Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Universitätsklinik Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann Differenzierung neonataler naiver T-Helferzellen in der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Andreas Bongartz aus Düsseldorf 2008 Dekan: Prof. Dr. G. Muhr 1. Referent: Prof. Dr. U. Schauer 2. Referent: Prof. Dr. A. Bufe Tag der Mündlichen Prüfung: 25.06.2009 ABSTRACT Bongartz Andreas Differenzierung neonataler naiver T-Helferzellen in der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen Problem Die Faktoren, die eine Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu T-Helferzellen vom Typ Th1 bzw. vom Typ Th2 beeinflussen, sind in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung gewesen. Dabei konnten sowohl im Mausmodell als auch in humanen Zellkulturmodellen wichtige Einflussfaktoren ermittelt werden, unter anderem Art und Dosis des Antigens, Art der Antigenaufnahme, genetische Faktoren und das vorherrschende Zytokinmilieu. Allerdings sind die Ergebnisse aus Mausmodellen nur begrenzt auf die Verhältnisse beim Menschen übertragbar und bisherige Ergebnisse aus humanen Zellkulturmodellen kamen häufig unter relativ unphysiologischen Bedingungen zu Stande, z.B. in allogenen Kultursystemen oder unter Verwendung exogener Zytokine. Im Rahmen dieser Arbeit sollte in einem autologen Zellkultursystem und unter Verwendung möglichst physiologischer Stimuli die Differenzierung neonataler T-Helferzellen untersucht werden. Methode Vorversuche zeigten das Vorhandensein von HLA-DR-positiven Zellen in der Gruppe der CD45RA-positiven Zellen. Diese Zellen konnten erfolgreich depletiert werden, so dass für die autologe Zellkultur CD45RApositive, HLA-DR-negative Zellen zusammen mit dendritischen Zellen verwendet wurden, die aus Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchtet wurden. Die Zellkulturen wurden je nach Versuchsansatz mit IL-2, IL-7, Lipopolysaccharid (LPS) oder dem Superantigen TSST stimuliert. Die Differenzierung der TZellen wurde durch Messung der intrazellulären Zytokinbildung mittels Durchflußzytometrie ermittelt. Dabei dienten die charakteristischen Zytokine IFN-γ und IL-4 als Marker für Th1- bzw. Th2-Antworten. Ergebnis T-Zellen ohne Stimulation zeigten in der autologen Zellkultur nach 7 Tagen kein Überleben mehr. Durch Einsatz der Zytokine IL-2 oder IL-7 konnten die Zellen am Leben erhalten werden. Die Zellen zeigten unter dieser Stimulation eine Th2-Differenzierung. Durch Einsatz des Superantigens TSST-1 konnte gezielt die Gruppe der Vβ2-positiven Zellen stimuliert werden. Unter Einsatz von TSST-1 waren auch Th1-differenzierte Zellen nachweisbar und es konnten eine hohe TSST-Konzentration und die Anwesenheit von LPS als wichtige Einflussfaktoren für eine Th1-Differenzierung identifiziert werden. Untersuchungen zur Kinetik der Differenzierung zeigten, dass der Anteil IFN-γ-bildender Zellen an Tag 3 am größten ist und dann schnell wieder abnimmt. IL-4-bildende Zellen sind in geringer Zahl ab dem zweiten Tag vorhanden. Unter niedrigen TSST-Konzentrationen steigt ihr Anteil ab dem sechsten Tag stark an. Diskussion Es wurde ein autologes Zellkultursystem etabliert, mit dem unter Einsatz definierter Zelltypen und Stimuli sowohl die Erzeugung von Th1- als auch von Th2-Zellen möglich ist. Dieses Modell bietet Möglichkeiten zur Untersuchung des Einflusses pathogener Faktoren auf die Differenzierung von T-Helferzellen. Widmung Diese Arbeit ist meiner Familie gewidmet. Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 10 1.1 T-Zellen 1.1.1 Einteilung der T-Zellen 1.1.2 T-Helferzellen 1.1.3 Effekte von Th1- und Th2-Zellen 1.1.4 Nachweis der T-Zell-Differenzierung 10 12 13 14 15 1.2 Antigenpräsentierende Zellen 1.2.1 Dendritische Zellen 1.2.2 Anzucht dendritischer Zellen aus Stammzellen 16 16 18 1.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit allogenen oder autologen Zellen und primäre Immunantwort 18 1.4 Besonderheiten des neonatalen Immunsystems 19 1.5 Staphylokokkentoxine wirken als Superantigene 20 1.6 Fragestellung 23 2 PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN 24 2.1 Probanden 24 2.2 Magnetische Zellseparation (MACS) 24 2.3 Isolierung hämatopoetischer Stammzellen 26 2.4 Anzucht dendritischer Zellen 27 2.5 Isolierung CD45RA-positiver Zellen 28 2.6 Isolierung naiver T – Zellen 29 2.7 Kokultur der T-Zellen mit dendritischen Zellen 29 2.8 Durchflußzytometrie 30 2.9 Messung der intrazellulären Zytokinproduktion 34 2.10 Herstellernachweis 35 3 3.1 3.2 ERGEBNISSE 38 Das Überleben von T-Zellen in Kokultur mit autologen dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli 38 T-Zellen zeigen nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 eine Th2Differenzierung 39 5 3.3 3.4 3.5 Die Fraktion der CD45RA-positiven Zellen enthält neben naiven TZellen auch HLA-DR-positive antigenpräsentierende Zellen 41 Th1-Antwort und Th2-Antwort erreichen ihr Maximum zu verschiedenen Zeitpunkten 43 Das Ausmaß der IFN-γγ-Produktion ist abhängig von der TSSTKonzentration 45 3.6 TSST stimuliert Vβ β2-positive Zellen stärker als Vβ β2-negative Zellen zur Bildung von IFN-γγ 45 3.7 Die Expression von Vβ β2 nach Stimulation mit TSST ist abhängig von der eingesetzten TSST-Dosis 46 3.8 LPS ist ein wichtiger Stimulus für die Bildung von IFN-γγ 47 3.9 Restimulationen mit TSST erhöhen die Anzahl IFN-γγ-produzierender Zellen nur gering 48 3.10 Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin stimulieren die Produktion von IFN-γγ und unterdrücken die Produktion von IL-4 49 4 52 4.1 DISKUSSION Das Überleben von T-Zellen in der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli 53 4.2 Die Th2-Differenzierung ist ein „Grundzustand“ neonataler T-Zellen, aber eine Th1-Antwort ist auslösbar 54 4.3 Die Differenzierung zu Th1-Zellen ist abhängig von der Anwesenheit dendritischer Zellen. Th2-Zellen lassen sich auch ohne dendritische Zellen erzeugen. 56 4.4 Effekte von LPS auf die Differenzierung zu Th1- und Th2-Zellen 59 4.5 NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen können über sezernierte Zytokine die Differenzierung naiver T-Helferzellen beeinflussen 61 Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Superantigen-Dosis 63 4.7 Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Dauer der Kultur 65 4.8 Unterschiede zwischen Vβ β2-positiven und Vβ β2-negativen T-Zellen 67 4.9 Einfluss von Nachstimulationen mit dendritischen Zellen, LPS und TSST 69 4.10 Effekte von Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin 71 4.11 Weitere Einflussfaktoren 73 4.6 6 4.12 Perspektiven / Klinische Aspekte 73 5 ZUSAMMENFASSUNG 75 6 LITERATURVERZEICHNIS 76 7 DANKSAGUNG 8 LEBENSLAUF 7 Abkürzungsverzeichnis CD Cluster of Differentiation CD40L CD40-Ligand DC Dendritische Zelle DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure FCS Fetal Calf Serum, fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC Forward Scatter GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor HBSS Hanks Balanced Salt Solution HEPES 2-(N-Hydroxyethylpiperazil).-2-Ethansulfonsäure HLA Humanes Leukozyten-Antigen ICAM Intercellular Cell Adhesion Molecule IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin LFA Lymphocyte-Function-associated Antigen LPS Lipopolysaccharid MACS Magnet-assoziierte Zellsortierung MHC Major Histocompatibility Complex mRNA messenger-Ribonukleinsäure NFAT Nuclear factor of activated T-cells NK-Zelle natürliche Killerzelle PE Phycoerythrin PKC Protein-Kinase C PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat RS-Virus Respiratory Syncytial Virus RT-PCR real-time-Polymerase-chain-reaction SCF Stammzellfaktor SSC Side Scatter SE Staphylokokken-Enterotoxin TCR T-Zell-Rezeptor TGF Transforming Growth Factor TNF Tumor-Nekrose Faktor Th-Zelle T-Helferzelle TLR Toll-like Rezeptor TSST Toxic Shock Syndrome Toxin 8 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Methoden zum Nachweis einer Th1- oder Th2-Differenzierung 15 Tabelle 2: Unterschiede zwischen Superantigen und konventionellen Peptidantigenen 22 Tabelle 3: Oberflächenmarker nach Depletion von HLA-DR- und CD45R0positiven Zellen 42 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Aufbau und schematischer Strahlengang im FACScanDurchlußzytometer 32 Abbildung 2: Dot Plot-Darstellung der durchflußzytometrischen Messergebnisse. 33 Abbildung 3: Histogramm-Darstellung der Messergebnisse. 33 Abbildung 4: Zellzahl nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 und einer Kulturdauer von sieben Tagen. 39 Abbildung 5: Anteil IFN-γγ-bildender Zellen in Abhängigkeit von der eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur. 40 Abbildung 6: Anteil IL-4-bildender Zellen in Abhängigkeit von der eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur. 40 Abbildung 7: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, nicht HLA-DR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der Kultur. 43 Abbildung 8: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, HLADR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der Kultur. 43 Abbildung 9: Kinetik der IFN-γγ-produzierenden Zellen. 44 Abbildung 10: Kinetik der IL-4-produzierenden Zellen. 44 Abbildung 11: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der TSST-Konzentration und von der Vβ β2-Expression 45 Abbildung 12: Abhängigkeit des Anteils IL-4-produzierender Zellen von der TSST-Konzentration und von der Vβ β2-Expression 46 Abbildung 13: Anteil Vβ β2-positiver und Vβ β2-negativer Zellen in Abhängigkeit von der TSST-Konzentration 47 Abbildung 14: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der Anwesenheit von LPS 48 Abbildung 15: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST auf den Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen 49 Abbildung 16: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST auf den Anteil IL-4-produzierender Zellen 49 Abbildung 17: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin und Anwesenheit von dendritischen Zellen 50 Abbildung 18: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin bei Abwesenheit von dendritischen Zellen 50 Abbildung 19: Vergleich der Kinetik IFN-γγ-produzierender Zellen mit und ohne Nachstimulation durch PMA und Ionomycin 51 9 1 Einleitung In der zweiten Hälfte des letzen Jahrhunderts wurden wesentliche Grundlagen der Immunantwort erforscht. Frank Macfarlane Burnet postulierte in den Fünfzigerjahren erstmals die Theorie der klonalen Selektion. In den frühen Sechzigerjahren entdeckte James Gowans, dass die Lymphozyten, deren Funktion bis dahin unbekannt war, die Grundeinheiten der klonalen Selektion darstellen. Die Grundforderungen der Theorie der klonalen Selektion lassen sich in vier Kernaussagen zusammenfassen: 1. Jeder Lymphozyt weist einen einzigen Rezeptortyp von einmaliger Spezifität auf. 2. Die Wechselwirkung zwischen einem fremden Molekül und einem Rezeptor, der dieses Molekül mit hoher Affinität bindet, aktiviert den entsprechenden Lymphozyten. 3. Die ausdifferenzierten Effektorzellen, die von diesem aktivierten Lymphozyten abstammen, tragen Rezeptoren derselben Spezifität wie die Ursprungszelle. 4. Lymphozyten mit Rezeptoren für körpereigene Moleküle werden bereits in einer frühen Entwicklungsphase der Lymphozyten beseitigt und sind deshalb im Repertoire der reifen Zellen nicht mehr vorhanden. In den folgenden Jahrzehnten wurden die Lymphozyten und ihre Funktion zum Schwerpunkt der Forschung in der zellulären Immunologie (Gowans, 1996; Janeway et al., 2002). 1.1 T-Zellen Die T-Lymphozyten nehmen für die erworbene, zellvermittelte Immunantwort eine Schlüsselstellung ein. Ihr wichtigstes Merkmal ist der hochvariable T-ZellRezeptor, der mit den invarianten akzessorischen Ketten des Oberflächenmoleküls CD3 verbunden ist. Der T-Zell-Rezeptor selbst besteht aus 10 zwei verschiedenen Polypeptidketten, den T-Zell-Rezeptor-α und –β-Ketten. Diese sind miteinander durch eine Disulfidbrücke verbunden. Eine Minderheit der T-Zellen trägt einen anderen Typ des T-Zell-Rezeptors mit anderen Polypeptidketten, die mit γ und δ bezeichnet werden. Die Funktion dieser γ:δ-T-Zellen für die Immunantwort ist noch nicht vollständig geklärt. Sie kommen vermehrt in der Darmschleimhaut vor und scheinen bei der Entwicklung einer oralen, immunologischen Toleranz eine wichtige Rolle zu spielen. Im folgenden ist mit dem Begriff T-Zell-Rezeptor der α:β-Rezeptor gemeint. Jede Kette des T-Zell-Rezeptors setzt sich aus einer konstanten C-Region und einer variablen V-Region zusammen. Die nebeneinander liegenden variablen Domänen bilden die Antigenbindungsstelle. Der T-Zell-Rezeptor bindet Antigene nicht direkt, sondern erkennt kurze Peptidfragmente von Proteinen eines Pathogens, die an MHC-Moleküle auf der Oberfläche anderer Zellen gebunden sind. Bei diesen MHC-Molekülen handelt es sich um Glykoproteine, die durch die große Gengruppe des Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert werden und auf allen Körperzellen vorkommen. Dadurch ist die T-Zelle gezwungen, zur Aktivierung mit einer anderen Körperzelle zu interagieren. Erkannt wird dabei die zum T-Zell-Rezeptor passende Kombination aus Peptid und MHC-Komplex. Dieses Prinzip wird MHC-Restriktion genannt. Die MHC-Moleküle werden in zwei Klassen unterteilt. MHC-Moleküle der Klasse I präsentieren Peptide, die durch Abbau von Proteinen im Zytoplasma der Zelle entstanden sind. Diese Moleküle kommen auf allen kernhaltigen Zellen vor. Auf Zellen des Immunsystems werden sie besonders stark exprimiert. MHC-Moleküle der Klasse II präsentieren Peptide, die durch den Abbau in Vesikeln entstehen. Dies können zum Beispiel intravesikuläre Pathogene in Makrophagen sein oder extrazelluläre Pathogene und Toxine, die durch Endocytose aufgenommen werden. Die MHC-Moleküle der Klasse II sind nur auf Zellen des Immunsystems zu finden, insbesondere auf Zellen, die auf die Präsentation von Antigenen spezialisiert sind. Aber auch aktivierte T-Lymphozyten können MHC-Klasse IIMoleküle exprimieren (Janeway et al., 2002; Holländer et al., 2005). 11 1.1.1 Einteilung der T-Zellen Anhand anderer Oberflächenmoleküle können die T-Zellen in zwei Untergruppen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen unterteilt werden. So kennzeichnet CD4 T-Helferzellen, CD8 zytotoxische T-Zellen. Zytotoxische T-Zellen erkennen Antigene, die Zellen über MHC-Moleküle der Klasse I präsentieren. Die Folge ist eine Aktivierung der zytotoxischen T-Zelle, die den Zelltod der präsentierenden Zelle zur Folge hat. T-Helferzellen erkennen Antigene, die durch antigenpräsentierende Zellen über MHC-Moleküle der Klasse II präsentiert werden. In Folge der Aktivierung erlangen diese Zellen die Fähigkeit, weitere Zellen des Immunsystems zu aktivieren. Die CD4- bzw. CD8-Moleküle auf der TZell-Oberfläche dienen bei der Erkennung der MHC-Antigen-Komplexe als CoRezeptoren, die jeweils an unveränderliche Stellen des MHC-Komplexes binden. Dabei dient CD4 als Co-Rezeptor für MHC-Klasse-II-Moleküle und CD8 als CoRezeptor für MHC-Klasse-I-Moleküle. T-Helferzellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten, sind durch das Oberflächenmolekül CD45RA gekennzeichnet, und werden als naive T-Zellen bezeichnet. Nach Antigenkontakt proliferieren und differenzieren sie zu Effektor-TZellen, welche das Oberflächenmolekül CD45R0 tragen. Diese Isoform von CD45 kann sich mit dem T-Zell-Rezeptor zusammenlagern und die Antigenerkennung auf molekularer Ebene erleichtern. Teilweise entwickeln sich diese Effektorzellen zu Memory-T-Zellen weiter, die wiederum in Effektor-Gedächtniszellen und zentrale Gedächtniszellen unterschieden werden können. Diese Zellen können nach einer Zeit ohne Antigenkontakt den Oberflächenmarker CD45R0 wieder verlieren und erneut CD45RA exprimieren. Damit kann CD45RA nicht als alleiniges Kriterium für die Naivität von T-Zellen verwendet werden (Janeway et al, 2002; Holländer et al., 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurden allerdings T-Zellen aus Nabelschnurblut eingesetzt, die noch keinen Antigenkontakt hatten. In dieser Zellpopulation tragen 95% aller Zellen der Oberflächenmarker CD45RA, bei denen es sich unstrittig um naive Zellen handelt. 12 1.1.2 T-Helferzellen T-Helferzellen übernehmen zahlreiche steuernde Funktionen im Immunsystem. Anhand der gebildeten und sezernierten Zytokine lassen sich die T-Helferzellen in funktionell verschiedene Untergruppen unterteilen. Naive T-Helferzellen werden als Th0-Zellen bezeichnet. Dieser Zelltyp ist lediglich in der Lage, IL-2 zu bilden, das ein wichtiger Faktor für Wachstum und Proliferation der T-Zellen ist. Aus den Th0-Zellen entwickeln sich nach Aktivierung entweder Th1-Zellen, die als charakteristische Zytokine unter anderem IFN-γ, IL-2 und TNF-α bilden, oder Th2-Zellen, welche die charakteristischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-9 bilden. Ursprünglich wurde die Einteilung in Th1- und Th2-Zellen an T-Lymphozyten der Maus 1986 von Mosmann und Mitarbeitern entwickelt und in den folgenden Jahren weiter untersucht (Mosmann and Coffman, 1989). So konnten unter anderem die für die Differenzierung entscheidenden Signalwege und Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. So sind STAT-4 und T-bet verantwortlich für die Th1-Differenzierung, im Unterschied zur Th-Differenzierung, die durch STAT-6, GATA-3 und c-maf gesteuert wird (Szabo, 2003). Für die Differenzierung spielen Zytokine eine wesentliche Rolle. So fördern IL-12, IL-18 und IFN-γ über die oben genannten Transkriptionsfaktoren die Th1-Differenzierung (Schoenborn and Wilson, 2007), während die Th2-Differenzierung im wesentlichen von IL-4 abhängig ist (Le Gros et al., 1990). Daneben existieren verschiedene Arten regulatorischer T-Zellen. So wurde als weiterer Zelltyp die Th3-Zelle identifiziert, die charakteristisches Zytokin große Mengen TGF-β produziert (Weiner, 2001). Tr1-Zellen werden durch IL-10 induziert und regulieren die Immunantwort ihrerseits durch IL-10 (Roncarolo et al., 2001). Diese Zytokine können wiederum einen steuernden Einfluss auf die Differenzierung von Th1- und Th2-Zellen haben. Außerdem gibt eine Untergruppe CD4-positiver und CD25-negativer Zellen, die unter bestimmten Bedingungen CD4-positiv und CD25-positiv werden und als charakteristisches Merkmal den Transkriptionsfaktor Foxp3 aufweisen (Walker et al., 2003). Kürzlich wurde als weiterer Subtyp der Th-Zellen die IL-17-produzierende Th17Zelle klassifiziert (Harrington et al., 2005; Park et al., 2005). Th17-Zellen entwickeln sich unter dem Einfluss der Zytokine IL-6 und TGF-β. Ihre Effektorfunktionen sind noch unklar, aber sie scheinen eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen zu spielen. Das von ihnen gebildete IL-17 spielt eine 13 wichtige Rolle für die Mobilisierung und Neubildung neutrophiler Granulozyten und in der Abwehr extrazellulärer Bakterien- und Pilzinfektionen (Stockinger and Veldhoen, 2007). 