CCL18 als Induktor der
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung für Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau CCL18 als Induktor der „Epithelial to Mesenchymal Transition“ im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2013 von Ben Scholtes geboren in Stadt Luxemburg Dekan: 1. Gutachter: 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum Prof. Dr. rer. nat. Gernot Zissel Prof. Dr. med. Thomas Brabletz Jahr der Promotion: 2013 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen ............................................................................................................... i Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... iii Tabellenverzeichnis ...............................................................................................iv 1. Zusammenfassung ............................................................................................... 1 2. Einleitung................................................................................................................ 2 2.1 Das Karzinom der Lunge .................................................................................................. 2 2.1.1 Epidemiologie ....................................................................................................................... 2 2.1.2 Risikofaktoren....................................................................................................................... 3 2.1.3 Pathomorphologie ............................................................................................................... 4 2.1.4 Symptome, Diagnostik und Therapie........................................................................... 5 2.2 Epithelial to Mesenchymal Transition ......................................................................... 7 2.2.1 Rolle der EMT bei der Tumorprogression und Metastasierung........................ 7 2.2.2 Marker der Epithelial to Mesenchymal Transition................................................. 9 2.2.3 Induktoren der Epithelial to Mesenchymal Transition ..................................... 12 2.3 Tumormilieu und CC Chemokin Ligand 18 .............................................................. 13 2.3.1 Rolle des Tumormilieus bei der Tumorprogression ........................................... 13 2.3.2 CCL18: Vorkommen, Eigenschaften, Funktionen, Rezeptoren ....................... 14 3. Fragestellung ...................................................................................................... 18 4. Material ................................................................................................................ 19 4.1 Geräte und Software ....................................................................................................... 19 4.2 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................. 20 4.3 Chemikalien, Biochemikalien, Medien und Stimulanzien ................................... 21 4.4 Antikörper und Primer .................................................................................................. 22 5. Methoden ............................................................................................................. 23 5.1 Zellkultivierung ................................................................................................................ 23 5.2 Stimulation ........................................................................................................................ 23 5.3 Realtime-Polymerase-Kettenreaktion ...................................................................... 24 5.3.1 RNA Isolation ..................................................................................................................... 24 5.3.2 Reverse Transkription .................................................................................................... 24 5.3.3 Realtime Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) .................................................... 25 5.3.4 Relative Quantifizierung der rt-PCR.......................................................................... 27 5.4 Western Blot ...................................................................................................................... 28 5.4.1 Extraktion von Proteinen aus Zellen ......................................................................... 28 5.4.2 SDS-PAGE ............................................................................................................................. 29 5.4.3 Western Blot ....................................................................................................................... 31 5.4.4 Auswertung ......................................................................................................................... 33 5.5 Chemotaxis in Boyden Chamber .................................................................................. 34 5.6 Cell Invasion Assay .......................................................................................................... 35 5.7 Scratch Assay .................................................................................................................... 35 5.8 Zytotoxizitäts-Test ........................................................................................................... 36 5.9 BRDU-Proliferationstest ................................................................................................ 37 5.10 Statistische Auswertung ............................................................................................. 39 6. Ergebnisse ........................................................................................................... 40 6.1 Morphologische Veränderung der A549-Zellen unter Stimulation ................. 40 6.2 Expression der EMT-Marker E-Cadherin, snail1 und S100A4 ............................ 42 6.2.1 E-Cadherin ........................................................................................................................... 42 6.2.2 snail1 ..................................................................................................................................... 44 6.2.3 S100A4 .................................................................................................................................. 45 6.3 Chemotaktische Wirkung von CCL18 auf A549-Zellen ......................................... 48 6.4 Migrations- und Invasionseigenschaften ................................................................. 50 6.5 Chemoresistenz gegenüber Cisplatin ....................................................................... 52 6.6 Proliferation unter Stimulation .................................................................................. 53 6.7 Rezeptorstatus der A549-Zellen: GPR30, CCR6 und PITPNM3 ........................... 54 7. Diskussion ........................................................................................................... 55 7.1 Einführung ......................................................................................................................... 55 7.2 CCL18 als Induktor der „epithelial to mesenchymal transition“ ..................... 56 7.2.1 Expressionsanalyse von E-Cadherin, snail1 und S100A4 ................................. 57 7.2.2 Einfluss von CCL18 auf das Migrations- und Invasions-Verhalten .............. 60 7.2.3 Chemosensibilität unter CCL18-Stimulation ......................................................... 64 7.3 CCL18-Rezeptoren und Tumorprogression ............................................................. 66 7.4 Ausblick ............................................................................................................................... 69 7.5 Fazit ..................................................................................................................................... 72 8. Literaturverzeichnis ........................................................................................ 73 9. Danksagung......................................................................................................... 89 10. Publikationen .................................................................................................. 90 Abkürzungen Abkürzungen APS Ammoniumperoxidisulfat αSMA α smooth muscle actin BAC Bronchoalveoläres Karzinom BAL Bronchoalveoläre Lavage BMP Bone Morphogenic Proteins BRDU Bromdesoxyuridin BSA Bovines Serumalbumin CAF carcinoma associated fibroblasts CCL18 CC motif chemokine ligand 18 CCR6 CC Chemokin Rezeptor Typ 6 CXCR4 CXC Chemokin Rezeptor Typ 4 COPD chronic obstructive pulmonary disease CT Computertomographie DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline EBUS Endobronchial Ultraschall EDTA Ethylendiamintetraessigsäure; Ethylendiamintetraacetat EGTA Ethylenglykol-bis(aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure EGFR epithelial growth factor receptor ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EMT epithelial to mesenchymal transition EndMT endothelial to mesenchymal transition ER Östrogenrezeptor ERCC1 excision repair cross-complementing protein 1 ERK extracellular-regulated kinases FCS fetal calf serum, fetales Kälberserum FDG Fluordesoxyglucose FGF Fibroblast Growth Factor GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase i Abkürzungen GFP green fluorescent protein GPR30 G-Protein gekoppelter Rezeptor 30, GPER HCl Hydrogenchlorid IFN Interferon IL Interleukin IPF idiopathic pulmonary fibrosis MMPs Matrix-Metalloproteinasen MET mesenchymal to epithelial transition MRT Magnetresonanztomographie MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid NSCLC Non-small cell lung cancer PBS phosphate buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion PET Positronen-Emissions-Tomographie POD Peroxidase PVDF Polyvinylidenfluorid RCF relative centrifugation force RNA Ribonukleinsäure rt-PCR Realtime Polymerase-Kettenreaktion S100A4 S100 calcium binding protein A4 SCLC Small cell lung cancer SD standart deviation, Standartabweichung SDS Natriumlaurylsulfat, Natriumdodecylsulfat SERM Selektiver Estrogenrezeptormodulator siRNA small interfering TAM Tumor-assoziierte Makrophagen TBNA transbronchiale Nadelaspiration TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine TGF-β1 Transforming growth factor β1 TMB 3,3’,5,5’–Tetramethylbenzidin UICC union internationale contre le cancer VEGF vascular endothelial growth factor ii Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 EMT bei der Tumorprogression .................................................................... 8 Abbildung 2 Induktoren und Funktionen von snail ...................................................... 12 Abbildung 3 Zellmorphologie nach 72 h Stimulation .................................................. 41 Abbildung 4 E-Cadherin-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR............... 42 Abbildung 5 E-Cadherin-Expression im Western Blot ................................................. 43 Abbildung 6 snail1-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR ........................ 44 Abbildung 7 snail1-Expression im Western Blot ........................................................... 45 Abbildung 8 S100A4-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR...................... 46 Abbildung 9 S100A4-Expression im Western Blot ........................................................ 47 Abbildung 10 Zellen pro Gesichtsfeld nach 24 h Migration ......................................... 48 Abbildung 11 Zellmigration in der Boyden Chamber nach 24 h ................................. 49 Abbildung 12 Beobachtung der Zellmigration im Scratch Assay über 24 h ........... 50 Abbildung 13 Cell Invasion Assay nach 24 h ..................................................................... 51 Abbildung 14 Zytotoxizitätstest, Cisplatin Behandlung für 72 h ................................ 52 Abbildung 15 BRDU-Proliferationstest nach 24 h Stimulation ................................... 53 Abbildung 16 Rezeptorstatus der A549-Zellen ................................................................ 54 iii Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1 In vitro Kriterien für EMT ................................................................................... 9 Tabelle 2 Reaktionsansatz für cDNA-Synthese ............................................................ 25 Tabelle 3 Primer für rt-PCR ............................................................................................... 26 Tabelle 4 Reaktionsansatz rt-PCR ................................................................................... 27 Tabelle 5 Lysepuffer für Proteinextraktion .................................................................. 28 Tabelle 6 Gele für Gelelektrophorese .............................................................................. 30 Tabelle 7 Lämmli-Ladepuffer ............................................................................................ 30 Tabelle 8 SDS-Ladepuffer ................................................................................................... 31 Tabelle 9 Blotting-Puffer .................................................................................................... 31 Tabelle 10 TBS-Waschpuffer ................................................................................................ 32 Tabelle 11 Antikörper für Western Blot ........................................................................... 33 Tabelle 12 MTT Solvent.......................................................................................................... 37 Tabelle 13 BRDU-Stammlösung .......................................................................................... 38 iv 1. Zusammenfassung 1. Zusammenfassung Das Lungenkarzinom ist eine der weltweit am häufigsten vorkommenden Krebsarten und verantwortlich für die meisten krebsassoziierten Todesfälle bei Männern (Jemal et al., 2011). Zu knapp einem Drittel haben Lungenkarzinome bereits bei der Diagnosestellung Metastasen gebildet (Yang et al., 2005). Ein entscheidender Prozess bei der Bildung von Metastasen ist die sogenannte epithelial to mesenchymal transition, kurz EMT. Hierbei handelt es sich um eine Metaplasie, bei der epitheliale Zellen einen mesenchymalen Zellphänotyp annehmen. Sie erlangen unter anderem die Eigenschaft zu migrieren, invasiv zu wachsen und Proteine der extrazellulären Matrix zu produzieren (Thiery, 2002; Kalluri und Weinberg, 2009). Der CC Chemokin Ligand 18 (CCL18), der unter anderem von alternativ aktivierten Makrophagen gebildet wird (Schutyser et al., 2002; MüllerQuernheim et al., 2012), konnte in erhöhten Serumkonzentrationen bei der idiopathischen Lungenfibrose (Prasse et al., 2007) nachgewiesen werden. Auch bei nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen wurde eine erhöhte CCL18-Konzentration nachgewiesen. Diese war abhängig vom Tumorstadium und korrelierte beim Adenokarzinom negativ mit der Überlebensrate (Plönes et al., 2012). In dieser Arbeit wurde am Beispiel der Zelllinie A549 untersucht, inwiefern CCL18 eine EMT bei Adenokarzinomzellen der Lunge induzieren kann. Als Vergleich diente eine Zellstimulation mit dem bekannten EMTInduktor TGF-β1 (Kasai et al., 2005; Kim et al., 2007; Song, 2007). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCL18 ein potenter EMTInduktor bei Tumorzellen ist. Durch die Stimulation mit CCL18 veränderte sich die Zellmorphologie zu einem spindelförmigen, fibroblasten-ähnlichen Phänotyp. Daneben wurde die Expression des epithelialen Markers E-Cadherin herunterreguliert und die von S100A4 und snail1 hochreguliert. CCL18 wirkte chemotaktisch auf die A549-Zellen und erhöhte die Invasivität, sowie die Chemoresistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum Cisplatin. Insgesamt wirkte CCL18 ebenso stark EMT-induzierend wie TGF-β1. Die Proliferationsrate der Tumorzellen sank unter CCL18-Einfluss konzentrationsabhängig und die CCL18-Rezeptoren CCR6 und GPR30 konnten nachgewiesen werden. EMT-Induktoren, zu denen CCL18, basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit, zu zählen ist, und deren funktionelle Rezeptoren könnten Zielstrukturen zukünftiger Therapeutika werden. Eine solche Therapie könnte womöglich die Bildung von Metastasen verhindern und Tumore sensibler gegenüber Chemotherapeutika machen. 1 2. Einleitung 2. Einleitung Bösartige Tumorerkrankungen stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. Aus diesem Grund wird intensiv an onkologischen Erkrankungen geforscht, um die Entstehung und das Wachstumsverhalten von Malignomen besser zu verstehen. Nur durch ein größeres Verständnis der molekularen Mechanismen, die an der Entstehung, dem Wachstum und der Metastasierung von Malignomen beteiligt sind, können gezielte Therapien zur Behandlung dieser Erkrankungen entwickelt werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss vom CC Chemokin Ligand 18 (CCL18) auf die Tumorprogression von Adenokarzinomzellen der Lunge untersucht. Dabei wurde analysiert ob CCL18 eine sogenannte epthelial to mesenchymal transition (EMT) bei Zellen der Linie A549 induzieren kann. 2.1 Das Karzinom der Lunge 2.1.1 Epidemiologie Das Lungenkarzinom ist die häufigste Krebsart bei Männern und eine der häufigsten krebsassoziierten Todesursachen weltweit. Im Jahr 2008 war das Lungenkarzinom für 13% (1,6 Millionen) der neu diagnostizierten Krebsfälle und für 18% (1,4 Millionen) der krebsassoziierten Todesfälle verantwortlich (Jemal et al., 2011). In Deutschland lag die altersstandardisierte Neuerkrankungsrate bei 84 Erkrankungsfällen je 100.000 Einwohner. Dies entspricht etwa 14% aller bösartigen Neubildungen bei Männern und etwa 7% bei Frauen. Damit ist das Lungenkarzinom in Deutschland die dritthäufigste Tumorerkrankung bei beiden Geschlechtern. Das mittlere Erkrankungsalter lag bei 69 Jahren (Husmann et al., 2010). Die zeitliche Entwicklung der Inzidenz und der Mortalität zeigt gegenläufige Tendenzen für Mann und Frau. Bei den Männern erreichte die Inzidenz Ende der 1980er Jahre ihr Maximum und sank auf 60/100.000 im Jahr 2006, die Sterberate lag bei etwa 54/100.000. Dahingegen lag die Neuerkrankungsrate bei Frauen bei rund 24/100.000 Einwohner und die Mortalität bei 18/100.000, was einen Anstieg der Inzidenz um 200% und der Mortalität um über 100% in den letzten 30 2 2. Einleitung Jahren bedeutet (Husmann et al., 2010). Dieser Trend wird vor allem auf das sich verändernde Konsumverhalten von Tabak zurückgeführt (Youlden et al., 2008). Trotz moderner Diagnostik und therapeutischer Fortschritte liegt die 5-Jahres-Überlebensrate nur bei 10% bis 20% und ist bei Frauen höher als bei Männern (Cerfolio et al., 2006; Alberg et al., 2007; Verdecchia et al., 2007; Youlden et al., 2008). 