Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss der In
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Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss der In-vitro-Maturationsbedingungen boviner Oozyten auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Nina Burmester-Kintrup Bremen Hannover 2014 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki Klinik für Rinder Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Derzeitige Adresse: Justus-Liebig-Universität Gießen, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß-und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz Dr. Nina Hambruch Institut für Anatomie 1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2014 Für Wolfgang Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 1. Einleitung ................................................................................................................ 1 2. Literatur .................................................................................................................. 3 2.1. Physiologische Grundlagen ............................................................................. 3 2.1.1. Eizell- und Follikelentwicklung ................................................................... 3 2.1.2. Kumulus-Oozyten-Komplex (KOK) ............................................................ 7 2.2. Steroidhormon Progesteron ........................................................................... 10 2.2.1. Bildung von Progesteron ......................................................................... 10 2.2.2. Progesteron im weiblichen Reproduktionstrakt ....................................... 11 2.3. Rezeptorformen ............................................................................................. 13 2.3.1. Extrazelluläre und nukleäre (intrazelluläre) Rezeptoren .......................... 13 2.4. Progesteronrezeptorarten .............................................................................. 14 2.4.1. Nuklearer Progesteronrezeptor ............................................................... 15 2.4.1.1. Genomische Wirkung des nuklearen Progesteronrezeptors ............. 15 2.4.1.2. Nicht-genomische Wirkungen des nuklearen Progesteronrezeptors 18 2.4.2. Membranprogesteronrezeptoren ............................................................. 19 2.4.3. Progesteronrezeptormembrankomponenten 1 und 2 .............................. 19 2.5. Wirkungen von Progesteron und seinen Rezeptoren ..................................... 20 2.6. In-vitro-Produktion von Embryonen ................................................................ 22 2.6.1. In-vitro-Maturation ................................................................................... 22 2.6.1.1. Eizellgewinnung ................................................................................ 23 2.6.1.2. Maturationsmedien und Zusätze ....................................................... 23 2.6.1.3. Sauerstoffkonzentration .................................................................... 25 2.6.1.4. Glukose im Reifungsmedium ............................................................ 28 2.6.1.5. Progesteron im Reifungsmedium ...................................................... 30 2.6.2. Probleme in der IVP ................................................................................ 31 2.7. MessengerRNA-Expression ........................................................................... 33 2.7.1. Progesteronrezeptor ................................................................................ 34 2.7.1.1. Nuklearer Progesteronrezeptor ......................................................... 34 2.7.1.2. Membranprogesteronrezeptoren....................................................... 37 2.7.1.3. Progesteronrezeptormembrankomponete 1 und 2............................ 37 2.7.2. Zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) ................................................. 38 2.7.3. Prostaglandin-Endoperoxidase Synthase 2 (PTGS2).............................. 39 2.7.4. Prostaglandin F2α Rezeptor (PTGFR) .................................................... 41 2.7.5. Enzyme in der Steroidgenese ................................................................. 42 2.7.5.1. Steroidogenic Acute Regulatory Protein (STAR) .............................. 42 2.7.5.2. Hydroxy-Delta-5-Steroid-Dehydrogenase (HSD3B) .......................... 43 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 2.7.5.3. P450, Familie 19, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP19A1) ................ 44 2.7.6. Follikelstimulierender Hormonrezeptor (FSHR) ....................................... 46 2.7.7. Luteinisierender Hormon/Choriongonadotropin-Rezeptor (LHCGR) ....... 47 2.7.8. Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) ............................................ 48 2.7.9. Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) ............................................... 49 2.7.10. Solute Carrier Family 2A Isoform 1 (SLC2A1) ....................................... 50 2.7.11. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) ................ 52 2.7.12. Endothelial PAS Domain Protein 1 (EPAS1 / HIF-2α) ........................... 54 2.8. Proteinexpression .......................................................................................... 56 2.8.1. Methoden zur Analyse der Proteinexpression ......................................... 56 2.8.2. Proteinanalysen in Oozyten und Kumuluszellen ..................................... 59 2.8.3. Zeitlicher Ablauf der Proteinexpression in Oozyten während der ----------------Reifung .................................................................................................... 61 2.8.4. Proteinexpression der Progesteronrezeptoren ........................................ 63 3. Material und Methoden ......................................................................................... 68 3.1. Gewinnung der Kumulus-Oozyten-Komplexe ................................................ 68 3.2. In-vitro-Maturation .......................................................................................... 70 3.2.1. Ölüberschichtetes Reifungsmedium ........................................................ 70 3.2.2. Reifungsmedium ohne Silikonölüberschichtung ...................................... 71 3.2.3. Sauerstoffkonzentration........................................................................... 72 3.2.4. Entfernung der Kumuluszellen................................................................. 72 3.2.5. ................................................................................................................. 72 3.3. Reifungskontrolle der Oozyten ....................................................................... 73 3.3.1. Fixierung der Oozyten ............................................................................. 73 3.3.2. Färbung der Oozyten............................................................................... 73 3.4. MessengerRNA-Analyse ................................................................................ 75 3.4.1. Isolierung der MessengerRNA ................................................................ 75 3.4.2. Isolierung der Gesamt-RNA .................................................................... 76 3.4.3. Reverse Transkription (RT) ..................................................................... 77 3.4.4. Quantitative real-time Polymerase Kettenreaktion (qPCR)...................... 80 3.5. Proteinanalyse ............................................................................................... 88 3.5.1. Gelelektrophorese ................................................................................... 88 3.5.2. Probenaufbereitung ................................................................................. 89 3.5.2.1. Proteinisolation aus Gewebeproben ................................................. 89 3.5.2.2. Proteinisolation aus Kumulus- und Eizellen ...................................... 91 3.5.3. Western Blot ............................................................................................ 91 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 3.5.4. Ladungskontrolle ..................................................................................... 93 3.5.5. Antikörper ................................................................................................ 94 3.5.5.1. Auswahl des nuklearen Progesteronrezeptor-Antikörpers ................ 94 3.5.5.2. Eingesetzte Antikörper ...................................................................... 94 3.5.6. Semi-quantitative Bestimmung des nPR-Proteins ................................... 96 3.6. Ermittlung der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium ...................... 97 3.7. Statistische Auswertung ................................................................................. 99 3.8. Versuchsaufbau ........................................................................................... 100 4. Ergebnisse.......................................................................................................... 102 4.1. Reifungskontrolle ......................................................................................... 102 4.2. Darstellung der mRNA-Expression ausgewählter Gentranskripte ................ 102 4.2.1. mRNA-Expression spezifischer Gentranskripte in Kumuluszellen ......... 102 4.2.2. MessengerRNA-Expression spezifischer Gentranskripte in Oozyten .... 106 4.3. Proteinexpression ........................................................................................ 109 4.3.1. Nuklearer Progesteronrezeptor ............................................................. 109 4.3.1.1. Proteinexpression des nPRs in Kumuluszellen ............................... 109 4.3.1.2. Proteinexpression des nPRs in Oozyten ......................................... 112 4.4. Progesterongehalt im Reifungsmedium ....................................................... 115 5. Diskussion .......................................................................................................... 116 5.1. Beurteilung der Kernreifung ......................................................................... 118 5.2. Progesterongehalt im Reifungsmedium ....................................................... 119 5.3. Genexpression in bovinen Oozyten und Kumuluszellen .............................. 121 5.3.1. Genexpression in Kumuluszellen .......................................................... 122 5.3.1.1. Expression von STAR, CYP19A1 und HSD3B1 ............................. 122 5.3.1.2. Expression des LHCGR und FSHR in Kumuluszellen .................... 124 5.3.1.3. Expression der cPLA2 und PTGS2 in Kumuluszellen ..................... 124 5.3.1.4. Expression des PTGFR in Kumuluszellen ...................................... 126 5.3.1.5. Expression des PPARγ in Kumuluszellen ....................................... 126 5.3.1.6. Expression des PGR in Kumuluszellen ........................................... 127 5.3.2. Genexpression in bovinen Oozyten ....................................................... 127 5.3.2.1. Expression des BMP15 und GDF9 in Oozyten ............................... 127 5.3.2.2. Expression des SLC2A1 in Oozyten ............................................... 128 5.3.2.3. Expression des EPAS1 in Oozyten ................................................. 129 5.3.2.4. Expression der PGRMC1 und 2 in Oozyten .................................... 130 5.3.2.5. Expression des PGR in Oozyten..................................................... 131 5.3.2.6. Expression des PAQR5 in Oozyten ................................................ 132 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 5.4. Proteinexpression des nuklearen Progesteronrezeptors.............................. 132 5.5. Schlussfolgerung ......................................................................................... 137 6. Zusammenfassung ............................................................................................ 141 7. Summary ............................................................................................................ 144 8. Verzeichnisse ..................................................................................................... 147 8.1. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ 147 8.2. Verzeichnis der Tabellen.............................................................................. 151 8.3. Abbildungsverzeichnis ................................................................................. 154 9. Anhang ............................................................................................................... 156 9.1. Medien ......................................................................................................... 156 9.1.1. Medien für KOK Gewinnung und IVM.................................................... 156 9.1.2. Medien für Reifungskontrolle ................................................................. 158 9.1.3. Medien für MessengerRNA-Analyse ..................................................... 159 9.1.4. Medien für Western Blot ........................................................................ 161 9.1.5. Verbrauchsmaterialen ........................................................................... 164 9.1.6. Geräte ................................................................................................... 165 10. Literaturverzeichnis .......................................................................................... 166 Einleitung ___________________________________________________________________ 1. Einleitung In den letzten 25 Jahren hat die Reproduktionsbiotechnologie große Fortschritte erlangt (WRENZYCKI et al. 2001, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2006). Die Invitro-Produktion (IVP) hat sich bei Rinderembryonen als eine bewährte Alternative zu konventionellen Techniken der Superovulation und als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der frühen Embryonalentwicklung vor der Implantation herausgestellt (BAVISTER 1995). Die IVP setzt sich aus den drei Teilschritten In-vitro-Maturation (IVM), -Fertilisation (IVF) und -Kultivierung (IVC) zusammen. Studien belegen, dass die Qualität in vitro produzierter Embryonen geringer ist als die von In-vivo-Embryonen (RIZOS et al. 2002a, LONERGAN et al. 2006, MERTON et al. 2003, WRENZYCKI et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2005). Wird die Anzahl der eingesetzten Oozyten betrachtet, entwickeln sich in der IVP prozentual gesehen weniger Embryonen im Vergleich zu den In-vivo-Verhältnissen. Daher lässt sich vermuten, dass unter anderem (u.a.) die bislang verwendeten Reifungsbedingungen den wichtigen Prozess der Eizellreifung nicht adäquat unterstützen (RIZOS et al. 2002b, LONERGAN et al. 2003c, PREIS et al. 2007, CAIXETA et al. 2013, SALHAB et al. 2013). In vivo verändert zirka (ca.) 24 Stunden vor der Ovulation der Luteinisierungs-HormonPeak (LH-Peak) die Steroidhormonkonzentration (von Östrogen zu Progesteron) in der Follikelflüssigkeit. Kurz vor der Ovulation bildet Progesteron ca. 90% der intrafollikulären Steroidhormonmenge (DIELEMAN et al. 1983, OSBORN u. MOOR 1983). Dies ist ein Hinweis darauf, dass eine feine Abstimmung von Steroidhormonen, insbesondere von Progesteron, für die Reifung der Oozyte notwendig ist (SIROTKIN 1992, SILVA u. KNIGHT 2000, ROBKER et al. 2009). In der Regel wird in der IVM das Reifungsmedium mit Öl überschichtet. Da es sich bei Progesteron um ein lipophiles Steroidhormon handelt, diffundiert das durch Kumuluszellen sezernierte Progesteron in das Öl (SHIMADA et al. 2002). Daher wurde in der vorliegenden Studie ölüberschichtetes bzw. nicht-ölüberschichtetes Maturationsmedium eingesetzt, um den Einfluss der Progesteronkonzentration im Medium auf die Kernreifung boviner Oozyten zu untersuchen. Die Wirkungen von Progesteron werden auf genomischem und/oder nichtgenomischem Weg sowohl durch nukleäre als auch durch membran-assoziierte 1 Einleitung ___________________________________________________________________ Rezeptoren vermittelt. Während der Maturation wirkt Progesteron vermutlich über 3 verschiedenen Rezeptoren: (1) Membran-Progesteronrezeptor (mPR), (2) Progesteronrezeptor-Membran-Komponenten 1 & 2 (PGRMC1 und 2) und (3) nukleärer Progesteronrezeptor (nPR, PELUSO 2006, ZHU et al. 2008). Studien bezüglich dieser Rezeptoren erfolgten u.a. auf Messenger Ribonucleic Acid (mRNA)und Protein-Ebene (HILD-PETITO et al. 1988, ROBKER et al. 2000, SHIMADA et al. 2004b, CLEMENTE et al. 2009, APARICIO et al. 2011, SALHAB et al. 2011). Nicht nur der Einfluss von Progesteron auf die Reifung der Oozyte, sondern auch die Identität beziehungsweise (bzw.) Mechanismen der einzelnen Progesteronrezeptoren werden kontrovers diskutiert. In dieser Arbeit liegt daher der Fokus auf der Darstellung der relativen Proteinmenge des nPRs und dem daraus abzuleitenden Effekt von Progesteron auf die Kernreifung der bovinen Oozyte. Während der Maturation ist auch die Sauerstoffkonzentration von großer Bedeutung (LONERGAN et al. 1999, KHURANA u. NIEMANN 2000, VAN SOOM et al. 2002). In der bovinen Follikelflüssigkeit wird die Sauerstoffkonzentration (O2-Konzentration) auf <5 bis 14% (FISCHER et al. 1992, VAN BLERKOM et al. 1997, REDDING et al. 2006) geschätzt. Die IVM boviner Eizellen findet bislang unter 20% Sauerstoff (O2), also in einer höheren O2-Konzentration als in vivo statt. Aus Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass eine steigende O2-Konzentration eine hohe Anzahl von Sauerstoffradikalen generiert. Diese Radikale haben wahrscheinlich einen direkten, zum Teil negativen Einfluss auf das Überleben der Gameten (LONERGAN et al. 1999, KHURANA u. NIEMANN 2000, VAN SOOM et al. 2002). Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Analyse des Effektes der Sauerstoffkonzentration auf die relative Proteinmenge des nPRs. Die Ergebnisse der Studie sollen zur kontinuierlichen Verbesserung der IVM beitragen, um in Zukunft in der IVP qualitativ ähnlich hochwertige Embryonen wie in vivo erzeugen zu können. 2 Literatur 2. Literatur 2.1. Physiologische Grundlagen 2.1.1. Eizell- und Follikelentwicklung Die Funktionen des bovinen Ovars sind die Bereitstellung von befruchtungsfähigen, entwicklungskompetenten Oozyten und die Sekretion von Steroidhormonen (KNIGHT u. GLISTER 2006). Die Eizell- und Follikelentwicklung beginnt beim Säugetier bereits vor der Geburt. Zwischen dem 75. und 80. Tag post konzeptionem beginnt bei den Eizellen des bovinen Embryos die Prophase der 1. Reifeteilung. Zirka um den 170. Tag post konzeptionem arretiert die Eizelle im Diplotänstadium der Prophase der 1. Reifeteilung (MeioseI [MI]). Die Oozyte wird von einigen Prä-Granulosazellen umgeben und diese Einheit wird als Primordialfollikel bezeichnet. Der Primordialfollikel bleibt bis zum Zeitpunkt der Pubertät und somit bis zum Einsetzten des Östruszyklus in einem Ruhezustand (ERICKSON 1966, RÜSSE u. SINOWATZ 1998, SCHNORR u. KRESSIN 2001, KNIGHT u. GLISTER 2006). Die Regulation der zyklischen Aktivität des bovinen Ovars (einschließlich der Follikelentwicklung), erfolgt über positive und negative Rückkopplungsmechanismen der Hormone der Hypothalamus-HypophysenAchse (Gonadotrophin Releasing Hormone [GnRH], Follikelstimulierends Hormon [FSH] und LH) und des Ovars (Progesteron, Östradiol und Inhibin, [ROCHE 1996, GRUNERT u. DE KRUIF 1999]). Eine schematische Darstellung dieser Mechanismen zeigt die Abbildung 1. 3 Literatur Abbildung 1: Neuro-endokriner Steuerregelkreis der Sexualfunktion beim weiblichen Rind nach Erreichen der Geschlechtsreife (GRUNERT u. DE KRUIF 1999) Ox=Oxytocin, PGF2α=Prostaglandin F2α, Prog=Progesteron Im nachfolgenden wird die Follikelentwicklung beim Rind näher beschrieben. Eine niedrige Frequenz der pulsatilen GnRH-Ausschüttung stimuliert die Freisetzung von FSH aus dem Hypophysenvorderlappen. FSH bewirkt das parallele Wachstum mehrerer Primordialfollikel (ADAMS et al. 1992, SUNDERLAND et al. 1994, GRUNERT 1996, RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die Weiterentwicklung des Primordialfollikels zum Primärfollikel ist charakterisiert durch die Transformation und Proliferation der Granulosazellen (HULSHOF et al. 1994, BRAW-TAL u. YOSSEFI 1997, FAIR et al. 1997). Kennzeichnend für die Entwicklung zum Sekundärfollikel ist u.a. eine zweite Lage von Granulosazellen an der Follikelwand. Die Umorganisation, auch als Prä-Maturation bezeichnet, vom Sekundär- zum Tertiärfollikel beinhaltet die Verlagerung der Oozyte an den Follikelrand, die Proliferation und Differenzierung der 4 Literatur Follikelzellen in Theca interna und externa, die Basallamina und die Kumuluszellen sowie die Bildung eines flüssigkeitsgefüllten Hohlraumes. Die Oozyte selbst bildet mit den sie umgebenen Kumuluszellen am Rand des Follikels den Kumulus oophorus (HYTTEL 1997, RÜSSE u. SINOWATZ 1998, SCHNORR u. KRESSIN 2001). Wenn einer der Follikel eine Größe von 8 bis 9 Millimeter (mm) und somit das Stadium der Dominanz (FAIR et al. 1997, FAIR 2003) erreicht, nimmt dieser Follikel, angeregt durch FSH, beträchtlich an Größe zu (SAVIO et al. 1988, RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die weitere Entwicklung des dominanten Follikels ist von der pulsatilen LH-Frequenz abhängig. Zum Zeitpunkt der Gelbkörperphase sind erhöhte Progesteronwerte vorhanden, die Pulsfrequenz von LH ist niedrig und der Follikel atresiert. Das Wachstum einer neuen Follikelwelle unter FSH-Einfluss beginnt. Abbildung 2 zeigt Folikeldurchmesser (mm) FSH oder P4 Konzentration schematisch die Hormonverhältnisse während des Zykluses. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Hormonkonzentrationen und des Wachstums von Follikeln (FORDE et al. 2011) FSH=Follikelstimulierendes Hormon (schwarze Linie), P4=Progesteron (hellgraue Linie), LH=Luteinisierungshormon Bei Nichtvorliegen einer Trächtigkeit und damit verbunden die fehlende Sekretion von Interferon Ʈ durch den Embryo wird ab Zyklustag 17 vom Endometrium Prostaglandin F2α (PGF2α) gebildet. PGF2α bewirkt im Ovar die Freisetzung von Oxytocin, welches 5 Literatur im Uterus eine vermehrte Ausschüttung von PGF2α auslöst. Dieser Mechanismus löst die Rückbildung des Gelbkörpers und einen Abfall in der Progesteronkonzentration im Blutplasma aus (HANSEL u. CONVEY 1983, GRUNERT 1996, GRUNERT u. DE KRUIF 1999). Das Absinken der peripheren Progesteronkonzentration induziert eine Ausschüttung von GnRH (FRANDSON et al. 2009). Die präovulatorische GnRHFreisetzung hat einen Anstieg in der FSH-Ausschüttung zur Folge (SUNDERLAND et al. 1994). Dies führt wiederum zu einer Erhöhung der Östradiolkonzentration in der follikulären Flüssigkeit (HILLIER 1994). Östradiol hemmt via negativem Rückkopplungsmechanismus die FSH-Freisetzung im Hypophysenvorderlappen (SUNDERLAND et al. 1994, GINTHER et al. 2000). Die Pulsfrequenz der LH-Sekretion steigt an (SUNDERLAND et al. 1994, FORTUNE et al. 2009) und stimuliert die finale Reifung des Tertiärfollikels zum Graafschen Follikel (RAHE et al. 1980, GRUNERT 1996, ROCHE 1996, GRUNERT u. DE KRUIF 1999, FORTUNE et al. 2009). Dieser Vorgang ist charakterisiert durch die Expansion der die Oozyte umgebenen Kumuluszellen und die Wiederaufnahme der Meiose der Eizelle. Die Kernmembran löst sich auf. Es findet eine Kondensation der Chromosomen statt und die 1. Reifeteilung endet mit der Ausschleussung des Polkörperchens in den perivittelinen Raum. Die Oozyte arretiert erneut in der Metaphase der 2. Reifeteilung (MeioseII [MII], HYTTEL et al. 1986, 1989, 1997). Die Ovulation des Graffschen Follikels erfolgt, wenn eine basale Progesteronkonzentration (< 1ng/ml, GRUNERT u. DE KRUIF 1999) im Serum und eine erhöhte LH-Sekretionsfrequenz für 2 bis 3 Tage vorliegt (ROCHE 1996). Zum Zeitpunkt der Ovulation befindet sich die bovine Oozyte in MII-Stadium (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Beispielhaft sind die Funktionsgebilde am Rinderovar im Diöstrus in der Abbildung 3 dargestellt. Der frisch ovulierte Follikel ist aufgrund des Zyklusstadiums nicht abgebildet. 6 Literatur Abbildung 3: Schematische Darstellung der Funktionsgebilde im Ovar des Rindes im Stadium des Diöstrus (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) 1=Primordialfollikel, 2=Primärfollikel, 3=junger Sekundärfollikel, 4=reifer Sekundärfollikel, 5=Antrumbildung im jungen Tertiärfollikel, 6=großer Tertiärfollikel, 7=Cumulus oophorus, 8=Eizelle, 9=Follikelzellen, 10=Theka folliculi, 11=atretischer Follikel, 12=Corpus luteum im Blütestadium, 13=Ateria ovarica, 14=Vena ovarica, 15=Lymphgefäße, 16=Nervenfasern des vegetativen Nervensystems 2.1.2. Kumulus-Oozyten-Komplex (KOK) Die Eizelle bildet zusammen mit den Kumuluszellen den Kumulus-Oozyten-Komplex (KOK, MAKABE et al. 1992, MOTTA et al. 1995). In einer Untersuchung konnte festgestellt werden, dass die Entfernung der Kumuluszellen vor der IVF eine signifikante Verminderung der Teilungsrate von Embryonen zur Folge hat (FATEHI et 7 Literatur al. 2002). Sowohl für das Wachstum und die Entwicklung der Oozyte als auch für die Wiederaufnahme der Meiose in der Eizelle ist die Kommunikation zwischen Oozyte und Kumuluszellen essentiell (SIMON et al. 1997, HASHIMOTO et al. 1998, VOZZI et al. 2001, TANGHE et al. 2002, LUCIANO et al. 2005, GUTNISKY et al. 2007). Da der Eizelle der Gonadotropin-Rezeptor fehlt, wird der Effekt von FSH und LH auf die Eizellreifung über die Kumuluszellen ausgeübt (DEKEL u. BEERS 1978, EPPIG 1982, DEKEL 1988, DOWNS et al. 1988, BYSKOV et al. 1997). Ab dem Stadium des Sekundärfollikels bilden beim Rind die Kumuluszellen Fortsätze aus, die die Zona pellucida penetrieren und an das Oolemma angrenzen und auch in die Eizelle hineinreichen. Am Ende dieser Fortsätze befinden sich Gap junctions (EPPIG 1991, FAIR et al. 1997, WRIGHT et al. 2001). Auf diesem (via Gap junctions) und auf parakrinem Wege erfolgt die Kommunikation zwischen Oozyte und Kumuluszellen (ALBERTINI et al. 2001, SUTTON et al. 2003). In der Abbildung 4 sind schematisch die Kommunikationswege dargestellt. 8 Literatur Kumuluszellen zu Oozyte z.B. FF-MAS Gap junctions z.B. cAMP Purine/Pyrimidine Aminosäuren Metaboliten Oozyte zu Kumuluszellen z.B. Oocyte-secreted factors (GDF-9, BMP-15) Abbildung 4: Oozyten-Kumuluszell-Kommunikation (bi-direktional; SUTTON et al. 2003) Durchgehender Pfeil=parakrine Kommunikation, gestrichelter Pfeil=Kommunikation via Gap junctions, FF-MAS=follicular fluid meiosis-activating sterol, cAMP=cyclic adenosine monophosphate, GDF9=growth differentiation factor-9, BMP15=bone morphogenetic factor15 Einerseits findet durch die Gap junctions der Transport von Aminosäuren, Nukleotiden und Glukosemetaboliten, die das Wachstum der Oozyte gewährleisten, statt. Andererseits können Moleküle mit geringem Molekulargewicht, wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), die Gap junctions passieren und dadurch die Regulation der Eizellreifung beeinflussen (DEKEL u. BEERS 1980, SALUSTRI u. SIRACUSA 1983, EPPIG u. DOWNS 1984, RACOWSKY 1985, RACOWSKY u. SATTERLIE 1985, EPPIG 1991). Diese Aussage wird unterstützt durch eine Studie mit Mäusen, bei denen das Fehlen der Proteine Connexin37 oder Connexin43, die an der Bildung der Gap junctions beteiligt sind, zu einer beeinträchtigten Follikulogenese 9 Literatur und Oogenese führt (SIMON et al. 1997, ACKERT et al. 2001). Bei der IVM von bovinen KOKs verursacht die Hemmung der Connexin43-Proteinbildung eine Herabsetzung der Eizellreifungsrate um bis zu 50% (VOZZI et al. 2001). Gleichzeitig, mit der Weiterentwicklung der Eizelle zur Metaphase II, bilden die Kumuluszellen eine hoch viskoelastische extrazelluläre Matrix. Hauptbestandteil dieser Matrix ist Hyaluron. Dieser Vorgang wird als „Kumulusexpansion“ bezeichnet (SALUSTRI et al. 1989). Zum Zeitpunkt der Ovulation wird die bovine Eizelle mit ihren sie umgebenen expandierten Kumuluszellen aus dem Follikel freigesetzt (RÜSSE u. SINOWATZ 1998, NUTTINCK et al. 2008). 2.2. Steroidhormon Progesteron 2.2.1. Bildung von Progesteron Progesteron (Abbildung 5) ist ein Steroidhormon und der Gruppe der Sexualhormone zuzuordnen. Aufgrund der lipophilen Eigenschaft von Steroidhormonen ist Progesteron fähig, Zellmembranen zu penetrieren (HORN et al. 2003, KARLSON et al. 2005). CH3 C = O> Abbildung 5: Strukturformel Progesteron (HORN et al. 2003) 10 Literatur Die Biosynthese des Steroidhormons Progesteron findet abhängig von der Tierart im Ovar und/oder der Plazenta statt. Das Ausgangsprodukt dieses Syntheseweges ist das Cholesterin. Sein Transport von der äußeren zur inneren Mitochondrienmembran wird durch das Steroidogenic Acute Regulatory (STAR)-Protein vermittelt. Im weiteren erfolgt die Konversion von Cholesterin zu Pregnenolon durch das Zytochrom P450, Familie 11, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP11A1) Enzym, welches an der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert ist (SIMPSON 1979, HORN et al 2003). Dies findet bei Wiederkäuern in Theka- und Granulosazellen statt (FORTUNE u. HANSEL 1985, CONLEY u. BIRD 1997). Nachfolgend wird in den Thekazellen Pregnenolon einerseits durch die Zytochrom P450, Familie 17, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP17A1) zu Dehydroepiandrosteron und andererseits durch die Hydroxy-Delta-5-Steroid- Dehydrogenase (HSD3B1) zu Progesteron umgewandelt. Im weiteren Verlauf erfolgt die Metabolisierung von Dehydroepiandrosteron zu Androstenedion durch HSD3B1 (CONLEY u. BIRD 1997). Nach dem Eintritt von Androstenedion in die Granulosazellen wird es via der Zytochrom P450, Familie 19, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP19A1) zu Estron (SIMPSON u. DAVIS 2001) und weiter durch die Hydroxysteroid (17-Beta) Dehydrogenase 2 (HSD17B2) zu Östradiol-17β konvertiert (LUU-THE 2001). Zusätzlich erfolgt in Granulosazellen die Metabolisierung von Pregnenolon zu Progesteron durch die HSD3B1 (CONLEY u. BIRD 1997). 2.2.2. Progesteron im weiblichen Reproduktionstrakt Das Hormon Progesteron spielt eine zentrale Rolle bei der weiblichen Reproduktion (MULAC-JERICEVIC u. CONNEELY 2004). Es ist assoziiert mit der Etablierung und Aufrechterhaltung der Trächtigkeit (ULBERG 1951, MCDONALD et al. 1952, GRUNERT 1996), Entwicklung der Milchdrüsen und Regulierung des sexualbedingten Verhaltens (CLARKE u. SUTHERLAND 1990, LYDON et al. 1995). Im Ovar findet während der präovulatorischen Phase eine Änderung in der Steroidgenese vom Androgen/Östradiol produzierenden dominanten Follikel zum progesteronsezernierenden Corpus luteum statt (GRUNERT 1996, GRUNERT u. DE KRUIF 1999, DAVIS u. RUEDA 2002). Ungefähr 6 Stunden nach dem LH-Peak sinkt die Konzentration von Östradiol-17β. Gefolgt von einer abfallenden Androgen- und 11 Literatur steigenden Progesteronkonzentration. Zirka 18 Stunden nach LH-Peak besteht die Hormonzusammensetzung in der Follikelflüssigkeit zu 90% aus Progesteron (DIELEMAN et al. 1983, OSBORN u. MOOR 1983). Die Progesteronkonzentration in der bovinen Follikelflüssigkeit weist in Relation zum LH-Peak unterschiedliche Stufen auf: Vor dem LH-Peak 0,4 µmol/L 0 – 6 Stunden nach dem LH-Peak 0,7 µmol/L 6 – 20 Stunden nach dem LH-Peak 0,3 µmol/L 20 – 25 Stunden nach dem LH-Peak 1,5 µmol/L (DIELEMAN et al. 1983) Auch BRIDGES et al. (2006) dokumentieren, dass ungefähr 24 Stunden post LH-Peak ein zweiter Anstieg der Progesteronkonzentration in der bovinen Follikelflüssigkeit erfolgt. Diese Änderungen in der Hormonzusammensetzung der Follikelflüssigkeit implizieren, dass eine präzise Balance der Steroidhormonkonzentration für die vollständige Eizellreifung notwendig ist (MOOR et al. 1980, SILVA u. KNIGHT 2000, GARCIA-HERREROS et al. 2010). Im Gegensatz dazu ist eine Studie veröffentlicht worden, in der die intrafollikuläre Injektion von Trilostane (Hemmer der HSD3B1) in einen bovinen präovulatorischen Follikel weder die Ovulation selbst noch die Gelbkörperfunktion beeinträchtigt (LI et al. 2007). Im Hinblick auf den KOK erfolgt die Produktion von Progesteron beim Menschen (CHIAN et al. 1999), beim Rind (ARMSTRONG et al. 1996), bei der Ratte (ZHANG u. ARMSTRONG 1989) und beim Schwein (COSKUN et al. 1995) durch die Kumuluszellen. MONTANO et al. (2009) haben während der Kultivierung boviner Granulosazellen einen signifikanten Anstieg des Progesterongehaltes von 40 auf 550 ng/ml im Kulturmedium im Zeitraum von 12 bis 96 Stunden nachgewiesen. Eine weitere Studie bestätigt dieses Ergebnis (GUTIERREZ et al. 1997). Die Untersuchungen einer weiteren Forschungsarbeit zeigen, dass bovine Kumuluszellen in einem definierten IVM-Medium (M199 + 0,6% BSA + 0,5 µg/ml FSH + 100 IU/ml hCG) Östradiol und Progesteron synthetisieren (MINGOTI et al. 2002). 12 Literatur 2.3. Rezeptorformen 2.3.1. Extrazelluläre und nukleäre (intrazelluläre) Rezeptoren Für die Wirkung eines Hormons ist nicht nur der Botenstoff selbst von Bedeutung, sondern auch der entsprechende Rezeptor. Erst durch die Bindung des Hormons an seinen Rezeptor wird der Effekt des Botenstoffes auf der Seite der Zielzelle vermittelt (HORN et al. 2003). Die Rezeptoren können sich außerhalb der Zelle oder intrazellulär befinden (SQUIRES 2010). Durch die Bindung des Hormons an seinen extrazellulären Rezeptor wird via eines Second-Messenger-Systems eine Proteinkinase aktiviert, welche wiederum spezifische intrazelluläre Proteine phosphoryliert. Abbildung 6 zeigt schematisch die Funktion extrazellulärer Rezeptoren. Das phosphorylierte Protein vermittelt die biologische Wirkung des Hormons innerhalb kürzester Zeit und wird auch als nicht-genomische Wirkung bezeichnet. Abbildung 6: Schematische Darstellung der extrazellulären Rezeptorfunktion (SQUIRES 2010) Bei intrazellulären (nuklearen) Rezeptoren findet die Bindung des Hormons an seinen Rezeptor innerhalb der Zelle statt. Die Steroidhormone penetrieren aufgrund ihrer Lipophilie die Zellmembran und binden im Zytoplasma an ihren nuklearen Rezeptor. (Abbildung 7, SQUIRES 2010). Durch die Bindung des Hormons wird der nukleare Rezeptor aktiviert und wandert in den Zellkern (HORN et al. 2003). Im Kern bindet der 13 Literatur Hormon-Rezeptor-Komplex an die Hormone-Responsive Elements (HREs) der Desoxyribonucleic Acid (DNA) und interagiert mit den Transkriptionsfaktoren der DNA. Dann folgt eine Aktivierung der Ribonucleic Acid (RNA)-Polymerase und der Gentranskription. Nachfolgend wird die Expression/Repression von Proteinen gesteuert (HORN et al. 2003, SQUIRES 2010). Die Wirkung des Hormons entsteht durch die Beeinflussung der Gentranskription und erfolgt Minuten bis Stunden nach der Bindung an seinen nuklearen Rezeptor. Sie wird auch als genomische Wirkung bezeichnet. Hormon Zellmembran Kernmembran Rezeptor Hormon Antwort Gen Transkription (mRNA) Translation (Proteinsynthese) zelluläre Antwort Abbildung 7: Hormonwirkung via nuklearen Rezeptor (SQUIRES 2010) Die Wirkung eines Hormons wird beendet durch 1. seinen Abbau oder 2. Desensibilisierung des Rezeptors durch Phosphorylierung oder 3. Endozytose durch die Membran und anschließenden Abbau oder Recycling des Rezeptors oder 4. Abbau der zyklischen Nukleotide und Dephosphorylierung der Proteine (SQUIRES 2010). 