1.1.3 Effekte von Th1- und Th2-Zellen Die Th1- bzw. Th2-Zellen haben einen wesentlichen Einfluss auf die weitere Immunantwort. Th1-Zellen vermitteln eine zellvermittelte Immunantwort, beispielsweise durch die Aktivierung von Makrophagen. Dieser Weg ist insbesondere bei der Abwehr intrazellulärer Erreger von Bedeutung. Th2-Zellen hingegen vermitteln über die Stimulation von antikörperbildenden B-Zellen eine humorale Immunantwort mit einer starken Antikörperproduktion. Für die Vermittlung der jeweiligen Effekte der T-Helferzellen spielen Zytokine eine entscheidende Rolle. So werden die makrophagenaktivierenden Effekte von Th1Zellen über IFN-γ und TNF-β vermittelt, wobei letzteres auch für die Hemmung von B-Zellen verantwortlich ist. Th2-Zellen hingegen sezernieren IL-4 und IL-5, die BZellen aktivieren, und IL-10, welches die Makrophagenaktivierung blockiert. Zahlreiche Zytokine der Th-2-Zellen können die Entstehung allergischer Reaktionen fördern. So werden IgE-Antikörper-Bildung (IL-4 und IL-13), Bildung eosinophiler Granulozyten (IL-5), Wachstum von Mastzellen (IL-4 und IL-10) und vermehrte Schleimproduktion (IL-9 und IL-13) über entsprechende Zytokine gesteuert. Doch auch für die Toleranz allogener Transplantate scheinen Th2Antworten eine wichtige Rolle zu spielen; ein Prinzip das insbesondere für die Aufrechterhaltung einer intakten Schwangerschaft von Bedeutung ist. Überschießende Th1-Antworten findet man hingegen häufig bei einer Reihe von Autoimmunerkrankungen, unter anderem bei Multipler Sklerose, Morbus Crohn und Typ-1-Diabetes. Die Aufklärung von Faktoren, die eine Th1- oder Th2-Antwort bevorzugen, könnte daher sowohl zur Aufklärung der Ätiologie der genannten Erkrankungen als auch bei der Entwicklung möglicher (präventiver) Therapien eine wichtige Rolle spielen (Janeway et al., 2002; Holländer et al, 2005; Murphy et al., 2000). 14 1.1.4 Nachweis der T-Zell-Differenzierung Zum Nachweis der Th1- bzw. Th2-Differenzierung wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, die jeweils typische Vor- und Nachteile bieten. Da die meisten Zytokine nur in kleinen Mengen gebildet werden und zum Teil nicht sezerniert werden, sondern direkt durch Zellkontakte von Zelle zu Zelle weitergegeben werden, gestaltet sich der Nachweis aus Überständen von Zellkulturen schwierig. Der intrazelluläre Nachweis von Zytokinen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper in der Durchflußzytometrie ermöglicht die Beurteilung der Differenzierung auf der Ebene einzelner Zellen und ist hoch sensitiv (Jung et al., 1993). Dieses Verfahren wurde daher in der vorliegenden Arbeit zur Beurteilung der Zytokinbildung durch T-Zellen verwendet. Tabelle 1: Methoden zum (nach Romagnani, 2000) Methode Klonierung Nachweis einer Th1- oder Th2-Differenzierung Vorteile Nachteile Zytokin-Profile einfach Hoher Arbeits- und nachweisbar Zeitaufwand; Messung spiegelt eher das Potenzial als das gegenwärtige Zytokinprofil wieder RT-PCR Hoch sensitiv, Möglichkeit der Hohes Risiko nicht spezifischer Untersuchung von Reaktionen; Möglichkeit von Gewebeproben transskribierten, aber nicht sezernierten Zytokinen; Charakterisierung des Zelltyps nicht möglich In situ Hybridisierung Charakterisierung des Zelltyps Höherer Arbeitsaufwand im möglich, Möglichkeit der Vergleich zur RT-PCR Untersuchung von Gewebeproben Immuncytochemie Charakterisierung des Zelltyps Nicht alle Zytokine nachweisbar möglich, Möglichkeit der (z.B. IL-4) Untersuchung von Gewebeproben ELIspot Relativ einfach anwendbar, Teilweise durch Nachweis niedriger Frequenzen Durchflußzytometrie überholt von Zielzellen Intrazelluläre Färbung und Relativ einfach; hoch sensitiv; Nur mit Zellsuspensionen Durchflußzytometrie erlaubt Nachweis der anwendbar Zytokinsynthese auf der Ebene einzelner Zellen 15 1.2 Antigenpräsentierende Zellen Um einen Lymphozyten zu aktivieren, muss wie bereits beschrieben das „passende“ Antigen in einer bestimmten Form präsentiert werden. Diese Aufgabe übernehmen professionelle antigenpräsentierende Zellen, die neben MHCMolekülen der Klasse I auch MHC-Moleküle der Klasse II tragen, und somit in der Lage sind, T-Helferzellen zu aktivieren. Für diese Aktivierung ist zusätzlich ein costimulierendes Signal notwendig. T-Zellen, denen lediglich ein MHC-AntigenKomplex ohne entsprechende Kostimulation präsentiert wird, können eine Toleranzentwicklung für das betreffende Antigen zeigen. Das wichtigste kostimulierende Signal wird über die sogenannten B7-Moleküle (CD80 und CD86) auf antigenpräsentierenden Zellen über den entsprechenden Rezeptor CD28 auf T-Zellen vermittelt. kostimulierende Nach Systeme der Aktivierung zum Tragen, der welche T-Zelle für kommen die weitere Steuerung und Aufrechterhaltung der initiierten Immunantwort eine wesentliche Rolle spielen, so zum Beispiel die Interaktion zwischen CD40 und CD40-Ligand. Während unter experimentellen Bedingungen mehrere verschiedene Zelltypen wie B- Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen in der Lage sind, diese Aufgabe zu übernehmen, sind in vivo die dendritischen Zellen die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen. Sie sind als einzige Zellen in der Lage, naive TZellen zu aktivieren. B-Lymphozyten und Makrophagen spielen eine Rolle bei der Aktivierung von Memory-T-Zellen (Janeway et al., 2002). 1.2.1 Dendritische Zellen Dendritische Zellen sind die stärksten Stimulatoren naiver T-Zellen. Bevor eine dendritische Zelle jedoch in der Lage ist, eine T-Zelle zu aktivieren, muss sie zunächst einen Reifungsprozess durchmachen. Die unreifen dendritischen Zellen findet man unter den Oberflächenepithelien und in den meisten parenchymatösen Organen. In der Haut werden sie als Langerhans-Zellen bezeichnet. In ihrem unreifen Zustand besitzen sie nur wenige MHC-Moleküle und keine kostimulierenden B7-Moleküle. Dendritische Zellen nehmen dort eine WächterFunktion war, indem sie vorhandene Krankheitserreger entdecken und aufnehmen. Ein wichtiger Mechanismus ist hierfür neben der Phagozytose, zu der 16 auch andere Zellen wie z.B. Makrophagen in der Lage sind, die Makropinozytose. Dabei werden extrazelluläre Antigene unspezifisch gemeinsam mit großen Mengen extrazellulärer Flüssigkeit aufgenommen. Bei einer Infektion wandern die dendritischen Zellen nach einer Antigenaufnahme zu den benachbarten Lymphknoten. Dabei verlieren sie die Fähigkeit zur Antigenaufnahme und synthetisieren stattdessen große Mengen neue MHC-Moleküle, mit denen sie Peptide der Krankheitserreger präsentieren (Signal 1). Außerdem exprimieren sie jetzt große Mengen an kostimulierenden B7-Molekülen (Signal 2) und Adhäsionsmolekülen. Dadurch werden sie zu optimalen Stimulatorzellen für TZellen. Für die Aktivierung und Reifung der dendritischen Zellen sind eine Vielzahl von Oberflächenmolekülen und Signalwegen bekannt. Neben Rezeptoren, die Pathogene binden, gehören dazu vor allem Rezeptoren für Komplement und Rezeptoren für die Phagozytose wie der Mannose-Rezeptor. Da manche Krankheitserreger über Mechanismen verfügen, mit denen sie eine Phagozytose verhindern können, stellt die Makropinozytose einen entscheidenden Mechanismus dar, um auch diese Antigene den T-Zellen präsentieren zu können. Bei der Aktivierung der dendritschen Zelle nach Erregerkontakt spielt der Signalweg, der über Rezeptoren der Toll-like-Rezeptorfamilie vermittelt wird, eine besondere Rolle. So kann der Kontakt mit bakterieller DNA über TLR-9 und nachfolgende intrazelluläre Signalwege zur Produktion von Zytokinen wie IL-6, IL12, IL-18 und IFN-α sowie IFN-γ führen. Diese Zytokine und Interferone sind wiederum Auslöser einer verstärkten Expression co-stimulierender Moleküle und haben auch direkten Einfluss auf die Th-Zell-Differenzierung (Signal 3). Von besonderer Bedeutung ist auch der Signalweg über TLR-4, der durch Lipopolysaccharid, einen Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, aktiviert wird. Durch die Aktivierung dieses Signalwegs kommt es ebenfalls zur vermehrten Expression von B7-Molekülen und zur Bildung von TNF-α, welches die Wanderung von dendritischen Zellen zum Lymphknoten auslöst (Banchereau and Steinman, 1998; Mellman and Steinman, 2001; Lanzavecchia and Sallusto, 2001; de Jong et al, 2005). 17 1.2.2 Anzucht dendritischer Zellen aus Stammzellen Für in vitro Untersuchungen von dendritischen Zellen werden relativ hohe Zellzahlen benötigt, die aus peripherem Blut nicht in ausreichender Menge gewonnen werden können. Der wesentliche Durchbruch in der Erforschung dendritischer Zellen gelang durch die Möglichkeit, diese Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen anzuzüchten. Als Quelle für diese Stammzellen können Knochenmark, Nabelschnurblut und peripheres Blut dienen, wobei Nabelschnurblut den Vorteil der relativ leichten Verfügbarkeit zusammen mit einem relativ hohen Stammzellanteil von ca. 1,3% bietet. Diese hämatopoetischen Stammzellen können über das Oberflächenmolekül CD34 identifiziert werden. Durch magnetische Zellseparation können sie in ausreichender Reinheit aus den Zellen des Nabelschnurblutes isoliert werden. Anschließend lassen sich in der Zellkultur durch Einsatz der Wachstumsfaktoren GM-CSF und TNF-α dendritische Zellen mit charakteristischem morphologischem Aussehen und typischen Oberflächenmolekülen anzüchten. Es handelt sich hier allerdings nicht um eine einheitliche Population, sondern um ein heterogenes Gemisch verschiedener Arten und Entwicklungsstufen von dendritischen Zellen (Caux et al., 1992). Durch den Einfluss verschiedener Zytokine und Wachstumsfaktoren können aus diesen Zellen entweder dendritische Zellen, Monozyten oder Makrophagen entstehen. Durch ein modifiziertes Protokoll, bei dem neben GM-CSF und TNF-α auch Stammzellfaktor (SCF / c-kit-Ligand) eingesetzt wird, lässt sich der Anteil dendritischer Zellen um den Faktor 100 bis 1000 steigern (Szabolcs et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen verwendet, die anhand ihrer Oberflächenmoleküle charakterisiert wurden und die einen hohen Anteil dendritischer Zellen aufwiesen. 1.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit allogenen oder autologen Zellen und primäre Immunantwort Die Untersuchung von T-Zell-Antworten in der Zellkultur von T-Lymphozyten mit bestimmten Stimulatorzellen wird als „gemischte Lymphozytenreaktion“ (MLR) bezeichnet. Dabei können T-Zellen und Stimulatorzellen von verschiedenen Spendern stammen (allogene MLR) oder von demselben Spender (autologe 18 MLR). Typisch für die allogene MLR ist eine Reaktivität eines großen Teils der TZellen (etwa 1 bis 10%), die durch die unterschiedlichen MHC-Moleküle von Spender und Empfänger ausgelöst wird. Diese Alloreaktivität kann als in vitro Nachweis der Graft-versus-host-Reaktion in der Transplantationsmedizin angesehen werden. In der autologen MLR ist der Anteil reagierender Zellen geringer. Vergleicht man die Proliferation von T-Zellen anhand der Aufnahme der radioaktiv markierten Base Thymidin, so stimulieren allogene dendritische Zellen die T-Zellen etwa doppelt so stark wie autologe dendritische Zellen. Selbst in der autologen MLR sind dendritische Zellen allerdings noch in der Lage, eine Proliferation auszulösen, wenn sie im Verhältnis 1:100 zu den zu stimulierenden T-Zellen eingesetzt werden. Als Stimulatorzellen der MLR kommen neben dendritischen Zellen auch Makrophagen und Lymphozyten in Betracht. Vergleichende Untersuchungen haben gezeigt, dass sowohl in der allogenen wie in der autologen MLR dendritische Zellen die stärksten Stimulatorzellen sind. Im Gegensatz zu allen anderen Zellarten bilden dendritische Zellen mit T-Zellen Zellhaufen, die bereits lichtmikroskopisch in den Kulturen sichtbar sind und als „cluster“ bezeichnet werden (Kuntz-Crow and Kunkel, 1982; Steinman, 1991). Verwendet man in der autologen MLR dendritische Zellen und naive T-Zellen, so kann dieser Ansatz als in vitro-Modell der primären Immunantwort gesehen werden (Bartz, 2001). In diesem Modell ist es dann möglich, eine Vielzahl von Einflussfaktoren zu variieren und in ihren Auswirkungen zu beurteilen. Das in dieser Arbeit eingesetzte Modell entspricht der autologen MLR, bei der allerdings genau definierte Zelltypen zum Einsatz kamen, die durch vorhergehende Versuche bereits gut charakterisiert waren. 1.4 Besonderheiten des neonatalen Immunsystems Neugeborene zeigen eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen, die häufig einem noch nicht ausgereiften und voll funktionsfähigen Immunsystem zugeschrieben wird. Für antigenpräsentierende Zellen und für NK-Zellen wurde eine verminderte Aktivität beschrieben. Insbesondere die Fähigkeit zur Bildung von IL-12 durch 19 neonatale dendritische Zellen und neontale NK-Zellen scheint im Vergleich zu adulten Zellen vermindert zu sein, was die bei Neugeborenen geringer ausgeprägte Th1-Antwort erklärt. Möglicherweise wird die eingeschränkte Fähigkeit zur IL-12-Bildung bei Neugeborenen zumindest teilweise kompensiert durch eine im Vergleich zum Erwachsenen gesteigerte Bildung von IL-27 (Krumbiegel, Anthogalidis-Voss et al., 2007). Daneben bestehen Unterschiede insbesondere bei der Aktivierung und Differenzierung der T-Lymphozyten. So wurden eine verminderte Bildung von IL-2, verminderte Proliferationsraten, verminderte zytotoxische Aktivität, schlechte Fähigkeit zur Aktivierung von B-Zellen und eine veränderte Zytokinproduktion für neonatale T-Zellen beschrieben. Hierfür ist allerdings vermutlich vor allem der hohe Anteil CD45RA-positiver, naiver T-Zellen im Nabelschnurblut verantwortlich (Cohen et al. 1999). Insgesamt scheint eine Th2-Antwort leichter auslösbar zu sein als eine Th1-Antwort. Bis vor einigen Jahren wurde eine Th1-Antwort in neonatalen Zellen sogar für unmöglich gehalten und eine Th2-Antwort als „vorgegeben“ angesehen. Versuche am Tiermodell haben allerdings gezeigt, das unter bestimmten Voraussetzungen Th1-Antworten neonataler Zellen möglich sind, die dasselbe Ausmaß haben wie bei Erwachsenen (Adkins, 2000; Garcia, 2000). Da – wie beschrieben – ein verändertes Verhältnis von Th1- und Th2Zellen ein wichtiger Faktor in der Pathogenese vieler Erkrankungen ist, ist die Aufklärung der Faktoren, welche die Th-Zell-Differenzierung beeinflussen, ein wichtiges Ziel der immunologischen Forschung und wurde auch in dieser Arbeit untersucht. Von besonderem Interesse waren dabei die Faktoren, die eine Th1Differenzierung der neonatalen Zellen hervorrufen können. 1.5 Staphylokokkentoxine wirken als Superantigene Die Staphylokokkenenterotoxine A bis E (SEA – SEE) und das ebenfalls von Staphylokokken gebildete Toxic Shock Syndrome Toxin-1 (TSST-1) wirken als Superantigene. Neben den Staphylokokkentoxinen sind auch die StreptokokkenExotoxine A und C von Streptococcus pyogenes und das von Mycoplasma arthritidis gebildete Mykoplasma arthridis-Mitogen als bakterielle Superantigene bekannt. Daneben gibt es auch virale Superantigene, wie z.B. das durch den Retrovirus MMTV codierte Superantigen. 20 Bei den Staphylokokkenenterotoxinen und TSST-1 handelt es sich um Proteine mittlerer Größe mit einem Molekulargewicht zwischen 22 und 30 kDa. Für diese Toxine konnten Genom- und Aminosäuresequenz sowie die Kristallstruktur aufgeklärt werden. Während die SE sich in ihrer Struktur sehr ähnlich sind, ist TSST-1 etwas anders aufgebaut. TSST-1 besteht aus 194 Aminosäuren und ist damit etwas kürzer als die SE, z.B. SEA mit 233 Aminosäuren. Daneben fehlen auch die für die SE charakteristischen Cysteine und die Disulfid-Schleife. Sowohl die SE als auch TSST-1 weisen allerdings einen hohen Anteil an βFaltblattstrukturen und einen geringen Anteil an α-Helices auf. Dieser ähnliche Aufbau hat Einfluss auf das unten beschriebene Bindungsverhalten an den TCR und MHC-Klasse II-Moleküle. Werden Superantigene in kleinere Einheiten gespalten, verlieren sie daher ihre charakteristische biologische Aktivität. Im Unterschied zu gewöhnlichen Antigenen werden Superantigene von T-Zellen direkt erkannt, ohne dass sie zu Peptiden verarbeitet und durch MHC-Moleküle an der Antigenbindungsstelle präsentiert werden. Vielmehr binden Superantigene direkt an MHC-II-Moleküle und spezifische Regionen des T-Zell-Rezeptors außerhalb der Antigenbindungsstelle. Diese Bindungsstellen auf dem T-ZellRezeptor liegen für die verschiedenen Superantigene auf verschiedenen Teilen des variablen Teils der β-Kette (Vβ). So bindet beispielweise TSST-1 ausschließlich an Vβ2, während die Enterotoxine SEA-SEE jeweils zwei bis zehn verschiedene Vβ-Spezifitäten aufweisen. Bei der Bindung an die MHC-Klasse IIMoleküle wird von den meisten Superantigenen, so auch TSST-1, der HLA-DRIsotyp bevorzugt. Durch die Bindung des Superantigens an das MHC-II-Molekül und die spezifische Region des TCR kommt es zu einer antigenunabhängigen, polyklonalen, aber Vβ-selektiven T-Zell-Aktivierung. Dadurch kommt es zur Aktivierung einer großen Zahl von T-Zellen (Thomas et al., 2007; Bueno et al., 2007). Diese ist, wie bei konventionellen Antigenen, abhängig von kostimulierenden Molekülen, wie zum Beispiel der Interaktion zwischen B7 / CD28, die erforderlich ist, um die Expression von IL-2 zu induzieren (Fraser et al., 1992). Während durch die antigenabhängige T-Zellaktivierung 0,0001-0,01 % der TZellen aktiviert werden, können durch Superantigene 5-20% der T-Zellen aktiviert werden (Choi et al., 1990). Durch diese überschießende Immunreaktion kommt es zu einer massiven Freisetzung von Zytokinen, einer vermehrten Expression von 21 Adhäsionsmolekülen, zunächst extremer T-Zell-Proliferation mit nachfolgender Apoptose und T-Zell-Anergie (Marrack and Kappler, 1990; Krakauer, 1999). Die Folge dieser systemischen Entzündungsreaktion sind Symptome wie Fieber, Hypotension und Schock, welche sowohl durch die Staphylokokkenenterotoxine als auch durch TSST-1 ausgelöst werden können. Auch wird eine Beteiligung der Staphylokokkensuperantigene an der Pathogenese bestimmter Autoimmunerkrankungen und Arthritisformen diskutiert. So wurden beispielweise bei Patienten mit Kawasaki-Syndrom gehäuft TSST-1-bildende Staphylococcus aureus-Stämme nachgewiesen (Leung et al., 1993). Tabelle 2: Unterschiede zwischen Superantigenen und Peptidantigenen (Krakauer 1999; Florquin and Aaldering, 1997) konventionellen Superantigene Peptidantigene Aktive Konzentration 10-9 M 10-6 M Processing erforderlich Nein Ja Antigenspezifität Nein Ja MHC-Restriktion Nein Ja Co-stimululierende B7 / CD28 Signale LFA-1 / ICAM – 1 Anteil aktivierter Lymphozyten 5-20 % B7 / CD28 0,0001-0,01 % 22 1.6 Fragestellung Es sollten die Faktoren untersucht werden, welche die Differenzierung naiver TZellen zu Th1-Zellen und Th2-Zellen beeinflussen. Dazu sollten Kokulturen von naiven T-Zellen und dendritischen Zellen als antigenpräsentierende Zellen verwendet werden. Um eine Beeinflussung durch MHC-Inkompatibilitäten auszuschließen, sollten ausschließlich autologe Zellen verwendet werden. Im Einzelnen sollte geklärt werden, - ob eine Stimulation von T-Zellen durch dendritische Zellen auch ohne exogene Stimuli möglich ist. - welchen Einfluss die Anwesenheit bzw. die Abwesenheit von dendritischen Zellen als antigenpräsentierende Zellen hat. - welchen Einfluss der Zusatz des Endotoxins LPS durch die Aktivierung und Reifung dendritischer Zellen hat. - welchen Einfluss das Ausmaß der Aktivierung des T-ZellRezeptors durch Zusatz verschiedener Konzentration des Superantigens TSST-1 hat. - ob eine Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Dauer der Zellkultur besteht und wie der Anteil Zytokinbildender Zellen im zeitlichen Verlauf ist. - ob eine Restimulation der Zellkultur mit Superantigen und dendritischen Zellen die Anzahl und Verteilung zytokinbildender Zellen verändert. Unter verschiedenen Kulturbedingungen wurden dazu in den T-Zellen jeweils die Zytokine IFN-γ und IL-4 als Maß für die Differenzierung in Th1- und Th2- Zellen durchflußzytometrisch gemessen. 