Differenzierung neonataler naiver T-Helferzellen in der

Aus der
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital
Universitätsklinik
Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann
Differenzierung neonataler naiver T-Helferzellen in
der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Andreas Bongartz
aus Düsseldorf
2008
Dekan:
Prof. Dr. G. Muhr
1. Referent:
Prof. Dr. U. Schauer
2. Referent:
Prof. Dr. A. Bufe
Tag der Mündlichen Prüfung: 25.06.2009
ABSTRACT
Bongartz
Andreas
Differenzierung neonataler naiver T-Helferzellen in der autologen Kokultur mit dendritischen Zellen
Problem
Die Faktoren, die eine Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu T-Helferzellen vom Typ Th1 bzw. vom
Typ Th2 beeinflussen, sind in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung gewesen. Dabei
konnten sowohl im Mausmodell als auch in humanen Zellkulturmodellen wichtige Einflussfaktoren ermittelt
werden, unter anderem Art und Dosis des Antigens, Art der Antigenaufnahme, genetische Faktoren und das
vorherrschende Zytokinmilieu. Allerdings sind die Ergebnisse aus Mausmodellen nur begrenzt auf die
Verhältnisse beim Menschen übertragbar und bisherige Ergebnisse aus humanen Zellkulturmodellen kamen
häufig unter relativ unphysiologischen Bedingungen zu Stande, z.B. in allogenen Kultursystemen oder unter
Verwendung exogener Zytokine. Im Rahmen dieser Arbeit sollte in einem autologen Zellkultursystem und
unter Verwendung möglichst physiologischer Stimuli die Differenzierung neonataler T-Helferzellen untersucht
werden.
Methode
Vorversuche zeigten das Vorhandensein von HLA-DR-positiven Zellen in der Gruppe der CD45RA-positiven
Zellen. Diese Zellen konnten erfolgreich depletiert werden, so dass für die autologe Zellkultur CD45RApositive, HLA-DR-negative Zellen zusammen mit dendritischen Zellen verwendet wurden, die aus
Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchtet wurden. Die Zellkulturen wurden je nach Versuchsansatz
mit IL-2, IL-7, Lipopolysaccharid (LPS) oder dem Superantigen TSST stimuliert. Die Differenzierung der TZellen wurde durch Messung der intrazellulären Zytokinbildung mittels Durchflußzytometrie ermittelt. Dabei
dienten die charakteristischen Zytokine IFN-γ und IL-4 als Marker für Th1- bzw. Th2-Antworten.
Ergebnis
T-Zellen ohne Stimulation zeigten in der autologen Zellkultur nach 7 Tagen kein Überleben mehr. Durch
Einsatz der Zytokine IL-2 oder IL-7 konnten die Zellen am Leben erhalten werden. Die Zellen zeigten unter
dieser Stimulation eine Th2-Differenzierung. Durch Einsatz des Superantigens TSST-1 konnte gezielt die
Gruppe der Vβ2-positiven Zellen stimuliert werden. Unter Einsatz von TSST-1 waren auch Th1-differenzierte
Zellen nachweisbar und es konnten eine hohe TSST-Konzentration und die Anwesenheit von LPS als wichtige
Einflussfaktoren für eine Th1-Differenzierung identifiziert werden. Untersuchungen zur Kinetik der
Differenzierung zeigten, dass der Anteil IFN-γ-bildender Zellen an Tag 3 am größten ist und dann schnell
wieder abnimmt. IL-4-bildende Zellen sind in geringer Zahl ab dem zweiten Tag vorhanden. Unter niedrigen
TSST-Konzentrationen steigt ihr Anteil ab dem sechsten Tag stark an.
Diskussion
Es wurde ein autologes Zellkultursystem etabliert, mit dem unter Einsatz definierter Zelltypen und Stimuli
sowohl die Erzeugung von Th1- als auch von Th2-Zellen möglich ist. Dieses Modell bietet Möglichkeiten zur
Untersuchung
des
Einflusses
pathogener
Faktoren
auf
die
Differenzierung
von
T-Helferzellen.
Widmung
Diese Arbeit ist meiner Familie gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG
10
1.1
T-Zellen
1.1.1
Einteilung der T-Zellen
1.1.2
T-Helferzellen
1.1.3
Effekte von Th1- und Th2-Zellen
1.1.4
Nachweis der T-Zell-Differenzierung
10
12
13
14
15
1.2
Antigenpräsentierende Zellen
1.2.1
Dendritische Zellen
1.2.2
Anzucht dendritischer Zellen aus Stammzellen
16
16
18
1.3
Gemischte Leukozytenreaktion mit allogenen oder autologen
Zellen und primäre Immunantwort
18
1.4
Besonderheiten des neonatalen Immunsystems
19
1.5
Staphylokokkentoxine wirken als Superantigene
20
1.6
Fragestellung
23
2
PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN
24
2.1
Probanden
24
2.2
Magnetische Zellseparation (MACS)
24
2.3
Isolierung hämatopoetischer Stammzellen
26
2.4
Anzucht dendritischer Zellen
27
2.5
Isolierung CD45RA-positiver Zellen
28
2.6
Isolierung naiver T – Zellen
29
2.7
Kokultur der T-Zellen mit dendritischen Zellen
29
2.8
Durchflußzytometrie
30
2.9
Messung der intrazellulären Zytokinproduktion
34
2.10
Herstellernachweis
35
3
3.1
3.2
ERGEBNISSE
38
Das Überleben von T-Zellen in Kokultur mit autologen
dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli
38
T-Zellen zeigen nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 eine Th2Differenzierung
39
5
3.3
3.4
3.5
Die Fraktion der CD45RA-positiven Zellen enthält neben naiven TZellen auch HLA-DR-positive antigenpräsentierende Zellen
41
Th1-Antwort und Th2-Antwort erreichen ihr Maximum zu
verschiedenen Zeitpunkten
43
Das Ausmaß der IFN-γγ-Produktion ist abhängig von der TSSTKonzentration
45
3.6
TSST stimuliert Vβ
β2-positive Zellen stärker als Vβ
β2-negative Zellen
zur Bildung von IFN-γγ
45
3.7
Die Expression von Vβ
β2 nach Stimulation mit TSST ist abhängig
von der eingesetzten TSST-Dosis
46
3.8
LPS ist ein wichtiger Stimulus für die Bildung von IFN-γγ
47
3.9
Restimulationen mit TSST erhöhen die Anzahl IFN-γγ-produzierender
Zellen nur gering
48
3.10 Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin stimulieren die
Produktion von IFN-γγ und unterdrücken die Produktion von IL-4
49
4
52
4.1
DISKUSSION
Das Überleben von T-Zellen in der autologen Kokultur mit
dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli
53
4.2
Die Th2-Differenzierung ist ein „Grundzustand“ neonataler T-Zellen,
aber eine Th1-Antwort ist auslösbar
54
4.3
Die Differenzierung zu Th1-Zellen ist abhängig von der Anwesenheit
dendritischer Zellen. Th2-Zellen lassen sich auch ohne dendritische
Zellen erzeugen.
56
4.4
Effekte von LPS auf die Differenzierung zu Th1- und Th2-Zellen
59
4.5
NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen können über sezernierte
Zytokine die Differenzierung naiver T-Helferzellen beeinflussen
61
Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der
Superantigen-Dosis
63
4.7
Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Dauer der Kultur
65
4.8
Unterschiede zwischen Vβ
β2-positiven und Vβ
β2-negativen T-Zellen
67
4.9
Einfluss von Nachstimulationen mit dendritischen Zellen, LPS und
TSST
69
4.10
Effekte von Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin
71
4.11
Weitere Einflussfaktoren
73
4.6
6
4.12
Perspektiven / Klinische Aspekte
73
5
ZUSAMMENFASSUNG
75
6
LITERATURVERZEICHNIS
76
7
DANKSAGUNG
8
LEBENSLAUF
7
Abkürzungsverzeichnis
CD
Cluster of Differentiation
CD40L
CD40-Ligand
DC
Dendritische Zelle
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
FCS
Fetal Calf Serum, fötales Kälberserum
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FSC
Forward Scatter
GM-CSF
Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor
HBSS
Hanks Balanced Salt Solution
HEPES
2-(N-Hydroxyethylpiperazil).-2-Ethansulfonsäure
HLA
Humanes Leukozyten-Antigen
ICAM
Intercellular Cell Adhesion Molecule
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
LFA
Lymphocyte-Function-associated Antigen
LPS
Lipopolysaccharid
MACS
Magnet-assoziierte Zellsortierung
MHC
Major Histocompatibility Complex
mRNA
messenger-Ribonukleinsäure
NFAT
Nuclear factor of activated T-cells
NK-Zelle
natürliche Killerzelle
PE
Phycoerythrin
PKC
Protein-Kinase C
PMA
Phorbol-12-myristat-13-acetat
RS-Virus
Respiratory Syncytial Virus
RT-PCR
real-time-Polymerase-chain-reaction
SCF
Stammzellfaktor
SSC
Side Scatter
SE
Staphylokokken-Enterotoxin
TCR
T-Zell-Rezeptor
TGF
Transforming Growth Factor
TNF
Tumor-Nekrose Faktor
Th-Zelle
T-Helferzelle
TLR
Toll-like Rezeptor
TSST
Toxic Shock Syndrome Toxin
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Methoden zum Nachweis einer Th1- oder Th2-Differenzierung 15
Tabelle 2: Unterschiede zwischen Superantigen und konventionellen
Peptidantigenen
22
Tabelle 3: Oberflächenmarker nach Depletion von HLA-DR- und CD45R0positiven Zellen
42
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Aufbau und schematischer Strahlengang im FACScanDurchlußzytometer
32
Abbildung 2: Dot Plot-Darstellung der durchflußzytometrischen
Messergebnisse.
33
Abbildung 3: Histogramm-Darstellung der Messergebnisse.
33
Abbildung 4: Zellzahl nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 und einer
Kulturdauer von sieben Tagen.
39
Abbildung 5: Anteil IFN-γγ-bildender Zellen in Abhängigkeit von der
eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur.
40
Abbildung 6: Anteil IL-4-bildender Zellen in Abhängigkeit von der
eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur.
40
Abbildung 7: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, nicht
HLA-DR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen.
Messung an Tag 3 der Kultur.
43
Abbildung 8: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, HLADR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung
an Tag 3 der Kultur.
43
Abbildung 9: Kinetik der IFN-γγ-produzierenden Zellen.
44
Abbildung 10: Kinetik der IL-4-produzierenden Zellen.
44
Abbildung 11: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der
TSST-Konzentration und von der Vβ
β2-Expression
45
Abbildung 12: Abhängigkeit des Anteils IL-4-produzierender Zellen von der
TSST-Konzentration und von der Vβ
β2-Expression
46
Abbildung 13: Anteil Vβ
β2-positiver und Vβ
β2-negativer Zellen in Abhängigkeit
von der TSST-Konzentration
47
Abbildung 14: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der
Anwesenheit von LPS
48
Abbildung 15: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und
TSST auf den Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen
49
Abbildung 16: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und
TSST auf den Anteil IL-4-produzierender Zellen
49
Abbildung 17: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit
PMA und Ionomycin und Anwesenheit von dendritischen Zellen
50
Abbildung 18: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit
PMA und Ionomycin bei Abwesenheit von dendritischen Zellen
50
Abbildung 19: Vergleich der Kinetik IFN-γγ-produzierender Zellen mit und
ohne Nachstimulation durch PMA und Ionomycin
51
9
1 Einleitung
In der zweiten Hälfte des letzen Jahrhunderts wurden wesentliche Grundlagen der
Immunantwort
erforscht.
Frank
Macfarlane
Burnet
postulierte
in
den
Fünfzigerjahren erstmals die Theorie der klonalen Selektion. In den frühen
Sechzigerjahren entdeckte James Gowans, dass die Lymphozyten, deren
Funktion bis dahin unbekannt war, die Grundeinheiten der klonalen Selektion
darstellen. Die Grundforderungen der Theorie der klonalen Selektion lassen sich
in vier Kernaussagen zusammenfassen:
1. Jeder Lymphozyt weist einen einzigen Rezeptortyp von einmaliger
Spezifität auf.
2. Die Wechselwirkung zwischen einem fremden Molekül und einem
Rezeptor, der dieses Molekül mit hoher Affinität bindet, aktiviert den
entsprechenden Lymphozyten.
3. Die
ausdifferenzierten
Effektorzellen,
die
von
diesem
aktivierten
Lymphozyten abstammen, tragen Rezeptoren derselben Spezifität wie die
Ursprungszelle.
4. Lymphozyten mit Rezeptoren für körpereigene Moleküle werden bereits in
einer frühen Entwicklungsphase der Lymphozyten beseitigt und sind
deshalb im Repertoire der reifen Zellen nicht mehr vorhanden.
In den folgenden Jahrzehnten wurden die Lymphozyten und ihre Funktion zum
Schwerpunkt der Forschung in der zellulären Immunologie (Gowans, 1996;
Janeway et al., 2002).
1.1 T-Zellen
Die T-Lymphozyten nehmen für die erworbene, zellvermittelte Immunantwort eine
Schlüsselstellung ein. Ihr wichtigstes Merkmal ist der hochvariable T-ZellRezeptor,
der
mit
den
invarianten
akzessorischen
Ketten
des
Oberflächenmoleküls CD3 verbunden ist. Der T-Zell-Rezeptor selbst besteht aus
10
zwei verschiedenen Polypeptidketten, den T-Zell-Rezeptor-α und –β-Ketten. Diese
sind miteinander durch eine Disulfidbrücke verbunden.
Eine Minderheit der T-Zellen trägt einen anderen Typ des T-Zell-Rezeptors mit
anderen Polypeptidketten, die mit γ und δ bezeichnet werden. Die Funktion dieser
γ:δ-T-Zellen für die Immunantwort ist noch nicht vollständig geklärt. Sie kommen
vermehrt in der Darmschleimhaut vor und scheinen bei der Entwicklung einer
oralen, immunologischen Toleranz eine wichtige Rolle zu spielen. Im folgenden ist
mit dem Begriff T-Zell-Rezeptor der α:β-Rezeptor gemeint.
Jede Kette des T-Zell-Rezeptors setzt sich aus einer konstanten C-Region und
einer variablen V-Region zusammen. Die nebeneinander liegenden variablen
Domänen bilden die Antigenbindungsstelle.
Der T-Zell-Rezeptor bindet Antigene nicht direkt, sondern erkennt kurze
Peptidfragmente von Proteinen eines Pathogens, die an MHC-Moleküle auf der
Oberfläche anderer Zellen gebunden sind. Bei diesen MHC-Molekülen handelt es
sich
um
Glykoproteine,
die
durch
die
große
Gengruppe
des
Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert werden und auf allen Körperzellen
vorkommen. Dadurch ist die T-Zelle gezwungen, zur Aktivierung mit einer anderen
Körperzelle zu interagieren. Erkannt wird dabei die zum T-Zell-Rezeptor passende
Kombination aus Peptid und MHC-Komplex. Dieses Prinzip wird MHC-Restriktion
genannt.
Die MHC-Moleküle werden in zwei Klassen unterteilt. MHC-Moleküle der Klasse I
präsentieren Peptide, die durch Abbau von Proteinen im Zytoplasma der Zelle
entstanden sind. Diese Moleküle kommen auf allen kernhaltigen Zellen vor. Auf
Zellen des Immunsystems werden sie besonders stark exprimiert. MHC-Moleküle
der Klasse II präsentieren Peptide, die durch den Abbau in Vesikeln entstehen.
Dies können zum Beispiel intravesikuläre Pathogene in Makrophagen sein oder
extrazelluläre Pathogene und Toxine, die durch Endocytose aufgenommen
werden. Die MHC-Moleküle der Klasse II sind nur auf Zellen des Immunsystems
zu finden, insbesondere auf Zellen, die auf die Präsentation von Antigenen
spezialisiert sind. Aber auch aktivierte T-Lymphozyten können MHC-Klasse IIMoleküle exprimieren (Janeway et al., 2002; Holländer et al., 2005).
11
1.1.1 Einteilung der T-Zellen
Anhand anderer Oberflächenmoleküle können die T-Zellen in zwei Untergruppen
mit unterschiedlichen Effektorfunktionen unterteilt werden. So kennzeichnet CD4
T-Helferzellen, CD8 zytotoxische T-Zellen. Zytotoxische T-Zellen erkennen
Antigene, die Zellen über MHC-Moleküle der Klasse I präsentieren. Die Folge ist
eine Aktivierung der zytotoxischen T-Zelle, die den Zelltod der präsentierenden
Zelle
zur
Folge
hat.
T-Helferzellen
erkennen
Antigene,
die
durch
antigenpräsentierende Zellen über MHC-Moleküle der Klasse II präsentiert
werden. In Folge der Aktivierung erlangen diese Zellen die Fähigkeit, weitere
Zellen des Immunsystems zu aktivieren. Die CD4- bzw. CD8-Moleküle auf der TZell-Oberfläche dienen bei der Erkennung der MHC-Antigen-Komplexe als CoRezeptoren, die jeweils an unveränderliche Stellen des MHC-Komplexes binden.
Dabei dient CD4 als Co-Rezeptor für MHC-Klasse-II-Moleküle und CD8 als CoRezeptor für MHC-Klasse-I-Moleküle.
T-Helferzellen,
die
noch
keinen
Antigenkontakt
hatten,
sind
durch
das
Oberflächenmolekül CD45RA gekennzeichnet, und werden als naive T-Zellen
bezeichnet. Nach Antigenkontakt proliferieren und differenzieren sie zu Effektor-TZellen, welche das Oberflächenmolekül CD45R0 tragen. Diese Isoform von CD45
kann sich mit dem T-Zell-Rezeptor zusammenlagern und die Antigenerkennung
auf molekularer Ebene erleichtern. Teilweise entwickeln sich diese Effektorzellen
zu Memory-T-Zellen weiter, die wiederum in Effektor-Gedächtniszellen und
zentrale Gedächtniszellen unterschieden werden können. Diese Zellen können
nach einer Zeit ohne Antigenkontakt den Oberflächenmarker CD45R0 wieder
verlieren und erneut CD45RA exprimieren. Damit kann CD45RA nicht als
alleiniges Kriterium für die Naivität von T-Zellen verwendet werden (Janeway et al,
2002; Holländer et al., 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurden allerdings T-Zellen
aus Nabelschnurblut eingesetzt, die noch keinen Antigenkontakt hatten. In dieser
Zellpopulation tragen 95% aller Zellen der Oberflächenmarker CD45RA, bei denen
es sich unstrittig um naive Zellen handelt.
12
1.1.2 T-Helferzellen
T-Helferzellen übernehmen zahlreiche steuernde Funktionen im Immunsystem.
Anhand der gebildeten und sezernierten Zytokine lassen sich die T-Helferzellen in
funktionell verschiedene Untergruppen unterteilen.
