Biomolekulare Bindungskräfte

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Physikalisches Praktikum für Fortgeschrittene (PPD)
Biomolekulare Bindungskräfte
Lehrstuhl Experimentalphysik I
AG Prof. Dr. Holger Kress
Autoren: Tim Klaußner, Michael Schukalski und Holger Kress
Version vom 16. März 2016
Inhalt:
1. Einleitung
2. Theoretischer Hintergrund
3. Experimenteller Aufbau
4. Kalibrierungsmethoden
5. Bedienung der optischen Pinzette
6. Fragen zur Vorbereitung
7. Versuchsdurchführung
8. Auswertung
9. Literatur
2
1. Einleitung
Im makroskopischen Bereich lassen sich Kräfte mit einfachen Mitteln ausüben und mit Kraftmessern,
wie beispielsweise einer Federwaage bestimmen. Will man aber Untersuchungen im mikroskopischen Bereich durchführen, hat man es typischerweise mit viel geringeren Kräften zu tun. Biomolekulare Bindungskräfte und Kräfte, die einzelne Proteinmotoren ausüben, liegen in der Regel im Bereich
von einigen Pikonewton, was besondere Messmethoden erfordert. Hierbei zählen zu den am häufigsten genutzten Methoden das Rasterkraftmikroskop (atomic force microscope, kurz AFM), die magnetische Pinzette (magnetic tweezers, kurz MT) und die optische Pinzette (optical tweezers, kurz OT).
Die optische Pinzette ermöglicht es, Partikel (engl. Bead) mit Durchmessern in der Größenordnung
von Mikrometern zu fangen und in alle Raumrichtungen zu verschieben [1, 2].
In diesem Praktikumsversuch soll eine optische Pinzette kalibriert, charakterisiert und anschließend
zur Kraftmessung an einem biologischen System verwendet werden. Hierbei werden unterschiedlich
beschichtete Partikel an Bindegewebszellen angenähert, um Anbindungskräfte bei verschiedenen
Rahmenbedingungen zu untersuchen.
3
2. Theoretischer Hintergrund
2.1 Optische Pinzette
Bei einer optischen Pinzette wird ein Laserstrahl mittels eines Objektivs mit hoher numerischer
Apertur stark fokussiert. Dies ermöglicht es, kleine dielektrische Teilchen mit einem Radius in der
Größenordnung von Mikrometern zu fangen [3]. Je nach verwendeter Wellenlänge πœ† des Lasers und
des Radius 𝑅 des zu fangenden Teilchens, eignen sich verschiedene theoretische Beschreibungen der
wirkenden optischen Kräfte:
Fall 1: Partikel deutlich größer als Wellenlänge (𝑹 ≫ 𝝀):
In diesem Bereich können die auf das Kügelchen wirkenden optischen Kräfte durch Strahlenoptik
beschrieben werden. Die Kräfte lassen sich durch den Impulsübertrag des Lichts auf das Teilchen bei
Brechung und Reflexion bestimmen. Wird das einfallende Laserlicht an den Grenzflächen zwischen
umgebendem Medium und zu fangendem Teilchen gebrochen, so ergibt sich eine Impulsänderung
des Lichts, was eine Impulsänderung des Partikels in die entgegengesetzte Richtung bewirkt. Dies ist
in Abb. 1 dargestellt. Bedingung für die Funktion der OT ist ein stark fokussierter Laserstrahl und ein
Brechungsindex des Partikels der größer ist als der des umgebenden Mediums. In Abb. 1 A trifft ein
kollimierter Laserstrahl mittig auf ein Kügelchen. Durch die Symmetrie hebt sich die laterale Komponente der Impulsänderung des Lichts für alle Strahlen auf, so dass nur eine Kraftkomponente in Richtung des Laserstrahls übrig bleibt. Wird das Kügelchen hingegen nicht mittig getroffen (siehe Abb. 1
B), so wirkt aufgrund des inhomogenen Strahlprofils auch eine Kraft, die das Kugelzentrum zur Symmetrieachse zurück bewegt. Wie bereits erwähnt, wird für eine optische Falle ein stark fokussierter
Laser benötigt. In Abb. 1 C befindet sich das zu fangende Partikel hinter dem Fallenmittelpunkt (in
Strahlausbreitungsrichtung gesehen). Die durch die Brechung bewirkte Impulsänderung des Lichts
führt zu einer Kraft, die das Teilchen wieder in Richtung Fallenmittelpunkt drückt. Auf diese Weise
lässt sich anschaulich erklären, warum es möglich ist, ein Partikel an einer bestimmten lateralen und
vertikalen Position zu halten [4].
