Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise
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Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB des Bakteriophagen T4 Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum Angefertigt im Lehrstuhl der Biologie der Mikroorganismen/ Arbeitsgruppe Molekulare Genetik Vorgelegt von: Bernd Tiemann aus Dortmund Bochum (1999) Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB des Bakteriophagen T4 Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum Angefertigt im Lehrstuhl der Biologie der Mikroorganismen/ Arbeitsgruppe Molekulare Genetik Vorgelegt von: Bernd Tiemann aus Dortmund Bochum (1999) meinen Eltern Danksagung Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. W. Rüger für sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit, der ständigen Diskussionsbereitschaft und seinen wissenschaftlichen Anregungen, die diese Arbeit voran brachten. Herrn Prof. Dr. M. Rögner danke ich für die Übernahme des Korreferats. Danken möchte auch Herrn Prof. Dr. W. Klipp, an dessen Lehrstuhl diese Arbeit angefertigt wurde. Allen Mitarbeitern aus unserer Arbeitsgruppe Molekulare Genetik und des Lehrstuhls für Biologie der Mikroorganismen danke ich für das ausgezeichnete Arbeitsklima und ihre Unterstützung bei der Beschaffung diverser Vektoren und Bakterienstämme. Ganz besonders danke ich Frau Ursula Aschke-Sonnenborn für ihre ständige Hilfsbereitschaft und Herrn Heiko Koch, jetzt auch mit „Dr.“, für seine unermüdliche Diskussionsbereitschaft und die etlichen Hinweise auf den Bommerholzer Wasserturm. Abschließend möchte ich noch meinen Eltern danken, ohne deren Unterstützung weder das Studium noch die Dissertation möglich gewesen wären. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis................................................................................................................ V 1 Einleitung......................................................................................................................... 1 1.1 Der Bakteriophage T4....................................................................................................... 1 1.1.1 1.2 ADP-Ribosyltransferasen.................................................................................................. 4 1.2.1 1.3 2 Die Genexpression des Bakteriophagen T4............................................................. 3 Die ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 ........................................... 7 Aufgabenstellung ............................................................................................................ 12 Material und Methoden................................................................................................ 13 2.1 Geräteliste ....................................................................................................................... 13 2.2 Elektronische Datenverarbeitung.................................................................................... 14 2.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien........................................................................ 14 2.4 Biologisches Material ..................................................................................................... 15 2.4.1 Plasmide ................................................................................................................ 15 2.4.2 Oligonukleotide (Primer)....................................................................................... 17 2.4.3 Bakterienstämme ................................................................................................... 18 2.4.4 Bakteriophagen...................................................................................................... 18 2.5 Arbeiten mit Bakterien.................................................................................................... 19 2.5.1 Anzucht von Bakterien .......................................................................................... 19 2.5.2 Transformation in Escherichia coli ....................................................................... 21 2.5.2.1 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation ..................... 21 2.5.2.2 Elektrotransformation..................................................................................... 21 2.5.2.3 Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen mittels CaCl2 ............................ 21 2.5.2.4 Hitzeschocktransformation............................................................................. 22 2.5.3 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli................................................ 22 2.5.3.1 Überexpression mit λ-Phage CE6 .................................................................. 22 2.5.3.2 Überexpression mit M13-Phage mGP1-2 ...................................................... 23 2.5.3.3 Überexpression mit DE3 Stämmen ................................................................ 23 2.5.3.4 Überexpression aus pBAD-Vektoren ............................................................. 24 2.5.3.5 Überexpression in Gegenwart von Bakteriocinfreisetzungsprotein ............... 25 2.5.3.6 Coexpression von Chaperonen bei der Überexpression................................. 25 2.5.4 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren und Modifikationen des Testverfahrens26 I Inhaltsverzeichnis 2.5.4.1 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren ........................................................ 26 2.5.4.2 Schnellüberprüfung auf Expressionsfähigkeit der Transformanden .............. 26 2.5.4.3 Schnellüberprüfung der Toxizität von ModA und ModB sowie deren Mutanten......................................................................................................... 27 2.5.5 2.6 Aufschluß von Bakterien und Reinigung von Einschlußkörpern.......................... 27 Arbeiten mit DNA........................................................................................................... 28 2.6.1 Methoden der Plasmidisolierung ........................................................................... 28 2.6.2 Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA ................................................ 28 2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)......................................................................... 28 2.6.4 Mutagenese............................................................................................................ 29 2.6.5 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................... 29 2.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen............................................. 30 2.6.7 DNA-Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) .................................................. 30 2.7 Arbeiten mit Proteinen .................................................................................................... 30 2.7.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen ............................................................. 30 2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese................................................................. 31 2.7.2.1 Coomassie Brillantblau Färbung .................................................................... 32 2.7.2.2 Silberfärbung .................................................................................................. 32 2.7.3 Aufreinigung von „His-Tag“-Proteinen ................................................................ 32 2.7.3.1 2.7.4 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie................................ 33 Renaturierung von Proteinen ................................................................................. 34 2.7.4.1 Renaturierung durch Verdünnung .................................................................. 34 2.7.4.2 Renaturierung durch Dialyse.......................................................................... 35 2.7.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Western Blot) ....................................................................................................................... 36 2.7.6 2.8 Nachweis von rekombinanten „His-Tag“ Proteinen ............................................. 37 ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstest ........................................................................... 37 2.8.1 Aktivitätstest mit 32P-NAD+ .................................................................................. 37 2.8.2 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität mit p-Nitrobenzylidinaminoguanidin (NBAG) ........................................................................................ 38 2.8.2.1 2.9 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) ........................ 39 Transkriptionsversuche ................................................................................................... 39 2.9.1 Transkription von pKWIII Plasmiden ................................................................... 40 II Inhaltsverzeichnis 2.9.2 3 Transkription von genomischer DNA ................................................................... 41 Ergebnisse...................................................................................................................... 42 3.1 Computergestützte Auswertung der Proteinsequenzen von ModA und ModB.............. 42 3.2 Klonierung der beiden offenen Leserahmen zwischen den T4 Promotoren p11.815 und p13.149............................................................................................................................ 43 3.2.1 Klonierungsversuche in die Vektoren pBluescript II KS/SK................................ 43 3.2.2 Klonierungsversuche in die Vektoren pT7-5 und pT7-6....................................... 44 3.2.3 Klonierungsversuche in den Vektor pGEX-3X..................................................... 45 3.2.4 Klonierungsversuche in die pET-Vektoren ........................................................... 45 3.2.5 Klonierungsversuche in den Vektor pBAD/HisB ................................................. 50 3.3 Anzucht von Transformanden in Gegenwart von ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren 51 3.4 Identifizierung des Mod-Proteins, das die E. coli RNA-Polymerase modifiziert........... 52 3.5 Überexpression von Mod ................................................................................................ 53 3.5.1 Überexpression aus pET-Vektoren........................................................................ 53 3.5.1.1 Überexpression mit λCE6 .............................................................................. 53 3.5.1.2 Überexpression mit mGP1-2 .......................................................................... 53 3.5.1.3 Überexpression aus DE3 Stämmen ................................................................ 53 3.5.2 Überexpression aus dem Vektor pBAD ................................................................ 56 3.6 Reinigung von ModA unter denaturierenden Bedingungen ........................................... 57 3.7 Nachweis des „His-Tags“ ............................................................................................... 58 3.8 Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern .......................................................... 59 3.8.1 Veränderungen der Expressionsbedingungen ....................................................... 59 3.8.2 Überexpression in Gegenwart des Bakteriocinfreisetzungsproteins ..................... 60 3.8.3 Ausschleusen der exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum ............ 60 3.8.4 Coexpression von Chaperonen .............................................................................. 61 3.8.5 Fusion von ModA mit Thioredoxin....................................................................... 61 3.9 Renaturierung von Einschlußkörpern ............................................................................. 61 3.9.1 Renaturierung durch Verdünnung ......................................................................... 61 3.9.2 Renaturierung durch Dialyse ................................................................................. 62 3.10 Reinigung von ModA unter nativen Bedingungen ......................................................... 62 3.11 Nachweis katalytisch aktiver Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese............... 63 3.12 Entfernung des Trx aus p32modA2 ................................................................................ 66 3.13 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB................................................................. 68 III Inhaltsverzeichnis 3.14 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA .................................... 70 3.14.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin............................................... 70 3.14.2 Bestimmung von KM und Vmax .............................................................................. 71 3.15 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase ...... 74 4 Diskussion ...................................................................................................................... 77 4.1 Klonierung von modA und modB.................................................................................... 77 4.2 Gründe für die Toxizität von ModA und ModB............................................................. 80 4.3 Expression von ModA und ModB .................................................................................. 81 4.3.1 Expression von ModA und ModB aus pET-Vektoren .......................................... 81 4.3.1.1 4.3.2 Expression aus p32modA-His ........................................................................ 84 Expression von ModA aus dem pBAD-Vektor..................................................... 85 4.4 Vermeidung von Einschlußkörpern ................................................................................ 86 4.5 Renaturierung von denaturierten Proteinen .................................................................... 89 4.6 Reinigung von ModA...................................................................................................... 91 4.7 Mutanten von ModA und ModB..................................................................................... 92 4.8 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB................................................................. 96 4.8.1 4.9 ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit durch ModA........................................... 97 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA.............................................................. 100 4.10 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase .... 103 5 Zusammenfassung....................................................................................................... 106 6 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 108 IV Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis αCTD A A. dest. Abb. Amp APS ATP bp BRP C Cam cAMP CT CTP Da dATP ddH2O DMSO DNA dNTP DRAG DRAT dsDNA DT DTE DTT E. coli EDTA et al. G gp GST GuHCl HRP IMAC IPTG Kan kb kbp kDa kkat KM LT MCS min α-Carboxyterminale Domäne der E. coli RNA-Polymerase Adenin destilliertes Wasser (Aqua destillata) Abbildung Ampicillin Ammoniumpersulfat Adenosin-5'-triphosphat Basenpaar Bakteriocinfreisetzungsprotein (bacteriocin release protein) Cytosin Chloramphenicol zyklisches Adenosinmonophosphat (cyclic adenosin monophosphat) Cholera Toxin von Vibrio cholerae Cytidin-5'-triphosphat Dalton desoxy Adenosin-5'-triphosphat doppelt destilliertes Wasser Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleinsäure (desoxyribonucleic acid) desoxy Nucleosid-5'-triphosphat Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribose-Glycohydrolase von Rhodospirillum rubrum Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribosyltransferase von Rhodospirillum rubrum Doppelstrang-DNA (double strand DNA) Diphtherie Toxin von Corynebacterium diphtherie Dithioerythritol Dithiothreitol Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure (ethylen diamin tetra acetic acid und andere (et alius) Guanin Genprodukt Glutathion-S-Transferase Guanidinium Hydrochlorid Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase) immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie Isopropyl-β-D-thiogalaktosid Kanamycin Kilobasen Kilobasenpaare Kilo Dalton katalytische Konstante Michaelis-Konstante Escherichia coli hitzelabiles Enterotoxin multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) Minute(n) V Abkürzungsverzeichnis MOI NAD+ NBAG Ni-NTA ODxxx ORF oxi. PAETA PCR PDB PEG pfu PMSF POPOP PPO PT PVDF red. RNA RNAP RSA RT SD SDS ssDNA Str SV T TCA TEMED Tet Tris Trx TTP U UP Upm UTP v/v Vmax w/v xg Vielfache der Infektion (multiplicity of infection) Nicotinamid-adenin-dinucleotid (oxidiert) p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin Nickel-Nitrilotriessigsäure (Nickel-nitrilotriacetic acid) optische Dichte bei xxx nm Wellenlänge offener Leserahmen (open reading frame) oxidiert Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) 3D Struktur Proteindatenbank (Brookhaven Protein Data Base) Polyethylenglykol plaquebildende Einheit (plaque forming unit) Phenylmethylsulfonylfluorid 1,4-Bis(5 phenyl-2 oxazol) benzen 2,5-Diphenyloxazol Pertussis Toxin von Bordetella pertussis Polyvinylidenfluorid reduziert Ribonucleinsäure (ribonucleic acid) RNA-Polymerase von E. coli Rinderserumalbumin Raumtemperatur Shine-Dalgarno Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) Einzelstrang-DNA (single strand DNA) Streptomycin Säulenvolumen Thymin Trichloressigsäure (trichlor acetic acid) N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin Tetracyclin Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Thioredoxin Thymidin-5'-triphosphat Enzymeinheit (Unit) stromaufwärts (upstream) Umdrehungen pro Minute Uridin-5'-triphosphat Volumen pro Volumen (volume per volume) Maximalgeschwindigkeit Gewicht pro Volumen (weight per volume) Vielfache der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) VI Einleitung 1 Einleitung Wilhelm Roux stellte 1915 einen Katalog der funktionellen Merkmale des Lebens auf. Zum Leben gehören nach seiner Definition ein Stoffwechsel, bestehend aus Aufnahme, Assimilation, Dissimilation und Ausscheidung, Wachstum, Bewegung, bestehend aus Erregbarkeit und spontaner Bewegungsfähigkeit, Vermehrung und Vererbung. Nach dieser Definition können Bakteriophagen, das sind Viren, die Bakterien befallen, nicht als lebend angesehen werden, da den Viren ein eigener Stoffwechsel fehlt und sie weder wachsen noch erregbar sind. Für ihre eigene Vermehrung müssen die Viren deshalb den Stoffwechsel des Wirtes unter ihre Kontrolle bekommen. Sie rekrutieren dabei hauptsächlich die Ribosomen, die essentiell für die Proteinbiosynthese sind, und zum Teil die RNA-Polymerase des Wirtes. Die Viren bestehen aus einer mehr oder weniger komplexen Proteinhülle, in die das virale Erbmaterial verpackt ist. Das Erbmaterial besteht entweder aus dsDNA (λ, T-Phagen), ssDNA (M13) oder RNA (HIV, f2). Die Phagenhülle kann filamentös (M13), kugelig (Qβ, ΦX174) oder komplizierter aus einem Kopf- und Schwanzteil (λ, T-Phagen) bestehen. 1.1 Der Bakteriophage T4 Der Bakteriophage T4 gehört zu den geradzahligen T-Phagen (T2, T4, T6) und sein Wirt ist Escherichia coli. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, daß der T4 aus einem ikosaedrischen Kopf besteht, an dem ein etwa gleich langer Schwanz sitzt, der aus einer kontraktilen Scheide mit einer zentralen Röhre besteht (Abb. 1.1). Zwischen Kopf und Schwanz befindet sich der Kragen mit sechs „Whisker“. An der Basalplatte der Scheide sitzen sechs Schwanzfasern zur Anheftung an spezifische Rezeptoren der Bakterienzellwand. Das Genom besteht aus einer dsDNA mit 168.895 bp. Die DNA weist eine terminale Redundanz von ca. 3 kbp auf und ist wegen der Verpackung nach dem Kopf-Voll-Mechanismus zirkulär permutiert (STREISINGER et al., 1964; 1967). Eine Eigenart der T4 DNA ist das Vorhandensein von glycosyliertem 5-Hydroxymethyl-Cytosin statt des herkömmlichen Cytosins (Abb. 1.2), wodurch die Phagen DNA gegen den Verdau durch bakterielle Nukleasen geschützt ist (WYATT & COHEN, 1952; TAKAHASHI et al., 1979). Auf dem T4 Genom sind bisher ca. 150 Gene bekannt und es befinden sich dort noch einmal ca. 150 offene Leserahmen dessen Funktionen noch nicht ermittelt werden konnten (KUTTER et al., 1994). Diese Vielzahl der Gene erfordert eine zeitlich koordinierte Expression für eine effiziente Phagenvermehrung. 1 Einleitung Abb. 1.1 Schematische Darstellung des Bakteriophagen T4. H NH2 NH2 N O N R Cytosin Abb. 1.2 CH2 O N O O CH2OH H H H HO OH OH H N R alpha-Glucosid des 5-Hydroxymethyl-Cytosin Strukturvergleich zwischen Cytosin und glycosyliertem 5-Hydroxymethyl-Cytosin. Die Entwicklung des Bakteriophagen T4 verläuft nach einem vorherbestimmten Programm, wobei verschiedene Gruppen von Genen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Phageninfektion exprimiert werden. Die zeitliche Kontrolle der T4 Genexpression wird auf der Ebene der Transkription durch drei unterschiedliche Promotortypen (frühe, mittlere und späte) erreicht (Abb. 1.3). Für die RNA-Synthese wird während der gesamten T4 Infektion die wirtseigene DNA abhängige RNA Polymerase (EC 2.7.7.6) verwendet. Das Core-Enzym der E. coli RNA-Polymerase bleibt während der gesamten T4 Infektion aktiv und transkribiert die gesamte Phagen DNA (DIMAURO et al., 1969; HASELKORN et al., 1969). Bis zu 13 phagenkodierte Proteine modifizieren die RNA-Polymerase oder assoziieren mit ihr, was zu einer schrittweisen Erkennung der drei unterschiedlichen Promotortypen und zu Antiterminationen führt (MOSIG & HALL, 1994; WILKENS & RÜGER, 1994; STITT & HINTON, 1994; WILLIAMS et al., 1994). 2 Einleitung Promotorklasse (1) E. coli (2) T4 „früh“ (3) T4 „mittel“ (4) T4 „spät“ Abb. 1.3 „-35“-Region Abstand „-10“-Region TTGACA (16 - 18 bp) TATAAT GTTTACt/attcc (11 bp) GTGGTAt/ca/tATa Mot-Box (-30 Region) a a /t /tTGCTTt/cA (12 – 17 bp) TATAAT ------ ------ TATAAATActatt Konsensussequenzen für die verschiedenen Promotoren von T4 und E. coli. (1) (HAWLEY & MCCLURE, 1983; HARLEY & REYNOLDS, 1987) (2) (LIEBIG & RÜGER, 1989) (3) (GUILD et al., 1988) (4) (KASSAVETIS et al., 1986) 1.1.1 Die Genexpression des Bakteriophagen T4 Die 37 bekannten frühen Promotoren des T4 werden von der E. coli RNA-Polymerase mit dem σ70-Faktor erkannt. Diese Promotoren ähneln den E. coli Promotoren und weisen eine erweiterte –10 Sequenz auf. Außerdem besitzen sie in den Bereichen „-42“ und „-52“ charakteristische A/T reiche UP-Elemente (WILKENS & RÜGER, 1994). Die unveränderte RNA-Polymerase transkribiert in vitro nur von den frühen T4 Promotoren, die mittleren und späten Promotoren werden von ihr nicht erkannt. Die erste Modifikation der RNAPolymerase erfolgt durch das gpAlt (Alteration). Alt liegt mit ca. 25 – 50 Kopien im Phagenkopf vor und wird bei der Infektion mit der Phagen-DNA in die Zelle injiziert (GOFF, 1979). In den ersten 30 Sekunden wird eine der beiden α-Untereinheiten ADPribosyliert. Die zweite Untereinheit kann, wahrscheinlich auf Grund sterischer Behinderung, nicht ribosyliert werden (ZILLIG et al., 1977). Durch diese „Alteration“ werden einige frühe Promotoren verstärkt abgelesen (KOCH et al., 1995). Vom Promotor P13.149, der durch die „Alterierung“ am stärksten verstärkt wird, wird die zweite, bis vor Beginn dieser Arbeit bekannte, ADP-Ribosyltransferase Mod (Modifikation) transkribiert. Mod ADP-ribosyliert die zweite α-Untereinheit und beendet damit möglicherweise die Transkription von den frühen Promotoren (WILKENS et al., 1997). Diese Modifikation durch Mod ist vier Minuten nach der Infektion abgeschlossen (GOFF, 1974; HORVITZ, 1974b). Durch die Bildung der frühen Genprodukte AsiA (Anti Sigma) und MotA (modifier of transcription) wird von der frühen Transkription auf die mittlere Transkription 3 Einleitung umgeschaltet. Die mittleren Promotoren haben eine –10 Region, die von σ70 erkannt wird, aber keine –35 Region (STITT & HINTON, 1994). Die feste Bindung von AsiA an die σ70Untereinheit der RNA-Polymerase ist wichtig für den Übergang zwischen der frühen und mittleren T4 Transkription. AsiA verhindert sowohl die Erkennung der Wirts- als auch der frühen T4 Promotoren und stimuliert die Transkription von den mittleren Promotoren (OUHAMMOUCH et al., 1994; 1995). Außerdem wird noch MotA benötigt, das die „MotBox“ um Position –30 der mittleren Promotoren erkennt (OUHAMMOUCH et al., 1995; MARCH-AMEGADZIE & HINTON, 1995). Die mittlere Transkription nutzt zum Teil immer noch frühe Promotoren (HINTON, 1989; HSU & KARAM, 1990), jedoch werden die Transkripte durch Antiterminationsfaktoren bis über 15 kb verlängert (SANSON & UZAN, 1993; BRODY & GEIDUSCHEK, 1970). Die späte Transkription ist an die Replikation des T4 Genoms gekoppelt, da sie durch Einzelstrangbrüche positiv beeinflußt wird (HERENDEEN et al., 1989). Die späten T4 Promotoren weisen nur eine –10 Region auf, die von dem T4 gp55 (σ-Faktor) erkannt wird, aber noch Transkriptionsaktivatoren benötigt (BRODY et al., 1995; LEONETTI et al., 1998). Dazu gehören gp45 die sogenannte „sliding clamp“, der gp44-gp62-Komplex (DNA Ladefaktor) und gp33 (Co-Aktivator) (NOSSAL, 1994; YOUNG et al., 1994; TINKER et al., 1994; HERENDEEN et al., 1990). Nach etwa 25 Minuten sind ca. 150 neue Phagenpartikel zusammengebaut. Durch Lyse der Wirtszelle werden diese dann für die Infektion neuer Wirte freigesetzt. 