Naive T-Helferzellen werden als Th0-Zellen bezeichnet. Dieser Zelltyp ist lediglich
in der Lage, IL-2 zu bilden, das ein wichtiger Faktor für Wachstum und
Proliferation der T-Zellen ist. Aus den Th0-Zellen entwickeln sich nach Aktivierung
entweder Th1-Zellen, die als charakteristische Zytokine unter anderem IFN-γ, IL-2
und TNF-α bilden, oder Th2-Zellen, welche die charakteristischen Zytokine IL-4,
IL-5 und IL-9 bilden. Ursprünglich wurde die Einteilung in Th1- und Th2-Zellen an
T-Lymphozyten der Maus 1986 von Mosmann und Mitarbeitern entwickelt und in
den folgenden Jahren weiter untersucht (Mosmann and Coffman, 1989). So
konnten unter anderem die für die Differenzierung entscheidenden Signalwege
und Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. So sind STAT-4 und T-bet
verantwortlich für die Th1-Differenzierung, im Unterschied zur Th-Differenzierung,
die durch STAT-6, GATA-3 und c-maf gesteuert wird (Szabo, 2003). Für die
Differenzierung spielen Zytokine eine wesentliche Rolle. So fördern IL-12, IL-18
und IFN-γ über die oben genannten Transkriptionsfaktoren die Th1-Differenzierung
(Schoenborn and Wilson, 2007), während die Th2-Differenzierung im wesentlichen
von IL-4 abhängig ist (Le Gros et al., 1990).
Daneben existieren verschiedene Arten regulatorischer T-Zellen. So wurde als
weiterer Zelltyp die Th3-Zelle identifiziert, die charakteristisches Zytokin große
Mengen TGF-β produziert (Weiner, 2001). Tr1-Zellen werden durch IL-10 induziert
und regulieren die Immunantwort ihrerseits durch IL-10 (Roncarolo et al., 2001).
Diese
Zytokine
können
wiederum
einen
steuernden
Einfluss
auf
die
Differenzierung von Th1- und Th2-Zellen haben. Außerdem gibt eine Untergruppe
CD4-positiver und CD25-negativer Zellen, die unter bestimmten Bedingungen
CD4-positiv und CD25-positiv werden und als charakteristisches Merkmal den
Transkriptionsfaktor Foxp3 aufweisen (Walker et al., 2003).
Kürzlich wurde als weiterer Subtyp der Th-Zellen die IL-17-produzierende Th17Zelle klassifiziert (Harrington et al., 2005; Park et al., 2005). Th17-Zellen
entwickeln sich unter dem Einfluss der Zytokine IL-6 und TGF-β. Ihre
Effektorfunktionen sind noch unklar, aber sie scheinen eine Rolle bei
Autoimmunerkrankungen zu spielen. Das von ihnen gebildete IL-17 spielt eine
13
wichtige Rolle für die Mobilisierung und Neubildung neutrophiler Granulozyten und
in der Abwehr extrazellulärer Bakterien- und Pilzinfektionen (Stockinger and
Veldhoen, 2007).
1.1.3 Effekte von Th1- und Th2-Zellen
Die Th1- bzw. Th2-Zellen haben einen wesentlichen Einfluss auf die weitere
Immunantwort.
Th1-Zellen
vermitteln
eine
zellvermittelte
Immunantwort,
beispielsweise durch die Aktivierung von Makrophagen. Dieser Weg ist
insbesondere bei der Abwehr intrazellulärer Erreger von Bedeutung. Th2-Zellen
hingegen vermitteln über die Stimulation von antikörperbildenden B-Zellen eine
humorale Immunantwort mit einer starken Antikörperproduktion. Für die
Vermittlung der jeweiligen Effekte der T-Helferzellen spielen Zytokine eine
entscheidende Rolle. So werden die makrophagenaktivierenden Effekte von Th1Zellen über IFN-γ und TNF-β vermittelt, wobei letzteres auch für die Hemmung von
B-Zellen verantwortlich ist. Th2-Zellen hingegen sezernieren IL-4 und IL-5, die BZellen aktivieren, und IL-10, welches die Makrophagenaktivierung blockiert.
Zahlreiche Zytokine der Th-2-Zellen können die Entstehung allergischer
Reaktionen fördern. So werden IgE-Antikörper-Bildung (IL-4 und IL-13), Bildung
eosinophiler Granulozyten (IL-5), Wachstum von Mastzellen (IL-4 und IL-10) und
vermehrte Schleimproduktion (IL-9 und IL-13) über entsprechende Zytokine
gesteuert. Doch auch für die Toleranz allogener Transplantate scheinen Th2Antworten eine wichtige Rolle zu spielen; ein Prinzip das insbesondere für die
Aufrechterhaltung
einer
intakten
Schwangerschaft
von
Bedeutung
ist.
Überschießende Th1-Antworten findet man hingegen häufig bei einer Reihe von
Autoimmunerkrankungen, unter anderem bei Multipler Sklerose, Morbus Crohn
und Typ-1-Diabetes. Die Aufklärung von Faktoren, die eine Th1- oder Th2-Antwort
bevorzugen, könnte daher sowohl zur Aufklärung der Ätiologie der genannten
Erkrankungen als auch bei der Entwicklung möglicher (präventiver) Therapien
eine wichtige Rolle spielen (Janeway et al., 2002; Holländer et al, 2005; Murphy et
al., 2000).
14
1.1.4 Nachweis der T-Zell-Differenzierung
Zum Nachweis der Th1- bzw. Th2-Differenzierung wurde eine Vielzahl von
Methoden entwickelt, die jeweils typische Vor- und Nachteile bieten. Da die
meisten Zytokine nur in kleinen Mengen gebildet werden und zum Teil nicht
sezerniert werden, sondern direkt durch Zellkontakte von Zelle zu Zelle
weitergegeben werden, gestaltet sich der Nachweis aus Überständen von
Zellkulturen schwierig. Der intrazelluläre Nachweis von Zytokinen mittels
fluoreszenzmarkierter Antikörper in der Durchflußzytometrie ermöglicht die
Beurteilung der Differenzierung auf der Ebene einzelner Zellen und ist hoch
sensitiv (Jung et al., 1993). Dieses Verfahren wurde daher in der vorliegenden
Arbeit zur Beurteilung der Zytokinbildung durch T-Zellen verwendet.
Tabelle 1: Methoden zum
(nach Romagnani, 2000)
Methode
Klonierung
Nachweis
einer
Th1-
oder
Th2-Differenzierung
Vorteile
Nachteile
Zytokin-Profile einfach
Hoher Arbeits- und
nachweisbar
Zeitaufwand; Messung spiegelt
eher das Potenzial als das
gegenwärtige Zytokinprofil
wieder
RT-PCR
Hoch sensitiv, Möglichkeit der
Hohes Risiko nicht spezifischer
Untersuchung von
Reaktionen; Möglichkeit von
Gewebeproben
transskribierten, aber nicht
sezernierten Zytokinen;
Charakterisierung des Zelltyps
nicht möglich
In situ Hybridisierung
Charakterisierung des Zelltyps
Höherer Arbeitsaufwand im
möglich, Möglichkeit der
Vergleich zur RT-PCR
Untersuchung von
Gewebeproben
Immuncytochemie
Charakterisierung des Zelltyps
Nicht alle Zytokine nachweisbar
möglich, Möglichkeit der
(z.B. IL-4)
Untersuchung von
Gewebeproben
ELIspot
Relativ einfach anwendbar,
Teilweise durch
Nachweis niedriger Frequenzen Durchflußzytometrie überholt
von Zielzellen
Intrazelluläre Färbung und
Relativ einfach; hoch sensitiv;
Nur mit Zellsuspensionen
Durchflußzytometrie
erlaubt Nachweis der
anwendbar
Zytokinsynthese auf der Ebene
einzelner Zellen
15
1.2 Antigenpräsentierende Zellen
Um einen Lymphozyten zu aktivieren, muss wie bereits beschrieben das
„passende“ Antigen in einer bestimmten Form präsentiert werden. Diese Aufgabe
übernehmen professionelle antigenpräsentierende Zellen, die neben MHCMolekülen der Klasse I auch MHC-Moleküle der Klasse II tragen, und somit in der
Lage sind, T-Helferzellen zu aktivieren. Für diese Aktivierung ist zusätzlich ein costimulierendes Signal notwendig. T-Zellen, denen lediglich ein MHC-AntigenKomplex ohne entsprechende Kostimulation präsentiert wird, können eine
Toleranzentwicklung für das betreffende Antigen zeigen. Das wichtigste
kostimulierende Signal wird über die sogenannten B7-Moleküle (CD80 und CD86)
auf antigenpräsentierenden Zellen über den entsprechenden Rezeptor CD28 auf
T-Zellen
vermittelt.
kostimulierende
Nach
Systeme
der
Aktivierung
zum
Tragen,
der
welche
T-Zelle
für
kommen
die
weitere
Steuerung
und
Aufrechterhaltung der initiierten Immunantwort eine wesentliche Rolle spielen, so
zum Beispiel die Interaktion zwischen CD40 und CD40-Ligand. Während unter
experimentellen
Bedingungen
mehrere
verschiedene
Zelltypen
wie
B-
Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen in der Lage sind, diese
Aufgabe zu übernehmen, sind in vivo die dendritischen Zellen die wichtigsten
antigenpräsentierenden Zellen. Sie sind als einzige Zellen in der Lage, naive TZellen zu aktivieren. B-Lymphozyten und Makrophagen spielen eine Rolle bei der
Aktivierung von Memory-T-Zellen (Janeway et al., 2002).
1.2.1 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen sind die stärksten Stimulatoren naiver T-Zellen. Bevor eine
dendritische Zelle jedoch in der Lage ist, eine T-Zelle zu aktivieren, muss sie
zunächst einen Reifungsprozess durchmachen. Die unreifen dendritischen Zellen
findet man unter den Oberflächenepithelien und in den meisten parenchymatösen
Organen. In der Haut werden sie als Langerhans-Zellen bezeichnet. In ihrem
unreifen
Zustand
besitzen
sie
nur
wenige
MHC-Moleküle
und
keine
kostimulierenden B7-Moleküle. Dendritische Zellen nehmen dort eine WächterFunktion
war,
indem
sie
vorhandene
Krankheitserreger
entdecken
und
aufnehmen. Ein wichtiger Mechanismus ist hierfür neben der Phagozytose, zu der
16
auch andere Zellen wie z.B. Makrophagen in der Lage sind, die Makropinozytose.
Dabei werden extrazelluläre Antigene unspezifisch gemeinsam mit großen
Mengen extrazellulärer Flüssigkeit aufgenommen. Bei einer Infektion wandern die
dendritischen Zellen nach einer Antigenaufnahme zu den benachbarten
Lymphknoten. Dabei verlieren sie die Fähigkeit zur Antigenaufnahme und
synthetisieren stattdessen große Mengen neue MHC-Moleküle, mit denen sie
Peptide der Krankheitserreger präsentieren (Signal 1). Außerdem exprimieren sie
jetzt
große
Mengen
an
kostimulierenden
B7-Molekülen
(Signal
2)
und
Adhäsionsmolekülen. Dadurch werden sie zu optimalen Stimulatorzellen für TZellen.
Für die Aktivierung und Reifung der dendritischen Zellen sind eine Vielzahl von
Oberflächenmolekülen und Signalwegen bekannt. Neben Rezeptoren, die
Pathogene binden, gehören dazu vor allem Rezeptoren für Komplement und
Rezeptoren für die Phagozytose wie der Mannose-Rezeptor. Da manche
Krankheitserreger über Mechanismen verfügen, mit denen sie eine Phagozytose
verhindern
können,
stellt
die
Makropinozytose
einen
entscheidenden
Mechanismus dar, um auch diese Antigene den T-Zellen präsentieren zu können.
Bei der Aktivierung der dendritschen Zelle nach Erregerkontakt spielt der
Signalweg, der über Rezeptoren der Toll-like-Rezeptorfamilie vermittelt wird, eine
besondere Rolle. So kann der Kontakt mit bakterieller DNA über TLR-9 und
nachfolgende intrazelluläre Signalwege zur Produktion von Zytokinen wie IL-6, IL12, IL-18 und IFN-α sowie IFN-γ führen. Diese Zytokine und Interferone sind
wiederum Auslöser einer verstärkten Expression co-stimulierender Moleküle und
haben auch direkten Einfluss auf die Th-Zell-Differenzierung (Signal 3). Von
besonderer Bedeutung ist auch der Signalweg über TLR-4, der durch
Lipopolysaccharid, einen Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, aktiviert
wird. Durch die Aktivierung dieses Signalwegs kommt es ebenfalls zur vermehrten
Expression von B7-Molekülen und zur Bildung von TNF-α, welches die
Wanderung von dendritischen Zellen zum Lymphknoten auslöst (Banchereau and
Steinman, 1998; Mellman and Steinman, 2001; Lanzavecchia and Sallusto, 2001;
de Jong et al, 2005).
17
1.2.2 Anzucht dendritischer Zellen aus Stammzellen
Für in vitro Untersuchungen von dendritischen Zellen werden relativ hohe
Zellzahlen benötigt, die aus peripherem Blut nicht in ausreichender Menge
gewonnen werden können. Der wesentliche Durchbruch in der Erforschung
dendritischer
Zellen
gelang
durch
die
Möglichkeit,
diese
Zellen
aus
hämatopoetischen Stammzellen anzuzüchten. Als Quelle für diese Stammzellen
können Knochenmark, Nabelschnurblut und peripheres Blut dienen, wobei
Nabelschnurblut den Vorteil der relativ leichten Verfügbarkeit zusammen mit
einem relativ hohen Stammzellanteil von ca. 1,3% bietet. Diese hämatopoetischen
Stammzellen können über das Oberflächenmolekül CD34 identifiziert werden.
Durch magnetische Zellseparation können sie in ausreichender Reinheit aus den
Zellen des Nabelschnurblutes isoliert werden. Anschließend lassen sich in der
Zellkultur durch Einsatz der Wachstumsfaktoren GM-CSF und TNF-α dendritische
Zellen mit
charakteristischem morphologischem Aussehen
und
typischen
Oberflächenmolekülen anzüchten. Es handelt sich hier allerdings nicht um eine
einheitliche Population, sondern um ein heterogenes Gemisch verschiedener
Arten und Entwicklungsstufen von dendritischen Zellen (Caux et al., 1992). Durch
den Einfluss verschiedener Zytokine und Wachstumsfaktoren können aus diesen
Zellen entweder dendritische Zellen, Monozyten oder Makrophagen entstehen.
Durch ein modifiziertes Protokoll, bei dem neben GM-CSF und TNF-α auch
Stammzellfaktor (SCF / c-kit-Ligand) eingesetzt wird, lässt sich der Anteil
dendritischer Zellen um den Faktor 100 bis 1000 steigern (Szabolcs et al., 1995).
In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen verwendet, die anhand ihrer
Oberflächenmoleküle charakterisiert wurden und die einen hohen Anteil
dendritischer Zellen aufwiesen.
1.3 Gemischte Leukozytenreaktion mit allogenen oder autologen
Zellen und primäre Immunantwort
Die Untersuchung von T-Zell-Antworten in der Zellkultur von T-Lymphozyten mit
bestimmten Stimulatorzellen wird als „gemischte Lymphozytenreaktion“ (MLR)
bezeichnet. Dabei können T-Zellen und Stimulatorzellen von verschiedenen
Spendern stammen (allogene MLR) oder von demselben Spender (autologe
18
MLR). Typisch für die allogene MLR ist eine Reaktivität eines großen Teils der TZellen (etwa 1 bis 10%), die durch die unterschiedlichen MHC-Moleküle von
Spender und Empfänger ausgelöst wird. Diese Alloreaktivität kann als in vitro
Nachweis
der
Graft-versus-host-Reaktion
in
der
Transplantationsmedizin
angesehen werden.
In der autologen MLR ist der Anteil reagierender Zellen geringer. Vergleicht man
die Proliferation von T-Zellen anhand der Aufnahme der radioaktiv markierten
Base Thymidin, so stimulieren allogene dendritische Zellen die T-Zellen etwa
doppelt so stark wie autologe dendritische Zellen. Selbst in der autologen MLR
sind dendritische Zellen allerdings noch in der Lage, eine Proliferation auszulösen,
wenn sie im Verhältnis 1:100 zu den zu stimulierenden T-Zellen eingesetzt
werden.
Als Stimulatorzellen der MLR kommen neben dendritischen Zellen auch
Makrophagen und Lymphozyten in Betracht. Vergleichende Untersuchungen
haben gezeigt, dass sowohl in der allogenen wie in der autologen MLR
dendritische Zellen die stärksten Stimulatorzellen sind. Im Gegensatz zu allen
anderen Zellarten bilden dendritische Zellen mit T-Zellen Zellhaufen, die bereits
lichtmikroskopisch in den Kulturen sichtbar sind und als „cluster“ bezeichnet
werden (Kuntz-Crow and Kunkel, 1982; Steinman, 1991).
Verwendet man in der autologen MLR dendritische Zellen und naive T-Zellen, so
kann dieser Ansatz als in vitro-Modell der primären Immunantwort gesehen
werden (Bartz, 2001). In diesem Modell ist es dann möglich, eine Vielzahl von
Einflussfaktoren zu variieren und in ihren Auswirkungen zu beurteilen. Das in
dieser Arbeit eingesetzte Modell entspricht der autologen MLR, bei der allerdings
genau definierte Zelltypen zum Einsatz kamen, die durch vorhergehende
Versuche bereits gut charakterisiert waren.
1.4 Besonderheiten des neonatalen Immunsystems
Neugeborene zeigen eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen, die häufig einem
noch nicht ausgereiften und voll funktionsfähigen Immunsystem zugeschrieben
wird.
Für antigenpräsentierende Zellen und für NK-Zellen wurde eine verminderte
Aktivität beschrieben. Insbesondere die Fähigkeit zur Bildung von IL-12 durch
19
neonatale dendritische Zellen und neontale NK-Zellen scheint im Vergleich zu
adulten Zellen vermindert zu sein, was die bei Neugeborenen geringer
ausgeprägte Th1-Antwort erklärt. Möglicherweise wird die eingeschränkte
Fähigkeit zur IL-12-Bildung bei Neugeborenen zumindest teilweise kompensiert
durch eine im Vergleich zum Erwachsenen gesteigerte Bildung von IL-27
(Krumbiegel, Anthogalidis-Voss et al., 2007).
Daneben
bestehen
Unterschiede
insbesondere
bei
der
Aktivierung
und
Differenzierung der T-Lymphozyten. So wurden eine verminderte Bildung von IL-2,
verminderte Proliferationsraten, verminderte zytotoxische Aktivität, schlechte
Fähigkeit zur Aktivierung von B-Zellen und eine veränderte Zytokinproduktion für
neonatale T-Zellen beschrieben. Hierfür ist allerdings vermutlich vor allem der
hohe Anteil CD45RA-positiver, naiver T-Zellen im Nabelschnurblut verantwortlich
(Cohen et al. 1999). Insgesamt scheint eine Th2-Antwort leichter auslösbar zu
sein als eine Th1-Antwort. Bis vor einigen Jahren wurde eine Th1-Antwort in
neonatalen Zellen sogar für unmöglich gehalten und eine Th2-Antwort als
„vorgegeben“ angesehen. Versuche am Tiermodell haben allerdings gezeigt, das
unter bestimmten Voraussetzungen Th1-Antworten neonataler Zellen möglich
sind, die dasselbe Ausmaß haben wie bei Erwachsenen (Adkins, 2000; Garcia,
2000). Da – wie beschrieben – ein verändertes Verhältnis von Th1- und Th2Zellen ein wichtiger Faktor in der Pathogenese vieler Erkrankungen ist, ist die
Aufklärung der Faktoren, welche die Th-Zell-Differenzierung beeinflussen, ein
wichtiges Ziel der immunologischen Forschung und wurde auch in dieser Arbeit
untersucht. Von besonderem Interesse waren dabei die Faktoren, die eine Th1Differenzierung der neonatalen Zellen hervorrufen können.