4
Abb. 1: Strahlgeometrie bei Lichtbrechung an der Kugeloberfläche für verschiedene Kugelpositionen. Die Kraft
die auf das Bead wirkt, ist entgegen der Änderung des Lichtimpulses gerichtet. Dicker gezeichnete Linien entsprechen höherer Laserintensität. 𝑝𝑣 , 𝑝𝑛 und Δ𝑝 beschreiben den Impuls des Lichts vor und nach der Brechung,
sowie die Impulsänderung. 𝐹 ist die auf das Kügelchen wirkende Nettokraft. A) Befindet sich das Kügelchen auf
der Achse höchster Intensität eines kollimierten Lichtstrahls, so wirkt eine Streukraft in Richtung des Laserstrahls. B) Ist das Kügelchen lateral ausgelenkt, so erhält man eine Kraft, die neben der axialen auch noch eine
laterale Komponente besitzt und das Teilchen wieder Richtung der Strahlmittelachse drückt. C) Wird der Laser
fokussiert, ergibt sich eine Kraft, die es ermöglicht das Teilchen zu fangen. Die Gradientenkraft wirkt hier in
Richtung des Fokuspunktes. (Abb. nach [4])
Fall 2: Partikelgröße vergleichbar mit Wellenlänge (𝒓 β‰ˆ 𝝀):
Für einen Großteil der Experimente mit optischen Pinzetten werden Teilchen genutzt, deren Radius
in der gleichen Größenordnung liegt, wie die Wellenlänge des Laserlichts, d.h. 𝒓 β‰ˆ 𝝀 . Eine theoretische Beschreibung der Wechselwirkung des Lichts mit dem Partikel liefert hier die Mie-Streutheorie,
wobei die explizite Berechnung der wirkenden Kräfte den Rahmen dieses Versuches übersteigt. Für
weitere Informationen siehe [5] und [6].
Fall 3: Partikelgröße deutlich kleiner als Wellenlänge (𝒓 β‰ͺ 𝝀):
Für den Grenzfall sehr kleiner Teilchen mit 𝒓 β‰ͺ 𝝀 , kann die Beschreibung mittels Mie-Streuung durch
Rayleigh-Streuung genähert werden kann. Dabei können die optischen Kräfte auf das polarisierbare
Partikel mittels Punktdipolansatz berechnet werden. Die Gesamtkraft setzt sich dabei aus zwei Komponenten zusammen, der Streukraft und der Gradientenkraft. Die Streukraft 𝐹Streu lässt sich beschreiben als
𝐹Streu =
𝐼0 πœŽπ‘›π‘š
𝑐
mit
𝜎=
128πœ‹ 5 π‘Ÿ 6 π‘š2 βˆ’1
3πœ†4
οΏ½
π‘š2 +2
οΏ½
2
,
wobei 𝐼0 die Intensität des eingestrahlten Lichts, 𝜎 der Streuquerschnitt, π‘›π‘š der Brechungsindex des
Mediums, 𝑛𝑝 der Brechungsindex des Partikels und π‘š = 𝑛𝑝 /π‘›π‘š der Quotient der Brechungsindizes
5
ist. Die Streukraft wirkt parallel zur Ausbreitungsrichtung des eingestrahlten Lichts und ist proportional zur Lichtintensität [4].
Die Formel für die Gradientenkraft 𝐹𝐺𝐺𝐺𝐺 ergibt sich ebenfalls aus der Wechselwirkung des induzierten Dipols mit dem inhomogenen Lichtfeld und lässt sich beschrieben durch
𝐹𝐺𝐺𝐺𝐺 =
2πœ‹πœ‹
2
π‘π‘›π‘š
βˆ‡πΌ0
mit
2 3
𝛼 = π‘›π‘š
π‘Ÿ οΏ½
π‘š2 βˆ’1
οΏ½
π‘š2 +2
wobei 𝛼 die Polarisierbarkeit des Partikels beschreibt. Die Gradientenkraft ist proportional zum In-
tensitätsgradienten βˆ‡πΌ0 und für π‘š > 1 zum Fokusmittelpunkt gerichtet [4].
Abb. 2 zeigt die schematische Darstellung eines Partikels in der optischen Falle. Durch den Beitrag
der Streukraft liegt die Fallenposition typischerweise nicht exakt in der Fokusebene.