1.2 ADP-Ribosyltransferasen ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation bei der ein ADP-Riboserest vom NAD+ auf unterschiedlichste Proteine übertragen wird (Abb. 1.4). Diese Reaktion wird durch virale, bakterielle oder eukaryontische Mono- oder Poly-ADP- Ribosyltransferasen (EC 2.4.2.30) katalysiert (DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996). PolyADP-Ribosyltransferasen sind bisher allerdings nur bei Eukaryonten in den Zellkernen gefunden worden (SHALL, 1995) Eine Poly-ADP-Ribosyltransferase ist im Nukleus von vielen Eukaryonten zu finden und verrichtet dort wichtige Aufgaben. So hält sie die Genomintegrität während der Excisionsreparatur von Basen aufrecht (DEMURCIA et al., 1997), hilft bei der DNA Rekombination (SATOH et al., 1994) und der Zelldifferenzierung (FARZANEH et al., 1987). Außerdem ist sie an der Organisation des Chromatins beteiligt (REALINI & ALTHAUS, 4 Einleitung 1992). Es werden Histone und Proteine, die an der Replikation beteiligt sind, modifiziert. Diese Proteine verlieren dadurch ihre Affinität zur DNA und es wird Platz für die DNA Reparatur geschaffen. Außerdem scheint die Poly-ADP-Ribosyltransferase auch eine Rolle während der Apoptose zu spielen (BERNARDI et al., 1995). O N O OH N N + O Rest CH2 O P O + OH O Abb. 1.4 Argininseitenkette N N CH2 + NH2 N + + H O OH + O N N O OH + NH2 NH O P O NAD NH OH NH2 NH2 O OH O HN Transferase H2N Rest O N H N N CH2 Rest OH NH2 O P O O N H + CH2 O O Rest NH2 O O P O OH ribosylierte Seitenkette Nicotinamid Schema der NAD+: Arginin ADP-Ribosyltransferase katalysierten Reaktion. Ob es sich bei dieser Reaktion um einen SN1 oder SN2 Mechanismus handelt konnte noch nicht geklärt werden (BELL & EISENBERG, 1996). Mono-ADP-Ribosyltransferasen wurden ursprünglich als pathogenes Prinzip des Diphtherie Toxins (DT), Cholera Toxins (CT), Pertussis Toxins (PT), Pseudomonas aeruginosa Exotoxins A (PAETA) und anderer bakterieller Toxine entdeckt (HONJO et al., 1968; MOSS & VAUGHAN, 1976; KATADA & UI, 1982; IGLEWSKI & KABAT, 1975). Sie wurden außerdem z.B. in Erythrocyten von Truthähnen, in der Milz von Hühnern und in Skelett- und Herzmuskeln von Säugetieren gefunden (OKAZAKI & MOSS, 1996). MonoADP-Ribosyltransferasen von Eukaryonten scheinen u.a. an der Immunregulation beteiligt zu sein (WANG et al., 1994). Einige Gene der bakteriellen Toxine stammen jedoch aus Phagen. So stammt das Strukturgen für das Cholera-Toxin aus einem filamentösen Phagen, der sich in das Chromosom von Vibrio cholerae integriert hat (WALDOR & MEKALANOS, 1996). Ebenso stammt das Gen für Diphtherie Toxin in Corynebacterium diphtherie vom lysogenen Phagen β (UCHIDA et al., 1971). Durch die ADP-Ribosylierung werden die Akzeptorproteine häufig inaktiviert. So inhibieren DT und PAETA durch die ADP-Ribosylierung des eukaryontischen Elongationsfaktors 2 (EF2) die Proteinsynthese, was zum Zelltod führt (PASSADOR & 5 Einleitung IGLEWSKI, 1994). In manchen Fällen wird die Aktivität jedoch durch korrespondierende ADP-Ribosyl-Hydrolasen wieder hergestellt. So z.B. bei dem photosynthetisch aktiven Bakterium Rhodospirillum rubrum. Hier wird die Stickstoffixierung durch eine Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribosyltransferase (DRAT) und eine entgegen wirkende Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribose-Glycohydrolase (DRAG) reguliert (POPE et al., 1985; LOWERY et al., 1986; Ludden, 1994). Die verschiedenen bakteriellen ADP-Ribosyltransferasen zeigen keine Homologien in der Aminosäuresequenz. Sie weisen aber drei ähnliche Regionen auf (DOMENIGHINI et al., 1994). Region I enthält ein nukleophiles Arginin oder Histidin, was für die Bindung des NAD+ essentiell ist. Der Austausch des His440 von PAETA oder des His21 von DT in der Region I führt zu einem drastischen Aktivitätsverlust (HAN & GALLOWAY, 1995). Der konservative Austausch des Arg7 im hitzelabilen Enterotoxin von E. coli (LT) und im CT, bzw. des Arg9 im PT gegen Lysin führte zum vollständigen Verlust der Enzymaktivität (LOBET et al., 1991; BURNETTE et al., 1988; 1991). Die Region II weist viele aromatische und hydrophobe Aminosäuren auf, die an der hydrophoben Interaktion mit den aromatischen Ringen des NAD+ beteiligt sein sollen. In der Region III befindet sich ein vollständig konserviertes Glutamat, was für die katalytische Aktivität eine wichtige Rolle spielt (DOMENIGHINI et al., 1994). So inhibierte z.B. der Austausch des Glu148 von DT oder des Glu553 von PAETA die Enzymaktivität ohne den KM-Wert für NAD+ zu beeinflussen (TWETEN et al., 1985; DOUGLAS & COLLIER, 1987). Die Kristallisation von DT mit NAD+ lieferte Hinweise, daß in den bakteriellen ADPRibosyltransferasen DT, PAETA, LT und PT ähnliche NAD+-Bindetaschen vorhanden sind, auch wenn weniger als 10 % Aminosäurehomologien bestehen (Abb. 1.5). Diese Bindetasche unterscheidet sich völlig von der Rossmannfaltung einiger Dehydrogenasen, die NAD+ als Coenzym verwenden (BELL & EISENBERG, 1996; ROSSMANN et al., 1975). DOMENIGHINI und RAPPUOLI (1996) haben das Modell der NAD+-Bindetasche auf alle bisher bekannten Mono- und Poly-ADP-Ribosyltransferasen von Eukaryonten, Prokaryonten und Viren ausgeweitet. 6 Einleitung Abb. 1.5 Überlagerung der dreidimensionalen Strukturen des β/α Motivs, das die NAD+Bindetasche von LT (grün), DT (rot), PAETA (blau) und PT (gelb) bildet. Das gebundene NAD+ (himmelblau) ist so in die Grube eingeführt, wie es in der DT Struktur vorliegt. Die konservierten Aminosäuren, die für die Katalyse wichtig sind, sind in gelb angegeben. (aus DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996) Ob es sich bei dem ADP-Ribosylierungsmechanismus um eine SN1 oder SN2 Reaktion handelt kann nicht genau bestimmt werden, da aufgrund der Kristalldaten beide Reaktionstypen möglich sind (BELL & EISENBERG, 1996). Die bemerkenswerte Konservierung der NAD+-Bindetasche und der Aminosäurereste, die an der Katalyse beteiligt sind deuten aber auf einen ähnlichen Mechanismus für alle ADPRibosyltransferasen hin (DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996). 1.2.1 Die ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 Bislang waren zwei ADP-Ribosyltransferasen beim Bakteriophagen T4 bekannt, das gpAlt und das gpMod. Durch die ADP-Ribosylierung von Wirtsproteinen und evtl. auch T4 eigener Proteine kann der Vermehrungszyklus des Phagen womöglich effizienter ausgeführt werden. Eine der ersten ADP-Ribosylierungen findet an einer der beiden α-Untereinheiten der wirtseigenen DNA abhängigen RNA-Polymerase statt. Diese „Alteration“ wird durch das T4 Protein Alt katalysiert und ist bereits 30 Sekunden nach der Infektion abgeschlossen. Die zweite Untereinheit kann, wahrscheinlich auf Grund sterischer Behinderung, durch das relativ große gpAlt nicht ribosyliert werden (ZILLIG et al., 1977). Die ADP-Ribosylierung der RNA-Polymerase durch Alt bewirkt, daß einige frühe T4 Promotoren verstärkt 7 Einleitung transkribiert werden (KOCH et al., 1995). Der ADP-Ribosylrest wird hauptsächlich auf das Arg265 der α-Carboxyterminalen Domäne (αCTD) übertragen (GOFF, 1974; OVCHINNIKOV et al., 1977) (Abb. 1.6). Ein geringer Anteil der Markierung findet sich aber auch am Arg191 oder Arg195 in der Aminoterminalen Domäne (GOFF, 1984). Unter in vitro Bedingungen werden noch viele andere Proteine wie z.B. Hühnereiweiß-Lysozym, Rinderserumalbumin, Histon F1 und ebenfalls in vivo die anderen RNA-Polymerase Untereinheiten durch Alt ADP-ribosyliert (ROHRER et al., 1975; HORVITZ, 1974b). Unter in vitro Bedingungen wurden aber auch noch viele andere E. coli Proteine durch ADPribosyliert. Dies alles ist ein Hinweis darauf, daß die ADP-Ribosylierung durch Alt nicht sehr spezifisch ist. Das alt Gen befindet sich zwischen den Genen 30 (DNA Ligase) und 54 (Basisplattenprotein) auf der genomischen Karte von T4 (GOFF, 1979) (Abb. 1.7). Das Alt Protein wird erst spät während der T4 Infektion als ein 79 kDa Vorläuferprotein gebildet (HORVITZ, 1974b). Diese Vorstufe wird jedoch während des Zusammenbaus der Phagenpartikel proteolytisch zum aktiven 67 kDa Alt Protein gespalten und 25 bis 50 Moleküle dieses Enzyms in den Phagenkopf verpackt. Bei der Infektion mit der Phagen DNA wird das gpAlt mit in die Wirtszelle injiziert (HORVITZ, 1974a; ROHRER et al., 1975; GOFF, 1979). Abb. 1.6 Die 3D Struktur der αCTD der RNA-Polymerase dargestellt als „Cartoon“ (links) und „Strand“ (rechts) (mit RasMol generiert, PDB Kode: 1COO (JEON et al., 1995)). Es ist der Aufbau aus den vier α-Helices (H1 – H4) wiedergegeben und das Arg265 ist hervorgehoben (links). In der rechten Abbildung sind die anderen Arginine als mögliche Ribosylierungsstellen dargestellt. 8 Einleitung Abb. 1.7 Genomische Karte des Bakteriophagen T4 (KUTTER et al., 1994). Die ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit erfolgt durch das gpMod (Modifikation). Die Lage des mod Gens wurde durch Deletionskartierung auf den Bereich zwischen den Genen 39 (DNA Topoisomerase Untereinheit) und 56 (dCTPase) auf der genomischen Karte eingeschränkt (HORVITZ, 1974a) (Abb. 1.7). Die ADP-Ribosylierung beider α-Untereinheiten am Arg265 ist nach vier Minuten durch dieses neusynthetisierte 23 kDa große Protein vollendet (GOFF, 1974; HORVITZ, 1974b). Nach diesen vier Minuten fällt die Aktivität von Mod stark ab (SKORKO et al., 1977). Im Gegensatz zu Alt kann Mod beide α-Untereinheiten modifizieren. Es modifiziert aber nicht die anderen Untereinheiten der RNA-Polymerase. Diese ADP-Ribosylierung bleibt für den Rest der T4 Infektion erhalten und wird nicht wieder rückgängig gemacht (HORVITZ, 1974a; GOFF & SETZER, 1980). Im Gegensatz zu Alt wirkt Mod spezifischer. Es wurde nur noch ein 13 kDa Protein gefunden, das von Mod ribosyliert wird, ob es ein E. coli Protein oder ein T4 Protein ist wurde jedoch nicht ermittelt (SKORKO et al., 1977). Die Modifikation der RNAPolymerase durch Mod verändert das Enzym dahingehend, daß E. coli Gene nicht mehr transkribiert werden, die Transkription der T4 Gene aber unbeeinflußt bleibt. 9 Einleitung Die Unterschiede zwischen Alteration und Modifikation sind folgende. (1) Die Alteration benötigt keine Proteinsynthese, da Alt bei der Infektion mit der T4 DNA in die Zelle gelangt. Für die Modifikation wird die Expression von Mod benötigt. (2) Die Modifikation ist spezifischer als die Alteration, d.h. es werden nicht so viele Proteine durch Mod markiert. (3) Mod ADP-ribosyliert beide α-Untereinheiten der RNA-Polymerase, wohingegen Alt nur eine α-Untereinheit in der RNA-Polymerase markiert. (4) Mod hängt an der α-Untereinheit nur an einer Aminosäureseitenkette einen ADP-Ribosylrest, während Alt an verschiedenen Argininresten der α-Untereinheit einen solchen Rest setzt (HORVITZ, 1974b). Die biologischen Auswirkungen der ADP-Ribosylierung der RNA-Polymerase für den Phagen sind nicht bekannt, da eine T4 alt-, mod- Doppelmutante keine signifikanten Auswirkungen während des Infektionszyklus zeigt (GOFF & SETZER, 1980). Es wurde vermutet, daß die ADP-Ribosylierung der Wirts RNA-Polymerase an der Blockierung der bakteriellen RNA-Synthese beteiligt sein könnte (MAILHAMMER et al., 1975; GOLDFARB & PALM, 1981). Die Blockierung der bakteriellen RNA-Synthese findet in alt-, modMutanten aber immer noch statt (GOFF & SETZER, 1980) und die konstitutive Expression von Alt führt zu keiner Wachstumshemmung bei E. coli (KOCH et al., 1995). Alt und Mod könnten evtl. unter nicht Laborbedingungen zu einem breiteren Wirtsspektrum führen oder einen leichten Wuchsvorteil des T4 bewirken, der mit den eingesetzten Methoden nicht erkannt werden kann (HORVITZ, 1974a; GOFF & SETZER, 1980). An Hand von T4 Deletionsmutanten, die keine Mod-Aktivität mehr aufweisen, war vor Beginn dieser Arbeit bereits vermutet worden, daß das Gen für die ADPRibosyltransferase Mod zwischen den T4 Promotoren P11.815 und P13.149 liegen müßte. Sequenzdaten aus diesem Bereich zeigten, daß hier zwei offene Leserahmen hinter dem frühen Promotor P13.149 liegen, die durch ein ATGA verbunden sind, wobei das ATG das Start-Codon des zweiten Gens und das TGA das Stop-Codon des ersten Gens darstellt (Abb. 1.8). Es war bisher allerdings noch nicht gelungen einen dieser beiden Leserahmen komplett zu klonieren. Eine Sequenzhomologiesuche in den Datenbanken gab keinen Hinweis darauf, welcher dieser beiden Leserahmen für eine ADP-Ribosyltransferase kodieren könnte. Erst „Threading-Experimente“, d.h. ein Alignment der Sekundärstrukturen mit bekannten ADP-Ribosyltransferasen zeigte, daß beide Proteine 10 Einleitung sehr wahrscheinlich zu den NAD(P)+-Arginin ADP-Ribosyltransferasen (EC 2.4.2.31) gehören (Abb. 1.9) (BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997; WILKENS et al., 1997). Es war bis dahin nicht bekannt, welches der beiden Proteine die E. coli RNA-Polymerase ADPribosyliert oder ob beide Proteine diese Reaktion unabhängig katalysieren können, bzw. ob Mod sogar als Heterodimer vorliegt. AccI DraI 200 P13.149 Abb. 1.8 SpeI DraI HindIII DraI DdeI DdeI RsaI DraI RsaI NsiI 400 ORF1 600 ATGA 800 (1467 bps) PvuII PvuII DdeI DdeI NdeI DraI EcoRI HincII 1000 1200 ORF2 1400 P11.815 Anordnung der beiden offenen Leserahmen zwischen den frühen Promotoren P11.815 und P13.149. Des weiteren sind einige Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegeben, die aus den Sequenzdaten ermittelt wurden. Toxa_Pseae Dtx_Corbe Elap_Ecoli Chta_Vibch Tox1_Borpe Parp_Chick Alt_Bpt4 Alt_bpt6 ModA_Bpt4 ModB_Bpt4 GYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQD........................LDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDA... ..NFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYD.....................DDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPL... ..GDRLYRADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRYDDGYVSTSLSLRSAHLAGQSILSG.... ..DDKLYRADSRPPDEIKQSGGLMPRGQSEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRHDDGYVSTSISLRSAHLVGQTILSG.... DPPATVYRYDSRPPEDVFQNGFTAWGNND...........NVLDHLTGRSCQVGSSNSAFVSTSSSRRYTEVYLEHRMQEAVEA HNRQLLWHGSRTTNFAGILSQGLRIAPPEAPVT....................GYMFGKGIYFADMVSKSANYCHTSQA..... PKGITLYRSQRMLPSIYEAMVKNRVF.............................YFRNFVSTSLYP.NIFGTWMTDSSIGVLP PEGITVYRAQSMTAPIYEALVKNKVF.............................YFRNFVSTSLTP.IIFGRFGITHAGIGLL PNDKPLWRGVPAETKQVLNQGIDIITFDKVVSASY.................DKNIALHFASGLEYNTQVIFEFKAP....... KSPYQLYRGISKSTKELIKDLQVGEVFSTNRVDSF................TTSLHTACSFSYAEYFTETILRLKTD....... β1 Toxa_Pseae Dtx_Corbe Elap_Ecoli Chta_Viboh Tox1_Borpe Parp_Chick Alt_Bpt4 Alt_Bpt6 ModA_Bpt4 ModB_Bpt4 Ü b erh a ng S c hle ife α1 β2 α2 ........RGRIRN.GALLRVYVPRSLDAITQ..............PEEE......GGRLETILGWPLAERTVV.IPSA...... ..........SGKA.GGVVKVTYPGSRVVLSL..............PFAEG.....SSSVEYINNWEQAKALSV.ELEINFE... ............YSTYYIYVIATA..PNMFNVNDVLGVYS......PHP........YEQEVSALGGI.PYSQIYGWYRVN.... ............HSTYYIYVIATA..PNMFNVNDVLGAYS......PHP........DEQEVSALGGI.PYSQIYGWYRVH.... ERAGRGTG....HFIGYIYEVRAD..NNFYGAASSYFEYVDTYGDNAGRILAGALATYQSEYLAHRRI.PPENIRRVTRVYHNGI ............DPIGLILLGEVALGNHSVKGLGKTAPDPTAPLGNGISTGINDTCLLYNEYIVYDV..AQVNLKYLLKLKFNYK .DEKRLSVSIDKTDEGIGWVITGADKVNVVLPGGSLAPS..................NEMEVILPRGL.MVKVNKITDASYNDGT EPEARNELTVDKNEEGIGWAIDGAHKVNVVYPG.SLGIA..................TEAEVILPRGL.MVKVNKITDASNNDGT ..............MVFNFQEYAIKALRCKEYNPNFKFP......DSHRYRNMELVSDEQEVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYT ..............KAFNYSDHISDIILSSPNTEFKYTYEDTDGLDSERTDNLMMIVREQEWMIPIGKYKITSISKEKLHDSFGT β3 β4 β5 β6 Abb. 1.9 Alignment von ausgesuchten ADP-Ribosyltransferasen eukaryotischer und prokaryotischer Organismen sowie von T-Phagen (nach BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997). Toxa_Pseae: Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa; Dtx_Corbe: Diphtherie Toxin von Corynebacterium diphtherie; Elap_Ecoli: hitzelabile Enterotoxin A von Escherichia coli; Chta_Vibch: Cholera Toxin von Vibrio cholerae; Tox1_Borpe: Pertussis Toxin von Bordetella pertussis; Parp_Chick: Poly-ADP-Ribosyltransferase von Gallus gallus; Alt_Bpt4: Alt Protein von Phagen T4; Alt_Bpt6: Alt Protein von Phagen T6; ModA_Bpt4: ModA Protein von Phagen T4; ModB_Bpt4: ModB Protein von Phagen T4. 11 Aufgabenstellung 1.3 Aufgabenstellung Das erste Ziel dieser Arbeit war es die beiden offenen Leserahmen zu klonieren und das Gen für mod, der zweiten ADP-Ribosyltransferase des Bakteriophagen T4, zu identifizieren. Nach der Klonierung sollte das gpMod überexprimiert und gereinigt werden. Das gereinigte Protein sollte dann in einigen Aspekten wie Aktivität und Auswirkungen auf die Transkription näher charakterisiert werden. Mit Hilfe ortspezifischer Mutagenese sollten einige für die Katalyse als relevant postulierte Aminosäuren verifiziert bzw. falsifiziert werden. Außerdem sollte ein Reinigungsprotokoll für Mod erstellt werden, um es in ausreichender Menge und Reinheit isolieren zu können. Dieses gereinigte Protein kann dann für kristallographische Untersuchungen eingesetzt werden. Ein Vergleich mit den Tertiärstrukturen anderer ADP-Ribosyltransferasen könnte das Wissen über die Funktionsweise dieser Proteine erweitern. 12 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Geräteliste Elektrophoresezubehör: Agarose-Gelkammern: Glasplatten, Kämme, Kammern Protein-Gelkammern: Mini-PROTEANII Elektroporator: Gene Pulse II Geltrockner: Biometra Gel AirDryer Inkubationsroller und –schüttler: New Brunswick Scientific G10 Gio Gyrotory Shaker PCR-Cycler: Mini-Cycler™ Photometer: PU 8730 UV/VIS UV-Visible Spectrophotometer Spannungsgeber: EPS 3500 Power Pac 300 Vakuumzentrifuge: Speed Vac Concentrator Videodokumentation: Gel Print 2000i Western-Blot Apparatur: Mini-Trans-Blot-Kammer Zellaufschluß: Branson Sonifier 250 Branson Sonifier B-12 French Pressure Cell Press Zentrifugen: Biofuge pico Biofuge 15 R Sorvall RC-5B Werkstätten der Ruhr-Universität Bochum BioRad, Richmond (USA) BioRad, Richmond (USA) Biometra, Göttingen BioRad, Richmond (USA) New Brunswick (Can) New Brunswick (Can) Biozym, Hessisch Oldendorf Philips, Eindhoven (NL) Pharmacia LKB, Freiburg Pharmacia LKB, Freiburg BioRad, Richmond (USA) Uni Equip, München MWG-Biotech, Ebersberg BioRad, Richmond (USA) Branson, Danbury (USA) SLM-Aminco, Rochester (USA) Heraeus, Osterode Heraeus, Osterode Du Pont, Bad Homburg Alle weiteren Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard. 13 Material und Methoden 2.2 Elektronische Datenverarbeitung Zur Auswertung und Darstellung der Ergebnisse wurden folgende Computerprogramme verwendet: Microsoft® Office 97 Professional (Microsoft Corporation) CorelDraw™ 6 oder 8 (Corel Corporation) DNAStar (DNAStar Inc.) Tina 2.09g (Raytest GmbH) Diverse PDB-Betrachter wie RasMol , WebLab Viewer, Swiss PDB Viewer, MolMol Die in dieser Arbeit wiedergegebenen Bilder wurden elektronisch in das Dokument eingebunden. Die Originalgele wurden mit Hilfe einer Videodokumentationsanlage digitalisiert. Im Verlauf der Datenerfassung und Datenverarbeitung kam es zu keiner inhaltlichen Veränderung der Abbildungen. 2.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Acrylamid-Bisacrylamidstammlösungen: Long Ranger Gellösung 19:1 50% FMC, Vallenbaek Strand (DK) (Sequenzgele) Rotiphorese 29:1 40% (Proteingele) Roth, Karlsruhe DNA-modifizierende Enzyme, Restriktionsenzyme, MBI Fermentas, St. Leon-Rot; Gibco BRL, Nukleotide, Polymerasen, RNase-Inhibitor Neu-Isenburg; Boehringer, Mannheim Molekularbiologische Kits: Quiaquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden NucleoSpin C+T Macherey-Nagel, Düren ™ T7 Sequenzing Mixes Pharmacia, Freiburg Quickchange Mutagenese Kit Stratagene, La Jolla (USA) ™ Wizard Minipreps Plus Promega, Madison (USA) Molekulargewichtsmarker: MBI Fermentas, St. Leon-Rot λ-Marker, EcoRI und HindIII geschnitten MBI Fermentas, St. Leon-Rot 100 bp Leiter Plus Gibco BRL, Neu-Isenburg 10 kDa Leiter Oligonukleotide Gibco BRL, Neu-Isenburg PVDF-Membran: Millipore, Eschborn Immobilon-P Radiochemikalien: Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig α[32P]-UTP spez. Aktivität: 30 TBq/mmol 35 α[ S]-dATP spez. Aktivität: 600 Ci/mmol Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig NEN, Boston (USA) [32P]NAD+ spez. Aktivität: 800 Ci/mmol Röntgenfilm: Fuji Medical X-Ray Film Fuji (Japan) Alle anderen nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von den Firmen Biomol, Hamburg; J.T. Baker, Groß-Gerau; Merck, Darmstadt; Riedel-de Haën, Hannover; Serva, Heidelberg und Sigma, München bezogen. 14 Material und Methoden 2.4 Biologisches Material 2.4.1 Plasmide Plasmid/Vektor pBluescript II KS pBluescript II SK pT7-5 pT7-6 pGEX-3X pET-11d pET-16b (+) pET-22b (+) pET-32b (+) pLysS pSW1 pBAD/His B pGroESL pBN19 p13.149 p8.182 ptac pTKRI p11modAB3 p11modBB5 p11modB1 p22modBB2 p16modA7 p16modB1 p16modA7-E165D p16modA7-R72K p16modB1-E173D p16modB1-R73K p32modA2 p32modA-His pBADmodA2 pBADmodA2-R72K pBADmodA2-E165D relevante Eigenschaften (Resistenz) allgemeiner Klonierungsvektor (Amp) allgemeiner Klonierungsvektor (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor (Amp) Expressionsvektor, Fusionsprotein mit GST (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator, Nterminaler His-Tag (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator, Signalsequenz für Periplasma (Amp) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator, Fusionsprotein mit Trx, C-terminaler His-Tag (Amp) Exprimiert T7 Lysozym als Inhibitor für T7 Polymerase (Cam) Exprimiert „Bacteriocin Release Protein“ (Tet) Expressionsvektor mit araBAD Promotor und Nterminalen His-Tag (Amp) Exprimiert GroEL und GroES (Cam) Exprimiert DnaK (Tet) pKWIII mit T4 Promotor p13.149 (Amp) pKWIII mit T4 Promotor p8.182 (Amp) pKWIII mit Promotor ptac (Amp) Exprimiert gpAlt des Bakteriophagen T4 (Kan) pET-11d mit modA kloniert über NcoI und BamHI (Mutation M125→K) (Amp) pET-11d mit modB kloniert über NcoI und BamHI (Amp) pET-11d mit modB kloniert über NcoI (Amp) pET-22b mit modB kloniert über NcoI und BamHI (Amp) pET-16b mit modA kloniert über BamHI, N-terminaler His-Tag (Amp) pET-16b mit modB kloniert über NdeI und BamHI, Nterminaler His-Tag (Amp) p16modA7 mit Mutation E165→D (Amp) p16modA7 mit Mutation R72→K (Amp) p16modB1 mit Mutation E173→D (Amp) p16modB1 mit Mutation R73→K (Amp) pET-32b mit modA kloniert über NcoI und XhoI als TrxFusionsprotein (Amp) p32modA2 ohne NdeI Schnittstelle in modA und ohne trx Anteil (Amp) pBAD/His B mit modA über XhoI und HindIII kloniert (Amp) pBADmodA2 mit Mutation R72→K (Amp) pBADmodA2 mit Mutation E165→D (Amp) Referenz SHORT et al., 1988 TABOR & RICHARDSON, 1985 SMITH & JOHNSON, 1988 STUDIER & MOFFATT, 1986 ROSENBERG et al., 1987 STUDIER et al., 1990 DUBENDORFF & STUDIER, 1991 LA VALLIE et al., 1993 STUDIER, 1991 VAN DER WAL et al., 1995 GUZMAN et al., 1995 GOLOUBINOFF et al., 1989 BLUM et al., 1992 WILKENS & RÜGER, 1996 KOCH et al., 1995 diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit 15 Material und Methoden Dra II Xho I Kpn I Eag I Bgl II Not I Nde I Hin dIII Xmn I Acc I Cla I Hin cII Sal I Nde I T7 Ter f1 Sac I Xba I Eco RI Cla I trxA II Bam HIDra T7 Pro Eco RV Nco I Amp Xmn I Sca I Pvu I Pst I pET-32b(+) 5899 bps lacI Apa I Bss HII Eco RV lacI Bam HI Dra II Eco RV Nco I Hin dIII Xba I Cla I Bgl II Eco RI Dra II Dra II lac operator Xmn I T7 Pro Sca I Pvu I Pst I Amp pET-11d Pvu II Pvu II 5674 bps Apa I ori pBR322 Bss HII Hin cII Pvu II Pvu II Acc I Pvu II Xmn I Dra II Eco RI Cla I Hin dIII Eco RV Dra II Bam HI Xho I Dra II Nde I Xmn I Nco I Sca I Bgl II Pvu I MCS Dra II His-Tag Pst I T7 Pro Amp Apa I lacI Dra II Dra II Afl III Bam HI Nco I Nhe I Xmn I pBAD MCS pBAD/His B Rsa I Bam HI Sac I Xho I Bgl II Pst I Pvu II Kpn I Rsa I Nde I Eco RI Hin dIII 4094 bps ori pBR322 Eag I Acc I Pvu II Xmn I Bss HII Ssp I Rsa I I Rsa Eco RV araC 5711 bps Bss HII Eco RV Pvu II Pvu II Abb. 2.1: Dra II Dra II Nsi I Bss HII pET-16b(+) ori pBR322 Eag I Acc I Pvu II Xmn I Acc I Rsa I Nde I Afl III Amp ColE1 Xmn I Hin cII Sca I Rsa I Pvu I Die Abbildung gibt die wichtigsten, in dieser Arbeit verwendeten, Expressionsvektoren wieder. 16 Material und Methoden 2.4.2 Oligonukleotide (Primer) Tabelle 2.1 Die angegebenen Oligonukleotide wurden für die PCR, zum Sequenzieren oder für die Mutagenese eingesetzt. Die farbig hervorgehobenen Basen geben entweder eingefügte Restriktionsschnittstellen für die gerichtete Klonierung oder Basenaustausche für die Mutagenese wieder. Name 1018 (PstI) 1021 (BglII) modA (EcoRV) 7-5Vorn 7-5Hinten modBAnf modBEnde modAAnf modAEnde modBEndBam modAEndBam modBNde modABam Seq-AP Seq-AT Seq-BP Seq-BT Mut-A-E165→D1 Mut-A-E165→D2 Mut-B-E173→D1 Mut-B-E173→D2 Mut-A-R72→K1 Mut-A-R72→K2 Mut-B-R73→K1 Mut-B-R73→K2 T7-Promotor modANcoIAnf modAXhoIEnd Mut-A-Nde1 Mut-A-Nde2 modAAnfXhoI modAEndHindIII Sequenz TTCTGCAGTATACGGAGG TAATGAGATCTAAGTCCTTCC CGGAGGATATCATGATTATT AATTCTCATGTTTGACAGCT GGCTTATCGAAATTAATACG ACGGAGGCTACCATGGTTATTAAT CACCGATGCATCCATGGATTTTAT TGAGGTAGTTCCATGGAATACTCA GCTTTAAAACTTCCATGGTATAATGA GCACCGATGGATCCATTGATTTTA TGGTATAATGGATCCAAGTCCTTC ACGGAGGCTCATATGATTATTAAT TTGAATGAAGGATCCAGTAATGCA AAACCAGATGACCATTCTTG CAAGAATGGTCATCTGGTTT GAATGAAGCTCTTCATAAGC GCTTATGAAGAGCTTCATTC GAACAAGACGTAATGATA TATCATTACGTCTTGTTC GAACAAGACTGGATGATT AATCATCCAGTCTTGTTC CTTTGGAAAGGTGTTCCA TGGAACACCTTTCCAAAG CAATTATATAAAGGTATATCA TGATATACCTTTATATAATTG TAATACGACTCACTATAGGG ATTGAGGTAGTTCCATGGAATACTCAG AGTCCTTCCACTCGAGATTAAATCCTTC CGTATCAGCTTCTTATGATAAAAATATAG CTATATTTTTATCATAAGAAGCTGATACG GGTAGTTGCTCGAGATACTRCAGTAATGC GGTATAATGAATCTAAAAGCTTCCATTATAG 17 Material und Methoden 2.4.3 Bakterienstämme Stamm BL21 Genotyp E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal BL21(DE3) E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ(DE3) BLR F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm ∆(srlrecA)306::Tn10(TetR) BLR(DE3) F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm ∆(srlrecA)306::Tn10(TetR) λ(DE3) C41(DE3) nicht näher definierte Mutante von BL21 (DE3) C43(DE3) nicht näher definierte Mutante von BL21 (DE3) DH5αF' F'Φ80d lacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi1, hsdR17 (rK-, mK+), supE44, relA1, deoR, ∆(lacZYA-argF)U169 ED8739 F- metB supE supF hsdS (rK12- mK12-) JM103 JM109 LE392 LMG194 MV1190 XL-1 Blue endA1 supE sbcBC thi-1 strA ∆(lac-pro) [F' traD36 lacIqZ∆M15 proAB] (P1 lysogen) e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+) supE44 relA1 ∆(lac-proAB)[F' traD36 proAB lacIqZ∆M15] F- hsdR514 (rK12- mK12+) mcrA supE44 supF58 lacY1 oder ∆(lacIZY) galK2 galT22 metB1 trpR55 F- ∆lacX74 gal E thi rpsL ∆phoA (PvuII) ∆ara714 leu::Tn10 (TetR StrR) ∆(lac-proAB) thi supE ∆(srlrecA)306::Tn10(Tet)R [F':traD36 proAB lacIq∆M15] recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)] Firma Stratagene Referenz STUDIER & MOFFATT, 1986 Stratagene Novagen Novagen Stratagene Novagen Stratagene MIROUX & WALKER, 1996 WOODCOCK et al., 1989 BORCK et al., 1976 STUDIER & MOFFATT, 1986 HANAHAN, 1983 Stratagene YANISCH-PERRON et al., 1985 Novagen MANIATIS et al., 1982 Invitrogen Stammsammlung Stratagene BULLOCK et al., 1987 2.4.4 Bakteriophagen Phage λCE6 mGP1-2 Eigenschaft Enthält Gen für T7 RNA-Polymerase Enthält Gen für T7 RNA-Polymerase Referenz STUDIER & MOFFATT, 1986 TABOR & RICHARDSON, 1985 18 Material und Methoden 2.5 Arbeiten mit Bakterien 2.5.1 Anzucht von Bakterien Nähr- und Lagermedien LB-Medium 1 % (w/v) 0,5 % (w/v) 1 % (w/v) pH 7,5 SOC-Medium 2 % (w/v) 0,5 % (w/v) 10 mM 2,5 mM 10 mM 10 mM 20 mM pH 7,5 Bacto-Pepton Hefeextrakt NaCl Bacto-Pepton Hefeextrakt NaCl KCl MgCl2 MgSO4 Glucose 2x YT-Medium 1,6 % (w/v) 1 % (w/v) 0,5 % (w/v) pH 7,5 Bacto-Pepton Hefeextrakt NaCl Trypton-Phosphat-Medium (MOORE et al., 1993) 2 % (w/v) Bacto-Pepton 1,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,2 % (w/v) Na2HPO4 0,1 % (w/v) KH2PO4 0,8 % (w/v) NaCl vor Gebrauch 0,2 % Glucose dazu RM-Medium + Glucose 1 x M9 Salze 2 % (w/v) Casaminosäuren 0,2 % (w/v) Glucose 1 mM MgCl2 für 1 Liter 20 g Casaminosäuren in 890 ml A.dest. autoklavieren, dann 100 ml 10 x M9 Salze 1 ml 1 M MgCl2 10 ml 20 % Glucose 10 x M9 Salze 60 g Na2HPO4 30 g KH2PO4 5 g NaCl 10 g NH4Cl ad 900 ml A.dest. pH 7,4 M9-Medium 100 ml 10 ml 10 ml 100 ml 750 ml Lösung 3 0,2 g CaCl2 x 2 H2O ad 100 ml A. dest. Lösung 1 Lösung 2 Lösung 3 Lösung 4 steriles A. dest. Lösung 1 20 g Glucose ad 500 ml A. dest. Lösung 2 2,5 g MgSO4 x 7 H2O ad 100 ml A. dest. Lösung 4 35 g Na2HPO4 x 2 H2O 15 g KH2PO4 2,5 g NaCl 5 g NH4Cl ad 500 ml A. dest. pH 7,4 19 Material und Methoden β-Galaktosidase-Medium 8 g LAB-Lemco Broth 4 g NaCl 10 g Casaminosäuren 5 g Pepton ad 1 Liter A. dest. pH 7,5 Lager-Medium 0,3 % (w/v) 0,7 % (w/v) 0,05 % (w/v) 0,01 % (w/v) 55 % (w/v) KH2PO4 K2HPO4 Na-Citrat MgSO4 Glyzerin Für die Herstellung von Festplattenagar wurden den entsprechenden Medien 1,5 % (w/v) Bacto-Agar zugegeben. Zur Selektion von plasmidtragenden Bakterien wurden den Medien entsprechende Antibiotika zugesetzt. Festplattenmedien mit ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren Manchem selektiv 3-Methoxybenzamid Festplattenagar (m-Anisamid) wurden für spezifische Inhibitoren poly-ADP-Ribosyltransferasen wie bzw. 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (Benzoylenharnstoff) für mono-ADP-Ribosyltransferasen in Konzentrationen von 2 mM zugesetzt (BANASIK & UEDA, 1994). Abb. 2.2 gibt die Strukturformeln der verwendeten Inhibitoren wieder. O CH3O CONH2 NH N 3-Methoxybenzamid (m-Anisamid) Abb. 2.2 O 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (Benzoylen-Harnstoff) Strukturformeln der ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren 3-Methoxybenzamid und 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion. Verfahren zur Anzucht der Bakterien Die Anzucht von Übernacht-Kulturen erfolgte in Reagenzgläsern mit 5 ml Flüssigmedium, je nach Versuchsvorgaben bei 30° C bis 37° C auf einem Inkubationsroller bei 220 Upm. 20 Material und Methoden 2.5.2 Transformation in Escherichia coli 2.5.2.1 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation Es wurden 2 x 200 ml 2x YT-Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben mit 2 ml einer frischen Übernacht-Kultur der entsprechenden Bakterien angeimpft und bei 37° C auf einem Schüttler bis OD590 von 0,5 - 0,8 inkubiert. Anschließend verblieben die Zellen 15 – 30 min auf Eis und wurden weiterhin kalt gehalten. Die Zellen wurden bei 4000 x g für 15 min bei 4° C sedimentiert (Sorvall RC-5, GSA Rotor). Der Überstand wurde vollständig entfernt und die Zellen in 200 ml eiskalten A. dest. gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation folgte ein weiterer Waschschritt mit 100 ml eiskaltem A. dest. und Zentrifugation. Die Bakterien wurden nun in 4 ml 10 % Glyzerin aufgenommen und auf je vier 2 ml Eppendorfgefäße verteilt. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 4° C und 3000 x g (Biofuge 15R, Rotor #3042) wurden die Bakterien in je 125 µl 10 % Glyzerin suspendiert, in Aliquots zu 40 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80° C gelagert. 2.5.2.2 Elektrotransformation Die elektrokompetenten Zellen wurden vorsichtig aufgetaut und zusammen mit der zu transformierenden DNA in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (0,2 cm; Peqlab, Erlangen) gegeben. Enthielt die DNA-Lösung Salze, mußte sie vorher auf einem Nitrozellulosefilter (0,025 µm Porengröße, 13 mm ∅, Millipore, Erlangen) dialysiert werden. Die Elektrotransformation (Gen Pulse II, BioRad) erfolgte bei 2,5 kV, 25 µF und 200 Ω. Nach erfolgtem Stromstoß lag die Zeitkonstante bei ca. 5 msec. Anschließend wurden die Bakterien mit 1 ml SOC-Medium (2.5.1) versetzt und für 30 – 60 min bei 37° C auf einem Schüttler inkubiert. Je nach eingesetzter DNA Menge wurden 50 – 200 µl der Bakteriensuspension auf entsprechende Selektivmedien ausplattiert. 2.5.2.3 Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen mittels CaCl2 Zur Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen wurden 400 ml LB-Medium 1 %ig mit einer frischen Übernacht-Kultur angeimpft und bei 37° C auf einem Schüttler bis OD590 von ca. 0,375 inkubiert. Nach einer 10 minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen für 7 min bei 4° C und 1600 x g (Sorvall RC-5, GSA Rotor) sedimentiert und die Zellen in 40 ml CaCl2-Lösung (60 mM CaCl2, 15 % (w/v) Glyzerin, 10 mM MOPS) suspendiert. Nach einer weiteren Zentrifugation für 5 min bei 4° C und 1100 x g wurden die Zellen 21 Material und Methoden noch einmal in 40 ml CaCl2-Lösung aufgenommen und 30 min auf Eis inkubiert, wieder für 5 min sedimentiert und anschließend in 8 ml CaCl2-Lösung suspendiert. Die nun kompetenten Zellen wurden in Aliquots zu je 100 µl aufgeteilt und bei –80° C gelagert. 2.5.2.4 Hitzeschocktransformation 100 µl der hitzeschockkompetenten Zellen wurden mit der zu transformierenden DNA vermischt und 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock für 2 min bei 42° C. Danach wurde 1 ml LB-Medium (2.5.1) zu den Bakterien gegeben. Die phänische Expression erfolgte für 1 Stunde bei 37° C auf einem Inkubationsroller. Je nach eingesetzter DNA wurden 50 – 200 µl der Bakteriensuspension auf entsprechende Selektivmedien ausplattiert. 2.5.3 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli 2.5.3.1 Überexpression mit λ-Phage CE6 Herstellung von λCE6 Stocklösungen Der Wirtsstamm für die Vermehrung des λCE6 muß supF exprimieren, damit die Sam7 Lysismutation im Phagen unterdrückt wird. Als Wirtsbakterien wurden somit die Stämme ED8739 oder LE392 verwendet, die in 10 ml LB-Medium (2.5.1) mit 0,2 % Maltose und 10 mM MgSO4 angezogen wurden bis sie eine OD600 von 1 erreicht hatten. Danach wurden 5 ml der Wirtszellen mit 2 x 108 Phagenpartikeln gemischt und bei 37° C für 15 min ohne zu schütteln inkubiert. Das Bakterien/Phagen-Gemisch wurde in 500 ml LBMedium mit 10 mM MgSO4 überführt und bei 37° C mit 250 Upm auf einem Schüttler inkubiert bis die Zellen lysiert waren (ca. 5 Stunden). Danach wurden 5 ml Chloroform zugegeben und weitere 10 min geschüttelt. Anschließend wurden die Zelltrümmer bei 10.000 x g und 4° C für 10 min sedimentiert. Nach Zugabe von 7 % (v/v) DMSO Endkonzentration zu der Phagensuspension konnte diese bei –70° C gelagert werden. Induktion der Überexpression mit λCE6 BL21 Zellen mit dem zu exprimierenden Plasmid wurden in LB-Medium mit 0,2 % Maltose und entsprechendem Antibiotikum bei 37° C auf einem Schüttler angezogen bis die OD600 zwischen 0,6 und 1 lag. Danach wurde MgSO4 zu einer Endkonzentration von 10 mM und λCE6 zu einer Endkonzentration von 2 – 4 x 109 pfu/ml („MOI“ 5-10) zugegeben. Außerdem mußte 1 mM IPTG Endkonzentration verabreicht werden, um den 22 Material und Methoden T7 Promotor auf den pET-Vektoren zu öffnen. Die infizierten Zellen wurden für weitere drei Stunden inkubiert und anschließend durch Zentrifugation geerntet. 2.5.3.2 Überexpression mit M13-Phage mGP1-2 Herstellung von mGP1-2 Stocklösungen Der Wirtsstamm für die Vermehrung von mGP1-2 muß F' sein und einen Amber Suppressor tragen (z.B. JM103, JM109 oder MV1190). Die Wirtsbakterien wurden in 50 ml 2x YT-Medium bei 37° C bis zu einer OD590 = 0,1 angezogen, mit einem Einzelplaque von mGP1-2 infiziert und 5 – 8 Stunden weiter inkubiert. Nach einer Sedimentation der Zellen wurden zu den 50 ml Phagensuspension 3,5 g PEG 6000 gegeben und die Phagen gefällt. Induktion der Überexpression mit mGP1-2 MV1190 Zellen mit dem zu exprimierenden Plasmid wurden in 5 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum über Nacht bei 37° C angezogen. Von der Übernacht-Kultur wurden 100 ml LB-Medium 1 %ig angeimpft, entsprechendes Antibiotikum zugegeben und die Zellen bei leichtem Schütteln bis OD590 = 0,5 inkubiert. Danach wurden die Zellen mit mGP1-2 infiziert („MOI“ ~ 10) und 1 mM IPTG Endkonzentration zugegeben, um die Expression von den pET-Vektoren zu starten. Nach 1,5 bis 3 Stunden konnten die Zellen geerntet werden. 2.5.3.3 Überexpression mit DE3 Stämmen Zur Überexpression der Proteine aus pET-Vektoren wurden hauptsächlich Bakterienstämme benutzt, die durch einen λ-lysogenen Phagen das Gen der T7 RNA Polymerase im Genom integriert haben (BL21(DE3); BLR(DE3); C41(DE3); C43(DE3) (2.4.3)). Einige dieser Stämme enthielten ebenfalls das Plasmid pLysS, das für T7 Lysozym kodiert, was einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA Polymerase darstellt (MOFFATT & STUDIER, 1987; STUDIER, 1991; ZHANG & STUDIER, 1997). In Abb. 2.3 sind die Kontrollelemente des pET Systems wiedergegeben. Für die Überexpression wurden die Zellen mit dem entsprechenden Plasmid unter Selektionsdruck in verschiedenen Medien angezogen (LB-, 2x YT-, M9-, TryptonPhosphat-Medium (2.5.1)). Die Anzucht erfolgte bei Temperaturen zwischen 16° C und 23 Material und Methoden 45° C auf einem Schüttler bei 200 Upm. Bei Erreichen einer OD590 von 0,8 wurde die Überexpression mit 0,5 - 1 mM IPTG Endkonzentration gestartet. Je nach verwendetem Bakterienstamm wurden die Zellen für 0,5 – 16 Stunden weiter inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (Sorvall RC-5B; Rotor GSA; 4000 x g, 20 min, 4°C) geerntet, in Aufschlußpuffer (2.5.5) suspendiert und bei –20° C bis zur Weiterverarbeitung gelagert. Abb. 2.3: Kontrollelemente des pET Systems (nach Novagen, verändert). 2.5.3.4 Überexpression aus pBAD-Vektoren Zur Überexpression aus pBAD-Vektoren wurde der E. coli Stamm LMG194 (2.4.3) verwendet. Die mit dem entsprechenden pBAD-Plasmid transformierten Zellen wurden unter Selektionsdruck in RM-Medium + Glucose oder β-Galaktosidase-Medium (2.5.1) bis OD600 = 0,5 bei 37° C und 200-250 Upm auf einem Schüttler angezogen. Die Induktion erfolgte mit 0,00002 % bis 0,2 % L-Arabinose Endkonzentration. Die induzierten Zellen wurden nach 4 Stunden durch Zentrifugation (Sorvall RC-5B; Rotor GSA; 4000 x g, 20 min, 4°C) geerntet, in Aufschlußpuffer (2.5.5) suspendiert und bei –20° C bis zur Weiterverarbeitung gelagert. In Abb. 2.4 ist eine schematische Darstellung der Regulation des pBAD Promotors wiedergegeben. 24 Material und Methoden AraC Dimer keine Transkription + Arabinose Transkription Abb. 2.4: Regulation des pBAD Promotors. C: Carboxyterminus des AraC; N: Aminoterminus des AraC; O2, I1, I2: Bindestellen für AraC; CAP: (CAP)-cAMP Komplex; Pc: araC Promotor 2.5.3.5 Überexpression in Gegenwart von Bakteriocinfreisetzungsprotein Das Plasmid pSW1 kodiert für das Bakteriocinfreisetzungsprotein BRP („bacteriocin release protein“) dessen Bildung durch Zugabe von Mitomycin C induziert werden kann (VAN DER WAL et al., 1995). Durch die Coexpression des BRP mit dem gpModA bzw. gpModB sollten diese in das Medium freigesetzt und die Bildung von Einschlußkörpern verhindert werden. Cotransformanden mit pSW1 und entsprechenden pET-Vektoren in BL21(DE3) bzw. BLR(DE3) wurden von einer Übernacht-Kultur 1 %ig in 1x YT-Medium mit 15 µg/ml Tetracyclin und 100 µg/ml Ampicillin angeimpft. Anschließend wurden die Zellen bei 37° C auf einem Schüttler inkubiert. Bei Erreichen einer OD590 von 0,6 wurde die Expression des BRP durch Zugabe von 10 – 300 ng/ml Endkonzentration Mitomycin C induziert. 30 min später erfolgte die Induktion der pET-Vektoren mit 1 mM IPTG Endkonzentration. Die Expression wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt, die Zellen sedimentiert und der Proteinanteil im Überstand und den Zellen in einem SDSPolyacrylamidgel (2.7.2) analysiert. 2.5.3.6 Coexpression von Chaperonen bei der Überexpression Weitere Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern schlossen die Coexpression von Chaperonen ein. Dazu wurden die Plasmide pGroESL (GOLOUBINOFF et al., 1989) und pBN19 (BLUM et al., 1992a; 1992b) verwendet. Das Plasmid pGroESL kodiert für die 25 Material und Methoden Hitzeschockproteine GroES und GroEL während pBN19 für das HSP70 Chaperon DnaK kodiert. Für die Überexpression wurden Cotransformanden der pET-Vektoren mit pGroESL bzw. pBN19 in BL21(DE3) verwendet. Die Anzucht erfolgte bei 37° C auf einem Schüttler bis zu einer OD590 von 0,6 - 0,8. Die Coexpression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG Endkonzentration induziert und die Zellen für 3 Stunden weiter inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, aufgeschlossen und der Gehalt an löslichen bzw. unlöslichen Proteinen auf SDS-Polyacrylamidgelen (2.7.2) analysiert. 2.5.4 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren und Modifikationen des Testverfahrens 2.5.4.1 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren Kurz vor der Induktion der pET-Vektoren kann man die Kultur auf den Anteil der Bakterien untersuchen, die das Plasmid noch tragen und exprimieren können. Dazu wurden Verdünnungen der Bakterien auf unterschiedliche Agar-Platten ausplattiert, siehe Tabelle 2.2. Für diesen Test wurden die Stämme BL21(DE3) und BLR(DE3) verwendet. Tabelle 2.2: Übersicht über die verwendeten Agar-Platten im Plasmidstabilitätstest und die zu erwarteten Kolonienzahlen. LB-Agar-Platte Verdünnung erwartetes Wachstum in % Wachstum von ohne Zusatz 2 x 10-4 100 alle Zellen mit 100 µg/ml Amp 2 x 10-4 100 Zellen mit Plasmid mit 1 mM IPTG 10-3 <2 mit 100 µg/ml Amp und 1 mM IPTG 10-3 < 0,01 Zellen ohne Plasmid oder Mutanten, die die Ziel-DNA nicht mehr exprimieren können Mutanten, die die Ziel-DNA nicht mehr exprimieren können 2.5.4.2 Schnellüberprüfung auf Expressionsfähigkeit der Transformanden Der Plasmidstabilitätstest (2.5.4.1) konnte leicht modifiziert auch zur Schnellüberprüfung auf die Expressionsfähigkeit von Transformanden herangezogen werden. Dazu wurden die Transformanden in einem Raster auf LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin und auf LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG übertragen. Die Transformanden, die nicht auf dem IPTG haltigen Agar wuchsen wurden von dem Ampicillin haltigen Agar für die Überexpression angeimpft. 26 Material und Methoden 2.5.4.3 Schnellüberprüfung der Toxizität von ModA und ModB sowie deren Mutanten Eine weitere Modifikation des Plasmidstabilitätstests (2.5.4) konnte Hinweise über die Toxizität von ModA, ModB und deren Mutanten geben. Für diesen Test wurde der Stamm C41(DE3) (MIROUX & WALKER, 1996) verwendet. Dieser Stamm ist eine nicht näher definierte Mutante von BL21(DE3) und hat die Fähigkeit unter induzierten Bedingungen auf Agar-Platten zu wachsen, da entweder die Prozessivität oder die Menge der gebildeten T7 RNA Polymerase verringert ist. Zur Überprüfung der Toxizität wurden die zu untersuchenden Plasmide in C41(DE3) transformiert und auf Selektiv-Agar und Selektiv-Agar mit 1 mM IPTG ausplattiert. 2.5.5 Aufschluß von Bakterien und Reinigung von Einschlußkörpern Die aus einer 500 ml Expressionskultur geernteten Bakterien (ca. 2,5 g) wurden in 10 – 30 ml Aufschlußpuffer suspendiert und entweder mit Ultraschall (Branson Sonifier B-12, bei 100 W) auf Eis für 6 mal 30 sec oder mit der French Presse (Cell Typ 40 K) bei 2000 psig aufgeschlossen. Nach erfolgtem Aufschluß wurden die Einschlußkörper bei 3000 x g (Sorvall RC-5, GSA Rotor) für 20 min bei 4° C von den Zellresten und den löslichen Proteinen getrennt. Die Einschlußkörper wurden anschließend in 30 ml „Inclusionbody“-Waschpuffer resuspendiert und 30 min auf Eis mit gelegentlichem vortexen inkubiert. Nach einer weiteren Sedimentation der Einschlußkörper bei 10.000 x g für 20 min bei 4°C konnten diese dann entweder im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl oder im „Inclusionbody“Denaturierungspuffer aufgelöst werden. Schwer lösliche Bestandteile wurden durch eine Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 min sedimentiert oder die Lösung durch einen 0,45 µm Filter gegeben. Aufschlußpuffer 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM Imidazol pH 8,0 nach dem Autoklavieren frisch dazu: 1 mM DTT 2 mM PMSF „Inclusionbody“-Waschpuffer (HLODAN et al., 1991) 50 mM Tris-HCl pH 7,5 2 mM EDTA 100 mM NaCl 1 M Harnstoff 0,05 % (w/v) Deoxycholatsäure 1 mM DTT 1 mM PMSF 0,5 mg/ml Lysozym 27 Material und Methoden „Inclusionbody“-Denaturierungspuffer 100 mM Tris 2 M Harnstoff pH 12,0 2.6 Arbeiten mit DNA 2.6.1 Methoden der Plasmidisolierung Zur Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli wurden diverse Plasmid Isolations Kits der Firmen Qiagen (Hilden), Macherey-Nagel (Düren) und Promega (Madison USA) unter Befolgung der entsprechenden Protokolle verwendet. Des weiteren wurde die Methode von BIRNBOIM & DOLY (1979) oder zur Schnellisolation von Plasmid-DNA die Methode von GOODE & FEINSTEIN (1992) eingesetzt. 2.6.2 Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA wie Restriktionsverdau, Ligation, Dephosphorylierung, S1-Verdau, Mungbohnen Nuklease-Verdau und Modifikationen mit dem Klenow-Fragment erfolgten nach den Angaben der entsprechenden Enzymhersteller (Gibco BRL, Neu-Isenburg; MBI Fermentas, St. Leon-Rot; Boehringer, Mannheim) oder nach AUSUBEL et al. (1993). 2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation der Gene modA und modB aus dem T4 Genom wurde die Polymerase Kettenreaktion verwendet. Es wurde T4 DNA verwendet, die nicht das 5-HydroxymethylCytosin sondern Cytosin beinhaltet (Cyt-DNA aus T4 alc563 [42- (amC87), 56- (amE51), denB- (amS19), alc (unf39)]. Die PCR wurde in einem Mini-Cycler (Biozym) nach folgendem Standard Protokoll durchgeführt: 1) 2) 3) 4) 5) 30 sec 2 min 1 min gehe zu 1) 10 min 95° C 5° - 10° C unter der Schmelztemperatur der Primer 72° C 35 mal 72° C 28 Material und Methoden Die Reaktionsansätze setzten sich im Allgemeinen folgendermaßen zusammen: Komponente T4 Cyt-DNA (XhoI-hydrolysiert) 10 ng/µl 10 x Puffer je 2,5 mM dNTP´s 50 mM MgCl2 Anfang-Primer (10 pmol/µl) Ende-Primer (10 pmol/µl) Taq-Polymerase 2 U/µl A. dest. µl 2 10 10 5 5 5 1 62 2.6.4 Mutagenese Die ortsspezifische Mutagenese der Gene modA und modB erfolgte mit dem „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ von Stratagene. Dabei wurden die unter 2.4.2 aufgeführten Mutageneseprimer (Mut...) verwendet. Die Mutagenese erfolgte in einem Mini-Cycler (Biozym) in Anlehnung des Herstellers. Da die Mutageneseprimer laut Angabe von Stratagene eine zu niedrige Schmelztemperatur haben, wurde das PCRProtokoll wie folgt geändert: 1) 2) 30 sec 1 min 2 min 3) 4) 13 min gehe zu 1) 95° C 40° C ↓ 68° C 68° C 16 mal Nach erfolgter Mutagenese wurde das methylierte, nicht mutierte Parental-DNA Template durch DpnI hydrolysiert. Die verbliebenen mutagenisierten Plasmide wurden in E. coli XL1-Blue transformiert und auf Selektiv-Medium ausplattiert. Zur Überprüfung der erfolgreichen Mutagenese wurden die Plasmide isoliert und sequenziert (2.6.1; 2.6.7). 2.6.5 Agarose-Gelelektrophorese Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte je nach Größe der zu trennenden Fragmente in 0,6 – 1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid. Die Gelelektrophorese fand in einer horizontalen Elektrophoresekammer (9 x 10 cm) bei 80 mA für 0,5 – 2 Stunden statt. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese mit entsprechenden Mengen 10 x DNA-Probenpuffer versetzt. Als Größenstandards wurde EcoRI/HindIII-verdaute λ-DNA und eine 100 bp Plus Leiter eingesetzt (2.3). 29 Material und Methoden 10 x TAE-Puffer 400 mM Tris-HCl pH 7,6 10 mM Essigsäure 2 mM EDTA 10 x DNA-Probenpuffer 25 % (w/v) Glyzerin 0,05 % (w/v) Bromphenolblau in TAE-Puffer 2.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mittels des „QIAquick Gel Extraction Kit“ (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers. 2.6.7 DNA-Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) Die DNA Sequenzierung erfolgte mit den „T7 Sequencing Mixes“ (Pharmacia, Freiburg) unter Einsatz von α[35S]dATP nach Angaben des Herstellers. Die Auftrennung der Reaktionsgemische erfolgte in 6 %igen Polyacrylamidgelen (290 x 600 x 0,35 mm) mit 7 M Harnstoff in 1,2 x TBE-Puffer. Als Laufpuffer dienten der Anoden-Puffer (0,6 x TBE) und der Kathoden-Puffer (0,6 x TBE, 90 mM Na-Phosphat). Die Proben wurden bei 35 W für 2,5 Stunden bzw. 5,5 Stunden aufgetrennt, das Gel auf Whatman Papier gezogen und auf einem Geltrockner getrocknet. Anschließend erfolgte eine Exposition mit einem Röntgenfilm für 1 bis 2 Tage. 10 x TBE-Puffer 0,89 M Tris 0,83 M Borsäure 25 mM EDTA pH 8,3 2.7 Arbeiten mit Proteinen 2.7.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen colorimetrisch nach BRADFORD (1976) Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen von Proteingemischen erfolgte photometrischen nach der Methode von BRADFORD (1976). Dazu wurden 1-20 µl der Probe mit A. dest. auf 200 µl gebracht, mit 2 ml Bradfordreagenz versetzt und 10 min im Dunkeln inkubiert. Die Messung erfolgte bei einer OD595 und die Proteinkonzentration wurde nach einer mit Rinderserumalbumin erstellten Eichgeraden ermittelt. 30 Material und Methoden Bradfordreagenz 10 % (v/v) Phosphorsäure 5% (v/v) Ethanol 0,01 % (w/v) Coomassie Brillantblau G-250 spektroskopisch Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen von gereinigten Proteinen erfolgte bei einer OD280. Die benötigten Werte (1A280= ) zur Berechnung der jeweiligen Konzentrationen wurden dem Programm Protean aus dem DNAStar Programmpaket entnommen. 2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Auftrennung von Proteinen erfolgte in einem diskontinuierlichen Gelsystem (MiniPROTEANII) nach LAEMMLI (1970) nach Angaben des Herstellers. Für die Auftrennung der Proteine wurden 4 %ige Sammelgele und 10 - 15 %ige Trenngele, je nach Versuchsziel, verwendet. Die Proben wurden mit 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 bis 10 min gekocht. Die Elektrophorese erfolgte im Tris-Glycin Laufpuffer bei 200 V für 50 min. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie Brillantblau (2.7.2.1) oder Silber (2.7.2.2) gefärbt. Sammelgel (4 %) 0,5 ml Rotiphorese 29:1 (40 %) 1,25 ml 4 x Sammelgelpuffer 3,25 ml A. dest. 25 µl 20 % (w/v) SDS 25 µl 10 % (w/v) APS 10 µl TEMED Trenngel (13 %) 3,25 ml Rotiphorese 29:1 (40 %) 2,5 ml 4 x Trenngelpuffer 4,25 ml A. dest. 40 µl 20 % (w/v) SDS 40 µl 10 % (w/v) APS 20 µl TEMED 4 x Sammelgelpuffer 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 5 x SDS-Probenpuffer 100 mM Tris 50 % (w/v) Glyzerin 25 % (v/v) β-Mercaptoethanol 15 % (w/v) SDS 0,01 % (w/v) Bromphenolblau pH 6,8 4 x Trenngelpuffer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 Tris-Glycin Laufpuffer 25 mM Tris 190 mM Glycin 0,1 % (w/v) SDS 31 Material und Methoden 2.7.2.1 Coomassie Brillantblau Färbung Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele für 5 – 15 min in der Coomassie-Färbelösung gefärbt und mit der Entfärbelösung der Gelhintergrund bis zum gewünschten Grad entfärbt. Coomassie-Färbelösung 45 % (v/v) Methanol 9 % (v/v) Eisessig 0,25 % (w/v) Coomassie Brillantblau Entfärbelösung 30 % (v/v) Methanol 7,5 % (v/v) Eisessig 2.7.2.2 Silberfärbung Zur Silberfärbung von Proteingelen wurde die Methode nach BLUM et al. (1987) verändert von NESTERENKO et al. (1994) angewendet. Dazu wurde das Trenngel 5 min im Fixierer inkubiert, mit ddH20 gespült (3 x 5 sec; 1 x 5 min; 3 x 5 sec). Nach einer Vorbehandlung mit 50 % Azeton für 5 min und 1 min in der Na2S2O3-Lösung wurde erneut mit ddH2O gespült (3 x 5 sec). Die Färbung erfolgte für 8 min in der Färbelösung. Nach erfolgter Spülung mit ddH2O (2 x 5 sec) wurde das Gel für 10 – 20 sec im Entwickler entwickelt und die Reaktion durch Austausch der Lösung gegen 1 % Essigsäure gestoppt. Fixierer 60 ml 1,5 ml 25 µl 50 % (v/v) Azeton in ddH2O 50 % (w/v) TCA in ddH2O 37 % Formaldehyd Färbelösung 0,16 g AgNO3 0,6 ml 37 % Formaldehyd 60 ml ddH2O Na2S2O3-Lösung 100 µl 10 % (w/v) Na2S2O3 in ddH2O 60 ml ddH2O Entwickler 1,2 g 25 µl 25 µl 60 ml NaCO3 37 % Formaldehyd 10 % (w/v) Na2S2O3 in ddH2O ddH2O 2.7.3 Aufreinigung von „His-Tag“-Proteinen Die Proteine ModA und ModB, sowie deren modifizierte Varianten, wurden durchweg als Einschlußkörper synthetisiert und lagen nur zu einem nicht mehr detektierbaren Anteil löslich im Cytoplasma vor. Die Reinigung der Proteine erfolgte aus den Einschlußkörpern (2.5.5) unter denaturierenden Bedingungen im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5). Renaturierte Proteine wurden unter nativen Bedingungen über eine immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie gereinigt. 32 Material und Methoden 2.7.3.1 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie Zur Reinigung der „His-Tag“ Proteine wurde die von PORATH et al. (1975; PORATH, 1992) eingeführte immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) verwendet. Hier wird die hohe Affinität von aufeinanderfolgenden Histidinen (6-10 Stück) zu zweiwertigen Ionen ausgenutzt. Die gebundenen Proteine können anschließend mit Imidazol oder bei pH 6,0 eluiert werden. • Reinigung unter denaturierenden Bedingungen Zum Einsatz kamen die Säulenmaterialien Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure, Qiagen), Talon (Co2+ beladen, Clontech) und His•Bind Resin (Novagen). Die Handhabung der Säulenmaterialien erfolgte nach Angaben des jeweiligen Herstellers mit 2 ml Säulenmaterial in 5 ml Polypropylen-Säulen. Nach erfolgter Äquilibrierung der Säule mit 5 Säulenvolumen (SV) Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl erfolgte die Bindung der Proteine an das Säulenmaterial nach dem „Batch-Verfahren“ bei Raumtemperatur (RT). Nachdem die Säule mit 5 SV Aufschlußpuffer mit 8 M Harnstoff gewaschen war erfolgte die Renaturierung der gebundenen Proteine auf der Säule. Dazu wurden 4 SV Renaturierungspuffer mit 6 M Harnstoff, 4 SV Renaturierungspuffer mit 3 M Harnstoff bei RT und 5 SV Renaturierungspuffer bei 4° C über die Säule gegeben. Die Elution der Proteine erfolgte mittels eines Imidazol-Stufengradienten (50 – 300 mM) im Aufschlußpuffer in 50 mM Schritten. Die gesammelten Fraktionen (0,5 bis 1 SV) wurden mit Hilfe eines SDS-Polyacrylamidgels auf ihren Proteingehalt hin analysiert, die entsprechenden Fraktionen vereinigt und gegen Dialyse-Puffer 1 oder Dialyse-Puffer 2 dialysiert. Aufschlußpuffer 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM Imidazol pH 8,0 Renaturierungspuffer 20 mM Tris 500 mM NaCl 20 % (v/v) Glyzerin 2 mM red. Glutathion 0,2 mM oxi. Glutathion 0,5 mM PMSF pH 7,4 33 Material und Methoden Dialyse-Puffer 1 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA 50 % (v/v) Glyzerin pH 8,0 • Dialyse-Puffer 2 50 mM 500 mM 1 mM 10 mM 40 % (v/v) Tris-Acetat NH4Cl EDTA β-Mercaptoethanol Glyzerin Reinigung unter nativen Bedingungen Für die Reinigung unter nativen Bedingungen wurde die Ni-NTA Matrix (Qiagen) nach Angaben des Herstellers verwendet. Als zu reinigendes Proteingemisch wurden unter pH 12,0 denaturierte und anschließend über Dialyse renaturierte Einschlußkörper (2.7.4.2) verwendet. Die gesamte Reinigung erfolgte bei 4° C. 2 ml Säulenmaterial wurden mit Lysis-Nativ-Puffer äquilibriert, das Proteingemisch über die Säule gegeben und diese mit 6 SV Lysis-Nativ-Puffer gespült. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit je 5 SV Qia-Elute-Puffer mit 50 mM, 80 mM, 100 mM und 250 mM Imidazol. Es wurden Fraktionen von 2 ml gesammelt und auf einem SDS-Polyacrylamidgel auf ihren Proteingehalt analysiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und gegen DialysePuffer 2 über Nacht dialysiert. Anschließend wurden die Proteine bei –20° C gelagert. 10 x Lysis-Nativ-Puffer 500 mM NaH2PO4 3 M NaCl 100 mM Imidazol pH 8,0 10 x Qia-Elute-Puffer 500 mM NaH2PO4 3 M NaCl pH 8,0 2.7.4 Renaturierung von Proteinen Da die Bindung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen an den oben erwähnten Säulenmaterialien (2.7.3.1) nicht sehr effektiv war wurden alternative Renaturierungsmethoden angewendet. 2.7.4.1 Renaturierung durch Verdünnung Bei dieser Methode wurden die im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5) gelösten Einschlußkörper langsam in 100 ml Renaturierungspuffer 2 bei RT unter ständigem Rühren getropft. Anschließend wurden die Proteine durch Zentrifugationsfiltration (Ultrafree-15 Centrifugal Filter Device Biomax-10K, Millipore, Eschborn) aufkonzentriert. 34 Material und Methoden Renaturierungspuffer 2 50 mM Tris-HCl pH 8,0 100 mM Glycin 0,5 % (v/v) Triton X-100 0,01 % (v/v) Tween 20 20 % (v/v) Glyzerin 100 mM Mg-Acetat 100 mM KCl 0,5 mM PMSF 15 mM β-Mercaptoethanol 2.7.4.2 Renaturierung durch Dialyse • Die im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5) aufgelösten Einschlußkörper wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml gebracht. Die Dialyse erfolgte in Dialyseschläuchen mit einer Ausschlußgröße von 12 - 16 kDa (Dialysemembran Type20, Biomol, Hamburg) gegen 1 Liter Dialyse-Renaturierungs-Puffer mit stufenweiser Verringerung der Harnstoffkonzentration (6 M → 4 M → 2 M → 0 M). Dialyse-Renaturierungs-Puffer 100 mM NaH2PO4 10 mM Tris 50 mM Glycin 100 mM KCl 2 mM MgCl2 0,005 % (v/v) Tween 20 0,5 mM PMSF pH 8,0 • Die im „Inclusionbody“-Denaturierungspuffer (2.5.5) aufgenommenen Einschlußkörper wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml bzw. 3 mg/ml für die Trx-Fusionsproteine gebracht. Die Dialyse erfolgte in Dialyseschläuchen mit einer Ausschlußgröße von 12 - 16 kDa (Dialysemembran Type20, Biomol, Hamburg) gegen 1 Liter Lysis-Puffer über Nacht bei 4° C. Lysis-Puffer 50 mM 300 mM 2 M pH 8,0 NaH2PO4 NaCl Harnstoff 35 Material und Methoden 2.7.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Western Blot) Die in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine wurden in einer Mini-TransBlot-Kammer (BioRad) auf eine PVDF-Membran übertragen. Dazu wurde die PVDFMembran 5 sec in Methanol getaucht, 2 min mit A. dest. abgespült und 2 – 3 min im Towbin-Puffer äquilibriert. Der Blot wurde wie in Abb. 2.5 zusammengesetzt und in der Blot-Kammer fixiert. Nach Zugabe des eiskalten Towbin-Puffers erfolgte die Übertragung der Proteine auf die Membran für 15 min bei 150 mA und 30 min bei 300 mA. Nach erfolgtem Transfer konnten die rekombinanten „His-Tag“ Proteine mit einem Ni-NTAKonjugat nachgewiesen werden (2.7.6). Towbin-Puffer (TOWBIN et al., 1979) 25 mM Tris 192 mM Glycin 20 % (v/v) Methanol Abb. 2.5 Schematische Anordnung der Western-Blot Apparatur. 