1.5 Staphylokokkentoxine wirken als Superantigene
Die Staphylokokkenenterotoxine A bis E (SEA – SEE) und das ebenfalls von
Staphylokokken gebildete Toxic Shock Syndrome Toxin-1 (TSST-1) wirken als
Superantigene. Neben den Staphylokokkentoxinen sind auch die StreptokokkenExotoxine A und C von Streptococcus pyogenes und das von Mycoplasma
arthritidis gebildete Mykoplasma arthridis-Mitogen als bakterielle Superantigene
bekannt. Daneben gibt es auch virale Superantigene, wie z.B. das durch den
Retrovirus MMTV codierte Superantigen.
20
Bei den Staphylokokkenenterotoxinen und TSST-1 handelt es sich um Proteine
mittlerer Größe mit einem Molekulargewicht zwischen 22 und 30 kDa. Für diese
Toxine konnten Genom- und Aminosäuresequenz sowie die Kristallstruktur
aufgeklärt werden. Während die SE sich in ihrer Struktur sehr ähnlich sind, ist
TSST-1 etwas anders aufgebaut. TSST-1 besteht aus 194 Aminosäuren und ist
damit etwas kürzer als die SE, z.B. SEA mit 233 Aminosäuren. Daneben fehlen
auch die für die SE charakteristischen Cysteine und die Disulfid-Schleife. Sowohl
die SE als auch TSST-1 weisen allerdings einen hohen Anteil an βFaltblattstrukturen und einen geringen Anteil an α-Helices auf. Dieser ähnliche
Aufbau hat Einfluss auf das unten beschriebene Bindungsverhalten an den TCR
und MHC-Klasse II-Moleküle. Werden Superantigene in kleinere Einheiten
gespalten, verlieren sie daher ihre charakteristische biologische Aktivität.
Im Unterschied zu gewöhnlichen Antigenen werden Superantigene von T-Zellen
direkt erkannt, ohne dass sie zu Peptiden verarbeitet und durch MHC-Moleküle an
der Antigenbindungsstelle präsentiert werden. Vielmehr binden Superantigene
direkt an MHC-II-Moleküle und spezifische Regionen des T-Zell-Rezeptors
außerhalb der Antigenbindungsstelle. Diese Bindungsstellen auf dem T-ZellRezeptor liegen für die verschiedenen Superantigene auf verschiedenen Teilen
des variablen Teils der β-Kette (Vβ). So bindet beispielweise TSST-1
ausschließlich an Vβ2, während die Enterotoxine SEA-SEE jeweils zwei bis zehn
verschiedene Vβ-Spezifitäten aufweisen. Bei der Bindung an die MHC-Klasse IIMoleküle wird von den meisten Superantigenen, so auch TSST-1, der HLA-DRIsotyp bevorzugt. Durch die Bindung des Superantigens an das MHC-II-Molekül
und die spezifische Region des TCR kommt es zu einer antigenunabhängigen,
polyklonalen, aber Vβ-selektiven T-Zell-Aktivierung. Dadurch kommt es zur
Aktivierung einer großen Zahl von T-Zellen (Thomas et al., 2007; Bueno et al.,
2007).
Diese
ist,
wie
bei
konventionellen
Antigenen,
abhängig
von
kostimulierenden Molekülen, wie zum Beispiel der Interaktion zwischen B7 /
CD28, die erforderlich ist, um die Expression von IL-2 zu induzieren (Fraser et al.,
1992).
Während durch die antigenabhängige T-Zellaktivierung 0,0001-0,01 % der TZellen aktiviert werden, können durch Superantigene 5-20% der T-Zellen aktiviert
werden (Choi et al., 1990). Durch diese überschießende Immunreaktion kommt es
zu einer massiven Freisetzung von Zytokinen, einer vermehrten Expression von
21
Adhäsionsmolekülen, zunächst extremer T-Zell-Proliferation mit nachfolgender
Apoptose und T-Zell-Anergie (Marrack and Kappler, 1990; Krakauer, 1999).
Die Folge dieser systemischen Entzündungsreaktion sind Symptome wie Fieber,
Hypotension und Schock, welche sowohl durch die Staphylokokkenenterotoxine
als auch durch TSST-1 ausgelöst werden können. Auch wird eine Beteiligung der
Staphylokokkensuperantigene
an
der
Pathogenese
bestimmter
Autoimmunerkrankungen und Arthritisformen diskutiert. So wurden beispielweise
bei Patienten mit Kawasaki-Syndrom gehäuft TSST-1-bildende Staphylococcus
aureus-Stämme nachgewiesen (Leung et al., 1993).
Tabelle 2: Unterschiede zwischen Superantigenen und
Peptidantigenen (Krakauer 1999; Florquin and Aaldering, 1997)
konventionellen
Superantigene
Peptidantigene
Aktive Konzentration
10-9 M
10-6 M
Processing erforderlich
Nein
Ja
Antigenspezifität
Nein
Ja
MHC-Restriktion
Nein
Ja
Co-stimululierende
B7 / CD28
Signale
LFA-1 / ICAM – 1
Anteil aktivierter
Lymphozyten
5-20 %
B7 / CD28
0,0001-0,01 %
22
1.6 Fragestellung
Es sollten die Faktoren untersucht werden, welche die Differenzierung naiver TZellen zu Th1-Zellen und Th2-Zellen beeinflussen. Dazu sollten Kokulturen von
naiven T-Zellen und dendritischen Zellen als antigenpräsentierende Zellen
verwendet werden. Um eine Beeinflussung durch MHC-Inkompatibilitäten
auszuschließen, sollten ausschließlich autologe Zellen verwendet werden.
Im Einzelnen sollte geklärt werden,
-
ob eine Stimulation von T-Zellen durch dendritische Zellen
auch ohne exogene Stimuli möglich ist.
-
welchen Einfluss die Anwesenheit bzw. die Abwesenheit
von dendritischen Zellen als antigenpräsentierende Zellen
hat.
-
welchen Einfluss der Zusatz des Endotoxins LPS durch die
Aktivierung und Reifung dendritischer Zellen hat.
-
welchen Einfluss das Ausmaß der Aktivierung des T-ZellRezeptors durch Zusatz verschiedener Konzentration des
Superantigens TSST-1 hat.
-
ob eine Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der
Dauer der Zellkultur besteht und wie der Anteil Zytokinbildender Zellen im zeitlichen Verlauf ist.
-
ob eine Restimulation der Zellkultur mit Superantigen und
dendritischen Zellen die Anzahl und Verteilung zytokinbildender Zellen verändert.
Unter verschiedenen Kulturbedingungen wurden dazu in den T-Zellen jeweils die
Zytokine IFN-γ und IL-4 als Maß für die Differenzierung in Th1- und Th2- Zellen
durchflußzytometrisch gemessen.
23
2 Probanden, Material und Methoden
2.1 Probanden
Die verwendeten Nabelschnurblutproben stammten von Neugeborenen, die
zwischen Juli 1998 und Februar 2001 im Augusta-Krankenhaus oder im St.
Elisabeth-Hospital in Bochum geboren wurden. Als Ausschlusskriterien galten
Frühgeburtlichkeit, Schwangerschaftskomplikationen sowie eine Hepatitis- oder
HIV-Infektion der Mutter. Die Ethik-Kommision der Medizinischen Fakultät der
Ruhr-Universität Bochum hat der Durchführung der Studie zugestimmt. Die Eltern
haben sich nach Aufklärung mit der Verwendung des Nabelschnurbluts
einverstanden erklärt.
2.2 Magnetische Zellseparation (MACS)
2.2.1 Grundlagen
Die Methode der magnetischen Zellseparation erlaubt es, aus einer heterogenen
Zellpopulation auch kleine Zellmengen mit hoher Reinheit zu isolieren. Dabei
werden die Zellen mit einem spezifischen paramagnetischen Antikörper markiert
und über eine Trennsäule gegeben, die sich in einem Magnetfeld befindet. Die mit
dem Antikörper magnetisch markierten Zellen verbleiben auf der Säule, die
unmarkierten Zellen nicht. Nach dem Entfernen der Trennsäule aus dem
Magnetfeld können die auf ihr zurückgebliebenen Zellen eluiert werden.
2.2.2 Selektionsstrategien
Mit
der
magnetischen
Zellseparation
bestehen
zwei
Möglichkeiten
zur
Zellisolierung: die positive Selektion oder die negative Selektion (Depletion). Für
diese beiden Selektionsmöglichkeiten werden verschiedene Trennsäulen mit
unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten verwendet. Bei der positiven Selektion
werden die Zielzellen mit Antikörpern markiert, die gegen Oberflächenmoleküle
dieser Zellen gerichtet sind. Die so markierten Zellen verbleiben auf der Säule und
24
können nach Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld eluiert und aufgefangen
werden. Bei der Depletion werden alle Zellen außer den Zielzellen mit Antikörpern
markiert. Die nicht markierten Zellen werden aufgefangen, nachdem sie die Säule
passiert haben.
2.2.3 Markierungsstrategien
Grundsätzlich stehen zwei Möglichkeiten der Markierung einer Zielzelle zur
Verfügung. Bei der direkten Markierung werden paramagnetische Antikörper
gegen eine Antigenstruktur der Zielzelle eingesetzt. Zur indirekten Markierung
werden nicht-paramagnetische Antikörper verwendet, die in einem zweiten
Markierungsschritt mit paramagnetischen Antikörpern markiert werden, die gegen
ein Epitop des ersten Antikörpers gerichtet sind.
2.2.4 Super-paramagnetische Antikörper
Die verwendeten Antikörper bestehen aus sogenannten MicroBeads aus
Eisenoxid und Polysacchariden, die an einen spezifischen Antikörper gebunden
sind. Dadurch erhält dieser Antikörper paramagnetische Eigenschaften, das heißt,
innerhalb eines starken Magnetfelds ist er selbst magnetisch, außerhalb des
Magnetfeldes verliert er diese Eigenschaft wieder. In Zellkulturen zersetzen sich
die Antikörper und beeinflussen weder Funktion noch Überlebensfähigkeit der
Zellen.
2.2.5 Separierungseinheit
Die Separierungseinheit besteht aus einem starken Dauermagneten und einer
Trennsäule. Durch das Einbringen der Trennsäule in das Magnetfeld des
Dauermagneten entstehen in der Matrix der Trennsäule äußerst starke lokale
Magnetfelder. Bei Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld erfolgt eine schnelle
Entmagnetisierung, so dass eine zügige Eluation markierter Zellen ermöglicht
wird.
2.2.6 Isolierte Zellarten
Mit der MACS wurden hämatopoetische Stammzellen, CD45RA-positive Zellen
und naive T-Zellen aus Nabelschnurblut isoliert.
25
2.3 Isolierung hämatopoetischer Stammzellen
2.3.1 Gewinnung von Nabelschnurblut
Das Nabelschnurblut wurde nach der Abnabelung des Neugeborenen aus der
Vena umbilicalis der Plazenta entnommen und in sterile 50 ml Reagenzröhrchen
mit Schraubverschluss gegeben. Die Reagenzröhrchen enthielten 10 ml einer
gerinnungs- und keimhemmenden Pufferlösung mit
20 % Heparin – Natrium (100 IE / ml),
1% HEPES – Puffer (1 M),
1% Penicillin / Streptomycin (10000 IE / ml, 10000 µg / ml) und
1% Amphotericin B (250 µg / ml)
in HBSS.
2.3.2 Dichtegradientenzentrifugation
Die
Auftrennung
der
Zellen
des
Gesamtblutes
erfolgte
mittels
Ficoll-
Dichtegradientenzentrifugation. Bei dieser Methode werden die Erythrozyten und
die polymorphkernigen Leukozyten aufgrund ihrer größeren Dichte von den
mononukleären Zellen abgetrennt. Die mononukleären Zellen reichern sich an der
Phasengrenze an und können dort abpipettiert werden. Zu diesen mononukleären
Zellen gehören neben Lymphozyten und Monozyten auch die hämatopoetischen
Stammzellen.
Hierzu wurde das Nabelschnurblut mit HBSS im Verhältnis 1:4 verdünnt, mit 15 ml
Ficoll-Lösung (spezifische Dichte 1.077 g / ml) unterschichtet und 20 min bei 400 g
zentrifugiert. Anschließend wurde der zellreiche Interphasenring abgenommen
und zweimal für 10 Minuten bei 300 g mit HBSS gewaschen. Zur Ermittlung der
Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer wurde eine Probe entnommen und mit
Türkscher Lösung angefärbt.
2.3.3 Magnetische Zellseparation
Die Isolierung der hämatopoetischen Stammzellen aus den mononukleären Zellen
erfolgte
mittels
indirekter
Markierung
der
CD34-positiven
Zellen
durch
8
magnetische Zellseparation. Dazu wurden die Zellen in 300 µl Puffer / 10 Zellen
aufgenommen, mit je 100 µl humanen IgG und 100 µl Hapten-konjugierten CD34Antikörper je 108 Zellen versetzt und 15 min bei 4-6°C inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen für 10 min bei 300 g gewaschen, in 400 µl Puffer / 108 Zellen
26
aufgenommen und mit 100 µl gegen das Hapten des CD34-Antikörpers
gerichteten MACS MicroBeads je 108 Zellen markiert. Nach einer Inkubationszeit
von 15 min bei 4-6°C wurden die Zellen erneut bei 300 g für 10 min gewaschen.
Die Zellen wurden dann in 500 µl Puffer / 108 Zellen resuspendiert und über eine
MS-Trennsäule nach Herstellervorschrift sortiert. Zur Erzielung einer hohen
Reinheit der Sortierung wurden anschließend die Positiv-Fraktion der ersten
Sortierung über eine zweite MS-Trennsäule erneut sortiert.
2.3.4 Einfrieren der CD34-negativen Zellen
Die CD34-negativen Zellen wurden bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Dazu wurden die Zellen bei 300 g über 10 Minuten abzentrifugiert und in einem
Einfriermedium resuspendiert. Dieses Einfriermedium bestand aus
45% FCS,
44% RPMI-1640,
10% DMSO und
1% Penicillin / Streptomycin.
Die Zellsuspension wurde in ein vorgekühltes KryoTube pipettiert und sofort bei
–80°C eingefroren. Nach ein bis drei Tagen wurden die KryoTubes in flüssigen
Stickstoff überführt.
2.4 Anzucht dendritischer Zellen
Die Anzucht dendritischer Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen erfolgte
modifiziert nach der von Caux et al. beschriebenen Methode (Caux et al., 1992).
Aus den isolierten CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen wurde eine
Probe entnommen. Nach Anfärbung mit Türkscher Lösung wurde in einer FuchsRosenthal-Zählkammer die Zellzahl ermittelt und dann auf eine Konzentration von
1,5 x 105 / ml Kulturmedium eingestellt.
Zusammensetzung des Kulturmediums:
RPMI 1640 VLE mit 10% fötalem Kälberserum (FCS 417 L) und 4% einer
nährstoffreichen und keimhemmenden Zusatzlösung. Diese Zusatzlösung bestand
aus:
27
L-Glutamin 200mM,
Natriumpyruvat 100mM,
nicht-essentiellen Aminosäuren
(L-Alanin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, LSerin),
Penicillin 10000 IE / ml und
Streptomycin 10000 µg / ml,
gemischt im Verhältnis 1:1:1:0,5:0,5.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Multiwell-24-Loch-Flachbodenplatten. Als
Stimuli wurden GM-CSF in einer Konzentration von 100 ng / ml, TNF-α einer
Konzentration von 2,5 ng / ml und SCF in einer Konzentration von 100 ng / ml
eingesetzt. Der Ansatz wurde 14 Tage in einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank
bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Zellkulturen regelmäßig
mikroskopisch kontrolliert und je nach Ausmaß der Proliferation wurde die Kultur
geteilt und neues Kulturmedium zugegeben. An Tag 8 wurden die Kulturen mit
GM-CSF und TNF-α in den oben angegebenen Konzentrationen nachstimuliert.
An Tag 14 wurden die Zellen geerntet und die Zellzahl in der NeubauerZählkammer bestimmt.
2.5 Isolierung CD45RA-positiver Zellen
Die Isolierung CD45RA-positiver Zellen erfolgte mittels positiver MACS. Die
eingefrorenen CD34-negativen Zellen aus Nabelschnurblut wurden aufgetaut und
mit HBSS einmal 10 min bei 300 g und einmal 10 min bei 200 g gewaschen. Eine
Probe wurde entnommen, mit Türkscher Lösung gefärbt und die Zellzahl in der
Neubauer-Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden die Zellen erneut bei 300
g für 10 min gewaschen und der Überstand vollständig entfernt. Die Zellen wurden
in 80 µl HBSS und 20 µl CD45RA MicroBeads je 107 Zellen resuspendiert und 15
min bei 4-6°C inkubiert. Dann wurden sie erneut mit HBSS bei 300 g für 10 min
gewaschen, in 1 ml HBSS aufgenommen und über eine LS-Trennsäule nach
Vorschrift des Herstellers sortiert. Die Negativ-Fraktion wurde verworfen, die
Positiv-Fraktion mit 5 ml Kulturmedium von der Säule gespült und die Zellzahl
bestimmt.
28
2.6 Isolierung naiver T – Zellen
Die Isolierung von naiven T-Zellen erfolgte durch Depletion von CD45R0- und
HLA-DR-positiven Zellen aus CD34-negativen Zellen aus Nabelschnurblut.
Außerdem wurden Glycophorin A-positive Zellen depletiert, um eine Störung der
durchflußzytometrischen Messung durch verunreinigende Normoblasten zu
verhindern. Die Zellen wurden wie oben beschrieben aufgetaut, gewaschen und
gezählt. Die Zellen wurden dann in 40 µl HBSS, 20 µl CD45R0 Microbeads, 20 µl
HLA-DR MicroBeads und 20 µl Glycophorin A MicroBeads je 107 Zellen
resuspendiert und 15 min bei 4-6°C inkubiert. Anschließend wurden sie erneut mit
HBSS bei 300 g für 10 min gewaschen, in 1 ml HBSS aufgenommen und über
eine BS-Trennsäule mit 23 G Nadel nach Vorschrift des Herstellers sortiert. Die
Negativ-Fraktion wurde aufgefangen und die Zellzahl bestimmt.
2.7 Kokultur der T-Zellen mit dendritischen Zellen
Die Kokulturen von T-Zellen und dendritischen Zellen wurden in Multiwell-24-LochFlachbodenplatten
angesetzt.
Es
wurde
das
beschriebene
Kulturmedium
eingesetzt. Die Zellzahlen wurden auf 2,5x105 T-Zellen und 2,5x104 dendritische
Zellen je ml Medium eingestellt. Die Zellen wurden für eine Dauer von 3 bis 7
Tagen in einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank kultiviert. Zur Überprüfung des
Einflusses
exogener
Stimuli
wurden
verschiedene
Substanzen
in
unterschiedlichen Mengen eingesetzt:
GM-CSF: 100 ng / ml
LPS: 10 µg / ml
TSST: 100 ng / ml; 10 ng / ml; 1 ng / ml; 0,1 ng / ml
IL-2: 5 ng / ml; 1 ng / ml; 0,2 ng / ml
IL-7: 5 ng / ml; 1 ng / ml; 0,2 ng / ml
Zur Stimulation mit LPS wurden zunächst die dendritischen Zellen mit GM-CSF für
2 h im Brutschrank inkubiert, dann wurden die T-Zellen, LPS und gegebenenfalls
weitere Stimuli hinzugefügt.