Strahlausbreitungsrichtung
Abb. 2: Skizze der in einer optischen Falle wirkenden Kräfte. In Strahlausbreitungsrichtung wirkt die Streukraft,
zum Fokuspunkt hin die Gradientenkraft. Durch die Streukraft ist die Gleichgewichtsposition eines gefangenen
Teilchens etwas aus der Fokusebene verschoben. (Abb. nach [7])
6
2.2 Bindungen zwischen Integrinen in Fibroblastenmembranen und Liganden
In diesem Praktikum sollen unter anderem Bindegewebszellen, sogenannte 3T3-Fibroblasten, untersucht werden. In deren Zellmembran befinden sich Integrine, welche die extrazelluläre Matrix mit
dem intrazellulären Zytoskelett verbinden, so dass beispielsweise außerhalb der Zelle wirkende Kräfte in intrazelluläre Signalkaskaden umgewandelt werden können. Integrine besitzen Bindungsstellen
für bestimmte Liganden, z.B. die RGD-Sequenz des Proteins Fibronektin (FN) [8]. Beschichtet man
Partikel mit diesem Glykoprotein FN, können Integrine der Zelle anbinden (siehe Abb. 3). Mittels der
optischen Pinzette können beim Trennen der Bindungspartner Abreißkräfte gemessen und, unter
Zuhilfenahme von Theorien molekularer Adhäsionsbindungen, charakteristische Bindungsparameter
bestimmt werden.
Abb. 3: Schematische Darstellung eines Adhäsionsexperiments mit einer optischen Pinzette zur Untersuchung
der Bindung eines mit Fibronektin beschichteten Partikels an Integrine der Fibroblastenzelle (Abb. nach [9])
Weitere Details zur Probenpräparation und Arbeit mit Zellen werden während des Praktikums durch
den Betreuer erläutert.
7
3. Versuchsaufbau und Komponenten
In Abb. 4 und 5 ist der Versuchsaufbau als schematische Darstellung und als Foto mit Markierungen
der wichtigsten Komponenten zu sehen.
Abb. 4: Schematische Darstellung des Mikroskops mit optischer Pinzette: Der blau markierte Strahlengang zeigt
den Strahlengang des Laserlichts, welches in der Probenebene die optische Falle erzeugt. Der rote Strahlengang
entspricht dem Strahlengang eines inversen Mikroskops. (Abb. aus [10])
8
Abb. 5: Foto des Mikroskops mit optischer Pinzette: Der Strahlengang des Fallenlasers (blau) beginnt mit Einspeisung des Lichts der Laserdiode am Fiberport (1). An der Abdeckung von empfindlichen Spiegel- und Linsenelementen ist ein Schieber (2) zum manuellen Unterbrechen des Strahlengangs angebracht. Nach Aufweitung
(Linsen nicht sichtbar) wird der Laserstrahl am dichroitischen Spiegel D1 und Spiegel S2 reflektiert und vom
Ölimmersionsobjektiv (3) in die Probenebene fokussiert. Hier befindet sich der Probenträger (4), welcher durch
die Stage (5) manuell oder über Piezoelemente computergesteuert verschoben werden kann. Nach Reflexion
am dichroitischen Spiegel D2 trifft das Laserlicht auf die Quadranten-Photodiode (6). Die dichroitischen Spiegel
reflektieren nur das infrarote Laserlicht. Die Beleuchtung des inversen Mikroskops erfolgt mittels Weißlicht-LED
(7). Nach Beleuchtung der Probenebene und weiterer Reflexion trifft dieses Licht auf die CMOS-Kamera (8)
(Abb. aus [10])
9
In Abb. 4 und 5 ist zu erkennen, dass der gesamte Aufbau zwei Strahlengänge beinhaltet, welche im
Folgenden genauer behandelt werden. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Beschreibung der
wichtigsten Bauteile.
a) Strahlengang des inversen Mikroskops (rot):
Das sichtbare Licht für den inversen Mikroskopaufbau wird mittels Weißlicht-LED erzeugt. Es kann
den dichroitischen Spiegel D2 passieren, wird durch den Kondensor gebündelt und beleuchtet die
Probenebene. Danach wird es durch weitere Spiegel auf die CMOS-Kamera abgelenkt. Diese ist mittels USB-Schnittstelle mit dem Computer verbunden, sodass mit Hilfe der Software uc480viewer Bilder der Probenebene erstellt werden können.
