Studien zur Bedeutung des Neuralen - Ti

Aus dem Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Studien zur Bedeutung des
Neuralen Zelladhäsionsmoleküls und der Polysialinsäure
in der Entstehung von
Valproinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten
THESE
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY
-Ph.D.im Fachgebiet Lebensmitteltoxikologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Katrin Hoffmann
aus Diekholzen
Hannover 2004
Supervisor:
Prof. Dr. H. Nau
Wissenschaftliche
Betreuung:
Prof. Dr. H. Nau
Prof. Dr. R. Gerardy-Schahn
Prof. Dr. W. Löscher
1. Gutachten:
Prof. Dr. H. Nau, Institut für Lebensmitteltoxikologie und
chemische Analytik, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. R.Gerardy-Schahn, Zentrum Biochemie, Abteilung für
Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover
Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Toxikologie
und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachten:
Dr. J. Buschmann, Institut für Toxikologie und experimentelle
Medizin, Fraunhofer Gesellschaft
Datum der mündlichen Prüfung: 3. Juni 2004
In Dankbarkeit meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1.0
EINLEITUNG .................................................................................................
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
Embryonalentwicklung und Neuralrohrdefekte ..................................................
Embryonalentwicklung ...........................................................................
Neuralrohrentwicklung ...........................................................................
Neuralrohrdefekte .... ..............................................................................
2
2
3
5
1.2
1.2.1
Valproinsäure (VPA)...........................................................................................
Anwendung und Bedeutung der VPA.....................................................
7
7
Nebenwirkungen der VPA Anwendung .................................................
VPA Anwendung während der Embryonalentwicklung.........................
Epidemiologie von VPA-induzierten Fehlbildungen des
Menschen .......................................................................................
Teratogene Effekte der VPA in verschiedenen
Labortierspezies .............................................................................
Mechanismen der teratogenen Wirkung von VPA und VPADerivaten: Kinetik — Stoffwechselwege — Proliferation,
Zelldifferenzierung und Zelladhäsion — Kernrezeptoren —
Genexpression ................................................................................
Struktur-Aktivitätsbeziehungen der VPA-Derivate im
Mausmodell....................................................................................
8
9
1.2.2
1.2.3
1.2.3.1
1.2.3.2
1.2.3.3
1.2.3.4
9
11
13
17
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.3.5
Neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und α-2,8 Polysialinsäure (PSA)......
NCAM.....................................................................................................
PSA .........................................................................................................
Einfluss von PSA-NCAM auf isolierte Nervenzellsysteme ...................
Funktionen von PSA-NCAM im adulten Organismus ...........................
PSA-NCAM während der Embryonalentwicklung ................................
20
20
21
24
25
28
2.0
ZIEL DER ARBEIT.......................................................................................
33
Inhaltsverzeichnis
3.0
MATERIAL UND METHODEN ................................................................
34
3.1
3.1.1
3.1.1.1
3.1.1.2
3.1.1.3
3.1.1.4
3.1.1.5
3.1.1.6
3.1.2
3.1.3
3.1.3.1
3.1.3.2
3.1.3.3
3.1.3.4
3.1.3.5
3.1.4
3.1.4.1
3.1.5
3.1.6
3.1.6.1
3.1.6.2
3.1.6.3
3.1.6.4
3.1.6.5
3.1.6.6
3.1.6.7
In-vivo Methodik .................................................................................................
Versuchstiere...........................................................................................
Mäusestämme ................................................................................
Haltung und Fütterung...................................................................
Zucht der ST8SiaIV(+/+)und ST8SiaIV(-/-) Mäuse ..........................
Genotypisierung ............................................................................
Tierversuchsgenehmigungen.........................................................
Randomisierung.............................................................................
Testsubstanzen ........................................................................................
Reproduktionstoxizität............................................................................
Verpaarung und Bestimmung der Trächtigkeit .............................
Zyklusbestimmung ........................................................................
Zyklussynchronisation...................................................................
Exenzephaliemodell ......................................................................
Spina bifida-Modell.......................................................................
Neurotoxizität .........................................................................................
Rotarod Toxizitätstest....................................................................
Somitenzählung.......................................................................................
Histologie und Histochemie....................................................................
Probenahme und Fixierung ...........................................................
Paraffineinbettung und Entparaffinierung.....................................
Technoviteinbettung ......................................................................
Hämalaun-Eosin-Färbung .............................................................
Versilberung nach Bodian .............................................................
Immunhistochemie: PSA-Färbung — NCAM-Färbung................
Fotografie ......................................................................................
34
34
34
34
34
35
36
36
37
37
37
38
38
38
39
39
39
40
40
40
41
41
42
42
43
44
3.1.7
3.1.7.1
3.1.7.2
3.1.7.3
3.1.8
3.1.8.1
3.1.8.2
3.1.8.3
Quantitative Bestimmung von S-Pentyl-4-yn in Plasma und Gewebe ...
Probenahme ...................................................................................
Probenaufarbeitung........................................................................
Gaschromatographische Trennung und Detektion ........................
Real time-PCR (RT-PCR).......................................................................
Probenahme ...................................................................................
RNA-Isolierung und Erstellung der copyDNA (cDNA) ...............
Real time-PCR (RT-PCR) und Acrylamid-Gelelektrophorese .....
45
45
45
46
47
47
47
48
Inhaltsverzeichnis
3.1.8.4
3.1.9
3.1. 9.1
3.1. 9.2
3.1. 9.3
3.1. 9.4
Auswertung ...................................................................................
Statistik ...................................................................................................
Exenzephaliemodell ......................................................................
Neurotoxizität ................................................................................
Somitenzählung .............................................................................
RT-PCR .........................................................................................
50
52
52
52
53
53
3.2
3.2.1
3.2.1.1
3.2.1.2
3.2.1.3
3.2.1.4
In-vitro Methodik ................................................................................................
Neuritenwachstum in fetalen Hippocampuszellen..................................
Präparation von fetalen Hippocampuszellen .................................
Hippocampuszellkultur..................................................................
Färbung..........................................................................................
Bestimmung des Neuritenwachstums............................................
54
54
54
55
56
57
3.2.1.5
Statistik ..........................................................................................
58
3.3
Verwendete Chemikalien ....................................................................................
59
4.0
ERGEBNISSE .................................................................................................
63
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Effekte von VPA und SPentyl-4-Pentinsäure im Mausmodell .................................................................
C57BL/6J-Maus im Spina bifida-Modell ...............................................
C57BL/6J-Maus im Exenzephaliemodell ...............................................
Embryonalentwicklung C57BL/6J im Vergleich zu Hsd:Win NMRI....
63
63
66
70
4.2
Zyklusdiagnostik bei ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/+) .......................................
71
4.3
4.3.1
4.3.2
Embryonalentwicklung der ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) Maus.....................
Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung.........................................
Immunhistochemische Darstellung der Expression von PSA und
NCAM ....................................................................................................
Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV und NCAM auf mRNA Ebene.....
72
72
4.3.3
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
75
84
ST8SiaIV(-/-) im Exenzephaliemodell.................................................................. 90
Teratogene Effekte und Neurotoxizität................................................... 90
Kontrolle der Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV und NCAM im
Exenzephaliemodell-Experiment............................................................ 96
Genotypisierung...................................................................................... 100
Inhaltsverzeichnis
4.5
Gehirn- und Plasmakonzentrationen der S-Pentyl-4-Pentinsäure....................... 101
4.6
Einfluß von VPA-Derivaten auf die Differenzierung fetaler
Hippocampuszellen ............................................................................................. 104
5.0
DISKUSSION .................................................................................................. 111
5.1
Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte von VPA
und S-Pentyl-4-Pentinsäure im Mausmodell....................................................... 111
5.2
Embryonalentwicklung von C57BL/6J, ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV (-/-) im
Vergleich zu Hsd:Win NMRI ............................................................................. 114
5.3
Paarungsverhalten von ST8SiaIV(-/-) und hormonelle Zyklussynchronisation ... 118
5.4
Studien zur Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV, PSA und NCAM während
der frühen Embryonalentwicklung der ST8SiaIV(-/-) Maus................................. 121
5.5
Die ST8SiaIV(-/-) Maus im Exenzephaliemodell ................................................. 125
5.6
S-Pentyl-4-Pentinsäure........................................................................................ 131
5.7
Einfluß von VPA-Derivaten auf die Differenzenzierung fetaler Hippocampuszellen ....................................................................................................... 134
5.8
Ausblick .............................................................................................................. 138
6.0
ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................... 140
7.0
SUMMARY ...................................................................................................... 143
8.0
LITERATUR ................................................................................................... 146
9.0
ANHANG.......................................................................................................... 167
9.1
9.2
9.3
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 167
Tabellenverzeichnis............................................................................................. 170
Ct-Werte der RT-PCR Studie.............................................................................. 171
Abkürzungen
ABKÜRZUNGEN
4en-VPA............................. Propyl-4-Pentensäure
4-yn VPA ........................... Propyl-4-Pentinsäure
Abb..................................... Abbildung
AK ...................................... Antikörper
C0............................................................ Konzentration zum Zeitpunkt 0
CHO ................................... Chinese Hamster Ovary Cells
Cmax ....................................................... Maximale Konzentration
cDNA ................................. copy DNA
DNA ................................... Desoxyribonukleinsäure
dpi....................................... dots per inch
E ......................................... Tag der Embryonalentwicklung
EndoN ................................ Endoneuraminidase N
Fa........................................ Firma
HDAC ................................ Histondeacetylase
i.p........................................ intraperitoneal
Ig ........................................ Immunglobulin
Iso-4-yn ............................. Isobutyl-4-Pentinsäure
k .......................................... Eliminationskonstante
KGW .................................. Körpergewicht
LTP..................................... Long Term Potentation
M. ....................................... Mittelwert
Min. .................................... Minute
n.......................................... Anzahl
NCAM................................ Neurales Zelladhäsionsmolekül
NCAM (-/-) .......................... B6.129P2-Ncam1tm1Cgn/J
p.o....................................... peroral
PPAR.................................. Peroxisomen-Proliferations-aktivierender-Rezeptor
PSA ................................... Polysialinsäure
RNA ................................... Ribonukleinsäure
rpm ..................................... Umdrehungen pro Minute
RT-PCR.............................. Real time Polymerase Chain Reaction
s.c. ...................................... subcutan
S.D...................................... Standardabweichung
S-Pentyl-4-yn .................... S-Pentyl-4-Pentinsäure
ST8SiaIV(-/-) ....................... B6.129P2-Siat8dtm1Zch
Std. ..................................... Stunde
t1/2 ........................................................... Halbwertszeit
Tab. .................................... Tabelle
VPA.................................... Valproinsäure
ZNS .................................... Zentrales Nervensystem
1-
1-
Einleitung
EINLEITUNG
Carbonsäuren sind Substanzen, die sowohl im Fach der Lebensmitteltoxikologie als auch in
der pharmakologischen Forschung von Interesse sind. Funktionelle Nahrungsinhaltsstoffe,
wie z.B. konjugierte Linolsäurederivate (CLA´s), sind als gesundheitsfördernde Substanzen
ein Gegenstand intensiver Forschung im Lebensmittelbereich. Toxikologisch relevante
verzweigte Fettsäuren sind beispielsweise Phthalate, die als Weichmacher in Kunststoffen
eingesetzt werden und als Nahrungsmittelkontaminanten von Bedeutung sind.
Die Valproinsäure ist eine kurzkettige und verzweigte Fettsäure, die als Arzneimittel einen
weiten
Anwendungsbereich
hat
und
als
Modellsubstanz
zur
Erforschung
von
Neuralrohrdefekten eingesetzt wird. Ursprünglich als Antiepileptikum etabliert, erweiterte
sich der Einsatz der VPA auf die Prophylaxe von Migräneerkrankungen, Therapie manischdepressiver Erkrankungen und auf die Bekämpfung verschiedener Tumoren. Dieser breiten
Anwendung stehen zwei schwere, lebensbedrohliche Nebenwirkungen gegenüber: die
Hepatotoxizität und die Teratogenität. Das Thema dieser Arbeit sind die teratogenen Effekte
der VPA und der VPA-Derivate. Bei den Fehlbildungen handelt es sich um ein spezielles
Schädigungsmuster: die VPA schädigt gezielt das Neuralrohr. Beim Menschen tritt diese
Schädigung klinisch als Spina bifida aperta in Erscheinung, in der Maus kann als einzigem
Modelltier ebenfalls ein Neuralrohrdefekt erzeugt werden. Der Schluß des Neuralrohres ist
ein komplexer Vorgang aus fein regulierten Einzelschritten, und es gibt über 100
Mausmodelle, die diese Defekte zeigen. Kein einziger Mausstamm zeigt jedoch isoliert, ohne
andere Defekte, einen offenen Rücken. Dies verdeutlicht die multifaktorielle Genese der
Erkrankung, und stellt wahrscheinlich einen Grund dar, warum diese schwere Fehlbildung des
Menschen vergleichsweise wenig erforscht ist.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem neuralen Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und der
Polysialinsäure (PSA) als Zielstruktrur in der Genese der Neuralrohrdefekte. Die gezielte
Vermittlung von Annäherung und Abstand stellt ein Leitprinzip in der Embryonalentwicklung
dar, das bei einer Störung des Gleichgewichts zu Defekten führt. Die wichtige Funktion des
PSA-NCAM in dem Prozess des Neurulation ist bereits dokumentiert, andererseits ist
bekannt, dass VPA in-vitro NCAM zu beeinflussen vermag. In dieser Arbeit soll aus beiden
Bausteinen ein möglicher Mechanismus zur Entstehung der Neuralrohrdefekte durch
teratogene VPA-Derivate in-vivo abgeleitet werden.
1
1-
Einleitung
1.1-
Embryonalentwicklung und Neuralrohrdefekte
1.1.1-
Embryonalentwicklung
Die Lehre von der Embryologie beschäftigt sich mit der Entwicklung des Individuums von
der Befruchtung bis zur Geburt. Nach morphologischen Gesichtspunkten läßt sich die
Entwicklung
in
die
Blastogenese,
Embryonal-
und
Fetalperiode
einteilen.
Die
Embryonalperiode beginnt mit dem Aufreten des Primitvstreifens als Voraussetzung zur
Bildung des Neuralrohres und beeinhaltet die Bildung aller Organanlagen. In der Fetalperiode
differenzieren sich die meisten Organe bis zur Geburt aus. Der zeitliche Verlauf der frühen
Individualentwicklung ist in Tabelle 1 für den Menschen und die Hausmaus (Mus musculus)
gezeigt.
Im
Gegensatz
zu
den
großen
zeitlichen Differenzen
der
embryonalen
Entwicklungsstufen zwischen Mensch und Hausmaus sind die sichtbaren Somitenpaare wie
ein inneres Uhrwerk, das in der Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung tickt
(Macdonald et al., 1998). Die Somiten sind unabhängig von dem Zeitpunkt der Entwicklung
ein Kennzeichen der Reife des Embryos und charakterisieren damit spezifisch die Phase der
Embryonalentwicklung.
Tabelle 1.1: Morphologische Kennzeichen der Embryonalentwicklung im zeitlichen Verlauf
und im Vergleich zur Anzahl der Somiten beim Menschen und der Hausmaus.
Maus(1)
Embryonale Entwicklungsstufe
Tag
Somiten
(n)
Befruchtung der Eizelle
0
Anheftung der Blastozyste
4,5
Implantation des Embryos
5
Primitivgrube sichtbar
7
1. Somitenpaar sichtbar, Neuralrohr schließt sich im 8-8,5
1-7
Hals-/Kopfbereich
Formation des rostralen Neuroporus
9-9,5
13-20
Formation des caudalen Neuroporus,
9,521-29
Gliedmaßenknospe vorne sichtbar
10,25
Schluß des caudalen Neuroporus, Gliedmaßen10,25- >30
knospe hinten sichtbar
10,75
1: (Kaufman, 1999)und (Theiler, 1972), 2: (O´Rahilly & Müller, 1987)
2
Mensch(2)
Tag
Somiten
(n)
0
5-6
7-12
18
20
1-3
24
26
13-20
21-29
27-29
>30
1-
1.1.2-
Einleitung
Neuralrohrentwicklung
Das Neuralrohr ist der embryonale Vorläufer von Gehirn und Rückenmark, es entsteht im
Verlauf der Neurulation. Die Neurulation läßt sich in 3 Abschnitte unterteilen: neurale
Induktion, Bildung der Neuralfalten und Schluß des Neuralrohres (siehe Abb. 1.1). Während
der neuralen Induktion entsteht die Neuralplatte aus multipotenten Stammzellen des
embryonalen Ektoderm (Coop et al., 1990).
Abb. 1.1:
Neuralrohrentwicklung
(Langmann, 1975)
a: Chorda dorsalis
b: Neuralleistenzellen
c: Neuralgrube
d: Oberflächenektoderm
e: Neuralrohr
1: rostraler Neuroporus
2: Neuralfalten
3: Somiten
4: caudaler Neuroporus
Die treibende Kraft für diese Induktion der Differenzierung ist umstritten. Traditionell wird
angenommen, dass das initiale Signal zur Differenzierung in den Stammzellen selbst
begründet ist (Roux, 1885). Eine neue Sichtweise geht von intrinsischen und extrinsischen
Signalen des Notochord und paraxialem Mesoderm aus (Schoenwolf & Smith, 1990). Die
lateralen Kanten der Neuralplatte verdicken sich und heben sich über die Oberfläche hervor,
wobei sich zwischen den beiden entstehenden Neuralfalten die Neuralgrube bildet. Die
Neuralgrube vertieft sich mit der fortlaufenden Entwicklung der Neuralfalten. Die
Neuralfalten durchlaufen einen Richtungswechsel, falten sich in mediane Richtung und
3
1-
Einleitung
nähern sich aneinander an. Während des Schlusses des Neuralrohres fusionieren die
Neuralfalten in der Medianen und über dem geschlossenen Rohr bildet sich eine epidermale
Deckschicht (Schoenwolf & Smith, 1990; Coop et al., 1990).
Der Neuralrohrschluß beginnt von 4 verschiedenen initialen Fusionspunkten aus (siehe Abb.
1.2). Die Zeitspanne der Neurulation läuft in verschiedenen Mäusestämmen unterschiedlich
ab, die morphologischen Kennzeichen sind allerdings gleich (Golden & Chernoff, 1993). Die
beschriebene primäre Neurulation findet bis zur Kreuzbeinregion statt. Das Rückenmark des
caudalen Kreuzbeins und des Schwanzes entsteht durch sekundäre Neurulation, bei der sich
mesenchymale Zellen verdichten und kanalisieren, ohne zuvor Neuralfalten gebildet zu
haben. Die sekundäre Neurulation spielt beim Menschen eine untergeordnete Rolle, bei der
Maus nimmt sie fast die Hälfte der Rückenmarksentwicklung ein (Schoenwolf, 1984).
Abb. 1.2: Initiale Punkte des Neuralrohrschlusses
(Harris & Juriloff, 1999)
(Golden & Chernoff, 1993)
1- Übergang von cervikaler zu thorakaler Achse
2- Vorderhirn-/Mittelhirngrenze
3- rostraler Rand des Vorderhirns
4- Stammhirn und cervikale Körperachse
Die Pfeile geben die Richtung des fortlaufenden
Neuralrohrschlusses an.
Die Entwicklung des Neuralrohres wird nicht isoliert, sondern im Zusammenspiel mit der
Morphogenese der gesamten Körperachse betrachtet. Einige Säugetiere, wie z.B. die
Rodentiae, durchlaufen in ihrer frühen Embryonalentwicklung eine Rotation der Körperachse.
Der dorsal konkave Embryo rotiert während des Neuralrohrschlusses zu einem dorsal
konvexen Embryo. Der menschliche Embryo durchläuft diese Rotation nicht (Rugh, 1968).
Weiterhin ist die Entwicklung der Neuralleiste eng mit dem Neuralrohr verbunden. Aus
Zellen der Neuralleiste entstehen periphere Gliazellen (Schwann´sche Zellen), Melanoblasten,
chromaffine Zellen der Nebenniere und Neuroblasten der Spinalganglien (Schnorr, 1996).
4
1-
1.1.3-
Einleitung
Neuralrohrdefekte
Neuralrohrdefekte sind die häufigsten, angeborenen Defekte des zentralen Nervensystems
(ZNS). Eine große Studie aus Ungarn über 2,1 Millionen lebend- und totgeborene Kinder
stellt die Neuralrohrdefekte mit 1206 Fällen als zweithäufigste, schwere isolierte Fehlbildung
nach den kongenitalen Herzdefekten heraus (Czeizel et al., 2001). Neuralrohrdefekte
entstehen durch eine Störung der primären oder sekundären Neurulation; eine Ruptur nach
vollständigem Schluß des Neuralrohres ist selten, aber beschrieben (Hook, 1992).
Unterschieden werden die partielle Rachischisis, eine Spaltbildung in Teilen des
Neuralrohres, und die komplette Rachischisis. Die partielle Rachischisis wird nach
Körperregionen unterteilt. Als craniale Neuralrohrdefekte werden Fehlbildungen des Gehirns,
als caudale Neuralrohrdefekte werden Fehlbildungen des Rückenmarks bezeichnet. Die
Defekte werden durch eine Beschreibung der beteiligten Strukturen genauer charakterisiert:
eine Meningocele bezeichnet einen blasenartig erweiterten Subarachnoidalraum mit intaktem
Nervengewebe,
bei
der
Myelomeningocele
(Fehlbildung
des
Rückenmarks)
bzw.
Craniomeningocele (Fehlbildung des Gehirns) ist das Nervengewebe in der blasenartigen
Erweiterung verlagert und verformt. Die Myeloschisis bzw. Cranioschisis beschreibt den
Zustand des nicht geschlossenen Neuralrohrs, der Defekt ist unbedeckt von Haut oder
Schädelknochen. Im lumbalen Bereich wird dieser Defekt als Spina bifida aperta (offener
Rücken) bezeichnet, im cranialen Bereich als Anenzephalie bzw. Exenzephalie (Patten,
1953).
Die Ursachen von Neuralrohrdefekten sind multifaktoriell. Formell werden genetische und
umweltbedingte Ursachen unterschieden, man geht aber von einer Interaktion der genetischen
Prädisposition mit einem auslösenden Agens aus (Carter, 1974). Epidemiologische Studien
zeigen beim Menschen den Einfluß des Herkunftlandes und eine Geschlechtsprädisposition
für Anencephalie bei Frauen (Chatkupt et al., 1994; Dolk et al., 1991). Die Prävalenz von
Spina bifida und Anencephalie ist rückläufig. Eine US amerikanische Studie verzeichnet
einen Rückgang der Neuralrohrdefekte von1991 bis 2001 um 23% und führt diesen Rückgang
auf die staatliche Folsäure-Supplementierung in Getreideprodukten zurück (Mathew et al.,
2002). Die Wirsamkeit der Folsäuresupplementierung zur Prävention von Neuralrohrdefekten
ist sowohl für nicht-prädisponierte als auch für prädisponierte Familien gezeigt (Czeizel &
Dudas, 1992; MRC Vitamin Study Research Group, 1991).
5
1-
Einleitung
Die epidemiologische Erfassung von Neuralrohrdefekten ist ausgesprochen schwierig, da
aufgrund einer häufig unzureichenden Erfassung von Schwangerschaftsabbrüchen sowie Totund Frühgeburten die gezählte Häufigkeit nicht der wahren Inzidenz entspricht (Frey &
Hauser, 2003). Als teratogener Effekt wird ein Defekt der physiologischen Organogenese
durch ein auslösendes Agens bezeichnet. Fetale Anomalien infolge toxischer Einflüsse sind
dagegen unspezifisch, wie eine gehemmte Knochenentwicklung mit verschmolzenen
Rippenpaaren oder ein verringertes Körpergewicht (Black & Marks, 1992). Im Tiermodell
sind zahlreiche Substanzen bekannt, die Neuralrohrdefekte in-vivo induzieren können. Hierzu
zählen:
ƒ
Arzneimittel:
Retinoide (Ehlers et al., 1992)
Valproinsäure (Nau et al., 1981)
ƒ
Suchtmittel:
Ethanol (Bannigan & Burke, 1982)
Lysergsäurediethylamid (LSD) (Geber, 1967)
ƒ
Pflanzeninhaltsstoffe:
Solanumalkaloide (Keeler et al., 1978)
ƒ
Physikalische Einflüsse:
Röntgenstrahlung (Friedberg et al., 1987)
Hyperthermie (Webster & Edwards, 1984)
ƒ
Schwermetalle:
Cadmium (Webster & Messerle, 1980)
ƒ
Weichmacher:
Phtalate (DEHP, DBP) (Shiota & Nishimura, 1982)
ƒ
Azofarbstoffe:
Trypanblau (Lendon, 1974)
Es gibt nur wenige Teratogene, die bei beiden Spezies, beim Menschen und einem
Labornager, Neuralrohrdefekte induzieren, hierzu zählen Retinoide und Valproinsäure. Die
meisten teratogenen Substanzen, die in Versuchstieren Neuralrohrdefekte erzeugen,
verursachen beim Menschen keine Fehlbildung des Neuralrohrs (Übersicht siehe Coop et al.,
1990)
6
1-
Einleitung
1.2-
Valproinsäure (VPA)
1.2.1-
Anwendung und Bedeutung der VPA
Die 2-Propylpentansäure (Valproinsäure, VPA) ist eine kurzkettige und einfach verzweigte
Fettsäure. Die Synthese dieser Substanz gelang dem Chemiker Burton erstmalig 1882
(Burton, 1882). Die antikonvulsive Wirksamkeit der VPA wurde durch Zufall von Pierre
Eymard entdeckt, der den Wirkstoff als Lösungsmittel für andere Substanzen verwendete
(Meunier et al., 1963). VPA wurde 1967 zuerst in Frankreich als Arzneimittel gegen die
Epilepsie zugelassen, darauffolgend in über 100 anderen Ländern und ist heute eines der am
häufigsten verwendeten antikonvulsiven Medikamente (Löscher, 2002; Perucca, 2002).
Klinische Studien zeigen die hohe Wirksamkeit als Monotherapeutikum gegen partielle und
generalisierte tonisch-klonische Krämpfe sowohl bei Erwachsenen (Heller et al., 1995) als
auch bei Kindern (de Silva et al., 1996). Die Erfahrungen der langjährigen Anwendung
zeigen, dass die VPA wahrscheinlich das weiteste antikonvulsive Spektrum aller etablierten
Antiepileptika hat (Davis et al., 1994). Die optimalen therapeutischen Plasmaspiegel der
Valproinsäure als Antikonvulsivum werden beim Menschen mit 50- 100 µg/ml angegeben,
das entspricht 350- 700 µmol/ml; einige Patienten sprechen allerdings auch außerhalb dieses
Bereiches auf die Therapie an (Davis et al., 1994; Commission on Antiepileptic drugs, 1993).
H
COOH
Abb. 1.3: Chemische Struktur der Valproinsäure
Molekulargewicht: 144,21 g/Mol
Schmelzpunkt: 120- 121°C
pKa: 4,56
log P (Wasser/Oktanol): 2,72
Ein weiterer Anwendungsbereich der VPA ist die Migräneprophylaxe. 1988 beschreibt
Sørensen
in
einer
offenen,
prospektiven
Studie
die
vorbeugende
Wirkung
auf
Migräneattacken (Sörensen, 1988). Dieser Untersuchung folgen verblindete, Placebokontrollierte Studien, die die Wirksamkeit der VPA in der Migräneprophylaxe bei Kindern
und erwachsenen Patienten bestätigen (Klapper, 1997; Serdaroglu et al., 2002). Die
therapeutischen Plasmaspiegel sind in der Migräneprophylaxe niedriger als die empfohlenen
7
1-
Einleitung
Spiegel in der Epilepsiebehandlung. Eine aktuelle Studie empfiehlt Dosierungen, die zu
einem Plasmaspiegel unter 50 µg/ml führen (Kinze et al., 2001).
VPA wird seit Ende der 70er Jahre gegen schwere Psychosen eingesetzt. Bowden beschreibt
1994 die gute Wirksamkeit von VPA und Lithium bei der Behandlung akuter Psychosen in
einer Placebo-kontrollierten, verblindeteten Studie an 179 Patienten (Bowden et al., 1994).
Eine andere Studie vergleicht Carbamazepin und VPA in ihrer Effizienz und Verträglichkeit
bei der Behandlung manischer Erkrankungen. Beide Substanzen sind als gut wirksam
beschrieben, der Autor kommt allerdings im direkten Vergleich zu dem Ergebniss, dass VPA
eine schnellere Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen als Carbamazepin hat. Die
wirksame Plasmakonzentration beträgt in dieser Studie 50- 100 µg/ml (Vasudev et al., 2000).
Eine aktuelle Entwicklung in der Anwendung der VPA ist die Therapie bösartiger
Gliazelltumoren im Kindesalter. 1996 entdeckt die Arbeitsgruppe um Jindrich Cinatl die
antitumorale Wirkung von VPA auf humane Neuroblastomzellen in-vitro (Cinatl Jr. et al.,
1996). 2 Jahre später zeigt Driever die Induktion der Differenzierung von Gliomzellen invitro und beschreibt VPA als sinnvolle Konsolidierungstherapie nach Chemo- oder
Strahlentherapie bei malignen Gliomen im Kindesalter (Driever et al., 1999). Aufgrund der
vorklinischen Ergebnisse wird die VPA in einer klinischen Testphase I an Patienten mit
malignen Gliomen angewendet (Gesellschaft deutschsprachiger Neuropediatrie und pediatr.
Onkologie und Hämatologie, HIT-GBMc Studie, Deutsche Kinderkrebsstiftung DKS
2000.03).
1.2.2-
Nebenwirkungen der VPA-Anwendung
Der größte Anteil der Nebenwirkungen, die während der Behandlung mit VPA beobachtet
werden, sind von geringer Schwere, meist in der frühen Phase der Therapie zu beobachten
und erzwingen keine Veränderung der Dosierung (Schmidt, 1984). Jeavons berichtet, dass in
einem Zeitraum von 6 Jahren bei über 500 Patienten im üblichen Dosierungsbereich der
Epilepsiebehandlung keine schweren Nebenwirkungen beobachtet wurden (Jeavons, 1982).
Als eine der häufigsten Nebenwirkungen tritt eine Gewichtszunahme auf sowie
gastrointestinale
Störungen
und
neurologische
Effekte,
wie
Müdigkeit,
Tremor,
Kopfschmerzen und Schwindelanfälle. Weiterhin wird vorübergehender Haarausfall
8
1-
Einleitung
beschrieben (Davis et al., 1994). Die starke Gewichtszunahme durch die VPA-Therapie ist
nicht unumstritten. Easter et al. (1997) stellten fest, dass zwischen einer VPA- und einer
Carbamazepin
behandelten
Gruppe
von
Kindern
keine
Unterschiede
in
der
Gewichtsentwicklung festzustellen sind. Im Vergleich zu anderen Antiepileptika werden
gastrointestinale häufiger als neurologische Nebenwirkungen beobachtet (Schmidt, 1984). Bei
weiblichen Patienten werden endokrinologische Störungen wie polyzystische Ovarien und
Hyperandrogenismus beschrieben (Isojärvi et al., 1996).
Gegenüber den beschriebenen häufigeren, aber nicht lebensbedrohlichen Nebenwirkungen, ist
die VPA-Therapie assoziiert mit zwei schweren, aber seltenen Nebenwirkungen: der akuten
schweren Hepatotoxizität und der Teratogenität. Eine englische Studie wertet 331 Todesfälle
von Kindern im Zusammenhang mit einer Arzneimitteltherapie in den Jahren von 1964 bis
2000 aus. Von den 331 Todesfällen werden 31 mit einer VPA-Therapie assoziiert, hiervon
starben 21 Kinder an einem akuten, schweren Leberversagen (Clarkson & Choonara, 2002).
Eine Studie aus Deutschland und der Schweiz dokumentiert 8 Todesfälle bei Kindern-von
1988 bis 1996 durch ein VPA-assoziiertes Leberversagen (Konig et al., 1994). Die
Hepatopathie wird im Zusammenhang mit dem VPA-Metaboliten 2-Propyl-4-Pentensäure
diskutiert, die Mechanismen sind aber unbekannt (Siemens & Nau, 1991).
1.2.3-
VPA-Anwendung während der Embryonalentwicklung
1.2.3.1- Epidemiologie von VPA-induzierten Fehlbildungen des Menschen
Die Einnahme von VPA während der Schwangerschaft ist korreliert mit verschiedenen
Fehlbildungen bei den Nachkommen. Robert und Guibaud berichten 1982 erstmals von dem
vermehrten Auftreten von Meningozelen bei Kindern von epilepsiekranken Müttern während
der VPA-Therapie (Robert & Guibaud, 1982). Im gleichen Jahr werden 9 Fälle von
Myelomeningozelen im französischen Rhônes-Alpes von 1976 bis 1982 während VPABehandlung dokumentiert (Bjerkedal et al., 1982) und das Risiko einer Spina bifida durch
VPA auf ca. 1% der exponierten Embryos kalkuliert. Diese Risikoeinschätzung von ca. 1%
wird von Lindhout et al. 1984 bestätigt (Lindhout & Meinardi, 1984). Eine internationale
Studie beschreibt 1986 das Risiko für Spina bifida nach VPA-Exposition im ersten Trimester
9
1-
Einleitung
der Schwangerschaft als 1-5% gegenüber einer Inzidenz in der Normalbevölkerung von 0,05
bis 0,3% in Holland, Helsinki und Montreal (Lindhout & Schmidt, 1986). Metaanalysen
großer Patientenzahlen belegen das erhöhte Risiko für Neuralrohrdefekte nach VPAExposition. Das Risiko wird in einer europäischen Studie bei Tagesdosen >1000 mg als
besonders hoch und signifikant höher als nach Carbamazepin-Exposition eingestuft. Neben
der Spina bifida aperta werden auch Phocomelie, Herzdefekte und Porenzephalie mit der
VPA-Einnahme korreliert (Samren et al., 1997; Arpino et al., 2000). Die sensible Phase der
Neuralrohrentwicklung und damit der Zeitpunkt der Schädigung des Embryos durch VPA
liegt beim Menschen ungefähr zwischen dem 20. und 30. Tag der Embryonalentwicklung, das
entspricht der 4. bis 5. Schwangerschaftswoche (siehe Tabelle 1.1). Zu diesem frühen
Zeitpunkt wird der Mutter meist mit dem Ausbleiben der Menstruationsblutung die
Schwangerschaft bewußt, die Schädigung des Embryos ist aber bereits irreversibel.
Die VPA-Therapie wird neben den schweren, lebensbedrohlichen Fehlbildungen auch mit
weniger schweren Anomalien des Gesichtes und der Hände in Zusammenhang gebracht
(Koch et al., 1983; Huot et al., 1987; Arpino et al., 2000). Ein Fehlbildungssyndrom des
Gesichts, der Hände und der Gliedmaßen wird von einigen Autoren als fetales ValproatSyndrom bezeichnet (Verloes et al., 1990; Sarnakava et al., 1990). Die VPA-Exposition des
Embryo ist weiterhin verantwortlich für die vermehrte Ausbildung einer Hypospadie
(Lindhout & Meinardi, 1984; Lindhout et al., 1992; Arpino et al., 2000).
Die Inzidenz von Neuralrohrdefekten und anderen Fehlbildungen bei Epilepsiekranken ohne
Einfluß des Antiepileptikums ist nicht unumstritten. Die Prävalenz von Neuralrohrdefekten
pro 10.000 geborener Kinder in der gesamten Bevölkerung wird aktuell für Sachsen-Anhalt
zwischen 15,8 für das Jahr 1990 und 11,5 für das Jahr 2001 angegeben (Rösch et al., 2002).
Das Risiko einer Spina bifida aperta nach VPA-Exposition ist ungefähr 20mal größer als in
der Allgemeinbevölkerung und 10mal höher als bei Kindern, deren Mütter während der
Schwangerschaft mit einem anderen Antiepileptikum behandelt worden sind (Lindhout &
Schmidt,
1986).
Zahlreiche
Studien
belegen
den
Zusammenhang
zwischen
der
Epilepsieerkrankung und leichten Fehlbildungen des Gesichts und der Hände (Rating et al.,
1987; Koch et al., 1983; Gaily et al., 1988; Thomas et al., 2001; Nulman et al., 1997). Die
Korrelation zwischen schweren Fehlbildungen und der Epilepsieerkrankung wird von einigen
Autoren bestätigt (Koch et al., 1983; Lindhout et al., 1992; Durner et al., 1992), entweder
10
1-
Einleitung
aufgrund einer genetischen Prädisposition oder aufgrund maternaler Krampfanfälle während
der Schwangerschaft. Eine amerikanische Studie findet keine Korrelation zwischen dem
Risiko für Fehlbildungen und der Erkrankung an Epilepsie. In dieser Untersuchung wird die
teratogene Wirkung der VPA auch an nicht-epilepsiekranken Patienten gezeigt (Holmes et al.,
2001).
1.2.3.2- Teratogene Effekte der VPA in verschiedenen Labortierspezies
Die Teratogenität von Valproinsäure unterliegt starken Unterschieden zwischen den Spezies.
Während beim Menschen der weitaus häufigste Neuralrohrdefekt die Meningomyelocele oder
Spina bifida aperta im Lumbalbereich ist, ist der häufigste Neuralrohrdefekt im Versuchstier
die Exenzephalie in der Maus. Das Exenzephaliemodell (siehe Abb.1.4) wurde im NMRIAuszuchtstamm 1981 etabliert (Nau et al., 1981). Die sensible Phase zur Induktion der
Exenzephalie liegt bei Tag 8,0 der Trächtigkeit, außerhalb dieses Zeitrahmens fällt die
Exenzephalierate der Feten deutlich ab (Nau, 1985). Der optimale Zeitpunkt wurde in
nachfolgenden Arbeiten bei Tag 8,25 für den NMRI Stamm festgelegt (Elmazar & Nau,
1992). Der teratogene Effekt im Mäusefetus hängt von den erreichten Plasmapeaks im
maternalen Blut ab, während die embryotoxischen Effekte, gemessen als Embryolethalität
und fetaler Gewichtsrückgang, direkt vom Konzentrations-/Zeitverhältnis (area under the
curve in einer Konzentrations-/Zeitkurve) abhängen (Nau, 1985).
Die Induktion der Spina bifida aperta ist im NMRI-Stamm mit hohen Dosen von VPA
möglich. Die weitaus häufigste Mißbildung im Spina-bifida Modell (siehe Abb. 1.4) der Maus
ist allerdings die Spina bifida occulta, die als Spaltbildung im pathologisch erweiterteten
knöchernen Wirbelkanal gemessen wird (Ehlers et al., 1992). Die Mißbildung des
Neuralrohres tritt bei sehr hohen Dosen ( 600 mg/kg) in der Maus gemeinsam mit
Knochenmißbildungen des Schädels und der Wirbelsäule auf (Padmanabhan & Hameed,
1994), bei niedrigeren Dosen (125 und 250 mg/kg) sind dosisabhängig zusätzliche Rippen zu
beobachten (Chernoff & Rogers, 1992).
11
1-
Einleitung
Exenzephaliemodell
0
18
8.25
Tag der Trächtigkeit
Spina bifida- Modell
9.0, 9.25, 9.5
0
18
Tag der Trächtigkeit
Verpaarung
Behandlung
Sektion
Abb. 1.4: Exenzephalie- Modell und Spina bifida- Modell.
Die Modelle unterscheiden sich in den Zeitpunkten der Substanzapplikation und in den
benötigten Dosierungen. Der teratogene Effekt der VPA ist abhängig von der sensiblen
Phase des Neuralrohrs als Zielorgan.
Durch Verabreichrung von VPA an zwei Zeitpunkten an Tag 9 der Trächtigkeit wird
Ektrodaktylie induziert (Scott et al., 1997), und der ausgeprägte Zirkadianrythmus der Maus
kann die Embryotoxizität der VPA zusätzlich beeinflussen (Ohdo et al., 1995). Bis heute ist
die Maus die einzige Versuchstierspezies, die nach VPA-Behandlung deutlich erkennbare und
signifikant vermehrt Neuralrohrdefekte zeigt. Zwischen den verschiedenen Mäusestämmen
sind allerdings erhebliche Unterschiede in der Empfindlichkeit auf die teratogenen Effekte der
VPA beschrieben (Naruse et al., 1988; Faiella et al., 2000).
Die Teratogenität der VPA wurde auch in anderen Labortierspezies untersucht. Der
Rhesusaffe reagiert mit erhöhter Embryolethalität, retardiertem Wachstum und Mißbildungen
des Gesichts und verschiedener Skelettanteile (Mast et al., 1986) (Hendrichx et al., 1988).
Häufiger ist die VPA-Behandlung während der Embryonalentwicklung der Ratte beschrieben;
auch in dieser Spezies werden zahlreiche Skelettdeformationen (Menegola et al., 1998;
Ceylan & Duru, 2001) und abhängig vom Somitenstadium deformierte Somiten, Spinalnerven
und Spinalganglien beobachtet (Menegola et al., 1999). Ein vergleichbares Bild mit
Skelettmißbildungen und zusätzlichen Defekten des Herzens und Urogenitaltraktes zeigt das
12
1-
Einleitung
Kaninchen (Petrere et al., 1986). Die VPA erzeugt auch im Zebrafisch (Brachydanio rerio),
im Axolotl (Ambystoma mexicanum) und im Krallenfrosch (Xenopus laevis) keine
Neuralrohrdefekte (Oberemm & Kirschbaum, 1991; Dawson et al., 1992; Herrmann, 1993).
Ein in-ovo Hühnchen-Modell beschreibt neben verschiedenen anderen Defekten auch eine
Deformation des Neuralrohres (Whitsel et al., 2002).
1.2.3.3- Mechanismen der teratogenen Wirkung von VPA und VPA-Derivaten
Kinetik
Die teratogenen Effekte eines Wirkstoffes sind direkt abhängig von seiner Aufnahme,
Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung. Die Liphophilie einer Subststanz kann mit
dem Wasser-Oktanol-Verteilungskoeffizient als Modell für biologische Membranen,
abgekürzt als log P Wert, beschrieben werden. VPA ist mit einem log P Wert von 2,72 eine
lipohile Substanz (Bojic et al., 1996). Nach einer oralen Gabe von 50 mg/kg werden für die
Maus folgende pharmakokinetische Daten im Ein-Kompartment Modell angenommen:
Halbwertszeit:
0,8 Stunden
Verteilungsvolumen:
0,3 l/kg
Gesamtclearance:
400 – 900 ml/Std./kg
Proteinbindung:
30 – 50%
Bei einem pKa von 4,56 liegt die schwache Säure bei physiologischem Blut-pH von 7,4 zu
99,9% ionisiert vor. Die VPA unterliegt in der Maus einem ausgeprägten first-pass Effekt;
nach oraler Gabe erreichen die Plasmaspiegel nur 50% der Konzentration im Vergleich zur
subcutanen Injektion (Löscher & Esenwein, 1978; Löscher, 1978; Nau & Löscher, 1984; Nau,
1985; Nau & Löscher, 1986). Die Gewebeschichten zwischen maternalem Blut und Fetus sind
beim Menschen und der Maus mit einer Placenta haemochorialis ähnlich ausgeprägt. In-vitro
ist ein aktiver, pH-abhängiger Transport in humanen Chorionkarzinomzellen beschrieben, der
zu einer Anreicherung der VPA auf der fetalen Seite führt (Ushigome et al., 2001).
In-vivo ist für die VPA eine deutliche Akkumulation im embryonalen Neuroepithel
nachgewiesen; diese Anreicherung einer schwachen Säure im Embryo erklärt sich durch einen
höheren pH Wert des Embryos im Vergleich zum maternalen Gewebe (Dencker et al., 1990;
Nau & Scott, 1986). Die VPA wird zu verschiedenen pharmakologisch aktiven Substanzen
13
1-
Einleitung
metabolisiert, die Metaboliten sind jedoch nicht verantwortlich für den teratogenen Effekt.
Von den Metaboliten ist nur die 2-Propyl-4-Pentensäure (4-en-VPA) teratogen, und diese
Substanz liegt deutlich geringer konzentriert als die Ausgangssubstanz VPA im Plasma vor.
Die Teratogenität der VPA folgt einer Dosis-Wirkungsbeziehung, die Metaboliten steigen
aber aufgrund von Sättigungsmechanismen nicht proportional zur Dosis an. Die
Vorbehandlung mit Phenobarbital induziert einige Metabolisierungswege, verstärkt aber nicht
die Teratogenität (Nau, 1986).
Stoffwechselwege
Als mögliche Mechanismen für die Teratogenität der VPA werden verschiedene
Stoffwechselwege diskutiert. Die Supplementierung von Folsäure ist wirksam zur Prävention
von Neuralrohrdefekten, die Prävention von VPA-induzierten Defekten durch Folsäure wird
widersprüchlich diskutiert. In einer randomisierten, Doppel-Blind-Studie beschreiben Trotz et
al. eine dosisabhängige, signifikante Reduzierung der Exenzaphlieraten in NMRI Mäusen
nach gemeinsamer Verabreichung von Folsäure und VPA (Trotz et al., 1987). Die protektive
Wirkung der Folsäure wird von Hansen et al. in CD-1 Mäusen nicht bestätigt (Hansen et al.,
1995). Einen Hinweis auf die Interaktion der Teratogenität der VPA mit dem
Folatstoffwechsel geben Arbeiten über den protektiven Effekt von Vitamin B6 und B12. Die
Vitaminsupplementierungen führen zu einer Reduktion der VPA-induzierten Exenzephalie
und Spina bifida occulta (Elmazar et al., 1992). Ein Folsäure- oder Vitamin B12 Mangel kann
einen Methioninmangel verursachen. Auch die zusätzliche Verabreichung von Methionin
reduziert die VPA- induzierte Spina bifida (Ehlers et al., 1996). Der DihydrofolatreduktaseInhibitor Trimethoprim verstärkt hingegen die teratogenen Effekte der VPA (Elmazar & Nau,
1993).