29
Teilweise wurden die Kulturen einen Tag vor der Messung erneut mit
dendritischen Zellen und exogenen Stimuli in den oben angegebenen Mengen
restimuliert.
In allen Versuchsreihen wurden jeweils mindestens drei voneinander unabhängige
Experimente mit Zellen von verschiedenen Probanden durchgeführt.
2.8 Durchflußzytometrie
2.8.1 Grundlagen
Das Prinzip der Durchflußzytometrie ist die simultane Messung verschiedener
physikalischer und chemischer Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel,
wobei sie hintereinander in einem Flüssigkeitsstrom angeordnet einzeln
untersucht werden. Dabei werden gleichzeitig Streulicht- und Fluoreszenzsignale
an einzelnen Zellen gemessen.
2.8.2 Aufbau und Funktionsweise eines Durchflußzytometers
Voraussetzung zur Messung ist das Vorliegen der Probe als Einzelzellsuspension
in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter. Zur
Analyse wird die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension über
eine Stahlkapillare durch Überdruck der aus Quarzglas bestehenden Meßküvette
zugeführt.
Die
Zellen
passieren,
vom
einem
Hüllstrom
umgeben,
den
Analysepunkt. Der Hüllstrom dient dazu, den Probenstrom im Zentrum der
Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, dass die Zellen hintereinander
einzeln
zum
Fokussierung).
Analysepunkt
Am
gelangen
Analysepunkt
(Prinzip
kreuzt
ein
der
hydrodynamischen
Lichtstrahl
(Laser)
den
Flüssigkeitsstrahl. Nur Zellen, die diesen Punkt treffen, werden korrekt erfasst,
analysiert und klassifiziert.
Lichtstreuung ist ein physikalischer Prozess, bei dem die Zelle mit dem
einfallenden Lichtstrahl interagiert und dabei die Richtung des Lichts verändert,
wobei die Wellenlänge nicht verändert wird. Zur Lichtstreuung tragen folgende
Zelleigenschaften bei:
-
Zellgröße
-
Zellmembran
30
-
Zellkern
-
intrazelluläre granuläre Bestandteile.
Das Licht wird nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut. Der größte Anteil
wird in Vorwärtsrichtung gestreut und als Vorwärtsstreulicht bezeichnet (engl.
forward scatter, FSC). Es stellt hauptsächlich ein Maß für die Zellgröße dar. Das
im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hängt von der
Zelldichte und der Granularität, nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab. Es
wird als Rechtwinkelstreulicht bezeichnet (engl. side scatter, SSC).
Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes. Dabei
absorbieren
Fluoreszenzfarbstoffe
Licht
eines
bestimmten
Wellenlängen-
spektrums und emittieren Licht, das ebenfalls ein charakteristisches Spektrum
aufweist.
Für
die
Durchflußzytometrie
werden
Farbstoffe
mit
ähnlichem
Absorptionsspektrum und unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet. Das
eingesetzte Durchflußzytometer FACScan erzeugt mit einem 15mW Argon-Laser
Licht der Wellenlänge 488 nm. Es wurden als Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Tricolor verwendet.
Passiert eine Zelle den Analysepunkt, so werden Signale von Vorwärtsstreulicht,
Rechtwinkelstreulicht und den Fluoreszenzen gemessen. Dies geschieht mittels
Photodioden und Photoröhren. Das gemessene Signal wird verstärkt und durch
einen Analog-Digital-Wandler in ein digitales Signal umgewandelt.
31
Abbildung 1: Aufbau
Durchlußzytometer
und
schematischer
Strahlengang
im
FACScan-
2.8.3 Datenaufnahme und Datenauswertung
Das Durchflußcytometer FACScan ist so konzipiert, dass es bis zu fünf
Eigenschaften (2 Lichtstreuungen und 3 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen
simultan messen kann. Da zur quantitativen Auswertung immer nur zwei
Eigenschaften gleichzeitig korrelierbar sind, werden die Daten in der sogenannten
5-Parameter-LIST-MODE-Datenaufnahme gespeichert. Dabei werden alle fünf
Eigenschaften der gemessenen Zelle als Liste hintereinander gespeichert.
Dadurch
können
bei
der
Auswertung
alle
gemessenen
Korrelationen
berücksichtigt werden und durch das Setzen von „Fenstern“ ist es möglich, nur
Zellen mit bestimmten Eigenschaften in die Auswertung einzubeziehen (Nebe,
1996).
Die Daten wurden mit der Software CellQuest, entweder als Histogramm oder als
korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot Plot) aufgetragen, ausgewertet.
32
Abbildung 2: Dot Plot-Darstellung der durchflußzytometrischen Messergebnisse.
Im ersten Bild sind FSC und SSC gegeneinander aufgetragen. Die Region R1 entspricht
den auszuwertenden Lymphozyten. Im zweiten Bild sind in Region R2 die Vβ2-negativen
und in Region R3 die Vβ2-positiven Zellen erkennbar. Im dritten Bild sind im linken oberen
Quadranten die IFN-γ-bildenden Vβ2-positiven Zellen dargestellt.
Abbildung 3: Histogramm-Darstellung der Messergebnisse.
Auf der x-Achse ist die Fluoreszenz-Intensität dargestellt, auf der y-Achse die Anzahl der
gezählten Zellen. Der Bereich M1 stellt die IFN-γ-bildenden Zellen dar.
33
2.9 Messung der intrazellulären Zytokinproduktion
Die Messung der intrazellulären Zytokinproduktion erfolgte durchflußzytometrisch
mittels fluoreszenzmarkierter Zytokin-Antikörper in Anlehnung an die von Jung et
al. entwickelte Methode (Jung et al., 1993; Prussin and Metcalfe 1995). Hierbei
werden die intrazellulären Transportprozesse durch Monensin oder Brefeldin A
unterbrochen, was zu einer Anreicherung von Zytokinen im Golgi-Apparat führt.
Brefeldin A bietet gegenüber Monensin den Vorteil einer geringeren Zelltoxizität,
erfordert
aber
längere
Paraformaldehydlösung
Inkubationszeiten.
fixiert
und
die
Die
Zellen
Zellmembran
mit
werden
mit
Saponin-Puffer
permeabilisiert. Anschließend erfolgt die Färbung der intrazellulären Zytokine.
Zu einem Teil der Zellkulturen wurde 18 h vor Ernte der Zellen Brefeldin A (10 µg /
ml) zugegeben, der andere Teil wurde 5 h vor der Ernte der Zellen mit PMA (10 ng
/ ml) und Ionomycin (1µM) stimuliert und die intrazellulären Transportprozesse
wurden mit Monensin (2,5 µM / ml) unterbrochen. Die Zellkulturen wurden geerntet
und die Zellen einmal mit HBSS bei 300 g gewaschen. Die Zellen wurden für 10
min in Paraformaldehydlösung (4%) fixiert und zweimal für 10 min bei 300 g
gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einer Pufferlösung aus 0,1 %
Saponin und 0,01 M Hepes in HBSS aufgenommen und dreimal 100 µl in ein
FACS-Röhrchen pipettiert. Die Färbung der Zytokine erfolgte mit 10 µl anti-IL-4-PE
oder anti-IFN-γ-PE. Außerdem wurden mit 3,5 µl anti-CD3-Tricolor und (bei
Ansätzen mit TSST-Stimulation) 5 µl anti-TCR-Vβ2-FITC die entsprechenden
Oberflächenantigene markiert, um bei der durchflußzytometrischen Messung die
T-Zellen zu identifizieren. Nach einer Inkubationszeit von
15 min bei 4-6°C
wurden die Zellen für 5 min bei 200 g gewaschen und zur Messung in 250 µl
HBSS aufgenommen.
34
2.10 Herstellernachweis
Aminosäuren, nicht-essentielle: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0293
Amphotericin B: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2612
Anti-CD3-Tricolor: Caltag, Burlingame (USA), Best.-Nr. MHCD0306
Anti-IFN-γ-FITC: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 18904 A
Anti-IFN-γ-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 554552
Anti-IL-4-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 554516
Anti-Mouse IgG1-FITC: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr.
20604 A
Anti-Mouse IgG1-PE: PharMingen / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr.
20605 A
Anti-TCR-Vβ2-FITC: Immunotech / Beckman Coulter, Krefeld, Best.-Nr. IM 2407
Brefeldin A: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. B 7651
Brutschrank: Heraeus, Düsseldorf
CD1a-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-051-001
CD34-Isolation-Kit: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-701
CD45RA-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-045-901
CD45R0-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-001
CellQuest Softwarepaket: Becton Dickinson, Heidelberg
Dimethylsulfoxid (DMSO): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. D 5879
Durchflußzytometer: FACScan®, Becton Dickinson, Heidelberg
EDTA: Fluka Chemika, Buchs (CH), Best.-Nr. 03609
FACS-Röhrchen: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg
FcR-Blocking-Reagenz: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-059901
Ficoll Separating Solution: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 6115
Fötales Kälberserum (FCS) 417 L: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. S 0115
Glycophorin A-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-050501
Hanks balanced salts: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. H 4891
Hanks balanced salt solution (HBSS): Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 2045
Heparin-Natrium (Vetren ® 200): Promonta, Hamburg, Reg.-Nr. V767
HEPES-Pufferlösung: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 1613
HLA-DR-Microbeads: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-046-101
35
Ionomycin Calciumsalz: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. I 0643
Interleukin 2 (IL-2): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-2
Interleukin 4 (IL-4): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-4
Interleukin 7 (IL-7): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016200-7
KryoTube®: Nunc, Wiesbaden, Best.-Nr. 363401
Leucomax (GM-CSF): Novartis, Nürnberg, Zul.-Nr. 25756.02.00
L-Glutamin: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0282
Lipopolysaccharid (LPS): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. L 3880
MACS Multistand®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Magnet Separator MiniMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Magnet Separator MidiMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Magnet Separator VarioMACS®: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Microtest III-96 Loch-Flachbodenplatte: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg,
Best.-Nr. 3072
Monensin: Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. M 5273
Multiwell-24-Loch-Flachbodenplatte: Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg, Best.Nr. 3047
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3): Merck, Darmstadt, Best.-Nr. 6329
Natriumpyruvat: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 0473
Paraformaldehyd: Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16005
Penicillin / Streptomycin: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2213
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA): Sigma, Deisenhofen, Best.-Nr. P 8143
Polystyren Reagenzgläser (Rundboden): Falcon / Becton Dickinson, Heidelberg,
Best.-Nr. 2052
Probenröhre neutral, 12 ml: Kabe Labortechnik, Nümbrecht-Elsenroth, Best.-Nr. N
95
Reagenzröhrchen, konisch, mit Verschluß, 15 ml: Falcon / Becton Dickinson,
Heidelberg, Best.-Nr. 2096
Reagenzröhrchen, konisch, mit Verschluß, 50 ml: Falcon / Becton Dickinson,
Heidelberg, Best.-Nr. 2070
RPMI 1640 VLE: Biochrom, Berlin, Best.-Nr. F 1415
Saponin: Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16109
Stammzellfaktor (SCF): PeproTech / Tebu, Frankfurt, Best.-Nr. 016300-07
Staphylokokkenenterotoxin A (SEA): ToxinTechnology / Alexis Biochemicals,
Grünberg, Best.Nr. TX-AT-101
36
Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (TSST-1): ToxinTechnology / Alexis Biochemicals,
Grünberg, Best.Nr. TX-TT-606
Trennsäule AS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-041-302
Trennsäule BS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-041-304
Trennsäule LS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr. 130-042-401
Trennsäule MS: Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Best.-Nr.
Tuerk’sche Lösung: Fluka Chemika, Buchs (CH), Best.-Nr. 93770
Tumornekrosefaktor α (TNF-α): R&D Systems, Wiesbaden, Best.-Nr. 210 - TA
Verschlußstopfen für Probenröhre neutral, 12 ml: Kabe Labortechnik, NümbrechtElsenroth, Best.-Nr. 052102
Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS): Heraeus, Düsseldorf
37
3 Ergebnisse
3.1 Das Überleben von T-Zellen in Kokultur mit autologen
dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli
CD45RA-positive Zellen wurden mit dendritischen Zellen für sieben Tage in
Kokultur gegeben. In dieser Zeit erfolgten regelmäßige mikroskopische Kontrollen
der Kulturen. Ab dem vierten Tag wurde eine deutliche Abnahme der Zellzahl in
den Kulturen beobachtet. Am siebten Tag waren nur noch einzelne Zellen
vorhanden. Die Zellen wurden geerntet und ein kleiner Teil wurde einer
mikroskopischen Vitalitätsprüfung mittels Trypan-Blau-Färbung unterzogen. Dabei
zeigte sich ein hoher Anteil avitaler Zellen. Für eine durchflußzytometrische
Zytokinmessung war nur in 2 Versuchen ausreichend Material vorhanden. Der
Anteil IFN-γ-produzierender Zellen lag in beiden Versuchen bei 0,8%. Der Anteil
IL-4-bildender Zellen lag bei durchschnittlich 20,3% (17,8%-22,7%).
In weiteren Versuchen wurden Kokulturen von CD45RA-positiven Zellen und
dendritischen Zellen mit IL-2 oder IL-7 in verschiedenen Konzentrationen
stimuliert. In der mikroskopischen Kontrolle der Kulturen zeigte sich eine
Proliferation der Zellen, die unter Stimulation mit IL-7 stärker war als unter
Stimulation mit IL-2. Unter höheren Konzentrationen war der beobachtete Effekt
ausgeprägter. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen an Tag 7
geerntet und die Zellzahl in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt.
Außerdem wurden Kokulturen von CD45RA-positiven Zellen und dendritischen
Zellen, mit GM-CSF und LPS sowie SEA einzeln oder in Kombination stimuliert.
Hier zeigten die mikroskopischen Kontrollen eine starke Proliferation der Zellen die
mit SEA oder mit GM-CSF, LPS und SEA stimuliert wurden. In der Kontrollgruppe,
die GM-CSF und LPS stimuliert wurde, war diese Proliferation nicht zu
beobachten, ebenso in der nicht stimulierten Gruppe.
38
Zellzahl
2.0×10 06
IL-2
IL-7
Kontrolle
1.0×10 06
0.0×10 -00
0.2 1.0 5.0
0.2 1.0 5.0
0.0
IL-7
IL-2
IL-Konzentration [ng / ml]
Abbildung 4: Zellzahl nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 und einer Kulturdauer von
sieben Tagen.
3.2 T-Zellen zeigen nach Stimulation mit IL-2 oder IL-7 eine Th2Differenzierung
CD45RA-positive Zellen in Kokultur mit dendritischen Zellen wurden mit IL-2 oder
IL-7 in verschiedenen Konzentrationen stimuliert. Nach sieben Tagen wurden
intrazellulär IL-4 und IFN-γ gemessen.
Es fanden sich ausschließlich IL-4 produzierende T-Zellen. Die mit IL-2
stimulierten Kulturen zeigten einen etwas größeren Anteil IL-4 bildender Zellen
(11,4%) als die mit IL-7 stimulierten Kulturen (8,4%). Eine Abhängigkeit von der
eingesetzten Konzentration war nicht feststellbar. Der Anteil IFN–γ-produzierender
Zellen lag in allen Experimenten unter 0,5%.
39
IFN-γγ produzierende
Zellen [%]
2
IL-2
IL-7
Kontrolle
1
0
0.2 1.0 5.0
0.2 1.0 5.0
0.0
IL-2
IL-7
IL-Konzentration [ng / ml]
Abbildung 5: Anteil IFN-γγ-bildender Zellen in Abhängigkeit von der
eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur.
IL - 4 produzierende
Zellen [%]
20
IL-2
IL-7
Kontrolle
15
10
5
0
0.2 1.0 5.0
0.2 1.0 5.0
0.0
IL-2
IL-7
IL-Konzentration [ng / ml]
Abbildung 6: Anteil IL-4-bildender Zellen in Abhängigkeit von der
eingesetzten IL-2- und IL-7-Konzentration. Messung an Tag 7 der Kultur.
40
3.3 Die Fraktion der CD45RA-positiven Zellen enthält neben
naiven T-Zellen auch HLA-DR-positive antigenpräsentierende
Zellen
CD45RA-positive Zellen wurden jeweils mit und ohne dendritische Zellen in Kultur
gegeben. Die dendritischen Zellen wurden vor Zugabe zur Kokultur für 2 h mit LPS
und GM-CSF vorinkubiert. Als zusätzliches Stimulans wurde TSST in einer
Konzentration von 100 ng / ml oder 0.1 ng / ml eingesetzt, die Kulturen ohne
Zugabe dendritischer Zellen wurden nur mit 100 ng / ml TSST stimuliert. Die
Bestimmung der intrazellulären Zytokinproduktion erfolgte am dritten Tag der
Kultur.
In den Kulturen mit Zugabe dendritischer Zellen lag der Anteil IFN-γ
produzierender Zellen für die TSST-Konzentration von 100 ng / ml bei 37,3% und
für die TSST-Konzentration von 0,1 ng / ml bei 8,2%. Auch in den T-Zellen, die
ohne dendritische Zellen kultiviert wurden, ließ sich die Bildung von IFN-γ
nachweisen. Der Anteil positiver Zellen lag bei 17,2% und damit sogar noch
deutlich höher als in den Kulturen mit dendritischen Zellen und niedriger TSSTKonzentration.
Der Anteil IL-4 bildender Zellen war in den Kulturen ohne dendritische Zellen mit
13,7% größer als in den Kulturen mit dendritischen Zellen (8,8% bei 100 ng TSST
/ ml; 9,2% bei 0,1 ng TSST / ml). Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass
in den CD45RA-positiven Zellen noch antigenpräsentierende Zellen enthalten
sind, die als Stimulatorzellen für die T-Zellen dienen können.
In Proben CD34-negativer Zellen aus Nabelschnurblut wurde daher der Anteil
HLA-DR-positiver
Zellen
mittels
Durchflußzytometrie
bestimmt.
Er
betrug
durchschnittlich 4,6%. Um diese Zellen zu eliminieren und naive T-Zellen zu
erhalten wurden Zellen mit den
Oberflächenantigenen HLA-DR und CD45R0
durch magnetische Zellseparation depletiert. Die erhaltene Zellpopulation wurde
durchflußzytometrisch untersucht. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche
Depletion HLA-DR-tragender antigenpräsentierender Zellen. Diese Zellpopulation
besteht aus T-Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen und wurde für
alle weiteren Versuche im Rahmen dieser Arbeit verwendet.
41
Tabelle 3: Oberflächenmarker nach Depletion von HLA-DR- und CD45R0-positiven
Zellen. Die Zellpopulation enthält keine antigenpräsentierenden Zellen mehr. Sie besteht
aus T-Helferzellen (CD3/CD4), zytotoxischen T-Zellen (CD3/CD8) und NK-Zellen
(CD16/CD56). Der Anteil CD45R0-positiver Zellen ist kleiner 1%.
Oberflächenantigen Positive Zellen [%]
CD45RA
98,2
CD45R0
0,6
HLA-DR
< 0,1
CD3 / CD4
52,8
CD3 / CD8
22,1
CD3 / CD20
0,1
CD16 / CD56
22,0
CD14
0,2
CD33
< 0,1
CD123
< 0,1
In weiteren Versuchen wurden CD45RA-positive, HLA-DR-depletierte Zellen mit
dendritischen Zellen in Kultur gegeben und mit TSST stimuliert. Die dendritischen
Zellen wurden zuvor zwei Stunden mit GM-CSF und LPS vorinkubiert. CD45RApositve, HLA-DR-depletierte Zellen des gleichen Spenders wurden ohne
dendritische Zellen in Kultur gegeben und mit TSST stimuliert. Nach drei Tagen
wurde bei beiden Gruppen die intrazelluläre Zytokinproduktion gemessen.