2.1.2 Risikofaktoren Der wichtigste Risikofaktor bei der Entstehung eines Lungenkarzinoms ist das inhalative Zigarettenrauchen. Weltweit sind 80% der Lungenkrebsfälle bei Männern und mindestens 50% der Fälle bei Frauen auf das Rauchen zurückzuführen (Jemal et al., 2011). Das Risiko für Raucher an einem Lungenkarzinom zu erkranken ist 24-fach höher als für Nicht-Raucher. Für Ex-Raucher ist es etwa 7,5-fach erhöht. Das Risiko hängt entscheidend davon ab, wie viel geraucht wurde und wann damit begonnen wurde (Simonato et al., 2001). Auch Passivrauchen erhöht das Lungenkarzinomrisiko um bis zu 24% (Brennan et al., 2004). Bemerkenswert ist, dass in den USA etwa 10% der Patienten mit Lungenkarzinom Nichtraucher sind, während der Nichtraucheranteil der Lungenkrebserkrankten in Asien etwa 30% und bei den asiatischen Frauen sogar rund 50% beträgt (Kawaguchi et al., 2010). Ein weiterer Risikofaktor ist Radon, ein radioaktives Erdgas. Radonexposition erhöht das Lungenkrebsrisiko um etwa 16% pro 100 Bq/m3. Rauchen und Radon sind additiv in ihrer Wirkung (Darby et al., 2005). Eine Assoziation gibt es auch mit der Ernährung, der allgemeinen Luftverschmutzung und Feinstaubbelastung, sowie meist beruflicher Exposition durch Asbest oder Nickel. Auch eine Tuberkuloseerkrankung und chronische Lungenerkrankungen sind Risikofaktoren (Goeckenjan et al., 2010). Neben Umwelteinflüssen spielen endogene Faktoren bei der Entstehung des Lungenkarzinoms eine entscheidende Rolle. Eine Vielzahl an tumorassoziierten Genen ist bekannt, darunter Onkogene wie K-ras und Tumorsuppressorgene wie TP53. Polymorphismen in DNA-Reparaturmechanismen, bei der Metabolisierung oder Entzündungsreaktionen tragen ebenfalls zu der Tumorentstehung bei und können helfen, die Pathogenese des Lungenkarzinoms zu erklären (Lam, 2005; Greulich, 2010). 3 2. Einleitung 2.1.3 Pathomorphologie Histologisch werden die Lungenkarzinome in zwei große Subgruppen eingeteilt. Unterschieden werden die kleinzelligen Karzinome (small cell lung carcinoma, SCLC) und die nicht-kleinzelligen Karzinome (non-small cell lung carcinoma, NSCLC). Daneben gibt es noch seltene Typen wie das Adenosquamöse Karzinom, Karzinoidtumore oder Bronchialdrüsenkarzinome, die zusammen weniger als 1% der Bronchialkarzinome ausmachen (Travis et al., 2004). Etwa 20% aller Lungenkarzinome sind kleinzellige Bronchialkarzinome (SCLC). Sie sind stark mit dem Zigarettenrauchen assoziiert, stellen die aggressivste Form des Lungenkarzinoms dar, sind meistens bereits bei Diagnosestellung metastasiert und haben mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 7% die schlechteste Prognose (Jackman und Johnson, 2005). Die nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC) machen knapp 80% der Lungenkarzinome aus und haben eine Gesamt-5-Jahres-Überlebensrate von etwa 17% (Youlden et al., 2008). NSCLC metastasieren lymphogen und hämatogen vor allem in perihiläre Lymphknoten und in die Pleura, sowie in das Gehirn und die Knochen (Huber 2009). Es gibt hauptsächlich drei NSCLC-Typen: das Plattenepithelkarzinom, das Adenokarzinom und das großzellige Karzinom. Das großzellige Karzinom macht 9% aller Lungenkarzinome aus. Es wächst typischerweise peripher und ist histologisch oft gering differenziert. Das durchschnittliche Erkrankungsalter beträgt 60 Jahre. Dagegen treten Plattenepithelkarzinome vor allem bei männlichen Rauchern auf und tendieren dazu, zentral in den Haupt- und Segmentbronchien zu wachsen. Je nach Land gehören 30 bis 50% der Lungenkarzinome zu diesem Typ (Youlden et al., 2008, Travis et al., 2004). Die dritte Form des NSCLC ist das Adenokarzinom, das häufigste Lungenkarzinom. Seine Häufigkeit variiert zwischen 30 und 70% aller Bronchialkarzinome (Youlden et al., 2008). Es wächst vorrangig in den peripheren Abschnitten der Lunge. Histologisch werden verschiedene Subtypen unterschieden, wobei zu 80% ein gemischter Typ vorliegt. 4 2. Einleitung Das bronchioalveoläre Karzinom stellt eine Sonderform der Adenokarzinome dar, da es nicht invasiv wächst (Travis et al., 2004; Huber 2009). Zwar kommt das NSCLC am häufigsten bei Rauchern vor, jedoch ist das Adenokarzinom weltweit das häufigste Lungenkarzinom bei Nichtrauchern. In den USA kommen 10% der NSCLC bei Patienten vor, die nie geraucht haben (Subramanian und Govindan, 2007). Bei diesen Neversmokern sind gehäuft Mutationen im EGFR und anderen tumorassoziierten Genen zu finden (Sun et al., 2010). 2.1.4 Symptome, Diagnostik und Therapie Die klinischen Symptome für ein Lungenkarzinom sind meist unspezifisch und treten deshalb oft erst in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung auf. Am häufigsten sind persistierender Husten, Dyspnoe, Brustschmerzen und Hämoptysen. Allgemeine Symptome, wie Gewichtsverlust, Fieber und Nachtschweiß können ebenfalls auftreten. Daneben können Manifestationen wie eine obere Einflussstauung (Vena-cava-superiorSyndrom), Dysphagie, das Horner-Syndrom oder die Läsion des Plexus brachialis die ersten Anzeichen für ein malignes Geschehen sein. Bei etwa einem Drittel der Patienten sind durch extrathorakale Metastasen verursachte Symptome, beispielsweise pathologische Frakturen bei Knochenmetastasen, vorhanden (Goeckenjan et al., 2010). Neben der Diagnosesicherung, mit der Feststellung des histologischen Typs, kommt dem Staging, also der Bestimmung des Ausbreitungsgrads des Tumors, eine entscheidende Rolle zugute. Das Tumorstadium bestimmt die Therapie und ist entscheidend für die Prognose des Patienten. Zur Stadieneinteilung von Lungenkarzinomen wird die von der UICC (union internationale contre le cancer) festgelegte TNM-Klassifikation benutzt. Das klinische T-Stadium, das die Größe und Ausdehnung des Primärtumors beschreibt, wird durch die Staginguntersuchungen festgelegt. Das N-Stadium steht für die Tumorstreuung in regionale Lymphknoten. Tumorverdächtige mediastinale Lymphknoten werden durch die Größenbestimmung im CT im Zusammenspiel mit einer FDG-PETUntersuchung identifiziert. Die Biopsie verdächtiger Lymphknoten kann in einer Ultraschall-gestützten Bronchoskopie mit transbronchialer Nadelaspiration, der EBUS-TBNA, oder einer Mediastinoskopie erfolgen. Das M-Stadium beschreibt das Vorhandensein von Fernmetastasen. Diese können zum Beispiel in einem Ganzkörper FDG-PET nach5 2. Einleitung gewiesen werden. Hirnmetastasen können mit einem MRT des Schädels diagnostiziert werden. Als Alternative zur FDG-PET kommen eine Knochenszintigrafie und eine Abdomen-Sonographie zum Einsatz um das Staging zu vervollständigen (Goeckenjan et al., 2010). Bei nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen richtet sich die Therapie nach dem Tumorstadium. Die von der UICC definierten Stadien basieren auf der TNM-Klassifikation und reichen von lokalisierten Tumoren ohne Lymphknotenmetastasen (T1-2 N0 M0) im Stadium I, über Tumore mit Lymphknotenmetastasierung (N1-3) im Stadium II und III bis hin zu einem fortgeschrittenen Tumor mit Fernmetastasen (M1) im Stadium IV (Huber 2009). In den Stadien I und II wird immer eine radikale Operation des Tumors angestrebt. Voraussetzung für die operative Therapie ist, dass der Patient die Kriterien der allgemeinen Operabilität erfüllt und die funktionellen Reserven der Lunge ausreichend sind. Bei der Therapie von Tumoren im Stadium III wird ebenfalls eine Operation angestrebt. Meist wird in diesem fortgeschrittenen Stadium ein multimodales Konzept bestehend aus Chemotherapie, Strahlentherapie und chirurgischer Therapie erstellt. Aufgrund eingeschränkter Lungenfunktion oder reduziertem Allgemeinzustand kann bei funktionell inoperablen Patienten eine kombinierte Cisplatin-haltige Radiochemotherapie des Tumors erfolgen. Insgesamt ist das Stadium III heterogen und eine Therapieentscheidung sollte interdisziplinär getroffen werden. Im Stadium IV erfolgt meist eine palliative Chemotherapie (Crinò et al., 2010; D’Addario et al., 2010; Goeckenjan et al., 2010). Zu den neuesten Entwicklungen in der Therapie von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen zählt die targeted therapy, mit zielgerichteten Medikamenten gegen beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) oder den vascular endothelial growth factor (VEGF). Die mit dieser targeted therapy erzielten Therapieerfolge sind vielversprechend und zeigen, dass in Zukunft die Behandlung von Tumorerkrankungen gezielter und individueller an den einzelnen Patienten angepasst werden kann und so die Überlebensraten weiter steigen werden. 6 2. Einleitung 2.2 Epithelial to Mesenchymal Transition Die epthelial to mesenchymal transition (EMT), die erstmalig 1995 von Elizabeth D. Hay beschrieben wurde, ist ein biologischer Prozess, bei dem polare epitheliale Zellen multiple zellbiologische und biochemische Veränderungen erfahren und so einen mesenchymalen Zellphänotyp erlangen (Hay, 1995). Die EMT führt somit zu einer Metaplasie von Epithel- zu Mesenchymzellen. Die Epithelzellen können ihren ursprünglichen Zellverbund verlassen und verlieren den Kontakt mit der Basalmembran. Sie erlangen unter anderem die Eigenschaft zu migrieren und invasiv zu wachsen, sind resistenter gegen Apoptose und produzieren Proteine der extrazellulären Matrix. Dieser Umwandlungsprozess ist im Prinzip reversibel. Der gegensätzliche Mechanismus, bei dem Mesenchymzellen einen epithelialen Phänotyp annehmen, wird folglich als mesenchymal to epithelial transition (MET) bezeichnet (Kalluri und Weinberg, 2009). 2.2.1 Rolle der EMT bei der Tumorprogression und Metastasierung Die Bedeutung der EMT für die Tumorprogression und die Metastasierung ist nicht endgültig geklärt. Vor allem in vitro wurde, durch die Expressionsanalyse von diversen EMT-Markern, das Phänomen der EMT an Tumorzellen untersucht. Epiteliale Marker wie das Zelladhäsionsprotein E-Cadherin werden runterreguliert, während mesenchymale Zellmarker wie N-Cadherin, Vimentin oder S100A4 und Transkriptionsfaktoren wie snail1 hochreguliert werden (Thiery et al., 2009). Doch auch in vivo gibt es Hinweise für den Einfluss von EMT auf Prozesse der Metastasierung. Die Beschreibung von kleinen Tumorzellaggregaten, die aus kolorektalen Karzinomen in das angrenzende Gewebe hineinwachsen, das sogenannte tumor budding, stellen das histomorphologische Korrelat für EMT beim Tumorwachstum dar (Prall, 2007). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sich an der Wachstumsfront von kolorektalen Adenokarzinomen entdifferenzierte, migratorische Zellen aus dem Zellverbund lösen und invasiv wachsen. Diese Zellen haben ihre apiko-basale Polarität verloren und tragen nicht mehr das wichtige Zelladhäsionsprotein E-Cadherin in der Zellmembran. Diese Phänotypänderung kommt einer EMT gleich (Brabletz et al., 2001). Demnach scheint belegt zu sein, dass EMT bei der Invasion von Tumorzellen in das gesunde Gewebe und bei der Intravasation in Lymphund Blutgefäße einen entscheidenden Prozess darstellt (Abbildung 1). 7 2. Einleitung Normales Epithel Dysplasie Carcinoma in situ Basalmembran Extravasation Intravasation Lymph/Blutgefäß Invasives Karzinom EMT EMT Metastasenbildung modifiziert nach Thiery, J. P. (2002) Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat. Rev. Cancer 2, 442–454 Abbildung 1 EMT bei der Tumorprogression Neben der EMT-abhängigen gibt es auch Evidenz für eine EMT-unabhängige Tumorinvasion. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere in Plattenepithelkarzinomen, jedoch auch in Mammakarzinomen, in Zellen der Tumorfront das Muzin-ähnliche Protein Podoplanin hochreguliert wird und zu einer erhöhten Zellmotilität führt, ohne, dass gleichzeitig E-Cadherin vermindert exprimiert wird (Wicki et al., 2006). Neben den Mechanismen, die in den Tumorzellen ablaufen, ist auch das Tumormilieu mit den tumorassoziierten Zellen, insbesondere den Fibroblasten (Kalluri und Zeisberg, 2006), ein entscheidender Faktor bei der Tumorprogression und Metastasierung. Die zentrale Bedeutung von EMT bei der Tumorprogression, wird deutlich unter der Betrachtung weiterer Tumoreigenschaften die durch EMT induziert werden. EMT trägt dazu bei, dass Tumorzellen der Immunabwehr entkommen, indem eine Toleranz gegenüber den neoplastischen Zellen induziert wird. Durch EMT werden Tumorzellen resistenter gegen Apoptose-Mechanismen und gegenüber Chemotherapeutika. EMT ist ein Zeichen für ein fortgeschrittenes Tumorstadium und ist an der Neoangiogenese im Tumor beteiligt (Thiery et al., 2009). 8 2. Einleitung 2.2.2 Marker der Epithelial to Mesenchymal Transition Feste Kriterien zur Identifizierung von Zellen, die eine EMT vollzogen haben, sind schwer zu definieren, da eine epthelial to mesenchymal transition einen dynamischen Prozess beschreibt, der mit multiplen molekularen Mechanismen und diversen Einflussfaktoren einhergeht. Zudem handelt es sich um einen zeitabhängigen Prozess, in dessen Verlauf die unterschiedlichen Marker verschieden exprimiert werden. Daher kann eine EMT nicht anhand eines einzelnen Markers belegt werden, sondern es müssen mindestens drei EMT-Marker untersucht werden. In dieser Arbeit wurden die in Tabelle 1 dargestellten Kriterien angewendet (Zeisberg und Neilson, 2009). In vitro EMT-Kriterien - Spindelförmige Zellmorphologie mit Neuordnung von Stressfasern und Verlust der Polarität Neuexpression von S100A4 und eventuell DDR2 Erhöhte Expression von HSP47, Kollagen Typ I und II oder Vimentin Cadherin switch (Ersatz von E-Cadherin durch N-Cadherin) Neuexpression der Transkriptionsfaktoren: snail1, slug oder Twist Fehlen von epithelialen Markern oder Verlust von Zytokeratin oder ZO-1 Resistenz gegenüber Apoptosestimuli gesteigertes Migrationspotential stabiler Phänotyp ohne den induzierenden Stimulus modifiziert nach Zeisberg, M., und Neilson, E. G. (2009). Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions. J. Clin. Invest 119, 1429–1437 Tabelle 1 In vitro Kriterien für EMT Die in dieser Arbeit untersuchten Kriterien sind unterstrichen. Das erste Kriterium für eine stattgefundene EMT ist die veränderte Zellmorphologie. Epitheliale Zellen sind gekennzeichnet durch eine meist kubische Form und einen polaren Aufbau mit engen Zell-Zellkontakten. Durch EMT erlangen die Epithelzellen mesenchymale Eigenschaften. Die Zellmorphologie verändert sich zu einer spindelförmigen, fibroblasten-ähnlichen Form. Die Zellen verlieren ihre Polarität und die Verbindung zu anderen Zellen. Aus dem Zellverbund losgelöst, gewinnen die Zellen an Motilität und bilden ein ungeordnetes Netzwerk. Wandern die Zellen durch die Basalmembran hindurch, spricht man von invasivem Wachstum. Des Weiteren beginnen die Zellen, Proteine der Extrazellulären Matrix, zum Beispiel Kollagene, zu bilden. 9 2. Einleitung Es sind mehrere Proteine bekannt, die als Marker für die EMT dienen können (Tabelle 1). In dieser Arbeit wurde die Expression von S100A4, snail1 und E-Cadherin untersucht. S100A4 ist ein 12 kDa schweres Protein, das als Dimer ausschließlich bei Säugetieren ubiquitär im Zytoplasma und Zellkern vorkommt. Als Multimer konnte es auch extrazellulär nachgewiesen werden. S100-Proteine sind Ca2+-bindende Proteine, die keine enzymatische Funktion haben, sondern durch Interaktion mit anderen Proteinen deren Aktivität modulieren. S100A4 wird auch als FSP1, Fibroblasten-spezifisches Protein 1, bezeichnet. Weitere Synonyme sind pEL-98, mts1, CAPL oder 18A2. Die Gene für S100Proteine liegen auf dem Chromosom 1q21. S100A4 ist an Prozessen der Zelldifferenzierung, der Zellzykluskontrolle und der Modulation von Zellkontakten beteiligt (Donato, 2003). S100A4 ist ein entscheidender Faktor bei der Tumorprogression. Es ist per se kein Onkogen, da es die Entstehung von Tumoren nicht beeinflusst, aber es fördert die Migration, die Invasion und die Metastasenbildung von Tumorzellen (Mazzucchelli, 2002; Helfman et al., 2005). Es wird deshalb auch als das metastasen-bildende Protein S100A4, oder Metastasin, bezeichnet. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Tumorzellen selbst, sondern vor allem tumorassoziierte Makrophagen und Fibroblasten S100A4 sezernieren (Cabezón et al., 2007). Diese Tatsache unterstreicht, wie essenziell das Tumorstroma bei dem Fortschreiten des Tumorwachstums ist. Es kann festgehalten werden, dass S100A4 eine Schlüsselrolle bei der EMT und in der Metastasenbildung einnimmt (Xue et al., 2003). E-Cadherin ist ein kalzium-abhängiges Zelladhäsions-Glykoprotein. Es ist membranständig und zählt neben N-Cadherin zur Gruppe der klassischen Typ I Cadherine. Das etwa 130 kDa schwere E-Cadherin wird auch als cadherin-1, Uvomorulin oder ECAD bezeichnet. Es wird durch das CDH1-Gen kodiert, das sich auf Chromosom 16q22.1 befindet. Das E-Cadherin ist ein wesentlicher Bestandteil der adherens junctions. Zu diesen Zell-Zellverbindungen zählen unter anderem die Zonula adhaerens und die Desmosomen. Die extrazelluläre Domäne bindet an ein E-Cadherin einer benachbarten Zelle. Damit ist E-Cadherin, durch seine Funktion als Zelladhäsionsprotein, ein epithelialer Marker. Es wurde beobachtet, dass während der Tumorprogression der meisten Karzinome eine Verminderung, beziehungsweise ein Verlust von E-Cadherin stattfindet (Birchmeier 10 2. Einleitung und Behrens, 1994). Intrazellulär bindet E-Cadherin unter anderem an α- und β-Catenin, welche durch Bindung an das Aktin eine Verankerung im Zytoskelett herstellen. Durch die EMT wird E-Cadherin herunterreguliert und so ß-Catenin freigesetzt, welches im Zellkern akkumuliert. Dieses nukleare ß-Catenin ist ein Indikator für EMT (Brabletz et al., 2001). Für das NSCLC wurde gezeigt, dass der Verlust von E-Cadherin und ß-Catenin mit einer ungünstigen Prognose einhergeht. Bei erhaltener Produktion lag die 5-JahresÜberlebensrate bei 72,4%, beim Verlust von einem der beiden Proteine bei 58,2% und beim Verlust von beiden bei nur 45,8% (Kase et al., 2000). Snail1 ist ein Transkriptionsfaktor, der zur Gruppe der Zinkfingerproteine gehört. Er ist einer der stärksten Regulatoren der EMT. Das Gen SNAI1 ist auf dem Chromosom 20q13 kodiert. Snail1 aktiviert mehrere Reaktionskaskaden, die mesenchymale Marker, wie Fibronektin oder Metalloproteinasen, induzieren und die Expression epithelialer Marker, wie Zytokeratine oder Occludine, reprimieren (Barrallo-Gimeno und Nieto, 2005). In Tumorzellen wirkt snail1, durch Bindung an drei E-Boxen der Promotorregion, als Repressor von E-Cadherin (Batlle et al., 2000; Cano et al., 2000). Zusammen mit SMAD3 und SMAD4, die durch TGF-β aktiviert werden, bildet snail1 einen Komplex an Transkriptionsfaktoren, die als Gen-Repressor EMT induzieren (Vincent et al., 2009). Neben der Induktion von Invasion und Metastasenbildung beeinflusst snail1 auch die Sensibilität von Tumoren gegenüber Chemotherapeutika. Durch Aktivierung des Gens ERCC1 (excision repair cross complementation group 1) reduziert snail1 die Sensibilität gegenüber Cisplatin bei Zellen aus Tumoren des Kopf- und Halsbereichs (Hsu et al., 2010). Eine Vielzahl an EMT-Induktoren aktivieren snail1 (Barrallo-Gimeno und Nieto, 2005). Damit wird deutlich, dass dieser Transkriptionsfaktor als eine Art Konfluenzpunkt der EMT-Aktivierung betrachtet werden kann (Abbildung 2), wobei er die Transkription von vielen EMT-Markern beeinflusst (De Craene et al., 2005). 