b) Strahlengang des Fallenlasers (blau):
Das Laserlicht (πœ† = 975 nm), welches zum Fangen der Teilchen genutzt wird, verlässt die Glasfaser
des Diodenlasers stark divergent und wird durch eine Linse kollimiert. Durch den Strahlaufweiter, der
aus einer Zerstreuungslinse und einer Sammellinse besteht, wird der Strahldurchmesser von
ca. 1,5 mm auf ca. 4,5 mm vergrößert, um später die rückseitige Apertur der Objektivs ausreichend
auszuleuchten und somit eine Falle mit möglichst hoher Fallenstärke zu ermöglichen. Der dichroitische Spiegel D1 ist so gewählt, dass der infrarote Laserstrahl im Gegensatz zum sichtbaren Licht reflektiert wird und mittig auf die rückseitige Öffnung des Ölimmersionsobjektivs (3) trifft. Diese erzeugt die starke Fokussierung des Lasers, die für die Falle benötigt wird. Nach Durchlaufen der Probenebene wird das Laserlicht durch den Kondensor gesammelt und trifft nach der Reflektion an einem weiteren dichroitischen Spiegel (D2) und Durchlaufen einer Sammellinse auf die QuadrantenPhotodiode (QPD, Nr. 6). Das an der QPD entstehende Signal kann dazu verwendet werden, um die
Fallenstärke und die Position des Kügelchens in der Falle zu bestimmen.
10
c) Quadranten-Photodiode (QPD):
Bei der QPD handelt es sich um eine Photodiode, welche in vier Quadranten unterteilt ist (siehe Abb.
6). Befindet sich ein Bead in der Falle, sind die an den Quadranten gemessenen Spannungen abhängig von der Position des Beads in der Falle. Verwendet man die Signale
π‘₯𝑑𝑑𝑑𝑑 = (𝑆2 + 𝑆4 ) βˆ’ (𝑆1 + 𝑆3 )
und
𝑦𝑑𝑑𝑑𝑑 = (𝑆1 + 𝑆2 ) βˆ’ (𝑆3 + 𝑆4 )
,
so lässt sich aus den Spannungsdifferenzen für hinreichend kleine Auslenkungen die x- und y-Position
des Partikels relativ zur Fallenposition bestimmen. Nach dem Fangen eines Partikels kann man die
QPD mit zwei Schrauben in x- und y-Richtung justieren, sodass π‘₯𝑑𝑑𝑑𝑑 und 𝑦𝑑𝑑𝑑𝑑 minimal werden und
damit die QPD für die Kalibrierung und anschließende Messungen zentriert ist.
Abb. 6: Schematische Darstellung des mittels optischer Falle gefangenen Partikels: Eine Auslenkung
des Partikels aus der Fallenposition kann mittels QPD registriert werden. (Abb. nach [7])
11
d) Laser und Objektiv:
Der Fallenlaser (Wellenlänge πœ† = 975 nm) wird durch eine Laserdiode mit einer maximalen Leistung
π‘ƒπ‘šπ‘šπ‘š = 340 mW erzeugt. Die Wellenlänge wurde so gewählt, dass bei Messungen an lebenden Zellen möglichst geringer Schaden entsteht (vgl. Abb. 7).
Abb. 7: Verlauf der mittleren letalen Dosis LD50 für E. Coli Bakterien in Abhängigkeit von der Wellenlänge πœ†: LD50 beschreibt die Zeit, nach der statistisch die Hälfte der Bakterien durch den optischen
Schaden vernichtet wurden. Bei πœ† β‰ˆ 975 𝑛𝑛 liegt das Maximum, d.h. hier ist der Schaden an den
Zellen relativ gering. (Abb. nach [4])
Durch den zur Laserdiode zugehörigen Controller lässt sich der Diodenstrom und somit auch die Laserleistung einstellen, wodurch es möglich ist, die Fallenstärke zu variieren. Außerdem ist ein Temperaturcontroller an die Laserdiode angeschlossen, um durch eine konstant gehaltene Temperatur einen stabileren Laserstrahl zu erhalten.
Der Laserstrahl wird durch das Objektiv fokussiert. Hierbei handelt es sich um ein Ölimmersionsobjektiv (Nikon: 100X, NA1.25). Im Zwischenraum zwischen Objektiv und Probenträger (Deckglas) muss
deshalb ein Tropfen Immersionsöl hinzugefügt werden.
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4. Kalibrierungsmethoden
Im Folgenden werden zwei Kalibrierungsmethoden behandelt, die zur Berechnung der Fallenstärke
einer optischen Pinzette genutzt werden können.
4.1 Bestimmung der Fallenstärke mittels Stokes-Reibung (Kamera-basiert)
Bewegt man ein gefangenes Partikel in einem Medium mit bekanntem viskosem Reibungskoeffizienten, kann über die Messung der Partikelauslenkungen bei definierten Flussgeschwindigkeiten des
Mediums um das Partikel auf die Fallensteifigkeit πœ… geschlossen werden.