36 Material und Methoden 2.7.6 Nachweis von rekombinanten „His-Tag“ Proteinen Zum Nachweis der rekombinanten „His-Tag“ Proteine wurde das „Ni-NTA HRP Konjugat“ der Firma Qiagen verwendet. Das Ni-NTA mit der gekoppelten MeerrettichPeroxidase (Horseradish Peroxidase, HRP) erlaubt die Detektion der rekombinanten Proteine anhand von Chemilumineszenz, die zur Schwärzung eines Röntgenfilmes eingesetzt wird. Nach erfolgtem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran (2.7.5) wurde diese der Reihe nach 2 mal 10 min in TBS-Puffer, eine Stunde im Blocking-Puffer, 3 mal 10 min in TBS-Tween-Puffer, eine Stunde in TBS-Tween-Puffer mit Ni-NTA-Konjugat-Stocklösung (1:1000 verdünnt) und 3 mal 10 min in TBS-Tween-Puffer inkubiert. Danach wurde die Membran mit 1 ml ECL (Amersham, Braunschweig) überschichtet und in durchsichtige Folie eingeschlagen. Die Detektion der „His-Tag“ Proteine erfolgte mit einem Röntgenfilm, der für 5 – 20 sec auf der Folie exponiert wurde. Nach erfolgter Detektion konnten die Proteine auf der PVDF-Membran mittels der Coomassie Brillantblau Färbung sichtbar gemacht werden (2.7.2.1). TBS-Puffer 10 mM 150 mM Tris-HCl pH 7,5 NaCl TBS-Tween-Puffer 20 mM Tris-HCl pH 7,5 500 mM NaCl 0,05 % (v/v) Tween 20 Blocking-Puffer 3 % (w/v) RSA in TBS-Puffer 2.8 ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstest 2.8.1 Aktivitätstest mit 32P-NAD+ Die ADP-Ribosyltransferase Aktivität der gpModA und gpModB sowie deren modifizierte Varianten wurde in einem leicht veränderten ADP-Ribosyltransferasetest nach ROHRER et al. (1975) ermittelt. Die Versuchsansätze setzten sich im Allgemeinen wie in Tabelle 2.3 beschrieben zusammen. Alle Reaktionen fanden in einem Volumen von 100 µl für 30 min bei 15° C statt. Nach erfolgter Inkubation wurden die Proteine mit 40 µl 50 %iger (w/v) Trichloressigsäure gefällt und die Proteine durch ein Zentrifugation (13.000 Upm, 10 min, RT) sedimentiert. Das Sediment wurde anschließend mit 70 % (v/v) Azeton gewaschen 37 Material und Methoden (Zentrifugation für 5 min bei RT), getrocknet, in 80 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen und 15 min gekocht. Ein Aliquot von 15 – 20 µl wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt (2.7.2), das Gel mit Coomassie Brillantblau gefärbt (2.7.2.1) und getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann mit einem Röntgenfilm und Verstärkerfolien bei –80° C für 2 Tage bis 4 Wochen exponiert. Tabelle 2.3 Allgemeine Zusammensetzung des ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstests. lösliche Proteine aus BLR (DE3) (100 µg) 10 x Transferasepuffer 32 P-NAD+ (1 µCi ) E. coli RNA-Polymerase (20 µg optional) ADP-Ribosyltransferase (5 – 10 µg gereinigtes Enzym oder 100 µg lösliches Protein einer Überexpression) 10 x Transferasepuffer 500 mM Tris-Acetat pH 7,5 100 mM Magnesium-Acetat 220 mM NH4Cl 10 mM EDTA 10 mM β-Mercaptoethanol 2.8.2 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität mit p-Nitrobenzylidinaminoguanidin (NBAG) Zur Bestimmung der KM und Vmax Werte von gpModA wurde die photometrische Methode von SOMAN et al. (1983) angewendet. Dabei wurde die ADP-Ribosylierung von NBAG (2.8.2.1) durch die kontinuierliche Absorptionszunahme bei 370 nm über einen Zeitraum von einer Stunde bei RT gemessen. Eine Änderung der Absorption um 0,1 Einheiten entspricht dabei einer Menge von 5 x 10-2 µmol Produkt in 1 ml Reaktionsansatz. Die allgemeine Zusammensetzung der Reaktionsgemische ist Tabelle 2.4 zu entnehmen. Tabelle 2.4: Allgemeine Zusammensetzung des NBAG-Tests. 0,4 M Tris-Acetat pH 7,4 160 mM DTE ADP-Ribosyltransferase A. dest. 25 mM NAD+ 20 mM NBAG in 36 mM DTE A. dest. 50 µl 200 µl 30 – 100 µg ad 400 µl für 10 – 30 min vorinkubieren 0 – 400 µl 0 – 20 µl ad 1000 µl 38 Material und Methoden 2.8.2.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) Das p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin wurde in Anlehnung an das Protokoll von BAIOCCHI et al. (1963) für die Synthese von Guanylhydrazone hergestellt. Eine 0,11 M Lösung von Aminoguanidin Bicarbonat (in 125 ml A. dest.) wurde mit HCl angesäuert (pH 5 – 6) und auf 60° C erwärmt. Eine gleiche molare Menge p-Nitrobenzaldehyd (in 100 ml Ethanol) wurde unter Rühren zugegeben und 16 Stunden bei RT weiter gerührt. Die Feststoffe wurden in einem Rotationsverdampfer gesammelt und in Ethanol bei 60° C bis zur Sättigungsgrenze gelöst. Die bei der Abkühlung entstandenen Kristalle stellten das gewünschte NBAG dar (Rekristallisation). Abb. 2.6 gibt die Strukturformeln der eingesetzten Chemikalien wieder, sowie deren Farbgebungen in Lösung. O O NH HO OH H2N N O O p-Nitrobenzaldehyd (in Lösung gelb) N H NH2 Aminoguanidin Bicarbonat (in Lösung klar) NH O N N O N H NH2 p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) (in Lösung rötlich) Abb. 2.6 Strukturformeln von p-Nitrobenzaldehyd, Aminoguanidin Bicarbonat und dem synthetisiertem p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin, sowie deren Farbgebung in Lösung. 2.9 Transkriptionsversuche Für die Transkriptionsversuche wurde die von U. Aschke-Sonnenborn nach der Methode von BURGESS & JENDRISAK (1975) isolierte E. coli RNA-Polymerase eingesetzt. Um Veränderungen im Transkriptionsverhalten der unveränderten und durch ModA modifizierten E. coli RNA-Polymerase festzustellen wurden Transkriptionsversuche unternommen. Für die Versuche wurden pKWIII Plasmide mit dem artifiziellen Promotor ptac und den frühen T4-Promotoren p8.182 und p13.149 verwendet. Außerdem wurde die 39 Material und Methoden Transkription von genomischer T4-Wildtyp DNA (isoliert von U. Aschke-Sonnenborn) und genomischer E. coli DNA (isoliert mit NucleoSpin C+T) untersucht. 2.9.1 Transkription von pKWIII Plasmiden Die in vitro Transkription von den pKWIII Plasmiden erfolgte in Form einer zeitabhängigen Kinetik. Dazu wurden 7,2 pmol Gesamtvektor bzw. 0,36 pmol der über PvuII herausgeschnittenen Promotoren verwendet. Die Transkription erfolgte über 60 min bei RT in einem 500 µl Ansatz (Tabelle 2.5) wobei nach 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 und 60 min je ein Aliquot von 50 µl des Ansatzes mit 150 µl 20 mM EDTA gestoppt wurde. Um den Einfluß von ModA auf die Transkription zu untersuchen wurde 10 min nach dem Reaktionsstart ModA zum Ansatz zugegeben. Die einzelnen Aliquots wurden anschließend auf DE81 Filter (Whatman) gesaugt und diese 3 mal in 0,5 M NaH2PO4, pH 7,0 gewaschen (pro Filter 5 ml). Zur Bestimmung der eingebauten Radioaktivität wurden die getrockneten Filter in 5 ml Szintilationsflüssigkeit gegeben und die Radioaktivität auf den Filtern in einem Szintilationszähler bestimmt. Tabelle 2.5: Allgemeiner Reaktionsansatz für die in vitro Transkription von pKWIII Plasmiden. pKWIII Plasmid bzw. Promotorfragment 7,2 pmol 0,36 pmol 10 x RNA-Polymerase-Puffer 50 µl RNase-Inhibitor (50 U/µl) 50 U ADP-Ribosyltransferase ModA + NAD (25 mM) 5 µl E. coli RNA-Polymerase 0,36 pmol (173 ng) ad 420 µl A. dest. 3 NTP-Mix (ATP, CTP, GTP) (je 5 mM) UTP (1 mM) 32 α P-UTP (10 µCi/µl) 10x RNA-Polymerase-Puffer 400 mM Tris-HCl pH 8,0 100 mM MgCl2 500 mM KCl 5 mM DTT 0,5 mg/ml RSA 10 – 500 ng 40 µl 37,5 µl 2,5 µl Szintilationsflüssigkeit 5 g 2,5-Diphenyloxazol (PPO) 0,22 g 1,4-Bis(5 phenyl-2 oxazoyl) benzen (POPOP) 1 Liter Toluol ad 40 Material und Methoden 2.9.2 Transkription von genomischer DNA Die Transkriptionsversuche von genomischer DNA erfolgten mit isolierter E. coli RNAPolymerase und mit löslichen Gesamtzellextrakten. Für die löslichen Gesamtzellextrakte wurden E. coli Zellen unter induzierten Bedingungen mit den Plasmiden pET16b(+) (Kontrolle), p16modA7 (gpModA) und pTKRI (gpAlt) bis zu einer OD590 von 0,65 bei 37° C auf einem Schüttler angezogen. Durch die Anzucht der Bakterien unter induzierten Bedingungen sollte die E. coli RNA-Polymerase durch die Genprodukte ModA bzw. Alt ADP-ribosyliert vorliegen. Die Reaktionen erfolgten in 50 µl Ansätzen, deren allgemeine Zusammensetzung der Tabelle 2.6 zu entnehmen ist. Die Transkription erfolgte für 30 min bei 37° C und wurde anschließend mit 150 µl 20 mM EDTA gestoppt. Die Ansätze wurden auf DE81 Filter (Whatman) gesaugt und wie unter 2.9.1 beschrieben weiter behandelt. Tabelle 2.6: Allgemeiner Reaktionsansatz für die Transkription von genomischer DNA. T4-Wildtyp DNA bzw. E. coli DNA 2 µg 10 x RNA-Polymerase-Puffer (2.9.1) 5 µl RNase-Inhibitor (50 U/µl) 10 U NAD+ (25 mM) 0,5 µl RNA-Polymerase bzw. 60 - 173 ng löslicher Proteinrohextrakt 30 – 110 µg A. dest. 3 NTP-Mix (ATP, CTP, GTP) (je 5 mM) ad 42 µl 4 µl UTP (1 mM) 3,75 µl α32P-UTP (10 µCi/µl) 0,25 µl 41 Ergebnisse 3 Ergebnisse Nach den „Threading-Experimenten“ sollten die beiden unbekannten Leserahmen für ADP-Ribosyltransferasen kodieren. Es soll an dieser Stelle vorweggenommen werden, daß sich im Laufe der Arbeit gezeigt hat, daß beide Polypeptide ADP-Ribosyltransferasen sind. Dabei kodiert der zweite Leserahmen für die bereits bekannte ADP-Ribosyltransferase Mod, die nun als ModA bezeichnet wird. In Anlehnung daran wurde das zweite Protein als ModB bezeichnet (Abb. 3.1). N d eI E c o R I H in dIII m o d A (20 0 a a , 2 3.3 k D a) m o d B (20 7 a a , 2 4.2 k D a) 1 2 .5 1 3 k b 1 3 .1 3 3 k b P 1 3 .1 49 Abb. 3.1 11 .9 1 3 k b ATGA P 11 .8 1 5 Anordnung der Leserahmen von modB und modA zwischen den Promotoren P13.149 und P11.815. Die Angaben in kb entsprechen den Positionen auf der genomischen Karte des T4. 3.1 Computergestützte Auswertung der Proteinsequenzen von ModA und ModB Die folgenden Angaben über die rekombinanten Proteine ModA, His-ModA, ModB und His-ModB wurden mit dem Programm Protean aus dem DNAStar Paket ermittelt. A B His-ModA Analyse 20 40 60 80 100 120 His-ModB Analyse 140 160 180 200 220 20 Faktor Xa (Protease) 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Faktor Xa (Protease) A Alpha, Regionen - Chou-Fasman A Alpha, Regionen - Chou-Fasman B Beta, Regionen - Chou-Fasman B Beta, Regionen - Chou-Fasman T Turn, Regionen - Chou-Fasman T Turn, Regionen - Chou-Fasman A Alpha, Regionen - Garnier-Robson A Alpha, Regionen - Garnier-Robson B Beta, Regionen - Garnier-Robson B Beta, Regionen - Garnier-Robson T Turn, Regionen - Garnier-Robson T Turn, Regionen - Garnier-Robson C Coil, Regionen - Garnier-Robson C Coil, Regionen - Garnier-Robson 3 0 3 Hydrophobizitäts Plot - Hopp-Woods -3.4 G hydrophobe Regionen - Hopp-Woods hydrophile Regionen - Hopp-Woods G hydrophobe Regionen - Kyte-Doolittle W 0 hydrophile Regionen - Hopp-Woods Hydrophobizitäts Plot - Kyte-Doolittle G hydrophobe Regionen - Kyte-Doolittle 4.5 Hydrophilizitäts Plot - Kyte-Doolittle -4.5 Abb. 3.2 Hydrophilizitäts Plot - Hopp-Woods -4.5 4.5 W hydrophobe Regionen - Hopp-Woods 4.5 Hydrophobizitäts Plot - Kyte-Doolittle -4.5 0 0 -3.4 4.5 0 G 3 Hydrophilizitäts Plot - Hopp-Woods -3.4 W Hydrophobizitäts Plot - Hopp-Woods -3.4 3 0 0 0 Hydrophilizitäts Plot - Kyte-Doolittle -4.5 hydrophile Regionen - Kyte-Doolittle W hydrophile Regionen - Kyte-Doolittle Vorhersagen über die Sekundärstrukturen und die Verteilung hydrophober und hydrophiler Bereiche innerhalb der Proteine His-ModA (A) und His-ModB (B). Dargestellt sind die Verteilungen dieser Regionen über die Aminosäurekette nach den Algorithmen von CHOU & FASMAN (1978), GARNIER & ROBSON (1978), HOPP & WOODS (1981) sowie KYTE & DOOLITTLE (1982). 42 Ergebnisse Außerdem weisen beide Proteine noch eine potentielle Glykosylierungsstelle auf. Bei ModA liegt diese bei Aminosäure Leu34 und bei ModB bei Aminosäure Tyr131. Tabelle 3.1: Einige wichtige Eckdaten der Proteine ModA, His-ModA, Trx-ModA, ModB und His-ModB. ModA His-ModA Trx-ModA Molekulargewicht: 23.349,50 Da 25.947,10 Da 41.434,10 Da Länge in Aminosäuren: 200 222 366 1 A280 = 0,95 mg/ml 1,12 mg/ml 1,07 mg/ml isoelektrischer Punkt: 6,04 6,53 5,95 Ladung bei pH 7,0: - 2,49 - 3,49 -11,04 ModB His-ModB 24.244,5 Da 207 0,94 mg/ml 5,31 - 7,16 26.766,10 Da 228 1,04 mg/ml 6,41 - 5,16 Die Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz von ModA und ModB beträgt 25 % identische bzw. 47 % homologe Aminosäuren (Abb. 3.3). Abb. 3.3 3.2 Alignment der Aminosäuresequenzen von ModA und ModB. Es werden 25 % identische und 47 % homologe Aminosäuren gefunden. (nach CuraBLASTP über den Curatools Server (ALTSCHUL et al., 1990)) Klonierung der beiden offenen Leserahmen zwischen den T4 Promotoren p11.815 und p13.149 3.2.1 Klonierungsversuche in die Vektoren pBluescript II KS/SK Zur Klonierung der beiden offenen Leserahmen wurden die Gene einzeln über eine PCR aus dem T4 Genom amplifiziert (2.6.3). Die benutzten Primer enthielten zur gerichteten Klonierung in die Vektoren entsprechende Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen. Die Klonierung der Gene sollte zum Einen in Richtung des lacZ-Gens und zum Anderen entgegen der Leserichtung von lacZ erfolgen. Keiner dieser Klonierungsversuche war erfolgreich, was zu der Überzeugung führte, daß beide Genprodukte eine toxische Wirkung auf E. coli haben müssen, zumal es kein Problem darstellte Teilsequenzen bis 2/3 der Gene 43 Ergebnisse in diese Vektoren zu klonieren. Da die pBluescript Vektoren von der E. coli RNAPolymerase gut abgelesen werden können (Blau/Weiß-Selektion) zeigen sie eine hohe Transkriptionsrate der lacZ Region. Versucht man hier ein Gen zu klonieren, dessen Genprodukt toxisch ist, wird dieses sofort transkribiert und translatiert, so daß es zu keiner Vermehrung der Bakterien kommt. Aus diesem Grund sollten die nächsten Klonierungsversuche mit Expressionsvektoren durchgeführt werden, deren klonierte Gene unter der Kontrolle eines T7 Promotors stehen, der nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird. Eine weitere Option war es, ein Fusionsprotein zu generieren. Es bestand die Möglichkeit, daß durch die Fusion mit einem anderen Protein die Toxizität der beiden Zielproteine stark eingeschränkt sein könnte. 3.2.2 Klonierungsversuche in die Vektoren pT7-5 und pT7-6 Die Amplifikation der beiden Gene erfolgte wieder unabhängig voneinander mittels PCR. Für die gerichtete Klonierung waren ebenfalls Restriktionsschnittstellen durch die Primer eingefügt worden. Da vor dem zu exprimierenden Gen der T7 Promotor Φ10 liegt, und dieser nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird, bestand Hoffnung, die Gene kloniert zu bekommen. Letzten Endes erwiesen sich die Vektoren pT7-5 bzw. pT7-6 aber auch nicht als geeignet für die Klonierung der beiden Gene. Die „Low-Level“ Expression in diesen Vektoren ist anscheinend zu hoch. Bei TOMASCHEWSKI (1988) führte die Einführung einer Struktur zur Transkriptionstermination (poly(dA)•poly(dT)) in den Vektor pT7-6 zum Erfolg der Klonierung von Gen 49 (Endonuklease VII) aus dem Bakteriophagen T4. SHIGESADA & IMAI (1982) haben gezeigt, daß eine poly(dA)•poly(dT) Abfolge mit poly(dA) in 5'→3' Richtung in Gegenwart von ρ (Roh) die Transkription um 64 % hemmt. Deshalb sollte ebenfalls versucht werden durch die Einführung einer solchen Struktur zur Transkriptionstermination die Klonierung der Gene zu ermöglichen. Dazu wurde in der PvuII Schnittstelle der Vektoren pT7-5 und pT7-6, die direkt vor dem Φ10 Promotor liegt, eine poly(dA)•poly(dT) Sequenz eingefügt. Dafür wurde poly(dA)•poly(dT) DNA (Sigma) mit Ultraschall behandelt und Fragmente von 100 bis 300 bp aus einem Agarosegel isoliert (2.6.6), die Fragmente mit S1-Nuklease behandelt und in die mit PvuII geschnittenen und dephosphorylierten Vektoren ligiert. Nach einer Restriktionsanalyse auf inserierte poly(dA)•poly(dT) DNA wurde durch Sequenzierung die Orientierung dieser DNA ermittelt. Die Sequenzierung einzelner Klone ergab, einen Einbau von 80 bis 130 bp 44 Ergebnisse poly(dA)•poly(dT). Die Klone mit der passenden poly(dA) Orientierung wurden für die weiteren Klonierungsexperimente verwendet (Klone mit Richtiger Orientierung von poly(dA): pT7-5AT7, 9, 10, 11, 16, pT7-6AT11). Die Klonierung der beiden Gene in die neu generierten pT7-xAT Vektoren gelang allerdings nicht, was dafür spricht, daß die Transkriptionstermination durch poly(dA)•poly(dT) nicht effektiv genug ist und eine „Low-Level“ Transkription der beiden Gene immer noch letal für E. coli ist. 3.2.3 Klonierungsversuche in den Vektor pGEX-3X Eine andere Idee die Toxizität der Genprodukte zu unterbinden war es ein Fusionsprotein zu generieren. Es bestand Hoffnung, daß durch die Fusion mit der Glutathion S-Transferase (GST, 27 kDa) die beiden Mod Proteine (24 kDa bzw. 23 kDa) ihre Toxizität nicht mehr entfalten können. Dazu wurde der Expressionsvektor pGEX-3X verwendet, dessen Expression von dem tac-Promotor kontrolliert wird. Die Gene sollten über die SmaI Schnittstelle des Vektors in den Leserahmen für die GST kloniert werden. Die Klonierung der beiden Gene in diesen Vektor war ebenfalls nicht möglich. Anscheinend ist das GST-Fusionsprotein auch toxisch und die „Low-Level“ Expression unter nicht induzierten Bedingungen von dem induzierbaren tac-Promotor immer noch zu hoch, was eine Beeinträchtigung des Wachstums von E. coli bewirken könnte. 3.2.4 Klonierungsversuche in die pET-Vektoren Die Expression von pET-Vektoren unterliegt einer sehr stringenten Kontrolle (2.5.3.3). Die Zielgene stehen wie bei den pT7-x Vektoren unter der Kontrolle eines starken Bakteriophagen T7 Promotors. Direkt hinter dem T7 Promotor befindet sich allerdings als zusätzlicher Transkriptionsschutz der lac Operator, so daß in diesen Vektoren unter nicht induzierten Bedingungen die Transkription vollständig unterdrückt sein sollte. Vektor pET-11d Die Gene sollten zuerst in den Vektor pET-11d kloniert werden, da hier die Proteine in ihrer ursprünglichen Form ohne größere Modifikation (z.B. Fusion mit anderen Aminosäuren) exprimiert werden können. Die Gene modA und modB wurden mittels PCR amplifiziert (Primer: modAAnf – modAEndBam bzw. modBAnf – modBEndBam (2.4.2)). Die verwendeten Primer enthielten die Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme NcoI und BamHI, um die PCR-Produkte gerichtet in den Vektor pET-11d zu klonieren. 45 Ergebnisse Nach erfolgter Transformation in XL1-Blue wurden von einigen Transformanden die Plasmide isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen. Zur Identifizierung von einklonierten modA wurde mit EcoRI und zur Identifizierung von modB mit HindIII die DNA hydrolysiert. erwartete Fragmente nach EcoRI-Hydrolyse pET-11d p11modAB 5674 bp 5676 bp 578 bp erwartete Fragmente nach HindIII-Hydrolyse pET-11d p11modBB 5674 bp 5729 bp 578 bp Wie sich zeigte, ist die Transkriptionskontrolle der pET-Vektoren stringent genug, um die Gene modA bzw. modB zu klonieren. Es wurden die Plasmide p11modAB3 (pET11d, modA über NcoI und BamHI 3. Klon) und p11modBB5 (pET11d, modB über NcoI und BamHI 5. Klon) erhalten (Abb. 3.4). Bam HI Pvu II Eco RI Nde I Pvu II Nsi I Nco I Xba I Bgl II Eco RV Rsa I Hin dIII Bsp 106I Cla I Eco RI modA T7 Promotor Amp Nco I Xba I Bgl II Hin cII ScaI Rsa I Pvu I Pst I Bam HI Rsa I Rsa I Hin dIII Spe I modB T7 Promotor lacI Bss HII Eco RV Hin cII Pvu II Pvu II Abb. 3.4 6254 bps Rsa I Apa I pBR322 Eag I Amp Hin cII ScaI Rsa I Pvu I PstI p11modBB p11modAB Rsa I Apa I Eco RV Rsa I Hin dIII Bsp 106I Cla I EcoRI Rsa I Acc I Pvu II lacI 6307 bps pBR322 Bss HII Eco RV Hin cII Pvu II Pvu II Eag I Rsa I Acc I Pvu II Vektorkarten von p11modAB und p11modBB. Vektor pET-16b(+) Um die rekombinanten Proteine ModA und ModB schnell und einfach zu isolieren, wurden die entsprechenden Gene in den Vektor pET-16b(+) kloniert. Dieser Vektor erlaubt die Fusion rekombinanter Proteine mit einem N-terminalen „His-Tag“ aus 10 Histidinen. Das Gen modA wurde wegen einer internen NdeI Schnittstelle über BamHI (Primer: modABam - modAEndBam (2.4.2)) und das Gen modB über NdeI und BamHI (Primer: modBNde - modBEndBam (2.4.2)) so in den Vektor pET-16b(+) kloniert, daß ein Nterminales Fusionsprotein mit „His-Tag“ entstand. Nach erfolgter Restriktionsanalyse (wie bei pET-11d) erhielt man die Klone p16modA7 und p16modB1 (Abb. 3.5). 46 Ergebnisse Bei der Klonierung von modA hätte das Gen in zwei möglichen Orientierungen in den Vektor eingebaut werden können (Klonierung nur über eine Schnittstelle). Bei den Restriktionsanalysen von ca. 20 Klonen fand sich aber kein Klon mit einer inversen Orientierung des Gens, was evtl. dafür spricht, daß das Gen in inverser Orientierung abgelesen werden konnte und die Toxizität von gpModA zu tragen kam. Eco RI Hin dIII Rsa I Eco RV Bam HI Pvu II Eco RI Nde I Pvu II Nsi I Bam HI Xho I Nde I Nco I Xba I Bgl II His-modA Ssp I Hin cII Sca I Rsa I Pvu I Pst I Amp Eco RI Hin dIII Rsa I Eco RV Bam HI Rsa I Rsa I Hin dIII Ssp I Spe I Nde I Nco I Xba I His-modB Bgl II T7 Promotor Rsa I Abb. 3.5 6370 bps pBR322 Rsa I Acc I Pvu II Eag I Amp p16modB lacI Bss HII Eco RV Hin cII Pvu II Pvu II Hin cII Sca I Rsa I Pvu I Pst I T7 Promotor p16modA 6320 bps Ssp I Rsa I pBR322 lacI Bss HII Eco RV Hin cII Pvu II Pvu II Rsa I Acc I Pvu II Eag I Vektorkarten von p16modA und p16modB. Vektor pET-22b(+) Um das toxische gpModB aus dem Cytoplasma zu entfernen, wurde modB in den Vektor pET-22b(+) über NcoI und BamHI kloniert (Primer: modBAnf – modBEndBam (2.4.2)) es entstand der Vektor p22modBB2 (Abb. 3.6). Dieser Vektor besitzt die „pelB LeaderSequenz“ für den Proteinexport in den periplasmatischen Raum. Auf eine Klonierung von modA in diesen Vektor wurde verzichtet (3.8.3). 47 Ergebnisse Xho I Eco RV Eag I Nco I Not I Rsa I Hin dIII Rsa I Sal I Hin dIII Hin cII Spe I Acc I Nco I Sac I Nde I Eco RI Xba I modB Bam HI Bgl II pelB leader T7-Promotor Amp Rsa I Pvu I Pst I p22modBB 6158 bps lacI Rsa I Apa I Bss HII Eco RV Hin cII Pvu II Pvu II Abb. 3.6 pBR322 Rsa I Acc I Pvu II Vektorkarte von p22modBB. Vektor pET-32a(+) Die rekombinanten Mod-Proteine werden ausschließlich als Einschlußkörper exprimiert. Um dem entgegenzuwirken sollten N-terminale Thioredoxin (Trx)-Fusionsproteine generiert werden. Dazu wurde das Gen modA nach einer PCR (Primer: modANcoIAnf – modAXhoIEnd (2.4.2)) über NcoI und XhoI in den Vektor pET-32b(+) kloniert. Die Restriktionsanalyse erfolgte mit PvuII. erwartete Fragmente nach PvuII-Hydrolyse pET-32a(+) p32modA 4807 bp 2939 bp 2132 bp 999 bp 999 bp 282 bp 93 bp 93 bp Als exemplarisches Beispiel einer dreifachen Restriktionskontrolle auf das korrekt klonierte Gen dient Abb. 3.7. Für die Analyse wurden die Restriktionsschnittstellen so ausgewählt, daß sie zum Einen in dem zu klonierenden Gen und zum Anderen auf dem Vektor lagen (hier NdeI bzw. PvuII, siehe auch Abb. 3.8). Des weiteren wurde das Insert über die Klonierungsstellen wieder herausgeschnitten (hier NcoI und XhoI). 48 Ergebnisse Abb. 3.7 Restriktionsanalyse des Klones p32modA2 auf einem 0,8 %igen Agarosegel. Erwartete Fragmentgrößen nach Restriktion mit NdeI: 5673 bp, 427 bp, 345 bp; PvuII: 2939 bp, 2132 bp, 999 bp, 282 bp, 93 bp (aufgrund der geringen Größe nicht zu sehen); NcoI+XhoI: 5846 bp, 599 bp. Als Größenstandard dienten eine 100 bp Leiter Plus (links) und λ/EcoRI+HindIII (rechts). Nach erfolgter Expression erhielt man ein Fusionsprotein mit folgendem Aufbau: Trx6His-ModA-6His also ein Trx-Fusionsprotein mit einem internen und einem C-terminalen „His-Tag“. Abb. 3.8 gibt die Karte des so generierten Vektors p32modA wieder. Wahrscheinlich auf Grund der hohen Expressionsrate wurde das Trx-Fusionsprotein aber immer noch als Einschlußkörper exprimiert (3.8.5). 49 Ergebnisse Xho I Pvu II Eco RI Nde I Pvu II I Nsi Nco I Kpn I Bgl II Nde I Xmn I Cla I Nde I Trx-ModA Xba I Cla I Xmn I Sca I Pvu I Pst I amp T7 Promotor p32modA 6445 bps lacI pBR322 Apa I Bss HII Hin cII Pvu II Pvu II Abb. 3.8 Acc I Pvu II Xmn I Vektorkarte von p32modA. 3.2.5 Klonierungsversuche in den Vektor pBAD/HisB Um die Bildung von Einschlußkörpern zu vermeiden, wurde versucht von der starken Expression, von dem T7 Promotor aus, wegzukommen. Hierfür bot sich der Vektor pBAD/HisB an. Die Expression klonierter Gene aus dem Vektor pBAD/HisB steht unter der Kontrolle des regulierbaren, Dosis abhängigen Promotors PBAD. Je nach verabreichter Menge L-Arabinose kann hier die Genexpression von schwach bis stark reguliert werden. Außerdem konnte mit diesem Vektor auch eine Fusion mit einem N-terminalen „His-Tag“ erreicht werden. Das Gen modA wurde mit dem Primerpaar modAAnfXhoI – modAEndHindIII (2.4.2) amplifiziert und über die Schnittstellen XhoI und HindIII in den Vektor pBAD/HisB kloniert. Die Restriktionsanalyse erfolgte mit RsaI. erwartete Fragmente nach RsaI-Hydrolyse pBAD/HisB pBADmodA 1565 bp 1565 bp 1464 bp 957 bp 957 bp 848 bp 663 bp 663 bp 44 bp 17 bp 17 bp Dieser Vektor erwies sich ebenso wie die pET-Vektoren als genügend stringent reguliert, um die Aufnahme des modA Gens zu tolerieren. Man erhielt somit das Plasmid 50 Ergebnisse pBADmodA2 (Abb. 3.9). Das Gen modB wurde von F. KAISER im Rahmen seiner Diplomarbeit (1999) in diesen Vektor kloniert. Rsa I Rsa I Eco RV araC Afl III Bam HI Nco I Nhe I Rsa I Bam HI Xho I Nsi I pBAD Pvu II Nde I Eco RI His-modA Nsi I pBADmodA Acc I Rsa I Nde I Afl III Pvu II Hin dIII 4666 bps ColE1 amp Hin cII Sca I Rsa I Pvu I Abb. 3.9 Vektorkarte von pBADmodA. Sämtliche Klone wurden durch Sequenzierung auf Fehler hin überprüft, die bei der PCR oder beim Klonieren der Gene aufgetreten sein könnten. Dabei erwiesen sich alle Klone bis auf p11modAB3 als fehlerfrei. Der Klon p11modAB3 weist eine Punktmutation im modA Gen an der Stelle Met125 auf. Hier ist das entsprechende Codon ATG zu AAG verändert, was einen Aminosäureaustausch von Methionin nach Lysin (Met125→Lys) bewirkt. Aktivitätstests und Vergleiche mit dem Ribosylierungsmuster von His-ModA konnten aber zeigen, daß diese Mutation keinen deutlichen Einfluß auf die Aktivität bzw. auf das Erkennungsmuster von Zielproteinen hat. 3.3 Anzucht von Transformanden in Gegenwart von ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren Bei den Klonierungsexperimenten mit den Vektoren pBluescript II KS/SK, pT7-x und pGEX-3X wurden den Selektivagarplatten teilweise die ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren 3-Methoxybenzamid bzw. 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion in Konzentrationen von 2 mM zugesetzt. Diese Inhibitoren sollten die ADP-Ribosylierung von Wirtsproteinen verhindern und somit den Klonierungserfolg in diese Vektoren ermöglichen. Diese Maßnahme führte allerdings zu keinem Erfolg, sei es, daß die Substanzen nicht von den Bakterien aufgenommen wurden, sie abgebaut oder nicht spezifisch genug für ModA bzw. ModB waren. 51 Ergebnisse 3.4 Identifizierung des Mod-Proteins, das die E. coli RNA-Polymerase modifiziert Die ersten Überexpressionsversuche aus den Vektoren p11modAB3 und p11modBB5 wurden mit dem Phagen λCE6 durchgeführt (3.5.1.1). Nach der Überexpression lag der größte Teil der exprimierten Proteine als Einschlußkörper, also in einer inaktiven Form, vor. Da aber zu erwarten war, daß ein geringer Prozentsatz als lösliches und somit aktives Protein vorhanden war, wurden die ersten Aktivitätstests nach ROHRER et al. (1975) (2.8.1) mit löslichen Proteinüberständen einer Expressionskultur durchgeführt. Dazu wurden 300 µg löslicher Proteinrohextrakt mit 35 µg gereinigter E. coli RNAPolymerase in Gegenwart von 32 P-NAD+ inkubiert, auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und das mit Coomassie Brillantblau gefärbte und getrocknete Gel auf einem Röntgenfilm exponiert (Abb. 3.10). Nach Auswertung des Autoradiogramms konnte das zweite Protein des Leserahmens (hier schon als ModA bezeichnet) als dasjenige identifiziert werden, das die E. coli RNA-Polymerase modifiziert. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß das andere Protein (bereits als ModB bezeichnet), wie von BAZAN & KOCH-NOLTE (1997) vorhergesagt, ebenfalls eine ADP-Ribosyltransferase ist. Da nun bekannt war, daß ModA (definiert als „A“, da dieses Protein zuerst in der Literatur als Mod beschrieben wurde) die E. coli RNA-Polymerase modifiziert, wurde verstärkt an diesem Protein weitergearbeitet. Abb. 3.10 SDS-Polyacrylamidgel (links) und Autoradiogramm (rechts) der ADPRibosylierung von RNAP und löslicher Proteine mit löslichen Rohextrakten einer Überexpression von ModA und ModB. An der rechten Seite sind die Lauffronten von den Untereinheiten der RNAP wiedergegeben. 