Ein weiterer Zusammenhang besteht zwischen der Teratogenität der VPA und den
antioxidativen Effekten von Vitamin E. Die kombinierte Verabreichung von Vitamin E und
hohen Dosen VPA führte zu signifikant geringeren Exenzephalierate und einer verringerten
Embryotoxizität (Al Deep et al., 2000). Der Retinoidmetabolismus spielt in der
Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle. Eine Studie an Kindern und Jugendlichen zeigt,
dass VPA und andere antikonvulsiv wirkende Medikamente den Retinoidmetabolismus
beeinflussen (Nau et al., 1995).
14
1-
Einleitung
Proliferation, Zelldifferenzierung und Zelladhäsion
VPA besitzt anti-proliferative Wirkung in verschiedenen Nervenzellkulturen. Dieser Effekt
wird sehr exakt auf eine Unterbrechung der Interphase in der mittleren G1-Phase der Mitose
in C6-Gliomazellen terminiert. Die Unterbrechung des Zellzyklus in der G1-Phase ist
assoziiert mit einer verstärkten Expression des Proteins Cyclin D3. Embryonalen Zellen
durchlaufen Phasen intensiver Zellteilung und die Hemmung der Interphase könnte ein
Teratogenitätsmechanismus sein (Bacon et al., 2002; Martin & Regan, 1991). Eine Studie in
Ratten zeigt, dass VPA einen Einfluß auf die Vaskularisierung der Plazenta während der
Trächtigkeit hat. Die Sprossung und Proliferation von Kapillaren der fetalen Seite ist
verringert und der Durchmesser der Nabelvenen verkleinert (Khera, 1992).
VPA und VPA-Derivate zeigen in verschiedenen in-vitro Systemen einen ausgeprägten
Einfluß auf die Proliferation von Nervenzellen. In Korrelation zu ihrer teratogenen Potenz
hemmen VPA-Derivate die Proliferation von C6-Gliomzellen (Courage-Maguire et al., 1997;
Bojic et al., 1998). In verschiedenen Neuroblastomzelllinien hemmen VPA-Derivate analog
ihrer Teratogenität die Verzweigung von Neuriten sowie die Motilität der Zellen und
beeinflussen verschiedene Proteine des Zytoskeletts, wie F-Aktin und ß-Tubulin (Walmod et
al., 1998; Skladchikova et al., 1998). In einer primären Kultur von Kleinhirnzellen hemmt
VPA die Formation von Nervenfasern und die Aggregation der Nervenzellen (Maar et al.,
1997). Die Beeinflussung von Proliferation und Zellmotilität kann auch während der
Embryonalentwicklung
eine
Ursache
für
die
gestörte
Neurulation
sein.
In
F9-
Teratokarzinomazellen induzieren teratogene VPA-Derivate in-vitro eine verstärkte
Expression des Neuralen Zelladhäsionsmoleküls (NCAM, siehe Abschnitt 1.3.1, bisher
unveröffentlichte Ergebnisse von Dr. Dr. Alfonso Lampen aus dem eigenen Arbeitskreis), ein
Protein, das Wanderung, Adhäsion und Kommunikation zwischen Zellen regulieren kann.
Das hochteratogene Derivat rac-Pentyl-4-yn (siehe Abschnitt 1.2.3.4) induziert in der
Neuroblastomzelllinie neuro-2A die Differenzierung der Zellen, vermehrte Neuritogenese und
dosisabhängig einen Anstieg der NCAM-Expression in Konzentrationen von 0,5 bis 2,0 mM
(Bojic et al., 1998). Der Effekt von VPA-Derivaten auf die Adhäsion von Zellen wird in-vivo
im Meerwasserpolypen Hydractinia gezeigt; konzentrationsabhängig verhindern die
Substanzen eine Integration bestimmter Zellgruppen in den Larvenkörper (Berking, 1991).
15
1-
Einleitung
Kernrezeptoren
Ein möglicher Bestandteil einer Zellkaskade als Ursache der teratogenen Effekte der VPA
sind Rezeptoren des Zellkerns. Die peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR´s)
gehören zu einer Superfamilie von Kernrezeptoren, die nach Aktivierung über eine DNAbindende Domäne direkt die Transkription verschiedener DNA-Abschnitte beeinflussen. Die
teratogenen VPA-Derivate induzieren eine Zelldifferenzierung in F9-Teratokarzinomzellen
und in Chinese Hamster Ovary Zellen (CHO). Mit Hilfe eines Luciferase-Reportergenassays
wird gezeigt, dass nur die teratogenen VPA- Derivate den PPARδ Rezeptor aktivieren. Die
nicht-teratogenen Derivate induzieren weder die Differenzierung, noch aktivieren sie den
PPARδ Rezeptor (Lampen et al., 1999; Lampen et al., 2001; Lampen et al., 2001). Einen
komplexen Einfluß auf die Transkription verschiedener Gene kann VPA über die Hemmung
von Histondeacetylasen (HDAC) nehmen. HDACs bestimmen die Verpackung der
Nukleosomen und damit den direkten Zugriff auf die genetische Information. Zeitgleich
beschreiben zwei Arbeitsgruppen VPA als potenten HDAC-Inhibitor (Göttlicher et al., 2001;
Phiel et al., 2001). Phiel et al. korrelieren die Inhibition von HDACs mit der teratogenen
Wirkung und zeigen, dass nicht-teratogene VPA-Derivate HDAC nicht hemmen. Die
Inhibition von HDAC ist bekannt als Strategie zur Krebstherapie, andererseits ist der HDACInhibitor Trichostatin A ein Teratogen und verursacht Neuralrohrdefekte (Svensson et al.,
1998).
Genexpression
Die unterschiedliche Sensibilität verschiedener Mäusestämme für die teratogenen Effekte der
VPA wirft die Frage nach den genetischen Ursachen und möglichen molekularen
Zielstrukturen auf (Naruse et al., 1988; Faiella et al., 2000). In verschiedenen Mäusestämmen
werden abhängig von der Sensibilität auf die VPA-Behandlung Gene aus dem
Folsäurestoffwechselweg
aktiviert.
Auch
ohne
die
VPA-Behandlung
zeigt
der
hochempfindliche SWV-Inzuchtstamm während der Neurulation eine schwächere Expression
wichtiger Gene für den Folatstoffwechsel (Finnell et al., 1997); dies könnte eine Ursache für
die hohe Sensibilität auf die teratogenen Effekte der VPA sein. In Reaktion auf eine VPABehandlung in teratogenen Dosisbereichen werden mehrere Gene verstärkt exprimiert; hierzu
zählen Transkriptionsfaktoren (Emx-1, Emx-2, c-fos, c-jun, creb), regulatorische Gene des
16
1-
Einleitung
Zellzyklus (p53 und bcl-2) und verschiedene Wachstumsfaktoren. Die direkte Bedeutung der
zumeist sehr komplexen Zusammenhänge zwischen Genexpression und Teratogenität bleibt
allerdings unklar (Wlodarczyk et al., 1996; Bennett et al., 2000).
Ein spezielles Enzym des Zellzyklus, die Ribonukleotidreduktase (RNR), wird in 2
Untereinheiten codiert (RNR-r1 und RNR-r2). RNR-r1 wird spezifisch an der Stelle der
gestörten Neurulation nach VPA-Behandlung erhöht exprimiert und stellt eine mögliches
Zielgen dar (Craig et al., 2000). VPA beeinflußt neben der Neurulation auch die Knochenund Knorpelentwickung, inbesondere bei hohen Dosierungen und außerhalb der sensiblen
Phase der Neuralrohrentwicklung. Als möglicher Mechanismus wird eine verringerte
Expression von Knorpelmatrixgenen (Kollagen Typ IX und aggrecan core Protein) im
Hühnerembryo beschrieben (Basu & Wezemann, 2000).
Ausgehend von der Beobachtung, dass die VPA-induzierten Skelettdefekte oftmals keine
strukturelle Veränderung, sondern nur eine Verschiebung oder Verdopplung beeinhalten
(homeotic transformations), gelingt der Nachweis einer veränderten Expression verschiedener
Gene der HOX Familie (Faiella et al., 2000). Das activator protein-1 (AP-1) ist ein Komplex
aus verschiedenen Produkten der Transkriptionsfaktorfamilien Fos und Jun. Diese Faktoren
spielen eine zentrale Rolle in der Regulation von Apoptose und Differenzierung der Zelle.
VPA verstärkt die Expression der verantwortlichen Gene in Gliom- und Neuroblastomzellen
in-vitro und könnte auf diese Weise auch in die Embryogenese eingreifen (Chen et al., 1999).
Die Mikroarray-Technik ermöglicht die Expressionsanalyse vieler verschiedener Gene
gleichzeitig. Zwei Studien haben VPA-behandeltes Fetalgewebe untersucht, detailierte
Beschreibungen und Bewertungen der Ergebnisse stehen allerdings noch aus (Stodgell et al.,
2003; Horsley et al., 2003)
1.2.3.4- Struktur- Aktivitätsbeziehungen der VPA-Derivate im Mausmodell
Die
teratogene
Wirkung
der
VPA
im
Exenzephaliemodell
folgt
sehr
engen
Strukturmerkmalen. Durch die gezielte Veränderung des VPA-Moleküls können die
Zusammenhänge zwischen chemischer Struktur und biologischem Effekt genau beschrieben
werden. Das α-C Atom muß in einem teratogenen Derivat eine freie Carboxylgruppe tragen
(Nau et al., 1991), die Kohlenstoffkette ist am C2-Atom verzweigt und das C2-Atom
17
1-
Einleitung
verbindet 2 Alkylketten. Zusätzlich tragen teratogene Derivate am C2-Atom einen
Wasserstoffrest (Bojic et al., 1998). Die Einführung einer Methylgruppe an C2, C3 oder C4
führt zu starker Abnahme oder zum Verschwinden der Teratogenität (Bojic et al., 1996).
Ebenso sind Derivate mit Doppelbindungen zwischen C2/C3 oder C3/C4 nicht oder nur sehr
schwach teratogen (Nau et al., 1991). Eine randständige Doppel- oder Dreifachbindung am
C4 Atom hingegen verstärkt die teratogene Aktivität. Propyl-4-Pentinsäure (4-yn VPA) ist
das erste Derivat der VPA, das stärker teratogen als die Muttersubstanz ist. Eine wichtige
Erkenntis ist, dass sich die chiralen Derivate in der teratogenen Aktivität ihrer Enantiomere
stark unterscheiden. Das S-Enantiomer der 4-yn VPA ist achtfach stärker teratogen als das REnantiomer (Abb. 1.5) und S-Propyl-4-Pentensäure verursacht ca. viermal mehr Exenzephalie
im Mausmodell als R-Propyl-4-Pentensäure (Hauck & Nau, 1989; Hauck & Nau, 1992). Die
Erkenntnisse aus den Studien der Struktur-Aktivitäten werden gezielt zur Synthese neuer
Substanzen umgesetzt, auf diese Weise entsteht die (S)-Pentyl-4-Pentinsäure (S-Pentyl-4-yn,
siehe Abb. 1.5). S-Pentyl-4-yn hat einen TeraD50-Wert von 0,72 mmol/kg, R-Pentyl-4-yn von
3,11 mmol/kg und VPA hat einen TeraD50-Wert von 3 mmol/kg in-vivo in der NMRI Maus
(Dissertation J. Volland 2002). Durch die Verzweigung der Seitenkette des 4-yn VPA entsteht
Isobutyl-4-Pentinsäure, eine Substanz ohne teratogene Aktivität (Bojic et al., 1996).
18
1-
Einleitung
H
COOH
Valproinsäure
zunehmende Teratogenität
Dreifachbindung
CO 2H
Kettenverlängerung
4-yn -VPA
Enantiomere
C O2
H CO2H
C O2H
(S)-4-yn -VPA
H CO2H
(R)-4-yn -VPA
C O2H
COOH
(S)-Pentyl-4-yn
Abb. 1.5: Struktur-Aktivitätsbeziehungen verschiedener VPA-Derivate.
Durch das Einfügen einer Dreichfachbindung zwischen das vierte und fünfte Kohlenstoffatom
der Seitenkette entsteht 4-yn-VPA, ein Derivat mit stärkerer Teratogenität als VPA. Das SEnantiomer zeigt zusätzlich eine deutlich stäkere Teratogenität als das R-Enantiomer. Durch
Verlängerung einer Seitenkette kann die Teratogenität ebenfalls gesteigert werden. Aus der
Kombination dieser 3 Struktur-Aktivitätsbeziehungen entsteht (S)-Pentyl-4-yn, eines der
teratogensten VPA-Derivate in-vivo und in-vitro.
(Bojic et al., 1996), (Dissertation U. Gravemann, Hannover 2001)
19
1-
Einleitung
1.3-
Neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und α2,8-Polysialinsäure (PSA)
1.3.1-
NCAM
Die Moleküle an der Oberfläche von Nervenzellen fügen die einzelne Zelle in ein komplex
koordiniertes Gesamtsystem ein. Eine Möglichkeit zur Koordination von Zellen ist die
Vermittlung von Abstand oder Annäherung. Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM ist ein
Glykoprotein und wird in die Großfamilie der Immunglobulin-artigen Zelladhäsionmoleküle
eingeordnet. Innerhalb dieser Familie ist NCAM das erste Zelladhäsionsmolekül, das entdeckt
wurde (Rutishauser et al., 1976). Die Grundstruktur aller Immunglobulinproteine der Klasse 3
sind sich wiederholende Motive, sogenannte Ig-artige Domänen und Fibronektin Typ III
Sequenzen. Alle NCAM-Isoformen basieren auf der gleichen Polypeptidkette und besitzen
extrazellulär 5 Ig-artige Domänen mit 2 Fibronektin Typ III Sequenzen (Cunningham et al.,
1987; Hoffmann et al., 1982). Die Basen- und Aminosäuresequenz des NCAM-Proteins ist
beschrieben bei Cunningham et al. (1987).
Durch alternatives Splicing des primären Transkripts des einzigen Gens entstehen 3
Isoformen des NCAM (Owens et al., 1987). Diese Isoformen haben eine Molekülmasse von
120, 140 und 180 kDa und besitzen einen ähnlichen extrazellulären Anteil. Die 140 und 180
kDa Isoformen sind über eine transmembrane Domäne mit einem intrazellulären Anteil
verbunden,
während
die
kleinste
120
kDa
Isoform
extrazellulär
über
einen
Glykophosphatidyl-Inositol Anker an die Zellmembran geknüpft ist (Cunningham et al.,
1987). Weitere Isoformen des NCAM werden gewebe- und zellspezifisch durch alternatives
Splicing des extrazellulären Anteils gebildet (Santoni et al., 1989; Small et al., 1988). Die 140
kDa Isoform wird auf humanen Leukozytenfraktionen exprimiert (natural killer cells) und in
diesem Zusammenhang als CD56 bezeichnet (Lanier et al., 1991).
NCAM ist phylogenetisch zwischen verschiedenen Wirbeltierspezies stark konserviert und
stellt in der Stammesentwicklung ein bewährtes Prinzip zur Vermittlung zellulärer
Interaktionen dar (Hoffmann et al., 1984). NCAM vermittelt Bindungsreaktionen zwischen
verschiedenen Zellen, und zwar sowohl homophile NCAM-NCAM-Bindungen (Hoffmann et
al., 1984), als auch heterophile Bindungen mit anderen Proteoglykanen wie Heparansulfatund Chondroitinsulfat-Proteoglykanen (Burg et al., 1995; Friedlander et al., 1994). NCAM
reagiert mit weiteren Adhäsionsmolekülen entweder auf der eigenen Zelloberfläche in Form
20
1-
Einleitung
einer cis-Interaktion oder mit Adhäsionmolekülen gegenüberliegender Zellen in einer transInteraktion, wobei sich große Adhäsionskomplexe bilden. Durch die Bindungsreaktion von
NCAM werden intrazelluläre Signalkaskaden beeinflußt. Den ersten Hinweis für den Einfluß
von NCAM auf intrazelluläre Signalwege erbringt Schuch (Schuch et al., 1989); er blockiert
die NCAM-Bindung in-vitro durch spezifische Antikörper und steigert dadurch den
intrazellulären Calciumspiegel, senkt den intrazellulären pH und reduziert verschiedene
Moleküle des Phosphoinositol-Signalweges. Weitergehende Studien zeigen, dass die
Aktivierung von second messenger Systemen zwischen verschiedenen Zellsystemen variiert,
und dass eine generalisierte Aussage zur intrazellulären Signalübertragung schwierig ist (von
Bohlen und Halbach et al., 1992).
1.3.2-
PSA
Die PSA wird im embryonalen Vertebratenhirn aufgrund ihrer unüblichen Größe und
Zusammensetzung erstmals als Pronase-resistentes Makromolekül beschrieben (Finne, 1982).
PSA ist ein Kohlenhydratpolymer, dessen Einzelbausteine im Wirbeltierorganismus aus 5-NAcetyl-Neuraminsäure bestehen. Die einzelnen Zuckermoleküle sind
zu Sialinsäure
verknüpft und die Sialinsäuredimere bilden über α2,8-glycosidische Bindungen die PSA
(siehe Abb. 1.6). Die Modifikation mit PSA ist einzigartig, und NCAM ist der einzige
natürliche Akzeptor (Tomasiewicz et al., 1993; Acheson et al., 1991).
1 COOH
9 CH OH
2
7
8
6
2
2
O
OH
N
O
6
O
OH
4
5
COOH
7
8
O
O
1
9 CH OH
2
OH
N
4
5
3
O
OH
3
n>4
Abb. 1.6: Sialinsäuredimer aus 5-N-Acetylneuraminsäure
21
1-
Einleitung
Diese Erkenntnis wird vor allem durch die Konstruktion der NCAM-knockout-Maus
(B6.129P2-Ncam1tm1Cgn/J) gestützt. Der Verlust von NCAM führt bei dieser Maus zu einem
nahezu völligen Verlust von PSA (Cremer et al., 1994). Zwei Jahre vor der Konstruktion der
NCAM-knockout-Maus wird der Nachweis von PSA an
Natriumkanälen im adulten
Rattengehirn beschrieben (Zuber et al., 1992). Die Modifikation von NCAM mit PSA (PSANCAM) führt zu einer funktionellen Umkehr der Adhäsion; die Adhäsion wird verringert und
der Abstand zwischen den Zellmembranen vergrößert sich (Sadoul et al., 1983). Der
Mechanismus dieser Effektumkehr wird diskutiert und durch zwei Theorien beschrieben: Die
erste Theorie erklärt die anti-adhäsive Wirkung der PSA durch die raumfüllende, hydrophile
und negativ geladene Raumstruktur der PSA. Durch diese Struktur wird eine sterische
Inhibition bewirkt, die andere Zelloberflächenmoleküle an der Interaktion hindert, ohne dabei
selbst mit anderen Molekülen zu reagieren (Rutishauser et al., 1988).
Abb. 1.7: Die Modifikation des
NCAM mit PSA führt zu einer
funktionellen
Umkehr
der
Adhäsion und einem vergrößerten
Zell-Zellabstand.
(Rutishauser et al., 1988)
Die zweite Theorie geht von einer direkten Interaktion anderer Zelloberflächenmoleküle mit
PSA aus. Durch eigene Bindungspartner von PSA-NCAM kann
die Zelle für weitere
Faktoren sensibilisiert werden und im Nervenzellverbund auf äußere Reize reagieren (Kiss et
al., 2001). Die anti-adhäsive Wirkung der PSA ist unabhängig von der Korrespondenz zu
NCAM. Auch in Wechselwirkung mit anderen Adhäsionsmolekülen, wie Integrinen und
Cadherinen, zeigt PSA einen inhibierenden Einfluß auf Zell-Zellkontakte (Fujimoto et al.,
2001; Rutishauser et al., 1988).
Für die Synthese der PSA an NCAM im Golgi Apparat der Zelle sind zwei verschiedene
Polysialyltransferasen verantwortlich. ST8SiaII wird erstmalig aus dem Gehirn einer
neugeborenen Ratte kloniert (Livingston & Paulson, 1993) und später in der Maus
22
1-
Einleitung
beschrieben (Kojima et al., 1996). ST8SiaIV wird im gleichen Zeitraum im Hamster und in
der Maus charakterisiert (Eckhardt et al., 1995; Yoshida et al., 1995). Die Basen- und
Aminosäuresequenzen der beiden Enzyme für die Maus sind zu finden bei Yoshida et al.
(1996) für ST8SiaII und bei Eckhardt et al. (1995) für ST8SiaIV. Die Glykosylierung des
NCAM erfolgt an Asparaginreste in der fünften Immunglobulindomäne; die Modifikation
durch die Polysialyltransferasen ist eine sogenannte „N-linked glycosylation“. Sowohl
ST8SiaII als auch ST8SiaIV sind ausgehend von einer Zuckergrundstruktur (core region)
eigenständig in der Lage, das PSA-Homopolymer zu synthetisieren (Mühlenhoff et al., 1996;
Kojima et al., 1996). Beide Enzyme können an den gleichen Glykosylierungsstellen arbeiten
und synthetisieren ein PSA-Polymer mit ca. 50-60 Sialinsäureresten (Angata et al., 1998).
PSA-NCAM wird aus dem Golgi Apparat durch regulierte Exozytose an die Zelloberfläche
transportiert (Kiss et al., 1994; Kojima et al., 1997).
Neu5Ac
Gal
GlcNAc
Man
α-2,8
α -2,3
Asn NCAM
Abb. 1.8: N-Glykosylierung von NCAM.
An einen Asparaginrest des NCAM wird ein
Grundgerüst aus Kohlenhydraten aufgebaut.
Ausgehend von dieser Struktur synthetisieren
die Polysialyl-transferasen ST8SiaII und
ST8SiaIV die PSA. (Mühlenhoff et al., 1996)
Neu5Ac: 5-N-Acetylneuraminsäure
Gal: Galaktose
GlcNAc: N-Acetylglucosamin
Man: Mannose
Die Expression der Enzyme wird unabhängig voneinander auf transkriptionaler Ebene
reguliert (Hildebrandt et al., 1998; Seidenfaden et al., 2000). Das einzige Substrat für die
beiden Enzyme ist NCAM und das jeweilige Enzym selbst (Mühlenhoff et al. 1996a und
1996b). Die funktionelle Rolle der Autopolysialylierung von ST8SiaII und ST8SiaIV ist noch
unklar, vermutlich sind die Autopolysialylierung und die Glykosylierung von NCAM
funktionell verknüpft (Mühlenhoff et al., 2001). Deutliche Unterschiede in den katalytischen
23
1-
Einleitung
Eigenschaften der beiden Polysialyltransferasen sind bisher nicht beschrieben, gezeigt wird
ein synergistischer Effekt der Zusammenarbeit beider Enzyme und eine Präferenz für
verschiedene NCAM-Isoformen (Kitazume-Kawaguchi et al., 2001)
1.3.3-
Einfluß von PSA-NCAM auf isolierte Nervenzellsysteme
NCAM beeinflußt das Wachstum und Verhalten von Nervenzellen. Eine der ersten in-vitro
Studien zu dieser Fragestellung beschreibt das Wachstum von Neuriten auf einem
Fibroblasten-Monolayer. In diesem Experiment wachsen die Ausläufer der Nervenzellen nur,
wenn der Fibroblasten-Untergrund NCAM an der Zelloberfläche exprimiert (Doherty et al.,
1989). Die besondere Rolle des NCAM für das Neuritenwachstum wird in weiteren Arbeiten
bestätigt und zusätzlich in einen Zusammenhang mit der posttranslationalen Polysialylierung
gebracht (Doherty et al., 1990). Das Wachstum der Neuriten scheint von NCAM über die
Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden vermittelt zu werden (Kolkova et al., 2000). Für
die Ausbildung funktioneller Netzwerke von Nervenzellen ist ein gerichtetes Wachstum und
die Vernetzung von Neuriten notwendig. Neuriten des Rückenmarks wachsen ohne PSA
geradlinig und unverzweigt; wird PSA-NCAM exprimiert, verzweigen sich die Neuriten und
bilden Netzwerke (Acheson et al., 1991; Rutishauser et al., 1988).
An der motorischen Endplatte wird durch die Expression von PSA die Vernetzung und
Formung der Nervenenden reguliert. Diese Regulation ist unabhängig vom NCAM-Gehalt,
PSA agiert allein als regulatives Element (Landmesser et al., 1990). Das zielgerichtete
Wachstum von Axonen steht ebenfalls unter der Kontrolle des PSA-Gehaltes. Wird in einem
System von Motoneuronen des Plexus brachialis die PSA durch eine Behandlung mit
Endoneuraminidase (EndoN) entfernt, so orientieren sich die Axone falsch, und es entstehen
Projektionsfehler (Tang et al., 1992).
Die Markscheidenbildung scheint ebenfalls unabhängig von NCAM durch den PSA-Gehalt
beeinflußt zu werden. Mit beginnender Myelinisierung peripherer Nerven sinkt die PSAExpression, und durch die EndoN-Behandlung kann die Myelinisierung gestartet und
gesteigert werden (Charles et al., 2000). NCAM wird nicht nur in neuronalen Zellen, sondern
auch in Muskelzellen exprimiert. In der Muskulatur ist PSA-NCAM beteiligt an
Regenerationvorgängen. Nach der Abtrennung des Muskels vom innervierenden Nerven in-
24
1-
Einleitung
vitro steigt die PSA-NCAM-Expression im Muskel stark an (Daniloff et al., 1986). In
Hippocampuszellen regenerieren die Neuronen nach einer Verletzung wesentlich schneller,
wenn sie hohe Gehalte an PSA exprimieren; nach EndoN Behandlung ist die Regeneration
gehemmt (Muller et al., 1994).
Der PSA-Gehalt des NCAM scheint nicht nur die Fähigkeit der Nervenzelle zur Teilung und
Regeneration zu erhalten, sondern auch die Plastizität von synaptischen Verbindungen zu
beeinflussen. Die Synapsen beantworten die neuronale Aktivität von Nervenzellnetzwerken
mit strukturellem Umbau. Durch die Anpassung ihrer Form wird die synaptische Übertragung
moduliert. Dieses Prinzip ist die physiologische Grundlage von Gedächtnisleistungen,
Erinnerungsvermögen und Lernvorgängen. Durch die hochfrequente Stimulierung von
Hippocampusfasern in-vitro und in-vivo (s.u.) wird die synaptische Plastizität modellhaft
simuliert. Dieses Modell wird als long term potentiation (LTP) bezeichnet. In diesem System
wird PSA-NCAM in Reaktion auf die Depolarisation der Nervenzelle erhöht exprimiert und
ist ein notwendiger Faktor für die Plastizität der Synapse (Muller et al., 1996).
NCAM beeinflußt in Gliomzellen die Motilität und Zellwanderung
der gesamten
Nervenzelle. Durch Langzeitvideoaufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Beweglichkeit
von Tumorzellen in der Kulturschale von der NCAM-Expression abhängt (Prag et al., 2002).
In neuronalen Stammzellen reduziert die Zugabe von löslichem NCAM die Zellproliferation
und induziert die Differenzierung zu einem reiferen Phänotyp (Amoureux et al., 2000). Die
Regulation der Adhäsion zwischen Zellen ist eine Grundvoraussetzung zur Bildung von
Geweben und Organen. NCAM beeinflußt die Bildung von Nervenzellverbänden nicht nur
durch die Vermitttlung von Zelladhäsion, sondern auch durch eine Beeinflussung des
Cytoskeletts der Zellen (Jaffe et al., 1990).
1.3.4-
Funktionen von PSA-NCAM im adulten Organismus
Während NCAM auf Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Schwann´schen Zellen und
Muskelzellen im adulten Organismus exprimiert wird, ist die Synthese von PSA im
erwachsenen Säugetier auf wenige Regionen beschränkt. Diese Regionen zeichnen sich durch
lebenslange Plastizität aus, d.h. die Neuronen sind potentiell in der Lage, sich zu regenerieren.
Diese Regionen sind Bereiche der Hippocampusformation (Seki & Rutishauser, 1998; Becker
25
1-
et
Einleitung
al., 1996), neurosekretorische Neuronen
des
Hypothalamus-Hypophysensystems
(Theodosis et al., 1991) und Neuroblasten des Bulbus olfaktorius (Eckhardt et al., 2000).
Die knockout-Technologie ermöglicht das gezielte systemische Abschalten oder Entfernen
eines Gens. Die genaue Beurteilung des Phänotyps erlaubt Rückschlüsse auf die Funktion des
Gens im Gesamtorganismus auch ohne genaue Kenntnisse von Regulation und
Signalkaskaden. Zur Erforschung der Funktionen von PSA-NCAM sind durch gene-targeting
verschiedene knockout-Modelle erstellt worden. Zur Konstruktion der NCAM-knockoutMaus (B6.129P2-Ncam1tm1Cgn/J ) wurden zwei Exons und das flankierte Intron entfernt. Die
homozygoten (NCAM(-/-)) und heterozygoten (NCAM(+/-)) knockout-Tiere sind lebensfähig
und fertil. Adulte NCAM(-/-) Tiere zeigen zu 10% ein verringertes Gehirngewicht und zu
36% einen verkleinerten Bulbus olfaktorius. Der Morris water maze-Test dient zur Erprobung
von räumlichem und zeitlichem Lernvermögen, die NCAM(-/-)-Maus zeigt eine Schwäche im
räumlichem Lernverhalten (Cremer et al., 1994). Das Angst- und Vermeidungsverhalten bei
NCAM(-/-) ist stärker ausgeprägt (Stork et al., 1999), das Erkundungsverhalten ist schwächer
und die Aggressivität zwischen den männlichen Tieren stärker als bei Kontrolltieren aus dem
gleichen Wurf (Stork et al., 1997). Weiterhin scheint die Abwesenheit von PSA-NCAM die
zirkadiane Rhythmik zu stören (Shen et al., 2001). Die NCAM(-/-)-Mäuse zeigen
Projektionsfehler von corticospinalen Axonen und verkleinerte motorische Endplatten
(Moscoso et al., 1998; Rolf et al., 2002). Die synaptische Plastizität in Reaktion auf
elektrische Reize (LTP) ist ebenfalls gestört (Cremer et al., 1998).
Ein weiteres knockout-Modell wurde für die 180 kD Isoform des NCAM erstellt. Auch bei
diesen Tieren ist der Bulbus olfaktorius betroffen: die Granulazellen sind klein und
unorganisiert und die Vorläufer dieser Zellfraktion akkumulieren an ihrem Ursprungsort,
offensichtlich unfähig zur gerichteten Wanderung (Tomasiewicz et al., 1993). Die Axone im
Bulbus olfaktorius sind ungeordnet (Treloar et al., 1997). Die Moosfasern des Hippocampus
sind ungebündelt, unstrukturiert und aufgelockert. Die gleichen Effekte werden durch eine
gezielte EndoN-Injektion erreicht, um PSA zu entfernen. Der Defekt scheint also nicht durch
den Verlust des 180 kD NCAM, sondern durch den Verlust der PSA bedingt zu sein (Seki &
Rutishauser, 1998). In einer anderen Arbeit wird durch gezielte Mutation die
membrangebundene Form des NCAM durch eine lösliche Form ersetzt. Die mutierten Tiere
sterben während der Embryonalentwicklung; eine genauere Untersuchung zeigt, dass an E 8,5
26
1-
Einleitung
das Neuralrohr geknickt ist, die Somiten unregelmäßig angeordnet sind und sich der craniale
Neuroporus an E 9,5 nicht schließt (Rabinowitz et al., 1996).
Grundlage für die eigene Arbeit ist die ST8SiaIV-knockout-Maus (B6.129P2-Siat8dtm1Zch).
Dieses Mausmodell besitzt durch gene targeting eine lacZ/Neomycinresistenz-Kassette an
Stelle des ersten Exons und teilweise des ersten Introns. Die ersetzten Anteile haben eine
Größe von ca. 2 kb und codieren den zytosolischen und transmembranen Anteil des ST8SiaIV
Gens. Der genetische Hintergrund ist noch nicht determiniert und besteht aus der
Stammzelllinie 129/Ola und C57BL/6J. Die ST8SiaIV-Expression ist in allen Körperregionen
ausgeschaltet und in heterozygoten Tieren um 50% reduziert. ST8SiaII und NCAM zeigen
keine veränderten Expressionsmuster. Die Tiere sind lebensfähig, fertil und zeigen
makroskopisch anatomisch keine Auffälligkeiten. Die PSA-Spiegel der untersuchten inneren
Organen sind nicht beeinflusst, deutliche Unterschiede zeigen sich jedoch in der PSAExpression im Gehirn erwachsener Tiere. Ab der 4. Woche sinkt der PSA-Gehalt im Gehirn
der knockout-Tiere deutlich schneller als im Kontrolltier. Im Alter von 6 Monaten ist die PSA
in Teilen des Moosfasertrakts des Hippocampus drastisch reduziert, während die
Neuroblasten
des
Bulbus
olfaktorius
unveränderte
PSA-Expression
zeigen.
Das
Gehirngewicht und die Anatomie des Gehirns sind unauffällig. Entsprechend des PSA
Verlusts zeigen die Tiere ab der 6. Woche eine abgeschwächte LTP in der CA1-Region des
Hippocampus (Eckhardt et al., 2000). Diese Ergebnisse stehen in gutem Einklang mit
früheren Befunden, wonach ST8SiaII die dominierende Polysialytransferase bis zur Geburt
ist, danach jedoch bis zur Nachweisgrenze abnimmt, und ST8SiaIV im Gehirn des
erwachsenen Organismus erhalten bleibt (Hildebrandt et al., 1998).
Der Einfluß von PSA-NCAM auf das Lernverhalten wird insbesondere in der Ratte erforscht.
Die Induktion der LTP in-vivo an der anaesthesierten Ratte hat eine erhöhte NCAMExpression zur Folge (Fazeli et al., 1994). In einem passiven Vermeidungstest lernen die
Ratten, die bevorzugten dunklen Teile der Versuchanlage zu finden und die erleuchteten
Bereiche zu meiden. Die Tiere sollten sich später noch an den Versuchsaufbau erinnern. In
diesem Test bewirkt eine Blockierung von NCAM durch Antikörper (Doyle et al., 1992b)
oder durch einen NCAM-Liganden (Foley et al., 2000), die intraventrikulär verabreicht
werden, ein verringertes Erinnerungsvermögen an den Versuchsaufbau. Die Injektion
markierter PSA-Bausteine zeigt eine vermehrte Polysialylierung von NCAM in bestimmten
27
1-
Einleitung
Gehirnregionen nach dem Training (Doyle et al., 1992a). Der Morris water maze-Test fordert
von den Ratten räumliches Orientieren und Lernen. Auch in diesem Testaufbau steigt der
PSA-NCAM Spiegel an (O´Connel et al., 1997) und eine intraventrikuläre Injektion von
EndoN schwächt das Lern- und Erinnerungsvermögen in diesem des Versuchsaufbau deutlich
(Becker et al., 1996).
Das hochteratogene VPA-Derivat rac-Pentyl-4-yn scheint das Lernverhalten ebenso
beeinflussen zu können. Durch Verabreichung von 16 bis 85 mg/kg vor dem Morris water
maze-Test kann die Lernleistung verbessert und eine Scopolamin-induzierte Amnesie
abgeschwächt werden. Die Langzeitapplikation von rac-Pentyl-4-yn führt zu einer Zunahme
von polysialylierten Neuronen in bestimmten Cortexregionen (Murphy et al., 2001). Die
Applikation von 200 mg VPA/kg KGW 40 Minuten vor der Tötung führt zu keiner
vermehrten NCAM-Expression in verschiedenen Hirnregionen (Ushakova et al., 1995).
PSA-NCAM hat einen Einfluß auf das Metastasierungsverhalten verschiedener Tumoren und
wird zum Teil als klinischer Marker für die Prognose von Krebserkrankungen genutzt.
Nachgewiesen ist dieser Zusammenhang für das periphere T-Zelllymphom (Kern et al.,
1992), das Neuroblastom (Glüer et al., 1998), das Rhabdomyosarcom im Kindesalter (Glüer
et al., 1998), den Beta-Zelltumor des Pankreas (Perl et al., 1999) und das kleinzellige
Lungenkarzinom (Tanaka et al., 2001). NCAM scheint in der Pathogenese der Schizophrenie
beteiligt zu sein; eine lösliche NCAM Isoform wird vermehrt in der cerebrospinalen
Flüssigkeit von Patienten nachgewiesen (Poltorak et al., 1996). In-vitro ist NCAM ein
Rezeptor für das Lyssavirus; die NCAM-knockout-Maus zeigt nach einer Tollwutinfektion
eine verringerte Virusinvasion in das Gehirn und eine verminderte Mortalität (Thoulouze et
al., 1998).
1.3.5
PSA-NCAM während der Embryonalentwicklung
Die Expression von PSA-NCAM ist im adulten Säugetier auf wenige Hirnregionen
beschränkt (siehe Abschnitt 1.3.4), im Embryo hingegen liegt NCAM zumeist polysialyliert
vor und zeigt daher andere adhäsive Eigenschaften als adultes NCAM (Sadoul et al., 1983;
Rougon et al., 1986). Die Polysialyltransferasen ST8SiaII und -IV sind während der
Fetalphase stark im Nervensystem exprimiert, kurz nach der Geburt nimmt die Expression
28
1-
Einleitung
deutlich ab. Während ST8SiaII im adulten Organismus nur noch sehr schwach vorhanden ist,
bleibt ST8SiaIV in den Gehirnregionen mit lebenslanger PSA-Synthese vorhanden (Philips et
al., 1997; Hildebrandt et al., 1998). Einen Überblick der Literatur zur Expression von NCAM,
PSA und ST8SiaII und -IV während der Embryonalentwicklung der Maus geben die Tab. 1.2
bis 1.4. Zusammengefasst beginnt die Expression von NCAM an E 7.5 bis E 8.0 im
Neuroektoderm und Mesoderm. Die größte Intensität findet sich stets in Geweben des
Ektoderm,
wie
dem
Neuralrohr
und
der
Gehirnanlage.
Um
den
9.
Tag
der
Embryonalentwicklung wird NCAM auch in den Somiten, in verschiedenen mesenchymalen
Geweben und im Herz nachgewiesen, in der weiteren Entwicklung der Ratte auch in
endodermalen Geweben des Magen-Darm-Traktes und der Lunge (Lackie et al., 1994). Die
PSA-Synthese folgt weitgehend der Verteilung des NCAM. Der früheste PSA-Nachweis
gelingt an E 8,5; die Synthese wird am intensivsten in ektodermalen Geweben beschrieben.
Ab dem Tag 9,0 der Embryonalentwicklung der Maus wird PSA in Somiten, im Herz und
mesodermalen Geweben exprimiert. Gegen Ende der Embryonalphase wird PSA auch in der
Nasenhöhle, der Urniere und Zellen der Zunge, des Darmes und des Pancreas nachgewiesen.
Die Expression der Polysialyltransferasen beginnt an E 8.0 und folgt im weiteren den Orten
der PSA-Synthese. Für die Enzyme kann keine differenzierte Expression während der
Embryonalentwicklung festgestellt werden (Ong et al., 1998). Generell wird die PSA nicht
ohne Enzymexpression nachgewiesen, aber die Enzyme durchaus ohne PSA (Philips et al.,
1997).
Neben den Hinweisen aus dem Expressionsmuster von PSA-NCAM während der
Embryonalentwicklung zeigen verschiedene funktionelle Studien die Bedeutung des
Glykoproteins für die Entwicklung des Neuralrohrs. Die Spontanmutation Splotch-C57Be
(splotch) auf dem Chromosom 1 der Maus führt bei homozygoten Tieren zur Embryolethalität
an E 13-14 mit lumbosacraler Rachischisis ab Tag 9,5 der Embryonalentwicklung,
Exenzephalie des Myelencephalon und anderen Hirnschäden, fehlenden oder veränderten
Spinalganglien und Schwanzfehlbildungen. Die Mutation in heterozygoter Form führt bei
verringerter Ausprägung der beschriebenen Fehlbildungen
zu Pigmentstörungen bei
erwachsenen Tieren. Die weißen Flecken an Bauch, Pfoten und Schwanz geben der Mutation
ihren Namen (Auerbach, 1954; Russell, 1947). Die Störungen der Pigmentierung, der
Spinalganlien und weitere Abweichungen werden auf eine gestörte Wanderung der
29
1-
Einleitung
Neuralleistenzellen zurückgeführt (Kapron-Brás & Trasler, 1988; Moase & Trasler, 1990).
Die NCAM-Expression zeigt zum Zeitpunkt der Defektbildung an E 9,0 keine örtlichen oder
zeitlichen Abweichungen zum gesunden Tier. Das NCAM-Profil weist jedoch eine abnorme,
200 kDa schwere Isoform zusätzlich zu den physiologischen 140 und 180 kDa Isoformen auf
(Moase & Trasler, 1991). Diese veränderte Masse wird auf die abnorme Polysialylierung des
NCAM zurückgeführt (Neale & Trasler, 1994). Die Genexpression des NCAM ist
unverändert, wohingegen N-Cad und Pax-3 deutlich verringert sind (Bennett et al., 1998).
In einem Hühnchenmodell führt die Blockierung von NCAM mit polyklonalen Antikörpern
zu einer abnormen Entwicklung des Neuralrohres in 55% der Fälle. Die gestörte Neurulation
entwickelt sich in 5% aller Embryonen zu einem Neuralrohrdefekt. 15% der
Hühnerembryonen entwickeln Neuralrohrdefekte durch die gleichzeitige Blockade von
NCAM und N-Cad (Bronner-Fraser et al., 1992). Durch eine induzierte starke Überexpression
von NCAM kann im Krallenfrosch (Xenopus laevis) keine Veränderung der Neurulation
induziert werden. Der Autor folgert, dass NCAM nicht als regulatives Element für den
Neuralrohrschluß dient (Kintner, 1988). Die Untersuchung einer großen Anzahl von
Wachtelembryonen (Coturnix coturnix japonica) zeigt, dass Embryonen mit spontanen
Neuralrohrdefekten eine abnorm starke und abweichend verteilte Expression von NCAM und
N-Cad haben (Newgreen et al., 1997).