23 2 Probanden, Material und Methoden 2.1 Probanden Die verwendeten Nabelschnurblutproben stammten von Neugeborenen, die zwischen Juli 1998 und Februar 2001 im Augusta-Krankenhaus oder im St. Elisabeth-Hospital in Bochum geboren wurden. Als Ausschlusskriterien galten Frühgeburtlichkeit, Schwangerschaftskomplikationen sowie eine Hepatitis- oder HIV-Infektion der Mutter. Die Ethik-Kommision der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum hat der Durchführung der Studie zugestimmt. Die Eltern haben sich nach Aufklärung mit der Verwendung des Nabelschnurbluts einverstanden erklärt. 2.2 Magnetische Zellseparation (MACS) 2.2.1 Grundlagen Die Methode der magnetischen Zellseparation erlaubt es, aus einer heterogenen Zellpopulation auch kleine Zellmengen mit hoher Reinheit zu isolieren. Dabei werden die Zellen mit einem spezifischen paramagnetischen Antikörper markiert und über eine Trennsäule gegeben, die sich in einem Magnetfeld befindet. Die mit dem Antikörper magnetisch markierten Zellen verbleiben auf der Säule, die unmarkierten Zellen nicht. Nach dem Entfernen der Trennsäule aus dem Magnetfeld können die auf ihr zurückgebliebenen Zellen eluiert werden. 2.2.2 Selektionsstrategien Mit der magnetischen Zellseparation bestehen zwei Möglichkeiten zur Zellisolierung: die positive Selektion oder die negative Selektion (Depletion). Für diese beiden Selektionsmöglichkeiten werden verschiedene Trennsäulen mit unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten verwendet. Bei der positiven Selektion werden die Zielzellen mit Antikörpern markiert, die gegen Oberflächenmoleküle dieser Zellen gerichtet sind. Die so markierten Zellen verbleiben auf der Säule und 24 können nach Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld eluiert und aufgefangen werden. Bei der Depletion werden alle Zellen außer den Zielzellen mit Antikörpern markiert. Die nicht markierten Zellen werden aufgefangen, nachdem sie die Säule passiert haben. 2.2.3 Markierungsstrategien Grundsätzlich stehen zwei Möglichkeiten der Markierung einer Zielzelle zur Verfügung. Bei der direkten Markierung werden paramagnetische Antikörper gegen eine Antigenstruktur der Zielzelle eingesetzt. Zur indirekten Markierung werden nicht-paramagnetische Antikörper verwendet, die in einem zweiten Markierungsschritt mit paramagnetischen Antikörpern markiert werden, die gegen ein Epitop des ersten Antikörpers gerichtet sind. 2.2.4 Super-paramagnetische Antikörper Die verwendeten Antikörper bestehen aus sogenannten MicroBeads aus Eisenoxid und Polysacchariden, die an einen spezifischen Antikörper gebunden sind. Dadurch erhält dieser Antikörper paramagnetische Eigenschaften, das heißt, innerhalb eines starken Magnetfelds ist er selbst magnetisch, außerhalb des Magnetfeldes verliert er diese Eigenschaft wieder. In Zellkulturen zersetzen sich die Antikörper und beeinflussen weder Funktion noch Überlebensfähigkeit der Zellen. 2.2.5 Separierungseinheit Die Separierungseinheit besteht aus einem starken Dauermagneten und einer Trennsäule. Durch das Einbringen der Trennsäule in das Magnetfeld des Dauermagneten entstehen in der Matrix der Trennsäule äußerst starke lokale Magnetfelder. Bei Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld erfolgt eine schnelle Entmagnetisierung, so dass eine zügige Eluation markierter Zellen ermöglicht wird. 2.2.6 Isolierte Zellarten Mit der MACS wurden hämatopoetische Stammzellen, CD45RA-positive Zellen und naive T-Zellen aus Nabelschnurblut isoliert. 25 2.3 Isolierung hämatopoetischer Stammzellen 2.3.1 Gewinnung von Nabelschnurblut Das Nabelschnurblut wurde nach der Abnabelung des Neugeborenen aus der Vena umbilicalis der Plazenta entnommen und in sterile 50 ml Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss gegeben. Die Reagenzröhrchen enthielten 10 ml einer gerinnungs- und keimhemmenden Pufferlösung mit 20 % Heparin – Natrium (100 IE / ml), 1% HEPES – Puffer (1 M), 1% Penicillin / Streptomycin (10000 IE / ml, 10000 µg / ml) und 1% Amphotericin B (250 µg / ml) in HBSS. 2.3.2 Dichtegradientenzentrifugation Die Auftrennung der Zellen des Gesamtblutes erfolgte mittels Ficoll- Dichtegradientenzentrifugation. Bei dieser Methode werden die Erythrozyten und die polymorphkernigen Leukozyten aufgrund ihrer größeren Dichte von den mononukleären Zellen abgetrennt. Die mononukleären Zellen reichern sich an der Phasengrenze an und können dort abpipettiert werden. Zu diesen mononukleären Zellen gehören neben Lymphozyten und Monozyten auch die hämatopoetischen Stammzellen. Hierzu wurde das Nabelschnurblut mit HBSS im Verhältnis 1:4 verdünnt, mit 15 ml Ficoll-Lösung (spezifische Dichte 1.077 g / ml) unterschichtet und 20 min bei 400 g zentrifugiert. Anschließend wurde der zellreiche Interphasenring abgenommen und zweimal für 10 Minuten bei 300 g mit HBSS gewaschen. Zur Ermittlung der Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer wurde eine Probe entnommen und mit Türkscher Lösung angefärbt. 2.3.3 Magnetische Zellseparation Die Isolierung der hämatopoetischen Stammzellen aus den mononukleären Zellen erfolgte mittels indirekter Markierung der CD34-positiven Zellen durch 8 magnetische Zellseparation. Dazu wurden die Zellen in 300 µl Puffer / 10 Zellen aufgenommen, mit je 100 µl humanen IgG und 100 µl Hapten-konjugierten CD34Antikörper je 108 Zellen versetzt und 15 min bei 4-6°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 10 min bei 300 g gewaschen, in 400 µl Puffer / 108 Zellen 26 aufgenommen und mit 100 µl gegen das Hapten des CD34-Antikörpers gerichteten MACS MicroBeads je 108 Zellen markiert. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei 4-6°C wurden die Zellen erneut bei 300 g für 10 min gewaschen. Die Zellen wurden dann in 500 µl Puffer / 108 Zellen resuspendiert und über eine MS-Trennsäule nach Herstellervorschrift sortiert. Zur Erzielung einer hohen Reinheit der Sortierung wurden anschließend die Positiv-Fraktion der ersten Sortierung über eine zweite MS-Trennsäule erneut sortiert. 2.3.4 Einfrieren der CD34-negativen Zellen Die CD34-negativen Zellen wurden bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Dazu wurden die Zellen bei 300 g über 10 Minuten abzentrifugiert und in einem Einfriermedium resuspendiert. Dieses Einfriermedium bestand aus 45% FCS, 44% RPMI-1640, 10% DMSO und 1% Penicillin / Streptomycin. Die Zellsuspension wurde in ein vorgekühltes KryoTube pipettiert und sofort bei –80°C eingefroren. Nach ein bis drei Tagen wurden die KryoTubes in flüssigen Stickstoff überführt. 2.4 Anzucht dendritischer Zellen Die Anzucht dendritischer Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen erfolgte modifiziert nach der von Caux et al. beschriebenen Methode (Caux et al., 1992). Aus den isolierten CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen wurde eine Probe entnommen. Nach Anfärbung mit Türkscher Lösung wurde in einer FuchsRosenthal-Zählkammer die Zellzahl ermittelt und dann auf eine Konzentration von 1,5 x 105 / ml Kulturmedium eingestellt. Zusammensetzung des Kulturmediums: RPMI 1640 VLE mit 10% fötalem Kälberserum (FCS 417 L) und 4% einer nährstoffreichen und keimhemmenden Zusatzlösung. Diese Zusatzlösung bestand aus: 27 L-Glutamin 200mM, Natriumpyruvat 100mM, nicht-essentiellen Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, LSerin), Penicillin 10000 IE / ml und Streptomycin 10000 µg / ml, gemischt im Verhältnis 1:1:1:0,5:0,5. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Multiwell-24-Loch-Flachbodenplatten. Als Stimuli wurden GM-CSF in einer Konzentration von 100 ng / ml, TNF-α einer Konzentration von 2,5 ng / ml und SCF in einer Konzentration von 100 ng / ml eingesetzt. Der Ansatz wurde 14 Tage in einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Zellkulturen regelmäßig mikroskopisch kontrolliert und je nach Ausmaß der Proliferation wurde die Kultur geteilt und neues Kulturmedium zugegeben. An Tag 8 wurden die Kulturen mit GM-CSF und TNF-α in den oben angegebenen Konzentrationen nachstimuliert. An Tag 14 wurden die Zellen geerntet und die Zellzahl in der NeubauerZählkammer bestimmt. 2.5 Isolierung CD45RA-positiver Zellen Die Isolierung CD45RA-positiver Zellen erfolgte mittels positiver MACS. Die eingefrorenen CD34-negativen Zellen aus Nabelschnurblut wurden aufgetaut und mit HBSS einmal 10 min bei 300 g und einmal 10 min bei 200 g gewaschen. Eine Probe wurde entnommen, mit Türkscher Lösung gefärbt und die Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden die Zellen erneut bei 300 g für 10 min gewaschen und der Überstand vollständig entfernt. Die Zellen wurden in 80 µl HBSS und 20 µl CD45RA MicroBeads je 107 Zellen resuspendiert und 15 min bei 4-6°C inkubiert. Dann wurden sie erneut mit HBSS bei 300 g für 10 min gewaschen, in 1 ml HBSS aufgenommen und über eine LS-Trennsäule nach Vorschrift des Herstellers sortiert. Die Negativ-Fraktion wurde verworfen, die Positiv-Fraktion mit 5 ml Kulturmedium von der Säule gespült und die Zellzahl bestimmt. 28 2.6 Isolierung naiver T – Zellen Die Isolierung von naiven T-Zellen erfolgte durch Depletion von CD45R0- und HLA-DR-positiven Zellen aus CD34-negativen Zellen aus Nabelschnurblut. Außerdem wurden Glycophorin A-positive Zellen depletiert, um eine Störung der durchflußzytometrischen Messung durch verunreinigende Normoblasten zu verhindern. Die Zellen wurden wie oben beschrieben aufgetaut, gewaschen und gezählt. Die Zellen wurden dann in 40 µl HBSS, 20 µl CD45R0 Microbeads, 20 µl HLA-DR MicroBeads und 20 µl Glycophorin A MicroBeads je 107 Zellen resuspendiert und 15 min bei 4-6°C inkubiert. Anschließend wurden sie erneut mit HBSS bei 300 g für 10 min gewaschen, in 1 ml HBSS aufgenommen und über eine BS-Trennsäule mit 23 G Nadel nach Vorschrift des Herstellers sortiert. Die Negativ-Fraktion wurde aufgefangen und die Zellzahl bestimmt. 2.7 Kokultur der T-Zellen mit dendritischen Zellen Die Kokulturen von T-Zellen und dendritischen Zellen wurden in Multiwell-24-LochFlachbodenplatten angesetzt. Es wurde das beschriebene Kulturmedium eingesetzt. Die Zellzahlen wurden auf 2,5x105 T-Zellen und 2,5x104 dendritische Zellen je ml Medium eingestellt. Die Zellen wurden für eine Dauer von 3 bis 7 Tagen in einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank kultiviert. Zur Überprüfung des Einflusses exogener Stimuli wurden verschiedene Substanzen in unterschiedlichen Mengen eingesetzt: GM-CSF: 100 ng / ml LPS: 10 µg / ml TSST: 100 ng / ml; 10 ng / ml; 1 ng / ml; 0,1 ng / ml IL-2: 5 ng / ml; 1 ng / ml; 0,2 ng / ml IL-7: 5 ng / ml; 1 ng / ml; 0,2 ng / ml Zur Stimulation mit LPS wurden zunächst die dendritischen Zellen mit GM-CSF für 2 h im Brutschrank inkubiert, dann wurden die T-Zellen, LPS und gegebenenfalls weitere Stimuli hinzugefügt. 29 Teilweise wurden die Kulturen einen Tag vor der Messung erneut mit dendritischen Zellen und exogenen Stimuli in den oben angegebenen Mengen restimuliert. In allen Versuchsreihen wurden jeweils mindestens drei voneinander unabhängige Experimente mit Zellen von verschiedenen Probanden durchgeführt. 2.8 Durchflußzytometrie 2.8.1 Grundlagen Das Prinzip der Durchflußzytometrie ist die simultane Messung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel, wobei sie hintereinander in einem Flüssigkeitsstrom angeordnet einzeln untersucht werden. Dabei werden gleichzeitig Streulicht- und Fluoreszenzsignale an einzelnen Zellen gemessen. 2.8.2 Aufbau und Funktionsweise eines Durchflußzytometers Voraussetzung zur Messung ist das Vorliegen der Probe als Einzelzellsuspension in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter. Zur Analyse wird die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension über eine Stahlkapillare durch Überdruck der aus Quarzglas bestehenden Meßküvette zugeführt. Die Zellen passieren, vom einem Hüllstrom umgeben, den Analysepunkt. Der Hüllstrom dient dazu, den Probenstrom im Zentrum der Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, dass die Zellen hintereinander einzeln zum Fokussierung). Analysepunkt Am gelangen Analysepunkt (Prinzip kreuzt ein der hydrodynamischen Lichtstrahl (Laser) den Flüssigkeitsstrahl. Nur Zellen, die diesen Punkt treffen, werden korrekt erfasst, analysiert und klassifiziert. Lichtstreuung ist ein physikalischer Prozess, bei dem die Zelle mit dem einfallenden Lichtstrahl interagiert und dabei die Richtung des Lichts verändert, wobei die Wellenlänge nicht verändert wird. Zur Lichtstreuung tragen folgende Zelleigenschaften bei: - Zellgröße - Zellmembran 30 - Zellkern - intrazelluläre granuläre Bestandteile. Das Licht wird nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut. Der größte Anteil wird in Vorwärtsrichtung gestreut und als Vorwärtsstreulicht bezeichnet (engl. forward scatter, FSC). Es stellt hauptsächlich ein Maß für die Zellgröße dar. Das im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hängt von der Zelldichte und der Granularität, nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab. Es wird als Rechtwinkelstreulicht bezeichnet (engl. side scatter, SSC). Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes. Dabei absorbieren Fluoreszenzfarbstoffe Licht eines bestimmten Wellenlängen- spektrums und emittieren Licht, das ebenfalls ein charakteristisches Spektrum aufweist. Für die Durchflußzytometrie werden Farbstoffe mit ähnlichem Absorptionsspektrum und unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet. Das eingesetzte Durchflußzytometer FACScan erzeugt mit einem 15mW Argon-Laser Licht der Wellenlänge 488 nm. Es wurden als Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Tricolor verwendet. Passiert eine Zelle den Analysepunkt, so werden Signale von Vorwärtsstreulicht, Rechtwinkelstreulicht und den Fluoreszenzen gemessen. Dies geschieht mittels Photodioden und Photoröhren. Das gemessene Signal wird verstärkt und durch einen Analog-Digital-Wandler in ein digitales Signal umgewandelt. 31 Abbildung 1: Aufbau Durchlußzytometer und schematischer Strahlengang im FACScan- 2.8.3 Datenaufnahme und Datenauswertung Das Durchflußcytometer FACScan ist so konzipiert, dass es bis zu fünf Eigenschaften (2 Lichtstreuungen und 3 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen simultan messen kann. Da zur quantitativen Auswertung immer nur zwei Eigenschaften gleichzeitig korrelierbar sind, werden die Daten in der sogenannten 5-Parameter-LIST-MODE-Datenaufnahme gespeichert. Dabei werden alle fünf Eigenschaften der gemessenen Zelle als Liste hintereinander gespeichert. Dadurch können bei der Auswertung alle gemessenen Korrelationen berücksichtigt werden und durch das Setzen von „Fenstern“ ist es möglich, nur Zellen mit bestimmten Eigenschaften in die Auswertung einzubeziehen (Nebe, 1996). Die Daten wurden mit der Software CellQuest, entweder als Histogramm oder als korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot Plot) aufgetragen, ausgewertet. 32 Abbildung 2: Dot Plot-Darstellung der durchflußzytometrischen Messergebnisse. Im ersten Bild sind FSC und SSC gegeneinander aufgetragen. Die Region R1 entspricht den auszuwertenden Lymphozyten. Im zweiten Bild sind in Region R2 die Vβ2-negativen und in Region R3 die Vβ2-positiven Zellen erkennbar. Im dritten Bild sind im linken oberen Quadranten die IFN-γ-bildenden Vβ2-positiven Zellen dargestellt. Abbildung 3: Histogramm-Darstellung der Messergebnisse. Auf der x-Achse ist die Fluoreszenz-Intensität dargestellt, auf der y-Achse die Anzahl der gezählten Zellen. Der Bereich M1 stellt die IFN-γ-bildenden Zellen dar. 33 2.9 Messung der intrazellulären Zytokinproduktion Die Messung der intrazellulären Zytokinproduktion erfolgte durchflußzytometrisch mittels fluoreszenzmarkierter Zytokin-Antikörper in Anlehnung an die von Jung et al. entwickelte Methode (Jung et al., 1993; Prussin and Metcalfe 1995). Hierbei werden die intrazellulären Transportprozesse durch Monensin oder Brefeldin A unterbrochen, was zu einer Anreicherung von Zytokinen im Golgi-Apparat führt. Brefeldin A bietet gegenüber Monensin den Vorteil einer geringeren Zelltoxizität, erfordert aber längere Paraformaldehydlösung Inkubationszeiten. fixiert und die Die Zellen Zellmembran mit werden mit Saponin-Puffer permeabilisiert. Anschließend erfolgt die Färbung der intrazellulären Zytokine. Zu einem Teil der Zellkulturen wurde 18 h vor Ernte der Zellen Brefeldin A (10 µg / ml) zugegeben, der andere Teil wurde 5 h vor der Ernte der Zellen mit PMA (10 ng / ml) und Ionomycin (1µM) stimuliert und die intrazellulären Transportprozesse wurden mit Monensin (2,5 µM / ml) unterbrochen. Die Zellkulturen wurden geerntet und die Zellen einmal mit HBSS bei 300 g gewaschen. Die Zellen wurden für 10 min in Paraformaldehydlösung (4%) fixiert und zweimal für 10 min bei 300 g gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einer Pufferlösung aus 0,1 % Saponin und 0,01 M Hepes in HBSS aufgenommen und dreimal 100 µl in ein FACS-Röhrchen pipettiert. Die Färbung der Zytokine erfolgte mit 10 µl anti-IL-4-PE oder anti-IFN-γ-PE. Außerdem wurden mit 3,5 µl anti-CD3-Tricolor und (bei Ansätzen mit TSST-Stimulation) 5 µl anti-TCR-Vβ2-FITC die entsprechenden Oberflächenantigene markiert, um bei der durchflußzytometrischen Messung die T-Zellen zu identifizieren. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei 4-6°C wurden die Zellen für 5 min bei 200 g gewaschen und zur Messung in 250 µl HBSS aufgenommen. 34 2.10 Herstellernachweis Aminosäuren, nicht-essentielle: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0293 Amphotericin B: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2612 Anti-CD3-Tricolor: Caltag, Burlingame (USA), Best.-Nr. MHCD0306 Anti-IFN-γ-FITC: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 18904 A Anti-IFN-γ-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 554552 Anti-IL-4-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 554516 Anti-Mouse IgG1-FITC: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 20604 A Anti-Mouse IgG1-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 20605 A Anti-TCR-Vβ2-FITC: Immunotech / Beckman Coulter, Krefeld, Best.-Nr. IM 2407 Brefeldin A: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. B 7651 Brutschrank: Heraeus, Düsseldorf CD1a-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-051-001 CD34-Isolation-Kit: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-701 CD45RA-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-045-901 CD45R0-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-001 CellQuest Softwarepaket: Becton Dickinson, Heidelberg Dimethylsulfoxid (DMSO): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. D 5879 Durchflußzytometer: FACScan®, Becton Dickinson, Heidelberg EDTA: Fluka Chemika, Buchs (CH), Best.-Nr. 03609 FACS-Röhrchen: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg FcR-Blocking-Reagenz: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-059901 Ficoll Separating Solution: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 6115 Fötales Kälberserum (FCS) 417 L: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. S 0115 Glycophorin A-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-050501 Hanks balanced salts: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. H 4891 Hanks balanced salt solution (HBSS): Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 2045 Heparin-Natrium (Vetren ® 200): Promonta, Hamburg, Reg.