11 2. Einleitung FGF EGF TGF β BMPs Östrogene Hypoxie Snail Gene Epitheliale Marker Cytokeratine Occludine E-Cadherin Proliferation Cyclin D Chemoresistenz Invasion Mesenchymale Marker ERCC1 p53 MMPs Fibronectin S100A4 Vimentin Abbildung 2 Induktoren und Funktionen von snail 2.2.3 Induktoren der Epithelial to Mesenchymal Transition In Abbildung 2 sind eine Reihe von bekannten EMT-Induktoren aufgeführt. Diese Faktoren wirken in verschiedenen Stadien der Entwicklung und in unterschiedlicher Stärke. Während bei der Embryogenese vor allem Notch, bone morphogenic proteins (BMPs) oder Wnt die Metaplasie von epithelialen zu mesenchymalen Zellen induzieren, so sind es bei der Tumorprogression Integrine, fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF) und transforming growth factor β (TGF-β) (Huber et al., 2005; Thiery et al., 2009). Jegliche Art von Zellstress, zum Beispiel Hypoxie oder Entzündungsreaktionen, kann ebenfalls eine EMT auslösen. Auch Hormone, wie Östrogene (Park et al., 2008), oder exogene Noxen wie Nikotin (Davis et al., 2009) sind potentielle EMT-Induktoren. TGF-β1 ist wohl der am besten untersuchte EMT-Induktor. TGF-β1 kann EMT bei verschiedenen Tumorzelllinien epithelialer Herkunft induzieren und die Invasivität dieser erhöhen (Oft et al., 1996; Song, 2007). Mehrere Arbeiten mit der A549-Zelllinie belegen, dass TGF-β1 bei Adenokarzinomzellen der Lunge EMT induziert (Kasai et al., 2005; Kim et al., 2007). 12 2. Einleitung 2.3 Tumormilieu und CC Chemokin Ligand 18 2.3.1 Rolle des Tumormilieus bei der Tumorprogression Bei der Entstehung und der Progression von Tumoren spielt das Tumormilieu eine entscheidende Rolle (Lorusso und Rüegg, 2008). Unter anderem wird vermutet, dass Signale aus dem Tumorstroma EMT-induzierende Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise snail1, aktivieren (Kalluri und Weinberg, 2009). Tumore bestehen nicht nur aus neoplastischen Zellen, sondern enthalten auch Fibroblasten, Endothelzellen und immunkompetente Zellen. Dabei machen Makrophagen bis zu 50% der Tumormasse aus (Solinas et al., 2009). Diese tumor-assoziierten Makrophagen (TAM) haben in der Regel den Phänotyp von alternativ aktivierten Makrophagen (Mantovani et al., 2002). Makrophagen differenzieren sich aus Monozyten, die aus der Blutbahn in das Gewebe einwandern. Es werden klassisch aktivierte von alternativ aktivierten Makrophagen unterschieden. Als alternativ aktiviert, oder M2, werden Makrophagen bezeichnet, die durch Zytokine der Typ2 T-Helfer-Zellen (Th2-Zellen), wie IL-4, IL-10, IL-13 oder durch Glukokortikoide stimuliert werden. Die klassische Makrophagen-Aktivierung (M1) wird durch bakterielle Lipopolysaccharide und Interferon-γ, einem Th1-assoziierten Zytokin, vermittelt. M1-Makrophagen agieren in der Abwehr von Bakterien und Viren und hemmen das Tumorwachstum. M2-Makrophagen, zu denen auch die TAM gezählt werden, agieren vorwiegend bei der Geweberegeneration. Bei der Tumorentstehung wirken TAM als Promotoren (Mantovani et al., 2002). Durch die Produktion von Wachstumsfaktoren wie EGF und TGF-β stimulieren sie das Tumorzellwachstum und hemmen die M1vermittelte antitumorale Immunantwort. TAM sind entscheidend beim invasiven Wachstum von Tumorzellen in das umliegende Parenchym, sowie Blut- bzw. Lymphbahnen (Pollard, 2004; Solinas et al., 2009). In vitro Versuche belegen die Wirkung von TAMs bei der Tumorprogression. A549-Zellen zeigten ein gesteigertes Migrations- und Invasionspotential nach der Behandlung mit konditioniertem Medium von NSCLCassoziierten Makrophagen (Wang et al., 2011). Das in dieser Arbeit untersuchte Chemokin CCL18 wird von TAM sezerniert (Schutyser et al., 2002). Durch die Co-Kultivierung von Makrophagen und A549-Zellen wurden vermehrt alternativ aktivierte Makrophagen induziert und die Produktion von CCL18 erhöht (Müller-Quernheim et al., 2012). 13 2. Einleitung Neben den Makrophagen bilden Fibroblasten einen großen Anteil des Tumorstromas. Besonders Zellen einer heterogenen Subpopulation von speziell aktivierten Fibroblasten, die sich unter anderem durch die Expression von S100A4 und α smooth muscle actin (αSMA) auszeichnen, sind im Tumorstroma zu finden und werden als Tumor- oder Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) bezeichnet (Sugimoto et al., 2006; Franco et al., 2010). Diese CAF, die zu bis zu 40% aus Endothelzellen entstehen (Potenta et al., 2008), produzieren ebenfalls Wachstumsfaktoren (z.B. TGF-β), Chemokine und die extrazelluläre Matrix, die das Wachstum der neoplastischen Zellen und die Neoangiogenese stimulieren. So tragen CAF durch verschiedenste Interaktionsmechanismen mit entarteten Zellen zur Tumorprogression und Metastasierung bei (Kalluri und Zeisberg, 2006). 2.3.2 CCL18: Vorkommen, Eigenschaften, Funktionen, Rezeptoren Der CC Chemokin Ligand 18 hat ein Molekulargewicht von 7,85 kDa und besteht aus 69 Aminosäuren. Er spielt vor allem eine Rolle bei immunregulatorischen und inflammatorischen Prozessen. Synonyme für CCL18 sind pulmonary and activation regulated chemokine (PARC), monocyte inflammatory protein 4 (MIP4), alternative macrophage activation-associated CC Chemokine (AMAC-1), dendritic cell chemokine 1 (DC-CK1) oder small inducible cytokine A18 (SCY-A18). Es wird auf dem Chromosom 17q11.2 kodiert (Schutyser et al., 2005). CCL18 kommt ausschließlich bei Primaten vor und ist am nächsten verwandt mit CCL3 (MIP-1α), dessen Proteinsequenz zu 59% mit der von CCL18 übereinstimmt (Kodelja et al., 1998). Als Chemokine werden Zytokine bezeichnet, die chemotaktisch wirken und mit 7transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren interagieren. Sie werden nach der Konfiguration der beiden N-terminalen Cysteinreste in zwei Subgruppen unterteilt. In der Gruppe der CC-Chemokine sind die Cysteinreste direkt benachbart, während bei den CXC-Chemokinen die beiden endständigen Cysteinreste durch eine andere Aminosäure getrennt sind. In der neueren Nomenklatur der Chemokine wird den Liganden ein L und den Rezeptoren ein R hinzugefügt. 14 2. Einleitung Chemokine können weiter in homöostatisch und inflammatorisch unterteilt werden. Homöostatische Chemokine werden konstitutiv in einem Organ exprimiert und tragen zur Zellmigration bei, während inflammatorische Chemokine abhängig von inflammatorischen Signalen von verschiedenen Zelltypen (Makrophagen, T-Zellen, Fibroblasten, u.a.) produziert werden (Zlotnik und Yoshie, 2000). CCL18 scheint in beide Kategorien zu passen. CCL18 wird konstitutiv in der Lunge und im lymphatischen Gewebe exprimiert (Kodelja et al., 1998). Aufgrund dieser Beobachtung wird CCL18 auch als pulmonary and activation regulated chemokine (PARC) bezeichnet (Hieshima et al., 1997). CCL18 wird vor allem von M2-Makrophagen, also alternativ aktivierten Alveolarmakrophagen (Kodelja et al., 1998), tumor-assoziierte Makrophagen (Schutyser et al., 2002; Chen et al., 2011), aber auch von dendritischen Zellen (Adema et al., 1997), Monozyten und eosinophilen Granulozyten (Schraufstatter et al., 2004) produziert und sezerniert. Aus den entsprechenden Untersuchungen stammen die alternativen Bezeichnungen für CCL18, wie AMAC-1, DC-CK1 oder MIP-4. CCL18 agiert sowohl in physiologischen, wie pathologischen Prozessen. Es wirkt chemotaktisch auf T-Lymphozyten (Luzina et al., 2006), B-Lymphozyten (Lindhout et al., 2001) sowie unreife dendritische Zellen (Vulcano et al., 2003) und scheint so bei der Reifung von Abwehrzellen und der Regulation des Immunsystems beteiligt zu sein. Dabei ist noch nicht geklärt, wann CCL18 pro- und wann anti-inflammatorisch wirkt. CCL18 wirkt chemotaktisch auf CD4+ T-Helfer-Zellen und auf CD8+ T-Killer-Zellen und ist somit zugleich an der humoralen wie an der zellulären Immunantwort beteiligt (Guan et al., 1999). Jedoch induziert CCL18 bei Monozyten, Makrophagen und Granulozyten keine Chemotaxis (Schraufstatter et al., 2004). Bei verschiedenen pathologischen Prozessen spielt CCL18 eine Rolle, vor allem bei Erkrankungen der Lunge, der Haut und der Gelenke (Schutyser et al., 2005). CCL18 konnte auch mit allergischen Erkrankungen wie der atopischen Dermatitis assoziiert werden (Pivarcsi et al., 2004). Es konnte ein erhöhtes CCL18 im Sputum, respektive der BAL bei Patienten mit allergischem Asthma bronchiale nachgewiesen werden (de Nadaï et al., 2006; Kim et al., 2009). CCL18 wurde auch bei entzündlichen Prozessen in der Lunge, wie beispielsweise der Lungenfibrose, als Faktor identifiziert (Prasse et al., 2006). Die Stimulation mit CCL18 steigert die Produktion von Kollagen bei Fibroblasten der Lunge (Atamas et al., 2003), wurde im Serum von 15 2. Einleitung Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF) in erhöhten Konzentrationen nachgewiesen (Prasse et al., 2007) und korreliert mit dem Outcome von IPF-Patienten (Prasse et al., 2009). Daneben wurde auch eine erhöhte Serum-CCL18-Konzentration bei Patienten mit einer COPD nachgewiesen (Sin et al., 2011). Neben den entzündlichen Erkrankungen konnte auch bei Tumorerkrankungen eine erhöhte CCL18-Expression gezeigt werden, beispielsweise beim Ovarialkarzinom (Schutyser et al., 2002) und der akuten lymphatischen Leukämie (Struyf et al., 2003). Bei Patienten mit einem NSCLC konnte ein stadienabhängig erhöhtes Serum-CCL18 gemessen werden, wobei die CCL18-Konzentration negativ mit der Überlebenszeit von Patienten mit Adenokarzinom korrelierte (Plönes et al., 2012). Die Rolle von CCL18 bei der Tumorgenese wird dennoch kontrovers diskutiert, da es auch Untersuchungen gibt, in denen eine verstärkte CCL18-Expression mit einem verlängerten Überleben assoziiert wird. Hierbei wurde nicht die Serumkonzentration, sondern die CCL18-Expression im Tumorgewebe mittels Immunhistochemie quantifiziert, zum Beispiel beim Magenkarzinom (Leung et al., 2004) und beim kolorektalen Karzinom (Yuan et al., 2013). Der erste CCL18-Rezeptor der identifiziert wurde, ist GPR30. Bei pre-B-ALL-Zellen hemmt CCL18 die CXCR4-vermittelten Effekte über eine Interaktion mit GPR30 (Catusse et al., 2010). Als Nächstes wurde entdeckt, dass CCL18 an den PITPNM3-Rezeptor (Nir1) bei Mammakarzinom-Zellen bindet. Hierbei wurde auch beobachtet, dass CCL18 in vivo die Metastasierung von Mammakarzinomen beschleunigt und mit einer verringerten Überlebensrate einhergeht (Chen et al., 2011). Aus Daten unserer Arbeitsgruppe geht hervor, dass CCR6 ein Rezeptor für CCL18 ist (Zissel et al., 2011). Als bisher einziger Ligand für CCR6 war CCL20 bekannt (Schutyser et al., 2003). Die Stimulation von Fibroblasten aus fibrotischen Lungen mit CCL18 zeigte eine Hochregulation der Expression von FGF2, Kollagen Typ1 und αSMA. Durch die Blockade des CCR6 mit einem Antikörper wurden diese Effekte von CCL18 nahezu vollständig attenuiert. Des Weiteren konnte mit Hilfe eines GFP fluoreszenz-markierten CCR6 gezeigt werden, dass die Stimulation mit CCL18 zu einer Internalisierung des CCR6Rezeptors führt. Damit wurde CCR6 als CCL18-Rezeptor identifiziert. 16 2. Einleitung Aufgrund dieser Erkenntnisse, die CCL18 als potentiellen Induktor der epithelial to mesenchymal transition identifiziert haben und aufgrund der Tatsache, dass die CCL18Serumkonzentration beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom erhöht ist, wurde die Hypothese für diese Arbeit formuliert. Ziel war es die Wirkung von CCL18 auf Adenokarzinomzellen der Lunge und die Fähigkeit von CCL18 zur EMT-Induktion zu untersuchen. Als Kriterien galten die in Tabelle 1 dargestellten Parameter, nach denen nacheinander die Zellmorphologie, die Expression der Protein-Marker E-Cadherin, S100A4 und snail1 auf mRNA- und Proteinebene, die chemotaktische Wirkung, sowie die Migrationsund Invasionsfähigkeiten, die Proliferationsrate und die Chemosensibilität von Adenokarzinomzellen der Linie A549 unter CCL18-Einfluss untersucht wurden. Zur Abschätzung der Stärke der EMT-Induktion durch CCL18 wurden die Versuche in Vergleichsproben mit dem bekannten EMT-Induktor TGF-β1 durchgeführt. 17 3. Fragestellung 3. Fragestellung 1. Kann CCL18 eine „Epithelial to Mesenchymal Transition“ bei Adenokarzinomzellen der Lunge induzieren? 2. Wie beeinflusst CCL18 das Migrations- und Invasionsverhalten von A549-Zellen? 3. Hat die Stimulation mit CCL18 einen Effekt auf die Chemosensibilität von Adenokarzinomzellen ? 18 4. Material 4. Material 4.1 Geräte und Software Absorbance Reader, MRX Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA Analysewaage Handy H 51-D Sartorius, Göttingen, D Analysewaage Handy SBC 51 Scaltec Instruments GmbH, Göttingen, D Brutschrank, Typ B 5060 EK-CO² Heraeus Instruments, Hanau, D Cell^A Software Olympus, Tokio, Japan Eismachine, AF 10 Scotsman, Vernon Hills, IL, USA Heizblock, Digital Dry Bath Labnet International, Edison, NJ, USA iCycler Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA iCycler Software Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA Lichtmikroskop, CKX41 Olympus, Tokio, Japan Magnetrührer, Ikamag RCT Ika-Werke, Staufen, D Mikrowelle Siemens, München, D Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA Mini-Protean 3 Electrophoresis System Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA Multiwell Chemotaxis Chamber, AA10 Neuro Probe Inc., Gaithersburg, MD, USA NanoDrop 2000C Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Neubauer-Zählkammer Marienfeld-Superior, Lauda-Königshofen, D Odyssey Infrared Imaging System Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA Odyssey V3.0 Software Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA pH Meter, pH Level1 WTW GmbH, Weilheim, D Pipetboy acu Integra Biosciences GmbH, Fernwald, D Pipetten (2,5; 10; 20; 100; 200;1000 μl) Eppendorf, Hamburg, D Pipetten (2; 10; 20; 200;1000 μl) Gilson Inc., Middleton, WI, USA Schüttler, Rocking Platform Shaker VWR International GmbH, Darmstadt, D Spannungsgerät, PowerPac Basic Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA Sterilbank, HERAsafe Heraeus Instruments, Hanau, D Sterilbank, Laminair HB 2448 Heraeus Instruments, Hanau, D Stickstofftank, Arpege100 Air Liquide, Paris, Frankreich Thermocycler PeqSTAR 96 Universal Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D Transferpipette (100, 200 μl) Brand, Wertheim/Main, D 19 4. Material Vortex-Shaker Reax 2000 Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, D Wasserbad Köttermann GmbH, Uetze/Hänigsen, D Zellkulturflaschen, 25cm² Corning Inc., Corning, NY, USA Zellkulturflaschen, 75cm² Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D Zentrifuge, Centrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg, D Zentrifuge, Labofuge 400 R Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Zentrifuge, PerfectSpin P Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D Zentrifuge, Rotanta 460 RS Andreas Hettich GmbH, Tuttlingen, D 4.2 Verbrauchsmaterialien 12-Well-Platten, Costar Corning Inc., Corning, NY, USA 6-Well-Platten, Cellstar Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D 96-Well-Platten, Microtest BectonDickinson, Lincoln Park, NY, USA Abdichtfolie, ABsolute QPCR Seal Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Cell Invasion Assay, ECM 550 Chemicon International, Temecula, CA, USA Filterspitzen (2; 30; 200; 1000μl) Corning Inc.,Corning, NY, USA Deckgläser 24mmx24mm R. Langenbrinck, Emmendingen, D Handschuhe Sensiclean Latex/Nitratex Ansell, München, D Molecular Weight Markers Odyssey Li-cor Biosciences, Lincoln, NE, USA Objektträger R. Langenbrinck, Emmendingen, D PCR Platten, Thermo-Fast 96 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA PCR Tubes 0,2 ml Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D Pipettenspitzen (10; 200; 1000μl) Sarstedt Inc., Newton, NC, USA Polycarbonate Membranes, 12μm Neuro Probe Inc., Gaithersburg, MD, USA Polystyrol Pipetten (5, 10 und 25 ml) Corning Inc., Corning, NY, USA PVDF-Membranen Millipore, Billerica, MA,USA Reagenzröhrchen Cellstar (15, 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D Reaktionsgefäße (0,5; 1,5 und 2ml) Eppendorf, Hamburg, D RNeasy Plus Mini kit Qiagen Inc., Venlo, Niederlande Sterilfilter Corning Inc., Corning, NY, USA Whatmanpapiere 0,8 mm GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, D Zellschaber, Cell Scraper Sarstedt Inc., Newton, NC, USA 20 4. Material 4.3 Chemikalien, Biochemikalien, Medien und Stimulanzien ABsolute SYBR Green Fluorescein Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Acrylamid 30%, Rotiphorese Gel 30 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D APS Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Aqua B. Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D BRDU Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA Bromphenolblau 1% Merck, Darmstadt, D BSA Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA CCL18 (rh MIP-4) Immunotools GMbH, Friesoythe, D Cisplatin KL NeoCorp AG, Weilheim, D Desoxycytidin Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA DMEM Invitrogen, Carlsbad, USA DPBS Invitrogen, Carlsbad, USA EDTA Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA EGTA Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Ethanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D FCS PAA laboratories GmbH, Pasching, Österrreich Glyzerol, Glyzerin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Glycin SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, D Isopropanol=2-Propanolol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Kristallviolett Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Methanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D MTT Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA Natriumacetat-Trihydrat Merck, Darmstadt, D Natriumchlorid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Natriumlaurylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Nonidet P-40 AppliChem GmbH, Darmstadt, D Nuklease freies Wasser Life technologies, Carlsbad, USA Omniscript RT Kit Qiagene, Düsseldorf, D Penicillin/Streptomycin Biochrom AG, Berlin, D Proteinase Inhibitor Cocktail BioVision, Mountain View, CA, USA rh TGF-β1 R&S Systems Inc., Minneapolis,MN, USA 21 4. Material Rotiblock Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Salzsäure, Hydrogenchlorid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Schwefelsäure, H2SO4 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA ß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA TEMED Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA TMB Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA Tris USB Corp., Cleveland, OH, USA Tris-Hydrochlorid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D Triton X-100 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA Trypsin Biochrom AG, Berlin, D Tween 20 Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, D Zitronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt, D 4.4 Antikörper und Primer Anti-Human-BrdU-POD, clone BMG 6H8 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D Anti-Human CCR6, sc-9697 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Anti-Human GPR30, sc-48525-R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA Anti-Human-E-Cadherin, 07-697 Upstate, Billerica, MA,USA Anti-Human-S100A4, ab27957 Abcam Inc., MA, USA Anti-Human-snail, ab85935 Abcam Inc., MA, USA Anti-Human-α-Tubulin, ab7291 Abcam Inc., MA, USA Donkey anti-Mouse IRDye 680 Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA Donkey anti-Mouse IRDye 800CW Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA Donkey anti-Rabbit IRDye 680 Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA Donkey anti-Rabbit IRDye 800CW Li-cor Bioscences, Lincoln, NE, USA PCR-Primer biomers.net GmbH, Ulm, D 22 5. Methoden 5. Methoden 5.1 Zellkultivierung Als in vitro Modell für die Untersuchungen zum nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom wurde die Zelllinie A549 benutzt. Diese Adenokarzinomzellen wurden erstmals 1972 aus einem resezierten Tumor eines kaukasischen Mannes isoliert (Giard et al., 1973) und seitdem kultiviert. Die A549-Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) mit 10% Fetalem Kälberserum (FCS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) bei 37°C und einer CO2-Konzentration von 5% in 75 cm2 großen Zellkulturflaschen kultiviert. Die Zellen wurden bis 80% Konfluenz kultiviert und alle zwei bis drei Tage geteilt. Hierfür wurde das Nährmedium entfernt und die Zellen mit 10 ml DPBS gewaschen. Anschließend wurden sie mit 3-4 ml einer Lösung aus Trypsin (0,05%) und EDTA (0,02%) für eine Minute umspült und für fünf Minuten in den Brutschrank bei 37°C gestellt, bis sie sich vollständig vom Flaschenboden ablösten. Die Zellen wurden dann in DMEM Nährmedium aufgenommen. Ein Drittel der Zellen wurde in der Flasche belassen und das Medium bis auf 10 ml aufgefüllt. Die restlichen Zellen wurden für die Versuche weiterverwendet oder verworfen. Die Zellen wurden von der fünften bis zur fünfzehnten Passage in Kultur gehalten. Alle Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilbank mit laminarer Strömung durchgeführt. 