In der Gruppe, die ohne dendritische Zellen kultiviert wurde, ließ sich IFN-γ nur in
geringen Mengen nachweisen. Der Anteil IFN-γ produzierender Zellen lag für alle
eingesetzten TSST-Konzentrationen unter 2%. Für die Kulturen mit dendritischen
Zellen lag der Anteil IFN-γ produzierender Zellen in Abhängigkeit von der TSSTKonzentration zwischen 5% und 15%.
Der Anteil IL-4 produzierender Zellen lag in den Kulturen mit dendritischen Zellen
für alle eingesetzten TSST-Konzentrationen um 3% (2,8% - 3,5%). In den Kulturen
ohne dendritische Zellen lag der Anteil IL-4 produzierender Zellen mit 5 - 10%
höher. Eine Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration war ebenfalls
nicht vorhanden.
42
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
50
mit DC
ohne DC
40
30
20
10
0
100
0.1
100
TSST - Konzentration [ng / ml]
Abbildung 7: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, nicht HLADR-depletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der
Kultur.
IFN-γγ produzierende
Zellen [%]
20
mit DC
ohne DC
15
10
5
0
100 10
1
0,1
100 10
1
0,1
TSST-Konzentration [ng / ml]
Abbildung 8: Abhängigkeit der IFN-γγ-Produktion in CD45RA-positiven, HLA-DRdepletierten Zellen von der Zugabe dendritischer Zellen. Messung an Tag 3 der
Kultur.
3.4 Th1-Antwort und Th2-Antwort erreichen ihr Maximum zu
verschiedenen Zeitpunkten
CD45RA-positive Zellen und dendritische Zellen wurden mit GM-CSF, LPS und
TSST stimuliert und über 7 Tage kultiviert. Ab dem zweiten Tag wurden täglich
Zellen geerntet und die Zytokinproduktion durchflußzytometrisch gemessen.
43
Am zweiten Tag waren kaum IFN-γ bildende Zellen nachzuweisen. Der höchste
Anteil IFN-γ produzierender Zellen wurde an Tag 3 der Kultur gemessen, in den
nächsten beiden Tagen ging der Anteil wieder zurück. An Tag 6 und 7 waren
kaum noch IFN-γ bildende Zellen vorhanden. IL-4 produzierende Zellen waren
schon ab dem zweiten Tag vorhanden. Ihr Anteil nahm ab dem fünften Tag stark
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
zu und erreichte am siebten Tag der Kultur den Höchstwert.
50
40
30
100 ng TSST / ml
0.1 ng TSST / ml
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abbildung 9: Kinetik der IFN-γγ-produzierenden Zellen.
IL - 4 produzierende
Zellen [%]
50
40
30
100 ng TSST / ml
0.1 ng TSST / ml
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abbildung 10: Kinetik der IL-4-produzierenden Zellen.
44
3.5 Das Ausmaß der IFN-γγ-Produktion ist abhängig von der
TSST-Konzentration
Um die Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration zu untersuchen,
wurden die Zellen mit TSST in Konzentrationen von 100, 10, 1 und 0.1 ng / ml
stimuliert, zusätzlich mit GM-CSF und LPS. Die Anzahl der IFN-γ bildenden Zellen
korrelierte positiv mit der Höhe der TSST-Konzentration. Der Anteil der IL-4
bildenden Zellen zeigte keine Abhängigkeit von der TSST-Konzentration.
3.6 TSST stimuliert Vβ
β2-positive Zellen stärker als Vβ
β2-negative
Zellen zur Bildung von IFN-γγ
Unter den selben Versuchsbedingungen wurden auch Unterschiede zwischen
Vß2-positiven und Vß2-negativen T-Zellen hinsichtlich des Anteils IFN-γ- und IL-4bildender Zellen untersucht. Vß2-positive Zellen bildeten zu einem wesentlich
größeren Teil IFN-γ als Vß2-negative Zellen. Der Unterschied war bei niedrigen
TSST- Konzentrationen deutlicher. Die Anteil IL-4 bildender Zellen war in beiden
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
Gruppen annähernd gleich.
40
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
30
20
10
0
100
10
1
0.1
TSST - Konzentration [ng / ml]
Abbildung 11: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der TSSTKonzentration und von der Vβ
β 2-Expression
45
IL - 4 produzierende
Zellen [%]
20
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
10
0
100
10
1
0.1
TSST - Konzentration [ng / ml]
Abbildung 12: Abhängigkeit des Anteils IL-4-produzierender Zellen von der TSSTKonzentration und von der Vβ
β 2-Expression
3.7
Die Expression von Vβ
β2 nach Stimulation mit TSST ist
abhängig von der eingesetzten TSST-Dosis
Um Unterschiede in der Expression von Vβ2 nach Stimulation
mit TSST zu
erfassen, wurde in einer Kokultur von dendritischen Zellen und CD45RA-positiven
Zellen nach einer Kulturdauer von sieben Tagen mit verschiedenen TSST-Dosen
jeweils der Anteil Vβ2-positiver und Vβ2-negativer T-Zellen durchflußzytometrisch
bestimmt. Als Kontrolle dienten Zellkulturen ohne TSST-Stimulation. Diese zeigten
einen Anteil Vβ2-positiver Zellen von durchschnittlich 9,4% (7,5%-11,3%). Der
Anteil Vβ2-positiver Zellen nach TSST-Stimulation lag deutlich höher und zeigte
eine Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Dosis. Der höchste Anteil Vβ2positiver Zellen war bei einer niedrigen TSST-Dosis von 0.1 ng / ml zu
beobachten, mit steigender TSST-Dosis nahm der Anteil Vβ2-positver Zellen ab.
46
Anteil an gemessenen
Zellen [%]
100
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
75
50
25
0
0
0.1
1
10
100
TSST-Konzentration [ng / ml]
Abbildung 13: Anteil Vβ
β 2-positiver und Vβ
β 2-negativer Zellen in Abhängigkeit von
der TSST-Konzentration
3.8
LPS ist ein wichtiger Stimulus für die Bildung von IFN-γγ
Um den Einfluss der Anwesenheit von LPS zu untersuchen wurden Kulturen mit
LPS in einer Konzentration von 10 µg / ml und ohne LPS angesetzt. Alle Kulturen
wurden mit TSST stimuliert; die eingesetzte Konzentration betrug entweder 100 ng
/ ml oder 0,1 ng / ml. An Tag 3 wurde der Anteil IFN-γ- und IL-4 bildender Zellen
bestimmt.
LPS-Stimulation führte zu einem deutlich höheren Anteil IFN-γ-bildender Zellen.
Lediglich bei der geringen TSST-Konzentration war der Effekt bei den Vβ2negativen Zellen nicht eindeutig.
Der Anteil IL-4 produzierender Zellen war in den Gruppen mit und ohne LPS
nahezu gleich.
47
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
60
50
40
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
30
20
10
0
100
0.1
100
0.1
TSST- Konzentration [ng / ml]
mit LPS (10 µg / ml)
ohne LPS
Abbildung 14: Abhängigkeit des Anteils IFN-γγ-produzierender Zellen von der
Anwesenheit von LPS
3.9
Restimulationen mit TSST erhöhen die Anzahl IFN-γγproduzierender Zellen nur gering
Die
Zellkulturen
wurden
24
Stunden
vor
Messung
der
intrazellulären
Zytokinbildung erneut stimuliert. Dazu wurden nochmals mit GM-CSF und LPS
vorinkubierte dendritische Zellen und 100 ng TSST zu den Kulturen gegeben.
Die Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen lag in den nachstimulierten Kulturen
mit 46,2% nur an Tag 3 deutlich höher als in den nicht nachstimulierten Kulturen
(37,3%), für alle anderen Tage war in nachstimulierten Kulturen nur ein gering
erhöhter Anteil IFN-γ-produzierender Zellen nachweisbar.
Der Anteil IL-4 bildender Zellen war an den Tagen 2 bis 4 in den nachstimulierten
Kulturen niedriger als in den nicht nachstimulierten Kulturen. Für die Tage 5 bis 7
waren keine Unterschiede nachzuweisen.
Hinsichtlich des Anteils Vβ2-positiver Zellen zeigten sich keine Unterschiede
zwischen den nachstimulierten und nicht nachstimulierten Kulturen.
48
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
60
50
40
ohne Nachstimulation
mit Nachstimulation
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abbildung 15: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST
auf den Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen
IL - 4 produzierende
Zellen [%]
20
ohne Nachstimulation
mit Nachstimulation
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abbildung 16: Einfluss von Restimulation mit dendritischen Zellen, LPS und TSST
auf den Anteil IL-4-produzierender Zellen
3.10 Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin stimulieren die
Produktion von IFN-γγ und unterdrücken die Produktion von
IL-4
Ein Teil jeder durchgeführten Zellkultur wurde wie beschrieben fünf Stunden vor
Messung
der
intrazellulären
Zytokinproduktion
mit
PMA
und
Ionomycin
nachstimuliert.
49
Auch unter diesen Umständen war die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen
abhängig von der eingesetzten TSST-Konzentration, der Expression von Vβ2 und
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
der Anwesenheit von dendritischen Zellen.
50
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
40
30
20
10
0
100
10
1
0.1
TSST - Konzentration [ng / ml]
IFN - γ produzierende
Zellen [%]
Abbildung 17: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und
Ionomycin und Anwesenheit von dendritischen Zellen
50
Vβ2 pos. Zellen
Vβ2 neg. Zellen
40
30
20
10
0
100
10
1
0.1
TSST - Konzentration [ng / ml]
Abbildung 18: Anteil IFN-γγ-produzierender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und
Ionomycin bei Abwesenheit von dendritischen Zellen
In der Abhängigkeit von der Dauer der Kultur zeigten sich Unterschiede zwischen
der Gruppe mit und ohne Nachstimulation. In mit PMA und Ionomycin stimulierten
Kulturen war an allen Tagen ein hoher Anteil IFN-γ bildender Zellen nachweisbar.
50
IFN-γγ produzierende
Zellen [%]
80
60
mit PMA / Ionomycin
40
ohne PMA / Ionomycin
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abbildung 19: Vergleich der Kinetik IFN-γγ-produzierender Zellen mit und ohne
Nachstimulation durch PMA und Ionomycin
Der Anteil IL-4 produzierender Zellen war nach Stimulation mit PMA und
Ionomycin geringer.
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4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, welche Faktoren in
vitro die Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th1- oder Th2-Effektorzellen
beeinflussen. Dazu wurde ein Zellkultursystem etabliert, das ausschließlich
autologe Zellen verwendet. Die Differenzierung der naiven T-Zellen wurde anhand
des intrazellulären Zytokinprofils beurteilt; die Zytokine IFN-γ und IL-4 dienten
hierbei als charakteristische Zytokine für Th1- bzw. Th2-Antworten.
In ersten Versuchen zeigten sich nach einer Kulturdauer von sieben Tagen keine
vitalen Zellen mehr. Stimulationen dieser Kulturen mit den Zytokinen IL-2 oder IL-7
verbesserten das Überleben der Zellen deutlich. Allerdings gelang es unter diesen
Bedingungen nicht, einen nennenswerten Anteil an IFN-γ-bildenden Zellen zu
induzieren.
Es wurde daraufhin ein System entwickelt, in dem mittels des Superantigens
TSST-1 gezielt ein bestimmter Anteil der naiven T-Zellen stimuliert wurde.
Dadurch war es möglich, die stimulierten und die nicht-stimulierten Zellen parallel
zu untersuchen. In diesem System wurde dann eine Vielzahl möglicher
Einflussfaktoren untersucht.
Ein Faktor mit Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung ist das Vorkommen von HLADR-positiven Zellen in der Fraktion der CD45RA-positiven Zellen. Diese Zellen
verstärken deutlich die Ausbildung von Th1-Mustern. Nach dieser Feststellung
wurden als naive T-Zellen nur noch Zellen eingesetzt, die durch Depletion von
HLA-DR-positiven und CD45R0-positiven Zellen gewonnen wurden.
Als wesentliche Einflussfaktoren konnten die Dauer der Zellkultur sowie das
Ausmaß der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor identifiziert werden. Eine kurze
Dauer der Zellkultur sowie eine starke Stimulation in Form einer hohen TSST-1Konzentration führte zu einem überwiegen von Th1-Zellen bei den stimulierten
Vβ2-positiven Zellen. Unterstützt wurde die Ausbildung von Th1-Mustern durch die
Anwesenheit von LPS.
Erneute Stimulationen mittels einer zweiten Gabe von TSST und von mit GM-CSF
und LPS vorbehandelten dendritischen Zellen hatten keinen ausgeprägten Effekt
auf die Anzahl IFN-γ-produzierender Zellen. Einen starken polarisierenden Einfluss
in Richtung Th-1-Antwort zeigten Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin, dies
sogar unabhängig von der Dauer der Kultur.
52
4.1 Das Überleben von T-Zellen in der autologen Kokultur mit
dendritischen Zellen erfordert zusätzliche Stimuli
Die autologen Kokulturen ohne zusätzliche Stimuli zeigten sich anfällig für ein
frühes Absterben der eingesetzten Zellen. Nur in der Hälfte der durchgeführten
Versuche waren genügend Zellen für eine Messung der Zytokinproduktion
vorhanden. Da einerseits die Zahl der initial einsetzbaren Zellen für die Kultur
beschränkt war, andererseits aber auch mehrere Einflussfaktoren parallel an den
Zellkulturen untersucht werden sollten, musste ein Zellkultursystem entwickelt
werden, in dem durch zusätzliche Stimuli ein Überleben der Zellen ermöglicht
wird.
Dieses Ziel konnte durch Stimulation mit den Zytokinen IL-2 bzw. IL-7 erreicht
werden. Die Stimulation führte zu einem deutlich verbesserten Überleben oder
einer Proliferation der Zellen. IL-7 zeigte eine stärkere Wirkung auf die
Proliferation als IL-2. Die Wirkung war bei beiden Zytokinen von der eingesetzten
Dosis nur in geringem Maße abhängig.
Als Ursachen für die fehlende Proliferation in der unstimulierten autologen
Kokultur kommen mehrere Faktoren in Betracht:
1. Die verwendeten neonatalen T-Zellen sind unreifer als adulte Zellen und
zeigen deshalb eine geringe Ansprechrate in der MLR.
2. Die als Stimulatorzellen verwendeten dendritischen Zellen sind aufgrund
fehlender Ausreifung nicht in der Lage eine Proliferation von T-Zellen
auszulösen.
Soares verglich unstimulierte Kulturen von CD45RA-positiven Zellen aus
Nabelschnurblut mit adulten Zellen. Nach acht Tagen waren alle Zellen aus
Nabelschnurblutkulturen abgestorben, während in den adulten Kulturen noch 75%
lebende Zellen vorhanden waren. Diese Abnahme der Zellzahl war durch
Apoptose bedingt und ließ sich durch Zytokine verhindern , die wie IL-2, IL-4, IL-7
und IL-15 an die gemeinsame γ-Kette des IL-2-Rezeptors binden. IL-7 war hier
den anderen Zytokinen deutlich überlegen und führte als einziges Zytokin zu einer
deutlichen Zunahme der Zellzahl durch Proliferation (Soares et al., 1998).
Neonatale Zellen zeigen ein vermindertes Ansprechen auf eine Stimulation mit
Antikörpern gegen CD2 und / oder CD28 im Vergleich zu adulten Zellen. Die
Expression von IL-2, des IL-2-Rezeptors (CD25) sowie die Proliferationsantwort,
53
sind in neonatalen Zellen jeweils signifikant geringer. Durch die Zugabe von
exogenem IL-2 kann die Antwort neonataler Zellen auf das Niveau adulter Zellen
angehoben werden (Hassan et al., 1995).
Diese Unreife neonataler Zellen bezüglich der Bildung des Wachstumsfaktors IL-2
könnte erklären, warum in der vorliegenden Arbeit das Überleben der Zellen in der
MLR vermindert war.
Sowohl in der allogenen als auch in der autologen MLR sind dendritische Zellen
die wirksamsten Stimulatorzellen. Die Proliferation von T-Lymphozyten ist in der
autologen MLR allerdings deutlich geringer als in der allogenen MLR (Kuntz Crow
and Kunkel, 1982).
In der autologen MLR spielt die Ausreifung der dendritischen Zellen im Gegensatz
zur allogenen MLR eine besondere Rolle. Durch Reifung der dendritischen Zellen
mit GM-CSF über 48 h wird eine vermehrte Expression von CD80 und CD86
erzielt, welche die Fähigkeit zur Stimulation um den Faktor 100 steigert
(Scheinecker et al., 1998).
Eine Unreife der in dieser Arbeit verwendeten dendritischen Zellen könnte daher
die fehlende Proliferation der T-Zellen erklären. Diese dendritischen Zellen wurden
in einer früheren Arbeit genauer untersucht. Hier zeigte sich ein Anstieg der
Expression von CD80, CD86 und anderen Reifungsparametern nach Stimulation
mit GM-CSF und LPS (Bartz, 2001).
Den hier genannten Aspekten wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter
nachgegangen, da sie nicht zur zentralen Fragestellung gehörten. In zukünftigen
Arbeiten auf diesem Gebiet könnte der Einsatz von Proliferations- und ApoptoseAssays eine bessere Aussage bezüglich Überleben und Proliferation der Zellen
ermöglichen, als dies mittels mikroskopischer Kontrollen und Bestimmungen der
Zellzahl möglich ist.
4.2 Die Th2-Differenzierung ist ein „Grundzustand“ neonataler TZellen, aber eine Th1-Antwort ist auslösbar
Bei den ersten Messungen der intrazellulären Zytokinproduktion im Rahmen
dieser Arbeit fiel auf, dass die Stimulation mit IL-2 bzw. IL-7 ausschließlich zu
54
einer Th2-Antwort der T-Zellen führte. Die Messungen wurden an Tag 7 der
Zellkultur durchgeführt. Dabei waren IFN-γ bildende Zellen nicht nachweisbar. Der
Anteil IL-4-bildender Zellen lag je nach eingesetztem Stimulans zwischen 11% und
34%.
Eine
relative
Unfähigkeit
zur
Bildung
von
IFN-γ
durch
T-Zellen
aus
Nabelschnurblut ist mehrfach beschrieben worden. So zeigten Zellen aus
Nabelschnurblut nach Stimulation mit PMA und Ionomycin im Vergleich mit
adulten Zellen eine um ein Vielfaches geringere IFN-γ-Produktion, während die
Fähigkeit zur Bildung von IL-2 und IL-4 annähernd gleich war (Chalmers et al.,
1998). Andere Studien zeigten, dass ohne Stimulation mit PMA und Ionomycin
CD45RA-positive Zellen aus Nabelschnurblut auch eine verminderte IL-2Produktion und eine verminderte Proliferation verglichen mit adulten Zellen zeigen.
Unter PMA- und Ionomycin-Stimulation zeigten adulte und neonatale Zellen
allerdings vergleichbares Verhalten (Hassan and Reen, 1997). Der Nachweis IFNγ-bildender Zellen bei Nachstimulation mit PMA und Ionomycin im Rahmen dieser
Arbeit passt in diesen Zusammenhang.