Tabelle 1.2: Expression von NCAM während der Embryonalentwicklung der Maus
Tag(a)
Gewebe/ Struktur(b
Nachweismethode
Zitat
< 7.0
kein NCAM Nachweis
Immunfärbung
1
7.0
Embryo negativ
Immunfärbung
2
7.5
Embryo negativ
Immunhistologie
3
Ektoderm, Mesoderm
rt-PCR
4
Embryo negativ
RNA in Situ Hybridisierung 5
Gehirnanlage, craniales und caudales
Neuralrohr
Immunhistologie
6
8.0- 8.5 Neuroectoderm, Myocard, Somiten
Kopfmesenchym
Immunhistologie
3
8.5
Immunhistologie
5
quantitative PCR
5
8.0
Gehirnvorläufer, Rumpfmesenchym,
Somiten, Neuralplatte, Neuralrohr
gesamter Embryo
30
1-
Einleitung
Neuralplatte, Neuralrohr, Rumpfmesenchym, RNA in Situ Hybridisierung 5
Somiten
9.0-9.5
Zellen aller Gehirnregionen, Neuralrohr,
Somiten, Herz, Rumpfmesoderm
Immunhistologie
3
9.0
Gehirnvorläufer, Rumpfmesenchym,
Somiten, Neuralplatte und Neuralrohr
Immunhistologie
5
Neuroepithel des cranialen und caudalen
Neuralrohrs und umgebendes Mesoderm
Immunhistologie
6
Herz, Milz, Rumpfmesenchym und Somiten, RNA in Situ Hybridisierung 5
Rückenmarksvorläufer
Rückenmarksvorläufer, Mittelhirn, Vorläufer RNA in Situ Hybridisierung 5
des Trigeminalganglions
11.0
Transkripte für 140 kD und 180 kD NCAM
Isoformen nachgewiesen
Northern Blot
3
11.5
Neuronen über die gesamte Länge des
Neuralrohres verteilt, olfaktorisches Epithel
des Kopfes, Gehirnanlage
RNA in Situ Hybridisierung 5
12.5
Gehirnanlage, Neuronen des Neuralrohres
RNA in Situ Hybridisierung 5
Tabelle 1.3: Expression von ST8SiaII und -IV während der Embryonalentwicklung der Maus
(a)
(c)
Gewebe/ Struktur
Nachweismethode
Embryo negativ
Northern Blot
7
Neuralrohr
RNA in Situ Hybridisierung
8
9.0
Neualrohr
RNA in Situ Hybridisierung
8
10.0
Embryo negativ
Northern Blot
7
Gehirnanlage, Rückenmarksanlage,
Nasenhöhle, Herz und Leber
RNA in Situ Hybridisierung
8
11.0
Gehirnanlage, Rückenmarksanlage, Nasenhöhle, Herz,Leber, Lunge, Mesonephros
RNA in Situ Hybridisierung
8
12.0
Gehirnanlage, Rückenmarksanlage,
Nasenhöhle, Herz,Leber, Lunge, Meta-und
Mesonephros positiv, Zellen der Zunge, des
RNA in Situ Hybridisierung
8
Tag
8.0
Darmes, des Pancreas
31
Zitat
1-
Einleitung
Tabelle 1.4: Nachweise von PSA während der Embryonalentwicklung der Maus
(a)
(b)
Gewebe/ Struktur
Nachweismethode Zitat
7.5
Gesamter Embryo negativ
Immunhistologie
3
8.0
kein PSA-Nachweis
Western Blot
3
kein PSA-Nachweis
Immunhistologie
8
PSA-Nachweis aus gesamtem Embryo
Western Blot
3
8.0- 8.5 Neuroektoderm, Somiten, Kopfmesenchym
Immunhistologie
3
9.0
Neuralrohr
Immunhistologie
8
gesamter Embryo
Western Blot
3
9.0- 9.5 gesamte Gehirnanlage, Neuralrohr, Somiten, Herz,
Mesoderm des Rumpfes
Immunhistologie
3
10.0
gesamter Embryo
Western Blot
3
Mittelhirn, Nachhirn, Rückenmarksvorläufer
Immunhistologie
8
gesamter Embryo
Western Blot
3
Mittelhirn, Nachhirn, Rückenmarksvorläufer,Nasenhöhle, Herz, Mesonephros
Immunhistologie
8
Mittelhirn, Nachhirn, Rückenmarksvorläufer;
Nasenhöhle, Herz, Mesonephros, Zellen der Zunge,
Leber, Darmwand, Pancreas
Immunhistologie
8
Tag
8.5
11.0
12.0
a: Tag der Embryonalentwicklung, wobei die Methoden der exakten Verpaarung und
Altersbestimmung zwischen den Autoren variieren
b: In den bezeichneten Geweben ist NCAM bzw. PSA nachgewiesen worden.
c: ST8SiaII und IV wurden gleichzeitig in den bezeichneten Geweben nachgewiesen
1: (Plu et al., 2002)
2: (Kimber et al., 1994)
3: (Probstmeier et al., 1994)
4: (Wells & Melton, 2000)
5: (Bally-Cuif et al., 1993)
6: (Moase & Trasler, 1991)
32
7: (Kurosawa et al., 1997)
8: (Ong et al., 1998)
9: (Neale & Trasler, 1994)
2-
2-
Ziel der Arbeit
ZIEL DER ARBEIT
Die Valproinsäure ist seit über 20 Jahren als teratogene Substanz für den Menschen bekannt;
die Mechanismen der Fruchtschädigung sind jedoch trotz der weiten Anwendung dieses
Wirkstoffes noch immer weitgehend unbekannt. Die vorgestellte Arbeit hatte die Zielsetzung,
NCAM und die ektopische Polysialylierung des NCAM in der Entstehung von Valproinsäureinduzierten Neuralrohrdefekten zu untersuchen und einen möglichen funktionellen
Zusammenhang zwischen dem Glykoprotein und der Teratogenese aufzuzeigen.
Im Rahmen dieser Zielsetzung sollte ein Tiermodell gefunden werden, das den
Anforderungen der Fragestellung gerecht wird. Die Maus ist bis heute die einzige
Versuchstierspezies, die die Untersuchung von VPA-induzierten Neuralrohrdefekten
ermöglicht. Die knockout-Technologie ermöglicht das gezielte Abschalten der Expression
eines Gens in der Maus, so dass durch die Erforschung von Neuralrohrdefekten in NCAModer PSA-defizienten Mäusen ein Rückschluss auf die Funktion des Adhäsionsmoleküls in
der Teratogenese gezogen werden könnte. Durch eine detaillierte Untersuchung der
Embryonalentwicklung sollte die ST8SiaIV-knockout Maus als Tiermodell charakterisiert
werden. Diese Charakterisierung sollte die Expression von NCAM, PSA und der
Polysialyltransferasen und die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung beeinhalten. Der
Einfluß des genetischen Hintergrundes eines Mausstammes auf die teratogenen Effekte der
Valproinsäure erwies sich im weiteren Verlauf der Arbeit als interessanter Nebenaspekt.
Als Leitsubstanz der Arbeit sollte das hochteratogene VPA-Derivat S-Pentyl-4-Pentinsäure
eingesetzt werden. Die Substanz hatte bereits in-vivo und in-vitro Effekte auf NCAM gezeigt,
und war daher als VPA-Derivat zur Bearbeitung der Fragestellung sehr geeignet. In einer
parallel durchgeführten in-vitro Studie sollte unabhängig von den systemischen Effekten des
Gesamtorganismus ein möglicher Effekt von VPA und teratogenen VPA-Derivaten auf
embryonale Nervenzellen gezeigt werden.
33
3-
Material und Methoden
3-
MATERIAL UND METHODEN
3.1-
In-vivo Methodik
3.1.1-
Versuchstiere
3.1.1.1- Mäusestämme
Hsd:Win NMRI und C57BL/6J (Fa. Harlan-Winkelmann, Borchen) waren bei der Ankunft
pathogenfrei nach Empfehlung der Federation of European Laboratory Animal Science
Associations (FELASA). Die ST8Sia IV (+/+) und ST8Sia IV (-/-) Mäuse (Eckhardt et al., 2000)
stammten aus dem zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover, Institut für
zelluläre Chemie.
3.1.1.2- Haltung und Fütterung
Die Mäuse wurden in einem Tierhaltungsraum der Sicherheitsstufe 1 gemäß §8 Abs.2
Gentechnikgesetz
gehalten.
Die
Aufzeichnungen
über
gentechnische
Arbeiten
zu
Forschungszwecken erfolgten nach Maßgabe der Gentechnikaufzeichnungsverordnung, alle
gentechnisch veränderten Organismen wurden durch Ohrlochung (Lochzange für Labortiere,
Fa. Faust, Hamburg) individuell markiert. Die klimatischen Bedingungen des Tierraums
waren kontrolliert bei einer Raumtemperatur von 21-23°C und einer Luftfeuchte von 55-70
%. Die Aufzeichnung der Klimaparameter erfolgte durch einen Thermohydrographen
(Trommelschreiber, Fa. Lambrecht, Göttingen). Die Dunkelphase dauerte von 22°° Uhr bis
10°°Uhr. Die Mäuse wurden in Polycarbonatkäfigen der Größen II bis IV mit
Edelstahldeckeln gehalten und erhielten pelletiertes Fertigfutter der Marke Altromin
(Standarddiät „Haltung“ für Mäuse und Ratten), Einstreu der Marke Lignocell (staubfreie
Natur-und Weichholzfaser, BK8/15) sowie Leitungswasser ad libitum.
3.1.1.3- Zucht der ST8Sia IV (+/+) und ST8Sia IV (-/-) Mäuse
Die Vermehrung der Mäuse wurde im September 2001 mit 4 männlichen und 6 weiblichen
ST8Sia IV(+/+) und 5 männlichen und 4 weiblichen ST8Sia IV(-/-) Tieren begonnen. Die Tiere
waren Wurfgeschwister aus Verpaarungen heterozygoter Tiere. Die ST8Sia IV(+/+) und
34
3-
Material und Methoden
ST8Sia IV(-/-) Tiere wurden streng separiert und zu keinem Zeitpunkt vermischt. Die Auswahl
der Zuchtpaare erfolgte zufällig. Jede Verpaarung und jeder Wurf wurde in einem Zuchtbuch
protokolliert.
3.1.1.4- Genotypisierung
Zur regelmäßigen Kontrolle des Genotyps wurden Genotypisierungen mittels PCR
durchgeführt. Aus dem Gesamtbestand der ST8Sia IV
+/+
und ST8Sia IV
-/-
Tiere wurden 15
bis 20 Tiere älter als 2 Wochen ausgewählt (siehe Randomisierung). Den Tieren wurde mit
einer Schere 2 mm vom knorpeligen Schwanzende abgeschnitten und das Gewebe in ein
Probengefäß
(Eppendorf-Probengefäß,
Fa.
Eppendorf-Netheler-Hinz)
gegeben.
Zur
Auflösung des Gewebes wurde 750 µl Lysispuffer hinzugegeben und die Probe über Nacht
bei 55°C inkubiert.
Am nächsten Morgen wurde die Probe gut gemischt, mit 750 µl 6M NaCl versetzt, gemischt
und bei 13.000 rpm 10 Minuten zentrifugiert. In ein neues Probengefäß wurde 500 µl
Isopropanol vorgelegt und 750 µl Probenflüssigkeit aus der mittleren Phase dazugegeben,
gemischt und zentrifugiert (13.000 rpm, 10 Minuten). Der Überstand wurde abpipettiert, so
dass das Pellet am Boden des Probengefäßes erhalten blieb. Zu dem Pellet wurden 250 µl
70% Ethanol gegeben, gemischt und zentrifugiert (13.000 rpm, 10 Minuten). Der Alkohol
wurde abpipettiert und 200 µl gereinigtes, entionisiertes Wasser dazugegeben (Ampuwa®).
Der Ansatz wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert und zwischendurch mehrmals gemischt.
Für jede Probe und jede Kontrolle wurde 50 µl Mastermix auf Eis angesetzt. Von jeder Probe
wurde 1 µl mit 49 µl Mastermix in Softstripe-Probengefäßen versetzt. Für jeden Probenansatz
wurde als Negativkontrolle nur der Mastermix verwandt und als Positivkontrollen Gewebe
einer ST8SiaIV+/+ und ST8SiaIV-/- Maus. Die Proben wurden in einem PCR Gerät der Marke
Thermocycler® (Fa. Biometra, Göttingen) mit folgendem Programm behandelt: 95°C, 5
Minuten, {95°C, 20 Sekunden, 56°C, 30 Sekunden, 72°C, 1 Minute}x30, 72°C für 7 Stunden,
anschließend auf 4°C gehalten. In ein 1% Agarosegel wurden pro Tasche 5 µl Loading Puffer
und 20 µl Probe bzw. Kontrolle gegeben. Als Grössenstandard diente 5 µl einer 1 kB DNA
Leiter. Das beladene Gel wurde in TBE-Puffer an 130 V für ca. 1 Stunde angeschlossen. Nach
Färbung mit Ethidiumbromid wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert und als Datei
gespeichert.
35
3-
Material und Methoden
Lysispuffer:
50 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 µl Proteinase K
(20 mg/ml)
PCR-Ansatz:
5
µl
1
5
0,2
38,8
µl
µl
µl
µl
10x Reaktionspuffer: 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM
KCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2, 0,01% Gelatine
10 µM Primer
2 mM Desoxyribonukleotide (dNTP)
Taq Polymerase
Ampuwa® Wasser
Ladungspuffer: 50% Glycerol, 50% TBE-Puffer, Orange G® zugeben, bis die Lösung satt
orange ist
TBE-Puffer:
100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA
Primersequenzen:
PSTkoLW-13 (forward): 5´-CTC AGT TCT GGC TAT TTC TTT TGT-3´
PSTkoLW-14 (reverse): 5´-GAC CTC ACA ACG ACT CTC CGA GC-3´
PSTkoLW-18 (lacZ-Gen): 5´-ACC GCG AGG CGG TTT TCT CCG GC-3´
3.1.1.5- Tierversuchsgenehmigungen
Es wurden genehmigungspflichtige Tierversuche nach §§7 und 8 des Tierschutzgesetzes
durchgeführt. Die Versuche waren durch folgende Anträge von der Bezirksregierung
Hannover genehmigt:
ƒ
„Mechanismen
embryonaler
Neuralrohrfehlentwicklungen
unter
Einfluß
von
Valproinsäure und die Entwicklung neuer Antiepileptika“, Aktenzeichen 00/269,
Hannover 2000
ƒ
„Valproinsäure-verursachte Effekte: Teratologie, molekulare Mechanismen und das
Verhalten der verschiedenen Derivate im Stoffwechsel der Maus“, Aktenzeichen 02/612,
Hannover 2002
3.1.1.6- Randomisierung
Für die Untersuchungen der Neurotoxizität, der Kinetik, der Zyklusbestimmung und der
Genotypisierung wurden die Mäuse zufällig aus dem gesamten Bestand der zur Verfügung
stehenden Tiere ausgewählt. Die individuell markierten ST8Sia IV
36
(+/+)
und ST8Sia IV
(-/-)
3-
Material und Methoden
Mäuse wurden durch zufällige Auswahl der Käfigkarten mit der Tiernummer gewählt. Die
nicht markierten Hsd:Win NMRI Tiere wurden in einer Gruppe in einen hohen,
undurchsichtigen Plastikeimer mit kleiner Bodenfläche gesetzt und ohne Sichtkontrolle
herausgegriffen.
3.1.2-
Testsubstanzen
S-Pentyl-4-Pentinsäure, R-Pentyl-4-Pentinsäure (168,23 g/Mol) und rac-2-Isobutyl-4Pentinsäure (154,21 g/Mol) wurden im Rahmen Ihrer Dissertation von Frau Dr. Ute
Gravemann synthetisiert (Nau & Regan, 1997). Die Valproinsäure (144,2 g/mol) wurde bei
der Firma Sigma-Aldrich gekauft.
Die Testsubstanz wurde in einem Schnappdeckelgläschen (Fa. Fisher Scientific, Nidderau)
auf einer Analysenwaage (MC 210 P, Fa. Sartorius, Göttingen) eingewogen und eine
äquimolare Menge 1 N NaOH hinzugefügt. Der Ansatz wurde mit Aqua tridest auf das
berechnete Endvolumen von 10 ml/kg Körpergewicht aufgefüllt und der pH Wert mit 1 N
NaOH auf ca. pH 7,5 mittels pH Papier eingestellt. Die Substanz wurde 2 Minuten in einem
Ultraschallbad (Bandelin Sonorex RK 100, Fa. Bandelin electronic, Berlin) in Lösung
gebracht und dann mit einem Magnetrührer 1 Stunde gerührt. Die Aufbewahrung erfolgte bei
+2-4°C.
3.1.3-
Reproduktionstoxizität
3.1.3.1- Verpaarung und Bestimmung der Trächtigkeit
1-3 weibliche Mäuse wurden von 7°° bis 10°° Uhr mit einer männlichen Maus verpaart.
Tiere mit Vaginalpfropf galten als befruchtet und wurden separiert. Der Zeitpunkt 0 und der
Tag 0 der Trächtigkeit (E 0) wurde als 8°° Uhr am Tag der Verpaarung definiert.
37
3-
Material und Methoden
3.1.3.2- Zyklusbestimmung (van Zutphen et al., 1995).
Bei den ST8Sia IV +/+ und ST8Sia IV -/- Mäusen wurde eine Zyklusbestimmung durchgeführt.
Gruppen von jeweils 10 weiblichen Tieren (siehe Randomisierung) wurden separiert. Von
jedem Tier wurde an 8 aufeinander folgenden Tagen um 10°° und um 18°° Uhr ein Abstrich
vom Scheidendach mit einer Impföse genommen. Während des Untersuchungszeitraumes
wurden die Tiere dreimal im Abstand von 2 bzw. 3 Tagen verpaart (siehe Verpaarung und
Bestimmung der Trächtigkeit). Der Scheidenabstrich wurde an diesen Tagen vor der
Verpaarung entnommen. Das Material wurde in einem Wassertropfen auf einem Objekträger
verrieben und trocknen gelassen. Nach jedem Tier wurde die Impföse trocken gereinigt und
mit 70% Ethanol desinfiziert. Die Abstriche wurden in gesättigter May-Grünwald Lösung 8
Minuten gefärbt und dann in Aqua tridest 10 Minuten gespült. Die Beurteilung der Ausstriche
erfolgte mikroskopisch. Jeder Abstrich wurde anhand der Zellform und -größe, Zellzahl,
Farbe der Zellen und der Kerngröße als Östrus oder nicht-Östrus eingeteilt.
3.1.3.3- Zyklussynchronisation (Whittingham, 1971)
Bei
den
ST8Sia
IV+/+
und
IV-/-
ST8Sia
Mäusen
wurde
im
Rahmen
der
reproduktionstoxikologischen Untersuchungen eine Zyklussynchronisation durchgeführt.
Jedes weibliche Tier erhielt 2 Tage vor der Verpaarung am Ende der Dunkelphase 7 I.E.
PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) in einem Volumen von 0,2 ml 0,9% NaCl
subcutan injiziert. Direkt vor der Verpaarung erhielt jedes Tier 5 I.E. HCG (human chorion
gonadotropin) in einem Volumen von 0,2 ml 0,9% NaCl subcutan injiziert.
3.1.3.4- Exenzephaliemodell (Nau et al., 1981)
Am Tag 8,25 der Trächtigkeit (14°° Uhr) wurde die Testsubstanz in einem Volumen von 10
ml/kg Körpergewicht subkutan injiziert (Einmalspritzen 1 ml mit 0,1 ml Graduierung, Fa.
Becton-Dickinson, Heidelberg, Injektionskanülen 26 G, 0,45 mm, Fa. B. Braun, Melsungen).
Die Injektionslösung wurde vor der Verabreichung unter Rühren auf Körpertemperatur
angewärmt.
Die Muttertiere wurden an Tag 18 der Trächtigkeit durch cervikale Dislokation getötet. Nach
Öffnen der Bauchhöhle durch einen Schnitt in der Medianen wurde der gravide Uterus
präpariert und aus der Bauchhöhle vorgelagert. Der Uterus wurde an der antimesenterialen
38
3-
Material und Methoden
Seite von der Hornspitze bis zur Basis aufgeschnitten und die Feten aus den Eihäuten
präpariert. Die Anzahl der lebenden und toten Feten und der embryonalen Resorptionen
wurde protokolliert. Nach Durchtrennung der Nabelschnüre wurden die Feten durch einen
Scherenschlag hinter dem Kopf getötet. Jeder Fetus wurde gewogen und auf externe
Fehlbildungen untersucht.
3.1.3.5- Spina bifida-Modell (Ehlers et al., 1992)
Die Injektion der Substanzen erfolgte an Tag 9,0 (8°°Uhr), 9,25 (14°°Uhr) und 9,5 (20°°Uhr)
der Trächtigkeit subkutan.
Die Sektion und Beurteilung wurde in der gleichen Weise wie beim Exenzephaliemodell
durchgeführt. Nach der Sektion wurden die Feten zuerst in 70% und dann in 96% Ethanol
jeweils mindestens eine Woche gelagert. Die Feten wurden eviszeriert und in frischem 96%
Ethanol für mindestens 1 Tag gelagert. Zur Färbung der Knochen wurde das Gewebe 2 Tage
in 1% KOH behandelt, die Knochen mit 0,5 % Alizarin Rot S Lösung in 1% KOH gefärbt
und dann das Gewebe entfärbt: 2 Tage 20% Glyzerin in 1% KOH , 1 Woche 25% Glyzerin in
1% KOH und gelagert in 50% Glyzerin in 1% KOH. Die Beschreibung der
Knochenfehlbildungen basiert auf Taylor (1986), die Färbetechnik wurde modifiziert nach
Kaufman (1999). Die Fotografie wurde mit einem Stereomikroskop (Stemi 2000, Fa. C. Zeiss,
Jena) mit einer Spiegelreflexkamera Nikon F-201 mit Kleinbildfilm 200 ASA (Fujicolor)
durchgeführt.
3.1.4-
Neurotoxizität
3.1.4.1- Rotarod Toxizitätstest (Dunham & Miya, 1957)
Eine elektrisch angetriebene Tretmühle ( Treadmill 7600, Fa. Ugo Basile, Comerio, Italien)
wurde mit einer gleichbleibenden Geschwindigkeit von 16 Umdrehungen/Minute benutzt.
Gruppen von 10 weiblichen Tieren wurden 1 Tag vor dem Test an die Versuchsbedingungen
gewöhnt, indem sie eine Gesamtzeit von 5 Minuten auf der drehenden Stange laufen mußten.
Zur Untersuchung wurden alle Tiere zunächst unbehandelt auf die rotierende Stange gesetzt
und nur Tiere, die sich mindestens 1 Minute auf der Stange gehalten haben, sind zum Test
39
3-
Material und Methoden
zugelassen worden. Alle Mäuse bekamen die Testsubstanz subcutan verabreicht und wurden
insgesamt 3 mal auf die rotierende Stange gesetzt. Der Test galt im Sinne der Fragestellung
als bestanden (= kein toxischer Effekt), wenn ein Tier in mindestens 2 von 3 Durchgängen für
mindestens eine Minute auf der Stange geblieben ist. Der Test galt als nicht bestanden (=
toxischer Effekt), wenn ein Tier in mindestens 2 von 3 Durchgängen nicht für 1 Minute auf
der drehenden Stange geblieben ist. Die Gesamtzahl der bestandenen und nicht-bestandenen
Tiere einer Gruppe wurde für jede Dosierung prozentual erfaßt.
3.1.5-
Somitenzählung
Gruppen von weiblichen Mäusen wurden gezielt verpaart (siehe Reproduktionstoxikologie:
Verpaarung und Bestimmung der Trächtigkeit). Zu den Zeitpunkten E 8,25, E 8,5 und E 9,0
der Trächtigkeit wurden 5-6 Muttertiere durch cervikale Dislokation getötet, der gravide
Uterus entfernt und in eine Petrischale mit 0,9% NaCl Lösung gelegt. Mit Hilfe eines
Stereomikroskopes wurde bei 1,6- bis 10-facher Vergrößerung die antimesenteriale Seite
jeder Implantationsstelle aufgeschnitten und durch Druck auf den Uterus der Embryo
vorgelagert. Aus der Gesamtzahl der präparierten Embryonen in der Petrischale wurden
zufällig Embryonen ausgewählt. Durch eine externe Kaltlichtquelle (Kl 1500 electronic, Fa.
Schott, Mainz) wurde eine Schattenbildung des embryonalen Gewebes erzeugt und die gut
sichtbaren Somiten jedes Embryos gezählt.
3.1.6-
Histologie und Histochemie
3.1.6.1- Probenahme und Fixierung
Die Entnahme der Embryonen erfolgte wie bei der Somitenzählung beschrieben. Die
Embryonen wurden in Bouin´scher Lösung in Eppendorf-Probegefäßen für 24 Stunden (E 8.5
bis E 10.0), 48 Stunden (E 11.0 bis E 13.0) oder 72 Stunden (älter als E 13.0) fixiert. Die
Präparate wurden danach 1 Tag in 70% Ethanol gelagert, die Ethanollösung wurde mehrfach
40
3-
Material und Methoden
gewechselt. Für die spätere Einbettung in Technovit® wurden die Präparate in 70% Ethanol +
0,25% Ammoniak 2 Tage gelagert.
Bouin´sche Lösung :
(Böck, 1989)
15 Teile
5 Teile
1 Teil
gesättigte Pikrinsäure
37% Formaldehyd
100% Essigsäure
3.1.6.2- Paraffineinbettung und Entparaffinierung (Böck, 1989)
ƒ
45 Minuten 90% Ethanol, 1x gewechselt
ƒ
45 Minuten 96% Ethanol, 1x gewechselt
ƒ
30 Minuten Isopropanol, 1x gewechselt
ƒ
1 Stunde Xylol, 2x gewechselt
ƒ
Einbettung in Paraplast Plus® bei 60°C in einem Thermomixer für EppendorfProbengefäße( Modell comfort, Fa. Eppendorg-Netheler-Hinz, Hamburg).
Am nächsten Tag wurden die Präparate in frisches Paraplast Plus® bei 60°C gelagert und in
einem Paraffintropfen ausgehärtet. Der erhärtete Tropfen wurde in Paraplast® eingebettet.
Die Präparate wurden mit einem Rotationsmikrotom (Modell 1512, Fa. Ernst Leitz, Wetzlar)
in einer Dicke von 4 µm geschnitten, auf Adhäsionsobjekträger (Histobond®, Fa. Paul
Marienfeld, Lauda-Königshofen) aufgezogen und über Nacht bei 60°C gelagert.
Zur Entparaffinierung wurden die Schnitte 2x für 15 Minuten in Xylol gebracht, 3 Minuten
Isopropanol, 3 Minuten 96% Ethanol, 3 Minuten 80% Ethanol bzw. 30 Minuten 80% Ethanol
mit Wasserstoffperoxid (196 ml 80% Ethanol + 4 ml 30% H2O2) bei DAB-Färbung, 3
Minuten
70%
Ethanol
und
gespült
in
Aqua
dest.
bzw.
in
PBS-Puffer
bei
immunhistochemischen Färbungen.
3.1.6.3- Technoviteinbettung (Gerrits & Smid, 1983)
ƒ
4 Stunden 90% Ethanol, 2x gewechselt
ƒ
4 Stunden 96% Ethanol, 4x gewechselt
Danach kamen die Präparate in Technovit-Vorbereitungslösung (100 ml Technovit 7100 + 1 g
Härter 1) für 24 Stunden bei 37°C. Die Feten wurden in Histobloc Formen ( Fa. Heraeus-
41
3-
Kulzer,
Wehrheim/Ts.)
Material und Methoden
ausgerichtet
und
mit
Technovit
(15
ml
Technovit
Vorbereitungslösung + 1 ml Härter 2) ausgegossen. Geschnitten wurden die Präparate mit
dem Gerät Autocut (Modell 1140, Fa. Reichert-Jung, Wien, Östereich)
mit einem
Hartmetallmesser in einer Dicke von 3 µm, auf Objekträger aufgezogen und auf einer
Heizplatte von ca. 90°C für mindestens 2 Stunden aufgebrannt.
3.1.6.4- Hämalaun-Eosin Färbung (Böck, 1989)
Die HE-Färbung wurde an Technovit- und an Paraffin-eingebetteten Objekten durchgeführt.
Technovitschnitte kamen für 1 Stunde in filtrierte Hämalaun-Färbelösung nach Delafield,
danach 1 bis 2 Sekunden in 70% Ethanol mit 0,1% HCl, 15 Minuten in fließendes
Leitungswasser und 5 Minuten in 1%iges Eosin in 96% Ethanol mit 2-3 Tropfen Eisessig. Die
Schnitte wurden durch eine aufsteigende Alkoholreihe behandelt (2x 70%, einmal 80% und
2x 96% Ethanol) und mit DePex eingedeckt. Die Paraffin-eingebetteten Objekte wurden nach
der Entparaffinierung 8 Minuten in Hämalaun-Färbelösung und in 1% Eosin in Aqua dest.
gefärbt und danach analog zu den Technovit-Schnitten behandelt. Nach der aufsteigenden
Alkoholreihe (70%, 80%, 96% Ethanol, Isopropanol, 2x Xylol) wurden die Paraffinschnitte in
Eukitt eingedeckt.
3.1.6.5- Versilberung nach Bodian, modifiziert nach Ziesmer (Ziesmer, 1951)
Die Versilberung wurde an Paraffin-eingebetteten Embryonen durchgeführt. Während des
gesamten Färbevorganges kamen die verwendeten Lösungen nicht in Kontakt mit
metallischen Gegenständen; alle verwendeten Gefäße wurden vor Gebrauch mit 96% Ethanol
ausgespült. Nach der Entparaffinierung wurden die Objekte mit 1% Protargol Lösung mit 5 g
metallischem Kupfer (handelsüblicher Kupferdraht ohne Isolierung) bei 37°C 18 Stunden
behandelt. Danach wurden die Präparate dreimal 5 Minuten in Aqua dest. gespült, mit
Entwicklerlösung (1 g Hydrochinon + 5 ml 37% Formaldehyd auf 100 ml Aqua dest.) bis zur
deutlichen Färbung behandelt, in Aqua dest. gespült, mit 1% Goldchlorid Lösung 1 Minute
versehen und wieder in Aqua dest. gespült. Anschließend wurden die Ojekte mit 2%
Oxalsäure 5 Minuten behandelt, gespült in Aqua dest., mit 5% Natriumthiosulfat 3 Minuten
behandelt und 10 Minuten mit fließendem Leitungswasser gespült. Nach einer aufsteigenden
Alkoholreihe wurde die Präparate eingedeckt, wie bei der HE-Färbung beschrieben. Die
42
3-
Material und Methoden
Färbungsintensität wurde gering gehalten, um mit Hilfe des Phasenkontrastverfahrens feine
Strukturen fotografisch darzustellen.
3.1.6.6- Immunhistochemie
Alle Objekträger mit Präparateschnitten wurden, nach Zeitpunkt der Probenahme sortiert,
fortlaufend
durchnummeriert.
Embryonalstadien
verschiedener
In
einem
Färbedurchgang
Mäusestämme
bzw.
wurden
behandelte
die
und
gleichen
unbehandelte
Embryonen des gleichen Stammes zusammen gefärbt. Nach Fertigstellung wurden die
Objekte mindestens zweimal mikroskopisch analysiert und dann fotografiert. Während der
mikroskopischen Untersuchung wurden die angefärbten embryonalen Körperteile identifiziert
(Kaufman, 1999), protokolliert und die Intensität der Färbung als schwach, mittel oder stark
beurteilt. Zum Zeitpunkt der Beurteilung waren die Präparate für den Untersucher verblindet.
Die
immunhistochemische
Färbungen
wurden
an
paraffineingebetteten
Präparaten
durchgeführt. Die Schnitte wurden nach der Entparaffinierung in PBS-Puffer gespült.
PBS-Puffer für die Histologie:
7,8 g
NaH2PO4
40 g
NaCl
auf 5 Liter Aqua dest, mit 1N NaOH auf pH 7,2 eingestellt,
Lagerung bei 2-4°C
Polysialinsäure-Färbung
Die entparaffinierten Schnitte wurden nach folgendem Schema behandelt:
ƒ
10 Minuten 1% Natrium-Borhydrid
ƒ
3x 10 Minuten PBS-Puffer mit 0,1 % BSA
ƒ
10 Minuten 50 mM Glycin
ƒ
2x 10 Minuten PBS mit 0,1 % BSA + 0,1% Triton
ƒ
2 Stunden 2% BSA in PBS
ƒ
3x 10 Minuten in PBS mit 0,1% BSA
Der spezifische erste momoklonale Antikörper mAb 735 Maus Anti-Maus, IgG2a (Frosch et
al., 1985) hatte die Chargennummer #64AZ0699 und einen Titer von 6,43 mg/ml. Der
Antikörper wurde mit PBS auf 1 mg/ml verdünnt und diese Stammlösung in einer
Verdünnung von 1:200 auf die Präparate gegeben (100 µl/Objekträger) und für 48 Stunden
43
3-
Material und Methoden
bei 2-4°C in einer feuchten Kammer reagieren gelassen. In jedem Färbedurchgang diente
mindestens ein Schnitt als Negativkontrolle. Die Negativkontrolle wurde vor der Behandlung
mit dem spezifischen ersten Antikörper mit dem Enzym Endoneuraminidase aus dem Phagen
K1F (EndoNF) (Mühlenhoff et al., 2003) in einer Konzentration von 1 µg/ml 4 Stunden bei
37°C behandelt. Die Negativkontrolle wurde im weiteren wie die anderen Schnitte behandelt.
Danach wurden die Schnitte dreimal 10 Minuten in PBS gespült und mit 100 µl/Objekträger
mit unverdünnter Ziege-anti-Maus-Antikörperlösung EnVision-Peroxidase der Fa. DAKO
Cytomation für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Präparate
erneut dreimal 10 Minuten in PBS gespült und mit DAKO liquid DAB + SubstrateChromogen Lösung nach Angaben des Herstellers gefärbt. Die überschüssige Farbe wurde in
PBS herausgelöst, die Schnitte wurden mit Glyceringelatine eingedeckelt, und nach
Trocknung der Glyceringelatine das Deckglas von allen Seiten mit Nagellack versiegelt.
NCAM-Färbung
Nach der Entparaffinierung wurden die Schnitte dreimal 5 Minuten in PBS gespült und dann
4
Stunden
in
einer
feuchten
Kammer
bei
37°C
mit
EndoNF
1µg/ml
(siehe
Polysialinsäurefärbung) behandelt. Das Enzym wurde dreimal 5 Minuten in PBS abgespült
und die Schnitte 20 Minuten mit 2% BSA inkubiert. Danach wurden die Schnitte mit dem
spezifischen ersten Antikörper versehen. Der Klon H-28 Ratte Anti-Maus, IgG2a hatte einen
Titer von 1,25 mg/ml (Hirn et al., 1981). Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:50
mit PBS + 0,1% BSA über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte erneut eine
Spülung mit PBS dreimal 5 Minuten und Visualisierung mit dem DAKO Envision- System
wie bei der Polysialinsäure Färbung beschrieben.
3.1.6.7- Fotografie
Alle histologischen Präparate wurden mit einem Zeiss Photomikroskop II fotografiert. Die
ungerahmten Diaabzüge wurden in einer Auflösung von 150 dpi eingescannt. Im
Bildbearbeitungsprogramm Adobe Photoshop 5.0 wurde der korrekte Maßstab eingefügt und
die Abbildung in Tonwert, Helligkeit, Kontrast und Schärfe bearbeitet. Die Archivierung der
Abbildung erfolgte bearbeitet und unbearbeitet.
44
3-
3.1.7-
Material und Methoden
Quantitative Bestimmung von S-Pentyl-4-yn in Plasma und Gewebe
3.1.7.1- Probenahme
Für jeden Zeitpunkt nach Verabreichung der Testsubstanz wurde eine Gruppe von 3
weiblichen Mäusen ausgewählt (siehe Randomisierung). Alle Tiere wurden gewogen und
separiert. Die Injektion der Testsubstanzen erfolgte in einem Volumen von 10 ml/kg
Körpergewicht subcutan im Nackenbereich im Abstand von 2 Minuten für den
Probenzeitpunkt 1 (7 Minuten nach Injektion), im Abstand von 4 Minuten für den
Probenzeitpunkt 2 (15 Minuten nach der Injektion) und im Abstand von 5 Minuten für alle
weiteren Probenzeitpunkte. 1 Minute vor Ablauf der Messzeit wurde die Maus in eine
Narkosekammer mit Diethylether gesetzt. Nach 1 Minute war die Narkose eingetreten, und
dem Tier wurde mit einem heparinisierten Mikro-Hämatokritröhrchen vom medialen
Augenwinkel eine Blutprobe von 0,5 bis 1,0 ml Vollblut in ein Lithium-Heparin Probengefäß
(15 I.E. Heparin/ml, Fa. Sarstedt, Nürnbrecht) entnommen. Nach der Blutentnahme wurde die
Maus während der Narkose durch cervikale Dislokation getötet. Die Bauchhöhle wurde durch
einen medianen Schnitt geöffnet und die Leber entnommen. Nach einem Schnitt von caudal
durch das Foramen magnum über die Stirn in Richtung Nase wurde die knöcherne
Schädelkalotte lateral aufgeklappt und das Gehirn in toto entnommen. Die Blutproben wurde
bei 10.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, das Plasma mit einer Pipette entnommen und in
ein neuess Eppendorf-Probengefäß gegeben. Die Organe wurde zusammen mit dem Plasma
bei –20°C bis zur Analytik eingefroren.
3.1.7.2- Probenaufarbeitung (Fisher et al., 1992)
Die Aufarbeitung der Plasmaproben und die Analytik des S-Pentyl-4-yn wurde von Herrn
Daniel Eikel durchgeführt.
Von den Plasmaproben wurde nach Erwärmung auf Raumtemperatur 50 µl pro Analyse
entnommen (Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz, Pipetten Reference). Zu dieser Menge wurden 30
µl einer internen Standardlösung (3-Ethyl-Pentansäure, 0,5 µg/µl) und 200 µl saurer
Phosphatpuffer, pH 5,0 (NaH2PO4. 2 H20, 0,5 mol/l Aqu. dest.) gegeben und zweimal mit 1 ml
Essigsäureethylester extrahiert. Nach der Extraktion wurden die Proben zentrifugiert (5 Min.,
20.000g), in ein Glasgefäß überführt, mit 100 µl Acetonitril versetzt und in einem sample
45
3-
Material und Methoden
concentrator (Dri Block®, DB. 3, Fa. Techne) bis auf ein Volumen von ca. 50-100 µl
reduziert. Die chirale Derivatisierung erfolgte durch Zugabe von:
ƒ
400 µl Dichlormethan
ƒ
200 µl 1-Hydroxybenzotriazol
ƒ
200µl N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid
ƒ
200 µl S-1-(1-Naphtyl)-Ethylamin.
Die Lösung reagierte 90 Min. bei Raumtemperatur. Die Lösung wurde im sample
concentrator vollständig eingeengt und mit 100 µl Lösungsmittel (n-Hexan/Essigester 1:4) zur
GC-Analyse überführt. Von den Gehirnproben wurde tiefgefroren 20-100 mg entnommen und
die Probe nach Zugabe von 400 µl saurem Phosphatpuffer und internem Standard zerkleinert
(Ultra Turrax T8, Fa. Ika Labortechnik). Die Extraktion erfolgte wie oben beschrieben.
3.1.7.3- Gaschromatographische Trennung und Detektion (Hauck & Nau, 1989)
Die gaschromatographische Trennung von Analyt und internem Standard erfolgte mit dem
GC-System 6890 von der Firma Hewlett Packard. Zur Quantifizierung wurden die
Peakflächen des Chromatogramms berechnet. Trennungsparameter:
Säule:
HP5-MS Agilent (30 m lang, 320 µm Innendurchmesser, 0,25 µm
Flüssigkeitsfilm).
Trägergas:
Helium 5.0, Durchfluss von 2 ml/Min.
Injektorsystem:
1 µl splittless, splittless liner konstant auf 250°C vorgeheizt.
Temperaturprogramm:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Detektor:
Thermionischer Detektor (N-P-Detektor), 50 pA, Rubidiumperle auf
250°C geheizt.
120°C, 2 Min.
mit 20°C/Min. auf 220°C für 1 Min.
mit 10°C/Min. auf 230°C für 12 Min.
mit 60°C/Min. auf 325°C für 6 Min.
Die quantitative Bestimmung des Analyten erfolgte durch die Bestimmung der Peakflächen
von Analyt und internem Standard. Das Peakflächenverhältniss wurde in einer
Kalibrierfunktion in einem Bereich von 5-1000 µg/ml mithilfe dotierter Maus-Plasmaproben
bestimmt. Die Nachweisgrenze (=LOD, limit of detection) lag bei 5 µg/ml, die
46
3-
Material und Methoden
Bestimmungsgrenze (=LOQ, limit of quantification) bei 14 µg/ml und das Bestimmtheitsmaß
r2 bei 0,9992 (Programm Valoo, Version 1.0, Fa. Analytical Software). Die Wiederfindung
wurde in 8 Plasmaproben und 6 Gehirnproben bestimmt und betrug für Mausplasma 100%,
Variationskoeffizient ≤ 4%, und für Mausgehirn 86% bei einem Variationskoeffizienten ≤
5%.
3.1.8-
Real time-PCR (RT-PCR)
Die Real time-PCR ist eine hochsensitive Methode zum quantitativen Nachweis von mRNA.
Die mRNA wird zunächst aus dem Gewebe isoliert und dann in copyDNA (cDNA)
umgeschrieben. Die cDNA wurde in dieser Arbeit unspezifisch mit SybrGreen angefärbt und
die Menge der amplifizierten cDNA mit der Menge eines konstant exprimierten Gens (house
keeping-Gen) verglichen. Die abgebildeten Amplifikationskurven im Ergebnissteil zeigen die
Verdopplung der Zielgene und des house keeping-Gens; dargestellt sind jeweils die
Fluoreszensintensität im Verhältnis zum Verdopplungszyklus (siehe Abb. 3.1). Aus der
Differenz der Verdopplungszyklen zwischen Zielgen und house keeping-Gen bei gleicher
Fluoreszensintensität kann im linearen Bereich der Amplifikationskurven auf die
Ausgangsmenge mRNA zurückgeschlossen werden.
3.1.8.1- Probenahme
Die Verpaarung der Mäuse erfolgte wie zuvor beschrieben. Nach Tötung des Muttertieres
durch cervikale Dislokation wurde die Bauchhöhle geöffnet, der gravide Uterus entnommen,
in eine sterile Petrischale gelegt und mit DEPC Wasser bedeckt. Die weitere Präparation
wurde durchgeführt wie bei der Somitenzählung beschrieben. Der präparierte Embryo wurde
mit einer Pipette in ein Eppendorf-Probengefäß gelegt und mit RNAlater bedeckt. Die Menge
an RNAlater betrug mindestens das fünffache des Probenvolumens. Die Präparate wurden
über Nacht bei 2-4°C gelagert und dann bei –80°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
DEPC-Wasser:
(Diethylpyrocarbonat)
Aqua dest. in autoklavierter Flasche mit
0,01 % DEPC versetzt, über Nacht stehen lassen und am
folgenden Tag autoklaviert.
47
3-
Material und Methoden
3.1.8.2- RNA-Isolierung und Erstellung von copyDNA (cDNA)
Die Proben wurden auf Eis aufgetaut, der Embryo mit einer Pipettenspitze aus der RNAlater
Lösung gefischt und in 500 µl Trizol überführt. Durch energisches auf- und abpipettieren
wurde das Gewebe zerkleinert (Fa. Sarstedt, Biosphere Filter Tips) und die Trizollösung mit
100µl Chloroform versetzt, gemischt, 10 Minuten stehen gelassen und zentrifugiert (15
Minuten, 13.000 rpm, 4°C). Die obere, wässrige Phase wurde in ein 2,0 ml Eppendorf-Cup
gegeben, mit 1 µl Glycogen und 250 µl Isopropanol versetzt und 30 Minute bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Nach erneutem Zentrifugieren (15 Minuten, 13.000 rpm,
4°C) wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 100 µl DEPC-Wasser gelöst, gemischt,
mit 10 µl 3M Na-Acetat pH 5,2 und 250 µl 100% Ethanol versetzt, gemischt und über Nacht
bei –20°C gefällt. Nach dem Zentrifugieren (20 Minuten, 13.000 rpm, 4°C) am nächsten
Morgen wurde das RNA-Pellet in 70% Ethanol gewaschen, kurz getrocknet und in 50 µl
DEPC-Wasser aufgenommen. Zur Messung des RNA-Gehaltes wurde die optische Dichte bei
260/280 nm gemessen (Spektrophotometer, Fa. Beckmann, DU-600), als Leerwert wurde
Ampuwa-Wasser verwandt. Die isolierte RNA wurde bei –20°C aufbewahrt.
Erstellung von cDNA:(Biosphere Filter Tips, Fa. Sarstedt; Pipetten Reference, Fa. EppendorfNetheler-Hinz; PCR-Softtubes 0,2 ml, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz)
500- 1000 ng RNA
X
µl
DEPC-Wasser
X
µl
pdN6 (random primer, 10 µg/µl)
1,0
µl
5x Puffer
4,0
µl
dNTP (10 mM
1,0
µl
Dithiothreitol (DTT)
2,0
µl
RNAse Inhibitor (40U/µl)
0,5
reverse Transkriptase Superscript II
∑
PCR-Programm:
(Personal Cycler, Fa. Biometra)
ƒ
70°C, 10 Minuten
µl
ƒ
25°C, 10 Minuten
1,0
µl
ƒ
ƒ
42°C, 50 Minuten
70°C, 15 Minuten
20
µl
48
3-
Material und Methoden
Die cDNA wurde bei –20°C aufbewahrt. Als Negativkontrolle wurden einige Proben in
diesem Protokoll ohne reverse Transkriptase behandelt (-RT-Kontrolle).
3.1.8.3- RT-PCR und Acrylamid-Gelelektrophorese
Jede cDNA wurde mit folgendem Ansatz behandelt:
(Biosphere Filter Tips, Fa. Sarstedt; Pipetten Reference, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz;
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate, Fa. Applied Biosystems; MicroAmp Optical Caps,
Fa. Applied Biosystem)
Ampuwa-Wasser
10x Puffer
MgCl2, 25 mM in 1x TE-Puffer
dNTP, 10 mM
Primer, 10 pmol/µl in 1x TE-Puffer
ROX Reference Dye
SYBR-Green 104 in 1x TE verdünnt
Platinum Taq DNA-Polymerase
15,5
2,5
1,5
0,5
0,6
0,25
2,0
0,125
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
Æ
23 µl Mastermix + 2 µl cDNA
RT-PCR-Programm: (ABI Prism Sequence Detector 7700, Fa. Applied Biosystems)
ƒ 50°C, 10 Sekunden
ƒ
95°C, 5 Minuten
ƒ
40mal:
95°C, 30 Sekunden
60°C, 30 Sekunden
2°C, 30 Sekunden
Primersequenzen:
(Größe des PCR-Produktes)
Maus-ST8SiaII:
(72 bp)
forward: 5´-GGC TGT GGC CAG GAG ATT G-3´
reverse: 5´-GGC ATA CTC CTG AAC TGG AGC C-3´
Maus-ST8SiaIV:
(68 bp)
forward: 5´-GCA CCA AGA GAC GCA ACT CAT C-3´
reverse: 5´-CAG AGC TGT TGA CAA GTG ATC TGC-3´
49
3-
Maus-HPRT:
Material und Methoden
(90 bp)
forward: 5´-TTC CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA-3´
reverse: 5´-AGA GGG CCA CAA TGT GAT GG-3´
Maus-NCAM:
(68 bp) Diese Primer liegen zwischen den extrazellulären Ig-
Domänen 3 und 4, daher werden alle NCAM-Isoformen amplifiziert.
forward: 5´-GGA TGC CTC CAT CCA CCTC-3´
reverse: 5´-GGC CGT CTG ATT CTC TAC ATA GG-3´
1x TE-Puffer, pH 7,4:
10 mM
1 mM
Tris/HCl
EDTA
Zur Kontrolle wurde mindestens ein PCR-Ansatz ohne cDNA nach dem gleichen Protokoll
behandelt (NTC= no template control). Zur Kontrolle der cDNA-Synthese wurde in einigen
PCR-Durchgängen –RT-Proben eingesetzt.