5.2 Stimulation Zur Stimulation wurden die Zellen geerntet und in Kulturflaschen mit 25 cm2 ausgesät. Die Zellen wurden in 3 ml DMEM Medium mit 10% FCS inkubiert und die Zellkonzentration auf 30.000 Zellen/ml eingestellt. Danach wurden die Zellen für mindesten zwölf Stunden im Brutschrank belassen, bis sie adhäriert waren. Zur Stimulation wurden die Chemokine TGF-β1 und CCL18 in DMEM Medium gelöst und in das auf den Zellen befindliche Nährmedium hinzugefügt. Die Konzentrationen wurden so eingestellt, dass im Medium die folgenden Chemokin-Konzentrationen erzielt wurden: TGF-β1 2 ng/ml, CCL18 0,1 ng/ml, CCL18 1 ng/ml, CCL18 10 ng/ml und CCL18 100 ng/ml. Die so stimulierten Zellen wurden für 24 respektive 72 Stunden im Brutschrank (37°C, 5% CO2) aufbewahrt. Als Kontrolle dienten Zellen ohne Zusatz von Chemokinen. 23 5. Methoden 5.3 Realtime-Polymerase-Kettenreaktion 5.3.1 RNA Isolation Die Zellen wurden mit Hilfe von Trypsin geerntet und mit DPBS gewaschen, bevor sie zu einem Zellpellet abzentrifugiert wurden (RCF=180, 5 Minuten). Zur Isolation der RNA wurde das RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Niederlande) verwendet. Dieses Kit macht sich das Prinzip der selektiven Bindung von RNA an eine Silikonmembran zu Nutzen. Zuerst wurden die Zellen in einem Guanidinthiocyanat-haltigen Puffer lysiert. Das Zelllysat wurde mit Ethanol versetzt, um die erforderlichen Bindungseigenschaften der RNA herzustellen, und in Zentrifugationssäulen pipettiert. Die RNA konnte dann an die in den Säulen befindliche Membran binden. Zur Aufreinigung der RNA folgten wiederholte Waschschritte mit salzhaltigen Puffern. Zum Schluss konnte die wasserlösliche RNA mit RNase-freiem Wasser aus der Silikonmembran gewaschen werden. Die Konzentration der RNA wurde spektrophotometrisch mit dem NanoDrop 2000C (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) gemessen. 5.3.2 Reverse Transkription Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT), auch als RNA-abhängige DNAPolymerase bezeichnet, kann aus RNA die komplementäre DNA, auch cDNA genannt, hergestellt werden. So entsteht zunächst aus der einzelsträngigen RNA ein doppelsträngiger DNA-RNA-Hybridstrang. Durch eine weitere Transkriptionsreaktion entsteht doppelsträngige cDNA. Zur cDNA-Herstellung wurde das Omniscript RT Kit (Qiagene, Düsseldorf, D) benutzt. Die Reaktionsbestandteile wurden nach dem vorgegebenen Schema (Tabelle 2) in ein Reaktionsgefäß pipettiert, wobei für jede Reaktion 1 µg RNA eingesetzt wurde. Die cDNA-Synthese wurde im Thermocycler PegStar Universal (Peqlab Biotechnologie GmbH, D) durchgeführt. Die Reverse Transkription fand für 60 Minuten bei 37°C statt. Die Konzentration an gelöster cDNA wurde analog zur RNA spektrophotometrisch bestimmt. 24 5. Methoden Reaktionsansatz für cDNA-Synthese Volumen 10x Buffer RT 2 µl dNTP Mix 2 µl Reverse Transkriptase 1 µl RNA (1 µg) Volumen variabel, nach RNA-Konzentration Nuklease-freies Wasser Variabel (ad 20 µl) Gesamtvolumen 20 µl Tabelle 2 Reaktionsansatz für cDNA-Synthese 5.3.3 Realtime Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode um DNA zu vervielfältigen. Durch wiederholte DNA-Verdopplung anhand einer hitzestabilen DNA-Polymerase (taqPolymerase) kann ein bestimmtes DNA-Fragment stark vervielfältigt werden. In der medizinischen Forschung wird die PCR benutzt, um die Expression von DNAAbschnitten, zum Beispiel einzelner Gene, zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde eine Realtime-PCR durchgeführt, die es erlaubt, die amplifizierte DNA zu quantifizieren. Hierzu wurde SYBR Green, ein Cyanin-Farbstoff, benutzt. SYBR Green hat die Eigenschaft, bei Interkalierung in doppelsträngige DNA zu fluoreszieren. Da der Grad der Fluoreszenz von der Menge an DNA abhängt, konnte diese durch die Messung des vom DNA-SYBR Green-Komplex emittierten Lichts ermittelt werden. Eine DNA-Verdopplung (= 1 Zyklus) erfolgt in drei Teilschritten: Denaturierung, Primerhybridisierung (Annealing) und Elongation (Amplifikation). Die rt-PCR wurde in einem iCycler (Bio-Rad Laboratories Inc., USA) durchgeführt. Vor dem ersten Zyklus wurde die cDNA für 15 Minuten bei 95°C denaturiert, so dass sie in Einzelsträngen vorlag. Das Annealing der Primer erfolgte bei 57°C für 15 Sekunden pro Zyklus. Primer sind spezifische Oligonukleotide, die an die Einzelstrang-DNA binden. Anhand der Basensequenz der Primer wurde bestimmt, welcher DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Um gezielt einen DNA-Abschnitt zu vervielfältigen, ist ein Primer für jeden Strang notwendig. Da die Ableserichtung für beide Stränge in entgegen gesetzter Richtung verläuft, jeweils vom 3‘ zum 5‘-Ende, wird ein vorwärts (forward) und ein rückwärts (reverse) gerichteter Primer benötigt. Die Zielgene, target genes, und die Basensequenz der benutzten Primer 25 5. Methoden sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Elongation, in der die DNA-Polymerase den DNA-Strang mit freien Nukleinsäuren komplettiert, erfolgte bei 72°C für 20 Sekunden. Nun lag die DNA als Doppelstrang vor, das SYBR Green wurde gebunden und die Fluoreszenz gemessen. Nach diesem Schritt erfolgte eine Schmelzkurvenanalyse, indem die Temperatur sukzessive bis auf 95°C erhöht wurde. Bei einer für das jeweils gesuchte Fragment spezifischen Temperatur denaturierte der Doppelstrang und das SYBR Green wurde freigesetzt. Dies führte zu einer Änderung der Fluoreszenz. So konnte die Schmelztemperatur des PCR-Produktes ermittelt werden. Da die Schmelztemperatur für spezifische PCR-Produkte höher liegt als für unspezifisch entstehende Primerdimere, konnten diese anhand der Schmelzkurvenanalyse voneinander unterschieden werden und die Spezifität des entstandenen PCR-Produktes überprüft werden. Der nächste Zyklus begann mit einer Denaturierung bei 95°C für 10 Sekunden. Nach insgesamt 45 Zyklen wurde die DNA sukzessive auf 4°C abgekühlt. Zielgen Accession Number Primer Sequenz GAPDH forward NM 002046 5‘-CAC CAG GGC TGC TTT TAA CT-3‘ GAPDH reverse NM 002046 5‘-GAT CTC GCT CCT GGA AGA TG-3‘ E-Cadherin forward NM 004360 5‘-TGC CCA GAA AAT GAA AAA GG-3‘ E-Cadherin reverse NM 004360 5‘-GTG TAT GTG GCA ATG CGT TC-3‘ S100A4 forward NM 019554 5‘-GGT GTC CAC CTT CCA CAA GT-3‘ S100A4 reverse NM 019554 5’-GCT GTC CAA GTT GCT CAT CA-3’ Snail forward NM 005985 5’-GCG AGC TGC AGG ACT CTA AT-3’ Snail reverse NM 005985 5’-GGA CAG AGT CCC AGA TGA GC-3’ PITPNM3 forward NM 001165966.1 5’-CAA CTT CCC ACA GGG CAT GAT CTT-3’ PITPNM3 reverse NM 001165966.1 5’-GAT GAA GCA CTC CTG CAT GAG GTT-3’ Tabelle 3 Primer für rt-PCR Der Reaktionsansatz für die beschriebene rt-PCR wurde in Tabelle 4 aufgeführt. Der in diesem Ansatz benutzte Absolute SYBR Green Fluorescein Mix (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) enthielt Puffer, dNTPs und die taq-Polymerase. Alle Komponenten wurden in eine PCR-Platte pipettiert, gut vermischt und zentrifugiert, bevor die PCR im iCycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) gestartet wurde. 26 5. Methoden PCR-Reaktionsansatz Volumen Absolute SYBR Green Mix 12,5 µl Forward Primer 0,63 µl 100 pmol/µl Reverse Primer 0,63 µl 100 pmol/µl Nuklease-freies Wasser 9,3 µl cDNA 2 µl Tabelle 4 Endkonzentration Reaktionsansatz rt-PCR 5.3.4 Relative Quantifizierung der rt-PCR Während der rt-PCR wurde nach jedem Zyklus die Fluoreszenz gemessen. Der Grad der Fluoreszenz ist dabei Proportional zu der Menge an vorhandener DNA. Zu einem bestimmten Zeitpunkt übersteigt die Fluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz. Die Anzahl der zu diesem Zeitpunkt absolvierten Zyklen wird als ct-Wert bezeichnet, dabei steht ct für cycle threshold. Der ct-Wert ist abhängig von der Menge an spezifischer cDNA, die eingesetzt wurde. Je häufiger ein DNA-Abschnitt in der cDNA-Probe vorkommt, umso früher wird die kritische Fluoreszenz gemessen und umso niedriger ist der ct-Wert. Bei der Transkription wird ein Gen abgelesen und in Form von mRNA vervielfältigt, die dann bei der Translation zur Synthese des vom Gen kodierten Proteins führt. Da die cDNA aus mRNA synthetisiert wurde, entspricht die Menge an cDNA der Expression eines Zielgens. Um den Gehalt an spezifischer DNA in unterschiedlichen Proben vergleichen zu können, muss der ct-Wert, und damit die Expression eines Zielgens, auf ein Gen bezogen werden, das unabhängig vom Zellstadium exprimiert und nicht reguliert wird. Ein solches Gen wird auch als Reporter- oder Haushältergen, englisch housekeeping gene, bezeichnet. Als Reportergen wurde Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet. Zur relativen Quantifizierung wurde die Expression eines Zielgens mit der des Reportergens in Relation gesetzt. Die relative Expression eines Zielgens im Verhältnis zum Reportergen wurde mit Hilfe der sogenannten Delta-Delta-Methode aus den ct-Werten errechnet. Die Formel für die relative Expression (rE) lautete: rE = 2Ct(GAPDH)-Ct(Zielgen)*10.000. Zum besseren Vergleich wurden die Werte der relativen Expression prozentual zu den Expressionswerten der Kontrolle dargestellt. 27 5. Methoden 5.4 Western Blot 5.4.1 Extraktion von Proteinen aus Zellen Die A549 Zellen wurden stimuliert und anschließend mechanisch abgelöst. Hierbei wurden die Zellen nicht durch die Zugabe von Trypsin aus der Flasche, bzw. den Wells, gelöst, sondern mit Hilfe eines Zellschabers vom Flaschenboden abgesammelt. Mit dieser Technik sollte vermieden werden, dass die nachzuweisenden Proteine, vor allem das extrazelluläre E-Cadherin, durch das Hinzufügen von Trypsin fragmentiert und zu Oligopeptiden gespalten werden. Zur Herstellung des Proteinlysats wurde das Zellpellet aus stimulierten Zellen in eisgekühltem Lysepuffer (Tabelle 5) aufgenommen und nach kurzem Vortexen für mindestens 30 Minuten auf Eis belassen. Dem Lysepuffer wurde 1% Proteinase-Inhibitor hinzugefügt. Abschließend wurden nicht lysierte Zellreste für 3-4 Minuten bei einer RCF von 500 abzentrifugiert. Die Gesamtproteinkonzentration in den Proteinlysaten wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) bestimmt. Dabei wurden die Proteine mit einer Färbelösung versetzt und photometrisch ausgewertet. Die Proteinkonzentration wurde durch den Vergleich mit einer Verdünnungsreihe aus Rinderserumalbumin ermittelt. Die Proben wurden mit Lysepuffer so verdünnt, dass eine Endkonzentration an Proteinen von 500-1000 µg/ml entstand. Die so gewonnenen Proteinlysate wurden bei -20°C aufbewahrt. Lysepuffer Endkonzentration Tris HCl, pH 7,6 50 mM NaCl 150 MM EDTA 2 mM EGTA 2 mM Triton X 0,1 % Tabelle 5 Lysepuffer für Proteinextraktion 28 5. Methoden 5.4.2 SDS-PAGE Das Prinzip der SDS-PAGE (sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) besteht in der elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht in einem Polyacrylamidgel. Die Proteine werden zunächst thermisch denaturiert. Nun liegen sie in ihrer Primärstruktur vor und das SDS kann sich an diese anlagern und ihnen so eine negative Ladung verleihen. Die Eigenladung der Proteine wird so durch das SDS maskiert. Über das Polyacrylamidgel wird ein elektrisches Feld angelegt. Die durch SDS negativ geladenen Proteine wandern in Richtung Anode. Zuerst durchlaufen sie ein Sammelgel und werden zu einer scharfen Bande konzentriert. Die eigentliche Auftrennung nach Größe erfolgt anschließend im Trenngel. Zur Gelelektrophorese wurden je nach Molekulargewicht des gesuchten Proteins Polyacrylamidgele unterschiedlicher Konzentration verwendet: für Proteine mit großer Masse, wie E-Cadherin (140 kDa), ein 10%iges und für Proteine mit geringer Masse, wie snail1 (29 kDa), S100A4 (12 kDa), GPR30 (38 kDa) und CCR6 (48 kDa) ein 15%iges Polyacrylamidgel. Die 1,5 mm dicken Gele wurden in einer aus zwei Glasplatten bestehenden Kammer gegossen. Die detaillierte Zusammensetzung der Gele kann Tabelle 6 entnommen werden. Die chemische Polymerisation wurde hierbei durch Ammoniumperoxi-disulfat (APS) gestartet und durch N’N‘ Tetramethylethylendiamin (TEMED) katalysiert. Zuerst wurden die Trenngele zwischen die Glasplatten gegossen bis etwa 2 cm unterhalb der oberen Glaskante. Damit sich eine glatte Grenzfläche bildete, wurde das Gel mit etwa 1 ml Isopropanol überschichtet. Nach einer Polymerisationszeit von circa 45 Minuten wurde das überstehende Isopropanol abgegossen und dann die Glasplatten bis zur Oberkante mit Sammelgel gefüllt. Zuletzt wurde ein Gelkamm in das Sammelgel gesteckt. So entstanden die Taschen für die Proben. Nach weiteren 45 Minuten Polymerisationszeit konnte der Gelkamm entfernt werden. 29 5. Methoden Angaben für 2 Gele Sammelgel (4%) Trenngel (10%) Trenngel (15%) Aqua dest. 3 ml 8 ml 3,68 ml Tris-HCl 1,25 ml 5 ml 4 ml (0,5 M; pH 6,8) (1,5 M; pH 8,8) (1,5 M ; pH 8,8) 10% SDS 50 µl 200 µl 160 µl 30% Acrylamid 665 µl 6,66 ml 8 ml 10% APS 25 µl 100 µl 160 µl TEMED 5 µl 10 µl 16 µl Tabelle 6 Gele für Gelelektrophorese Der nächste Schritt bei der SDS-PAGE war die Vorbereitung der zu untersuchenden Proben. Hierzu wurden je 15 µl Proteinlysat (Proteinkonzentration 500-1000 µg/ml) und 5 µl Lämmli-Puffer (Tabelle 7) gemischt und für fünf Minuten in einem Heizblock bei 93°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren. Nach dem Aufheizen wurde durch kurzes Zentrifugieren (1 min, 5000 rpm) das gesamte Lysat-Puffer-Gemisch im EppendorfGefäß gesammelt. 4-fach Lämmli-Ladepuffer Aqua dest 3,8 ml Tris-HCl (0,5 M; pH 6,8) 1 ml Glycerol 0,8 ml 10% SDS 1,6 ml β-Mercaptoethanol 0,4 ml 1% Bromphenolblau 0,4 ml Tabelle 7 Lämmli-Ladepuffer Die Polyacrylamidgele wurden in dem Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis System (BioRad Laboratories Inc., USA) eingespannt und die gesamte Apparatur mit SDS-Laufpuffer (Tabelle 8) gefüllt, bis die Gele komplett im Laufpuffer eingetaucht waren. Die Proben, je 20 µl bestehend aus Lämmli-Puffer und Proteinlysat, wurden dann vorsichtig in die Ladetaschen aufgetragen. Zur Bestimmung der Proteingröße wurden 3 µl von einem Protein-Gewichtsmarker (Molecular Weight Marker; Li-cor Biosciences, USA) mit bekannten Proteingrößen aufgetragen. 30 5. Methoden Angaben für 10-fach SDS-Laufpuffer In 1 L Aqua dest. Tris 30,35 g Glycin 144 g SDS (Natriumlaurylsulfat) 10 g Tabelle 8 SDS-Ladepuffer Die Gelelektrophorese wurde mit einer konstanten Stromstärke von 12 A pro Gel durchgeführt bis die Proben das Sammelgel durchlaufen hatten. Anschließend wurde die Stromstärke auf 18 A pro Gel erhöht und die Gelelektrophorese solange weiterlaufen gelassen, bis die farbmarkierte Lauffront am unteren Ende des Gels angelangt war. Nun konnte die Elektrophorese beendet werden und das Sammelgel, sowie die Lauffront, vom Trenngel mithilfe eines Plastikspatels abgetrennt werden. 5.4.3 Western Blot Der Transfer der nach Größe aufgetrennten Proteine vom Polyacrylamidgel auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF Immobilon Transfer Membrane, Millipore, USA) erfolgte in einem Wet-Blot Verfahren. Hierzu wurde das Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories Inc., USA) verwendet. Zu Beginn wurden die benötigten Schwämme und Filterpapiere (0,8 mm Whatmanpapier, GE Healthcare Europe GmbH, D) zum Einweichen in Blotting-Puffer (Tabelle 9) versetzt. Die PVDF-Membran wurde in Methanol (>99,5%) für eine Minute aktiviert und dann ebenso in Blotting-Puffer eingelegt. Die Komponenten des Wet-Blots wurden auf der Katodenplatte wie folgt aufgebaut: auf einen Schwamm folgten zwei Filterpapiere, dann das Gel, die PVDF-Membran, zwei weitere Filterpapiere, ein weiterer Schwamm und schließlich die Anodenplatte. Um den Einschluss von Luftblasen zwischen den einzelnen Schichten zu vermeiden, wurde jede einzelne Schicht vorsichtig mit einer Glaspipette abgerollt. Blotting-Puffer; pH 9,2 In 1 L Aqua dest. Endkonzentration Tris 5,82 g 48 mM Glycin 2,93 g 39 mM Tabelle 9 Blotting-Puffer 31 5. Methoden Das so zusammengesetzte „Blotting-Sandwich“ wurde in die dafür vorgesehene Kammer eingespannt. Der Elektrotransfer der Proteine auf die PVDF-Membran erfolgte für 60 Minuten bei einer konstanten Stromspannung von 100 Volt. Als Nächstes wurde die PVDF-Membran für mindestens 60 Minuten in 10 ml Roti-Block-Lösung (Carl Roth GmbH, D) oder 10 ml TBS-Waschpuffer mit 5% entfettetem Milchpulver auf einem Schüttler inkubiert. Dieser als „Blocken“ bezeichnete Arbeitsschritt diente dazu, alle freien Bindungsstellen auf der Membran für Antikörper zu blockieren. Nach dem Blocken wurde die Membran über Nacht bei 4°C mit einem für das gesuchte Protein spezifischen Antikörper inkubiert. Die Antikörper (Tabelle 11) wurden in 10 ml Roti-Block Lösung oder 10 ml TBS-Waschpuffer mit 5% entfettetem Milchpulver in einer vom Hersteller vorgegebenen Konzentration gelöst. Nach der Inkubation wurden die nicht gebundenen Primärantikörper von der Membran gewaschen. Dabei wurde die Membran fünf Mal für fünf Minuten mit TBS-T (Tabelle 10) auf dem Schüttler gespült. Dann folgte die Inkubation mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper (Tabelle 11) für mindestens 45 Minuten auf dem Schüttler. Hierbei wurden die Sekundärantikörper in 10 ml TBS gelöst. Überschüssige Zweitantikörper wurden abgewaschen. Auf drei 5minütige Waschschritte in TBS-T folgten zwei 5-minütige Waschschritte in TBS ohne Tween 20. Die Detektion der durch die Sekundärantikörper emittierten Fluoreszenz erfolgte durch einscannen der Membran mit dem Odyssey-Gerät von Li-Cor. Dieser Scanner registrierte Fluoreszenz in den beiden Wellenlängen 680 und 800 nm. TBS-Waschpuffer In 1 L Aqua dest Endkonzentration Tris-HCl 1,6 g 10 mM, pH 7,8 NaCl 8,8 g 150 mM 1 ml 0,1% TBS-T (Zusatz) Tween 20 Tabelle 10 TBS-Waschpuffer 32 5. Methoden Primär-Antikörper Isotyp Wirt Hersteller Anti-Human-α-Tubulin IgG1, monoklonal Maus Abcam Inc., MA, USA Anti-Human-E-Cadherin IgG, polyklonal Kaninchen Upstate, MA,USA Anti-Human-snail IgG, polyklonal Kaninchen Abcam Inc., MA, USA Anti-Human-S100A4 IgG, polyklonal Kaninchen Abcam Inc., MA, USA Anti-Human-GPR30 IgG, polyklonal Kaninchen Santa Cruz, CA, USA Anti-Human-CCR6 IgG, polyklonal Ziege Santa Cruz, CA, USA Anti-Rabbit IRDye 800CW IgG, polyklonal Esel Li-Cor Bioscences, NE, USA Anti-Rabbit IRDye 680 IgG, polyklonal Esel Li-Cor Bioscences, NE, USA Anti-Mouse IRDye 800CW IgG, polyklonal Esel Li-Cor Bioscences, NE, USA Anti-Mouse IRDye 680 IgG, polyklonal Esel Li-Cor Bioscences, NE, USA Anti-Goat IRDye 800CW IgG, polyklonal Esel Li-Cor Bioscences, NE, USA Sekundär-Antikörper Tabelle 11 Antikörper für Western Blot 5.4.4 Auswertung Zum Auswerten wurden die Proteinbanden auf dem Bild der eingescannten Membran durch Umrahmen markiert. Dann wurde mittels der Odyssee-Software die mittlere Intensität der Banden ermittelt. Abschließend wurden die Intensitäten der Zielproteine (targets) mit dem konstant exprimierten Haushälterprotein α-Tubulin (50 kDa) in Relation gesetzt. So konnte die relative Proteinexpression (rE) der Zielproteine im Vergleich zu α-Tubulin errechnet werden. Hierfür lautete die Formel: rE = Intensitättarget/Intensitätα-Tubulin, Wie bei der rt-PCR wurden die Werte der relativen Expression zum besseren Vergleich prozentual zu den Expressionswerten der Kontrolle berechnet. 