2.4. Progesteronrezeptorarten Auch die diversen biologischen Effekte des Steroidhormons Progesteron auf die Organe des weiblichen Reproduktionstraktes werden durch Bindung des Hormons an nukleare und extrazelluläre Rezeptoren vermittelt (LEONHARDT et al. 2003, APARICIO et al. 2011). 14 Literatur 2.4.1. Nuklearer Progesteronrezeptor Die nuklearen Progesteronrezeptoren (nPRs) sind der Gruppe der Nuclear Receptor Superfamily von Transkriptionsfaktoren zuzuordnen (SCHRADER u. O'MALLEY 1972, EVANS 1988, TSAI u. O'MALLEY 1994). Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 3 Isoformen des nPRs bekannt (Tabelle 1). Tabelle 1: Isoformen des nuklearen Progesteronrezeptors Größe (kDa) DURLEJ et al. (2010), porcin GADKARSABLE et al. (2005), human PELUSO et al. (2007), human SCHAMS et al. (2003), bovin APARICIO et al. (2011), bovin A 94 94 90 92 80 B 120 116 110 116 120 Isoform C 60 65 2.4.1.1. Genomische Wirkung des nuklearen Progesteronrezeptors Der nPR besteht aus mehreren funktionellen Domänen (siehe Abbildung 8), die relativ gut beschrieben sind (LEONHARDT et al. 2003). Bindet Progesteron an die Ligandenbindungsdomäne (LBD), wird eine Konfirmationsänderung im Rezeptor ausgelöst, die zu seiner Phosphorylierung und Trennung vom Hitzeschockprotein 90 (HSP90, der Rezeptor ist im Zytoplasma im inaktiven Zustand an HSP90 gebunden) und zur Wanderung des Liganden-Rezeptor-Komplexes in den Kern führt (CHEN et al. 1999, WARDELL et al. 2002, GELLERSEN u. BROSENS 2003). 15 Literatur Progesteron N AF1, AF3 und IF (Transkriptionsregulierung) Zinkfinger (DBD) HRE HingeRegion LBD AF2 (Interaktion mit HSP90) C DNA Abbildung 8: Schematische Darstellung der Rezeptordomänen (modifiziert nach SQUIRES 2010) Für die Interaktion von Rezeptor und HSP90 ist die Aktivierungsdomäne AF2 verantwortlich (MULAC-JERICEVIC und CONNEELY 2004, REKAWIECKI et al. 2011). Am N-Terminus befinden sich die Domänen AF1 und AF3, die die Spezifität des Promoters und die transkriptionale Aktivität regulieren (CONNEELY et al. 2003, LEONHARDT et al. 2003). Die DNA-Bindungsdomäne (DBD), bestehend aus zwei „Zinkfinger“-Strukturen (siehe Abbildung 9), ermöglicht die Bindung des Rezeptors an die HREs der DNA (FREEDMAN 1992, GIANGRANDE et al. 1997). Abbildung 9: Darstellung der „Zinkfinger“ (SQUIRES 2010) Die verschiedenen Isoformen des nPRs unterscheiden sich hinsichtlich ihrer strukturellen Domänen und dadurch bedingt auch in ihrer Funktion. Diese Unterschiede können der nachfolgenden Tabelle 2 entnommen werden. 16 Literatur Tabelle 2: Die unterschiedliche Ausprägung der strukturellen Domänen der jeweiligen nPR- Isoformen Strukturelle Domäne Funktion Isoform A B C AF1 Ja1,2 Ja1,2 Nein1 AF3 Nein1,2 Ja1,2 Nein1 IF Ja1,2 Ja1,2 Nein1 Bindung an DNA DBD (2 Zinkfinger) Ja1 Ja1 Ja, nur 1 Zinkfinger ausgebildet1 Hormonbindung LBD Ja1 Ja1 Ja1 Interaktion mit HSP90 AF2 Ja1 Ja1 Ja1 Transkriptionsregulierung 1=Mensch, 2=Huhn (TORA et al. 1988 [Huhn], KASTNER et al. 1990 [Mensch], SARTORIUS et al. 1994 [Mensch], WEI et al. 1996, 1997 [Mensch], GIANGRANDE et al. 1999 [Mensch], LEONHARDT et al. 2003 [Mensch], TAYLOR et al. 2009 [Mensch]) Die Bindung der Rezeptoren im Kern erfolgt als Dimer an die HRE-Region des Zielgens. Die Isoformen A und B sind in der Lage als Homodimer A:A, B:B und Heterodimer A:B zu binden (MULAC-JERICEVIC und CONNEELY 2004, REKAWIECKI et al. 2011). Da die Isoform C nur einen Zinkfinger ausbildet und keine Domäne zur Transkriptionsregulierung besitzt, ist ihre Fähigkeit der Transkriptionsaktivierung aufgehoben. Jedoch nimmt sie Einfluss auf die Regulierung der Transkription, in dem sie mit den Isoformen A oder B ein Heterodimer bildet und deren transkriptionale Aktivität fördert. Die Isoform B besitzt beide Domänen (AF1 und AF3) für die Regulierung der Transkription und hat folglich die stärkste transkriptionale Aktivität. Bei der Isoform A ist die Aktivität um 90% aufgrund der fehlenden AF3 Domäne reduziert (WEI et al. 1996, 1997, GIANGRANDE et al. 1997, TUNG et al. 2001, LEONHARDT et al. 2003, TAYLOR et al. 2009). Die Isoformen A und B weisen ähnliche autoinhibitorische Domänen (IF) auf 17 Literatur (LEONHARDT et al. 2003). Dies bedeutet, dass bei der Aktivierung von beiden Isoformen in derselben Zelle, die Isoform A als ein wirksamer Inhibitor gegenüber der Wirkung der Isoform B agiert und dadurch der Progesteroneffekt in der Zielzelle reduziert wird (PIEBER et al. 2001, LEONHARDT et al. 2003). Ebenfalls ist die Isoform A in der Lage die Rezeptoren für Östrogene, Glukokortikoide oder Mineralokortikoide zu hemmen (KRAUS et al. 1995). Es wird vermutet, dass die Inhibition der Östrogenrezeptorfunktion unabhängig von der Bindung an die DNA erfolgt (MCDONNELL u. GOLDMAN 1994, VEGETO et al. 1993). Letztendlich wird die transkriptionale Aktivität des Progesteronrezeptors und die Vielfalt der physiologischen Wirkungen, die mit Progesteron assoziiert werden, durch die Rezeptordimerisierung moduliert (MULAC-JERICEVIC u. CONNEELY 2004, REKAWIECKI et al. 2011). 2.4.1.2. Nicht-genomische Wirkungen des nuklearen Progesteronrezeptors Durch die Bindung von Progesteron an den nPR kann auch die Aktivierung der intrazellulären Phosphorylierungskaskade in der Zielzelle ausgelöst werden (BALLARE et al. 2003, BOONYARATANAKORNKIT u. EDWARDS 2004). Der an der Innenseite der Plasmamembran lokalisierte nPR bindet (nach seiner Aktivierung durch Progesteron) an die SH2/SH3-Domäne der Src-Kinase. Es erfolgt eine direkte Aktivierung des Src/Erk-1-Signal-Transduktionsweges und im weiteren Verlauf die Phosphorylierung von Co-Aktivator-Proteinen (MIGLIACCIO et al. 1998, LEONHARDT et al. 2003, BOONYARATANAKORNKIT u. EDWARDS 2004, LANGE 2004). Diese Proteine sind dafür verantwortlich, dass Zellen in die S-Phase der Mitose eintreten können (LANGE 2004). Die Proliferation von humanen T47D-Brustkrebszellen konnte durch Aktivierung des Src/Erk-1-Signalweges und im weiteren Verlauf durch die Induktion der Cyclin D1-Genepxression ausgelöst werden (MIGLIACCIO et al. 1998, BOONYARATANAKORNKIT et al. 2007). Letztgenannte Wirkung erfolgt durch die Isoform B (BOONYARATANAKORNKIT et al. 2007). Diese Untersuchungen belegen, dass die nPR zwei Funktionen besitzen und diese synergistisch fungieren. Zum einen agieren sie als Kerntranskriptionsfaktoren und zum anderen als Aktivator von 18 Literatur Zellsignalmolekülen (LEONHARDT et al. 2003, BOONYARATANAKORNKIT und EDWARDS 2004, LANGE 2004, BOONYARATANAKORNKIT et al. 2007). 2.4.2. Membranprogesteronrezeptoren Die mPRs sind der Familie der Progestin- und AdipoQ-Rezeptoren zuzuordnen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind drei verschiedene Membranrezptoren (mPRα, β und γ) beim Menschen, der Maus, dem Rind und dem Schwein (ZHU et al. 2003a, b, APARICIO et al. 2011) identifiziert worden. Die Nomenklatur für mPRα, β und γ ist entsprechend ihrer neuen Zuordnung zu den Progestin und AdipoQ-Rezeptoren in PAQR7, 8 und 5 geändert worden (ZHU et al. 2003a, b). Ihre molekulare Größe liegt bei 40 kDa. Sie bestehen aus einer kurzen extrazellulären Domäne, einer membranübergreifenden Domäne (zusammengesetzt aus sieben Transmembransegmenten) und einem kurzen zytoplasmatischem Ende. Abbildung 10 zeigt eine schematische Darstellung des PAQR7. Extrazelluläre Domäne Transmembran Domäne Zytoplasmatische Domäne Abbildung 10: Schematische Darstellung des PAQR7 (PELUSO 2007) Die Aktivierung der Signalwege via mPRs ist noch relativ unbekannt. Im Fall des PAQR7 erfolgt durch die Bindung von Progesteron ein Abfall im intrazellulären cAMPGehalt und eine Steigerung der Erk-1-Aktivität (ZHU et al. 2003a, 2003b, KARTERIS et al. 2006). 2.4.3. Progesteronrezeptormembrankomponenten 1 und 2 Progesteronrezeptormembrankomponenten (PGRMC1 und 2) sind der Proteinfamilie der membran-assoziierten Progesteronrezeptoren zuzuordnen (CAHILL 2007). Das 19 Literatur Molekulargewicht der PGRMC1 liegt bei 28 kDa (FALKENSTEIN et al. 2001). Die PGRMC1 weist eine kurze am N-Terminus lokalisierte extrazelluläre Domäne, eine einzelne Transmembrandomäne und ein zytoplasmatisches Ende auf (Abbildung 11, LOSEL et al. 2005). Dieses Ende beinhaltet eine Häm-Bindungsstelle und verschiedene SH2/SH3-Domänen (MIFSUD u. BATEMAN 2002, PELUSO 2007). Extrazelluläre Domäne TransmembranDomäne Zytoplasmatische Domäne Häm-ProteinBindungs-Domäne Abbildung 11: Schematische Darstellung des PGRMC1 (PELUSO 2007) Der Aufbau der PGRMC2 ähnelt dem der PGRMC1 (PELUSO et al. 2005, INTLEKOFER u. PETERSEN 2011). Weitere Einzelheiten über den Aufbau sind bis zum heutigen Zeitpunkt nicht bekannt (ZHANG et al. 2008, INTLEKOFER und PETERSEN 2011). Die Aktivierung der PGRMC1 hat einen Anstieg in der Proteinkinase G (PELUSO et al. 2004) und einen Abfall in der Erk-1-Aktivität (PELUSO et al. 2003) zur Folge. Die Funktion des PGRMC2 ist bis heute noch nicht geklärt (ZHANG et al. 2008, INTLEKOFER und PETERSEN 2011). 2.5. Wirkungen von Progesteron und seinen Rezeptoren Die Wirkung von Progesteron beim Säugetier scheint vielfältig zu sein. Im Hinblick auf die Funktion des Ovars beeinflusst Progesteron das Follikelwachstum, die Ovulation und die Gelbkörperbildung (PELUSO 2006, 2007). Die Ausprägung der Progesteronrezeptoren variiert im Ovargewebe aufgrund des unterschiedlichen Entwicklungs- und Hormonstatus (PARK u. MAYO 1991, NATRAJ u. RICHARDS 20 Literatur 1993, HANEKAMP et al. 2003). Sowohl genomische als auch nicht-genomische Progesteronrezeptoren sind in verschiedenen Tierarten und unterschiedlichen Geweben/Zellen identifiziert worden (ASHLEY et al. 2006 [Schaf], D'HAESELEER et al. 2007 [Rind], DURLEJ et al. 2010 [Schwein], LUCIANO et al. 2010 [Rind], SALVETTI et al. 2007 [Rind], SARUHAN et al. 2011 [Rind], SCHAMS et al. 2003 [Rind], SCHÄUBLI et al. 2008 [Rind], YOU et al. 2010 [Maus]). In bovinen Kumulus- und Eizellen wurden in den letzten Jahren Progesteronrezptoren auf mRNA- und ProteinEbene analysiert (CLEMENTE et al. 2009, APARICIO et al. 2011, SALAHB 2011). Im Follikel wird zum Zeitpunkt der Antrumbildung durch Progesteron die Proliferationsrate von Granulosazellen (CHAFFKIN et al. 1993, LUCIANO u. PELUSO 1995) verlangsamt und ihre Apoptoserate (LUCIANO et al. 1994) gehemmt. Da während der Follikelentwicklung die PGRMC1 in Granulosazellen vermehrt vorhanden ist (NATRAJ und RICHARDS 1993, SHAO et al. 2003, PELUSO 2007), führt dies zu der Annahme, dass sowohl die antiapoptotische als auch die antimitotische Wirkung von Progesteron durch PGRMC1 vermittelt wird (LUCIANO et al. 1994, LUCIANO und PELUSO 1995, PELUSO et al. 2001, PELUSO et al. 2002, PELUSO et al. 2005, CRUDDEN et al. 2006, PELUSO 2006, 2007). Um den Ovulationszeitpunkt treten die Granulosazellen synchronisiert in die S-Phase des Zellzykluses ein (AGARWAL et al. 1996, PIONTKEWITZ et al. 1997). Dieses Ereignis ist gleichzeitig verbunden mit einer rasanten Induktion von nPR in Granulosazellen präovulatorischer Follikel (NATRAJ und RICHARDS 1993, PARK und MAYO 1991, LUCIANO und PELUSO 1995). Da die Isoform B in der Lage ist, Gene, die mit der Zellmitose in Verbindung gebracht werden, zu induzieren, ist sie an der Mitose der Granulosazellen beteiligt (SVENSSON et al. 2001, SHAO et al. 2003, LANGE 2004, RUNG et al. 2005, SHAO et al. 2006, PELUSO 2007). Die Expression von mPRβ in porcinen KOKs ist zeitlich korreliert mit dem Germinal Vesicle Breakdown (GVBD) der Oozyte. Während der IVM von porcinen KOKs konnte bei Zugabe eines Anti-mPRβ in das Medium eine Beeinträchtigung der Kumuluszellexpansion detektiert werden. Es wird davon ausgegangen, dass der an der Plasmamembran von Kumuluszellen lokalisierte mPRβ in die Expansion dieser Zellen involviert ist (QIU et al. 2008). 21 Literatur 2.6. In-vitro-Produktion von Embryonen Die IVP von bovinen Embryonen ist zum einen eine Alternative zu konventionellen Invivo-Techniken, zum anderen ein passendes Hilfsmittel bzw. Werkzeug zur Analyse der Embryonalentwicklung vor der eigentlichen Implantation (GORDON u. LU 1990, LOONEY et al. 1994, GANDOLFI 1994, FARIN u. FARIN 1995). Insbesondere um Fragen bezüglich der endokrinen Kontrolle, der molekularen „Schalter“ und der metabolischen Wege/Abläufe, die die frühe Entwicklung regulieren, zu klären, ist die Technologie der IVP als ein Forschungsinstrument von immenser Wichtigkeit (GALLI et al. 2003). Seit der Geburt des ersten Kalbes aus IVF im Jahre 1981 (BRACKETT et al. 1982) ist die IVP stetig weiterentwickelt worden (WRENZYCKI et al. 2007). Dadurch konnte in den letzten Jahren eine große Anzahl von Embryonen generiert werden (IETS 2009: 378.244 transfertauglichen Embryonen). 2.6.1. In-vitro-Maturation Im Jahre 1935 zeigten PINCUS und ENZMANN, dass spontan eine Wiederaufnahme der 1. meiotischen Reifeteilung in der Oozyte stattfindet, wenn der KOK aus der inhibitorischen Follikelumwelt freigesetzt wird. Seitdem wird versucht, die In-vivoSituation in vitro nachzustellen (CAMARGO 2006). Unter optimalen Reifungsbedingungen erreichen ca. 90% der Oozyten das MII-Stadium (GALLI et al. 2003). Jedoch liegt die Blastozystenrate bei 30 – 40%. Wenn Oozyten, die in vivo reiften, verwendet werden, kann eine Blastozystenrate von bis zu 70% erreicht werden (WRENZYCKI u. STINSHOFF 2013). Die verminderte Blastozystenrate der IVMOozyten ist auf eine gestörte zytoplasmatische Reifung zurückzuführen (SILVA u. KNIGHT 2000, PREIS et al. 2003, GILCHRIST und THOMPSON 2007, WRENZYCKI et al. 2007). In der IVM sind u.a. der Einsatz unterschiedlicher Reifungsmedien sowie deren Zusätze und verschiedene Sauerstoffkonzentration im Brutschrank während der Maturation untersucht worden, um die Eizellreifung zu fördern. Im nachfolgenden wird auf einzelne Schritte und Optimierungsansätze der IVM eingegangen. 22 Literatur 2.6.1.1. Eizellgewinnung Es werden zwei Verfahren zur Gewinnung der KOK für die IVP verwendet: 1. mittels transvaginaler ultraschallgeleiteter Follikelpunktion (Ovum pick up) von Spendertieren oder 2. aus Ovarien frisch geschlachteter Tiere. Aus den Ovarien der geschlachteten Tiere können die KOK auf zwei Arten gewonnen werden, zum einen durch Aspiration der Follikelflüssigkeit mit Hilfe einer Kanüle und Spritze (CAROLAN et al. 1994), zum anderen mittels der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995). Es werden unterschiedliche Populationen von KOK aus Follikeln verschiedener Entwicklungsstadien genutzt (GILCHRIST u. THOMPSON 2007). Nachfolgend findet eine Selektion der KOK an Hand morphologischer Kriterien (Kumulusexpansion, Anzahl der Kumuluszellen, homogenes/heterogenes Ooplasma) auf IVP-Tauglichkeit statt (PAVLOK et al. 1992, KHURANA u. NIEMANN 2000, KELLY et al. 2007). 2.6.1.2. Maturationsmedien und Zusätze In der IVM werden komplexe Medien, die ursprünglich für die Kultur von nichtovariellen somatischen Zellen produziert wurden, eingesetzt. Hierzu zählen unterschiedliche kommerziell erhältliche Medien wie Tissue Culture Medium 199 (TCM199), Waymouth MB 752/1, Minimum Essential Medium (MEM), Hamster Embryo Culture Medium (SUTTON et al. 2003). Wenn die Reifung von bovinen Oozyten in den Medien TCM199, Serum-free medium based on TCM199 (SFRE) und MEM erfolgt, ist die anschließende Blastozystenrate höher im Vergleich zu der in Medien wie Waymouth MB 752/1, Ham’s F-12 (ROSE u. BAVISTER 1992) oder Ménézo’s B2 (HASLER 2000, SUTTON et al. 2003). Als Maturationsmedium für bovine Oozyten wird in der Regel das TCM199 (GALLI et al. 2003, SUTTON-MCDOWALL et al. 2005) eingesetzt. Zur Analyse der metabolischen Vorgänge während der In-vitroEizellreifung ist Synthetic Oviduct Fluid (SOF, TERVIT et al. 1972) als Reifungsmedium eingesetzt worden. Hier wurden ähnliche Reifungsraten (70 - 80%) wie mit dem TCM199 erreicht, jedoch ist mit SOF im Vergleich zum TCM 199 die Blastozystenrate an Tag 8 erniedrigt (LONERGAN et al. 1994, FUKUI et al. 2000). Die Autoren vermuten daher, dass TCM199 als Maturationsmedium die zytoplasmatische 23 Literatur Reifung boviner Oozyten und die Voraussetzungen zur weiteren Entwicklung zur Blastozyste adäquater unterstützt als SOF (LONERGAN et al. 1994). Fetal Calf Serum (FCS), Estrous Cow Serum (OCS) oder Bovines Serum Albumin (BSA) können als nicht definierte bzw. semi-definierte Proteinzusätze im Reifungsmedium genutzt werden. Bei der Maturation von bovinen Oozyten im Reifungsmedium + FCS ist die Rate der Eizellen, die das MII-Stadium erreichen, höher als mit anderen Zusätzen (WIEMER et al. 1991, MILLÁN 1999). Alternativen zur Proteinsupplementation bilden die Zusätze Polyvinylalkohol (PVA) und Polyvinylpyrolidon als definierte Komponenten (PVP, ECKERT u. NIEMANN 1995). Eine Supplementierung des Reifungsmediums mit PVA (Grundmedium TCM199) reduziert signifikant die nachfolgende Blastozystenrate im Vergleich zu der mit Proteinzusatz (BSA) im Maturationsmedium (FUKUI et al. 2000, SUTTON et al. 2003). FCS und BSA enthalten Faktoren, wie zum Beispiel (z.B.) Hormone, Peptide, Wachstumsfaktoren etc., die die Entwicklung zur Blastozyste fördern (SUTTON et al. 2003). Im Hinblick auf die Forschung besteht bei der Verwendung von undefinierten Zusätzen das Risiko einer Kontamination bzw. einer Schwankung in der Zusammensetzung der Zusätze, was eine exakte Analyse erschwert (SUTTON et al. 2003). Üblicherweise werden in der IVM dem Reifungsmedium Hormone, wie z.B. FSH, LH, equines Gonadotropin (eCG), hCG (humanes Gonadotropin) und/oder Östradiol zugesetzt. Es wird angenommen, dass diese Hormone die Reifung der Eizelle fördern, indem sie u.a. die metabolische Aktivität der Kumuluszellen und die Kumuluszellexpansion beeinflussen bzw. fördern (FUKUI et al. 1982, DOWNS et al. 1988, TESARIK u. MENDOZA 1997, MINGOTI et al. 2002, SUTTON et al. 2003, ALBUZ et al. 2010, CAIXETA et al. 2013). Durch die Zugabe von Forskolin (100mM, Adenylatzyklaseaktivator [Erhöhung des cAMP-Levels]) und PhosphordiesteraseHemmer (500 mM, 3-Isobutyl-1-methylxanthin [Inhibition des cAMP-Abbaus]) 1 bis 2 Stunden vor der IVM zeigt sich eine signifikante Erhöhung in der Anzahl der Gap junction-Einheiten boviner KOK (ALBUZ et al. 2010). Auch konnte in der Studie von 24 Literatur ALBUZ et al. (2010) festgestellt werden, dass bei dem Einsatz des Reifungsmediums (Bovine VitroMat) ohne FSH-Zusatz sich die Reifungsrate boviner KOK signifikant reduziert gegenüber der der Kontrollgruppe (ALBUZ et al. 2010). 2.6.1.3. Sauerstoffkonzentration In der In-vitro-Produktion erfolgt die Reifung der bovinen Oozyten in der Regel für 24 Stunden bei 39°Celcius (C) unter feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre, in der die O2Konzentration bei 20% und die Kohlenstoffdioxid (CO2)-Konzentration bei 5% liegt. Die O2-Konzentration in der Follikelflüssigkeit beträgt bei Kühen 5 bis 17% (FISCHER et al. 1992, VAN BLERKOM et al. 1997, REDDING et al. 2006). In einer weiteren Untersuchung ist in der Follikelflüssigkeit (durchschnittlicher Follikeldurchmesser 15,9 ±1,2 mm) laktierender Milchkühe eine O2-Konzentration von 4,9 – 8,5 % gemessen worden (DE CASTRO u. HANSEN 2007). Eine Studie aus dem Jahr 2011 zeigt an Hand eines mathematischen Modells, dass sich die O2-Konzentration in der Follikelflüssigkeit während der Follikelentwicklung (Follikelradius 2 – 14 mm) verändert (CLARK u. STOKES 2011). Zum Zeitpunkt der Antrumbildung steigt die O2Konzentration im Follikel. Wenn der Follikel einen Durchmesser von 16 mm aufweist ist die O2-Konzentration in der Follikelflüssigkeit geringer als zuvor. Im weiteren Entwicklungsverlauf des Follikels steigt die O2-Konzentration wieder an. Zusätzlich berücksichtigt dieses Modell die Position des KOK im Follikel und die Follikelstruktur/geometrie. Es ist davon auszugehen, dass die O2-Konzentration in der Nähe des KOK geringer ist als die durchschnittliche O2-Konzentration. Wird dieses mathematische Modell der In-vivo-Bedingungen auf die IVM übertragen, so wird die O2-Verfügbarkeit für den KOK durch das Volumen des Reifungsmediums und die O2Konzentration im Inkubator beeinflusst (CLARK u. STOKES 2011). Die letzt genannte wissenschaftliche Arbeit unterstützt eine Studie aus dem Jahre 1992, in der angenommen wird, dass im Zyklus die Reifung des Follikels begleitet von einem Zuwachs in der Follikelgröße und einem Anstieg in der Produktion von Follikelflüssigkeit ist. Und diese Umstände könnten zu einer Steigerung der Diffusionsdistanz führen und mit einem Absinken des Sauerstoffangebotes im Follikel einhergehen. Das Absinken des Sauerstoffdruckes im Follikel könnte ein Auslöser für 25 Literatur metabolische und biochemische Abläufe sein, die zur Ovulation führen (FISCHER et al. 1992). Der Effekt einer niedrigen (5%) bzw. hohen (20%) O2-Konzentration im Inkubator während der IVM boviner KOK wird kontrovers diskutiert. Einige Forschungsgruppen nehmen an, dass eine hohe O2-Konzentration (20%) eine vermehrte Sauerstoffradikalbildung hervorruft und dadurch das Gleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalen und Antioxidant-Enzymen innerhalb der Zelle und/oder im Kulturmedium beeinflusst und der daraus folgende Stress sich auf die Eizellentwicklung auswirkt (LONERGAN et al. 1999, KHURANA u. NIEMANN 2000; VAN SOOM et al. 2002, AGARWAL et al. 2006, COMBELLES et al. 2009). Ein Hinweis auf oxidativen Stress ist, dass in in vitro gereiften Oozyten der Gehalt von Transkripten dreier Antioxidant-Enzyme (Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, SOX) signifikant erhöht ist im Vergleich zu in vivo generierten bovinen Eizellen (LONERGAN et al. 2003b). Die vermehrte Bildung von Antioxidant-Enzymen soll die Zelle vor Schäden durch Sauerstoffradikale schützen. Während der Reifung der KOK könnten die Kumuluszellen die Bildung von Antioxidant-Enzymen übernehmen, um die Oozyte vor Schäden, die durch Sauerstoffradikale entstehen, zu bewahren (GILCHRIST et al. 2004, COMBELLES et al. 2009, LONERGAN et al. 2003a). Autoren anderer Studien vermuten, dass unter einer geringen O2-Konzentration (5%) die mitochondriale Atmung (Atmungskette) gehemmt und die Energieproduktion vom Zitrat-Zyklus und der Atmungskette auf anaerobe Glykolyse umgestellt wird (CZYZYK-KRZESKA 1997, WENGER u. GASSMANN 1997, HASHIMOTO et al. 2000a). In einigen Untersuchungen ist durch eine verminderte O2-Konzentration die Entwicklungskompetenz der Oozyte positiv beeinflusst worden. Die Ergebnisse anderer Forschungsgruppen demonstrieren das Gegenteil. Der Tabelle 3 sind Untersuchungen zu unterschiedlichen O2-Konzentrationen während der IVM zu entnehmen. 26 Literatur Tabelle 3: Untersuchungen zur O2-Konzentration Referenz HAIDRI et al. (1971) Tierart Maus O2Konzentration Parameter Effekt 5 – 10% Kernreifung der Oozyte inkl. Ausschleusung des Polkörpers + + GWATKIN u. HAIDRI (1974) Hamster 5% Kernreifung der Oozyte inkl. Ausschleusung des Polkörpers PREIS et al. (2007) Maus 5% Zellanzahl der Blastozysten + IWAMOTO et al. (2005) Schwein 5% Blastozystenqualität, + PARK et al. (2005) Schwein 20% Blastozystenrate + LONERGAN et al. (1999) Rind 5% Blastozystenrate (Tag 8) + BERMEJOÁLVAREZ et al. (2009) Rind 5% oder 20% Blastozystenrate (Tag 8) +/- HASHIMOTO (2009) Rind 5% Blastzystenrate + HASHIMOTO et al. (2000) Rind 5% Anzahl der Oozyten im MII-Stadium − DE CASTRO u. HANSEN (2007) Rind 20% Blastozystenrate (Tag 8) + + Positiver Effekt auf den genannten Parameter - negativer Effekt auf den genannten Parameter 27 Literatur 2.6.1.4. Glukose im Reifungsmedium Während der Reifungsphase ist Glukose ein wichtiger Energielieferant für den KOK (ROSE-HELLEKANT et al. 1998, KHURANA u. NIEMANN 2000, SUTTONMCDOWALL et al. 2004). Die Eizelle selbst hat eine geringe Kapazität zur Speicherung von Glukose (BIGGERS et al. 1967, SUTTON-MCDOWALL et al. 2010). Aus diesem Grund wird Glukose durch die Kumuluszellen metabolisiert und die Endprodukte wie z.B. Pyruvat und Laktat der Oozyte zur Verfügung gestellt (SUTTON et al. 2003, SUTTON-MCDOWALL et al. 2010). Während der Maturationsphase nutzen die Kumuluszellen Glukose für die Energieproduktion und verschiedenste zelluläre Prozesse (Synthese von Purinen oder Nukleinsäuren, SUTTON et al. 2003). Zum Ende der Reifungsphase verwenden die Kumuluszellen einen signifikanten Anteil der Glukose für die Produktion der extrazellulären Matrix (SUTTON-MCDOWALL et al. 2004). Daher verbrauchen bovine KOK während der Reifungsphase das 2-fache an Pyruvat, Glukose und Sauerstoff im Gegensatz zu unreifen KOK (SUTTON et al. 2003). Die Tabelle 4 zeigt verschiedene Studien bezüglich unterschiedlicher Glukosekonzentrationen im Reifungsmedium und deren Auswirkung auf die Kernreifungsrate boviner Oozyten. Jedoch kann die Glukosesupplementierung nicht allein betrachtet werden. Untersuchungen zeigen, dass sich bei der Reifung von KOK unter einer O2-Konzentration von 5% die mRNA-Mengen für Gene, die dem Metabolismus (Glukosetransporter, anaerobe Glykolyse) zugeordnet werden, signifikant erhöhen im Vergleich zu denen bei einer Maturation unter 20% O2. (BERMEJO-ÁLVAREZ et al. 2009). In einer weiteren Untersuchung konnte festgestellt werden, dass durch die Zugabe von Glukose in das Reifungsmedium die Glutamylcysteine-Synthetase beeinträchtigt und im Weiteren die Glutathionmenge in bovinen Oozyten reduziert wird (HASHIMOTO et al. 2000b). Somit haben Änderungen im Metabolismus Auswirkungen auf die Genexpression (BERMEJO-ÁLVAREZ et al. 2009, SALHAB et al. 2013). 28 Literatur Tabelle 4: Glukosekonzentration im Reifungsmedium GlukoseO2Referenz konzentration im Konzentration Reifungsmedium 20% 1,5 mM Kernreifungsrate ca. 80% 1,5 mM Kernreifungsrate ca. 17% (ATP Gehalt 237±12 fmol boviner Oozyten) 5% 20 mM Kernreifungsrate ca. 90% (ATP Gehalt 307±21 fmol boviner Oozyten) 5% 40 mM Kernreifungsrate ca. 70% 20% 0 mM Kernreifungsrate ca. 43% 20% 1,5 mM Kernreifungsrate ca. 67% Blastozystenrate ca. 25% 20% 5,6 mM Kernreifungsrate ca. 65% Blastozystenrate ca. 16% 20% 20 mM Kernreifungsrate ca. 74 % Blastozystenrate ca. 14% 20% 5,6 mM Kernreifungsrate ca. 70% 20% 2,3 mM Kernreifungsrate ca. 40% 21% 5,6 mM Blastozystenrate ca. 41% 5% 5,6 mM Blastozystenrate ca. 25% 21% 20 mM Blastozystenrate ca. 30% 5% 20 mM Blastozystenrate ca. 30% 5% HASHIMOTO et al. (2000a) HASHIMOTO et al. (2000b) SUTTONMCDOWALL et al. (2005) DE CASTRO u. HANSEN (2007) Effekt Bei der IVM boviner KOK unter einer O2-Konzentration von 5% ist Glukose als kritischer Faktor für die meiotische Reifung und ATP-Produktion anzusehen (HASHIMOTO 2009). Findet die IVM boviner KOK unter einer hohen O2-Konzentration (20 bzw. 21%) statt, wirkt sich eine Glukosekonzentration von 20 mM negativ auf die Blastozystenrate, aber nicht auf die Kernreifungsrate, aus (DE CASTRO u. HANSEN 2007, HASHIMOTO et al. 2000b). Die negative Wirkung ist auf eine erhöhte 29 Literatur Sauerstoffradikalbildung und abfallende intrazelluläre Glutathionproduktion (endogenes Antioxidant) zurückzuführen (HASHIMOTO et al. 2000b). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Glukosekonzentration an der Regulierung des GVBD in bovinen Eizellen beteiligt ist (SUTTON-MCDOWALL et al. 2005) und dass die Umwelt (insbesondere die O2-Konzentration), der die KOK während der Maturationsphase ausgesetzt sind, die nachfolgende Embryonalentwicklung beeinflusst (SUTTON-MCDOWALL et al. 2010). 2.6.1.5. Progesteron im Reifungsmedium Untersuchungen zeigen, dass nach dem LH-Peak die Progesteronkonzentration in der bovinen Follikelflüssigkeit ansteigt (siehe Kapitel 2.2.2., DIELEMAN et al. 1983, OSBORN und MOOR 1983, BRIDGES et al. 2006). Jedoch wird der Effekt der Progesteronzugabe in das Reifungsmedium kontrovers diskutiert. Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse einiger Forschungsarbeiten. Tabelle 5: Untersuchungen zur Progesteronzugabe in das Reifungsmedium Refernz Tierart Progesteronkonzentration Parameter Effekt FUKUI et al. (1982) Rind 1 μg/ml Reifungsrate der Oozyten + SIROTKIN (1992) Rind 1 bzw. 5 μg/ml Entwicklung der Meiose + SILVA u. KNIGHT (2000) Rind 300 nmol l-1 Blastozystenrate − APARICIO et al. (2011) Rind 50 und 100 ng/ml Blastozystenrate ± Rind 0 – 10000 ng/ml Kernreifungsrate ± (abhängig von der Konzentration) SIQUEIRA et al. (2012) + Positiver Effekt auf den genannten Parameter - negativer Effekt auf den genannten Parameter 30 Literatur ARMSTRONG et al. (1996) untersuchten die Progesteronproduktion boviner Kumuluszellen (169 ± 37 bzw. 126 ± 26 pg/KOK) und Granulosazellen (15,9 ± 0,5 bzw. 13,8 ± 0,2 pg/103 Zellen) im HEPES-buffered Tissue Culture Medium 199 (HTCM199). Für bovine Granulosazellen sind nach 48-stündiger Kultur (M199) ähnliche Werte (Progesterongehalt von 19,4 ± 3,9 ng/ml) wie in der Studie von ARMSTRONG et al. (1996) gemessen worden (PEREIRA et al. 2008). Durch die Zugabe von 10 mM Aminoglutethimiden (Hemmstoff der CYP11A1) in das Maturationsmedium (TCM199) reduziert sich nach 22 Stunden die Rate der reifen bovinen KOK von 90 auf 10% und die Expansion der Kumuluszellen ist komplett gehemmt. Der Progesterongehalt in diesem Reifungsmedium (5 ng/ml) ist im Vergleich zu dem in der Kontrollgruppe (30 ng/ml reduziert (WANG et al. 2006). Die Analyse boviner KOK auf ihre Fähigkeit im perikonzeptionalen Zeitraum Progesteron zu bilden zeigt, dass die Progesteronproduktion pro KOK bei 144,1 ± 14,7 pg liegt (TCM199+EGF, NUTTINCK et al. 2008). Diese Werte werden durch eine weitere Studie aus dem Jahr 2011 unterstützt. In dieser Untersuchung liegt die Progesteronkonzentration im Reifungsmedium pro KOK zwischen 129,9 und 87,2 pg (SALHAB et al. 2011). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Progesteronsekretion der Kumuluszellen durch das Reifungsmedium (TCM199EM, TCM199, TCM199 + EGF) beeinflusst wird. Bei einer Maturationsphase von 22 Stunden ist die Progesteronsekretion pro KOK im TCM199EM (TCM199 + 10 ng EGF, 19 ng IGF etc.) signifikant höher als im TCM199 allein. Ebenfalls ist in dieser Gruppe (TCM199EM) die Blastozystenrate signifikant erhöht im Vergleich zur der der „TCM199-Gruppe“ (SALHAB et al. 2011). Wird dem Reifungsmedium (TCM199 + 10% FCS + 10ng/ml EGF) boviner KOK Trilostane (10 µM, Hemmer der HSD3B1) zugegeben, reduziert sich sowohl die Blastozystenrate als auch die Progesteronkonzentration im Reifungsmedium signifikant und die Expansion der Kumuluszellen ist gegenüber der der Kontrollgruppe beeinträchtigt (APARICIO et al. 2011). 2.6.2. Probleme in der IVP Es ist bekannt, dass Rinderembryonen, die in vivo, beispielsweise nach einer Superovulation, künstlicher Besamung und anschließender Spülung, generiert werden 31 Literatur von höherer Qualität sind, als solche, die aus der IVP stammen (WRENZYCKI et al. 1996, 2001, 2004, LONERGAN et al. 2006). Sowohl reduzierte Trächtigkeitsraten als auch Veränderungen in Genexpressionsmustern in vitro generierter Blasotzysten zeigen, dass die In-vivo-Situation noch nicht hinreichend nachgestellt werden kann (WALKER et al. 1996, KRUIP u. DENDAAS 1997, NIEMANN u. WRENZYCKI 2000, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 2000, FARIN et al. 2001, NIEMANN et al. 2002). In der Tabelle 6 sind Merkmale auf molekularer/zellularer Ebene bei in vitro produzierten Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten genannt. Tabelle 6: Merkmale in vitro produzierter Embryonen im Vergleich zu in vivo Embryonen Merkmal Autor Jahr Dunkleres Zytoplasma POLLARD u: LEIBO 1994 Fragilere Zona pellucida DUBY 1997 Reduzierte Expression von Kommunikationseinheiten (Gap junctions) BONI et al. WRENZYCKI et al. 1999 1996 Unterschiede im Metabolismus zu in vivo KHURANA u. NIEMANN, THOMPSON 2000, 2000 Höhere Inzidenz chromosomaler Aberrationen VIUFF et al., SLIMANE et al., LONERGAN et al. 1999, 2000, 2004 Gesteigerte Temperatursensitivität LEIBO u. LOSKUTOFF 1993 Veränderung des Genexpressionsmusters WRENZYCKI et al. TESFAYE et al. SALHAB et al. 2001, 2004, 2005 2009 2013 Nicht nur die in vitro produzierten Embryonen zeigen veränderte Merkmale gegenüber In-vivo-Embryonen. Bereits im Stadium der gereiften Eizelle zeigt sich eine reduzierte Entwicklungskompetenz in vitro gereifter Oozyten gegenüber In-vivo-Eizellen. Um die Anzahl von Embryonen und deren Qualität zu steigern, ist die Verbesserung der Maturationsphase ein entscheidender Punkt (GALLI et al. 2003, PREIS et al. 2007). In 32 Literatur Arbeiten einiger Forschungsgruppen ist eine In-vitro-Prämaturationsphase (24 bis 48 Stunden) vor der eigentlichen IVM eingesetzt worden. Durch die Zugabe von Proteinkinaseinhibitoren, wie z.B. Roscovitin und Butylrolacton I, in das Reifungsmedium wird versucht, die Oozyte für ca. 24 Stunden im Germinal Vesicle(GV)/MI-Stadium zu „fixieren“ bzw. den GVBD zu blockieren. Dieser Versuchsansatz dient dazu, den letzten Abschnitt des In-vivo-Eizellwachstums, insbesondere die zytoplasmatische Reifung (Anstieg der Kinaseaktivitäten, wie z.B. M-Phase promoting factor, Mitogen-activated protein kinase), nachzustellen. Es konnte jedoch keine Verbesserung zu den Oozyten der Kontrollgruppen, die ohne die Stufe der Prämaturation produziert wurden, festgestellt werden (KUBELKA et al. 2000, MERMILLOD et al. 2000, PONDERATO et al. 2001, 2002). Nur ungefähr 30 - 40% der in vitro gereiften Oozyten erreichen das Stadium der Blastozyste, während 60 - 70% der in vivo gewonnenen Eizellen nach IVF/IVC sich zur Blastozyste entwickeln. Diese Daten implizieren, dass die IVM die Blastozystenentwicklung beeinflusst (RIZOS et al. 2002a, 2002b, WRENZYCKI u. STINSHOFF 2013). In einer Untersuchung aus dem Jahre 2010 gelang es durch den Einsatz eines mehrphasigen IVM-Systems und durch die Supplementierung des Reifungsmedium (Bovine VitroMat+FSH) mit Cilostamide (spezifischer Typ3- Phosphordiesterase-Hemmer), die bovine Blastozystenrate (45%) signifikant gegenüber der der Kontrollgruppe (20%) zu erhöhen (ALBUZ et al. 2010). 2.7. MessengerRNA-Expression Die Unterschiede zwischen in vivo gereiften Eizellen und in vitro kultivierten Oozyten zeigen sich einerseits an Hand morphologischer Kriterien und andererseits in der nachfolgenden Embryonalentwicklung. In entwicklungskompetenten Oozyten akkumulieren sich wichtige Faktoren in Form von Proteinen und von stabiler mRNA (SIRARD u. BLONDIN 1996, FAIR et al. 1997, FAIR 2003, 2010, WEBB et al. 2004, WRENZYCKI et al. 2007). Abweichungen im mRNA-Gehalt entwicklungsrelevanter Gene zwischen in vitro und in vivo gereiften bovinen Eizellen sind erstmals im Jahre 2003 aufgezeigt worden (LONERGAN et al. 2003a). In murinen, humanen und bovinen Oozyten konnte ein Unterschied im mRNA-Profil zwischen GV- und MII-Stadium demonstriert werden (ASSOU et al. 2006, CUI et al. 2007, FAIR et al. 2007). Das 33 Literatur Ergebnis weiterer Studien zeigt Differenzen im Transkriptionsprofil zwischen in vivo und in vitro gereiften bovinen Oozyten (KUES et al. 2008, KATZ-JAFFE et al. 2009). Die bis zum heutigen Tag nachgewiesenen Funktionen bzw. Aufgaben einzelner Gentranskripte in der weiblichen Reproduktion (insbesondere in bovinen Oozyten und Kumuluszellen während der Eizellreifung) werden in den nachfolgenden Kapiteln erläutert. 