Die PCR-Produkte wurden zur Kontrolle einer korrekten Amplifikation in einer
Acrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (siehe Auswertung). Zur Erstellung des Gels wurden
folgende Lösungen benötigt:
6% Polyacrylamid-Lösung: Acrylamidlösung 38%
10x TBE-Puffer
Aqua dest.
87 ml
50 ml
371 ml
6% Acrylamid-Gel:
40 ml
500 µl
1x TBE-Puffer:
6% PAA Lösung
10% (w/v) Ammoniumpersulfat
(APS)
N´N´N´N-Tetramethyl-EthylenDiamin (TEMED)
20
µl
TRIS
270 g
Borsäure
137 g
0,5 M EDTA
100 ml
mit Aqua dest. auf 25 l auffüllen.
Die Lösung wurde zwischen 2 Glasplatten im Abstand von 1 mm gegeben und nach Erhärten
in eine Laufkammer mit TBE-Puffer eingebaut. In die Geltaschen wurde jeweils 10 µl PCRProdukt mit einem Tropfen 6-fach Ladungs-Puffer gegeben. Als Größenstandard wurden 6 µl
50
3-
Material und Methoden
des Restriktionsproduktes pBR 322DNA/BSU RI (Hae III) eingesetzt. Nach Anlegen einer
Spannung (Fa. Gibco BRL, Elektrophoresis Power Supply ST606) von 160 V für ca. 15 Min.
wurde die Spannung auf 180 V erhöht, bis die Proben deutlich erkennbar aufgetrennt waren
(ca. 1 Stunde). Das Gel mit den aufgetrennten Proben wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und
unter UV-Licht fotografiert (Fluorescent Tables, Fa. Renner GmbH, D-6701 Dannstadt).
3.1.8.4- Auswertung
Die quantitative Beurteilung der PCR-Produkte erfolgte relativ zu einer endogenen Kontrolle.
Als konstant exprimierte Kontrolle wurde HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase)
der Maus verwendet. Amplifikationskurven mit nicht-exponentiellem Verlauf oder ohne
deutlich erkennbare lineare Phase wurden nicht ausgewertet. Die Analyse der entsprechenden
cDNA wurde in einem zweiten RT-PCR-Ansatz wiederholt; wenn die Amplifikationskurve
wiederum nicht verwendet werden konnte, wurde neue cDNA erstellt. Die Kurven einer
Probe wurden ebenfalls nicht ausgewertet, wenn die Amplifikation des HPRT keinem
exponentiellen Verlauf folgte oder keine deutlich lineare Phase zu erkennen war. Als
Parameter für die Ausgangsmenge cDNA im RT-PCR-Ansatz wurde der Treshhold-Cycle (Ct
–Wert) im Verhältnis zu einer internen Kontrolle verwendet. Der Ct –Wert beschreibt den
Verdopplungszyklus,
bei
dem
das
Fluoreszenzsignal
zum
ersten
Mal
aus
der
Hintergrundfluoreszenz hervortritt. Zur relativen Quantifizierung wurde ein ∆Ct –Wert als
Differenz zu HPRT berechnet. Entscheidend für die korrekte Beurteilung war nicht die
absolute Höhe des Ct-Wertes, sondern der parallele Verlauf der Amplifikationskurven im
Meßbereich (Abb. 3.1).
In jeder Messung wurden von einer Proben alle 4 Zielgene bestimmt. Bei der Bestimmung
des Threshhold-Cycle wurde stets ein linearer Bereich ausgewählt, in dem alle
Amplifikationskurven parallel zueinander verliefen. Das PCR-Produkt jeder Probe wurde
mindestens einmal in einer Gelelektrophorese aufgetrennt und und anhand eines
Größenstandards als Primerdimer oder Amplifikat identifiziert, ebenso wurden alle
Negativkontrollen jeder PCR-Analyse in einer Gelelektrophorese charakterisiert. Da die
Negativkontrollen Ct-Werte von 31-40 hatten, wurden alle Amplifikate von Proben mit einem
Ct-Wert >30 grundsätzlich in der Gelelektrophorese untersucht, um eine Verwechslung des
Signals mit Primerdimeren zu verhindern.
51
3-
Material und Methoden
1
2
Abb. 3.1: Ermittlung des ∆Ct-Wertes. Die Abbildung verdeutlicht, dass die lineare Phase der
exponentiellen Funktion entscheidend für die Ermittlung des korrekten ∆Ct-Wertes ist.
Innerhalb dieser Phase ist es unerheblich, ob der ∆Ct-Wert auf Höhe von Gerade 1 oder 2
gemessen wird, da sich das Verhältnis der Amplifikationskurven untereinander nicht ändert.
3.1.9-
Statistik
3.1.9.1- Exenzephaliemodell
Zwischen den Behandlungsgruppen wurden die Parameter Fetalgewicht, Exenzephalierate
und Embryolethalität miteinander verglichen. Das Signifikanzniveau lag bei p< 0,05. Die
Fetalgewichte der Behandlungsgruppen wurden als Mittelwerte und Standardabweichungen
berechnet (Microsoft Excel 1997) und in einem one-way ANOVA (Jandel Scientific,
SigmaStat 2.0) verglichen. Ergab der multiple Vergleich signifikante Unterschiede, wurde mit
Dunnett´s Methode die Kontrollgruppe mit allen anderen Gruppen verglichen. Die Daten
waren normalverteilt (Kolmogorov-Smirnov Test) und varianzhomogen (Levene-Median
Test). Die Häufigkeiten der Exenzephalie waren binomial verteilte Daten und wurden
aufgrund von Erwartungswerten <5 mit dem Fisher´s-Exact-Test verglichen. Gerechnet wurde
mit den gemessenen Häufigkeiten exenzephaler Feten je Gruppe, die Grundmenge entsprach
der Gesamtzahl der lebenden Feten der Gruppe. Die Lethalitätsraten waren ebenfalls binomial
52
3-
Material und Methoden
verteilte Daten und wurden aufgrund von Erwartungswerten >5 mit dem Chi2 Test verglichen.
Gerechnet wurde mit der gemessenen Häufigkeit toter Feten, die Grundmenge entsprach der
Gesamtzahl lebender und toter Feten.
3.1.9.2- Neurotoxizität (Litchfield & Wilcoxon 1949)
Alle protokollierten Werte wurden in ein Wahrscheinlichkeitsnetz eingetragen, eine lineare
Regressionsgerade erstellt (Jandel Scientific, Sigma Plot 4.0) und Werte von 0% und 100%
wurden nach Vorgabe von Tabelle 1 aus Litchfield & Wilcoxon (1949) korrigiert. Um den
Grad der Übereinstimmung der linearen Regressionsgeraden mit den Datenpunkten zu
überprüfen, wurde der Chi2-Wert aus der Differenz der Beobachtungs- und Erwartungswerte
berechnet und mit den Werten aus Tabelle 2 der beschriebenen Veröffentlichung verglichen.
Die Chi2-Werte lagen alle unter den angegebenen Grenzwerten, und die Geraden stimmten
daher ausreichend mit den Meßwerten überein. Die Berechnung des graphisch dargestellten
TD50-Wertes wurde mit dem Programm Pharm PCS Version 3.2 durchgeführt. Die
Überprüfung der Parallelität zweier Geraden und die Berechnung der Potency-Ratio wurde
mit dem Programm Microsoft Excel 1997 durchgeführt. Zwei Versuchsgruppen wurden als
signifikant unterschiedlich angenommen, wenn die Potency-Ratio größer war als der
berechnete Faktor der Potency-Ratio.
3.1.9.3- Somitenzählung
Die durchschnittliche Anzahl der Somiten wurde als Mittelwert und Standardabweichung
berechnet (Microsoft Excel 1997). Mit einem zweiseitigen Student´s t-Test wurden ST8Sia
IV(+/+) und ST8Sia IV(-/-) mit NMRI-Mäusen verglichen (Jandel Scientific, SigmaStat 2.0).
Durch Bonferroni-Anpassung wurde das Signifikanzniveau von p <0,05 auf p <0,025 erhöht.
Die Fotografie der Embryonen wurde analog zum Spina bifida-Modell durchgeführt.
3.1.9.4- RT-PCR
Die mittleren ∆Ct –Werte aus mindestens 2 Wiederholungsmessungen von 3 Proben wurden
als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und in einem Student´s t-test mit einem
Signifikanzniveau
von
5%
mit
Proben
Entwicklungsstadiums verglichen (n=3).
53
unbehandelter
Tiere
des
gleichen
3-
3.2-
3.2.1-
Material und Methoden
In-vitro Methodik
Neuritenwachstum in fetalen Hippocampuszellen
3.2.1.1- Präparation von fetalen Hippocampuszellen (Maar et al., 1997)
Rattenfeten im Alter von E 18-19 wurde durch einen Scherenschlag der Kopf entfernt und das
Gehirn in Lösung I auf Eis gelagert. Die weitere Präparation erfolgte unter sterilen
Bedingungen. Unter einem Stereomikroskop (Leica MZ6) wurden die zwei Hemispheren des
Gehirns getrennt und die Schnittkante nach oben positioniert. Das rostrale Ende der
Hippocampusformation wurde gelöst, die basale Linie davon ausgehend präpariert, der
Hippocampus herausgelöst und Meningen und Blutgefässe entfernt. Auf einer Petrischale
wurde jeder Hippocampus zweimal geteilt und mit einem Tropfen von Lösung II versehen.
Der Tropfen mit dem Gewebe wurde in ein Probengefäss pipettiert und auf 2 ml mit Lösung
II aufgefüllt. Nach 6 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde das 2-3fache Volumen
von Lösung IV zugegeben, zentrifugiert (1500 rpm, 2-3 Minuten) und der Überstand
abgenommen. Nach Zugabe von 800 µl Lösung III wurde das Gewebe maximal 20mal aufund abpipettiert. Nach 5 Minuten auf Eis setzten die Zellen sich ab und der Überstand wurde
entfernt. Nach Zugabe von Lösung V im gleichen Volumen wurden die Zellen zentrifugiert
(700 rpm, 5 Minuten) und in Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde in einer Zählkammer
nach Burker-Turk bestimmt.
Krebs-Puffer:
7,07 g
NaCl
0,36 g
KCl
0,166 g
KH2PO4
2,14 g
NaHCO3
2,57 g
Glukose
0,015 g
Phenolrot
in 1l sterilem Aqua dest. löse
Lösung I:
3
g
bovines Serum Albumin (Sigma A4503)
8
ml 3,8% MgSO4 Lösung
20
ml 1M HEPES (Gibco 15630-056)
auf 1l Krebs-Puffer
Lösung II:
125
ml
Lösung I
54
3-
Material und Methoden
31,3
mg
Trypsin (Sigma T-2271)
Lösung III:
100
8
52
1000
ml
mg
mg
µl
Lösung I
DNAse (Sigma D5025, 1,5 Kunitz-U/mg solid)
Soybean Trypsin Inhibitor (10000BAEE-U/mg Protein)
3,8% MgSO4 Lösung
Lösung IV:
105
20
ml
ml
Lösung I
Lösung III
Lösung V:
125
150
100
ml
µl
µl
Lösung I
1,2% CaCl2 Lösung
3,8% MgSO4 Lösung
3.2.1.2- Hippocampuszellkultur (Maar et al., 1997)
Die präparierten Zellen wurden sofort in 8-well Plastikkulturgefässe (Lab-Tek Chamber Slide
System, 8 well Permanox 177445, Fa. NUNC, Roskilde, Denmark) in einem Volumen von
200 µl Medium und Zelldichte von 10.000 Zellen/cm2 (50.000 Zellen/ml in angegebenen
Kulturplatten) ausgesäht. Die Behandlung der Zellen erfolgte direkt nach der Aussaat. Die
VPA-Derivate wurden 1 molar in DMSO gelöst und in einem Volumen von 100 µl Medium
direkt auf die Zellen gegeben. Als Positivkontrolle diente ein stark differenzierungsinduzierendes Protein in einer Konzentration von 1,5 µg/ 300 µl Medium, die verwendete
Charge hatte einen Titer von 0,275 mg/ml. (Soroka et al., 2002). Das Endvolumen pro Well
betrug 300 µl Medium. Die Hippocampuszellen wurden für 24 Stunden, 37°C, 5% CO2 der
Behandlung ausgesetzt. Zur Entfernung der PSA wurden die Zellen mit 1 µl
Endoneuraminidase NF (Konzentration von 85 µg/ml, siehe Abschnitt 3a.6.5.1) auf 300 µl
Medium behandelt . Das Enzym wurde direkt nach der Aussaat der Zellen in das Medium
gegeben und verblieb dort bis zur Fixierung und Färbung.
Zellmedium:
500
10
5,5
5,5
ml
ml
ml
ml
serumfreies Neurobasal Medium
B27 Supplement X50
1% Penicillin-Streptomycinlösung
1% Glutamaxlösung
55
3-
Material und Methoden
10
ml
1M HEPES
steril, Lagerung bei -20°C
3.2.1.3- Färbung
Zur
Visualisierung
des
gesamten
Proteins
der
Hippocampuszellen
wurde
eine
Coomassiefärbung eingesetzt. Zu den 300 µl Medium jedes Wells wurde 300 µl einer frisch
angesetzten
8%
Paraformaldehyd/
PBS-Lösung
für
30
Minuten
gegeben.
Die
Paraformaldehydlösung wurde vorsichtig entfernt, die Zellen 3mal für 5 Minuten mit PBS
gewaschen und die Zellen dann mit Coomassielösung für 30 Minuten gefärbt. Die Farbe
wurde mit Leitungswasser abgespült, die Oberseite des Chamber Slides Systems entfernt und
der Objektträger mit Fluorescent Mounting Medium und einem Deckgläschen versiegelt.
Coomassielösung:
80 ml
96% Ethanol
20 ml
100% Eisessig
0,8 g
Coomassie R250
auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen
Zur Darstellung von PSA und NCAM wurden immunhistochemische Färbungen angewandt.
Die Zellen wurden fixiert, wie für die Coomassiefärbung beschrieben, und danach mit dem
spezifischen ersten Antikörper behandelt. Die Protokolle der Färbungen entsprachen der
Vorgehensweise im embryonalen Mausgewebe (siehe Abschnitte 3a.6.5.1 und 3a.6.5.2), bei
der PSA-Färbung wurde auf die Behandlung mit Natriumborhydrid verzichtet. Die
gebundenen Antikörper wurden durch sekundäre, fluoreszensmarkierte Antikörper (eine
Stunde Inkubation bei Raumtemperatur) sichtbar gemacht. Die Konzentrationen der
Antikörper betrugen:
PSA-Färbung:
NCAM-Färbung:
1. AK mouse-anti-mouse 735
(1mg/ml) 1:100 in 0,1% BSA/PBS
2. AK goat-anti-mouse546 nm
(2mg/ml) 1:1000 in 1% BSA/PBS
1. AK mouse-anti-rat H28
(1mg/ml) 1:100 in 0,1% BSA/PBS
2. AK goat-anti-rat 488 nm
(2mg/ml) 1:1000 in 1% BSA/PBS
Zur Dokumentation der Färbung wurden die Fluorophore in einem Konfokalmikroskop
(Nikon Eclipse TE200 mit BioRad MicroRadiance 2000 Laser) durch Laserenergie angeregt
56
3-
Material und Methoden
(488 nm: Argon Laser, 14 mW, 546 nm: Green HeNa Laser, 1,5 mW). Die Präparate wurden
bei
60-facher
Vergrösserung
mit
Immersionsöl
betrachtet
und
durch
eine
mikroskopgekoppelte Videokamera (Fa. Grundig Elektronics, Germany) in einer Auflösung
von 512 x 512 Pixel dokumentiert. Die Helligkeitswerte der Pixel wurden in verschiedene
Farbtöne übersetzt, um eine quantitative Abschätzung des detektierten Antigens zu
ermöglichen (schwache Helligkeit= blau, mittlere Helligkeit= gelb, starke Helligkeit= rot).
3.2.1.4- Bestimmung des Neuritenwachstums (Rönn et al., 2000)
Zur zufälligen Auswahl der Blickfelder wurde mit einem computerunterstützten Nikon
Diaphot 300 Inversionmikroskop bei 20facher Vergrösserung das Präparat in Schlangenlinien
unter Auslassung der Randbereiche gemustert. Innerhalb dieser Schlangenlinien wurden 4050 Blickfelder mit einer computergekoppelten Videokamera (Fa. Grundig Electronics,
Deutschland) als 512 x 512 Pixel gif-Dateien gespeichert. Die Bildausschnitte wurden in
einem Bildanalyseprogramm (Process Length, erstellt von der Arbeitsgruppe von Prof.
Elisabeth Bock, Proteinlabor des Panum Institut, Kopenhagen) auf ein Quadrat mit 8
waagerechten Linien projiziert. Zur Bildanalyse wurden alle Zellkörper innerhalb des
Quadrates und alle Kreuzungen von Neuriten mit den waagerechten Linie auf dem
Computerbildschirm markiert und gezählt (siehe Abb. 3.2 ).
Aus jedem Well wurden mindestens 200 Zellkörper gezählt. Der Abstand zwischen den
Linien des Bildanalyseprogramms wurde mit einem Objektmikrometer (Nikon) ermittelt. Das
durchschnittliche Neuritenwachstum pro Zelle wurde berechnet als:
Ltotal =
d:
I:
LZellen:
Ltotal:
NZellen:
π ⋅d
2
⋅I
Ltotal
= LZellen
N Zellen
Abstand zwischen 2 Linien der Bildanalyse (28 µm)
Anzahl der Kreuzungspunkte zwischen Neuriten und Meßlinien
durchschnittliche Neuritenlänge pro Zelle
Neuritenlänge insgesamt
Anzahl der Zellen
57
3-
Material und Methoden
Abb. 3.2 : Ermittlung des Neuritenwachstums aus einem zufälligen Bildausschnitt. Alle
Zellkörper innerhalb des Bildausschnittes und auf der rechten und der oberen
Begrenzungslinie wurden gezählt (grosse, gepunktete Kreise). Die kleinen Kreise markieren
die gezählten Kreuzungspunkte der Neuriten mit den Messlinien
3.2.1.5- Statistik
Zur Ermittlung eines signifikanten Unterschiedes zwischen behandelten und DMSObehandelten Zellen wurde die durchschnittliche Neuritenlänge pro Zelle als Mittelwert mit
Standardabweichung aus mindestens 4 unabhängigen Versuchen berechnet (Microsoft Exel
1997). Diese Werte wurden in einem 2-seitigen Student´s t-Test mit der Kontrollgruppe
verglichen.
Die
Daten
waren
normalverteilt
(Kolmogorov-Smirnov
Test)
und
varianzhomogen (Levene-Median Test). Das Signifikanzniveau lag bei p< 0,05 (Jandel
Scientific, SigmaStat 2.0).
58
3-
3.3-
Material und Methoden
Verwendete Chemikalie
Chemikalien der in-vivo Studien (Abschnitt 3.1)
Chemikalie
Anbieter
10x PCR Puffer
1-Hydroxybenzotriazol, <5% H20
3-Ethyl-Pentansäure, 98%
5x First strand Buffer
Acetonitril, Chromasolv®
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Diss. Ute Gravemann, Hannover 2001
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Riedel-de-Haen/Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, D-82024 Taufkirchen
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Acrylamidlösung 38%
Rotiphorese® Gel 40
Alizarin Rot S Monohydrat
Ammoniumpersulfat (APS), MB grade
Ampuwa Wasser
Antikörper: mAb 735 und mAb H28
Aqua tridest aus Millipore Purification Pak
Borsäure min. 99%
Bovines Serum Albumin, min. 98% (A7906)
DAKO Envision, Ziege Anti-Maus IgG
DAKO liquid DAB + Substrate Chromogen
Depex
Desoxyribonukleotide (dNTP)
Dichlormethan, HPLC grade
Diethylether p.a.
DNA Marker 1 kB
DNA Marker pBR322DNA/BSUR I, 0,5 mg
DNA/ml
DTT
Eisessig, p.a.
Endoneuraminidase EndoNF
Eosin G, für die Mikroskopie
Essigsäureethylester, HPLC grade
Ethanol, technisch
Ethidiumbromid, HPLC grade
Eukitt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
AppliChem, D-64291 Darmstadt
Fresenius, Bad Homburg
Geschenk von Prof. Rita Gerardy-Schahn
Millipore S.A., D-67120 Molsheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Dako Cytomation, D-2204 Hamburg
Dako Cytomation, D-2204 Hamburg
Serva, D-69115 Heidelberg
MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, Karlsruhe
MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Geschenk von Prof. Rita Gerardy-Schahn
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Kindler GmbH, 79098 Freiburg
59
3-
Material und Methoden
Formaldehyd, purum, ~36% in Wasser
Glyceringelatine, Kaisers
Glycerol, wasserfrei min. 98%
Glycin, min. 99%
Glycogen, MB grade
Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
RocheRoche Deutschland Holding GmbH,
D-79639 Grenzach-Wyhlen
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Schering Deutschland GmbH, D-10589 Berlin
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Gold(III)chlorid-trihydtrat, min. 49%
H2O2 30%
HCG, Primogonyl, 1000 I.E./ml
HCl 37%, p.a.
Hydrochinon, min. 99%
Isopropanol, HPLC grade
KCl, min. 99%
Ladungspuffer (6x Loading Dye Solution)
May-Grünwald Lösung, gesättigt
MgCl2, 50 mM
MgCl2, min. 99%
Na-Borhydrid, min. 98%
NaH2PO4, p.a.
NaH2PO4. 2 H20, reinst
NaOH, min. 98%
Natriumthiosulfat, min. 98%
N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid-Hydrochlorid, min. 98%
n-Hexan, HPLC grade
Orange G, dye content min. 60%
Oxalsäure, min. 99%
Paraplast Plus
pdN6, Random primer
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sherwood Medical, St. Louis, USA
Amersham Biosciences Europe GmbH, D79111 Freiburg
Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Intervet, D-85716 Unterschleißheim
MWG Biotech AG, D- 85560 Emmendingen
MWG Biotech AG, D- 85560 Emmendingen
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Pikrinsäure, gesättigte wässrige Lösung
Platinum Taq DNA-Polymerase, 5 /µl
PMSG, Intergonan, 10000 I.E./6,5 mg
Primer für Genotypisierung
Primer für RT-PCR (HPRT)
Primer für RT-PCR (ST8SiaII, ST8SiaIV,
NCAM)
Protargol (Silberprotein), >20%
Proteinase K, (P8044)
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
60
3-
Material und Methoden
Reverse Transcriptase Superscript II, 200 U/µl
RNAlaterTM
RNaseOUT, rekombinanter Ribonukleotid
Inhibitor
ROX Reference Dye
S-1-(1-Naphtyl)-Ethylamin, Chiraselect®,
99,5% optische Reinheit
SybrGreen
TEMED
TRIS p.a.
Triton X-100, p.a.
Trizol Reagenz
Valproinsäure, p.a.
Xylol, Isomerengemisch
61
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Ambion, Austin/Texas, USA
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs
Carl Roth GmbH & Co, D-76185 Karlsruhe
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Invitrogen GmbH, D-6131 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
3-
Material und Methoden
Chemikalien der in-vitro Studien (Abschnitt 3.2)
Chemikalie
Anbieter
Bovines Serum Albumin (A4503)
CaCl2, reinst
Desoxyribonuklease (D5025)
Eisessig, p.a.
Fluorescent Mounting Medium
HEPES 1M (15630-056)
KCl, reinst
KH2HCO3, reinst
MgSO4, reinst
NaCl, reinst
P2-Peptid
Penicillin-Streptomycinlösung
Phenolrot, cell culture tested (P3532)
Soybean Trypsin Inhibitor (T9128)
Trypsin (T0303)
Paraformaldehyd 37%, zur Synthese
Coomassie Brilliant Blue R250, dye content
min. 90%
Ethanol 96%, p.a.
Glukose, min. 99,5% (G7021)
DMSO, min. 99,9%
Antikörper goat-anti-rat IgG, AlexaFluor,
488 nm
Antikörper goat-anti-mouse IgG,
AlexaFluor, 546 nm
B27 Supplement X50 (7504-044)
Neurobasal Medium (21103-049)
Glutamax (35050-061)
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Dako Cytomation, D-2204 Hamburg
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Geschenk von Prof. Elisabeth Bock
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Merck KGaA, D-64271 Darmstadt
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Sigma-Aldrich GmbH, D-89552 Steinheim
Fa. Eugene, Oregon, USA
Fa. Eugene, Oregon, USA
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
GibcoBRL/ Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
62
4-
Ergebnisse
4-
ERGEBNISSE
4.1-
Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Effekte von VPA und S-Pentyl-4Pentinsäure im Mausmodell
Gemäß der Fragestellung sollte ein möglicher Einfluß eines teratogenen VPA-Derivats auf
PSA-NCAM während der Embryonalentwicklung mit Hilfe von Knockout-Mausmodellen
untersucht werden. Die ST8SiaIV-knockout-Mäuse basieren partiell auf dem genetischen
Hintergrund der C57BL/6J-Maus, so dass eine konkrete Aussage zur Empfindlichkeit des
C57BL/6J-Stammes in den etablierten Modellen für Neuralrohrdefekte die praktische Voraussetzung zur Arbeit mit den Knockoutmäusen darstellte.
4.1.1
C57BL/6J-Mausstamm im Spina bifida-Modell
Durch die Applikation von VPA an Tag 9,0, 9,25 und 9,5 der Trächtigkeit können in der
NMRI-Maus Spina bifida aperta und Schwanzfehlbildungen induziert werden (Ehlers et al.,
1992). Die C57BL/6J-Maus zeigte hingegen eine deutlich verringerte Empfindlichkeit in diesem Modell. Durch die dreimalige Verabreichung von 300 mg/kg VPA an Tag 9 der Embryonalentwicklung wurden keine spezifischen Fehlbildungen induziert (Tab. 4.1). Die Anwendung des stark teratogenen S-Pentyl-4-yn führte ab Dosen von 3x 0,6 mmol/kg zur Ausprägung von Schwanzfehlbildungen, jedoch auch bei einer Erhöhung der Dosis auf 3x 0,7
mmol/kg wurde keine Spina bifida aperta induziert. Bei den Schwanzfehlbildungen wurden
stark verkürzte Schwänze, Knick- oder Drehschwänze gefunden. Als weitere Fehlbildungen
traten vereinzelt Fehlstellungen der Gliedmaßen in allen Behandlungsgruppen ohne signifikante Unterschiede auf. Die Embryoletalität lag in diesem Dosisbereich zwischen 54 und 75%
(Tabelle 4.1). Die Applikation von 3x 0,5 mmol S-Pentyl-4-yn induzierte keine extern sichtbaren Fehlbildungen bei den Nachkommen, das Fetalgewicht war jedoch signifikant verringert (Tabelle 4.1). Nach Präparation und Färbung des knöchernen Skeletts mit Alizarin Red S
wurden Mißbildungen der Wirbelsäule durch die Behandlung mit 0,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg
63
4-
Ergebnisse
sichtbar. Die Alizarinfärbung von exponierten Feten und histologische Untersuchungen zeigten, dass S-Pentyl-4-yn Fehlbildungen der Lendenwirbelsäule ohne extern sichtbare Veränderungen verursachte. Abb. 4.1 veranschaulicht repräsentativ einige häufig beobachtete Fehlbildungen der Lendenwirbelsäule in dieser Behandlungsgruppe: Lendenwirbelkörper sind fehlgestaltet und ossifizieren verlangsamt, die Bögen der Lendenwirbel sind ebenfalls fehlgestaltet und teilweise mit anderen Wirbeln verschmolzen. Abb. 4.2 fokussiert die Verschmelzung
von Bögen der Lendenwirbelsäule im histologischen Präparat. Die Behandlung der
C57BL/6J-Maus mit VPA und S-Pentyl-4-yn nach Vorgabe des Spina-bifida-Modells scheint
die Körperachse im Bereich der Lende zu treffen, die beobachteten Effekte waren jedoch
unspezifisch, und auch hohe Dosierungen induzierten keine Neuralrohrdefekte. Diese Beobachtungen ließen den C57BL/6J-Stamm als ungeeignet für das Spina-bifida-Modell erscheinen.
Tabelle 4.1: Externe Fehlbildungen der C57BL/6J-Maus im Spina bifida-Modell.
Behandlung(1)
0,9 % NaCl
0,5 mmol/kg
S-pentyl-4yn
0,6 mmol/kg
S-pentyl-4-yn
0,7 mmol/kg
S-pentyl-4-yn
300 mg/kg
( 2,1 mmol/kg )
VPA
Fehlbildungen(4)
(n)/(%)
Resorptionen(3)
(n)/(%)
Schwanz
Würfe Lebende
(n)
Feten
(n)
Fetales
Gewicht(2)
(g)
7
7
44
50
1,13 ± 0,1
5/(12)
0,98 ± 0,16* 7/(12)
0
0
Spina
bifida ap.
0
0
7
28
0,86 ± 0,13* 33/(54)*
16/(57)*
0
8
16
0,92 ± 0,12* 47/(75)*
14/(88)*
0
10
48
0,92 ± 0,16* 10/(17)*
0
0
1: Applikation der angegebenen Dosis dreimal an Tag 9,0, 9,25 und 9,5 der Trächtigkeit, 2: Mittelwert
± Standardabweichung, 3: % aller Implantationsstellen, 4: % aller lebenden Feten.
*: p< 0,05 im Vergleich zur NaCl-Behandlung, one-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test (Fehlbildungen und Resorptionen)
64
4-
Ergebnisse
Abb. 4.1: Fehlbildungen der Lendenwirbelsäule nach Behandlung mit S-pentyl-4-yn im Spina bifida-Modell. C57BL/6J Maus, E 18, ventral, Färbung der Knochen mit Alizarin Red S,
repräsentative Befunde aus 50 Präparaten (A) 0,9 % NaCl (B) 0,5 mmol S-pentyl-4-yn (E
9,0; 9,25; 9,5) LW-Körper 2 hantelförmig, LW-Bogen 2 fehlgestaltet und verschmolzen mit
LW3, LW-Körper 3 fehlgestaltet, LW-Körper 4 verzögerte Ossifikation
lw: Lendenwirbel, rm: Rückenmark, h: Haut
Abb. 4.2: Fehlbildung des lumbalen Wirbelbogens nach Behandlung mit 0,5 mmol S-pentyl4-yn/kg im Spina bifida-Modell. C57BL/6J Fetus, E 18, Wirbelbögen der Lendenwirbelsäule horizontal, H.-E.-Färbung, Maßstab: 40µm, (A) physiologische Ossifikation des 3. und 4.
Wirbelbogens der Lendenwirbelsäule, (B) fehlgeformter 2. Wirbelbogen der Lendenwirbelsäule, verschmolzen mit 3. Wirbelbogen
65
4-
4.1.2-
Ergebnisse
C57BL/6J-Maus im Exenzephaliemodell
Die Behandlung der NMRI-Maus mit VPA-Derivaten an Tag 8,25 der Trächtigkeit führt dosis- und substanzabhängig zur Ausprägung von Exenzephalie bei den Nachkommen (Nau et
al., 1981). Die C57BL/6J-Maus entwickelte in diesem Modell ebenfalls Exenzephalie, die
Empfindlichkeit war aber geringer. Tabelle 4.3 stellt die Dosis-Wirkungsbeziehungen für den
Mausstamm C57BL/6J-Maus im Exenzephaliemodell dar. Die Tiere wruden mit VPA und SPentyl-4-yn behandelt. Zum direkten Vergleich zeigt Tabelle 4.2 die Empfindlichkeit der
NMRI Maus. Die Zahlen verdeutlichen, dass eine dosisabhängige Induktion von Exenzephalie in C57BL/6J möglich war. Bei einer Dosis von 3 mmol VPA/kg (= 432,6 mg/kg) an Tag
8,25 der Trächtigkeit wurden in der NMRI-Maus 51% Exenzephalie bei den Nachkommen
induziert, die gleiche Dosis erzeugte im Stamm C57BL/6J 15% Exenzephalie. Die Exenzephalierate war auch nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn ca. 3,5-fach geringer in C57BL/6J:
1 mmol S-Pentyl-4-yn/kg (= 168 mg/kg) induzierte 84% Exenzephalie in NMRI und 23%
Exenzephalie in C57BL/6J. Die Berechnung der durchschnittlichen letalen Dosis für 50% der
implantierten Embryos (EmbryoLD50) und der durchschnittlichen teratogenen Dosis für 50%
der lebenden Feten (TeraD50) ist in den Abb. 4.3 und 4.4 dargestellt. Der direkte Vergleich der
Em-bryoLD50 und TeraD50 zwischen NMRI und C57BL/6J in Abb. 4.5 zeigt den deutlichen
Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte der beiden Substanzen.
Die TeraD50 für S-Pentyl-4-yn in C57BL/6J betrug 2,8 mmol/kg, in NMRI 0,7 mmol/kg. Im
Vergleich wurden 3 mmol VPA/kg in NMRI für eine 50% Exenzephalierate benötigt und 9,1
mmol VPA/kg in C57BL/6J. Die Darstellung im Wahrscheinlichkeitsnetz verdeutlicht, dass
die TeraD50-Werte in C57BL/6J errechnete Werte darstellen, die in dieser Dosis nicht verabreicht wurden. Für die erwachsene, weibliche C57BL/6J-Maus wurde die mittlere neurotoxische Dosis (TD50) S-Pentyl-4-yn im Rotarod-Toxizitätstest als 1,0 mmol/kg bestimmt. Die
TD50-Dosis für VPA betrug 2,0 mmol/kg (siehe Abb. 4.6). Im Vergleich zu den Werten aus
Tabelle 4.3 induzierten diese Dosen 23% (S-Pentyl-4-yn) und 13% (VPA) Exenzephalie bei
den Nachkommen.
66
4-
Ergebnisse
Tabelle 4.2: Hsd:Win NMRI im Exenzephaliemodell
Behandlung(1)
(mmol/kg)
Lebende
Feten (n)
Resorptionen(3) Exenzephalie(4)
Fetales
Gewicht(2) (g) (n)/(%)
(n)/(%)
NaCl-Kontrolle 6
70
1,27 ± 0,11
4/(5%)
0
1,0 VPA
6
69
1,23 ± 0,11
9/(12%)*
7/(10%)*
2,0 VPA
5
51
1,15 ± 0,12*
14/(22%)*
17/(33%)*
3,0 VPA
7
63
1,04 ± 0,17*
21/(25%)*
32/(51%)*
0,6 S-Pent.-4yn 6
57
1,08 ± 0,08*
23/(29%)*
24/(42%)*
0,8 S-Pent.-4yn 7
71
1,06 ± 0,13*
24/(24%)*
46/(65%)*
1,0 S-Pent.-4yn 6
45
0,98 ± 0,12*
37/(45%)*
38/(84%)*
1,2 S-Pent.-4yn 7
45
0,95 ± 0,07*
43/(49%)*
42/(93%)*
Würfe
(n)
Tabelle 4.3: C57BL/6J im Exenzephaliemodell
Behandlung(1)
(mmol/kg)
Lebende
Feten (n)
Resorptionen(3) Exenzephalie(4)
Fetales
(2)
Gewicht
(g) (n)/(%)
(n)/(%)
NaCl-Kontrolle 7
47
1,14 ± 0,1
2/(2%)
0
1,0 VPA
5
30
1,13 ± 0,09
4/(12%)
2/(7%)
2,0 VPA
5
32
1,13 ± 0,10
10/(24%)*
4/(13%)*
3,0 VPA
8
40
0,86 ± 0,10*
19/(32%)*
6/(15%)*
4,0 VPA
6
21
1,01 ± 0,14*
21/(50%)*
6/(29%)*
0,8 S-Pent.-4yn 6
32
1,05 ± 0,10*
15/(32%)*
5/(16%)*
1,0 S-Pent.-4yn 8
35
1,02 ± 0,12*
19/(32%)*
9/(23%)*
1,2 S-Pent.-4yn 6
27
0,94 ± 0,08*
19/(41%)*
7/(26%)*
1,5 S-Pent.-4yn 8
26
0,91 ± 0,11*
27/(51%)*
8/(31%)*
Würfe
(n)
1: Applikation der angegebenen Dosis an Tag 8,25 der Trächtigkeit, 2: Mittelwert ± Standardabweichung, 3: % aller Implantationsstellen, 4: % aller lebenden Feten, *: p< 0,05 im Vergleich zur NaClBehandlung, one-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test (Resorptionen) und Fisher´s exact-Test (Fehlbildungen)
67
Wahrscheinlichkeit für Exenzephalie (%)
4-
Ergebnisse
99,9
NMRI, S-Pentyl-4-yn
C57BL/6J, S-Pentyl-4-yn
NMRI, VPA
C57BL/6J, VPA
99
90
70
TeraD50
50
30
10
1
log Dosis (mmol/kg)
0,1
Wahrscheinlichkeit für Embryoletalität (%)
0,6
0,8
1
1,2
1,5
2
3
4
99,9
99
90
70
EmbryoLD50
50
30
10
1
log Dosis (mmol/kg)
0,1
0,6
0,8
1
1,2
1,5
2
3
4
Abb. 4.3 und 4.4: Darstellung der TeraD50 und der EmbryoLD50 im Wahrscheinlichkeitsnetz.
Zur Berechnung der mittleren letalen Dosis für den implantierten Embryo (EmbryoLD50) und
der mittleren teratogenen Dosis für den lebenden Feten (TeraD50) nach Litchfield & Wilcoxon
(1949) wurden die Werte der Tabellen 4.2 und 4.3 verwendet.
68
Dosis (mmol/kg)
4-
Ergebnisse
10
3
2.77
TeraD50
8.89
EmbryoLD50
9.10
8
2
6
1.46
4.28
1.16
4
2.97
1
0.66
0
Hsd:Win NMRI
S-Pentyl-4-yn
2
0
C57BL/6
S-pentyl-4-yn
Hsd:Win NMRI
VPA
C57BL/6
VPA
Wahrscheinlichkeit für Neurotoxizität (%)
Abb. 4.5: Vergleich der TeraD50 und EmbryoLD50 nach VPA- und S-Pentyl-4-yn Behandlung.
Die angegebenen Dosierungen entsprechen den Berechnungen aus den Abb. 4.3 und 4.4.
99,9
99
S-Pentyl-4-yn
VPA
90
70
50
30
10
1
0,1
0,8
1 1,2 1,5
2
3
log Dosis (mmol/kg)
Abb. 4.6: Neurotoxizität von S-Pentyl-4-yn und VPA in der adulten C57BL/6J-Maus im Rotarod-Toxizitätstest (n= 6).
TD50-S-Pentyl-4-yn: 1,0 mmol/kg
TD50-VPA: 2,0 mmol/kg ( Gemessener Effekt bei einer Dosierung von 1,5 mmol VPA/kg:
0%, erwarteter Effekt: 49%, korrigierter Effekt 10,5%)
69
4-
4.1.3-
Ergebnisse
Embryonalentwicklung C57BL/6J im Vergleich zu Hsd:Win NMRI
Die teratogene Wirkung der VPA-Derivate ist abhängig von der sensiblen Phase im Neuralrohrschluß. Eine Variation von 12 Stunden in der Exposition der Feten führt zu signifikanten
Veränderungen der Exenzephalierate (Nau, 1985). Die Vergleichbarkeit zwischen zwei Mäusestämmen ist nur gewährleistet, wenn die Exposition der Feten während der gleichen Entwicklungsstufe erfolgt. Die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung wurde durch die
Zählung von Somitenpaaren an E 8,25 und E 9,0 verglichen. Für beide Zeitpunkte sind die
Anzahl der Somitenpaare von mindestens 27 Embryonen (6 Muttertiere) in Abb. 4.7 gezeigt.
Die Anzahl der Somitenpaare zeigte im untersuchten Zeitraum keine signifikanten Unterschiede; die Embryonen waren zum Behandlungszeitraum durchschnittlich in der gleichen
Entwicklungsstufe. Die unterschiedliche Empfindlichkeit von NMRI und C57BL/6J auf die
teratogenen Effekte von VPA und S-Pentyl-4-yn beruhten daher nicht auf einer abweichenden
Embryonalentwicklung; durch die Behandlung an Tag 8,25 der Trächtigkeit wurde in beiden
Mäusestämmen durchschnittlich die gleiche Entwicklungsphase beeinflusst.
Hsd:Win NMRI
E 9,0 (n=27)
95. Perzentil
90. Perzentil
75. Perzentil
C57BL/6J
E 9,0 (n=29)
50. Perzentil
Hsd:Win NMRI
E 8,5 (n=33)
25. Perzentil
10. Perzentil
5. Perzentil
C57BL/6J
E 8,5 (n=32)
Somitenpaare
Somiten (Anzahl)(n)
0
2
4
6
C57BL/6J
Hsd:Win NMRI
8
10
12
14
16
18
20
Somitenpaare E 8,5(1)
7,0 ± 1,2
6,9 ± 1,1
Somitenpaare E 9,0(1)
12,0 ± 1,6
13,5 ± 1,6
(1): Anzahl, Mittelwert ± Standardabweichung
Abb. 4.7: Anzahl Somitenpaare von C57BL/6J- und NMRI-Embryonen an E 8,5 und E 9,0.
Die Darstellung in Boxplots zeigt die Verteilung der Werte vom 5. bis zum 95. Perzentil. Der
Vergleich der Anzahl von Somitenpaaren zwischen NMRI und C57BL/6J zum gleichen Entwicklungszeitpunkt zeigte keine signifikanten Unterschiede (Student´s t-test, p< 0,05).
70
4-
4.2-
Ergebnisse
Zyklusdiagnostik bei ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV (+/+)
Eine methodische Voraussetzung für reproduktionstoxikologische Studien ist die Arbeit mit
zeitlich terminiert trächtigen Tieren. Nach eigenen Beobachtungen wurden die ST8SiaIV(-/-)
Mäuse im Gegensatz zu ihren Kontrolltieren trotz erfolgter Verpaarung (vaginaler Plaque) in
einem Zeitfenster von 3 Stunden zumeist nicht tragend, wenngleich die Zuchtraten der
ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) ähnlich waren . Diese Beobachtung war der Grund für eine
Zyklusdiagnostik im Verpaarungszeitraum bei ST8SiaIV(-/-) und
(+/+)
Mäusen. 2 Gruppen von
jeweils 10 individuell markierten weiblichen ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) Mäusen wurden
dreimal im Abstand von 3-4 Tagen mit jeweils einem männlichen Tier für 3 Stunden am Ende
der Dunkelphase verpaart. Vorher wurde der Zyklusstand des weiblichen Tieres durch einen
Scheidenabstrich festgestellt, Mäuse mit einem vaginalen Plaque wurden nach der Verpaarung separiert und die Trächtigkeit an Tag 18 durch die Sektion überprüft.
Verpaarung
I
Verpaarung
II
10 ST8SiaIV(+/+), davon 1 mit vaginalem Plaque, im Östrus und tragend
10 ST8SiaIV(-/-), davon 2 mit vaginalem Plaque, beide nicht im Östrus und
nicht tragend
9 ST8SiaIV(+/+), davon 2 mit vaginalem Plaque, beide im Östrus und tragend
8 ST8SiaIV(-/-), davon 3 mit vaginalem Plaque, alle 3 nicht im Östrus und
nicht tragend
Verpaarung 7 ST8SiaIV(+/+), davon 2 mit vaginalem Plaque, beide im Östrus und tragend
III
5 ST8SiaIV(-/-), davon 3 mit vaginalem Plaque, alle 3 nicht im Östrus und
nicht tragend
Bei insgesamt 3 Verpaarungen von 5 - 10 ST8SiaIV(-/-) Mäusen wurden 8 Tiere mit vaginalem
Plaque separiert. Keines dieser 8 Tiere war während der Verpaarung im Östrus und keines
war trächtig. Dieses abnorme Paarungsverhalten ist wahrscheinlich die Ursache für die große
Anzahl nicht-trächtiger Weibchen trotz erfolgter Verpaarung. Das Verhalten der ST8SiaIV(+/+)
Mäuse erscheint hingegen ohne Abweichungen. In den weiteren reproduktionstoxikologischen Untersuchungen wurde durch eine hormonelle Zyklussynchronisation die Befruchtung
der ST8SiaIV(-/-) Mäuse sichergestellt.
71
4-
4.3-
Ergebnisse
Embryonalentwicklung der ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) Maus
Die Untersuchung der Embryonalentwicklung im Vergleich verschiedener Mausstämme diente einerseits zur Phänotypisierung der knockout-Mäuse im Vergleich zum Wildtyp, andererseits war der Vergleich zur NMRI-Maus notwendig, um eine Exposition der Embryonen während der sensiblen Phase des cranialen Neuralrohrschlusses sicherzustellen.