Neben einer verminderten Fähigkeit zur IFN-γ-Produktion als intrinsische
Eigenschaft neonataler T-Zellen kommen allerdings noch eine Reihe weiterer
Faktoren für dieses Phänomen in Frage:
Ein
wesentlicher
Faktor
kann
eine
inadäquate
Interaktion
zwischen
antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle sein. Besondere Bedeutung kommt
hierbei kostimulierenden Molekülen zu. So kann ein Mangel an Kostimulation über
den CD28-Rezeptor zur Anergie und Toleranzentwicklung führen (Nurieva et al.,
2006).
Andere wichtige Faktoren könnten die Kostimulation über den CD40/CD40LSignalweg und veränderte Eigenschaften von neonatalen dendritischen Zellen
sein. Das bakterielle Produkt LPS wird von TLR-4 erkannt und führt zur Reifung
von myeloiden DC mit gesteigerter Expression von MHC-II-Molekülen, CD86 und
erhöhter Produktion von IL-12 (Medzhitov and Janeway, 2000). In Versuchen mit
Zellen aus Nabelschnurblut konnte gezeigt werden, dass LPS im Gegensatz zu
adulten Zellen nicht zu einer Produktion von aktivem IL-12 (p70) führte, dafür aber
zu einer erhöhten IL-10-Bildung, welche die Th2-Differenzierung begünstigt.
Während die LPS-Exposition in Nabelschnurblut wie adultem Blut zu einer
gleichen Steigerung der HLA-DR-Expression und der CD86-Expression führte,
55
war die Zunahme der CD40-Expression bei neonatalen DC geringer ausgeprägt
(De Wit et al., 2003). Dies könnte eine Erklärung für die Bevorzugung von Th2Antworten in der neonatalen Immunantwort sein. Eine neuere Studie konnte
zeigen, dass bei kombinierter Stimulation über mehrere TLR-Signalwege (TLR-3,
TLR-4, TLR-8) neonatale DC eine IL-12 und IFN-γ-Produktion wie adulte Zellen
zeigen (Krumbiegel, Zepp and Meyer, 2007).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde allerdings lediglich LPS als über den TLR-4
wirkendes Stimulans eingesetzt, so dass die beeinträchtigte IL-12-Produktion eine
wesentliche Rolle für die Th2-Differenzierung haben könnte. IL-12 führt auch zu
einer Suppression der autokrinen IL-4-Stimulation aus Th2-Zellen, die ein weiterer
Faktor für die Ausbildung von Th2-Antworten ist.
Ein weiterer Einflussfaktor für die Bevorzugung von Th2-Antworten wird in der
intrauterinen
Entwicklung
gesehen.
Intrauterine
Umgebungsbedingungen,
insbesondere das Vorhandensein von IL-4 und Progesteron, fördern eine Th2Antwort. Dies ist für die Erhaltung der Schwangerschaft von Bedeutung und führt
auch systemisch bei der Schwangeren zur Bevorzugung einer Th2-Antwort
(Wegmann et al., 1993). Eine „Nachwirkung“ dieser Umgebungsbedingungen auf
die neonatale Immunantwort wird diskutiert (Herz et al., 2000; Adkins et al., 2001).
Insgesamt zeigt die Studienlage, dass bei Vorliegen einer optimalen Stimulation
die T-Zell-Antworten von adulten und neonatalen Zellen vergleichbar sind und
neonatale Zellen eine Th1-Differenzierung und IFN-γ-Produktion zeigen können.
Die Identifizierung der optimalen Stimulation bei dem hier verwendeten autologen
Zellkulturmodell war daher ein wichtiges Ziel dieser Arbeit und wird in den
nächsten Abschnitten diskutiert.
4.3 Die Differenzierung zu Th1-Zellen ist abhängig von der
Anwesenheit dendritischer Zellen. Th2-Zellen lassen sich
auch ohne dendritische Zellen erzeugen.
In Vorexperimenten zeigte die Kultur von mit TSST stimulierten CD45RA-positiven
Zellen ohne Zugabe von dendritischen Zellen eine Bildung von IFN-γ in den TLymphozyten. Es stellte sich daher die Frage, ob in den Kulturen außer den
naiven T-Zellen noch ein anderer Zelltyp vorhanden ist, der für die Induktion der
56
beobachteten
Th1-Antwort
verantwortlich
sein
könnte.
Nach
durchfluß-
zytometrischen Untersuchungen ergab sich ein Anteil von etwa 5% HLA-DR
positiven Zellen an den CD45RA-positiven Zellen. Dieser Oberflächenmarker ist
typischerweise auf antigenpräsentierenden Zellen zu finden. Ein Zelltyp, der
diesen genannten Eigenschaft entspricht, sind lymphoide dendritische Zellen,
welche die Oberflächenmarker CD4, CD45RA und CD123 exprimieren (Grabbe et
al., 2000; Reid et al., 2000).
Für weitere Experimente gelang es, die HLA-DR-positiven Zellen vollständig zu
entfernen. Auf den depletierten Zellen waren auch keine anderen für dendritische
Zellen oder Makrophagen typischen Oberflächenmoleküle mehr nachweisbar,
beispielweise CD14, CD33 oder CD123 (Liu, 2001).
In den Kulturen ohne Zugabe von dendritischen Zellen ließ sich jetzt keine Bildung
von IFN-γ mehr nachweisen. Verglichen mit den Kulturen ohne HLA-DR-Depletion
nahm der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen in der Gruppe mit dendritischen
Zellen deutlich ab, so zum Beispiel von 37% auf 15% für die TSST-Konzentration
von 100 ng / ml. Unabhängig von der Durchführung einer HLA-DR-Depletion
zeigte sich, dass in den Kulturen ohne dendritische Zellen ein höherer Anteil IL-4bildender Zellen nachweisbar war.
Eine vergleichbare Beobachtung machten Brandt und Mitarbeiter, die in Kulturen
gereinigter und von antigenpräsentierenden Zellen depletierter T-Zellen eine
Proliferation und Differenzierung nach TSST-Stimulation fanden. Nach einer
Depletion der HLA-DR positiven T-Zellen, die einen Anteil von 1-3% ausmachten,
waren Proliferation und Differenzierung nicht mehr zu beobachten. Brandt und
Mitarbeiter folgerten daraus, dass sich Superantigen-aktivierte T-Zellen in
Anwesenheit von HLA-DR positiven T-Zellen sehr ähnlich verhalten wie in der
Gegenwart professioneller antigenpräsentierender Zellen (Brandt et al., 2002).
Möglicherweise handelte es sich aber auch in diesem Fall bei den HLA-DR
positiven Zellen um lymphoide dendritische Zellen.
Die Anwesenheit antigenpräsentierender Zellen - hier dendritischer Zellen - ist
eine Voraussetzung für die Erzeugung von Th1-Antworten in dem hier
vorgestellten Kulturmodell. Dieses Ergebnis stimmt überein mit einer Vielzahl von
Arbeiten, welche die Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und TZellen untersuchten. Die erste notwendige Stimulation der T-Zellen erfolgt
57
antigenabhängig über MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zell-Rezeptor. Hier
konnte gezeigt werden, dass Superantigene am effektivsten durch dendritische
Zellen präsentiert werden, welche allen anderen antigenpräsentierenden Zellen
überlegen sind, da sie 10-fach bis 100-fach höhere Dichten an HLA-DR, -DP und
–DQ auf ihrer Oberfläche aufweisen (Bhardwaj et al., 1992).
Eine weitere wesentliche Rolle spielen Interaktionen zwischen kostimulierenden
Molekülen, vor allem dem CD28 / B7-Komplex (CD80, CD86) und CD40 / CD40L
(CD154).
Der Signalweg über CD40 auf dendritische Zellen und CD40L auf T-Zellen ist der
stärkste Stimulus, der eine IL-12-Bildung durch dendritische Zellen induziert, und
ist damit von entscheidender Bedeutung für die Entstehung von Th1-Mustern.
Ohne Stimulation über CD40 können auch andere Faktoren, die als IL-12Induktoren bekannt sind (z.B. LPS), keine Bildung von IL-12 induzieren (Cella et
al., 1996). Hinsichtlich der Aktivierung über CD40 stellen lymphoide dendritische
Zellen eine Ausnahme dar. Für diese Zellen konnte kürzlich im Mausmodell
gezeigt werden, dass die Aktivierung unter Stimulation mit dem Superantigen SEA
zwar von T-Zellen abhängig ist, aber nicht über CD40 vermittelt wird (Muralimohan
and Vella, 2006). Aufgrund dieser Beobachtungen ist nachvollziehbar, dass in den
Kulturen nach Depletion der lymphatischen dendritischen Zellen und ohne Zugabe
weiterer dendritischer Zellen keine Bildung von IFN-γ mehr nachweisbar war.
Der Signalweg über CD28 auf T-Zellen und CD80 / CD86 auf dendritischen Zellen
ist – wie bereits in der Einleitung beschrieben – von Bedeutung für Aktivierung und
Proliferation der T-Zellen. So konnte gezeigt werden, dass wiederholte
Stimulationen über CD28 die Ausbildung einer Th2-Antwort fördern und die
Bildung von IFN-γ unterdrücken (King et al., 1995). In einem anderen Modell, in
dem TSST-1 als Stimulus eingesetzt wurde, konnte jedoch durch Antikörper
gegen CD80 / CD86 die Sekretion von IFN-γ durch aktivierte, Vβ2-positive TLymphozyten unterdrückt werden (Kum et al., 2002). Auch die fehlende
Kostimulation über CD28 könnte daher erklären, warum in den Kulturen ohne
dendritische Zellen keine Bildung von IFN-γ zu beobachten war.
Ein wesentlicher Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung wird seit einigen Jahren
auch verschiedenen Untergruppen dendritischer Zellen zugeschrieben. So
postulierten Rissoan und Mitarbeiter ein Modell der T-Zell-Differenzierung, in dem
myeloide dendritische Zellen (als DC1 bezeichnet) zu einer Th1-Differenzierung
58
führen, während lymphoide dendritische Zellen (DC2) eine Th2-Differenzierung
hervorrufen (Rissoan et al., 1999).
Weitere
Arbeiten
zeigten
allerdings,
dass
neben
der
Ontogenese
der
dendritischen Zellen auch die Art der dendritische Zellen aktivierenden Stimuli
und der Reifungszustand der dendritischen Zellen eine Rolle für die T-ZellDifferenzierung spielen (Grabbe et al., 2000).
So können in Abhängigkeit von den Reifungsbedingungen auch myeloide
dendritische Zellen starke Th2-Antworten auslösen. Setzt man LPS als alleinigen
Stimulus zur Reifung ein, können myeloide dendritische Zellen – wie auch in
dieser Arbeit gezeigt - sowohl die Bildung von IFN-γ als auch von IL-4 hervorrufen.
Wird zusätzlich zu LPS auch IFN-γ zur Reifung der dendritischen Zellen
verwendet, dann erhält man eine Population dendritischer Zellen, die starke Th1Induktoren sind; bei Verwendung von LPS und Prostaglandin E2 erhält man starke
Th2-Induktoren (Vieira et al., 2000).
Diese Einflüsse von LPS wurden im Rahmen dieser Arbeit noch weiter untersucht
und werden im nächsten Abschnitt diskutiert.
4.4 Effekte von LPS auf die Differenzierung zu Th1- und Th2Zellen
Die Zugabe von LPS zu den Zellkulturen führte zu einer Zunahme der IFN-γbildenden Zellen. Der Unterschied lag je nach eingesetzter TSST-Konzentration
und betrachteter Zellgruppe (Vβ2-positive vs. Vβ2-negative Zellen) bei einem
Faktor von 3 bis 8. Der Anteil IL-4-bildender Zellen war unabhängig vom
Vorhandensein von LPS.
Diese Effekte von LPS werden über dendritische Zellen vermittelt. LPS führt zu
einer Reifung der dendritischen Zellen, wobei die Zellen ihre Eigenschaft zur
Antigenaufnahme und Antigenprozessierung verlieren und stattdessen vermehrt
Oberflächenmoleküle exprimieren, die eine Bedeutung für Antigenpräsentation
und T-Zell-Stimulation haben, so zum Beispiel MHC-Komplexe, CD80, CD58 und
CD54. Diese Veränderungen finden innerhalb von 24 bis 48 Stunden statt
(Sallusto et al., 1995). Daneben stimuliert LPS bereits in Dosierungen von 0,1 ng /
59
ml dendritische Zellen innerhalb von 24 Stunden zu vermehrter Produktion der
proinflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8, TNF-α und IL-12, die bei der Induktion
spezifischer Immunantworten durch T- und B-Zellen eine wichtige Rolle spielen. In
der allogenen MLR führen diese mit LPS behandelten dendritischen Zellen zu
einer erhöhten Produktion von IL-2 und IFN-γ und zu einer gesteigerten
Proliferation verglichen mit unstimulierten dendritischen Zellen desselben
Spenders. Insbesondere die Produktion von IFN-γ ist bei Einsatz von LPS um den
Faktor 7 höher als beim Einsatz von unstimulierten dendritischen Zellen
(Verhasselt et al., 1997). Diese Ergebnisse konnten in dieser Arbeit für die
autologe Zellkultur bestätigt werden.
Langenkamp et al. untersuchten die Kinetik der Zytokinproduktion in dendritischen
Zellen nach Stimulation mit LPS und die Fähigkeit dieser Zellen zur Polarisation
von autologen CD4 positiven T-Zellen. Die Produktion von IL-6, IL-10, IL-12 und
TNF-α folgt dabei einer für jedes Zytokin eigenen Kinetik. Ab einem bestimmten
Zeitpunkt führt auch fortgesetzte oder erneute Stimulation nicht mehr zu einer
Zytokinproduktion. Die frühen dendritischen Zellen, die Zytokine bilden, wurden
deshalb in dieser Studie als „aktive“ dendritische Zellen bezeichnet und die späten
dendritischen Zellen, welche die Fähigkeit zur Zytokinproduktion verloren haben,
als „erschöpfte“ dendritische Zellen. Aktive dendritische Zellen führen zu einer
Th1-Differenzierung
und
erschöpfte
dendritische
Zellen
zu
einer
Th2-
Differenzierung der autologen T-Zellen. Zusätzlich besteht auch eine Abhängigkeit
von der Antigendosis (Langenkamp et al., 2000).
Auch der Zeitpunkt der Stimulation mit LPS hat einen Einfluss auf die von den
dendritischen Zellen gebildeten Zytokine (Jiang et al., 2002). Dazu wurde im
Mausmodell die Zytokinantwort von aus Knochenmark generierten dendritischen
Zellen auf LPS-Stimulation zu verschieden Zeitpunkten nach Beginn der Zellkultur
gemessen. Die sofortige oder frühe Zugabe innerhalb von 2 Stunden von LPS
führt zu einer starken IL-10-Antwort, die bei einer Zugabe zu einem späteren
Zeitpunkt deutlich geringer ausfällt. Umgekehrt verhält sich die IL-12-Antwort, die
bei sofortiger Zugabe zur Zellkultur kaum nachweisbar ist. Erst bei einer Zugabe
nach 2 Stunden wird IL-12 in größeren Mengen gebildet. Das Maximum ist
erreichbar bei einer Zugabe von LPS nach 10 Stunden. Die IL-12-produzierenden
dendritischen Zellen erwiesen sich den IL-10-bildenden dendritischen Zellen als
deutlich überlegen hinsichtlich der Kapazität zur T-Zell-Stimulation.
60
In dieser Arbeit wurden, wie beschrieben, die dendritischen Zellen zunächst für 2
Stunden mit GM-CSF vorinkubiert, bevor T-Zellen, LPS und andere Stimuli
hinzugefügt wurden. Unter den oben genannten Voraussetzungen wären zu
diesem Zeitpunkt sowohl die Bildung von IL-10 als auch von IL-12 zu erwarten.
Eine Messung von Zytokinen in dendritischen Zellen wurde im Rahmen dieser
Arbeit nicht durchgeführt. Zur Kontrolle des Einflusses der Dauer der
Vorinkubation
wurde
in
einer
Versuchsreihe
die
Inkubationsdauer
der
dendritischen Zellen mit GM-CSF auf 24 Stunden verlängert. Es ergaben sich
keine Unterschiede hinsichtlich der T-Zell-Differenzierung am Ende der Kokultur
nach sieben Tagen, so dass dieser Aspekt im Rahmen der vorliegenden Arbeit
nicht weiter untersucht wurde.
4.5 NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen können über sezernierte
Zytokine
die
Differenzierung
naiver
T-Helferzellen
beeinflussen
In der in dieser Arbeit verwendeten Population naiver T-Zellen waren neben den
untersuchten T-Helferzellen noch zwei andere Zelltypen in größerer Anzahl
vorhanden. Es handelt sich dabei um NK-Zellen, charakterisiert durch die
Oberflächenmarker CD16 und CD56, und zytotoxische T-Zellen, die den
Oberflächenmarker CD8 tragen.
Diese Zellen könnten auf zwei verschiedene Weisen die Ergebnisse beeinflussen:
1. Die Zellen nehmen direkt Einfluss auf die Messergebnisse, da sie bei der
durchflußzytometrischen Messung erfasst werden.
2. NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen bilden und sezernieren Zytokine,
welche,
im
Sinne
eines
sogenannten
„Bystander-Effektes“,
die
Differenzierung der T-Helferzellen beeinflussen.
Bei der Auswertung der durchflußzytometrischen Messung wurde wie beschrieben
ein Gating auf Lymphozyten anhand des Oberflächenmarkers CD3 durchgeführt.
Da NK-Zellen dieses Oberflächenmolekül nicht tragen, wurden sie bei der
Messung der intrazellulären Zytokine nicht erfasst. Miterfasst werden hingegen
zytotoxische T-Zellen, welche das Messergebnis beeinflussen könnten. Studien
61
zeigen
jedoch,
dass
diese
Beeinflussung
zumindest
keine
größeren
Veränderungen des Messergebnisses erwarten lässt. Proliferierende Zellen in der
MLR sind vorwiegend CD4 T-Zellen (Smolen et al., 1981). Außerdem bilden CD8positive Zellen nach Stimulation mit TSST kein IL-4 und nur zu einem geringen
Anteil (< 5%) IFN-γ (Gehring et al., 1998).
Von Bedeutung ist der geringe Anteil IFN-γ-bildender Zellen aber möglicherweise,
wenn es um den Einfluss auch geringer Mengen von Zytokinen auf die
Differenzierung von T-Helferzellen geht. Wie bereits in der Einleitung beschrieben,
ist die Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu T-Helferzellen vom Typ 1
abhängig von IL-12, das beispielsweise von dendritischen Zellen gebildet wird. Die
Bildung von IL-12 ist abhängig von IL-12-induzierenden Faktoren wie LPS, CD40L
oder exogenem IFN-γ. Mit exogenem IFN-γ gemeinsam mit LPS konnte eine
Steigerung der IL-12-Bildung in dendritischen Zellen um den Faktor 40 gegenüber
LPS alleine beobachtet werden. Dabei wirkt IFN-γ nur während der initialen Phase
der Kultur, dass heißt in den ersten vier Stunden (Hilkens et al., 1997; Schuhbauer
et al., 2000).