2.7.1. Progesteronrezeptor 2.7.1.1. Nuklearer Progesteronrezeptor Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 3 Isoformen (A, B und C) dieses Rezeptors identifiziert worden (Punkt 2.4.1. und 2.5.). Ihre Transkription erfolgt vom selben Gen (siehe Abbildung 12), jedoch durch verschiedene Promotoren (OTTANDER et al. 2000, HANEKAMP et al. 2003, REKAWIECKI et al. 2011). Da die Sequenzen der Isoformen A und C nur einen Teil der mRNA der Isoform B repräsentieren, kann die einzelne Analyse dieser Isoformen nicht vorgenommen werden (OTTANDER et al. 2000, SHIMADA et al. 2004a, 2004b, REKAWIECKI et al. 2011). 1 PGRB PGRA 2 3 4 5 6 PGRC Abbildung 12: Progesteronrezeptorgen (REKAWIECKI et al. 2011) Zahlen 1 – 8=Anzahl der Exons Pfeile=Promoter für die entsprechende Isofom 34 7 8 Literatur In der nachfolgenden Tabelle 7 ist der Nachweis der PGR-mRNA in verschiedenen Geweben/Zellen in unterschiedlichen Tierarten dargestellt. Beim Rind sind in allen Stadien der frühen bovinen Embryonalentwicklung, außer der Morula, Transkripte für den PGR nachgewiesen worden. Bei dem Probenmaterial handelt es sich um bovine unreife Eizellen und in vitro generierte Embryonen (2- bis 4-Zeller, 8-Zeller, 16-Zeller, Morula und Blastozystenstadium, Oozyten im MII-Stadium sowie Zygoten sind nicht analysiert worden). Der höchste mRNA-Gehalt ist in unreifen Oozyten und der niedrigste in 2- bis 4- Zellern und 16-Zellern gemessen worden (CLEMENTE et al. 2009). Die Analyse des mRNA-Gehaltes für den PGR zeigt, dass in in vitro gereiften bovinen Kumuluszellen die Transkriptmenge im Vergleich zu unreifen Kumuluszellen signifikant erhöht ist (SALHAB et al. 2011). 35 Literatur Tabelle 7: MessengerRNA-Expression des PGR in unterschiedlichen Geweben/Zellen Referenz GONCALVES et al. (2009) KENNGOTT et al. (2011) OKUMU et al. (2010) BERISHA et al. (2002) BERISHA et al. (2002) SAKUMOTO et al. (2009) SHIMADA et al. (2004a) Tierart Gewebe/Zellen Expression Kumuluszellen 15 – 50% der Kumuluszellen exprimieren PGR während Proöstrus, Östrus und Anöstrus (RT-qPCR*) Ampullagewebe Im Epithelium während Follikelphase stärker exprimiert als in der Mitte der Gelbkörperphase (RT-qPCR*) Rind Uterus (Färsen) Am 5. Zyklustag am höchsten, signifikanter Abfall zwischen Tag 7 und 13 des Östrus (RT-qPCR*) Rind Follikel (> 4mm); Granulosa- und Theka internazellen Ca. 5 fg/μg PGR-RNA in Follikeln Ø 4mm; ca. 25 fg/μg PGR-RNA in Follikeln Ø >14mm (RT-qPCR*) Corpus luteum Ca. 2,5 fg/μg PGR-RNA an Tag 1 des Östrus, ca. 12 fg/μg PGRRNA Tag 13-16 des Östrus (RT-qPCR*) Corpus luteum 6,0 relativer mRNA-PGR-Gehalt in der frühen Lutealphase, (RT-qPCR*) und im weiteren Verlauf abfallend bis auf 0,1 in der Rückbildungsphase des Corpus luteum Kumuluszellen Relativer mRNA-Gehalt an PGR von 0,1 auf 0,7 innerhalb der ersten 10h IVM (RT-PCR*) Hund Rind Rind Rind Schwein * angewendete Nachweismethode 36 Literatur 2.7.1.2. Membranprogesteronrezeptoren Die Membranprogesteronrezeptoren (mPRα = PAQR7, mPRβ = PAQR8 und mPRγ = PAQR5) vermitteln einen nicht-genomischen Effekt des Progesterons (siehe Punkt 2.4.2. und 2.5.). Im ovinen Corpus luteum sind mRNA-Mengen für den PAQR7 sowohl in kleinen als auch großen Lutealzellen nachgewiesen worden. Der höchste Gehalt ist am Tag 10 des Zyklus detektierbar, wohingegen die Analyse des ovinen Uterus die höchste Expression des PAQR7 am 4. Zyklustag zeigt. Die Progesteronkonzentration im Blutserum der Mutterschafe steigt mit Beginn des Zyklus langsam an, erreicht seinen Höhepunkt an Tag 8 und sinkt zum Ende des Zyklus. Die PAQR8-Expression ähnelt dem Verlauf der Progesteronserumkonzentration während des Zyklus (ASHLEY et al. 2006, 2009). Der Gelbkörper tragender Ratten exprimiert Paqr7-, 8- und 5-Transkripte. Interessanter Weise bleibt der mRNA-Gehalt von Paqr8 im Verlauf der Trächtigkeit konstant, jedoch steigt die Transkriptmenge für Paqr7 und Paqr5 an. Ein Abfall in der mRNA-Menge von Paqr7 und Paqr5 erfolgt kurz vor der Geburt, einhergehend mit einem sinkenden Progesteronwert (CAI u. STOCCO 2005). Die Autoren leiten aus diesen Ergebnissen ab, das der Paqr8 einerseits durch Progesteron reguliert wird und andererseits Einfluss auf die Gelbkörperfunktion nimmt (CAI u. STOCCO 2005, ASHLEY et al. 2009). Untersuchungen beim Rind bezüglich (bzgl.) der mRNA-Expression der mPR’s in Kumuluszellen bzw. Oozyten sind nicht bekannt. 2.7.1.3. Progesteronrezeptormembrankomponete 1 und 2 Die PGRMC1 und 2 sind an der nicht-genomischen Wirkung von Progesteron beteiligt (CAHILL 2007). Die Effekte der PGRMC1 und 2 sind den Punkten 2.4.3. und 2.5. zu entnehmen. Bei der Analyse der Expression von Pgrmc1 und 2 im Corpus luteum tragender Ratten zeigt sich, dass die mRNA-Menge des Pgrmc2 im Verlauf der Trächtigkeit konstant bleibt. Im Gegensatz dazu erhöht sich im selben Zeitraum der mRNA-Gehalt des Pgrmc1 (CAI u. STOCCO 2005). In einer In-vitro-Studie zur Analyse des mRNA-Gehaltes für PGR, PGRMC1 und PGRMC2 sind bovine unreife Eizellen und in vitro generierte Embryonen (2- bis 4-Zeller, 8-Zeller, 16-Zeller, Morula und 37 Literatur Blastozystenstadium) verwendet worden. Die Expression für PGRMC1- und 2-mRNA findet in allen Entwicklungsstadien statt. Von der Oozyte bis zum Zeitpunkt der Aktivierung des Genoms des Embryos verringert sich der mRNA-Gehalt, gefolgt von einem Anstieg im Stadium der Blastozyste (CLEMENTE et al. 2009). Das bovine Corpus luteum weist ebenfalls eine zyklusabhängige Expression der PGRMC1-mRNA auf. Die niedrigsten mRNA-Gehalte sind in den ersten fünf Tagen des Östrus und die höchsten an den Tagen 6 bis 10 ermittelt worden (KOWALIK u. KOTWICA 2008). Weitere Analysen zur mRNA-Menge des PGRMC1- und 2 in bovinen Kumuluszellen sind nicht bekannt. 2.7.2. Zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) Bei der Bildung von Prostaglandinen ist die Freisetzung der Arachidonsäure aus den Membranglycerolphospholipiden (Membranvesikeln) der erste regulierende Schritt, der durch die cPLA2 induziert wird (CLARK et al. 1991). Die Wanderung der cPLA2 vom Zytosol zur Membran wird durch eine Änderung im intrazellulären freien Kalziumspiegel oder die Phosphorylierung der cPLA2 durch Mitogen-ActivatedProtein-Kinase ausgelöst (CLARK et al. 1991, GIJON et al. 1999). Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 3 Enzyme der cPLA2-Subfamilie analysiert worden: PLA2G4A (cPLA2α), PLA2G4B (cPLA2β) und PLA2G4C (cPLA2γ; PICKARD et al. 1999, SONG et al. 1999, DIOUF et al. 2006). Pla2g4a-KO-Mäuse haben eine verzögerte Implantation und eine gestörte Entwicklung der Trächtigkeit (BONVENTRE et al. 1997, SONG et al. 2002). Die Annahme, dass cPLA2 an der Implantation beteiligt ist, wird durch die Messung von hohen Konzentrationen an cPLA2-mRNA im ovinen Endometrium an Tag 11 des Zyklus unterstützt (GRAF et al. 1999). Auch ist die cPLA2 an der Ovulation beteiligt. Nach einer LH/hCG-Behandlung von Ratten steigt die Aktivität der kalziumabhängigen Pla2g4a im Ovar an (BONNEY u. WILSON 1993). Beim Rind wird vermutet, dass die Enzyme PTGS2 und PLA2G4A während der Ovulation metabolisch gekoppelt sind und die Prostaglandinsynthese, die für die Ovulation und Eizellreifung benötigt wird, sicherstellen (DIOUF et al. 2006). In der Tabelle 8 sind Studienergebnisse bezüglich spezifischer Wirkungen auf die cPLA2mRNA-Menge aufgeführt. 38 Literatur Tabelle 8: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von cPLA2 Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor GRAF et al. (1999) Ovines Endometrium Simulierter Östruszyklus DUFFY et al. (2005) Granulosazellen periovulatorischer Follikel des Primaten DIOUF et al. (2006) Bovine Granulosazellen Ergebnis Exprimierung ab Tag 11 des Zyklus hCG-Injektion Anstieg 12 h nach hCGInjektion hCG-Injektion 45-facher Anstieg 24 h nach hCG-Injektion Studien, in denen der mRNA-Gehalt der cPLA2 boviner KOK, Oozyten und/oder Kumuluszellen analysiert wurden, sind zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit nicht bekannt. 2.7.3. Prostaglandin-Endoperoxidase Synthase 2 (PTGS2) Die Prostaglandin-Endoperoxidase Synthase 2 (Cyclooxygeanse-2) vermittelt die Umwandlung der Arachidonsäure in Prostaglandin H2 (MURAKAMI u. KUDO 2004). Dieses instabile Zwischenprodukt (Prostaglandin H2) wird durch spezifische Prostaglandinsynthasen in verschiedenste Prostaglandine (PG) konvertiert. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind in Säugetieren 2 Isoformen (PTGS1/COX-1 und PTGS2/COX2) der PTGS identifiziert worden (NUTTINCK et al. 2011). Beide Isoformen besitzen eine identische katalytische Aktivität und weisen eine signifikante Homologie in ihrer Sequenz auf (DUBOIS et al. 1998, WILLIAMS et al. 1999). Der PTGS1 wird eine „Housekeeping“-Rolle zugeschrieben und sie wird in nahezu allen Geweben exprimiert (PALMER u. HENRICH 1995, TREVETHICK et al. 1995, CROFFORD 1997), wohingegen die PTGS2 erst durch physiologische und/oder proinflammatorische Stimuli (z.B. epidermal growth factor, Interleukin) transient im entsprechenden Gewebe induziert wird (DUBOIS et al. 1998, WILLIAMS et al. 1999). Eine Ausnahme 39 Literatur bildet die Ovulation und Implantation der Blastozyste. Bei diesen Vorgängen wird die PTGS2 konstitutiv exprimiert (TSAFRIRI 1995, CHAKRABORTY et al. 1996, DUBOIS et al. 1998, STACK u. DUBOIS 2001). Zum Zeitpunkt der präovulatorischen Gonadotropin-Ausschüttung (LH-Peak) wird die Expression der PTGS2 hochreguliert, um einige Stunden vor Ovulation in den Kumuluszellen und Wandgranulosazellen weiter drastisch zu steigen (SIROIS 1994, LIU et al. 1997, DAVIS et al. 1999, CALDER et al. 2001, NUTTINCK et al. 2002, MCKENZIE et al. 2004). Dieser Anstieg wird begleitet von einer Erhöhung des intrafollikulären Gehaltes an Prostaglandinen (TAKAHASHI et al. 2006). In diesem Zusammenhang ist Prostaglandin E2 (PGE2) das Prostaglandin, welches von den Kumuluszellen am meisten synthetisiert wird (TAKAHASHI et al. 2006, NUTTINCK et al. 2002, 2008). Durch Hemmung der PTGS2 (NS-398 = selektiver PTGS-Inhibitor) ist zum einen die Kumuluszellexpansion und zum anderen die Anzahl der bovinen Eizellen, die das MII-Stadium erreichen, vermindert (NUTTINCK et al. 2011). Diese Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass die PTGS2-Aktivität in bovinen Kumuluszellen an der Wiederaufnahme der Meiose in Oozyten und vermutlich insbesondere an der Regulierung der Mikrotubuliorganisation beteiligt ist (NUTTNICK et al. 2011). Im Gelbkörpergewebe ist PGE2, ein Endprodukt der PTGS2, in die Steroidhormonsynthese involviert. Die Stimulierung boviner Lutealzellen mit PGE2 erhöht den mRNA-Gehalt an CYP11A1, STAR-Protein und HSD3B1 (REKAWIECKI et al. 2005). Die nachfolgende Tabelle 9 zeigt Ergebnisse von Studien hinsichtlich der Einflussfaktoren auf die PTGS2-mRNA-Menge. Untersuchungen, die sich speziell mit der Analyse der PTGS2-mRNA-Menge in bovinen Kumuluszellen beschäftigen, sind nicht bekannt. 40 Literatur Tabelle 9: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von PTGS2 Referenz Einflussfaktor Ergebnis hCG-Injektion Dramatischer Anstieg 18h nach Injektion Unreife bovine KOK IVM (TCM199 + Gonadotropine + 10% Serum) Anstieg 6 und 12h nach IVMBeginn NUTTINCK et al. (2002) Unreife Bovine KOK IVM (TCM199 + Gonadotropin + 10% FCS + 10ng/ml EGF) Anstieg 24h nach IVMBeginn DIOUF et al. (2006) Bovine Granulosazellen (zyklussynchronisierte Färsen) hCG-Injektion (3000 I.U.) Anstieg 18h nach hCG-Injektion SIROIS (1994) CALDER et al. (2001) Versuchsmaterial Bovine präovulatorische Follikel (Theka interna und Granulosazellen) 2.7.4. Prostaglandin F2α Rezeptor (PTGFR) Die Biosynthese von PGF2α erfolgt über das instabile Zwischenprodukt PGH2 oder über PGE2. Diese Schritte werden durch die Aldo-Keto-Reduktasen (AKR1C1 und AKR1C2) katalysiert (NISHIZAWA et al. 2000). PGF2α bindet an seinen spezifischen Rezeptor, den PTGFR. Beim Rind löst eine PGF2α-Injektion innerhalb von 5 Minuten eine signifikante Reduzierung der PTGFR-mRNA-Expression im Corpus luteumGewebe aus. Des Weiteren sinkt die Progesteronkonzentration im Blutplasma 30 Minuten post PGF2α-Injektion (SHIRASUNA et al. 2012). In der bovinen Follikelflüssigkeit ist 24 Stunden nach einer GnRH-Injektion ein Anstieg der PGF2αund PGE-Konzentration festgestellt worden (SIROIS et al. 1994, BRIDGES et al. 2006). Dieser Effekt konnte in einer Zellkultur wiederholt werden. Es zeigt sich in der Kultur boviner Follikelwandzellen (Theka- und Granulosazellen), die 3,5 Stunden post GnRH-Injektion gewonnen wurden, ein Anstieg in der PGF2α-Konzentration im Kulturmedium (Kulturdauer 24 – 48 Stunden, BRIDGES et al. 2006). Die Autoren vermuten einen zellspezifischen Effekt von PGF2α und seinem Rezeptor in der 41 Literatur präovulatorischen Phase (BRIDGES u. FORTUNE 2007). Weitere publizierte Studien bezüglich der mRNA-Expression des PTGFR in bovinen Kumuluszellen sind nicht bekannt. 2.7.5. Enzyme in der Steroidgenese Der Syntheseweg für das Steroidhormon Progesteron ist dem Kapitel 2.2.1. zu entnehmen. Die Regulierung von Transkripten, die an der Steroidgenese in den Granulosazellen beteiligt sind, findet durch LH statt (SEKAR et al. 2000, SASSON et al. 2004, LUO et al. 2011). Durch Bindung von LH an seinen Rezeptor wird die Proteinkinase A aktiviert. Im nachfolgendem erhöht sich die Aktivität der CYP11A1, HSD3B und STAR. Daraus resultiert ein Anstieg in der Progesteronsynthese (SUGAWARA et al. 1995, NISWENDER et al. 2000, STOCCO 2000, REKAWIECKI et al. 2005). Die Zugabe von FSH in das Reifungsmedium boviner Granulosazellen (aus Antralfollikeln 2-4 mm) löst (nach einer Maturationsphase von 24 Stunden) eine signifikante Erhöhung der mRNA-Mengen von CYP11A1, STAR und HSD3B1 im Vergleich zu Zellen einer Kontrollgruppe aus. Ebenso konnte im Reifungsmedium mit FSH eine höhere Progesteronkonzentration (22 – 30 ng/ml) im Vergleich zum Kontrollmedium (14 ng/ml) gemessen werden (ORISAKA et al. 2006). Enzyme, die an der Steroidbiosynthese (z.B. STAR und CYP11A1) beteiligt sind, konnten in bovinen Granulosazellen, KOK und isolierten bovinen Kumuluszellen nachgewiesen werden (MINGOTI et al. 1995, 2002, NUTTINCK et al 2008). 2.7.5.1. Steroidogenic Acute Regulatory Protein (STAR) Der limitierende Faktor der Steroidbiosynthese ist der Transport von Cholesterin zur inneren Mitochondrienmembran, an dem das STAR-Protein beteiligt ist. Eine Studie bei Mäusen zeigt, dass durch die Inaktivierung des Star-Proteins eine starke Verminderung der Steroidgenese hervorgerufen wird (CARON et al. 1997). Die Erhöhung des mRNA-Gehaltes für STAR wird durch einen steroidogenen Stimulus (LH), der auf die Steroidogenic Factor Elements im STAR-Promoter wirkt, ausgelöst (CLARK et al. 1994, STOCCO u. CLARK 1996, IVELL et al. 2000, STOCCO 2000). 42 Literatur Einflussfaktoren auf die mRNA-Menge von STAR sind in der nachfolgenden Tabelle 10 aufgelistet. Tabelle 10: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von STAR Referenz IVELL et al. (2000) Versuchsmaterial Bovine Thekazellkultur Einflussfaktor LH-Zugabe in das Kulturmedium Ergebnis Anstieg 2 h nach LH-Zugabe REKAWIECKI et al. (2005) Bovine Lutealzellkultur LH-Zugabe in das Kulturmedium (100 ng/ml) Anstieg ORISAKA et al. (2006) Bovine Granulosazellkultur (aus Follikeln mit einer Größe von 2-4 mm) FSH-Zugabe in das Kulturmedium Anstieg LUO et al. (2011) Thekazellen (Kühe) Injektion GnRHAntagonist (3μg/kg KG) Abnahme 12 h und 24 h nach Acyline-Injektion Bovine Kumuluszellen IVM (TCM199 + 10ng/ml EGF + 10% FCS) Signifikanter Anstieg 22 h nach IVMBeginn SALHAB et al. (2011) 2.7.5.2. Hydroxy-Delta-5-Steroid-Dehydrogenase (HSD3B) Das Enzym HSD3B katalysiert die Umwandlung von Pregnenolon zu Progesteron in Granulosazellen und von Dehydroepiandrosteron zu Androstenedion in Thekazellen (CONLEY u. BIRD 1997). Transkriptmengen der HSD3B1 sind beim Rind in Granulosa- und Thekazellen präovulatorischer Follikel (Folikel-Ø > 8mm) und vom Stadium der in vitro gereiften Oozyte bis zur Blastozyste nachgewiesen worden (BAO et al. 1997b, a, CHIAPPE et al. 2002). Faktoren, die sich auf die mRNA-Menge von HSD3B1 auswirken, sind der Tabelle 11 zu entnehmen. 43 Literatur Tabelle 11: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von HSD3B1 Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor LH-Zugabe in das Kulturmedium (100 ng/ml) Ergebnis REKAWIECKI et al. (2005) Bovine Lutealzellkultur ORISAKA et al. (2006) Bovine Granulosazellkultur (aus 2-4 mm großen Follikeln) FSH-Zugabe in das Kulturmedium Anstieg PARADIS et al. (2010) Porcine Kumuluszellkultur Zugabe porciner Oozyten in das Kulturmedium Anstieg nach 22 Stunden Anstieg In bovinen Granulosazellen (Follikel-Ø >8mm) erhöht sich nach einer Kulturphase von 6 Tagen im serumfreien Medium die mRNA-Menge für HSD3B1 deutlich. Auch ist ein geringer Anstieg für die CYP11A1 verzeichnet worden (SAHMI et al. 2004). Die anschließende Progesteronmessung im Medium zeigt einen beachtlichen Anstieg in der Sekretion, zum einen durch aus der Follikelflüssigkeit gewonnenen Granulosazellen (von 400 [2. Kulturtag] auf 900 ng/μg DNA) und zum anderen durch Granulosazellen der Follikelwand (von 250 [2. Kulturtag] auf 500 ng/μg DNA, SAHMI et al. 2004). Die Autoren vermuten, dass die HSD3B1 in bovinen Granulosazellen einen wichtigen Regulator der Progesteronproduktion darstellt (SAHMI et al. 2004). Ergebnisse aus anderen Studien, die sich mit der mRNA-Analyse der HSD3B1 in bovinen Kumuluszellen beschäftigen, sind unbekannt. 2.7.5.3. P450, Familie 19, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP19A1) In Follikeln des Rindes ist die Synthese von Steroiden abhängig vom Entwicklungsstadium des Follikels und der Gonadotropin-Ausschüttung. Die CYP19A1 ist das Schlüsselenzym für die Östrogen-Biosynthese. In bovinen Antralfollikeln findet in Granulosazellen die Synthese und Konvertierung von Androgenen zu 17β-Östradiol durch die CYP19A1 statt (CHRYSSIKOPOULOS 2000, SCHOENFELDER et al. 2003). Im Verlauf der Follikelentwicklung zum dominanten Follikel steigt der mRNA- 44 Literatur Gehalt der CYP19A1 in bovinen Granulosazellen an (TIAN et al. 1995, BAO et al. 1997a). Zum selben Zeitpunkt steigt die 17β-Östradiol-Konzentration in der Follikelflüssigkeit (XU et al. 1995, BAO et al. 1997a, HAMEL et al. 2005). Östrogene, insbesondere 17β-Östradiol, erhöhen zum einen die Anzahl der ausgebildeten Gap junctions zwischen Granulosazellen und die Expression des LHCGR in selbigen Zellen und zum anderen wirken sie hemmend auf die Apoptose von Granulosazellen (RICHARDS et al. 1979, BURGHARDT u. ANDERSON 1981, HSUEH et al. 1994, LUO u. WILTBANK 2006). Einflussfaktoren auf die mRNA-Menge von CYP19A1 beim Rind zeigt Tabelle 12. Tabelle 12: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von CYP19A1 Referenz KOMAR et al. (2001) Versuchsmaterial Bovine Follikelwandzellen (Theka- und Granulosazellen) Einflussfaktor Ergebnis Injektion GnRHAnalog Signifikante Abnahme 6 Stunden nach GnRH-Injektion Anstieg während der ersten 4 h nach IVM-Beginn, gefolgt von einer Abnahme SCHOENFELDE R et al. (2003) Unreife bovine KOK IVM (MPM199 = TCM199 + 10% FCS + FSH + LH) HAMEL et al. (2005) Bovine Granulosazellkultur AndrostendionZugabe (0,1 bis 1 oder 10 μM) in das Kulturmedium Anstieg Bovine Granulosazellkultur Zugabe von 17βÖstradiol (0,1 – 300 n/ml) oder Testosteron (10 – 300 ng/ml) oder Dihydrotestostero n (10 – 100 ng/ml) zur Kultur (M199) Anstieg LUO und WILTBANK (2006) - Fortsetzung auf nächster Seite – 45 Literatur Tabelle 12: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von CYP19A1 (1. Fortsetzung) Referenz LUO und WILTBANK (2006) SALHAB et al. (2011) Versuchsmaterial Bovine Granulosazellkultur (M199) Bovine KOK Einflussfaktor Ergebnis Zugabe von 17β-Östradiol (30 ng/ml) oder Testosteron (30 ng/ml) Anstieg (Tag 1, 3 und 5 untersucht) IVM (TCM199 + 10% EGF + 0% FCS) Anstieg in Kumuluszellen während der ersten 3 h nach IVMBeginn 2.7.6. Follikelstimulierender Hormonrezeptor (FSHR) FSH beeinflusst die Follikelentwicklung und wirkt sich auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle aus (HARPER und BRACKETT 1993, IZADYAR et al. 1998, CALDER et al. 2003, ADRIAENS et al. 2004, SIRARD et al. 2007). In einer Studie mit Fshr-KOMäusen zeigen die weiblichen Tiere Ovulationsprobleme, einen gestörten Zyklus und waren infertil (DANILOVICH et al. 2000). In bovinen und porcinen KOK ist der FSHR durch Aktivierung der Proteinkinase C an der Wiederaufnahme der Meiose in der Eizelle beteiligt (ROSE-HELLEKANT u. BAVISTER 1996, SU et al. 1999). Dieser Effekt von FSH auf die Oozyte wird durch Kumuluszellen, die den FSHR ausbilden, vermittelt (HARPER und BRACKETT 1993, NUTTINCK et al. 2004, SIRARD et al. 2007). FSHR-mRNA ist in bovinen Kumuluszellen nachgewiesen worden (NUTTINCK et al. 2004, VAN TOL et al. 1996). In in vitro gereiften bovinen KOK sinkt der mRNAGehalt für den FSHR signifikant gegenüber dem in unreifen KOK. Dagegen ist bei einem Vergleich zwischen in vivo generierten KOK und unreifen KOK kein signifikanter Unterschied im FSHR-mRNA-Gehalt festzustellen (NUTTINCK et al. 2004). Weitere Ergebnisse bezüglich bestimmter Wirkungen auf die mRNA-Menge von FSHR sind in der nachfolgenden Tabelle 13 aufgeführt. 46 Literatur Tabelle 13: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von FSHR Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor IVM (TCM199 + 10% Serum + 1000 ng/ml pFSH + 5000 ng/ml pLH + 1000 ng/ml Östradiol) Ergebnis CALDER et al. (2003) Unreife bovine KOK LUO et al. (2011) Granulosazellen (Kühe) Gabe von GnRHAntagonist (3 μg/kg KG Acyline) Kein Effekt 12/24 h nach Injektion SALHAB et al. (2011) Unreife bovine Kumuluszellen IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF) Abnahme 3 und 10 h nach IVM-Beginn Abnahme 6 h nach IVMBeginn 2.7.7. Luteinisierender Hormon/Choriongonadotropin-Rezeptor (LHCGR) Für die Entwicklung, das Wachstum und die Ovulation des dominanten Follikels ist die Wirkung des LH auf Granulosa- und Thekazellen ein wichtiger Aspekt. Einerseits stimuliert LH in Thekazellen die Expression von Enzymen (die in die Androgensynthese involviert sind), wie z.B.: STAR, CYP11A1 und Zytochrome P450, Familie 17, Subfamilie A, Polypeptid 1 (CYP17A1, MAGOFFIN 1989, IVELL et al. 2000, LUO et al. 2011) und andererseits wird durch das LH in Granulosazellen die mRNA-Expression von Genen, die an der Signaltransduktion und der Apoptose beteiligt sind, reguliert (SEKAR et al. 2000, SASSON et al. 2004, LUO et al. 2011). Beim Rind sind sowohl in Granulosazellen als auch Thekazellen Gentranskripte für den LHCGR identifiziert worden (XU et al. 1995, EVANS u. FORTUNE 1997). Untersuchungen zeigen, dass beim Rind der LH-Peak kurz vor der Ovulation eine drastische Erhöhung der Expression des LHCGR in bovinen Granulosazellen auslöst. Dieser Vorgang wird auch mit der Selektion zum dominanten Follikel assoziiert (BAO et al. 1997a, RHODES et al. 2001, MIHM et al. 2006, NOGUEIRA et al. 2007, NIMZ et al. 2009). Weiterhin löst die Injektion von Kühen mit einem GnRH-Antagonisten (3μg/kg Körpergewicht) nach 12 und 24 Stunden eine dramatische Abnahme des LHCGR-mRNA-Gehaltes in den Granulosazellen aus (LUO et al. 2011). In einer Studie aus dem Jahr 2004 (NUTTINCK et al. 2004) ist weder in unreifen noch in in vitro 47 Literatur gereiften KOK LHCGR-mRNA nachgewiesen worden. In einer anderen Arbeit konnte der LHCGR in unreifen und in vitro gereiften KOK identifiziert werden. Hier zeigte sich ein Trend zur Erhöhung der Transkriptmenge des LHCGRs zwischen 6 und 24 h nach IVM-Beginn (TCM199 + 10%Serum + 1000 ng/ml pFSH + 5000 ng/ml pLH + 1000 ng/ml Östradiol, CALDER et al. 2003). 2.7.8. Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) Der Growth and Differentiation Factor 9 gehört zu der Transforming Growth Faktor β (TGF β)-Superfamilie. Für die zytoplasmatische Reifung der Oozyte und den Erwerb ihrer Entwicklungskompetenz ist ein Transport von Wachstumsfaktoren, wie z.B. GDF9 und Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15), von der Oozyte zu den Kumuluszellen notwendig (ASSEY et al. 1994, HYTTEL et al. 1997, EPPIG 2001, GILCHRIST et al. 2004, GILCHRIST u. THOMPSON 2007). Der GDF9 gehört mit dem BMP15 zu den Faktoren, die durch die Oozyte selbst sezerniert werden. Dadurch ist die Eizelle in der Lage, die Kumuluszellfunktion, die strukturelle Umstellung und dadurch bedingt den charakteristischen Phänotyp des KOK zu steuern. In vitro reguliert der Gdf9 die Expansion von murinen Kumuluszellen (SALUSTRI et al. 1990, ELVIN et al. 1999, MATZUK 2000, VANDERHYDEN et al. 2003, GUI u. JOYCE 2005). Im Gegensatz zu den vorangegangenen Untersuchungen präsentiert eine Studie aus dem Jahre 2005, dass Gdf9 weder allein noch in Kombination mit Tumor growth factor β (Tgfβ) in die Expansion von Kumuluszellen der Maus involviert ist (DRAGOVIC et al. 2005). Beim Rind ist einerseits die Beteiligung des GDF9 an der Follikelentwicklung und andererseits die Expression des GDF9 in Kumulus- und Eizellen aller Follikelstadien nachgewiesen worden (BODENSTEINER et al. 1999, LONERGAN et al. 2003, JUENGEL et al. 2009, HOSOE et al. 2011). Die nachfolgende Tabelle 14 zeigt die Wirkung bestimmter Faktoren auf die Expression des GDF9 in bovinen Oozyten. 48 Literatur Tabelle 14: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von GDF9 Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor LONERGAN et al. (2003) Unreife bovine Oozyten IVM (TCM199 + 10 % FCS + 10 ng/ml EGF) Ergebnis Abnahme in reifen Oozyten DONNISON u. PFEFFER (2004) Unreife bovine Oozyten Follikelgröße Ø > 5mm im Vergleich zu Ø < 2mm Reduziert in Oozyten aus Follikeln < 2mm MOUROT et al. (2006) Unreife bovine Oozyten Zusatz rhFSH zum Reifungsmedium (SOF + 0,8 % BSA + modified eagle medium) Kein Effekt 2.7.9. Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) Der BMP15, ein Mitglied der TGFβ-Superfamily und ein durch die Oozyte sezernierter Faktor, hat Einfluss auf die Follikelentwicklung, insbesondere auf die Proliferation von Granulosazellen und die FSH-induzierte Erhöhung der mRNA-Expression für Star, Cyp11a1, Hsd3b und Lhr (Ratte, OTSUKA et al. 2000, 2001). Der BMP15 ist in anderen Wiederkäuerarten (Schaf und Ziege) auf Protein- und mRNA-Ebene in Follikeln aller Entwicklungsstadien nachgewiesen worden (JUENGEL et al. 2002, SILVA et al. 2005). Beim Rind erfolgte die Identifizierung von BMP15-Transkripten in In-vivo-Oozyten und -Kumuluszellen (HOSOE et al. 2011). Durch die Zugabe von BMP15 in das Reifungsmedium (Bovine VitroMat + 0,1 I.U./ml FSH) von bovinen KOK erhöht sich die Blastozystenrate von 41 auf 58% (HUSSEIN et al. 2006) und in bovinen Kumuluszellen selbst (in vitro) reduziert BMP15 signifikant ihre eigene Apoptose (HUSSEIN et al. 2005). Faktoren, die sich beim Rind auf die mRNA-Menge von BMP15 in Oozyten auswirken, sind in der nachfolgenden Tabelle 15 aufgeführt. 49 Literatur Tabelle 15: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von BMP15 Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor DONNISON u. PFEFFER (2004) Unreife bovine Oozyten (Kühe, Follikelgröße > 5mm im Vergleich zu < 2mm) 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + Gonadotropine) Unreife bovine Oozyten Zugabe rhFSH zum Reifungsmedium (SOF + 0,8 % BSA + modified eagle medium) MOUROT et al. (2006) Ergebnis Follikelgröße aus der die Oozyten stammen hat keinen Effekt auf den mRNAGehalt Kein Effekt 6h nach IVM-Beginn 2.7.10. Solute Carrier Family 2A Isoform 1 (SLC2A1) Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 14 Glukosetransporter, die der Solute Carrier Family (SLC) 2A Proteinfamilie angehören, identifiziert worden (ULDRY u. THORENS 2004). Diese Na+-unabhängigen Membranproteine vermitteln die rapide Beförderung von Glukose in oder aus der Zelle entlang eines Konzentrationsgradienten (KASAHARA u. HINKLE 1977, CARRUTHERS et al. 2009). Glukose ist an der Regulation der Gentranskription, Hormonsekretion, Protein- und Lipidsynthese und der Enzymaktivität beteiligt (YAMAMOTO et al. 2007, ZHAO u. KEATING 2007, YU u. AUWERX 2009, WELLEN et al. 2009). Bei der Metabolisierung von Glukose entsteht sowohl Acetyl-CoA als auch Nicotinamidadenindinukleotid. Diese beiden Produkte beeinflussen Regulatoren der Gentranskription, wie z.B. Histone (YAMAMOTO et al. 2007, WELLEN et al. 2009, YU und AUWERX 2009). Die am häufigsten vorkommende Isoform der SLC2A-Familie ist der SLC2A1. Er wird in vielen fetalen und adulten Geweben (Gehirn) und Zelltypen (Erythrozyten) von Säugetieren exprimiert (MUECKLER 1994). In der frühen Embryonalentwicklung bzw. Implantationsphase spielt der SLC2A1 eine entscheidende Rolle (WRENZYCKI et al. 1998, 1999, 2001, NIEMANN und WRENZYCKI 2000, CARRUTHERS et al. 2009). Da die Fähigkeit der Eizelle, Glukose zu metabolisieren, begrenzt ist, erhält sie ihre Energie bevorzugt von 50 Literatur den sie umgebenen Kumuluszellen. Diese verstoffwechseln die Glukose und leiten die entstandenen Metabolite wie z.B. Pyruvat und Laktat via Gap junctions an die Oozyte weiter (BIGGERS et al. 1967, EPPIG 1991, LONERGAN et al. 2003). In bovinen unreifen und reifen Oozyten ist mRNA für den SLC2A1 nachgewiesen worden, wobei die mRNA-Mengen der einzelnen Gruppen (unreif und reif) ähnlich sind (WRENZYCKI et al. 1999, AUGUSTIN et al. 2001, LONERGAN et al. 2003). Die Tabelle 16 zeigt Faktoren, die den mRNA-Gehalt von SLC2A1 beeinflussen. 51 Literatur Tabelle 16: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von SLC2A1 Referenz Versuchsmaterial Einflussfaktor Ergebnis LONERGAN et al. (2003) Unreife bovine Oozyten IVM (TCM199 + 10% FCS+10 ng/ml EGF) Kein Effekt gegenüber in vivo gereiften Oozyten Unreife bovine KOK IVP (bis Tag 4: 20% O2 und 6% CO2; ab Tag 5: 2, 7 oder 20% O2; modifiziertes SOFaa–Medium) Anstieg in Blastozysten, die unter 2% O2 kultiviert wurden Unreife bovine KOK Zugabe von ECS (Estrus Cow Serum) in das Reifungsmedium (TCM199 + FSH + hCG + Östradiol) Kein Effekt gegenüber in vivo gereiften Morulae Unreife bovine KOK Zugabe von 10 ng/ml EGF und 10% Synthetic Serum Substitute (SSS) in das Reifungsmedium (TCM199) Signifikante Abnahme in Blastozysten (Tag 8) gegenüber Kontrolle (Medium: TCM199 + 10% FCS) Unreife bovine Kumuluszellen IVM unter 5% O2-Konzentration (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF) Signifikanter Anstieg im Vergleich zu IVM unter 20% O2Konz. HARVEY et al. (2004) OLIVEIRA et al. (2006) SAGIRKAYA et al. (2007) BERMEJOÁLVAREZ et al. (2010) 2.7.11. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) Die PPARs sind der Familie der nuklearen Hormonrezeptoren zuzuordnen (BERGER u. MOLLER 2002, KOWALEWSKI et al. 2009). Durch die Bindungen von Liganden, wie z.B. Eicosanoiden oder ungesättigten Fettsäuren, findet die Aktivierung des Rezeptors in der Zielzelle statt. Im Zellkern selbst wirkt der PPAR durch die Bindung an das spezifische Element („response element“) des Promoters auf die Kontrolle der Genexpression ein (BERGER u. MOLLER 2002). Der PPAR ist in diverse Prozesse, wie z.B. die Steroidgenese, die Angiogenese, 52 den Zellzyklus und den Literatur Lipidmetabolismus, involviert (GELMAN et al. 1999, ROCCHI u. AUWERX 1999, PETERS et al. 2000, MARGELI et al. 2003, THEOCHARIS et al. 2004, KOMAR 2005). Bis zum heutigen Zeitpunkt sind drei Subtypen des PPARs (α, γ, δ) identifiziert worden (KOMAR 2005). Die nachfolgende Tabelle 17 zeigt die Spezies, bei denen der PPARγ im Ovar identifiziert werden konnte. Tabelle 17: Identifizierung des PPARγ im Ovar verschiedener Spezies Referenz Spezies LAMBE u. TUGWOOD (1996) Mensch SCHOEPPE et al. (2002) Schwein LÖHRKE et al. (1998) und MOHAN et al. (2003) Rind CUI et al. (2002) Maus KOMAR et al. (2001) Ratte Der Nachweis dieses nuklearen Hormonrezeptors im Ovar unterschiedlicher Arten deutet auf eine Involvierung in der Regulierung der Follikelentwicklung, Ovulation und/oder Luteinisierung hin (KOWALEWSKI et al. 2009, KOMAR et al. 2001, KOMAR u. CURRY 2003, FROMENT et al. 2003). Bei der Ratte zeigt sich vor dem LH-Peak eine erhöhte Expression des Ppar in Granulosazellen wachsender Follikel, wohingegen nach dem LH-Peak eine Abnahme der Ppar-Expression stattfindet (KOMAR et al. 2001, KOMAR u. CURRY 2002). Eine weitere Studie bekräftigt die Mitwirkung des PPARγ an der Ovulation (KIM et al. 2008). Die fehlende Expression des Pparγ in murinen Granulosazellen hat eine mangelhafte Follikelruptur und eine stark verringerte Anzahl an freigesetzten Eizellen zur Folge. In der eben erwähnten Studie reguliert der Pgr den Pparγ (KIM et al. 2008). Eine andere Untersuchung stellt den Einfluss des PPARγ auf Progesteron dar. Durch eine Behandlung sowohl einer Granulosazellkultur (Schwein) als auch Lutealzellkultur (Rind) mit einem natürlichen oder synthetischen Liganden für den PPARγ erhöht sich die Progesteronsekretion (LÖHRKE et al. 1998, SCHOPPEE et al. 2002). In der bovinen Lutealzellkultur ist ein 1½-facher Anstieg gegenüber dem Progesteronbasalwert nachgewiesen worden (LÖHRKE et al. 1998). Analysen der PPARγ-mRNA-Menge in bovinen Ooyzten sind zum Zeitpunkt der Zusammenfassung dieser Arbeit nicht bekannt. 53 Literatur 2.7.12. Endothelial PAS Domain Protein 1 (EPAS1 / HIF-2α) Bei dem HIF (Hypoxie inducible factor) handelt es sich um ein Heterodimer, welches aus zwei Basic-Helix-Loop-Helix-Protein-Untereinheiten besteht, der regulierbaren HIF-α- und der generell exprimierten HIF-β- (auch bekannt unter ARNT=Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator) Untereinheit (WANG et al. 1995). Bis zum heutigen Zeitpunkt sind drei HIF-α-Untereinheiten (HIF-1α, HIF-2α = EPAS1, HIF-3α) identifiziert worden, die sich in ihrer Struktur ähneln (WENGER 1997, HUANG u. BUNN 2003). In der Zelle selbst ist HIF-α nur unter einer geringen Sauerstoffkonzentration stabil (SEMENZA 2001, WANG et al. 1995). Hypoxie in der Zelle aktiviert zusätzlich die Wanderung von HIF-α zum Kern. Nachfolgend findet die Bildung des Heterodimers mit HIF-β statt. Im weiteren Verlauf bindet dieser Komplex an spezifische Elemente (Hypoxia-Responsive Elements) der DNA und es folgt die Expression von Genen, die in den Glukosemetabolismus, den Zellzyklus und die Angiogenese invovliert sind (SEMENZA 1998, CHILOV et al. 1999, HARRIS 2002, SEMENZA 2003). Die Beteiligung des HIF an der zellulären Proliferation, der Lungenentwicklung und der Follikelruptur ist im nachfolgendem näher dargestellt. Die fehlende Ausprägung des HIF-1α in embryonalen Stammzellen (J1-ES-Zellen) reduziert den mRNA-Gehalt für Glukosetransporter und glykolytische Enzyme. Die Folge ist eine Beeinträchtigung der zellulären Proliferation (IYER et al. 1998). Der Einfluss von HIF-1α auf den Zellzyklus ist in Mausembryonen nachgewiesen worden. Zwischen dem 8. und 9. Trächtigkeitstag steigt in den Embryonen die Expression der Transkripte für den Hif1α. Ab dem 8. Trächtigkeitstag findet in „Knock out (KO)-Hif-1α Mausembryonen“ ein erhebliches Zellsterben, das den Tod des Embryos zur Folge hatte, statt (IYER et al. 1998, RYAN et al. 1998). Ein weiterer KO-Versuch mit Mausembryonen (HIF2α=Epas1) demonstriert eine beeinträchtigte Lungenentwicklung sowie eine verringerte Herzfrequenz. Auch diese Embryonen wurden bis zum 17. Trächtigkeitstag resorbiert (TIAN et al. 1998, COMPERNOLLE et al. 2002). In Bezug auf die verminderte Lungenentwicklung vermuten die Autoren, dass Epas1 eine wichtige Rolle sowohl in der Konversion von Glykogen zu Surfactant als auch der Glykogenolyse übernimmt (COMPERNOLLE et al. 2002). 