Ein nicht zu vernachlässigender Effekt für die hier und in Abschnitt 4.2 beschriebene Kalibrierung ist
der Anstieg des viskosen Reibungskoeffizienten des Partikels in Probenträgernähe. Nach dem Gesetz
von Faxén müssen deshalb folgende Korrekturterme des viskosen Reibungskoeffizienten 𝛾 berücksichtigt werden:
𝛾=
1βˆ’
6πœ‹πœ‹πœ‹
9 π‘Ÿ
1 π‘Ÿ 3
οΏ½ οΏ½+ οΏ½ οΏ½
16 β„Ž
8 β„Ž
βˆ’
45 π‘Ÿ 4
οΏ½ οΏ½
256 β„Ž
βˆ’
1 π‘Ÿ 5
οΏ½ οΏ½
16 β„Ž
β„Ž ist die Höhe des Kugelzentrums über der Oberfläche und πœ‚ ist die Viskosität der Flüssigkeit [4].
Die vom Medium auf das gefangene Partikel ausgeübte Kraft 𝐹Stokes ist bedingt durch StokesReibung und lässt sich beschreiben als Produkt des viskosen Reibungskoeffizienten 𝛾 und der Geschwindigkeit des umfließenden Mediums. Letztere entspricht aufgrund der viskosen Eigenschaft des
Mediums und der Randbedingung, dass die Bewegung des gefangenen Partikels in geringer Höhe
(hier: typischerweise < 2 ΞΌm) und damit sehr nahe am bewegten Probenträger betrachtet wird, in
guter Näherung der Geschwindigkeit der Stage 𝑣Stage . Unter der Annahme eines harmonischen Po-
tentials der optischen Falle ist die rücktreibende Kraft 𝐹Falle das Produkt aus Fallensteifigkeit πœ… und
Auslenkung π‘₯ . Die maximale Geschwindigkeit der Stage 𝑣Stage,max führt zur maximalen Auslenkung
des gefangenen Partikels π‘₯𝐡𝐡𝐡𝐡,π‘šπ‘šπ‘š , wobei folgende Beziehungen gelten:
𝐹Stokes = 𝛾 βˆ™ 𝑣Stage,max = 𝐹Falle = πœ… βˆ™ π‘₯Bead,max
β†’
πœ…=
𝛾 βˆ™ 𝑣Stage,max
π‘₯Bead,max
Im Experiment wird die Stage sinusförmig bewegt mit einer definierten Amplitude und Periodendauer. Die Partikelauslenkungen können mittels Videoanalyse bestimmt werden. Diese Art der Kalibrierung ist in der Durchführung zeitaufwendig und benötigt in der Fallenumgebung freien Platz zur ungestörten Bewegung der Partikel.
13
4.2 Bestimmung der Fallenstärke mittels thermischer Fluktuationen (QPD)
Die zweite Methode ist für die genutzte Versuchsdurchführung wesentlich schneller und benötigt
keine zusätzliche Stagebewegung. Die Fallenstärke wird unter Zuhilfenahme der Autokorrelation der
thermischen Fluktuationen des gefangenen Partikels bestimmt.
Für die Autokorrelierte der Brownschen Bewegung eines kugelförmigen Teilchens in einem harmonischen Potential gilt:
𝑑
< π‘₯(𝑑 β€² ) π‘₯(𝑑 β€² + 𝑑) > = 𝜎 2 𝑒𝑒𝑒 οΏ½βˆ’ οΏ½
𝜏
𝜎 2 ist hierbei die Varianz und 𝜏 die Autokorrelationszeit [11].
Abb. 8 zeigt die thermischen Fluktuationen (QPD-Signal) eines mittels optischer Pinzette gefangenen
Partikels und den Verlauf der zugehörigen Autokorrelationsfunktion (rot). Durch den Fit einer Exponentialfunktion kann man die Autokorrelationszeit 𝜏 bestimmen. Des Weiteren lässt sich zeigen, dass
dieser Parameter 𝜏 in direktem Zusammenhang mit der Fallensteifigkeit πœ… und dem viskosen Rei-
bungskoeffizienten 𝛾 steht, gemäß:
πœ…=
𝛾
𝜏
Für diesen Aufbau liegen die Parameter bei einer Laserleistung von P β‰ˆ 50β€ŠmW typischerweise bei
etwa 𝛾 β‰ˆ 4·10-8 Pa·s und 𝜏 β‰ˆ 1 ms, woraus eine Fallensteifigkeit von ca. πœ… β‰ˆ 40 pN/µm resultiert.
Abb. 8: Thermische Fluktuationen (QPD-Signal) eines mittels optischer Pinzette gefangenen
Partikels und Verlauf der zugehörigen Autokorrelationsfunktion (rot) mit Exponentialfit
(schwarz).