Im Mausmodell konnte eine Untergruppe der CD8 T-Zellen als frühe IFN-γProduzenten identifiziert werden, die bereits 45 Minuten nach Stimulation mit CD3Antikörpern IFN-γ bilden und nach drei Stunden die maximale Expression von
IFN-γ auf Protein- und mRNA-Ebene zeigen (Das et al., 2001). Beim Menschen
konnte diese frühe IFN-γ-Produktion ebenfalls gezeigt werden. Hier führte
allerdings nur die gemeinsame Stimulation von DC mit CD8- und CD4-T-Zellen zur
Bildung von IL-12. Als wesentliche Faktoren hierfür wurden von den Autoren das
von den CD8 T-Zellen gebildete IFN-γ und die Stimulation von DC durch CD40L
auf CD4-T-Zellen genannt (Mailliard et al., 2002)
Auch von NK-Zellen ist bekannt, dass sie IFN-γ bilden können. Dies wird
wiederum unterstützt durch IL-12, welches durch dendritische Zellen zur
Verfügung gestellt werden kann (Kamath, 2005). Dendritische Zellen sind aber
auch in der Lage, NK-Zellen direkt zu aktivieren. Direkte Zell-Zell-Kontakte
zwischen DC und NK-Zellen sowie das von den NK-Zellen freigesetzte IFN-γ
führen zu einer weiteren Aktivierung der dendritischen Zellen (Gerosa et al., 2002)
und unterstützen so die Ausbildung eines Th1-Musters (Maillard et al., 2003).
62
Der Einfluss der CD8 T-Zellen und NK-Zellen auf die Differenzierung der naiven
CD4 T-Zellen im hier vorgestellten Modell sollte in künftigen Arbeiten durch
selektive Depletion der genannten Zellgruppen näher untersucht werden, um
unerwünschte Bystander-Effekte zu vermeiden.
4.6 Abhängigkeit
der
T-Zell-Differenzierung
von
der
Superantigen-Dosis
Der Anteil IFN-γ bildender Zellen zeigte bei Messungen am dritten Tag der
Zellkultur eine strenge Abhängigkeit von der eingesetzten TSST-Konzentration.
Bei höherer TSST-Konzentration bildete ein größerer Anteil der Zellen in der
Zellkultur IFN-γ als bei niedrigerer TSST-Konzentration. Diese Beobachtung war
sowohl bei den Vβ2-positiven als auch bei den Vβ2-negativen Zellen zu machen.
Der Anteil IL-4 bildender Zellen war hingegen in beiden Gruppen weitestgehend
unabhängig von der TSST-Konzentration.
Der Einfluss der Konzentration von Antigenen auf die Differenzierung von THelferzellen ist ein seit längerem viel diskutierter Faktor. Constant und Mitarbeiter
konnten zeigen, dass in einem Mausmodell mit für den T-Zell-Rezeptor
transgenen Mäusen, in dem alle T-Zell-Rezeptoren die gleiche Spezifität haben,
niedrige Antigendosen zu einer Th2-Antwort und hohe Antigendosen des gleichen
Antigens zu einer Th1-Antwort führen. Die Ausbildung einer Th2-Antwort wurde in
diesem Modell nur bei Verwendung naiver CD4-positiver T-Zellen beobachtet.
Bereits das Vorhandensein einer kleinen Population IFN-γ-produzierender
Memory-Zellen konnte die Bildung von IL-4 unterdrücken (Constant et al., 1995).
Unter diesem Gesichtspunkt könnte die bereits diskutierte Anwesenheit von NKZellen und CD8+ Zellen als frühen IFN-γ-Produzenten erklären, weshalb in der
vorliegenden Arbeit keine Dosisabhängigkeit der Th2-Antwort zu beobachten war.
In mehreren Arbeiten im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass, unabhängig
von anderen, zusätzlichen Einflüssen wie Co-Stimulation über CD28 / B7 oder
Vorhandensein bestimmter Zytokine, die Antigen-Dosis bzw. die Stärke des TCRSignals einen wesentlichen Faktor für die T-Zell-Differenzierung und die
63
Regulation von Oberflächenmolekülen der T-Zellen darstellt. Insgesamt führten
kleine Antigendosen zusammen mit Stimulation über CD28 zu einer Th2-Antwort,
während eine hohe Antigendosis zu einer Th1-Antwort führte (Tao et al., 1997; Ise
et al., 2002). Eine neuere Studie zeigte, dass unabhängig von Zytokinmilieu und
Kostimulation die Stärke der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor wesentlich für
die
Th1-
bzw.
Th2-Differenzierung
ist.
Durch
Einsatz
von
veränderten
Peptidantigenen mit unterschiedlicher Rezeptoraffinität konnte gezeigt werden,
dass schwach affine Antigene zu Th2-Antworten führen, während normal affine
Antigene sonst unter gleichen Bedingungen zu einer Th1-Differenzierung führten
(Ariga et al., 2007).
Dass auch bei Superantigenen die Affinität zum T-Zell-Rezeptor entscheidend für
die Aktivierung der T-Zellen ist, konnte Andersen in einer Arbeit zeigen, in der
Varianten des Superantigens SEC3 mit unterschiedlicher Affinität zum T-ZellRezeptor eingesetzt wurden. Eine stärkere Bindung an den T-Zell-Rezeptor führte
hier zu einer stärkeren T-Zell-Antwort. So war in Abhängigkeit von der Bindung an
den T-Zell-Rezeptor die Herunterregulierung des T-Zell-Rezeptors bei Liganden
mit starker Affinität erhöht, ebenso die Aktivität des Transskriptionsfaktor NFAT
und die IL-2-Produktion. Die Proliferation der T-Zellen korrelierte ebenfalls positiv
mit der Stärke der TCR-Bindung (Andersen et al., 2001).
Auch Weber et al. konnten eine dosisabhängige Beziehung von T-Zell-Aktivierung,
Proliferation, Zytokinfreisetzung und Zelltod durch Apoptose nachweisen. Zur
Frage der T-Zell-Polarisation machte diese Studie keine Aussagen, allerdings
konnte interessanterweise nachgewiesen werden, das IFN-γ auch bei hohen
Superantigendosen die Apoptose verhindert, nicht jedoch IL-4 (Weber et al.,
1999). Der Nachweis einer Dosisabhängigkeit der T-Zell-Differenzierung gelang
Brandt et al. an adulten, humanen Zellen. Hier führten hohe Dosierungen von
TSST-1 zu einer Th1-Antwort, während niedrige Dosierungen zu einer Th2Differenzierung führten (Brandt et al., 2002). Diese Ergebnisse konnten in der
vorliegenden Arbeit für neonatale Zellen bestätigt werden, die sich damit
hinsichtlich der Induzierbarkeit von Th1- oder Th2-Antworten wie adulte Zellen
verhalten.
Insgesamt ist ein starkes Signal über den T-Zell-Rezeptor der wesentliche Faktor
für eine Th1-Differenzierung. Bei einem starken TCR-Signal spielen polarisierende
Zytokine wie IL-12 eine untergeordnete Rolle. Lediglich die autokrine Sekretion
von IFN-γ ist von Bedeutung. Allerdings können über TLR aktivierte dendritische
64
Zellen auch bei einem schwachen TCR-Signal zu einer Th1-Differenzierung
führen. Ebenso sind bei einem schwachen TCR-Signal die Zytokine IL-12 und IL18 wesentlich für die Induktion einer Th1-Differenzierung verantwortlich (Nembrini
et al., 2006). Diese Aussagen decken sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit, die
sowohl die Abhängigkeit von der TCR-Stimulation als auch den Einfluss der TLRaktivierten dendritischen Zellen, ausgelöst durch LPS-Stimulation, für die Th1Differenzierung ebenfalls nachweisen konnte.
4.7 Abhängigkeit der T-Zell-Differenzierung von der Dauer der
Kultur
Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Feststellung, dass die Th1-Antwort und
die Th2-Antwort ihr Maximum zu verschiedenen Zeitpunkten erreichen. Dabei ist
der Anteil von Th1-Zellen am dritten Tag am höchsten; sowohl davor als auch ab
dem sechsten Tag lassen sich praktisch keine Zellen mit Th1-Differenzierung
mehr nachweisen. Th2-differenzierte Zellen ließen sich hingegen schon sehr früh
ab dem zweiten Tag nachweisen. Ein starker Anstieg der Th2-Zellen war aber erst
ab dem sechsten Tag zu beobachten.
Die Antwort naiver T-Zellen kann in drei Phasen unterteilt werden: Aktivierung,
Proliferation
und
Differenzierung.
Auch
wenn
diese
Phasen
prinzipiell
nacheinander ablaufen, so finden doch für alle drei einzelnen Phasen von Anfang
an entscheidende Weichenstellungen statt.
Die Aktivierungsphase umfasst den Zeitraum von der Aktivierung des TLymphozyten bis zur ersten Zellteilung. In dieser Phase werden die für die
Zellteilung wichtigen Gene aktiviert und ihre Produkte zur Vorbereitung der DNAReplikation und Zellteilung synthetisiert (Jelley-Gibbs et al., 2000). Sie dauert
ungefähr 24 Stunden (Ullman et al., 1990).
Nach der ersten Zellteilung durchlaufen die T-Zellen in der Proliferationsphase
eine schnelle Abfolge von Zellteilungen. Durch diese Expansion der T-Zellen, die
durch die Zytokine IL-2 und TGF-β gefördert wird (Zhang et al., 1995), entsteht
innerhalb von vier Tagen eine große Anzahl aktivierter Effektorzellen (Bradley et
al., 1991).
65
Wesentliche Entscheidungen über die Differenzierung der T-Helferzelle werden
schon in der Aktivierungsphase getroffen, auch wenn die effektive Differenzierung
in Th1- und Th2-Zellen erst später stattfindet (Swain et al., 1990; Lanzavecchia et
al., 1999). Die Abhängigkeit von der Art und der Dosis des aktivierenden Antigens
ist hierbei vor allem in den ersten achtundvierzig Stunden von Bedeutung für die
Differenzierung. Vom zweiten bis zum vierten Tag tritt die Bedeutung der Zytokine
in den Vordergrund. Proliferation und Differenzierung der T-Zellen erfolgen dann
Antigen-unabhängig (Jelley-Gibbs et al., 2000).
Dabei folgt die Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen einer jeweils eigenen
Kinetik. Von Bedeutung ist insbesondere die Dauer der Stimulation über den TZell-Rezeptor. Eine kurze Stimulation von 24 Stunden ohne Anwesenheit von
exogenen Zytokinen führt nur zu einer Proliferation, nicht aber zu einer
Differenzierung
der
T-Zellen,
wohingegen
eine
längere
T-Zell-Rezeptor-
Stimulation über 72 bis 96 Stunden zur Differenzierung von etwa 20% Zellen
sowohl zum Th1-Typ als auch zum Th2-Typ führt. Die Anwesenheit von
exogenem IL-12 führt auch schon bei einer kurzen T-Zell-Rezeptor-Stimulation zur
einer Th1-Differenzierung von 70% der Zellen, da eine schnelle Produktion von
IFN-γ einsetzt und IL-12 auch noch nach dem Ende der Stimulation über den TZell-Rezeptor wirksam ist. Für eine Th2-Differenzierung ist hingegen eine längere
Periode der Stimulation über den T-Zell-Rezeptor zeitgleich mit der Anwesenheit
von IL-4 erforderlich (Iezzi et al., 1999).
Bird und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die T-Zell-Differenzierung direkt von der
Anzahl der durchlaufenen Zellteilungen abhängig ist (Bird et al., 1998). Während
IL-2 unabhängig von der Anzahl der Zellteilungen war, nahm die Anzahl IFN-γbildender Zellen mit jedem durchlaufenen Zellzyklus zu. IL-4 war erst nach
mindestens drei Zellteilungen, dass heißt ab dem dritten Tag, nachweisbar. In
diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass IFN-γ-mRNA in
aktivierten Zellen innerhalb von 6 Stunden aktiviert wird, IL-4-mRNA hingegen erst
nach 48 Stunden (Lederer et al., 1996).
Die vorstehenden Erkenntnisse aus Mausmodellen lassen sich auch auf humane
Verhältnisse übertragen.
Sornasse und Mitarbeiter verwendeten neonatale CD4-positive T-Zellen für
kinetische Untersuchungen der T-Zell-Differenzierung. IFN-γ-bildende Th1-Zellen
waren bei Zugabe von exogenem IL-2 nach vier Tagen, aber nicht mehr nach
sechs Tagen nachweisbar. Unter Zugabe von IL-12 war nach vier Tagen eine
66
höhere Rate von Th1-Zellen (60-70%) nachweisbar als nach sechs Tagen (3040%). Th2-Zellen waren nach sechs Tagen selbst nach Stimulation mit IL-4 nur in
sehr
geringem
Umfang
nachweisbar
(2%).
Erst
nach
einem
weiteren
Stimulationszyklus von sechs Tagen stieg der Anteil an Th2-Zellen auf 20%
(Sornasse et al., 1996).
In Zellkultursystemen mit humanen Zellen und unter Verwendung von TSST
konnten Gehring und Mitarbeiter Th1-differenzierte Zellen nach 18 Stunden und
Th2-differenzierte Zellen nach drei Tagen nachweisen (Gehring et al., 1998).
Ein wesentlicher Unterschied zwischen murinen und humanen T-Zellen ist die
Stabilität der Th2-Zell-Differenzierung. Maus-Th2-Zellen weisen im Gegensatz zu
humanen Zellen eine stabile Zytokinproduktion auf und können nicht in einen Th1Phenotyp „umdifferenziert“ werden (Perez et al., 1995). Humane Th2-Zellen
können durch IL-12 zur Bildung von IFN-γ induziert werden. Th1-Zellen hingegen
werden durch IL-4 nicht zur Bildung von IL-4 induziert (Seder and Prussin, 1997).
4.8 Unterschiede zwischen Vβ
β2-positiven und Vβ
β2-negativen TZellen
Die vorgestellten Ergebnisse zeigen einen deutlichen Unterschied hinsichtlich der
Bildung von IFN-γ zwischen den Vβ2-positiven und den Vβ2-negativen T-Zellen.
Vβ2-positive Zellen sind an Tag 3 die überwiegenden IFN-γ-Produzenten.
Dennoch bilden bei hohen TSST-Konzentrationen von 100 ng / ml auch etwa 12%
der Vβ2-negativen Zellen IFN-γ.
Hinsichtlich des Anteils IL-4-produzierender Zellen gab es keine wesentlichen
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Vβ2-negativen Zellen zeigten
tendenziell eine geringfügig höhere Rate IL-4-bildender Zellen als die Vβ2positiven Zellen.
Superantigene führen – wie in der Einleitung ausführlich dargestellt – zu einer
selektiven Expansion spezifischer T-Zell-Klone; für TSST sind dies T-Zellen, die
Vβ2-Ketten als Teil ihres T-Zell-Rezeptors exprimieren. Diese selektive Expansion
ist in experimentellen Arbeiten gut untersucht (Marrack and Kappler, 1990) und
lässt sich auch in vivo bei Patienten mit toxischem Schocksyndrom nachweisen
67
(Choi et al., 1990). Daher ist die in dieser Arbeit gemachte Beobachtung, dass
auch Vβ2-negative Zellen aktiviert werden und eine Zytokinproduktion zeigen,
zunächst nicht erklärlich. Für TSST konnte allerdings gezeigt werden, dass neben
der Aktivierung über die Verbindung von MHC-Komplex und T-Zell-Rezeptor auch
über Zytokine indirekt eine wesentliche T-Zell-Stimulation auslösbar ist (Rink et al.,
1997). Die wesentlichen Zytokine, die für die starke T-Zell-Proliferation in Frage
kommen, sind IL-1 und IL-6. In vergleichbarer Weise kann auch IFN-γ durch
direkte und indirekte Wirkungen von TSST induziert werden. Das Vorkommen
aktivierter und insbesondere IFN-γ bildender Vβ2-negativer Zellen wäre also über
Bystander-Effekte sezernierter Zytokine erklärbar.
Eine weitere Erklärung kann das Verhalten der aktivierten T-Zellen auf die
Aktivierung mit TSST geben. Superantigene führen zu einer Herunterregulierung
der spezifischen Vβ-Ketten des T-Zell-Rezeptors. Dieser Effekt ist dosisabhängig
und nimmt mit steigender Konzentration zu. Während bei einer Konzentrationen
von 10 fg / ml keine Auswirkungen zu beobachten sind, werden bei
Konzentrationen von 0,1 pg / ml und 100 pg / ml etwa 30-60% der Rezeptoren
herunterreguliert. Bei Konzentration von 10 ng / ml und 1 µg / ml ist der Effekt fast
vollständig, so das kaum noch Vβ-positive Zellen nachweisbar sind (Gehring et al.,
1998). Die Herunterregulierung beginnt bereits 10 min nach Aktivierung und ist
nach etwa 6-8 Stunden komplett (Kum et al., 2001; Gehring et al., 1998). Damit
sind diese Effekte die ersten, die nach Kontakt mit dem Superantigen auftreten,
und liegen zeitlich deutlich vor der klonalen Expansion mit dem Maximum nach 72
Stunden. Auch im Rahmen dieser Arbeit konnten vergleichbare Effekte
nachgewiesen werden. Nach einer Kulturdauer von sieben Tagen war eine war
eine Abhängigkeit der Vβ2-Expression von der eingesetzten TSST-Konzentration
zu beobachten, wobei bei kleinsten Konzentrationen die höchste Expression
messbar war. Damit kommt neben den oben genannten Bystander-Effekten auch
eine verminderte (erneute) Expression von Vβ2 als Erklärung für das Vorkommen
aktivierter, Vβ2-negativer Zellen in Betracht.
Eine
weitere
Erklärungsmöglichkeit
Superantigenzubereitungen.
besteht
bei
verunreinigten
So wurde auch für das im Rahmen dieser Arbeit
verwendete TSST vereinzelt von Verunreinigungen berichtet, die eine erweiterte
Vβ-Reaktivität zur Folge hatten (Fleischer et al., 1996). Die Möglichkeit von
68
Verunreinigungen könnte in Zukunft durch Verwendung rekombinant hergestellter
Superantigene ausgeschlossen werden.
Auch
das
Vorkommen
von
aktivierenden
Substanzen
im
Kulturmedium
(insbesondere LPS) könnte eine Erklärung für die Aktivierung Vβ2-negativer
Zellen sein.
4.9 Einfluss von Nachstimulationen mit dendritischen Zellen,
LPS und TSST
Im Rahmen der Untersuchungen zur Kinetik der IFN-γ- und IL-4-Produktion wurde
ein Teil der Zellkulturen jeweils 24 Stunden vor der intrazellulären ZytokinMessung mit 100 ng TSST sowie mit LPS vorinkubierten DC nachstimuliert. Diese
nachstimulierten
Zellkulturen
zeigten
aber
im
Vergleich
zu
den
nicht-
nachstimulierten Zellkulturen kaum andere Verteilungen der gemessenen
Zytokine. Lediglich an Tag 3 war der Anteil IFN-γ-bildender Zellen erhöht (46,2%
vs. 37,3%). An den Tagen 2-4 war zudem der Anteil IL-4-bildender Zellen in den
nachstimulierten Zellkulturen geringer.
Hierfür kommen verschiedene Erklärungen in Frage. Zunächst könnte eine Unreife
der Nabelschnur-T-Zellen als Erklärung herangezogen werden. Takahashi
berichtete,
dass
Restimulation
mit
TSST
bei
Nabelschnur-T-Zellen
zur
Toleranzentwicklung führt, während adulte T-Zellen eine hohe IL-2-Produktion
nach Restimulation mit TSST zeigten. Zudem zeigten die Nabelschnur-T-Zellen in
dieser Studie keine oder eine wesentlich geringere IL-4-Produktion als die adulten
T-Zellen (Takahashi et al., 1995). Neuere Studien und auch die Ergebnisse dieser
Arbeit lassen allerdings vermuten, dass die Ursachen hierfür vor allem in den
Stimulationsbedingungen
–
vor
allem
im
Fehlen
geeigneter
antigenpräsentierender Zellen (z.B. DC) – zu suchen sind. Eine generelle
Annahme immunologischer Unreife von Nabelschnurzellen ist nicht mehr aufrecht
zu erhalten.