4.3.1-
Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung
Die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung von knockout-Tieren und Kontrolltieren im
Vergleich zur NMRI-Maus wurde durch die Zählung von Somitenpaaren an E 8,25, E 8,5 und
E 9,0 untersucht. Die Abb. 4.8 und 4.9 zeigen Embryonen an E 8,5 und E 9,0, die Somiten
sind paarig als würfelartige Strukturen beidseitig des Neuralrohres angelegt. (A) und (B) aus
Abb. 4.9 verdeutlichen, dass die gleiche Somitenzahl mit dem Schluß des Neuralrohres in
gleicher Geschwindigkeit einherging. Die mittlere Anzahl der Somitenpaare unterschied sich
zu keinem der untersuchten Zeitpunkte signifikant zwischen den Gruppen (Abb. 4.10), d.h.
die Embryonalentwicklung lief bei NMRI, ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) in der gleichen
Geschwindigkeit ab. Die Abb. 4.9 C zeigt einen ST8SiaIV(-/-) Embryo während der für die
Embryonalentwicklung der Nagetiere typischen Körperachsendrehung. Dieses morphologische Kennzeichen trat in seiner Häufigkeit in allen untersuchten Gruppen ohne signifikante
Unterschiede auf.
___________________________________________________________________________
Abb. nächste Seite, oben:
Abb 4.8: Embryonen an Tag 9,0 der Entwicklung.
Native Präparate in physiolog. NaCl-Lösung, Maßstab: 500 µm,
(A) ST8SiaIV(+/+), 15 Somiten (B) ST8SiaIV(-/-), 16 Somiten
*: erster und letzter Somit
av: Auditorischer Vesikel, H:Herz, Ms: Mesencephalon, P: Prosencephalon, R: Rhombencephalon
72
4-
Ergebnisse
Abb. 4.9: Embryonen an Tag 8,5 der Entwicklung.
(A) Hsd:Win NMRI (B) ST8SiaIV(+/+) (C)
ST8SiaIV(-/-). Native Präparate in physiolog.
NaCl-Lösung, Maßstab: 500µm.
*: erstes und letztes Somitenpaar, alle abgebildeten Embryonen haben 7 Somitenpaare,
x: Neuralrohrschluß
73
4-
Ergebnisse
NMRI, E 9,0
(-/-) E 9,0
(+/+) E 9,0
NMRI, E 8,5
(-/-) E 8,5
(+/+) E 8,5
95. Perzentil
90. Perzentil
NMRI, E 8,25
75. Perzentil
(-/-), E 8,25
50. Perzentil
25. Perzentil
(+/+), E 8,25
10. Perzentil
5. Perzentil
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Somitenpaare (Anzahl)
NMRI
(+/+)
(-/-)
E 8,25(1)
5,5 ± 0,9
5,7 ± 1,2
5,3 ± 1,0
E 8,5(1)
6,9 ± 1,1
7,0 ± 1,3
6,9 ± 1,4
(1): Anzahl Somitenpaare, Mittelwert ± Standardabweichung
E 9,0(1)
13,5 ± 2,0
13,4 ± 1,1
13,2 ± 2,4
Abb. 4.10: Anzahl Somitenpaare von ST8SiaIV(+/+), ST8SiaIV(-/-) und Hsd:Win NMRI- an den
Tagen 8,25, 8,5 und 9,0 der Entwicklung.
Die Boxplot Grafiken zeigen die Verteilung der Werte vom 5. bis zum 95. Perzentil. Der Vergleich der Anzahl der Somitenpaare zum gleichen Entwicklungszeitpunkt zeigt keine signifikanten Unterschiede zur Hsd:Win NMRI-Maus und zwischen ST8SiaIV(+/+) und (-/-) (Student´s t-test mit Bonferroni-Anpassung, p<0,05). Die Werte für NMRI an den Tagen E 8,5
und E 9,0 sind bereits in Abb. 4.7 gezeigt und werden zur Veranschaulichung wiederholt.
74
4-
4.3.2-
Ergebnisse
ImmunhistochemischeDarstellung der Expression von PSA und NCAM
Die immunhistochemische Studie der NCAM- und PSA-Expression sollte die Effekte des
ST8SiaIV-knockouts darstellen und zur Charakterisierung dieser Zielstrukturen auf Proteinbzw. Kohlenhydratebene während der Embryonalentwicklung der Maus beitragen. Die Ergebnisse beruhen auf mindestens 3 Embryonen, die je Entwicklungszeitpunkt für die
ST8SiaIV(+/+) und
(-/-)
Maus präpariert wurden. Die Negativkontrollen der DAB-Färbungen
sind in Abb. 4.15 B und D für die PSA-Färbung und in Abb. 4.16 C für die NCAM-Färbung
gezeigt.
Der erste untersuchte Zeitpunkt war Tag 8,5 der Entwicklung. In diesem Stadium waren
NCAM und PSA in den Neuralfalten der Gehirnanlage und des Rumpfes, in den Neuralleistenzellen und schwach im mesodermalen Gewebe zu finden. NCAM und PSA waren immer gemeinsam in den Geweben vorhanden, die Intensität der Färbung war jedoch unterschiedlich (Abb. 4.11 A+B). ST8SiaIV(-/-) Embryonen synthetisierten an Tag 8,5 der Entwicklung keine PSA, der Verlust der Polysialyltransferase hatte also den Verlust der PSA zur Folge. Die Abb. 4.13 A+B zeigen detailliert die Neuralfalten im Bereich der Gehirnentwicklung
an Tag 8,5.
12 Stunden später wurde in der knockout-Maus eine schwache PSA-Färbung sichtbar. Das
Kohlenhydrat war vereinzelt in den Somiten, der Gehirnanlage und dem Neuralrohr nachzuweisen (Abb. 4.12 C, Abb. 4.13 C). Die NCAM-Expression in (+/+) und (-/-) war deutlich
über den gesamten Embryo verteilt, besondere Intensität zeigten Gehirnanlage, späteres Rückenmark und die Somiten (Abb. 4.12 B+D). Die PSA war in (+/+) ebenso wie das NCAM
verteilt, die Abb. 4.13 C fokussiert die PSA-Expression im Neuroektoderm.
Mit dem Tag 10,0 der Entwicklung hatte sich die PSA-Expression in der (-/-) Maus in ihrer
Verteilung den Kontrolltieren angeglichen und erschien in der Ausprägung sogar intensiver
als in der (+/+) Maus. Alle Gehirnbereiche und das Rückenmark waren in beiden Gruppen
deutlich PSA-positiv, die deutlichste Färbung trat um die Ventrikel und den späteren Canalis
spinalis auf (Abb. 4.14 A+C). Ebenso wie im späteren ZNS beschränkte sich auch in den Somiten der PSA-Nachweis auf den extrazellulären Raum (Abb. 4.14 D). Im direkten Vergleich
der Abb. 4.14 B und C sind die Parallelen zwischen PSA- und NCAM–Verteilung deutlich
sichtbar; die Abbildungen zeigen jedoch auch, dass das Herz NCAM-positiv, aber PSAnegativ ist.
75
4-
Ergebnisse
Die Herzentwicklung ist in Abb. 4.16 A und B im Detail dargestellt, die NCAM-Expression
während der Herzentwicklung erschien ab Tag 10,0 ohne PSA und war vorwiegend auf epitheloide Zellen der Trabekelstruktur beschränkt. Ein weiteres Gebiet von nichtpolysialyliertem NCAM waren vereinzelte, stark positive Zellen der oberen Hautschichten
(Abb. 4.16 D) und Epithelzellen in der Auskleidung der Aorta (ohne Abbildung).
Am Tag 12,0 der Entwicklung waren (+/+) und (-/-) Embryonen anhand der PSA- und
NCAM-Expression nicht mehr zu unterscheiden. Abb. 4.15 A zeigt repräsentativ die PSAExpression in der Gehirnentwicklung eines ST8SiaIV(+/+) Embryos an Tag 12,0. In der detaillierten Betrachtung wird das konzentrierte Auftreten der PSA im extrazellulären Bereich insbesondere um die Gehirnventrikel herum deutlich (Abb. 4.15 B). Die starke Reaktion in diesem Entwicklungsstadium des Gehirns entspricht den Erfahrungen von (Ong et al., 1998) und
wurde daher regelmäßig als Positivkontrolle für die PSA-Färbung genutzt.
Mit dem Verschwinden der Somiten wurden im lumbalen Rückenmark Faserstrukturen sichtbar, die an den Enden deutlich PSA-positiv reagierten (Abb. 4.17 A+B). Die Versilberungsreaktion zeigte, dass es sich bei den Fasern um Ausläufer von Zellen des Rückenmarks handelt
(Abb. 4.17 C). Aufgrund von Lage und Form der Zellen wurden die Faserstrukturen als Neuriten eingeordnet. Der NCAM-Nachweis der Neuriten war einheitlich positiv ohne eine Intensivierung der Endbereiche (Abb. 4.17 D). Eine funktionelle Einordnung der PSA-positiven
Neuriten war anhand der vorliegenden Daten nicht möglich.
76
4-
Ergebnisse
NCAM
ST8SiaIV(-/-)
ST8SiaIV(+/+)
PSA
caNR: caudales Neuralrohr, cNr: craniales Neuralrohr, Nl: Neuralleiste
Abb. 4.11: Expression von PSA und NCAM an Tag 8,5 der Entwicklung.
(A) ST8SiaIV(+/+) , transversal, PSA-Färbung (B) ST8SiaIV(+/+) , transversal, NCAM-Färbung
(C) ST8SiaIV(-/-) , transversal PSA-Färbung (D) ST8SiaIV(-/-), Gehirnentwicklung, horizontal,
NCAM-Färbung.
ST8SiaIV(-/-) Embryonen synthetisieren in dieser frühen Entwicklungsstufe keine PSA.
NCAM ist deutlich im (+/+) und (-/-) Embryo vorhanden. Die PSA-Synthese im (+/+) Embryo folgt der NCAM-Verteilung.
77
4-
Ergebnisse
NCAM
ST8SiaIV(-/-)
ST8SiaIV(+/+)
PSA
G: Gehirn, H: Herz, Sf: Schwanzfortsatz, S: Somiten
Abb. 4.12: Expression von PSA und NCAM an Tag 9,0 der Entwicklung.
(A) ST8SiaIV(+/+), sagittal, PSA-Färbung (B) ST8SiaIV(+/+), sagittal, NCAM-Färbung (C)
ST8SiaIV(-/-), sagittal, PSA-Färbung (D) ST8SiaIV(-/-), sagittal, NCAM-Färbung.
NCAM wird deutlich im gesamten Embryo exprimiert, der intensive Nachweis im Neuroektoderm „umrandet“ die Entwicklung von Gehirn und Rückenmark (B+D). PSA wird im gesamten (+/+) Embryo nachgewiesen, im (-/-) Embryo ist ein schwacher PSA-Nachweis einzelner Zellen der Somiten, der Gehirnentwicklung und im Neuralrohr des Schwanzfortsatzes
zu erkennen.
78
4-
Ergebnisse
Abb. 4.13: Details der PSA-Expression an Tag 8 und 9 der Entwicklung.
(A) ST8SiaIV(+/+), Neuralfalten der Gehirnentwicklung transversal, E8 (B) ST8SiaIV(-/-), Neuralfalten der Gehirnentwicklung transversal, E8 (C) ST8SiaIV(+/+), Neuroektoderm des
Schwanzfortsatzes sagittal, E9 (D) ST8SiaIV(-/-), Somiten sagittal, E9.
PSA wird während des cranialen Neuralrohrschlusses stark in den Neuralfalten exprimiert.
Auffallend ist, dass die PSA im Kontaktbereich der Neuralfalten deutlich schwächer auftritt
als in den „offenen“ Bereichen (A). In der knockout-Maus zeigen die Neuralfalten bei normaler Form, Faltung und Funktion keine PSA während des Neuralrohrschlusses (B). Die PSA ist
im frühen (+/+) Embryo am stärksten im Neuroektoderm vorhanden (C). Bild C zeigt ebenfalls die Reaktion von Blasten im Blut. Der knockout Embryo beginnt an E9 mit einer leichten PSA-Synthese, Bild D verdeutlicht die Expression im Bereich der Somiten.
79
4-
Ergebnisse
aV: auditorischer Vesikel,
H: Herz
Ms/Mt: Mesencephalon/Metencephalon
My: Myelencephalon,
Sf: Schwanzfortsatz
T: Telencephalon
Abb. 4.14: Expression von PSA und NCAM an Tag 10,0 der Entwicklung.
(A) ST8SiaIV(+/+), sagittal, PSA-Färbung (B) ST8SiaIV(-/-), sagittal, NCAM-Färbung (C)
ST8SiaIV(-/-), sagittal, PSA-Färbung (D) Detail der Somiten aus (C), PSA-Färbung.
An Tag 10,0 ist die PSA im (+/+) und (-/-) Embryo insbesondere in ektodermalen Geweben
(ZNS-Entwicklung) und in den Somiten stark exprimiert. Die NCAM-Verteilung entspricht
weitgehend dem PSA-Muster, eine Ausnahme bildet der Herzmuskel (Vergleich von B+C).
80
4-
Ergebnisse
D: Diencephalon,
Ms/Mt: Mesencephalon/Metencephalon,
My: Myelencephalon,
T: Telencephalon,
3. und 4.V: 3. und 4. Ventrikel
Abb. 4.15: Expression von PSA an Tag 12 der Entwicklung und Negativkontrollen der PSAFärbung.
(A) ST8SiaIV(+/+), Kopf sagittal, PSA-Färbung (B) Wand des 4.Ventrikels/ Entwicklung des
Mittelhirns, PSA-Färbung (C) ST8SiaIV(+/+), Kopf sagittal, PSA-Färbung nach Vorbehandlung mit EndoNF zum enzymatischen Abbau der PSA (D) Wand des 4. Ventrikel/Entwicklung
des Mittelhirns, Färbung ohne spezifischen ersten Antikörper.
PSA ist deutlich am Ende der Embryonalphase in der Gehirnentwicklung nachzuweisen (A),
wie in (B) verdeutlicht beschränkt sich der Nachweis auf extrazelluläre Bereiche. Die Entfernung der PSA reduziert die DAB-Reaktion auf die unspezifische Färbung des Gewebes (C),
ohne spezifischen Antikörper wird die Färbungsreaktion vollständig beseitigt (D).
81
4-
Ergebnisse
Abb. 4.16: Details und Negativkontrolle der NCAM-Färbung.
(A) ST8SiaIV(+/+), Herz sagittal, E 11.0, NCAMFärbung (B) Herztrabekel und Blasten der
Blutzellen, Detail aus (A), NCAM-Färbung (C) ST8SiaIV(+/+), Herz sagittal, E11.0, Färbung
ohne spezifischen ersten Antikörper (D) ST8SiaIV(+/+), Haut im Gesichtsbereich sagittal, E
12.0, NCAM-Färbung.
Die Abb. A, B und D zeigen Bereiche der NCAM-Expression in Abwesenheit von PSA. Die
NCAM-Expression in der Herzentwicklung ist vorwiegend auf epitheloide Zellen der Trabekel beschränkt (A+B). Vereinzelte, stark positive Zellen der Haut sind in den obersten Hautschichten konzentriert (D). Die DAB-Reaktion ohne spezifischen ersten Antikörper zeigt eine
leichte Färbung von Blasten der Blutzellen und keine Färbereaktion des Gewebes (C).
82
4-
Ergebnisse
C
Abb.4.17: PSA- und NCAM-Expression in Neuriten des Rückenmarks.
A-D: Rückenmark lumbal sagittal (A + B) ST8SiaIV(+/+), E 11,0, PSA-Färbung (C)
ST8SiaIV(+/+), Versilberung (D) ST8SiaIV(+/+), NCAM-Färbung.
Im Bereich der späteren Lendenwirbelsäule erscheinen nach dem Verschwinden der Somiten
faserartige Strukturen mit starker PSA-Reaktivität an den Enden (A+B). Durch Versilberung
lassen sich die Strukturen als Ausläufer von embryonalen Neuroblasten einordnen (C). Die
Strukturen erscheinen homogen NCAM-positiv ohne verstärkte Expression an den Enden (D).
83
4-
4.3.3-
Ergebnisse
Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV und NCAM auf mRNA-Ebene
Im vorangegangenen Abschnitt wurden die Auswirkungen der Inaktivierung des ST8SiaIVGens auf die Synthese von NCAM und PSA beschrieben. Um die beobachteten Effekte in
Korrelation zur Expression der Gene zu bringen, wurde eine quantitative Expressionsanalyse
angeschlossen. In dieser Studie wurden die mRNA-Level für NCAM, ST8SiaII und ST8SiaIV
bestimmt. Die Untersuchung umfasste vergleichend den ST8SiaIV-knockout und Wildtyp.
Die in diesem Abschnitt vorgestellten Daten beruhen auf jeweils 3 Embryonen je Versuchsgruppe. Die RNA wurde aus den Gesamtembryonen isoliert, und in cDNA umgeschrieben..
Jeder Meßwert wurde mindestens doppelt meistens jedoch dreifach bestimmt. Die Ct-Werte
für die Messungen sind im Anhang unter Abschnitt 9.4 zu finden.
Begleitend zu jeder Messung wurde eine Kontrolle ohne Template (=NTC) untersucht, in
einigen Messungen wurde zusätzlich die korrekte cDNA-Synthese durch Kontrollen ohne
reverse Transkriptase (-RT) gesichert. Die Abb. 4.21 und 4.22 zeigen repräsentativ die Amplifikationen der Negativkontrollen. In beiden Abbildungen sind falsch-positive Fluoreszenssignale von Primerdimeren zu erkennen. Die Trennung dieser Produkte in einem hochauflösenden Acrylamidgel (Abb. 4.20) ließ die eindeutige Identifizierung der Primerdimere zu und
bewies damit kontaminationsfreie Durchführung der Studie.
Der erste untersuchte Zeitpunkt war analog zur Immunhistochemie der Tag 8,5 der Entwicklung. Die Abb. 4.18 und 4.19 zeigen repräsentativ die Amplifikation von NCAM, ST8SiaII
und ST8SiaIV an diesem Tag in einer ST8SiaIV(+/+) und -(-/-) Maus. Die Abbildungen verdeutlichen die ähnliche Expression von ST8SiaII und NCAM im Verhältnis zur endogenen Kontrolle. Das ST8SiaIV-Gen wurde in der knockout-Maus nicht exprimiert und die Abb. 4.20
Bande 2b zeigt deutlich, dass es sich bei dem Fluoreszenssignal aus Abb. 4.19 Nr. b um ein
Primerdimer handelt. Die weiteren Fluoreszenssignale der beiden Amplifikationskurven werden in der Abb. 4.20 als richtige PCR-Produkte indentifiziert. Zur Kontrolle eventueller Kontaminationen oder Verwechslungen wurde das ST8SiaIV-Gen in den Embryonen der
ST8SiaIV(-/-) Tiere in mindestens einer Wiederholung bestimmt. Keine dieser Proben zeigte
ein Signal (ohne Abbildung).
Die Abb. 4.23 und 4.24 zeigen an 2 repräsentativen Proben die Expression der 3 Zielgene am
Tag 10 der Entwicklung. Im Vergleich zu den Amplifikationen an Tag 8,5 fällt auf, dass die
Expression aller untersuchten Gene relativ zur HPRT-Expression stärker wird. Während an
84
4-
Ergebnisse
Tag 8,5 das HPRT-Gen die stärkste Expression zeigte, so war an Tag 10,0 das NCAM-Signal
früher oder gleichzeitig zu detektieren. Alle PCR-Produkte der Amplifikationen sind in Abb.
4.25 und 4.26 identifiziert.
Die Expression der ST8SiaII wird isoliert im Zeitverlauf von Tag 8,5 bis Tag 10,0 in Abb.
4.27 dargestellt. Sowohl in der ST8SiaIV(+/+) als auch in der ST8SiaIV (-/-) Maus nahm die
Expression während der Embryonalentwicklung zu. Trotz der Abwesenheit der PSA an Tag
8,5 in der knockout-Maus (siehe Abschnitt 4.3.2) war eine Polysialyltransferase zu diesem
frühen Zeitpunkt vorhanden. An Tag 10,0 der Entwicklung war die ST8SiaII in der knockoutMaus signifikant schwächer exprimiert als in den Kontrolltieren.
Analolg zur ST8SiaII-Expression nahm auch die Menge der NCAM-mRNA von Tag 8,5 bis
Tag 10,0 der Entwicklung zu (Abb. 4.28). Tendenziell war NCAM in der ST8SiaIV(-/-)-Maus
schwächer exprimiert als in den Kontrolltieren, diese Tendenz war allerdings erst an Tag 10,0
der Entwicklung signifikant. Die ST8SiaIV-Expression stieg in den Kontrolltieren innerhalb
von 12 Stunden von Tag 8,5 bis Tag 9,0 der Entwicklung um das dreifache an (Abb. 4.29).
Dieser Anstieg setzte sich zwischen Tag 9,0 und Tag 10,0 nicht weiter fort.
85
4-
Ergebnisse
Abb. 4.18- 4.20:
a= ST8SiaII
b= ST8SiaIV
c= HPRT
d= NCAM
Abb. 4.18:
Amplifikation
von
cDNA eines 8,5 Tage
alten
ST8SiaIV(+/+)Embryos.
∆Ct(ST8SiaII): -4,7
∆Ct(ST8SiaIV): -3,5
∆Ct(NCAM): -2,3
Abb. 4.19:
Amplifikation
von
cDNA eines 8,5 Tage
alten
ST8SiaIV(-/-)Embryos.
∆Ct(ST8SiaII): -3,9
∆Ct(ST8SiaIV): ⎯
∆Ct(NCAM): -1,2
Abb. 4.20:
PCR-Produkte der Amplifikationskurven 4.18- 4.19
und 4.21- 4.22.
(bp)
⎯104
⎯89
⎯80
⎯64
⎯57
⎯51
1 a-d= Abb.4.18 (ST8SiaIV(+/+))
2 a-d= Abb. 4.19 (ST8SiaIV(-/-))
3 a-c= Abb. 4.21 (NTC)
4 a-d= Abb. 4.22 (-RT)
m: Marker
n: Negativkontrolle (TE-Puffer)
86
4-
Ergebnisse
Abb. 4.21- 4.22:
a= ST8SiaII
b= ST8SiaIV
c= HPRT
d= NCAM
Abb. 4.21: Negativkontrolle ohne Template (= NTC).
Die repräsentative NT-Kontrolle zeigt, daß durch die Entstehung von Primerdimeren falsche
Signale entstehen können. Kurve b gibt ein relativ starkes Signal und zeigt einen partiell exponentiellen Verlauf, die Gelelektrophorese verdeutlicht jedoch, daß das Signal nicht von
einem Template stammt (Abb. 4.20, Bandennr. 3b).
Ct-Werte: ST8SiaII= 35,5; ST8SiaIV= 33,0; HPRT= kein Signal; NCAM= 36,0
Abb. 4.22: Negativkontrolle ohne reverse Transkriptase in der Erstellung der cDNA (-RT).
Ebenso wie in der Kontrolle aus Abb. 4.21 entstehen bei –RT-Kontrollen falsche Signale
durch Primerdimere. In dem hier gezeigten Kurvenverlauf entspricht das Signal der
ST8SiaIV-Amplifikation der Bandennr. 4b aus Abb. 4.20. Der Schmierfilm im unteren Bereich des Acrylamidgels zeigt die Entstehung von Primerdimeren und beweist eine korrekte
Negativkontrolle für die cDNA-Erstellung.
Ct-Werte: ST8SiaII= 36,2; ST8SiaIV= 33,3; HPRT= 36,9; NCAM= kein Signal
87
4-
Ergebnisse
Abb. 4.23- 4.26:
a= ST8SiaII
b= ST8SiaIV
c= HPRT
d= NCAM
Abb. 4.23:
Amplifikation von cDNA
eines 10 Tage alten
ST8SiaIV(+/+)-Embryos.
∆Ct(ST8SiaII)= -2,8
∆Ct(ST8SiaIV)= -1,2
∆Ct(NCAM)= 0,6
Abb. 4.24:
Amplifikation von cDNA
eines 10 Tage alten
ST8SiaIV(-/-)-Embryos.
∆Ct(ST8SiaII)= -2,5
∆Ct(ST8SiaIV)= /
∆Ct(NCAM)= -1,0
Abb. 4.25:
PCR-Produkte der
Amplifikation aus
Abb. 4.23.
Abb. 4.26:
PCR-Produkte der
Amplifikation aus
Abb. 4.24.
(bp)
104⎯
89 ⎯
80 ⎯
64 ⎯
57 ⎯
51 ⎯
m= Marker
n= Negativkontrolle
88
4-
Ergebnisse
0
-1
delta
Ct
∆ Ct-Wert
-2
-3
*
-4
-5
-6
(-/-)
(+/+)
-7
E 8,5
E 9,0
E 10,0 Tag der Embryonalentwicklung
Abb. 4.27: Expression von ST8SiaII in ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/+) (M. ± S.D.).
Das ST8SiaII-Enzym wird von Tag 8,5 bis Tag 10,0 der Entwicklung in beiden Mäusestämmen zunehmend stärker exprimiert. An Tag 10 der Entwicklung ist ST8SiaII in den knockoutTieren allerdings signifikant geringer exprimiert als in den Kontrolltieren (*: Student´s t-test,
p< 0,05, n= 3).
3
2
delta Ct
∆ Ct-Wert
1
*
0
-1
-2
(-/-)
(+/+)
-3
-4
E 8,5
E 10,0 Tag der Embryonalentwicklung
E 9,0
Abb. 4.28: Expression von NCAM in ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/+) (M. ± S.D.).
Ebenso wie das ST8SiaII-Gen, nimmt auch die Expression des NCAM von Tag 8,5 bis Tag
10,0 der Entwicklung in beiden Mäusestämmen zu. Der Anstieg ist in (+/+)-Mäusen stärker
als in (-/-) und unterscheidet sich an Tag 10 der Entwicklung signifikant von den Kontrolltieren (*: Student´s t-test, p< 0,05, n= 3).
89
4-
Ergebnisse
0
delta Ct
∆ Ct-Wert
-1
*
-2
*
-3
-4
E 8,5
E 9,0
E 10,0 Tag der Entwicklung
Abb. 4.29: Expression von ST8SiaIV in der frühen Embryonalentwicklung der Maus (M. ±
S.D.) Innerhalb von 12 Stunden zwischen Tag 8,5 und Tag 9,0 verdreifacht sich die Expression des ST8SiaIV in den (+/+) Kontrolltieren (*: Student´s t-test im Vgl. zu Tag 8,5, p< 0,05,
n= 3).
4.4-
ST8SiaIV(-/-) im Exenzephaliemodell
Im vorherigen Abschnitt wurde gezeigt, dass die ST8SiaIV(-/-) Maus an Tag 8,5 der Embryonalentwicklung ausschließlich die nicht-polysialylierte Form des NCAM exprimierte. Bei
einer Behandlung im Rahmen des Exenzephaliemodells an Tag 8,25 beeinflusste das Teratogen demzufolge einen embryonalen Organismus ohne PSA.
4.4.1-
Teratogene Effekte und Neurotoxizität
Die Induktion von Exenzephalie bei den Nachkommen der ST8SiaIV(-/-) Maus erfolgte im
Vergleich zu Mäusen des gleichen genetischen Hintergrundes. Wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, war durch das abweichende Paarungsverhalten der knockout-Mäuse eine hormonelle
Zyklussynchronisation der Tiere mit PMSG und HCG vor der Verpaarung erforderlich. Die
Effekte der Synchronisation auf die Nachkommen sind für ST8SiaIV(+/+) in Tabelle 4.4 gezeigt. Im Vergleich zu nicht-synchronisierten Tieren traten nach Hormonbehandlung ohne
Zusatzbehandlung (NaCl) keine vermehrten Fehlbildungen und keine spontanen Exenzepha-
90
4-
Ergebnisse
lien auf. Nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn wurden in synchronisierten und nichtsynchronisierten Tieren durchschnittlich gleich viele Exenzephalien der Nachkommen beobachtet. Ein deutlicher Effekt war für das Gewicht der Feten festzustellen. Die Feten synchronisierter Weibchen waren signifikant leichter. Dieser Effekt war unter S-Pentyl-4-yn Behandlung jedoch nicht zu beobachten. Auch die Resorptionsrate nach hormoneller Vorbehandlung
war in einer Behandlungsgruppe signifikant erhöht. Die durchschnittliche Empfindlichkeit des
gemischten genetischen Hintergrundes von knockout- und Kontrollmäusen lag bei einem TeraD50 von 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg und damit zwischen der Empfindlichkeit von C57BL/6J
und Hsd:Win NMRI. Abb. 4.30 zeigt die Dosis-Wirkungsbeziehung im Vergleich zu NMRI;
aus dem nahezu parallelen Verlauf der Geraden konnte ein vergleichbarer Mechanismus gefolgert werden.
Im Vergleich von ST8SiaIV(+/+) zu ST8SiaIV(-/-) wird deutlich, dass die knockout Tiere in
ihrer
Reaktion
auf
die
teratogenen
Effekte
von
S-Pentyl-4-yn
keiner
Dosis-
Wirkungsbeziehung folgten. Die Exenzephalierate stieg bei Dosen von 0,6 und 0,8 mmol SPentyl-4-yn/kg in knockout- und Kontrolltieren leicht an und verblieb in den knockout- Tieren bei ca. 16- 17%, während bis zu 62% der Kontrolltiere in hohen Dosisbereichen eine Exenzephalie entwickelten (Abb. 4.31). Die Fetalgewichte waren in beiden Gruppen im Vergleich zur NaCl-Kontrolle signifikant reduziert, die Resorptionsraten waren jedoch nicht verändert. Die niedrige Exenzephalierate der knockout-Tiere war nicht abhängig von einer erhöhten Embryoletalität (Tabellen 4.4 und 4.5).
Die Arbeit mit homozygoten Zuchtlinien ermöglichte eine gezielte Verpaarung der Elterntiere, um heterozygote Embryonen zu erhalten. Tabelle 4.6 verdeutlicht, dass maternale und paternale Effekte keinen Einfluß auf Exenzephalierate, Embryoletalität und Reduktion des Fetalgewichtes hatten. ST8SiaIV(+/-) Embryonen zeigten einen sehr flachen Anstieg der DosisExenzephaliebeziehung und unterschieden sich in einer hohen Dosis von 1,5 mmol S-Pentyl4-yn /kg signifikant zu ST8SiaIV(+/+) (Abb. 4.31). Die Neurotoxizität im Rotarodtoxizitätstest
unterschied sich nicht zwischen adulten ST8SiaIV(+/+) und (-/-) Tieren, die TD50 Werte von ca.
1 mmol/kg verdeutlichten die relativ hohen Dosisbereiche im Exenzephaliemodell (Abb.
4.32). Die Tabelle 4.7 zeigt die teratogenen Effekte von VPA in (+/+) und (-/-) Embryonen.
Bei einer Dosis von 3 mmol/kg entwickelten 25% der (+/+) Tiere und 12% der (-/-) Tiere eine
Exenzephalie, der Effekt war jedoch nicht signifikant.
91
4-
Ergebnisse
Tabelle 4.4: ST8SiaIV(+/+) nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn und der Einfluß einer hormonellen Zyklussynchronisation im Exenzephaliemodell
Behandlung(1)
Würfe Lebende
(mmol/kg)
(n)
Feten (n) Gewicht(2) (g) (n)/(%)
NaCl (I)
7
43
0,81 ± 0,11
27/(39%)
0
NaCl (II)
6
34
0,80 ± 0,06
24/(41%)
0
NaCl
7
41
1,15 ± 0,07*
15/(27%)
0
0,6 S-Pentyl-4-yn 7
36
0,65 ± 0,05
22/(38%)
4/(11%)
0,8 S-Pentyl-4-yn 6
40
0,62 ± 0,08*
26/(39%)
5/(13%)*
1,0 S-Pentyl-4-yn 7
26
0,8 ± 0,08
52/(67%)*
5/(19%)*
1,0 S-Pentyl-4-yn 6
30
1,10 ± 0,1*
13/(30%)*
5/(17%)
1,2 S-Pentyl-4-yn 6
32
0,57 ± 0,07*
37/(54%)
8/(25%)*
1,3 S-Pentyl-4-yn 6
32
0,72 ± 0,06*
17/(35%)
13/(41%)*
1,4 S-Pentyl-4-yn 7
38
0,67 ± 0,09*
20/(36%)
20/(53%)*
1,5 S-Pentyl-4-yn 6
35
0,62 ± 0,09 *
37/(51%)
21/(60%)*
26
0,63 ± 0,07*
33/(57%)
16/(62%)*
25
0,93 ± 0,13*
22/(47%)
10/(40%)
Fetales
Resorptionen(3) Exenzephalie(4)
(n)/(%)
nicht-synchronisiert
nicht-synchronisiert
(I)
1,5 S-Pentyl-4-yn 6
(II)
1,5 S-Pentyl-4-yn 7
nicht-synchronisiert
1: Applikation der angegebenen Dosis an Tag 8,25 der Trächtigkeit, die Behandlungen mit NaCl (Negativkontrolle) und mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn wurden unabhängig voneinander zweimal durchgeführt, 2: Mittelwert ± Standardabweichung, 3: % aller Implantationsstellen, 4: % aller lebenden Feten,
*: p< 0,05 im Vergleich zur NaCl-Behandlung, nicht-synchronisierte Tiere wurden mit synchronisierten Tieren der gleichen Behandlung verglichen. One-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test (Resorptionen), Fisher´s exact-Test (Exenzephalie).
Grau unterlegte Felder kennzeichnen Behandlungsgruppen ohne hormonelle Synchronisation.
92
4-
Ergebnisse
Tabelle 4.5: ST8SiaIV(-/-) nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn im Exenzephaliemodell
Behandlung(1)
Würfe Lebende
(mmol/kg)
(n)
Feten (n) Gewicht(2) (g)
NaCl (I)
10
38
NaCl (II)
5
0,6 S-Pentyl-4-yn
Fetales
Resorptionen(3) Exenzephalie(4)
(n)/(%)
(n)/(%)
0,77 ± 0,14
54/(59%)
0
23
0,73 ± 0,08
21/(48%)
0
6
32
0,59 ± 0,05
29/(47%)
3/(9%)
0,8 S-Pentyl-4-yn
6
31
0,51 ± 0,07*
36/(54%)
4/(13%)*
1,0 S-Pentyl-4-yn
7
35
0,67 ± 0,08*
31/(47%)
6/(17%)*
1,2 S-Pentyl-4-yn
6
20
0,56 ± 0,06*
46/(70%)
3/(15%)*
1,3 S-Pentyl-4-yn
7
37
0,67 ± 0,07*
25/(40%)
6/(16%)*
1,4 S-Pentyl-4-yn
6
29
0,64 ± 0,06*
25/(55%)
5/(17%)*
1,5 S-Pentyl-4-yn
8
19
0,59 ± 0,12*
52/(73%)
3/(16%)*
7
25
0,65 ± 0,08*
29/(54%)
3/(12%)*
(I)
1,5 S-Pentyl-4-yn
(II)
1: Applikation der angegebenen Dosis an Tag 8,25 der Trächtigkeit, die Behandlungen mit NaCl (Negativkontrolle) und mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn wurden unabhängig voneinander zweimal durchgeführt, 2: Mittelwert ± Standardabweichung, 3: % aller Implantationsstellen, 4: % aller lebenden Feten
*: p< 0,05 im Vergleich zur NaCl-Behandlung. One-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test und Fisher´s exact-Test (Resorptionen und Exenzephalie).
93
Wahrscheinlichkeit für Exenzephalie (%)
4-
Ergebnisse
99,9
Hsd:Win NMRI
St8SiaIV (+/+)
99
90
70
50
30
10
1
log Dosis (mmol/kg)
0,1
0,6
0,8
1
1,2
1,3 1,4 1,5
Abb.4.30: Darstellung der TeraD50 nach Litchfield & Wilcoxon von S-Pentyl-4-yn für
ST8SiaIV(+/+) im Vergleich zu Hsd:Win NMRI. Die Werte für NMRI sind bereits in Abb. 4.3
gezeigt und werden zur Veranschaulichung wiederholt.
Tabelle 4.6: ST8SiaIV(+/-) im Exenzephaliemodell, maternale und paternale Effekte.
Resorptionen(4) Exenzephalie(5)
(n)/(%)
(n)/(%)
Behandlung
(mmol/kg) (1)
♀/♂ Würfe Lebende Fetales
(2)
(n)
Feten
(n)
Gewicht
(g)
NaCl
+/-
6
37
0,64 ± 0,12
32/(46%)
0
NaCl
-/+
5
24
0,64 ± 0,06
20/(45%)
0
0,8 S-p.-4-yn
+/-
5
24
0,64 ± 0,14
14/(37%)
2/(8%)
0,8 S-p.-4-yn
-/+
4
17
0,66 ± 0,04
15/(48%)
2/(12%)
1,0 S-p.-4-yn
+/-
4
18
0,61 ± 0,04
17/(49%)
3/(17%)
1,0 S-p.-4-yn
-/+
5
25
0,65 ± 0,11
(3)
16/(42%)
4/(16%)
*
1,5 S-p.-4-yn
+/-
5
22
0,57 ± 0,06
21/(49%)
7/(32%)*
1,5 S-p.-4-yn
-/+
7
40
0,54 ± 0,15*
26/(39%)
11/(28%)*
1: Applikation der angegebenen Dosis an Tag 8,25 der Trächtigkeit, 2: (+/-) bezeichnet (+/+) Mutter
und (-/-) Vater, (-/+)bezeichnet (-/-) Mutter und (+/+) Vater, 3: Mittelwert ± Standardabweichung, 4:
% aller Implantationsstellen, 5: % aller lebenden Feten
*: p< 0,05 im Vergleich zu unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe, one-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test (Resorptionen), Fisher´s exact-Test (Exenzephalie), keine signifikanten Unterschiede
im Vergleich von (+/-) zu (-/+)
94
Exenzephalie (%)
4-
Ergebnisse
70
ST8SiaIV (+/+)
ST8SiaIV (-/-)
ST8SiaIV (+/-)
60
50
40
*
30
20
*
*
*
10
0
0,6
0,8
1
1,2
1,3 1,4 1,5
log Dosis (mmol/kg)
Abb. 4.31: Exenzephalie von ST8SiaIV(+/+), ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/-) nach Behandlung
mit S-Pentyl-4-yn. Die Daten der Grafik sind aus den Tabellen 4.4- 4.6 entnommen. Die Werte für die heterozygoten Tiere sind aus den jeweiligen Behandlungsgruppen der Tabelle 4.6
gepoolt.
*: Fisher´s exact Test, p< 0,05, im Vergleich zu ST8SiaIV(+/+) der gleichen Behandlung.
Tabelle 4.7: Behandlung von ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) mit 3 mmol VPA/kg an Tag
8,25 der Trächtigkeit
Würfe Lebende
Fetales Gewicht(1) Resorptionen(2) Exenzephalie(3)
(n)
Feten (n)
(g)
(n)/(%)
(n)/(%)
ST8SiaIV(+/+) 6
36
0,54 ± 0,15
32/(47%)
9/(25%)
ST8SiaIV(-/-)
25
0,65 ± 0,08
29/(54%)
3/(12%)
6
1: Mittelwert ± Standardabweichung, 2: % aller Implantationsstellen, 3: % aller lebenden Feten.
*: One-way ANOVA (Fetalgewicht), χ2-Test (Resorptionen), Fisher´s exact-Test (Exenzephalie) im
Vergleich von (+/+) zu (-/-).
95
Wahrscheinlichkeit für Neurotoxizität (%)
4-
99
ST8SiaIV
ST8Sia
IV(-/-)
(-/- )
TD 50: 0.95 mmol/kg
90
ST8SiaIV(+/+)
ST8Sia
IV (+/+)
TD 50: 1.05 mmol/kg
Ergebnisse
Abb. 4.32 Neurotoxizität
von
S-Pentyl-4-yn
in
(+/+)
und
ST8SiaIV
(-/-)
ST8SiaIV
im RotarodToxizitätstest (n= 10). Die
neurotoxische Wirkung der
Substanz
unterscheidet
sich nicht zwischen adulten ST8SiaIV(+/+) und
ST8SiaIV(-/-).
70
50
30
10
log Dosis (mmol/kg)
1
0,6
4.4.2-
1
1,2
Kontrolle der Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV und NCAM im ExenzephalieExperiment
Die Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV und NCAM wurde in behandelten und unbehandelten ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) Embryonen an den Tagen 8,5, 9,0 und 10,0 der Entwicklung untersucht. Behandlung bedeutet in diesem Zusammenhang die subkutane Behandlung
des Muttertieres mit 1,5 mmol S-Pentyl-4yn/kg an Tag 8,25 der Trächtigkeit. Als Kontrolle
wurden jeweils unbehandelte Tiere des gleichen Stammes eingesetzt, eine vergleichende Betrachtung erfolgte darüber hinaus zwischen behandelten ST8SiaIV(+/+) und (-/-) Tieren des gleichen Entwicklungszeitpunktes.
Die Abb. 4.33 beschreibt den Einfluß der Behandlung auf die Expression von NCAM. 6 Stunden nach der Behandlung (=E 8,5) war in keiner der untersuchten Gruppen eine signifikante
Veränderung der NCAM-Expression zu erkennen. Die NCAM-Expression variierte in den 3
untersuchten ST8SiaIV(+/+)-Embryonen nach Behandlung sehr stark, so daß keine Aussage zu
einem signifikanten Behandlungseffekt im Vergleich zu den knockout-Tieren möglich war.
18 Stunden nach der Behandlung (= E 9,0) war die NCAM-Expression in ST8SiaIV(+/+) Embryonen signifikant stärker als in den gleichermaßen behandelten knockout-Tieren. Dieser Effekt ist am Beispiel der HPRT- und NCAM-Amplifikation in 2 verschiedenen Embryonen in
Abb. 4.34 und 4.35 dargestellt. Zur Verdeutlichung der korrekten Amplifikation sind die
96
4-
Ergebnisse
PCR-Produkte in den Abb. 4.36 und 4.37 gezeigt. Ein signifikanter Effekt im Vergleich zu
den unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe konnte nicht festgestellt werden. 42 Stunden
nach der Behandlung (= E 10,0) gleichen sich die NCAM-mRNA Spiegel im Vergleich von
behandelten ST8SiaIV(+/+) und (-/-) Embryonen einander an, die NCAM-Expression war jedoch
in behandelten ST8SiaIV(+/+) Embryonen signifikant geringer als in unbehandelten (Abb.
4.33).
Wie die Abb. 4.38 veranschaulicht, zeigte die ST8SiaII kaum Reaktion auf die Behandlung.
Eine signifikant schwächere ST8SiaII-Expression zeigten die ST8SiaIV(+/+) Embryonen 42
Stunden nach der Behandlung im Vergleich zu unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe.
Die ST8SiaIV hingegen war in behandelten ST8SiaIV(+/+) Embryonen 18 Stunden nach Behandlung ca. dreifach niedriger exprimiert (= 1,5 Verdopplungzyklen) als in unbehandelten
Tieren der gleichen Gruppe. Dieser Effekt wurde ebenso 42 Stunden nach Behandlung beobachtet. (Abb. 4.39).
ST8SiaIV(+/+)
4
3
2
2
1
*
0
C We
3
-1
unbehandelt
behandelt
1
0
-1
-2
-2
-3
-3
-4
ST8SiaIV(-/-)
de
∆ Ct-Wert
4
8,5
9,0
-4
10,0
8,5
Tag der Embryonalentwicklung
(*)
9,0
10,0
Abb. 4.33: Expression von NCAM in ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) nach Behandlung mit
einer teratogenen Dosis S-pentyl-4-yn (M. ± S.D., n=3).
*: im Vgl. zu unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe, (*): Vgl. zwischen behandelten
ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-), Student´s t-test, p< 0,05.
97
4-
Ergebnisse
Abb. 4.34- 4.35:
c= HPRT
d= NCAM
Abb. 4.34:
Amplifikation von NCAM
und
HPRT
in
2
(+/+)
Embryonen an
ST8SiaIV
Tag 9,0 der Entwicklung
nach Behandlung mit einer
teratogenen Dosis S-Pentyl4-yn.
∆Ct(d1): 0,8; ∆Ct(d2): 0,4
Abb. 4.35:
Amplifikation von NCAM
und HPRT in 2 ST8SiaIV(-/-)
Embryonen an Tag 9,0 der
Entwicklung nach Behandlung mit einer teratogenen
Dosis S-Pentyl-4-yn.
∆Ct(d1): -2,8; ∆Ct(d2): -2,2
Abb. 4.36: PCR-Produkte der Amplifikationen aus Abb. 4.34
Abb. 4.37: PCR-Produkte der Amplifikationen
aus Abb. 4.35
(bp)
⎯ 104
⎯ 89
⎯ 80
⎯ 64
⎯ 57
(bp)
104 ⎯
89 ⎯
80 ⎯
64 ⎯
57 ⎯
98
4-
ST8SiaIV(+/+)
0
∆ Ct-Wert
Ergebnisse
ST8SiaIV(-/-)
0
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
*
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
8,5
9,0
-9
10,0
unbehandelt
behandelt
8,5
9,0
10,0
Tag der Embryonalentwicklung
Abb. 4.38: Expression von ST8SiaII in ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) Mäusen nach Behandlung mit einer teratogenen Dosis S-pentyl-4-yn im Vergleich zu nicht-exponierten Embryonen
(M. ± S.D., n=3). * Vgl. zu unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe, Student´s t-test, p<
0,05.