-Nr. V767 HEPES-Pufferlösung: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 1613 HLA-DR-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-101 35 Ionomycin Calciumsalz: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. I 0643 Interleukin 2 (IL-2): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-2 Interleukin 4 (IL-4): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-4 Interleukin 7 (IL-7): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-7 KryoTube®: Nunc, Wiesbaden, Best.-Nr. 363401 Leucomax (GM-CSF): Novartis, Nürnberg, Zul.-Nr. 25756.02.00 L-Glutamin: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0282 Lipopolysaccharid (LPS): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. L 3880 MACS Multistand®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Magnet Separator MiniMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Magnet Separator MidiMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Magnet Separator VarioMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Microtest III-96 Loch-Flachbodenplatte: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 3072 Monensin: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. M 5273 Multiwell-24-Loch-Flachbodenplatte: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.Nr. 3047 Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3): Merck, Darmstadt, Best.-Nr. 6329 Natriumpyruvat: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 0473 Paraformaldehyd: Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16005 Penicillin / Streptomycin: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2213 Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. P 8143 Polystyren Reagenzgläser (Rundboden): Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 2052 Probenröhre neutral, 12 ml: Kabe Labortechnik, Nümbrecht-Elsenroth, Best.-Nr. N 95 Reagenzröhrchen, konisch, mit Verschluß, 15 ml: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 2096 Reagenzröhrchen, konisch, mit Verschluß, 50 ml: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 2070 RPMI 1640 VLE: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. F 1415 Saponin: Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16109 Stammzellfaktor (SCF): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016300-07 Staphylokokkenenterotoxin A (SEA): ToxinTechnology / Alexis Biochemicals, Grünberg, Best.Nr. TX-AT-101 36 Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (TSST-1): ToxinTechnology / Alexis Biochemicals, Grünberg, Best.Nr. TX-TT-606 Trennsäule AS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-041-302 Trennsäule BS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-041-304 Trennsäule LS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-042-401 Trennsäule MS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. Tuerk’sche Lösung: Fluka Chemika, Buchs (CH), Best.-Nr. 93770 Tumornekrosefaktor α (TNF-α): R&D Systems, Wiesbaden, Best.-Nr. 210 - TA Verschlußstopfen für Probenröhre neutral, 12 ml: Kabe Labortechnik, NümbrechtElsenroth, Best.-Nr. 052102 Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS): Heraeus, Düsseldorf 37 3 Ergebnisse 3.1 Das Überleben von T-Zellen in Kokultur mit autologen dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli CD45RA-positive Zellen wurden mit dendritischen Zellen für sieben Tage in Kokultur gegeben. In dieser Zeit erfolgten regelmäßige mikroskopische Kontrollen der Kulturen. Ab dem vierten Tag wurde eine deutliche Abnahme der Zellzahl in den Kulturen beobachtet. Am siebten Tag waren nur noch einzelne Zellen vorhanden. Die Zellen wurden geerntet und ein kleiner Teil wurde einer mikroskopischen Vitalitätsprüfung mittels Trypan-Blau-Färbung unterzogen. Dabei zeigte sich ein hoher Anteil avitaler Zellen. Für eine durchflußzytometrische Zytokinmessung war nur in 2 Versuchen ausreichend Material vorhanden. Der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen lag in beiden Versuchen bei 0,8%. Der Anteil IL-4-bildender Zellen lag bei durchschnittlich 20,3% (17,8%-22,7%). In weiteren Versuchen wurden Kokulturen von CD45RA-positiven Zellen und dendritischen Zellen mit IL-2 oder IL-7 in verschiedenen Konzentrationen stimuliert. In der mikroskopischen Kontrolle der Kulturen zeigte sich eine Proliferation der Zellen, die unter Stimulation mit IL-7 stärker war als unter Stimulation mit IL-2. Unter höheren Konzentrationen war der beobachtete Effekt ausgeprägter. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen an Tag 7 geerntet und die Zellzahl in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt. Außerdem wurden Kokulturen von CD45RA-positiven Zellen und dendritischen Zellen, mit GM-CSF und LPS sowie SEA einzeln oder in Kombination stimuliert. Hier zeigten die mikroskopischen Kontrollen eine starke Proliferation der Zellen die mit SEA oder mit GM-CSF, LPS und SEA stimuliert wurden. In der Kontrollgruppe, die GM-CSF und LPS stimuliert wurde, war diese Proliferation nicht zu beobachten, ebenso in der nicht stimulierten Gruppe. 38 Zellzahl 2.0×10 06 IL-2 IL-7 Kontrolle 1.0×10 06 0.0×10 -00 0.2 1.0 5.0 0.2 1.0 5.0 0.0 IL-7 IL-2 IL-Konzentration [ng / ml] Abbildung 4: Zellzahl nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 und einer Kulturdauer von sieben Tagen. 3.2 T-Zellen zeigen nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 eine Th2Differenzierung CD45RA-positive Zellen in Kokultur mit dendritischen Zellen wurden mit IL-2 oder IL-7 in verschiedenen Konzentrationen stimuliert. Nach sieben Tagen wurden intrazellulär IL-4 und IFN-γ gemessen. Es fanden sich ausschließlich IL-4 produzierende T-Zellen. Die mit IL-2 stimulierten Kulturen zeigten einen etwas größeren Anteil IL-4 bildender Zellen (11,4%) als die mit IL-7 stimulierten Kulturen (8,4%). Eine Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration war nicht feststellbar. Der Anteil IFN–γ-produzierender Zellen lag in allen Experimenten unter 0,5%. 39 IFN-γγ produzierende Zellen [%] 2 IL-2 IL-7 Kontrolle 1 0 0.2 1.0 5.0 0.2 1.0 5.0 0.0 IL-2 IL-7 IL-Konzentration [ng / ml] Abbildung 5: Anteil IFN-γγ-bildender Zellen in Abhängigkeit von der eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur. IL - 4 produzierende Zellen [%] 20 IL-2 IL-7 Kontrolle 15 10 5 0 0.2 1.0 5.0 0.2 1.0 5.0 0.0 IL-2 IL-7 IL-Konzentration [ng / ml] Abbildung 6: Anteil IL-4-bildender Zellen in Abhängigkeit von der eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur. 40 3.3 Die Fraktion der CD45RA-positiven Zellen enthält neben naiven T-Zellen auch HLA-DR-positive antigenpräsentierende Zellen CD45RA-positive Zellen wurden jeweils mit und ohne dendritische Zellen in Kultur gegeben. Die dendritischen Zellen wurden vor Zugabe zur Kokultur für 2 h mit LPS und GM-CSF vorinkubiert. Als zusätzliches Stimulans wurde TSST in einer Konzentration von 100 ng / ml oder 0.1 ng / ml eingesetzt, die Kulturen ohne Zugabe dendritischer Zellen wurden nur mit 100 ng / ml TSST stimuliert. Die Bestimmung der intrazellulären Zytokinproduktion erfolgte am dritten Tag der Kultur. In den Kulturen mit Zugabe dendritischer Zellen lag der Anteil IFN-γ produzierender Zellen für die TSST-Konzentration von 100 ng / ml bei 37,3% und für die TSST-Konzentration von 0,1 ng / ml bei 8,2%. Auch in den T-Zellen, die ohne dendritische Zellen kultiviert wurden, ließ sich die Bildung von IFN-γ nachweisen. Der Anteil positiver Zellen lag bei 17,2% und damit sogar noch deutlich höher als in den Kulturen mit dendritischen Zellen und niedriger TSSTKonzentration. Der Anteil IL-4 bildender Zellen war in den Kulturen ohne dendritische Zellen mit 13,7% größer als in den Kulturen mit dendritischen Zellen (8,8% bei 100 ng TSST / ml; 9,2% bei 0,1 ng TSST / ml). Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass in den CD45RA-positiven Zellen noch antigenpräsentierende Zellen enthalten sind, die als Stimulatorzellen für die T-Zellen dienen können. In Proben CD34-negativer Zellen aus Nabelschnurblut wurde daher der Anteil HLA-DR-positiver Zellen mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Er betrug durchschnittlich 4,6%. Um diese Zellen zu eliminieren und naive T-Zellen zu erhalten wurden Zellen mit den Oberflächenantigenen HLA-DR und CD45R0 durch magnetische Zellseparation depletiert. Die erhaltene Zellpopulation wurde durchflußzytometrisch untersucht. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Depletion HLA-DR-tragender antigenpräsentierender Zellen. Diese Zellpopulation besteht aus T-Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen und wurde für alle weiteren Versuche im Rahmen dieser Arbeit verwendet. 41 Tabelle 3: Oberflächenmarker nach Depletion von HLA-DR- und CD45R0-positiven Zellen. Die Zellpopulation enthält keine antigenpräsentierenden Zellen mehr. Sie besteht aus T-Helferzellen (CD3/CD4), zytotoxischen T-Zellen (CD3/CD8) und NK-Zellen (CD16/CD56). Der Anteil CD45R0-positiver Zellen ist kleiner 1%. Oberflächenantigen Positive Zellen [%] CD45RA 98,2 CD45R0 0,6 HLA-DR < 0,1 CD3 / CD4 52,8 CD3 / CD8 22,1 CD3 / CD20 0,1 CD16 / CD56 22,0 CD14 0,2 CD33 < 0,1 CD123 < 0,1 In weiteren Versuchen wurden CD45RA-positive, HLA-DR-depletierte Zellen mit dendritischen Zellen in Kultur gegeben und mit TSST stimuliert. Die dendritischen Zellen wurden zuvor zwei Stunden mit GM-CSF und LPS vorinkubiert. CD45RApositve, HLA-DR-depletierte Zellen des gleichen Spenders wurden ohne dendritische Zellen in Kultur gegeben und mit TSST stimuliert. Nach drei Tagen wurde bei beiden Gruppen die intrazelluläre Zytokinproduktion gemessen. In der Gruppe, die ohne dendritische Zellen kultiviert wurde, ließ sich IFN-γ nur in geringen Mengen nachweisen. Der Anteil IFN-γ produzierender Zellen lag für alle eingesetzten TSST-Konzentrationen unter 2%. Für die Kulturen mit dendritischen Zellen lag der Anteil IFN-γ produzierender Zellen in Abhängigkeit von der TSSTKonzentration zwischen 5% und 15%. Der Anteil IL-4 produzierender Zellen lag in den Kulturen mit dendritischen Zellen für alle eingesetzten TSST-Konzentrationen um 3% (2,8% - 3,5%). In den Kulturen ohne dendritische Zellen lag der Anteil IL-4 produzierender Zellen mit 5 - 10% höher. Eine Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration war ebenfalls nicht vorhanden. 42 IFN - γ produzierende Zellen [%] 50 mit DC ohne DC 40 30 20 10 0 100 0.1 100 TSST - Konzentration [ng / ml] Abbildung 7: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, nicht HLADR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der Kultur. IFN-γγ produzierende Zellen [%] 20 mit DC ohne DC 15 10 5 0 100 10 1 0,1 100 10 1 0,1 TSST-Konzentration [ng / ml] Abbildung 8: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, HLA-DRdepletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der Kultur. 3.4 Th1-Antwort und Th2-Antwort erreichen ihr Maximum zu verschiedenen Zeitpunkten CD45RA-positive Zellen und dendritische Zellen wurden mit GM-CSF, LPS und TSST stimuliert und über 7 Tage kultiviert. Ab dem zweiten Tag wurden täglich Zellen geerntet und die Zytokinproduktion durchflußzytometrisch gemessen. 43 Am zweiten Tag waren kaum IFN-γ bildende Zellen nachzuweisen. Der höchste Anteil IFN-γ produzierender Zellen wurde an Tag 3 der Kultur gemessen, in den nächsten beiden Tagen ging der Anteil wieder zurück. An Tag 6 und 7 waren kaum noch IFN-γ bildende Zellen vorhanden. IL-4 produzierende Zellen waren schon ab dem zweiten Tag vorhanden. Ihr Anteil nahm ab dem fünften Tag stark IFN - γ produzierende Zellen [%] zu und erreichte am siebten Tag der Kultur den Höchstwert. 50 40 30 100 ng TSST / ml 0.1 ng TSST / ml 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abbildung 9: Kinetik der IFN-γγ-produzierenden Zellen. IL - 4 produzierende Zellen [%] 50 40 30 100 ng TSST / ml 0.1 ng TSST / ml 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abbildung 10: Kinetik der IL-4-produzierenden Zellen. 44 3.5 Das Ausmaß der IFN-γγ-Produktion ist abhängig von der TSST-Konzentration Um die Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration zu untersuchen, wurden die Zellen mit TSST in Konzentrationen von 100, 10, 1 und 0.1 ng / ml stimuliert, zusätzlich mit GM-CSF und LPS. Die Anzahl der IFN-γ bildenden Zellen korrelierte positiv mit der Höhe der TSST-Konzentration. Der Anteil der IL-4 bildenden Zellen zeigte keine Abhängigkeit von der TSST-Konzentration. 3.6 TSST stimuliert Vβ β2-positive Zellen stärker als Vβ β2-negative Zellen zur Bildung von IFN-γγ Unter den selben Versuchsbedingungen wurden auch Unterschiede zwischen Vß2-positiven und Vß2-negativen T-Zellen hinsichtlich des Anteils IFN-γ- und IL-4bildender Zellen untersucht. Vß2-positive Zellen bildeten zu einem wesentlich größeren Teil IFN-γ als Vß2-negative Zellen. Der Unterschied war bei niedrigen TSST- Konzentrationen deutlicher. Die Anteil IL-4 bildender Zellen war in beiden IFN - γ produzierende Zellen [%] Gruppen annähernd gleich. 40 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 30 20 10 0 100 10 1 0.1 TSST - Konzentration [ng / ml] Abbildung 11: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der TSSTKonzentration und von der Vβ β 2-Expression 45 IL - 4 produzierende Zellen [%] 20 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 10 0 100 10 1 0.1 TSST - Konzentration [ng / ml] Abbildung 12: Abhängigkeit des Anteils IL-4-produzierender Zellen von der TSSTKonzentration und von der Vβ β 2-Expression 3.7 Die Expression von Vβ β2 nach Stimulation mit TSST ist abhängig von der eingesetzten TSST-Dosis Um Unterschiede in der Expression von Vβ2 nach Stimulation mit TSST zu erfassen, wurde in einer Kokultur von dendritischen Zellen und CD45RA-positiven Zellen nach einer Kulturdauer von sieben Tagen mit verschiedenen TSST-Dosen jeweils der Anteil Vβ2-positiver und Vβ2-negativer T-Zellen durchflußzytometrisch bestimmt. Als Kontrolle dienten Zellkulturen ohne TSST-Stimulation. Diese zeigten einen Anteil Vβ2-positiver Zellen von durchschnittlich 9,4% (7,5%-11,3%). Der Anteil Vβ2-positiver Zellen nach TSST-Stimulation lag deutlich höher und zeigte eine Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Dosis. Der höchste Anteil Vβ2positiver Zellen war bei einer niedrigen TSST-Dosis von 0.1 ng / ml zu beobachten, mit steigender TSST-Dosis nahm der Anteil Vβ2-positver Zellen ab. 46 Anteil an gemessenen Zellen [%] 100 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 75 50 25 0 0 0.1 1 10 100 TSST-Konzentration [ng / ml] Abbildung 13: Anteil Vβ β 2-positiver und Vβ β 2-negativer Zellen in Abhängigkeit von der TSST-Konzentration 3.8 LPS ist ein wichtiger Stimulus für die Bildung von IFN-γγ Um den Einfluss der Anwesenheit von LPS zu untersuchen wurden Kulturen mit LPS in einer Konzentration von 10 µg / ml und ohne LPS angesetzt. Alle Kulturen wurden mit TSST stimuliert; die eingesetzte Konzentration betrug entweder 100 ng / ml oder 0,1 ng / ml. An Tag 3 wurde der Anteil IFN-γ- und IL-4 bildender Zellen bestimmt. LPS-Stimulation führte zu einem deutlich höheren Anteil IFN-γ-bildender Zellen. Lediglich bei der geringen TSST-Konzentration war der Effekt bei den Vβ2negativen Zellen nicht eindeutig. Der Anteil IL-4 produzierender Zellen war in den Gruppen mit und ohne LPS nahezu gleich. 47 IFN - γ produzierende Zellen [%] 60 50 40 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 30 20 10 0 100 0.1 100 0.1 TSST- Konzentration [ng / ml] mit LPS (10 µg / ml) ohne LPS Abbildung 14: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der Anwesenheit von LPS 3.9 Restimulationen mit TSST erhöhen die Anzahl IFN-γγproduzierender Zellen nur gering Die Zellkulturen wurden 24 Stunden vor Messung der intrazellulären Zytokinbildung erneut stimuliert. Dazu wurden nochmals mit GM-CSF und LPS vorinkubierte dendritische Zellen und 100 ng TSST zu den Kulturen gegeben. Die Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen lag in den nachstimulierten Kulturen mit 46,2% nur an Tag 3 deutlich höher als in den nicht nachstimulierten Kulturen (37,3%), für alle anderen Tage war in nachstimulierten Kulturen nur ein gering erhöhter Anteil IFN-γ-produzierender Zellen nachweisbar. Der Anteil IL-4 bildender Zellen war an den Tagen 2 bis 4 in den nachstimulierten Kulturen niedriger als in den nicht nachstimulierten Kulturen. Für die Tage 5 bis 7 waren keine Unterschiede nachzuweisen. Hinsichtlich des Anteils Vβ2-positiver Zellen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den nachstimulierten und nicht nachstimulierten Kulturen. 48 IFN - γ produzierende Zellen [%] 60 50 40 ohne Nachstimulation mit Nachstimulation 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abbildung 15: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST auf den Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen IL - 4 produzierende Zellen [%] 20 ohne Nachstimulation mit Nachstimulation 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abbildung 16: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST auf den Anteil IL-4-produzierender Zellen 3.10 Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin stimulieren die Produktion von IFN-γγ und unterdrücken die Produktion von IL-4 Ein Teil jeder durchgeführten Zellkultur wurde wie beschrieben fünf Stunden vor Messung der intrazellulären Zytokinproduktion mit PMA und Ionomycin nachstimuliert. 49 Auch unter diesen Umständen war die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen abhängig von der eingesetzten TSST-Konzentration, der Expression von Vβ2 und IFN - γ produzierende Zellen [%] der Anwesenheit von dendritischen Zellen. 50 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 40 30 20 10 0 100 10 1 0.1 TSST - Konzentration [ng / ml] IFN - γ produzierende Zellen [%] Abbildung 17: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin und Anwesenheit von dendritischen Zellen 50 Vβ2 pos. Zellen Vβ2 neg. Zellen 40 30 20 10 0 100 10 1 0.1 TSST - Konzentration [ng / ml] Abbildung 18: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin bei Abwesenheit von dendritischen Zellen In der Abhängigkeit von der Dauer der Kultur zeigten sich Unterschiede zwischen der Gruppe mit und ohne Nachstimulation. In mit PMA und Ionomycin stimulierten Kulturen war an allen Tagen ein hoher Anteil IFN-γ bildender Zellen nachweisbar. 50 IFN-γγ produzierende Zellen [%] 80 60 mit PMA / Ionomycin 40 ohne PMA / Ionomycin 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abbildung 19: Vergleich der Kinetik IFN-γγ-produzierender Zellen mit und ohne Nachstimulation durch PMA und Ionomycin Der Anteil IL-4 produzierender Zellen war nach Stimulation mit PMA und Ionomycin geringer. 