54 Literatur KIM et al. (2009) haben festgestellt, dass die Transkription der Gene Hif-1α, Arnt und Epas1 durch den Pgr reguliert werden. Die mRNA-Expression von Hif-1α, Arnt und Epas1 ist in murinen Granulosazellen präovulatorischer Follikel von Pgr-KO-Mäusen im Vergleich zu Pgr-heterozygoten Mäusen verringert. Dies verursacht eine fehlerhafte Follikelruptur und führt zur Anovulation. Für die Follikelruptur ist vermutlich HIF-1α verantwortlich (KIM et al. 2009). Der nachfolgenden Tabelle 18 sind Faktoren, die den HIF-mRNA-Gehalt beeinflussen, zu entnehmen. Arbeiten, in denen die EPAS1Expression in bovinen Oozyten untersucht wurde, sind nicht bekannt. Tabelle 18: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von HIF Referenz Versuchsmaterial HARVEY et al. (2004) Unreife bovine KOK Einflussfaktor IVP (bis Tag 4: 20% O2 und 6% CO2; ab Tag 5: 2, 7 oder 20% O2; modifiziertes SOFaa Medium) HARVEY et al. (2004) Unreife bovine KOK IVP (7% O2; SOFaa Medium, Tag 5 Zugabe von 10µM DNP*) KIM et al. (2009) Murine Granulosazellen (präovulatorischer Follikel) nPR-KO-Mäuse * DNP = 2,4-Dinitrophenol (bindet Protonen) 55 Ergebnis Kein Effekt in Blastoysten (Tag 7) Anstieg in Blastozysten (Tag 7) von HIF1α und EPAS1 Abnahme Literatur 2.8. Proteinexpression Proteine bestehen aus einer unterschiedlich langen Kette von proteinogenen Aminosäuren und erfüllen sehr unterschiedliche Funktionen. Sie katalysieren als Enzyme Reaktionen im Stoffwechsel, dienen als Kanäle in Zellemembranen, sind als Antikörper im Immunsystem tätig oder bilden Rezeptoren. Die im Zellkern generierte mRNA wird in das Zytoplasma exportiert. Hier findet an den Ribosomen die Proteinbiosynthese an Hand der mRNA statt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet. Die folgende Abbildung 13 zeigt eine schematische Darstellung dieses Prozesses (HORN et al. 2003). Abbildung 13: Schematische Darstellung des Proteinsyntheseweges (HORN et al. 2003) 2.8.1. Methoden zur Analyse der Proteinexpression Zur Analyse von bestimmten Inhaltsstoffen (Proteinen) in einer Stofflösung (Rohproteinlösung) können Trennmethoden verwendet werden. Hierzu zählt die Chromatographie. Bei dieser Methode wird eine Stoffmischung mithilfe eines Gasoder Flüssigkeitsstromes (mobile Phase) über eine stationäre Phase geleitet. Die einzelnen Bestandteile der Stoffmischung sind aufgrund ihrer verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten in der stationären Phase unterschiedlich aufgeteilt. Im Anschluss können Substanzen, wie z.B. Proteine mithilfe einer Detektion qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden (LOTTSPEICH et al. 2006). 56 Literatur Eine weitere Trennmethode von Proteinmischungen ist die Elektrophorese. Bei diesem Verfahren wird in einer Pufferlösung ein elektrisches Feld angelegt und die elektrisch geladenen Proteine beginnen zu wandern. Dabei erfolgt eine Auftrennung der Proteine nach nur einem Parameter und zwar der molaren Masse (REHM u. LETZEL 2009). Die Sodium-Dodecyl-Sulfate-Polyacrylamide-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist die gängigste Trennmethode. Für die Auftrennung komplexer Proteinlösungen wird häufig die zweidimensionale (2D-) Elektrophorese verwandt, da mit dieser Analysemethode ein hohes Auflösungsvermögen erreicht werden kann. In der ersten Dimension werden die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt durch isoelektrische Fokussierung in einem pH-Gradienten aufgetrennt. Es folgt eine weitere Aufteilung entsprechend dem Molekulargewicht durch die SDS-PAGE (zweite Dimension). Beide Parameter, sowohl isoelektrischer Punkt als auch Molekulargewicht, stehen nicht in Beziehung zueinander. Aus diesem Grund findet beinahe eine gleichförmige Verteilung von Proteinspots auf dem zweidimensionalen Gel statt (KLOSE 1975, O'FARRELL 1975, CORBETT et al. 1994, LOTTPSEICH et al. 2006, REHM u. LETZEL 2006). Zur Erkennung dieser Proteinspots wird das SDS-Polyacrylamidgel gefärbt und im Anschluss detektiert. Im Idealfall entspricht jeder Spot einer Proteinmolekülspezies (LOTTPSEICH et al. 2006, RHEM u. LETZEL 2006). Zur Analyse des Gesamtproteoms erfolgt die Identifizierung und Charakterisierung der Proteinspots aus der 2D-Gelelektrophorese mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS). In der MS wird aus einer Probe ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt. Hinsichtlich des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses findet eine Auftrennung der Ionen statt. Die Messung des Ionenstroms erfolgt mithilfe eines Detektors. Die Ionisierung der Probenmoleküle kann auf unterschiedliche Weise stattfinden. Bei der ElektrosprayIonisation werden polare, nicht flüchtige Moleküle einer gelösten Probe in einem elektrischen Feld ionisiert. Die Methode, bei der die zu analysierenden Proteine in Kristalle von Ultraviolett (UV)-absorbierenden Molekülen eingebaut werden, wird als Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization (MALDI) bezeichnet. Bei diesem Vorgang übertragen die sauren UV-absorbierenden Moleküle Protonen auf die Proteine und laden sie positiv auf. In einem Hochvakuum findet die Bestrahlung der Kristalle mit 57 Literatur einem UV-Laser Puls statt. Es folgt eine explosionsartige Freisetzung sowohl der Matrix-Moleküle als auch der eingebauten Proteine. Die freigesetzten positiv geladenen Proteine gehen in die Gasphase über. Im weiteren Verlauf werden die Ionen durch ein elektrisches Feld beschleunigt und fliegen in ein feldfreies VakuumFlugrohr, den Flugzeitanalysator oder time to flight (TOF), um dann auf den Detektor zu treffen. Aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeit der Ionen, erreichen diese den Detektor zu verschiedenen Zeiten. Die Ermittlung der Proteinmasse/ Molekülmasse erfolgt aus der gemessenen Flugzeit. Für die Kalibrierung werden Substanzen mit bekannten Massen verwendet (HILLENKAMP et al. 1991, LOTTSPEICH et al. 2006, REHM u. LETZEL 2006). Zur Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Tausend Einzelproteinen in einer geringen Probenmenge ist in den 90er Jahren die Erstellung von Protein-Microarrays entwickelt worden. Generell sind zwei Systeme zu unterscheiden. Bei dem planaren Microarrary sind die Fängermoleküle (z.B. Antikörper) in Form von Mikrospots auf der Oberfläche eines planaren Trägermaterials immobilisiert. Die Zuordnung der Proben erfolgt über die XY-Koordinaten. Eine weitere Möglichkeit ist, die Proben auf fluoreszenz- oder größenkodierten Beads zu immobilisieren. Hier erfolgt die Unterscheidbarkeit der Proben durch die Kodierung der Beads. Im Anschluss erfolgt die Inkubation mit einem markierten Bindungspartner. Zur Detektion werden unterschiedliche Systeme eingesetzt (EKINS u. CHU 1991, TEMPLIN et al. 2003, LOTTSPEICH et al. 2006). Für den quantitativen und qualitativen Nachweis von Einzelproteinen eignet sich der Mechanismus der erworbenen Immunität, die Antigen-Antikörper-Bindung. Der Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird für die quantitative Analyse von Einzelproteinen verwendet (AVRAMEAS u. GUILBERT 1971, ENGVALL u. PERLMANN 1971, REHM u. LETZEL 2006). Die Detektion von relevanten Proteinen in Geweben und Zellen unter Ausnutzung der spezifischen Antigen-AntikörperBindung wird als Immunhistochemie bezeichnet. Dieser qualitative Nachweis kann sowohl an nativen Gewebeschnitten als auch an fixierten, die in Paraffin oder Plastik eingebetteten sind, erfolgen (COONS u. KAPLAN 1950, LUTTMANN et al. 2009, LOTTSPEICH et al. 2006). Mit der Western Blot-Methode können elektrophoretisch 58 Literatur aufgetrennte Proteine über Antikörper oder Enzymsubstrate direkt auf der Membran nachgewiesen werden (BURNETTE 1981, LOTTSPEICH et al. 2006). Dadurch erfolgt eine Identifizierung und/oder Quantifizierung spezifischer Proteine innerhalb eines Proteingemisches. Heutzutage finden Membranen aus Nitrocellulose, Glasfaser oder Polymeren Verwendung. Durch den Einsatz solcher Membranen ist es möglich die Sequenzierung oder Aminosäureanalyse von Proteinen direkt auf der Membran vorzunehmen (LOTTSPEICH et al. 2006). 2.8.2. Proteinanalysen in Oozyten und Kumuluszellen Aufgrund der Verfügbarkeit an Untersuchungsmaterial (Tabelle 19 zeigt den Gesamtproteingehalt einer Eizelle) sind bis zum heutigen Zeitpunkt nur wenige Analysen des Gesamtproteingehalts zur Darstellung der Proteinexpressionsmuster von Oozyten vorgenommen worden (SASAKI et al. 1999, ELLEDEROVA et al. 2004, MASSICOTTE et al. 2006, MEMILI et al. 2007). Tabelle 19: Proteingehalt der Eizelle Referenz Spezies Proteingehalt der Eizelle SASAKI et al. (1999) Maus 16,5 ng (reif) THOMPSON et al. (1998) Rind 122 ± 7,8 ng (reif, ohne Zona pellucida) GREALY et al. (1996) Rind 126 ± 5,9 ng (unreif) Die in den letzten Jahren durchgeführten Analysen zur Bestimmung und Untersuchung des Proteingehalts in Eizellen und Kumuluszellen unterschiedlicher Tierarten werden im Nachfolgenden erläutert. Bei Untersuchungen muriner reifer Oozyten sowie 2-Zeller sind zwischen diesen beiden Entwicklungsstadien Differenzen in den Proteinbanden der Größenordnung von 290 bis 70 kilodalton (kDa) festgestellt worden. Dieser Unterschied impliziert, dass eine Veränderung in der Proteinexpression zwischen unbefruchteten Eizellen und 2Zellern stattfindet. Die Ergebnisse aus der 2-dimensionalen Gelelektrophorese stellten sich ähnlich dar. In den unbefruchteten Eizellen sind 230 Proteinspots identifiziert 59 Literatur worden, während in jedem untersuchten Stadium der Präimplantationsphase 80 bis 100 Proteinspots detektiert wurden. Die Autoren führen diese Divergenz auf eine Abnahme oder ein „Verschwinden“ der Proteine nach der Befruchtung zurück (SASAKI et al. 1999). Eine Untersuchung von 200 unreifen porcinen Oozyten (GVBD-Stadium) demonstriert, dass die Größe der gelösten Proteine in diesen Eizellen zwischen 8 und 150 kDa liegt. Insgesamt sind 350 Proteinspots ermittelt worden. Von diesen 350 Positionen konnten mittels Datenbank-Analyse 35 Proteine identifiziert werden. Wenn Proteinspots nah beieinander liegen, ist angenommen worden, dass es sich hierbei um die Darstellung von Proteinisoformen oder post-translationalen Änderungen einzelner Proteine handelt. Auch die Möglichkeit, dass sich das Protein geteilt hat und nun mit einem niedrigeren Molekulargewicht vorliegt, ist in Betracht gezogen worden. Im Vergleich zwischen den Reifungsstadien (unreif, MI und MII) zeigt sich, dass die vorher identifizierten 35 Proteine in allen drei Stadien vorhanden sind. Sechs Proteinspots verändern sich signifikant in der Reifungsphase im Vergleich zum GVBD-Stadium. Jedoch bestehen 5 dieser 6 Proteinspots hauptsächlich aus Zona pellucidaProteinmolekülen (ELLEDEROVA et al. 2004). In bovinen KOK im GV-Stadium sind 5253 Proteine in Kumuluszellen und 1950 Proteine in der Eizelle identifiziert worden. Achthundertachtundfünfzig dieser Proteine werden von beiden Zelltypen (Oozyte und Kumuluszellen) ausgebildet. Zum Teil sind die einzelnen Proteinspots identifiziert worden. Es zeigt sich, dass die Proteine unterschiedlichen Familien, wie z. B. Proteine des Zytoskeletts, des Metabolismus, sowie Regulatoren des Zellzykluses und Proteinkinasen angehören (BHOJWANI et al. 2006). MEMILI et al. (2007) haben in ihrer Untersuchung 186 Kernproteine, 378 Membranproteine und 36 Signalproteine mittels der ontologischen Datenbank (Gen Ontology) annotiert. Für die Modellierung von Zell-Zell-Interaktionen sind Membranund Kernproteine von Bedeutung und die Interaktionen zwischen Oozyte und Kumuluszellen im GVBD-Stadium sind für die weitere Entwicklung der Eizelle entscheidend (BUCCIONE et al. 1990). Für die Untersuchung von Proteinen, die an der Kommunikation zwischen boviner Oozyte im GV-Stadium und ihren Kumuluszellen involviert sind, ist eine weitere Studie 60 Literatur durchgeführt worden. Insgesamt wurden 811 Proteine in der Eizelle und 1247 in Kumuluszellen identifiziert. Hiervon sind 352 Proteine von beiden Zellarten (Oozyten und Kumuluszellen) exprimiert worden. In den Kumuluszellen liegt im Vergleich zu der Eizelle eine signifikant höhere Expression von Proteinen für bestimmte biologische Prozesse vor. Diese Prozesse beinhalten die Zellkommunikation, den Transport und die Generierung von Vorläufermetaboliten für die Energieproduktion. In Bezug auf die Versorgung der Oozyte durch die Kumuluszellen konnte gezeigt werden, dass 12 Proteine, die in die Glykolyse involviert sind, in Kumuluszellen stärker exprimiert werden als in der Oozyte. Insgesamt sind 91 Proteine, die an der bidirektionalen Kommunikation zwischen Oozyte und Kumuluszellen beteiligt sind, identifiziert worden. Von diesen wiesen 6 eine höhere Expression in den Kumuluszellen als in der Oozyte auf (PEDDINTI et al. 2010). In Bezug auf Einfluss der IVM-Bedingungen auf die Proteinexpression zeigte sich in einer Studie mit Mäuseembryonen, dass eine O2-Konzentration von 20% (im Inkubator) während der IVM die Expression von 10 Proteinen/Biomarkern reduziert (KATZ-JAFFE et al. 2005). Untersuchungen bzgl. der eben genannten Thematik erfolgten beim Rind bis heute nur auf der mRNA-Ebene (z.B. PEREIRA et al. 2010). 2.8.3. Zeitlicher Ablauf der Proteinexpression in Oozyten während der Reifung Die während der Eizellreifung ablaufenden zytoplasmatischen Veränderungen in der Oozyte sind charakterisiert durch die Reorganisation von Zellorganellen und die Synthese von mRNA und Proteinen (BACHVAROVA 1985, TOMEK et al. 2002). Im Anschluss an die Synthese von mRNA und Proteinen sind Mechanismen notwendig, um die Degradierung der gelagerten mRNA und Proteine zu vermeiden (GANDOLFI u. GANDOLFI 2001). Während der Maturationsphase erfolgt innerhalb der bovinen Oozyte eine rapide Abnahme in der Transkriptionsaktivität. Es wird vermutet, dass bedeutsame Informationen für die Entwicklungskompetenz der Eizelle auf der Proteinebene lokalisiert sind (HYTTEL et al. 1997, TOMEK et al. 2002, ELLEDEROVA et al. 2004, VILLAESCUSA et al. 2006, MEMILI et al. 2007, BERENDT et al. 2009). Auch zeigen Untersuchungen, dass die Proteinsynthese bei der Wiederaufnahme der Meiose nicht nur bei bovinen, sondern auch bei porcinen und ovinen Oozyten 61 Literatur unerlässlich ist (MOOR u. CROSBY 1986, MOTLIK u. FULKA 1986, HUNTER u. MOOR 1987, SIRARD et al. 1989, COENEN et al. 2004). Die Analyse des zeitlichen Ablaufs der Proteinsynthese boviner Oozyten mittels 2dimensionaler Gelelektrophorese (Reifungsmedium SOF+0,8% BSA; 24-28 Stunden) zeigt, dass zu IVM-Beginn die Anzahl der synthetisierten Protein am höchsten ist. Nach 12 Stunden Reifungsphase reduziert sich die Proteinbildung, um im weiteren Verlauf der IVM (16 – 28 Stunden) stabil zu bleiben (COENEN et al. 2004). Das Proteinsynthesemuster unterscheidet sich zu Beginn der IVM von dem, welches am Ende der Reifungsphase (24-28 Stunden) vorliegt. Neu synthetisierte Proteine konnten in den Zeitintervallen 4 bis 8 Stunden und 16 bis 20 Stunden nach IVM-Beginn identifiziert werden. Hierbei scheint es sich um Proteine zu handeln, die an dem GVBD, der zytoplasmatischen Reifung oder der Kernreifung (von MI- zum MII-Stadium) beteiligt sind. Fünfzehn Prozent der Gesamtproteinmenge zum Zeitpunkt des Reifungsbeginns (0 Stunden IVM) werden über die gesamte Maturationsphase (0 – 28 Stunden) synthetisiert. Diese Proteine sind einerseits für die Aufrechterhaltung der Zellstruktur und andererseits für die Funktion der Eizelle verantwortlich und werden als „Housekeeping“-Proteine bezeichnet (COENEN et al. 2004). In einer weiteren Studie, die sich mit der Untersuchung der Proteinbildung beschäftigt, gelang die Identifizierung von 92 synthetisierten Proteinen in bovinen Oozyten während der Reifungsphase (IVM). Im Weiteren sind für das 2-, 4- und 8 Zell-Stadium im Durchschnitt 291, 373 bzw. 252 Proteine identifiziert worden. In allen Entwicklungsstadien (unreife und reife Oozyte, sowie frühe Embryonalentwicklung) sind 32 gleiche Proteine detektierbar und präsentieren somit die „Housekeeping“Proteine. Von diesen 32 gelang es wiederum, 10 zu identifizieren. Es handelt sich hierbei um Proteine des Zytoskeletts, der Glykolyse, des Lipidtransports, der Proteindegradation und um antioxidantische (MASSICOTTE et al. 2006). 62 Proteine sowie Chaperone Literatur 2.8.4. Proteinexpression der Progesteronrezeptoren Um den Effekt bzw. Einfluss von Progesteron auf den weiblichen Reproduktionstrakt zu analysieren, sind verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden. Im Jahr 1988 ist beim Primaten die Identifizierung der Isoformen A und B des nPRs in folgenden Geweben und Zellen erfolgt: Stroma- und Interstitiumgewebe, Theka interna und externa gesunder und atretischer Follikel (unabhängig vom Zyklusstadium), Granulosazellen von Primordial- und Primärfollikeln (HILD-PETITO et al. 1988). Beim Rind sind beide Isoformen des nPRs im Kern von Fibroblasten und Fibrozyten des Plazentoms (BOOS et al. 2000), im Kern von Lutealzellen des Gelbkörpers (RUEDA et al. 2000) und die Isoform B im Kern von Stromazellen der Karunkel (SCHULER et al. 1999) nachgewiesen worden. Die Tabelle 20 (die einzelnen Abkürzungen bzgl. der Progesteronrezeptoren sind am Ende der Tabelle erläutert) zeigt die Ergebnisse einiger Studien, die sich mit der Proteinexpression von Progesteronrezeptoren in verschiedenen Geweben und Zellen weiblicher Säugetiere beschäftigten. Tabelle 20: Proteinexpression der Progesteronrezeptoren Referenz YOU et al. (2010) SCHAMS et al. (2003) SCHAMS et al. (2003) SALVETTI et al. (2007) Progesteronrezeptor Analysemethode Organ/Zelle Maus mPRα Immunhistochemie Primär-, Sekundär-, Tertiärfollikel, Corpus luteum, Zytoplasma und Zellmembran Rind nPRA, nPRB, nPRC Western Blot Milchdrüsengewebe von nichttragenden Färsen Western Blot Milchdrüsengewebe während Laktogenese, Galaktopoiesis und Involution Immunhistochemie Granulosazellkern, Theka interna und externa Zellen von Sekundär-, Tertiär-, atretischen und zystischen Follikeln Spezies Rind Rind nPRB nPRA, nPRB, - Fortsetzung auf nächster Seite - 63 Literatur Tabelle 20: Proteinexpression der Progesteronrezeptoren (1. Fortsetzung) Referenz SCHÄUBLI et al. (2008) DURLEJ et al. (2010) DURLEJ et al. (2010) Spezies Rind Schwein Schwein Progesteronrezeptor nPRA, nPRB nPRA nPRB Analysemethode Immunhistochemie Organ/Zelle Interkarunkulargewebe um den Geburtszeitpunkt Immunhistochemie Follikelgewebe (Ø<5mm – Theka interna Zellen; Ø 610mm- Granulosa- und Thekazellen), Gelbkörpergewebe (Anbildung, Mitte, Rückbildung) Immunhistochemie Follikelgewebe (Ø 610mm – Granulosazellen), Gelbkörpergewebe (Anbildung, Mitte, Rückbildung Zytoplasma von Lutealzellen – nur bei Rückbildung) nPRA / nPRB=Isoform A / Isoform B des nuklearen Progesteronrezeptors mPR α oder β oder γ=Membranprogesteronrezepor α oder β oder γ Die Expression des Progesteronrezeptors kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden. Zu dieser Thematik sind verschiedene In-vivo- und In-vitroUntersuchungen durchgeführt worden. Bei der Maus konnte 4 und 8 Stunden nach hCG-Gabe ein Anstieg der Expression des Progesteronrezeptors in Zellen der Follikelwand und in Kumuluszellen nachgewiesen werden (ROBKER et al. 2000). Nach einer 10-stündigen Reifungsdauer von porcinen KOK (NCSU37 + 10% FCS + 20 ng/ml FSH + 500 ng/ml LH) erfolgte die Detektion der Isoformen A und B des nPRs, gefolgt von einer Abnahme des Proteingehaltes der Isoform A bis zu einer Reifungsdauer von 40 Stunden (SHIMADA et al. 2004b). In bovinen Plazentomen fand ein Anstieg beider Isoformen des nPRs im letzten Trimester der Trächtigkeit und während der induzierten Geburt (Gabe von 1mg Cloprostenol/kg Körpergewicht) statt. Post partum konnte eine Abnahme beider Isoformen festgestellt werden (BOOS et al. 64 Literatur 2002). Die folgende Tabelle 21 zeigt Ergebnisse weiterer Analysen bei der Spezies Rind. Tabelle 21: Einflussfaktoren auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors Referenz Spezies Versuchsmaterial QUIRK et al. (2004) Rind Granulosazellen D’HAESELEER et al. (2007) LUCIANO et al. (2010) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) Rind Rind Rind Rind Rind Rind Versuchsbedingungen 10 und 14 h nach GnRH-Injektion (Kühe und Ovarektomie) Ergebnis Anstieg nPRA, nPRB Follikelzellen Primordial-, Primär-, Sekundärfollikel Anstieg nPRA, nPRB von Primordial- zu Sekundärfollikel KOK Injektion eines AK gegen PGRMC1 in unreife KOK, 24h IVM Abnahme Reifungsrate (Arretierung in Prometaphase I) Kumuluszellen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF) Anstieg nPRA, nPRB, mPRα, mPRβ Oozyten KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF) Abnahme nPRA, mPRα, mPRβ Kumuluszellen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10ng/ml EGF) Abnahme PGRMC1, PGRMC2 Kumuluszellen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 100 ng/ml LH) Anstieg nPRA, nPRB im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne LH - Fortsetzung auf nächster Seite – 65 Literatur Tabelle 21: Einflussfaktoren auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors (1. Fortsetzung) Referenz APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) APARICIO et al. (2011) Spezies Rind Rind Rind Rind Rind Rind Versuchsmaterial Kumuluszellen Versuchsbedingungen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 100 ng/ml FSH) Ergebnis Anstieg nPRA, nPRB im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FSH Oozyten KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 100 ng/ml LH) Abnahme nPRA, mPRβ im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne LH Oozyten KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 100 ng/ml FSH) Abnahme nPRA im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FSH Oozyten KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 100 ng/ml Progesteron) Abnahme nPRA Oozyten KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 500 ng/ml Progesteron) Abnahme nPRA, mPRα, mPRβ Kumuluszellen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 10 ng/ml Progesteron) Anstieg PGRMC2 - Fortsetzung auf nächster Seite – 66 Literatur Tabelle 21: Einflussfaktoren auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors (2. Fortsetzung) Referenz Spezies Versuchsmaterial APARICIO et al. (2011) Rind Kumuluszellen 67 Versuchsbedingungen KOK 24h IVM (TCM199 + 10% FCS + 10 ng/ml EGF + 500 ng/ml Progesteron) Ergebnis Anstieg nPRB, PGRMC1 Material und Methoden 3. Material und Methoden Die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Chemikalien sowie die verwendeten Geräte sind – sofern nicht im Text angegeben – im Anhang beschrieben. Soweit nicht anders angegeben, stammen die Chemikalien von der Firma SigmaAldrich (Steinheim, Deutschland). 3.1. Gewinnung der Kumulus-Oozyten-Komplexe Zur Gewinnung der KOK wurden Ovarien von frisch geschlachteten, nicht augenscheinlich erkrankten Tieren verwendet. Vom Schlachthof in Bad Bramstedt bis zum Forschungslabor fand die Aufbewahrung der Eierstöcke im Thermobehälter, der Phosphate Buffered Saline (PBS) Complete enthielt, bei 25 – 32 °C statt. PBS Complete bestand aus 1000 ml destilliertem Wasser, in dem 9,65 g Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline , 10 ml PBS Stocklösung, 11,2 mg Heparin (= 4 I.E.) der Firma Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland und 1 g bovines Serumalbumin (BSA, Fraktion V) gelöst waren. Direkt nach Ankunft im Labor wurden die Ovarien drei Mal mit jeweils ca. 350 ml 0,9 %iger Natrium-Chlorid-Lösung gewaschen. Die auf 37 °C erwärmte Lösung enthielt zusätzlich 0,06 g Penicillin und 0,1 g Streptomycin pro Liter. Im Anschluss wurden die oberflächlichen und tiefer gelegenen Follikel nach der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) mit einem Vielklingenmesser (siehe Abbildung 14) eröffnet. Die Follikelflüssigkeit, in der sich die KOK befanden, wurde in einer Petrischale in ca. 100 ml PBS Complete (37 °C) aufgefangen. Zur Entfernung überschüssiger Gewebereste wurde der Inhalt der Petrischale durch ein handelsübliches Teesieb gegeben und in einem Becherglas erneut aufgefangen. Während des folgenden 10-minütigen Sedimentationsschrittes stand das Becherglas auf einem Styroporstück, um eine Auskühlung der gewonnen Flüssigkeit zu vermeiden. Der Flüssigkeitsüberstand wurde bis auf 100 ml mittels einer herkömmlichen Vakuumpumpe abgesaugt. Im Anschluss erfolgte die gleichmäßige Verteilung des Sediments auf Plastik-Tubes mit einem Fassungsvermögen von 15 ml. 68 Material und Methoden Abbildung 14: Slicing-Methode Der folgende Sedimentationsschritt fand für 10 Minuten (min) auf einer Wärmeplatte (37 °C) statt. Das Sediment in den Plastik-Tubes wurde mittels einer Pasteurpipette abgesaugt und in eine Petrischale überführt. Diese wurde mit ca. 80 ml PBS Complete aufgefüllt. Mittels eines Stereomikroskopes (SZX7, Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte wurden bei 45-facher Vergrößerung die KOK selektiert und in 2 ml TCM (Tissue Culture Medium) air, welches auf 37 °C erwärmt war, aufbewahrt. Anschließend erfolgte die Selektion der KOK entsprechend der modifizierten Klassifizierungseinteilung (Tabelle 22) nach PAVLOK et al. (1992). Es wurden hierbei nur KOK verwendet, die den Kategorien eins bis drei entsprachen. 69 Material und Methoden Tabelle 22: Klassifizierung der KOK (modifiziert nach PAVLOK et al. [1992]) Klasse Mindestanzahl Kumuluszellen KumuluszellExpansion Ooplasma IVPTauglichkeit Klasse 1 3 Lagen Nein Homogen Ja Klasse 2 1 Lage Nein Homogen Ja Klasse 3 Einzelne Nein Homogen/Heterogen Ja Klasse 4 Keine Nein Homogen/Heterogen Nein Klasse 5 Keine Ja Homogen/Heterogen Nein 3.2. In-vitro-Maturation Die selektierten KOK wurden in Gruppen zu je 20 Stück zusammengefasst und drei Mal durch äquilibrierte, mit Silikonöl überschichtete, 100 μl-Tropfen TCM + BSA unter Verwendung einer 25 μl-Glaskapillare (Hirschmann, Eberstadt, Deutschland) pipettiert. Dieser Schritt des „Auswaschens“ diente der Entfernung von Zellresten und der Verdünnung des vorher verwendeten TCM-air-Mediums. Im Anschluss wurden die KOK in ölüberschichtetes (Gruppe: ölüberschichtet) oder nicht-ölüberschichtetes (Gruppe: ölfrei) Reifungsmedium überführt. Dieser Vorgang ist unter Punkt 3.2.1 und 3.2.2 näher beschrieben. 3.2.1. Ölüberschichtetes Reifungsmedium Nachfolgend wurden 20 KOK in 100 μl große Tropfen des Reifungsmediums, bestehend aus TCM + BSA + 10 IE/ml eCG (Equines Choriongonadotropin, Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) + 5 IE/ml hCG (Humanes Choriongonadotropin, Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) überführt. Diese Tropfen befanden sich in einer Petrischale (Durchmesser 35 mm) und waren mit Silikonöl überschichtet (siehe Abbildung 15). Die Äquilibrierung der verwendeten Medien erfolgte mindestens eine Stunde vor Gebrauch im Brutschrank (HeraCell, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 °C und 5% CO2. 70 Material und Methoden Abbildung 15: 100 μl Tropfen Reifungsmediums mit Silikonölüberschichtung in einer Petrischale 3.2.2. Reifungsmedium ohne Silikonölüberschichtung Dreißig KOK wurden in 200 μl äquilibriertes (siehe Punkt 3.3.1.) Reifungsmedium (TCM + BSA + eCG + hCG) überführt. Das Maturationsmedium befand sich in einem kleinen Töpfchen, das von einer 96er Well-Platte abgetrennt wurde. Das einzelne Well wurde in eine Petrischale (Durchmesser 35 mm) gestellt, welche mit ca. 7 ml destilliertem Wasser befüllt war, um einer Verdunstung des Mediums vorzubeugen (siehe Abbildung 16). Abbildung 16: 200 μl Tropfen Reifungsmedium im Töpfchen (ohne Ölüberschichtung) 71 Material und Methoden 3.2.3. Sauerstoffkonzentration Die 24-stündige Inkubation der KOK fand im Brutschrank bei 39 °C unter zwei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen statt: o Luftsauerstoff (ca. 20% O2), 5% CO2 und 75% N2 (feuchtigkeitsgesättigt) o 5% O2, 5% CO2 ,90% N2 (feuchtigkeitsgesättigt) 3.2.4. Entfernung der Kumuluszellen Nach Beendigung der Maturationsphase wurden die KOK in 37 °C warme TCM-airTropfen überführt und die Kumuluszellen von den Oozyten mechanisch entfernt. Dieser Vorgang fand unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle auf einer Wärmeplatte mittels einer ausgezogenen Glaskapillare oder eines Strippers (MidAtlantic, Mt. Laurel, NJ, USA) sowie den dazugehörigen Spitzen mit einem Durchmesser von 135 und 125 μm statt. Die Kumuluszellen wurden in ein 1,5 ml beschichtetes Eppendorfgefäß überführt und für 60 Sekunden bei 2400 g zentrifugiert (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Deutschland). Zur Ausverdünnung des TCM-airMediums folgten drei Waschschritte mit PVA 0,1% (37 °C) à 100 μl mit jeweils nachgeschalteter Zentrifugation bei 2400 g. Nach Abnahme des Überstandes unter mikroskipischer Kontrolle wurden die Oozyten (Gruppengröße 20 bis 40 reife Eizellen) und die Kumuluszellen (Gruppengröße: Kumuluszellen von 20 bis 40 reifen Oozyten) getrennt voneinander bei -80 °C für nachfolgende Analysen eingefroren. 3.2.5. Unreife Kumulus-Oozyten-Komplexe Im Anschluss an die Qualitätsbeurteilung und Selektion der unreifen KOK erfolgte sowohl die Entfernung der Kumuluszellen als auch die Probenaufbereitung wie unter Punkt 3.2.4. (Entfernung der Kumuluszellen) beschrieben. Sowohl die gewonnenen unreifen Kumuluszellen (Gruppengröße: Kumuluszellen von 20 bis 40 Oozyten) als auch die unreifen Eizellen (Gruppengröße 20 bis 40 Oozyten) wurden zu weiteren Analysezwecken bei -80 getrennt voneinander eingefroren. 72 Material und Methoden 3.3. Reifungskontrolle der Oozyten 3.3.1. Fixierung der Oozyten Zur Überprüfung des Reifestadiums der Oozyten wurden aus unterschiedlichen Versuchsdurchgängen aus jeder Versuchsgruppe zufällig ausgewählte KOK verwendet. Die Entfernung der Kumuluszellen fand im TCM-air-Medium wie unter Punkt 3.2.4. beschrieben statt. Auf einem fettfreien Objektträger wurden zwei parallele Paraffin-Vaseline (Verhältnis 9:1)-Streifen aufgetragen. Zwischen diesen erfolgte unter stereomikroskopischer Kontrolle die Platzierung der Oozyten inklusive 5 - 10 μl TCMair-Medium. Nach Auflage eines Deckglases unter leichtem Druck wurde der Objektträger für mind. 24 Stunden in der Fixierlösung (Essigsäure:absoluter Alkohol, Verhältnis 1:3, Roth, Karlsruhe, Deutschland) aufbewahrt. 3.3.2. Färbung der Oozyten Nach Entnahme des Objektträgers aus der Essig-Alkohol-Fixierlösung erfolgte die Färbung der Chromosomen mit einer 1%igen Lacmoid-Arbeitslösung. Hierfür wurden zwei bis drei Tropfen der Färbelösung an den Rand des Deckglases verbracht. Durch Kapillarkräfte verteilte sich die 1%ige Lacmoid-Arbeitslösung unterhalb des Deckglases. Zur Entfernung überschüssiger Färbelösung wurden drei bis vier Tropfen der Fixierlösung in gleicher Weise auf den Objektträger aufgetragen. Unter dem Stereomikroskop (Zeiss, Axiostar plus, Labor- und Analysetechnik, Garbsen, Deutschland) erfolgte bei 40-facher Vergrößerung die Beurteilung der Kernreifung der einzelnen Oozyten in Anlehnung an TSAFRIRI (1978, siehe Tabelle 23). Die nachfolgende Abbildung 17 zeigt eine Oozyte im MII-Stadium. 73 Material und Methoden Tabelle 23: Kriterien der Eizellkernreifung nach TSAFRIRI (1978) Befund Stadium der Reifung Kernreifung der Oozyte Einzel vorliegende Chromosomen 1. Reifeteilung / Metaphase I, Ana- oder Telophase I Nein Polkörper und Spindelapparat bzw. Metaphasenplatte 2. Reifeteilung / Metaphase II Ja 1 bis 2 Vorkerne 2. Reifeteilung / Ana- oder Telophase II Nein 1 2 Abbildung 17: Oozyte im Stadium der Meiose II 1= Metaphasenplatte, 2= ausgeschleuster Polkörper 74 Material und Methoden 3.4. MessengerRNA-Analyse 3.4.1. Isolierung der MessengerRNA Zur Isolierung der MessengerRNA (mRNA) aus den Eizellen kam das Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) zum Einsatz. Zu Beginn wurden alle Reagenzien bei Raumtemperatur äquilibriert und sowohl die Dynabeads als auch die in silikonisierten Eppendorfgefäßen eingefrorenen Eizellen mittels des Lysis/Bindingpuffer aufgereinigt. Die Isolierung der mRNA erfolgte durch die Bindung dieser an Oligo-dT-Nukleotide der Dynabeads. Die Trennung der magnetischen Dynabeads (inklusive mRNA) vom Flüssigkeitsüberstand fand mittels des Magnetic Particle Concentrator (MPC) statt. Nachfolgend ist dieser Vorgang näher erläutert. Die bei -80 °C aufbewahrte Eizellprobe wurde auf Eis gestellt und zur Aufbereitung mit 150 μl Lysis/Bindingpuffer und 1 μl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/μl) versetzt. Die Kaninchen-Globin-mRNA diente als externer Standard für die nachfolgende Quantifizierung. Im Anschluss erfolgte für 10 Sekunden (s) die Homogensierung der Proben. Dann fand ein Zentrifugationsschritt (Biofuge Fresco, Hereaus, Thermo Fisher Scientific, USA) für 1 min bei 16000 g und eine Inkubation der Proben für 10 min bei 400 rpm bei Raumtemperatur auf dem Schüttelblock (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) statt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 μl der gereinigten Dynabead-Lösung zu jeder Probe und eine Inkubation für weitere 5 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttelblock (400 rpm). Nachfolgend wurden die Proben in den MPC gestellt. Der Überstand aus dem Eppendorfgefäß wurde abgenommen und verworfen. Dann erfolgte ein Reinigungsschritt der Probe mit 100 μl Washing Buffer A (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Diesem Schritt schlossen sich drei weitere Reinigungsschritte mit jeweils 100 μl Washing Buffer B (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) an. Nach jedem „Waschen“ wurde der Überstand entfernt und verworfen. Der nun gereinigten Probe wurden 11 μl steriles H2O (Ampuwa®, Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) hinzugegeben. Im Nachfolgenden wurde die Probe für 3 min bei 65 °C im Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Hierbei fand die Trennung der mRNA von den Dynabeads statt. Anschließend wurden die Eppendorfgefäße in den gekühlten MPC auf Eis gestellt und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Der Überstand, in dem sich die 75 Material und Methoden mRNA befand, wurde sofort für die Reverse Transkriptase-Reaktion verwandt. Die verwendeten Medien und entsprechenden Konzentrationen sind im Anhang aufgeführt. 