0
Ct
∆ delta
Ct-Wert
-1
-2
-3
*
*
-4
unbehandelt
behandelt
-5
8,5
9,0
10,0 Tag der Embryonalentwicklung
Abb. 4.39: Expression von ST8SiaIV in ST8SiaIV(+/+) Mäusen nach Behandlung mit einer
teratogenen Dosis S-Pentyl-4-yn im Vergleich zu nicht-exponierten Embryonen (M. ± S.D.,
n=3). * Vgl. zu unbehandelten Tieren der gleichen Gruppe, Student´s t-test, p< 0,05.
99
4-
Ergebnisse
4.4.3 Genotypisierung
Die Zucht von homozygoten ST8SiaIV(+/+) und
(-/-)
Tieren macht eine ständige Genotypisie-
rung der Embryonen überflüssig. Durch eine strenge Trennung in der Tierhaltung war während der gesamten Studienzeit sichergestellt, dass keine Verwechslung der Genotypen auftreten konnten. Dennoch wurden zur Überprüfung der Situation mehrfach erwachsene Tiere zufällig ausgewählt und der Genotyp aus einem Schwanzbioptat mittels PCR bestimmt. Die
Abb. 4.40 zeigt repräsentative Ergebnisse von 2 Genotypisierungen und bestätigt die Richtigkeit der obigen Aussage.
1000 bp
500 bp
1000 bp
500 bp
M: DNA-Marker, neg: Negativkontrolle ohne DNA
Abb. 4.40: Genotypisierung der Studientiere durch PCR.
Das obere Gelfoto zeigt die Typisierung zur Auswahl einiger Zuchttiere, die heterozygoten
Mäuse wurden daraufhin nicht zur Zucht eingesetzt. Das untere Foto zeigt eine zufällige
Stichprobe erwachsener Versuchstiere. Der erwartete Genotyp stimmt mit dem nachgewiesenen Genotyp überein. Größe der Amplifikate:(+/+): 533 bp, (+/-): 533 bp und 733 bp, (-/-):
733 bp
100
4-
4.5-
Ergebnisse
Gehirn- und Plasmakonzentrationen der S-Pentyl-4-Pentinsäure
Die beschriebenen teratogenen und toxischen Effekte sollten im Zusammenhang mit den
Wirkstoffkonzentrationen des S-Pentyl-4-yn in Plasma und Gehirn beurteilt werden können.
In Anlehnung an das konventionelle Exenzephaliemodell in der NMRI-Maus wurde die Kinetik des S-Pentyl-4-yn ebenfalls vergleichend in diesem Mäusestamm untersucht. Die Konzentrationsangaben in diesem Abschnitt bezeichnen stets den Mittelwert ± Standardabweichung. Die Abb. 4.41 zeigt, dass in der ST8SiaIV(-/-) Maus der Wirkstoffpeak (Cmax) im Plasma nach subkutaner Injektion nach 15- 30 Minuten erreicht wurde. Die Konzentration betrug
565 ± 9 µg/ml Plasma 15 Minuten nach s.c. Injektion und 577 ± 16 µg/ml Plasma 30 Minuten
nach s.c. Injektion in jeweils 3 weiblichen Tieren. Der Wirkstoffpeak im Gehirn war nach 1
Stunde erreicht und betrug 266 µg/g Gehirngewebe. Der Peak im Mittel des gesamten Gehirngewebes betrug damit über 50% des maximalen Plasmaspiegels. Im Verlauf der Metabolisierung und Exkretion fielen Plasma- und Gehirnspiegel in den folgenden Stunden stark ab,
12 Stunden nach der Verabreichung lag die Konzentrationen in beiden Matrices unter der Bestimmungsgrenze von 14 µg/ml. Die Abb. 4.42 stellt die Berechnung der Halbwertszeit (t1/2)
aus der Funktion einer linearen Regressionsgeraden dar. t1/2 von S-Pentyl-4-yn betrug im
Plasma 2,2 Stunden. Der Korrelationkoeffizient r2 betrug 0,98; unabhängig davon, ob der erste einbezogene Meßpunkt 565 µg/ml wie in Abb. 4.42 angewendet ist, oder ob die lineare
Regression ohne diesen Meßpunkt errechnet und 577 µg/ml als ersten Meßpunkt eingesetzt
wird (ohne Abbildung). Die Abb. 4.43 stellt vergleichend den Plasmaverlauf von S-Pentyl-4yn in ST8Sia(+/+) und NMRI in jeweils 3 weiblichen Tieren/ Meßpunkt dar. Die maximale
Konzentration im Plasma nach s.c. Injektion von 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg wurde in der
ST8Sia(+/+) Maus analog zur knockout-Maus nach 15 Minuten erreicht, Cmax war allerdings
niedriger und lag bei 439 ± 51 µg/ml. In der NMRI-Maus wurde ein höherer Cmax von 628 ±
49 µg/ml erreicht, die große Streuung der Werte in der Anflutungsphase erschwerte jedoch
die Bewertung. Cmax wurde in der NMRI-Maus ca. 15 Minuten später erreicht und die Konzentration im Plasma sank langsamer ab als in ST8SiaIV(+/+). Die Abb. 4.44 verdeutlicht die
Berechnung von t1/2 aus der Funktion einer linearen Regression. Analog zur Berechnung in
Abb. 4.42 wurde t1/2 aus dem Konzentrationsverlauf der Substanz im Plasma zwischen Cmax
und dem letzten Meßwert berechnet. t1/2 für S-Pentyl-4-yn betrug für NMRI 2,4 Stunden und
für ST8SiaIV(+/+) 1,8 Stunden. Die beschriebenen Werte der Plasmakinetik der S-Pentyl-4-yn
sind in Tab. 3.8 zusammengefaßt.
101
(µg/ml)
4-
Ergebnisse
600
Gehirn
Plasma
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
10 30
60
90
120
240
360
Zeit (Min.)
log Konz. (µg/ml Plasma)
Abb. 4.41: Gehirn- und Plasmaspiegel von S-Pentyl-4-yn in ST8SiaIV(-/-).
Subkutane Injektion von 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg zum Zeitpunkt 0, angegeben sind die
mittlere Konzentration ± Standardabweichung von 3 Tieren / Zeitpunkt. Ein weiterer Meßpunkt nach 12 Stunden ist nicht angegeben, da die Konzentrationen unter der Bestimmungsgrenze von 14 µg/ml liegen.
700
600
500
400
300
200
100
t1/2
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Zeit (Std.)
Abb. 4.42: Halbwertszeit von S-Pentyl-4-yn im Plasma der ST8SiaIV(-/-) Maus.
Zur Berechnung der Halbwertszeit werden die Plasmakonzentrationen von Cmax bis zum letzten Datenpunkt verwendet. Die Steigung der linearen Regression entspricht der Eliminationskonstanten k, damit gilt: c = c0 * exp(-k * t) und t1/2 = ln2 / k.
c0 = 683 µg/ml, k= 0,31, t1/2= 2,2 Stunden, r2= 0,98
102
Konz. (µg/ml Plasma)
4-
Ergebnisse
700
NMRI
600
ST8SiaIV(+/+)
500
400
300
200
100
0
15 30
60
120
240
Zeit (Min.)
log Konz. (µg/ml Plasma)
Abb. 4.43: Plasmaspiegel von S-Pentyl-4-yn in NMRI und ST8SiaIV(+/+).
Subkutane Injektion von 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg zum Zeitpunkt 0, angegeben sind die
mittlere Plasmakonzentration ± Standardabweichung von 3 weiblichen Tieren / Zeitpunkt.
800
700
NMRI
(+/+)
ST8SiaIV
St8SiaIV(+/+)
600
500
400
(2) t1/2
300
(1) t1/2
200
0 15 30
60
120
240
Zeit (Min.)
Abb. 4.44: Halbwertszeit von S-Pentyl-4-yn im Plasma von ST8SiaIV(+/+) und NMRI.
Zur Berechnung der Halbwertszeit werden die Plasmakonzentrationen von Cmax bis zum letzten Datenpunkt verwendet. Die Steigung der linearen Regression entspricht der Eliminationskonstanten k, damit gilt: c = c0 * exp(-k * t) und t1/2 = ln2 / k.
NMRI: c0 = 759 µg/ml, k= 0,29, (2) t1/2= 2,4 Std., r2= 0,98
ST8SiaIV(+/+): c0 = 490 µg/ml, k= 0,38, (1) t1/2= 1,8 Std., r2= 1,00
103
4-
Ergebnisse
Tab. 4.8: Kennwerte der Plasmakinetik von S-Pentyl-4-Pentinsäure in der ST8SiaIV(-/-)-,
ST8SiaIV(+/+)- und NMRI-Maus nach s.c.-Injektion
Cmax (µg/ml)
k
t1/2 (Std.)
ST8SiaIV(-/-)
577
0,31
2,2
ST8SiaIV(+/+)
439
0,38
1,8
NMRI
628
0,29
2,4
Cmax= maximale Plasmakonzentration
k= Eliminationskonstante
t1/2= Halbwertszeit
4.6-
Einfluß von VPA-Derivaten auf die Differenzierung fetaler
Hippocampuszellen
Über die Betrachtung möglicher VPA-induzierter Veränderungen von PSA- und NCAMExpression in einem gegenüber dem Tiermodell vereinfachten zellulären Experimentalsystem
sollten die beobachteten Effekte bestätigt und gegebenenfalls molekular auswertbar werden.
Auf diese Weise sollte versucht werden, eine generalisierte Aussage zur Wirkung von teratogenen VPA-Derivaten auf Nervenzellen zu ermöglichen.
Hippocampale Explantatkulturen wurden wie in Absatz 3.2.1 beschrieben für 24 Stunden mit
der originären Substanz und verschieden Derivaten behandelt. Als quantifizierbarer Parameter
wurde in der in-vitro Studie die mittlere Neuritenlänge in µm pro Zelle genutzt. Die Tab. 4.9
verdeutlicht, wie aus der Anzahl der Zellen und den gezählten Kreuzungspunkten der Neuriten mit den Linien des Bildanalyseprogramms die Neuritenlänge/Zelle berechnet wurde. Alle
Daten stammen aus 4 unabhängigen Versuchen.
Abb. 4.45 zeigt die Wirkung von VPA-Derivaten auf die Differenzierung fetaler Hippocampuszellen nach einer Exposition von 24 Stunden. Als Positivkontrolle wird das P2-Peptid eingesetzt; dieses Peptid bindet an eine extrazelluläre Domäne des NCAM und stellt in dem benutzten System die hinsichtlich Differenzierungsinduktion bisher potenteste Substanz dar
(Soroka et al., 2002). Der Vergleich mit DMSO-behandelten Zellen zeigte, dass die teratoge-
104
4-
Ergebnisse
nen Substanzen VPA, S-Pentyl-4-yn und R-Pentyl-4-yn in Konzentrationen von 0,5 mM und
2,0 mM das Wachstum der Neuriten signifikant erhöhten, das nicht-teratogene Derivat Isobutyl-4-yn beeinflußte das Neuritenwachstum dagegen nicht. VPA und R-Pentyl-4-yn verstärkten das Neuritenwachstum dosisabhängig. S-Pentyl-4-yn führte in einer Konzentration von
0,5 mM zu einer signifikanten Erhöhung der mittleren Neuritenlänge pro Zelle im Vergleich
zur Negativkontrolle, der Effekt konnte durch Erhöhung der Konzentration auf 2,0 mM jedoch nicht weiter gesteigert werden. Die Zellen sind nach Behandlung mit P2-Peptid, VPA,
S-Pentyl-4-yn, Isobutyl-4-yn und DMSO in Abb. 4.47 gezeigt. Unbehandelte und mit Isobutyl-4-yn behandelte Zellen bildeten nach 24 Stunden kleine nasenartige Ausläufer (B+E), im
Vergleich sind bei VPA- und S-Pentyl-4-yn-behandelten Zellen kleine Neuriten erkennbar
(C+D).
Die Behandlung der fetalen Hippocampuszellen mit EndoN führte zu einer völligen Entfernung der PSA (Abb. 4.49 D). Die fetalen Zellen reagierten ohne PSA jedoch nicht abweichend auf die Behandlung mit den VPA-Derivaten, wie in Abb. 4.46 gezeigt ist. In diesem
Versuch wurden Zellen mit EndoNF vorbehandelt und mit nicht-vorbehandelten Zellen bei
gleicher VPA-Behandlung verglichen. Bei einer 0,5 mM Konzentration der teratogenen VPADerivate ist gegenüber der Negativkontrolle ein differenzierender Effekt sichtbar, im Vergleich zu nicht-EndoNF -vorbehandelten Zellen unterscheidet sich die mittlere Neuritenlänge
jedoch nicht. Die Polysialylierung des NCAM scheint in diesem Einzelzellsystem keine Auswirkung auf die differenzierende Wirkung der teratogenen VPA-Derivate zu haben. Die Abb.
4.48 und 4.49 zeigen, dass das verwendete Zellsystem in starkem Umfang polysialyliertes
NCAM exprimiert. Die Behandlung mit P2-Peptid und mit VPA induziert die Differenzierung
zu einem reiferen Phänotyp und erhöht die PSA-NCAM-Expression. Die starke Expression
der Zielstrukturen ist an den roten Farbereichen erkennbar.
105
4-
Ergebnisse
Tab. 4.9: Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten.
Konzentration Kreuzungspunkte(1)
Substanz
Zellen(2)
Neuritenlänge/Zelle
(Anzahl)
(Anzahl)
(3)
(µm)
VPA
0,1 mM
20 ± 8
203 ± 1
4,34 ± 1,96
VPA
0,5 mM
34 ± 4
208 ± 3
7,21 ± 1,08
VPA
2,0 mM
42 ± 3
204 ± 8
9,10 ± 0,53
Isobutyl
0,1 mM
22 ± 5
226 ± 36
4,16 ± 0,39
Isobutyl
0,5 mM
14 ± 5
205 ± 2
2,96 ± 1,21
Isobutyl
2,0 mM
14 ± 4
208 ± 5
3,00 ± 0,96
S-Pentyl-4yn
0,1 mM
25 ± 10
214 ± 16
4,97 ± 2,16
S-Pentyl-4yn
0,5 mM
40 ± 9
202 ± 2
8,75 ± 2,16
S-Pentyl-4yn
2,0 mM
33 ± 6
206 ± 4
6,98 ± 1,40
R-Pentyl-4yn
0,1 mM
26 ± 4
209 ± 5
5,34 ± 0,96
R-Pentyl-4yn
0,5 mM
31 ± 5
222 ± 21
6,09 ± 1,05
R-Pentyl-4yn
2,0 mM
30 ± 4
205 ± 4
6,34 ± 1,01
DMSO
0,1% (v/v)
16 ± 8
215 ± 27
2,16 ± 1,20
DMSO
0,3% (v/v)
15 ± 4
205 ± 3
3,03 ± 1,07
(1) Kreuzungspunkte zwischen Neuriten und Meßlinien des Bildanalyseprogramms, Mittelwert ±
Standardabweichung aus mindestens 4 unabhängigen Versuchen
(2) Anzahl zufällig ausgewählter Zellen, Mittelwert ± Standardabweichung aus mindestens 4 unabhängigen Versuchen
(3) Zur Berechnung der durchschnittlichen Neuritenlänge pro Zelle werden die Daten aus mindestens
4 einzelnen Versuchen verwendet. Aus diesen 4 Werten wird der Mittelwert ± Standardabweichung
berechnet. Die Neuritenlänge pro Zelle berechnet sich wie folgt:
Ltotal =
d:
I:
LZellen:
Ltotal:
NZellen:
π ⋅d
2
⋅I
Ltotal
= LZellen
N Zellen
Abstand zwischen 2 Linien der Bildanalyse (28 µm)
Anzahl der Kreuzungspunkte zwischen Neuriten und Meßlinien
durchschnittliche Neuritenlänge pro Zelle
Neuritenlänge insgesamt
Anzahl der Zellen
106
Neuritenlänge/ Zelle (µm)
4-
0,1 mM
0,5 mM
2,0 mM
DMSO 0,1%
DMSO 0,3%
P2-Peptid
50
40
30
12
10
8
Ergebnisse
*
*
*
*
*
6
*
**
4
P2
-P
ep
tid
D
M
SO
Iso
bu
t
V
PA
yl
-4
yn
0
SPe
nt
yl
-4
yn
RPe
nt
yl
-4
yn
2
Neuritenlänge/Zelle (µm)
Abb. 4.45: Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten.
Mittlere Neuritenlänge ± Standardabweichung aus 4 unabhängigen Versuchen. *: p< 0,05,
Student´s
udent´s t-test gegen DMSO-Kontrolle.
70
60
EndoN behandelt
unbehandelt
50
40
30
10
0
Iso ,5 m
bu M
ty
l-4
yn
0
S- ,5 m
Pe M
nt
yl
-4
yn
0,
R- 5 m
Pe M
nt
yl
-4
yn
0
D ,1%
M
SO
P2
-P
ep
tid
0
V ,5 m
PA M
0
Abb. 4.46: Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten nach Vorbehandlung
mit EndoNF. Mittelwert ± Standardabweichung der Neuritenlänge aus 4 unabhängigen Versuchen. Die Polysialylierung des NCAM hat keinen Einfluß auf den Behandlungseffekt (Student´s t-test gegen nicht-EndoN-behandelte Gruppe, p< 0,05).
107
4-
Ergebnisse
Abb. 4.47: Neuritenwachstum in fetalen Hippocampuszellen nach Kultur von 24 Stunden.
Coomassie- Färbung, Lichtmikroskopie
(A) P2-Peptid, 5µg/ml Neurobasalmedium , (B) 0,1 % DMSO, (C) 0,5 mM VPA, (D) 0,5 mM
S-Pentyl-4-yn, (E) 0,5 mM Isobutyl-4-yn.
Der deutliche Effekt des P2-Peptids wurde als Positivkontrolle genutzt. Unter DMSO-Einfluß
und nach Isobutyl-4-yn Behandlung differenzieren die Zellen sehr wenig und bilden kleine,
„nasenartige“ Neuriten (B+E). Die teratogenen Substanzen VPA und S-Pentyl-4-yn induzieren eine geringes, aber deutlich erkennbares Neuritenwachstum (C+D).
108
4-
Ergebnisse
Farbcode: keine FluoreszensÆ schwarz, gering Æ blau, mittelÆ gelb, starkÆ rot
Abb. 4.48: NCAM-Expression in behandelten und unbehandelten fetalen Hippocampuszellen.
NCAM-Färbung, konfokale Mikroskopie
(A) P2-Peptid, 5µg/ml Neurobasalmedium, (B) 0,5 mM VPA, (C) 0,1 % DMSO, (D) Negativkontrolle ohne spezifischen Antikörper.
Die Aufnahmen zeigen die NCAM-Expression der verwendeten Zellen im behandeltem und
unbehandeltem Zustand. Nach Behandlung mit P2-Peptid und VPA ist das Neuritenwachstum
und die verstärkte NCAM-Expression erkennbar.
109
4-
Ergebnisse
Farbcode: keine FluoreszensÆ schwarz, gering Æ blau, mittelÆ gelb, starkÆ rot
Abb. 4.49: PSA-Expression in behandelten und unbehandelten fetalen Hippocampuszellen.
PSA-Färbung, konfokale Mikroskopie (A) P2-Peptid, 5µg/ml Neurobasalmedium, (B) 0,5
mM VPA, (C) 0,1 % DMSO, (D) EndoN Kontrolle.
Die PSA-Expression ist in wenig differenzierten Neuronen unter DMSO-Einfluß gering und
beschränkt sich auf einige Abschnitte der Zellmembran (C). Die Behandlung mit P2-Peptid
führt zu einer starken Zunahme der PSA-Synthese; die Behandlung mit VPA zeigt einen geringeren, aber gegenüber den unbehandelten Zellen deutlichen Effekt auf die Differenzierung
der Zellen mit einer verstärkten Synthese von PSA (A+B). Die Behandlung mit EndoN entfernt die PSA nahezu vollständig von der Zelloberfläche und reduziert die PSA-Färbung auf
eine unspezifische Hintergrundreaktion (D).
110
5-
5-
Diskussion
DISKUSSION
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die teratogenen Effekte von VPA und VPA-Derivaten
in einen funktionellen Zusammenhang mit der Polysialylierung des NCAM im Mausmodell
zu stellen. Im Rahmen dieser Fragestellung ist es gelungen:
Die ST8SiaIV-knockout-Maus im Exenzephaliemodell als passendes Werkzeug für die
Fragestellung zu identifizieren und so in-vivo einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Polysialylierung des NCAM in der frühen Embryonalentwicklung und den teratogenen Effekten des S-Pentyl-4-yn aufzuzeigen.
Die Auswirkungen des ST8SiaIV-knockout auf die Expression von PSA in der frühen
Embryonalentwickung der Maus zu beschreiben.
Die Fragestellung auf ein adäquates in-vitro System zu übertragen und die differenzierende Wirkung verschiedener teratogener VPA-Derivate auf embryonale Nervenzellen zu
zeigen.
5.1-
Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte von
VPA und S-Pentyl-4-Pentinsäure im Mausmodell
Die Teratogenität von VPA unterliegt einer ausgeprägten Speziesabhängigkeit, so dass bis
heute die Maus das einzige Versuchstiermodell darstellt (Vgl. Einleitung Abschnitt 1.2.3.2).
Innerhalb dieser Spezies beeinflußt ebenfalls die genetische Variation zwischen den Mäusestämmen die zu beobachtenden Effekte. In dieser Arbeit wurde speziell die Empfindlichkeit
des C57BL/6J Stammes mit dem etablierten Hsd:Win NMRI Auszuchtstamm verglichen. Der
C57BL/6J wurde ausgewählt, da alle für die These der Arbeit in Frage kommenden knockoutModelle (NCAM, ST8SiaII und ST8SiaIV) partiell oder reingezüchtet auf diesem genetischen
Hintergrund basieren ((Cremer et al., 1994; Eckhardt et al., 2000), persönliche Mitteilung von
Dr. Birgit Weinhold, MH-Hannover).
Das Spina bifida-Modell ermöglicht durch den Einsatz hoher Dosen VPA an Tag 9 der Entwicklung die Induktion von Spina bifida aperta bei den Feten (Ehlers et al., 1992). Durch die
Applikation von 300 mg VPA/kg dreimal an Tag 9 der Embryonalentwicklung konnten kei-
111
5-
Diskussion
nerlei Fehlbildungen in C57BL/6J induziert werden (Tab.4.1). NMRI-Feten entwickelten
nach dieser Behandlung zu einem geringen Prozentsatz Exenzephalie und Schwanzfehlbildungen. Bei einer Dosierung von 500 mg VPA/kg dreimal an Tag 9 der Entwicklung beschreiben Ehlers et al. 52% Schwanzfehlbildungen, 3% Exenzephalie und 6% Spina bifida
aperta bei einer Embryoletalität von 80% (Ehlers et al., 1992). Der TD50-Wert für VPA im
Rotarodtoxizitätstest beträgt 2,0 mmol/kg (= 288,4 mg) in der NMRI-Maus (Dissertation J.
Volland, Hannover 2002). Der relativ geringe Anteil von Spina bifida aperta wird in der Arbeit von Ehlers et al. mit toxischen Dosen und einer sehr hohen Embryoletalität erreicht, daher wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, ähnliche Effekte mit dem hochteratogenen SPentyl-4-yn zu erzielen.
Ein vergleichbarer Anteil von 57% Schwanzfehlbildungen bei einer Embryoletalität von 54%
wurde mit einer dreimaligen Applikation von 0,6 mmol S-Pentyl-4-yn/kg induziert, die Defekte sind allerdings nicht mit Neuralrohrdefekten korreliert wie in der Arbeit von Ehlers et
al. (1992). Die Erhöhung der Dosis im angegebenen Schema induzierte vermehrt Schwanzfehlbildungen, jedoch keine Neuralrohrdefekte. Die niedrigste verwendete Dosierung von
dreimal 0,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg verursachte keine äußerlich erkennbaren Defekte, führte
jedoch zu Fehlbildungen im Bereich der Lendenwirbelsäule (Tab.4.1 und Abb. 4.1-4.2). Der
TD50-Wert für S-Pentyl-4-yn in C57BL/6J wurde bestimmt und beträgt 1,0 mmol/kg. Eine
Tierzahl von 6 Tieren je Dosierung ist knapp kalkuliert, da ein einzelnes Tier einen Prozentsatz von ca. 17% darstellt. Aufgrund der guten Anpassung der Datenpunkte an die DosisWahrscheinlichkeitsgerade in Abb. 4.6 wurde die Tierzahl in diesem Experiment jedoch als
ausreichend bewertet (χ2-Test mit beobachteten und erwarteten Werten, (Litchfield & Wilcoxon, 1949)).
Faiella et al. (2000) beschreiben Knochendefekte in C57BL/6J über die gesamte Länge der
Wirbelsäule und die Rippen verteilt. Die Streuung der Knochendefekte könnte darin begründet sein, dass die Verpaarung der Muttertiere über Nacht durchgeführt wurde und demzufolge
eine hohe Variation des Behandlungszeitpunktes hingenommen wurde. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Muttertiere 3 Stunden verpaart, und demzufolge beträgt die Variation
maximal ± 1,5 Stunden zwischen dem ältesten und dem jüngesten Embryo innerhalb einer
Versuchsgruppe. Diese vergleichsweise geringe Variation hat wahrscheinlich im Spina bifidaModell die Knochendefekte auf den Bereich der Lendenwirbelsäule begrenzt.
112
5-
Diskussion
Defekte der Wirbelsäule und anderer Skelettanteile nach Behandlung mit VPA sind insbesondere in Spezies beschrieben, die keine Neuralrohrdefekte nach VPA-Exposition entwickeln,
wie z.B. der Rhesusaffe, die Ratte oder das Kaninchen (Petrere et al., 1986; Hendrichx et al.,
1988; Menegola et al., 1998). Die Ursachen für die Unempfindlichkeit in der Entwicklung des
lumbalen Rückenmarks sind bis heute nicht bekannt; Faiella et al. (2000) stellen die beobachteten Knochendefekte in Zusammenhang mit einer veränderten HOX-Genexpression. Black &
Marks (1992) stellen fest, dass fetale Defekte wie eine verzögerte Ossifikation und verschmolzene Rippen üblicherweise mit einer maternalen Intoxikation assoziiert sind und keinen Hinweis auf spezifisch-teratogene Wirkungsweisen geben. Als praktische Schlußfolgerung aus den vorliegenden Ergebnissen wurde das Spina bifida-Modell für den C57BL/6J
Stamm als ungeeignet bewertet.
Die Behandlung der C57BL/6J Maus im Exenzephaliemodell wurde direkt vergleichend zum
NMRI Auszuchtstamm durchgeführt. Entgegen den von (Finnell et al., 2003) publizierten
Daten konnte ich zeigen, dass der C57BL/6J Stamm nicht resistent gegen die teratogenen Einflüsse der VPA ist. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass mit einer Dosis von 3 mmol
VPA/kg (= 432 mg) 15% Exenzephalie bei den Nachkommen erzeugt werden kann (Tab.
4.3). Finnell et al. (1988) induzieren mit 600 mg VPA/kg 20% Exenzephalie im LM/Bc Inzuchtstamm und ordnen aufgrund dieses Ergebnises den Stamm als mittelmäßig empfindlich
im Vergleich zum hochempfindlichen SWV- und dem resistenten DBA/2J-Stamm ein. Im
Gegensatz zu dieser Studie wurden in der vorliegenden Arbeit für 2 teratogene Substanzen
aus mindestens 3 Dosierungen TeraD50-Werte errechnet und diese mit EmbryoLD50-Werten
und der maternalen Toxizität verglichen. Diese Vorgehensweise erlaubt die Beurteilung von
Dosis-Effektkurven und stellt die teratogenen Effekte im Verhältnis zur Embryotoxizität dar.
Das Verhältnis von Embryoletalität und Teratogenität war im Vergleich von VPA und SPentyl-4-yn in einem Mausstamm ähnlich. Der NMRI-Stamm war deutlich empfindlicher,
während eine 50% Exenzephalierate in C57Bl/6J nicht erreicht werden konnte (Abb. 4.5). Die
Beurteilung der Teratogenität im Vergleich zur neurotoxischen Wirkung zeigt, dass die VPA
bei gleicher neurotoxischer Wirkung auf das Muttertier weniger Exenzephalie verursacht als
S-Pentyl-4-yn (Tab. 5.1). Die Substanz S-Pentyl-4-yn zeigt im Vergleich zur VPA keine allgemeine Steigerung der toxischen Potenz, sondern eine selektive Verstärkung der teratogenen
Eigenschaften sowohl in der C57BL/6J- als auch in der NMRI-Maus im hier angewendeten
113
5-
Diskussion
Modell. Die Tabelle 5.1 stellt die wahrscheinlichen Exenzephalieraten in der C57BL/6J- und
in der NMRI-Maus nach Verabreichung der TD50-Dosis dar.
Tab. 5.1: Wahrscheinliche Exenzephalieraten bei TD50-Dosis des Muttertieres
TD50 (mmol/kg)
Exenzephalie (%)(1)
C57BL/6J
S-Pentyl-4-yn: 1,0
23
C57BL/6J
VPA:
2,0
13
NMRI*
S-Pentyl-4-yn: 1,5
97
NMRI*
VPA:
33
2,0
*: Werte aus J. Volland, Dissertation, Hannover 2002
(1): wahrscheinliche Werte für Exenzephalie abgeleitet aus Abb. 4.3
Die Teratogenität von S-Pentyl-4-yn wurde bereits von J. Volland (Dissertation, Hannover
2002) im NMRI-Auszuchtstamm untersucht. In dieser Arbeit wird eine mittlere teratogene
Dosis (TeraD50) von 0,7 mmol/kg berechnet; diese Dosis wird in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Die Reproduzierbarkeit der Daten zeigt, dass der genetische Hintergrund des NMRIAuszuchtstammes in einem Zeitraum von ca. 2 Jahren stabil zu sein scheint.
Interessante Rückschlüsse auf mögliche Mechanismen erlaubt der Vergleich der DosisEffektgeraden für Teratogenität (Abb. 4.3), Embryoletalität (Abb. 4.4) und Neurotoxizität
(Abb. 4.6). Während die Geraden zur Berechnung der TD50 und EmbryoLD50 nahezu parallel
verlaufen, unterscheiden sich die Steigungen der TeraD50-Geraden zwischen den zwei verwendeten Mäusestämmen deutlich, verlaufen jedoch im Vergleich der zwei verwendeten Substanzen innerhalb eines Mausstammes nahezu parallel. J. Volland beschreibt 2002 die TD50Werte im Rotarod-Toxizitätstest für VPA und S-Pentyl-4-yn in der NMRI-Maus. S-Pentyl-4yn hat einen TD50-Wert von 1,5 mmol/kg und VPA von 2,0 mmol/kg, der Vergleich zu den
Rohdaten der Berechnung zeigt, daß die Geraden parallel zu den Geraden aus Abb. 4.6 verlaufen (Diss. J. Volland, Hannover 2002). Die gezeigten Geraden im Wahrscheinlichkeitsnetz
entsprechen dem linearen Bereich einer Dosis-Effektkurve. Die Steigung einer DosisEffektkurve entspricht einer Funktion nach dem Massenwirkungsgesetz zwischen einem beliebigen Rezeptor und einer Substanz; der biologische Effekt ist also proportional zur Rezeptorbesetzung (Fuhrmann, 1994). Die Teratogenität scheint in den beiden Mausstämmen unterschiedlichen Mechanismen zu folgen, während die Neurotoxizität und die Embryoletalität
114
5-
Diskussion
nach einem ähnlichen Prinzip funktionieren. Die Neurotoxizität und Embryoletalität folgen
wahrscheinlich einem oder mehreren unspezifischen Mechanismen; auch die Teratogenität
kann mehreren Mechanismen folgen, das Wirkprinzip scheint jedoch spezifischer zu sein und
nicht auf einer allgemeinen Schädigung von Zellen zu beruhen.
In Abschnitt 4.4 dieser Arbeit wird die ST8SiaIV(+/+)-Maus im Exenzephaliemodell behandelt.
Die Abb. 4.19 zeigt vergleichend zum NMRI-Stamm die Empfindlichkeit in einer TeraD50Berechnung für S-Pentyl-4-yn. Die mittlere teratogene Dosis liegt in ST8SiaIV(+/+) bei 1,5
mmol S-Pentyl-4-yn/kg und damit zwischen der mittleren teratogenen Dosis in NMRI (0,7
mmol/kg) und C57BL/6J (2,8 mmol/kg). Die Steigung der Dosis-Effektgeraden in Abb. 4.19
entspricht der Steigung der NMRI-Geraden, analog zur vorhergehenden Diskussion weist die
Parallelität der Geraden auf einen ähnlichen Mechanismus hin. Die ST8SiaIV(+/+) Mäuse wurden vergleichend zum knockout-Stamm nach hormoneller Zyklussynchronisation behandelt.
Diese Vorbehandlung verursacht eine Superovulation und dementsprechend eine abweichende Embryoletalität im Vergleich zu nicht-vorbehandelten Tieren. Aus diesem Grund kann die
EmbryoLD50 –Dosis nicht mit den Werten für NMRI und C57BL/6J verglichen werden.
Andererseits zeigen die ermittelten Daten, daß ST8SiaIV(+/+) nicht vollständig auf dem Hintergrund von C57BL/6J beruht, sondern auf einem gemischten Hintergrund zwischen der
Mutterlinie C57BL/6J und der verwendeten Stammzelllinie 129/Ola (Eckhardt et al., 2000).
Diese Vermischung zwischen Stammzelllinie und Mutterlinie führt zu einem genetisch nicht
fixierten Hintergrund. Dieser Problematik wurde entsprochen, indem die Tiere zu Beginn der
Arbeit aus mehreren heterozygoten Würfen ausgewählt und während des gesamten Zeitraumes streng zufällig verpaart wurden. Die Empfindlichkeit von ST8SiaIV(+/+) auf die teratogenen Effekte von VPA und S-Pentyl-4-yn kann sich durchaus bei Reinzucht auf den
C57BL/6J-Hintergrund verändern. Im Sinne der Fragestellung wurde die Vergleichbarkeit zu
den Kontrolltieren gewahrt; das Verhältnis zwischen ST8SiaIV(+/+) und (-/-) stellt eine reproduzierbare Datenmenge dar, auch wenn sich die absoluten Werte durch weitere Zuchtprogramme verschieben könnten. Die Zucht der ST8SiaIV(-/-) auf einen reinen C57BL/6J-Hintergrund
ist seit dem Jahr 2002 in Arbeit (persönlich Mitteilung, Dr. Birgit Weinhold, MH-Hannover).
Die Ursachen für die unterschiedliche Empfindlichkeit verschiedener Mäusestämme - und
damit auch die genetische Basis für die Teratogenität der VPA - werden diskutiert. Finnell et
al. (1997) stellen aus Untersuchungen von Mäusestämmen verschiedener Empfindlichkeit
115
5-
Diskussion
fest, dass die Expression von Enzymen des Folsäurestoffwechsels zwischen den Stämmen
analog zu ihrer Empfindlichkeit auf die teratogenen Effekte der VPA variiert. Ebenso unterscheidet sich die Expression verschiedener Wachstumsfaktoren zwischen dem hochempfindlichen SWV- und dem weniger empfindlichen LM/Bc-Stamm (Bennett et al., 2000). Untersuchungen zur Erklärung des Zusammenhangs zwischen den vorgestellten Faktoren und der
Empfindlichkeit im Exenzephaliemodell wurden in Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt.
Eine andere Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit morphologischen Kennzeichen des cranialen
Neuralrohrschlusses. In diesen Untersuchungen wird gezeigt, dass der Neuralrohrschluss
nicht fortlaufend entlang der gesamten Längsachse des Embryos verläuft, sondern von 4 Initialpunkten ausgeht (Golden & Chernoff, 1993). Von besonderem Interesse ist die weitergehende Beobachtung, dass der zweite Initialpunkt im Neuralrohrschluss (= closure site II, Vgl.
Abschnitt 1.1.2 und Abb. 1.2) je nach Empfindlichkeit für Neuralrohrdefekte zwischen verschiedenen Inzuchtstämmen unterschiedlich ausgeprägt ist. Bei caudaler Lage des zweiten
Initialpunktes ist der Stamm empfindlicher (z.B. DBA/2), bei rostraler Lage ist der Stamm
resistenter (z.B. NZW). Anhand dieser Untersuchungen konnte die Exenzephaliehäufigkeit in
splotch Mäusen (Sp2H) vor einem anderen genetischen Hintergrund deutlich gesenkt werden,
die Häufigkeit der Spina bifida aperta blieb jedoch unverändert (Fleming & Copp, 2000).
5.2-
Embryonalentwicklung von C57BL/6J, ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV (-/-) im
Vergleich zu Hsd:Win NMRI
Die exakte Bestimmung des Stadiums eines Embryos im Verhältnis zur individuell angewandten Methode der Haltung und Verpaarung eines Mausstammes stellt ein generelles Problem in der reproduktionstoxikologischen Forschung dar. Die Definition des embryonalen Alters folgte in der vorliegenden Arbeit zwei konkreten Zielsetzungen:
1. Die Charakterisierung der Embryonalentwicklung sollte vergleichbar und diskutierfähig
mit anderen Arbeiten in der Maus und anderen Spezies sein.
2. Die Behandlung von Mäusen im Exenzephaliemodell sollte unabhängig vom verwendeten
Mausstamm die gleiche sensible Phase der cranialen Neuralrohrentwicklung beeinflussen.
116
5-
Diskussion
Um dieser Zielsetzung zu entsprechen, wurden an mehreren Tagen der frühen Embryonalentwicklung in den verwendeten Mäusestämmen die Somitenpaare gezählt.
Zur Erfassung des embryonalen Entwicklungsstadiums (Staging) werden verschiedene Methoden angewandt; grundsätzlich kann eine chronologische und eine morphologische Vorgehensweise unterschieden werden. Chronologisch wird abhängig vom Verpaarungszeitpunkt
und dem Zeitpunkt der Kontrolle der Muttertiere ein Zeitpunkt 0 der Entwicklung festgelegt.
Häufig werden die Tiere 12 Stunden während der Dunkelphase verpaart und die Mitte der
Dunkelphase wird als Zeitpunkt 0 der Entwicklung definiert, da Ovulation und Befruchtung
zumeist in diesem Zeitrahmen stattfinden (Rugh, 1968; Theiler, 1972; Kaufman, 1999). In
den zitierten Standardwerken der Mausembryologie wird diese Methodik durch sehr detaillierte Beschreibungen der Morphologie und der Anzahl der Somiten des Embryo erweitert.
Ohne diese Erweiterung sind die Ergebnise von Arbeiten mit ausschließlich chronologischem
Staging in Abhängigkeit der angewandten Methodik oft schwer vergleichbar. Aus diesem
Grund wurde neben der chronologische Einordnung der Embryonen in dieser Arbeit zusätzlich der morphologische Parameter der Somitenanzahl herangezogen.
Die Beschreibung der Morphologie des Embryo kann verschiedenen Stagingsystemen folgen,
das häufigste in der Maus stammt von Theiler (1972) und in der Ratte von Witschi (1962).
Theiler und Witschi nummerieren verschiedene Stadien anhand äußerlich erkennbarer Merkmale des Embryo. Auch diese Methodik ist nicht unumstritten, da morphologische Entwicklungsvorgänge fließend sind und individuell zwischen verschiedenen Untersuchern interpretiert werden können (Fujinaga et al., 1992). Fujinaga et al. stellen jedoch auch fest, dass die
Anzahl der Somitenpaare im implantierten Embryo ein guter Parameter zum präzisen Staging
ist.
Die Nomenklatur der Morphologie folgte in dieser Arbeit den Angaben von Kaufman (1999)
für histologische und Rugh (1968) für äußerlich erkennbare Strukturen. Trotz abweichender
Methodik der Verpaarung und chronologischem Staging sowie unterschiedlichen Mäusestämmen war die Zuordnung der embryonalen Entwicklungsstufe anhand der Anzahl der Somitenpaare einfach und präzise möglich. Unterschiede in morphologischen Parametern des
Neuralrohrschlusses zwischen verschiedenen Mäusestämmen sind bereits bekannt. Die Autoren stellen fest, dass kein direkter Zusammenhang zwischen dem Fortschreiten des Neuralrohrschlusses und dem chronologischen Entwicklungsalter der Embryonen besteht. Der direk-
117
5-
Diskussion
te Vergleich morphologischer Parameter mit der Anzahl der Somiten stimmt jedoch überein
(Golden & Chernoff, 1993; Macdonald et al., 1998). In der eigenen Arbeit wurde festgestellt,
dass in NMRI, C57BL/6J, ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) kein Unterschied zwischen dem
Entwicklungsalter und der Anzahl der Somiten besteht und sich demzufolge alle Mäusestämme in der gleichen Geschwindigkeit entwickeln (Abb. 4.7 und 4.12).
Da sich alle verwendeten Mäusestämme in der gleichen Geschwindigkeit entwickelten, entsprach Tag 8,25 in der NMRI-Maus dem gleichen Entwicklungsstadium in C57BL/6J,
ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-). Dies entspricht dem Stadium 12 nach Theiler (1-7 Somitenpaare), in dem die ersten Somiten auftreten und sich die Neuralfalten in der Hals-/Kopfregion
schließen. Der Schluß der Neuralfalten in dieser Region ist in Abb. 4.9 zu erkennen. Das Stadium 14 nach Theiler entspricht 13-20 Somitenpaaren, in dieser Phase bildet sich der optische
und der auditorische Vesikel und die Herzanlage ist deutlich erkennbar. Diese morphologischen Kennzeichen konnten im gleichen Somitenstadium identifiziert werden (Abb. 4.8). Die
gute Übereinstimmung mit der Literatur und der unkomplizierte Vergleich zu anderen Arbeiten zeigen, dass die Zählung von Somiten eine Methode im Sinne der Zielsetzung darstellt,
und die zeitgleiche Behandlung der verwendeten Mäusestämme im Exenzephaliemodell
rechtfertigt.
5.3-
Paarungsverhalten von ST8SiaIV(-/-) und hormonelle Zyklussynchronisation
Die ST8SiaIV(-/-) Maus zeigte bei der Diagnostik des Sexualzyklus zum Zeitpunkt der Verpaarung eine für die Maus ungewöhnliche Besonderheit; während die Kontrolltiere die Verpaarung nur im Östrus duldeten, ließ die knockout-Maus diese auch außerhalb des Östrus zu.
Dieses Verhalten hatte zur Folge, dass die Tiere trotz erfolgter Verpaarung nicht trächtig wurden (Abschnitt 4.2). Im Gegensatz zur zeitlich terminierten Verpaarung war die Zucht mit
ST8SiaIV(-/-) nach eigenen Erfahrungen und nach Austausch mit Dr. Birgit Weinhold, MHHannover, bisher problemlos. Die durchgeführte Diagnostik des Zyklusstandes mithilfe von
Scheidenabstrichen und einer einfachen May-Grünwald-Färbung ließ eine differenzierte Un-
118
5-
Diskussion
terscheidung der Zyklusstadien nicht zu, im Sinne der Problemstellung war die Unterscheidung zwischen Östrus und nicht-Östrus jedoch ausreichend. Es wurde jeweils eine Gruppe
von 10 weiblichen Tieren über einen Zeitraum von 3 Verpaarungen hinweg untersucht. In der
Verhaltensbiologie werden für statistisch signifikante Aussagen im allgemeinen größere Tierzahlen benötigt und das einzelne Tier wird unter standardisierten Bedingungen mehrfach getestet. Die Zyklusdiagnostik der vorliegenden Arbeit erhebt daher keinen Anspruch auf Vollständigkeit, sondern stellt lediglich den verwendeten Ansatz zur Problemlösung vor.
Als Ursache für die äußerst geringe Befruchtungsrate nach zeitlich terminierter Verpaarung
wurde die versuchte Befruchtung außerhalb des Östrus identifiziert. Der Östrus der Maus
dauert höchstens 20 Stunden bei einer Zykluslängen von 4-5 Tagen (Taylor, 1986). Bei einer
Verpaarungsdauer von 3 Stunden ist es vergleichsweise unwahrscheinlich, dass eine erfolgreiche Befruchtung stattfindet. Vermutlich sind in der Zucht, wo männliche und weibliche
Maus dauerhaft zusammen gehalten werden, viele Decksprünge des Männchens notwendig,
um die Eizelle erfolgreich zu befruchten. Dieses Verhalten bliebe allerdings unbemerkt. Die
10 untersuchten knockout-Mäuse waren im Untersuchungszeitraum nicht in einem generellen
Anöstrus, wie er bei weiblichen Mäusen in Gruppen ohne Männchen zuweilen auftritt (van
Zutphen et al., 1995); zwischen den Verpaarungen zeigten einige Tiere einen Östrustypischen Scheidenabstrich mit zahlreichen keratinisierten Zellen. Der Abstand der Verpaarungen wurde mit 3 bis 4 Tagen so gewählt, dass die Pheromone des zweiten Männchens die
Implantation der befruchteten Eizelle nicht beeinflussen (Bruce-Effekt, van Zutphen et al.,
1995).