33 5. Methoden 5.5 Chemotaxis in Boyden Chamber Für die Versuche zur Chemotaxis wurde die Chemotaxis Chamber von Neuro Probe® mit zehn Wells mit einer jeweiligen Filterfläche von 50 mm2 benutzt. Zuerst wurden in das untere Well 400 µl Nährmedium mit oder ohne Chemokin pipettiert. Danach wurde eine Polycarbonat-Membran mit einer Porengröße von 12 µm Durchmesser über die Wells aufgelegt. Anschließend wurde eine Silikonplatte aufgelegt und die Deckplatte der Kammer aufgeschraubt. In die oberen Wells wurden jeweils 20.000 Zellen in 285 µl Nährmedium gegeben. Als Negativkontrolle dienten Versuchsansätze ohne Chemokin im unteren Well, beziehungsweise Ansätze mit Chemokinen sowohl im unteren, wie im oberen Well, wodurch kein gerichteter Chemokingradient entstehen konnte. Die Boyden Chamber wurde im Brutschrank (37°C, 5% CO2) für 24 Stunden inkubert. Im Anschluss wurde die Kammer auseinander gebaut und die nicht gewanderten Zellen auf der Oberseite der Membran mit einem Gummischaber abgestreift. Die Zellen auf der Unterseite der Membran wurden für fünf Minuten in Methanol (>99,5%) fixiert. Die Färbung der Zellen erfolgte in 1%iger Kristallviolett-Lösung für mindestens 30 Minuten. Färbereste wurden mit destilliertem Wasser abgespült. Zur Untersuchung unter dem Lichtmikroskop wurden die Membranen auf einen Objektträger geklebt. Zur Auswertung wurden unter dem Lichtmikroskop pro Well zehn zufällig ausgewählte Membranausschnitte bei einer 200-fachen Vergrößerung fotografiert und die angefärbten Zellen wurden markiert und ausgezählt. Die Zellen, die in das untere Well durchgewandert waren, wurden stichprobenartig ausgezählt, um zu beurteilen, wie viele Zellen durch die Membran wanderten ohne an der Unterseite zu adhärieren. 34 5. Methoden 5.6 Cell Invasion Assay Mit einem weiteren Versuch sollte geklärt werden, inwiefern eine Stimulation mit CCL18 die A549-Zellen anregt, invasiv zu wachsen. Hierfür wurde das Cell Invasion Assay Kit ECM 550 (Chemicon International, Temecula CA, USA) benutzt. Der Versuchsaufbau war analog zu den Migrationsversuchen in der Boyden Chamber (Kapitel 5.5). Im Unterschied zu den Chemotaxis-Versuchen war die Membran jedoch beim Cell Invasion Assay mit Kollagen verschlossen. So konnten nur Zellen durch die Membran hindurchwandern, die fähig waren, Proteinasen, insbesondere Kollagenasen, zu bilden. Als Porengröße wurde ein Durchmesser von 8 µm gewählt. Dafür wurde die Zahl der eingesetzten Zellen auf 200.000 erhöht. In das untere Well wurde Zellmedium mit/ohne Chemokin pipettiert. In die obere Kammer wurden je 200.000 Zellen in 300 µl Nährmedium zugegeben. Anschließend wurden die Kammern für die 24 Stunden Versuchszeit im Brutschrank (37°C, 5% CO2) aufbewahrt. Danach wurde das Medium aus dem oberen Well entfernt und die nicht-gewanderten Zellen von der oberen Membranseite mit einem Wattestäbchen abgeschabt. Nach 5-minütigem Fixieren in Methanol (>99,5%) wurden die gewanderten Zellen mit der im Kit enthaltenen Färbelösung für mindestens 20 Minuten gefärbt. Unter dem Lichtmikroskop wurden je zehn zufällig ausgewählte Bereiche der Membran bei einer 200-fachen Vergrößerung fotografiert und die Zellen ausgezählt. 5.7 Scratch Assay Die Zellmigration unter dem Einfluss von Chemokinen wurde in einem sogenannten Scratch Assay analysiert. Hierbei wird eine mechanische Narbe in einen Zellmonolayer gesetzt und im zeitlichen Verlauf beobachtet, wie schnell sich die künstliche Wunde verschließt. Hierfür wurden Zellen in eine 6-Well-Platte ausgesät, bis sie nahezu 80% Konfluenz erreichten. Dann wurde durch Kratzen (scratch) mit einer sterilen 200 µl Pipettenspitze eine artifizielle Wunde in dem Zellrasen erzeugt. Hierbei wurde auf eine gleichmäßige Druckausübung und Kratzgeschwindigkeit geachtet. Die Zellen wurden mit Chemokinen in den folgenden Konzentrationen stimuliert: TGF-β1 2 ng/ml, CCL18 0,1 ng/ml, CCL18 1 ng/ml, CCL18 10 ng/ml und CCL18 100 ng/ml. Daneben wurde eine Kontrolle ohne Chemokine angelegt. Die Migration in den zellfreien Raum wurde über 35 5. Methoden 24 Stunden beobachtet und mit mikroskopischen Aufnahmen unter dem Lichtmikroskop zu den Zeitpunkten 0, 6, 12 und 24 Stunden nach Erzeugung der Verletzung dokumentiert. Eine Markierung am Plattengrund sorgte dafür, dass immer der gleiche Abschnitt fotografiert wurde. Zur Auswertung wurde die Migrationsfront der Zellen auf den Fotos eingezeichnet. Die Distanz zwischen den Migrationsfronten wurde an insgesamt sechs Punkten gemessen. Die Migrationsgeschwindigkeit wurde durch Berechnung der Längendifferenz der verschiedenen Distanzen im zeitlichen Verlauf quantifiziert. 5.8 Zytotoxizitäts-Test Zur Untersuchung der Chemoresistenz von A549-Zellen gegenüber Cisplatin wurde ein Zytotoxizitäts-Test mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) durchgeführt. Das gelbe MTT ist ein Tetrazol, das in lebenden Zellen durch eine Reduktase zu einem blau-violetten Formazan reduziert wird. Da nur wachstumsfähige Zellen zu dieser enzymatischen Reaktion fähig sind, lässt die Messung des umgesetzten Farbstoffes direkte Rückschlüsse auf die Zahl der lebenden Zellen in einer Probe zu. Zu diesem Versuch wurden A549-Zellen, wie in Kapitel 5.2 beschrieben, mit CCL18 und TGFβ für 72 Stunden stimuliert. Anschließend wurden die stimulierten Zellen, sowie unstimulierte Kontroll-Zellen, in eine 96-Well-Platte ausgesät und für 24 Stunden im Brutschrank aufbewahrt (je 7000 Zellen pro Well). Danach erfolgte die Behandlung mit Cisplatin für weitere 72 Stunden. Dabei wurden im Nährmedium die folgenden Cisplatin-Konzentrationen erzielt: 0 µg/ml; 1,56 µg/ml; 3,125 µg/ml; 6,25 µg/ml; 12,5 µg/ml und 25 µg/ml. Nach diesen 72 Stunden wurde das Medium abgekippt und in jedes Well 20 µl MTT-Lösung (MTT 5 mg/ml in PBS) hinzugegeben, bevor die Platte für vier Stunden im Brutschrank inkubiert wurde. In dieser Zeit fand die Reduktion des MTT statt. Dann wurde die MTT-Lösung abgegossen, in jedes Well 150 µl vom MTT Solvent (Tabelle 12), einem Zelllysepuffer, pipettiert und die Platte für 15 Minuten auf den Schüttler gestellt. Hierbei wurde die Platte zum Schutz vor Licht in Alufolie verpackt. Nach Abschluss der Lyse wurde die Absorption vom MTT-Formazan bei einer Wellenlänge von 563 nm im Spektrophotometer (MRX Absorbance Reader, Dynex Technologies, USA) gemessen. Als Referenzfilter wurde eine Wellenlänge von 620 nm eingestellt. 36 5. Methoden MTT Solvent Endkonzentration Isopropanol > 99,5 % HCl 4 mM Triton X 0,1 % Tabelle 12 MTT Solvent Zur Auswertung wurde angenommen, dass die Proben, die nicht mit Cisplatin behandelt wurden, die maximale Anzahl an lebenden Zellen enthielten. Die gemessene Absorption dieser Proben wurde als Maximalwert für die Anzahl lebender Zellen, also als High Control, beziehungsweise 100% Überleben, festgelegt. So konnte die Anzahl an Zellen nach Behandlung mit Cisplatin im Verhältnis zu der Anzahl unbehandelter Zellen dargestellt werden. Die Rechnung für den prozentualen Anteil lebender Zellen (N) lautete wie folgt: N = AbsorptionCisplatin treated cells/Absorptionuntreated cells*100. Abschließend wurde die Cisplatin-Dosis bei der 50 Prozent der Zellen starben, graphisch bestimmt. Dieser Wert wird auch als Letale Dosis 50, kurz LD50, bezeichnet. 5.9 BRDU-Proliferationstest Die Proliferationsgeschwindigkeit von A549-Zellen unter CCL18- und TGF-β1Stimulation wurde mithilfe des BRDU-Proliferationstests ermittelt. Bromdesoxyuridin (BRDU) ist ein chemisches Analogon von Thymidin. Während der Zellreplikation wird, durch eine DNA-Polymerase phosphoryliertes BRDU anstelle von Desoxythymidintriphosphat (dTTP) als Nukleotid in den neu entstehenden DNA-Strang eingebaut. Die Quantifizierung des eingebauten BRDU erfolgt dann in einem ELISA-Verfahren. Ein BRDU-spezifischer, Peroxidase-gekoppelter Antikörper, bindet an das in die DNA integrierte BRDU. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation von 3,3’,5,5’–Tetramethylbenzidin (TMB). Der bei der Oxidation dieses Substrats entstandene blaue Farbstoff wird durch das Abstoppen der Reaktion mit Schwefelsäure im sauren Milieu gelb und kann dann spektrophotometrisch gemessen werden. Die Menge an Farbstoff korreliert dabei mit der Menge an integriertem BRDU und damit auch mit der Zahl an neu gebildeten Zellen und ist damit ein Maß für die Proliferationsgeschwindigkeit. 37 5. Methoden Für diesen Versuch wurden je 20.000 A549-Zellen in 50 µl Nährmedium in eine 96-WellPlatte ausgesät. Nach 24 Stunden Adhärieren wurden CCL18 und TGF-β1 hinzugefügt und die gewünschten Konzentrationen eingestellt. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden im Brutschrank wurden in jedes Well 5 µl einer BRDU-enthaltenden Lösung (Tabelle 13) hinzugefügt und die Zellen für weitere 24 Stunden inkubiert, damit das BRDU während der Zellreplikation in die DNA eingebaut werden konnte. 100-fach BRDU-Stammlösung Bromdesoxyuridin 38 mg Desoxycytidin 28,5 mg DMEM-Medium 10 ml Tabelle 13 BRDU-Stammlösung Das ungebundene BRDU wurde durch dreimaliges Waschen mit einer Lösung aus PBS und 0,05% Tween20 aus den Zellen gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 70% eiskaltem Ethanol fixiert und zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Platten durch abdampfen getrocknet und können so einige Zeit bis zur BRDU Messung aufbewahrt werden. Zur Messung werden dann die Zellen während fünf Minuten in der Mikrowelle denaturiert und erneut drei Mal gewaschen. Die Zellen konnten nun mit je 25 µl/Well des BRDU-spezifischen und Peroxidase-gekoppelten Antikörpers für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Ungebundene Antikörper wurden danach durch drei weitere Waschschritte aus den Zellen gespült. Die Enzymreaktion wurde gestartet, indem 100 µl einer Substratlösung (pH 4,9), bestehend aus 3,3’,5,5’– Tetramethylbenzidin (TMB) und Natriumacetat-Citrat-Puffer, auf die Zellen pipettiert wurden. Die Farbreaktion wurde nach 20-30 Minuten mit dem Farbumschlag mit 50 µl Schwefelsäure (H2SO4, 1 M) gestoppt. Die Optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm Wellenlänge und eine Referenzwellenlänge von 595 nm im Spektrophotometer gemessen. Die Proliferationsrate der stimulierten im Verhältnis zu den unstimulierten Zellen wurde errechnet, indem der Quotient aus den jeweiligen Absorptionen gebildet wurde. Die relative Proliferationsrate wurde demnach wie folgt errechnet: rR = (Absorptionstimulierte Zellen-AbsorptionHintergrund)/(Absorptionunstimulierte Zellen-AbsorptionHintergrund). 38 5. Methoden 5.10 Statistische Auswertung Zur statistischen Auswertung der Ergebnisse konnte aufgrund der geringen Anzahl der Tests (n=3-5) keine Normalverteilung der Messwerte angenommen werden. Aus diesem Grund wurde auf eine nicht-parametrische Statistikmethode zurückgegriffen. Zur Prüfung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse wurde der Friedman Test durchgeführt, gefolgt von einem Paarvergleich mittels Wilcoxon-Vorzeichen-Rang Test. Verglichen wurden die Ergebnisse jeweils mit dem Ergebnis der Kontrolle aus unstimulierten Zellen. Als statistisch signifikant wurden Ergebnisse angesehen, bei denen der p-Wert unter 0,05 lag. Die Ergebnisse wurden graphisch in Säulendiagrammen dargestellt. Dabei zeigen die Bilder Mittelwerte ± eine Standartabweichung (SD). 39 6. Ergebnisse 6. Ergebnisse 6.1 Morphologische Veränderung der A549-Zellen unter Stimulation Zur Beantwortung der Frage, ob CCL18 eine epithelial to mesenchymal transition (EMT) bei Adenokarzinomzellen der Lunge induzieren kann, wurden die in Tabelle 1 dargestellten Kriterien als Maßstab herangezogen. Als Erstes wurden die morphologischen Veränderungen der A549-Zellen unter Stimulation beobachtet. Als Positiv-Kontrolle diente eine Stimulation mit dem bekannten EMT-Induktor TGF-β1 (Kasai et al., 2005; Wendt et al., 2009) in einer Konzentration von 2 ng/ml. Abbildung 3 zeigt A549-Zellen nach 72 Stunden der Stimulation in 125-facher Vergrößerung. Unstimuliert (Bild1) zeigten die A549-Zellen einen typisch epithelialen Phänotyp mit polygonal geformten Zellen. Sie waren optisch durch enge Zell-Zell-Kontakte miteinander verbunden und bildeten ein kopfsteinpflasterartiges Muster. In der Positiv-Kontrolle mit TGF-β1 (Bild 2) zeichneten sich die Zellen durch ein spindelförmiges, in die Länge gezogenes und mit langen Ausläufern versehenes Aussehen aus. Die Adenokarzinom-Zellen hatten einen fibroblasten-ähnlichen, typisch mesenchymalen Phänotyp angenommen. Auch unter der Stimulation mit CCL18 (Bild 3 bis 6) veränderten die A549-Zellen ihre Morphologie. Ähnlich wie unter TGF-β1-Stimulation haben die Zellen ihre engen Zellkontakte aufgegeben und sind in einem lockeren Zellverbund weitergewachsen. Einzelne Zellen begannen, sich aus dem Zellverbund zu lösen und sich von den Nachbarzellen abzugrenzen. Viele Zellen bekamen lange Ausläufer und die Zellkörper wurden in die Länge gezogen. Über die 72 Stunden der Stimulation nahmen immer mehr Zellen einen spindelförmigen Phänotyp an. Die morphologischen Veränderungen waren nach 72 Stunden bei der höchsten CCL18-Konzentration, die hier mit 100 ng/ml gewählt wurde, am stärksten ausgeprägt. 40 6. Ergebnisse ① unstimuliert ③ CCL18 0,1 ng/ml ⑤ CCL18 10 ng/ml ② TGFß1 2 ng/ml ④ CCL18 1 ng/ml ⑥ CCL18 100ng/ml Abbildung 3 Zellmorphologie nach 72 h Stimulation Typische Zellen und Zellausläufer sind mit Pfeilen markiert. 125-fache Vergrößerung 41 6. Ergebnisse 6.2 Expression der EMT-Marker E-Cadherin, snail1 und S100A4 6.2.1 E-Cadherin In der rt-PCR zeigten sich stark schwankende Expressionswerte von E-Cadherin relativ zu GAPDH. In Abbildung 4 sind die Expressionswerte relativ zur Kontrolle nach 24 und nach 72 Stunden Stimulation dargestellt. Die Ergebnisse sind in Prozentwerten relativ zur Kontrolle dargestellt. Die Expression der Kontrolle wurde auf 100% festelegt. Es wird ersichtlich, dass CCL18 die E-Cadherin-Expression maximal in einer Konzentration von 1 ng/ml senkte. Die relative Expression sank auf 79±29% nach 24 Stunden und auf 71±35% nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden. Unter TGF-β1 sank die Expression auf 71±31% nach 24 Stunden. Die relative E-Cadherin-Repression wurde bereits nach 24 Stunden maximal gesenkt. Unter dem Einfluss von 0,1 ng/ml CCL18 erreichte die Expression nach 72 Stunden wieder annähernd ihren Ausgangswert. Insgesamt war dementsprechend eine geringe Hemmung der E-Cadherin-Expression durch CCL18 und 140 A E-Cadherin (Prozent der Kontrolle) E-Cadherin (Prozent der Kontrolle) TGF-β1 zu beobachten. Die Effekte waren jedoch statistisch nicht signifikant. 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 140 B 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 Abbildung 4 E-Cadherin-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR A) nach 24 h Stimulation (n=4) B) nach 72 h Stimulation (n=3) Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben. 42 E-Cadherin (Prozent der Kontrolle) 6. Ergebnisse 120 A B 100 kDa 80 150 CCL18 TGF-ß Kontrolle 2ng/ml 0,1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml E-Cadherin 60 100 40 20 50 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml α-Tubulin CCL18 Abbildung 5 E-Cadherin-Expression im Western Blot A) E-Cadherin-Expression relativ zu α-Tubulin in Prozent der Kontrolle B) Abbildung der Proteinbanden: E-Cadherin (140 kDa), α-Tubulin (50 kDa) Stimulationsdauer 72 h. Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben (n=4). Im Western Blot bestätigten sich die Ergebnisse aus der rt-PCR (Abbildung 5). Die Quantifizierung des E-Cadherin (140 kDa) Nachweises erfolgte relativ zur α-TubulinExpression (50 kDa). Durch die Stimulation der Zellen über 72 Stunden mit CCL18 wurde weniger E-Cadherin produziert. Es konnte eine durchschnittliche Verminderung des E-Cadherin-Proteins um 20% festgestellt werden. Konzentrationsabhängige Effekte des CCL18 konnten nicht beobachtet werden. In den Konzentrationen zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml hemmte CCL18 die E-Cadherin-Synthese minimal stärker als TGF-β1. Der Unterschied betrug im Schnitt jedoch nur 5%. Insgesamt bleibt festzuhalten, dass sowohl TGF-β1 2 ng/ml als auch CCL18, in Konzentrationen zwischen 0,1 ng/ml bis 100 ng/ml, die Expression von E-Cadherin geringfügig, um maximal 20% gegenüber unstimulierten A-549-Zellen, reduzierten. 43 6. Ergebnisse 6.2.2 snail1 B snail1 (Prozent der Kontrolle) snail1 (Prozent der Kontrolle) A 400 350 300 250 200 150 100 50 0 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Kontrolle TGFß 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 2ng/ml CCL18 Kontrolle TGFß 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 2ng/ml CCL18 Abbildung 6 snail1-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR A) nach 24 h Stimulation (n=4) B) nach 72 h Stimulation (n=4) Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben.. Mittels rt-PCR konnte nur eine sehr geringe relative Expression von snail1 gezeigt werden. In Abbildung 6 sind die Expressionswerte von snail1 nach 24 respektive 72 Stunden Inkubation mit den Chemokinen im Verhältnis zu den unstimulierten Zellen (Kontrolle) aufgeführt. In dieser Betrachtung ist zu erkennen, dass die relative Hochregulation von snail1 durch CCL18 im Vergleich zur Kontrolle bereits nach 24 Stunden ihr Maximum erreichte, genau wie durch TGF-β1-Stimulation. Durch die Darstellung relativ zur Kontrolle lässt sich keine Aussage über die absoluten Veränderungen der snail1-Expression treffen. Der höchste Expressions-Zugewinn wurde durch TGF-β1-Stimulation nach 24 Stunden erzielt, mit durchschnittlich 250±102% des Ausgangswertes. Der stärkste CCL18-Effekt wurde bei einer Konzentration von 1 ng/ml gemessen. Hier stieg die snail1-Expression im Mittel auf knapp 210±151% nach 24 Stunden. Die Hochregulation durch CCL18 hielt im Gegensatz zu TGF-β1 2 ng/ml auch noch nach 72 Stunden an. Hier wurden Werte um 180% gegenüber der Kontrolle erreicht. Die Ergebnisse waren statistisch nicht signifikant, die Tendenz einer zunehmenden snail1-Expression war jedoch in allen Versuchen erkennbar. 44 6. Ergebnisse snail1 (Prozent der Kontrolle) A 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 B p<0.005 kDa TGF-ß CCL18 Kontrolle 2ng/ml 0,1ng/ml1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 50 α-Tubulin 37 snail1 25 Kontrolle TGFß 2ng/ml 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 Abbildung 7 snail1-Expression im Western Blot A) snail1-Expression relativ zu α-Tubulin in Prozent der Kontrolle B) Abbildung der Proteinbanden: snail1 (29 kDa), α-Tubulin (50 kDa) Stimulationsdauer 72 h. Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben. (n=5). Im Western Blot (Abbildung 7) wurde die Proteinexpression nach 72 Stunden Stimulation gemessen. Wider Erwarten wurde keine Hochregulation der snail1-Synthese durch TGF-β1 beobachtet. Dagegen erhöhte CCL18 die Produktion von snail1 (29 kDa) um 20 bis 40 %. Den stärksten Effekt hatte ein Stimulus von 1 ng/ml CCL18, der die Proteinexpression um 40±24% erhöhte. Die CCL18-Effekte waren statistisch signifikant (p<0,005). Die exemplarisch dargestellten Proteinbanden sind unter CCL18-Stimulation deutlich stärker. 6.2.3 S100A4 Den stärksten Effekt hatte die CCL18-Stimulation auf die Expression von S100A4. In der rt-PCR stieg die relative S100A4-Expression nach 24 Stunden durch die Stimulation mit CCL18 (1 ng/ml) auf 260% der Kontrolle (n=4). Die Stimulation mit TGF-β1 (2 ng/ml) brachte erst nach 72 Stunden einen deutlichen Anstieg der Expression. Dieser Effekt wurde jedoch nochmals von CCL18 übertroffen. Durch die Darstellung der Expressionen relativ zur Kontrolle wurden die Effekte hervorgehoben (Abbildung 8). CCL18 steigerte in allen Konzentrationen die S100A4-Expression. Das Maximum wurde nach 72 Stunden bei einer CCL18-Konzentration von 1 ng/ml erreicht. Hier wurde eine Expression von durchschnittlich 461±167% des Ausgangswertes erzielt. In höheren CCL18- Konzentrationen war die Induktion von S100A4 weniger stark ausgeprägt. Doch auch hier stieg die Expression nochmals nach 72 Stunden gegenüber der 24-stündigen Stimu45 6. Ergebnisse lation an. Die Expressionswerte waren starken Schwankungen unterlegen, was sich in großen Standardabweichungen ausdrückt. Die CCL18-Effekte waren in allen Konzentrationen statistisch signifikant. Der p-Wert lag bei <0,006 nach 24 Stunden, beziehungsweise bei <0,03 nach 72 Stunden Stimulation. TGF-β1 hatte nur eine schwache Wirkung auf die S100A4-Expression. Die Expression lag nach 72 Stunden Stimulation 57% über dem Kontrollwert. B S100A4 (Prozent der Kontrolle) S100A4 (Prozent der Kontrolle) A p<0,006 600 500 400 300 200 100 0 p<0,03 600 500 400 300 200 100 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 Kontrolle TGFß 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 2ng/ml CCL18 Abbildung 8 S100A4-Expression relativ zur Kontrolle in der rt-PCR A) nach 24 h Stimulation (n=4) B) nach 72 h Stimulation (n=5) Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben. Durch Untersuchungen mittels Western Blot konnten die Ergebnisse aus der rt-PCR bestätigt werden. In allen Konzentrationen wurde die S100A4-Synthese durch CCL18 hochreguliert. In den exemplarisch ausgewählten Abbildungen sind die deutlich verbreiterten Proteinbanden unter CCL18-Einfluss zu erkennen. Im Gegensatz zu E-Cadherin und snail1 konnte bereits nach 24 Stunden Stimulation eine vermehrte Proteinmenge an S100A4 nachgewiesen werden, die statistisch allerdings nicht signifikant war. In Bezug auf die Proteinmenge unstimulierter Zellen steigerte CCL18 1 ng/ml die Proteinsynthese um den Faktor 2,2 nach 24 Stunden. Nach 72 Stunden Stimulation war eine signifikante, konzentrationsabhängige Steigerung der Proteinsynthese zu beobachten. Durch TGF-β1 2 ng/ml wurde die S100A4-Expression nur geringfügig hochreguliert. In Abbildung 9 sind die Expressionswerte von S100A4 relativ zur α-Tubulin-Konzentration und exemplarische Proteinbanden dargestellt. 46 6. Ergebnisse B S100A4 (Perozent der Kontrolle) A 250 TGF-ß kDa 200 50 150 α-Tubulin 100 15 50 10 S100A4 0 Kontrolle TGFß 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 2ng/ml CCL18 C S100A4 (Prozent der Kontrolle) CCL18 Kontrolle 2ng/ml 0,1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 250 D p<0.05 TGF-ß 200 kDa 150 CCL18 Kontrolle 2ng/ml 0,1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 50 α-Tubulin 100 15 50 10 S100A4 0 Kontrolle TGFß 0.1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 2ng/ml CCL18 Abbildung 9 S100A4-Expression im Western Blot - Stimulationsdauer 24 h (n=3): A) S100A4-Expression relativ zu α-Tubulin in Prozent der Kontrolle B) Proteinbanden: S100A4 (12 kDa), α-Tubulin (50 kDa) - Stimulationsdauer 72 h (n=6): C) S100A4-Expression relativ zu α-Tubulin in Prozent der Kontrolle D) Proteinbanden: S100A4 (12 kDa), α-Tubulin (50 kDa) Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben. 47 6. Ergebnisse 6.3 Chemotaktische Wirkung von CCL18 auf A549-Zellen Die zur Untersuchung der chemotaktischen Wirkung von CCL18 auf A549-Zellen durchgeführten Versuche in einer Boyden Chamber zeigten, dass bis zu 50% mehr Adenokarzinomzellen entlang des CCL18-Gradienten wanderten als ohne Stimulus. In der unstimulierten Kontrolle wanderten im Schnitt 9,7±4,8 Zellen pro Gesichtsfeld durch die mit Poren versehene Membran. Durch die Gabe von CCL18 konnte ein signifikanter (p<0.0001) und direkt konzentrationsabhängiger Anstieg der migrierenden Zellen erzeugt werden. In dem Kontrollansatz ohne gerichteten Chemokin-Gradienten, mit CCL18 in beiden Wells, war mit durchschnittlich 10,6±3,7 gewanderten Zellen kein statistisch signifikanter Unterschied zu der Kontrolle festzustellen. Damit konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Migrationstendenz entlang des Gradienten CCL18-spezifisch und zielgerichtet war. Bei der höchsten CCL18-Konzentration (100 ng/ml) wurde mit 15,8±6,3 auch die höchste Anzahl migrierter Zellen gezählt (Abbildung 10). 25 Zellen pro Gesichtsfeld p<0.0001 20 15 10 5 0 Kontrolle Abbildung 10 TGFß 2ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 10ng/ml CCL18 oben&unten Zellen pro Gesichtsfeld nach 24 h Migration Auszählung von Membranausschnitten bei 200-facher Vergrößerung. Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben(n=4). Durch stichprobenartiges Auszählen des Mediums aus dem unteren Well, wurde überprüft, wie viele Zellen durch die Membran wanderten, ohne an dieser zu adhärieren. Dabei wurde erkannt, dass kaum Zellen durchwanderten und es somit zu keinem Einfluss auf das Ergebnis durch nicht-adhärente Zellen kam. Die in Abbildung 11 aufgezeigten Fotos sollen beispielhaft einen Eindruck von der Anzahl der gewanderten Zellen vermitteln. 48 6. Ergebnisse 200-fache Vergrößerung CCL18 100 ng/ml CCL18 10 ng/ml CCL18 1 ng/ml TGF-β1 2 ng/ml unstimuliert 125-fache Vergrößerung Abbildung 11 Zellmigration in der Boyden Chamber nach 24 h Fotos bei 125- und 200-facher Vergrößerung 49 6. Ergebnisse 6.4 Migrations- und Invasionseigenschaften Zur Untersuchung der Motilität von A549-Zellen unter CCL18-Stimulus wurde ein Scratch Assay durchgeführt. Dabei wurde über 24 Stunden dokumentiert, wie schnell die Zellen eine artifiziell zugefügte Narbe verschließen konnten. Durch Ausmessung der Abstände zwischen den Wachstumsfronten (Daten nicht dargestellt) konnte die Wachstumsgeschwindigkeit quantifiziert werden. Bei wiederholten Versuchsansätzen konnte kein verändertes Migrationsverhalten der Zellen unter CCL18- oder TGF-β1-Einfluss gegenüber der Kontrolle beobachtet werden. Die Wunden verschlossen sich nur unvollständig. CCL18 hatte damit kein Einfluss auf die Wundheilungsgeschwindigkeit. Abbildung 12 veranschaulicht den Versuch und die Beobachtungen. 12 h 24 h CCL18 100ng/ml CCL18 1ng/ml TGFß 2ng/ml Unstimuliert 0h Abbildung 12 Beobachtung der Zellmigration im Scratch Assay über 24 h Fotodokumentation zu den Zeitpunkten 0 h, 12 h und 24 h. (n=3) 50-fache Vergrößerung 50 6. Ergebnisse Ein weiterer Aspekt der EMT ist die Fähigkeit von Zellen, invasiv zu wachsen. Dies wurde mit einem „Invasion Assay“ untersucht, wobei die A549-Zellen durch Kollagen verschlossene Poren wandern mussten. Nach 24 Stunden Versuchsdauer wurden die gewanderten Zellen ausgezählt (Abbildung 13). Durch das Hinzufügen der Stimulanzien CCL18 und TGF-β1 konnte ein deutlicher Anstieg wandernder Zellen beobachtet werden. Ohne Stimulus wanderten im Schnitt 16±8 Zellen pro Gesichtsfeld. Diese Anzahl stieg auf 28,7±10,6 bei Stimulation mit TGF-β1 (2 ng/ml) und auf 36,6±15,6 bei Stimulation mit CCL18 (1 ng/ml). Alle CCL18-Konzentrationen förderten die Zellinvasion. Interessant war die Erkenntnis, dass im Vergleich zur Kontrolle auch vermehrt Zellen invasiv wuchsen, wenn kein CCL18-Gradient bestand. So wanderten auch dann mehr Zellen (22,1±9,7), wenn CCL18 (10 ng/ml) sowohl im oberen als auch im unteren Well vorhanden war. Die Unterschiede in der Invasivität zwischen den stimulierten Zellen und der Kontrolle waren statistisch signifikant (p<0,0001). Auch bei diesem Versuch wurde ein Durchwandern der Membran ohne Adhäsion durch stichprobenartiges Auswerten des Mediums aus dem unteren Well ausgeschlossen. Zellen pro Gesichtsfeld A 60 p=0.044 50 p<0.0001 40 30 20 10 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml CCL18 10ng/ml CCL18 oben&unten B unstimuliert Abbildung 13 TGFß 2ng/ml CCL18 1ng/ml Cell Invasion Assay nach 24 h A) Auszählung von Membranausschnitten bei 200-facher Vergrößerung. Die Messergebnisse sind als Mittelwert ± 1 SD angegeben (n=3). B) Drei exemplarische Membranausschnitte (125-fache Vergrößerung). 51 6. Ergebnisse 6.5 Chemoresistenz gegenüber Cisplatin Zu den EMT-Kriterien gehört auch die Resistenz gegenüber apoptotischen Stimuli. In einem Zytotoxizitäts-Test wurden A549-Zellen, die zuvor mit CCL18 stimuliert wurden, für 72 Stunden mit Cisplatin behandelt und danach die Anzahl der noch lebenden Zellen gemessen. Die Kurven der lebenden Zellen lagen nach einer Stimulation mit CCL18 0,1 ng/ml und 1 ng/ml über den Überlebenskurven der anderen Versuchsansätze (Abbildung 14). Zwischen den unstimulierten Zellen und der Stimulation mit TGF-β1 (2 ng/ml) war kein Unterschied zu sehen. Bei 1 ng/ml CCL18 konnte bei den A549-Zellen die höchste Resistenz gegenüber Cisplatin beobachtet werden. Prozent an lebenden Zellen Kontrolle TGFß1 2ng/ml CCL18 0,1ng/ml CCL18 1ng/ml Cisplatin [µg/ml] Abbildung 14 Zytotoxizitätstest, Cisplatin Behandlung für 72 h Darstellung der lebenden Zellen im Verhältnis zu unbehandelten Zellen (0 µg Cisplatin), graphische Bestimmung der LD50 (n=4). Die Letale Dosis 50 (LD59) bei den unstimulierten Zellen betrug etwa 6,5 µg/ml. CCL18 0,1 ng/ml steigerte die LD50 auf mehr als 9 µg/ml Cisplatin. Die LD50 nach einer Stimulation mit 1 ng/ml CCL18 lag bei über 10 µg/ml Cisplatin. Dies entspricht einer Steigerung der LD50 um über 50%. In einer anderen Betrachtung war erkennbar, dass nach der Behandlung mit 6,25 µg/ml Cisplatin nur noch 51,2±7,6% der unstimulierten Zellen lebten, was nahezu der LD50 entsprach. Unter der gleichen Konzentration Cisplatin überlebten 70,2±24,5% der Zellen, die zuvor mit 1 ng/ml CCL18 stimuliert worden waren. Die Anzahl überlebender Zellen nahm damit um 35% zu. 52 6. Ergebnisse 6.6 Proliferation unter Stimulation Zur Überprüfung ob die Stimulation mit CCL18 die Proliferationsgeschwindigkeit beeinflusst, wurde ein Proliferationstest mit BRDU durchgeführt. Die Messungen ergaben, dass mit steigender Chemokin-Konzentration die Zellen immer langsamer proliferierten (Abbildung 15). Die relative Proliferationsrate nahm unter CCL18-Einfluss konzentrationsabhängig ab und erreichte ein Minimum von 54±17% gegenüber der Kontrolle. TGFβ1 2 ng/ml hemmte die Proliferation noch etwas stärker. Hier lag die Anzahl der Zellen nach 24 Stunden bei 46±8%. Mit einem p-Wert ≤ 0,001 war die Proliferationshemmung Proliferationsrate (Prozent der Kontrolle) durch 2 ng/ml TGF-β1 und durch 1000 ng/ml CCL18 statistisch signifikant. Abbildung 15 160 140 p<0.001 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolle TGFß 2ng/ml 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 1000ng/ml CCL18 BRDU-Proliferationstest nach 24 h Stimulation Proliferationsrate relativ zur Kontrolle, (n=7) Die Messergebnisse sind mit einer Standardabweichung angegeben 53 6. Ergebnisse 6.7 Rezeptorstatus der A549-Zellen: GPR30, CCR6 und PITPNM3 Aufgrund der neuesten Erkenntnisse über die CCL18-Rezeptoren, die im Laufe dieser Arbeit publiziert wurden, erfolgte zur Vervollständigung der Arbeit eine Untersuchung der A549-Zellen auf die CCL18-Rezeptoren GPR30 (38 kDa) und CCR6 (48 kDa) mittels Western Blot. Beide Rezeptoren wurden von dieser Adenokarzinomzelllinie exprimiert (Abbildung 16). Als Positivkontrollen dienten für den GPR30 Mammakarzinomzellen der Linie MCF7 und für den CCR6 Lungenepithelzellen der Ratte (RLE), in welche CCR6 transfiziert wurde. Die Menge an exprimierten Rezeptoren war von einer vorausgegangenen Chemokin-Stimulation mit CCL18 oder TGF-β1 unabhänigig. In einer rt-PCR wurden die A549-Zellen auf den PITPNM3-Rezeptor untersucht. Dieser Rezeptor konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). B A TGF-ß kDa + Kontrolle unstim 2ng/ml TGF-ß CCL18 1ng/ml 100ng/ml kDa + Kontrolle unstim 2ng/ml CCL18 1ng/ml 100ng/ml 50 50 α-Tubulin α-Tubulin kDa 50 37 CCR6 Abbildung 16 GPR30 Rezeptorstatus der A549-Zellen A) CCR6 (48 kDa), α-Tubulin (50 kDa) B) GPR30 (38 kDa, α-Tubulin (50 kDa) Western Blot, Proteinlysate nach 72-stündiger Stimulation. (unstim = unstimulierte Zellen) 54 7. Diskussion 7. Diskussion 7.1 Einführung Das Lungenkarzinom ist weltweit das Malignom mit der höchsten Prävalenz und die häufigste tumorassoziierte Todesursache bei Männern (Jemal et al., 2011). Die Prognose für Patienten mit Lungenkrebs ist insgesamt schlecht. In der EUROCARE-4 Studie lag in den Jahren 2000-2002 die 5-Jahres-Überlebensrate für Lungenkrebspatienten in Europa bei 10,9% und in Deutschland bei 14,7% (Verdecchia et al., 2007). Diese stark eingeschränkte Prognose ist darauf zurückzuführen, dass das Lungenkarzinom meistens sehr aggressiv ist und schnell metastasiert. Aktuelle Therapieformen beinhalten die chirurgische Resektion, Chemotherapie und Bestrahlung. Diese Therapien wurden in jüngster Vergangenheit durch gezielte Tumortherapien (targeted therapy) mit zum Beispiel EGFR-Inhibitoren ergänzt (Yang, 2009). Die Rate an Lokalrezidiven, beziehungsweise das Auftreten von Metastasen, nach primär chirurgischer Therapie ist hoch. So wurde bei Patienten mit einem NSCLC im Stadium I nach Tumorresektion und Lymphadenektomie nach fünf Jahren follow up ein krankheitsfreies Überleben von 73% errechnet (Varlotto et al., 2009). Die Metastasierung ist der limitierende Faktor für die Therapie und die Prognose. Der Fakt, dass über 65% der nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinome erst in fortgeschrittenen Stadien (III und IV) diagnostiziert werden (Yang et al., 2005), zeigt wie wichtig es ist, Therapien zu entwickeln, die gezielt auf die Tumorbiologie abgestimmt sind. Ein Prozess, der bei der Metastasierung eine entscheidende Rolle spielt, ist die epithelial to mesenchymal transition (Yang und Weinberg, 2008; Thiery, 2009). Bei dieser EMT unterlaufen die Zellen einer Phänotypänderung, von einem epithelialen hin zu einem mesenchymalen Zellphänotyp. Dabei erlangen Zellen unter anderem die Fähigkeit zu migrieren, invasiv zu wachsen und Proteine der extrazellulären Matrix zu produzieren (Thiery, 2002; Kalluri und Weinberg, 2009). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob CCL18, ein vorwiegend von alternativ aktivierten Makrophagen produziertes Chemokin, eine EMT bei Adenokarzinomzellen der Lunge 55 7. Diskussion induzieren kann. Dazu wurden Zellen der Linie A549 mit verschiedenen CCL18Konzentrationen stimuliert und auf diverse EMT-Kriterien untersucht. Als Vergleichsgruppe dienten A549-Zellen, die mit TGF-β1, einem bekannten EMT-Induktor (Song, 2007; Wendt et al., 2009), behandelt wurden. 7.2 CCL18 als Induktor der „epithelial to mesenchymal transition“ CCL18 ist ein bekannter Induktor der Lungenfibrose (Prasse et al., 2006) und kommt in erhöhten Serumkonzentrationen sowohl bei Patienten mit Lungenfibrose (Prasse et al., 2007), als auch bei Patienten mit einem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (Plönes et al., 2012) vor. Aus Daten der Abteilung ging hervor, dass CCL18 bei Fibroblasten aus fibrotischen Lungen die Expression von Kollagen Typ I und αSMA hochreguliert (Zissel et al., 2011). Diese beiden Marker sind charakteristisch für Myofibroblasten. Demnach induziert CCL18 eine Phänotypänderung bei Fibroblasten, ähnlich wie sie bei der EMT von epithelialen Zellen abläuft. Des Weiteren sind Kollagen Typ I und αSMA, neben S100A4, Marker für eine heterogene Gruppe von tumor-assoziierten Fibroblasten (CAFs) (Sugimoto et al., 2006; Franco et al., 2010). Aus diesen Erkenntnissen ergab sich die Frage, welchen Einfluss CCL18 auf die Tumorprogression hat und ob CCL18 bei Lungenkarzinomzellen eine EMT induzieren kann. Der erste Aspekt, der betrachtet wurde, war die Zellmorphologie von A549-Zellen unter CCL18 Stimulation. Die typisch epithelialen Zellen gaben nach und nach ihre engen ZellZell-Kontakte auf und nahmen einen spindelförmigen, fibroblasten-ähnlichen, typisch mesenchymalen Phänotyp an. Diese zellmorphologischen Veränderungen waren unter allen CCL18-Konzentrationen etwa gleich ausgeprägt und nahmen über die 72 Stunden Stimulationsdauer zu. Die Phänotypänderungen unter CCL18-Einfluss waren identisch mit denen unter TGF-β1. Die Proliferationsrate der A549-Zellen wurde durch CCL18 konzentrationsabhängig vermindert. Vermutlich gingen weniger Zellen eine Mitose ein, da sie unter dem Zytokineinfluss eine große Syntheseleistung erbringen mussten. Diese Beobachtungen waren ein erster Hinweis auf eine EMT-Induktion durch CCL18 und wurden durch die Expressionsanalyse der EMT-Marker E-Cadherin, S100A4 und snail1 erweitert. 