52 Ergebnisse 3.5 Überexpression von Mod Im Allgemeinen gestaltete sich die Überexpression der Genprodukte ModA und ModB auf Grund ihrer Toxizität als schwierig. Teilweise neigten die Kulturen der DE3-Stämme dazu, vor der Induktion der Expression, zu lysieren und Phagen freizusetzen. Um mit weniger toxisch wirkenden Proteinen zu arbeiten wurden im Laufe dieser Arbeit Mutanten beider Proteine hergestellt (3.11). 3.5.1 Überexpression aus pET-Vektoren 3.5.1.1 Überexpression mit λCE6 Da die Genprodukte ModA und ModB sehr toxisch für E. coli sind, wurden die ersten Überexpressionen mit einem λ–Phagen, der das Gen für die T7 RNA-Polymerase trägt (λCE6) (STUDIER & MOFFATT, 1986) durchgeführt (2.5.3.1). Die Induktion der Überexpression von selbst hergestellten Phagenstocklösungen erwies sich allerdings als ineffektiv, so daß für die Überexpression Bakterienstämme eingesetzt wurden, die den λ-Phagen DE3 lysogen im Genom tragen (3.5.1.3). 3.5.1.2 Überexpression mit mGP1-2 Eine Alternative die T7 RNA-Polymerase in die Wirtsbakterien zu bekommen ist der M13Phage mGP1-2 (STUDIER & MOFFATT, 1986) (2.5.3.2). Mit diesem Phagen ließ sich in F' Bakterien aber keine Überexpression der gewünschten Genprodukte ModA bzw. ModB erzielen. 3.5.1.3 Überexpression aus DE3 Stämmen Zur erfolgreichen Überexpression von gpModA und gpModB wurden DE3 Stämme eingesetzt (2.5.3.3). Diese E. coli Stämme enthalten den λ-Phagen DE3 lysogen im Genom, er trägt das lacI Gen, den lacUV5 Promotor und das Gen für die T7 RNAPolymerase. Zum Einsatz kamen die E. coli Stämme BL21(DE3), BLR(DE3), C41(DE3) und C43(DE3), die zum Teil das Plasmid pLysS beinhalteten. Dieses Plasmid kodiert für das T7 Lysozym, einem natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase und sollte deshalb eine stringentere Kontrolle vor Induktion der Überexpression gewährleisten. Abb. 3.11 zeigt als 53 Ergebnisse Beispiel eine Überexpression aus p16modA7 in E. coli BL21(DE3), der zusätzlich das Plasmid pLysS enthielt. Abb. 3.11 Überexpression von His-ModA (p16modA7) in BL21(DE3) pLysS. Spur 1: 10 kDa-Leiter Spur 2: Rohextrakt von Zellen kurz vor der Induktion Spur 3: Rohextrakt von Zellen 3 Stunden nach Induktion mit 1 mM IPTG Trotz der stringenten Expressionskontrolle hat der mit den Plasmiden p16modA7 oder p16modB1 transformierte Bakterienstamm BL21(DE3) unter nicht induzierten Bedingungen einen deutlichen Wuchsnachteil (Abb. 3.12), der auf die klonierten Gene modA bzw. modB zurückzuführen ist . 2,5 2 1,5 OD590 BL21 (DE3) pET16b(+) p16modB1 p16modA7 1 0,5 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Stunden Abb. 3.12 Wuchskurven von BL21(DE3) mit den Plasmiden pET16b(+), p16modA7 (ModA) oder p16modB1 (ModB). 54 Ergebnisse Der Plasmidstabilitätstest (2.5.4.1) zeigte immer zuverlässig an, ob eine Überexpression von ModA oder ModB stattgefunden hatte oder nicht. Wuchsen auf den LB-Agarplatten mit 1 mM IPTG sehr viele Kolonien, vergleichbar mit der LB-Amp-Agarplatte, konnte auf einem SDS-Polyacrylamidgel auch keine Überexpression nachgewiesen werden. Fanden sich auf der IPTG-haltigen Platte im Vergleich mit der LB-Amp-Agarplatte wenige Kolonien (2 - 6%) wurden die rekombinanten Proteine auch immer überexprimiert. Im Verlauf der Überexpression von gpModA oder gpModB kam es zur Bildung von Einschlußkörpern. Abb. 3.13 zeigt exemplarisch die Überexpression und die Isolation der Einschlußkörper von der Mutante His-ModA-R72K aus dem Vektor p16modA7-R72K. In Abb. 3.14 ist aus einer typischen Überexpression aus p16modA7 der Anteil des überexprimierten Proteins His-ModA vom Gesamtproteingehalt bestimmt worden. Die densitometrische Auswertung dieser Gelspur mit dem Programm Tina2.09 ergab einen Anteil des rekombinanten Proteins von ca. 40 % der Gesamtproteinmenge. 1 2 3 4 5 6 68 kDa 25 kDa 14,4 kDa Abb. 3.13 Überexpression aus p16modA7-R72K in BLR(DE3) pLysS und Isolation der Einschlußkörper. Spur 1: Größenstandard (RSA, 68 kDa; α-Chymotrypsin, 25 kDa; Lysozym, 14,4 kDa); Spur 2: Gesamtzellextrakt; Spur 3: lösliche Proteine; Spur 4: Sediment; Spur 5: Überstand nach waschen der Einschlußkörper; Spur 6: gereinigte Einschlußkörper. 55 Ergebnisse Abb. 3.14: Überexpression von His-ModA und densitometrisches Profil über die Gelspur. Da die rekombinanten „His-Tag“-Proteine als Einschlußkörper exprimiert wurden, fand die Reinigung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen statt (2.7.3.1, 3.6). 3.5.2 Überexpression aus dem Vektor pBAD Die Expressionsversuche von ModA aus dem Vektor pBAD erfolgten nach Angaben des Herstellers mit L-Arabinose wie unter 2.5.3.4 beschrieben. Selbst bei 0,2 % Arabinose Endkonzentration kam es aber zu keiner erkennbaren Expression des Zielproteins, obwohl der Promotor bereits mit 0,004 % Arabinose (Angabe des Herstellers) induziert werden kann. Die gleichen Ergebnisse lieferten die Expressionen der Mutanten ModA-R72K (aus pBADmodA2-R72K) und ModA-E165D (aus pBADmodA2-E165D). An Hand einer Wuchskurve (Abb. 3.15) zeigte sich, daß ModA bei einer Arabinosekonzentration von 0,2 % wahrscheinlich exprimiert wurde, wenn auch in sehr geringen Mengen, da hier ein deutlicher Wuchsnachteil bei pBADmodA2 in LMG194 gegenüber dem induzierten pBAD/HisB in LMG194 zu verzeichnen ist. 56 Ergebnisse 1,8 1,6 1,4 OD590 1,2 pBAD/HisB 0% pBAD/HisB 0,2 % pBADmodA2 0 % pBADmodA2 0,2 % 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Stunden Abb. 3.15 Wuchskurven von LMG194 mit den Vektoren pBAD/HisB und pBADmodA2 unter nicht induzierten und induzierten (0,2 % Arabinose) Bedingungen. Die %-Angaben in der Legende beziehen sich auf die Arabinosekonzentration. 3.6 Reinigung von ModA unter denaturierenden Bedingungen Die rekombinanten Proteine His-ModA und His-ModB aus den Vektoren p16modA7 bzw. p16modB1 wurden als Einschlußkörper exprimiert (Abb. 3.13) und lagen somit als inaktive Formen dieser Proteine vor. Diese Einschlußkörper wurden wie unter 2.5.5 beschrieben isoliert und im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl aufgelöst. Aus einer 500 ml Überexpressionskultur erhielt man, je nachdem wie gut die Expression war, ca. 80 – 250 mg isolierte Einschlußkörper. Die denaturierten Proteine wurden anschließend an eine Ni-NTA Säulenmatrix gebunden und durch schrittweise Verringerung des denaturierenden Agenz im Aufschlußpuffer auf der Säule renaturiert (2.7.3.1). Die Elution der Proteine erfolgte mit einem Imidazol Stufengradienten, wobei die Proteine bei einer Imidazolkonzentration von 250 mM von der Säule eluierten. Bei diesem Verfahren stellte sich allerdings heraus, daß die denaturierten „His-Tag“Proteine nur sehr schlecht an dem Ni-NTA Säulenmaterial banden. Pro Säulenlauf ließen sich nur 0,8 bis 1,6 mg Protein, statt den zu erwarteten 50 mg von einer 5 ml Säule, isolieren. Ein Ausweichen auf alternative Säulenmaterialien wie Talon (Clontech) oder His•Bind (Novagen) brachte ebenfalls keine Verbesserung der Bindung. 57 Ergebnisse Das Trx-ModA Fusionsprotein band unter denaturierenden Bedingungen viel besser an der Ni-NTA Matrix als His-ModA unter gleichen Bedingungen. Das Trx-ModA hat außer dem C-terminalen „His-Tag“ am ModA noch einen internen „His-Tag“ zwischen dem Trx und ModA. Zum Vergleich des Aufbaus beider Proteine siehe Tabelle 3.2. Es wurde nun vermutet, daß der C-terminale „His-Tag“ für die bessere Bindung am Säulenmaterial verantwortlich ist. Da das Thioredoxin, wie sich noch zeigen wird, keinen Einfluß auf die Löslichkeit von ModA hat, sollte dieses aus dem Vektor entfernt werden und das rekombinante Protein ModA-His exprimiert werden (3.12). Tabelle 3.2: Aufbau der Proteine His-ModA und Trx-ModA. His-ModA 10 Histidine – ModA Trx-ModA Trx – 6 Histidine – ModA – 6 Histidine 3.7 Nachweis des „His-Tags“ Zunächst wurde vermutet, daß die exprimierten Proteine ihren „His-Tag“ evtl. verloren hatten und somit nicht mehr am Säulenmaterial binden konnten. Dies sollte durch eine Western Blot Analyse nachgeprüft werden (2.7.6). Dazu wurde ein Ni-NTA HRP Konjugat (Qiagen) verwendet. Der Nachweis erfolgte über Chemilumineszenz (ECL von Amersham). In Abb. 3.16 sieht man den deutlichen Nachweis des „His-Tags“ am rekombinanten Protein His-ModA. Obwohl das verwendete Ni-NTA Konjugat das Vorhandensein des „His-Tags“ eindeutig belegen konnte, blieb nur sehr wenig von dem Protein an der entsprechenden Ni-NTA Matrix der Säulen haften. Der Blot zeigt aber auch, daß nur ein kaum detektierbarer Anteil des Fusionsproteins sich in der löslichen Fraktion befindet. Dieser Anteil war zu gering, um das native Protein in größeren Mengen aus der löslichen Proteinfraktion zu reinigen. Das Problem mit den denaturierten Proteinen, die nicht an dem Säulenmaterial haften bleiben ist bekannt (Steinert, Forschungsabteilung Qiagen, persönliche Mitteilung). Es sind zwei andere Proteine bekannt, die unter denaturierenden Bedingungen nicht an der NiNTA Matrix binden. Diese Proteine binden aber unter nativen Bedingungen an dem Säulenmaterial und können so gereinigt werden. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte nicht gegeben werden, da unter denaturierenden Bedingungen der „His-Tag“ frei zugänglich und die Bindung an die Matrix ohne Einschränkungen möglich sein sollte. So wurde im Folgenden versucht die Expressionsbedingungen der Art zu gestalten, daß zumindest ein Teil der exprimierten Proteine in löslicher Form vorliegt. 58 Ergebnisse M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 50 kDa 30 kDa 20 kDa Abb. 3.16 Western Blot zum Nachweis des „His-Tags“ an dem rekombinanten Protein HisModA. PVDF-Membran, mit Coomassie gefärbt (links) und dazugehöriger Film (rechts). Spur 1: BLR(DE3) pLysS (negativ Kontrolle); Spur 2: Gesamtzellextrakt nach Überexpression von His-ModA; Spur 3: lösliche Proteine nach der Überexpression; Spur 4: Überstand der gewaschenen Einschlußkörper; Spur 5: isolierte Einschlußkörper. 3.8 Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern Es gibt verschiedene Methoden die Bildung von Einschlußkörpern zu verhindern. C.H. SCHEIN (1991) hat sechs verschiedene Wege aufgelistet, über die man die Proteinfaltung während der Überexpression verbessern kann. Als erstes sollte man die Wuchsbedingungen verändern, dann die Fusion zu einem Solubilisierungslinker herstellen oder das Protein ausschleusen. Des weiteren könnte man Chaperone oder Foldasen coexprimieren und man sollte „klebrige Proteinsequenzen“, also solche mit einer hohen Adhäsion (z.B. L-R-E, R-G-D-(V, S oder T) ), vermeiden. Zum Schluß könnten auch noch Mutationen in die Primärstruktur der Proteinsequenz eingebracht werden, hier sind die Methoden der Vorhersage jedoch noch nicht ausgereift. Im Folgenden wurden einige dieser Wege beschritten. 3.8.1 Veränderungen der Expressionsbedingungen Die Anzuchtbedingungen zu verändern schien erst einmal das einfachste Mittel zu sein die Bildung der Einschlußkörper zu verhindern. Dazu wurden die unter 2.5.1 beschriebenen Nährmedien bei Temperaturen von 16° C, 20° C, 30° C, 37° C und 45° C für die Überexpression verwendet. Außerdem wurde die Induktion der Expression mit 0,5 mM, 0,75 mM und 1 mM IPTG durchgeführt. Die Expression der Proteine fand im Stamm C41(DE3) statt. 59 Ergebnisse Den größten Erfolg zum löslichen Protein zu kommen versprach dabei das TryptonPhosphat-Medium. MOORE et al. (1993) verwendeten dieses Medium, um die dCMP Deaminase des T4 von einem pET-Vektor aus in löslicher Form zu exprimieren, wobei Versuche mit anderen Medien nur zur Bildung von Einschlußkörpern geführt hatten. Im Falle der Proteine ModA und ModB ließ sich jedoch in keinem Versuchsansatz der Anteil an löslichem Protein steigern. Es mußte also ein anderer Weg gewählt werden. 3.8.2 Überexpression in Gegenwart des Bakteriocinfreisetzungsproteins Die Expression des Bakteriocinfreisetzungsproteins (BRP) initiiert die Freisetzung periplasmatischer und cytosolischer E. coli Proteine in das Kulturmedium. Überexprimierte Proteine sollten somit nicht im Cytoplasma akkumulieren und als Einschlußkörper aggregieren können. Für die Versuche wurde das Plasmid pSW1 mit p16modA7 in BLR(DE3) cotransformiert und wie unter 2.5.3.5 beschrieben angezogen. Es wurden Gesamtzellextrakte nach erfolgter Überexpression bei verschiedenen Gaben von Mitomycin C mit den Gelen der zugehörigen Kulturüberstände verglichen. Bei der Auswertung der SDS-Polyacrylamidgele zeigte sich, daß bei einer Konzentration von 50 ng/ml Mitomycin C E. coli Proteine aus den Bakterien in das Medium ausgeschleust wurden. Obwohl in den Gesamtzellextrakten eine deutliche Überexpression zu verzeichnen war, fand sich im Überstand kein ausgeschleustes HisModA wieder. 3.8.3 Ausschleusen der exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum Mit dem Vektor pET-22b(+) ist es möglich, die zu exprimierenden Proteine mit einer Leitsequenz („pelB-Leader“) für den periplasmatischen Raum zu versehen und die Proteine dorthin zu transportieren. Dies wurde mit ModB ausprobiert, das aus dem Vektor p22modBB2 exprimiert wurde. Da sich auch hier wieder nur die Bildung von Einschlußkörpern nachweisen ließ, wurde auf eine Klonierung von modA in diesem Vektor verzichtet. 60 Ergebnisse 3.8.4 Coexpression von Chaperonen Einige Proteine benötigen sogenannte Chaperone, die sie bei der Faltung zur aktiven Form unterstützen oder es erst ermöglichen die aktive Form einzunehmen. Damit bei einer Überexpression die vorhandenen Chaperone nicht austitriert werden, kann man diese coexprimieren und die „Faltungshelfer“ somit in ausreichender Menge zur Verfügung stellen. Zum Einsatz kamen die Chaperone GroES/GroEL und DnaK. Bei der Coexpression von GroES/GroEL mit His-ModA bzw. Trx-ModA (2.5.3.6) zeigte sich, daß die Chaperone sehr gut überexprimiert wurden, die Expression von His-ModA bzw. TrxModA aber nicht zu erkennen war. Die Coexpression mit DnaK und His-ModA lieferte von beiden Proteinen eine gute Überexpression, wobei von DnaK ca. die Hälfte löslich und die andere Hälfte als unlösliches Protein vorlag. His-ModA fand sich nur in der unlöslichen Proteinfraktion wieder. 3.8.5 Fusion von ModA mit Thioredoxin Thioredoxin (109 Aminosäuren, 11.675 Da) ist ein Protein, was noch bei einer Konzentration von 40 % des gesamten Zellproteins in Lösung vorliegen kann. Deshalb erschien es geeignet die Bildung der Einschlußkörper zumindest teilweise zu unterbinden. Wie unter 3.2.4 bereits beschrieben wurde das Gen modA in den Vektor pET-32b(+) kloniert. Bei der Überexpression des Fusionsproteins zeigte sich aber, daß die Aggregationsfähigkeit von ModA die Fähigkeit der Löslichkeit des Thioredoxins überschreitet und man kein lösliches Fusionsprotein vorfand. 3.9 Renaturierung von Einschlußkörpern Da es nicht möglich war, durch die Anzuchtbedingungen während der Expression einen größeren Teil der rekombinanten Proteine in Lösung zu halten, sollten Bedingungen gefunden werden, unter denen sich die denaturierten Proteine in ihre aktive Form zurückführen ließen. 3.9.1 Renaturierung durch Verdünnung Es wurden, wie unter 2.7.4.1 beschrieben, die in 7 M GuHCl aufgelösten Einschlußkörper langsam unter ständigem Rühren in einem Renaturierungspuffer getropft. Dabei sollte anfangs die Konzentration der Proteine so gering sein, daß sie sich während ihres Faltungsprozesses nicht gegenseitig behindern und sie sich somit ungestört in ihre aktive 61 Ergebnisse Form falten lassen. Nach Zentrifugation und Einengung der löslichen Fraktion über Zentrifugationsfiltration fand sich kein nennenswerter Anteil der Proteine in Lösung wieder, fast 100 % der eingesetzten Proteine wurden wieder sedimentiert. 3.9.2 Renaturierung durch Dialyse Wurden die in GuHCl gelösten Einschlußkörper stufenweise gegen einen DialyseRenaturierungs-Puffer dialysiert (2.7.4.2), flockten die Proteine bei weniger als 2 M Harnstoff im Puffer aus. Wurden die Einschlußkörper bei einem pH von 12,0 denaturiert (2.5.5) und durch Dialyse der pH Wert auf 8 gebracht (2.7.4.2) hatte man kaum Verluste durch ausgefallene Proteine während der Dialyse. Bei Proteinkonzentrationen < 1 mg/ml für ModA oder His-ModA konnten fast 100 % der Proteine in Lösung gehalten werden. Für das Trx-ModA Fusionsprotein liegt diese Konzentration bei < 3 mg/ml. Bei höheren Konzentrationen neigen die Proteine auch hier wieder dazu ein Präzipitat zu bilden. Mit dieser letzten Methode hatte man nun die Möglichkeit größere Mengen der rekombinanten Proteine in eine lösliche Form zu überführen. 3.10 Reinigung von ModA unter nativen Bedingungen Da nun größere Mengen löslicher rekombinanter Proteine zur Verfügung standen, wurde die Reinigung von His-ModA unter nativen Bedingungen wiederholt (2.7.3.1). Das NiNTA Säulenmaterial wurde nach Angabe des Herstellers (Qiagen) mit den entsprechenden Puffern verwendet. Unter nativen Bedingungen banden die „His-Tag“-Proteine viel besser an der Säule als unter denaturierenden Bedingungen. Ein Teil der Proteine eluierte jedoch bereits bei einer Konzentration von 100 mM Imidazol von der Säule, der größte Teil jedoch erst bei 250 mM Imidazol. Die Fraktionen mit dem gewünschten Protein wurden vereinigt und gegen Dialyse-Puffer 2 (2.7.3.1) dialysiert. Die Reinheit der Proteine wurde densitometrisch mit dem Programm Tina2.09 über ein silbergefärbtes SDS- Polyacrylamidgel bestimmt (Abb. 3.17). Nach einer solchen Auswertung ist das Protein zu ca. 95 % sauber. 62 Ergebnisse Abb. 3.17: Analyse zur Reinheit durch densitometrische Auswertung eines silbergefärbten 13 %igen SDS-Polyacrylamidgels. In der Spur wurden 3 µg gereinigtes His-ModA aufgetragen. Als Marker diente eine 10 kDa-Leiter. 3.11 Nachweis katalytisch aktiver Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese Nach dem strukturellen Alignment von BAZAN & KOCH-NOLTE (1997) (Abb. 1.9) wurden vier katalytisch essentielle Aminosäuren für die Proteine ModA und ModB vorhergesagt. Für ModA sind dies die Aminosäuren Arginin 72, Serin 109, Phenylalanin 129 und Glutamat 165 (Abb. 3.18). Für ModB wurden die Aminosäuren Arginin 73, Serin 111, Tyrosin 131 und Glutamat 173 postuliert (Abb. 3.18). Durch den Austausch der Aminosäuren Arg72 bzw. Glu165 für ModA und Arg73 bzw. Glu173 für ModB sollten Mutanten generiert werden, deren ADP-Ribosylierungs-Aktivität stark eingeschränkt sein sollte. Die Mutagenese erfolgte mit dem „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ von Stratagene (2.6.4). Es wurden jeweils nur homologe Aminosäuren ausgetauscht, also Arginin gegen Lysin und Glutamat gegen Aspartat. Nach erfolgter Mutagenese erhielt man die Klone p16modA7-R72K, p16modA7-E165D, p16modB1-R73K und p16modB1E173D. Diese Mutanten wurden einem Plattentest zur Überprüfung ihrer Toxizität unterzogen (2.5.4.3). Dabei stellte sich heraus, daß die Bakterien (C41(DE3)) mit den mutierten Plasmiden unter induzierten Bedingungen auf den Agar-Platten wuchsen, wohingegen Bakterien mit den Originalplasmiden kein Wachstum zeigten. Die Größe der 63 Ergebnisse Kolonien unter induzierten und nicht induzierten Bedingungen kann hier als Maß der Toxizität dienen. In einer Kooperation mit der Gruppe um Rimas Nivinskas (Litauen) wurden weitere Mutanten hergestellt, eine Auflistung findet sich in Tabelle 3.3. Dieser Test funktioniert nur in dem Stamm C41(DE3). Der Stamm C43(DE3), einer anderen BL21(DE3) Mutante, zeigte mit den Originalplasmiden unter induzierten Bedingungen ein Wachstum, wenn auch die Kolonien sehr klein blieben. In den Stämmen BL21(DE3) oder BLR(DE3) findet man unter induzierten Bedingungen kein Wachstum auf den Agar-Platten, egal ob die exprimierten Proteine eine toxische Wirkung haben oder nicht. Tabelle 3.3 Auflistung der in dieser Arbeit hergestellten Mutanten (fett) und der in der Arbeitsgruppe von Rimas Nivinskas erzeugten Mutanten. Der Grad der Toxizität kann an Hand der Koloniegröße im Vergleich zum Wuchs unter induzierten und nicht induzierten Bedingungen ermittelt werden. Mutation Koloniegröße (% von nicht induziert) ModA R72K E165D R72A S109A F127A F129A E163A E165A N128A Q116A Q164A ModB R73K E173D 50 50 100 70-80 20 10 5 50 50 Mit diesem Plattentest konnte nachgewiesen werden, daß die Aminosäuren Arg72 und Glu165 bei ModA und Arg73 und Glu173 bei ModB essentiell für die Aktivität der Proteine sind. Selbst ein homologer Austausch dieser Aminosäuren senkte die Aktivität der Proteine dermaßen, daß die Bakterien unter induzierten Bedingungen noch Kolonien von 50 % der Größe wie unter nicht induzierten Bedingungen hervorbrachten. Wurden bei ModA die Aminosäuren Arg72 bzw. Glu165 gegen Alanin ausgetauscht, ergab sich für R72A kein Unterschied mehr in der Koloniegröße zwischen induziert und nicht induziert, für E165A lag sie bei 70-80 %, also auch höher als bei dem konservativen Austausch E165D. 64 Ergebnisse 1 1 ATG ATT ATT AAT CTT GCA GAT GTT GAA CAG TTA TCT ATA AAA GCT GAA M I I N L A D V E Q L S I K A E 49 17 AGC GTT GAT TTT CAA TAT GAT ATG TAT AAA AAG GTC TGT GAA AAA TTT S V D F Q Y D M Y K K V C E K F 97 33 ACT GAC TTT GAG CAG TCT GTT CTT TGG CAA TGT ATG GAA GCC AAA AAG T D F E Q S V L W Q C M E A K K 145 49 AAT GAA GCT CTT CAT AAG CAT TTA AAT GAA ATC ATT AAA AAG CAT TTA N E A L H K H L N E I I K K H L 193 65 ACT AAA TCG CCT TAT CAA TTA TAT CGT GGT ATA TCA AAA TCG ACA AAA T K S P Y Q L Y R G I S K S T K 241 81 GAA CTC ATT AAA GAT TTA CAA GTT GGA GAA GTG TTT TCA ACG AAC AGG E L I K D L Q V G E V F S T N R 289 97 GTA GAT TCA TTT ACT ACT AGT TTG CAT ACA GCG TGT TCT TTT TCT TAT V D S F T T S L H T A C S F S Y 337 113 GCT GAA TAT TTC ACT GAA ACA ATA CTT CGT TTA AAA ACT GAT AAA GCT A E Y F T E T I L R L K T D K A 385 129 TTT AAT TAT TCT GAC CAT ATC AGC GAT ATT ATA CTT TCT TCT CCT AAT F N Y S D H I S D I I L S S P N 433 145 ACT GAG TTT AAG TAC ACG TAT GAA GAT ACT GAT GGA TTA GAT TCA GAG T E F K Y T Y E D T D G L D S E 481 161 CGT ACT GAT AAC TTA ATG ATG ATT GTG CGT GAA CAA GAA TGG ATG ATT R T D N L M M I V R E Q E W M I 529 177 CCA ATT GGA AAG TAT AAA ATA ACT TCT ATT TCA AAA GAA AAA TTA CAC P I G K Y K I T S I S K E K L H 577 193 GAT TCA TTT GGA ACA TTT AAA GTT TAT GAT ATT GAG GTA GTT GAA TG(A) D S F G T F K V Y D I E V V E - 1 Abb. 3.18 M o dB M o dA M 624 2 AAA TAC TCA GTA ATG CAA CTA AAA GAT TTT AAA ATA AAA TCA ATG GAT K Y S V M Q L K D F K I K S M D 672 18 GCA TCG GTG CGT GCT TCT ATT CGT GAA GAA TTA CTT TCT GAA GGG TTT A S V R A S I R E E L L S E G F 720 34 768 50 AAT TTA TCT GAA ATT GAA CTT TTA ATT CAT TGT ATT ACT AAT AAA CCA N L S E I E L L I H C I T N K P GAT GAC CAT TCT TGG TTA AAT GAA ATA ATC AAA TCT CGT TTG GTT CCA D D H S W L N E I I K S R L V P 816 66 864 82 AAC GAT AAA CCT CTT TGG AGA GGT GTT CCA GCT GAG ACT AAA CAA GTA N D K P L W R G V P A E T K Q V TTA AAT CAA GGA ATT GAT ATT ATT ACA TTT GAT AAA GTC GTA TCA GCT L N Q G I D I I T F D K V V S A 912 98 TCA TAT GAT AAA AAT ATA GCT CTA CAT TTT GCT TCT GGT TTA GAG TAT S Y D K N I A L H F A S G L E Y 960 114 AAC ACA CAA GTT ATT TTT GAA TTC AAA GCT CCT ATG GTA TTC AAT TTC N T Q V I F E F K A P M V F N F 1008 130 CAG GAG TAT GCT ATA AAA GCT CTA CGC TGT AAA GAA TAC AAT CCA AAC Q E Y A I K A L R C K E Y N P N 1056 146 TTT AAG TTT CCG GAT AGT CAT CGT TAT CGT AAT ATG GAA TTA GTT TCA F K F P D S H R Y R N M E L V S 1104 162 1152 178 GAT GAA CAA GAA GTA ATG ATA CCA GCT GGA AGT GTA TTT AGA ATT GCA D E Q E V M I P A G S V F R I A GAT AGA TAT GAG TAT AAA AAG TGT TCA ACA TAC ACT ATC TAT ACT CTT D R Y E Y K K C S T Y T I Y T L 1200 194 GAT TTT GAA GGA TTT AAT CTA TAA TGG AAG GAC TTA GAT TCA TTA TAC D F E G F N L W K D L D S L Y DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Gene modB und modA. Die Start-Codons sind fett und unterstrichen dargestellt. Die als katalytisch aktiv postulierten Aminosäuren sind durch ein Fünfeck markiert. Das (A) in der Sequenz an Position 624 wurde in die nächste Zeile transferiert, um in den neuen Leserahmen für ModA zu gelangen. 65 Ergebnisse 3.12 Entfernung des Trx aus p32modA2 Das rekombinante Fusionsprotein Trx-ModA zeigte unter denaturierenden Bedingungen ein sehr viel besseres Bindeverhalten an der Ni-NTA Matrix als His-ModA. Diese verbesserte Bindung wurde auf den C-terminalen „His-Tag“ zurückgeführt. Da das Trx keine Wirkung auf die Löslichkeit von ModA hatte, sollte das Gen trxA aus dem Vektor entfernt werden, um es nach der erfolgten Reinigung nicht durch eine Protease abspalten zu müssen. Das Gen trxA sollte aus dem Plasmid p32modA2 über die Schnittstellen NdeI und NcoI entfernt werden. Da im Gen modA aber eine interne NdeI Schnittstelle vorhanden ist, wurde diese durch eine ortsspezifische Mutagenese (2.6.4) mit den Primern Mut-A-Nde1 und Mut-A-Nde2 (2.4.2) eliminiert, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Das so erzeugte Plasmid p32trx-modA-NdeI wurde dann für die Deletion von trxA eingesetzt. Dazu wurde das Plasmid mit NdeI und NcoI restringiert, die überhängenden Enden unter Zuhilfenahme des Klenow-Fragments aufgefüllt und der Vektor ligiert. Nach erfolgter Transformation wurden einige Transformanden mittels einer Restriktionsanalyse mit RsaI oder PvuII auf das verkürzte Plasmid hin untersucht. Überexpressionsversuche mit diesen so verkürzten Plasmiden zeigten aber keine Expression des Proteins ModA-His. Nach Deletion des trxA Gens fanden sich zwischen der Shine-Dalgarno Region (SD-Region) und dem Start-Codon ATG 10 Nukleotide, vor der Deletion befanden sich dort nur 8 Nukleotide. Nach CHEN et al. (1994) spielt der Abstand zwischen der Ribosomenbindestelle und dem Start-Codon aber eine wichtige Rolle für eine effiziente Translation. Deshalb wurde im zweiten Ansatz das Gen trxA wie in Abb. 3.19 dargestellt eliminiert. Nach dieser Vorgehensweise sollte man wieder einen Spacer von 8 Nukleotiden erhalten. Von diesem Plasmid ließ sich eine gute Überexpression von ModA-His induzieren. 66 Ergebnisse Xho I Pvu II Eco RI Nde I del Pvu II Nco I T7 Ter Nde I modA-His amp Nde I trx-His T7 Pro p32 trx-modA-NdeI NdeI + S1-Nuklease 6445 bps Nco I ori lacI Xho I Pvu II Eco RI Pvu II T7 Ter modA-His amp 'trx-His Pvu II Pvu II T7 Pro Pvu II Fragment 1 6098 bps lacI Xho I Pvu II Eco RI Pvu II ori NcoI + Klenow Auffüllung Pvu II Pvu II T7 Ter modA-His Pvu II amp T7 Pro Fragment 2 Xho I Pvu II Eco RI Pvu II 5968 bps lacI T7 Ter modA-His ori Ligation T7 Pro amp Pvu II Pvu II Pvu II p32 modA-His 5968 bps lacI ori Pvu II Pvu II Pvu II Abb. 3.19 Deletion von trxA aus dem Vektor p32trx-modA-NdeI. Die deletierte NdeI Schnittstelle im Gen modA ist in Magenta hervorgehoben, die verwendeten Schnittstellen NdeI und NcoI sind in Rot dargestellt. Wie sich bei einer späteren Sequenzierung herausstellte sind in dem Plasmid p32modA-His 12 bp zusätzlich deletiert (Abb. 3.20), so daß die Translation von dem zweiten ATG stattfand und das Protein um die ersten fünf Aminosäuren verkürzt vorlag. Hier fand eine gute Translation trotz eines Spacers von 11 Nukleotiden zwischen der SDRegion und dem AUG statt. erwartete Sequenz aagaaggagatatacac atg gaa tac tca gta atg caa cta M E Y S V M Q L gefundene Sequenz aagaaggaga....... ... ..a tac tca gta atg caa cta M Q L Abb. 3.20 Zusätzliche Deletion im Vektor p32modA-His. Die Ribosomenbindestelle und das StartCodon sind jeweils Fett dargestellt. Die erwartete bessere Bindung von ModA-His an der Ni-NTA Matrix unter denaturierenden Bedingungen konnte allerdings nicht bestätigt werden. So muß die verbesserte Bindefähigkeit des Trx-ModA Fusionsproteins auf die Anwesenheit beider „His-Tags“ zurückzuführen sein (Tabelle 3.2). 