Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und

5 Zusammenfassung
Die ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation, bei der eine kovalente
Bindung durch den Transfer eines ADP-Ribosylrestes von NAD+ auf das Zielprotein erreicht
wird. Die diese Reaktion katalysierenden ADP-Ribosyltransferasen sind in Bakteriophagen,
Prokaryonten und Eukaryonten identifiziert worden und zur Zeit Gegenstand intensiver
Forschung. Der Bakteriophage T4 kodiert für die drei ADP-Ribosyltransferasen Alt, ModA
und ModB. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularbiologischen und
biochemischen Charakterisierung dieser drei Enzyme mit dem Ziel der Beschreibung ihrer
Funktionen im Infektionszyklus des Bakteriophagen sowie der Lokalisation katalytisch aktiver
Aminosäure-Positionen und der Aufklärung der dreidimensionalen Struktur.
Die Funktion der ADP-Ribosyltransferasen im Infektionszyklus des Phagen definiert sich
durch die Rolle der modifizierten Zielproteine. Es wurden deshalb Experimente zur
Identifikation der jeweils ADP-ribosylierten Proteine durchgeführt. Die dafür zunächst
eingeführte Methode der hochauflösenden, zweidimensionalen Gelelektrophorese ermöglichte
die Auftrennung der in einem in vitro Test ADP-ribosylierten Wirtsproteine. Die Lokalisation
der modifizierten Proteine erfolgte anhand des im Verlauf der Reaktion übertragenen
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P markierten ADP-Ribosylrestes. Die anschließende Identifikation der selektierten E. coli
Proteine wurde mit den massenspektrometrischen Verfahren MALDI-TOF und ESI-MS,
sowie dem Edman-Abbau durchgeführt. Die ADP-Ribosyltransferase ModB katalysiert, neben
der schon bekannten Modifikation des ribosomalen Proteins S1, die ADP-Ribosylierung des
Elongationsfaktors EF-Tu, des Chaperons Trigger Faktor und des Thioredoxins. Für Alt und
ModA wurde bereits nachgewiesen, dass sie die α-Untereinheit der RNA-Polymerase
modifizieren. Die weiteren durch ModA modifizierten Proteine zeigten nach der
zweidimensionalen Auftrennung eine zu geringe radioaktive Markierung, so dass keine
Zielproteine lokalisiert werden konnten. Demgegenüber erzeugte Alt insgesamt 27 markierte
Proteinspots, von denen zehn einer Proteinidentifizierung zugänglich waren. Das ZielproteinSpektrum dieses Enzyms konnte damit um EF-Tu, das Chaperon GroEL, die Pyruvat Kinase I,
die 3-Oxoacyl-Synthase, die MTA/SAH Nukleosidase, die Ribose-5-Phosphat-Isomerase und
die Dihydrolipoamid Acetyltransferase erweitert werden. Weiterhin kommen als Zielproteine
die Prolyl-tRNA-Synthetase, die NADPH-Sulfit Reduktase, der Trigger Faktor, die
Dihydrolipoamid Dehydrogenase, das ThiF Protein und das 50 S ribosomale Protein L1 in
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Frage. Diese Proteine wurden jeweils paarweise in einem Proteinspot identifiziert, so dass
eine endgültige Bestätigung als Zielproteine erst nach deren Klonierung und anschließendem
Einsatz im Aktivitätstest erfolgen kann. Die identifizierten Zielproteine von ModB und Alt
weisen insgesamt auf einen erheblichen Einfluss des Bakteriophagen auf die Translations- und
Proteinfaltungsmaschinerie seines Wirtes hin. Die Ergebnisse stimmen deshalb mit der schon
vorher diskutierten Modulation der Translation durch die ADP-Ribosylierung des ribosomalen
Proteins S1 überein. Insbesondere die Identifikation der verschiedenen Zielproteine von Alt
impliziert die Möglichkeit einer Regulation des Wirtsstoffwechsels durch den Bakteriophagen
T4, die weit über das bisher angenommene Mass hinausgeht.
Erkenntnisse über die Struktur eines Proteins können durch die Analyse von
Röntgenbeugungsmustern gewonnen werden. Die notwendige Voraussetzung für deren
Durchführung ist die Kristallisation des Proteins und deshalb dessen Aufreinigung in
möglichst homogener Weise. ModA und ModB lagen nach ihrer Expression als
Einschlußkörper vor. Kulturbedingungen, die die Synthese von nativem Protein durch E. coli
ermöglichen, konnten nicht gefunden werden. Deshalb erfolgte die Reinigung von ModA und
ModB nach einer Vorreinigung der Einschlußkörper und deren Renaturierung mittels
immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie. Die gereinigten Proteine wiesen
reproduzierbar eine Homogenität von ca. 95 % auf. Die Kristallisationsexperimente mit Alt,
ModA, ModB und verschiedenen ModA und ModB Mutanten resultierten nur im Fall der
ModB Mutante R73A in einer Kristallbildung. Diese Kristalle waren allerdings äußerst klein
und fragil und ermöglichten deshalb keine Auflösung der Röntgenstruktur.
Aufgrund von Inhibitorstudien ließen sich ModA und ModB als argininspezifische MonoADP-Ribosyltransferasen charakterisieren. Ein Alignment dieser beiden Enzyme mit anderen
ADP-Ribosyltransferasen ermöglichte die Vorhersage katalytisch essentieller Aminosäuren,
die im Rahmen von ortsspezifischen Mutagenese-Experimenten verifiziert werden konnten.
Die postulierte NAD+-Bindetasche der ADP-Ribosyltransferasen enthält ein essentielles an der
Bindung des NAD+ beteiligtes Arginin, das auch für ModA (R72) und ModB (R73) in der
vorhergesagten Position nachgewiesen wurde. Das in ADP-Ribosyltransferasen konservierte
Glx-X-Glu Motiv ist auch in der Primärstruktur von ModA und ModB vorhanden.
Insbesondere die Glutaminsäure an der dritten Position dieses Motivs ist für die Katalyse der
ADP-Ribosyltransferasen notwendig und wurde für ModA (E165) und ModB (E173)
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ebenfalls bestätigt. Ein zweites in den beiden Proteinen gut konserviertes Motiv, Phe-AsnPhe/Tyr, ist für deren enzymatische Aktivität ebenfalls essentiell, da der Austausch einzelner
Positionen dieses Motivs eine komplette Inaktivierung von ModA und ModB bewirkt. Das
Phenylalanin (ModA) bzw. Tyrosin (ModB) in der dritten Position repräsentiert dabei eine in
allen ADP-Ribosyltransferasen vorhandene aromatische Aminosäure oder Leucin.
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