Die Ursachen dieses abnormen Verhaltens sind nicht bekannt. Möglicherweise besteht ein
Zusammenhang zum Aggressionsverhalten der Tiere; eine sehr geringe Aggressivität der
Mäuse würde den Deckakt außerhalb des Östrus erklären. Eine gesteigerte Aggressivität der
Männchen ist dagegen keine direkte Erklärung des Phänomens, denn im Zusammenhang mit
der Paarung konnte keinerlei vermehrte Kampfaktivität festgestellt werden, und die Tiere waren nicht verletzt. Eine verstärkte Aggressivität und verstärktes Angstverhalten ist für die
NCAM-knockout Maus beschrieben, durch das Einfügen der NCAM 180 kD-Form wird das
Verhalten wiederum normalisiert (Stork et al., 1997; Stork et al., 1999; Stork et al., 2000).
Das ST8SiaIV-Enzym ist die dominante Polysialyltransferase im adulten Gehirn, der knockout führt zu Verlust von PSA im Bulbus olfaktorius, Hypothalamus, Hippocampus, in der
119
5-
Diskussion
Medulla und einigen Regionen des Neocortex (Eckhardt et al., 2000). Die Auswirkungen auf
das Verhalten sind bisher nicht beschrieben; das Aggressions- und Angstverhaltens stellt aber
meiner Meinung nach einen hochinteressanten Verhaltensphänotyp dieser Tiere dar, dessen
Untersuchung zu den geplanten Arbeiten gehört.
Um die Arbeit in einer reproduktionstoxikologischen Fragestellung mit den ST8SiaIVknockout Mäusen zu ermöglichen, wurde der Sexualzyklus der Tiere zur Verpaarung mit Gonadotropinen synchronisiert. Diese Behandlung führte zu einem großen Anteil trächtiger
Weibchen nach terminierter Verpaarung und bestätigte im Nachhinein die Theorie der Bedeckung außerhalb des Östrus. Die Behandlung mit Gonadotropinen steht im Verdacht, für
Fehlbildungen verantwortlich zu sein. In der Maus wurde nach Vorbehandlung mit 5-10 I.U.
FSH/LH und PMSG in 2199 Feten eine Exenzephalie beobachtet und eine signifikante Zunahme von Oligo- und Polydactylie berichtet (Elbling, 1975). Eine andere Arbeitsgruppe beobachtet nach hormoneller Vorbehandlung 4 Fälle von Exenzephalie in insgesamt 996 Nachkommen (Sakai & Endo, 1987).
Diese Hinweise waren der Ansatz für eine vergleichende Untersuchung von synchronisierten
und nicht-synchronisierten ST8SiaIV(+/+)-Mäusen im Exenzephaliemodell (Tabelle 4.4). Die
vergleichende Untersuchung in ST8SiaIV(-/-)-Mäusen konnte nicht durchgeführt werden, da
ohne die Hormonbehandlung keine ausreichend großen Gruppen von trächtigen Weibchen
gebildet werden konnten. In den Untersuchungen konnte keine Zunahme der Exenzephaliehäufigkeit in unbehandelten Tieren festgestellt werden, das Fetalgewicht der Nachkommen
war allerdings signifikant verringert. Die Exenzephalieraten nach Behandlung mit S-Pentyl-4yn in zwei verschiedenen Dosierungen unterschieden sich nicht signifikant zu den nichtsynchronisierten Tieren. In einer Behandlungsgruppe war die Resorptionsrate der nichtsynchronisierten Tiere signifikant niedriger als in der Vergleichsgruppe, diese Beobachtung
beruht vermutlich auf der induzierten Superovulation. Die angewandte Hormonbehandlung
wird insbesondere zur Gewinnung embryonaler Stammzellen der Maus und beim Embryotransfer angewendet (persönliche Mitteilung Dr. Martina Dorsch, MH-Hannover).
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die hormonelle Zyklussynchronisation auch bei den
knockout-Mäusen angewendet; alle unbehandelten Kontrolltiere und die (+/+)-Tiere wurden
zur Vergleichbarkeit von Resorptionsrate und fetalem Gewicht auf die gleiche Weise vorbehandelt.
120
5-
5.4-
Diskussion
Studien zur Expression von ST8SiaII, ST8SiaIV, PSA und NCAM
während der frühen Embryonalentwicklung der ST8SiaIV(-/-) Maus
Die Herstellung der ST8SiaIV-knockout Maus ermöglicht eine differenzierte Betrachtung der
Bedeutung dieser Polysialyltransferase im Gehirn der erwachsenen Maus (Eckhardt et al.,
2000). Die vorliegende Arbeit hat erstmals die Auswirkungen des ST8SiaIV-knockouts während der frühen Embryonalentwicklung untersucht und den Verlust der ST8SiaIV sowohl auf
mRNA- als auch auf der Ebene des Translations- (NCAM) und des Biosyntheseprodukts
(PSA) in Zusammenhang mit der Expression der ST8SiaII und des NCAM gebracht. Der direkte Vergleich zu (+/+)-Kontrolltieren hat die bestehenden Kenntnisse zur Expression der
des NCAMs und der PSA in der Ontogenese der Maus erweitert.
Der erste untersuchte Zeitpunkt war Tag 8,5 der Entwicklung. An diesem Tag wurde die PSA
in Zellen des Neuralrohres und der Neuralleisten nachgewiesen; der ST8SiaIV-knockout
Embryo zeigte zum gleichen Entwicklungszeitpunkt keine PSA-Expression. NCAM war in
beiden Gruppen insbesondere in den Zellen des Neuroektoderms deutlich vorhanden (Abb.
4.11 und 4.13A und B). Die Abb. 4.14A zeigt die PSA-Reaktivität an der Zelloberfläche der
Neuralfalten im Gehirnbereich und verdeutlicht durch die geringere Präsenz des Zuckers im
Kontaktbereich der Neuralfalten seine vermutete Funktion als anti-adhäsiver Faktor. Der Vergleich zur Expression der Polysialyltransferasen hat gezeigt, dass in beiden untersuchten
Gruppen die ST8SiaII in gleichem Maße schwach exprimiert wird (Abb. 4.18- 20 und 4.27),
und dass die ST8SiaIV in den Kontrolltieren nachweisbar ist. ST8SiaII produziert trotz vergleichbarer Expression keine PSA in den knockout-Mäusen. Es kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass PSA in sehr geringen Mengen unterhalb der Detektionsgrenze des
Systems vorhanden ist. Wie die Kontrolltiere zeigen, führt erst die konzertierte Expression
von ST8SiaII und –IV zu nachweisbarer PSA-Expression. Andererseits wird beschrieben,
dass der PSA-Spiegel nicht zwangsläufig mit der Expression der ST8SiaII und –IV korreliert,
sondern auch mit dem intrazellulären Calciumspiegel der Zellen (Brusés & Rutishauser,
1998). Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit liegt darüber hinaus in dem Nachweis, dass auch
in frühen Phasen der Ontogenese keine ektopische Expression der zweiten Polysialyltransferases (ST8SiaII) zu beobachten ist. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit der Situation im
Neugeborenen oder jungen erwachsenen Tier (Eckhardt et al., 2000).
121
5-
Diskussion
Das erste Auftreten der PSA während der Embryonalentwicklung der Maus wird in der Literatur widersprüchlich beschrieben. Einerseits wird die PSA im Neuroektoderm und schwach
im Mesoderm des Kopfes an Tag 8,5 identifiziert (Probstmeier et al., 1994), in einer anderen
Arbeit wird der erste Nachweis an Tag 9,0 erbracht (Ong et al., 1998). In der selben Arbeit
wird der Nachweis für die Expression der beiden Polysialyltransferasen bereits an Tag 8,0 der
Entwicklung erbracht (Ong et al., 1998); dieser Befund wird von einer anderen Arbeitsgruppe
jedoch nicht bestätigt, die die Enzymexpression erst an Tag 14 der Embryonalentwicklung
nachweisen (Kurosawa et al., 1997).
Das Auftreten des NCAM wird in mehreren Arbeiten übereinstimmend auf den frühen Tag
8,0 der Mausentwicklung datiert und entspricht damit den eigenen Ergebnissen (Moase &
Trasler, 1991; Bally-Cuif et al., 1993; Probstmeier et al., 1994). Bally-Cuif et al. betonen
allerdings die verstärkte Expression des NCAM im caudalen Neuralrohr des Embryo, ein Ergebnis, dass durch die eigenen Daten nicht gestützt werden kann. Der Nachweis erfolgte in
der zitierten Arbeit allerdings auf mRNA-Ebene und muß daher nicht deckungsgleich zum
Proteinnachweis sein.
Bereits 12 Stunden später war eine schwache PSA-Reaktion in den Somiten und in Zellen des
Neuroektoderm des ST8SiaIV(-/-) Embryos nachzuweisen. Die PSA-Synthese startet diesen
Ergebnissen zufolge ohne die ST8SiaIV am frühen Tag 9,0 der Embryonalentwicklung. Die
Kontrolltiere zeigten in diesem Entwicklungsstadium eine PSA-Synthese in den gleichen Regionen, aber in deutlich stärkerem Maße. NCAM wurde in beiden Gruppen gut nachweisbar
gebildet (Abb. 4.12). Die zeitliche und morphologische Verteilung der PSA- und NCAMNachweise in den Kontrolltieren werden durch die Studien anderer Gruppen weitgehend bestätigt; insbesondere Gehirnanlage, Neuralrohr und Somiten sind übereinstimmend mit der
eigenen Arbeit an Tag 9,0 der Entwicklung als PSA-NCAM positiv beschrieben (Probstmeier
et al., 1994; Ong et al., 1998).
Zwischen Tag 8,5 und Tag 9,0 ist die Expression der untersuchten Zielstrukturen ausgesprochen dynamisch und reflektiert eine Phase intensiver zellulärer Umlagerungsprozesse im Embryo. ST8SiaIV steigt innerhalb von nur 12 Stunden um das dreifache an, und die NCAMExpression wird verdoppelt. Genau in dieses Zeitfenster fällt das erste Auftreten der PSA im
ST8SiaIV(-/-) Embryo. Aufgrund der Abwesenheit einer Polysialyltransferase kann diese PSA
nur von der ST8SiaII synthetisiert werden. Über qualitative Unterschiede dieses ST8SiaII-
122
5-
Diskussion
synthetisierten Zuckers kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Die vorliegenden Daten geben keinen Aufschluß darüber, ob die PSA in den Kontrolltieren durch eine
rein additive Zusammenarbeit der zwei Polysialyltransferasen entsteht, oder ob entsprechend
des Vorschlags von Angata et al. (1998) sich die Enzyme kooperativ ergänzen und gemeinsam effektiver sind, als die Summe ihrer einzelnen Syntheseleistungen. Die beschriebenen
Daten sind in Tabelle 5.2 vereinfacht zusammengefaßt.
Tab. 5.2: Übersicht der Synthese von PSA-NCAM in Abhängigkeit der Expression von
ST8SiaII und -IV in der frühen Embryonalentwicklung der Maus.
Tag
8,5
(+/+)
ST8SiaIV
9,0
8,5
(-/-)
ST8SiaIV
9,0
mRNAST8SiaII
mRNAST8SiaIV
PSA
NCAM
(Protein und
mRNA)
a
a
a
a
a
a
∅
∅
a
a
∅
aschwach
a
a
a
a
∅: nicht vorhanden, a: vorhanden
Die Synthese von PSA-NCAM nahm von Tag 9,0 bis Tag 10,0 in den untersuchten Embryonen weiter zu und erstreckt sich über alle neuralen Gewebe, wie Gehirnvorläufer und Rückenmark, ebenso wie über die Somiten (Abb. 4.14). Der ST8SiaIV-knockout hat zu diesem
Zeitpunkt in den angewendeten Verfahren keine nachweisbaren Auswirkungen mehr auf die
Synthese von PSA-NCAM. Auf Ebene der mRNA zeigte sich eine signifikant geringere Expression von ST8SiaII und NCAM in den ST8SiaIV-knockout Mäusen (Abb. 4.27 und 4.28),
eine Problematik bei der Bewertung der vorliegenden Daten stellt allerdings die starke Streuung der Werte bei einer geringen Probenzahl dar. Weiterhin reflektieren die Expressionsdaten
einen Gesamteffekt aus der mRNA des kompletten Embryos, so dass ein deutlicher Anstieg in
der Expression eines Zielgens in wenigen Körperzellen durch einen moderaten Abfall in vielen Körperzellen maskiert werden könnte. Beginnend von Tag 10,0 wäre eine lichtmikroskopisch unterstützte Trennung verschiedener Körperregionen des Embryo möglich, exaktere
Hinweise auf das Verhalten der Neuralrohrzellen gäbe eine Lasermikrodissektion. Entsprechende Studien sind geplant.
123
5-
Diskussion
Der Nachweis von PSA während der Gehirnentwicklung an Tag 12,0 der Entwicklung entsprach den Beschreibungen von Ong et al. (1998)und wurde daher als Positivkontrolle genutzt. Die spezifische Endosialidaseaktivität der angewendeten EndoNF reduzierte die Reaktion auf eine unspezifische Färbung, während ohne den spezifischen ersten Antikörper die Färbereaktion vollständig beseitigt wurde (Abb. 4.15). Auch andere Autoren haben den AK 735
zur PSA-Färbung eingesetzt und hatten trotz der hohen Spezifität des Antikörpers Probleme
mit einer Hintergrundfärbung (Probstmeier et al., 1994; Ong et al., 1998). Die Hintergrundfärbung schränkte auch in der hier vorgestellten Arbeit die quantitative Bewertung der immunhistochemischen Nachweisreaktionen ein.
In fast allen untersuchten Geweben war NCAM gemeinsam mit PSA exprimiert. In keinem
Gewebe wurde PSA ohne NCAM nachgewiesen und in nur wenigen Regionen NCAM ohne
PSA. Diese Ergebnise bestätigen, dass NCAM im zellulären System der einzige natürliche
Akzeptor für PSA ist (Cremer et al., 1994). Die Regionen eines isolierten NCAM-Nachweises
an Tag 11,0 der Entwicklung waren die Herzentwicklung und einzelne Zellen der oberen
Hautschichten (Abb. 4.16). Die PSA-negative Herzentwicklung steht im Gegensatz zu Ergebnissen von Probstmeier et al. (1994) und Ong et al. (1998), in welchen das Herz in seiner
Entwicklung als PSA-positiv beschrieben wurde. Die NCAM-positiven Zellen der Haut sind
in der Literatur in dieser Ausprägung bisher nicht beschrieben. Zum Zeitpunkt der Fetalentwicklung wird die Epidermis als komplett NCAM-negativ charakterisiert, einzig mit NCAMpositiven Reaktionen von Nervenfasern (Nolte et al., 1999). Der vereinzelte Nachweis von
NCAM-positiven Zellen weist auf eine spezielle Funktion dieser Zellfraktion hin. Möglicherweise handelt es sich um Zellen, die sich funktionell von den anderen Epithelzellen unterscheiden oder die aus der Neuralleiste eingewandert sind und sich zu Melanoblasten differenzieren. Der Nachweis von NCAM und PSA in mesodermalen Geweben wird in der Ratte, im
Huhn und in der Lunge des Menschen bestätigt. Die Autoren stellen weiterhin fest, dass der
Verlust von PSA meistens mit einem Differenzierungsprozess der Zellen einhergeht (Lackie
et al., 1994).
Eine weitere Beobachtung waren partiell PSA-positive Neuriten im Rückenmark an Tag 11,0
der Entwicklung (Abb. 4.18). Auch diese Strukturen sind in der gefundenen Ausprägung bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. Auffallend war, dass vor allem die „Faserenden“ deutlich PSA-positiv waren, während sich die Strukturen in der NCAM-Färbung homo-
124
5-
Diskussion
gen positiv darstellten. Durch eine Versilberungsreaktion konnten die Strukturen als Zellausläufer von Neuroblasten identifiziert werden, eine weitere Bestimmung dieser Zellfraktion ist
anhand der vorliegenden Daten nicht möglich. Die Rolle der PSA als Wegweiser für die korrekte Innervation und Verzweigung der Nerv-Muskelverbindung während der Embryonalentwicklung ist im Hühnerembryo beschrieben (Landmesser et al., 1990; Tang et al., 1992), eine
ähnlich Funktionsweise wäre auch im Rückenmark denkbar.
5.5-
Die ST8SiaIV(-/-) Maus im Exenzephaliemodell
Durch die Charakterisierung der Embryonalentwicklung der ST8SiaIV knockout-Maus war
eine Anwendung des Tiermodells im Sinne der eigentlichen Fragestellung der Arbeit erst
möglich: Steht die Polysialylierung des NCAM in einem funktionellen Zusammenhang mit
den teratogenen Effekten der Valproinsäurederivate?
Die ST8SiaIV(-/-) Mäuse zeigten nach der Behandlung mit dem hochteratogenen S-Pentyl-4yn signifikant weniger Exenzephalie als die Kontrolltiere (Abb. 4.31). In einem Dosisbereich
von 0,6 bis 1 mmol/kg stieg die Exenzephalierate in den untersuchten Tieren in gleicher Weise bis auf ca. 17% an; aber während die Exenzephaliehäufigkeit dosisabhängig in den Kontrolltieren über 60% anstieg, verblieben die knockout-Mäuse bei einer Fehlbildungshäufigkeit
von 16- 17%. Dieser Effekt wurde in 3 Dosierungen gezeigt und einmal in der höchsten Dosierung mit dem gleichen Ergebnis wiederholt (Tab. 4.4 und 4.5). Zwischen den zwei Wiederholungsbehandlungen mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg lag ein Zeitraum von 5
(ST8SiaIV(+/+)) bzw. 8 Wochen (ST8SiaIV(-/-)). Der ST8SiaIV-Verlust und damit die Abwesenheit der PSA während der Behandlungen, führte nicht zu einer völligen Resistenz gegen
die teratogenen Effekte, sondern schien vielmehr die maximale Häufigkeit des Defektes einzuschränken. Die ST8SiaIV-defizienten Tiere folgten nur sehr eingeschränkt einer DosisWirkungsbeziehung. Auf immunhistochemischer Ebene lag der einzig nachgewiesene Unterschied zwischen den zwei Mäusestämmen zum Zeitpunkt der Behandlung bei der fehlende
PSA. Wie zuvor beschrieben wurde in den knockout-Tieren die PSA erstmals an Tag 9,0 der
Entwicklung schwach nachgewiesen. Wie ebenfalls bereits diskutiert, ergab sich aus dem
125
5-
Diskussion
Fehlen der PSA-Immunreaktivität jedoch keine Veränderung in der Geschwindigkeit der
Embryonalentwicklung.
Auffallend war, dass die ST8SiaIV-defizienten Tiere keine völlige Resistenz gegen die teratogenen Effekte des S-Pentyl-4-yn zeigten, sondern vielmehr nach einem sehr flachen Anstieg
der Dosis-Wirkungskurve ein geringes Maß an Exenzephalie nicht überschritten. Es besteht
die Möglichkeit, dass das angewendete immunhistologische Detektionsverfahren geringe
Mengen des Zuckers nicht nachweisen kann. Wenngleich diese Erklärung wahrscheinlich ist,
kann daraus nicht auf die Ursache des Phänomens geschlossen werden. Die VPA hat zahlreiche Angriffspunkte im Gesamtorganismus und innerhalb der einzelnen Zelle (siehe Einleitung: Kinetik, Stoffwechselwege, Proliferation, Zelldifferenzierung und Zelladhäsion, Kernrezeptoren, Genexpression) und jeder Effekt ist als Zusammenspiel zahlreicher Einzeleffekte
zu beurteilen. Weiterhin wurde der starke Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte des S-Pentyl-4-yn und der VPA bereits beschrieben. Da die ST8SiaIV(-/-)
Mäuse noch keinen Inzuchthintergrund besitzen, werden die beobachteten Effekte möglicherweise auch durch die genetische Konstellation weiter kompliziert.
Die Valproinsäure hat in der Maus eine sehr kurze Halbwertszeit von ungefähr einer Stunde,
die Halbwertszeit für S-Pentyl-4-yn wurde in der ST8SiaIV(-/-) Maus auf 2,2 Stunden berechnet (Abb. 4.42). Bei einer Verabreichung an Tag 8,25 der Trächtigkeit wäre die Substanz 18
Stunden später, wenn die PSA schwach synthetisiert wird, nicht mehr nachweisbar. Der Zeitpunkt der Defektinduktion ist ebenfalls zeitnah zur Verabreichung der Substanz zu sehen,
denn der teratogene Effekt der VPA ist direkt abhängig von den Spitzenkonzentrationen im
Plasma und nicht von der AUC (=area under the curve) (Nau, 1985). Der craniale Neuralrohrschluß findet in der Maus im Stadium von 1-7 Somitenpaaren statt, dies entspricht in den
hier untersuchten Mäusen einem Entwicklungszeitpunkt von spätestens Tag 8,5 der Entwicklung (Abb. 4.7). Zusammenfassend kann man davon ausgehen, dass der Prozess der Defektbildung in den untersuchten knockout-Mäusen in einem embryonalen Organismus ohne oder
mit sehr wenig PSA stattfindet.
Die teratogenen Effekte sollten im Zusammenhang mit der maternalen Toxizität diskutiert
werden, daher wurde die Neurotoxiziät im Rotarod-Test bestimmt. Für diese Fragestellung
wurde der Rotarod-Test gewählt, da er einerseits für die Tiere kaum invasiv und wenig belastend ist und zum anderen die einfache Berechnung vergleichbarer Daten ermöglicht. Die Neu-
126
5-
Diskussion
rotoxizität wurde in Anlehnung an die Plasmakinetik zum Zeitpunkt der maximalen Konzentration des Wirkstoffes 15 Minuten nach subkutaner Injektion und vergleichend in ST8SiaIV(-/)
Mäusen und in Kontrolltieren durchgeführt. Der TD50-Wert betrug ungefähr 1 mmol/kg und
unterschied sich nicht signifikant zwischen den beiden Tiergruppen (Abb. 4.32). Anscheinend
bestehen auch in der Neurotoxizität genetisch bedingte Unterschiede zwischen verschiedenen
Mäusestämmen, denn der TD50 - für S-Pentyl-4-yn im gleichen Verfahren für die NMRIMaus ermittelt - beträgt 1,5 mmol/kg (n= 6 je Dosis, Berechnung basiert auf 3 Dosaeirungen,
Dissertation J. Volland, Hannover 2002). Bezogen auf die eigenen Untersuchungen konnte
eine stärkere toxische Wirkung in den Kontrolltieren als Ursache der verstärkten teratogenen
Effekte ausgeschlossen werden.
Weiterhin kann die niedrigste verabreichte Dosis, mit der ein signifikanter Unterschied zwischen knockout- und Kontrolltieren erzeugt wurde, in Beziehung zur maternalen Toxizität
gesetzt werden. Diese Dosis betrug 1,3 mmol/kg und entspricht einer Dosierung, bei der
>50% der Muttertiere motorische Ausfallerscheinungen aufgrund der Neurotoxizität zeigten.
Trotzdem ist die Annahme falsch, dass jede Substanz teratogen wirken kann, wenn nur die
Dosierung hoch genug ist. Fetale Anomalien infolge von Toxizität äußern sich in einem geringeren fetalen Gewicht und gehemmter Knochenentwicklung oder verschmolzenen Rippenpaaren (Black & Marks, 1992). Die toxischen Effekte von S-Pentyl-4-yn äußerten sich in
einem verringerten Fetalgewicht ab einer Dosierung von 0,8 mmol/kg (Tab. 4.5). Als weiterer
Parameter wurde die Resorptionsrate genutzt, die zum einen keine signifikanten Unterschiede
zwischen (+/+) und (-/-) Tieren zeigte und weiterhin durch die Behandlung nicht generell höher war als in den ohne Wirkstoff behandelten Kontrollgruppen. Dies verdeutlicht, dass der
ST8SiaIV-knockout keine verstärkte Embryoletalität verursacht, und dass die geringeren Exenzephalieraten der Knockouts nicht durch eine verstärkte Lethalität verursacht wurden.
Vergleichend zur Behandlung der ST8SiaIV(-/-) Mäuse wurde eine Behandlung heterozygoter
knockout-Tiere mit S-Pentyl-4-yn in 3 Dosierungen durchgeführt. Dieser Versuch folgte zwei
Fragestellungen: Erstens sollte analog zur (-/-) Maus der Behandlungseffekt von S-Pentyl-4yn im Exenzephaliemodell dargestellt werden und dadurch die Empfindlichkeit auf die teratogenen Effekte wiederholt in Beziehung zum PSA-Spiegel gestellt werden. Die zweite Fragestellung behandelte eine mögliche Beeinflussung der Teratogenität durch maternale oder
paternale Parameter. Hinweise auf einen möglichen Effekt durch Imprinting geben Arbeiten,
127
5-
Diskussion
die den stärkeren Einfluß des maternalen Elternteiles auf die Exenzephaliehäufigkeit nach
VPA-Behandlung der Nachkommen beschreiben (Sidney & Beck, 1999; Beck, 2001). Die
direkte Hypo- bzw. Hypermethylierung eventueller Zielgene wird allerdings nicht beschrieben, zumal die Zielgene der VPA-Teratogenität noch weitgehend unbekannt sind. In der vorliegenden Arbeit konnte kein verstärkter Einfluß der maternalen oder paternalen Seite auf
teratogene und reproduktionstoxikologische Parameter beobachtet werden (Tab. 4.6).
Die erhobenen Daten im Vergleich zwischen (+/-) und (-/+) Tieren stimmen gut überein. Da
keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden konnten, wurden die Werte der gleichartig
behandelten (+/-) und (-/+) Tiere zum Vergleich mit ST8SiaIV(-/-) und
(+/+)
zusammengefaßt.
Im Verhältnis zu den ST8SiaIV-knockouts und den homozygoten Kontrolltieren entwickeln
die heterozygoten Mäuse Exenzephalien in mittlerer Häufigkeit. Die Untersuchung der heterozygoten Tiere wurde in 3 verschiedenen Dosierungen durchgeführt, die Exenzephaliehäufigkeit nach der höchsten Dosis ist signifikant niedriger als die Häufigkeit in den homozygoten (+/+) Mäusen (Abb. 4.31). Der PSA-Nachweis wurde in den heterozygoten Embryonen
nicht durchgeführt; aufgrund der vorliegenden Daten und den Angaben zur ST8SiaIVExpression in den adulten Mäusen (Eckhardt et al., 2000) sei jedoch die Annahme einer geringen PSA-Synthese zum Zeitpunkt der Behandlung erlaubt. Diese Annahme erklärt jedoch
den beobachteten Behandlungseffekt im Sinne der Hypothese nur ungenügend, denn wenn es
sich bei PSA-NCAM um eine Zielstruktur der VPA-Teratogenese handelt, so sollte bei einer
geringen PSA-Synthese eine deutlich höhere Exenzephalierate im Vergleich zu den Knockouts ohne PSA resultieren. Die Abb. 4.20 verdeutlicht jedoch, dass die Exenzephalierate nur
halb so hoch ist im Vergleich zu den homozygoten Kontrolltieren und lediglich das zweifache
der Exenzephalierate der Knockouts beträgt.
Die beobachteten Behandlungseffekte in ST8SiaIV knockout-Mäusen wurden in Beziehung
zur Expression der untersuchten Zielgene NCAM, ST8SiaII und –IV gesetzt. Die Ergebnise
dieser Expressionsstudie bedürfen einiger grundsätzlicher Bemerkungen. Die Methodik der
RT-PCR hat trotz der ausgesprochen geringen Probenmenge zuverlässig funktioniert. Die
verwendeten Primersequenzen wurden für diese Anwendung entwickelt und haben reproduzierbare Daten geliefert. Die Gefahr des SybrGreen-Assays einer möglicherweise unspezifischen Amplifikation und falsch-positiven Ergebnissen wurde durch die Auftrennung der
PCR-Produkte in einem hochauflösenden Acrylamidgel ausgeschlossen. Die Negativkontrol-
128
5-
Diskussion
len und der Einsatz der St8SiaIV-Primer in den Knockouts zeigen eindeutig die kontaminationsfreie Durchführung der Arbeit (Abb. 4.19 bis 4.22 , 4.24, 4.25). Zusätzlich zu den durchgeführten Genotypisierungen (Abschnitt 4.4.3) hat diese Studie eine unabhängige Bestätigung
der eingesetzten Genotypen ermöglicht.
Die Expression der Zielgene in jeder Behandlungsgruppe wurde in jeweils 3 Embryonen bestimmt. Die Ergebnise sind immer unter der Einschränkung der geringen Gruppengröße zu
betrachten. Die große Streuung der Werte sollte unter folgenden Gesichtspunkten bewertet
werden: Ebenso wie bei der Analyse der Embryonalentwicklung diskutiert, können bei der
Isolierung der mRNA des gesamten Organismus geringe Effekte maskiert werden. Die Embryonen wurden streng zufällig ausgewählt und zu den frühen Zeitpunkten der Entwicklung
konnte keine Entscheidung über eine Mißbildung des Embryo getroffen werden. Theoretisch
ist es möglich, dass extreme Werte in dieser Studie die Situation in Embryonen mit Exenzephalie wiedergeben, während andere Werte der gleichen Behandlungsgruppe von gesunden
Embryonen stammen. Trotz dieser einschränkenden Bewertung erlauben die vorliegenden
Daten einige Rückschlüsse auf die Behandlungseffekte.
Die Expression des NCAM zeigte eine schwache Reaktion auf die Behandlung. Während die
Behandlung der knockout-Tiere keine nachweisbaren Effekte auf die Expression des NCAM
hatte, führte die Behandlung in den Kontrolltieren zu einem leichten Rückgang der NCAMExpression. Dieser Effekt, der zur Zeit nicht erklärt werden kann, bedarf der Erhärtung durch
die Analyse größerer Tiergruppen. Ein deutlicher Anstieg des NCAM kann für den Gesamtembryo ausgeschlossen werden (Abb. 4.33). Die ST8SiaII-mRNA-Spiegel reagierten nicht auf
die Behandlung. Die Abb. 4.38 zeigt, dass die ST8SiaII an Tag 10,0 in behandelten (+/+) Tieren signifikant geringer exprimiert wird. Dieser Effekt spiegelt aber im Gegenteil zur Reduktion der NCAM-Expression keine Tendenz wieder, sondern muss als Einzeleffekt bewertet
werden, der sich nicht zuletzt durch die, in diesem Falle geringe Streuung innerhalb der unbehandelten Kontrollgruppe ergibt; der Effekt sollte daher nicht überbewertet werden. Die
ST8SiaIV zeigt in zwei verschiedenen Behandlungsgruppen an Tag 9,0 und an Tag 10,0 der
Entwicklung eine geringere Expression nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn (Abb. 4.39).
129
5-
Diskussion
NCAM
PSA-NCAM
ST8SiaIV(+/+)
unbehandelt
ST8SiaIV
ST8SiaII
E 8,25
E 8,5
E 9,0
PSA-NCAM
E 10,0
NCAM
(+/+)
ST8SiaIV
behandelt
Behandlung
E 8,25
ST8SiaIV
ST8SiaII
E 8,5
NCAM
ST8SiaIV(-/-)
behandelt und
unbehandelt
E 9,0
E 10,0
PSA-NCAM
NCAM
(Behandlung)
E 8,25
ST8SiaII
E 8,5
E 9,0
E 10,0
Abb. 5.1: Auswirkungen der Behandlung mit S-Pentyl-4-yn auf die Expression von ST8SiaII,
-IV und NCAM in der ST8SiaIV knockout-Maus und Kontrolltieren.
Die Abb. 5.1 verdeutlicht, dass die Expression der Zielgene derzeit nicht in Einklang mit den
Erwartungen der Arbeitshypothese steht. Ausgehend von den immunhistologischen Daten war
die Erwartung eine VPA-induzierte Hochregulation der Expression des NCAMs und/oder der
Polysialyltransferasen. Die bislang vorliegenden Daten sprechen jedoch, wenigstens im Falle
des NCAMs, für den ungekehrten Effekt, die Reduktion der mRNA-Expression. Diese Befunde befinden sich derzeit auch im Widerspruch zu Untersuchungen auf zellulärer Ebene.
NCAM wird in verschiedenen Tumorzelllinien in Reaktion auf eine VPA-Behandlung verstärkt exprimiert (Bojic et al., 1998; Knüpfer et al., 1998; Cinatl Jr. et al., 2002), in diesen
Arbeiten wurden verschiedene Kulturen von Neuroblastomzellen und maligne Gliomzellen
verwendet. Die Arbeit von Bojic et al. beschreibt einen dosisabhängigen Anstieg der antiNCAM Immunoreaktivität in Reaktion auf die Behandlung mit rac-Pentyl-4-yn. In-vivo beschreibt ein Tagungsbeitrag eine mögliche Erhöhung der NCAM 180 kD Isoform im Embryo
130
5-
Diskussion
in Reaktion auf die VPA-Behandlung (Terry et al., 1997). Die erhöhte NCAM-Expression
scheint allerdings kein generelles Prinzip darzustellen. Einige von Patienten isolierte Neuroblastomzellen zeigen keinerlei Beeinflussung des NCAM durch die VPA-Behandlung (persönliche Mitteilung von J. Cinatl, Februar 2004).
Eine direkte und funktionelle Verbindung von der Genexpression zur Proteinsynthese und
zum biologischen Effekt kann anhand der vorliegenden Daten nicht gezogen werden, die regulativen Schritte sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt unbekannt. Bei der Beurteilung sollte
jedoch nicht der Gesamtorganismus aus den Augen verloren werden. Die Vorgänge, die zu
einem korrekt angelegten Neuralrohr führen, beeinhalten neben der Fusion der Neuralfalten
eine Vielzahl fein regulierter Einzelschritte, die im System eine tragende Rolle spielen. Es
bleibt auch zu bedenken, dass das Fehlen der PSA zu dem sehr frühen Zeitpunkt der Entwicklung keine wesentliche Beeinträchtigung des Systems darstellt, d.h. entgegen der Hypothese
der Funktion der PSA offensichtlich keine Defekte in der koordinierten Wanderung der Zellen
zu diesem Zeitpunkt auftreten. Die derzeit geltende Hypothese lautet, dass PSA gebraucht
wird, um die adhäsiven Eigenschaften des NCAM in Wanderungsschritten zu kompensieren.
Eine gleichermaßen erstaunliche Feststellung bei der Erforschung des NCAM-knockout Phänotyps war, dass keinerlei Defekte während der Embryonalentwicklung auftraten (Cremer et
al., 1994). Wenn den eigenen Ergebnissen zufolge NCAM in Reaktion auf die Behandlung
verringert exprimiert wird, könnte dies also in Kompensation zur Zelladhäsion erfolgen und
damit den NCAM-knockout simulieren.
5.6-
S-Pentyl-4-Pentinsäure
Die S-Pentyl-4-Pentinsäure wurde als Modellsubstanz dieser Arbeit ausgewählt. Bereits in der
Racematform zeigte die Fettsäure eine enorme Potenz in ihrer antiproliferativen und prodifferenzierenden Wirkung in verschiedenen neuralen Tumorzellen. In dieser Arbeit wurde
bereits eine Assoziation zur NCAM-Expression hergestellt (Bojic et al., 1998). Das Racemat
zeigte in-vivo eine Verbesserung der Lernleistung bei Ratten, auch dieser Effekt wurde mit
der Expression des NCAM korreliert (Murphy et al., 2001). Die Synthese des Enantiomers
bewirkte eine weitere Steigerung der antikonvulsiven, neurotoxischen und teratogenen Wir-
131
5-
Diskussion
kung der Substanz (Dissertationen U. Gravemann und J. Volland, Hannover 2001 und 2002).
Das S-Pentyl-4-yn war für den Einsatz im Sinne der grundlagenorientierten Fragestellung
eine ideale Substanz, da erstmalig in-vivo der Zusammenhang zwischen der Teratogenität und
der Polysialylierung des NCAM hergestellt werden sollte und daher der Einsatz eines möglichst potenten Wirkstoffes gefragt war.
Die Kinetik des rac-Pentyl-4-yn wurde bereits in der Ratte beschrieben, der Schwerpunkt lag
in dieser Arbeit allerding auf der gesamten Eliminationszeit bis zur Nachweisgrenze und der
Anflutungszeit bis zum Plasmamaximum. Das Plasmamaximum war 15 bis 30 Minuten nach
intraperitonealer Injektion erreicht und die Elimination der Substanz bis zur Nachweisgrenze
dauerte 2 Stunden (Murphy et al., 2001). Die Halbwertszeit wurde nicht berechnet und kann
aus den angegebenen Daten nur als unter 1 Stunde geschätzt werden. Die schnelle Anflutung
entspricht den eigenen Ergebnissen für das S-Pentyl-4-yn; das Plasmamaximum war abhängig
vom Mausstamm etwa 15 bis 30 Minuten nach subkutaner Injektion erreicht. Die berechneten
Halbwertszeiten in den untersuchten Mäusestämmen betrugen zwischen 1,8 und 2,4 Stunden,
damit verblieb das S-Pentyl-4-yn ungefähr doppelt so lange wie VPA im Organismus
(Abb.4.42 und 4.44). Ebenso schien die Blut-Hirnschranke keine große Barriere darzustellen:
Aus dem Gehirn konnte ohne Unterscheidung verschiedener Gehirnbereiche bereits 7 Minuten nach der subcutanen Injektion der Wirkstoff detektiert werden, das Maximum im Gehirngewebe war mit einer Verzögerung zum Plasmapeak von 45 bis 60 Minuten erreicht (Abb.
4.41). Die Konzentrationen im Gehirngewebe schwankten zwischen der Hälfte und einem
Drittel der Plasmakonzentrationen zum gleichen Meßzeitpunkt. Die Plasmaproteinbindung
der VPA in der Maus liegt zwischen 30 und 50% (siehe Abschnitt 1.2.3.3, Überblick bei Nau
(1986a)), wenn für die S-Pentyl-4-yn eine gleiche Proteinbindung angenommen wird, so befindet sich der gesamte freie Anteil der Fettsäure im Gehirn.
Zur Untersuchung der Kinetik des S-Pentyl-4-yn wurden Gruppen von drei weiblichen Mäusen mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg behandelt und zu verschiedenen Zeitpunkten zur Blutentnahme narkotisiert und getötet, um das Gehirn zu entnehmen. Die relativ hohe Dosierung
wurde gewählt, um die Situation analog zum Exenzephaliemodell darzustellen. Im Exenzephaliemodell wurde bei dieser Dosierung ein signifikanter Unterschied in der DosisWirkungsbeziehung zwischen ST8SiaIV(+/+) und
(-/-)
Mäusen gefunden. Die Untersuchung der
Kinetik analog zum Exenzephaliemodell im Vergleich der zwei Mäusestämmen sollte mögli-
132
5-
Diskussion
che Unterschiede in der Kinetik aufzeigen und die beobachteten und gemessenen Behandlungseffekte in ein Verhältnis zu den erreichten Plasmaspiegeln setzen. Die Untersuchung der
Kinetik in der NMRI-Maus wurde ergänzend durchgeführt, um die Aussagen auch auf die
herkömmlich in der Arbeitsgruppe eingesetzten Mäuse anwenden zu können.
Der Nachteil bei der Applikation von hohen Dosen kann eine Sättigungskinetik sein. Der
Kurvenverlauf der Plasmakonzentration in ST8SiaIV(-/-) gibt keinen Hinweis auf mögliche
Sättigungsmechanismen. Bei einer Sättigung von Metabolisierungs- oder Umverteilungsvorgängen wäre ein linearer Kurvenverlauf im Sinne einer Kinetik 0. Ordnung zu erwarten.
Üblicherweise werden in pharmakokinetischen Untersuchungen mehrere Proben im Zeitverlauf von dem selben Tier genommen, so kann z.B. mit Hunden eine Studie über viele Entnahmezeitpunkte bis zur vollständigen Eliminierung des Stoffes geplant werden. Die Durchführung war in dieser Arbeit nur mit Mäusen möglich, und die Körpergröße der Maus
schränkte die Möglichkeiten der Versuchsplanung ein. Die Blutentnahme mit Hämatokritkapillaren ist in zeitlichem Abstand mehrmals an einer Maus möglich. Bei einem Körpergewicht
der knockout-Mäuse von 20 g würde diese Maus ein Gesamtblutvolumen von ca. 7 %, entsprechend ca. 1,4 ml besitzen. Die Untersuchung in den ST8SiaIV(-/-) Mäusen fand über 7
Entnahmezeitpunkte in 6 Stunden statt. Bei einem minimalen Entnahmevolumen vn 40 µl in
einer Hämatokritkapillare betrüge der Blutverlust 280µl und damit schon 20 % des Gesamtblutvolumens. Die Tiere wären stark belastet und die physiologischen Parameter der normalen
Körperfunktion wären nicht gewährleistet. Die Tötung der Tiere nach der Blutentnahme ermöglichte weiterhin die einfache Entnahme von Geweben. Die Analytik müßte mit minimalen
Plasmamengen von weniger als 30 µl auskommen, dies schränkt die Möglichkeit von Wiederholungsmessungen stark ein. Ein analytisches Verfahren, wie es in dieser Arbeit durchgeführt wurde, benötigt eine minimale Plasmamenge von 50 µl.
Im Vergleich der untersuchten Mäusestämme sind drei unterschiedliche Halbwertszeiten berechnet worden: 1,8 Stunden für ST8SiaIV(+/+), 2,2 Stunden für ST8SiaIV(-/-) und 2,4 Stunden
für NMRI. Einerseits sollte angesichts der kleinen Gruppengrößen ein Unterschied von 36
Minuten nicht überbewertet werden, andererseits fällt im Vergleich zu NMRI die langsamere
Anflutungsphase auf. Ein möglicher Faktor dieser Unterschiede könnte das unterschiedliche
Körpergewicht der untersuchten Mäuse bei gleichem Alter (± 2 Monate) sein. In den vorgestellten Studien betrug das durchschnittliche Gewicht der Tiere (M. ± S.D.):
133
5-
Diskussion
NMRI: 34,3 ± 7,6
ST8SiaIV(+/+): 24,8 ± 1,9
ST8SiaIV(-/-): 20,4 ± 2,8
Für die Kinetik der VPA sind zahlreiche Faktoren als Unterschiede zwischen verschiedenen
Spezies beschrieben (zusammengefaßt bei: Nau (1986a)), auch zwischen verschiedenen
Stämmen innerhalb einer Spezies sind Unterschiede in der Metabolisierung möglich. Anhand
der vorliegenden Daten kann über das Muster der entstehenden Metabolite keine Aussage
getroffen werden.
Die teratogenen Mechanismen einer Substanz können viele Parallelen zu Wirkstrategien in
der Tumorbekämpfung aufweisen; die VPA ist ein sehr gutes Beispiel für diese Theorie. VPA
wirkt hemmend auf den Zellzyklus, induziert Apoptose und Differenzierung, wirkt auf die
Metastasierung und Immunogenität von Tumoren, und hat Effekte auf die Angiogenese (zusammenfassender Überblick bei: Blaheta et al. (2002)). Die VPA-Derivate und insbesondere
die hochteratogenen Derivate sind daher auch im Gebiet der Tumorforschung von Interesse.
S-Pentyl-4-yn steht ebenso wie die Racematform in ihrer eventuellen Anwendung als neuroprotektive und anti-neoplastischen Substanz unter Patentschutz .
5.7
Einfluß von VPA-Derivaten auf die Differenzierung fetaler
Hippocampuszellen
Der Einsatz der ST8SiaIV(-/-) Maus im Exenzephaliemodell hat die Teratogenität des SPentyl-4-yn in einen funktionellen Zusammenhang mit der Polysialylierung des NCAM gestellt; wie aber die Ergebnise der Genexpressionsstudien zeigten, blieb ein möglicher Mechanismus weiterhin unklar. Um zu prüfen, of die beobachteten VPA-Effekte in anderen NCAMund PSA-tragenden Systemen gleichgerichtet ablaufen, sollten die Experimente in einem vereinfachten, zellulären System durchgeführt werden. Um die in-vivo Situation möglichst gut
anzunähern, viel die Entscheidung für eine Primärkultur von Zellen. Im Rahmen eines Gastaufenthaltes im Labor von Prof. Elisabeth Bock sollte die in diesem Labor vorhandene Expertise im Bereich hippocampaler Primärkulturen genutzt werden. Hippocampuszellen wurden
134
5-
Diskussion
aus Rattenfeten kurz vor der Geburt isoliert und stark verdünnt für 24 Stunden kultiviert. Zellen dieses Stadiums wurden ausgewählt, weil hier eine starke Polysialylierung des NCAM
auftritt, d.h. nahezu alle Zellpopulationen des Hippocampus sind zu diesem Zeitpunkt
NCAM- und PSA-positiv, so dass in einem ersten Ansatz keine weitere Charakterisierung der
Zellen erfolgen musste. Im Gegenteil, die Unterschiedlichkeit der Zellpopulation sollte Aufschluss darüber geben, ob im Mittel alle Zelltypen in gleicher Weise auf VPA und seine Derivate reagierten. Ein weiterer Vorteil dieser Zellpopulation bestand in der Möglichkeit, das
Neuritenwachstum als leicht zugänglichen und standardisierbaren Differenzierungsmarker zu
bewerten. Die serumfreie Kultur der Zellen sicherte darüber hinaus eine streng vereinheitlichte Durchführung und die Vergleichbarkeit der Versuche.