67 Ergebnisse 3.13 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB Die ADP-Ribosylierung wurde nach der Methode von ROHRER et al. (1975) (2.8.1) mit 32 P-NAD+ durchgeführt. Die löslichen E. coli Proteine wurden in einem 13 %igen SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und ein Autoradiogramm des gefärbten und getrockneten Gels angefertigt. Von Alt (von H. Koch zur Verfügung gestellt) und ModA konnte gereinigtes Protein eingesetzt werden, für ModB wurden die löslichen Proteine einer Kultur eingesetzt, die ModB überexprimiert hatte. Abb. 3.21 zeigt die unterschiedlichen Ribosylierungsmuster der drei T4 ADPRibosyltransferasen Alt, ModA und ModB. Man erkennt, daß sich alle drei Muster unterscheiden. In einigen Bereichen findet man Signale auf gleicher Höhe (Abb. 3.21, Tabelle 3.4). Die Kontrolle weist ebenfalls eine markierte Bande bei ca. 70 kDa auf, was auf eine E. coli eigene ADP-Ribosyltransferase hindeutet. Von ModA war bekannt, daß es die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase markiert. Diese Markierung findet sich im Gel bei einer Größe von ca. 42 kDa wieder. Außerdem vollzieht ModA eine Autoribosylierung (Bande bei ca. 28 kDa). Die anderen markierten Proteine werden im Moment identifiziert. Im Rahmen seiner Diplomarbeit fand R. DEPPING (1998), daß es sich bei der durch ModB stark markierten Bande bei ca. 70 kDa um das S1-Protein der kleinen Untereinheit der Ribosomen handelt. Auch hier findet die Identifizierung der anderen markierten Proteine zur Zeit statt. Vergleichende Tests mit den unveränderten Proteinen ModA bzw. ModB aus p11modAB3 bzw. p11modBB5 und den „His-Tag“ Proteinen His-ModA und His-ModB oder dem Fusionsprotein Trx-ModA ergaben immer identische Ribosylierungsmuster für ModA bzw. ModB. Dies deutet darauf hin, daß der „His-Tag“ und das Thioredoxin keinen Einfluß auf die Erkennung der Zielproteine haben und die Transferasen immer noch aktiv sind. Die beiden Mutanten ModA-R72K und ModA-E165D zeigten in diesem Test nur wenige sehr schwache Banden auf dem Röntgenfilm, was auf eine niedrigere Restaktivität der beiden Proteine schließen läßt (siehe auch 3.11). 68 Ergebnisse Abb. 3.21 Tabelle 3.4 Ribosylierungsmuster von löslichen E. coli Proteinen in Gegenwart von Alt, ModA oder ModB. A: 13% SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie Brillantblau gefärbt. B: Autoradiogramm von A. Die Expositionsdauer für Alt betrug 4 Tage, die der anderen Spuren 9 Tage. Die starke Markierung auf der Höhe der S1-Untereinheit in der Alt Spur stammt von der Autoribosylierung von Alt. Ob das S1 Protein auch von Alt ribosyliert wird, wird zur Zeit noch untersucht. Molekulargewichte der durch ModA oder ModB markierten Proteinbanden. Wenn bekannt, wurden die entsprechenden Proteine in Klammern angegeben. ModA 79 kDa 56 kDa 50 kDa 42 kDa (α–Untereinheit) 35 kDa 28 kDa (Autoribosylierung ModA) 22 kDa 14 kDa ModB 72 kDa (S1-Untereinheit) 50 kDa 46 kDa 42 kDa 36 kDa 29 kDa 28 kDa 27 kDa 22 kDa 21 kDa 14 kDa Es wurde ebenfalls untersucht, ob es im Zusammenspiel der drei ADP-Ribosyltransferasen zu synergetischen Effekten kommt. Dazu wurden die Ribosylierungsmuster der einzelnen Transferasen mit den Mustern verglichen, die entstehen wenn mehr als eine Transferase im Reaktionsansatz tätig ist. In Abb. 3.22 ist das Ergebnis dieses Versuchs wiedergegeben. 69 Ergebnisse Man erkennt, daß sich die Bandenmuster lediglich aufaddieren, und es zu keiner neuen Markierung kommt. Daraus folgt, daß alle drei ADP-Ribosyltransferasen unabhängig voneinander agieren und keine auf die Anwesenheit der anderen angewiesen ist. Abb. 3.22 Vergleich der Ribosylierungsmuster von Alt, ModA und ModB sowie die Muster nach Einsatz von Kombinationen dieser Proteine. A: 13% SDS-Polyacrylamidgel Coomassie Brillantblau gefärbt. B: Autoradiogramm von A. Als Marker wurde eine 10 kDa Leiter verwendet, außerdem sind die Positionen der Untereinheiten der E. coli RNA-Polymerase angegeben. 3.14 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA 3.14.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin Über einen photometrischen Test sollten die Werte für die Michaelis Konstante (KM) und die Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) ermittelt werden. Für diesen Test mußte zunächst das Substrat p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) synthetisiert werden (2.8.2.1). Zur Überprüfung des Substrates wurde ein Absorptionsspektrum aufgenommen (Abb. 3.23). Es fanden sich die bei SOMAN et al. (1983) angegebenen Absorptionsmaxima bei 315 nm in 0,1 N HCl und 375 nm in 0,1 N NaOH. 70 Ergebnisse Abb. 3.23 λ-Scan von NBAG im Bereich zwischen 230 nm bis 550 nm. NBAG in 0,1 N NaOH NBAG in Tris-Acetat pH 7,4 NBAG in 0,1 N HCl 3.14.2 Bestimmung von KM und Vmax Nachdem das NBAG für den photometrischen Aktivitätstest hergestellt war, wurde die ADP-Ribosylierung des NBAG in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration ermittelt. Es ergab sich unter den gewählten Versuchsbedingungen (2.8.2) ein linearer Zusammenhang zwischen der Absorptionsänderung und der ModA Konzentration (Abb. 3.24). Dies war ein Hinweis darauf, daß es während des Versuchs zu keiner Limitierung der Substrate kam. Im weiteren Verlauf zur Bestimmung von Vmax und KM wurde einmal die Konzentration an NAD+ konstant gehalten und die Konzentration von NBAG variiert (Abb. 3.25, Abb. 3.26) und entsprechend die Konzentration von NBAG konstant gehalten und die Konzentration von NAD+ variiert (Abb. 3.27, Abb. 3.28). Die Absorptionsänderung wurde jeweils über einen Zeitraum von einer Stunde ermittelt. Aus der Geradengleichung (y = mx +b) des Lineweaver-Burk-Diagramms ergaben sich die Werte für Vmax = 1/b und KM = m/b. In Tabelle 3.5 sind die ermittelten Werte zusammengefaßt. Unter diesen Versuchsbedingungen ergab sich für die Abhängigkeit von NBAG ein Vmax-Wert von 5,34 mol Produkt . h-1 . mol ModA-1 und ein KM-Wert von 219 µM. Für die Abhängigkeit von NAD+ ergaben sich für Vmax 20,04 mol Produkt . h-1 . mol ModA-1 und für KM 258 µM. 71 Ergebnisse 0,05 y = 0,0009x 2 R = 0,9955 0,045 ∆ Absorption bei 370 nm 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 0 10 20 30 40 50 60 ModA (µg/ml) Abb. 3.24 Effekt der Enzymkonzentration auf die Rate der ADP-Ribosylierung von NBAG. Die Reaktion fand über einen Zeitraum von 60 min statt. Es sind die Geradengleichung und das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben. (Endkonzentrationen: 10 mM NAD+; 32 mM DTE; 0,4 mM NBAG; 20 mM Tris-acetat pH 7,4) V (mol Produkt/(h * mol ModA)) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 [NBAG] (mM) Abb. 3.25 Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NBAG Konzentration nach Michaelis-Menten. 72 Ergebnisse 1/V (1/(mol Produkt/(h * mol ModA)) 1,2 y = 0,0409x + 0,1872 2 R = 0,9986 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -10 -5 0 5 10 15 20 25 1/[NBAG] (1/mM) Abb. 3.26 Doppeltreziproke Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NBAG Konzentration nach Lineweaver-Burk. Außerdem sind die Geradengleichung und das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben. V (mol Produkt/(h*mol ModA)) 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 [NAD] (mM) Abb. 3.27 Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NAD+ Konzentration nach Michaelis-Menten. 73 Ergebnisse 0,18 y = 0,0129x + 0,0499 R2 = 0,9986 1/V (1/mol Produkt/(h * mol ModA)) 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 1/[NAD] (1/mM) Abb. 3.28 Tabelle 3.5 Doppeltreziproke Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NAD Konzentration nach Lineweaver-Burk. Außerdem sind die Geradengleichung und das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben. Vmax- und KM-Werte von ModA sowie kkat und die Spezifitätskonstante (kkat/KM) für die Substrate NBAG und NAD. Vmax KM kkat kkat/KM (mol Produkt . h-1 . mol ModA-1) (µM) (s-1) (l . mol-1 . s-1) 5,34 20,04 219 258 0,00148 0,005567 7 22 NBAG NAD 3.15 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNAPolymerase WILKENS & RÜGER (1996) konnten zeigen, daß in einem in vivo System die Transkription von vielen frühen T4 Promotoren durch Alt ADP-ribosylierte (alterierte) E. coli RNAPolymerase gesteigert werden kann. Nun sollte mit in vitro Versuchen die Auswirkung durch ModA ADP-ribosylierter (modifizierter) RNA-Polymerase auf die Transkription untersucht werden (2.9). Die ersten Versuche mit gereinigter E. coli RNA-Polymerase, die mit Alt (Positivkontrolle) bzw. ModA ribosyliert wurde, und T4 Wildtyp DNA erbrachte keine eindeutigen Ergebnisse. Eine Steigerung der Transkriptionsrate durch Alt, wie es zu erwarten gewesen wäre, konnte in diesem System nicht nachgewiesen werden. Eine Transkriptionskinetik von T4 DNA bzw. ausgesuchten, klonierten frühen T4 Promotoren (2.9.1) zeigte in diesem in vitro System ebenfalls keine eindeutige Änderung in der Transkriptionsrate. Die Kinetik wurde über 60 min aufgenommen, wobei nach 10 min Alt 74 Ergebnisse oder ModA dem Reaktionsansatz zugesetzt wurde und die Einbaurate an α32P-UTP mit einer Kontrollreaktion ohne Alt oder ModA verglichen wurde. Es schien in diesem System evtl. eine weitere unbekannte Komponente, wie ein „Mittlerprotein“ zu fehlen. Wahrscheinlicher ist aber, daß aufgrund der geringen Reaktionsgeschwindigkeiten von ModA bzw. Alt kein Effekt auf die Transkription gefunden werden konnte (Tabelle 4.3). Deshalb wurden E. coli Kulturen mit den Plasmiden pET-16b (Kontrolle), p16modA7 (ModA) und pTKRI (Alt) unter induzierten Bedingungen bis zu einer OD590 von 0,65 angezogen und geerntet. Während des Wachstums der Bakterien sollte die RNA-Polymerase in Gegenwart des Vektors pET-16b unverändert, in Gegenwart des Vektors p16modA7 modifiziert und bei pTKRI alteriert vorliegen. Für die folgenden Transkriptionsexperimente wurden die Zellen aufgeschlossen und die lösliche Proteinfraktion in unterschiedlichen Mengen eingesetzt (2.9.2). Um die Transkription von mitgeschleppter genomischer E. coli DNA in der löslichen Proteinfraktion zu bestimmen, wurden Kontrollversuche ohne Zugabe zusätzlicher DNA durchgeführt. Die Versuchsansätze wurden in Hinblick auf den Einbau der hier gemessenen Radioaktivität rechnerisch korrigiert. Die Transkription wurde mit T4 Wildtyp DNA und mit genomischer E. coli DNA durchgeführt und verglichen. In Abb. 3.29 sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Man sieht für die T4 DNA, daß die alterierte RNAPolymerase die Transkription bei Zugabe von mehr löslichem Protein steigert. Gibt man mehr lösliches Protein von der Kontrolle (normale RNA-Polymerase) dazu, kann man keine Änderung feststellen, bei einer noch höheren Proteinkonzentration findet man schließlich eine geringere Transkription. Bei der modifizierten RNA-Polymerase findet man von Anfang an bereits eine nur geringe Transkription (ca. 30 % von Alt), die bei Zugabe von mehr löslichem Protein auch nicht stark gesteigert werden kann. Im Vergleich dazu sieht man bei der E. coli DNA, daß alterierte RNA-Polymerase keinen Einfluß auf die Transkription von dieser DNA hat. Allerdings zeigt die Kontrolle aber auch keinen Einfluß auf die Transkription, wenn man die Proteinmenge steigert. Es wäre zu erwarten gewesen, daß bei Zugabe von mehr Protein, also auch mehr RNA-Polymerase, mehr Transkript gebildet wird. Die Transkription mit modifizierter RNA-Polymerase zeigt hier auch wieder den geringsten Einbau an Radioaktivität, der sich ebenfalls durch Zugabe von mehr Protein nicht steigern läßt. 75 Ergebnisse Abb. 3.29 Transkription von T4 DNA und E. coli DNA mit unveränderter, alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase in löslichen E. coli Proteinrohextrakten. Im linken Bild ist die Transkription von T4 DNA und im rechten Bild die Transkription von der E. coli DNA wiedergegeben. Zum besseren Vergleich wurde die eingebaute Radioaktivität in % angegeben, wobei der höchste Wert bei 30 µg löslichem Protein auf 100 % gesetzt wurde. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte aus zwei bis drei unabhängigen Untersuchungen. Die Auswirkungen einer alterierten und modifizierten RNA-Polymerase ließen sich nicht untersuchen, da ModA in Gegenwart des Plasmides pTKRI nicht exprimiert wurde. 76 Diskussion 4 Diskussion Zur Untersuchung von Proteinen werden diese in größeren Mengen benötigt. Aus den natürlichen Quellen können aber oft nicht ausreichend Proteine isoliert werden. Hier liefert die Gentechnik die entsprechenden Methoden, um über Klonierung und Expression der gewünschten Gene an die gesuchten Proteine zu gelangen. Anschließend können die gesuchten Proteine rekombinant hergestellt und isoliert werden, um Untersuchungen mit ihnen durchzuführen. 4.1 Klonierung von modA und modB Für die ADP-Ribosyltransferase Mod war der Locus auf dem T4 Genom bekannt (KUTTER et al., 1994). Mod sollte zwischen den Genen 39 und 56, genauer hinter dem frühen Promotor P13.149 liegen. An dieser Stelle befindet sich ein Operon, das aus zwei offenen Leserahmen besteht. Eine Homologiesuche in den Datenbanken brachte keinen Aufschluß darüber, welche der beiden Sequenzen für eine ADP-Ribosyltransferase kodiert, da keine signifikante Übereinstimmung zu bekannten ADP-Ribosyltransferasen gefunden werden konnte. Erst ein Alignment über die Sekundärstruktur mit anderen ADP- Ribosyltransferasen zeigte, daß beide Leserahmen für NAD(P)+-Arginin ADPRibosyltransferasen (EC 2.4.2.31) kodieren sollen (BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997). Das erste Ziel dieser Arbeit war somit beide Leserahmen zu klonieren, um die entsprechenden Proteine rekombinant herzustellen. Des weiteren sollte die Sequenz, die für das seit langem bekannte Mod kodiert, identifiziert werden. Das bekannte gpMod ist dasjenige, welches die E. coli RNA-Polymerase ribosyliert (SEIFERT et al., 1969; SKORKO et al., 1977). Es bestand aber auch die Möglichkeit, daß beide Enzyme die RNAPolymerase ribosylieren, oder daß Mod als Heterodimer aus beiden Proteinen aufgebaut ist. Die Klonierung der vollständigen Gene in einen allgemeinen Klonierungsvektor (pBluescript II) gelang nicht, was zu der Überzeugung führte, daß beide Genprodukte für E. coli toxisch sein müssen. Nach einer Beobachtung von BOUET et al. (1994) sind viele Gene des Phagen T4 extrem toxisch für E. coli, was eine Klonierung dieser Gene sehr erschwert. Klonierungen des Gens modA von MOSIG et al. (1998) lieferten nur inaktive Mutanten des Gens, was ebenfalls auf die Toxizität des Proteins hindeutete. 77 Diskussion Eine Klonierung in Vektoren bei denen die Expression unter der Kontrolle eines T7 Promotors steht, der nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird (DUNN & STUDIER, 1983; HAWLEY & MCCLURE, 1983), sollte eine frühzeitige Expression der Gene unterbinden. Die T7 RNA-Polymerase ist bei der Elongation der RNA-Ketten fünf mal schneller als die E. coli RNA-Polymerase (CHAMBERLIN & RING, 1973; GOLOMB & CHAMBERLIN, 1974), was eine hohe Transkriptionsrate zur Folge hat. In einigen Fällen kann die, von der T7 RNA-Polymerase katalysierte, Transkription sogar so hoch sein, daß die Transkription von der Wirts RNA-Polymerase nicht konkurrieren kann und die gesamte Transkription in der Zelle nur noch durch die T7 RNA-Polymerase stattfindet (STUDIER & MOFFATT, 1986). Bei effizienten Translationssignalen kann so innerhalb von drei Stunden das zu exprimierende Protein 50 % oder mehr des gesamten Zellproteins ausmachen (STUDIER & MOFFATT, 1986). Die ersten Klonierungsversuche, mit einem Gen unter der T7 Promotor Kontrolle, erfolgten mit den Expressionsvektoren pT7-5 und pT7-6 (TABOR & RICHARDSON, 1985). Eine Klonierung der kompletten Leserahmen von modA bzw. modB in diese Vektoren war ebenfalls nicht möglich. Hier liegt die „Low-Level“ Expression der Gene so hoch, daß ein toxisches Genprodukt das Wachstum der Zellen verhindert. Diese geringe Expression findet von stromaufwärts vom T7 Promotor liegenden Sequenzen statt, die von der E. coli RNA-Polymerase als schwache Promotoren erkannt werden können (eine T7 RNAPolymerase war zu diesem Zeitpunkt nicht in den Zellen vorhanden). Selbst durch die Einführung einer Struktur für die ρ-abhängige Transkriptionstermination, einer poly(dA)•poly(dT) Sequenz, die bei TOMASCHEWSKI (1988) die Klonierung des für E. coli letalen T4 Gens 49 (Endonuklease VII) erlaubte, brachte nicht den gewünschten Erfolg. Dabei sollte mit poly(dA) in 5'→3' Richtung die Transkription um 64 % gesenkt werden, bei einer Orientierung des poly(dT) in 5'→3' Richtung wird die Transkription nur um 23 % gesenkt und eine poly[d(A-T)] Sequenz zeigt keine Transkriptionsänderung (SHIGESADA & IMAI, 1982). Auch die Generierung eines Fusionsproteins mit der GST (Vektor pGEX-3X) brachte kein Ergebnis. Anscheinend zeigt der Vektor pGEX-3X auch eine gewisse „Low-Level“ Expression, die Expression des klonierten Gens erfolgt hier von dem induzierbaren artifiziellen tac-Promotor von E. coli. Das GST-Mod-Fusionsprotein scheint immer noch aktiv und somit toxisch für die Zelle zu sein. 78 Diskussion Nach diesen ersten Klonierungsversuchen war es unwahrscheinlich, daß Mod als Heterodimer aus den beiden Proteinen aufgebaut sein sollte, da jede Komponente für sich aktiv ist und eine letale Wirkung auf E. coli zeigt. Die Zugabe von ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren (3.3) in die Selektivagarplatten sollte die Klonierung in die oben erwähnten Vektoren ermöglichen. Dazu wurden als Inhibitoren 3-Hydroxybenzamid (für Poly-ADP-Ribosyltransferasen) und Benzoylenharnstoff (für Mono-ADP-Ribosyltransferasen) zugesetzt. Bei 1 mM Endkonzentration sollte eine Hemmung von > 92 % erfolgen (BANASIK & UEDA, 1994). Diese Maßnahme zeigte allerdings keine Auswirkung auf die Klonierungsergebnisse. Es konnten keine Klone mit vollständigen mod Genen gefunden werden. Entweder wurden die Inhibitoren nicht von den Zellen aufgenommen oder sie wurden abgebaut. Als weitere Möglichkeit kommt noch in Betracht, daß sie zwar inhibitorisch auf andere ADP-Ribosyltransferasen wirken, aber keinen hemmenden Effekt auf gpModA oder gpModB zeigen. Erst in einem stringent kontrollierten Expressionssystem (pET-Vektoren (STUDIER & MOFFATT, 1986), pBAD-Vektoren (GUZMAN et al., 1995)) konnten beide Gene vollständig kloniert werden. Die Stringenz der pET-Vektoren wird zum Einen durch einen T7 Promotor, der wie bereits erwähnt, nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird, und zum Anderen durch den direkt hinter dem T7 Promotor liegenden lac-Operator gewährleistet (STUDIER et al., 1990). Ist der Lac-Repressor an der Operatorsequenz gebunden, wird die „Low-Level“ Transkription, die von der E. coli RNA-Polymerase ausgeht, reprimiert. Eine Erhöhung der Stringenz während der Expression in DE3Stämmen wird durch die konstitutive Expression von T7 Lysozym (Vektoren pLysS oder pLysE) erreicht, was einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase darstellt (MOFFATT & STUDIER, 1987; STUDIER, 1991; ZHANG & STUDIER, 1997). Durch Zugabe von IPTG fällt der Lac-Repressor von der Operatorsequenz ab und es kann von diesem Promotor transkribiert werden (Abb. 2.3). Bei dem, durch Arabinose induzierbaren, pBAD-Vektor erfolgt eine strikte Kontrolle der Expression durch das AraC Dimer und die Aktivierung der Transkription durch das CAP Protein (GUZMAN et al., 1995). Beide Komponenten steuern die Expression, die von dem PBAD-Promotor ausgeht und gewährleisten eine stringente Kontrolle (Abb. 2.4). In diesem 79 Diskussion Expressionssystem soll zugleich eine proportionale Steuerung der Expression durch die Induktorkonzentration (Arabinose) möglich sein (LEE, 1980; LEE et al., 1987). Für die anschließende Reinigung der rekombinanten Proteine (4.6) wurden unter anderem Fusionen mit einem C-terminalen oder N-terminalen „His-Tag“ generiert. Wegen der Toxizität von ModA bzw. ModB für E. coli wurden Überlegungen angestellt, ob nicht ein anderes Expressionssystem verwendet werden sollte. Es bestand die Möglichkeit ein eukaryontisches System zu verwenden. Da man hier aber oft mit „ShuttleVektoren“ arbeitet, die vorher in E. coli vermehrt werden, war ein Erfolg fraglich. Gegen das eukaryontische Expressionssystem sprachen auch die potentiellen Glykosylierungsstellen in den beiden Proteinsequenzen: Es war nicht abzusehen, welchen Einfluß eine mögliche Glykosylierung auf die Aktivität der Proteine haben könnte. Eine Expression in Gram-positiven Bakterien z.B. Bacillus subtilis schien ebenfalls nicht einfacher zu sein, da die ADP-Ribosylierung sehr unspezifisch ist und die toxische Wirkung auch hier zur Entfaltung kommen könnte. Besonders für ModA ist hier anzuführen, daß die α-Untereinheit der B. subtilis RNA-Polymerase ein dem Arg265 äquivalentes Arginin an der Position 261 aufweist. Dieses Arg261 könnte mit großer Wahrscheinlichkeit ebenfalls von ModA ADP-ribosyliert werden und vielleicht toxisch für B. subtilis sein. 4.2 Gründe für die Toxizität von ModA und ModB Es überrascht, daß das gpAlt nicht ebenfalls eine toxische Wirkung auf E. coli hat, da im Gegensatz zu ModA oder ModB viel mehr E. coli Proteine ADP-ribosyliert werden (Abb. 3.21). Alt kann konstitutiv exprimiert werden, ohne den Wuchs von E. coli negativ zu beeinflussen (KOCH et al.,1995). Die Toxizität von ModA bzw. ModB muß also auf die Ribosylierung unterschiedlicher Zielproteine zurückzuführen sein. ModA ModA ADP-ribosyliert beide α-Untereinheiten der RNA-Polymerase von E. coli. Durch diese Modifikation werden keine UP-Element-abhängigen und CAP-abhängigen Promotoren von E. coli mehr erkannt (siehe 4.8.1). Ob die Toxizität von ModA alleine auf die Nichterkennung dieser Promotoren zurückzuführen ist, kann nur vermutet werden. Da 80 Diskussion von ModA noch eine Vielzahl anderer Proteine modifiziert werden, die noch nicht identifiziert sind, gibt es bis jetzt keine bessere Erklärung. ModB Vom T4 gpModB ist bisher nur bekannt, daß es das S1 Protein der 30S Untereinheit der Ribosomen modifiziert (DEPPING, 1998). Der Phage T7 phosphoryliert die Translationsinitiationsfaktoren IF1, IF2, IF3 und das S1 Protein von E. coli. Durch diese Phosphorylierung soll der Translationsapparat des Wirtes bevorzugt die Phagen mRNA rekrutieren (ROBERTSON & NICHOLSON, 1992). Durch eine ADP-Ribosylierung von S1 könnte ein solcher Mechanismus auch für den T4 zutreffen, zumal eine effiziente mRNA Bindung durch die 30S Untereinheit ohne S1 nicht möglich ist (KOLB et al., 1977; BONI et al., 1991; TZAREVA et al., 1994). Also könnte die Toxizität von ModB durch eine verschlechterte Translation der E. coli mRNA verursacht sein. Durch ein ADPribosyliertes S1 könnte die E. coli mRNA vielleicht nicht mehr an die 30S Untereinheit geladen werden. Genauso gut könnte die ADP-Ribosylierung aber auch eine essentielle Funktion im Stoffwechsel von E. coli stören und somit die Vermehrung der Bakterien verhindert sein. 4.3 Expression von ModA und ModB 4.3.1 Expression von ModA und ModB aus pET-Vektoren Für die Expression aus pET-Vektoren wird die T7 RNA-Polymerase benötigt. Es gibt mehrere Möglichkeiten die T7 RNA-Polymerase bereitzustellen und die Expression zu induzieren. Eine Möglichkeit besteht darin die RNA-Polymerase mittels Phagen in die Zelle zu bekommen. Dazu werden die Phagen CE6 (λ-Derivat) bzw. mGP1-2 (M13Derivat) verwendet. Die Induktion der Expression mit den Phagen CE6 bzw. mGP1-2 war nicht sehr effektiv und brachte nicht den gewünschten Erfolg. Bei der Verwendung von CE6 konnte nur eine geringe Überexpression erreicht werden. Womöglich war die Infektionsrate, die mit einer „MOI“ von fünf angegeben war, zu gering und nicht alle Bakterien konnten ModA bzw. ModB produzieren. Ebenso könnte aber auch in diesem besonderen Fall die Expression der T7 RNA-Polymerase vom Phagengenom durch die ADP-Ribosyltransferasen gestört worden sein. Bei der Infektion mit dem M13 Phagen mGP1-2 wurde kein Mod exprimiert. Gründe dafür konnten nicht festgestellt werden. Da 81 Diskussion die Expression der T7 RNA-Polymerase im Phagen mGP1-2 aber unter der Kontrolle des CAP-abhängigen lac Promotors steht, könnte eine effektive Expression der T7 RNAPolymerase durch eine ADP-ribosylierte E. coli RNA-Polymerase unterbunden werden (siehe auch 4.8.1). D.h. es wird anfangs etwas T7 RNA-Polymerase gebildet, durch das Auftreten der ersten ModA Proteine, die die E. coli RNA-Polymerase ribosylieren, kann jedoch kein weiteres Transkript für die T7 RNA-Polymerase synthetisiert werden und die Expression des Zielproteins bleibt gering. Es gibt keine Hypothese warum ModB nach der Infektion von mGP1-2 nicht exprimiert wurde, da die Zielproteine von ModB und die Folgen ihrer ADP-Ribosylierung nicht bekannt sind. Eine bessere Alternative waren DE3-Stämme, die den λ-Phagen DE3 lysogen im Genom tragen, hier steht die Transkription der T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des Promotors lacUV5. Die Expression aus BLR(DE3), BL21(DE3) und seinen Mutanten C41(DE3) und C43(DE3) hat ebenfalls den Vorteil, daß diesen Stämmen die Gene lon und ompT fehlen, die für die Lon-Protease bzw. die äußere Membran-Protease OmpT kodieren, die die Proteine während der Reinigung degradieren könnten (GRODBERG & DUNN, 1988). Die Expression eines beliebigen Gens in einem E. coli – T7 RNA-Polymerase System hat jedoch meistens toxische Auswirkungen auf E. coli, auch wenn das Genprodukt selbst nicht giftig ist. Diese Toxizität während einer Protein Überexpression soll durch die Entkoppelung von der Transkription und der Translation verursacht werden (IOST & DREYFUS, 1995; MAKAROVA et al., 1995). Im E. coli Stamm C41(DE3) liegt das Grundniveau der mRNA Synthese des klonierten Gens fünf mal niedriger als bei BL21(DE3) und unter induzierten Bedingungen sogar 10 mal niedriger (MIROUX & WALKER, 1996). Durch diese geringere mRNA Synthese findet keine Entkoppelung von Transkription und Translation mehr statt. Unter induzierten Bedingungen vermehren sich plasmidtragende C41(DE3) oder C43(DE3) weiter, während BL21(DE3) ihr Wachstum einstellen (MIROUX & WALKER, 1996). Wie die Wuchskurven in Abb. 3.12 zeigen, weist der Stamm BL21(DE3) einen deutlichen Wuchsnachteil mit kloniertem modA oder modB unter nicht induzierten Bedingungen auf. Dieses verzögerte Wachstum hängt möglicherweise mit dem oben erwähnten höheren Grundniveau der mRNA Synthese des klonierten Gens zusammen. 82 Diskussion Nach BARIK (1997) können Transformanden mit einer hohen Basalexpression bereits an ihrem Aussehen erkannt werden. Erscheinen Kolonien von transformierten BL21(DE3) opak, ist die basale Expression von dem klonierten Gen hoch, sehen sie durchsichtig aus, weisen sie nur eine sehr geringe Basalexpression auf. Diese durchsichtigen Kolonien sind den opak wirkenden in den meisten Fällen für die Überexpression vorzuziehen. Die Verwendung von Antibiotika zur Selektion von plasmidtragenden Bakterien bedarf ebenfalls einiger Beachtung. So fordert der Gebrauch von Ampicillin besondere Vorsicht bei instabilen Plasmiden, da die β-Lactamase in das Medium abgegeben und hier sehr schnell das Ampicillin durch Spaltung inaktiviert wird. Bei einer Bakterienkultur, die ein instabiles Plasmid trägt, können nach Zerstörung des Ampicillins Bakterien ohne Plasmid die Kultur sehr schnell überwachsen. Dies ist um so bedeutender, da sämtliches Ampicillin bereits gespalten ist, wenn die Bakteriensuspension erst leicht trübe ist. Eine Erhöhung der Ampicillinkonzentration hilft in diesem Falle nicht, der Zeitpunkt der kompletten Inaktivierung wird dadurch nur geringfügig hinausgezögert (pET System Handbuch, Novagen). Bei der Anzucht von ModA oder ModB in DE3-Stämmen kam es vor Induktion der Expression gelegentlich zur spontanen Lyse der Bakterien. Eine ähnliche Beobachtung machten auch MOSIG et al. (1998). Bakterien lysierten in Flüssigkulturen spontan, wenn sie ein Plasmid mit dem klonierten T4 Gen srd („similar to rpoD“, ähnlich zu σ70) trugen. Der Stamm C41(DE3) mit pET-Vektoren, die modA enthalten, wächst unter induzierten Bedingungen nicht auf Agar-Platten, aber in Flüssigkultur mit einem Vollmedium. Auf den Agar-Platten kommt es wahrscheinlich zu lokalen Unterversorgungen von einigen essentiellen Substanzen, so daß die entsprechenden Gene für die Synthese dieser Stoffe durch den CAP-Faktor aktiviert werden müssen. Dies gelingt aber durch eine ADPribosylierte RNA-Polymerase nicht und es ist kein Wachstum zu verzeichnen. In Flüssigkultur hingegen kommt es wahrscheinlich wegen der guten Durchmischung zu keiner Limitierung dieser Substanzen und die Zellen können sich vermehren. Aufgrund der hohen Transkriptionsrate von dem T7 Promotor aus und dem starken Translationssignal der pET-Vektoren kam es während der Expression der Mod-Proteine 83 Diskussion zur Bildung von Einschlußkörpern. Die Bildung von Einschlußkörpern kann von Vorteil sein, wenn es eine effiziente Methode gibt, das Protein zu renaturieren. Isoliert man die homogenen Einschlußkörper, kann das exprimierte Protein schon bis zu 90 % rein vorliegen (LANGLEY et al., 1987). 