3.4.2. Isolierung der Gesamt-RNA Die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Kumuluszellen erfolgte unter Verwendung des RNeasyMicro Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland). Hierfür wurde zunächst die Probe (Kumuluszellen einer Oozyte) mit 350 μl RLT-Puffer (QIAGEN, Hilden, Deutschland) und 5 μl β-Mercaptoethanol versetzt, um eine Zelllyse und die Denaturierung von RNasen zu erreichen. Zur Homogenisierung der Zellösung wurde die Probe in eine QIAshredder-Säule (QIAGEN, Hilden, Deutschland) überführt und für 2 min bei 13.000 rpm (Fresco Biofuge, Hereaus, Thermo Fisher Scientific, USA) zentrifugiert. Hiernach wurde die Zelllösung von der QIAshredder-Säule in ein 2 ml Eppendorfgefäß pipettiert und dieses in den QIACube (QIAGEN, Hilden, Deutschland) verbracht. Im QIACube kam die RNeasy-Säule (RNeasy Mini Elute Spin Columns, QIAGEN, Hilden, Deutschland) zum Einsatz. Die Gesamt-RNA bindet an die RNeasySäule und wird durch verschiedene Waschschritte mit Puffern aufgereinigt. Nach Durchlaufen dieser Vorgänge wurde die Gesamt-RNA mit 15 μl RNase-freiem Wasser von der RNeasy-Säule eluiert und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Die Konzentrationsbestimmung und die Kontrolle der Integrität der Gesamt-RNA erfolgte mit dem Agilent RNA 6000 Pico Assay (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland). Hierfür wurde zuerst der Gel-Dye Mix entsprechend Herstellerangaben vorbereitet. Im Anschluss erfolgte die Beladung des RNA 6000 Pico Chips mit dem aufbereiteten Gel-Dye Mix, der RNA 6000 Conditioning Solution, dem RNA 6000 Pico Marker (Größenmarker) und 1 μl der Probe (aufgereinigte Gesamt-RNA von Kumuluszellen einer Oozyte). Nachfolgend wurde der Chip für 1 min bei 2400 rpm (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland) gevortext. Die Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der Gesamt-RNA fand mittels elektrophoretische Auftrennung der einzelnen Nukleinsäurenfragmenten an Hand ihrer Größe mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland) statt. 76 Material und Methoden 3.4.3. Reverse Transkription (RT) Dieser Schritt diente der Herstellung von komplementärer DNA (cDNA), die im weiteren Versuchsverlauf als Template für die Polymerase chain reaction (PCR) genutzt wurde. Zu Beginn erfolgte die Erstellung des Master-Mixes, welcher u.a. die Enzyme Reverse Transkriptase (RT) und RNase Inhibitor (RI) enthielt. Das Endvolumen der Probenansätze betrug 20 μl. Zusätzlich zur Probe (Oozyte oder Kumuluszellen) wurde eine Negativkontrolle der Probe, ein Globin-Standard (nur bei der Analyse der Eizellen), eine Negativkontrolle des Standards und eine Negativkontrolle, die anstelle der mRNA steriles Wasser (Ampuwa®, Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) enthielt, mitgeführt. Letztgenannte Negativkontrolle erfolgte, um eine Kontamination der verwendeten Medien auszuschließen. Die Probenansätze ohne RT und RI dienten der Überprüfung der Reinheit der verwendeten mRNA (keine Kontamination mit genomischer DNA). Den beiden nachfolgenden Tabellen 24 und 25 sind die RT-Ansätze für die Eizellen und die Kumuluszellen zu entnehmen. 77 Tabelle 24: RT-Ansatz für Eizellen Substrat Konzentration Volumen Globin Standard Probe Eizelle Negativ RI/RT Standard Negativ RI/RT Probe Negativ (ohne RNA) 1x 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl MgCl2 (50mM) 5 mM 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl dNTPs (10mM) 1 mM 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl Hexamer Primer (50 μM) 2,5 μM 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl RNase Inhibitor (20U/μl) 20 U 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl - - 1,0 µl MuLV-ReverseTranskriptase (50U/μl) 50 U 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl - - 1,0 µl mRNA-Probe - - 1,0 µl 10,7µl 1,0 µl 0,3 µl - ad H2O - - 10,0 µl 0,3 µl 12,0 µl 12,7 µl 11,0 µl Material und Methoden 78 10x PCR Puffer Tabelle 25: RT-Ansatz für Kumuluszellen Substrat Konzentration Volumen Probe Negativ RI/RT Negativ RI/RT Negativ Kumuluszellen Probe H2O (ohne RNA) 1x 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl MgCl2 (50mM) 5 mM 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl dNTPs (10mM) 1 mM 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,0 µl 2,5 μM 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl RNase Inhibitor (20U/μl) 20 U 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl MuLV-ReverseTranskriptase (50U/μl) 50 U 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl Hexamer Primer (50 μM) 79 mRNAProbe * 1,0 µl ad H2O ** 12,0 µl *Endkonzentration der Gesamt-RNA je Probenansatz 0,3125 pg/μl ** in Abhängigkeit von Volumen der mRNA-Probe 13,0 µl 11,0 µl Material und Methoden 10x PCR Puffer Material und Methoden Das Enzym Reverse Transkriptase, welches im Reaktionsgemisch enthalten war, generierte die cDNA. Dieser Vorgang fand in dem PCR-Cycler „IQ5“ (siehe Abbildung 18, Bio-Rad, München, Deutschland) nach folgendem Programm statt: o 10 min bei 25 °C o 60 min bei 42 °C (Reverse Transkription der mRNA in cDNA) o 5 min bei 99 °C (Denaturierung) Die Proben mit der synthetisierten cDNA wurden sofort auf Eis gelagert und dienten als Template für die folgende Polymerase-Kettenraktion. Abbildung 18: IQ5 Multicolor real Time PCR Detection System (HANSTEDT 2009) 3.4.4. Quantitative real-time Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt bestimmte Nukleinsäureabschnitte der cDNA mit Hilfe entsprechender Primerpaare. Die Quantifizierung in Echtzeit erfolgt mittels der Fluoreszenz-Messung mit dem SYBR-Green-Farbstoff während des PCRZykluses. Hierbei wird zu Grunde gelegt, dass die Fluoreszenz proportional zur Menge der PCR-Produkte zunimmt. In dieser Arbeit sind die Gentranskripte PGR, cPLA2, PTGS2, PTGFR, STAR, HSD3B, 80 Material und Methoden CYP19A1, FSHR und LHCGR in unreifen und reifen Kumuluszellen und in unreifen und reifen bovinen Oozyten die mRNA-Gehalte von PGR, PAQR5, PGRMC1 und 2, GDF9, BMP15, SLC2A1, PPARγ, HIF-2α (EPAS1) analysiert worden. Die Untersuchung der Gentranskripte für nPR, mPR, PGRMC1 und 2 erfolgte, um eine Beteiligung von Progesteron bzw. seinen Rezeptoren während der IVM nachzuweisen. Die Quantifizierung der mRNA-Gehalte für cPLA2, PTGS2 und PTGFR wurde ausgewählt, da einerseits die Prostaglandinsynthese an der Ovulation beteiligt ist (TSAFRIRI 1995, CHAKRABORTY et al. 1996, DUBOIS et al. 1998, STACK u. DUBOIS 2001, DIOUF et al. 2006, NUTTINCK et al. 2011) und andererseits spezielle Prostaglandinrezeptoren während der Reifung eine Rolle spielen (BRIDGES u. FORTUNE 2007). Die Steroidsynthese ist in der Maturationsphase von besonderer Bedeutung (SUGAWARA et al. 1995, CHRYSSIKOPOULOS 2000, NISWENDER et al. 2000, STOCCO 2000, SCHOENFELDER et al. 2003, REKAWIECKI et al. 2005). Aus diesem Grund wurde die Expression von STAR, HSD3B1 und CYP19A1 untersucht. Im Hinblick auf die Beteiligung an der Entwicklung zum dominanten Follikel und der Steroidsynthese (MAGOFFIN 1989, HARPER u. BRACKETT 1993, IZADYAR et al. 1998, IVELL et al. 2000, CALDER et al. 2003, ADRIAENS et al. 2004, SIRARD et al. 2007, LUO et al. 2011) sind die Gonadotropinrezeptoren für FSH und LH (FSHR und LHCGR) ausgewählt worden. Die Analyse von GDF9 und BMP15 in unreifen und reifen Oozyten erfolgte, da diese beiden Faktoren an der Entwicklungskompetenz (GILCHRIST und THOMPSON 2007, ASSEY et al. 1994b, HYTTEL et al. 1997) der Oozyte beteiligt sind. Der SLC2A1 ist bzgl. der Energielieferung/-bereitstellung an die Oozyte während der Reifung von Bedeutung (BIGGERS et al. 1967, EPPIG 1991, LONERGAN et al. 2003a). Die Untersuchung des PPARγ erfolgte, da dieser Rezeptor eventuell an der Ovulation und/oder Progesteronsekretion (LOHRKE et al. 1998, KOMAR et al. 2001, KOMAR u. CURRY 2002, SCHOPPEE et al. 2002, KIM et al. 2008) beteiligt ist. Die mRNA-Analyse des HIF2-α (EPAS1) ist ausgewählt worden, da bei der Maus eine Beteiligung von epas1 an der Follikelruptur und die Regulierung des HIF2-α durch den PGR nachgewiesen wurde (KIM et al. 2009). Die hierfür verwendeten Primersequenzen sind in den nachfolgenden Tabellen 26 und 27 aufgeführt. 81 Tabelle 26: Eizellen - Übersicht über die verwendeten Primer Transkript SLC2A1 82 GDF9 EPAS1 PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15 forward: CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC reverse: CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT forward: TAC CTT AGG CCG GAT TCA GA reverse: CAA TCG TTT CTT CCA GCA CA forward: TCC TTT GGT TTT GCT GCT TT reverse: GTT CCC TGT GCC CAT CAT AC forward: GCG ACG ACA GAA TCA CAG AA reverse: TGT CTC CAG CCA CAC ATA GC forward: ACA CCT TCA GCT CCA TGT CC reverse: GTA GCA GGA GAG CCA GAT GC forward: GGA AGA GAT GCA TCC AGA GG reverse: TGG CTC CTC CTT GTC TGA GT forward: AGT CAG GGG CCT TCA GAA CTG CA reverse: TCA GGA TGA AGC CCC ACC AGA CAT T forward: GCA GCC AAG AGG TAG TGA GG reverse: CAA TAC TGC CTG CTT GAC GA 256 197 204 194 203 207 207 194 Startposition des Primers 894 1151 1570 1766 57 260 1043 1236 327 529 426 631 693 899 634 827 Datenbanknummer M60448 NM_001205356 NM_174681 AB018399 XM_605853 NM_001075133.1 NM_001099060.1 DQ463368 Material und Methoden PGR Primersequenz (5’ – 3’) Größe des Amplifikats (bp) Tabelle 27: Kumuluszellen – Übersicht über die verwendeten Primer Transkript PGR 83 HSD3B1 CYP19A1 cPLA2 PTGS2 PTGFR PPARγ2 Primersequenz (5’ – 3’) forward: TAC CTT AGG CCG GAT TCA GA reverse: CAA TCG TTT CTT CCA GCA CA forward: GTG GAT TTT GCC AAT CAC CT reverse: TTA TTG AAA ACG TGC CAC CA forward: CCA CAC CAA AGC TAC GAT GA reverse: CAC GCT GTT GGA AAG AG forward: TGA CCC TAA GCC AAG AGC AAC AAG reverse: ACT GCC AAA CAG CAG GAT GAG A forward: TTT GTT CAT CCC CAG ACC TC reverse: TCC TAC CAT GGC TCG AAA TC forward: CCA GAC AAG CAG GCT AAT CC reverse: GAA AGA CGT CAG GCA GAA GG forward: ACGCTG GAA AGA TGG CAT AC reverse: GAG TTG TGA CAA GGG GCT GT forward: AAG AAT ATC CCC GGC TTT GT reverse: TTG GGC TCC ATA AAG TCA CC 197 203 198 366 200 200 198 200 - Fortsetzung auf nächster Seite - Startposition des Primers 1570 1766 929 1131 885 1082 2823 3188 553 752 1054 1253 1454 1651 1164 1363 Datenbanknummer NM_001205356 NM_174189 X17614 NM_174305 NM_001075864.1 AF031698 NM_174061 Y12420 Material und Methoden STAR Größe des Amplifikats (bp) Tabelle 27: Kumuluszellen – Übersicht über die verwendeten Primer (1. Fortsetzung) Transkript FSHR forward: ACG CTG GAA AGA TGG CAT AC reverse: GAG TTG TGA CAA GGG GCT GT forward: GTT GCC TCT TGT GGG TGT CAG CA reverse: TGA GGG GCA CTT TGA AGG CAG C 198 299 Startposition des Primers 1454 1651 1512 1810 Datenbanknummer NM_174061 NM_174381.1 84 Material und Methoden LHCGR Primersequenz (5’ – 3’) Größe des Amplifikats (bp) Material und Methoden In Abhängigkeit vom untersuchten Gen variierten die in der PCR eingesetzten Eizellenäquivalente (EA). Die nachstehende Tabelle 28 zeigt die entsprechenden EA. Tabelle 28: Eingesetzte EA in Bezug auf das entsprechende Gen Gen Eizellenäquivalent SLC2A1 0,1 PGR 0,1 GDF9 0,05 HIF2α 0,05 PAQR5 0,05 PGRMC1 0,025 PGRMC2 0,025 BMP15 0,0125 Globin 0,05 Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Doppelansatz im „IQ5 Multicolor RealTime PCR“. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches betrug für jede Probe 20 μl. Der PCR-Ansatz für Oozyten und Kumuluszellen sind in den nachfolgenden Tabellen 29 und 30 aufgeführt. Für die Reaktion wurde der „Mesa Green qPCR MasterMix Plus for SYBR® Assay w/Flourescin“ (Eurogentec, Köln, Deutschland) Mastermix mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green verwendet. Dieser Farbstoff lagert sich zwischen doppelsträngige DNA. Es erfolgten mindestens 3 Wiederholungen für jedes zu analysierende Gentranskript. 85 Material und Methoden Tabelle 29: PCR-Ansatz für Eizellen (einfacher Ansatz) Substrat Konzentration Menge Globin Menge Probe Master-Mix 1-facher Ansatz 10,0 μl 10,0 μl Primer forward 0,2 μM 0,4 μl 0,4 μl Primer reward 0,2 μM 0,4 μl 0,4 μl cDNA 2,0 – 0,25 μl 0,25 – 2,0 μl* ad H2O 20,0 μl 20,0 μl * siehe Eizellenäquivalente der entsprechenden Gene (Tabelle 30) Tabelle 30: PCR-Ansatz für Kumuluszellen (einfacher Ansatz) Substrat Konzentration Menge RPS9* Menge Probe Master-Mix 1-facher Ansatz 10,0 μl 10,0 μl Primer forward 0,2 μM 0,4 μl 0,4 μl Primer reward 0,2 μM 0,4 μl 0,4 μl cDNA 1,0 μl 0,1 μl ad H2O 20,0 μl 20,0 μl * RPS9 = „Housekeeping“-Gen (interner Standard) Der Ablauf der PCR stellte sich wie folgt dar: Denaturierung: 10 min 95 °C 43 Zyklen: 15 Sekunden bei 95 °C (Denaturierung) 30 Sekunden bei 60 °C (Annealing) 30 Sekunden bei 72 °C (Elongation) Schmelzkurve: 55 °C bis 95 °C (alle 10 Sekunden Erhöhung um 0,5 °C) Die bei der Anlagerung des SYBR Greens an die doppelsträngige DNA emittierte Fluoreszenz wurde mit der Kamera des „IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection 86 Material und Methoden System“ ermittelt. Somit erfolgte die Quantifizierung der enthaltenen cDNA über eine kontinuierliche Messung der Fluoreszenz und der mitgeführten Standards (Globin [Eizellen] und RPS9 [Kumuluszellen]). Die im Anschluss durchgeführte Schmelzkurve (Denaturierung der DNA, dadurch wird erneut Fluoreszenz freigesetzt – für jedes Transkript einzigartig) diente der Verifikation der PCR-Produkte. Die relative Quantifizierung der einzelnen Genes of Interests (GOIs) erfolgte an Hand der gemessenen Cycle Threshold-Werte (Ct-Wert, gibt die Zykluszahl an, bei dem die Amplifikationskurve des GOIs bzw. Standards den Schwellenwert kreuzt). Die Berechnung der ΔCt-Werte fand nach folgender Formel statt: ΔCt-Wert (Globin) = Ct-Wert (Globin 50 fg) – Ct-Wert (Globin Eizelle) ΔCt-Wert (GOI) = Ct-Wert (GOI) – Ct-Wert (Globin [Eizellen], RPS9 [Kumuluszellen]) Die Effizienz (Amplifikationsmenge verdoppelt sich in jedem Zyklus während der exponentiellen Phase der Reaktion) der GOIs in Eizellen lag bei 100% und die des Globins (Standard) bei 99-100%. Die anschliessend vorgenommene Normalisierung setzt die relative Expression des GOI in Eizellen bzw. Kumuluszellen in Bezug zu der Expression des Referenzgens (Globin / RPS9). Im Nachfolgenden sind die Formeln zur Normalisierung aufgeführt: Eizellen: Fold Difference = (Effizienz GOI)-ΔCt GOI / (Effizienz Globin)ΔCt Globin (PFAFFL 2001) Kumuluszellen: Effizienz-ΔCt-Wert (GOI) (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001) 87 Material und Methoden 3.5. Proteinanalyse 3.5.1. Gelelektrophorese Zur Auftrennung der Proteine nach ihrer molekularen Masse wurde SDS-PAGE nach LAEMMLI (1970) durchgeführt. Die Durchführung der SDS-PAGE fand in einer MiniProtean-TetraCell-Apparatur (Bio-Rad, München, Deutschland) statt. Dazu wurde zunächst ein Stopfgel-Mix angefertigt, gefolgt von dem 8%igen Trenngel-Mix. Die Zusammensetzung der Gel-Mixe ist dem Anhang zu entnehmen. Letzteres wurde mit ca. 500 μl Isopropanol (Roth, Karlsruhe, Deutschland) überschichtet, um vorhandene Luftblasen zu entfernen. Nach der Polymerisierung erfolgte die Abnahme des Isopropanols durch Abschütten, wobei die Reste mittels Filterpapier (Whatman Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) aufgenommen wurden. Der SammelgelMix wurde auf das Trenngel pipettiert und der Teflonkamm zur Formung der Ladungstaschen eingesetzt. Nach vollständiger Polymerisation und Entfernung des Teflonkammes wurden die Ladungstaschen mit 30 µl der vorgesehenen Proben und einem Größenstandard „Prestained Molecular Weight“ (3 µl Sigma-Aldrich, München, Deutschland) beladen. Die Gelelektrophorese im SDS-Laufpuffer (Zusammensetzung siehe Anhang) startete bei 100 Volt (V) bis sich die Proben auf einer Höhe befanden. Für den weiteren Verlauf wurde eine Spannung von 150 V eingestellt. Nach ca. 50 min erreichten die Proben das Stopfgel. Um eine bessere Größenaufteilung der Proteine im Bereich von 50 bis 120 kDa zu erhalten, wurde die Elektrophorese danach für ca. 10 min fortgeführt. Abbildung 19 zeigt schematisch dargestellt das Trennprinzip der Elektrophorese. Die Abbildung 20 demonstriert das verwendete GelelektrophoreseSystem. 88 Material und Methoden Abbildung 19: Trennprinzip der Gelelektrophorese (LOTTSPEICH et al. 2006) Abbildung 20: Verwendetes Gelelektrophorese-System 3.5.2. Probenaufbereitung 3.5.2.1. Proteinisolation aus Gewebeproben Als Positivproben für den verwendeten Antikörper (AK) diente humane Plazenta sowie bovine Karunkel und Kotyledone, die bis zum Zeitpunkt der Analyse bei -80 °C aufbewahrt wurden. Um die Gewebeproben aufzuschliessen, erfolgte die Zugabe von Boehringer-Lysepuffer (Zusammensetzung siehe Anhang), der die ProteaseInhibitoren Leupeptin und 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid (AEBSF) enthielt. Dazu sind die zerkleinerten Gewebeproben in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt, mit 200 µl Boehringer Lysepuffer überschichtet, mindestens sieben mal resuspendiert 89 Material und Methoden und für 5 min auf Eis gestellt worden. Dieser Vorgang wiederholte sich, um ein relativ homogenes Gemisch zu erhalten. Im Anschluss an die Zentrifugation (Heraeus, Thermo Scientific, USA) für 5 min bei 17.000 g erfolgte die Überführung des Überstandes in ein neues Eppendorfgefäß. Die Ermittlung der Proteinkonzentration in den entsprechenden Proben erfolgte mit dem Kit „DC Protein Assay“ (Bio-Rad, München, Deutschland) nach der LOWRYMethode. Der Einsatz des „DC Protein Assay“-Kits erfolgte nach Herstellerangaben, wobei jeweils 2 µl des gewonnenen Überstandes der Gewebeproben eingesetzt wurden. Das Pipettieren einer BSA-Reihe (0, 2, 3, 4, 5 µl einer 2 mg/ml Eichlösung, Roth, Karlsruhe, Deutschland) in die 96er-Well-Platte fand zum Zwecke der Kalibrierung statt (siehe Abbildung 21). Das Protein in den eingesetzten Proben bildete in der Biuretreaktion mit den Cu+-Ionen (Reagenz A) einen Komplex. Durch die Zugabe von dem Folin-Ciocalteau-Reagenz (Reagenz B, Molybdän(VI) und Wolfram (VI)Heteropolysäuren) entstand ein instabiler blauer Komplex. Mittels ELISA-Reader „Multiskan EX Microplate Photometer“ (Thermo Scientific, USA) wurde bei 690 nm die Absorption des Komplexes durch die Ascent-Software (Thermo Scientific, USA) gemessen. Diese steigt über einen bestimmten Bereich linear mit der Proteinkonzentration an. Abbildung 21: Anwendung DC Protein Assay und BSA Standardreihe Die gemessenen Werte wurden in eine Tabelle übertragen und die resultierende Gerade für den BSA-Standard berechnet. An Hand dieser Standardreihe konnte die Proteinmengen in den Proben bestimmt und die jeweiligen Positivproben (humane 90 Material und Methoden Plazenta, bovine Karunkel/Kotyledone) auf 10 bis 15 µg pro Ansatz eingestellt werden. Nach erfolgter Zugabe des 4 x SDS-Laemmli-Puffers (8 µl, Rezept siehe Anhang) wurden die Proben bei 95 °C für 5 min denaturiert und anschließend bei 17.000 g für 5 min zentrifugiert. Nachfolgend fand das Auftragen der aufbereiteten Gewebeproben in die Ladungstaschen des SDS-Gels statt. 3.5.2.2. Proteinisolation aus Kumulus- und Eizellen Die Kumuluszellen und die Eizellen wurden mit 20 μl Boehringer-Lysepuffer überschichtet und mindestens 7-mal resuspendiert. Hiernach erfolgte ein dreimaliges Einfrieren in Flüssigstickstoff mit nachfolgendem Auftauen bei Raumtemperatur. Eizellen sowie Kumuluszellen wurden für 5 min auf Eis gestellt, um den Zellaufschluss zu intensivieren. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 8 μl 4 x SDS-Laemmli-Puffer und die Denaturierung der Proben für 5 min bei 95 °C. Nach Zentrifugation (5 min bei 17.000 g) wurden die Proben in die Ladungstaschen des SDS-Gels pipettiert. 3.5.3. Western Blot Die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden mittels Western Blot auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen (TOWBIN et al. 1979). Durch diese Methode werden die Proteine für Detektions- und Quantifizierungsanalysen zur Verfügung gestellt. Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das SDS-Gel zur Äquilibrierung in den Blotpuffer überführt. Die Zusammensetzung des Blotpuffers kann dem Anhang entnommen werden. Der Aufbau des eingesetzten Tank-Blot-Systems ist in Abbildung 22 schematisch dargestellt. Die Abbildung 23 demonstriert das verwendete System. Für ca. 5 min fand die Äquilibrierung der verwendeten Filterpapiere, der Foampads wie auch der Nitrocellulosemembran (Roth, Karlsruhe, Deutschland) im Blotpuffer statt. Das Gel wie auch die Nitrocellulosemembran (Porengröße 0,45 µm) wurden jederseits luftblasenfrei von 3 Whatmanpapieren (1 mm Dicke) und einem Foampad flankiert und zusammen in die Plastikkassette eingesetzt. 91 Material und Methoden Abbildung 22: Schematische Darstellung des „Tankblot-Systems“ (modifiziert nach GALLAGHER et al. 2008) Unter Berücksichtigung der Polung wurde die bestückte Plastikkassette in die Apparatur mit dem Blotpuffer befüllt. Um eine Überhitzung des Systems zu vermeiden, fand ein Kühlaggregat Verwendung. Während der einstündigen Laufzeit betrug die Spannung im Blotsystem 100 V. Nach Beendigung des Western Blots wurde die Nitrocellulosemembran für 45 min bei Raumtemperatur in einer 5%igen Magermilchlösung (Rezept siehe Anhang) inkubiert. Dieser Schritt diente der Blockierung noch freier Bindungsstellen der Membran. Die Inkubation des primären Antikörpers erfolgte über Nacht bei 4 °C. Nach drei Waschschritten in TBS-T (Trisbuffered Saline-Tween, Zusammensetzung siehe Anhang) für jeweils 10 min bei Raumtemperatur wurde der sekundäre AK aufgetragen. Die Inkubationszeit für den Meerrettichperoxidase-gekoppelten Zweitantikörper betrug 60 min bei Raumtemperatur. Es folgten drei weitere Waschvorgänge mit TBS-T. Im Anschluss an einen weiteren Waschschritt der Membran in TBS (Rezept siehe Anhang) für 10 min bei Raumtemperatur wurde das Luminolsubstrat Super Signal West Dura (Thermo Fisher Scientific, Bonn, Deutschland) nach Herstellerangabe aufgetragen. Die Einwirkungszeit des Substrates betrug 5 min bei Raumtemperatur. Durch die Meerrettichperoxidase des sekundären AK wird das Luminol oxidiert. Dieser Vorgang 92 Material und Methoden emittiert Licht (420-480nm), welches durch den Einsatz des Imagingsystems Fusion (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) detektiert wurde. Abbildung 23: Verwendetes Tank-Blot-System 3.5.4. Ladungskontrolle Um den korrekten Ablauf des Blotvorganges sowie die Menge der Probe je Ladungstasche zu kontrollieren, erfolgte eine Redetektion der Nitrocellulosemembran mit einem β-Aktin-Antikörper. Als Bestandteil des Zytoskelettes gehört β-Aktin zu den so genannten „Housekeeping“-Proteinen (MASSICOTTE et al. 2006). Durch die Verwendung dieser internen Ladungskontrolle war eine semi-quantitative Bestimmung der Proteinmenge möglich (siehe Punkt 3.5.6. Semi-quantitative Bestimmung des nPR-Proteins). Die Nitrocellulosemembran wurde dazu nach der Detektion des ersten Antikörpers erneut zwei Waschvorgängen in TBS-T für 10 min bei Raumtemperatur unterzogen. Um die gebundenen Antikörper zu entfernen, fand die Inkubation der Membran mit einem sauren Strippingpuffer (Zusammensetzung siehe Anhang) für 30 min bei Raumtemperatur statt. Nach zweimaligem Waschen in TBS für 10 min bei 93 Material und Methoden Raumtemperatur fand die Blockierung der Membran in 5%iger Magermilchlösung für 60 min bei Raumtemperatur statt. Im Anschluss an die Inkubation mit dem β-AktinAntikörper (SC-47778, Mouse Monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland) für 60 min bei Raumtemperatur wurde die Membran dreimal in TBS-T gewaschen (10 min bei Raumtemperatur). Die Behandlung mit dem sekundären AK erfolgte für 60 min bei Raumtemperatur. Zur Reinigung der Membran wurden drei Waschschritte in TBS-T und ein Waschvorgang in TBS vorgenommen (jeweils 10 min bei Raumtemperatur). Abschließend fand das Auftragen des Chemilumineszenzsubstrates und die Detektion mittels des Imagingsystems Fusion statt. Dieser Vorgang wurde bereits unter Punkt 3.5.3. näher beschrieben. 3.5.5. Antikörper 3.5.5.1. Auswahl des nuklearen Progesteronrezeptor-Antikörpers Zu Beginn erfolgte zur Auswahl eines geeigneten Primärantikörpers zum Nachweis des nuklearen Progesteronrezeptors (nPR) beim Rind ein Vorversuch. Für die Untersuchung des humanen nPR stehen bereits getestete AK zur Verfügung. Aus diesem Grund wurde zuerst ein Abgleich der Aminosäuresequenzen zwischen dem humanen und dem bovinen nuklearem Progesteronrezeptor mit Hilfe der Datenbank „Basic Local Alignment Search Tool System“ (BLAST) vorgenommen (NP_000917.3 [Homo sapiens], NP_001192285.1 [Bos taurus]). Die Homologie dieser beiden Aminosäuresequenzen liegt bei 72%. 3.5.5.2. Eingesetzte Antikörper Die Konzentrationen und Inkubationszeiten der verwendeten Antikörper können Tabelle 31 entnommen werden. Im Western Blot wurden zur Überrpüfung der Spezifität der AK gegen den nPR Gewebeproben humaner Plazenta, boviner Karunkel und Kotyledone verwendet. In der folgenden Abbildung 24 ist die Detaktion der Isoform C (60 kDa) des nPRs in den entsprechenden Proben zu erkennen. 94 Material und Methoden Bovine Kotyledone Bovine Karunkel Humane Plazenta Abbildung 24: Western Blot mit den verwendeten Positivproben (AK MAB 4298 [1:1000]) Im Vorversuch stellte sich heraus, dass sich der AK MAB 4298 zur Detektion des bovinen nPR eignete. Die anderen Antikörper zeigten geringe oder zum Teil keine Reaktion bei den bovinen Gewebeproben (Karunkel und Kotyledone). Zur Überprüfung der Spezifität des AK MAB 4298 wurden F3-Zellen (Trophoblasten Zellkultur), BCECZellen (Bovine Cotyledone Endothe Zellkultur) und Fib-Zellen (Fibroblasten Zellkultur) eingesetzt. Als Positivprobe kam humane Plazenta zur Verwendung. Die Zellkulturen (enthalten BSA) wiesen keine spezifischen Banden für den nPR (116 kDa, 90 kDa, 60 kDa) auf (Abbildung 25). Somit wurde eine unspezifische Bindung, insbesonder an BSA (66 kDa), des AK MAB 4298 ausgeschlossen. Isoform B Isoform C Hum. Plazenta Bovine Karunkel F3Zellen BCECZellen FibZellen Abbildung 25: Western Blot zur Überprüfung der Spezifität des AK MAB4298 (1:500) Als Zweitantikörper fand der Anti-Maus (SC-2005, goat anti-mouse IgG HRP, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland) Verwendung. Um eine Kreuzreaktion 95 Material und Methoden des sekundären Antikörpers mit „Fremd“-Proteinen (aus der Probe) auszuschließen, wurde die Nitrocellulosemembran einmalig mit dem verwendeten PBS-Puffer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Es zeigte sich bei der verwendeten Positivprobe (bovine Karunkel und Kotyledone) keine Reaktion. Tabelle 31: Verwendete Antikörper (KatalogNr.:) Hersteller Immunogen Konzentration (Verdünnung) Inkubationszeit SM 5025 Acris nPR 5 μl/ml (1:200) Über Nacht SM 5026 P Acris nPR AS 533 – 547 1 μl/ml (1:1000) Über Nacht MA1-410 Thermo Scientific nPR AS 533 – 547 5μl/ml (1:200) Über Nacht MAB 4298 Abnova nPR AS 922 – 933 1μl/ml (1:1000) Über Nacht MS-298-P1 Thermo Scientific nPR N-terminale Hälfte 10 μl/ml (1:100) Über Nacht SC-2005 Santa Cruz IgG-Maus 0,2 µl/ml (1:5000) 60 Minuten SC-47778 Santa Cruz β-Aktin 0,2 µl/ml (1:5000) 60 Minuten 3.5.6. Semi-quantitative Bestimmung des nPR-Proteins Zur Ermittlung der Progesteronrezeptors Eberhardzell, semi-quantitativen kam Deutschland) Proteinmenge des nuklearen Lourmat, die Bio1-D-Auswertesoftware (Vilber zum Einsatz. Chemilumineszenz Die bei der aufgenommene Signalstärke des nPR-Antikörpers wurde in Relation zu der Signalstärke der β-Aktin-Ladungskontrolle gesetzt. 96 Material und Methoden 3.6. Ermittlung der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium Pro Versuchsgruppe erfolgte an mindestens 6 unterschiedlichen Tagen die Probennahme für die Messung des Progesterongehaltes im Reifungsmedium. In den beiden ölüberschichteten Gruppen wurden durchschnittlich 20 KOK in 100µl Reifungsmedium und in den beiden Nicht-Ölüberschichteten Gruppen durchschnittlich 29 KOK in 200µl Reifungsmedium eingesetzt. Nach einer Maturationsphase von 24 Stunden und der Entnahme der KOK aus dem Reifungsmedium, wurde das Maturationsmedium (80 bis 190µl) mittels Pipette in ein Eppendorfgefäß überführt und bei –20° C eingefroren. Für die Ermittlung der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium kam der Festphasen Coat-A-Count Progesteron Radioimmunoassay (PITKPG-9, Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland) entsprechend Herstellerangabe zur Anwendung. Der klassische Radioimmunoassay (RIA) ist ein kompetitiver Assay. Als markiertes Antigen wurde 125I-markiertes Progesteron verwendet. Der spezifische AK war auf der Innenwandseite des Test-PolypropylenRöhrchens fest aufgebracht. Die bei -20 °C gelagerten Proben (Reifungsmedium) wurden bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Probenmenge betrug 100μl je Variante. Es erfolgte eine Dreifachbestimmung. Nach Zugabe der Proben fand eine Inkubation von einer Stunde bei 37 °C statt. Innerhalb dieses Zeitraumes konkurrierte das im Reifungsmedium enthaltene Progesteron mit dem 125I-markierten Progesteron um die spezifischen Antikörperbindungsstellen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand abgegossen. Die Messung der Gammastrahlung des an den AK gebundenen 125I-markierte Progesterons fand im Gammacounter „LKB 1272 clinigamma“ (Perkin-Elma, Monza, Italien) statt. Die gemessenen Counts pro Minute waren zu der Konzentration umgekehrt proportional. Zur Analyse von Basalwerten erfolgte die Messung des Reifungsmediums (mit und ohne Zusatz von hCG und eC). Für die Ermittlung der Progesteron-Standardkurve wurde Reifungsmedium ex- bzw. inklusive hCG- und eCG-Zusätzen mit Progesteron (10ng/ml) versetzt und eine Verdünnungsreihe angesetzt. Die untere und obere Nachweisgrenze des Coat-ACount Progesteron RIA lag bei 0,02 bis 40,0 ng/ml (0,3 bis 127,0 nmol/L). Der Interassay-Variationskoeffizient betrug 9,76%. Die Kreuzreaktivität des spezifischen AK ist in der Tabelle 32 aufgeführt. Für die statistische Auswertung wurden Werte 97 Material und Methoden unterhalb des Messbereichs (< 0,02 ng/ml) gleich der unteren Nachweisgrenze gesetzt. Die Ergebnisse des RIA’s beziehen sich auf die Progesteronkonzentration im Reifungsmedium. Für die Ermittlung der Progesteronkonzentration je KOK erfolgte eine Umrechnung, die in der nachfolgenden Formel dargestellt ist. Ø-Progesteronkonzentration im Reifungsmedium (µg/ml) Ø-Anzahl der KOK im Reifungsmedium * 1000 98 = Ø-Progesteronkonzentration je KOK (pg) Material und Methoden Tabelle 32: Kreuzreaktivität des im RIA verwendeten Antikörpers Substrat Kreuzreaktivität (%) Progesteron 100 Androstenediol ND Kortikosteron 0,9 Kortisol 0,03 Danazol 0,006 11-Deoxykortikosteron 2,2 11-Deoxykortisol 0,01 DHEA-SO4 0,002 20α-Dihydroprogesteron 0,2 Östradiol ND 17α-Hydroxyprogesteron 3,4 Medroxyprogesteron 0,3 Pregnan ND 5β-Pregnan-3α-ol-20-one 0,05 5α-Pregnan-3,20-dione 9,0 5β-Pregnan-3,20-dione 3,2 Pregnenolon 0,1 5-Pregnen-3β-ol-20-one-sulfate 0,05 Testosteron 0,1 ND = nicht detektierbar 3.7. Statistische Auswertung Mit Hilfe der SigmaStat 2.0 Software (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) erfolgte die statistische Auswertung der Reifungsraten, der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium, die relative Menge ausgewählter Gentranskripte und der relative Proteingehalt der nPR-Isoformen A, B und C. Zu Beginn wurden mittels des Kolmogorov-Smirnov-Tests die Daten auf eine Normalverteilung getestet. Danach 99 Material und Methoden wurden die Daten der verschiedenen Gruppen (Medium mit/ohne Öl, 5%/20% O2) mittels einer One-way Analysis of Variance (ANOVA) verglichen. Es folgte außerdem eine Two-way ANOVA mit den zwei Faktoren Öl und O2-Konzentration und ihren Interaktionen, gefolgt von einem Tukey-Test. 3.8. Versuchsaufbau Zur Erlernung der Technik und Identifizierung eines passenden AK begannen im März 2010 die Vorversuche. Von November 2010 bis Februar 2011 erfolgte die Probengewinnung (unreife/reife Oozyten/Kumuluszellen) für die Hauptversuche. Abbildung 26 zeigt schematisch den Versuchsaufbau und der Tabelle 33 sind die Versuchsgruppen zu entnehmen. Tabelle 33: Versuchsgruppen Stadium O2-Konzentration Reifungsmedium Unreif - Ölüberschichtet 20% Reif Ölfrei (nicht-ölüberschichtet) Ölüberschichtet 5% 100 Ölfrei (nicht-ölüberschichtet) Material und Methoden Abbildung 26: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus 101 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1. Reifungskontrolle Zur Überprüfung der Kernreifung wurden insgesamt an mindestens 3 unterschiedlichen Tagen 279 in vitro gereifte und entkumulierte Oozyten fixiert und gefärbt. Von diesen 279 wurden 222 Eizellen in die Auswertung einbezogen. Siebenundvierzig Oozyten konnten nicht eindeutig als reif oder unreif identifiziert werden und sind aus diesem Grund nicht gewertet worden. Tabelle 34 zeigt die durchschnittlichen Reifungsraten der Oozyten in den einzelnen Versuchsgruppen. Zwischen den durchschnittlichen Reifungsraten der Oozyten in den einzelnen Gruppen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Tabelle 34: Reifungsrate der Oozyten der einzelnen Versuchsgruppen Gruppe Anzahl Oozyten Reifungsrate (%) 20% ölüberschichtet 55 83,4 ±5,7 20% ölfrei 58 86,7 ±4,3 5% ölüberschichtet 56 83,9 ±6,0 5% ölfrei 53 88,5 ±3,0 4.2. Darstellung der mRNA-Expression ausgewählter Gentranskripte In Oozyten wurde die relative Menge der Gentranskripte SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1 und PGRMC2 und in Kumuluszellen von STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR und FSHR in jeder einzelnen Versuchsgruppe analysiert. 4.2.1. mRNA-Expression spezifischer Gentranskripte in Kumuluszellen Eine signifikante Verminderung der relativen Transkriptmenge von cPLA2, PGR und LHCGR wiesen die Kumuluszellen der Gruppe unreif im Vergleich zu denen aller anderen Versuchsgruppen auf. Die Analyse der Transkriptmenge von HSD3B1 ergab eine signifikante Erhöhung in Kumuluszellen der Gruppe unreif zu denen der Gruppen 102 Ergebnisse 5% ölfrei, 20% Öl sowie 20% ölfrei. Die Kumuluszellen der Gruppe unreif exprimierten signifikant weniger PTGS2 zu denen in den Gruppen 5% und 20% ölfrei. Für die Expression der relativen Gentranskriptmenge von STAR, PTGS2, PTGFR, LHCGR, FSHR zeigte sich eine signifikante Erhöhung in Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl gegenüber der in Kumuluszellen aller anderen Versuchsgruppen. Die relative Gentranskriptmenge von CYP19A1 in Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl war signifikant erhöht gegenüber der in Kumuluszellen der Gruppen 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei. Für das Gentranskript PPARγ zeigte sich kein Unterschied in der relativen Transkriptmenge in den Kumuluszellen innerhalb der unterschiedlichen Versuchsgruppen. Die nachfolgende Abbildung 27 stellt grafisch die relative Transkriptmenge der ausgewählten Gentranskripte dar. 103 Ergebnisse 104 Abbildung 27: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen * PPARγ x*10 Signifikanzen (p ≤ 0,05) gelten nur innerhalb des ausgewählten Gentranskriptes Ergebnisse Der Einfluss der Ölüberschichtung des Reifungsmediums und der verschiedenen O2Konzentrationen während der Maturationsphase auf die Expression der relativen Gentranskriptmenge von STAR, HSD3B1, PTGS2, PTGFR, LHCGR, FSHR und CYP19A1 in Kumuluszellen ist in der Tabelle 35 aufgeführt. Die relativen mRNAGehalte an cPLA2, PPARγ und PGR in Kumuluszellen wurden durch die eben genannten Faktoren nicht beeinflusst. Tabelle 35: Einfluss der Ölüberschichtung bzw. Nicht-Ölüberschichtung des Reifungsmediums und der verschiedenen O2-Konzentrationen auf die relative Transkriptmenge in Kumuluszellen Reifungsmedium Gentranskript ölüberschichtet NichtÖlüberschichtet STAR HSD3B1 O2-Konzetrantion 5% ( ) - - CYP19A1 20% - - - cPLA2 - - - - PTGS2 - - ( ) - PTGFR - - PPARγ - - - - PGR - - - - LHCGR ( ) - - FSHR - - - = Signifikanz p ≤ 0,05 ( ) = Tendenz p ≤ 0,06 bis 0,1 Statistisch konnte eine Interaktion zwischen der O2-Konzentration und der Silikonölübeschichtung des Reifungsmediums bei der Expression folgender Gentranksripte festgestellt werden: HSD3B1, PTGFR und CYP19A1. Die höchsten mRNA-Gehalt dieser 3 Gentranskripte sind in der Gruppe 5% Öl gemessen worden. Wohingegen die niedrigsten Werte für HSD3B1 in der Gruppe 5% ölfrei und für PTGFR und CYP19A1 in der Gruppe 20% ölfrei analysiert wurden. Bei der mRNA-Menge von STAR, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PGR, LHCGR und FSHR ließ sich keine Interaktion 105 Ergebnisse zwischen den beiden Parametern (O2-Konzentration und Öl- bzw. Nicht- Ölübeschichtung) nachweisen. 