Da die QPD Datenaufnahmeraten von bis zu 100 kHz ermöglicht, werden diese Messungen mithilfe
der Quadrantenphotodiode durchgeführt. Die QPD liefert Differenzsignale in Volt, die für den Bereich
kleiner Auslenkungen linear proportional zur realen Positionsabweichung in Nanometern sind und
deshalb genutzt werden können.
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5. Bedienung der optischen Pinzette
Das verwendete Mikroskop ist aus diversen Einzelkomponenten aufgebaut. Im Gegensatz zu einem
kommerziellen Standardmikroskop besitzt es kein Gehäuse und alle Teile sind frei zugängig. Bei der
Verwendung ist darauf zu achten, dass keinerlei Gegenstände in den Strahlengang geraten oder
Spiegel und sonstige Bauteile verstellt werden. Schon geringe Veränderung Strahlengangs können
dazu führen, dass die Qualität der optischen Falle und somit die Fangkraft stark abnimmt und im
Extremfall die Fallenwirkung gar nicht mehr vorhanden ist. Darüber hinaus kann bei einem stark dejustierten Aufbau der Laserstrahl unkontrolliert im Raum verlaufen und somit eine Gefährdung für
anwesende Personen darstellen. Bei der Bewegung der Stage ist darauf zu achten, dass das Objektiv
nicht vom Probenhalter berührt wird! Im Zweifel bitte beim Betreuer nachfragen.
Bei der Versuchsdurchführung muss eine geeignete Laserschutzbrille getragen werden! Diese muss
vor dem Einschalten des Lasers korrekt aufgesetzt werden und darf nicht ohne Rücksprache mit
dem Betreuer abgenommen werden!
Bitte bringen Sie einen USB-Stick mit, damit aufgenommene Daten für die spätere Verwendung exportiert werden können.
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6. Fragen zur Vorbereitung
1. Vergleichen Sie Rasterkraftmikroskop, magnetische Pinzette und optische Pinzette (Kraftbereich,
Funktionsweise, Besonderheiten, usw.) und überlegen Sie sich Einsatzbereiche für die jeweiligen
Methoden.
2. Mit welchen Größen und Angaben lässt sich eine optische Pinzette charakterisieren?
3. Erläutern Sie, was in Abb. 9 a) dargestellt ist und beschreiben Sie mithilfe von Abb. 9 b) und c)
welche Bedingung unter anderem erfüllt sein muss, um erfolgreich ein Teilchen mit einer optischen Pinzette fangen zu können.
Abb. 9: Schematische Darstellungen einer optischen Falle (Lichteinfall von unten) zur Bearbeitung der
Frage 3.
4. Wie kann ein Kamerabild mithilfe eines Mikrometerlineals kalibriert werden, d.h. wie führt man
eine möglichst genaue Berechnung des Kalibrationsfaktors (in nm/pixel) durch? (Hinweis: Im Kamerabild werden 7 Gitterlinien mit definiertem Abstand zu sehen sein.)
5. Erläutern Sie Vor- und Nachteile der beiden in Kap. 4 beschriebenen Kalibrierungsmethoden.
6. In welchem Medium sollten, bei Messungen mit Zellen, die Partikel suspendiert sein, um keinen
Schaden an den Zellen zu verursachen? Eignet sich beispielsweise deionisiertes Wasser?
7. Welche Erkenntnisse erhofft man sich von der Durchführung von Adhäsionsexperimenten mit FNbeschichteten Partikeln und Fibroblastenzellen? (Stichwort: Fibronektin-Integrin-Bindung)
8. Was könnten Gründe dafür sein, dass die Fallenstärke der optischen Pinzette tiefer in der Probe
abnimmt? Warum ist ab einer bestimmten Tiefe das Fangen von Partikeln nicht mehr möglich?
(Hinweis siehe [12], Fig. 3)
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7. Versuchsdurchführung
Im Allgemeinen ist auf eine strukturierte und einheitliche Benennung der Messdateien zu achten. Es
ist ebenfalls sinnvoll vor der Messdurchführung jeweils ein Bild der Fallenumgebung abzuspeichern.
β€’ Überprüfung der Vorbereitung der Studenten
β€’ Erläuterungen des Betreuers zum experimentellen Aufbau und Software
β€’ Kalibrierung des Kamerabildes
Zur Auswertung der Kamerabilder muss die Größe eines Pixels im Mikroskopbild ermittelt werden. Nehmen Sie dazu ein Bild des Mikrometerlineals auf. (Kamerasoftware "uc480 Viewer" mit
Profil "Camera_profile.ucp" laden; 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 = 19 𝑀𝑀𝑀 entspricht dem benötigten Pixeltakt
der Kamera.)
