelpunkt des Hornhautlabors“ bildet, für Ihre Unterstützung bei der täglichen
Laborarbeit bedanken.
Zudem möchte ich mich bei allen anderen Mitgliedern und Doktoranden des Hornhautlabors
für die unvergessliche und produktive Zusammenarbeit bedanken.
Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern und Großeltern bedanken, die mir das Studium
ermöglichten, mir stets zur Seite standen und mich unterstützten.
Speziell möchte ich meiner lieben Marianne von ganzem Herzen danken, die stets für mich da
war und mit viel Liebe, Geduld und Freude das Korrekturlesen der Arbeit übernahm.