51 4 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, welche Faktoren in vitro die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th1- oder Th2-Effektorzellen beeinflussen. Dazu wurde ein Zellkultursystem etabliert, das ausschließlich autologe Zellen verwendet. Die Differenzierung der naiven T-Zellen wurde anhand des intrazellulären Zytokinprofils beurteilt; die Zytokine IFN-γ und IL-4 dienten hierbei als charakteristische Zytokine für Th1- bzw. Th2-Antworten. In ersten Versuchen zeigten sich nach einer Kulturdauer von sieben Tagen keine vitalen Zellen mehr. Stimulationen dieser Kulturen mit den Zytokinen IL-2 oder IL-7 verbesserten das Überleben der Zellen deutlich. Allerdings gelang es unter diesen Bedingungen nicht, einen nennenswerten Anteil an IFN-γ-bildenden Zellen zu induzieren. Es wurde daraufhin ein System entwickelt, in dem mittels des Superantigens TSST-1 gezielt ein bestimmter Anteil der naiven T-Zellen stimuliert wurde. Dadurch war es möglich, die stimulierten und die nicht-stimulierten Zellen parallel zu untersuchen. In diesem System wurde dann eine Vielzahl möglicher Einflussfaktoren untersucht. Ein Faktor mit Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung ist das Vorkommen von HLADR-positiven Zellen in der Fraktion der CD45RA-positiven Zellen. Diese Zellen verstärken deutlich die Ausbildung von Th1-Mustern. Nach dieser Feststellung wurden als naive T-Zellen nur noch Zellen eingesetzt, die durch Depletion von HLA-DR-positiven und CD45R0-positiven Zellen gewonnen wurden. Als wesentliche Einflussfaktoren konnten die Dauer der Zellkultur sowie das Ausmaß der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor identifiziert werden. Eine kurze Dauer der Zellkultur sowie eine starke Stimulation in Form einer hohen TSST-1Konzentration führte zu einem überwiegen von Th1-Zellen bei den stimulierten Vβ2-positiven Zellen. Unterstützt wurde die Ausbildung von Th1-Mustern durch die Anwesenheit von LPS. Erneute Stimulationen mittels einer zweiten Gabe von TSST und von mit GM-CSF und LPS vorbehandelten dendritischen Zellen hatten keinen ausgeprägten Effekt auf die Anzahl IFN-γ-produzierender Zellen. Einen starken polarisierenden Einfluss in Richtung Th-1-Antwort zeigten Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin, dies sogar unabhängig von der Dauer der Kultur. 52 4.1 Das Überleben von T-Zellen in der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli Die autologen Kokulturen ohne zusätzliche Stimuli zeigten sich anfällig für ein frühes Absterben der eingesetzten Zellen. Nur in der Hälfte der durchgeführten Versuche waren genügend Zellen für eine Messung der Zytokinproduktion vorhanden. Da einerseits die Zahl der initial einsetzbaren Zellen für die Kultur beschränkt war, andererseits aber auch mehrere Einflussfaktoren parallel an den Zellkulturen untersucht werden sollten, musste ein Zellkultursystem entwickelt werden, in dem durch zusätzliche Stimuli ein Überleben der Zellen ermöglicht wird. Dieses Ziel konnte durch Stimulation mit den Zytokinen IL-2 bzw. IL-7 erreicht werden. Die Stimulation führte zu einem deutlich verbesserten Überleben oder einer Proliferation der Zellen. IL-7 zeigte eine stärkere Wirkung auf die Proliferation als IL-2. Die Wirkung war bei beiden Zytokinen von der eingesetzten Dosis nur in geringem Maße abhängig. Als Ursachen für die fehlende Proliferation in der unstimulierten autologen Kokultur kommen mehrere Faktoren in Betracht: 1. Die verwendeten neonatalen T-Zellen sind unreifer als adulte Zellen und zeigen deshalb eine geringe Ansprechrate in der MLR. 2. Die als Stimulatorzellen verwendeten dendritischen Zellen sind aufgrund fehlender Ausreifung nicht in der Lage eine Proliferation von T-Zellen auszulösen. Soares verglich unstimulierte Kulturen von CD45RA-positiven Zellen aus Nabelschnurblut mit adulten Zellen. Nach acht Tagen waren alle Zellen aus Nabelschnurblutkulturen abgestorben, während in den adulten Kulturen noch 75% lebende Zellen vorhanden waren. Diese Abnahme der Zellzahl war durch Apoptose bedingt und ließ sich durch Zytokine verhindern , die wie IL-2, IL-4, IL-7 und IL-15 an die gemeinsame γ-Kette des IL-2-Rezeptors binden. IL-7 war hier den anderen Zytokinen deutlich überlegen und führte als einziges Zytokin zu einer deutlichen Zunahme der Zellzahl durch Proliferation (Soares et al., 1998). Neonatale Zellen zeigen ein vermindertes Ansprechen auf eine Stimulation mit Antikörpern gegen CD2 und / oder CD28 im Vergleich zu adulten Zellen. Die Expression von IL-2, des IL-2-Rezeptors (CD25) sowie die Proliferationsantwort, 53 sind in neonatalen Zellen jeweils signifikant geringer. Durch die Zugabe von exogenem IL-2 kann die Antwort neonataler Zellen auf das Niveau adulter Zellen angehoben werden (Hassan et al., 1995). Diese Unreife neonataler Zellen bezüglich der Bildung des Wachstumsfaktors IL-2 könnte erklären, warum in der vorliegenden Arbeit das Überleben der Zellen in der MLR vermindert war. Sowohl in der allogenen als auch in der autologen MLR sind dendritische Zellen die wirksamsten Stimulatorzellen. Die Proliferation von T-Lymphozyten ist in der autologen MLR allerdings deutlich geringer als in der allogenen MLR (Kuntz Crow and Kunkel, 1982). In der autologen MLR spielt die Ausreifung der dendritischen Zellen im Gegensatz zur allogenen MLR eine besondere Rolle. Durch Reifung der dendritischen Zellen mit GM-CSF über 48 h wird eine vermehrte Expression von CD80 und CD86 erzielt, welche die Fähigkeit zur Stimulation um den Faktor 100 steigert (Scheinecker et al., 1998). Eine Unreife der in dieser Arbeit verwendeten dendritischen Zellen könnte daher die fehlende Proliferation der T-Zellen erklären. Diese dendritischen Zellen wurden in einer früheren Arbeit genauer untersucht. Hier zeigte sich ein Anstieg der Expression von CD80, CD86 und anderen Reifungsparametern nach Stimulation mit GM-CSF und LPS (Bartz, 2001). Den hier genannten Aspekten wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter nachgegangen, da sie nicht zur zentralen Fragestellung gehörten. In zukünftigen Arbeiten auf diesem Gebiet könnte der Einsatz von Proliferations- und ApoptoseAssays eine bessere Aussage bezüglich Überleben und Proliferation der Zellen ermöglichen, als dies mittels mikroskopischer Kontrollen und Bestimmungen der Zellzahl möglich ist. 4.2 Die Th2-Differenzierung ist ein „Grundzustand“ neonataler TZellen, aber eine Th1-Antwort ist auslösbar Bei den ersten Messungen der intrazellulären Zytokinproduktion im Rahmen dieser Arbeit fiel auf, dass die Stimulation mit IL-2 bzw. IL-7 ausschließlich zu 54 einer Th2-Antwort der T-Zellen führte. Die Messungen wurden an Tag 7 der Zellkultur durchgeführt. Dabei waren IFN-γ bildende Zellen nicht nachweisbar. Der Anteil IL-4-bildender Zellen lag je nach eingesetztem Stimulans zwischen 11% und 34%. Eine relative Unfähigkeit zur Bildung von IFN-γ durch T-Zellen aus Nabelschnurblut ist mehrfach beschrieben worden. So zeigten Zellen aus Nabelschnurblut nach Stimulation mit PMA und Ionomycin im Vergleich mit adulten Zellen eine um ein Vielfaches geringere IFN-γ-Produktion, während die Fähigkeit zur Bildung von IL-2 und IL-4 annähernd gleich war (Chalmers et al., 1998). Andere Studien zeigten, dass ohne Stimulation mit PMA und Ionomycin CD45RA-positive Zellen aus Nabelschnurblut auch eine verminderte IL-2Produktion und eine verminderte Proliferation verglichen mit adulten Zellen zeigen. Unter PMA- und Ionomycin-Stimulation zeigten adulte und neonatale Zellen allerdings vergleichbares Verhalten (Hassan and Reen, 1997). Der Nachweis IFNγ-bildender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin im Rahmen dieser Arbeit passt in diesen Zusammenhang. Neben einer verminderten Fähigkeit zur IFN-γ-Produktion als intrinsische Eigenschaft neonataler T-Zellen kommen allerdings noch eine Reihe weiterer Faktoren für dieses Phänomen in Frage: Ein wesentlicher Faktor kann eine inadäquate Interaktion zwischen antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle sein. Besondere Bedeutung kommt hierbei kostimulierenden Molekülen zu. So kann ein Mangel an Kostimulation über den CD28-Rezeptor zur Anergie und Toleranzentwicklung führen (Nurieva et al., 2006). Andere wichtige Faktoren könnten die Kostimulation über den CD40/CD40LSignalweg und veränderte Eigenschaften von neonatalen dendritischen Zellen sein. Das bakterielle Produkt LPS wird von TLR-4 erkannt und führt zur Reifung von myeloiden DC mit gesteigerter Expression von MHC-II-Molekülen, CD86 und erhöhter Produktion von IL-12 (Medzhitov and Janeway, 2000). In Versuchen mit Zellen aus Nabelschnurblut konnte gezeigt werden, dass LPS im Gegensatz zu adulten Zellen nicht zu einer Produktion von aktivem IL-12 (p70) führte, dafür aber zu einer erhöhten IL-10-Bildung, welche die Th2-Differenzierung begünstigt. Während die LPS-Exposition in Nabelschnurblut wie adultem Blut zu einer gleichen Steigerung der HLA-DR-Expression und der CD86-Expression führte, 55 war die Zunahme der CD40-Expression bei neonatalen DC geringer ausgeprägt (De Wit et al., 2003). Dies könnte eine Erklärung für die Bevorzugung von Th2Antworten in der neonatalen Immunantwort sein. Eine neuere Studie konnte zeigen, dass bei kombinierter Stimulation über mehrere TLR-Signalwege (TLR-3, TLR-4, TLR-8) neonatale DC eine IL-12 und IFN-γ-Produktion wie adulte Zellen zeigen (Krumbiegel, Zepp and Meyer, 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurde allerdings lediglich LPS als über den TLR-4 wirkendes Stimulans eingesetzt, so dass die beeinträchtigte IL-12-Produktion eine wesentliche Rolle für die Th2-Differenzierung haben könnte. IL-12 führt auch zu einer Suppression der autokrinen IL-4-Stimulation aus Th2-Zellen, die ein weiterer Faktor für die Ausbildung von Th2-Antworten ist. Ein weiterer Einflussfaktor für die Bevorzugung von Th2-Antworten wird in der intrauterinen Entwicklung gesehen. Intrauterine Umgebungsbedingungen, insbesondere das Vorhandensein von IL-4 und Progesteron, fördern eine Th2Antwort. Dies ist für die Erhaltung der Schwangerschaft von Bedeutung und führt auch systemisch bei der Schwangeren zur Bevorzugung einer Th2-Antwort (Wegmann et al., 1993). Eine „Nachwirkung“ dieser Umgebungsbedingungen auf die neonatale Immunantwort wird diskutiert (Herz et al., 2000; Adkins et al., 2001). Insgesamt zeigt die Studienlage, dass bei Vorliegen einer optimalen Stimulation die T-Zell-Antworten von adulten und neonatalen Zellen vergleichbar sind und neonatale Zellen eine Th1-Differenzierung und IFN-γ-Produktion zeigen können. Die Identifizierung der optimalen Stimulation bei dem hier verwendeten autologen Zellkulturmodell war daher ein wichtiges Ziel dieser Arbeit und wird in den nächsten Abschnitten diskutiert. 4.3 Die Differenzierung zu Th1-Zellen ist abhängig von der Anwesenheit dendritischer Zellen. Th2-Zellen lassen sich auch ohne dendritische Zellen erzeugen. In Vorexperimenten zeigte die Kultur von mit TSST stimulierten CD45RA-positiven Zellen ohne Zugabe von dendritischen Zellen eine Bildung von IFN-γ in den TLymphozyten. Es stellte sich daher die Frage, ob in den Kulturen außer den naiven T-Zellen noch ein anderer Zelltyp vorhanden ist, der für die Induktion der 56 beobachteten Th1-Antwort verantwortlich sein könnte. Nach durchfluß- zytometrischen Untersuchungen ergab sich ein Anteil von etwa 5% HLA-DR positiven Zellen an den CD45RA-positiven Zellen. Dieser Oberflächenmarker ist typischerweise auf antigenpräsentierenden Zellen zu finden. Ein Zelltyp, der diesen genannten Eigenschaft entspricht, sind lymphoide dendritische Zellen, welche die Oberflächenmarker CD4, CD45RA und CD123 exprimieren (Grabbe et al., 2000; Reid et al., 2000). Für weitere Experimente gelang es, die HLA-DR-positiven Zellen vollständig zu entfernen. Auf den depletierten Zellen waren auch keine anderen für dendritische Zellen oder Makrophagen typischen Oberflächenmoleküle mehr nachweisbar, beispielweise CD14, CD33 oder CD123 (Liu, 2001). In den Kulturen ohne Zugabe von dendritischen Zellen ließ sich jetzt keine Bildung von IFN-γ mehr nachweisen. Verglichen mit den Kulturen ohne HLA-DR-Depletion nahm der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen in der Gruppe mit dendritischen Zellen deutlich ab, so zum Beispiel von 37% auf 15% für die TSST-Konzentration von 100 ng / ml. Unabhängig von der Durchführung einer HLA-DR-Depletion zeigte sich, dass in den Kulturen ohne dendritische Zellen ein höherer Anteil IL-4bildender Zellen nachweisbar war. Eine vergleichbare Beobachtung machten Brandt und Mitarbeiter, die in Kulturen gereinigter und von antigenpräsentierenden Zellen depletierter T-Zellen eine Proliferation und Differenzierung nach TSST-Stimulation fanden. Nach einer Depletion der HLA-DR positiven T-Zellen, die einen Anteil von 1-3% ausmachten, waren Proliferation und Differenzierung nicht mehr zu beobachten. Brandt und Mitarbeiter folgerten daraus, dass sich Superantigen-aktivierte T-Zellen in Anwesenheit von HLA-DR positiven T-Zellen sehr ähnlich verhalten wie in der Gegenwart professioneller antigenpräsentierender Zellen (Brandt et al., 2002). Möglicherweise handelte es sich aber auch in diesem Fall bei den HLA-DR positiven Zellen um lymphoide dendritische Zellen. Die Anwesenheit antigenpräsentierender Zellen - hier dendritischer Zellen - ist eine Voraussetzung für die Erzeugung von Th1-Antworten in dem hier vorgestellten Kulturmodell. Dieses Ergebnis stimmt überein mit einer Vielzahl von Arbeiten, welche die Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und TZellen untersuchten. Die erste notwendige Stimulation der T-Zellen erfolgt 57 antigenabhängig über MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zell-Rezeptor. Hier konnte gezeigt werden, dass Superantigene am effektivsten durch dendritische Zellen präsentiert werden, welche allen anderen antigenpräsentierenden Zellen überlegen sind, da sie 10-fach bis 100-fach höhere Dichten an HLA-DR, -DP und –DQ auf ihrer Oberfläche aufweisen (Bhardwaj et al., 1992). Eine weitere wesentliche Rolle spielen Interaktionen zwischen kostimulierenden Molekülen, vor allem dem CD28 / B7-Komplex (CD80, CD86) und CD40 / CD40L (CD154). Der Signalweg über CD40 auf dendritische Zellen und CD40L auf T-Zellen ist der stärkste Stimulus, der eine IL-12-Bildung durch dendritische Zellen induziert, und ist damit von entscheidender Bedeutung für die Entstehung von Th1-Mustern. Ohne Stimulation über CD40 können auch andere Faktoren, die als IL-12Induktoren bekannt sind (z.B. LPS), keine Bildung von IL-12 induzieren (Cella et al., 1996). Hinsichtlich der Aktivierung über CD40 stellen lymphoide dendritische Zellen eine Ausnahme dar. Für diese Zellen konnte kürzlich im Mausmodell gezeigt werden, dass die Aktivierung unter Stimulation mit dem Superantigen SEA zwar von T-Zellen abhängig ist, aber nicht über CD40 vermittelt wird (Muralimohan and Vella, 2006). Aufgrund dieser Beobachtungen ist nachvollziehbar, dass in den Kulturen nach Depletion der lymphatischen dendritischen Zellen und ohne Zugabe weiterer dendritischer Zellen keine Bildung von IFN-γ mehr nachweisbar war. Der Signalweg über CD28 auf T-Zellen und CD80 / CD86 auf dendritischen Zellen ist – wie bereits in der Einleitung beschrieben – von Bedeutung für Aktivierung und Proliferation der T-Zellen. So konnte gezeigt werden, dass wiederholte Stimulationen über CD28 die Ausbildung einer Th2-Antwort fördern und die Bildung von IFN-γ unterdrücken (King et al., 1995). In einem anderen Modell, in dem TSST-1 als Stimulus eingesetzt wurde, konnte jedoch durch Antikörper gegen CD80 / CD86 die Sekretion von IFN-γ durch aktivierte, Vβ2-positive TLymphozyten unterdrückt werden (Kum et al., 2002). Auch die fehlende Kostimulation über CD28 könnte daher erklären, warum in den Kulturen ohne dendritische Zellen keine Bildung von IFN-γ zu beobachten war. Ein wesentlicher Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung wird seit einigen Jahren auch verschiedenen Untergruppen dendritischer Zellen zugeschrieben. So postulierten Rissoan und Mitarbeiter ein Modell der T-Zell-Differenzierung, in dem myeloide dendritische Zellen (als DC1 bezeichnet) zu einer Th1-Differenzierung 58 führen, während lymphoide dendritische Zellen (DC2) eine Th2-Differenzierung hervorrufen (Rissoan et al., 1999). Weitere Arbeiten zeigten allerdings, dass neben der Ontogenese der dendritischen Zellen auch die Art der dendritische Zellen aktivierenden Stimuli und der Reifungszustand der dendritischen Zellen eine Rolle für die T-ZellDifferenzierung spielen (Grabbe et al., 2000). So können in Abhängigkeit von den Reifungsbedingungen auch myeloide dendritische Zellen starke Th2-Antworten auslösen. Setzt man LPS als alleinigen Stimulus zur Reifung ein, können myeloide dendritische Zellen – wie auch in dieser Arbeit gezeigt - sowohl die Bildung von IFN-γ als auch von IL-4 hervorrufen. Wird zusätzlich zu LPS auch IFN-γ zur Reifung der dendritischen Zellen verwendet, dann erhält man eine Population dendritischer Zellen, die starke Th1Induktoren sind; bei Verwendung von LPS und Prostaglandin E2 erhält man starke Th2-Induktoren (Vieira et al., 2000). Diese Einflüsse von LPS wurden im Rahmen dieser Arbeit noch weiter untersucht und werden im nächsten Abschnitt diskutiert. 4.4 Effekte von LPS auf die Differenzierung zu Th1- und Th2Zellen Die Zugabe von LPS zu den Zellkulturen führte zu einer Zunahme der IFN-γbildenden Zellen. Der Unterschied lag je nach eingesetzter TSST-Konzentration und betrachteter Zellgruppe (Vβ2-positive vs. Vβ2-negative Zellen) bei einem Faktor von 3 bis 8. Der Anteil IL-4-bildender Zellen war unabhängig vom Vorhandensein von LPS. Diese Effekte von LPS werden über dendritische Zellen vermittelt. LPS führt zu einer Reifung der dendritischen Zellen, wobei die Zellen ihre Eigenschaft zur Antigenaufnahme und Antigenprozessierung verlieren und stattdessen vermehrt Oberflächenmoleküle exprimieren, die eine Bedeutung für Antigenpräsentation und T-Zell-Stimulation haben, so zum Beispiel MHC-Komplexe, CD80, CD58 und CD54. Diese Veränderungen finden innerhalb von 24 bis 48 Stunden statt (Sallusto et al., 1995). Daneben stimuliert LPS bereits in Dosierungen von 0,1 ng / 59 ml dendritische Zellen innerhalb von 24 Stunden zu vermehrter Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8, TNF-α und IL-12, die bei der Induktion spezifischer Immunantworten durch T- und B-Zellen eine wichtige Rolle spielen. In der allogenen MLR führen diese mit LPS behandelten dendritischen Zellen zu einer erhöhten Produktion von IL-2 und IFN-γ und zu einer gesteigerten Proliferation verglichen mit unstimulierten dendritischen Zellen desselben Spenders. Insbesondere die Produktion von IFN-γ ist bei Einsatz von LPS um den Faktor 7 höher als beim Einsatz von unstimulierten dendritischen Zellen (Verhasselt et al., 1997). Diese Ergebnisse konnten in dieser Arbeit für die autologe Zellkultur bestätigt werden. Langenkamp et al. untersuchten die Kinetik der Zytokinproduktion in dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS und die Fähigkeit dieser Zellen zur Polarisation von autologen CD4 positiven T-Zellen. Die Produktion von IL-6, IL-10, IL-12 und TNF-α folgt dabei einer für jedes Zytokin eigenen Kinetik. Ab einem bestimmten Zeitpunkt führt auch fortgesetzte oder erneute Stimulation nicht mehr zu einer Zytokinproduktion. Die frühen dendritischen Zellen, die Zytokine bilden, wurden deshalb in dieser Studie als „aktive“ dendritische Zellen bezeichnet und die späten dendritischen Zellen, welche die Fähigkeit zur Zytokinproduktion verloren haben, als „erschöpfte“ dendritische Zellen. Aktive dendritische Zellen führen zu einer Th1-Differenzierung und erschöpfte dendritische Zellen zu einer Th2- Differenzierung der autologen T-Zellen. Zusätzlich besteht auch eine Abhängigkeit von der Antigendosis (Langenkamp et al., 2000). Auch der Zeitpunkt der Stimulation mit LPS hat einen Einfluss auf die von den dendritischen Zellen gebildeten Zytokine (Jiang et al., 2002). Dazu wurde im Mausmodell die Zytokinantwort von aus Knochenmark generierten dendritischen Zellen auf LPS-Stimulation zu verschieden Zeitpunkten nach Beginn der Zellkultur gemessen. Die sofortige oder frühe Zugabe innerhalb von 2 Stunden von LPS führt zu einer starken IL-10-Antwort, die bei einer Zugabe zu einem späteren Zeitpunkt deutlich geringer ausfällt. Umgekehrt verhält sich die IL-12-Antwort, die bei sofortiger Zugabe zur Zellkultur kaum nachweisbar ist. Erst bei einer Zugabe nach 2 Stunden wird IL-12 in größeren Mengen gebildet. Das Maximum ist erreichbar bei einer Zugabe von LPS nach 10 Stunden. Die IL-12-produzierenden dendritischen Zellen erwiesen sich den IL-10-bildenden dendritischen Zellen als deutlich überlegen hinsichtlich der Kapazität zur T-Zell-Stimulation. 