β€’ Kalibrierung der optischen Falle mit Kamera und QPD
Bestimmen Sie die Stärke der optischen Falle unter Verwendung der QPD und der CMOSKamera. Nutzen Sie unbeschichtete Polystyren-Partikel (3 µm plain Beads in MilliQ-Water/Image
Medium) als Probe. Aus experimentellen Gründen werden zuerst QPD-Daten eines gefangenen
Partikels (Kalibrierung über thermische Fluktuationen) und anschließend ein Video mit der
CMOS-Kamera bei sinusförmiger Stagebewegung (Kalibration über Stokes-Reibung) aufgenommen.
Stellen Sie dazu an den Kontrolleinheiten des Lasers den Strom 𝐼𝐿𝐿 = 200 mA und den Wider-
stand 𝑅 = 9,87 kΞ© ein. Fangen Sie ein Partikel und bewegen Sie es in einen freien Bereich. Markieren Sie die Ruhelage mithilfe der Zeichenoption der Kamerasoftware. Ein auf dem Deckglas
angeheftetes Bead soll sich bei den Kalibrationsmessungen in der Nähe des gefangenen Beads
befinden (siehe Abb. 11).
Abb. 11: Schematische Darstellung des Kamerabilds mit
der für Kalibrierungsmessungen empfohlenen Umgebung
17
Starten Sie nun das LabView-Programm "Calibration of Optical Tweezers"
-
Bestimmung der Fallenstärke mittels thermischer Fluktuationen (QPD-basiert):
Zentrieren Sie das QPD-Signal. Kontrollieren Sie, ob im QPD-Panel die Option "Monitor" aktiviert ist. Führen Sie anschließend zwei Messungen der thermischen Fluktuationen aus.
(LabView-Einstellungen: 𝑁𝑁𝑁𝑁𝑁𝑁 π‘œπ‘œ 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠 = 300 000; 𝑅𝑅𝑅𝑅 π‘œπ‘œ 𝐷𝐷𝐷 = 10 kHz )
-
Bestimmung der Fallenstärke mittels Stokes-Reibung (Kamera-basiert):
 Starten Sie die Sinus-Bewegung der Stage.
(LabView-Einstellungen, Piezo-Stage Betrieb: open loop; Offset = 35 V;
Amplitude = 25 V; time for one step = 1 ms; number of steps = 1000)
 Nehmen Sie ein Video des optisch gefangenen Partikels (und des Beads auf dem Deckglas) auf. Die kleinen Auslenkungen des gefangenen Partikels aus der markierten Fallenposition sollten bereits im Kamerabild bei sehr genauer Betrachtung erkennbar
sein.
(Kamera-Einstellungen: kleine ROI auswählen; exposure time = 20 ms; Rate 30 fps; darauf achten, dass Bild nicht überbelichtet ist)
 Schätzen Sie die Höhe der Falle ab, indem Sie mit den Mikrometerschrauben die Stage
in z-Richtung soweit verfahren, bis das Interferenzmuster des gefangenen Partikels mit
dem des auf dem Deckglas angehefteten Partikels übereinstimmt. Aus der Differenz
der an der Schraube abgelesenen Werte, vor und nach dem Drehen, kann die Höhe
ermittelt werden. (Zur Kontrolle wurde eine Bilderserie der Interferenzmuster in verschiedenen Höhen erstellt. Sie können Ihren Wert bei Bedarf mit dieser vergleichen.)
Führen Sie beide Versuchsteile zügig hintereinander aus, sodass ein eventueller z-Drift keine
signifikante Auswirkung hat. Führen Sie die Aufnahmen zur Kalibrierung der optischen Pinzette mindestens jeweils dreimal aus.
β€’
Einführung in die Funktionen des LabView-Programms "Automatic Movement"
β€’ Präparation der Zellproben
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β€’ Vergleich der Adhäsionskräfte zwischen
Zellmembranen und unbeschichteten sowie be-
schichteten Partikeln und Abhängigkeit der Kräfte von der Kontaktdauer
Erstellen Sie für jede Messreihe einen neuen Ordner. Führen Sie vor jedem Abreißexperiment
eine Messung der thermischen Fluktuationen durch. Bereiten Sie anschließend die Videoaufnahme vor und bestimmen Sie mithilfe des "Test"-Fensters einen sinnvollen Wert für den
"threshold value" (Erläuterung durch Betreuer). Starten Sie dann die Videoaufnahme und die
Annäherungsautomatik im "Measurement"-Fenster. Nach dem Ende der Bewegung stoppen Sie
die Videoaufnahme und bestimmen Sie die Höhe des Partikels über dem Deckglas.