56 7. Diskussion 7.2.1 Expressionsanalyse von E-Cadherin, snail1 und S100A4 E-Cadherin ist als Protein der adherens junctions ein wesentlicher Bestandteil der ZellZell-Kontakte und damit ein wichtiger epithelialer Marker. Der E-Cadherin-Verlust ist einer der wichtigsten EMT-Kriterien (Zeisberg und Neilson, 2009) und Voraussetzung für invasives Wachstum von Tumorzellen (Birchmeier und Behrens, 1994). In unseren Versuchen wurde die E-Cadherin-Expression durch CCL18 um durchschnittlich 20% nach 72 Stunden Stimulation reduziert. Am stärksten hemmend wirkte CCL18 in einer Konzentration von 1 ng/ml. Dieser geringe Effekt war unter TGF-β1-Stimulation nicht stärker ausgeprägt als unter CCL18. Aus der Literatur ist bekannt, dass bei einer EMT in den meisten Tumoren, unter anderem dem Lungenkarzinom, eine Restproduktion an ECadherin bestehen bleibt und ein kompletter E-Cadherin-Verlust selten ist (Thiery, 2002). Die E-Cadherin-Reduktion ist auch von klinischer Bedeutung. Bei nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen geht der Verlust von E-Cadherin mit häufigeren Lymphknoten-Metastasen und einer ungünstigeren Prognose einher (Perl et al., 1998; Sulzer et al., 1998; Kase et al., 2000). Daneben hat die E-Cadherin-Expression einen positiven Einfluss auf das Überleben von Lungenkarzinom-Patienten die mit Gefitinib, einem EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor, behandelt werden (Miyanaga et al., 2008). Des Weiteren hängt der Differenzierungsgrad eines NSCLC vom E-Cadherin-Gehalt ab (Böhm et al., 1994; Kase et al., 2000). Oft wird die Tumorprogression mit der Überexpression von NCadherin in Verbindung gebracht. Beim gleichzeitigen Verlust von E-Cadherin, wird von einem Cadherin switch gesprochen. Dieses Phänomen kann allerdings nicht in allen Tumorentitäten festgestellt werden. Während der E-Cadherin-Verlust regelhaft stattfindet und einen der wichtigsten EMT-Kriterien darstellt, ist die Überexpression an N-Cadherin selten (Peinado et al., 2004). Bei den hier untersuchten A549-Zellen konnte kein NCadherin nachgewiesen werden, weder spontan noch nach Stimulation mit CCL18 (Daten nicht gezeigt). Die Schwierigkeit in der Bewertung der Messergebnisse war die stark schwankende Expression von E-Cadherin in den verschiedenen Versuchsansätzen. Neben einem möglichen Zusammenhang zwischen der E-Cadherin-Expression und der Wachstumsdichte des Zellrasens schien vor allem der Faktor Zeit eine wichtige Rolle zu spielen. Eine Erklärung für die geringe E-Cadherin-Repression könnte in einer zu kurzen Stimulations57 7. Diskussion dauer mit CCL18 liegen. Bevor E-Cadherin runterreguliert wird, müssen zuerst EMTinduzierende Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise snail1 (Batlle et al., 2000; Cano et al., 2000), hochreguliert werden, welche dann die Expression von E-Cadherin hemmen. Die für die Versuche gewählte Stimulationsdauer von 24 beziehungsweise 72 Stunden war zu kurz für eine vollständige E-Cadherin-Repression. In einer vergleichbaren Studie führte eine Stimulation von A549-Zellen mit TGF-β1 erst nach 30 Tagen zu einem kompletten Verlust des membranständigen E-Cadherins (Pirozzi et al., 2011). Dennoch konnte in dieser Arbeit eine, wenn auch geringe, E-Cadherin-Reduktion gezeigt werden, welche bereits nach kurzzeitiger Stimulation mit CCL18 feststellbar war. Dies kann deshalb als Hinweis auf eine EMT-Induktion durch CCL18 gewertet werden. Weiter wurde der EMT-Marker snail1, ein Transkriptionsfaktor mit einer zentralen Regulationsfunktion in der Induktions-Kaskade einer EMT, untersucht (Barrallo-Gimeno und Nieto, 2005). Snail1 wird vermehrt in Zellen der invasiven Wachstumsfront von epithelialen Tumoren nachgewiesen (Francí et al., 2006) und reprimiert unter anderem auch die Expression von E-Cadherin (Batlle et al., 2000; Cano et al., 2000). Durch den ECadherin-Verlust können sich die Zellen aus ihrem Verbund lösen. Somit triggert snail1 die Migrations- und Invasionsfähigkeiten von Tumorzellen (Peinado et al., 2004) über Veränderungen im Zytoskelett und durch Induktion von Matrixmetalloproteinasen (Miyoshi et al., 2005). Auch bei ausdifferenzierten mesenchymalen Zellen bleibt snail1 ein Regulator des invasiven Wachstums und der Angiogenese (Rowe et al., 2009). Aus klinischer Sicht bedeutet die E-Cadherin-Repression durch snail1 eine Dedifferenzierung des Tumors. Dies konnte sowohl bei Kolonkarzinomen (Pálmer et al., 2004), als auch bei Ovarial- und Mammakarzinomen (Elloul et al., 2005) gezeigt werden. Neben dem Tumorgrading korreliert die snail1-Expression beim Mammakarzinom auch positiv mit dem Lymphknotenstatus (Blanco et al., 2002). Mit ansteigender snail1-Expression steigt die Zahl der Tumorrezidive und das rezidivfreie Intervall wird verkürzt (Moody et al., 2005). Die Überexpression von snail1 in Lungenkarzinomen ist mit einem verkürzten Gesamtüberleben assoziiert. In einer retrospektiven Analyse lebten 50 Monate nach primärer Tumorresektion nur noch 60% der Patienten mit snail1-Überexpression, gegenüber 90% in der Kontrollgruppe (Hung et al., 2009). Auch bei anderen Tumorentitäten, wie beispielsweise dem Mammakarzinom (Elloul et al., 2005) oder dem hepatozellulären Karzinom (Miyoshi et al., 2005), verschlechterte snail1 die Überlebensprognose. 58 7. Diskussion In den untersuchten A549-Zellen war in der rt-PCR die Expression von snail1 relativ gering. Dies war jedoch zu erwarten, da Transkriptionsfaktoren insgesamt seltene Transkripte sind. Nach 24- und nach 72-stündiger CCL18-Stimulation stieg die snail1Expression sowohl auf mRNA, wie auch auf Proteinebene messbar an. Durch 2 ng/ml TGF-β1 wurde die snail1-Expression nach 24 Stunden hochreguliert. Nach 72 Stunden klang der Effekt aber bereits wieder ab. Obwohl in der Literatur berichtet (Peinado et al., 2003), schien TGF-β1 2 ng/ml keine Stimulation der snail1-Proteinsynthese auszulösen. Ein Grund hierfür könnte eine zu geringe Expression der TGF-β-Rezeptoren auf den A549-Zellen gewesen sein. Ein weiterer Grund könnte in einer zu niedrigen TGF-β1 Konzentration liegen, auch wenn in anderen Studien mit A549-Zellen eine Konzentration von 1 bis 5 ng/ml als ausreichend zur EMT-Induktion beschrieben wurde (Kasai et al., 2005; Kim et al., 2007). Wahrscheinlicher ist jedoch, dass der Stimulationseffekt durch TGF-β1 nach 72 Stunden nicht mehr auf Proteinebene nachweisbar war und die snail1-Synthese zwar schnell induziert, aber auch schnell wieder gestoppt wurde. Die rtPCR-Ergebnisse unterstützen diesen Erklärungsversuch. In Resektaten von Mammakarzinomen konnte gezeigt werden, dass insbesondere bei einem Tumorrezidiv snail1 die Expression von S100A4 hochreguliert (Moody et al., 2005). S100A4 ist ein weiteres Schlüsselprotein der EMT (Schneider et al., 2008). In dieser Arbeit erwies sich CCL18 als starker Induktor von S100A4. In der rt-PCR und im Western Blot steigerte der CCL18-Stimulus die S100A4-Expression statistisch signifikant in allen Konzentrationen. Im Vergleich dazu führte TGF-β1 nur zu einer schwachen S100A4-Induktion, obwohl diese bei Lungenendothelzellen bereits nachgewiesen werden konnte (Zeisberg et al., 2007). Auffällig war, dass die Induktion von S100A4 durch CCL18 nicht direkt dosisabhängig war. Nach einem Maximum bei 1 ng/ml fiel die induzierte S100A4-Expression bei 10 und 100 ng/ml CCL18 wieder ab. Wir deuteten dieses Phänomen als Indiz dafür, dass mehrere Rezeptoren für CCL18 auf den A549-Zellen vorhanden sind, die möglicherweise eine gegenläufige Signalkaskade induzieren. S100A4 kann sowohl intra- wie extrazelluläre Proteinfunktionen beeinflussen, die bei der Metastasierung eine Rolle spielen (Garrett et al., 2006). Die Mechanismen sind noch nicht eindeutig geklärt. Sicher ist, dass S100A4 mit verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts, zum Beispiel Tropomyosin (Takenaga et al., 1994) und Myosin IIA (Li und 59 7. Diskussion Bresnick, 2006) interagiert und die Myosin-Phosphorylierung durch die Proteinkinase C moduliert (Kriajevska et al., 1998). S100A4 scheint per se nicht kanzerogen zu sein (Ambartsumian et al., 1996), aber es ist an der Entstehung von Metastasen beteiligt (Helfman et al., 2005; Boye und Maelandsmo, 2010). Dabei beeinflusst S100A4 besonders die Migration und Invasion der Tumorzellen durch Induktion der Matrixmetalloproteinasen MMP2 (Mathisen et al., 2003), MMP9, MMP10 (Huang et al., 2011), MMP13 (SchmidtHansen et al., 2004) und MMP14 (Bjørnland et al., 1999). Daneben konnte in Tumorzellen der Maus gezeigt werden, dass die Expressionen von S100A4 und E-Cadherin gegenläufig reguliert sind (Keirsebilck et al., 1998). Das reduzierte E-Cadherin trägt zur erhöhten Migrationsfähigkeit der Zellen bei. Des Weiteren hatten Patienten mit einem Adenokarzinom der Lunge, welche die Kombination von E-Cadherin-Verlust und erhöhter S100A4-Expression im Tumorresektat aufwiesen, eine besonders schlechte Prognose (Miyazaki et al., 2006). Beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom korreliert die Tumorgröße (T-Stadium) und die Lymphknotenabsiedlung (N-Stadium) mit der S100A4Expression. Ein hochreguliertes S100A4 verschlechtert so die Prognose von NSCLCPatienten (Kimura et al., 2000). Auch in anderen Tumorentitäten, zum Beispiel dem Mammakarzinom (Rudland et al., 2000), dem Kolonkarzinom (Takenaga et al., 1997; Gongoll et al., 2002) und dem Magenkarzinom (Wang et al., 2010) beeinflusst S100A4 die Prognose ungünstig. Des Weiteren trägt S100A4 durch Interaktion mit dem Tumorsuppressor p53 zur Tumorprogression bei (Grigorian et al., 2001). 7.2.2 Einfluss von CCL18 auf das Migrations- und Invasions-Verhalten Nach den Erkenntnissen aus der Untersuchung der EMT-Marker, deren Hochregulation laut Literatur die Migrations- und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen fördert (Thompson und Newgreen, 2005; Christiansen und Rajasekaran, 2006; Guarino et al., 2007), konnten diese Eigenschaften in eigenen Versuchen verifiziert werden. Die chemotaktische Wirkung von CCL18 und TGF-β1 konnte in einem Versuch mittels Boyden Chamber, bei dem die A549-Zellen durch offene Poren durch eine Membran wanderten, beobachtet werden. Beide Chemokine führten zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Migration, wobei die chemotaktische Wirkung von CCL18 direkt konzentrationsabhängig war. 60 7. Diskussion Analog zu den Versuchen in der Boyden Chamber wandern die Zellen auch im InvasionsAssay durch eine Membran hindurch, wobei die Poren mit Kollagen verschlossen sind. Hier zeigte sich, dass sowohl TGF-β1, als auch CCL18, die Invasionsfähigkeit der A549Zellen signifikant erhöhen. Dabei steigerte CCL18 1ng/ml die Anzahl der invasiv gewanderten Zellen nach 24 Stunden auf 230% der Kontrolle. Durch den Versuchsaufbau, mit den Zytokinen im Ziel-Well ist ein Anteil der mehr gewanderten Zellen auf Chemotaxis zurückzuführen. Da jedoch auch ohne CCL18-Gradient (CCL18 10 ng/ml im oberen und unteren Well) mehr Zellen als in der Kontrolle wanderten, konnte sicher gezeigt werden, dass CCL18 die Fähigkeit von A549-Zellen invasiv zu wachsen erhöht. Die Befähigung zum invasiven Wachstum ist eine Voraussetzung für die Metastasierung von Malignomen. Die durchgeführten Untersuchungen geben somit Hinweise auf eine Beteiligung von CCL18 an der Entstehung von Metastasen von Adenokarzinomen der Lunge. Die Bedeutung der EMT bei der Entstehung von Metastasen ist Thema aktueller Diskussionen (Garber, 2008). Unter anderem liegt dies an der weit gefassten Definition von EMT. EMT funktioniert nicht nach dem Alles-oder-nichts-Prinzip. Vielmehr beschreibt der Begriff EMT multiple Mechanismen, die zur Metaplasie von einem epithelialen zu einem mesenchymalen Phänotyp führen (Thompson und Newgreen, 2005). EMT ist demnach ein dehnbarer Begriff für eine heterogene Gruppe an Prozessen, die zeitlich und örtlich unterschiedlich ablaufen können, teilweise nur partiell ablaufen und zudem reversibel sind (Voulgari und Pintzas, 2009). Hinzu kommt, dass es bis heute keine spezifischen Marker für EMT gibt, sondern dass summarisch verschiedene Prozesse betrachtet werden, was den Nachweis von EMT in vivo erschwert. Kritiker streiten zum Teil die Rolle der EMT bei der Tumorprogression komplett ab. Während zahlreiche in vitro Studien EMT-bedingte Veränderungen der Zellmorphologie und der Expression diverser Proteine zeigen konnten, wird insbesondere eine fehlende Evidenz für EMT in vivo bemängelt. Daneben wird argumentiert, dass Primärtumor und Metastase nach EMT der gewanderten Zellen unterschiedliche Histomorphologie aufweisen müssten (Tarin et al., 2005). Dem EMT-Konzept wird entgegen gehalten, dass nicht bei allen Malignomen eine EMT nachgewiesen werden konnte und dass zahlreiche Metastasen keine EMT-Merkmale aufweisen. Demnach wäre EMT nicht notwendig für eine Metastasierung (Christiansen und Rajasekaran, 2006). EMT ist ein seltenes Phäno61 7. Diskussion men. In einer in vitro Studie wurde nur bei 2 von 20 Zelllinien die mit TGF-β1, als bekannten EMT-Induktor, stimuliert wurden, eine komplette EMT beobachtet. Dabei konnte in den untersuchten humanen Zelllinien, zu denen auch A549 zählte, weder eine morphologische Phänotypänderung, noch ein E-Cadherin-Verlust beobachtet werden (Brown et al., 2004). Dagegen zeigten andere Studien eine EMT-Induktion durch TGF-β1 bei A549-Zellen (Kasai et al., 2005; Kim et al., 2007; Pirozzi et al., 2011). Trotz kritischer Stimmen gibt es zunehmende Evidenz für EMT bei der Karzinogenese (Thompson und Newgreen, 2005; Guarino et al., 2007). Für einen Zusammenhang von EMT und Metastasenbildung spricht die Tatsache, dass die veränderte Expression von EMT-Markern, wie die hier untersuchten E-Cadherin, snail1 und S100A4, mit einer geringen Differenzierung von Tumoren, vermehrten Metastasen und einer negativen Prognose einhergeht (Christiansen und Rajasekaran, 2006). Des Weiteren wurden durch histopathologische Untersuchungen auch in vivo morphologische Korrelate der EMT identifiziert. Im Kolonkarzinom wurde gezeigt, dass sich Zellaggregate aus dem Primärtumor lösen und in das umliegende Parenchym eindringen. Diese Ablösung von gruppierten Tumorzellen wurde als Tumor budding bezeichnet (Prall, 2007). Tumorzellen entwickeln im Verlauf der Tumorprogression diverse Mechanismen zur Migration und Invasion. Dabei könnte durch EMT eine Veränderung dieser Mechanismen erfolgen, von der Migration in Zellaggregaten, sogenannte Cluster, hin zu einzelnen Zellen die sich aus der Tumormasse lösen (Friedl und Wolf, 2003). Die stärkste Evidenz für EMT bei der Metastasenbildung wurde mit einem Tierversuch erbracht. In einer Mauslinie, die spontan multifokale Mammakarzinome und Lungenmetastasen entwickelte, konnte gezeigt werden, dass der EMT-Marker S100A4 mit einer erhöhten Zahl an Metastasen einhergeht. Die Expression von GFP wurde unter die Kontrolle des S100A4-Promoters gestellt. Zellen, die sich vom Primärtumor lösten, wurden GFP positiv. Da dies gleichbedeutend mit der S100A4-Expression war, konnte geschlussfolgert werden, dass diese invasiv wachsenden Zellen eine EMT vollzogen hatten. Die Injektion von GFP-positiven Zellen generierte vermehrt Metastasen. Wurde der S100A4-Promoter ausgeschaltet, unterliefen die Zellen keiner EMT und die Zahl der Metastasen wurde reduziert (Xue et al., 2003). Die meisten Metastasen von epithelialen Malignomen haben den gleichen Differenzierungsgrad und den gleichen histologischen Aufbau wie der Primärtumor. Diese sind ge62 7. Diskussion kennzeichnet durch eine organisierte epitheliale Zellstruktur. Wie diese Reorganisation der Tumorzellen in der Metastase nach einer EMT zustande kommt, könnten verschiedene Modelle erklären. In einem ersten Modell wird von einer Kooperation von Zellen in der Tumorperipherie, die eine EMT durchlaufen haben, und EMT-naiven Zellen im Tumorzentrum ausgegangen. EMT Zellen infiltrieren in die Gefäßwände und ermöglichen so EMT-naiven Zellen die Intravasation und die Absiedlung in einem anderen Organ. EMT-naive Zellen können alleine nicht ins Gefäßsystem eindringen, während hingegen EMT-Zellen nicht fähig sind, sich alleine in einem zweiten Organ anzusiedeln. Diese Theorie konnte mit einem Mausmodell unterstützt werden (Tsuji et al., 2009). Ein zweites Modell geht davon aus, dass EMT-Zellen nach Invasion in das Gewebe in ein Lymph- respektive ein Blutgefäß einbrechen, in einem anderen Organ wieder extravasieren und in diesem dann Mikrometastasen bilden. Durch den entgegengesetzten Prozess der EMT, nämlich einer mesenchymal to epithelial transition (MET), werden die Zellen wieder in ihren ursprünglichen epithelialen Phänotyp transformiert und bilden so Makrometastasen mit einer ähnlichen Histologie wie der Primärherd (Brabletz et al., 2001; Thiery, 2002). Dabei ist die MET, welche in Metastasen des kolorektalen Karzinoms (Brabletz et al., 2005) und des Mammakarzinoms (Bukholm et al., 2000) beobachtet werden konnte, durch eine Re-Expression von membranständigem E-Cadherin und dem Verlust an nuklearem β-Catenin gekennzeichnet. An Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass der E-Cadherin-Verlust reversibel ist und im Zuge einer EMT heterogen und transient abläuft (Graff et al., 2000). Diese Plastizität trägt zur Tumorprogression und womöglich auch zum Wechsel zwischen EMT und MET bei. Weiter ist davon auszugehen, dass nicht alle Zellen des Tumors eine EMT unterlaufen, sondern vor allem Zellen an der Tumorfront (Thompson und Newgreen, 2005). In den Zellen dieser invasiven Wachstumsfront ist eine für EMT charakteristische Expression diverser Marker zu beobachten. In diesen peripheren Tumorabschnitten wurde eine Hochregulation von snail1 (Francí et al., 2006), eine Herabregulation von E-Cadherin und die Akkumulation von β-Catenin in den Zellkernen (Brabletz et al., 2001) nachgewiesen. Dies spricht dafür, dass EMT und MET durch Interaktion mit dem Tumormilieu reguliert werden. Hierbei sind tumorassoziierte Fibroblasten und Makrophagen durch 63 7. Diskussion die Produktion von Wachstumsfaktoren (TGF-β1), Chemokinen (CCL18), Proteinen (Kollagene) und Enzymen (MMPs) der extrazellulären Matrix beteiligt (Guarino et al., 2007). Unklar bleibt auch, wie Tumorzellen der Immunabwehr in Blut- und Lymphbahnen entgehen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass CCL18 die Entstehung von regulatorischen T-Zellen (Treg), auch als Suppressor-T-Zellen bekannt, aus naiven T-Zellen und aus TGedächtniszellen induzieren kann. Diese Treg hemmen die Proliferation von Effektor-TZellen (Chang et al., 2010). Durch diesen immunsuppressiven Effekt könnte CCL18 bei der Toleranzentwicklung des Immunsystems gegenüber Tumorzellen mitwirken. Die Feststellung, dass CCL18 positive Chemotaxis auf Tumorzellen ausübt, ist auch im Hinblick auf die Organotropie von Tumoren sehr interessant. Zytokine wie CCL18, könnten, neben der Anatomie und der Architektur der Lymph- und Blutgefäße, dazu beitragen, dass verschiedene Tumore bevorzugt in unterschiedliche Organe metastasieren. Um die Rolle von CCL18 bei diesem tumor homing weiter aufzudecken, wäre eine Untersuchung der chemotaktischen Wirkung von CCL18 auf Zellen von Mamma-, Nierenzelloder Hodenkarzinomen interessant, da diese Tumore gehäuft Metastasen in der Lunge bilden, in der CCL18 in hoher Konzentration vorkommt. 7.2.3 Chemosensibilität unter CCL18-Stimulation Bei der Behandlung von NSCLC werden, neben der chirurgischen Resektion, vor allem platinhaltige Chemotherapeutika eingesetzt. Tumorzellen entwickeln diverse Strategien, um gegen diese Chemotherapeutika resistent zu werden. Dazu zählen ein erhöhter Efflux des Medikaments aus den Zellen, die Modifikation der Zielstruktur der Substanz durch Mutation und Substanz-Sequestration in spezifischen Zellkompartimenten (Chang, 2011). Beim NSCLC wurden eine enzymatische Inaktivierung von Platinderivaten durch Metallothioneine (Matsumoto et al., 1997) und die Aktivierung des DNAReparaturenzyms ERCC1 (excision repair cross complementation group 1) nachgewiesen. Dabei hatten ERCC1-negative Patienten, besonders beim Adenokarzinom, eine verbesserte Gesamtüberlebensrate gegenüber ERCC1-positiven Patienten (Olaussen et al., 2006; Li et al., 2009; Vilmar et al., 2010). 64 7. Diskussion Chemoresistenz von Tumoren wird auch im Zusammenhang mit einer epithelial to mesenchymal transition beobachtet (Voulgari und Pintzas, 2009; Iwatsuki et al., 2010). Sind Tumorzellen einem Chemotherapeutikum ausgesetzt, kann eine EMT induziert werden. So konnten sowohl die Paclitaxel-Resistenz beim Ovarialkarzinom (Kajiyama et al., 2007), die Gemcitabin-Resistenz von Pankreastumoren (Shah et al., 2007) als auch die Resistenz gegenüber Oxaliplatin beim Kolorektalen Karzinom (Yang et al., 2006) mit einer EMT assoziiert werden. Beim NSCLC wurde mit in vitro und in vivo Versuchen gezeigt, dass die Chemosensibilität gegenüber den EGFR-Kinase-Inhibitoren Erlotinib und Gefitinib abhängig vom EMT-Status und von der Expression epithelialer Marker wie ECadherin ist (Thomson et al., 2005; Yauch et al., 2005; Frederick et al., 2007). Zellen werden durch EMT resistenter gegen Apoptose (Thiery et al., 2009; Zeisberg und Neilson, 2009). An fetalen Hepatozyten der Ratte wurde festgestellt, dass die Zellen durch TGF-β1-Stimulation apoptotisch wurden und nur eine Subpopulation an Zellen, welche eine EMT durchmachten, überlebte (Valdés et al., 2002). Unter anderem induziert TGF-β den Transkriptionsfaktor snail1, der auch eine entscheidende Rolle bei der Chemoresistenz spielt (Thuault et al., 2006). Snail1 senkt durch Aktivierung von ERCC1 die Sensibilität gegenüber Cisplatin bei Zellen aus Tumoren aus dem Kopf- und Halsbereich (Hsu et al., 2010). Auch beim Pankreaskarzinom (Yin et al., 2007) und beim Ovarialkarzinom (Kajiyama et al., 2007) verstärkte snail1 die Chemoresistenz. Daneben hemmt snail1 die p53-vermittelte Apoptose beim Ovarialkarzinom (Kurrey et al., 2009). Am Beispiel von A549-Zellen konnte in vitro gezeigt werden, dass snail1 auch beim Adenokarzinom der Lunge die Resistenz gegenüber Cisplatin erhöht (Zhuo et al., 2008). Basierend auf der Feststellung, dass CCL18 snail1 induziert, wurde in dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass CCL18 die Chemoresistenz bei A549-Zellen erhöht. Untersucht wurde die Chemosensibilität gegenüber Cisplatin, das Bestandteil der Standardchemotherapie beim NSCLC ist. Bei vorrausgehender Stimulation mit CCL18 1 ng/ml und 0,1 ng/ml waren die Zellen, gemessen an der Letalen Dosis 50, deutlich resistenter gegen eine 72-stündige Cisplatin-Behandlung als die Kontrolle. TGF-β1 und höhere CCL18-Konzentrationen hatten keinen Einfluss auf die Chemosensibilität. 