4.2.2. MessengerRNA-Expression spezifischer Gentranskripte in Oozyten Der Abbildung 28 und 29 sind die relativen Mengen ausgewählter Gentranskripte in einzelnen Oozyten zu entnehmen. Die Gentranskripte SLC2A1 und PAQR5 wurden in Oozyten der Gruppe unreif signifikant stärker exprimiert als in denen der Gruppen 5% Öl und 20% ölfrei. Der relative mRNA-Gehalt an PGR in Oozyten der Gruppe unreif war signifikant erniedrigt zu dem in Eizellen aller anderen Versuchsgruppen. Auch zeigte sich eine signifikante Erhöhung in der relativen Transkriptmenge des PGRs in Oozyten der Gruppe 20% Öl im Vergleich zu denen der Gruppe 5% Öl. Eine signifikante Erhöhung der relativen mRNA-Menge an GDF9 wiesen die Oozyten der Gruppen unreif und 5% ölfrei im Vergleich zu den Eizellen der Gruppen 20% Öl und 20% ölfrei auf. Die Oozyten der Gruppen 5% ölfrei zeigten eine signifikante Erhöhung in der relativen PGRMC2-Menge im Gegensatz zu denen der Gruppen 5% Öl und 20% Öl. Der relative BMP15 mRNA-Gehalt wurde in den Eizellen der Gruppe 5% ölfrei stärker exprimiert als in den Oozyten der Gruppen 5% und 20% ölfrei. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der relativen mRNA-Menge für EPAS1 und PGRMC1 in den Oozyten der 5 Versuchsgruppen. 106 Ergebnisse relative Transkriptmenge 8,0 7,0 b 5,0 4,0 3,0 b b 6,0 ab a ac a 2,0 ac 5% ölfrei b c ab a ab ab a b 1,0 5% Öl ab a aab unreif a 20% Öl 20% ölfrei a F9 * R5 G D PA Q PG R SL C2 A1 0,0 Abbildung 28: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in Oozyten der 50,0 45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 b a b a 5% ölfrei 20% Öl 20% ölfrei ab P1 5* a 5% Öl BM C2 PG RM PG RM EP AS C1 ab a unreif ab ab 1 relative Transkriptmenge verschiedenen Gruppen *GDF9 x*100 Signifikanzen (p ≤ 0,05) gelten nur innerhalb des ausgewählten Gentranskriptes Abbildung 29: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in Oozyten der verschiedenen Gruppen *BMP15 x*10 Signifikanzen (p ≤ 0,05) gelten nur innerhalb des ausgewählten Gentranskriptes 107 Ergebnisse Für die Gentranskripte PGR, GDF9 und BMP15 zeigte sich ein signifikanter Einfluss der Parameter ölüberschichtetes/nicht-ölüberschichtetes Reifungsmedium und der O2Konzentration von 5% bzw. 20% während der Reifungsphase (Tabelle 36). Tabelle 36: Einfluss der Ölüberschichtung bzw. Nicht-Ölüberschichtung des Reifungsmediums und der verschiedenen O2-Konzentrationen auf die relative Transkriptmenge in Oozyten Reifungsmedium Gentranskript O2-Konzetrantion ölüberschichtet NichtÖlüberschichtet 5% 20% SLC2A1 - - - - PGR - - - PAQR5 - - - GDF9 - EPAS1 - - - - PGRMC1 - - - - PGRMC2 - - - - BMP15 - - - - = Signifikanz p ≤ 0,05 Eine Interaktion zwischen der Ölüberschichtung und der O2-Konzentration zeigte sich bei der Analyse der relativen mRNA-Menge von BMP15. Bei dem Einsatz eines Reifungsmediums ohne Silikonölüberschichtung und einer geringen O2-Konzentration (5%) ist der höchste mRNA-Gehalt an BMP15 in Eizellen gemessen worden. Für die mRNA-Mengen der übrigen Gentranskripte (SLC2A1, PGR, GDF9, HIF, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) ist in bovinen Oozyten keine Interaktion der beiden Parameter (Ölüberschichtung und O2-Konzentration) festgestellt worden. 108 Ergebnisse 4.3. Proteinexpression 4.3.1. Nuklearer Progesteronrezeptor Insgesamt wurden 4 Western Blot-Analysen durchgeführt. In diesen 4 Durchgängen wurden Kumuluszellen von 120 unreifen und 481 reifen Oozyten sowie 245 unreife und 962 reife Eizellen eingesetzt. Eine Übersicht zur Gruppeneinteilung und Probenanzahl zeigt die nachfolgende Tabelle 37. Tabelle 37: Gruppeneinteilung und Probenanzahl je Blot Durchgang Probe Versuchsgruppe Unreif Kumulszellen 20% O2 5% O2 Blot 1 Blot 2 Blot 3 Blot 4 --- 40* 42* 40* 40* ölüberschichtet 40* 42* 40* 40* ölfrei 40* 41* 41* 40* ölüberschichtet 40* 40* 39* 39* ölfrei 42* 39* 40* 40* 79 83 80 86 ölüberschichtet 80 83 80 80 ölfrei 83 83 80 80 ölüberschichtet 80 85 79 80 ölfrei 80 80 80 80 unreif Oozyten 20% O2 5% O2 Anzahl der eingesetzten Zellen * Anzahl der Oozyten, von denen die Kumuluszellen stammen Der zweite Western Blot-Durchgang (Blot 2) wies Unregelmäßigkeiten in der Detektion der einzelnen Banden auf (eventuell ein Handhabungs- oder Materialfehler) und wurde aus diesem Grund nicht in die Auswertung einbezogen. 4.3.1.1. Proteinexpression des nPRs in Kumuluszellen In Kumuluszellen erfolgte mit der Western Blot-Analyse die Detektion der Isoformen A, B und C des nPR. Als Positivkontrolle (Positivprobe) wurde bovines Plazentomgewebe (Karunkel- und Kotyledongewebe) eingesetzt. Die nachfolgenden 109 Ergebnisse Abbildungen 30 und 31 zeigen die Lumineszenzaufnahme für den nPR und β-Aktin in Kumuluszellen. kDa 180 116 Isoform B 90 Isoform A Isoform C 58 48 36 26 Positiv- unreif probe 20% 20% 5% 5% + Öl ölfrei + Öl ölfrei Abbildung 30: Repräsentativer Western Blot der nPR-Isoformen A, B und C in Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen Positivprobe unreif 20% 20% 5% 5% Positiv- + Öl ölfrei + Öl ölfrei probe Abbildung 31: Repräsentativer Western Blot zur Bestimmung des β-Aktin-Gehalts in Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen 110 Ergebnisse Die Abbildung 32 stellt die relative Proteinmenge der Isoformen A, B und C des nPR in Kumuluszellen dar. 1,6 b relative Proteinmenge 1,4 bc 1,2 unreif 1,0 0,8 b 0,6 0,0 ac* a ac bc bc* 0,4 0,2 5% Öl b ac b a b ac ac c b a ac 5% ölfrei 20% Öl 20% ölfrei a Abbildung 32: Relative Proteinmenge der Isoformen A, B und C des nPR in Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen * = Tendenz (p ≥ 0,05 bis 0,1) Signifikanzen (p ≤ 0,05) gelten nur innerhalb der einzelnen Isoformen Die relative Proteinmenge der Isoform A war in Kumuluszellen der Gruppen 5% ölfrei signifikant erhöht im Vergleich zu denen der Gruppen 5% Öl, 20% ölfrei und unreif. Eine signifikante Erhöhung der relativen Proteinmenge der Isoform A konnte in den Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl gegenüber denen der Gruppe unreif zu verzeichnen. Eine tendenzielle Reduzierung in der relativen Proteinmenge der Isoform A zeigte sich zwischen den Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl und denen der Gruppe 20% Öl. In Kumuluszellen der Gruppe unreif konnte die Isoform B nicht nachgewiesen werden. Jedoch war eine signifikante Erhöhung in der relativen Proteinmenge der Isoform B in den Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl im Vergleich zu denen aller anderen „reifen“ Versuchsgruppen zu verzeichnen. Eine signifikante Erhöhung in der relativen Proteinmenge der Isoform C sowie der relativen Proteinmenge insgesamt für alle 3 Isoformen konnte in den Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl zu denen in den Gruppen 5% Öl, 20% ölfrei und unreif festgestellt werden. Es zeigte sich auch eine signifikante Erniedrigung der relativen Proteinmenge in den Kumuluszellen der Gruppe 111 Ergebnisse unreif zu denen in den Gruppen 5% ölfrei sowohl hinsichtlich der Gesamtproteinmenge für alle 3 Isoformen als auch der Isoform C. Für die Isoformen B und C, jedoch nicht für die Isoform A, konnte ein signifikanter Einfluss der Ölüberschichtung des Reifungsmediums und/oder der verschiedenen O2Konzentration während der Maturationsphase auf die relative Proteinmenge festgestellt werden (Tabelle 38). Zwischen den beiden Parametern (Ölüberschichtung und O2-Konzentration) wurde eine Interaktion bzgl. der relativen Proteinmenge der Isoformen A und C nachgewiesen. Die niedrigste relative Proteinmenge für beide Isoformen (A und C) ist in der Gruppe „5% ölüberschichtet“ gemessen worden. Bei dem relativen Proteingehalt der Isoform B zeigte sich keine Interaktion zwischen der Silikonölüberschichtung und der O2-Konzentration. Tabelle 38: Einfluss der Ölüberschichtung des Reifungsmediums und der verschiedenen O2-Konzentrationen auf die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen in Kumuluszellen Reifungsmedium nPR Isform O2-Konzetrantion ölüberschichtet NichtÖlüberschichtet 5% 20% - - - - - - - - A B C - = Signifikanz p ≤ 0,05 4.3.1.2. Proteinexpression des nPRs in Oozyten Mit der Western Blot-Analyse erfolgte die Darstellung der Isoform B des nPR in bovinen Oozyten. Die Isoformen A und C konnten in dieser Arbeit nicht detektiert werden. Bei der Positivprobe handelte es sich um bovines Karunkel- und Kotyledongewebe. Die folgenden Abbildungen 33 und 34 zeigen die fotografischen Ergebnisse der Western Blot-Analyse für den nPR und β-Aktin in Oozyten. 112 Ergebnisse kDa 180 116 Isoform B 90 Isoform C 58 48 Positiv- unreif probe 20% 20% 5% 5% + Öl ölfrei + Öl ölfrei Abbildung 33: Repräsentativer Western Blot der nPR-Isoform B in Oozyten der verschiedenen Gruppen Positivprobe unreif 20% 20% 5% 5% Positiv- + Öl ölfrei + Öl ölfrei probe Abbildung 34: Repräsentativer Western Blot zur Bestimmung des β-Aktin-Gehalts in Oozyten der verschiedenen Gruppen Die Analyse der relativen Proteinmenge für die Isoform B des nPR in Oozyten zeigte, dass die Oozyten der Gruppen unreif und 20% Öl signifkant mehr nPR-Protein enthalten als die der Gruppen 5% Öl und 5% ölfrei (Abbildung 33). Weiterhin konnte festgestellt werden, dass eine O2-Konzentration von 20% die relative Proteinmenge der Isoform B des nPR in Oozyten erhöht. Eine Interaktion zwischen der O2Konzentration und der Ölüberschichtung des Maturationsmediums bzgl. der relativen Proteinmenge dieser Isoform (B) in bovinen Eizellen wurde nicht festgestellt. 113 Ergebnisse relative Proteinmenge 0,7 0,6 b b 0,5 unreif 5% Öl 0,4 5% ölfrei 0,3 a 0,2 a a 20% Öl 20% ölfrei 0,1 öl fre i 20 % Ö l 20 % öl f re i 5% Ö l 5% un re if 0,0 Abbildung 35: Relative Proteinmenge der Isoform B des nPR in Oozyten der verschiedenen Gruppen a:b p ≤ 0,05 114 Ergebnisse 4.4. Progesterongehalt im Reifungsmedium Es zeigt sich, dass in den beiden ölfreien Gruppen die Progesteronmenge je KOK im Reifungsmedium signifikant höher ist als die in den ölüberschichteten Gruppen. Innerhalb der ölfreien Gruppen weist die Gruppe 20% ölfrei (303,5±18,5 pg/KOK) einen signifikant höheren Progesterongehalt je KOK als der in der Gruppe 5% ölfrei (133,0±11,9 pg/KOK) auf. Zwischen den beiden ölüberschichteten Gruppen besteht kein signifikanter Unterschied in der Progesteronmenge je KOK (5,5±0,6 pg/KOK und 10,8±1,4 pg/KOK). Eine signifikante Interaktion (P =< 0,001) zwischen dem Reifungsmedium und der O2-Konzentration konnte ermittelt werden. Je höher die O2Konzentration, desto mehr Progesteron liegt im Reifungsmedium vor. Der Tabelle 39 ist der Progesterongehalt in pg/KOK der verschiedenen Versuchsgruppen zu entnehmen. Tabelle 39: Progesterongehalt in pg/KOK der verschiedenen Gruppen Gruppe Progesterongehalt (pg/KOK) 5% Öl 5,5 ± 0,7c 5% ölfrei 133,0 ± 11,9b 20% Öl 10,8 ± 1,4c 20% ölfrei 303,5 ± 18,5a a:b:c p ≤ 0,05 115 Diskussion 5. Diskussion In der Vergangenheit konnte hinreichend bewiesen werden, dass in vitro produzierte Embryonen von geringerer Qualität sind als ihre in vivo generierten Gegenstücke (WALKER et al. 1996, KRUIP u. DENDAAS 1997; NIEMANN u. WRENZYCKI 2000, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2000, FARIN et al. 2001; LAZZARI et al. 2002, NIEMANN et al. 2002, RIZOS et al. 2002a, b, WRENZYCKI et al. 2004). Ein Ansatz, um die Qualität der IVP zu verbessern ist, die IVM-Bedingungen den In-vivoVerhältnissen anzupassen, da die Entwicklungskompetenz der Eizelle von ihr selbst und durch die In-vitro-Reifungsbedingungen beeinflusst wird (ASSEY et al. 1994, HYTTEL et al. 1997, MERTON et al. 2003, GILCHRIST u. THOMPSON 2007, PREIS et al. 2007). Unter den derzeit verwendeten IVM-Bedingungen wird eine Kernreifung von 85 - 90% erreicht. Jedoch beträgt die In-vitro-Blastozystenrate nur 30 - 40% (WRENZYCKI et al. 2001, 2007, DIELEMAN et al. 2002, RIZOS et al. 2002, GALLI et al. 2003, RACEDO et al. 2008 MINGOTI et al. 2009, LUCIANO et al. 2010, STINSHOFF et al. 2011, ABELE et al. 2012). Hier zeigen sich die „Mängel“ der IVP. Da der Reifungsprozess der Eizelle aus der Kern- und der zytoplasmatischen Reifung besteht, ist anzunehmen, dass die zytoplasmatische Reifung nicht vollständig erfolgt (SILVA u. KNIGHT 2000, PREIS et al. 2003, GILCHRIST u. THOMPSON 2007, WRENZYCKI et al. 2007). Daraus lässt sich ableiten, dass die Entwicklungskompetenz der in vitro gereiften Oozyte reduziert ist und im Folgendem auch ihre Fähigkeit sich zum Embryo zu entwickeln (HYTTEL et al. 1986, 1989, 1997, MERTON et al. 2003, GILCHRIST und THOMPSON 2007, PREIS et al. 2007). Zur Verbesserung der IVM-Bedingungen sind zahlreiche Untersuchungen sowohl bezüglich der verwendeten Reifungsmedien und deren Zusätze (FUKUI et al. 1982, SIROTKIN et al. 1992, SILVA und KNIGHT 2000, ALBUZ et al. 2010) als auch unterschiedliche O2-Konzentrationen während der Reifungsphase (LONERGAN et al. 1999, BERMEJO-ALVEREZ et al. 2009, HASHIMOTO et al. 2000a, b, DE CASTRO u. HANSEN 2007, HASHIMOTO 2009) durchgeführt worden. Jedoch konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt die In-vivo-Situation nicht adäquat nachgestellt werden. 116 Diskussion Da das Steroidhormon Progesteron eine zentrale Rolle in der weiblichen Reproduktion spielt, ist in letzter Zeit dieses Hormon und seine Wirkung via seiner nuklearen und membranassoziierten Rezeptoren im Hinblick auf adäquatere IVM-Bedingungen in den Mittelpunkt gerückt. In unterschiedlichen Tierarten sind mittels mRNA- oder/und Proteinanalyse Progesteronrezeptoren im Gelbkörper (Rind [D´HAESELEER et al. 2007], Maus [YOU et al. 2010], Schaf [ASHLEY et al. 2009]), in Follikelgewebe (Schwein [DURLEJ et al. 2010]), in Oozyten (Rind [CLEMENTE et al. 2009, APARICIO et al. 2011]), in Kumuluszellen (Rind [SALHAB et al. 2010]) und im Endometrium (Rind [SCHAUBLI et al. 2008]) nachgewiesen worden. Beim Rind steigt in vivo 6 Stunden nach dem LH-Peak die Pogesteronkonzentration in der Follikelflüssigkeit an. Dieser Anstieg geht mit einer Erhöhung des mRNA-Gehaltes für den nPR in bovinen Granulosa- und Thekazellen einher (DIELEMAN et al. 1983, JO et al. 2002). Bei Zugabe eines Steroidsynthesehemmers zum Reifungsmedium reduzieren sich signifikant die Kernreifungsraten boviner Oozyten, der Progesterongehalt im Medium sowie die Kumuluszellexpansion im Vergleich zur Kontrollgruppe (WANG et al. 2006). Auch hat die Hemmung der HSD3B1 durch Zugabe von Trilostane in das IVM-Medium eine Reduzierung der bovinen Blastozystenrate an Tag 7 zur Folge (APARICIO et al. 2011). Aufgrund dieser Ergebnisse wird angenommen, dass Progesteron und seine Wirkung, die durch spezifische Rezeptoren vermittelt wird, am Ovulationsprozess beteiligt ist (LUCIANO et al. 2010, PELUSO 2006, 2007, MULAC-JERICEVIC et al. 2000, 2003, MULAC-JERICEVIC u. CONNEELY 2004, ROBKER et al. 2000, 2009, APARICIO et al. 2011). Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Einflüssen unterschiedlicher Reifungsbedingungen auf die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in Oozyten (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGRMC1, PGRMC2, PAQR5) und Kumuluszellen (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PTGFR, LHCGR, FSHR, PGR, PPARγ) und auf die Proteinexpression des nPRs in bovinen KOK. Hierzu wurden bovine KOK bei unterschiedlichen O2-Konzentrationen (5% versus 20%) entweder in ölüberschichtetem oder in nicht-ölüberschichtetem Medium in vitro gereift. Im Anschluss erfolgte die Reifungskontrolle bei zufällig ausgewählten Oozyten aus 117 Diskussion jeder Versuchsgruppe. Die Ermittlung des Progesterongehaltes im Reifungsmedium diente dazu, einen eventuellen Einfluss des Progesterons abzuklären. Um Veränderungen im mRNA- und Proteinexpressionsmuster zu identifizieren, wurden ebenfalls unreife Oozyten und Kumuluszellen der mRNA- und Protein-Analyse unterzogen. 5.1. Beurteilung der Kernreifung An Hand der Kernreifungsrate lässt sich beurteilen, inwieweit die IVM-Bedingungen die Kernreifung der Oozyte beeinflussen. In dieser Studie ist kein signifikanter Unterschied in den Kernreifungsraten (83 – 88%) zwischen den verschiedenen Gruppen (ölfreies oder ölüberschichtetes Medium, Reifung bei 5 oder 20% O2) festgestellt worden. Die Kernreifungsraten früherer Veröffentlichungen liegen zwischen 76 und 93% (KHURANA u. NIEMANN 2000, HASHIMOTO 2000a, WANG et al. 2006, BILODEAU-GOESEELS 2006, WARZYCH et al. 2007, LUCIANO et al. 2010). Die Spanne innerhalb der Kernreifungsrate ist einerseits auf die Verwendung unterschiedlicher Reifungsmedien (TCM199, SOF, MEM) und -zusätze (BSAfaf, EGF, BSA, Glukose, PVA) und Kriterien bei der KOK-Auswahl (LUCIANO et al. (2010) mind. 5 Lagen Kumuluszellen) zurückzuführen. Im Hinblick auf die O2-Konzentration während der Reifungsphase kann festgestellt werden, dass sich die Kernreifungsrate boviner Oozyten unter einer geringen O2-Konzentration (5%) im Vergleich zu einer O2Konzentration von 20% von 83 auf 19% (HASHIMOTO et al. 2000a) sowie von 60 – 64% auf 30 – 41% (MINGOTI et al. 2009) reduziert. Gegenteiliges zeigen Ergebnisse einer Studie aus dem Jahre 2010. Hier werden die Kernreifungsraten (72 bzw. 74%) boviner Oozyten weder durch die O2-Konzentration (5/20%) noch durch Mediumszusätze (Grundmedium TCM199, Zusatz Östrus-Kuhserum und PVA) beeinflusst (PEREIRA et al. 2010). HASHIMOTO et al. (2000a) verwendeten als Reifungsmedium SOFaa + 1,5mM Glukose + 3,3mM Laktat und in der Studie von MINGOTI et al. (2009) wurde TCM199 + 0,1 µg/ml Östradiol und als Mediumszusatz PVA, PVP, oder BSA eingesetzt. Die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen ist wahrscheinlich sowohl auf die verschiedenen Reifungsmedien als auch die unterschiedlichen Zusätze zurückzuführen (PEREIRA et al. 2010, MINGOTI et al. 2009, DE CASTRO u. HANSEN 2007). Der Effekt von Progesteron auf die Reifung 118 Diskussion von Oozyten wird kontrovers diskutiert. Untersuchungen, die sich mit dieser Thematik befasssen, nutzen zumeist einen von zwei Versuchsansätzen: Entweder wird Progesteron dem Reifungsmedium zugesetzt oder die Progesteronsekretion/produktion durch die Kumuluszellen selbst wird analysiert (ARMSTRONG et al. 1996). In einer vorherigen Untersuchung ist durch die Progesteronsupplementierung in das IVM-Medium eine Erhöhung der Kernreinfungsrate boviner Oozyten erzielt worden (SIROTIKIN et al. 1992). Ergebnisse einer Studie aus dem Jahr 2000 demonstrieren, dass die Zugabe von Progesteron in das Reifungsmedium (300nmol l-1) die Blastozystenrate reduziert. Die Autoren folgern daraus, dass dieser Effekt sich auch auf die Eizellreifung auswirkt (SILVA u. KNIGHT 2000). Für die Differenzen in den Ergebnissen der verschiedenen Studien sind vermutlich die unterschiedlichen IVMProtokolle verantwortlich (Temperatur während der Reifungsphase [37,5 bis 39° C], Zusätze zum Reifungsmedium). Die Kernreifungsraten, die in der vorliegenden Forschungsarbeit erzielt wurden, stimmen mit den durchschnittlichen Kernreifungsraten der bekannten Literatur überein (WANG et al. 2006, WARZYCH et al. 2007, RACEDO et al. 2008, LUCIANO et al. 2010, PEREIRA et al. 2010). Da die Kernreifung der Oozyte nur einen Teil der finalen Reifung boviner Eizellen darstellt, könnte, um die Entwicklungskompetenz der Oozyte bzw. des KOK zu beurteilen, ein weiterer Versuch erfolgen, in dem die Blastozystenraten erfasst werden. 5.2. Progesterongehalt im Reifungsmedium In der vorliegenden Arbeit ergeben die Untersuchungen des Reifungsmediums einen Progesterongehalt von 5,5 bis 303,5 pg/KOK bzw. 1,1 bis 44,0 ng/ml Medium. In den beiden ölfreien Gruppen liegen die Werte bei 19,3 (5% O2-Konentration) bis 44,0 (20% O2-Konentration) ng/ml. In der Studie von WANG et al. (2006) ist ein Progesterongehalt von 30 ng/ml bei einer O2-Konzentration von 20% analysiert worden. Die Differenzen zwischen den Progesterongehalten der vorliegenden Studie und der von WANG et al. (2006) sind vermutlich auf verschiedene Reifungsprotokolle, wie z.B. die Reifungsdauer (22 Stunden versus 24 Stunden), die Zusätze im Reifungsmedium (porcines FSH, equines LH und FCS versus eCG, hCG und BSA) 119 Diskussion zurückzuführen. Die KOK, die im ölüberschichteten Medium reiften, sezernierten 5,5 (5% O2Konzentration) bzw. 10,8 pg/KOK (20% O2-Konzentration) Progesteron. In einer anderen Studie liegt der Progesterongehalt bei 107,5 ± 3,9 pg/KOK unter der Verwendung von TCM199 als Reifungsmedium (NUTTINCK et al. 2008). Die Ursache für die höhere Progesteronkonzentration in der Arbeit von NUTTINCK et al. im Vergleich zu den vorliegenden Ergebnissen könnte in der Auswahl der unreifen KOK oder den Medienzusätzen liegen. NUTTINCK et al. (2008) verwendeten ausschließlich KOK mit mind. 3 Lagen Kumuluszellen, während in dieser Studie die unreife Oozyte von mind. 1 Lage Kumuluszellen umgeben war. Letztendlich ist die Akkumulation von Progesteron im Reifungsmedium in verschiedenen Studien bestätigt worden (WANG et al. 2006, PEREIRA et al. 2008, MONTANO et al. 2009, SHIMADA et al. 2002). In dieser Studie zeigt sich zwischen der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium und der O2-Konzentration eine signifikante Interaktion. Die höchsten Progesteronkonzentrationen sind im nicht-ölüberschichtetem Medium bei einer O2Konzentration von 20% gefolgt von einer O2-Konzentration von 5% gemessen worden. Das höhere Progesteronmengen im nicht-ölüberschichtetem Medium im Vergleich zu dem Gehalt im ölüberschichtetem Reifungsmedium vorliegen, ist bereits veröffentlicht worden (SHIMADA et al. 2002, CLEMENTE et al. 2009). Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Studie kann weiterhin angenommen werden, dass unterschiedliche Progesteronkonzentrationen im Reifungsmedium keinen direkten Effekt auf die Kernreifung ausüben, da sich die Kernreifungsraten innerhalb der unterschiedlichen Gruppen nicht signifikant unterscheiden. Generell ist aber zu bedenken, dass eventuell die zytoplasmatische Reifung und die Entwicklungskompetenz der Oozyte zum Embryo beeinflusst wird. Zur Ermittlung eines solchen Effektes wäre sowohl die Bewertung von Blastozysten an Hand morphologischer Kriterien als auch die Blastozystenrate heranzuziehen. 120 Diskussion 5.3. Genexpression in bovinen Oozyten und Kumuluszellen Es ist seit längerem bekannt, dass sich das Genexpressionsmuster in vitro produzierter Embryonen im Vergleich zu dem in vivo generierten Embryonen unterscheidet (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000, LONERGAN et al. 2003a, WRENZYCKI et al. 2001, 2004, 2005). Einige kürzlich veröffentlichten Studien zeigen, dass sich auch das Transkriptionsprofil in vivo und in vitro gereifter boviner Oozyten unterscheidet (FAIR et al. 2007, KUES et al. 2008, KATZ-JAFFE et al. 2009). Insgesamt sind 2117 Transkripte identifiziert worden, deren Expression sich in in vitro gereiften Oozyten im Gegensatz zu unreifen bovinen Oozyten verändert (MAMO et al. 2011). Auch zwischen in vitro gereiften und in vivo produzierten bovinen Kumuluszellen zeigen sich Unterschiede im Expressionsmuster von Transkripten. Insbesondere Transkripte, die in die Kumuluszellexpansion involviert sind, werden geringer exprimiert und Transkripte, die mit Stress assoziiert werden, zeigen eine verstärkte Expression in in vitro gereiften gegenüber in vivo generierten Kumuluszellen (TESFAYE et al. 2009, SALHAB et al. 2013). In der vorliegenden Studie akkumulierte sich, durch den Einsatz von nichtölüberschichtetem Reifungsmedium, Maturationsmedium. Und die das verschiedenen lipophile Progesteron O2-Konzentration während im der Reifungsphase, könnten einerseits durch vermehrte Radikalbildung (20% O2Konzentration [LONERGAN et al. 1999, KHURANA u. NIEMANN 2000; VAN SOOM et al. 2002, COMBELLES et al. 2009, AGARWAL et al. 2006]) und andererseits durch den Switch vom aeroben auf den anaeroben Energiestoffwechsel (5% O2Konzentration [HASHIMOTO et al. 2000a, CZYZYK-KRZESKA 1997, WENGER u. GASSMAN 1997]) einen Einfluss auf die Eizellentwicklung nehmen. Im nachfolgenden werden die Ergebnisse der RT-qPCR bzgl. dieser oben genannten Parameter diskutiert. 121 Diskussion 5.3.1. Genexpression in Kumuluszellen 5.3.1.1. Expression von STAR, CYP19A1 und HSD3B1 Zur Analyse der Steroidproduktion in unreifen und reifen Kumuluszellen sind in dieser Studie die relativen mRNA-Gehalte von STAR, CYP19A1 und HSD3B1 untersucht worden. Das STAR-Protein ist am Transport von Cholesterin zur inneren Mitochondrienmembran, wo Cholesterin zu Pregnenolon (Vorläufermolekül für u.a. Progesteron) umgewandelt wird, beteiligt (SIMPSON 1979, HORN et al 2003). Die HSD3B1 katalysiert die Konversion verschiedener Vorläufermoleküle (Pregnenolon, Dehydroepiandrosteron) zu Progesteron. Die Metabolisierung von Testosteron zu 17βÖstradiol findet durch die CYP19A1 statt (SIMPSON 1979, FORTUNE u. HANSEL 1985, CONLEY u. BIRD 1997, LUU-THE 2001, SIMPSON u. DAVIS 2001). Zwischen der mRNA-Menge in den Kumuluszellen der Gruppe unreif und den der Gruppe 20% Öl ist statistisch kein Unterschied festgestellt worden. Letzt genanntes Ergebnis stimmt mit dem einer vorherigen Untersuchung überein (SALHAB et al. 2011). Für CYP19A1 ist eine signifikante Erhöhung der relativen mRNA-Menge in den Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl im Vergleich zu der in den Kumuluszellen der Versuchsgruppen 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei gemessen worden. Im Gegensatz zu diesem Ergebnis ist in einer anderen Forschungsarbeit eine signifikante Erhöhung der CYP19A1 mRNA-Menge in unreifen Kumuluszellen im Vergleich zu der in reifen Kumuluszellen festgestellt worden (SALHAB et al. 2011). In der Studie von SALBHAB et al. (2011) ist dem Reifungsmedium Epidermal Growth Factor (EGF) zugesetzt worden und die Reifungsphase dauerte 22 Stunden. Dieses Protokoll ist von dem in der vorliegenden Untersuchung abweichend und eventuell der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse. Sowohl die Ölüberschichtung des Reifungsmediums als auch eine O2-Konzentration von 5% erhöhen signifikant den relativen mRNA-Gehalt von STAR und tendenziell den von CYP19A1 in bovinen Kumuluszellen. Ebenso löst die Ölüberschichtung des Reifungsmediums einen tendenziellen Anstieg im relativen mRNA-Gehalt für HSD3B1 in bovinen Kumuluszellen aus. Die Interaktion zwischen der O2-Konzentration und der Steroidgenese ist ebenfalls bei der Kultivierung boviner Lutealzellen festgestellt 122 Diskussion worden. Hier bewirkt eine O2-Konzentration von 3% während der Kultivierung eine signifikante Verminderung der Progesteronkonzentration im Medium (NISHIMURA et al. 2006, JIANG et al. 2011), aber keine signifikante Reduzierung im mRNA-Gehalt von STAR und HSD3B im Vergleich zur Kontrollgruppe (O2-Konzentration von 20% [NISHIMURA et al. 2006]). Diese beiden Studien können mit der vorliegenden Arbeit jedoch nicht konkret verglichen werden, da das Ausgangsmaterial (Lutealzellen versus Kumuluszellen) differiert. Aus den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen kann abgeleitet werden, dass in Kumuluszellen die mRNA-Expression von STAR durch oxidativen Stress und durch einen geringeren Progesterongehalt im Reifungsmedium (im Vergleich zu dem in den Gruppen ohne Silikonölüberschichtung des Mediums) ansteigt. Auch werden durch eine niedrigere Progesteronkonzentration im Maturationsmedium (im Vergleich zu den ölfreien Gruppen) die HSD3B1-mRNAMengen erhöht. Folglich fördert eine geringere Progesteronkonzentration in einem ölüberschichteten Reifungsmedium im Gegensatz zu einem nicht silikonölüberschichteten Medium die Transkription von Enzymen, die an der Progesteronsynthese beteiligt sind. Um diese Vermutung abzuklären, wäre die Analyse der Steroidbiosyntheseenzyme auf Proteinebene sinnvoll, denn aus der Literatur ist zu entnehmen, dass zum Teil eine geringe Korrelation zwischen der mRNA-Menge und dem entsprechenden Proteingehalt besteht (GYGI et al. 1999 [Hefe Saccharomyces cerevisiae], CHEN et al. 2002 [humanes Lungenadenokarzinom], KISLINGER et al. 2006 [murines Organgewebe z.B. Herz, Lunge, Leber, Niere, Plazenta], TIAN et al. 2004 [Zellinien aus murinem Knochenmark und murine Leberzellen], NIE et al. 2007 [Review]). Die mRNA wird in der Regel erst prozessiert, um dann vom Ribosom, wo die eigentliche Proteinsynthese stattfindet, erkannt zu werden. Mehrere Ribosomen können gleichzeitig ein mRNA-Molekül übersetzen (STRYER 1991). Es ist auch bekannt, dass manche Embryonalzellen „gespeicherte mRNAs“ enthalten, die erst in späteren Stadien der Embryonalentwicklung zur Steuerung der Proteinsynthese eingesetzt werden (LEWIN 1991, BREVINI et al. 2007). 123 Diskussion 5.3.1.2. Expression des LHCGR und FSHR in Kumuluszellen In bovinen Granulosazellen löst der LH-Peak kurz vor der Ovulation einen Anstieg der Expression seines eigenen Rezeptors (LHCGR) aus (BAO et al. 1997a, RHODES et al. 2001, MIHM et al.2006, NOGUEIRA et al. 2007). Der LHCGR-mRNA-Gehalt in der vorliegenden Arbeit ist in Kumuluszellen der Gruppe unreif im Vergleich zu dem in den „reifen“ Gruppen signifikant vermindert. Auch CALDER et al. (2003) stellten eine verstärkte Expression des LHCGR in reifen KOK gegenüber der in unreifen KOK fest. Das Hormon FSH beeinflusst via seines Rezeptors (FSHR) die Eizellentwicklung und Kumuluszellexpansion (HARPER und BRACKETT 1993, IZADYAR et al. 1998, CALDER et al. 2003, ADRIAENS et al. 2004, SIRARD et al. 2007). In der vorliegenden Studie ist die relative Transkriptmenge des FSHR in den Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl im Vergleich zu denen der anderen Gruppen signifikant erhöht. In drei vorherigen Untersuchungen, in denen ein ölüberschichtetes Reifungsmedium und eine O2-Konzentration von 20% verwendet wurden, ist in reifen bovinen Kumuluszellen eine signifikante Abnahme der mRNA-Menge für den FSHR gegenüber unreifen Kumuluszellen detektiert worden (CALDER et a. 2003, NUTTINCK et al. 2004, SALHAB et al. 2011). In dieser Untersuchung konnte zwischen unreifen und reifen Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl kein Unterschied im mRNA-Gehalt ermittelt werden. Ein Grund dafür sind vermutlich unterschiedliche IVM-Protokolle. Da sich die Expression des FSHR in reifen bovinen KOKs durch den Zusatz (Grundmedium TCM199) fetalen Kälberserums oder EGF oder von LH und Östrogenen reduziert (CALDER et al. 2005, SALHAB et a. 2011). 5.3.1.3. Expression der cPLA2 und PTGS2 in Kumuluszellen Die Prostaglandine sind an der Ovulation beteiligt und in die Eizellreifung involviert (DIOUF et al. 2006, NUTTINCK et al. 2011). Als Vorläufer der Prostaglandinsynthese agiert die cPLA2. Sie induziert die Freisetzung der Arachidonsäure aus den Membranvesikeln (CLARK et al. 1991). Die PTGS2 katalysiert die Umwandlung der Arachidonsäure in Prostaglandine (PGE, PGF2α) über das instabile Zwischenprodukt PGH2 (CLARK et al. 1991, LIM et al. 1997, DAVIS et al. 1999). Es wird vermutet, das 124 Diskussion die Enzyme PTGS2 und cPLA2 metabolisch gekoppelt sind (DIOUF et al. 2006). In der vorliegenden Studie ist erstmalig die relative Transkriptmenge von cPLA2 in bovinen Kumuluszellen analysiert worden. Es zeigte sich in den Kumuluszellen der „reifen“ Gruppen gegenüber der in unreifen Kumuluszellen eine signifikante Erhöhung der cPLA2-mRNA-Menge. Der mRNA-Gehalt von PTGS2 ist signifikant erhöht in den Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl, 5% ölfrei und 20% ölfrei gegenüber dem in unreifen Kumuluszellen. Eine vorherige Studie zeigt, dass bei der IVM von bovinen KOK (TCM199 + EGF) eine signifikante Erhöhung der mRNA-Menge für die PTGS2 erfolgt (NUTTINCK et al. 2002, 2008). Somit stimmen die vorliegenden Ergebnisse für die PTGS2 mit den genannten Veröffentlichungen überein. Veröffentlichungen bzgl. der cPLA2 Expression in bovinen Kumuluszellen ist nicht vorhanden und kann folglich nicht diskutiert werden. Statistisch ist durch eine O2-Konzentration von 5% eine tendenzielle Erhöhung des mRNA-Gehaltes der PTGS2 in bovinen Kumuluszellen nachgewiesen worden. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu dem aus einer vorherigen Untersuchung. Hier zeigt sich in Kumuluszellen von bovinen KOK, die bei einer O2-Konzentration von 20% reiften, eine signifikante Erhöhung der PTGS2-mRNA-Menge im Vergleich zu denen, die bei einer O2-Konzentration von 5% reiften (BERMEJO-ÁLVAREZ et al. 2010). Es ist zu vermuten, dass die unterschiedlichen IVM-Protokolle für die Differenzen in den Ergebnissen verantwortlich sind (BERMEJO-ÁLVAREZ et al. 2010 haben TCM199 10ng/ml EGF zugesetzt). Da durch eine O2-Konzentration von 5% die PTGS2-mRNAMenge signifikant erhöht wird, aber die der cPLA2 nicht, sind unter einer geringen O2Konzentration während der Reifung die PTGS2 und cPLA2 wahrscheinlich nicht gekoppelt. Wohingegen in den Gruppen 5% ölfrei und 20% ölfrei beide Transkriptmengen (cPLA2 und PTGS2) im Vergleich zu den in der Gruppe unreif signifikant erhöht sind. Daher ist zu vermuten, dass bei der IVM im nichtölüberschichtetem Reifungsmedium (höhere Progesteronkonzentration im Medium im Gegensatz zum ölüberschichtetem Medium) die cPLA2 und die PTGS2 gekoppelt sind und zwar unabhängig von der O2-Konzentration während der Reifungsphase. Zur Abklärung dieser Vermutung könnte unter den gleichen IVM-Bedingungen wie in dieser Untersuchung einerseits eine Analyse auf Proteinebene dieser beiden Enzyme 125 Diskussion erfolgen und andererseits die entsprechenden Endprodukte (z.B. Prostaglandin E2) mengenmäßig erfasst werden. Auch wäre zu überlegen, ob die Blockierung der cPLA2 mittels eines Antikörpers (AK)/Inhibitors einen Einfluss auf die PTGS2-Expression hat. 5.3.1.4. Expression des PTGFR in Kumuluszellen PGF2α und seinem Rezeptor (PTGFR) wird eine Rolle in der präovulatorischen Phase zugeschrieben (BRIDGES u. FORTUNE 2007). In der vorliegenden Studie ist der mRNA-Gehalt für PTGFR in Kumuluszellen der Gruppe 5% Öl signifikant höher als der in den Kumuluszellen aller anderen Versuchsgruppen (unreif, 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei). Dadurch wird deutlich, dass auch die Expression des PTGFR einerseits durch oxidativen Stress und andererseits durch eine niedrige Progesteronkonzentration im Reifungsmedium erhöht wird. Der PTGFR ist in der vorliegenden Untersuchung erstmalig in bovinen Kumuluszellen analysiert worden. Weitere Publikationen, die zur Diskussion der vorliegenden Ergebnisse verwendet werden könnten, sind nicht bekannt. Um zu klären, ob der PTGFR in die Ovulation involviert ist, wäre die Zugabe eines AK/Inhibitors gegen den PTGFR in das IVMMedium sinnvoll und im weiteren die Ermittlung der Blastozystenrate. 