Aufgrund des zeitlich engen Rahmens konnte in den hier vorgestellten Studien keine Vitaloder Apoptosefärbung durchgeführt werden, allerdings bildeten die Beobachtung der Differenzierung und des Neuritenwachstums ausreichende Kontrollen für das System. Typische
Anzeichen von absterbenden Zellen wie die Ablösung von der Unterlage und Abkugelung
oder andere Formveränderungen konnten in keiner Untersuchungsgruppe festgestellt werden.
Die Studie der Pharmakokinetik hat die Konzentrationen im Gehirngewebe und im Plasma
der lebenden Maus aufgezeigt, die nach Injektion einer hohen Dosis des S-Pentyl-4-yn erreicht werden. Die Konzentrationen in-vitro waren diesen Dosierungen angepaßt: Der
Wirkstoffpeak im Gehirngewebe betrug 266 µg/ml, dies entspricht bei einem Molekulargewicht von 168,23 g/mol einer Konzentration von 1,6 mM, die Maximalkonzentration im
Plasma betrug 3,4 mM (Abb. 4.41). Die maximalen Konzentrationen im Zellmedium in-vitro
betrugen 2 mM und waren damit im Bereich der in-vivo ereichten Plasmakonzentrationen.
Die durchgeführte Studie hat gezeigt, dass VPA und die teratogenen Derivate das Neuritenwachstum in fetalen Rattenhippocampuszellen innerhalb von 24 Stunden erhöhen. Die verwendete Methode zur Auswertung mittels eines Rasterzählverfahrens gab dabei Hinweise auf
eine Beeinflussung der Neuritenlänge, es konnten jedoch keine Aussagen über eine verstärkte
Vernetzung gemacht werden. Die Tab. 5.3 gibt einen Überblick über die Teratogenität der
verwendeten Stoffe und das induzierte Neuritenwachstum aus Tab. 4.8. Diese Gegenüberstellung zeigt, dass der Effekt auf die Hippocampuszellen in einer Beziehung zu den teratogenen
Effekten in-vivo steht. Das nicht-teratogene Isopropyl-4yn zeigt keine Effekte, während das
stark teratogene S-Pentyl-4-yn das Neuritenwachstum deutlich verstärkt. Die Mechanismen
135
5-
Diskussion
scheinen in-vitro genauso spezifisch wie in-vivo zu sein, denn das verwendete System vermag
die zwei Enantiomeren S- und R-Pentyl-4-yn zu unterscheiden. Die dargestellten Effekte folgen einer Dosis-Wirkungsbeziehung (Tab. 4.8, Abb. 4.45). Eine Ausnahme ist das S-Pentyl-4yn, das in der höchsten Konzentration von 2 mM weniger Neuritenwachstum induziert als bei
0,5 mM. Da S-Pentyl-4-yn die teratogenste der eingesetzten Substanzen ist, kann ein beginnender toxischer Effekt vermutet werden.
Tab. 5.3: Die Teratogenität der verwendeten VPA-Derivate im Vergleich zum induzierten
Neuritenwachstum.
DMSO 0,1%
Isobutyl-4-yn(2)
CH3 H
Neuritenwachstum (1)
(µm)
⎯
3,0 ± 1,2
3,11
6,1 ± 1,1
3,0
7,2 ± 1,1
0,72
8,8 ± 2,2
COOH
COOH
R-Pentyl-4-yn(3)
VPA(3)
TeraD50 (mmol/kg)
im Exenzephaliemodell
⎯
H
COOH
COOH
S-Pentyl-4-yn
2,2 ± 1,2
(1): angegeben sind Mittelwert ± Standardabweichung aus 4 unabhängigen Versuchen bei einer 0,5
mM Konzentration von VPA und Derivaten
(2): nicht-teratogene Substanz (Dissertation J. Volland, Hannover 2003)
(3): TeraD50-Werte aus: Dissertation J. Volland, Hannover 2003
Das Neuritenwachstum ist in unreifen Nervenzellen ein Ausdruck von Differenzierungsvorgängen; dieses Verhalten ist auch für die Kultur der fetalen Rattenhippocampuszellen beschrieben (Maar et al., 1997). NCAM ist in Nervenzellen, wie z.B. Neuroblastomzellen, ein
Differenzierungsmarker, während die embryonale PSA-NCAM Form in vielen Nervenzellen
Kennzeichen eines unreifen Stadiums ist und daher z.B in Formen des Neuroblastoms als klinischer Marker für die Malignität genutzt wird (Glüer et al., 1998). Eine Besonderheit des
Hippocampus besteht darin, dass die zur Teilung fähigen Zellen der Körnerzellschicht lebenslang PSA-positiv bleiben (Becker et al., 1996; Seki & Rutishauser, 1998).
136
5-
Diskussion
In der adulten Hippocampuszelllinie HN33 wurde durch chronische VPA-Exposition die Differenzierung induziert und dieser Effekt über Genexpressionsstudien in einen Kontext zur
neuralen Plastizität des Systems gestellt (Watterson et al., 2002). In der hier vorgestellten
Arbeit wurde die Differenzierung dieser Zellen erstmals mit der Teratogenität von VPADerivaten in Verbindung gebracht und die besondere Wirkung der Substanz S-Pentyl-4-yn
gezeigt.
Die Steigerung der NCAM- und PSA-Expression durch die VPA-Behandlung wurde in den
Abb. 4.48 und 4.49 veranschaulicht. Die abnehmende Proliferation und verstärkte Differenzierung wird in diesen Zellen mit einer NCAM-NCAM- Bindung oder der NCAM-Bindung an
heterophile Bindungspartner korreliert (Amoureux et al., 2000). In Analogie zu den beobachteten Effekten in-vivo wurde versucht, die differenzierenden Effekte mit der PSA-Synthese zu
korrelieren. Die Entfernung der PSA war erfolgreich, wie die Abb. 4.49 dokumentiert, der
induzierende Effekt auf das Neuritenwachstum war jedoch in Zellen ohne PSA der gleiche
wie in den nicht-vorbehandelten Zellen (Abb. 4.46). Die Polysialylierung des NCAM hatte
keinen erkennbaren Einfluß auf die differenzierende Wirkung der teratogenen VPA-Derivate.
Den Untersuchungen von Amoureux et al. (2000) zufolge schließt diese Erkenntnis aber eine
Verstärkung der NCAM-Expression als Ursache der Differenzierung und des Neuritenwachstums nicht aus. Das als Positivkontrolle genutzte P2-Peptid wird als NCAM-Ligand beschrieben (Soroka et al., 2002) und zeigt eine sehr starke Anregung des Neuritenwachstums
(Abb. 4.47). Eine verstärkte NCAM-Expression könnte die vergleichsweise schwache, aber
erkennbare Induzierung erklären. Diese Annahme geht allerdings nicht konform mit den Ergebnissen in-vivo, was wiederum einen deutlichen Hinweis dafür liefert, dass die Komplexität
des Systems im dissoziierten zellulären System wahrscheinlich nicht erhalten bleibt.
VPA und teratogene Derivate haben auch in anderen Nervenzellsystemen eine Differenzierung und eine erhöhte NCAM-Expression bewirkt, wie in verschiedenen Neuroblastomzellen
(Cinatl Jr. et al., 1996; Skladchikova et al., 1998; Bojic et al., 1998), C6-Gliomzellen
(Courage-Maguire et al., 1997; Bojic et al., 1998) und primären Kleinhirnzellkulturen (Maar
et al., 1997), trotzdem scheint dieser Effekt nicht generell in allen Zellen zu wirken; in Chondroblasten zeigen VPA sowie R- und S-Propyl-4-yn eine antidifferenzierende Wirkung
(Bacon et al., 1998).
137
5-
Diskussion
Diese Effekte der VPA und ihrer Derivate sind nicht nur in der Teratologie, sondern insbesondere in der Tumorforschung von Interesse. Die Differenzierung verschiedenster Tumoren,
wie verschiedene Karzinome, haematoblastische Tumoren, Neuroblastom und leukaemischer
Blasten wird mit der Inhibierung der Histondeacetylasen (HDAC) erklärt. Während Göttlicher
et al. (2001) die gesteigerte HDAC-Inhibition des S-Propyl-4-yn beschreiben, gelingt Phiel et
al. (2001) auch die Korrelation zu den teratogenen Effekten. Die verstärkten Hinweise auf die
Gemeinsamkeiten zwischen teratogener und anti-tumoraler Wirkung lassen die Erforschung
der teratogenen VPA-Derivate neben der Risikoabschätzung und der Prävention von Neuralrohrdefekten auch als mögliche Wirkstoffe in einem neuen Zusammenhang erscheinen.
5.8
Ausblick
Die hier vorgestellte Arbeit hat erstmals in-vivo einen funktionellen Zusammenhang zwischen
der Polysialylierung des NCAM und der Entstehung der Exenzephalie durch das teratogene
VPA-Derivat S-Pentyl-4-Pentinsäure gezeigt. Die Untersuchungen in-vivo und in-vitro haben
jedoch viele neue Fragen aufgeworfen. Der Zusammenhang zwischen der Expression der untersuchten Zielgene und dem beobachteten biologischen Effekt bleibt weiterhin unklar. Diese
Experimente zeigen daher sehr deutlich, dass nicht eine Zielstruktur, sondern die fein regulierte Koordination zwischen überlagerten Reaktionsebenen im Netzwerk unterschiedlicher, in
Kontakt und kommunikativem Austausch stehender Zellsysteme die Funktionen im Verlauf
ontogenetischer und funktioneller Prozesse steuern.
In diesem komplexen System haben sich die teratogenen VPA-Derivate als wertvolle Instrumente für die weitere Arbeit bewiesen, die in Kombination mit knockout-Mausmodellen molekulare Mechanismen im lebenden Organismus greifbar machen. Zur weitergehenden Bearbeitung der Fragestellung erscheint z.B. die NCAM-knockout Maus hochinteressant. Die Lasermikrodissektion bietet die Möglichkeit, die Genexpression in kleinen Zellgruppen des Gesamtorganismus zu betrachten. Ein Versuchsansatz mit dieser Technik würde den Vergleich
von Zellen in der Schließungszone des Neuralrohres mit Zellen aus den Randgebieten oder
Neuralleistenzellen ermöglichen. Eine Einschränkung der angewandten Genexpressionsstudie
auf spezielle Zellgruppen sollte die Effekte der VPA-Derivate eindeutiger darstellen.
138
5-
Diskussion
Bedauerlicherweise schränkt die Notwendigkeit eines fertilen und reproduktionsfähigen Organismus die Verwendung von knockout- oder knockin-Modellen stark ein. Wie in dieser
Arbeit gezeigt wurde, kann die genauere Betrachtung der Embryonalentwicklung auch bei
fertilen und lebensfähigen Mausmodellen neue Einblicke in molekulare Mechanismen gewähren. Die Phänotypisierung von gezielten oder zufälligen Mutationen sollte bei interessanten
Zielgenen nicht auf das adulte Tier beschränkt bleiben; von besonderem Interesse ist diese
Aufgabenstellung bei erhöhter embryonaler Sterblichkeit. Auf dem Gebiet der Verhaltensbiologie hat die adulte ST8SiaIV-knockout Maus interessante Tendenzen gezeigt, die eine nähere
Betrachtung wert sind. Anhand gezielter Fragestellung könnte von dem Verlust der PSA in
speziellen Gehirnbereichen auf grundlegende Mechanismen in Lern- oder Verhaltensabläufen
geschlossen werden.
Die S-Pentyl-4-Pentinsäure hat in diese Arbeit eine erstaunliche Wirkpotenz gezeigt und sollte in der Erforschung als möglicherweise anti-tumoraler oder neuroprotektiver Wirkstoff weiterhin Beachtung finden. Die Teratogenität ist eine sehr ernste Nebenwirkung, aber wenn sich
gegenwärtige Tendenzen bestätigen, so birgt der teratogene Effekt auch die anti-tumorale
Wirkung in sich. Die Thalidomid-Katastrophe hat die Konsequenzen eines nicht ausreichend
kontrollierten Einsatzes des teratogenen Wirkstoffes gezeigt, trotzdem erlebt Thalidomid bei
sehr gezieltem Gebrauch eine Renaissance in der Bekämpfung von Tumorerkrankungen.
NCAM und die Polysialylierung des NCAM sind nicht nur im Bereich der Teratogenese und
der Tumorforschung spannende Zielstrukturen. Viele neurodegenerative Erkrankungen konzentrieren sich in dem Problem, dass die adulte Nervenzelle nicht regenerationsfähig ist. Die
PSA ist ein Faktor, der eine Nervenzellen befähigt, sich lebenslang zu vernetzen und zu teilen. Das „embryonale NCAM“ könnte eine Schlüsselstellung in der Therapie von Erkrankungen wie z.B. Demenzen einnehmen, wenn die gezielte Beeinflussung dieses Systems möglich
wäre.
139
6-
6-
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
Studien zur Bedeutung des Neuralen Zelladhäsionsmoleküls und der Polysialinsäure in
der Entstehung von Valproinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten
Katrin Hoffmann
Die Valproinsäure (2-n-Propyl-Pentansäure, VPA) ist eine kurzkettige, einfach verzweigte
Fettsäure. VPA ist weltweit eines der am häufigsten eingesetzten Antiepileptika; das Einsatzgebiet ist ausgesprochen vielfältig und erstreckt sich über generalisierte und partielle Krampfanfälle sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern. Ein weiteres großes Einsatzgebiet der
VPA ist die Migräneprophylaxe und die Behandlung manisch-depressiver Erkrankungen. Eine aktuelle Entwicklung im vielfältigen therapeutischen Einsatz der VPA ist die antikanzerogene Wirkung, die bereits klinisch in der Bekämpfung maligner Gliome bei Kindern
genutzt wird. Dem großen therapeutischen Potential stehen allerdings zwei schwere Nebenwirkungen gegenüber: eine idiosynkratische Hepatotoxizität und die Teratogenität. Die teratogenen Effekte der Valproinsäure verursachen beim Menschen als einzige schwere Fehlbildung die Spina bifida aperta. Die Häufigkeit dieses Defektes ist bei Neugeborenen nach
VPA-Exposition 10- 20mal höher als im Bevölkerungsdurchschnitt. Das Exenzephaliemodell
in der NMRI-Maus erlaubt es, durch Injektion von VPA an Tag 8,25 der Embryonalentwicklung gezielt VPA-induzierte craniale Neuralrohrdefekte zu erzeugen. Durch die Modifikation
des VPA-Moleküls konnten enge Struktur-Aktivitätsbeziehungen aufgestellt werden; die Ursachen dieser Teratogenität sind in-vivo dennoch weitgehend unbekannt.
Eine mögliche Zielstruktur der teratogenen Effekte ist das Neurale Zelladhäsionsmolekül
(NCAM). Dieses Protein wird im adulten Organismus an der Oberfläche von Nervenzellen
exprimiert und vermittelt adhäsive Wechselwirkungen zwischen den Zellen. NCAM besitzt
eine einzigartige posttranslationale Modifikation, die Polysialinsäure (PSA). Die Modifikation
des NCAM mit PSA kehrt die adhäsiven Eigenschaften um, der Abstand zwischen den Zellen
wird vergrößert, und die Nervenzellen verlieren an Zusammenhalt. PSA-NCAM wird auch als
embryonale Form des NCAM bezeichnet, da während der Entwicklung das NCAM zum größten Teil polysialyliert vorliegt, und im adulten Organismus diese Modifikation bis auf einige
begrenzte Bereiche des Gehirns wieder verloren geht. Für die Polysialylierung sind die zwei
140
6-
Zusammenfassung
Polysialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV verantwortlich, die im embryonalen und adulten Organismus in unterschiedlicher Weise exprimiert werden. Die Arbeit folgte der Zielsetzung, die Polysialylierung des NCAM in-vivo als Faktor in der Teratogenese der VPA zu
untersuchen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die ST8SiaIV-knockout Maus im Exenzephaliemodell als passendes Instrument zur Bearbeitung der vorgestellte Fragestellung zu identifizieren.
Hierzu wurde die Embryonalentwicklung der ST8SiaIV-knockout Maus im Zeitraum des
Neuralrohrschlusses charakterisiert. Die Geschwindigkeit der frühen Embryonalentwicklung
wurde vergleichend zu NMRI- und zu ST8SiaIV(+/+) Mäusen anhand der Anzahl der Somitenpaare in verschiedenen Entwicklungsstadien ermittelt. Diese Untersuchungen zeigten, dass
der Verlust der ST8SiaIV oder der genetische Hintergrund keine verzögerte Entwicklung im
Vergleich zur NMRI-Maus zur Folge hat. Der immunhistochemische Nachweis der PSA und
des NCAM in den Embryonen der knockout-Mäuse zeigte jedoch, dass die Tiere durch den
Verlust der ST8SiaIV die PSA verzögert synthetisieren; der erste Nachweis gelang am Tag
9,0 der Entwicklung im Vergleich zu Tag 8,5 bei den Konntrolltieren. Die verzögerte Synthese führte jedoch nicht zu Defekten während der Entwicklung. Die Expression der beteiligten
Zielgene wurde quantitativ mit Hilfe der RT-PCR Technik untersucht. Diese Untersuchung
zeigte, dass sowohl die knockout- wie auch die Kontrolltiere ST8SiaII und NCAM im Zeitraum des Neuralrohrschlusses mit langsamer Steigerung exprimieren. Die ST8SiaIV zeigte in
den Kontrolltieren einen sprunghaften Anstieg zwischen Tag 8 und 9 der Entwicklung.
Die ST8SiaIV-knockouts basieren teilweise auf dem genetischen Hintergrund der C57BL/6J
Maus, daher beschäftigte sich ein Teil der Arbeit mit dem Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die teratogenen Effekte der VPA und des hochteratogenen VPA-Derivates SPentyl-4-Pentinsäure (S-Pentyl-4-yn). Diese Studie zeigte, dass die C57BL/6J Maus 3-4fach
weniger empfindlich war als die NMRI Maus. Diese Untersuchung wurde vergleichend zur
Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung der zwei Mäusestämme durchgeführt, um die
Behandlung der Tiere während der gleichen sensiblen Phase der Neuralrohrentwicklung
sicherzustellen.
Auf Grundlage eigener Untersuchungen wurde festgestellt, dass bei einer Nutzung der
ST8SiaIV-knockout Maus im Exenzephaliemodell der Wirkstoff auf einen embryonalen Organismus mit ausschließlich nicht-polysialyliertem NCAM traf. Die Entwicklung in gleicher
141
6-
Zusammenfassung
Geschwindigkeit der NMRI-Maus bedeutete im Exenzephaliemodell die Beeinflussung der
gleichen sensiblen Phase des cranialen Neuralrohrschlusses. Durch die Anwendung des hochteratogenen VPA-Derivates S-Pentyl-4-yn konnte gezeigt werden, dass die ST8SiaIVknockout Maus signifikant weniger Exenzephalien durch die Behandlung entwickelt als die
Kontrolltiere. Der Knockout der ST8SiaIV -und dadurch der Verlust der PSA im sensiblen
Zeitraum der Entwicklung- hatte eine deutlich verringerte Fehlbildungsrate zur Folge. Durch
die Untersuchung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen des S-Pentyl-4-yn wurde dokumentiert, dass der Wirkstoff aus dem Organismus entfernt war, bevor die Synthese der PSA
im STSiaIV-knockout Embryo begann. Die Untersuchung der Behandlungseffekte auf
mRNA-Ebene mit der RT-PCR Technik zeigten, dass NCAM nicht verstärkt, sondern verringert oder unbeeinflußt im Gesamtembryo exprimiert wird. Die ST8SiaIV wurde verringert
exprimiert, während die ST8SiaII keine Reaktion auf die Behandlung zeigte.
Zur Fokussierung auf die einzelne Zelle wurde ein in-vitro System verwendet. Die eingesetzten VPA-Derivate zeigten analog zu ihrer Teratogenität eine dosisabhängige, differenzierende
Wirkung auf fetale Hippocampuszellen. Die induzierte verstärkte Neuritogenese stand jedoch
nicht in einem funktionellen Zusammenhang mit der Polysialylierung des NCAM an der Oberfläche der Zellen, was durch einen enzymatischen Abbau des Zuckers gezeigt wurde.
Die Arbeit präsentiert erstmals die Polysialylierung des NCAM als funktionelle Zielstruktur
in S-Pentyl4-Pentinsäure-induzierten Neuralrohrdefekten. Die Frage nach den molekularen
Zusammenhängen und der Rolle des NCAM in diesem Prozess bleibt offen, und die Bearbeitung erscheint als spannendes Ziel weiterer Untersuchungen.
142
7-
7-
Summary
SUMMARY
About the Neural Cell Adhesion Molecule and Polysialic acid as targets in the origin of
Valproic acid-induced neural tube defects
Katrin Hoffmann
Valproic acid (2-n-propyl-pentanoic acid, VPA) is a single branched, short chain fatty acid.
VPA is one of the most commonly used antiepileptic drugs worldwide with a broad efficiency
against partial and generalised seizures in adults as well as in children. Additionally VPA is
widely used in migraine prophylactics and against bipolar disorders. Currently a new development is the utilise of VPA in fighting cancer, this potency is already clinically used against
childhood malignant glioma. Against this great therapeutical benefits of VPA are standing
two severe, side effects: a life threatening, idiosyncratic hepatotoxicity and the teratogenicity.
In men the spina bifida aperta is the only major malformation caused by the teratogenic effects of VPA. The incidence of spina bifida aperta is 10- to 20-times higher in new-borns
after VPA-exposition compared to the average population. The exencephaliemodel allows the
targeted induction of cranial neural tube defects in the NMRI-mouse by application of VPA
on embryonic day 8.25. The chemical structure of the VPA-molecule was modified and gave
insights into close structure-activity-relationships, but the reasons for the teratogenicity invivo still remained unknown.
One potential target-structure of the described teratogenic effects is the Neural Cell Adhesion
Molecule (NCAM). This protein is expressed in adults on the surface of neural cells and it
mediates adhesive interactions between the cells. Polysialic acid (PSA) is the unique posttranslational modification of NCAM. This modification reverts the adhesive properties of
NCAM; the distance between the cells is increased and the cells lose connection. PSA-NCAM
is also titled as embryonic NCAM, because NCAM is highly polysialylated during embryonic development. In adults this carbohydrate modification becomes reduced to a few restricted areas in the brain. Two polysialic acid-transferases are responsible for the polysialylation of NCAM; named ST8SiaIV and ST8SiaII. These enzymes are expressed in a different spatial and temporal pattern in embryonic and adult organisms. This thesis follows the
143
7-
Summary
question, if the polysialylation of NCAM could be a factor in the VPA-related teratogenesis
in-vivo.
This study shows, that the ST8SiaIV-knockout mouse is the suitable tool to investigate the
introduced question. To characterise the model, the embryonic development of the ST8SiaIVdeficient mouse was described. The somites of embryos in different stages were counted, to
gain information about the rates of development of the knockouts compared to wildtype- and
NMRI-mice. It is shown, that the knockout of ST8SiaIV or the different genetic background
has no influence on the rates of development within the investigated period. The following
immunochemical detection of PSA and NCAM at different embryonic stages proved, that
PSA-synthesis is delayed in the ST8SiaIV-deficient mouse compared to the wildtype controls.
The first demonstration of PSA-synthesis was successfully carried out on day 9.0 of development compared to day 8.5 in the control animals; but the delayed synthesis of PSA did not
cause any malformations in the knockout mice. The expression of the involved target-genes
was quantitatively investigated with RT-PCR. This study showed, that the knockouts as well
as the wildtype mice express ST8SiaII and NCAM with a slow increase during the period of
neural tube closure. The wildtype animals showed a sharp increase in ST8SiaIV expression
between day 8 and 9 of embryonic development.
The genetic background of the ST8SiaIV-knockout mice is partly based on the C57BL6/J
strain, therefore one part of this thesis worked out the influence of the genetic background on
the teratogenic effects of VPA and of the highly-teratogenic derivative S-pentyl-4-pentinoicacid. This thesis showed, that the C57BL6/J inbred strain is three- to fourfold less susceptible
compared to the Hsd:Win NMRI outbred strain. The investigation was carried out comparably
to the rates of embryonic development of the two mouse-strains, to guarantee the treatment in
the exencephalie model during the same sensible periods of neural tube development.
Based on own studies it was found out, that in case off a treatment of the ST8SiaIV-knockout
mouse within the exencephaliemodel the compound would enter an embryonic organism with
only PSA-free NCAM. The embryonic development within the same rates like the Hsd:Win
NMRI-mouse means a treatment of the same sensible period of cranial neural tube closure.
Using the highly teratogenic VPA-derivative S-pentyl-4-pentinoic acid, it could be shown,
that the ST8SiaIV-knockout mouse develops significantly less exencephalic-malformations
after treatment than wildtype-control mice. The deficiency of ST8SiaIV, and therefore the
144
7-
Summary
loss of PSA during the sensible period of neural tube closure, caused a significantly reduced
rate of exencephaly. By detecting S-pentyl-4-pentinoic acid-levels in brain tissue and plasma
it was documented, that the compound was removed from the maternal organism before PSAsynthesis started. The expression of the target genes on mRNA-level showed, that NCAMexpression is not increased but decreased or not influenced in the whole embryo. ST8SiaIV
expression was decreased after treatment, while ST8SiaII was not influenced.
In order to test VPA effects in a less complex system, VPA and derivatives were used in a rat
hippocampal cell model. The substances were able to induce dose-dependent differentiation
of foetal rat hippocampus-cells. The observed differentiation corresponded to the teratogenic
potencies of the drugs. However, because the neuritogenesis was induced in the presence and
absence of PSA, this system could not be set in correlation to the observed in-vivo effects.
This study presents for the first time the polysialylation of the Neural Cell Adhesion Molecule
as a functional target in S-pentyl-4-pentinoic acid-induced neural tube defects. Questions concerning the details of the underlying molecular mechanisms need further experimental work.
145
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Dissertationen:
JUTTA VOLLAND, Hannover 2002: „Embryotoxizität, Antikonvulsive Wirkung, Sedierung und
Adipogenese: Struktur-Aktivitäts-Studien von Valproinsäurederivaten bei der Maus und in
C3H/10T1/2 Zellen.“
UTE GRAVEMANN, Hannover 2001: „Synthese achiraler, racemischer und enantiomerenreiner
Valproinsäure-Analoga mit antikonvulsiver, neurotoxischer und teratogener Aktivität.“
RALF-SIEGBERT HAUCK, Berlin 1992: „Das Antiepileptikum Valproinsäure und struktuverwandte
Carbonsäuren: Stereoselektivität der teratogenen Wirkung im Gegensatz zur antikonvulsiven und sedierenden Wirkung –Asymmetrische Synthesen und Untersuchungen in der Maus.“
166
9-
9-
ANHANG
9.1-
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
3.1
3.2
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
4.17
4.18
Anhang
Neuralrohrentwicklung..........................................................................................
Initiale Punkte des Neuralrohrschlusses ................................................................
Chemische Struktur der Valproinsäure..................................................................
Exenzephalie-Modell und Spina bifida-Modell ....................................................
Struktur-Aktivitätsbeziehungen verschiedener VPA-Derivate .............................
Sialinsäuredimer aus 5-N-Acetylneuraminsäure ...................................................
Die Modifikation des NCAM mit PSA .................................................................
N-Glykosylierung von NCAM ..............................................................................
Ermittlung des ∆Ct-Wertes....................................................................................
Ermittlung des Neuritenwachstums aus einem zufälligen Bildausschnitt.............
Fehlbildungen der Lendenwirbelsäule nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn im
Spina bifida-Modell...............................................................................................
Fehlbildung des lumbalen Wirbelbogens nach Behandlung mit 0,5 mmol SPentyl-4-yn/kg im Spina bifida-Modell.................................................................
Darstellung der TeraD50 im Wahrscheinlichkeitsnetz ...........................................
Darstellung der EmbryoLD50 im Wahrscheinlichkeitsnetz ...................................
Vergleich der TeraD50 und EmbryoLD50 nach VPA- und S-Pentyl-4-yn Behandlung ................................................................................................................
Neurotoxizität von S-Pentyl-4-yn und VPA im der adulten C57BL/6J-Maus
im Rotarod-Toxizitätstest ......................................................................................
Anzahl Somitenpaare von C57BL/6J und NMRI-Embryonen an E 8,5 und E
9,0 ..........................................................................................................................
Embryonen an Tag 9,0 der Entwicklung ...............................................................
Embryonen an Tag 8,5 der Entwicklung ...............................................................
Anzahl Somitenpaare von ST8SiaIV(+/+),ST8SiaIV(-/-) und NMRI an den Tagen 8,25, 8,5 und 9,0 der Entwicklung..................................................................
Expression von PSA und NCAM an Tag 8,5 der Entwicklung.............................
Expression von PSA und NCAM an Tag 9,0 der Entwicklung.............................
Details der PSA-Expression an Tag 8 und 9 der Entwicklung..............................
Expression von PSA und NCAM an Tag 10,0 der Entwicklung...........................
Expression von PSA an Tag 12 der Entwicklung und Negativkontrollen der
PSA-Färbung .........................................................................................................
Details und Negativkontrolle der NCAM-Färbung ...............................................
PSA- und NCAM-Expression in Neuriten des Rückenmarks ...............................
Amplifikation von cDNA eines 8,5 Tage alten ST8SiaIV(+/+)-Embryos...............
167
3
4
7
12
19
21
22
23
52
58
65
65
68
68
69
69
70
73
73
74
77
78
79
80
81
82
83
86
9-
4.19
4.20
4.21
4.22
4.23
4.24
4.25
4.26
4.27
4.28
4.29
4.30
4.31
4.32
4.33
4.34
4.35
4.36
4.37
4.38
4.39
4.40
4.41
4.42
4.43
4.44
4.45
4.46
Anhang
Amplifikation von cDNA eines 8,5 Tage alten ST8SiaIV(-/-)-Embryos ................
PCR-Produkte der Amplifikationskurven 4.18- 4.19 und 4.21- 4.22....................
Negativkontrolle ohne Template (= NTC). ...........................................................
Negativkontrolle ohne reverse Transkriptase in der Erstellung der cDNA...........
Amplifikation von cDNA eines 10 Tage alten ST8SiaIV(+/+)-Embryos................
Amplifikation von cDNA eines 10 Tage alten ST8SiaIV(-/-)-Embryos .................
PCR-Produkte der Amplifikation aus Abb. 4.24. ..................................................
PCR-Produkte der Amplifikation aus Abb. 4.23. ..................................................
Expression von ST8SiaII in ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/+) ................................
Expression von NCAM in ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/+)...................................
Expression von ST8SiaIV in der frühen Embryonalentwicklung der Maus .........
Darstellung der der TeraD50 nach Litchfield & Wilcoxon von S-Pentyl-4-yn
für ST8SiaIV(+/+) im Vergleich zu Hsd:Win NMRI ..............................................
Exenzephalie von ST8SiaIV(+/+), ST8SiaIV(-/-) und ST8SiaIV(+/-) nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn ..........................................................................................
Neurotoxizität von S-Pentyl-4-yn in ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) im Rotarod-Toxizitätstest ...................................................................................................
Expression von NCAM in ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) nach Behandlung
mit einer teratogenen Dosis S-pentyl-4-yn............................................................
Amplifikation von NCAM und HPRT in 2 ST8SiaIV(+/+) Embryonen an Tag
9,0 der Entwicklung nach Behandlung mit einer teratogenen Dosis S-Pentyl-4yn. ..........................................................................................................................
Amplifikation von NCAM und HPRT in 2 ST8SiaIV(-/-) Embryonen an Tag
9,0 der Entwicklung nach Behand-lung mit einer teratogenen Dosis S-Pentyl4-yn........................................................................................................................
PCR-Produkte der Amplifikationen aus Abb. 4.34................................................
PCR-Produkte der Amplifikationen aus Abb. 4.35................................................
Expression von ST8SiaII in ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) nach Behandlung
mit einer teratogenen Dosis S-pentyl-4-yn im Vergleich zu nicht-exponierten
Embryonen.............................................................................................................
Expression von ST8SiaIV in ST8SiaIV (+/+) nach Behandlung mit einer teratogenen Dosis S-Pentyl-4-yn im Vergleich zu nicht-exponierten Embryonen ........
Genotypisierung der Studientiere durch PCR .......................................................
Gehirn- und Plasmakonzentrationen von S-Pentyl-4-yn in ST8SiaIV(-/-)..............
Halbwertszeit von S-Pentyl-4-yn im Plasma der ST8SiaIV(-/-) Maus ...................
Plasmaspiegel von S-Pentyl-4-yn in NMRI und ST8SiaIV(+/+) .............................
Halbwertszeit von S-Pentyl-4-yn im Plasma von ST8SiaIV(+/+) und NMRI.........
Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten ...............................
Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten nach Vorbehandlung mit EndoNF ....................................................................................................
168
86
86
87
87
88
88
88
88
89
89
90
94
95
96
97
98
98
98
98
99
99
100
102
102
103
103
107
107
9-
4.47
4.48
4.49
5.1
Anhang
Neuritenwachstum in fetalen Hippocampuszellen nach Kultur von 24 Stunden ..
NCAM-Expression in behandelten und unbehandelten fetalen Hippocampuszellen......................................................................................................................
PSA-Expression in behandelten und unbehandelten fetalen Hippocampuszellen ..........................................................................................................................
Auswirkungen der Behandlung mit S-Pentyl-4-yn auf die Expression von
ST8SiaII, -IV und NCAM in der ST8SiaIV knockout-Maus und Kontrolltieren .
169
108
109
110
130
9-
Anhang
9.3-
Tabellenverzeichnis
1.1
Morphologische Kennzeichen der Embryonalentwicklung im zeitlichen Verlauf
und im Vergleich zur Anzahl der Somiten beim Menschen und der Hausmaus.........
Expression von NCAM während der Embryonalentwicklung der Maus....................
Expression von ST8SiaII und ST8SiaIV während der Embryonalentwicklung der
Maus ............................................................................................................................
Nachweise von PSA während der Embryonalentwicklung der Maus.........................
Externe Fehlbildungen der C57BL/6J Maus im Spina bifida-Modell ........................
Hsd:Win NMRI im Exenzephaliemodell ....................................................................
C57BL/6J im Exenzephaliemodell..............................................................................
ST8SiaIV(+/+) nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn und der Einfluß einer hormonellen Zyklussynchronisation im Exenzephaliemodell...............................................
ST8SiaIV(-/-) nach Behandlung mit S-Pentyl-4-yn im Exenzephaliemodell ...............
ST8SiaIV(+/-) im Exenzephaliemodell, maternale und paternale Effekte....................
Behandlung von ST8SiaIV(+/+) und ST8SiaIV(-/-) mit 3 mmol VPA/kg an Tag 8,25
der Trächtigkeit ...........................................................................................................
Behandlung fetaler Hippocampuszellen mit VPA-Derivaten .....................................
Wahrscheinliche Exenzephalieraten bei TD50-Dosis des Muttertieres .......................
Übersicht der Synthese von PSA-NCAM in Abhängigkeit der Expression von
ST8SiaII und -IV in der frühen Embryonalentwicklung der Maus.............................
Die Teratogenität der verwendeten VPA-Derivate im Vergleich zum induzierten
Neuritenwachstum.......................................................................................................
1.2
1.3
1.4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
5.1
5.2
5.3
170
2
30
31
32
64
67
67
92
93
94
95
106
114
123
136
9-
9.4-
Anhang
Ct-Werte der Real time-PCR Studie
Tag 8,5 der Entwicklung, unbehandelt
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV(+/+)
7
8
9
ST8SiaIV(-/-)
102
103
105
23,5
23,8
23,7
28
26,1
27,1
28,3
25,9
28,5
27,1
29,1
30,3
28,2
29,1
28
ST8SiaIV
HPRT
NCAM
21,4
21,8
23,5
24,9
22,9
25,1
25,2
24
27,3
kein Signal
34,6
34,1
33,3
34,4
33,2
19,8
20,2
20
20,8
21,6
22
21
25,8
23,9
23,3
23,9
26,3
23
23,8
23,3
20,1
25,5
21,5
23,8
27,4
25,8
24
28,5
26,2
24,5
25,3
26,2
28,1
26,6
23,3
Tag 8,5 der Entwicklung, behandelt mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV
HPRT
ST8SiaIV(+/+)
67
68
69
ST8SiaIV(-/-)
137
138
139
27,9
28,7
28,1
28,5
31,1
28,2
29,4
28
28,3
30,1
31,4
35,7
29,6
33,3
29,2
31,6
24,7
26,1
26,5
24
25,8
25,4
27,1
24
24,9
28,4
34
>40
34,4
kein Signal
-
20,7
24,1
23,5
20
22,6
20,1
29,4
25,3
26,6
22,6
25,5
26,2
25
30,9
25,2
30,3
NCAM
21,4
23,2
23,6
20,7
23,6
23,4
23,8
21,9
22,8
25,4
27,5
31,8
27,4
27,1
28,5
26,4
grau unterlegte Felder sind als Primerdimere identifiziert worden
171
9-
Tag 9,0 der Entwicklung, unbehandelt
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV(+/+) 13
28,2
27,1
25,7
14
27,9
27,8
26,2
15
25,7
23,9
21,4
ST8SiaIV(-/-) 2
kein Signal
27
26,5
27
3
28,1
27,4
26,7
4
26,5
26,1
24,8
Anhang
ST8SiaIV
26,4
25,3
25,2
26,4
28,1
26,1
23,5
22,2
22,2
29,1
35,1
29,1
>40
34,3
29,6
36,9
36,3
HPRT
23,7
25,9
25,4
26,6
25,7
26,9
20,6
20,8
23
31,3
23,8
26,8
25,9
22,7
24,6
23,1
20,5
21,8
20,9
Tag 9,0 der Entwicklung, behandelt mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV
HPRT
ST8SiaIV(+/+) 37
28,2
27,8
26
22,0
24,1
19,7
27,2
29
38
29,7
27,1
25,3
28,2
29,9
26,2
28,2
27
25,5
39
29,7
27,1
25,3
25
23
22,3
24,8
24,8
22,4
ST8SiaIV(-/-) 118
25,6
28,8
21,2
23,0
34,1
20,8
25,1
35,7
22,8
119
27,4
28,7
23,3
25
33,9
22,6
>40
21,1
24,2
120
30,1
28,1
25,2
30,1
34,8
25,8
28,4
kein Signal
25,8
NCAM
24,8
23,2
23,5
23,3
21,3
19,9
30,7
24,7
kein Signal
kein Signal
23,2
kein Signal
24,3
21
kein Signal
22,5
NCAM
25,3
19,4
22,6
24,4
kein Signal
25
24,4
kein Signal
23,2
22,3
kein Signal
25,2
23,2
23,9
kein Signal
24,8
28
kein Signal
grau unterlegte Felder sind als Primerdimere identifiziert worden
172
9-
Tag 10,0 der Entwicklung, unbehandelt
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV(+/+) 18
23,8
24,9
24,8
19
24,4
26
22,7
20
24,1
24,5
22,1
ST8SiaIV(-/-) 33
25,2
24,9
21,7
34
24,8
21,8
35
23,6
25,3
22,5
Anhang
ST8SiaIV
23
23,3
24,7
24,5
24,3
23,1
22,9
24,1
21,5
33,5
36,6
33,5
>40
34,8
36,7
35,3
35,2
HPRT
21,9
22,1
22,3
22,7
24,2
21,2
22,1
21,6
20,6
22,7
21,4
19,6
21,1
19,3
21,2
21,6
20,2
Tag 10,0 der Entwicklung, behandelt mit 1,5 mmol S-Pentyl-4-yn/kg
Proben-Nr. ST8SiaII
ST8SiaIV
HPRT
(+/+)
ST8SiaIV
44
27,2
24,5
22,5
27
25,8
21,9
45
24,9
22,6
21,7
27,4
26,5
24
46
25,2
23,4
21
24,3
24,6
21,9
(-/-)
ST8SiaIV
121
29,4
36,9
27,2
29,1
29,3
25,7
35,5
25,5
29,6
122
27,1
39,8
23,7
24,7
30,3
21
34
22,2
24
123
26,7
36,4
23,9
24,9
29,5
21
37,6
23,4
27,1
NCAM
21,7
21,5
19,0
22,6
22,2
18
21,4
22,3
18
21,9
21,4
20,4
20,9
20,4
21,5
21
21,8
NCAM
22,4
22,6
21,8
22,5
21,1
20,9
26,8
25,4
25,3
23,1
21,3
19,2
22,6
21,1
25
grau unterlegte Felder sind als Primerdimere identifiziert worden
173
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel: „Studien zur Bedeutung des Neuralen Zelladhäsionsmoleküls und der Polysialinsäure in der Entstehung von Valproinsäureinduzierten Neuralrohrdefekten“ selbständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Die Genotypisierung der Studientiere wurde teilweise von Dr. Birgit Weinhold (MHHannover) durchgeführt.
Der quantitative Nachweis von S-Pentyl-4-Pentinsäure aus verschiedenen biologischen
Matrices mittels GC wurde von Herrn Daniel Eikel (Tierärztliche Hochschule Hannover)
erbracht.
Die Isolierung fetaler Hippocampuszellen der Ratte wurde von Dr. Stine Hansen (Universität Kopenhagen) durchgeführt.
Die Primer für die RT-PCR Studie hat Dr. Martina Mühlenhoff Weinhold (MHHannover) entworfen und die RT-PCR Methodik gemeinsam mit Dr. Ulrich Lehmann
(MH-Hannover) angepaßt.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir mittelbar oder unmittelbar entgeltlich Leistungen für Arbeiten
erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe
die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
Tierärztliche Hochschule Hannover:
Institut für Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik
Institut für Anatomie
Medizinische Hochschule Hannover:
Zentrum Biochemie, Abteilung Zelluläre Chemie
Institut für Pathologie
Universität Kopenhagen:
Panum Institut, Institut für Molekulare Pathologie, Protein Labor
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Hannover, den
_____________________________________
Katrin Hoffmann
174
DANKSAGUNGEN
Einen herzlichen Dank möchte ich Prof. Heinz Nau aussprechen, der mir dieses spannende
Thema anvertraut hat und durch seine stete wissenschaftliche Förderung und konstruktiven
Anregungen die Durchführung ermöglichte.
Herzlich möchte ich mich bei Prof. Rita Gerardy-Schahn bedanken, die mir in schwierigen
Situationen stets mit Diskussionbereitschaft und motivierender Tatkraft geholfen hat. Ich bedanke mich weiterhin für die Überlassung der knockout-Mäuse, der Antikörper und der Endoneuraminidase.
Prof. Wolfgang Löscher gilt mein Dank für eine Betreuung seitens der Ph.D.-Kommission,
die in fachlicher und kritischer Weise die Arbeit ergänzt und bereichert hat.
Bei Prof. Wilfried Meyer bedanke ich mich für die überaus freundliche Aufnahme in sein
Labor und die Ratschläge für das rechte Gelingen einer Versilberung nach Bodian. Marion
Gähle danke ich herzlich für Ihre Einführungen in die histologische Technik und für die vielen kleinen Handgriffe, die mir den Alltag im Histologielabor erleichtert haben.
Ein großes Dankeschön spreche ich Dr. Martina Mühlenhoff für das Primerdesign und die
zahlreichen freundlich-kritischen Diskussionen aus. Dr. Birgit Weinhold danke ich für die
Genotypisierungen und die Starthilfe in der Arbeit mit der ST8SiaIV-knockout Maus. Dr.
Ulrich Lehmann danke ich für die Bereitschaft, mich in seinem Labor arbeiten zu lassen und
für die Einführung in die RT-PCR Technik.
Georgina Zivkovic danke ich herzlich für Ihre zuverlässige und engagierte Betreuung der Tiere. Prof. Mohey M.A. Elmazar danke ich für die hervorragende Einarbeitung in die Reproduktionstoxikologie.
Dr. Elisabeth Bock und Dr. Vladimir Berezin danke ich für ihr freundliches Willkommen in
Kopenhagen und für die Ermöglichung der in-vitro Studie. Der Auslandsaufenthalt wurde
durch eine Finanzierung der Europäischen Union im Rahmen des Research Training NeworkProgrammes „Nutriceptors“ ermöglicht, auch dafür bedanke ich mich.
Ich bedanke mich bei allen Kollegen für das nette Klima der ZA Lm-Tox. und die vielen kleinen und großen Ratschläge und Hilfestellungen. Insbesondere bedanke ich mich bei Daniel
Eikel für die GC-Analytik und bei Dr. Ute Gravemann für die Synthese des S-Pentyl-4-yn.
Der Firma American Biogenetic Science Inc. danke ich für die großzügige finanzielle Förderung der Arbeit.
Ein besonderes Dankeschön spreche ich meinen Eltern aus, die mich menschlich immer unterstützt haben. Meiner Schwester Susanne danke ich für die Korrektur der Arbeit. Bent Pages
danke ich von ganzem Herzen dafür, dass er mir immer zur Seite stand.
175