65 7. Diskussion 7.3 CCL18-Rezeptoren und Tumorprogression Bisher wurden drei Rezeptoren für CCL18 identifiziert: GPR30, PITPNM3 und CCR6. Die Expression von GPR30 und CCR6 konnte mittels Western Blot in den hier untersuchten A549-Zellen nachgewiesen werden. Der PITPNM3-Rezeptor war in den A549Adenokarzinomzellen der Lunge nicht nachweisbar (Daten nicht aufgeführt). Daneben scheint PITPNM3 als CCL18-Rezeptor noch nicht sicher identifiziert zu sein, da er nur fünf transmembranäre Domänen aufweist. In der Regel binden Chemokine, wie CCL18, an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit sieben transmembranären Domänen (Zlotnik und Yoshie, 2000). Als erster CCL18-Rezeptor wurde GPR30 beschrieben. Es wurde beobachtet, dass CCL18 die CXCR4-vermittelte Chemotaxis bei Vorläuferzellen einer akuten lymphatischen BZell Leukämie hemmt und deren Proliferationsrate senkt (Catusse et al., 2010). Allerdings induziert CCL18 keine Internalisierung des GPR30, was dafür spricht, dass CCL18 keine klassische Chemokin/Rezeptor-Bindung mit GPR30 eingeht (Catusse et al., 2010). CXCR4 konnte auf den hier untersuchten A549-Zellen nicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). GPR30 ist ein bekannter Rezeptor für Östrogene, wie 17β-Estradiol, sowie für den selektiven GPR30-Agonisten G-1, Östrogen-Antagonisten und SERMs (z.B. Tamoxifen) (Prossnitz und Maggiolini, 2009) und ist an der Progression von Karzinomen beteiligt (Maggiolini und Picard, 2010). So werden die proliferativen Effekte von 17β-Estradiol und Hydroxytamoxifen auf Zellen des Endometriumkarzinoms durch GPR30 vermittelt (Vivacqua et al., 2006). Die agonistische Wirkung von Tamoxifen auf GPR30 könnte das erhöhte Risiko für Endometriumkarzinome sowie die Resistenzentwicklung bei der Brustkrebstherapie mit Tamoxifen erklären (Ignatov et al., 2011). Die Überexpression von GPR30 wurde mit einem aggressiven Tumorwachstum und einer erniedrigten Überlebensrate beim Endometrium- und Ovarialkarzinom assoziiert (Smith et al., 2007, 2009). Daneben wurde beim Mammakarzinom die Überexpression von GPR30 mit einer Tumorgröße über 2 cm, der Überexpression von Her-2/neu und einem erhöhten Metastasenrisiko assoziiert (Filardo et al., 2006). Östrogene wirken auch auf NSCLC, die neben den klassischen Östrogenrezeptoren ERα und ERβ auch GPR30 stark exprimieren (Siegfried et al., 2009). Auch die Interaktion zwischen Östrogenrezeptoren und dem EGF-Rezeptor ist bekannt. So konnte in Brustkrebszellen die Transaktivierung 66 7. Diskussion von EGFR durch GPR30 nachgewiesen werden (Filardo et al., 2000). EGF wiederum induziert den GPR30 in Östrogenrezeptor-negativen Brustkrebszellen (Albanito et al., 2008). Ob diese Interaktion an der Resistenzentwicklung von NSCLC gegenüber EGFRTyrosinkinase-Inhibitoren beteiligt ist, wurde bisher nicht untersucht. Allerdings konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Hemmung von Östrogenrezeptoren und EGFR die hemmenden Effekte auf die Proliferation von NSCLC verstärkt (Stabile et al., 2005). In Untersuchungen der Abteilung wurde CCR6 als CCL18-Rezeptor identifiziert (Zissel et al. 2011). Wie bereits erwähnt, wurden in diesen Versuchen die EMT-Marker αSMA und Kollagen Typ I bei Fibroblasten aus der Lunge von Patienten mit idiopathischer pulmonaler Fibrose (IPF) durch CCL18 hochreguliert. Diese EMT-Induktion durch CCL18 war CCR6-vermittelt. Nach diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass auch die in dieser Arbeit beschriebene EMT-Induktion über den CCR6-Rezeptor vermittelt wurde. Bisher war als einziger Ligand für CCR6 das CCL20 bekannt. Die CCL20/CCR6Achse ist unter anderem an der Immunantwort gegen Tumorzellen beteiligt (Schutyser et al., 2003). Die Effekte von CCR6 auf Tumorprogression und Prognose sind kontrovers diskutiert. Einige Studien schreiben CCR6 eine protektive Funktion bei der Tumorprogression zu. So wurde gezeigt, dass CCR6 in Lymphknotenmetastasen von Kopf- und Halstumoren herunterreguliert ist (Wang et al., 2005). Weiter wurde die Zahl an Lungenkarzinom-Metastasen bei Mäusen durch die CCR6-Expression reduziert (Sutherland et al., 2007). Die Daten zum Zusammenhang zwischen der CCR6-Expression und der Prognose beim Adenokarzinom der Lunge sind gegensätzlich. Während eine Studie eine hohe CCR6-Expression mit einem verkürzten krankheitsfreien Überleben assoziierte (Kirshberg et al., 2011), wies eine andere Studie bei hoher CCR6-Expression eine erniedrigte Anzahl an Rezidiven nach (Minamiya et al., 2011). Unterschiede in den Ergebnissen sind am ehesten auf die Methode zurückzuführen. Neben der Auswahl der Patienten, ist vor allem die Wahl des cut-off-Wertes für die Einteilung in die beiden Gruppen „niedrige“ und „hohe“ CCR6-Expression ein Kritikpunkt. Des Weiteren wurde eine Gesamtrezidivrate unabhängig vom initialen Tumorstadium berechnet, was einen Vergleich der beiden Studien erschwert. Weitere Studien assoziierten CCR6 mit einem aggressiven Tumorwachstum und Metastasenbildung. Demnach wurde beim NSCLC eine Überexpression von CCR6 in Nebennieren-Metastasen nachgewiesen (Raynaud et al., 2010). CCR6 ist bei Pankreaskarzinomen hochreguliert (Rubie et al., 2010), an der Metastasie67 7. Diskussion rung des Kolonkarzinoms in die Leber beteiligt (Ghadjar et al., 2009) und mit einem verkürzten rezidivfreien Intervall beim Mammakarzinom assoziiert (Cassier et al., 2011). Weiter besteht ein Zusammenhang zwischen der CCR6-Expression und dem T-Stadium bei Prostatakarzinomen (Ghadjar et al., 2008). Die Untersuchung der Rezeptoren war in dieser Arbeit für die Interpretation der Ergebnisse wichtig. Die Expression der EMT-Marker zeigte eine Regulation durch CCL18, die nicht direkt konzentrationsabhängig war. Die stärkste EMT-Induktion wurde mit einer Konzentration von 1 ng/ml CCL18 erreicht. Durch höhere CCL18-Konzentrationen wurde die EMT-Induktion wieder abgeschwächt. Mit Hilfe eines hypothetischen Modells mit mehreren CCL18-Rezeptoren könnte dieser Effekt erklärt werden. Dieses Modell beinhaltet mindestens zwei Rezeptoren mit unterschiedlicher Affinität für CCL18 und antagonistischer Wirkung. Bei exakt zwei Rezeptoren käme es zur folgenden Konstellation: während ein hochaffiner Rezeptor bereits durch niedrige CCL18-Konzentrationen aktiviert wird, benötigt die Aktivierung des zweiten Rezeptors höhere CCL18Konzentrationen. Dabei induzieren niedrige CCL18-Konzentrationen die EMT über den affinen Rezeptor. Höhere Konzentrationen aktivieren auch den zweiten Rezeptor, welcher die EMT-Induktion durch CCL18 wieder hemmt. Um herauszufinden, über welchen Rezeptor die EMT induziert wurde, müssen weitere Untersuchungen folgen. Zu klären bleibt, wie die Affinität der einzelnen Rezeptoren für CCL18 ist und ob eine Verhinderung der Rezeptoraktivierung (Blockade der CCL18Rezeptor-Bindung durch Antikörper oder Rezeptor-Knock-Out) die EMT-Induktion verhindert. Über welchen Rezeptor die CCL18-abhängige EMT in dieser Arbeit induziert wurde, kann nur spekuliert werden. Für den CCR6 spricht, dass bereits in anderen Untersuchungen eine CCR6-vermittelte Induktion von EMT-Markern (Kollagen Typ I und αSMA) beobachtet wurde (Zissel et al., 2011). 68 7. Diskussion 7.4 Ausblick Die aktuell verfügbaren Möglichkeiten, das Lungenkarzinom zu behandeln, sind nicht zufriedenstellend. Die insgesamt, für beide Geschlechter zusammen, häufigste Krebserkrankung weltweit (Jemal et al., 2011) hat eine stadienabhängige 5-JahresÜberlebensrate von durchschnittlich nur 10 bis 20% (Alberg et al., 2007; Verdecchia et al., 2007; Youlden et al., 2008). Die zumeist platinhaltigen Protokolle für eine systemische Therapie können das Tumorleiden nur bedingt bremsen und selten heilen (Schiller et al., 2002). Aus diesem Grund wird versucht zielgerichtete Medikamente zu entwickeln, die spezifisch auf die Tumorzellen wirken. Auch EMT-Induktoren werden als potentielle Zielproteine untersucht. Diese targeted therapy verspricht effektiver zu sein und weniger Nebenwirkungen hervorzurufen wie die konventionelle Chemotherapie. In den letzten Jahren fanden insbesondere Substanzen klinische Anwendung, die gegen den Rezeptor des epithelialen Wachstumsfaktor (EGF) gerichtet sind. Der EGFRInhibitor Erlotinib wurde zur Zweit- und Drittlinientherapie von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen eingesetzt und brachte einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber einem Placebopräparat (Shepherd et al., 2005). Ein weiterer TyrosinkinaseInhibitor ist das Gefitinib, das zur Erstlinientherapie bei Patienten mit einer aktivierenden EGFR-Mutation eingesetzt wurde. Die Prävalenz der Mutationen in Lungenkarzinomen liegt bei 8-20%. Die EGFR-Mutation ist ein positiver Prognosefaktor für das Gesamtüberleben und ein wichtiger Marker bei der Therapieentscheidung der Adenokarzinome (Ladanyi und Pao, 2008; Miyanaga et al., 2008). Die Mutationen wurden vorwiegend bei Nichtrauchern (66.6%), Frauen (69,7%) und Patienten mit einem Adenokarzinom (80,9%) gefunden (Rosell et al., 2009). In einer Studie in Ostasien mit Adenokarzinom-Patienten konnte mit Gefitinib ein 12-monatiges progressionsfreies Überleben von 24,9% gegenüber 6,7% bei einer Kombinationschemotherapie mit Carboplatin und Paclitaxel erzielt werden (Mok et al., 2009). Einschränkend gilt es zu erwähnen, dass trotz des sehr guten Ansprechens der Tumore auf die EGFR-Inhibitoren, diese Therapie nicht zu einer Senkung der Rezidivraten führte. Denn auch gegen die zielgerichteten Therapeutika entwickeln sich Resistenzmechanismen (Kosaka et al., 2011). So verlieren bei fortgeschrittener EMT, mit Verlust von E-Cadherin, auch EGFR-Kinase-Inhibitoren ihre Wirkung (Thomson et al., 2005; Yauch et al., 2005; Frederick et al., 2007). 69 7. Diskussion Bei der Progression einer malignen Erkrankung ist die Metastasenbildung ein entscheidendes Moment, da aus einer lokal begrenzten eine systemische Krankheit wird. Dies hat große Konsequenzen für Therapie und Prognose der Patienten. Die EMT ist an einer der ersten Etappen der Metastasenbildung beteiligt, bei der einzelne Tumorzellen die Fähigkeiten erlangen sich vom Primärtumor abzulösen, zu migrieren und invasiv zu wachsen. Diese Funktionen sind die Voraussetzung dafür, dass Tumorzellen in das umliegende Parenchym einwachsen und in Blut-/Lymphgefäße eindringen können. Diesen Prozess zu hemmen, ist eine potentielle Strategie, um die Metastasierung zu verhindern. Die Chemotherapie ist ein Hauptpfeiler der NSCLC-Therapie und bleibt häufig die einzige Therapieoption, da ein wesentlicher Anteil der Lungentumore erst in einem inoperablen Stadium diagnostiziert wird. In Zukunft könnten gegen EMT-Induktoren gerichtete Therapeutika als sensitizer eingesetzt werden, um Tumore empfindlicher gegenüber Chemotherapeutika zu machen und der Entwicklung von Resistenzen entgegenzuwirken. Ein weiterer Vorteil wäre, dass die Chemotherapeutika geringer dosiert werden könnten und somit auch die Häufigkeit und die Intensität der Nebenwirkungen gesenkt würden. Als Ziele für eine Verhinderung der EMT kommen extrazelluläre, wie intrazelluläre, EMT-Induktoren oder deren Rezeptoren in Betracht. Daneben könnten Therapien auf negativen EMT-Regulatoren wie dem Transkriptionsfaktor KLF17 basieren (Gumireddy et al., 2009). Auch die Suche nach endogenen EMT-Hemmern, wie sie während der Embryogenese vorkommen, ist ein vielversprechender Ansatz. Eine „Anti-EMT-Therapie“ könnte in Kombination mit einer etablierten Chemotherapie eingesetzt werden. In einem in vitro Versuch mit A549-Zellen führte eine Depletion von snail1 mittels siRNA zu einer erhöhten Sensibilität der Tumorzellen gegenüber Cisplatin (Zhuo et al., 2008). Auch S100A4 wurde als Zielprotein für eine antiinvasive Therapie identifiziert (Sherbet, 2009). Im Mausmodell mit Mammakarzinomzellen führte ein Knock-out von S100A4 zu einem signifikant reduzierten Tumorwachstum und zu geringerer Metastasierung (Grum-Schwensen et al., 2005). Auch die Hemmung der S100A4Transkription mit Calcimycin bei Kolonkarzinomen reduzierte in vitro die Zellmigration und –invasion und im Mausmodell die Metastasenbildung (Sack et al., 2011). 70 7. Diskussion Gegen den EMT-Induktor TGF-β wurden bereits Wirkstoffe entwickelt. Allerdings befinden sich diese noch in präklinischen Phasen der Entwicklung oder deren Wirksamkeit konnte nicht nachgewiesen werden. Bisher wurden drei unterschiedliche Strategien der TGF-β-Blockade erforscht (Biswas et al., 2006; Wrzesinski et al., 2007). Zum einen wurden monoklonale Antikörper gegen die verschiedenen TGF-β-Isoformen produziert (Benigni et al., 2003; Mead et al., 2003), zum anderen wurden small molecules zur Hemmung der TGF-β-Rezeptor-Tyrosinkinase (Alk5) entwickelt. Die dritte Strategie ist eine Form der Gentherapie mittels anti-sense Oligonukleotiden (AONs) (Bogdahn et al., 2011) oder RNA-Interferenz (Moore et al., 2008), durch welche die TGF-β-Synthese verhindert wird. Trotz des großen Potentials einer targeted therapy gegen TGF-β hat eine solche Therapie unerwünschte Nebenwirkungen. Dabei stellt die Unkenntnis der genauen immunmodulatorischen Funktionen von TGF-β das größte Problem dar. Die TGF-βInhibition könnte zu chronischen Entzündungs- oder Autoimmunreaktionen führen. Die Tumorsuppression durch TGF-β in frühen Tumorstadien würde durch diese Therapie gehemmt und prämaligne Läsionen könnten vermehrt entarten (Tian und Schiemann, 2009). In Tierexperimenten wurde aber noch keine Häufung von spontanen Tumorneubildungen durch TGF-β-Inhibitoren beobachtet (Arteaga, 2006; Massagué, 2008). Auch die Hemmung EMT-induzierender Transkriptionsfaktoren wird erforscht. So wurde in einem präklinischen Versuch das snail1-kodierende Gen SNAI1 mittels small interfering RNA (siRNA) blockiert. Dies führte zu der Reexpression von E-Cadherin im Sinne einer MET sowie zu der Inhibition der Invasivität und des Tumorwachstums (Olmeda et al., 2007). Allgemein ist die Inhibition der EMT ein neuartiges Therapiekonzept. Bei der Behandlung von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen könnte es in Zukunft eingesetzt werden, um bei Patienten mit einem lokalbegrenzten Tumor eine Metastasierung zu verhindern. In den fortgeschrittenen Stadien wäre ein Einsatz als Chemosensitizer zur effektiveren und nebenwirkungsärmeren Kombinations-Chemotherapie vorstellbar. Dies könnte zu einem verbesserten Überleben, einer Ersparnis an konventionellen Chemotherapeutika und zu weniger Nebenwirkungen führen. CCL18 wurde in dieser Arbeit als EMTInduktor beim Adenokarzinom der Lunge identifiziert und könnte daher Zielprotein neuartiger Therapeutika werden. 71 7. Diskussion 7.5 Fazit In der Zusammenschau aller Ergebnisse mit den EMT Kriterien (Tabelle 1), die in dieser Arbeit als Maßstab genommen wurden (Zeisberg und Neilson, 2009), kann geschlussfolgert werden, dass CCL18 ein potenter EMT-Induktor bei Tumorzellen ist. Beim Adenokarzinom der Lunge, für das in vitro die A549-Zelllinie benutzt wurde, änderte sich durch CCL18-Stimulus die Zellmorphologie zu einem spindelförmigen, fibroblastenähnlichen Phänotyp. Zum einen wurde die Expression des epithelialen Markers ECadherin herunterreguliert, zum anderen wurden S100A4 und der Transkriptionsfaktor snail1 hochreguliert. Des Weiteren wirkte CCL18 chemotaktisch auf die A549-Zellen und erhöhte deren Invasivität. In niedriger Konzentration machte CCL18 die Adenokarzinomzellen resistenter gegenüber Cisplatin. Dabei stellte sich eine CCL18-Konzentration von 1 ng/ml als Optimum für eine EMT-Induktion heraus. Bei dieser Konzentration waren die Invasion und die Chemoresistenz, sowie die relative Expression von S100A4 und snail1 maximal. Insgesamt wirkte CCL18 mindestens ebenso stark EMT-induzierend wie TGF-β1. Dabei waren die durch 1 ng/ml CCL18 induzierten Effekte sogar stärker als die durch TGF-β1 (2 ng/ml). Die nachgewiesenen Rezeptoren CCR6 und GPR30 sind mögliche Kandidaten für die Vermittlung der CCL18-abhängigen EMT-Induktion. Die Wirkung von CCL18, das von tumor-assoziierten Makrophagen sezerniert wird, auf die A549Zellen unterstreicht die Rolle des Tumormilieus bei der Tumorprogression. Der EMT-Induktor CCL18 könnte Ziel zukünftiger antiinvasiver Tumortherapien werden. Dabei ist CCL18 nicht nur ein potentielles Therapieziel bei nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (Plönes et al., 2012), sondern auch bei der Lungenfibrose (Prasse et al., 2006; Pochetuhen et al., 2007), der COPD (Sin et al., 2011) oder dem Asthma bronchiale (de Nadaï et al., 2006; Kim et al., 2009). 72 8. Literaturverzeichnis 8. Literaturverzeichnis Adema, G.J., Hartgers, F., Verstraten, R., de Vries, E., Marland, G., Menon, S., Foster, J., Xu, Y., Nooyen, P., McClanahan, T., et al. (1997). A dendritic-cell-derived C-C chemokine that preferentially attracts naive T cells. Nature 387, 713–717. Albanito, L., Sisci, D., Aquila, S., Brunelli, E., Vivacqua, A., Madeo, A., Lappano, R., Pandey, D.P., Picard, D., Mauro, L., et al. (2008). 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Thomas Brabletz danke ich für das Zweitgutachten. Ein besonderer Dank gilt meinem Betreuer, Herrn Dr. med. Till Plönes, für die Einarbeitung in die experimentelle Medizin, für seine Erreichbarkeit zu jeder Zeit, für die motivierenden Gespräche, wenn der Fortschritt der Arbeit stagnierte und für die Korrektur dieses Manuskriptes. Weiterhin bedanke ich mich bei allen Doktoranden, Diplomanden und Mitarbeitern des Labors für die gute Zusammenarbeit und die gute Stimmung innerhalb des Teams. Danke für die zahlreichen kleinen und großen Hilfestellungen, sei es bei der Anleitung zu einem neuen Verfahren, der Pflege der Zellkulturen oder der Suche nach verschollenen Chemikalien. Ein großer und herzlicher Dank gilt meinen Eltern, Romain und Josiane Scholtes, denen ich für ihre Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung danken möchte. Merci für alles! Genauso bedanke ich mich bei meinem Bruder Pol Scholtes, der stets ein offenes Ohr und einen guten Rat für mich hatte. Zum Schluss bedanke ich mich ganz besonders bei Christine Alle für ihre Unterstützung und Motivation, derer ich mir stets sicher sein konnte. Danke auch für das Korrekturlesen. 89 10. Publikationen 10. Publikationen 1. Ploenes T, Scholtes B, Krohn A, Burger M, Passlick B, et al. (2013) CC-Chemokine Ligand 18 Induces Epithelial to Mesenchymal Transition in Lung Cancer A549 Cells and Elevates the Invasive Potential. PLoS ONE 8(1): e53068.doi:10.1371/journal.pone.0053068 90