5.3.1.5. Expression des PPARγ in Kumuluszellen Bei dem PPARγ handelt es sich um einen nuklearen Hormonrezeptor, der nach seiner Aktivierung Einfluss auf die Genexpression in der Zelle nimmt (BERGER u.MOLLER 2002, KOWALEWSKI et al. 2009). Im Hinblick auf den Ovulationsprozess ist festgestellt worden, dass in der Maus der Pparγ, reguliert durch den Pgr, in die Follikelruptur involviert ist (KIM et al. 2008). Beim Rind konnte durch die Zugabe eines Liganden für den PPARγ nach 24 Stunden die Progesteronsekretion in einer bovinen Lutealzellkultur gesteigert werden (LÖHRKE et. 1998). Auch ist eine Beteiligung an der Regulierung der CYP19A1-Expression nachgewiesen worden (FAN et al. 2005). In der vorliegenden Studie konnte kein signifikanter Unterschied im relativen mRNAGehalt des PPARγ in den Kumuluszellen der einzelnen Versuchsgruppen festgestellt werden. Somit scheint sich weder oxidativer Stress (O2-Konzentration von 5% 126 Diskussion während der IVM) noch Änderungen der Progesteronkonzentration im Maturationsmedium auf die Expression des PPARγ in Kumuluszellen auszuwirken. Da sich die PPARγ-mRNA-Gehalte innerhalb aller 5 Versuchsgruppen nicht signifikant unterscheiden, aber die des PGRs und der CYP19A1 kann in der vorliegenden Arbeit nicht belegt werden, dass der PPARγ an der Regulierung des PGRs und der CYP19A1 beteiligt ist. 5.3.1.6. Expression des PGR in Kumuluszellen Der relative mRNA-Gehalt des PGR ist in den Kumuluszellen der Gruppe unreif signifikant vermindert gegenüber dem der Kumuluszellen aller anderen Gruppen. Dieses Ergebnis stimmt mit dem Ergebnis der Arbeitsgruppe SALHAB et al. (2011) überein. Dies deutet daraufhin, dass der PGR in die Reifung des bovinen KOK involviert ist. Weder die O2-Konzentration noch die Ölüberschichtung des Reifungsmediums haben Einfluss auf die relative PGR-mRNA-Menge in bovinen Kumuluszellen. Daher ist zu vermuten, dass in bovinen Kumuluszellen die Expression des PGR unabhängig von den Faktoren oxidativer Stress und Veränderungen der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium erfolgt. Um eine eventuelle Interaktion der einzelnen PGR-Isoformen auf mRNA-Ebene zu ermitteln, könnten diese (PGR-Isoformen) in einer weiterführenden Studie analysiert werden. 5.3.2. Genexpression in bovinen Oozyten 5.3.2.1. Expression des BMP15 und GDF9 in Oozyten Die oocyte-secreted factors BMP15 und GDF9 gehören zur TGFβ-Superfamily (JUENGEL et al. 2009) und beeinflussen die Entwicklungskompetenz der Oozyte (GILCHRIST u. THOMPSON 2007, JUENGEL et al. 2009, HOSOE et al. 2011, HUSSEIN et al. 2005, 2006). In der hier vorliegenden Arbeit konnte kein signifikanter Unterschied des relativen BMP15-mRNA-Gehaltes in unreifen und reifen Eizellen ermittelt werden. Diese Ergebnisse stimmen mit denen aus der Arbeitsgruppe LEAL et 127 Diskussion al. (2012) überein. Die relative mRNA-Menge des GDF9 ist in den Oozyten der Gruppe 20% Öl und 20% ölfrei signifikant vermindert im Gegensatz zu der in den Gruppen unreif, 5% Öl und 5% ölfrei. Vorherige Untersuchungen demonstrieren ebenfalls, dass sich die GDF9-mRNA-Menge in reifen bovinen Oozyten (bei einer O2-Konzentration von 20%) im Vergleich zu dem in unreifen Eizellen reduziert (LEAL et al. 2012, SOMFAI et al. 2011). Die relativen mRNA-Mengen des GDF9 und BMP15 in Eizellen werden somit durch eine höhere Progesteronkonzentration im nicht-ölüberschichteten Reifungsmedium im Vergleich zum ölüberschichteten Medium erhöht. Des Weiteren ist in den beiden Versuchsgruppen, die unter einer O2-Konzentration von 20% reiften, der relative GDF9-mRNA-Gehalt in bovinen Oozyten signifikant vermindert im Verlgeich zu dem in der Gruppe „unreif“. In einer Analyse aus dem Jahr 2003 ist eine signifikante Reduzierung des mRNA-Gehalts für den GDF9 in in vivo gereiften Eizellen im Vergleich zu dem in unreifen Oozyten festgestellt worden (LONERGAN et al. 2003a). Die in vivo gereiften Eizellen sind nach Superstimulation und nachfolgender GnRHGabe von 0,25mg je Tier via OPU gewonnen worden (LONERGAN e al. 2003a). Sofern die nachgestellten In-vivo-Verhältnisse als „Goldstandard“ angenommen werden, könnte vermutet werden, dass eine O2-Konzentration von 20% den In-vivoVerhältnissen ähnelt und somit eine positive Auswirkung auf die Eizellreifung hat. Um diese Vermutung abzuklären, sollte in einem weiteren Versuch die IVM unter den gleichen Bedingungen wie in dieser Arbeit erfolgen, aber im nachfolgenden die IVF und IVC durchgeführt und im Anschluss die Blastozystenrate ermittelt werden. 5.3.2.2. Expression des SLC2A1 in Oozyten Der SLC2A1 ist ein Na+-unabhängiger Glukosetransporter (KASAHARA u. HINKLE 1977, CARRUTHERS et al. 2009). Es wird angenommen, dass Glukose eine wichtige Rolle während der Reifungsphase boviner KOK spielt, insbesondere bei der ATPProduktion und der meiotischen Teilung der bovinen Oozyte unter einer geringen O2Konzentration (HASHIMOTO et al. 2000b). In der vorliegenden Studie ist zwischen den Eizellen der Gruppen unreif und 20% Öl kein signifikanter Unterschied ermittelt 128 Diskussion worden. Ergebnisse aus weiteren Studien stimmen mit denen unserer Untersuchung überein (WRENZYCKI et al. 1999, AUGUSTIN et al. 2001, LONERGAN et al. 2003a). Jedoch zeigt sich eine signifikante Reduzierung des mRNA-Gehaltes für den SLC2A1 in den Eizellen der Gruppe 5% Öl und 20% ölfrei im Vergleich zu dem in unreifen Oozyten. Einer Veröffentlichung aus dem Jahr 2010 ist zu entnehmen, dass sich unabhängig von der O2-Konzentration in der Oozyte der mRNA-Gehalt von SLC2A1 zwischen den Stadien unreif und reif nicht signifikant verändert (BERMEO-ÀLVAREZ et al. 2010). Die Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen und denen aus der Arbeitsgruppe von BERMEJO-ALVAREZ et al. (2010) könnte auf Differenzen im IVMProtokoll (50 KOK in 500µl + 10ng/ml EGF in das Reifungsmedium) zurückzuführen sein. Statistisch zeigt sich, dass weder die Ölüberschichtung des IVM-Mediums noch die verschiedenen O2-Konzentrationen einen signifikanten Einfluss auf die relativen mRNA-Gehalte des SLC2A1 in bovinen Eizellen haben. Daraus kann abgeleitet werden, dass die Expression des SLC2A1 in bovinen Oozyten unabhängig von der Progesteronkonzentration im Maturationsmedium und der O2-Konzentration im Inkubator während der Reifung (oxidativer Stress innerhalb der Zelle bei geringer O2Konzentration) erfolgt. 5.3.2.3. Expression des EPAS1 in Oozyten Liegt in der Zelle Hypoxie vor, nimmt der HIF Einfluss auf die Expression bestimmter Gene, die z.B. in den Zellzyklus oder den Glukosemetabolismus involviert sind (SEMENZA 1998, CHILOV et al. 1999, HARRIS 2002, SEMENZA 2003). EPAS1 (=HIF-2α) bildet mit einer weiteren Untereinheit (ARNT=HIF-β) den HIF (WANG et al. 1995, WENGER u. GASSMANN 1997, HUANG u. BUNN 2003). In der vorliegenden Studie zeigt sich keine signifikante Veränderung der mRNA-Menge für EPAS1 in Oozyten aller 5 Versuchsgruppen. Auch haben die beiden Faktoren Ölüberschichtung des Mediums und O2-Konzentration keinen signifikanten Einfluss auf die EPAS1mRNA-Gehalte in bovinen Eizellen. Zum jetzigen Zeitpunkt sind keine Veröffentlichungen mit ähnlichem Versuchsaufbau und Ergebnissen bekannt. Aus diesem Grund können die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht mit denen anderer 129 Diskussion Literatur verglichen werden. Da eine O2-Konzentration von 5% in der IVM keinen Einfluss auf die Expression des EPAS1 hat, scheint eine geringe O2-Konzentration im Inkubator während der IVM keine negativen Auswirkungen auf den Sauerstoffhaushalt in der Eizelle zu haben. Um diese Vermutung zu festigen, ist eine Analyse auf Proteinebene des HIF-2α unerlässlich. 5.3.2.4. Expression der PGRMC1 und 2 in Oozyten Während der Follikelentwicklung wird die Apoptosehemmung in den Granulosazellen u.a. durch den PGRMC1 vermittelt (PELUSO et al. 2005, PELUSO 2006, 2007, KOWALIK u. KOTWICA 2008). In der Lutealphase ist PGRMC1 an der Aufrechterhaltung der Funktion des bovinen Gelbkörpers beteiligt (KOWALIK u. KOTWICA 2008). Die Funktion der PGRMC2 ist noch unklar (ZHANG et al. 2008, INTLEKOFER u. PETERSEN 2011). In der Forschungsarbeit von CLEMENTE et al. (2009) ist PGRMC1- und 2-mRNA in allen Stadien der frühen bovinen Embryonalentwicklung (unreife Oozyte, 2/4-,8-, 16-Zeller, Morula und Blastozyste) detektiert worden. In der vorliegenden Studie sind relative mRNA-Mengen für den PGRMC1 und 2 in Oozyten aller 5 Versuchsgruppen analyisert worden. Publikationen, die die Expression des PGRMC1 und 2 in bovinen Oozyten behandelt sind nicht weiter bekannt. Der PGRMC1 vermittelt die antiapoptotische und antimitotische Wirkung von Progesteron auf die Kumuluszellen (LUCIANO et al. 1994, LUCIANO u. PELUSO 1995, PELUSO et al. 2001, 2002, 2005, CRUDDEN et al. 2006, PELUSO 2006, 2007). Daher liegt die Vermutung nahe, dass sich die PGRMC1-mRNA-Menge in unreifen und reifen Oozyten nicht unterscheiden. Die mRNA-Expression des PGRMC2 verändert sich signifikant innerhalb der „reifen Gruppen“, folglich könnte eine Beteiligung an der Reifung des bovinen KOK vermutet werden. Um eine Involvierung der PGRMC1 und 2 während der Ovulation festzustellen, ist eine Analyse auf Proteinebene dieser beider Progesteronrezeptoren sinnvoll. 130 Diskussion 5.3.2.5. Expression des PGR in Oozyten In der vorliegenden Studie sind in reifen bovinen Oozyten im Vergleich zu unreifen Eizellen signifikant höhere relative PGR mRNA-Gehalte gemessen worden. In einer vorherigen Arbeit sind mRNA-Mengen für den PGR in unreifen Eizellen identifiziert worden (CLEMENTE et al. 2009). Statistisch zeigt sich, dass durch eine O2-Konzentration von 20% die relativen mRNAGehalte des PGR in Oozyten signifikant erhöht werden. Aus diesem Ergebnis kann abgeleitet werden, dass sich die Produktion von Sauerstoffradikalen (bei einer O2Konzentration von 20%) auf die mRNA-Expression des PGR auswirkt. Die Ölüberschichtung des Reifungsmediums hat keinen signifikanten Einfluss auf die relativen mRNA-Gehalte des PGR. Folglich wirken sich unterschiedliche Progesteronkonzentrationen im Medium vermutlich nicht auf die Gesamt-mRNAMenge des PGR aus. In vorherigen Untersuchungen konnte ein Zusammenhang zwischen geringer bzw. hoher Progesteronkonzentration und der Expression der Isoformen A und B (cDNA mit speziellen Primern für Isoform A und Gesamt-PGR, anschliessend Southern Blot und semi-quantitative Analyse der mRNA-Konzentration) analysiert werden. In humanen Lutealzellen löst eine hohe Progesteronkonzentration die Expression von mRNA, welche für die Isoform A kodiert, aus (MISAO et al. 1998, REKAWIECKI et al. 2008). Durch diesen Effekt wird eine Hemmung der Transkription der PGR B-mRNA induziert. Ergebnis dieser Interaktion ist, dass sowohl die PGRFunktion als auch der Progesteroneffekt gedämpft bzw. unterbunden werden. Interessanter Weise kann durch einen niedrigen Progesterongehalt die Ausprägung der PGR A-mRNA gemindert werden, gefolgt von einem Anstieg in der Transkription von mRNA, die für die Isoform B kodiert (MISAO et al. 1998, REKAWIECKI et al. 2008). Ein Vergleich zwischen den mRNA-Mengen in in vitro gereiften und in vivo generierten Oozyten und Kumuluszellen würde zeigen, ob der PGR-mRNA-Gehalt in bovinen KOK bei einer Reifung unter einer O2-Konzentration von 20% den In-vivo-Verhältnissen ähnelt. 131 Diskussion 5.3.2.6. Expression des PAQR5 in Oozyten Bei dem PAQR5 handelt es sich um einen von 3 Membranprogesteronrezeptoren (PAQR7, 8 und 5, PELUSO 2007). Für den PAQR7 konnten im ovinen Corpus luteum mRNA-Mengen analysiert werden (ASHLEY et al. 2006). Weiterhin ist bislang festgestellt worden, dass die Hemmung des PAQR8 in porcinen KOK die Kumuluszellexpansion beeinträchtigt (QIU et al. 2008). In bovinen Eizellen aller 5 Versuchsgruppen sind PAQR5-mRNA-Mengen nachgewiesen worden. Unreife bovine Oozyten weisen in der vorliegenden Untersuchung einen signifikant höheren Gehalt an PAQR5 mRNA auf als reife Oozyten der Gruppen 5% Öl und 20% ölfrei. Ergebnisse anderer Studien, die mit den vorliegenden diskutiert werden könnten, sind nicht vorhanden. Ob der PAQR5 beim Rind an der Kumuluszellexpansion beteiligt ist, könnte durch die Zugabe eines AK gegen den PAQR5 in das IVM-Medium und im Anschluss durch die Beurteilung der Kumuluszellexpansion erfolgen. 5.4. Proteinexpression des nuklearen Progesteronrezeptors Seit Jahren ist die Wirkung von Progesteron, vermittelt durch seine nuklearen und extrazellulären Rezeptoren insbesondere in Verbindung mit der Reproduktion Gegenstand vieler Untersuchungen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 3 Isoformen (A, B und C) des nuklearen Progesteronrezeptors identifiziert worden (SCHAMS et al. 2003, TAYLOR et al. 2009, LUCIANO et al. 2010, APARICIO et al. 2011). In der vorliegenden Studie sind mittels Western Blot die Isoformen A, B und C des nPR in bovinen Kumuluszellen und die Isoform B in bovinen Oozyten nachgewiesen worden. In einer Untersuchung aus dem Jahr 2011 ist der Nachweis der Isoformen A und B in bovinen Kumuluszellen und Oozyten erfolgt (APARICIO et al. 2011). Ein Grund für die Differenz in den Ergebnissen unserer Arbeit und der von APARICIO et al. (2001) könnte der Einsatz verschiedener AK im Western Blot sein. In der Arbeit von APARICIO et al. (2011) wurde ein AK verwendet (MS-298-P1), der am N-Terminus des nPRs bindet. Der Isoform C fehlt jedoch der N-Terminus. Auf Grund dessen kann ihre Identifizierung nur mit einem spezifisch am C-Terminus bindenden AK erfolgen (SCHAMS et al. 2003). Der in dieser vorliegenden Studie verwendete AK (MAB 4298) 132 Diskussion ist immunogen gegenüber den letzten AS des C-Terminus. In der Milchdrüse von nichttragenden Rindern und im bovinen Endometrium konnten mit Hilfe eines AK (IM1408, Klon PR10A9) gegen den C-Terminus bereits alle 3 Isoformen (A, B und C) des nPRs identifiziert werden (SCHAMS et al. 2003). Eine Veröffentlichung aus dem Jahre 2008 demonstriert, dass alle untersuchten AK in dieser Studie (13 AK) keine spezifische nPR-Bindung aufweisen (SAMALECOS u. GELLERSEN 2008). Insbesondere AK, die am C-Terminus des nPRs binden sind laut dieser Studie sehr uneffizient/unspezifisch bzgl der Bindung an die Isoform B und A des nPRs. SAMALECOS u. GELLERSEN (2008) erwähnen einerseits, dass der AK MAB492 die Isoformen A und B in T47D-Zellen nicht bindet. Anderseits sind in derselben Untersuchung in einem weiteren Western Blot die nPR Isoformen A und B in T47D-Zellen mittels des AK MAB492 identifiziert worden. Die Grössen der Isoformen A, B und C sind in dieser Arbeit mit 97 kDa, 82 kDa und 38 kDa angegeben (SAMALECOS u. GELLERSEN 2008). Diese Angaben stehen im Gegensatz zu denen aus anderen Untersuchungen (SCHAMS et al. 2003, PELUSO et al. 2007, TAYLOR et al. 2009, DURLEJ et al. 2010, APARICIO et al. 2011). In den von SAMALECOS u. GELLERSEN (2008) verwendeten Proben (PR-B, PR-A, PR-289, PR-301, pcDNA, T47D, MDA-MB-231) ist jeweils bei 38kDa (Isoform C) eine Bande zu erkennen. Die Autoren gehen davon aus, dass es sich hierbei um unspezifische Banden handelt und nehmen aufgrund ihrer Versuche an, dass die Isoform C des nPRs (mit einer Größe von 38kDa angegeben) nicht in natürlichen Geweben exprimiert wird. Da sich SAMALECOS u. GELLERSEN (2008) in ihrer Studie bzgl. der Bindung der Isoform A und B widersprechen, die Größenangaben der einzelnen Isoformen von anderen Veröffentlichungen abweichen und in der vorliegenden Studie die Isoformen A, B und C in unterschiedlichen Zellen (humane Plazenta, bovine Karunkel/Kotyledone) identifiziert bzw. nicht identifiziert (F3-, BCEC-, Fib-Zellen) wurden, kann davon ausgegangen werden, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete AK MAB4298 spezifisch die Isoformen A, B und C bindet. Diese Aussage wird durch weitere Untersuchung unterstützt (GOLDMAN et al. 2006, HARDUF et al. 2009, TAYLOR et al. 2009). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus der Arbeitsgruppe APARICIO et al. 133 Diskussion (2011) zeigt sich in der vorliegenden Studie eine signifikante Erhöhung in der relativen Proteinmenge der Isoform A in Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl im Vergleich zu denen der Gruppe unreif. Auch konnte in der hier dargestellten Arbeit die Isoform B in unreifen Kumuluszellen nicht detektiert, aber dafür in reifen Kumuluszellen festgestellt werden. Dieses Ergebnis deckt sich mit der Veröffentlichung aus dem Jahr 2011 (APARICIO et al. 2011). In der hier vorliegenden Arbeit ist der Nachweis der Isoform B in unreifen und reifen Oozyten erfolgt. Die nPR Isoformen A und C konnten mittels Western Blot-Analyse in der hier dargestellten Arbeit nicht identifiziert werden. In den Oozyten der Gruppen unreif und 20% Öl ist der relative Proteingehalt für den nPR B im Gegensatz zu dem in den Gruppen 5% Öl, 5% ölfrei und 20% ölfrei signifikant erhöht. In der Studie von APARICIO et al. (2011) ist die Isoform A in unreifen und reifen Oozyten identifiziert worden. Auch zeigt sich eine signifikante Abnahme in der Expression der Isoform A in reifen gegenüber unreifen Oozyten (APARICIO et al. 2011). Im Gengensatz zu den Untersuchungen von APARICIO et al. (2011), die die Isoform A in unreifen und reifen bovinen Eizellen identifziert haben. Grund hierfür könnte evtl. eine zu gering vorhandene Menge an den Isoformen A und C in den bovinen Oozyten sein, die mittels der in dieser vorliegenden Studie eingesetzten Methoden nicht analysiert werden konnten. Die unterschiedlichen Ergebnisse könnten in Zusammenhang mit der Verwendung der verschiedenen AK oder an den Differenzen in der IVM oder der Proteinaufbereitung liegen. APARICIO et al. (2011) supplementierten das Reifungsmedium (TCM199) mit 10ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF). Hierdurch wird die Proteinsynthese beeinflusst (LONERGAN et al. 1996, GOFF et al. 2001), was zu der Hypothese führt, dass ein Switch in den Isoformen des nPR erfolgt sein könnte. Aus der Literatur ist zu entnehmen, dass das Verhältnis zwischen den Isoformen A und B Einfluss auf u.a. die eigene Genexpression nimmt (TAN et al. 2012, MULAC-JERICEVIC und CONNEELY 2004, REKAWIECKI et al. 2011). In der Arbeitsgruppe APARICIO et al. (2011) sind während der 24-stündigen Reifungsphase 50 KOKs in 500µl eingesetzt worden, während in dieser Studie 20 KOKs in 100µl Reifungsmedium waren. Somit ist das Verhältnis KOK zu 134 Diskussion Reifungsmedium unterschiedlich und diese Gegebenheit könnte sich auf die Expression der Isoformen ausgewirkt haben. In der Western Blot-Analyse setzten APARICIO et al. (2011) 100 Oozyten und in der vorliegenden Studie 80 Oozyten je Versuchsgruppe ein. Folglich könnte in dieser Arbeit die relative Proteinmenge für die Isoform A (und C) in Oozyten zu gering gewesen sein, um detektiert zu werden. Letztendlich ist nicht genau zu klären, warum die Ergebnisse in diesen beiden Arbeiten hinsichtlich der analysierten Isoformen in unreifen und reifen Oozyten differieren. Aufgrund der mitgeführten Positivprobe (boviner Uterus) und der entsprechenden kDaGröße der identifizierten Isoformen ist davon auszugehen, dass in dieser Arbeit der Nachweis der Isoform B in Oozyten und der der Isoformen A, B und C in Kumuluszellen erfolgt ist. In Anbetracht der Tatsache, dass die Isoform B die stärkste transkriptionale Aktivität aller 3 Isoformen besitzt (WEI et al. 1996, 1997, GIANGRANDE et al. 1997, TUNG et al. 2001, LEONHARDT et al. 2003, TAYLOR et al. 2009) und sich während der Reifungsphase das Expressionsmuster verschiedenster Transkripte verändert (ASSOU et al. 2006, CUI et al. 2007, FAIR et al. 2007), ist die Expression der Isoform B in unreifen und reifen Oozyten sehr wahrscheinlich. Diese Annahme wird unterstützt durch die Erkenntnis, dass die Isoform B Zellsignalwege aktiviert, wie z. B. den Src/Erk-1 Signalweg (MIGLIACCIO et al. 1998, LEONHARDT et al. 2003, BOONYARATANAKORNKIT u. EDWARDS 2004, LANGE 2004, BOONYARATANAKORNKIT et al. 2007) und dadurch eine nicht-genomische Wirkung des nPRs ausübt. Ein wichtiger Untersuchungsparameter in der vorliegenden Arbeit ist der Einfluss der Ölüberschichtung des Reifungsmediums und einer niedrigen (5%) bzw. hohen (20%) O2-Konzentration auf die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen. In bovinen Kumuluszellen wird die relative Proteinmenge der Isoform B sowohl durch das ölüberschichtete Reifungsmedium als auch durch eine O2-Konzentration von 20% signifikant erhöht. In einer vorherigen Untersuchung zeigt sich, dass durch die Zugabe von Progesteron (500ng/ml) in das mit Öl überschichtete Reifungsmedium die Proteinexpression der Isoform A in bovinen Kumuluszellen nicht verändert wird, jedoch konnte für die Isoform B eine signifikante Erhöhung der Expression im Vergleich zur 135 Diskussion Kontrollgruppe festgestellt werden (APARICIO et al. 2011). In einer weiteren Untersuchung ist Progesteron (80µg/ml) in der Lage, die Proteinmenge der nPR Isoformen B und C (in humanem Uterusgewebe/Dezidua) signifikant zu erhöhen (GOLDMAN et al. 2005). Die Ergebnisse aus den genannten Veröffentlichungen stehen im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen, da in dieser Untersuchung ein nicht ölüberschichtetes Reifungsmedium (und damit eine höhere Progesteronkonzentration im Medium) keinen Einfluss auf die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen hat. Aufgrund der Annahme, dass Progesteron in der Lage ist, die Expression seiner eigenen Rezeptoren zu beeinflussen (GOLDMAN et al. 2005, D´HAESELEER et al. 2007, APARICIO et al. 2011), könnte sich die Zugabe von Progesteron in das Medium auf die relativen Proteinmengen der Isoformen ausgewirkt haben. In der vorliegenden Studie ist nur das durch die Kumuluszellen sezernierte Progesteron im Reifungsmedium vorhanden. Jedoch ist zu bemerken, dass in dem ölüberschichteten Reifungsmedium das lipophile Progesteron in das Silikonöl diffundiert. Weiterhin ist in Betracht zu ziehen, dass in der vorliegenden Studie eine O2Konzentration von 20% die relativen Proteinmengen des nPR B und C in Kumuluszellen signifikant erhöht. Da in der Arbeit von APARICIO et al. (2011) die IVM unter einer O2-Konzentration von 20% durchgeführt wurde, ist zu vermuten, dass sich die O2-Konzentration (und nicht die Zugabe von Progesteron) auf die Expression der Isoform B in Kumuluszellen ausgewirkt hat. Da ebenfalls die relative Proteinmenge der Isoform C durch eine O2-Konzentration von 20% erhöht wird, besteht die Möglichkeit, dass aufgrund der vermehrten Bildung von Sauerstoffradikalen die Isoform C mit der Isoform B als Heterodimer an die DNA bindet und somit Einfluss auf die Expression der verschiedenen Isoformen nimmt, z.B. eine vermehrte Expression der Isoform B ausgelöst wird. Aus den Ergebnissen einer früheren Untersuchung leiten die Autoren ab, das im humanen Myometrium unabhängig von der Plasmaprogesteronkonzentration die Isoform C in der Lage ist, Progesteron „abzufangen“ und/oder die Wirkung der Isoform B „abzuschwächen“ (CONDON et al. 2006). Weitere Studien bezüglich der Isoform C sind zum jetzigen Zeitpunkt nicht bekannt. 136 Diskussion In der vorliegenden Untersuchung wird in bovinen Oozyten die relative Proteinmenge der Isoform B durch eine O2-Konzentration von 20% signifikant erhöht. Aufgrund der Tatsache, dass die Proteinexpression der nPR Isoformen in bovinen Oozyten bis jetzt nur in der Arbeit von APARICIO et al. (2011) behandelt wurden, können die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung mit anderen Arbeiten nicht verglichen werden. Zusammenfassend liegt die Vermutung nahe, dass sich in der IVM boviner KOK die Bildung von Sauerstoffradikalen auf die Expression der Isoform B und C in Kumuluszellen und des nPR B in Oozyten auswirkt. Statistisch ist die Wirkung der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium auf die relative Poteinmenge der Isoform B in Kumuluszellen nachgewiesen worden. Aus der Literatur ist jedoch bekannt, das die nPR-Isoformen aufgrund ihrer Rezepotordimerisierung unterschiedliche Wirkungen in der Zielzelle ausüben können (MULAC-JERICEVIC u. CONNEELY 2004, REKAWIECKI et al. 2011). Daher besteht die Möglichkeit, dass aufgrund veränderter IVM-Bedingungen die einzelnen Isoformen einerseits in variierender Menge exprimiert werden und andererseits in der Zielzelle selbst verschiedene Wirkungen ausüben. Um eine positive oder negative Wirkung dieser Annahme auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle zu belegen, sollten weitere Untersuchungen erfolgen, wie z.B. spezifische AK-Tests, Bewertung der Blastozysten und Ermittlung der Blastozysten-/Entwicklungsraten. 5.5. Schlussfolgerung Weder ein ölüberschichtetes oder nicht-ölüberschichtetes Reifungsmedium noch verschiedene O2-Konzentrationen (5 oder 20%) während der IVM haben einen signifikanten Einfluss auf die Kernreifungsraten boviner Oozyten. Jedoch wirken sich beide Faktoren auf die Progesteronkonzentration im Reifungsmedium aus. In den Gruppen, in denen ein nicht-ölüberschichtetes Medium verwendet wurde, sind signifikant höhere Progesteronwerte im Medium gemessen worden als in den Versuchsgruppen, in denen das Medium mit Silikonöl überschichtet war. Weiterhin ist innerhalb der beiden Gruppen, in denen ein nicht-ölüberschichtetes Medium eingesetzt wurde, die Progesteronmenge bei einer O2-Konzentration von 20% signifikanter höher als bei einer niedrigeren O2-Konzentration (5%). 137 Diskussion In der vorliegenden Studie spiegeln sich die Auswirkungen der Interaktion zwischen den Faktoren O2-Konzentration und ölüberschichtetes Reifungsmedium in der Proteinexpression der nPR-Isoformen und in der mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in in vitro gereiften Kumuluszellen und Oozyten wieder. Einerseits ist Progesteron in der Lage, die Expression seiner eigenen Rezeptoren zu beeinflussen und andererseits haben hohe bzw. niedrige O2-Konzentrationen Auswirkungen auf metabolische Abläufe in der Zelle selbst, wie z.B. Umstellung von aerober auf anaerobe Glykolyse und damit verbunden ein Mangel an ATP oder die vermehrte Bildung von Sauerstoffradikalen, die das Verhältnis zwischen Oxidantien und Antioxidantien verändern. Bezüglich der Kumuluszellen mRNA-Expression zeigt sich, dass entwicklungsrelevanter durch die Gene in bovinen Silikonölüberschichtung des Maturationsmediums die relative mRNA-Menge von STAR, CYP19A1 und PTGFR signifikant und die von HSD3B1 und LHCGR tendenziell erhöht wird. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgern, dass durch einen niedrigen Progesterongehalt im Medium die Enzyme für die Steroidsynthese aktiviert werden. In Kumuluszellen wird der mRNA-Gehalt für STAR, CYP19A1, FSHR, LHCGR und PTGFR signifikant und der für PTGS2 tendenziell durch eine 5%ige O2-Konzentration während der IVM erhöht. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass in Kumuluszellen eine eventuelle Umstellung des Energiemetabolismuses Entwicklungskompetenz des KOK von beeinflusst aerob und auf dass anaerob insbesondere die die zytoplasmatische Reifung betroffen ist (da sich in der vorliegenden Studie die Kernreifungsrate der verschiedenen Gruppen nicht unterscheidet). Das nicht ölüberschichtete Maturationsmedium und dadurch bedingt die höhere Progesteronkonzentration erhöht signifikant den mRNA-Gehalt der oocyte secreted factors (BMP15 und GDF9) in bovinen Oozyten. Mittels des BMP15 und GDF9 ist die Oozyte in der Lage, ihre Umwelt und damit verbunden die sie umgebenen Kumuluszellen und im Weiteren die Entwicklungskompetenz des KOK selbst zu beeinflussen. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, das Progesteron die mRNAExpression der OSFs steigert und dadurch die Oozyte Einfluss auf ihre Entwicklungskompetenz nimmt. Ob dieser Einfluss eine positive oder negative 138 Diskussion Wirkung hat, könnte durch weitere Versuche, in denen in vitro bzw. in vivo gereifte Oozyten verglichen werden, detaillierter erfasst werden. Die mRNA-Menge des GDF9 wird zusätzlich durch eine O2-Konzentration von 5% signifikant erhöht. Da die OSFs insbesondere an der Follikelentwicklung beteiligt sind, wird das vorliegende Ergebnis durch die Annahme, dass während der Follikelentwicklung eine geringe O2Konzentration vorliegt (aufgrund der schlechteren Versorgung mit O2), unterstützt. Der PGR-mRNA-Gehalt in bovinen Oozyten wird durch eine hohe O2-Konzentration (20%) signifikant erhöht. Für den PGR wird eine direkte Beteiligung an der Ovulation vermutet. Folglich ist zu vermuten, dass sich höhere Progesteronkonzentrationen im Reifungsmedium und die Umstellung von aerober auf anaerobe Glykolyse auf die Eizellreifung, insbesondere die zytoplasmatische Reifung, auswirken und dass die Bildung von Sauerstoffradikalen die Expression des PGR erhöht. In dieser Studie sind in bovinen Kumuluszellen die Isoformen A, B und C und in bovinen Oozyten die Isoform B identifiziert worden. Die relative Proteinmenge der Isoformen B und C in Kumuluszellen wird durch eine O2-Konzentration von 20% signifikant erhöht und die der Isoform B noch zusätzlich durch das ölüberschichtete Reifungsmedium. In bovinen Oozyten erhöht eine O2-Konzentration von 20% signifikant den relativen Proteingehalt der Isoform B. Dies führt zu der Annahme, dass die Proteinexpression Progesteronkonzentration der im Isoform B empfindlich Maturationsmedium und gegenüber der Bildung der von Sauerstoffradikalen ist. Aufgrund dieser Ergebnisse kann angenommen werden, dass der nPR in die Reifung boviner KOK involviert ist und das die IVM-Bedingungen Einfluss auf die relative Proteinmenge der einzelnen Isoformen haben. Des Weiteren kann eine Interaktion der einzelnen Isoformen vermutet werden und folglich ist die Wirkung von Progesteron in der Zielzelle variabel. Einerseits ist aus der Literatur bekannt, dass es relativ unsicher ist von der mRNAQuantität auf die produzierte Proteinmenge zu schliessen (LEWIN 1991). Andererseits ist nachgewiesen worden, dass in humanen Lutealzellen der Proteingehalt an PGR parallel zu seiner mRNA-Menge war (MISAO et al. 1998, REKAWIECKI et al. 2011). In der vorliegenden Arbeit weist die PGR-mRNA-Menge in den Kumuluszellen 139 Diskussion innerhalb der „reifen“ Gruppen keinen signifikanten Unterschied auf. Da aber die relative Gesamtproteinmenge des nPRs in den Kumuluszellen der Gruppe 20% Öl signifikant erhöht ist im Vergleich zu der in den Kumuluszellen der Gruppen 5% Öl und 20% ölfrei kann vermutet werden, dass Faktoren wie die O2-Konzentration und die Progesteronkonzentration im Reifungsmedium auf die posttranslationale Modifikation (und somit die Ausprägung der unterschiedlichen Isoformen) des nPRs Einfluss nehmen; wohingegen sich in Oozyten ein anderes Bild darstellt, denn eine O2Konzentration von 20% erhöht signifikant den PGR-mRNA-Gehalt und die relative Proteinmenge der Isoform B des nPRs. Da sich in dieser Arbeit die verschiedenen IVM-Bedingungen nicht auf die Kernreifung auswirken, liegt die Vermutung nahe, dass sie die zytoplasmatische Reifung beeinflussen. Daher sollten weitere Untersuchung erfolgen, in denen die KOK unterschiedlichen IVM-Bedingungen ausgesetzt sind, aber im Weiteren die Entwicklung zur Blastozyste bzw. deren Qualität an Hand morphologischer und genetischer Kriterien beurteilt wird. Um festzustellen ob unter einer geringen O2Konzentration während der IVM in der Oozyte selbst oxidativer Stress vorliegt, wäre die Analyse von speziellen Transkripten (z.B. Thioredoxin interacting protein), die an diesem Prozess beteiligt sind, von Bedeutung. 140 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Nina Burmester-Kintrup Einfluss der In-vitro-Maturationsbedingungen boviner Oozyten auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher In-vitroReifungsbedingungen auf die molekulare Qualität boviner Kumuluszellen und Oozyten zu untersuchen. Von November 2010 bis Februar 2011 wurden insgesamt (n=962) Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Schlachthofovarien gewonnen und entweder bei 5% O2 oder bei 20% O2 gereift. Das Steroidhormon Progesteron ist lipophil und aufgrund dieser Eigenschaft wurde zusätzlich der Einfluss einer Ölüberschichtung des Mediums (TCM 199) bei den respektiven Sauerstoffkonzentrationen untersucht. Insgesamt gab es fünf Versuchsgruppen: unreif, 5% Öl; 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei. Im Anschluss an die Maturationsphase wurden die Kumuluszellen manuell entfernt. Um die Kernreifungsrate zu ermitteln, erfolgte die Fixierung und anschließende Färbung von 279 Oozyten aus allen Gruppen. Im Weiteren wurde die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene sowohl in Oozyten (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) als auch in Kumuluszellen (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR, FSHR) mittels RT-qPCR untersucht. Die Ermittlung der relativen Proteinmenge des nuklearen Progesteronrezeptors (nPR) erfolgte mit der Western Blot-Analyse und einem nachfolgenden Chemilumineszenzverfahren. Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: 1. Die durchschnittliche Kernreifungsrate wies keinen signifikanten Unterschied innerhalb der verschiedenen Gruppen auf und lag zwischen 83 und 88 %. 2. Der relative mRNA-Gehalt des PGR war in Oozyten, die bei einer O2-Konzentration 141 Zusammenfassung von 20% reiften, signifikant höher als in Eizellen, die unter einer geringeren O2Konzentration (5%) reiften. 3. Wenn die IVM unter einer O2-Konzentration von 5% durchgeführt wurde, war in Kumuluszellen der relative Gehalt von STAR-, CYP19A1-, PTGFR-, LHCGR-, FSHRmRNA und in Oozyten die relative Menge von GDF9-mRNA signifikant höher als bei einer IVM unter einer hohen (20%) O2-Konzentration. 4. In den Gruppen mit einer Silikonölüberschichtung des Reifungsmediums waren die relativen Transkriptmengen von STAR, CYP19A1 und PTGFR in reifen Kumuluszellen im Gegensatz zu den Gruppen ohne Ölüberschichtung des Maturationsmediums signifikant erhöht. In Oozyten, die in Medium gereift wurden, welches nicht mit Öl überschichtet wurde, war die relative Transkriptmenge von GDF9 und BMP15 signifikant höher als in solchen, bei denen das Maturationsmedium mit Öl überschichtet war. 5. Auf Proteinebene konnte in unreifen und reifen Oozyten sowie in reifen Kumuluszellen die Isoform B des nPRs und in unreifen und reifen Kumuluszellen die Isoformen A und C des nPRs identifiziert werden. 6. In reifen Kumuluszellen war die relative Proteinmenge der Isoformen B und C des nPRs sowie in reifen Oozyten die der Isoform B signifikant erhöht, wenn die IVM unabhängig von der Ölüberschichtung bei einer O2-Konzentration von 20% erfolgte. 7. In reifen Kumuluszellen war beim Einsatz eines ölüberschichteten Reifungsmediums die Proteinexpression der Isoform B des nPRs im Gegensatz zu der Reifung in Maturationsmediums ohne Silikonölüberschichtung signifikant erhöht. 