60 In dieser Arbeit wurden, wie beschrieben, die dendritischen Zellen zunächst für 2 Stunden mit GM-CSF vorinkubiert, bevor T-Zellen, LPS und andere Stimuli hinzugefügt wurden. Unter den oben genannten Voraussetzungen wären zu diesem Zeitpunkt sowohl die Bildung von IL-10 als auch von IL-12 zu erwarten. Eine Messung von Zytokinen in dendritischen Zellen wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt. Zur Kontrolle des Einflusses der Dauer der Vorinkubation wurde in einer Versuchsreihe die Inkubationsdauer der dendritischen Zellen mit GM-CSF auf 24 Stunden verlängert. Es ergaben sich keine Unterschiede hinsichtlich der T-Zell-Differenzierung am Ende der Kokultur nach sieben Tagen, so dass dieser Aspekt im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht wurde. 4.5 NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen können über sezernierte Zytokine die Differenzierung naiver T-Helferzellen beeinflussen In der in dieser Arbeit verwendeten Population naiver T-Zellen waren neben den untersuchten T-Helferzellen noch zwei andere Zelltypen in größerer Anzahl vorhanden. Es handelt sich dabei um NK-Zellen, charakterisiert durch die Oberflächenmarker CD16 und CD56, und zytotoxische T-Zellen, die den Oberflächenmarker CD8 tragen. Diese Zellen könnten auf zwei verschiedene Weisen die Ergebnisse beeinflussen: 1. Die Zellen nehmen direkt Einfluss auf die Messergebnisse, da sie bei der durchflußzytometrischen Messung erfasst werden. 2. NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen bilden und sezernieren Zytokine, welche, im Sinne eines sogenannten „Bystander-Effektes“, die Differenzierung der T-Helferzellen beeinflussen. Bei der Auswertung der durchflußzytometrischen Messung wurde wie beschrieben ein Gating auf Lymphozyten anhand des Oberflächenmarkers CD3 durchgeführt. Da NK-Zellen dieses Oberflächenmolekül nicht tragen, wurden sie bei der Messung der intrazellulären Zytokine nicht erfasst. Miterfasst werden hingegen zytotoxische T-Zellen, welche das Messergebnis beeinflussen könnten. Studien 61 zeigen jedoch, dass diese Beeinflussung zumindest keine größeren Veränderungen des Messergebnisses erwarten lässt. Proliferierende Zellen in der MLR sind vorwiegend CD4 T-Zellen (Smolen et al., 1981). Außerdem bilden CD8positive Zellen nach Stimulation mit TSST kein IL-4 und nur zu einem geringen Anteil (< 5%) IFN-γ (Gehring et al., 1998). Von Bedeutung ist der geringe Anteil IFN-γ-bildender Zellen aber möglicherweise, wenn es um den Einfluss auch geringer Mengen von Zytokinen auf die Differenzierung von T-Helferzellen geht. Wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist die Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu T-Helferzellen vom Typ 1 abhängig von IL-12, das beispielsweise von dendritischen Zellen gebildet wird. Die Bildung von IL-12 ist abhängig von IL-12-induzierenden Faktoren wie LPS, CD40L oder exogenem IFN-γ. Mit exogenem IFN-γ gemeinsam mit LPS konnte eine Steigerung der IL-12-Bildung in dendritischen Zellen um den Faktor 40 gegenüber LPS alleine beobachtet werden. Dabei wirkt IFN-γ nur während der initialen Phase der Kultur, dass heißt in den ersten vier Stunden (Hilkens et al., 1997; Schuhbauer et al., 2000). Im Mausmodell konnte eine Untergruppe der CD8 T-Zellen als frühe IFN-γProduzenten identifiziert werden, die bereits 45 Minuten nach Stimulation mit CD3Antikörpern IFN-γ bilden und nach drei Stunden die maximale Expression von IFN-γ auf Protein- und mRNA-Ebene zeigen (Das et al., 2001). Beim Menschen konnte diese frühe IFN-γ-Produktion ebenfalls gezeigt werden. Hier führte allerdings nur die gemeinsame Stimulation von DC mit CD8- und CD4-T-Zellen zur Bildung von IL-12. Als wesentliche Faktoren hierfür wurden von den Autoren das von den CD8 T-Zellen gebildete IFN-γ und die Stimulation von DC durch CD40L auf CD4-T-Zellen genannt (Mailliard et al., 2002) Auch von NK-Zellen ist bekannt, dass sie IFN-γ bilden können. Dies wird wiederum unterstützt durch IL-12, welches durch dendritische Zellen zur Verfügung gestellt werden kann (Kamath, 2005). Dendritische Zellen sind aber auch in der Lage, NK-Zellen direkt zu aktivieren. Direkte Zell-Zell-Kontakte zwischen DC und NK-Zellen sowie das von den NK-Zellen freigesetzte IFN-γ führen zu einer weiteren Aktivierung der dendritischen Zellen (Gerosa et al., 2002) und unterstützen so die Ausbildung eines Th1-Musters (Maillard et al., 2003). 62 Der Einfluss der CD8 T-Zellen und NK-Zellen auf die Differenzierung der naiven CD4 T-Zellen im hier vorgestellten Modell sollte in künftigen Arbeiten durch selektive Depletion der genannten Zellgruppen näher untersucht werden, um unerwünschte Bystander-Effekte zu vermeiden. 4.6 Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Superantigen-Dosis Der Anteil IFN-γ bildender Zellen zeigte bei Messungen am dritten Tag der Zellkultur eine strenge Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration. Bei höherer TSST-Konzentration bildete ein größerer Anteil der Zellen in der Zellkultur IFN-γ als bei niedrigerer TSST-Konzentration. Diese Beobachtung war sowohl bei den Vβ2-positiven als auch bei den Vβ2-negativen Zellen zu machen. Der Anteil IL-4 bildender Zellen war hingegen in beiden Gruppen weitestgehend unabhängig von der TSST-Konzentration. Der Einfluss der Konzentration von Antigenen auf die Differenzierung von THelferzellen ist ein seit längerem viel diskutierter Faktor. Constant und Mitarbeiter konnten zeigen, dass in einem Mausmodell mit für den T-Zell-Rezeptor transgenen Mäusen, in dem alle T-Zell-Rezeptoren die gleiche Spezifität haben, niedrige Antigendosen zu einer Th2-Antwort und hohe Antigendosen des gleichen Antigens zu einer Th1-Antwort führen. Die Ausbildung einer Th2-Antwort wurde in diesem Modell nur bei Verwendung naiver CD4-positiver T-Zellen beobachtet. Bereits das Vorhandensein einer kleinen Population IFN-γ-produzierender Memory-Zellen konnte die Bildung von IL-4 unterdrücken (Constant et al., 1995). Unter diesem Gesichtspunkt könnte die bereits diskutierte Anwesenheit von NKZellen und CD8+ Zellen als frühen IFN-γ-Produzenten erklären, weshalb in der vorliegenden Arbeit keine Dosisabhängigkeit der Th2-Antwort zu beobachten war. In mehreren Arbeiten im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass, unabhängig von anderen, zusätzlichen Einflüssen wie Co-Stimulation über CD28 / B7 oder Vorhandensein bestimmter Zytokine, die Antigen-Dosis bzw. die Stärke des TCRSignals einen wesentlichen Faktor für die T-Zell-Differenzierung und die 63 Regulation von Oberflächenmolekülen der T-Zellen darstellt. Insgesamt führten kleine Antigendosen zusammen mit Stimulation über CD28 zu einer Th2-Antwort, während eine hohe Antigendosis zu einer Th1-Antwort führte (Tao et al., 1997; Ise et al., 2002). Eine neuere Studie zeigte, dass unabhängig von Zytokinmilieu und Kostimulation die Stärke der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor wesentlich für die Th1- bzw. Th2-Differenzierung ist. Durch Einsatz von veränderten Peptidantigenen mit unterschiedlicher Rezeptoraffinität konnte gezeigt werden, dass schwach affine Antigene zu Th2-Antworten führen, während normal affine Antigene sonst unter gleichen Bedingungen zu einer Th1-Differenzierung führten (Ariga et al., 2007). Dass auch bei Superantigenen die Affinität zum T-Zell-Rezeptor entscheidend für die Aktivierung der T-Zellen ist, konnte Andersen in einer Arbeit zeigen, in der Varianten des Superantigens SEC3 mit unterschiedlicher Affinität zum T-ZellRezeptor eingesetzt wurden. Eine stärkere Bindung an den T-Zell-Rezeptor führte hier zu einer stärkeren T-Zell-Antwort. So war in Abhängigkeit von der Bindung an den T-Zell-Rezeptor die Herunterregulierung des T-Zell-Rezeptors bei Liganden mit starker Affinität erhöht, ebenso die Aktivität des Transskriptionsfaktor NFAT und die IL-2-Produktion. Die Proliferation der T-Zellen korrelierte ebenfalls positiv mit der Stärke der TCR-Bindung (Andersen et al., 2001). Auch Weber et al. konnten eine dosisabhängige Beziehung von T-Zell-Aktivierung, Proliferation, Zytokinfreisetzung und Zelltod durch Apoptose nachweisen. Zur Frage der T-Zell-Polarisation machte diese Studie keine Aussagen, allerdings konnte interessanterweise nachgewiesen werden, das IFN-γ auch bei hohen Superantigendosen die Apoptose verhindert, nicht jedoch IL-4 (Weber et al., 1999). Der Nachweis einer Dosisabhängigkeit der T-Zell-Differenzierung gelang Brandt et al. an adulten, humanen Zellen. Hier führten hohe Dosierungen von TSST-1 zu einer Th1-Antwort, während niedrige Dosierungen zu einer Th2Differenzierung führten (Brandt et al., 2002). Diese Ergebnisse konnten in der vorliegenden Arbeit für neonatale Zellen bestätigt werden, die sich damit hinsichtlich der Induzierbarkeit von Th1- oder Th2-Antworten wie adulte Zellen verhalten. Insgesamt ist ein starkes Signal über den T-Zell-Rezeptor der wesentliche Faktor für eine Th1-Differenzierung. Bei einem starken TCR-Signal spielen polarisierende Zytokine wie IL-12 eine untergeordnete Rolle. Lediglich die autokrine Sekretion von IFN-γ ist von Bedeutung. Allerdings können über TLR aktivierte dendritische 64 Zellen auch bei einem schwachen TCR-Signal zu einer Th1-Differenzierung führen. Ebenso sind bei einem schwachen TCR-Signal die Zytokine IL-12 und IL18 wesentlich für die Induktion einer Th1-Differenzierung verantwortlich (Nembrini et al., 2006). Diese Aussagen decken sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit, die sowohl die Abhängigkeit von der TCR-Stimulation als auch den Einfluss der TLRaktivierten dendritischen Zellen, ausgelöst durch LPS-Stimulation, für die Th1Differenzierung ebenfalls nachweisen konnte. 4.7 Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Dauer der Kultur Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Feststellung, dass die Th1-Antwort und die Th2-Antwort ihr Maximum zu verschiedenen Zeitpunkten erreichen. Dabei ist der Anteil von Th1-Zellen am dritten Tag am höchsten; sowohl davor als auch ab dem sechsten Tag lassen sich praktisch keine Zellen mit Th1-Differenzierung mehr nachweisen. Th2-differenzierte Zellen ließen sich hingegen schon sehr früh ab dem zweiten Tag nachweisen. Ein starker Anstieg der Th2-Zellen war aber erst ab dem sechsten Tag zu beobachten. Die Antwort naiver T-Zellen kann in drei Phasen unterteilt werden: Aktivierung, Proliferation und Differenzierung. Auch wenn diese Phasen prinzipiell nacheinander ablaufen, so finden doch für alle drei einzelnen Phasen von Anfang an entscheidende Weichenstellungen statt. Die Aktivierungsphase umfasst den Zeitraum von der Aktivierung des TLymphozyten bis zur ersten Zellteilung. In dieser Phase werden die für die Zellteilung wichtigen Gene aktiviert und ihre Produkte zur Vorbereitung der DNAReplikation und Zellteilung synthetisiert (Jelley-Gibbs et al., 2000). Sie dauert ungefähr 24 Stunden (Ullman et al., 1990). Nach der ersten Zellteilung durchlaufen die T-Zellen in der Proliferationsphase eine schnelle Abfolge von Zellteilungen. Durch diese Expansion der T-Zellen, die durch die Zytokine IL-2 und TGF-β gefördert wird (Zhang et al., 1995), entsteht innerhalb von vier Tagen eine große Anzahl aktivierter Effektorzellen (Bradley et al., 1991). 65 Wesentliche Entscheidungen über die Differenzierung der T-Helferzelle werden schon in der Aktivierungsphase getroffen, auch wenn die effektive Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen erst später stattfindet (Swain et al., 1990; Lanzavecchia et al., 1999). Die Abhängigkeit von der Art und der Dosis des aktivierenden Antigens ist hierbei vor allem in den ersten achtundvierzig Stunden von Bedeutung für die Differenzierung. Vom zweiten bis zum vierten Tag tritt die Bedeutung der Zytokine in den Vordergrund. Proliferation und Differenzierung der T-Zellen erfolgen dann Antigen-unabhängig (Jelley-Gibbs et al., 2000). Dabei folgt die Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen einer jeweils eigenen Kinetik. Von Bedeutung ist insbesondere die Dauer der Stimulation über den TZell-Rezeptor. Eine kurze Stimulation von 24 Stunden ohne Anwesenheit von exogenen Zytokinen führt nur zu einer Proliferation, nicht aber zu einer Differenzierung der T-Zellen, wohingegen eine längere T-Zell-Rezeptor- Stimulation über 72 bis 96 Stunden zur Differenzierung von etwa 20% Zellen sowohl zum Th1-Typ als auch zum Th2-Typ führt. Die Anwesenheit von exogenem IL-12 führt auch schon bei einer kurzen T-Zell-Rezeptor-Stimulation zur einer Th1-Differenzierung von 70% der Zellen, da eine schnelle Produktion von IFN-γ einsetzt und IL-12 auch noch nach dem Ende der Stimulation über den TZell-Rezeptor wirksam ist. Für eine Th2-Differenzierung ist hingegen eine längere Periode der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor zeitgleich mit der Anwesenheit von IL-4 erforderlich (Iezzi et al., 1999). Bird und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die T-Zell-Differenzierung direkt von der Anzahl der durchlaufenen Zellteilungen abhängig ist (Bird et al., 1998). Während IL-2 unabhängig von der Anzahl der Zellteilungen war, nahm die Anzahl IFN-γbildender Zellen mit jedem durchlaufenen Zellzyklus zu. IL-4 war erst nach mindestens drei Zellteilungen, dass heißt ab dem dritten Tag, nachweisbar. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass IFN-γ-mRNA in aktivierten Zellen innerhalb von 6 Stunden aktiviert wird, IL-4-mRNA hingegen erst nach 48 Stunden (Lederer et al., 1996). Die vorstehenden Erkenntnisse aus Mausmodellen lassen sich auch auf humane Verhältnisse übertragen. Sornasse und Mitarbeiter verwendeten neonatale CD4-positive T-Zellen für kinetische Untersuchungen der T-Zell-Differenzierung. IFN-γ-bildende Th1-Zellen waren bei Zugabe von exogenem IL-2 nach vier Tagen, aber nicht mehr nach sechs Tagen nachweisbar. Unter Zugabe von IL-12 war nach vier Tagen eine 66 höhere Rate von Th1-Zellen (60-70%) nachweisbar als nach sechs Tagen (3040%). Th2-Zellen waren nach sechs Tagen selbst nach Stimulation mit IL-4 nur in sehr geringem Umfang nachweisbar (2%). Erst nach einem weiteren Stimulationszyklus von sechs Tagen stieg der Anteil an Th2-Zellen auf 20% (Sornasse et al., 1996). In Zellkultursystemen mit humanen Zellen und unter Verwendung von TSST konnten Gehring und Mitarbeiter Th1-differenzierte Zellen nach 18 Stunden und Th2-differenzierte Zellen nach drei Tagen nachweisen (Gehring et al., 1998). Ein wesentlicher Unterschied zwischen murinen und humanen T-Zellen ist die Stabilität der Th2-Zell-Differenzierung. Maus-Th2-Zellen weisen im Gegensatz zu humanen Zellen eine stabile Zytokinproduktion auf und können nicht in einen Th1Phenotyp „umdifferenziert“ werden (Perez et al., 1995). Humane Th2-Zellen können durch IL-12 zur Bildung von IFN-γ induziert werden. Th1-Zellen hingegen werden durch IL-4 nicht zur Bildung von IL-4 induziert (Seder and Prussin, 1997). 4.8 Unterschiede zwischen Vβ β2-positiven und Vβ β2-negativen TZellen Die vorgestellten Ergebnisse zeigen einen deutlichen Unterschied hinsichtlich der Bildung von IFN-γ zwischen den Vβ2-positiven und den Vβ2-negativen T-Zellen. Vβ2-positive Zellen sind an Tag 3 die überwiegenden IFN-γ-Produzenten. Dennoch bilden bei hohen TSST-Konzentrationen von 100 ng / ml auch etwa 12% der Vβ2-negativen Zellen IFN-γ. Hinsichtlich des Anteils IL-4-produzierender Zellen gab es keine wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Vβ2-negativen Zellen zeigten tendenziell eine geringfügig höhere Rate IL-4-bildender Zellen als die Vβ2positiven Zellen. Superantigene führen – wie in der Einleitung ausführlich dargestellt – zu einer selektiven Expansion spezifischer T-Zell-Klone; für TSST sind dies T-Zellen, die Vβ2-Ketten als Teil ihres T-Zell-Rezeptors exprimieren. Diese selektive Expansion ist in experimentellen Arbeiten gut untersucht (Marrack and Kappler, 1990) und lässt sich auch in vivo bei Patienten mit toxischem Schocksyndrom nachweisen 67 (Choi et al., 1990). Daher ist die in dieser Arbeit gemachte Beobachtung, dass auch Vβ2-negative Zellen aktiviert werden und eine Zytokinproduktion zeigen, zunächst nicht erklärlich. Für TSST konnte allerdings gezeigt werden, dass neben der Aktivierung über die Verbindung von MHC-Komplex und T-Zell-Rezeptor auch über Zytokine indirekt eine wesentliche T-Zell-Stimulation auslösbar ist (Rink et al., 1997). Die wesentlichen Zytokine, die für die starke T-Zell-Proliferation in Frage kommen, sind IL-1 und IL-6. In vergleichbarer Weise kann auch IFN-γ durch direkte und indirekte Wirkungen von TSST induziert werden. Das Vorkommen aktivierter und insbesondere IFN-γ bildender Vβ2-negativer Zellen wäre also über Bystander-Effekte sezernierter Zytokine erklärbar. Eine weitere Erklärung kann das Verhalten der aktivierten T-Zellen auf die Aktivierung mit TSST geben. Superantigene führen zu einer Herunterregulierung der spezifischen Vβ-Ketten des T-Zell-Rezeptors. Dieser Effekt ist dosisabhängig und nimmt mit steigender Konzentration zu. Während bei einer Konzentrationen von 10 fg / ml keine Auswirkungen zu beobachten sind, werden bei Konzentrationen von 0,1 pg / ml und 100 pg / ml etwa 30-60% der Rezeptoren herunterreguliert. Bei Konzentration von 10 ng / ml und 1 µg / ml ist der Effekt fast vollständig, so das kaum noch Vβ-positive Zellen nachweisbar sind (Gehring et al., 1998). Die Herunterregulierung beginnt bereits 10 min nach Aktivierung und ist nach etwa 6-8 Stunden komplett (Kum et al., 2001; Gehring et al., 1998). Damit sind diese Effekte die ersten, die nach Kontakt mit dem Superantigen auftreten, und liegen zeitlich deutlich vor der klonalen Expansion mit dem Maximum nach 72 Stunden. Auch im Rahmen dieser Arbeit konnten vergleichbare Effekte nachgewiesen werden. Nach einer Kulturdauer von sieben Tagen war eine war eine Abhängigkeit der Vβ2-Expression von der eingesetzten TSST-Konzentration zu beobachten, wobei bei kleinsten Konzentrationen die höchste Expression messbar war. Damit kommt neben den oben genannten Bystander-Effekten auch eine verminderte (erneute) Expression von Vβ2 als Erklärung für das Vorkommen aktivierter, Vβ2-negativer Zellen in Betracht. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit Superantigenzubereitungen. besteht bei verunreinigten So wurde auch für das im Rahmen dieser Arbeit verwendete TSST vereinzelt von Verunreinigungen berichtet, die eine erweiterte Vβ-Reaktivität zur Folge hatten (Fleischer et al., 1996). Die Möglichkeit von 68 Verunreinigungen könnte in Zukunft durch Verwendung rekombinant hergestellter Superantigene ausgeschlossen werden. Auch das Vorkommen von aktivierenden Substanzen im Kulturmedium (insbesondere LPS) könnte eine Erklärung für die Aktivierung Vβ2-negativer Zellen sein. 4.9 Einfluss von Nachstimulationen mit dendritischen Zellen, LPS und TSST Im Rahmen der Untersuchungen zur Kinetik der IFN-γ- und IL-4-Produktion wurde ein Teil der Zellkulturen jeweils 24 Stunden vor der intrazellulären ZytokinMessung mit 100 ng TSST sowie mit LPS vorinkubierten DC nachstimuliert. Diese nachstimulierten Zellkulturen zeigten aber im Vergleich zu den nicht- nachstimulierten Zellkulturen kaum andere Verteilungen der gemessenen Zytokine. Lediglich an Tag 3 war der Anteil IFN-γ-bildender Zellen erhöht (46,2% vs. 37,3%). An den Tagen 2-4 war zudem der Anteil IL-4-bildender Zellen in den nachstimulierten Zellkulturen geringer. Hierfür kommen verschiedene Erklärungen in Frage. Zunächst könnte eine Unreife der Nabelschnur-T-Zellen als Erklärung herangezogen werden. Takahashi berichtete, dass Restimulation mit TSST bei Nabelschnur-T-Zellen zur Toleranzentwicklung führt, während adulte T-Zellen eine hohe IL-2-Produktion nach Restimulation mit TSST zeigten. Zudem zeigten die Nabelschnur-T-Zellen in dieser Studie keine oder eine wesentlich geringere IL-4-Produktion als die adulten T-Zellen (Takahashi et al., 1995). Neuere Studien und auch die Ergebnisse dieser Arbeit lassen allerdings vermuten, dass die Ursachen hierfür vor allem in den Stimulationsbedingungen – vor allem im Fehlen geeigneter antigenpräsentierender Zellen (z.B. DC) – zu suchen sind. Eine generelle Annahme immunologischer Unreife von Nabelschnurzellen ist nicht mehr aufrecht zu erhalten. Neben einer Toleranzentwicklung kommt als mögliche Reaktion der T-Zellen auf eine Restimulation auch die Apoptose in Betracht. Für humane Thymozyten ist eine entsprechende Reaktion auf wiederholte TSST-Stimulation beschrieben (Mingari et al., 1996). Dabei zeigten nach erneuter Stimulation mit 5 ng TSST 47% 69 der Vß2-positiven Thymozyten nach 24 Stunden Zeichen der Apoptose wie DNAFragmentation. Insgesamt nahm der Anteil der Vß2-positiven Zellen dadurch ab. In der vorliegenden Arbeit wurden keine Marker für Apoptose bestimmt. Allerdings fielen die nachstimulierten Zellen auch nicht durch veränderte Zellstrukturen auf. So hätte ein Zerfall des Zellkernes zu Auffälligkeiten im side-scatter bei der durchflußzytometrischen Messung geführt. Der Anteil Vß2-positiver Zellen war in den nachstimulierten Kulturen nicht geringer, daher kann ein Verlust an Zellen durch Apoptose als unwahrscheinlich gelten. Für die oben genannten Ergebnisse im Rahmen dieser Arbeit scheinen daher andere Faktoren von Bedeutung zu sein. So konnte gezeigt werden, dass reife DC keine Reaktion auf eine (erneute) Stimulation mit LPS oder anderen bakteriellen Produkten zeigen und insbesondere die Fähigkeit zur Bildung von IL-12 verlieren, dem wichtigsten Induktor einer IFN-γ-Synthese in T-Zellen (Kalinski et al., 1999). Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurden daher bei den Restimulationen nicht nur TSST und LPS zu den Kulturen gegeben, sondern auch frische, d.h. unreife dendritische Zellen, die zuvor zwei Stunden mit GM-CSF vorinkubiert wurden. Dennoch führte die Restimulation nicht zu einer wesentlichen Veränderung der Zytokinproduktion in den T-Zellen. Als Ursache könnten veränderte Eigenschaften der T-Zellen zum Zeitpunkt der Restimulation in Frage kommen. So führt die erste Stimulation in der Regel bereits zu einer schnellen Herabregulierung des T-Zell-Rezeptors und anderer kostimulierender Moleküle (Jang and Gu, 2003; Geisler, 2004). Demnach könnte eine fehlende Ansprechbarkeit auf erneute Stimulation aufgrund mangelhafter Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen beruhen. Als weitere Erklärung kommt in Frage, dass humane Th1-Zellen in ihrer Differenzierung stabil sind, während Th2-Zellen durch Restimulation zur IFN-γProduktion angeregt werden können. Entsprechende Ergebnisse zeigen sich bei Stimulation humaner neonataler T-Zellen mit exogenem IL-4 und IL-12 (Sornasse et al., 1996). Wie zu erwarten, führte bei diesen Versuchen die Kultivierung in Gegenwart von IL-12 zu einer Th1-Differenzierung und in Gegenwart von IL-4 zu einer Th2-Differenzierung der T-Zellen. Wurden die so gewonnen Th2-Zellen mit IL-12 restimuliert, so waren Th1-Zellen und Th0-Zellen nachweisbar. Bei den Th1Zellen bewirkten auch mehrfache Restimulationen mit IL-4 allerdings keine Veränderung des Phänotyps hin zu Th2- oder Th0-Zellen. Lediglich der Anteil IFN-γ bildender Zellen und die Menge an gebildetem IFN-γ ging durch die 70 Restimulationen zurück. Diese Ergebnisse unterscheiden sich damit vom murinen Modell, wo Th2-Zellen stabil sind und Th1-Zellen zur Bildung von IL-4 angeregt werden können. Entscheidende Bedeutung für die Auslösung einer Th1-Antwort bei Th2differenzierten T-Zellen kommt offenbar auch der Interaktion zwischen T-Zellen und dendritischen Zellen über den B7-Komplex zu. So konnte gezeigt werden, dass Antikörper, die B7 und dendritische Zellen vernetzen, mehr als 10.000 mal effektiver einen Wechsel des Phänotyps induzieren als die Stimulation der dendritischen Zellen mit TLR-Agonisten wie CpG-oligodeoxynucleotid und Gardiquimod (Radhakrishnan et al., 2007). Möglicherweise war daher die Nachstimulation, die im Rahmen dieser Arbeit – passend zur primären Stimulation mit dem TLR-Agonisten LPS und mit TSST – gewählt wurde, nicht adäquat, um eine Umdifferenzierung der Th2-Zellen zu Th1-Zellen zu bewirken. Aufgrund der geringen Unterschiede zwischen den nachstimulierten und den nicht-nachstimulierten Zellen wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit auf Nachstimulationen mit TSST und dendritischen Zellen verzichtet. Neuere Arbeiten zeigen, dass mehrfache Restimulationen bei langen Kulturdauern von 21-28 Tagen und später gewählten Restimulationszeitpunkten den Anteil der Zytokinbildenden Zellen deutlich erhöhen (Rothoeft et al., 2007). 4.10 Effekte von Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte in allen Versuchsansätzen bei einem Teil der Zellkultur eine Restimulation mit PMA und Ionomycin. Wesentlicher Unterschied zu den nicht nachstimulierten Zellkulturen war ein höherer Anteil IFN-γ bildender Zellen. Diese waren an allen Tagen nachweisbar, insbesondere auch in der späten Phase der Zellkultur nach dem fünften Tag. Im Gegenzug war der Anteil IL-4 bildender Zellen nach Stimulation mit PMA und Ionomycin geringer als in der entsprechenden Kultur ohne Nachstimulation. Bei PMA handelt es sich um einen Phorbol-Ester, der zu einer Aktivierung der Protein-Kinase C führt (Nishizuka, 1984). Ionomycin führt als Calcium-Ionophor sowohl zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration als auch zu einer Aktivierung der Protein-Kinase C (Chatila et al., 1989). Beide 71 Wirkmechanismen haben mitogene Effekte auf Lymphozyten. Die Proliferation ist aber abhängig von der Anwesenheit akzessorischer Zellen, beispielsweise Monozyten (Hashimoto et al., 1991). In den Zellkulturen ohne dendritische Zellen war daher in dieser Arbeit auch kein Effekt der Nachstimulation mit PMA und Ionomycin nachweisbar. Damit ähnelt die Stimulation mit PMA und Ionomycin den Vorgängen bei einer TZell-Aktivierung durch Antigen, die ebenfalls zu einer Protein-Kinase-C-Aktivierung und zur Calcium-Freisetzung führt (Cantrell, 1996). Während PMA über den Mechanismus der PKC-Aktivierung zu einer Th2-Antwort führt, fördert Ionomycin über die Calcium-Freisetzung eine Th1-Antwort (Noble et al., 2000). Dabei ist das Gleichgewicht zwischen PKC-Aktivität und Calcium-Signal von Bedeutung für die Frage der T-Zell-Differenzierung. Hohe PMA- und niedrige Ionomycin-Konzentrationen führen zu einer Th2-Antwort, während niedrige PMAund hohe Ionomycin-Konzentrationen zu einer Th1-Antwort führten. Verglichen mit dieser Studie liegen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Konzentrationen von PMA (10 mg / ml) und Ionomycin (1 µM, ~ 750 ng / ml) jeweils im höheren Dosis-Bereich. Da im Rahmen dieser Arbeit ein deutlich verstärkender Effekt in Richtung Th1-Differenzierung und eine Supprimierung der Th2-Differenzierung nachgewiesen werden konnte, scheinen bei gleichzeitiger Anwendung hoher Dosierungen von PMA und Ionomycin die Effekte des Ionomycins zu dominieren. Ein wichtiges Ergebnis war die Tatsache, dass in den mit PMA und Ionomycin stimulierten Kulturen auch nach Tag 5 IFN-γ-bildende Zellen nachweisbar waren, während in den nicht stimulierten Kulturen fast ausschließlich IL-4 nachweisbar war. Zudem führte die Stimulation mit PMA und Ionomycin zu einer Abnahme der IL-4 bildenden Zellen. Dies lässt vermuten, dass PMA und Ionomycin in der Lage waren, in den stimulierten Kulturen Th2-Zellen zur Bildung von IFN-γ anzuregen. Entsprechende Ergebnisse ließen sich auch bei für das Hausstaubmilben-Antigen Der p 1 spezifischen Th2-Zellen erzielen, die mit PMA und Ionomycin stimuliert wurden, was darauf hinweist, dass auch in diesen Zellen das IFN-γ-Gen nicht komplett abgeschaltet ist (Yssel et al., 1992). Auf die Möglichkeit eines Wechsels des Phänotyps von Th2- zu Th1-Zellen wurde bereits im letzten Abschnitt eingegangen. 72 4.11 Weitere Einflussfaktoren Verschiedene Einflussfaktoren, die im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht wurden, sind in dieser Diskussion schon kurz genannt worden. Eine Weiterentwicklung des in dieser Arbeit vorgestellten Zellkultur-Systems sollte zum Ziel haben, die offen gebliebenen Fragen zu klären. Dazu zählen insbesondere: - Der Einfluss der Kostimulation über verschiedene Signalwege, z.B. CD28 / CD80 / CD86 und CD40 / CD40L - Der Einfluss verschiedener Arten von antigenpräsentierenden Zellen, insbesondere verschiedener Arten von dendritischen Zellen. So konnten kürzlich CD205-positive dendritische Zellen als Subtyp identifiziert werden, der in der Lage ist, unabhängig von IL-12 über CD70 zu einer Th1Differenzierung zu führen (Soares et al., 2007). Daneben gibt es noch zwei weitere offene Fragen, die für die Weiterentwicklung des Zell-Kultursystems von Bedeutung sind. Zum einen sind bei der Frage nach der Th-Zell-Differenzierung Unterschiede zwischen der Gen-Expression, der intrazellulären Zytokinproduktion und der extrazellulären Sekretion von Zytokinen beschrieben worden (Lagoo et al., 1994). Es sollte daher neben der intrazellulären Zytokinbestimmung auch Methoden angewendet werden, mit denen die Expression der jeweiligen Zytokin-Gene und die Menge an sezernierten Zytokinen im Überstand bestimmt werden kann. Daneben ist noch die Frage zu klären, ob bei den untersuchten T-Zellen auch Zellen vorhanden sind, die sowohl IFN-γ als auch IL-4 produzieren. Entsprechende Zellen sind bereits beschrieben worden (Openshaw et al., 1995). Eine Identifikation kann mit der durchflußzytometrischen, intrazellulären Zytokinmessung auf sicherem und einfachem Weg erfolgen. Möglicherweise handelt es sich bei den Zellen, die nach Aktivierung sowohl IFN-γ als auch IL-4 bilden können um NKT-Zellen und γ:δ-T-Zellen (Chen and Kung, 2007). 4.12 Perspektiven / Klinische Aspekte In der vorliegenden Arbeit wurde ein Zellkultursystem etabliert, das es ermöglicht, Einflüsse auf die T-Zell-Differenzierung naiver Nabelschnur-T-Zellen zu 73 untersuchen. Bisherige Arbeiten zu diesem Thema beruhten überwiegend auf in vitro und in vivo Mausmodellen. Das hier vorgestellte humane in vivo Zellkultursystem schließt daher eine Lücke, um langfristig eine Übertragbarkeit der Ergebnisse von Mausmodellen auf den Menschen zu überprüfen und eventuelle humane in vivo-Studien zu ermöglichen. Wesentliche Merkmale dieses Systems sind die Verwendung autologer Zellen sowie der weitgehende Verzicht auf unphysiologische externe Stimuli wie z.B. exogen zugeführte Zytokine oder Antikörper. Durch die Verwendung des Superantigens TSST gelang es, den physiologischen Weg der T-Zell-Aktivierung über den MHC-TCR-Kontakt zwischen antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle zu nutzen. Die Folge ist eine Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen, die durch die Bildung ihrer charakteristischen Zytokine identifiziert werden können. Durch die unterschiedliche Aktivierung von Vβ2-positiven und Vβ2-negativen Zellen ist es möglich, die durch TSST aktivierten Vβ2-positiven Zellen und die nicht aktivierten Vβ2-negativen Zellen in einer Probe parallel zu untersuchen. Diese nicht aktivierten Zellen können dann jeweils als Kontrollgruppe für jede Messung dienen, allerdings unter Berücksichtigung und Minimierung des bereits diskutierten Bystander-Effektes, der auch zur Aktivierung Vβ2 negativer Zellen führen kann. Die stabile IFN-γ- bzw. IL-4-Produktion in Abhängigkeit von Stimuli und Kinetik ermöglicht die Untersuchung verschiedener neuer Einflussfaktoren, auch aus dem klinischen Bereich. So wäre zum Beispiel die Untersuchung von Kindern mit einer atopischen Disposition interessant. Für Neugeborene mit dem erhöhten Risiko einer atopischen Erkrankung konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit zur IFN-γProduktion auf Stimulation mit bakteriellen Produkten wie LPS oder Superantigenen vermindert ist (Pohl et al., 1997). Andererseits gibt es Hinweise darauf, dass eine Endotoxin-Exposition vor der Entwicklung einer Atopie schützen kann (von Mutius et al., 2000). Ein wichtiger Krankheitserreger, der eine Veränderung der Th-Differenzierung bewirken kann, ist das RS-Virus. Reduzierte IFN-γ-Produktion und vermehrte Th2-Antworten nach RS-Virus-Infektionen sind beschrieben (Schauer et al., 2004), ein Effekt, der vermutlich mit einer veränderten Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen zusammenhängt (de Graaff et al., 2005). Hier bietet das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Zellkultur-System Möglichkeiten der genaueren Untersuchung der Zusammenhänge. 74 5 Zusammenfassung In dieser Arbeit sollten in einem humanen, autologen Zellkultursystem die Faktoren untersucht werden, welche die Differenzierung von naiven T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen beeinflussen. Die Differenzierung in Th1- bzw. Th2-Zellen wurde dabei anhand der durchflußzytometrischen Messung der intrazellulären Zytokinproduktion der charakteristischen Zytokine IFN-γ bzw. IL-4 beurteilt. Folgende Einflussfaktoren auf die T-Zell-Differenzierung wurden untersucht: die Notwendigkeit von exogenen Stimuli, die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von dendritischen Zellen, der Einfluss des Endotoxins LPS als Stimulus, das Ausmaß der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors durch Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen des Superantigens TSST, die Abhängigkeit von der Dauer der Zellkultur sowie der Einfluss von Restimulationen mit TSST und dendritischen Zellen bzw. mit PMA und Ionomycin. Im Gegensatz zu allogenen Zellkultursystemen erwiesen sich in der autologen Zellkultur die Zellen als nicht überlebensfähig. Durch Zusatz der Zytokine IL-2 oder IL-7 zu den Zellkulturen konnte das Überleben der Zellen verbessert werden. Unter dieser Stimulation zeigten die Zellen eine Th2-Differenzierung. Als wesentliche Einflussfaktoren für die Generierung von Th1-Zellen konnten die Stimulation mit LPS und eine starke Stimulation über den T-Zell-Rezeptor mit TSST identifiziert werden. Der zeitliche Ablauf der T-Zell-Differenzierung hat einen charakteristischen Verlauf, mit einem Maximum der Th1-differenzierten Zellen an Tag 3 der Kultur und einem Maximum der Th2-differenzierten Zellen an Tag 7 der Kultur. Restimulationen mit TSST und dendritischen Zellen hatten nur einen geringen Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung. Durch Stimulation mit PMA und Ionomycin konnte ein hoher Anteil Th1-differenzierter Zellen erzeugt werden, unabhängig von der Dauer der Kultur. Wesentliche Merkmale des im Rahmen dieser Arbeit etablierten Zellkultursystems sind die Verwendung autologer Zellen und der weitgehende Verzicht auf exogene Stimuli. Durch die Möglichkeit in Abhängigkeit von Stimuli und Kinetik Th1- und Th2-differenzierte T-Zellen zu erzeugen, ergeben sich Möglichkeiten zur Untersuchung pathogener Einflüsse auf die T-Zell-Differenzierung in diesem Modell. 75 6 Literaturverzeichnis Adkins, B. (2000). Development of Neonatal Th1 / Th2 Function. Intern Rev Immunol 19, 157-171 Adkins, B., Bu, Y., Guevara, P. (2001). The generation of Th memory in neonates versus adults : prolonged primary Th2 effector function and impaired development of Th1 memory effector function in murine neonates. J Immunol 166, 918-925 Andersen, P.S., Geisler, C., Buus, S., Mariuzza, R.A., Karjalainen, A. (2001). Role of the T Cell Receptor Ligand Affinity in T Cell Activation by Bacterial Superantigens. J Biol Chem 276, 33452-33457 Ariga, H., Shimohakamada, Y., Nakada, M., Tokunaga, T., Kikuchi, T., Kariyone, A., Tamura, T., Takatsu, K. (2007). Instruction of naïve CD4+ T-cell fate to T-bet expression and T helper 1 development: roles of T-cell receptor-mediated signals. Immunology 122, 210-221 Banchereau, J., Steinman, R.M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-251 Bartz, H. (2001). In vitro-Modell der primären Immunantwort. Dissertation, Ruhr-Universität Bochum. Bhardwaj, N., Young, J.W., Nisanian, A.J., Baggers, J., Steinman, R.M. (1993). Small Amounts of Superantigen, When Presented on Dendritic Cells, Are Sufficient to Iniatiate T Cell Responses. J Exp Med 178, 633-642 76 Bhardwaj, N., Friedman, S.M, Cole, B.C., Nisanian, A.J. (1992). Dendritic Cells Are Potent Antigen-presenting Cells for Microbial Superantigens. J Exp Med 175, 267-273 Bird, J.J., Brown, D.R., Mullen, A.C., Moskowitz, N.H., Mahowald, M.A., Sider, J.R., Gajewski, T.F., Wang, C-R., Reiner, S.L. (1998). Helper T Cell Differentiation Is Controlled by the Cell Cycle. Immunity 9, 229-237 Bradley, L.M., Duncan, D.D., Tonkonogy, S., Swain, S.L. (1991). Characterization of antigen-specific CD4+ effector T cells in vivo: immunization results in a transient population of MEL-14-, CD45RB- helper cells that secretes interleukin 2 (IL-2), IL-3, IL-4, and interferon gamma. J Exp Med 174, 547-559 Brandt, K., Van Der Bosch, J., Fliegert, R., Gehring, S. (2002). TSST-1 Induces Th1 or Th2 Differentiation in Naive CD4+ T Cells in a Dose- and APC-Dependent Manner. Scand J Immunol 56, 572-579 Bueno, C., Criado, G., McCormick, J.K., Madrenas, J. (2007) T Cell Signalling Induced by Bacterial Superantigens. Chem Immunol Allergy 93, 161-180 Cantrell, D. (1996). T cell antigen receptor signal transduction pathways. Annu Rev Immunol 14, 259-274 Caux, C., Dezutter-Dambuyant, C., Schmitt, D., Banchereau, J. (1992). GM-CSF and TNF-α cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells. Nature 360, 258-261 77 Cella, M., Scheidegger, D., Palmer-Lehmann, K., Lane, P., Lanzavecchia, A., Alber, G. (1996). Ligation of CD40 on Dendritic Cells Triggers Production of High Levels of Interleukin-12 and Enhances T Cell Stimulatory Capacity: T-T Help via APC Activation. J Exp Med 184, 747-752 Chalmers, I.M.H., Janossy, G., Contreras, M., Navarrete, C. (1998). Intracellular Cytokine Profile of Cord and Adult Blood Lymphocytes. Blood 92, 11-18 Chatila, T., Silverman, L., Miller, R., Geha, R. (1989). Mechanisms of T Cell activation by the calcium ionophore Ionomycin. J Immunol 143, 1283-1289 Chen, Y-T., Kung JT. (2007). IL-4 inducibility in NKT cells, naive CD4+ T cells and TCR-γ δ T cells. J Biomed Sci 14, 533-538 Choi, Y., Lafferty, J.A., Clements, J.R., Todd, J.K., Gelfand, E.W., Kappler, J., Marrack, P., Kotzin, B.L. (1990). Selective Expansion of T Cells Expressing Vβ2 in Toxic Shock Syndrome. J Exp Med 172, 981-984 Cohen, S.B., Perez-Cruz, I., Fallen, P., Gluckman, E., Madrigal, J.A. (1999). Analysis of the Cytokine Production by Cord and Adult Blood. Human Immunology 60, 331-336 Das, G., Sheridan, S., Janeway, C.A., Jr. (2001). The Source of Early IFN-γ That Plays a Role in Th1 Priming. J Immunol 167, 2004-2010 De Jong, E.C., Smits, H.H., Kapsenberg, M.L. (2005). Dendritic cell-mediated T cell polarization. Springer Semin Immun 26, 289-307 78 De Graaff, P.M, de Jong, E.C., van Capel, T.M., van Dijk, M.E., Roholl, P.J., Boes, J., Luytjes, W., Kimpen, J.L., van Bleek, G.M. (2005). Respiratory Syncytial Virus Infection of Monocyte-Derived Dendritic Cells Decreases Their Capacity to Activate CD4 T Cells. J Immunol 175, 5904-5911 De Wit, D., Tonon, S., Olislagers, V., Goriely, S., Boutriaux, M., Goldman, M., Willems, F. (2003). Impaired responses to toll-like receptor 4 and toll-like receptor 3 ligangs in human cord blood. J Autoimmun 21, 277-281 Fleischer, H., Necker, A., Leget, C., Malissen, B., Romagne, F. (1996). Reactivity of Mouse T-Cell Hybridomas Expressing Human Vβ Gene Segments with Staphylococcal and Streptococcal Superantigens. Infect Immun 64, 987-994 Florquin, S., Aaldering, L. (1997). Superantigens: a new tool to gain new insight into cellular immunity. Res Immunol 148, 373-386 Fraser, J.D., Newton, M.E., Weiss, A. (1992). CD28 and T cell antigen receptor signal transduction coordinately regulate interleukin 2 gene expression in response to superantigen stimulation. J Exp Med 175, 1131-1134 Garcia, A.M., Fadel, S.A., Cao, S., Sarzotti, M. (2000). T Cell Immunity in Neonates. Immunol Res 22, 177-190 Gehring, S., Schlaak, M., van der Bosch, J. (1998). A new in vitro model for studying human T cell differentiation: Th1/Th2 induction following activation by superantigens. J Immunol Meth 219, 85-98 79 Geisler, C. (2004). TCR trafficking in resting and stimulated T cells. Crit Rev Immunol 24, 67-86 Gerosa, F., Baldani-Guerra, B., Nisii, C., Marchesini, V., Carra, G., Trinchieri, G. (2002). Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells. J Exp Med 195, 327-333 Gowans, J.L. (1996). The lymphocyte – a disgraceful gap in medical knowledge. Immunology Today 17, 288-291 Grabbe, S., Kämpgen, E., Schuler, G. (2000). Dendritic cells: multi-lineal and multi-functional. Immunology Today 21, 431-433 Harrington, L.E., Hatton, R.D., Mangan, P.R., Turner, H., Murphy, T.L., Murphy, K.M., Weaver, C.T. (2005). Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol 6, 1123-1132 Hashimoto, S., Takahashi, Y., Tomita, Y., Hayama, T., Sawada, S., Horie, T, McCombs, C.C., Michalski, J.P. (1991). Mechanism of Calcium Ionophore and Phorbol Ester-Induced T-cell Activation. Scand J Immunol 33, 393-403 Hassan, J., O’Neill, S., O’Neill, L.A., Pattison, U., Reen, D.J. (1995). Signalling via CD28 of human naïve neonatal T lymphocytes. Clin Exp Immunol 102, 192-198 80 Herz, U., Ahrens, B., Scheffold, A., Joachim, R., Radbruch, A., Renz, H. (2000). Impact of in utero Th2 immunity on T cell deviation and subsequent immediatetype hypersensitivity in the neonate. Eur J Immunol 30, 714-718 Hilkens, C.M.U., Kalinski, P., de Boer, M., Kapsenberg, M.L. (1997). Human Dendritic Cells Require Exogenous Interleukin-12-Inducing Factors to Direct the Development of Naive T-Helper Cells Toward the Th1 Phenotype. Blood 90, 1920-1926. Holländer, G.A., Barthlott, T., Keller, M.P., Krenger, W., Piali, L. (2005): T-Zell-System (Kap.5, S. 82-133). In: Wahn, U., Seger, R., Wahn, V., Holländer, G.A. (Hrsg.). Pädiatrische Allergologie und Immunologie. Urban & Fischer, München Iezzi, G., Scotet, E., Scheidegger, D., Lanzavecchia, A. (1999). The interplay between the duration of TCR and cytokine signaling determines T cell polarization. Eur J Immunol 29, 4092-4101 Ise, W., Totsuka, M., Sogawa, Y., Ametani, A., Hachimura, S., Sato, T., Kumagai, Y., Habu, S., Kaminogawa, S. (2002). Naive CD4+ T Cells Exhibit Distinct Expression Patterns of Cytokines and Cell Surface Molecules on Their Primary Responses to Varying Doses of Antigen. J Immunol 168, 3242-3250 Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (2002). Immunologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Jang, I.K., Gu, H. (2003). Negative regulation of TCR signaling and T-cell activation by selective protein degradation. Curr Opin Immunol 15, 315-320 81 Jelley-Gibbs, D.M., Lepak, N.M., Yen, M., Swain S.L. (2000). Two Distinct Stages in the Transition from Naive CD4 T Cells to Effectors, Early Antigen-Dependent and Late Cytokine-Driven Expansion and Differentiation. J Immunol 165, 5017-5026 Jiang, H-R., Muckersie, E., Robertson, M., Xu, H., Liversidge, J., Forrester, J.V. (2002). Secretion of interleukin-10 or interleukin-12 by LPS-activated dendritic cells is critically dependent on time of stimulus relative to initiation of purified DC culture. J Leukoc Biol 72, 978-985 Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. (1993). Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Meth 159, 197-207 Kalinski, P., Schuitemaker, J.H.N., Hilkens, C.M.U., Wierenga, E.A., Kapsenberg, M.L. (1999). Final Maturation of Dendritic Cells Is Associated with Impaired Responsiveness to IFN-γ and to Bacterial IL-12 Inducers: Decreased Ability of Mature Dendritic Cells to Produce IL-12 During the Interaction with Th Cells. J Immunol 162, 3231-3236 Kamath, A.T., Sheasby, C.E., Tough, D.F. (2005). Dendritic Cells and NK Cells Stimulate Bystander T Cell Activation in Response to TLR Agonists through Secretion of IFN-αβ and IFN-γ. J Immunol 174, 767-776 King, C.L., Stupi, R.J., Craighead, N., June, C.H., Thyphronitis, G. (1995). CD28 activation promotes Th2 subset differentiation by human CD4+ cells. Eur J Immunol 25, 587-595 Krakauer, T. (1996). Immune Response to Staphylococcal Superantigens. Immunologic Research 20, 163-173 82 Krumbiegel, D., Anthogalidis-Voss, C., Markus, H., Zepp, F., Meyer, C.U. (2007). Enhanced expression of IL-27 mRNA in human newborns. Pediatr Allergy Immunol, epub ahead of print, 2007 Dec 21, p S0905-6157 Krumbiegel, D., Zepp, F., Meyer, C.U. (2007). Combined Toll-like receptor agonists synergistically increase production of inflammatory cytokines in human neonatal dendritic cells. Hum Immunol 68, 813-822 Kum, W.W.S., Hung, R.W.Y., Cameron, S.B., Chow, A.W. (2001). Temporal Sequence and Functional Implications of Vβ-Specific T Cell Receptor Down-regulation and Costimulatory Molecule Expression following In Vitro Stimulation with the Staphylococcal Superantigen Toxic Shock Syndrome Toxin-1. J Infect Dis 185, 555-560 Kuntz Crow, M., Kunkel. H.G. (1982). Human dendritic cells: major stimulators of the autologous and allogeneic mixed leucocyte reactions. J Exp Med 49, 338-346 Lagoo, A.S., Lagoo-Deenadayalan, S., Lorenz, H.M., Byrne, J., Barber, W.H., Hardy, K.J. (1994). IL-2, IL-4, and IFN-γ Gene Expression Versus Secretion in Superantigen-Activated T Cells. J Immunol 152, 1641-1652 Langenkamp, A., Casorati, G., Garavaglia, C., Dellabona, P., Lanzavecchia, A., Sallusto, F. (2002). T cell priming by dendritic cells: thresholds for proliferation, differentiation and death and intraclonal functional diversification. Eur J Immunol 32, 2046-2054 Lanzavecchia, A., Lezzi, G., Viola, A. (1999). From TCR engagement to T cell activation: a kinetic view of T cell behaviour. Cell 96, 1-4 83 Lanzavecchia, A., Sallusto, F. (2001). Regulation of T cell immunity by dendritic cells. Cell 106, 263-266 Lederer, J.A., Perez, V.L., Des Roches, L., Kim, S.M., Abbas, A.K., Lichtman, A.H. (1996). Cytokine transcriptional events during helper T cell subset differentiation. J Exp Med 184, 397-406 Leung, D.Y., Meissner, H.C., Fulton, D.R., Murray, D.L., Kotzin, B.L., Schlievert, P.M. (1993). Toxic shock syndrome toxin-secreting Staphylococcus aureus in Kawasaki syndrome. Lancet 342, 1385-1388 Liu, Y-J. (2001). Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity. Cell 106, 259-263 Mailliard R.B., Egawa, S., Cai, Q., Kalinska, A., Bykovskaya, S.N., Lotze, M.T., Kapsenberg, M.L., Storkus, W.J., Kalinski, P. (2002). Complementary Dendritic-Cell-activating Function of CD8+ and CD4+ T Cells: Helper Role of CD8+ T Cells in the Development of T Helper Type 1 Responses. J Exp Med 195, 473-483 Mailliard, R.B., Son, Y.I., Redlinger, R., Coates, P.T., Giermasz, A., Morel, P.A, Storkus, W.J., Kalinski, P. (2003). Dendritic cells mediate NK cell help for Th1 and CTL responses: two-signal requirement for the induction of NK cell helper function. J Immunol 171, 2366-2373 Marrack, P., Kappler, J. (1990). The Staphylococcal Enterotoxins and Their Relatives. Science 248, 705-711 84 Medzhitov, R., Janeway, C., Jr. (2000). The Toll receptor family and microbial recognition. Trends in Microbiology 8: 452-456 Mellman, I., Steinman, R.M. (2001). Dendritic cells: Specialized and Regulated Antigen Processing Machines. Cell 106, 255-258 Mingari M.C., Maggi, E., Cambiaggi, A., Annunziato, F., Schiavetti, F., Manetti, R., Moretta, L., Romagnani, S. (1996). Development in vitro of human CD4+ thymocytes into functionally mature Th2 cells. Exogenous Interleukin-12 is required for priming thymocytes to produce both Th1 cytokines and Interleukin-10. Eur J Immunol 26, 1083-1087 Mosmann, T.R., Coffman, R.L. (1989). Th1 and Th2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173 Mosmann, T.R., Sad, S. (1996). The expanding universe of T-cell subsets : Th1, Th2 and more. Immunology Today 17, 1085-1094 Muralimohan, G., Vella, A.T. (2006). A role for IFN-gamma in differential superantigen stimulation of conventional versus plasmacytoid DCs. Cellular Immunology 242, 9-22 Murphy, K.M., Ouyang, W., Farrar, J.D., Yang, J., Ranganath, S., Asnagli, H., Afkarian, M., Murphy, T.L. (2000). Signaling and Transcription in T Helper Development. Annu Rev Immunol 18, 451-494 85 Nebe, C.T. (1996). Durchflußzytometrische Messtechnik und Datenauswertung. Infusionsther Transfusionsmed 23, 111-113 Nembrini, C., Abel, B., Kopf, M., Marsland, B.J. (2006). Strong TCR Signaling, TLR Ligands, and Cytokine Redundancies Ensure Robust Development of Type 1 Effector T Cells. J Immunol 176, 7180-7188 Noble, A., Truman, J.P., Vyas, B., Vukmanovic-Stejic, M., Hirst, W.J., Kemeny, D.M. (2000). The Balance of Protein Kinase C and Calcium Signaling Directs T Cell Subset Development. J Immunol 164, 1807-1813 Nurieva, R., Thomas, S., Nguyen, T., Martin-Orozco, N., Wang, Y., Kaja, M.K., Yu, X.Z., Dong, C. (2006). T-cell tolerance or function is determined by combinatorial costimulatory signals. EMBO J 25, 2623-2633 Openshaw, P., Murphy, E.E., Hosken, N.A., Maino, V., Davis, K., Murphy, K., O'Garra, A. (1995). Heterogeneity of intracellular cytokine synthesis at the single-cell level in polarized T helper 1 and T helper 2 populations. J Exp Med 182, 1357-1367 Park, H., Li, Z., Yang, X.O., Chang, S.H., Nurieva, R., Wang, Y.H., Wang, Y., Hood, L., Zhu, Z., Tian, Q., Dong, C. (2005). A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing Interleukin 17. Nat Immunol 6, 1133-1141 Perez, V.L., Lederer, J.A., Lichtman, A.H., Abbas, A.K. (1995). Stability of Th1 and Th2 populations. Int Immunol 7, 869-875 86 Pohl, D., Bockelmann, C., Forster, K., Rieger, C.H., Schauer, U. (1997). Neonates at risk of atopy show impaired production of interferon-gamma after stimulation with bacterial products (LPS and SEE). Allergy 52, 732-738 Prussin, C., Metcalfe D. D. (1995). Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Meth 188, 117-128 Radhakrishnan, S., Wiehagen, K.R., Pulko, V., Van Keulen, V.P., Faubion, W.A., Knutson, K.L., Pease, L.R. (2007) Induction of a Th1 Response from Th2-Polarized T Cells by Activated Dendritic Cells: Dependence on TCR:Peptide-MHC Interaction, ICAM-1, IL-12, and IFNgamma J Immunol 178, 3583-3592 Reid, S.D., Penna, G., Adorini, L. (2000). The control of T cell responses by dendritic cell subsets. Curr Opin Immunol 12, 114-121 Rissoan, M.C., Soumelis, V., Kadowaki, N., Grouard, G., Briere, F., de Waal Malefyt, R., Liu, Y-J. (1999). Reciprocal Control of T Helper Cell and Dendritic Cell Differentiation. Science 283, 1183-1186 Romagnani, S. (2000). T-cell subsets (Th1 versus Th2). Ann Allergy Asthma Immunol 85, 9-21 Rothoeft, T., Fischer, K., Zawatzki, S., Schulz, V., Schauer, U., Körner-Rettberg, C. (2007). Differential response of human naive and memory/effector cells to dendritic cells infected by respiratory syncytial virus. Clin Exp Immunol 150, 263-273 87 Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. (1995). Dendritic Cells Use Macropinocytosis and the Mannose Receptor to Concentrate Macromolecules in the Major Histocompatibility Complex Class II Compartment: Downregulation by Cytokines and Bacterial Products. J Exp Med 182, 389-400 Scheinecker, C., Machold, K.P., Majdic, O., Höcker, P., Knapp, W., Smolen, J.S. (1998). Initiation of the Autologous Mixed Lymphocyte Reaction Requires the Expression of Costimulatory Molecules B7-1 and B7-2 on Human Peripheral Blood Dendritic Cells. J Immunol 161, 3966-3973 Schoenborn, J.R., Wilson, C.B. (2007). Regulation of Interferon-γ During Innate and Adaptive Immune Responses. Adv Immunol 96, 41-101 Schuhbauer, D.M.S., Mitchison, N.A., Mueller, B. (2000). Interaction within clusters of dendritic cells and helper T cells during initial Th1/Th2 commitment. Eur J Immunol 30, 1255-1262 Seder, R.A., Prussin, C. (1997). Are Differentiated Human T Helper Cells Reversible? Int Arch Allergy Immunol 113, 163-166 Smolen, J.S., Luger, T.A., Chused, T.M., Steinberg, A.D. (1981). Responder cells in the human autologous mixed lymphocyte reaction. J Clin Invest 68, 1601-1604 Soares, H., Waechter, H., Glaichenhaus, N., Mougneau, E., Yagita, H., Mizenina, O., Dudziak, D., Nussenzeig, M.C., Steinman, R.M. (2007). A subset of dendritic cells induces CD4+ T cells to produce IFN-γ by IL-12independent but CD70-dependent mechanism in vivo. J Exp Med 204, 1095-1106 88 Soares M.V.D, Borthwick N.J., Maini M.K., Janossy, G., Salmon, S., Akbar, A.N. (1998). IL-7-Dependent Extrathymic Expansion of CD45RA+ T Cells Enables Preservation of a Naïve Repertoire. J Immunol 161, 5909-5917 Sornasse ,T., Larenas, P.V., Davis, K.A., de Vries, J.E., Yssel, H. (1996). Differentiation and Stability of T helper 1 and 2 cells derived from naïve human neonatal CD4+ T cells, analysed at the single-cell level J Exp Med 184, 473-483 Steinman, R.M. (1991). The Dendritic Cell System And Its Role In Immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-296 Stockinger, B., Veldhoen, M. (2007). Differentiation and function of Th17 T cells. Curr Opin Immunol 19, 281-286 Swain, S.L., Weinberg, A.D., English, M., Huston, G. (1990). IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol 145, 3796-3806 Szabolcs, P., Feller, E.D., Moore, M.A., Young, J.W. (1995). Progenitor recruitment and in vitro expansion of immunostimulatory dendritic cells from human CD34+ bone marrow cells by c-kit-ligand, GM-CSF, and TNF alpha. Adv Exp Med Biol 378, 17-20 Takahashi, N., Imanishi, K., Nishida, H., Uchiyama, T. (1995). Evidence for Immunologic Immaturity of Cord Blood T Cells. Cord Blood T Cells Are Susceptible to Tolerance Induction to In Vitro Stimulation with a Superantigen. J Immunol 155, 5213-5219 89 Tao, X., Constant, S., Jorritsma, P., Bottomly, K. (1997). Strength of TCR Signal Determines the Costimulatory Requirements for Th1 and Th2 CD4+ T Cell Differentiation. J Immunol 159, 5956-5963 Thomas, D., Chou, S., Dauwalder, O., Lina, G. (2007). Diversity in Staphylococcus aureus Enterotoxins. Chem Immunol Allergy 93, 24-41 Ullman, K.S., Northrop, J.P., Verweij, C.L., Crabtree, G.R. (1990). Transmission of signals from the T lymphocyte antigen receptor to the genes responsible for cell proliferation and immune function: the missing link. Annu Rev Immunol 8, 421-452 Verhasselt, V., Buelens, C., Willems, F., De Groote, D., Haeffner-Cavaillon, N., Goldman, M. (1997). Bacterial Lipopolysaccharide Stimulates the Production of Cytokines and the Expression of Costimulatory Molecules by Human Peripheral Blood Dendritic Cells. Evidence for a Soluble CD-14-Dependent Pathway. J Immunol 158, 2919-2925 Vieira, P.L., de Jong, E.C., Wierenga, E.A., Kapsenberg, M.L., Kalinski, P. (2000). Development of Th1-Inducing Capacity in Myeloid Dendritic Cells Requires Environmental Instruction. J Immunol 164, 4507-4512 Von Mutius, E., Braun-Fahrländer, C., Schierl, R., Riedler, J., Ehlermann, S., Maisch, S., Waser, M., Nowak, D. (2000). Exposure to endotoxin or other bacterial components might protect against the development of atopy. Clin Exp Allergy 30, 1230-1234 90 Weber, A.K., Wahn, U., Renz, H. (2000). Superantigen-Induced T Cell Death by Apoptosis: Analysis on a Single Cell Level and Effect of IFN-γ and IL-4 Treatment. Int Arch Allergy Immunol 121, 215-223 Yssel, H., Johnson, K.E., Schneider, P.V., Wideman, J., Terr, A., Kastelein, R., De Vries, J.E. (1992). T Cell Activation-Inducing Epitopes of the House Dust Mite Allergen Der p I. Proliferation and Lymphokine Production Patterns by Der p I-Specific CD4+ T Cell Clones. J Immunol 148, 738-745 Zhang, X., Giangreco, L., Broome, H.E., Dargan, C.M., Swain, S.L. (1995). Control of CD4 effector fate: transforming growth factor beta1 and Interleukin 2 synergize to prevent apoptosis and promote effector expansion. J Exp Med 182, 699-709 Abbildungsnachweis Abbildung 1: Aufbau und schematischer Strahlengang im FACScanDurchlußzytometer: http://www.facslab.toxikologie.uni-mainz.de/zytometrie.jsp (Zugriff am 01.03.2008) 91 7 Danksagung Herrn Prof. Schauer danke ich für die Überlassung des Themas dieser Arbeit und für die geduldige Betreuung über einen langen Zeitraum. Herrn Dr. med. Holger Bartz danke ich für zahlreiche interessante Diskussionen und Anregungen während des praktischen Teils dieser Arbeit. Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel vom Immunologischen Labor danke ich für die Einarbeitung in die labortechnischen Arbeitsmethoden und Hilfestellung zu jedem Zeitpunkt. Meiner Ehefrau Silke Bongartz danke ich für Ermunterung und jede erdenkliche Unterstützung während dieser Arbeit sowie für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Meinen Eltern, Angelika Gonschorek und Helmut Gonschorek, danke ich für die Ermöglichung des Medizin-Studiums und ihre Unterstützung in dieser Zeit. 8 Lebenslauf Andreas Bongartz, geb. Gonschorek, geboren am 22.11.1975 in Düsseldorf, verheiratet, eine Tochter, römisch-katholischen Bekenntnisses Sohn von Helmut Gonschorek und Angelika Gonschorek, geb. Jansen 1995 Abitur 1997 Ärztliche Vorprüfung, Ruhr-Universität Bochum 1998 1. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum 2001 2. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum 2001 – 2002 Praktisches Jahr am Sana-Klinikum Remscheid, Wahlfach Anästhesie Mai 2002 3. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum Juni 2002 - Arzt im Praktikum und Assistenzarzt, Klinik für Mai 2005 Anästhesiologie, postoperative Intensivmedizin und Schmerztherapie (Chefarzt Dr. H. Thole), Grafschafter Klinikum, Nordhorn Februar 2005 Zusatzbezeichnung „Rettungsmedizin“ Seit Juni 2005 Leiter der Abteilung Medizincontrolling und Zentrale Patientenaufnahme, Grafschafter Klinikum, Nordhorn Seit Oktober 2007 Mitglied der Gruppe Leitender Notärzte im Landkreis Grafschaft Bentheim