Anmerkung: Bei Messungen mit Zellen bietet sich eine Annäherungshöhe von ca. 1,5 µm an. Auf
dieser Höhe finden sich meist geeignete Bereiche (sehr steil) der Zellmembran, sodass bei einer
Annäherung das gefangene Partikel nicht oder nur gering in z-Richtung ausgelenkt wird. Ebenfalls besteht ausreichend Abstand zu Schmutzpartikeln auf dem Deckglas.
- Unbeschichtete Beads:
Nutzen Sie als Probe unbeschichtete Partikel (3 µm plain Beads in Image Medium).
Führen Sie jeweils Annäherungen mit Kontaktzeit von 0 ms, 1.000 ms und 10.000 ms aus.
(LabView-Einstellungen: x-Piezo-Betrieb: closed loop;
𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 85 %; 𝐸𝐸𝐸 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 15 %; 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑑𝑑𝑑𝑑 = 0 π‘šπ‘š
𝑇𝑇𝑇𝑇 𝑓𝑓𝑓 π‘œπ‘œπ‘œ 𝑠𝑠𝑠𝑠 (𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑) = 40 π‘šπ‘š; 𝑆𝑆𝑆𝑆 𝑠𝑠𝑠𝑠 (𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑) = βˆ’0,1 % ;
𝑇𝑇𝑇𝑇 𝑓𝑓𝑓 π‘œπ‘œπ‘œ 𝑠𝑠𝑠𝑠 (𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏) = 40 π‘šπ‘š; 𝑆𝑆𝑆𝑆 𝑠𝑠𝑠𝑠 (𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏𝑏) = 0,4 % )
- Beschichtete Beads:
Nutzen Sie als Probe beschichtete Partikel (z.B. 3 µm FN-coated Beads in Image Medium,
3 µm COOH-Beads in Image Medium).
Führen Sie jeweils Annäherungen mit Kontaktzeit 0 ms, 1.000 ms und 10.000 ms aus.
(LabView-Einstellungen: analog zu vorheriger Aufgabe)
β€’ Auswertung der Videos
Die Videos der Partikelbewegung werden mit einem Matlab-basierten Bead-Tracking-Programm
ausgewertet. Die Auslenkungen der Partikel können mithilfe des Kalibrationsfaktors der Kamera
in eine Auslenkung in Mikrometern umgerechnet werden. Unter Berücksichtigung der Fallensteifigkeit folgen daraus die Abreißkräfte in Piko-Newton.
19
8. Auswertung
β€’ Bestimmen Sie den Kalibrationsfaktor der Kamera in der Einheit nm pro pixel.
β€’ Bestimmung Sie die Fallensteifigkeit:
-
Werten Sie die Daten der Kamera-basierten Kalibrierung aus. Erstellen Sie einen Graphen der
Trajektorie der Bewegung des gefangenen Partikels und des am Deckglas adhärierten Partikels (=Stagebewegung). Bestimmen Sie jeweils die Amplitude und die Periodendauer der
Bewegung.
π‘₯𝐡𝐡𝐡𝐡,π‘šπ‘šπ‘š entspricht der Amplitude der Bewegung des gefangenen Partikels.
𝑣𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆,π‘šπ‘šπ‘š der Stage-Bewegung ergibt sich durch Bestimmung der Ableitung von
2πœ‹
𝑇
π‘₯𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆 (𝑑) = 𝐴 βˆ— sin οΏ½
βˆ— 𝑑� und anschließender Bestimmung des Maximums.
Berechnen Sie nun mithilfe der gemessenen Höhe des Partikels über dem Objektträger den
-
viskosen Reibungskoeffizienten 𝛾 und bestimmen Sie die Fallensteifigkeit ΞΊ.
Analysieren Sie die Messungen der thermischen Fluktuationen und vergleichen Sie die erhaltenen Werte der Fallensteifigkeit der beiden Kalibrierungsmethoden. Geben Sie ebenfalls eine Abschätzung des Fehlers an.
β€’ Beschreiben Sie kurz, wie das LabView-Programm "Automatic Movement" funktioniert, insbesondere, wozu das QPD-Signal genutzt wird und warum die Mittelung durchgeführt wird.
β€’ Bestimmen und vergleichen sie die Adhäsionskräfte zwischen unbeschichteten bzw. beschichteten Partikeln und Fibroblastenmembranen.
β€’ Analysieren Sie die Abhängigkeit der Adhäsionskräfte von der Kontaktdauer. Tragen Sie die gemessene Abreißkraft gegen die Kontaktdauer auf und beschreiben Sie den Verlauf. Was hatten
Sie erwartet.
β€’ Welches Ergebnis hat Sie verwundert bzw. fanden Sie besonders interessant?
20
9. Literatur
[1]
K. Neuman and A. Nagy: Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic
tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods, 5(6), 491-505, (2008)
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