4.3.1.1 Expression aus p32modA-His Aus dem Vektor p32modA2 wurde der Vektor p32modA-His hergestellt, indem das trx Gen eliminiert wurde. Somit sollte ein ModA Fusionsprotein gestaltet werden, das nur einen C-terminalen „His-Tag“ trägt. Das trx wurde aus dem Vektor p32modA2 entfernt, weil das denaturierte gpTrx-6His-ModA-6His besser an der Ni-NTA Matrix bindet als das gp10His-ModA von p16modA7. Daraus wurde geschlossen, daß ein C-terminaler „HisTag“ eine bessere Bindung an der Matrix gewährleistet. Somit sollte eine bessere Reinigung und Renaturierung über eine Ni-NTA Säule möglich sein. Um das Trx, das nicht den gewünschten Einfluß auf die Löslichkeit hatte, nicht von dem Fusionsprotein durch einen Proteinaseverdau nach der Reinigung zu entfernen, sollte das trx Gen aus dem Vektor eliminiert werden. Später zeigte sich allerdings, daß das ModA-His mit dem Cterminalen „His-Tag“ nicht besser an der Ni-NTA Matrix bindet als His-ModA. Der Cterminale „His-Tag“ war anscheinend nicht alleine für die bessere Bindung an der Matrix verantwortlich, sondern eher die gemeinsame Haftung des internen und C-terminalen „HisTags“. Der generierte Vektor p32modA-His wies nach dem Entfernen des trx statt der 8 Nukleotide Spacer, optimal sollen 5 Nukleotide sein (GOLD, 1988; RINGQUIST et al., 1992; CHEN et al., 1994), zwischen der SD-Region und dem Start-Codon AUG 11 Nukleotide auf. Außerdem fehlen dem Exprimierten gpModA-His die ersten fünf Aminosäuren (Abb. 3.20), wie die entsprechende Nukleotidsequenz bei der Entfernung des trx verloren gegangen sein könnte blieb ungeklärt. Bei dem Vorgängerplasmid (siehe auch 3.12), das 10 Nukleotide als Spacer enthielt, war keine Synthese von ModA-His nachzuweisen, da für eine gute Translationseffizienz der Abstand zwischen der SD-Region und des Start-Codons eine sehr wichtige Rolle spielt (CHEN et al., 1994). Die gute Expression aus dem Vektor p32modA-His, mit den 11 Nukleotiden Spacer ist wahrscheinlich mit der guten Übereinstimmung der sogenannten „Downstream Box“ mit der „Anti-Downstream Box“ der 16S rRNA zu erklären (SPRENGART et al., 1996). In Abb. 4.1 ist die Übereinstimmung 84 Diskussion zwischen diesen beiden Sequenzen wiedergeben. Für eine gute Translation wird nicht unbedingt eine SD-Region benötigt, eine gute Übereinstimmung, 7 – 8 komplementäre Nukleotide, stromabwärts in der Nähe des Start-Codons mit der „Anti-Downstream Box“ der 16S rRNA ist für eine effiziente Proteinsynthese ausreichend (SPRENGART et al., 1996). Position „Anti-Downstream Box“ 1469 A G U A C U U A G U G U U U C A G U A A U G C A A C U A A A A G A U U U U A A A A T A Teil der mRNA von modA-His 1483 16S rRNA p32modA-His oder Position Abb. 4.1 „Anti-Downstream Box“ 1469 A G U A C U U A G U G U U U C A G U A A U G C A A C U A A A A G A U U U U A A A A T A Teil der mRNA von modA-His 1483 16S rRNA p32modA-His Vergleich der „Anti-Downstream Box“ mit einem Teil der mRNA von modA-His. Die komplementären Nukleotide sind fett hervorgehoben und das Start-Codon ist unterstrichen. 4.3.2 Expression von ModA aus dem pBAD-Vektor Die Basalexpression der pBAD-Vektoren ist sehr gering und das Verhältnis von Induktion zu Repression kann 1.200-fach sein, im Vergleich mit 50-fach bei Ptac-basierenden Vektoren (GUZMAN et al., 1995). Da die Expression aus dem Vektor pBAD/HisB durch die Induktormenge (Arabinose) reguliert werden kann, sollte eine Expression von ModA aus diesem Vektor erfolgen, mit der Aussicht eine größere Menge lösliches und somit natives ModA herzustellen. Nach einer induzierten Überexpression von ModA und seinen Mutanten aus den Vektoren pBADmodA2, pBADmodA2-R73K und pBADmodA2-E165D zeigte sich, daß die rekombinanten Proteine zu keinem detektierbaren Anteil exprimiert wurden. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß das Arg265 der α-Untereinheit der E. coli RNAPolymerase, welches ADP-ribosyliert wird, essentiell für die Erkennung von UP-Element und CAP-abhängigen Promotoren ist (GAAL et al., 1996) (siehe auch 4.8.1). Da die Transkription von dem Promotor PBAD CAP-abhängig ist, könnte dieser nach den ersten gebildeten ModA Proteinen durch eine Ribosylierung der RNA-Polymerase nicht mehr erkannt werden. Einen Hinweis auf die Richtigkeit dieser Vermutung liefert auch, daß eine rpoA (Gen der α-Untereinheit) Mutante nicht auf Arabinose Medium wachsen kann. Die 85 Diskussion verantwortliche Mutation befindet sich bei der Aminosäure Lys271 (GIFFARD & BOOTH, 1988), also in unmittelbarer Nähe des Arg265. Da die beiden Mutanten immer noch eine schwache Ribosylierungsaktivität aufweisen, schalten auch diese evtl. den Promotor durch eine ADP-Ribosylierung der RNAPolymerase aus. Wahrscheinlich könnte eine ModA Doppelmutante R73A, E165A, die vollständig inaktiv sein sollte, von diesem Plasmid aus in einer löslichen Form exprimiert werden. Die Wuchskurven in Abb. 3.15 zeigen einen deutlichen Einfluß des Gens modA unter induzierten Wuchsbedingungen. Die entsprechende Wuchskurve weist einen deutlich flacheren Verlauf im Vergleich zum leeren Vektor auf. Dies könnte bedeuten, daß ModA exprimiert wurde, die Mengen aber zu gering waren, um eine Expression erkennen zu können. 4.4 Vermeidung von Einschlußkörpern ModA lag nach der Expression aus den pET-Vektoren durchweg in Form von Einschlußkörpern vor. Da es zu dieser Zeit noch keine effizienten Protokolle für die Renaturierung von ModA gab und die ersten Versuche, die mit 7 M GuHCl denaturierten Proteine zu renaturieren, nicht sehr effektiv waren, wurde versucht die Bildung der Einschlußkörper zu vermeiden. Die Hauptparameter, die zur Bildung von Einschlußkörpern führen sind in abnehmender Reihenfolge die mittlere Ladung der Aminosäuren (Nettoladung/Anzahl der Aminosäuren), die „Turn“ bildenden Aminosäurereste, der Cysteingehalt, der Prolingehalt, die Hydrophilizität und die Gesamtanzahl der Aminosäuren (WILKINSON & HARRISON, 1991). Die Ergebnisse der Auswertung nach diesen Kriterien zur Löslichkeit bzw. Unlöslichkeit von Proteinen sind jedoch nicht immer ganz eindeutig. Nach SCHEIN & NOTEBORN (1988) gibt es auch keinen Zusammenhang zwischen der Bildung von Einschlußkörpern und der Proteinkonzentration oder der Produktionsrate. Faktoren, die die Löslichkeit direkt beeinflussen sind möglicherweise mehr mit der Sekundärstruktur verbunden als mit der Aminosäurezusammensetzung des Proteins (SCHEIN, 1989). Die cistrans Isomerisierung der Prolinreste könnte der limitierende Schritt während der Faltung verschiedener Proteine sein (SCHEIN, 1989). Die Faltung zum nativen Protein kann somit mehrere Minuten dauern (GUISE et al., 1996). Für ModA sollte die Faltung des Proteins allerdings schnell vonstatten gehen, da zwei Minuten nach der T4 Infektion bereits aktives 86 Diskussion ModA nachzuweisen ist. Durch eine hohe Translationsrate kommt es aber zu vielen Faltungsintermediaten, die hydrophobe Oberflächen exponieren, wodurch die Proteine aggregieren könnten (MITRAKI et al., 1987; MITRAKI & KING, 1989). Rekombinante Proteine aggregieren oft, wenn E. coli bei 37° C kultiviert wird. Eine Reduktion der Temperatur auf 30° C kann häufig eine Zunahme der nativen Proteine bewirken, da die Rate der Proteinsynthese herabgesetzt ist (SCHEIN & NOTEBORN, 1988). Im Falle von ModA brachte auch eine Kultivierung bei 16° C keine Verbesserung der Expression von löslichem ModA. Sollten die zu exprimierenden Proteine Faltungshelfer in Form von Chaperonen benötigen, werden diese während der Expression ausgedünnt und können nicht mehr alle neusynthetisierten Proteine bei ihrer Faltung in die native Form unterstützen. Die CoÜberexpression von Chaperonen kann somit zu einer Erhöhung des nativen Proteins beitragen (GOLOUBINOFF et al., 1989; BUCHNER et al., 1991; BLUM et al., 1992). Der nützliche Effekt der Chaperone ist allerdings nicht vorhersagbar, so daß die passende Substrat-Chaperon Kombination erst herausgefunden werden muß (YASUKAWA et al., 1995). So konnten BLUM et al. (1992) mit der Coexpression von DnaK die Löslichkeit des menschlichen Wachstumshormons steigern und die Bildung von Einschlußkörpern verringern. Die Coexpression von GroEL und GroES hingegen hatte keinen Einfluß auf die Löslichkeit dieses Proteins. Mit der Coexpression der Hitzeschockproteine GroEL und GroES war es aber möglich, die Ribulose-bisphosphat Carboxylase Oxigenase (Rubisco) in ihrer nativen Form zu exprimieren. Diese Chaperone scheinen notwendig für den Zusammenbau der Untereinheiten zu sein (GOLOUBINOFF et al., 1989). Da die Chaperone in einer aufeinanderfolgenden Art und Weise zusammenarbeiten (LANGER et al., 1992), könnte die Coexpression nur eines Chaperons nicht ausreichen, um die Faltung in den nativen Zustand zu gewährleisten. So zeigte die Coexpression von DnaK mit His-ModA oder Trx-ModA keinen erkennbaren Anstieg an löslichen rekombinanten Protein. ModA scheint für die Faltung in den nativen Zustand nicht an das Vorhandensein von DnaK angewiesen zu sein. Bei der Coexpression von GroEL und GroES wurde kein ModA mehr exprimiert. Worauf dieses Phänomen zurückzuführen sein könnte ist nicht bekannt. Es könnten Inkompatibilitäten zwischen den beiden Plasmiden gewesen sein, oder durch die Anwesenheit des Vektors pGroESL waren die Vektoren mit modA noch instabiler und wurden schneller von den Bakterien verloren. 87 Diskussion Die Fusion mit einem hydrophilen Protein wie Thioredoxin (Trx) kann auch die Löslichkeit erhöhen. So konnten mehrere Proteine, die vorher als Einschlußkörper vorlagen, als Trx-Fusionsprotein löslich und in aktiver Form exprimiert werden (LAVALLIE et al., 1993; HLAVAC & ROUER, 1997). Dabei weist das Trx noch andere nützliche Eigenschaften auf. Es ist sehr hitzestabil und so kann eine Vorreinigung durch Denaturierung bei 80° C von kontaminierenden E. coli Proteinen erfolgen. Durch einen schnellen osmotischen Schock werden die Proteine Trx und EF-Tu aus der Zelle freigesetzt und liegen somit nur mit wenigen Verunreinigungen vor. Im vorliegenden Fall ist die Aggregationsfähigkeit des rekombinanten Proteins Trx-ModA anscheinend größer als die Löslichkeit des Trx, da bei der Überexpression wieder nur Einschlußkörper gebildet wurden. Warum ModA so stark zur Aggregation neigt ist unbekannt, zumal es keinen ausgesprochen hydrophoben Charakter aufweist (Abb. 3.2). Manche Proteine werden erst durch die Bildung von Disulfidbrücken stabilisiert, deren Bildung im reduzierend wirkenden Cytoplasma von E. coli allerdings unterbunden ist. ModA weist drei Cysteine in der Aminosäuresequenz auf, womit eine Disulfidbrücke gebildet werden könnte. ModA sollte aber keine Disulfidbrücke aufweisen, da das Cytoplasma von E. coli der Bereich ist, in dem ModA nach einer T4 Infektion gebildet wird. Somit sollte auch ohne diese kovalente Bindung eine stabile, lösliche Struktur gebildet werden können. Die Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium verhindert in manchen Fällen ebenfalls die Bildung von Einschlußkörpern. Verwendet man ein porenbildendes Protein wie das Bakteriocinfreisetzungsprotein (BRP), werden auch keine Signalsequenzen für den Durchtritt durch die Zellwand benötigt. Dabei können die Proteine nicht nur aus dem periplasmatischen Raum, sondern auch aus dem Cytoplasma freigesetzt werden (VAN DER WAL et al.,1995). Während der Überexpression von ModA in Gegenwart des BRP konnte keine Freisetzung von ModA in das Medium beobachtet werden, obwohl die Expression in diesem System gut funktioniert hat, was man an der Menge des gebildeten ModA, das als Einschlußkörper vorlag, sehen konnte. Es wurden jedoch eine Anzahl anderer Proteine im Kulturüberstand gefunden. Ob diese freigesetzten Proteine nur aus dem Periplasma oder auch aus dem Cytoplasma stammen ist unbekannt. Wenn auch aus dem Cytoplasma die Proteine ausgeschleust wurden, was nach VAN DER WAL et al. (1995) geschieht, scheint ModA schneller zu aggregieren, evtl. schon bei der Synthese an den Ribosomen, als daß es aus der Zelle ausgeschleust werden könnte. 88 Diskussion MOORE et al. (1993) konnten die Bildung von Einschlußkörpern verhindern, indem sie ein angereichertes Vollmedium (Trypton-Phosphat-Medium (2.5.1)) verwendeten. Verschiedene T4-Proteine, wie die dCMP Deaminase, eine Endonuklease und andere Proteine, konnten mit diesem Medium in löslicher und aktiver Form aus pET-Vektoren exprimiert werden, was mit anderen Vollmedien nicht gelang. Dieses Medium ist zusätzlich mit Phosphat gepuffert, da die Kontrolle des pH Wertes auch einen entscheidenden Einfluß auf die Bildung von Einschlußkörpern hat. Die Bildung von Einschlußkörpern nimmt zu, wenn der pH Wert sinkt, da der intrazelluläre pH den Faltungsprozeß und die Konformation von Proteinen beeinflußt (STRANDBERG & ENFORS, 1991). Aber auch mit diesem Medium gelang es nicht, ModA in löslicher Form zu exprimieren, selbst wenn man alle Parameter, die die Bildung von nativem Protein fördern, wie niedrige Anzuchttemperatur, geringe Induktormenge und kurze Expressionszeit zusammen anwendete. 4.5 Renaturierung von denaturierten Proteinen Da die Bildung der Einschlußkörper durch keine der verwendeten Maßnahmen unterbunden werden konnte, mußte versucht werden, die denaturierten Proteine in vitro zu renaturieren. Das Auflösen und Renaturieren der Einschlußkörper kann ein limitierender Faktor für die effiziente Herstellung von aktiven Proteinen aus E. coli sein. Da es keine allgemeingültigen Regeln für eine effiziente Renaturierung gibt, muß für jedes Protein eine neue Strategie gefunden werden. Dabei wird die Effizienz der Rückfaltung durch die Proteinsequenz, dem Redoxpotential, dem Lösungsmittel, dem pH-Wert, der Ionenstärke und der Konzentration des denaturierten Proteins beeinflußt (KOPETZKI et al., 1989). Normalerweise werden Einschlußkörper in hohen Konzentrationen von chaotropen Agenzien wie Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid (GuHCl) aufgelöst. Dabei stabilisiert Harnstoff den ungefalteten Zustand der Proteine, während GuHCl die Wasserstoffbindungen stört und dadurch die Proteinstruktur auflöst (SCHEIN, 1990). Die Verwendung von GuHCl ist dem Harnstoff jedoch vorzuziehen, da Harnstoff bei der Zersetzung Isocyanate bilden kann und freie Amino- oder Thiolgruppen der Proteine dadurch irreversibel geschädigt werden (HAGEL et al., 1971). Wie oben dargelegt, spielt die Konzentration des denaturierten Proteins eine Rolle bei der Renaturierung. Bei der Renaturierung entstehen Faltungsintermediate, bei denen 89 Diskussion hydrophobe Bereiche noch an der Oberfläche liegen. Ist die Konzentration der Proteine zu hoch, können diese Faltungsintermediate über diese hydrophoben Bereiche interagieren und fallen dabei häufig aus. Diverse Versuche mit GuHCl denaturiertes ModA über Dialyse oder Verdünnung zu renaturieren, brachten nur minimale Ausbeuten an löslichem Protein (3.9). Wurden die verdünnten Proteinlösungen zentrifugiert, fand man einen Proteinniederschlag. Wurde der Überstand danach eingeengt, viel noch einmal ein Teil des Proteins aus. Durch die Immobilisierung der „His-Tag“-Proteine an eine Ni-NTA Matrix können diese effizient renaturiert werden, indem man das denaturierende Agens im Waschpuffer immer weiter verdünnt (HOLZINGER et al., 1996; SHI et al., 1997). Der Erfolg beruht wahrscheinlich darauf, daß die Proteine voneinander getrennt sind und es somit kaum zu Protein-Protein Interaktionen kommen kann, die zu einer Aggregation der Proteine führen. Für die Proteine ModA und ModB war diese Art der Renaturierung allerdings nur sehr bedingt anwendbar, da trotz „His-Tag“ die denaturierten Proteine aus unbekannten Gründen nur sehr schlecht an dem Säulenmaterial banden, und somit die Ausbeute an renaturiertem Protein sehr gering war. Eine weitere Methode, die die Rückfaltung von in GuHCl denaturierten Proteinen über eine Gelfiltrations Chromatographie beschreitet (WERNER et al., 1994; CHAUDHURI et al., 1996) wurde hier nicht angewendet, da die Mod Proteine selbst stark verdünnt noch zur Aggregation neigen, und die Gefahr bestand, daß die Säule verstopft. Es ist nur wenig über die strukturellen Eigenschaften der Einschlußkörper bekannt. OBERG et al. (1994) konnten aber zeigen, daß die Einschlußkörper einen gewissen Anteil an Sekundärstrukturen aufweisen. Durch die Denaturierung mit GuHCl oder Harnstoff verlieren die Proteine ihre Sekundärstruktur (DILL & SHORTLE, 1991), die sie während der Synthese an den Ribosomen bereits gebildet haben (PRZYBYCIEN et al., 1994; OBERG et al., 1994). Dies ist einer der Hauptgründe für die schlechte Ausbeute der Wiederherstellung des nativen Proteins aus Einschlußkörpern. MITRAKI et al. (1987) zeigten für die 3-Phosphoglycerat Kinase, daß schon bei einer Konzentration von 0,7 M GuHCl im Puffer, eine Rückfaltung des Proteins zur nativen Form nur noch bedingt möglich ist. Sie konnten ebenfalls zeigen, daß nach einer Renaturierung zwar sämtliche β-Strukturen wieder vorhanden waren, aber 29 % der α-Helices ungefaltet blieben. 90 Diskussion KHAN et al. (1998) nahmen an, daß die Renaturierung effektiver sein sollte, wenn man die Sekundärstrukturen während der Lösung der Einschlußkörper nicht auflöst. Sie konnten zeigen, daß man die Einschlußkörper bei einem pH von 12,0 und 2 M Harnstoff auflösen kann, ohne die nativ-ähnliche Sekundärstruktur zu zerstören und die Rückfaltung zum nativen Protein eine höhere Ausbeute erreicht, als es mit den herkömmlichen Methoden mit hohen Konzentrationen von Harnstoff oder GuHCl möglich war. So konnten selbst bei hohen Proteinkonzentrationen von bis zu 1 mg/ml für His-ModA bzw. 3 mg/ml für Trx-ModA die Proteine mit hoher Ausbeute renaturiert werden (3.9.2). ModA scheint allerdings nicht sehr stabil zu sein, da nach einigen Tagen Lagerung bei -20° C ein Teil der Proteine ausfällt. Nach früheren Beobachtungen wußte man bereits, daß ModA in vivo ebenfalls sehr instabil ist (GOFF, 1974; HORVITZ, 1974b). Nichts desto trotz hat man mit diesem Verfahren der Renaturierung nun eine Methode in der Hand größere Mengen ModA in aktiver Form zu gewinnen. So liegt die Ausbeute von angereicherten ModA (isolierte Einschlußkörper mit ca. 90 % ModA) bei etwa 70 mg aus einer 500 ml Expressionskultur. 4.6 Reinigung von ModA Zur Reinigung der „His-Tag“ Proteine wurde die von PORATH et al. (1975; PORATH, 1992) eingeführte immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) verwendet. Diese Methode nutzt die starke Affinität von zweiwertigen Ionen wie Ni2+ zu aufeinanderfolgenden Histidinresten (6 – 10 Stück) aus. Die gebundenen Proteine können anschließend mit Imidazol oder bei pH 6,0 eluiert werden. Hierbei ist es möglich, ein Protein in einem Schritt von weniger als 1 % Gesamtprotein auf über 95 % Homogenität aufzureinigen (JANKNECHT et al., 1991). Die Aufreinigung unter denaturierenden Bedingungen vermindert den Anteil an Fremdproteinen, da es zu keinen Protein-Protein Interaktionen kommen kann, wie es unter nativen Bedingungen möglich ist (LEGRICE & GRÜNINGER-LEITCH, 1990). Für die effiziente Reinigung des rekombinanten Proteins ModA wurde eine N-terminale Fusion mit einer 10-Histidin-Sequenz („His-Tag“) oder eine C-terminale Fusion mit einer 6-Histidin-Sequenz generiert. Die Reinigung unter denaturierenden Bedingungen über eine Ni-NTA Säule war wie schon dargelegt nicht sehr effektiv. Es wurde vermutet, daß evtl. der „His-Tag“ nicht mit exprimiert wurde. Das Vorhandensein des „His-Tags“ wurde mit einem Ni-NTA Konjugat überprüft. Wie Abb. 3.16 zeigt, konnte der „His-Tag“ eindeutig nachgewiesen werden. Da ein Ni-NTA 91 Diskussion Konjugat, also praktisch die gleiche Erkennung des „His-Tags“, wie an einer Ni-NTA Matrix verwendet wurde, ist es nicht einsichtig, warum die Proteine nicht ebenfalls an der Matrix binden. Es sind zur Zeit mit ModA und ModB vier Proteine bekannt, die unter denaturierenden Bedingungen nicht an Ni-NTA binden. Es bestand aber die Möglichkeit, daß ModA bzw. ModB, wie die anderen beiden Proteine, unter nativen Bedingungen gereinigt werden können (STEINERT persönliche Mitteilung (Firma Qiagen)). Mit der effizienten Renaturierungsmethode (3.9.2) lag ausreichend natives His-ModA für eine Reinigung unter nativen Bedingungen vor. Das renaturierte His-ModA bindet allerdings nicht mit den Kapazitäten (5 – 10 mg Protein pro ml Säulenmaterial) wie der Hersteller sie angibt, jedoch sehr viel besser als das denaturierte Protein an der Ni-NTA Matrix. Nach erfolgter Elution von der Säule kann man eine Reinheit von 95 % und darüber erzielen (Abb. 3.17). 4.7 Mutanten von ModA und ModB Nicht alle Aminosäuren eines Proteins sind für die katalytische Aktivität notwendig. Durch ortsspezifische Mutagenese können die funktionellen und somit für die Katalyse essentiellen Aminosäuren ermittelt werden. Das Alignment einiger ADP- Ribosyltransferasen (Abb. 1.9) zeigt konservierte Aminosäuren auf, die für die Funktion des Enzyms relevant sein sollen. Wie in der Einleitung erläutert, zeigen alle bekannten Strukturen der ADP-ribosylierenden Toxine eine Aushöhlung, in der die NAD+-Bindestelle lokalisiert ist. Diese Mulde besteht aus 18 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die eine αHelix über ein β-Faltblatt bildet (Abb. 4.2). Diese Struktur wird von anderen β-Strängen flankiert, die die katalytischen Seitenketten tragen. Dabei geht diese konservierte dreidimensionale Struktur aber nicht auf konservierte Aminosäuren zurück. Für die Cholera Toxin Gruppe ist ein Arginin in β1 hoch konserviert (Abb. 1.9). Ein konservativer Austausch des nukleophilen Arginins gegen Lysin eliminiert die enzymatische Aktivität, da das Lysin bei einem physiologischen pH protoniert vorliegt und somit keine Interaktion mit der Amidgruppe des Nicotinamid vom NAD+ eingehen kann (LOBET et al., 1991; BURNETTE et al., 1991). Eine weitere vollständig konservierte Aminosäure, die bei allen ADP-Ribosyltransferasen zu finden ist, ist das Glutamat in β5 (Abb. 1.9). In vielen Proteinen ist dieser Rest so wichtig, daß nicht einmal ein konservierter Austausch zu Aspartat für die Enzymaktivität toleriert werden kann (TWETEN et al., 1985; PIZZA et al., 1988). 92 Diskussion Abb. 4.2 Schemazeichnung der NAD+-Bindetasche, die in allen ADPRibosyltransferasen vorhanden sein soll. Gezeigt wird die Interaktion des Nicotinamidringes mit dem konservierten Arg/His Rest. Das katalytisch essentielle Glu ist ebenfalls angegeben. (nach DOMENIGHINI et al., 1994) In Tabelle 4.1 sind einige Untersuchungen aufgelistet, in denen die oben beschriebenen katalytisch essentiellen Aminosäurereste durch ortsspezifische Mutagenese verifiziert wurden. Nach diesen Ergebnissen und dem Alignment (Abb. 1.9) sollten für ModA die Aminosäuren Arg72 und Glu165 an der Katalyse beteiligt sein, für ModB entsprechend Arg73 und Glu173. In beiden Fällen wurden konservative Austausche der Aminosäuren vorgenommen, d.h. Arg wurde gegen Lys und Glu gegen Asp ausgetauscht (3.11). Der Austausch erfolgte über eine PCR, in der komplementäre Primer eingesetzt wurden, die die Mutation tragen (2.6.4). Der Elternstrang wurde mit dem Restriktionsenzym DpnI, das methylierte und hemimethylierte DNA erkennt, verdaut, so daß hauptsächlich der neusynthetisierte und mutagenisierte Vektor für eine Amplifikation in E. coli transformiert wurde. Eine Sequenzierung der Plasmide bestätigte die erfolgreiche Mutagenese. 