Neben einer Toleranzentwicklung kommt als mögliche Reaktion der T-Zellen auf
eine Restimulation auch die Apoptose in Betracht. Für humane Thymozyten ist
eine entsprechende Reaktion auf wiederholte TSST-Stimulation beschrieben
(Mingari et al., 1996). Dabei zeigten nach erneuter Stimulation mit 5 ng TSST 47%
69
der Vß2-positiven Thymozyten nach 24 Stunden Zeichen der Apoptose wie DNAFragmentation. Insgesamt nahm der Anteil der Vß2-positiven Zellen dadurch ab.
In der vorliegenden Arbeit wurden keine Marker für Apoptose bestimmt. Allerdings
fielen die nachstimulierten Zellen auch nicht durch veränderte Zellstrukturen auf.
So hätte ein Zerfall des Zellkernes zu Auffälligkeiten im side-scatter bei der
durchflußzytometrischen Messung geführt. Der Anteil Vß2-positiver Zellen war in
den nachstimulierten Kulturen nicht geringer, daher kann ein Verlust an Zellen
durch Apoptose als unwahrscheinlich gelten.
Für die oben genannten Ergebnisse im Rahmen dieser Arbeit scheinen daher
andere Faktoren von Bedeutung zu sein. So konnte gezeigt werden, dass reife DC
keine Reaktion auf eine (erneute) Stimulation mit LPS oder anderen bakteriellen
Produkten zeigen und insbesondere die Fähigkeit zur Bildung von IL-12 verlieren,
dem wichtigsten Induktor einer IFN-γ-Synthese in T-Zellen (Kalinski et al., 1999).
Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurden daher bei
den Restimulationen nicht nur TSST und LPS zu den Kulturen gegeben, sondern
auch frische, d.h. unreife dendritische Zellen, die zuvor zwei Stunden mit GM-CSF
vorinkubiert wurden. Dennoch führte die Restimulation nicht zu einer wesentlichen
Veränderung der Zytokinproduktion in den T-Zellen. Als Ursache könnten
veränderte Eigenschaften der T-Zellen zum Zeitpunkt der Restimulation in Frage
kommen. So führt die erste Stimulation in der Regel bereits zu einer schnellen
Herabregulierung des T-Zell-Rezeptors und anderer kostimulierender Moleküle
(Jang and
Gu,
2003;
Geisler,
2004). Demnach
könnte eine
fehlende
Ansprechbarkeit auf erneute Stimulation aufgrund mangelhafter Interaktion
zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen beruhen.
Als weitere Erklärung kommt in Frage, dass humane Th1-Zellen in ihrer
Differenzierung stabil sind, während Th2-Zellen durch Restimulation zur IFN-γProduktion angeregt werden können. Entsprechende Ergebnisse zeigen sich bei
Stimulation humaner neonataler T-Zellen mit exogenem IL-4 und IL-12 (Sornasse
et al., 1996). Wie zu erwarten, führte bei diesen Versuchen die Kultivierung in
Gegenwart von IL-12 zu einer Th1-Differenzierung und in Gegenwart von IL-4 zu
einer Th2-Differenzierung der T-Zellen. Wurden die so gewonnen Th2-Zellen mit
IL-12 restimuliert, so waren Th1-Zellen und Th0-Zellen nachweisbar. Bei den Th1Zellen bewirkten auch mehrfache Restimulationen mit IL-4 allerdings keine
Veränderung des Phänotyps hin zu Th2- oder Th0-Zellen. Lediglich der Anteil
IFN-γ bildender Zellen und die Menge an gebildetem IFN-γ ging durch die
70
Restimulationen zurück. Diese Ergebnisse unterscheiden sich damit vom murinen
Modell, wo Th2-Zellen stabil sind und Th1-Zellen zur Bildung von IL-4 angeregt
werden können.
Entscheidende Bedeutung für die Auslösung einer Th1-Antwort bei Th2differenzierten T-Zellen kommt offenbar auch der Interaktion zwischen T-Zellen
und dendritischen Zellen über den B7-Komplex zu. So konnte gezeigt werden,
dass Antikörper, die B7 und dendritische Zellen vernetzen, mehr als 10.000 mal
effektiver einen Wechsel des Phänotyps induzieren als die Stimulation der
dendritischen Zellen mit TLR-Agonisten wie CpG-oligodeoxynucleotid und
Gardiquimod (Radhakrishnan et al., 2007). Möglicherweise war daher die
Nachstimulation, die im Rahmen dieser Arbeit – passend zur primären Stimulation
mit dem TLR-Agonisten LPS und mit TSST – gewählt wurde, nicht adäquat, um
eine Umdifferenzierung der Th2-Zellen zu Th1-Zellen zu bewirken.
Aufgrund der geringen Unterschiede zwischen den nachstimulierten und den
nicht-nachstimulierten Zellen wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit auf
Nachstimulationen mit TSST und dendritischen Zellen verzichtet. Neuere Arbeiten
zeigen, dass mehrfache Restimulationen bei langen Kulturdauern von 21-28
Tagen und später gewählten Restimulationszeitpunkten den Anteil der Zytokinbildenden Zellen deutlich erhöhen (Rothoeft et al., 2007).
4.10 Effekte von Nachstimulationen mit PMA und Ionomycin
Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte in allen Versuchsansätzen bei einem Teil der
Zellkultur eine Restimulation mit PMA und Ionomycin. Wesentlicher Unterschied
zu den nicht nachstimulierten Zellkulturen war ein höherer Anteil IFN-γ bildender
Zellen. Diese waren an allen Tagen nachweisbar, insbesondere auch in der
späten Phase der Zellkultur nach dem fünften Tag. Im Gegenzug war der Anteil
IL-4 bildender Zellen nach Stimulation mit PMA und Ionomycin geringer als in der
entsprechenden Kultur ohne Nachstimulation.
Bei PMA handelt es sich um einen Phorbol-Ester, der zu einer Aktivierung der
Protein-Kinase C führt (Nishizuka, 1984). Ionomycin führt als Calcium-Ionophor
sowohl zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration als auch zu
einer
Aktivierung
der
Protein-Kinase
C
(Chatila
et
al.,
1989).
Beide
71
Wirkmechanismen haben mitogene Effekte auf Lymphozyten. Die Proliferation ist
aber abhängig von der Anwesenheit akzessorischer Zellen, beispielsweise
Monozyten (Hashimoto et al., 1991). In den Zellkulturen ohne dendritische Zellen
war daher in dieser Arbeit auch kein Effekt der Nachstimulation mit PMA und
Ionomycin nachweisbar.
Damit ähnelt die Stimulation mit PMA und Ionomycin den Vorgängen bei einer TZell-Aktivierung durch Antigen, die ebenfalls zu einer Protein-Kinase-C-Aktivierung
und zur Calcium-Freisetzung führt (Cantrell, 1996).
Während PMA über den Mechanismus der PKC-Aktivierung zu einer Th2-Antwort
führt, fördert Ionomycin über die Calcium-Freisetzung eine Th1-Antwort (Noble et
al., 2000). Dabei ist das Gleichgewicht zwischen PKC-Aktivität und Calcium-Signal
von Bedeutung für die Frage der T-Zell-Differenzierung. Hohe PMA- und niedrige
Ionomycin-Konzentrationen führen zu einer Th2-Antwort, während niedrige PMAund hohe Ionomycin-Konzentrationen zu einer Th1-Antwort führten. Verglichen mit
dieser Studie liegen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Konzentrationen
von PMA (10 mg / ml) und Ionomycin (1 µM, ~ 750 ng / ml) jeweils im höheren
Dosis-Bereich. Da im Rahmen dieser Arbeit ein deutlich verstärkender Effekt in
Richtung Th1-Differenzierung und eine Supprimierung der Th2-Differenzierung
nachgewiesen werden konnte, scheinen bei gleichzeitiger Anwendung hoher
Dosierungen von PMA und Ionomycin die Effekte des Ionomycins zu dominieren.
Ein wichtiges Ergebnis war die Tatsache, dass in den mit PMA und Ionomycin
stimulierten Kulturen auch nach Tag 5 IFN-γ-bildende Zellen nachweisbar waren,
während in den nicht stimulierten Kulturen fast ausschließlich IL-4 nachweisbar
war. Zudem führte die Stimulation mit PMA und Ionomycin zu einer Abnahme der
IL-4 bildenden Zellen. Dies lässt vermuten, dass PMA und Ionomycin in der Lage
waren, in den stimulierten Kulturen Th2-Zellen zur Bildung von IFN-γ anzuregen.
Entsprechende Ergebnisse ließen sich auch bei für das Hausstaubmilben-Antigen
Der p 1 spezifischen Th2-Zellen erzielen, die mit PMA und Ionomycin stimuliert
wurden, was darauf hinweist, dass auch in diesen Zellen das IFN-γ-Gen nicht
komplett abgeschaltet ist (Yssel et al., 1992). Auf die Möglichkeit eines Wechsels
des Phänotyps von Th2- zu Th1-Zellen wurde bereits im letzten Abschnitt
eingegangen.
72
4.11 Weitere Einflussfaktoren
Verschiedene Einflussfaktoren, die im Rahmen dieser Arbeit nicht näher
untersucht wurden, sind in dieser Diskussion schon kurz genannt worden. Eine
Weiterentwicklung des in dieser Arbeit vorgestellten Zellkultur-Systems sollte zum
Ziel haben, die offen gebliebenen Fragen zu klären. Dazu zählen insbesondere:
-
Der
Einfluss
der
Kostimulation
über
verschiedene
Signalwege,
z.B. CD28 / CD80 / CD86 und CD40 / CD40L
-
Der Einfluss verschiedener Arten von antigenpräsentierenden Zellen,
insbesondere verschiedener Arten von dendritischen Zellen. So konnten
kürzlich CD205-positive dendritische Zellen als Subtyp identifiziert werden,
der in der Lage ist, unabhängig von IL-12 über CD70 zu einer Th1Differenzierung zu führen (Soares et al., 2007).
Daneben gibt es noch zwei weitere offene Fragen, die für die Weiterentwicklung
des Zell-Kultursystems von Bedeutung sind. Zum einen sind bei der Frage nach
der Th-Zell-Differenzierung Unterschiede zwischen der Gen-Expression, der
intrazellulären Zytokinproduktion und der extrazellulären Sekretion von Zytokinen
beschrieben worden (Lagoo et al., 1994). Es sollte daher neben der intrazellulären
Zytokinbestimmung auch Methoden angewendet werden, mit denen die
Expression der jeweiligen Zytokin-Gene und die Menge an sezernierten Zytokinen
im Überstand bestimmt werden kann.
Daneben ist noch die Frage zu klären, ob bei den untersuchten T-Zellen auch
Zellen vorhanden sind, die sowohl IFN-γ als auch IL-4 produzieren. Entsprechende
Zellen sind bereits beschrieben worden (Openshaw et al., 1995). Eine
Identifikation
kann
mit
der
durchflußzytometrischen,
intrazellulären
Zytokinmessung auf sicherem und einfachem Weg erfolgen. Möglicherweise
handelt es sich bei den Zellen, die nach Aktivierung sowohl IFN-γ als auch IL-4
bilden können um NKT-Zellen und γ:δ-T-Zellen (Chen and Kung, 2007).
4.12 Perspektiven / Klinische Aspekte
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Zellkultursystem etabliert, das es ermöglicht,
Einflüsse
auf
die
T-Zell-Differenzierung
naiver
Nabelschnur-T-Zellen
zu
73
untersuchen. Bisherige Arbeiten zu diesem Thema beruhten überwiegend auf in
vitro und in vivo Mausmodellen. Das hier vorgestellte humane in vivo
Zellkultursystem schließt daher eine Lücke, um langfristig eine Übertragbarkeit der
Ergebnisse von Mausmodellen auf den Menschen zu überprüfen und eventuelle
humane in vivo-Studien zu ermöglichen.
Wesentliche Merkmale dieses Systems sind die Verwendung autologer Zellen
sowie der weitgehende Verzicht auf unphysiologische externe Stimuli wie z.B.
exogen zugeführte Zytokine oder Antikörper. Durch die Verwendung des
Superantigens TSST gelang es, den physiologischen Weg der T-Zell-Aktivierung
über den MHC-TCR-Kontakt zwischen antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle
zu nutzen. Die Folge ist eine Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen, die durch die
Bildung ihrer charakteristischen Zytokine identifiziert werden können. Durch die
unterschiedliche Aktivierung von Vβ2-positiven und Vβ2-negativen Zellen ist es
möglich, die durch TSST aktivierten Vβ2-positiven Zellen und die nicht aktivierten
Vβ2-negativen Zellen in einer Probe parallel zu untersuchen. Diese nicht
aktivierten Zellen können dann jeweils als Kontrollgruppe für jede Messung
dienen, allerdings unter Berücksichtigung und Minimierung des bereits diskutierten
Bystander-Effektes, der auch zur Aktivierung Vβ2 negativer Zellen führen kann.
Die stabile IFN-γ- bzw. IL-4-Produktion in Abhängigkeit von Stimuli und Kinetik
ermöglicht die Untersuchung verschiedener neuer Einflussfaktoren, auch aus dem
klinischen Bereich. So wäre zum Beispiel die Untersuchung von Kindern mit einer
atopischen Disposition interessant. Für Neugeborene mit dem erhöhten Risiko
einer atopischen Erkrankung konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit zur IFN-γProduktion
auf
Stimulation
mit
bakteriellen
Produkten
wie
LPS
oder
Superantigenen vermindert ist (Pohl et al., 1997). Andererseits gibt es Hinweise
darauf, dass eine Endotoxin-Exposition vor der Entwicklung einer Atopie schützen
kann (von Mutius et al., 2000). Ein wichtiger Krankheitserreger, der eine
Veränderung der Th-Differenzierung bewirken kann, ist das RS-Virus. Reduzierte
IFN-γ-Produktion und vermehrte Th2-Antworten nach RS-Virus-Infektionen sind
beschrieben (Schauer et al., 2004), ein Effekt, der vermutlich mit einer
veränderten Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen
zusammenhängt (de Graaff et al., 2005). Hier bietet das im Rahmen dieser Arbeit
entwickelte Zellkultur-System Möglichkeiten der genaueren Untersuchung der
Zusammenhänge.
74
5 Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollten in einem humanen, autologen Zellkultursystem die
Faktoren untersucht werden, welche die Differenzierung von naiven T-Zellen in
Th1- oder Th2-Zellen beeinflussen. Die Differenzierung in Th1- bzw. Th2-Zellen
wurde dabei anhand der durchflußzytometrischen Messung der intrazellulären
Zytokinproduktion der charakteristischen Zytokine IFN-γ bzw. IL-4 beurteilt.
Folgende Einflussfaktoren auf die T-Zell-Differenzierung wurden untersucht: die
Notwendigkeit von exogenen Stimuli, die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von
dendritischen Zellen, der Einfluss des Endotoxins LPS als Stimulus, das Ausmaß
der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors durch Stimulation mit verschiedenen
Konzentrationen des Superantigens TSST, die Abhängigkeit von der Dauer der
Zellkultur sowie der Einfluss von Restimulationen mit TSST und dendritischen
Zellen bzw. mit PMA und Ionomycin.
Im Gegensatz zu allogenen Zellkultursystemen erwiesen sich in der autologen
Zellkultur die Zellen als nicht überlebensfähig. Durch Zusatz der Zytokine IL-2 oder
IL-7 zu den Zellkulturen konnte das Überleben der Zellen verbessert werden.
Unter dieser Stimulation zeigten die Zellen eine Th2-Differenzierung.
Als wesentliche Einflussfaktoren für die Generierung von Th1-Zellen konnten die
Stimulation mit LPS und eine starke Stimulation über den T-Zell-Rezeptor mit
TSST identifiziert werden. Der zeitliche Ablauf der T-Zell-Differenzierung hat einen
charakteristischen Verlauf, mit einem Maximum der Th1-differenzierten Zellen an
Tag 3 der Kultur und einem Maximum der Th2-differenzierten Zellen an Tag 7 der
Kultur. Restimulationen mit TSST und dendritischen Zellen hatten nur einen
geringen Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung. Durch Stimulation mit PMA und
Ionomycin konnte ein hoher Anteil Th1-differenzierter Zellen erzeugt werden,
unabhängig von der Dauer der Kultur.
Wesentliche Merkmale des im Rahmen dieser Arbeit etablierten Zellkultursystems
sind die Verwendung autologer Zellen und der weitgehende Verzicht auf exogene
Stimuli. Durch die Möglichkeit in Abhängigkeit von Stimuli und Kinetik Th1- und
Th2-differenzierte T-Zellen zu erzeugen, ergeben sich Möglichkeiten zur
Untersuchung pathogener Einflüsse auf die T-Zell-Differenzierung in diesem
Modell.
75
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Abbildungsnachweis
Abbildung 1: Aufbau und schematischer Strahlengang im FACScanDurchlußzytometer:
http://www.facslab.toxikologie.uni-mainz.de/zytometrie.jsp (Zugriff am 01.03.2008)
91
7 Danksagung
Herrn Prof. Schauer danke ich für die Überlassung des Themas dieser Arbeit und
für die geduldige Betreuung über einen langen Zeitraum.
Herrn Dr. med. Holger Bartz danke ich für zahlreiche interessante Diskussionen
und Anregungen während des praktischen Teils dieser Arbeit.
Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel vom Immunologischen Labor
danke ich für die Einarbeitung in die labortechnischen Arbeitsmethoden und
Hilfestellung zu jedem Zeitpunkt.
Meiner Ehefrau Silke Bongartz danke ich für Ermunterung und jede erdenkliche
Unterstützung während dieser Arbeit sowie für die kritische Durchsicht des
Manuskripts.
Meinen Eltern, Angelika Gonschorek und Helmut Gonschorek, danke ich für die
Ermöglichung des Medizin-Studiums und ihre Unterstützung in dieser Zeit.
8 Lebenslauf
Andreas Bongartz, geb. Gonschorek,
geboren am 22.11.1975 in Düsseldorf,
verheiratet, eine Tochter,
römisch-katholischen Bekenntnisses
Sohn von Helmut Gonschorek und Angelika Gonschorek, geb. Jansen
1995
Abitur
1997
Ärztliche Vorprüfung,
Ruhr-Universität Bochum
1998
1. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
2001
2. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
2001 – 2002
Praktisches Jahr am Sana-Klinikum Remscheid,
Wahlfach Anästhesie
Mai 2002
3. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
Juni 2002 -
Arzt im Praktikum und Assistenzarzt, Klinik für
Mai 2005
Anästhesiologie, postoperative Intensivmedizin und
Schmerztherapie (Chefarzt Dr. H. Thole), Grafschafter
Klinikum, Nordhorn
Februar 2005
Zusatzbezeichnung „Rettungsmedizin“
Seit Juni 2005
Leiter der Abteilung Medizincontrolling und Zentrale
Patientenaufnahme, Grafschafter Klinikum, Nordhorn
Seit Oktober 2007
Mitglied der Gruppe Leitender Notärzte im Landkreis
Grafschaft Bentheim