8. Bei der Analyse des Progesterongehaltes im Reifungsmedium zeigte sich eine Interaktion zwischen der Ölüberschichtung und der O2-Konzentration. Je höher die O2Konzentration während der IVM, desto 142 höher die Progesteronmenge im Zusammenfassung Reifungsmedium. Die höchste Progesteronmenge je KOK konnte in der Gruppe 20% ölfrei (303,5 ±18,5 ng/KOK) gemessen werden. In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss der Sauerstoff- und der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium auf die Ausbildung der nPR-Isoformen A, B und C in reifen bovinen Kumuluszellen und Oozyten dargestellt. Der relative mRNA-Gehalt des PGR und die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen B und C war abhängig von der O2-Konzentration während der IVM. Wurde die Reifung der KOK unter einer atmosphärischen O2-Konzentration (20%) durchgeführt, war der relative mRNA-Gehalt des PGR in reifen Oozyten und die relative Proteinmenge der nPRIsoformen B und C in reifen Kumuluszellen signifikant höher als in den Vergleichsgruppen. Die Proteinexpression der Isoform B wurde ebenfalls durch die Progesteronkonzentration im Medium beeinflusst. In Kumuluszellen, die im ölüberschichteten Maturationsmedium reiften, war die relative Proteinmenge der Isoform B signifikant höher als in denen aller anderen Versuchsgruppen. Auch die relativen mRNA-Gehalte für Gene, die an der Steroidsynthese beteiligt (STAR, HSD3B1, CYP19A1 und LHCGR) sind, wiesen eine Abhängigkeit von der Ölüberschichtung des Reifungsmediums auf. So waren diese bei einer niedrigeren Progesteronkonzentration im Medium erhöht. Ob sich die Auswirkungen der verschiedenen IVM-Bedingungen (O2- und Progesteronkonzentration) auf die Proteinexpression des nPR auch im Weiteren die Entwicklungskompetenz der Oozyte beeinflusst, könnte durch weitere Untersuchungen, in denen morphologische Kriterien, wie z.B. die Blastozystenrate, und/oder in denen entwicklungsrelevante Gene auf mRNA- und Proteinebene analysiert werden, erfolgen. Die Analyse von speziellen Transkripten (z.B. Thioredoxin interacting protein) stellt eine Möglichkeit dar, festzustellen, ob unter einer geringen O2-Konzentration während der IVM oxidativer Stress in der Oozyte überhaupt vorliegt. 143 Summary 7. Summary Nina Burmester-Kintrup Influence of in vitro maturation conditions bovine oocytes on protein expression of the progesterone receptor The aim of the present study was to investigate the influence of different in vitro maturation conditions on the molecular quality of bovine oocytes and cumulus cells . From November 2010 to February 2011, in total (n = 962) cumulus-oocyte complexes were obtained from ovaries of cattle slaughtered at a local abattoir and matured either at 5% O2 or 20% O2. The steroid hormone progesterone is lipophilic and due to this property it will diffuse into the oil with which IVM media are traditionally overlaid. The influence of an oil overlay of the medium (TCM 199) with the respective oxygen concentrations was also investigated. Overall, there were five experimental groups: immature, 5% oil, 5% oil-free, 20% oil and 20% oil-free. After IVM the cumulus cells were mechanically removed. To determine the nuclear maturation rate 279 oocysts from all groups were fixed and subsequently stained. Furthermore, the mRNA expression of development-related genes in both oocytes (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) and cumulus cells (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR, FSHR) were examined by RT-qPCR. The relative amount of protein of the nuclear progesterone receptor (nPR) was determined using the western blot analysis with subsequent chemiluminescence. The following results were obtained: 1. The average nuclear maturation rates (83-88%) did not differ among groups. 2. The relative mRNA content of PGR in oocytes matured under an O2-concentration of 20%, was significantly higher than in oocytes that were matured under a lower O2concentration (5%). 144 Summary 3. When IVM was performed under an O2-concentration of 5% the relative amount of STAR, CYP19A1, PTGFR, LHCGR, FSHR-mRNA in cumulus cells and the relative amount of GDF9-mRNA in oocytes was significantly higher than in those after IVM under a high (20%) O2-concentration. 4. In the groups with an oil overlay of the maturation medium the relative transcript levels of STAR, CYP19A1 and PTGFR were significantly increased in matured cumulus cells in contrast to the groups without an oil overlay. In oocytes matured in medium that was not coated with oil, the relative amount of GDF9 and BMP15 transcripts was significantly higher than in those matured in maturation medium which was overlayed with oil. 5. At the protein level, the isoform B of the nPR was identified in immature and matured oocytes as well as in matured cumulus cells and the isoforms A and C in immature and matured cumulus cells. 6. The relative amount of nPR isoforms B and C in matured cumulus cells as well as the isoform B in matured oocytes were significantly increased independent of the oil overlay when IVM was carried out at an O2-concentration of 20%. 7. In matured cumulus cells the protein expression of the nPR isoform B was significantly increased if the an oil overlay of the medium was employed 8. The analysis of the progesterone concentration in the maturation medium showed an interaction between the oil overlay and the O2-concentration. The higher the O2concentration was during IVM, the higher was the amount of progesterone in the maturation medium. The highest amount of progesterone per COC was measured in the 20% oil-free group (303.5 ± 18.5 ng/COCs). In this study for the first time, the influence of oxygen and progesterone on the 145 Summary formation of nPR isoforms A, B and C in mature bovine cumulus cells and oocytes was shown. The relative mRNA content of the PGR and the relative amount of protein of nPR isoforms B and C is dependant on the O2-concentration during IVM. When maturation is performed under an atmospheric O2-concentration (20%), the relative mRNA content of the PGR in mature oocytes and the relative amount of protein of the nPR isoform B and C in mature cumulus cells was significantly higher than in those of all other groups. The protein expression of the B isoform was also influenced by the progesterone concentration in the medium. In cumulus cells, matured with a siliconoil overlay, the relative amount of protein isoform B was significantly higher than those of all other experimental groups. Inaddition, the relative mRNA levels for genes involved in steroid synthesis (STAR, HSD3B1, CYP19A1 and LHCGR) were dependant on the oil overlay of the maturation medium. Whether the differential expression of the nPR influences the developmental competence of the oocyte has to be assessed in further studies. Here morphological criteria such as blastocyst rates, mRNA and/or protein expression of developmental-related genes should be analysed. The analysis of specific transcripts (eg. thioredoxin interacting protein) may clarify whether oxidative stress is present in the oocyte under a low O2-concentration during IVM. 146 Verzeichnisse 8. Verzeichnisse 8.1. Abkürzungsverzeichnis AK Antikörper AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BMP15 Bone Morphogenetic Protein 15 BSA Bovine Serum Albumin BUS B-upstream-segment bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. Zirca cAMP cylcic Adenosine Monophosphat cDNA complemantary Desoxyribonucleic Acid CO2 Kohlenstoffdioxid cPLA2 Zytosolische Phospholipase A2 Ct Cycle Threshold CYP11A1 Zytochrome P450, Familie 11, Subfamilie A, Polypetid 1 CYP19A1 Zytochrome P450, Familie 19, Subfamilie A, Polypetid 1 CYP17A1 Zytochrome P450, Familie 17, Subfamilie A, Polypetid 1 DBD DNA-Bindungsdomäne DNA Desoxyribonucleic Acid EA Eizellenäquivalent EGF Epidermal Growth Factor EPAS1 Endothelial PAS Domain Protein 1 Fa. Firma FCS Fetal Calf Serum fg Femtogramm FSH Follikelstimulierendes Hormon FSHR Follikelstimulierender Hormonrezeptor 147 Verzeichnisse g Gramm g Erdbeschleunigung GDF9 Growth and Differentiation Factor 9 GnRH Gonadotrophin Releasing Hormon GOI Gene of Interest GV Germinal Vesicle GVBD Germinal Vesicle Breakdown hCG Humanes Choriongonadotropin HIF Hypoxia-inducible Factor HRE Hormone-Responsive Element HSD3B1 Hydroxy-Delta-5-Steroiddehydrogenase HSP 90 Hitzeschockprotein 90 IVC In-vitro-Kultur I.E. Internationale Einheiten IF Autoinhibitorische Domäne I.U. International Unit IVF In-vitro-Fertilisation IVM In-vitro-Maturation IVP In-vitro-Produktion kDa Kilodalton KO Knock Out KOK Kumulus-Oozyten-Komplex L Liter LBD Liganden-Bindungsdomän LH Luteinisierendes Hormon LHCGR Luteinisierender Hormon/Choriongonadotropin Rezeptor mM Millimol MM Master-Mix MEM Minimum Essential Medium mg Milligramm min Minute 148 Verzeichnisse ml Milliliter mm Millimeter MPC Magnetic Particle Concentrator mPR Membran-Progesteronrezeptor mRNA Messenger Ribonucleic Acid MS Massenspektrometrie MI Meiose 1 MII Meiose 2 ng Nanogramm nmol Nanomol nPR Nuklear-Progesteronrezeptor O2 Sauerstoff OPU Ovum Pick Up Ox Oxytocin p Propabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit PAQR Progestin und AdipoQ-Rezeptoren PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGF2α Prostagland F2α PGH2 Prostaglandin H2 PGRMC1 Progesteronrezeptor-Membran-Komponente 1 PGRMC2 Progesteronrezeptor-Membran-Komponente 2 PMSG Pregnant Mare Serum Gondaotropin PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Prog Progesteron PTGS2 Prostaglandin-Endoperoxidase Synthase 2 PTGFR Prostagland F2α-Rezeptor PVA Polyvinyl Alkohol PVP Polyvinyl Pyrolidone 149 Verzeichnisse RNA Ribonucleic Acid RI RNase Inhibitor RIA Radioimmunoassay RT Reverse Transkriptase RT-qPCR Reverse Transkriptase quantitative polymerase chain reaction S Sekunden SDS Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gelelektrophorese SLC Solute Carrier SLC2A1 Solute Carrier Family 2A Isoform 1 STAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein TCM Tissue Culture Medium TGFβ Tumor growth factor β u. und u.a. unter anderem UV Ultraviolett V Volt z.B. z.B. O2 Sauerstoff O2-Konzentration Sauerstoffkonzentration μl Mikroliter μm Mikrometer % Prozent 150 Verzeichnisse 8.2. Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Isoformen des nuklearen Progesteronrezeptors ...................................... 15 Tabelle 2: Die unterschiedliche Ausprägung der strukturellen Domänen der --------------------------jeweiligen nPR-Isoformen ........................................................................ 17 Tabelle 3: Untersuchungen zur O2-Konzentration .................................................... 27 Tabelle 4: Glukosekonzentration im Reifungsmedium.............................................. 29 Tabelle 5: Untersuchungen zur Progesteronzugabe in das Reifungsmedium .......... 30 Tabelle 6: Merkmale in vitro produzierter Embryonen im Vergleich zu in vivo -------------------------Embryonen .............................................................................................. 32 Tabelle 7: MessengerRNA-Expression des PGR in unterschiedlichen ----------------------------------Geweben/Zellen ....................................................................................... 36 Tabelle 8: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von cPLA2 ........................................................................ 39 Tabelle 9: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von PTGS2 ....................................................................... 41 Tabelle 10: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von STAR ....................................................................... 43 Tabelle 11: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von HSD3B1................................................................... 44 Tabelle 12: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von CYP19A1 ................................................................. 45 Tabelle 13: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von FSHR ....................................................................... 47 Tabelle 14: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von GDF9 ....................................................................... 49 Tabelle 15: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von BMP15 ..................................................................... 50 Tabelle 16: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von SLC2A1 ................................................................... 52 Tabelle 17: Identifizierung des PPARγ im Ovar verschiedener Spezies ................... 53 Tabelle 18: Ergebnisse von Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den -------------------------------mRNA-Gehalt von HIF........................................................................... 55 Tabelle 19: Proteingehalt der Eizelle ........................................................................ 59 Tabelle 20: Proteinexpression der Progesteronrezeptoren ...................................... 63 Tabelle 21: Einflussfaktoren auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors .. 65 151 Verzeichnisse Tabelle 22: Klassifizierung der KOK (modifiziert nach PAVLOK et al. [1992]) .......... 70 Tabelle 23: Kriterien der Eizellkernreifung nach TSAFRIRI (1978)........................... 74 Tabelle 24: RT-Ansatz für Eizellen ........................................................................... 78 Tabelle 25: RT-Ansatz für Kumuluszellen ................................................................ 79 Tabelle 26: Eizellen - Übersicht über die verwendeten Primer ................................. 82 Tabelle 27: Kumuluszellen – Übersicht über die verwendeten Primer...................... 83 Tabelle 28: Eingesetzte EA in Bezug auf das entsprechende Gen .......................... 85 Tabelle 29: PCR-Ansatz für Eizellen (einfacher Ansatz) .......................................... 86 Tabelle 30: PCR-Ansatz für Kumuluszellen (einfacher Ansatz) ................................ 86 Tabelle 31: Verwendete Antikörper .......................................................................... 96 Tabelle 32: Kreuzreaktivität des im RIA verwendeten Antikörpers ........................... 99 Tabelle 33: Versuchsgruppen ................................................................................. 100 Tabelle 34: Reifungsrate der Oozyten der einzelnen Versuchsgruppen................. 102 Tabelle 35: Einfluss der Ölüberschichtung bzw. Nicht-Ölüberschichtung des ---------------------------Reifungs-mediums und der verschiedenen O2-Konzentrationen auf -----------------------die relative Transkriptmenge in Kumuluszellen ................................... 105 Tabelle 36: Einfluss der Ölüberschichtung bzw. Nicht-Ölüberschichtung des ---------------------------Reifungs-mediums und der verschiedenen O2-Konzentrationen auf -----------------------die relative Transkriptmenge in Oozyten ............................................. 108 Tabelle 37: Gruppeneinteilung und Probenanzahl je Blot Durchgang .................... 109 Tabelle 38: Einfluss der Ölüberschichtung des Reifungsmediums und der ------------------------------verschiedenen O2-Konzentrationen auf die relative Proteinmenge -------------------------der nPR-Isoformen in Kumuluszellen .................................................. 112 Tabelle 39: Progesterongehalt in pg/KOK der verschiedenen Gruppen ................. 115 Tabelle 40: NaCl Complete..................................................................................... 156 Tabelle 41: PBS-Gebrauchslösung ........................................................................ 156 Tabelle 42: PBS-Stocklösung ................................................................................. 156 Tabelle 43: PBS Complete ..................................................................................... 157 Tabelle 44: TCMair ................................................................................................. 157 Tabelle 45: TCM199-Reifungsmedium ................................................................... 157 Tabelle 46: PVA 0,1%-Lösung................................................................................ 158 Tabelle 47: Fixierlösung ......................................................................................... 158 Tabelle 48: Lacmoid-Stocklösung........................................................................... 158 Tabelle 49: Lacmoid -Arbeitslösung ....................................................................... 158 Tabelle 50: Lysis/Binding Buffer ............................................................................ 159 Tabelle 51: Washing Buffer A ................................................................................. 159 152 Verzeichnisse Tabelle 52: Washing Buffer B ................................................................................. 159 Tabelle 53: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM) für Reverse Transkription-------------------- ............................................................................................................ 160 Tabelle 54: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM) für die Polymerase chain-------------------- reaction ................................................................................................ 160 Tabelle 55: Polyacrylamid-Gel ................................................................................ 161 Tabelle 56: Boehringer Lysepuffer.......................................................................... 161 Tabelle 57: SDS-Probenpuffer (4x) ........................................................................ 162 Tabelle 58: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) .................................................................. 162 Tabelle 59: 10x-TBS ............................................................................................... 162 Tabelle 60: TBS-T .................................................................................................. 163 Tabelle 61: SDS-Laufpuffer .................................................................................... 163 Tabelle 62: Blottingpuffer ........................................................................................ 163 Tabelle 63: Blockierungslösung .............................................................................. 164 Tabelle 64: Stripping-Puffer .................................................................................... 164 Tabelle 65: Verbrauchsmaterialen .......................................................................... 164 Tabelle 66: Geräte .................................................................................................. 165 153 Verzeichnisse 8.3. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Neuro-endokriner Steuerregelkreis der Sexualfunktion beim ---------------------------------weiblichen Rind nach Erreichen der Geschlechtsreife --------------------------(GRUNERT u. DE KRUIF 1999) ........................................................... 4 Abbildung 2: Schematische Darstellung der Hormonkonzentrationen und des--------------------------- Wachstums von Follikeln (FORDE et al. 2011) ..................................... 5 Abbildung 3: Schematische Darstellung der Funktionsgebilde im Ovar des Rindes im Stadium des Diöstrus (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) ................................................. 7 Abbildung 4: Oozyten-Kumuluszell-Kommunikation (bi-direktional; ------------------------------------------SUTTON et al. 2003) ............................................................................ 9 Abbildung 5: Strukturformel Progesteron (HORN et al. 2003) .................................. 10 Abbildung 6: Schematische Darstellung der extrazellulären Rezeptorfunktion ----------------------------(SQUIRES 2010)................................................................................. 13 Abbildung 7: Hormonwirkung via nuklearen Rezeptor (SQUIRES 2010) ................. 14 Abbildung 8: Schematische Darstellung der Rezeptordomänen (modifiziert nach----------------------- SQUIRES 2010) .................................................................................. 16 Abbildung 9: Darstellung der „Zinkfinger“ (SQUIRES 2010) ..................................... 16 Abbildung 10: Schematische Darstellung des PAQR7 (PELUSO 2007) .................. 19 Abbildung 11: Schematische Darstellung des PGRMC1 (PELUSO 2007) ............... 20 Abbildung 12: Progesteronrezeptorgen (REKAWIECKI et al. 2011)......................... 34 Abbildung 13: Schematische Darstellung des Proteinsyntheseweges (HORN et al. ----------------------2003) ................................................................................................ 56 Abbildung 14: Slicing-Methode ................................................................................. 69 Abbildung 15: 100 μl Tropfen Reifungsmediums mit Silikonölüberschichtung ------------------------------in einer Petrischale .......................................................................... 71 Abbildung 16: 200 μl Tropfen Reifungsmedium im Töpfchen (ohne Ölüber-------------------------------- schichtung) ........................................................................................ 71 Abbildung 17: Oozyte im Stadium der Meiose II ....................................................... 74 Abbildung 18: IQ5 Multicolor real Time PCR Detection System (HANSTEDT 2009)---------------------- ........................................................................................................... 80 Abbildung 19: Trennprinzip der Gelelektrophorese (LOTTSPEICH et al. 2006) ....... 89 Abbildung 20: Verwendetes Gelelektrophorese-System .......................................... 89 Abbildung 21: Anwendung DC Protein Assay und BSA Standardreihe .................... 90 Abbildung 22: Schematische Darstellung des „Tankblot-Systems“ (modifiziert -----------------------------nach GALLAGHER et al. 2008) ........................................................ 92 154 Verzeichnisse Abbildung 23: Verwendetes Tank-Blot-System ........................................................ 93 Abbildung 24: Western Blot mit den verwendeten Positivproben ............................. 95 Abbildung 25: Western Blot zur Überprüfung der Spezifität des AK MAB4298 --------------------------(1:500) ............................................................................................... 95 Abbildung 26: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus ............................ 101 Abbildung 27: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in ----------------------------------Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen .................................... 104 Abbildung 28: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in Oozyten ---------------------der verschiedenen Gruppen............................................................. 107 Abbildung 29: Relative Transkriptmenge ausgewählter Gentranskripte in Oozyten ---------------------der verschiedenen Gruppen............................................................. 107 Abbildung 30: Repräsentativer Western Blot der nPR-Isoformen A, B und C in--------------------------- Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen..................................... 110 Abbildung 31: Repräsentativer Western Blot zur Bestimmung des β-Aktin-Gehalts -------------------in Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen................................. 110 Abbildung 32: Relative Proteinmenge der Isoformen A, B und C des nPR in ------------------------------Kumuluszellen der verschiedenen Gruppen .................................... 111 Abbildung 33: Repräsentativer Western Blot der nPR-Isoform B in Oozyten der --------------------------verschiedenen Gruppen ................................................................... 113 Abbildung 34: Repräsentativer Western Blot zur Bestimmung des β-Aktin-Gehalts --------------------in Oozyten der verschiedenen Gruppen ......................................... 113 Abbildung 35: Relative Proteinmenge der Isoform B des nPR in Oozyten der -----------------------------verschiedenen Gruppen ................................................................... 114 155 Anhang 9. Anhang 9.1. Medien 9.1.1. Medien für KOK Gewinnung und IVM Tabelle 40: NaCl Complete Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Aqua bidest L 1,0 NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886 Penicillin g 0,06 Sigma-Aldrich P 3414 Tabelle 41: PBS-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Dulbecco’s phosphate buffered saline g/L 9,65 Sigma-Aldrich D 5773 PBS-Stocklösung ml/L 10,0 Ad X L Aqua bidest L 1,0 Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Penicillin IE/ml 50,0 Sigma-Aldrich PENK Streptomycinsulfat μg/ml 50,0 Sigma-Aldrich S 6501 Na-Pyruvat μg/ml 36,0 Sigma-Aldrich P 3662 D-Glucose mg/ml 1,0 Riedel-de-haen 16301 CaCl2 x H2O μg/ml 133,0 Riedel-de-haen C 4901 Tabelle 42: PBS-Stocklösung 156 Anhang Tabelle 43: PBS Complete Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. PBS-Gebrauchslösung ml 1000 Heparin (2,2 IE/ml) mg 11,2 Serva 24900 BSA (Fraktion V) g 1,0 Sigma-Aldrich A 9647 Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Na-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 35,0 Riedel-de-haen 31437 ad X ml H2O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (FAF)* mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 Tabelle 44: TCMair pH durch Zugabe von 1M NaOH auf 7,2 eingestellt * nach Einstellung des pH dazugegeben Tabelle 45: TCM199-Reifungsmedium Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Na-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 35,0 Riedel-de-haen 31437 ad X ml H2O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (FAF)* mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 PMSG* IE/ml 10,0 Intervet Suigonan hCG* IE/ml 5,0 Intervet Suigonan pH durch Rühren auf 7,4 eingestellt * nach Einstellung des pH dazugegeben 157 Anhang Tabelle 46: PVA 0,1%-Lösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Poly-Vinyl-Alkohol mg 10,0 Sigma-Aldrich P8136250G ad PBS-Gebrauchslösung ml 100,0 9.1.2. Medien für Reifungskontrolle Tabelle 47: Fixierlösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. 100% Essigsäure ml 20,0 Roth 3738.1 Absoluter Alkohol ml 60,0 Roth K928.1 Tabelle 48: Lacmoid-Stocklösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Lacmoid g 1,0 Sigma-Aldrich 274720-10G 100% Essigsäure* ml 45,0 Roth 3738.1 Hersteller Produktnr. * heiß (nicht kochend) Nach dem Abkühlen filtrieren Tabelle 49: Lacmoid -Arbeitslösung Substrat Einheit Menge Lacmoid Stocklösung ml 5,0 H2O ml 5,5 Im Anschluss filtrieren 158 Anhang 9.1.3. Medien für MessengerRNA-Analyse Tabelle 50: Lysis/Binding Buffer Substrat Konzentration (mM) pH Hersteller Tris-HCl 100 7,5 Invitrogen LiCl 500 EDTA 10 LiDS 1% Invitrogen DTT (Dithiothreitol) 5 Invitrogen Produktnr. Invitrogen 8,0 Invitrogen Tabelle 51: Washing Buffer A Substrat Konzentration (mM) pH Hersteller Tris-HCo 10 7,5 Invitrogen LiCl 0,15 Invitrogen EDTA 1 Invitrogen LiDS 0,1% Invitrogen Produktnr. Tabelle 52: Washing Buffer B Substrat Konzentration (mM) pH Hersteller Tris-HCl 10 7,5 Invitrogen LiCl 0,15 Invitrogen EDTA 1 Invitrogen 159 Produktnr. Anhang Tabelle 53: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM) für Reverse Transkription Substrat Konzentration (mM) Einheit Menge Hersteller Produktnr. PCR Puffer 1 µl 2,0 Invitrogen 18067-017 MgCl2 5 µl 2,0 Invitrogen 18067-017 dNTPs 1 µl 2,0 Eurogentec NU-0010-50 Hexamer Primer 0,0025 µl 1,0 Applied Biosystems N8080127 RNase Inhibitor 20 U µl 1,0 Applied Biosystems N8080119 MuLV Reverse Transkriptase 50 U µl 1,0 Applied Biosystems N8080018 µl 20,0 Ampuwa ad H2O Tabelle 54: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM) für die Polymerase chain reaction Substrat Konzent ration (mM) Einheit Menge Hersteller Produktnr. Master-Mix 1-facher Ansatz µl 10,0 Eurogentec RT-SY2X06+WOUFL Primer forward 0,2 μM µl 0,4 Eurofins Primer reward 0,2 μM µl 0,4 Eurofins µl 20,0 Ampuwa ad H2O 160 Anhang 9.1.4. Medien für Western Blot Tabelle 55: Polyacrylamid-Gel Substrat Hersteller Produktnr. Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) Applichem A 0843 Tris Sigma-Aldrich 93362 SDS Applichem A 3950 APS Merck 101200 TEMED Serva 35930.02 Bromphenolblau Serva 15375.02 BSA (Fraktion V) Sigma-Aldrich A 9647 Sigma-Aldrich SDS7B2 Thermo Scientific 37071 Prestained Weight Marker Molecular Detektionssubstrat SuperSignal West Dura Tabelle 56: Boehringer Lysepuffer Substrat Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris* 50 Sigma-Aldrich 93362 NaCl 150 Sigma-Aldrich S 3014 NaF 40 Sigma-Aldrich S 7920 EDTA 3 Merck 324506 EGTA 2 Sigma-Aldrich E 3889 Nonidet P40 1% Sigma-Aldrich 21-3277 Na-desoxycholat 0,1% Applichem A 1531 SDS 0,1% Sigma-Aldrich A 3950 Sigma-Aldirch P 8340 Protease Inhibitoren * pH mit HCl auf 7,4 eingestellt 161 Anhang Tabelle 57: SDS-Probenpuffer (4x) Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris* ml 3,6 1000 SigmaAldrich 93362 Bromphenolblau mg 6,0 0,04% Applichem A 2331 Glycerol ml 6,0 40% Merck 356352 SDS G 1,2 8% Applichem A 3950 β-Mercaptoethanol** ml 0,75 5% Applichem A 4338 ad H2O ml 15 * pH mit HCl auf 6,8 eingestellt ** erst vor Benutzung hinzugefügt Tabelle 58: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris* g 30,03 25 SigmaAldrich 93362 Glycin g 144 192 Roth HN07.3 ad. H2O ml 1000 * pH mit HCl auf 7,4 eingestellt Tabelle 59: 10x-TBS Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris* G 60,55 25 SigmaAldrich 93362 NaCl G 90 150 SigmaAldrich S 3014 ad. H2O ml 1000 * pH mit HCl auf 7,4 eingestellt 162 Anhang Tabelle 60: TBS-T Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris* g 60,55 25 SigmaAldrich 93362 NaCl g 90 150 SigmaAldrich S 3014 Tween 20 ml 1 0,1% Merck 655205 ad. H2O ml 1000 Hersteller Produktnr. * pH mit HCl auf 7,4 eingestellt Tabelle 61: SDS-Laufpuffer Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) 10x TG-Puffer ml 100 1x SDS ml 10 0,1% Applichem A 3950 ad. H2O ml 1000 Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. 10x TG-Puffer ml 100 1x Methanol ml 200 20% Roth CP43.4 ad. H2O ml 1000 Tabelle 62: Blottingpuffer 163 Anhang Tabelle 63: Blockierungslösung Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. 10 5% Roth T 145.2 Substrat Einheit Menge TBS-T ml 40 Magermilchpulver ml Tabelle 64: Stripping-Puffer Substrat Einheit Menge Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Glycin g 15 200 Roth HN07.3 SDS ml 10 1% Applichem A 3950 Tween20 μl 100 0,05% Merck 655205 ad. H2O* ml 100 * pH mit HCl auf 2,2 eingestellt 9.1.5. Verbrauchsmaterialen Tabelle 65: Verbrauchsmaterialen Materialr Hersteller Thermobehälter Plastikwaren Sarstedt, Eppendorf, Greiner Pasteurpipette Greiner Glaspipette Hirschmann Silikonöl Serva Stripper® Mikropettor Mid-Atlantic Nitrocellulosemembran Roth Filterpapiere Whatman Schleicher & Schuell Mikrotiterplatten Sarstedt 164 Anhang 9.1.6. Geräte Tabelle 66: Geräte Geräte Hersteller Stereomikroskop mit Wärmeplatte Olympus Pipettierhelfer Brand, BIOHIT Brutschränke (HeraCell) Heraeus, Thermo Scientific Zentrifugen Eppendorf, Heraeus Mini Trans-Blot Cell Apparatur BioRad Netzteil BioRad Thermomixer Biozym Scientific ELISA-Reader Thermo Scientific Chemilumineszenz-Imagingsystem Vilber Lourmat Vortex Mischer IDL Schüttler Heidolph Magnetrührer Heidolph 165 Literaturverzeichnis 10. Literaturverzeichnis ABELE, E., H. STINSHOFF, A. HANSTEDT, S. 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Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 148(4): 381-389. 211 Literaturverzeichnis Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt: Reproduction in Domestic Animals, 47(s2): Proceedings of the 45th Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, Berlin, 29 February – 2 March 2012 Burmester, N.; Hambruch, N.; Stinshoff, H.; Hanstedt, A.; Wilkening, S.; Wrenzycki, C. „Influence of the in vitro maturation conditions on the protein expression of the progesterone receptor isoforms in bovine oocytes“ Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder (Hrsg.): 39. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder (AET-d), Schwäbisch Hall, 14.-15.06.2012, 23 Poppicht, F.; Burmester, N.; Hambruch, N.; Stinshoff, H.; Hanstedt, A.; Wilkening, S.; Wrenzycki, C. „Einfluss der In-vitro-Reifungsbedingungen auf die Expression der Progesteronrezeptor-Isoformen boviner Oozyten“ European Embryo Transfer Association (Hrsg.): 28ème colloque scientifique, St. Malo, 7th and 8th September 2012, 120 N. Burmester, H. Stinshoff, A. Hanstedt, S. Wilkening, C. Wrenzycki „In vitro maturation conditions affect mRNA and protein expression of the progesterone receptor isoforms in bovine oocytes and cumulus cells“ Proceedings of the 46th Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, Danzig, 28 February – 2 March 2013 Poppicht, F.; Burmester, N.; Stinshoff, H.; Hanstedt, A.; Wilkening, S.; Wrenzycki, C. „Low oxygen concentration affects mRNA expression in bovine oocytes during IVM“ 212 Literaturverzeichnis DANKSAGUNG Vielen Dank an Frau Prof. C. Wrenzycki für die Überlassung dieses interessanten Themas, der laufenden Unterstützung, die Geduld bei der schriftlichen Anfertigung und für die persönliche und emotionale Aufmuterung bei den Höhen und Tiefen in den letzten 4 Jahren. Ein grosses Dankeschön an die Mitarbeiter des Anatomischen Instituts der Tiho, Hannover für die tatkräftige Untersützung. Insbesondere an Frau Dr. N. Hambruch, die jederzeit bei kleinen und größeren Katastrophen in der Proteinanalyse zu Hilfe kam. An Frau Dr. H. Stinshoff einen ganz lieben Dank für die fortwährende Unterstützung bei allen Grammatik-, Englisch-, Gefühlskatastrophen und für die immer (aber auch immer) aufmunternden Worte. Ein herzlichstes Dankeschön an Ana, Friedericke, Johanna, Katharina und Katha für die schönen Stunden in „unseren“ Büroräumen. Einen lieben Dank an Frau D. Müller und Frau S. Wilkening. Denn ohne die Fingerfertigkeit und die tatkräftige Unterstützung dieser beiden Damen in allen Laborangelegenheiten, hätte diese Arbeit nicht fertiggestellt werden können. Den Damen und Herren am Schlachthof in Bad Bramstedt ein Dankeschön für die Geduld und Unterstützung beim Sammeln der Ovarien. Für die finanzielle Unterstützung möchte ich mich bei dem Förderverein Biotechnologieforschung e.V., Bonn bedanken. Vielen lieben Dank an meine Eltern. Ohne ihre Hilfe wäre weder das „späte“ studieren noch die Doktorarbeit möglich gewesen. 213 Literaturverzeichnis Ein grosses und ganz liebes Dankeschön an Wolfgang. Dafür dass er mich stets aufgebaut hat und vor allem für die Ablenkung („kannst Du nicht mal eben“ oder „geh doch zum Pferd“ oder „was wollen wir heute schönes machen“) bei der Fertigstellung dieser Arbeit. 214