93 Diskussion Tabelle 4.1 Katalytisch aktive Aminosäuren einiger ADP-Ribosyltransferasen, die durch Mutageneseexperimente identifiziert wurden. Enzym (Organismus) Diphtherie Toxin (Corynebacterium diphtherie) Diphtherie Toxin (Corynebacterium diphtherie) Exotoxin A (Pseudomonas aeruginosa) Exotoxin A (Pseudomonas aeruginosa) Pertussis Toxin (Bordetella pertussis) Pertussis Toxin (Bordetella pertussis) hitzelabiles Enterotoxin (Escherichia coli) hitzelabiles Enterotoxin (Escherichia coli) C2 Toxin (Clostridium botulinum) C2 Toxin (Clostridium botulinum) Iota Toxin (Clostridium perfringens) Iota Toxin (Clostridium perfringens) C3-ähnliches Toxin (Clostridium botulinum) Cholera Toxin (Vibrio cholerae) Cholera Toxin (Vibrio cholerae) Mono-ADP-Ribosyltransferase (Kaninchen) Poly-ADP-Ribosyltransferase (Mensch) ModA (Bakteriophage T4) ModA (Bakteriophage T4) ModB (Bakteriophage T4) ModB (Bakteriophage T4) katalytisch aktive Aminosäure His-21 Glu-148 His-440 Glu-553 Arg-9 Glu-129 Arg-7 Glu-112 Referenz PAPINI et al., 1989 CARROLL & COLLIER, 1984; TWETEN et al., 1985 CARROLL & COLLIER, 1988 CARROLL & COLLIER, 1987; DOUGLAS & COLLIER, 1987 BURNETTE et al., 1988 BARBIERI et al., 1989 ANTOINE et al., 1993 LOBET et al., 1991 Arg-299 TSUJI et al., 1991 CIEPLAK et al., 1995 BARTH et al., 1998 Glu-389 BARTH et al., 1998 Arg-295 PERELLE et al., 1996 Glu-378 Glu-380 Glu-174 PERELLE et al., 1996 Arg-7 BURNETTE et al., 1991 Glu-112 TSUJI et al., 1991 Glu-240 TAKADA et al., 1995 Glu-988 MARSISCHKY et al., 1995 Arg-72 diese Arbeit Glu-165 diese Arbeit Arg-73 diese Arbeit Glu-173 diese Arbeit AKTORIES et al., 1995 94 Diskussion Für eine schnelle und einfache Überprüfung der Aktivität der Mutanten von ModA und ModB wurde der Plasmidstabilitätstest (STUDIER & MOFFATT, 1986; STUDIER et al., 1990) modifiziert (2.5.4.3). In diesem Test macht man sich die Toxizität von ModA bzw. ModB zu Nutze. Sind die entsprechenden Plasmide in den Stamm C41(DE3) transformiert, findet man keine Koloniebildung auf IPTG-haltigen Agar-Platten. Die Bakterien bilden erst Kolonien, wenn durch eine Mutation die toxischen Proteine nicht mehr gebildet werden oder die Proteine selbst durch eine Mutation in ihrer Aktivität eingeschränkt sind. Vergleicht man dann noch die Größe der Kolonien auf induzierenden und nicht induzierenden Agar-Platten hat man einen guten Anhaltspunkt auf die Aktivität der einzelnen Mutanten (Tabelle 3.3). So lag die Koloniegröße der generierten Mutanten unter induzierten Bedingungen bei ca. 50 % von der unter nicht induzierten Bedingungen. Dies bedeutet, daß die konservativen Austausche in ModA bzw. ModB zu keiner totalen Inaktivierung der Proteine geführt haben, deren Aktivität aber so stark abgenommen hat, daß sich Kolonien bilden konnten. Erst bei einem nicht konservativen Austausch des Arg72 zu Ala bei ModA findet man Kolonien gleicher Größe (NIVINSKAS persönliche Mitteilung). Dies bedeutet, daß in diesem Fall wahrscheinlich keine Restaktivität von ModA mehr zu verzeichnen ist. Beim Austausch des Glu165 gegen Ala bei ModA findet sich keine vollständige Inaktivierung des Enzyms. Mit einer Koloniegröße von 70-80 % liegt diese aber über der von der Mutante E165D. Also scheint hier die Aktivität durch diesen nicht konservativen Austausch weiter gesunken zu sein. Einen größeren Einfluß auf die Katalyse scheint das in unmittelbarer Nähe liegende Glu163 zu haben. Bei der Mutation E163A wird ModA anscheinend vollständig inaktiviert. Aminosäureaustausche gegen Alanin an den ebenfalls konservierten Aminosäuren Ser109, Phe127 und Phe129 in β2 bzw. β3 (Abb. 1.9) scheinen ModA ebenfalls vollständig zu inaktivieren (Tabelle 3.3). Bei Mutageneseuntersuchungen sollte man aber immer bedenken, daß ein einzelner Aminosäureaustausch auch dazu führen könnte, daß ein Protein seine Tertiärstruktur verliert und eine andere Konformation einnimmt. Dies würde wahrscheinlich ebenso eine Inaktivierung des Proteins anzeigen, obwohl die entsprechende Aminosäure nicht an der Katalyse beteiligt ist, sondern lediglich die Struktur des Proteins verändert wurde. So zeigt die Sekundärstruktur Vorhersage der Mutanten ModA_E165D und ModA_E165A in der Nähe der Mutation einen gravierenden Wechsel von einer α-Helix zu einem β-Faltblatt (Abb. 4.3). Da die Mutante ModA_E165D in dem Plattentest aber noch eine Restaktivität aufweist, scheint die Tertiärstruktur nicht wesentlich anders zu sein als beim 95 Diskussion Wildtyp ModA. Somit scheint die Sekundärstruktur Vorhersage an dieser Stelle nicht ganz zu stimmen. Bei der Mutante ModA_E165A liegt fast die gleiche Sekundärstruktur Vorhersage vor wie beim Wildtyp, also wahrscheinlich auch die gleiche Tertiärstruktur. Der Ausfall der Aktivität deutet darauf hin, daß Glu165 an der Katalyse beteiligt ist. Eine letzte Sicherheit, daß diese oben genannten Aminosäuren an der Reaktion involviert sind, könnte eine Kristallisation von ModA liefern. Aber auch die Cirkulardichroismus (CD) Spektroskopie kann Anhaltspunkte darüber liefern, ob durch eine eingefügte Mutation sich der Anteil an Helices oder Faltblättern verändert hat (FLANDERS et al., 1984; STRZELECKAGOLASZEWSKA et al., 1985). ModA_Wildtyp 141 EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQEVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL ccccccccccccchhhhhhhcchhhhccccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec ModA_E165D 141 EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQDVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL ccccccccccccceeeeeeeecchhhhhccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec ModA_E165A 141 EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQAVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL ccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec Abb. 4.3 Unterschiede in den Sekundärstruktur Vorhersagen von ModA_E165D und ModA_E165A zum Wildtyp ModA. Die mutierte Aminosäure ist in Fettdruck hervorgehoben. Die Vorhersage erfolgte nach dem Algorithmus von GARNIER et al. (1996). h: α-Helix; e: β-Faltblatt; c: ungeordnete Struktur 4.8 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB Der erste Aktivitätstest nach ROHRER et al. (1975) mit löslichen Proteinrohextrakten einer Überexpression zeigte, daß beide Proteine ADP-Ribosyltransferasen sind und nur das Protein des zweiten Leserahmens die RNA-Polymerase markierte (Abb. 3.10). Somit besitzt der Bakteriophage T4 nicht zwei, sondern drei ADP-Ribosyltransferasen, das Alt-, das ModA- und das ModB-Protein. In diesem ersten Test wurden sehr wenige Proteine radioaktiv markiert, was wahrscheinlich an der geringen Menge an löslichem Mod, einer für so wenig Protein kurzen Reaktionszeit und an einer kurzen Exposition liegen könnte. Bei nachfolgenden Aktivitätstests mit gereinigtem Enzym zeigten sich im Autoradiogramm mehrere markierte Banden (Abb. 3.21). Diese Vielfalt der Markierungen konnte in weiteren Versuchen mit löslichen Proteinüberständen ebenfalls nachvollzogen 96 Diskussion werden. Die Generierung der zusätzlich markierten Banden liegt also nicht an einer veränderten Faltung der Proteine nach der Renaturierung der Einschlußkörper, sondern sind vielmehr eine Auswirkung der Konzentration an aktivem Protein. Von den Proteinen, die durch ModA modifiziert werden, ist zur Zeit nur eines bekannt, die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase und für ModB ist im Moment nur das S1 Protein der Ribosomen identifiziert. Inwiefern die anderen Markierungen auf die Unspezifität der ADP-Ribosyltransferasen zurückzuführen sind (siehe auch 4.9), oder ob sie einen Einfluß auf den Wirt oder die T4 Entwicklung haben, muß noch geklärt werden. Bei der Verwendung von zwei oder allen drei ADP-Ribosyltransferasen in einem Reaktionsansatz tritt kein erkennbarer synergetischer Effekt auf (Abb. 3.22). Es findet sich lediglich eine Summierung der radioaktiven Markierungen. Somit scheint jede ADPRibosyltransferase des T4 unabhängig zu arbeiten, ohne einen Einfluß auf die anderen beiden Transferasen auszuüben oder von ihnen beeinflußt zu werden. Nicht infizierte E. coli zeigen ebenfalls eine ADP-Ribosylierung, die mit dem Alter der Kultur zunimmt und evtl. eine signifikante Rolle im Übergang von der logarithmischen in die stationäre Phase spielt (SKORKO et al., 1977; SKORKO & KUR, 1981). Dabei wird jedoch nur ein Protein mit ca. 20 kDa in vivo markiert. Diese Markierung bei 20 kDa wird in den in dieser Arbeit beschriebenen Kontrollansätzen nicht gefunden. Dies liegt wahrscheinlich daran, daß bei SKORKO & KUR Gesamtprotein verwendet wurde und in den erwähnten Kontrollen der vorliegenden Arbeit nur lösliches Protein verwendet wurde. Dies würde bedeuten, daß das besagte 20 kDa Protein mit der unlöslichen Zellfraktion sedimentierte. Die Markierung bei ca. 70 kDa wurde von SKORKO & KUR allerdings nicht gefunden. Unter in vitro Bedingungen wurden mit verschiedenen Proteinfraktionen von E. coli auch noch diverse andere, nicht näher beschriebene Proteine markiert, dieses ADPribosylierende E. coli Enzym ist allerdings sehr instabil, es fällt aus und ließ sich nicht weiter reinigen (SKORKO et al., 1977; SKORKO & KUR, 1981). 4.8.1 ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit durch ModA ModA ADP-ribosyliert die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase. Diese Modifikation sollte mit einigen Auswirkungen auf die Transkription verbunden sein. So 97 Diskussion wird die α-Carboxiterminale Domäne (αCTD) für die Interaktion mit stromaufwärts liegenden Promotorelementen (UP-Elemente) benötigt, wie bei dem ribosomalen E. coli Promotor rrnB P1 (ROSS et al., 1993; 1998). Die αCTD ist ebenfalls das Ziel für viele Transkriptionsaktivatoren (ISHIHAMA, 1993), wie z.B. den Klasse I Aktivatoren (ZOU et al., 1992; TANG et al., 1994). Von CAP (Katabolit Aktivator Protein) werden immerhin ca. 10 % aller E. coli Gene reguliert (ISHIHAMA, 1993). Das Arg265 scheint in diesen Fällen eine besonders wichtige Rolle einzunehmen (ZOU et al., 1992). GAAL et al. (1996) konnten zeigen, daß eine Mutation R265A in der αCTD für die Transkription von UP-Element abhängigen Promotoren beinahe den gleichen Effekt hat, als würde der gesamte Carboxyterminus fehlen. Wie Abb. 4.4 zeigt, kann der ADP-Ribosylrest den gesamten Carboxyterminus überspannen und der große, negativ geladene Rest so die Interaktion mit UP-Elementen oder Aktivatorproteinen unterbinden, aber auch neue Interaktionsflächen für z.B. vom T4 neusynthetisierte Proteine liefern. Es ist möglich, daß die ADPRibosylierung am Arg265 die Aktivatoren und die stromaufwärts liegenden Bereiche der ribosomalen Wirtspromotoren daran hindert die Transkription zu stimulieren und somit der beobachtete schnelle Abfall der Wirtstranskription bei einer T4 Infektion verursacht wird (ROSS et al., 1993). Außerdem könnte die ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit eine Rolle in der Verminderung der RNAP-Promotor Interaktion spielen, was die Transkriptelongation beeinflußt (ADELMAN et al., 1998). Für die Transkriptionsinitiation an Promotoren ohne UP-Elemente wird die αCTD nicht unbedingt benötigt (IGARASHI & ISHIHAMA, 1991). Sie hat hier aber trotzdem eine funktionelle Rolle, indem sie die Bildung des offenen Transkriptionskomplexes fördert (BURNS et al., 1999). Die Roh-abhängige Transkriptionstermination ist für die Genexpression und deren Regulation sehr wichtig. Hier spielt die αCTD ebenfalls eine sehr wichtige Rolle. Besonders die Aminosäuren Arg265, Gly296, Leu300, Ile303, Lys304, Asp305 und Leu307 werden für eine effiziente Roh-abhängige Termination in vivo benötigt. Ihr Austausch gegen Alanin hat teilweise den gleichen Effekt als würde der gesamte Carboxyterminus fehlen (KAINZ & GOURSE, 1998). 98 Diskussion Phe 249 Glu 329 Arg 317 Arg 310 Arg 255 Arg 284 Lys 271 Lys 304 Lys 291 Lys 298 Arg 265 Lys 297 ADP-Ribosylrest Abb. 4.4 α-Carboxyterminus der E. coli RNA-Polymerase mit ADP-Ribosylrest am Arg265. Die genaue Lage des ADP-Ribosylrestes ist nicht bekannt, die angegebene Position beruht auf Vermutungen. Es sind das Ende und der Anfang der αCTD sowie sämtliche Arginine und Lysine angegeben. Es wurde gezeigt, daß die ADP-ribosylierte RNA-Polymerase von den mittleren T4 Promotoren aus nicht sehr gut transkribiert. Hier wird die Transkription durch MotA („modifier of transcription“ von T4) aber aktiviert, da erst durch MotA die Bildung des offenen Transkriptionskomplexes erreicht werden kann (HINTON et al., 1996). Die unmodifizierte E. coli RNA-Polymerase kann von den mittleren T4 Promotoren transkribieren, es wird hier die erweiterte –10 Sequenz (TGNTATAAT) erkannt, aber die Transkription kann nicht mehr durch MotA stimuliert werden (HINTON, 1991; SCHMIDT & KREUZER, 1992). In Gegenwart von AsiA (Antisigmafaktor von T4) wird die unmodifizierte RNA-Polymerase wieder durch MotA aktiviert und die Transkription von den mittleren Promotoren gesteigert (OUHAMMOUCH et al., 1995; HINTON et al., 1996). Des weiteren wird die Transkription an den frühen Promotoren durch AsiA vermindert, wodurch von der frühen auf die mittlere Transkription umgeschaltet wird (OUHAMMOUCH et al., 1994; 1995). 99 Diskussion Die ADP-ribosylierte RNA-Polymerase erkennt also keine Promotoren mit erweiterter -10 Region, und die Kontakte der α-Untereinheit mit der DNA und Aktivatoren geht verloren, was einmal die Erkennung der entsprechen Wirtspromotoren unterdrückt, aber auch die Transkription von mittleren T4 Promotoren während der frühen Infektionsphase verhindert. Diese Einschränkungen in der Promotorerkennung der Wirts DNA verursachen womöglich die Toxizität von ModA. Für die Erkennung und erhöhte Transkription von späten T4 Promotoren wird die carboxyterminale Domäne der α-Untereinheit nicht benötigt (TINKER et al., 1995), somit hat die ADP-Ribosylierung des Arg265 keinen Einfluß auf die Transkription dieser späten Promotoren. RABUSSAY & GEIDUSCHEK (1977b) haben allerdings gezeigt, daß T4 modifizierte RNA-Polymerase für eine solide Stimulation der späten T4 Promotoren benötigt wird. Diese beiden Aussagen stehen nicht unbedingt im Widerspruch zu einander, da RABUSSAY & GEIDUSCHEK (1977b) T4 DNA, die 5-Hydroxymethylcytosin anstelle von Cytosin besitzt verwendet haben und diese modifizierte DNA normalerweise notwendig für die Synthese von späten Proteinen sein soll (zusammengefaßt bei RABUSSAY & GEIDUSCHEK, 1977a). TINKER et al. (1995) haben jedoch für ihre Untersuchungen späte Promotoren verwendet, die auf Plasmiden liegen und somit Cytosin enthalten. Der gefundene Unterschied mag also bei den verschiedenen DNA Typen liegen. 4.9 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA Da den ADP-Ribosyltransferasen offensichtlich eine Spezifität für die Seitenkette der Guanidinderivate fehlt (MOSS & VAUGHAN, 1977; 1978; MOSS et al., 1979; MEKALANOS et al., 1979), können künstliche Substrate für Aktivitätstests eingesetzt werden (S OMAN et al., 1983; 1984). Im Gegensatz zu vielen bakteriellen ADP-Ribosyltransferasen, die für in vitro Untersuchungen erst aktiviert werden müssen (PASSADOR & IGLEWSKI, 1994), sind die Transferasen des T4 von Anfang an aktiv. Die Aktivität von ModA wurde mit einem photometrischen Test ermittelt, wobei das artifizielle Substrat p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) eingesetzt wurde. Das Substrat NBAG mußte für diesen Versuch erst hergestellt werden (2.8.2.1). Zur Überprüfung, ob die richtige Substanz synthetisiert wurde, wurde ein Wellenlängenscan von 230 – 550 nm durchgeführt und mit den Scans der Ausgangsmaterialien und dem Scan für NBAG von SOMAN et al. (1983) verglichen. Es zeigte sich, daß NBAG synthetisiert 100 Diskussion wurde und keine erkennbaren Verunreinigungen zu finden waren. In dem entsprechenden Test wird das NBAG nur mono-ADP-ribosyliert (SOMAN et al., 1983; 1984). Dieser Hinweis muß bedacht werden, damit die Reaktionsgeschwindigkeit richtig bestimmt werden kann. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, daß während der Durchführung der pH-Wert konstant gehalten wird, da die Methode auf der Änderung des pKa von NBAG basiert (Erniedrigung von 0,7 – 0,8 pH Einheiten) (SOMAN et al., 1983). Deshalb kann diese Methode auch nicht über einen weiten pH-Bereich angewendet werden. Nach SKORKO et al. (1977) liegt das pH-Optimum für ModA bei 7,5 und das Temperaturoptimum zwischen 15° C und 20° C. Also sollte bei diesem Test (pH 7,4) keine große Aktivitätseinbuße von ModA zu befürchten sein. Außerdem war schon bekannt, daß ModA kein Mg2+ benötigt und nicht durch EDTA inhibiert wird, des weiteren wird es durch Sulfhydryl-Reagenzien geschützt und Nicotinamid ist ein Inhibitor für die Reaktion (SKORKO et al., 1977). Bei der Aktivitäts-Untersuchung von ModA unterliegt man jedoch einer gewissen Gradwanderung, da ModA bei einer niedrigen Ionenstärke instabil ist, die Aktivität aber durch eine hohe Ionenstärke inhibiert wird (SKORKO et al., 1977). Vor der Bestimmung von Vmax und KM wurde überprüft, ob unter den gegebenen Bedingungen ein linearer Zusammenhang in Abhängigkeit der Proteinkonzentration besteht. Die Linearität wurde bestätigt, was bedeutet, daß es unter der gegebenen Versuchsanordnung zu keiner Limitierung der Substrate kam. Im Anschluß wurden die Werte für Vmax und KM in Abhängigkeit beider Substrate (NAD+, NBAG) bestimmt. Dabei gibt der KM Wert die Substratkonzentration an, bei der die Hälfte der aktiven Zentren besetzt sind. Es wurde ein KM für NAD+ von 258 µM und für NBAG von 219 µM, also ein fast identischer Wert ermittelt. In Tabelle 4.2 sind zum Vergleich KM-Werte einiger ADPRibosyltransferasen aufgeführt. Der Wert, der von SKORKO et al. (1977) für ModA ermittelt wurde liegt um den Faktor 18 niedriger als der in dieser Arbeit ermittelte Wert. Diese Abweichung kann nur durch die unterschiedlichen Versuchsbedingungen erklärt werden. Die Werte für Vmax variieren stärker. Der Wert für Vmax(NAD+) liegt bei 20 mol Produkt h-1 . mol ModA-1 und Vmax(NBAG) bei nur 5,3 mol Produkt . h-1 . . mol ModA-1. Die Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von NBAG liegt wahrscheinlich höher, da 101 Diskussion ModA sich selbst ribosyliert und diese Ribosylierung bei wenig vorhandenem NBAG stärker zu tragen kommt und mit diesem Testverfahren nicht registriert werden kann. Man hat es hier mit einer enzymatischen Reaktion mit zwei Substraten zu tun (wenn man ModA, das sich autoribosyliert mitzählt, sind es sogar drei Substrate). Da in den Reaktionsansätzen ein Substrat (entweder NAD+ oder NBAG) aber immer konstant im Sättigungsbereich gehalten wurde, kann man sie wie eine Reaktion mit einem Substrat behandeln. Eine enzymatische Reaktion mit einem Substrat folgt nach Michaelis und Menten folgender Gleichung: k1 E n zy m + S u b strat S E k2 E n zy m -S u b stra t-K o m p lex ES k3 E n zy m + P ro d u k t E P (k2 + k3) k1 Für KM gilt: KM = Für k3 « k2 gilt: k2 KM = k 1 Für die Reaktionsgeschwindigkeit gilt nach Michaelis und Menten folgende Gleichung: [S] V = Vmax [S] + K M Wenn k2 wesentlich größer als k3 ist zeigt ein hoher KM-Wert eine schwache und ein niedriger KM-Wert eine feste Bindung des Substrates zum Enzym an. Tabelle 4.2 KM-Werte verschiedener ADP-Ribosyltransferasen. Protein ADP-Ribosyltransferase Substrat NAD+ KM (µM) Referenz 30 MOSS et al., 1979 aus Vogelerythrocyten NADP+ 30 Cholera Toxin NAD+ 4000 MOSS et al., 1976 E. coli Enterotoxin NAD+ 8000 MOSS & RICHARDSON, 1978 Pertussis Toxin NAD+ 2 ModA NAD+ 14,3 SKORKO et al., 1977 ModA NAD+ 258 diese Arbeit FINCK-BARBANCON & BARBIERI, 1995 102 Diskussion Die katalytische Konstante kkat von ModA wurde für NAD+ mit 0,334 Umsätzen pro Minute bestimmt. In Tabelle 4.3 sind die kkat-Werte einiger ADP-Ribosyltransferasen angegeben. ModA hat eine relativ geringe Aktivität. Sie liegt um einen Faktor von ca. 180 unter der des Diphtherie Toxins, aber auch um einen Faktor 1000 höher als bei dem C3ähnlichem Toxin von Clostridium limosum. Tabelle 4.3 Katalytische Konstanten (kkat) einiger ADP-Ribosyltransferasen. Protein C2 Toxin C3-ähnliches Toxin kkat (min-1) 1,77 Referenz BARTH et al., 1998 0,00033 BÖHMER et al., 1996 Diphtherie Toxin 58,8 WILSON et al., 1990 E. coli Enterotoxin 0,65 CIEPLAK et al., 1995 Alt-Protein vom T4 0,028 KOCH, 1999 ModA 0,334 diese Arbeit 4.10 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNAPolymerase Die ADP-Ribosylierung der E. coli RNA-Polymerase hat einen Einfluß auf die Transkription. MAILHAMMER et al. (1975) konnten zeigen, daß modifizierte RNAPolymerase unter in vitro Bedingungen von E. coli DNA weniger mRNA synthetisiert als normale RNA-Polymerase. Unter den gleichen Bedingungen wurde die mRNA Bildung von T4 DNA durch modifizierte RNA-Polymerase jedoch nicht beeinträchtigt, was darauf hindeutet, daß die Genexpression der Wirtszelle durch die ADP-Ribosylierung zum Teil ausgeschaltet wird. Dabei zeigte sich die normale RNA-Polymerase 4 bis 15 mal effektiver an bestimmten E. coli Promotoren als die modifizierte RNA-Polymerase. Sie konnten zeigen, daß die unmodifizierte α-Untereinheit essentiell für die effiziente Transkription des lac Promotors ist. In einem in vivo System konnte man zeigen, daß alterierte RNA-Polymerase die Transkription von vielen frühen T4 Promotoren steigert (WILKENS & RÜGER, 1996). Jetzt sollte im Vergleich die Auswirkung von modifizierter RNA-Polymerase (RNAP) untersucht werden. Experimente mit gereinigter RNAP, die während des laufenden Versuchs durch Alt oder ModA ADP-ribosyliert werden sollte, zeigten keine Veränderung in der Transkriptionsrate. Entweder fehlten zusätzliche Komponenten in dem 103 Diskussion Reaktionsansatz, die mit der ADP-ribosylierten RNAP interagieren, oder die Ribosylierung durch Alt bzw. ModA lief in dem Versuchsansatz zu langsam ab, so daß während der Versuchsdauer kein Einfluß auf die Transkription festzustellen war. Deshalb wurde ein „halb in vivo“ System, bei dem die löslichen Proteine einer überexprimierenden Kultur eingesetzt wurden, verwendet. Es wurde die Transkription von genomischer DNA von T4 bzw. E. coli untersucht. Von der T4 DNA wird in diesem System nur von den frühen Promotoren transkribiert, da die Proteine AsiA und MotA, die für die Transkription der mittleren Promotoren notwendig sind, fehlen. Eine Transkription von den späten Promotoren erfolgt ebenfalls nicht, da gp55, gp33 und der gp44-gp62 Komplex fehlen. Von T4 DNA läßt sich mit alterierter RNA-Polymerase durch Zugabe von mehr löslichem Proteinextrakt die Transkriptmenge steigern (Abb. 3.29). Bei unveränderter oder modifizierter RNAP ist eine solche Steigerung nicht festzustellen. Mit modifizierter RNAP erzielt man außerdem nur zwischen 30% und 50% der Transkriptmenge wie von der normalen RNAP. Dies bedeutet, daß modifizierte RNAP von T4 DNA schlechter transkribiert als normale RNAP. Der Unterschied kommt wahrscheinlich daher, daß normale RNAP auch von den mittleren Promotoren transkribiert, was die modifizierte RNAP nicht kann (siehe auch 4.8.1). Die ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit durch ModA bewirkt anscheinend, daß die gute Transkription der frühen T4 Promotoren durch die alterierte RNAP stark eingeschränkt und somit die frühe Transkription fast eingestellt wird. Bei der Transkription von E. coli DNA zeigen alterierte und normale RNAP ein fast identisches Verhalten. Durch Zugabe von mehr löslichem Proteinextrakt konnte in beiden Fällen nicht mehr Transkript gebildet werden. Für die normale RNAP wäre zu erwarten gewesen, daß mit mehr Protein auch mehr Transkript gebildet wird. Es sei denn, daß mit der eingesetzten Proteinmenge am Anfang des Versuchs schon so viel RNAP im Ansatz ist, daß sämtliche Promotoren auf der vorhandenen DNA bereits „ausgelastet“ sind. Übereinstimmend mit der T4 DNA zeigt die modifizierte RNAP bei der E. coli DNA wieder eine nur geringe Transkriptbildung. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß durch die modifizierte RNAP ein Teil der E. coli Promotoren abgeschaltet wird, was wohl zu dem beobachteten Zusammenbruch der E. coli Transkription beitragen könnte (GOLDFARB & PALM, 1981). Der Zusammenbruch der bakteriellen RNA-Synthese findet in alt -, mod Mutanten aber immer noch statt (GOFF & SETZER, 1980), so ist ModA nicht alleine dafür Verantwortlich, könnte aber einen Teil dazu beitragen. 104 Diskussion Man sollte bei diesen in vitro Versuchen aber bedenken, daß die RNA-Polymerase von vielen zusätzlichen Stellen, wie Einzelstrangbrüchen in der DNA, transkribieren kann, die keine Promotoren darstellen und es somit zu einer falschen Aussage kommen kann. Es bleibt noch viel zu tun, um die Auswirkungen der drei ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 auf seinen Wirt E. coli, aber auch auf seine eigene Entwicklung vollständig zu verstehen. 105 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die ADP-Ribosylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation von Proteinen, die bei Viren, Prokaryonten und Eukaryonten auftritt und zur Regulation diverser Stoffwechselprozesse eingesetzt wird. Obwohl die Familie der ADPRibosyltransferasen kaum Homologien in der Aminosäuresequenz aufweisen, zeigen sie doch eine gemeinsame Struktur, die das katalytische Zentrum bildet. Anhand der Sekundärstruktur kann ein Alignment der bekannten ADP-Ribosyltransferasen angefertigt werden. Das Alignment zeigt einige hoch konservierte Aminosäuren, die wahrscheinlich für die Katalyse notwendig sind. Vom Bakteriophagen T4 waren zwei, für ihn nicht essentielle, ADP-Ribosyltransferasen bekannt, das gpAlt und das gpMod. Die Auswirkungen von Alt auf die frühen T4 Promotoren sind bereits bekannt, nun sollte die Auswirkung von Mod auf die Transkription untersucht werden. Dazu mußte zuerst das Gen für Mod kloniert werden. Es gab zwei potentielle Kandidaten, die das Gen mod sein konnten. Die Gene liegen in einem Operon hinter dem frühen T4 Promotor P13.149. Bei den Klonierungsarbeiten stellte sich heraus, daß beide Genprodukte toxisch für E. coli sind. Eine Klonierung konnte somit erst in stringent kontrollierten Vektoren wie den pET-Vektoren oder dem Vektor pBAD erfolgen. Aktivitätstests mit beiden Genprodukten zeigten, daß es sich bei beiden Proteinen um ADP-Ribosyltransferasen handelt. Somit besitzt der Bakteriophage T4 drei ADPRibosyltransferasen, das gpAlt, das gpModA und das gpModB. Die drei Proteine zeigen unterschiedliche Ribosylierungsmuster in SDS-Polyacrylamidgelen, wobei einige Proteine von zwei der drei Transferasen ribosyliert werden. So z.B. die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase. Sie wird durch Alt und ModA ADP-ribosyliert. Die Proteine ModA und ModB werden als Einschlußkörper exprimiert. Es wurden keine Anzuchtbedingungen gefunden, die lösliches Protein lieferten. Auch die Coexpression von Chaperonen, der Versuch die exprimierten Proteine in das Kulturmedium zu bringen oder die Fusion mit Thioredoxin änderten nichts an der Bildung der Einschlußkörper. Aber durch die Isolierung der Einschlußkörper kann ModA bereits zu > 90 % sauber vorliegen. Zu diesem Zeitpunkt ist es allerdings inaktiv und muß noch renaturiert werden. 106 Zusammenfassung Die Renaturierung der mit 7 M GuHCl oder 8 M Harnstoff behandelten Einschlußkörper von ModA ist nicht sehr effektiv. Werden diese Einschlußkörper aber bei einem pH 12 und 2 M Harnstoff aufgelöst, können sie leicht durch Dialyse renaturiert werden. Jedoch ist ModA nicht sehr stabil und es fällt mit der Zeit aus. Eine Reinigung von rekombinanten ModA bzw. ModB, die mit einem „His-Tag“ versehen sind, ist unter denaturierenden Bedingungen nur bedingt möglich. Aus unbekannten Gründen hat der „His-Tag“ unter denaturierenden Bedingungen eine schlechte Affinität zur Ni-NTA Matrix. Ein „His-Tag“ am nativen Protein bindet besser an Ni-NTA, wodurch ModA bzw. ModB weiter gereinigt werden können. Für das gereinigte ModA wurde ein KM-Wert für NAD von 258 µM und für NBAG von 219 µM ermittelt. Die kkat-Werte liegen für NAD bei 0,334 min-1 und für NBAG bei 0,089 min-1. Der Austausch bestimmter Aminosäuren gibt Aufschluß über die Notwendigkeit dieser Aminosäuren für die Katalyse. Als katalytisch wirksame Aminosäuren wurden die für ModA postulierten Aminosäuren Arg72 und Glu165 und für ModB die Aminosäuren Arg73 und Glu173 durch ortsspezifische Mutagenese verifiziert. Der homologe Austausch je einer der genannten Aminosäuren zeigte eine verminderte Aktivität der toxischen Proteine, was für eine Beteiligung an der Reaktion oder für eine Beteiligung an der Bindung des Substrats spricht. Für die erzeugten Mutanten müssen die Werte für KM und Vmax noch bestimmt werden, um Anhaltspunkte zu erlangen ob die mutierten Aminosäuren an der Katalyse oder der Substratbindung beteiligt sind. Da ModA die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase modifiziert, liegt es nahe, eine Auswirkung auf die Transkription zu vermuten. Untersuchungen zur Transkription mit modifizierter RNA-Polymerase von genomischer T4 bzw. E. coli DNA zeigen, daß die Transkription im Vergleich zu alterierter oder unveränderter RNAP, deutlich geringer ist. Es ist somit zu vermuten, daß durch die modifizierte RNAP einige Promotoren nicht mehr erkannt werden können. Während einer T4 Infektion liegt erst eine alterierte RNAP vor, die gut von den frühen T4 Promotoren transkribieren kann. Durch eine Modifikation der RNAP wird die Transkription von diesen frühen Promotoren teilweise unterbunden und durch die Synthese von AsiA und MotA auf die mittleren Promotoren umgeschaltet. 107 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Adelman, K., Brody, E.N., & Buckle, M. (1998). Stimulation of bacteriophage T4 middle transcription by the T4 proteins MotA and AsiA occurs at two distinct steps in the transcription cycle. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 95, 15247-15252. Aktories, K., Jung, M., Bohmer, J., Fritz, G., Vandekerckhove, J., & Just, I. (1995). Studies on the active-site structure of C3-like exoenzymes: involvement of glutamic acid in catalysis of ADP-ribosylation. Biochimie, 77, 326-332. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., & Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol., 215, 403-410. Antoine, R., Tallett, A., van, H.S., & Locht, C. (1993). 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Januar 1965 in Dortmund ledig Schulbildung: 08/71 – 08/75 Grundschule in Dormund-Aplerbeck 08/85 – 08/81 Realschule am Bohlgarten in Schwerte 08/81 – 08/84 Ruhrtal Gymnasium in Schwerte Berufsausbildung, Berufstätigkeit: 10/84 – 07/85 Auslieferfahrer und Hilfskraft im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG in Dortmund-Aplerbeck 08/85 – 07/88 Ausbildung zum Zahntechniker im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG in Dormund-Aplerbeck 07/88 – 09/89 Geselle im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG 10/89 – 11/89 Geselle bei Hartmann-Dental GmbH in Datteln 12/89 – 10/90 Geselle im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG Hochschulausbildung: 10/90 – 11/95 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum, Diplomarbeit: Untersuchungen zur Molekularbiologie pflanzlicher Nitrilasen seit 04/96 wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen der Ruhr-Universität Bochum und Promotion Veröffentlichungen: Hillebrand, H.; Tiemann, B.; Hell, R.; Bartling, D. und Weiler, E.W. (1996). Structure of the gene encoding nitrilase 1 from arabidopsis thaliana. Gene 170, 197-200 124 Lebenslauf Wilkens, K.; Tiemann, B.; Bazan, F. und Rüger W. (1997). ADP-ribosylation and early transcription regulation by bacteriophage T4. Adv.Exp.Med.Biol. 419, 71-82 Tiemann, B.; Depping, R. und Rüger W. (1999). Overexpression, purification, and partial characterization of ADP-ribosyltransferases ModA and ModB of bacteriophage T4. Gene Expression (zur Publikation angenommen) 125
